JP2023531249A - Ｆｕｂｐ１発現を調節するための増強されたオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｆａｒ Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｅｌｅｍｅｎｔ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＦＵＢＰ１）に対して相補的であり、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡなどのＦＵＢＰ１標的核酸を減少させることができる増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、特に慢性ＨＢＶ感染の処置及び／又は予防に使用するための、ＦＵＢＰ１又はそのコンジュゲートを標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、特に、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡなどのｃｃｃＤＮＡを不安定化するための、ＦＵＢＰ１又はそのコンジュゲートを標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。本発明はさらに、がんの処置に使用するための、ＦＵＢＰ１又はそのコンジュゲートを標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。ＨＢＶ感染の処置及び／又は予防における医薬組成物及びその使用、又はがんの処置におけるその使用も本発明に含まれる。

Description

本発明は、Ｆａｒ Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｅｌｅｍｅｎｔ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＦＵＢＰ１）に相補的であり、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡなどのＦＵＢＰ１標的核酸を減少させることができる増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、特に慢性ＨＢＶ感染の処置及び／又は予防に使用するための、ＦＵＢＰ１又はそのコンジュゲートを標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、特に、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡなどのｃｃｃＤＮＡを不安定化するための、ＦＵＢＰ１又はそのコンジュゲートを標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。本発明はさらに、がんの処置に使用するための、ＦＵＢＰ１又はそのコンジュゲートを標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。ＨＢＶ感染の処置及び／又は予防における医薬組成物及びその使用、又はがんの処置におけるその使用も本発明に含まれる。

Ｆａｒ Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｅｌｅｍｅｎｔ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＦＵＢＰ１又はＦＢＰ１）は、複数のＤＮＡエレメントに結合する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。このタンパク質はまた、ＲＮＡに結合すると考えられ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖及びＲＮＡ－ＲＮＡ二重鎖の両方に対してインビトロ活性を有する３’－５’ヘリカーゼ活性を含有する。ＦＵＢＰ１は、未分化細胞においてｃ－ｍｙｃの上流に位置するｆａｒ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＦＵＳＥ）に結合することによって、癌原遺伝子ｃ－ｍｙｃの転写を活性化することが知られている。タンパク質は、主に細胞の核内に存在する。ＦＵＢＰ１の上方制御は、多くのタイプのがんにおいて観察されている。さらに、ＦＵＢＰ１は、Ｃ型肝炎ウイルス及びエンテロウイルス由来のＲＮＡに結合し、その複製を媒介することができる（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｎ ２０１３ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｖｏｌ ３２ ｐ．２９０７－２９１６）。

ＦＵＢＰ１はまた、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）においても同定されており、ＨＣＣ腫瘍形成に関与することが示唆されており（Ｒａｍｄｚａｎ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｖｏｌ ８ ｐ．５０８６－５０９６）、ＦＵＢＰ１を標的とするレンチウイルス発現ｓｈＲＮＡを使用して例示されるように、ＦＵＢＰ１がＨＣＣ腫瘍成長に必要であることが示唆されている（Ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ ２００９ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ５０ ｐ １１２１－１１２９）。

レンチウイルス発現ｓｈＲＮＡによるＦＵＢＰ１のノックダウンは、卵巣癌における処置応答を増強することが実証されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１７ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ １４ ｐ．５８１９－５８２４）。

国際公開第２００４／０２７０６１号には、被検物質がＦＢＰ（ＦＢＰは現在、ＦＵＢＰと呼ばれている）を阻害するか否かを解析する工程と、ＦＢＰを阻害する物質を有効成分として含有する増殖性疾患を処置するための医薬組成物とを含むスクリーニング方法が開示されている。

ポリ（Ｕ）結合スプライシング因子６０（ＰＵＦ ６０）は、ＨＢＶプレゲノム発現の転写及び転写後の工程の両方の潜在的調節因子である。ＰＵＦ６０は、ｃ－ｍｙｃ抑制に関連して、ＦＵＢＰ１と複合体を形成することが知られている。しかしながら、ＦＵＢＰ１は、ＨＢＶプレゲノム発現のＰＵＦ６０依存的調節に関与していない（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ ２０１７ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：１２８７４）。

ＨＢＶ感染は、推定３億５０００万人の慢性感染キャリアに影響を及ぼす世界的に大きな健康問題のままである。キャリアの約２５％は、最終的に慢性肝炎、肝硬変、又は肝臓癌で死亡する。Ｂ型肝炎ウイルスは、タバコに次いで２番目に重要な発癌物質であり、全原発性肝臓癌の６０％～８０％を引き起こす。ＨＢＶはＨＩＶよりも１００倍感染性が高い。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、エンベロープを有する部分的に二本鎖のＤＮＡウイルスである。コンパクトな３．２ｋｂのＨＢＶゲノムは、それぞれコア、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、エンベロープ及びＸタンパク質をコードする４つの重複するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。Ｐｏｌ ＯＲＦは最も長く、エンベロープＯＲＦはその中に位置するが、Ｘ及びコアＯＲＦはＰｏｌ ＯＲＦと重複する。ＨＢＶゲノムの複製サイクルは、２つの主要な事象を有する。１）緩和環状（ＲＣ ＤＮＡ）からの閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の生成、及び２）プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の逆転写によるＲＣ ＤＮＡの生成。ＲＣ ＤＮＡは、感染ウイルス粒子に由来し得るか、又は細胞内複製中間体として生じ得る。

ＨＢｓＡｇ定量化は、慢性感染患者における循環ＨＢｓＡｇの喪失が治癒を達成する上で重要な事象として見られる慢性Ｂ型肝炎における予後及び処置応答のための重要なバイオマーカーである。しかしながら、ＨＢｓＡｇ喪失及びセロコンバージョン（機能的治癒）の達成は、慢性感染患者ではほとんど観察されない。Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢＶエンベロープ抗原又はＨＢｅＡｇとも呼ばれる）は、Ｂ型肝炎感染細胞によって分泌されるウイルスタンパク質である。ＨＢｅＡｇは、慢性Ｂ型肝炎感染に関連し、活動性ウイルス疾患及び患者の感染度のマーカとして使用される。

したがって、ＨＢｓＡｇの分泌に加えてＨＢｅＡｇの分泌を減少させることは、ＨＢｓＡｇ単独の分泌の阻害と比較して、慢性ＨＢＶ感染の発症の改善された阻害をもたらし得る。

ヌクレオシ（チ）ド類似体などの現在の治療法は、ＨＢＶ ＤＮＡ合成を阻害するが、ＨＢｓＡｇレベルを低下させることを目的としない分子である。現在開発中のほとんどの治療法は、検出不能な血清ＤＮＡを用いて、及び転写不活性状態のｃｃｃＤＮＡを用いて、抗ＨＢｓセロコンバージョンの有無にかかわらず持続的なＨＢｓＡｇ喪失として定義される機能的治癒に到達することを目的としているが、ｃｃｃＤＮＡ持続性には対処していない。対照的に、ＨＢＶ感染の完全治癒は、持続性ＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇ喪失と組み合わせたｃｃｃＤＮＡ喪失として定義される。感染肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡの持続性は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＣＨＢ）患者におけるウイルスを根絶するための主な障壁であり、ｃｃｃＤＮＡを排除するＨＢＶ完全治癒のための新しい治療法を開発する緊急の必要性がある。

国際公開第２０１９／１９３１６５号では、低分子、ｓｉＲＮＡ又はＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかを使用したＦＵＢＰ１機能の阻害が、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの減少をもたらすことが示された。国際公開第２０１９／１９３１６５号の実施例セクションでは、一本鎖ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを分析し、これは、ＦＵＢＰ１発現を阻害することができた。

ＦＵＢＰ１を特異的に阻害することができる治療剤が必要とされている。本発明者らは、ヒトＦＵＢＰ１を標的とする２０００個を超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングし、ヒトＦＵＢＰ１を特異的に標的とするのに特に強力かつ有効な配列及び化合物を同定した。具体的には、９つの交互フランクギャップマーが同定され、インビトロでヒトＦＵＢＰ１の強い下方制御をもたらした。８つの化合物はヒトＦＵＢＰ１のエクソン１４内の領域を標的とし、１つの化合物はエクソン２０内の領域を標的とする（ＣＭＰ番号１８＿１）。

発明の目的
本発明は、ＦＵＢＰ１発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそのコンジュゲートを提供する。本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートによって標的化されて有効なＦＵＢＰ１阻害をもたらし得る、ヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡのエクソン１４又はエクソン２０に存在する特異的標的配列を同定した。特に、配列番号１の位置１６１８４－１６２０５を標的にするのが、ＦＵＢＰ１の低下という観点から有利である。

さらに、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートによって標的化されて有効なＦＵＢＰ１阻害をもたらし得る、ヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡのエクソン２０に存在する特異的標的配列を同定した。特に、配列番号１の位置３０５３６－３０５５３を標的にするのが、ＦＵＢＰ１の低下という観点から有利である。

したがって、本発明の目的は、ＦＵＢＰ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートを提供することであり、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、インビトロ及びインビボでＦＵＢＰ１の発現を阻害することができ、それによってＨＢＶ感染細胞においてｃｃｃＤＮＡを減少させることができる。ＦＵＢＰを標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド１又はそのコンジュゲートは、ＨＢＶ感染の処置及び／若しくは予防、又はがんの処置に使用することができる。

本発明は、ＦＵＢＰ１（Ｆａｒ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｅｌｅｍｅｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）核酸、例えば哺乳動物のＦＵＢＰ１核酸を標的とし、該核酸を発現する細胞において該核酸の発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲート、及び薬におけるそれらの使用に関する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＦＵＢＰ１などの哺乳動物ＦＵＢＰ１核酸に相補的である。

本発明は、ヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ（配列番号１に示される）のヌクレオチド１６１８４～１６２０５の領域に相補的、例えば完全に相補的な連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

また、本発明は、ヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ（配列番号１に示される）のヌクレオチド３０５３６～３０５５３の領域に相補的、例えば完全に相補的な連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８４～１６２００の領域に相補的である、例えば完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８６～１６２０３の領域に相補的である、例えば完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド３０５３６～３０５５３の領域に相補的である、例えば完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８８～１６２０５の領域に相補的である、例えば完全に相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８９～１６２０５の領域に相補的である、例えば完全に相補的である。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には１２～３０、例えば１２～２２、例えば１６～２０ヌクレオチド長であり、配列番号１のヌクレオチド１６１８４～１６２０５、１６１８４～１６２００、１６１８６～１６２０３、１６１８８～１６２０５、１６１８９～１６２０５、及び３０５３６～３０５５３由来の領域から選択されるヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ（配列番号１に示される）の領域に相補的である、例えば完全に相補的である、少なくとも１２ヌクレオチド、例えば１３、１４、１５、１６、１７又は１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、１２～２２ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１２～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、該連続ヌクレオチド配列が、配列番号１０に相補的、例えば、完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、１２～２０ヌクレオチド長（例えば、１５、１６、１７、又は１８ヌクレオチド長）のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１２～１８ヌクレオチド長（例えば、１５、１６、１７、又は１８ヌクレオチド長）の連続ヌクレオチド配列を含み、該連続ヌクレオチド配列が、配列番号１１に相補的、例えば、完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、１２～２０ヌクレオチド長（例えば、１５、１６、１７、又は１８ヌクレオチド長）のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１２～１８ヌクレオチド長（例えば、１５、１６、１７、又は１８ヌクレオチド長）の連続ヌクレオチド配列を含み、該連続ヌクレオチド配列が、配列番号１９に相補的、例えば、完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列が、配列番号６、７、８、９及び１８からなる群より選択される配列；又はその少なくとも１４個の連続ヌクレオチドと１００％同一であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列が、配列番号６、７、８、９及び１８からなる群より選択される配列、又はその少なくとも１５個の連続ヌクレオチドと１００％同一であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列が、配列番号６、７、８、９及び１８からなる群より選択される配列、又はその少なくとも１６個の連続ヌクレオチドと１００％同一であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、配列番号６、７、８、９及び１８からなる群から選択される配列、又はその１４、１５、１６、若しくは１７個の連続ヌクレオチドと１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、配列番号６、７、８、９及び１８からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含む（又はそれからなる）アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、配列番号６（ＣＴＴＡＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴ）、又はその１４、１５、若しくは１６個の連続ヌクレオチドと１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、配列番号７（ＣＴＴＡＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴ）、又はその１４、１５、１６、若しくは１７個の連続ヌクレオチドと１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、配列番号８（ＧＣＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣ）、又はその１４、１５、若しくは１６個の連続ヌクレオチドと１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、配列番号９（ＴＡＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣ）、又はその１４、１５、１６、若しくは１７個の連続ヌクレオチドと１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、配列番号１８（ＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＣＴＡＣ）、又はその１４、１５、１６、若しくは１７個の連続ヌクレオチドと１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、以下
ＣＴＴａｔＧｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴ（配列番号６、化合物番号６＿１）、
ＣＴＴａＴｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴ（配列番号６、化合物番号６＿２）、
ＣＴｔＡＴｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴＴ（配列番号７、化合物番号７＿１）、
ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴＴ（配列番号７、化合物番号７＿２）、
ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔＧｇＴＴ（配列番号７、化合物番号７＿３）、
ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔＧＧＴＴ（配列番号７、化合物番号７＿４）、
ＧｃｔｔＴｔｔａｔｇｇｔＴｔＣＡＣ（配列番号８、化合物番号８＿１）、
ＴＡＴｇｃＴｔｔｔｔａｔｇｇｔＴＴＣ（配列番号９、化合物番号９＿１）、及び
ＡｃＣＡＡｔｔｔｔｃａｔｔｔＣｔＡＣ（配列番号１８、化合物番号１８＿１）
から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、すべてのＬＮＡ ＣはＬＮＡ５－メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明はまた、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、表１に列挙される群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。
Ｈｅｌｍ注釈キー：
［ＬＲ］（Ｇ）は、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ｔ）は、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ａ）は、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（［５ｍｅＣ］は、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ ５－メチルシトシンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｇ）は、ＤＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｔ）は、ＤＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ａ）は、ＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（［Ｃ］は、ＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ｓＰ］は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
Ｐは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。

したがって、本発明は、化合物番号６＿１、６＿２、７＿１、７＿２、７＿３、７＿４；８＿１及び９＿１からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明はさらに、化合物番号１８＿１を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第２０１９／１９３１６５号に開示されているようなアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物番号５３＿１又は５４＿１ではない（実施例の節の表７も参照のこと）。

一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第２０１９／１９３１６５号に開示されているようなアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物番号７８＿１及び７９＿１ではない（実施例の節の表７も参照のこと）。

本発明はさらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、該アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲートを提供する。

いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体などのアシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる。例えば、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群より選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む少なくとも１つのコンジュゲート部分、例えば以下に記載される少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む少なくとも１つのコンジュゲート部分にコンジュゲートされ得る。本発明の一態様によれば、コンジュゲート部分は、本明細書中で以下に記載されるようなＧａｌＮＡｃ残基Ｒである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、少なくとも三価、例えば、二価、三価又は四価のＧａｌＮＡｃ残基Ｒである。好ましくは、コンジュゲート部分は三価ＧａｌＮＡｃ残基Ｒである。本明細書で使用される「三価ＧａｌＮＡｃ残基」という用語は、３つのＮ－アセチルガラクトサミン部分、すなわち好ましくは以下の式の３つの部分を含む残基を指す。

コンジュゲート部分又はＧａｌＮＡｃ残基Ｒ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生体切断可能なリンカーＬなどのリンカーＬを介して一緒に連結されていてもよい。したがって、コンジュゲート化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分又はＧａｌＮＡｃ残基Ｒとの間にそれぞれ位置するリンカーＬを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、リンカーＬは、１個～１０個の連結されたヌクレオシド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～６個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～５個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～４個の連結されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは２つの連結されたヌクレオチドを含む。したがって、ヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり得る。典型的には、ヌクレオシドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して結合される。さらに、リンカーＬは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介してアンチセンス化合物に結合していてもよい。

例示的なコンジュゲートは、表２（ＨＥＬＭ注釈フォーマット）並びに図１～８、図８．１及び図１０に提供されている。

本発明は、表２に列挙されるコンジュゲートの群から選択されるコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

上記の表において、［５ｇｎ２ｃ６］は、以下の式を有するＧａｌＮＡｃ残基Ｒである。

上記の図に示され、上記の表で使用されるＲは、図９Ｄ１及び図９Ｄ２に示される２つの立体異性体の混合物であることが理解されるべきである。

本発明のさらなる態様によれば、上記の図に示され、上記の表で使用されるＲは、図９Ｄ１に示される立体異性体である。

本発明のさらなる態様によれば、上記の図に示され、上記の表で使用されるＲは、図９Ｄ１に示される立体異性体である。表２に提供されるコンジュゲートの構造を図１～図８及び図８．１に示す。

本発明は、図１のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号６＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、図２のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号６＿２のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、図３のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号７＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、図４のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号７＿２のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、図５のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号７＿３のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、図６のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号７＿４のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、図７のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号８＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、図８のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号９＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、化合物番号１８＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、図８．１のコンジュゲート又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。

式（Ｉ）の化合物
本発明はまた、以下の式（Ｉ）の化合物を提供する。
式中、
ｎは０又は１であり
ｐは０又は１であり
ただし、ｎが１である場合、ｐは好ましくは１であり、
かつ、ｎが０でありｐが０である場合、Ｒは好ましくはＨであり、
Ｌはリンカーであり、好ましくはＬは、２～１０個のヌクレオシド、例えば２～５個のヌクレオシドを含むか又はそれからなるリンカーであり、
ＲはＧａｌＮＡｃ残基、好ましくは三価のＧａｌＮＡｃ残基であり、
Ａは、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド残基」という用語は、その５’末端を介して－（Ｌ）_ｎ－（Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－）_ｐ－を介して残基Ｒに結合している本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば表６に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド残基を図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ及び図８Ａに示す。さらに好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド残基を図８．１Ａに示す。

ＧａｌＮＡｃ残基Ｒ
ＲはＧａｌＮＡｃ残基、好ましくは三価のＧａｌＮＡｃ残基である。本明細書で使用される「ＧａｌＮＡｃ残基」という用語は、少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分、すなわち以下の式の少なくとも１つの部分を含む残基を指す。

本明細書で使用される「三価ＧａｌＮＡｃ残基」という用語は、３つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分、すなわち好ましくは以下の式の３つの部分を含む残基を指す。

好ましくは、ＧａｌＮＡｃ残基は、以下の構造を有する少なくとも１つ、好ましくは３つのＧａｌＮＡｃ構成単位（^Ｌａ）を含み、
式中、リンカー^ａは、アルキル基、アルキル－オキシ－アルキル基、少なくとも１つのホスホジエステル結合を含むアルキル基、少なくとも１つのアミド結合を含むアルキル基、少なくとも１つのホスホジエステル結合を含むアルキル－オキシ－アルキル基、及び少なくとも１つのアミド結合を含むアルキル－オキシ－アルキル基から選択される。

「アルキル」という用語は、置換又は非置換の直鎖又は分岐のアルキル基、例えばＣ１～Ｃ２０アルキル基、好ましくはＣ２～Ｃ８、例えばＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７又はＣ８アルキル基を指す。好ましくは、アルキル基は、非置換、より好ましくは直鎖及び非置換のアルキル基である。

「アルキルオキシアルキル」基という用語は、酸素を介して結合された少なくとも２つのアルキル基、好ましくはエチル－オキシ－エチル基、例えば－（ＣＨ_２－Ｏ）_ｘ－基を指し、整数ｘは、好ましくは２～２０の範囲、より好ましくは２～６の範囲、例えば２、３、４、５又は６であり、より好ましくはｘは３又は５である。

本発明の一態様によれば、ＧａｌＮＡｃ構成単位（Ｌ^ａ）は、以下の構造（Ｌ^ａ）の群から選択される。

３価のＧａｌＮＡｃ残基中の３つの残基など、１つよりも多くの残基（Ｌ^ａ）がＧａｌＮＡｃ残基中に存在する場合、すべての残基が同じであることが好ましい。

最も好ましくは、Ｌ^ａは、以下の構造を有する。

コンジュゲート部分Ｒが複数、例えば好ましくは３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む場合、Ｒは、ＧａｌＮＡｃ構成単位（Ｌ^ａ）の他に、好ましくは構成単位（Ｌ^ａ）が－（Ｌ）_ｎ－（Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－）_ｐ－を介してアンチセンスオリゴヌクレオチド残基Ａに結合している、多価、好ましくは四価の構成単位（Ｌ^ｂ）を含む。

Ｌ^ｂは、好ましくは以下の構造の１つから選択される。
式中、ＸはＯ又はＳであり、ＺはＯ又はＮＨであり、ｎは１～４、好ましくは２又は３、より好ましくは２である。

より好ましくは、Ｌ^ｂは、以下の構造を有する。

Ｌ^ｂは、構造Ｌ^ｂ＊又は構造Ｌ^ｂ＊＊のいずれかを有するか、又はそれらの混合物であることを理解されたい。好ましい態様によれば、Ｌ^ｂは、Ｌ^ｂ＊とＬ^ｂ＊＊の混合物である。

したがって、コンジュゲート部分Ｒは、好ましくは構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－を含み、より好ましくはＲは以下の構造のうちの１つを含み、
より好ましくは、以下の構造を含む。
式中、Ｌ^ｂは、好ましくはＬ^ｂ＊とＬ^ｂ＊＊の混合物であり、
ＸはＯ又はＳであり、ＺはＯ又はＮＨであり、ｎは１～３、好ましくは２であり、Ｌ^ａは上記の通りであり、好ましくはＬ^ａは以下、
及びそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＧａｌＮＡｃ残基内のすべての残基（Ｌ^ａ）は同じである。

（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂが以下である場合、

Ｌ^ａは、より好ましくは、以下からなる群から選択される。

（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂが以下である場合、
又は
好ましくは、
であり、Ｌ^ａは、好ましくは以下である。

任意に、コンジュゲート部分ＲはリンカーＬ^ｃをさらに含む。したがって、Ｒは、好ましくは構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃ－を有し、整数ｃは１又は０である。

そのようなリンカー化合物は当業者に公知であり、化合物の残りの部分、アンチセンスオリゴヌクレオチド残基に、すなわち－（Ｌ）_ｎ－（Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－）_ｐ－を介して（Ｌ^ａ）_３－Ｌ_ｂを結合させるように適切に選択される。

Ｌ^ｂの構造に応じて、Ｌ^ｃは、アルキル、アルキル－オキシ－アルキル、アミノ－アルキル（－ＮＨ－アルキル－）、アミノ－アルキル－オキシ－アルキル、非天然アミノ酸残基、及び天然アミノ酸残基からなる群から選択される。本発明の一態様によれば、Ｌ^ｃは、置換又は非置換リジン基である。

本発明の一態様によれば、Ｒは、（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃであり、ｃ＝１であり、（Ｌａ）３－Ｌｂ－（Ｌｃ）ｃであり、（Ｌ^ａ）_３－Ｌ_ｂは以下である。

Ｌ^ｃは、好ましくはアミノ－アルキル基、又は置換若しくは非置換リジン基などのアミノ酸であり、特にＬ^Ｃは、例えば、以下からなる群から選択され、
アミノ基がＬ^ｂのカルボニル基に結合して、それによりアミド結合を形成する。この態様による好ましい残基Ｒを図９Ａ１、図９Ａ２；図９Ｃ１、図９Ｃ２、図９Ｄ１、図９Ｄ２に示す。したがって、本発明の一態様によれば、Ｒは、図９Ａ１、図９Ａ２；図９Ｃ１、図９Ｃ２、図９Ｄ１、及び図９Ｄ２に示される残基からなる群から選択される。

本発明のさらなる態様によれば、Ｒは、構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃを有し、ｃは０であり、（Ｌ^ａ）_３－Ｌ_ｂは以下である。

本発明のこの態様による好ましい残基Ｒを図９Ｂ１及び図９Ｂ２に示す。

本発明のさらなる態様によれば、Ｒは、構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃを有し、（Ｌ ^ａ ）_３－Ｌ_ｂは以下であり、
ＺはＯである。この場合、ｃは好ましくは１であり、Ｌ^ｃは好ましくはアルキル基、より好ましくはＣ３～Ｃ６アルキル基、より好ましくはプロピル基、最も好ましくはｎ－プロピル基である。この態様による好ましい残基Ｒを図９Ｅ１、図９Ｆ１、図９Ｇ１及び図９Ｈ１に示す。したがって、本発明の一態様によれば、Ｒは、図９Ｅ１、図９Ｆ１、図９Ｇ１及び図９Ｈ１に示される残基からなる群から選択される。

本発明のさらなる態様によれば、Ｒは、構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃを有し、（Ｌ ^ａ ）_３－Ｌ_ｂは以下であり、
ＺはＮＨである。この場合、ｃは好ましくは１であり、Ｌ^ｃは好ましくはアルキル基、アミノ酸含有基、又は以下の構造を有する基である。

特に、この場合、Ｌ^ｃは以下である。

本発明のこの態様による好ましい残基Ｒを図９Ｊ１に示す。

本発明のさらなる態様によれば、Ｒは、構造（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃを有し、（Ｌ ^ａ ）_３－Ｌ_ｂは以下であり、
ＺはＮＨであり、ｃは０である。本発明のこの態様による好ましい残基Ｒを図９Ｉ１に示す。

本発明の一態様によれば、Ｒは、（Ｌ^ａ）_３－Ｌ^ｂ－（Ｌ^ｃ）_ｃであり、ｃ＝０であり、（Ｌａ）３－Ｌｂ－（Ｌｃ）ｃであり、（Ｌ^ａ）_３－Ｌ_ｂは以下である。

本発明のこの態様による好ましい残基Ｒを図９Ｌ１及び図９Ｌ２に示す。

したがって、Ｒは、好ましくは、図９Ａ１、９Ａ２；９Ｃ１、９Ｃ２、９Ｄ１、９Ｄ２、９Ｅ１、９Ｆ１、９Ｇ１、９Ｈ１、９Ｉ１、９Ｊ１、９Ｌ１ ９Ｌ２に示される残基及びそれらの混合物、例えば９Ａ１及び９Ａ２；９Ｃ１及び９Ｃ２又は９Ｄ１及び９Ｄ２の立体異性体混合物から選択され、より好ましくはＲは、９Ｄ１、９Ｄ２に示される残基及びそれらの混合物から選択され、より好ましくはＲは、９Ｄ１及び９Ｄ２に示される残基の混合物、例えば１０：９０～９０：１０の範囲、例えば３０：７０～７０：３０の範囲、例えば４５：５５～５５：４５の範囲の９Ｄ１対９Ｄ２のモル比を有する混合物である。

したがって、化合物（Ｉ）は、好ましくは、図１０Ａ１、１０Ａ２；１０Ｃ１、１０Ｃ２、１０Ｄ１、１０Ｄ２、１０Ｅ１、１０Ｆ１、１０Ｇ１、１０Ｈ１、１０Ｉ１、１０Ｊ１、１０Ｌ１、１０Ｌ２に示される化合物及びそれらの混合物、例えば、１０Ｄ１、１０Ｄ２に示される１０Ａ１と１０Ａ２；１０Ｃ１と１０Ｃ２又は１０Ｄ１と１０Ｄ２の立体異性体混合物から選択され、より好ましくは、化合物（Ｉ）は、１０：９０～９０：１０の範囲、例えば３０：７０～７０：３０の範囲、例えば４５：５５～５５：４５の範囲の１０Ｄ１対１０Ｄ２のモル比を有する混合物などの、１０Ｄ１及び１０Ｄ２に示される化合物の混合物である。

リンカーＬ
上記式において、Ｌは、本明細書で定義されるリンカーであり、好ましくは、Ｌは、２～１０個のヌクレオシド、例えば２～５個のヌクレオシド、例えば２個のヌクレオシドを含むか、又はそれらからなるリンカーであり、任意に、ヌクレオシドはホスホジエステル結合ヌクレオシドである。

リンカーＬは、１個～１０個の連結されたヌクレオシド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～６個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～５個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～４個の連結されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは２つの連結されたヌクレオチドを含む。したがって、ヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり得る。典型的には、ヌクレオシドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して結合される。さらに、リンカーＬは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介してアンチセンス化合物に結合していてもよい。さらに、リンカーＬは、適切な官能基を介して、例えば、アミド、アミン、エーテル、エステル、ホスホジエステル（－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－Ｏ－）又はチオホスホジエステル（－Ｏ－Ｐ（＝Ｓ）（－ＯＨ）－Ｏ－）結合を介して、コンジュゲート部分Ｒに結合している。Ｌは、任意に、ＬをＲに連結する官能基とヌクレオシドとの間に、アルキル基又はアルキル－オキシ－アルキル基をさらに含んでもよいことが理解されるべきである。この場合では、ヌクレオシドは、好ましくは、ホスホジエステル結合を介してアルキル基又はアルキル－オキシ－アルキル基に連結され、これが、例えばアミド、アミン、エーテル、エステル、ホスホジエステル（－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－Ｏ－）又はチオホスホジエステル（－Ｏ－Ｐ（＝Ｓ）（－ＯＨ）－Ｏ－）結合を介してなど、適切な官能基を介してＲに連結される。
好ましい実施形態によれば、Ｌは以下である。

アンチセンス（Ａ）オリゴヌクレオチド残基
Ａは、その５’末端を介してＲに－（Ｌ）_ｎ－（Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－）_ｐを介して結合している、表６に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。好ましくは、Ａは、図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ及び図８Ａに示されるか、又は図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ及び図８．１Ａに示される残基から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。

本発明のさらなる態様によれば、Ａは、図８．１Ａに示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。

したがって、化合物（Ｉ）は、好ましくは、図１０Ａ１、１０Ａ２；１０Ｃ１、１０Ｃ２、１０Ｄ１、１０Ｄ２、１０Ｅ１、１０Ｆ１、１０Ｇ１、１０Ｈ１、１０Ｉ１、１０Ｊ１、１０Ｌ１ １０Ｌ２に示される化合物、及びそれらの混合物、例えば１０Ａ１と１０Ａ２；１０Ｃ１と１０Ｃ２又は１０Ｄ１と１０Ｄ２の立体異性体混合物から選択され、より好ましくは化合物（Ｉ）は、１０Ｄ１及び１０Ｄ２に示される化合物及びそれらの混合物から選択され、より好ましくは化合物（Ｉ）は、化合物１０Ｄ１及び１０Ｄ２の混合物であり、好ましくはＡは、表６に示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択され、好ましくはＡは、図１Ａ、２Ａ ３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ及び８Ａに示される残基から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基であり、Ｌは２～１０個のヌクレオシド、例えば２～５個のヌクレオシド、例えば２個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなるリンカーであり、任意に、ヌクレオシドはホスホジエステル結合ヌクレオシドであり、

より好ましくは、Ｌは以下である。

さらなる態様において、Ｒは、構造（Ｉ）を有する残基であり、

Ｌは、本明細書で定義されるリンカーであり、好ましくは、Ｌは、２～１０個のヌクレオシド、例えば２～５個のヌクレオシド、例えば２個のヌクレオシドを含むか、又はそれらからなるリンカーであり、任意に、ヌクレオシドはホスホジエステル結合ヌクレオシドであり、より好ましくは、Ｌは以下である。
及び
Ａは、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば表６に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本発明の一態様によれば、Ａは、図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ及び図８Ａに示されるか、又は図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ及び図８．１Ａに示される残基から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。

本発明のさらなる態様によれば、Ａは、図８．１Ａに示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド残基である。

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩及びアンモニウム塩からなる群から選択される。

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートと、リン酸緩衝生理食塩水などの薬学的に許容され得る溶媒とを含む、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的溶液を提供する。あるいは、溶媒は水又は塩化ナトリウム溶液である。

本発明は、凍結乾燥粉末の形態などの固体粉末形態の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートを提供する。

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。

本発明は、薬学的に許容され得る塩がナトリウム塩である、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩又は本発明のコンジュゲートを提供する。あるいは、塩はカリウム塩である。

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート又は本発明の塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。

本発明は、ＦＵＢＰ１を発現している標的細胞におけるＦＵＢＰ１発現を阻害するための方法であって、該細胞に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物を有効量で投与することを含む、方法を提供する。本方法は、インビボ法又はインビトロ法であり得る。

本発明は、ヒトなどの対象におけるＨＢＶ感染を処置及び／又は予防するための方法であって、治療有効量又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物を投与して、ＨＢＶ感染、例えば慢性ＨＢＶ感染及び増殖性疾患、例えばがん、特に肝細胞癌腫から選択される疾患を処置及び／又は予防することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染、例えば慢性ＨＢＶ感染の処置及び／又は予防に使用するためのものである。

本発明は、薬に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物、又は本発明の塩を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートを有効量で細胞に投与することによって、ＦＵＢＰ１を発現している標的細胞におけるＦＵＢＰ１発現を阻害する方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートを有効量で細胞に投与することによって、ＦＵＢＰ１を発現している標的細胞におけるＦＵＢＰ１発現を阻害するためのインビボ又はインビトロの方法のための方法を提供する。細胞は、ヒト細胞、例えば肝臓細胞、例えば肝細胞であってよい。一実施形態では、細胞は肝細胞癌腫細胞である。

さらなる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートを有効量で細胞に投与することによって、ＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡを減少させる方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートを有効量で細胞に投与することによって、ＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡを減少させるためのインビボ又はインビトロの方法のための方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ＨＢＶ感染、例えば慢性ＨＢＶ感染及び増殖性疾患、例えばがん、特に肝細胞癌腫からなる群から選択される疾患を処置及び／又は予防する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ＨＢＶ感染、例えば慢性ＨＢＶ感染、及び増殖性疾患、例えばがん、特に肝細胞癌腫からなる群から選択される疾患を処置及び／又は予防するための医薬の製造に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、抗ウイルス薬の製造に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、抗腫瘍薬の製造に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を提供する。

本発明は、ＨＢＶ感染、例えば慢性ＨＢＶ感染、及び増殖性疾患、例えばがん、特に肝細胞癌腫からなる群から選択される疾患の処置及び／又は予防に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を提供する。

配列表
本出願と共に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表と明細書又は図面との間に不一致がある場合、明細書（図面を含む）に開示された情報は正しいとみなされる。

ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物６＿１（配列番号６） 化合物６＿１の残基Ａ（配列番号６） ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物６＿２（配列番号６） 化合物６＿２の残基Ａ（配列番号６） ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物７＿１（配列番号７） 化合物７＿１の残基Ａ（配列番号７） ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物７＿２（配列番号７） 化合物７＿２の残基Ａ（配列番号７） ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物７＿３（配列番号７） 化合物７＿３の残基（配列番号７） ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物７＿４（配列番号７） 化合物７＿４の残基Ａ（配列番号７） ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物８＿１（配列番号８） 化合物８＿１の残基Ａ（配列番号８） ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物９＿１（配列番号９） 化合物９＿１の残基Ａ（配列番号９） ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした化合物１８＿１（配列番号１８） 化合物１８＿１の残基Ａ（配列番号１８） 図９は、例示的なＧａｌＮＡｃ部分を示す。図９Ｌの化合物Ｋは、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、ＸはＳ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号参照）。図９Ｂと図９Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。 図１０は、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。図１０Ａ－Ｄの化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図１０Ａ及び図１０Ｂの化合物において、オリゴヌクレオチドは、好ましくはリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合される。図１０Ｃ及び図１０Ｄの化合物において、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合される。図１０Ｅ－Ｊの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図１０Ｌの化合物Ｋは、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、ＹはＳ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号参照）。 図１１は、Ｈｅｌａ細胞における抗ＦＵＢＰ１化合物のインビトロ有効性の分析の結果を示す。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡレベルを正規化し、対照の％として示す。 標的結合：ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ。実施例３に記載されるように、４つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物がＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞において試験されている。各化合物を１０μＭの濃度で週に１回、３週間細胞に送達した。最後の処置の１週間後に、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ標的ＫＤを評価した。総ＲＮＡを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅロボット及びＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔを製造者のプロトコルに従って使用して細胞から抽出し、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡをＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって定量した。この図は、１０μＭで試験したオリゴを用いた陰性対照（ＮＤＣ＝１）と比較した標的ｍＲＮＡの残存発現を示す。データをヒトＧＵＳ Ｂ参照遺伝子に対して正規化し、２つの生物学的レプリケートからの平均＋ＳＤを試験した各オリゴについて報告する。５０％及び２０％のＦＣがグラフ上で強調表示されている。ＣＭＰ番号７＿３は、それぞれ１０μＭで８０％減少ｍＲＮＡ発現を有する最良のＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ ＫＤを示す。ＣＭＰ番号１８＿１は、先行技術のオリゴ（ＣＭＰ番号３５＿１及び５０＿１）と比較して、ＣＭＰ番号７＿３を有するオリゴヌクレオチドと同等に、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡの減少において最も強い効果を示す。それらは両方とも、ＮＤＣと比較して１０μＭで標的ｍＲＮＡ発現を約８０％低下させる（より詳細には実施例３を参照）。 ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートしたＣＭＰ番号７＿３及び１８＿１を有するオリゴヌクレオチドのインビボ肝臓ＰＫ／ＰＤ相関の評価を、単回投与マウス試験（Ｃｏｎｊ．＝コンジュゲート、さらなる詳細については実施例４を参照）で評価した。

定義
ＨＢＶ感染
用語「Ｂ型肝炎ウイルス感染症」又は「ＨＢＶ感染」とは、当該技術分野では一般的に知られており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、かつ肝臓に影響を及ぼす感染性疾患を指す。ＨＢＶ感染は急性感染又は慢性感染であり得る。慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ＣＨＢ）感染は、世界中で２億４８００万人に影響する世界的な疾病負荷である。年間およそ６８６，０００人の死亡は、ＨＢＶ関連末期肝疾患及び肝細胞癌腫（ＨＣＣ）に起因する（ＧＢＤ、２０１３年；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、２０１５年）。ＷＨＯは、更なる介入がなければ、ＣＨＢ感染者の数は今後４０～５０年間にわたり現在の高い水準を維持し、累積２０００万人が２０１５～２０３０年の間に死亡すると予測した（ＷＨＯ、２０１６年）。ＣＨＢ感染は特異な臨床症状を呈する同種疾患ではない。感染した個体は、生涯でＣＨＢ関連肝疾患のいくつかの段階を経て進行している。これらの病期もまた標準治療（ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｃａｒｅ：ＳＯＣ）による処置の基礎となる。現在のガイドラインでは、血清ＡＬＴレベル、ＨＢＶ ＤＮＡレベル、及び肝疾患の重症度の３つの基準に基づいて、ＣＨＢに感染した特定の個人のみを処置することを推奨している（ＥＡＳＬ、２０１７年）。この推奨は、ＳＯＣ、すなわちヌクレオシ（チ）ド類似体（ＮＡ）及びペグ化インターフェロン－α（ＰＥＧ－ＩＦＮ）が治癒的ではなく、かつ長期間投与しなければならず、それによって安全性リスクが増加するという事実による。ＮＡはＨＢＶ ＤＮＡ複製を効果的に抑制する。しかしながら、他のウイルスマーカーには非常に限られた影響しか及ぼさない／一切影響を及ぼさない。ＨＢＶ感染の２つの特徴である、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）は、ＨＢＶ治癒を目的とする新薬の主な標的である。ＣＨＢ患者の血漿中において、ＨＢｓＡｇサブウイルス（中空）粒子は、ＨＢＶビリオンを数で１０３～１０５倍上回る（Ｇａｎｅｍ＆Ｐｒｉｎｃｅ、２０１４年）。その過剰は、急性ＨＢＶ感染の消散後に観察された血清学的マーカである中和抗ＨＢｓ抗体を発現できない個体を含む、該疾患の免疫病理発生に寄与すると考えられている。

いくつかの実施形態では、「ＨＢＶ感染」という用語は、「慢性ＨＢＶ感染」を指す。

さらに、この用語は、任意のＨＢＶ遺伝子型による感染を包含する。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ａに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃに感染している（これは、実施例セクションの実施例３において試験された）。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｈに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｉに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｊに感染している。
ｃｃｃＤＮＡ（共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ）

ｃｃｃＤＮＡは感染した肝細胞の核に存在するウイルスの遺伝的鋳型であり、増殖性感染に必要な全てのＨＢＶ ＲＮＡ転写物を生じ、慢性ＨＢＶ感染の自然経過中のウイルス持続に関与する（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ＆Ｚｏｕｌｉｍ（２０１０年）「Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ．」第１５巻補遺、第３号、第３～１４頁、ｄｏｉ：１０．３８５１／ＩＭＰ１６１９）。ｃｃｃＤＮＡはウイルスのリザーバとして作用し、処置中止後のウイルスリバウンド源であって、長期の、時として生涯の処置を必要とする。ＰＥＧ－ＩＦＮは、その種々の副作用に起因して、ＣＨＢの小サブセットにしか投与できない。

したがって、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの分解又は除去により定義される完全治癒をＣＨＢ患者の大部分にもたらすことができる新規の治療法が、強く必要とされている。

化合物
本明細書では、用語「化合物」とは、ＦＵＢＰ１の発現又は活性を阻害することができる任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子、又はこのような核酸分子を含む任意のコンジュゲートである。例えば、本明細書において、化合物は、ＦＵＢＰ１を標的とする核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。

オリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称されうる。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列又は順序、若しくはその修飾が言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、通常は精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）又は相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。

いくつかの実施形態では、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオシドを含まなくてもよい。

有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。さらに、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。

連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシドが連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、任意に、更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基（例えば、コンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、連続ヌクレオチド配列を構成である。

ヌクレオチド及びヌクレオシド
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「単位」又は「モノマー」と呼ぶことができる。

修飾ヌクレオシド
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの１つ以上は、修飾された糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語はまた、「ヌクレオシド類似体」又は修飾「ユニット」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。

修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合又は１つ又は複数のホスホロジチオエートのヌクレオシド間結合のような、１つ又は複数の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオアートである。

いくつかの有利な実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。

ホスホロチオエート結合は、例えば以下に示すように、種々の互変異性形態で存在し得る。

欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエート以外）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なっていてもよいが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能する修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｄ）に変えることにより修飾される。

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示されてもよく、ここで、各文字は、任意に等価機能の改変された核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

修飾オリゴヌクレオチド
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。

相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。

用語「％相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

ハイブリダイゼーション
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」「ハイブリダイズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」又は「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔ_ｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔ_ｍは、親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）と関連付けられており、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃での反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．に記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用することによって、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５に記載の最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いて、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載される適切に得られる熱力学的パラメータを使用し、数値的に推定し得る。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０から－６０ｋｃａｌ、例えば－１２から－４０、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ、又は－１６から－２７ｋｃａｌ、例えば－１８から－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。

標的
本明細書で使用される「標的」という用語は、「ＦＵＢＰ１」又は「ＦＢＰ」又は「ＦＵＢＰ」又は「ｈＤＨ Ｖ」としても知られる哺乳動物タンパク質Ｆａｒ Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｅｌｅｍｅｎｔ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １」を指す。ホモ・サピエンスのＦＵＢＰ１遺伝子は、第１番染色体、７７９４４０５５．．７７９７９４３５、相補体（ＮＣ＿０００００１．１１、遺伝子番号１４６２）に位置する。ＦＵＢＰ１遺伝子は、ｃ－ｍｙｃのｆａｒ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｅｌｅｍｅｎｔを活性化し、未分化細胞におけるｃ－ｍｙｃの発現を刺激するｓｓＤＮＡ結合タンパク質をコードする。ＦＵＢＰによるＦＵＳＥの調節は、非コード鎖へのＦＵＢＰの一本鎖結合によって起こる。ＦＵＢＰ１タンパク質は、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼ活性を有する。ヒトＦＵＢＰ１のアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、ＵｎｉＰｒｏｔによって評価することができ、例えば、ヒトＦＵＢＰ１についてはＵｎｉＰｒｏｔエントリーＱ９６ＡＥ４を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる）。

標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＦＵＢＰ１標的核酸と称することができる。

適切には、標的核酸は、ＦＵＢＰ１Ｆタンパク質、特に、本明細書で配列番号１、２及び／又は３として提供されるプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ配列をコードするヒトＦＵＢＰ１遺伝子などの哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする。配列番号１は、ヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡの配列である。配列番号２及び３は、ヒトＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡの配列である。
表３は、配列番号１の予測エクソン及びイントロン領域を列挙する。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、カニクイザルのＦＵＢＰ１核酸、例えばｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡであり得る。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、マウスのＦＵＢＰ１核酸、例えばｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡであり得る。

表４は、ヒト、カニクイザル及びマウスのＦＵＢＰ１のゲノム配列に関する概要を提供する。表５は、ヒト、サル及びマウスのＦＵＢＰ１のプレｍＲＮＡ配列、並びにヒトＦＵＢＰ１の成熟ｍＲＮＡの概要を提供する。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、２、３、４、及び／又は５、又はその天然に存在するバリアント（例えば、哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする配列）からなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、２及び／又は３、又はその天然に存在するバリアント（例えば、哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする配列）からなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１及び４及び５、又はその天然に存在するバリアント（例えば、哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする配列）からなる群より選択される。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。

インビボ又はインビトロでの適用のために、本発明の治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＦＵＢＰ１標的核酸を発現している細胞内のＦＵＢＰ１標的核酸の発現を阻害することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、任意に、１つ又は２つのミスマッチを除いて、また任意に、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチドを除いて、ＦＵＢＰ１標的核酸の保存領域に相補的である。

標的核酸は、ヒトＦＵＢＰ１などの哺乳動物ＦＵＢＰ１タンパク質、例えば配列番号１として開示されているものなどのヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ配列、配列番号４として開示されているものなどのカニクイザルＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ配列、又は配列番号５として開示されているものなどのマウスＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ配列、又は配列番号２及び３として開示されているヒト成熟ｍＲＮＡなどの成熟ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡをコードするプレｍＲＮＡなどのメッセンジャーＲＮＡであり得る。配列番号１～５、１０、１１、１５及び１９はＤＮＡ配列である。標的ＲＮＡ配列は、チミジン塩基（Ｔ）の代わりに、ウラシル（Ｕ）塩基を有することが理解されよう。

例示的な標的核酸に関するさらなる情報は、表５に提供される。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号２である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号３である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号４である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号５である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、２及び／又は３である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１及び／又は４である。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトとカニクイザルの両方のＦＵＢＰ１を標的とし得る。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１及び／又は５である。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト及びマウスの両方のＦＵＢＰ１を標的とする。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、４及び／又は５である。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト、カニクイザル及びマウスのＦＵＢＰ１を標的とし得る。

標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸分子に相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列（すなわち、部分配列）に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。

一実施形態では、標的配列は、ヒトＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡのエクソン１４内の領域である（上記の表３参照）。

別の実施形態では、標的配列は、ヒトＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡのエクソン２０内の領域である（上記の表３参照）。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸上の領域、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明のオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る、ヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ（参照として配列番号１を使用する）の領域により定義される標的配列が、本明細書において以下に提供される。

本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的な、又はその核酸にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列、例えば標的核酸のサブ配列、例えば本明細書で記載される標的配列を含む。

オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に存在する標的配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。連続ヌクレオチド配列（したがって、標的配列）は、少なくとも１２個の連続ヌクレオチド、例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチド、例えば１４～２０個、例えば１４～１８個の連続ヌクレオチドを含む。

標的配列領域
本発明者らは、本発明のオリゴヌクレオチドによって標的化され得る、ＦＵＢＰ１標的核酸の特に有効な配列を同定した。

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号１０である。

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号１１である。

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号１５である。

いくつかの実施形態では、標的配列は配列番号１９である。

配列番号１０：ＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＡＧ
配列番号１１：ＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＡＧ
配列番号１５：ＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡ
配列番号１９：ＧＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＴＧＧＴ
配列番号１０、１１、１５及び１９はＤＮＡ配列である。標的ＲＮＡ配列は、チミジン塩基（Ｔ）の代わりに、ウラシル（Ｕ）塩基を有することが理解されよう。

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８４～１６２００までの領域である。

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８６～１６２０３までの領域である。

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８８～１６２０５までの領域である。

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８９～１６２０５までの領域である。

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド３０５３６～３０５５３までの領域である。

標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えば、サル細胞若しくはヒト細胞である。

典型的には、標的細胞は、ＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ又はＦＵＢＰ１成熟ｍＲＮＡなどのＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡを発現する。例えば、標的細胞は、ヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ、例えば配列番号１、又はエクソン１４（又はエクソン２０）を含むヒトＦＵＢＰ１成熟ｍＲＮＡ、例えば配列番号２又は３）を発現する。実験的評価のために、標的配列を含む核酸を発現する標的細胞が使用され得る。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では考慮されない。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、例えばインビボ又はインビトロのいずれかで、ＦＵＢＰ１標的核酸を発現している標的細胞におけるＦＵＢＰ１標的核酸の発現を阻害することができる。

更に、標的細胞は肝細胞であってもよい。一実施形態では、標的細胞は、ＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞であり、ＨＢＶ感染個体に由来するか、又はヒト化肝臓を有するＨＢＶに感染したマウス（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ、ＰＸＢマウス）に由来するかのいずれかである。

一実施形態では、標的細胞はＨＢＶに感染し得る。更に、標的細胞は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含み得る。したがって、標的細胞は、ＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ又はＦＵＢＰ１成熟ｍＲＮＡなどのＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ及びＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含むことが好ましい。

さらに、標的細胞は、肝細胞癌腫細胞などの癌細胞であってもよい。

天然に存在するバリアント
用語「天然に存在するバリアント」は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＦＵＢＰ１遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。

いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物ＦＵＢＰ１標的核酸、例えば配列番号１、２、３、４、又は５からなる群から選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態において、天然に存在するバリアントは、配列番号１のヒトＦＵＢＰ１標的核酸に対して少なくとも９９％の相同性を有する。

発現の阻害
本明細書で使用される「発現の阻害」という用語は、標的細胞におけるＦＵＢＰ１の量又は活性を阻害するオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。活性の阻害は、ＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ若しくはＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、又は細胞中のＦＵＢＰ１若しくはＦＵＢＰ１活性のレベルを測定することによって決定することができる。したがって、発現の阻害をインビトロ又はインビボで決定することができる。

典型的には、発現の阻害は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に投与することによる活性の阻害を比較し、そのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与せずに標的細胞から得られた参照レベル（対照実験）又は既知の参照レベル（例えば、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前の発現レベル、又は所定若しくは他の公知の発現レベル）と比較することによって決定される。

例えば、対照実験は、動物若しくはヒト、又は食塩水組成物若しくは参照オリゴヌクレオチド（多くの場合、スクランブル対照）で処理した標的細胞であり得る。

「阻害」又は「阻害する」という用語は、ＦＵＢＰ１の発現を下方調節する、減少させる、抑制する、減らす、低下させるとも呼ばれ得る。

発現の阻害は、例えばプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの分解（例えば、ＲＮアーゼＨ動員オリゴヌクレオチド、例えばギャップマーを使用する）によって起こり得る。

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド中に組み込まれた場合に、例えば、融解温度（Ｔｍ）によって測定された、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較して、糖部分が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含みうる。
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。

そのような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、又は典型的には、リボース環上のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル（ｂｉｒａｄｉｃｌｅ）架橋を有する（ＬＮＡ）二環式環、又は典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、又はリボース環の２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）ヌクレオシドである。

実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、高められた結合親和性及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、幾つかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。

本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。

ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、上記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定されうる。

非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６、国際公開第００／６６６０４、国際公開第９８／０３９３５２、国際公開第２００４／０４６１６０、国際公開第００／０４７５９９、国際公開第２００７／１３４１８１、国際公開第２０１０／０７７５７８、国際公開第２０１０／０３６６９８、国際公開第２００７／０９００７１、国際公開第２００９／００６４７８、国際公開第２０１１／１５６２０２、国際公開第２００８／１５４４０１、国際公開第２００９／０６７６４７、国際公開第２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。さらに非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドがスキーム１に開示されている。
スキーム１：

特定のＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。特定の有利なＬＮＡは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。

ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成するときに、そのような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能することができ、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはＲＮアーゼＨなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介機構を介して作用するオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には少なくとも５個又は６個の連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマーが片側又は両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。

ＲＮａｓｅ Ｈの活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮアーゼＨを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員し得ると見なされる。ＲＨａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１）から入手できる。

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーオリゴヌクレオチド又はギャップマー設計とも称され得る。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介した標的核酸の阻害に用いられる。ギャップマー型オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの別個の構造領域、５’－フランク、ギャップ及び３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’→３’方向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）が隣接する。領域Ｆ及びＦ’の１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる（すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。

ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’及び３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ、５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、即ち５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。

領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。いくつかの実施形態では、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域のヌクレオシド間の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１５～２０、例えば１６～１８ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、全長は１７個のヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、全長は１７個のヌクレオシドである。

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_７－１６－Ｆ’_２－８、又は
Ｆ_４－８－Ｇ_７－１２－Ｆ’_２－８、又は
Ｆ_４－６－Ｇ_７－１１－Ｆ’_２－６
ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

一実施形態では、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ_４－６－Ｇ_７－１１－Ｆ’_２－６
好ましくは、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１６ヌクレオチド、例えば１７又は１８ヌクレオチドである。

本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるか又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’は独立して１～８個のヌクレオシドを含み、そのうち１～４個は２’糖修飾され、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を規定し、ＧはＲＮａｓｅＨを動員することが可能な６～１６個のヌクレオシドの領域、例えば７～１２個のヌクレオシドの領域である。
いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全ての修飾ヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである。さらに、領域Ｆ若しくはＦ’、又は、Ｆ及びＦ’は、任意に、ＤＮＡヌクレオシドを含む。任意に、フランキング領域Ｆ若しくはＦ’、又は両方のフランキング領域Ｆ及びＦ’は、１つ又は複数のＤＮＡヌクレオシド（交互フランク、より詳細については交互フランクの定義を参照されたい。）を含み得る。

領域Ｆ、Ｇ、及びＦ’は、さらに以下に定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式に組み込むことができる。

ギャップマー－領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞性酵素である。好適には、ギャップマーは、少なくとも５又は６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５～１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６～１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有し得る。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６連続するＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。

いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、７個などの、１２個以下の連続ＤＮＡヌクレオシドからなり得る。８．９個、１０個又は１１個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば９個、１０個又は１１個の連続ＤＮＡヌクレオシド。

ギャップ領域内の１つ以上のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、いくつかの場合、メチル化され得る（例えば、ＤＮＡ ｃにＤＮＡ ｇが続く場合）。そのような残基は、いずれも５－メチル－シトシン（^ｍｅＣ）として注釈が付けられている。いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個の連続するホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。

いくつかの実施形態では、ギャップ内のすべてのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である。

ギャップマー－フランキング領域、Ｆ及びＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆは、１～８連続ヌクレオチド長、例えば２～６、例えば４～６連続ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、領域Ｆの長さは４個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの長さは５個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの長さは６個の連続ヌクレオチドである。

有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、１～８連続ヌクレオチド長、例えば２～６、例えば２～５連続ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の長さは２個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の長さは３個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の長さは４個の連続ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の長さは５個の連続ヌクレオチドである。

有利には、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆの長さが１である場合、それは有利なことには、ＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。さらに、領域Ｆ及び／又はＦ’の長さが２である場合、領域Ｆ及び／又はＦ’の両方のヌクレオシドは、有利にはＬＮＡヌクレオシドであることに留意されたい。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’における糖修飾ヌクレオシドは、１タイプのみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、又はβ－Ｄ－オキシＬＮＡのみ、又はＳｃＥＴのみからなる。このような設計は、均一フランク又は均一ギャップマー設計とも称される。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’の全ヌクレオシドは、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドなどのＬＮＡヌクレオシドである。代替的な実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全ての糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ若しくはＦ’、又は領域Ｆ及びＦ’の両方は、ＤＮＡヌクレオシド（交互フランク、詳細についてはこれらの定義を参照されたい）を含み得る。

幾つかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の最５’及び最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合及び／又は領域Ｆ’と領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。幾つかの実施形態では、領域Ｆ又はＦ’、Ｆ及びＦ’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方に、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方に、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。

いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］_１－５であり、式中、領域Ｇは、ＲＮアーゼＨを動員することができる連続ＤＮＡヌクレオシドの領域であるか、又はそれを含む。

ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］_１－８－［領域Ｇ］_５－１６－［ＭＯＥ］_１－８、例えば［ＭＯＥ］_２－７－［領域Ｇ］_６－１４－［ＭＯＥ］_２－７、例えば［ＭＯＥ］_３－６－［領域Ｇ］_８－１２－［ＭＯＥ］_３－６のものであり、ここで、領域Ｇはギャップマーの定義に規定した通りである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。

混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、１つ又は複数のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。

交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡとＤＮＡヌクレオシドの両方を含んでよく、それらはＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互のモチーフを含むことから、「交互フランク」と呼ばれる。少なくとも１つの交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。したがって、「交互フランクギャップマー」は、フランクの少なくとも一方（Ｆ又はＦ’）がＬＮＡヌクレオシドに加えて１つ又は複数のＤＮＡヌクレオチドを含む、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、フランキング領域Ｆ又はＦ’、若しくはＦ及びＦ’の両方が少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。交互フランクＬＮＡギャップマーは、国際公開第ＷＯ２０１６／１２７００２号に開示されている。

交互フランク領域は、最大３の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば、１から２、若しくは１又は２又は３の連続ＤＮＡヌクレオシドを含み得る。

交互フランク領域は、ＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）の数とそれに続くＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）の数を表す一連の整数、例えば［Ｌ］_１－３－［Ｄ］_１－３－［Ｌ］_１－３ 又は［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_{１－２として注釈を付けることができる。}オリゴヌクレオチド設計では、これらは、２－２－１が５’［Ｌ］_２－［Ｄ］_２－［Ｌ］３’を表し、１－１－１－１－１が５’［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］３’を表すような数として表されることが多い。交互フランクを有するオリゴヌクレオチド内のフランク（領域Ｆ及びＦ’）の長さは、これらの領域について本明細書で上述したように、例えば４～８、例えば５～６個のヌクレオシド、例えば４、５、６又は７個の修飾ヌクレオシドであり得る。追加のエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利であり得る。

一実施形態では、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ_４－６－Ｇ_７－１１－Ｆ’_２－６、
式中、Ｆは、［Ｌ］_１－３－［Ｄ］_１－３－［Ｌ］_１－３の設計を有し、Ｆ’は、［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_２－４、又は［Ｌ］_２－６の設計を有する。

ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１６ヌクレオチド、例えば１７又は１８ヌクレオチド長であることを条件とする。

したがって、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの交互フランクを含み得る。典型的には、少なくともＦ領域は、交互フランクである。いくつかの実施形態では、Ｆ領域とＦ’領域の両方が交互フランクである。いくつかの実施形態では、Ｆ領域は交互フランクであり、Ｆ’領域は均一なフランクである（すなわち、Ｆ’は、β－Ｄ－オキシＬＮＡのみなどの１種類のみの糖修飾ヌクレオシドからなる）。

いくつかの実施形態では、領域Ｆの設計は、３－２－１（すなわちＬＬＬＤＤＬ）、３－１－１（すなわちＬＬＬＤＬ）、２－１－２（ＬＬＤＬＬ）、２－１－１（ＬＬＤＬ）及び１－３－１（すなわちＬＤＤＤＬ）の設計から選択される。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の設計は、１－１－３（すなわちＬＤＬＬＬ）又は１－１－２（すなわちＬＤＬＬ）である。いくつかの実施形態では、領域Ｆの設計は、ＬＬ、ＬＬＬ又はＬＬＬＬである。

オリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’、並びにさらに５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか、又はそれからなり得る。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ’’と称され得る。

領域Ｄ’又はＤ’’の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分又は別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連結に用いられる場合、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、若しくは合成又は製造を容易にするために使用されてもよい。

領域Ｄ’及びＤ’’は、各々、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、又はＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの糖修飾ヌクレオチドではなく、若しくはこれらの塩基修飾バージョンでもない。Ｄ’又はＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第ＷＯ２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。

一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。

幾つかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特に_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８、例えばＦ_４－６－Ｇ_７－１１－Ｆ’_２－６
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８、例えばＤ’_１－３－Ｆ_４－６－Ｇ_７－１１－Ｆ’_２－６
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３。
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

コンジュゲート
本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。

オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成については、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｄ．，Ｃｈ．１６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１及びＭａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３の包括的なレビューでも報告されている。

いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、又はそれらの組合せからなる群より選択される。

例示的なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができるものを含む。特に、三価Ｎ－アセチルガラクトサミンのコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、国際公開第２０１４／２０７２３２号、及び国際公開第２０１４／１７９６２０号を参照されたい。そのようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取り込みを増強するのに役立つ。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１４３３７９号に開示されているような、トランスフェリン受容体に対して特異的親和性を有する抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分は、抗体又は抗体断片、例えば血液脳関門を通る送達を促進する抗体又は抗体断片、特にトランスフェリン受容体を標的とする抗体又は抗体断片である。

リンカー
結合又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基又はセグメントを目的の別の化学基又はセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。

本発明の幾つかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含みうる。

生体切断可能なリンカー（領域Ｂ）は、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、又はそれからなる。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化又は還元条件、若しくは薬剤などの化学条件、並びに哺乳動物の細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。いくつかの実施形態では、生理学的に不安定なリンカー（生物切断性）は、１個～１０個の連結されたヌクレオシド、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～６個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～５個の連結されたヌクレオシド、例えば２個～４個の連結されたヌクレオシドを含み、少なくとも２個の連続する連結は生体切断可能であり、例えばホスホジエステル連結、例えば少なくとも３個又は４個又は５個の連続するホスホジエステル連結である。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡ又はＲＮＡである。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間のリンカーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の５’又は３’末端に少なくとも２個の連続するホスホジエステル結合を含む２～５個の連続するホスホジエステル結合ヌクレオシドで構成される生理学的に不安定なリンカーである。

いくつかの実施形態では、生理学的に不安定なリンカーは、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ又はＧＧからなる群から選択される配列を有するＤＮＡジヌクレオチドを含むか又はそれからなり、２つのＤＮＡヌクレオシドの間にホスホジエステル結合が存在し、少なくとも１つのさらなるホスホジエステルが、核酸分子のオリゴヌクレオチドをジヌクレオチドに連結するか又はコンジュゲート部分をジヌクレオチドに連結するジヌクレオチドの５’又は３’末端に存在する。例えば、リンカーはＣＡジヌクレオチドによるものであり得る。いくつかの実施形態では、生理学的に不安定なリンカーは、配列ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＴＡＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＴＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＡＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＧＡ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＣＡＧ、ＧＴＡ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＧＡ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、又はＧＧＧを含むか又はそれからなり、ＤＮＡヌクレオシドの間にホスホジエステル結合が存在し、トリヌクレオチドの５’又は３’末端にさらなるホスホジエステルが潜在的に存在する。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、ＷＯ２０１４／０７６１９５（参照により本明細書に組み込まれる）においてより詳細に記載されている。生体切断可能なリンカーを有するコンジュゲート化合物では、標準と比較した場合、コンジュゲート部分の少なくとも約５０％がオリゴヌクレオチドから切断され、例えば、少なくとも約６０％が切断され、例えば、少なくとも約７０％が切断され、例えば、少なくとも約８０％が切断され、例えば、少なくとも約８５％が切断され、例えば、少なくとも約９０％が切断され、例えば、コンジュゲート部分の少なくとも約９５％がオリゴヌクレオチドから切断される。

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造又はオリゴマーを含み得る。

本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。

薬学的に許容され得る塩
用語「薬学的に許容され得る塩」は、生物学的に又はそれ以外の点で望ましくないものではない、遊離塩基又は遊離酸の生物学的な有効性及び特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、並びに、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基又は有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウムの塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物は、双性イオンの形態で存在することもあり得る。特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容され得る塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、及びメタンスルホン酸の塩である。

処置
本明細書で使用される「処置」、「処置すること」、「処置する」などの用語は、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的又は完全に治癒するという点で治療的である。本明細書で使用される「処置」という用語は、対象における疾患の任意の処置を包含し、以下を含む：（ａ）疾患を阻害すること；又は（ｂ）疾患を改善（すなわち緩和）すること、すなわち疾患の退縮を引き起こすこと。ＨＢＶ感染を改善及び／又は阻害する化合物は、ＨＢＶ感染を処置する化合物である。好ましくは、本明細書で使用される「処置」という用語は、既に定義され顕在化したＨＢＶ感染又はがんの処置のような、既に顕在化した障害の医学的介入に関する。

予防
本明細書において、用語「予防すること」、「予防」、又は「予防する」とは、予防的処置、すなわち、その目的が疾患を治癒することよりむしろ予防することである、測定又は手段に関する。予防とは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果が、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという観点から、予防的に得られることを意味する。したがって、本明細書における「ＨＢＶ感染予防」とは、対象におけるＨＢＶ感染の発生を予防すること、及びＨＢＶ感染の症状の発生を予防することを含む。本発明では、特に、ＨＢＶに感染した母親からの小児におけるＨＢＶ感染の予防が企図される。また、急性ＨＢＶ感染が慢性ＨＢＶ感染に変化することを防ぐことも企図される。

患者
本発明の目的について、「対象」又は「患者」は、脊椎動物であり得る。本発明に関連して、用語「対象」は、ヒト及び他の動物、特に哺乳動物と、他の生物との両方を含む。したがって、本明細書に提供される手段及び方法は、ヒト治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。したがって、本明細書では、対象は、マウス、ラット、ハムスタ、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、又は霊長類などの動物であり得る。好ましくは、対象は、哺乳動物である。より好ましくは、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、患者は、ＨＢＶ感染又はがんなどの本明細書で言及される疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、患者は前記疾患にかかりやすい。

本発明の一態様は、ＨＢＶ感染、例えば慢性ＨＢＶ感染及び増殖性疾患、例えばがん、特に肝細胞癌腫からなる群から選択される疾患の処置及び／又は予防に使用するための、ＦＵＢＰ１を標的とする増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートである。

本発明の一実施形態は、ＨＢＶ感染細胞などの感染細胞において、ｃｃｃＤＮＡなどのＨＢＶ ＤＮＡ及びｐｇＲＮＡなどのＨＢＶ ＲＮＡ転写物を減少させることができる、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートである。

さらなる実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＨＢＶ感染個体においてインビボでＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇを減少させることができる。

本発明の別の態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、特に慢性ＨＢＶ感染の処置及び／若しくは予防、又はＦＵＢＰ１が過剰発現しているがんの処置における本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの使用である。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＦＵＢＰ１転写物を標的とすることができ、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を介してその分解を促進することができるので、潜在的に優れたＦＵＢＰ１阻害剤である。

本発明の一態様は、ＨＢＶ感染の処置及び／若しくは予防、又はがんの処置に使用するための増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートである。

本セクションは、ＨＢＶ感染の処置及び／若しくは予防、又はがんの処置に使用するのに適した増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートを記載する。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、インビトロ及びインビボでＦＵＢＰ１の発現を阻害することができる。阻害は、ＦＵＢＰ１をコードする又はＦＵＢＰ１の調節に関与する標的核酸に、アンチセンスオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより達成される。標的核酸は、配列番号１、２、３、４、及び／又は５からなる群から選択される配列といった、哺乳動物ＦＵＢＰ１配列であることができる。

したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＦＵＢＰ１を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、標的の発現を阻害又はダウンレギュレートすることにより調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＰＸＢ－ＰＨＨ細胞において２５μＭを使用して、インビトロで少なくとも５０％又は６０％、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡの発現レベルを阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、ＰＸＢ－ＰＨＨ細胞において２５μＭを使用して、インビトロで少なくとも５０％のＦＵＢＰ１タンパク質の発現レベルを阻害することができ、この範囲の標的減少は、ｃｃｃＤＮＡ減少との良好な相関を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択する点で有利である。適切には、実施例は、ＦＵＢＰ１ ＲＮＡ阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する（例えば、実施例１又は２）。標的阻害は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＦＵＢＰ１発現の所望の阻害を示すのに尚充分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。

本発明の一態様は、配列番号１の１６１８４～１６２００、１６１８６～１６２０３、１６１８８～１６２０５及び１６１８９～１６２０５から選択される標的配列などのヌクレオチド１６１８４～１６２０５からの標的配列と、少なくとも９０％の相補性、例えば１００％の相補性を有する、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば１４、１５、１６又は１７ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１２～３０、例えば１２～２２、例えば１６～２０ヌクレオチド長の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。特に、ＦＵＢＰ１の発現を阻害することができる、すなわち、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡなどのＦＵＢＰ１核酸を減少させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の一部と考えられる。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１２～２２ヌクレオチド、例えば１５～２０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１５～１８ヌクレオチド、例えば１７～１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１８の標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１５～１８ヌクレオチド、例えば１７～１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１の以下の領域：配列番号１の１６１８４～１６２０５、１６１８４～１６２００、１６１８６～１６２０３、１６１８８～１６２０５及び１６１８９～１６２０５から選択される標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１５～２２ヌクレオチド、例えば１５～１８ヌクレオチド、例えば１７又は１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。さらにそれは、配列番号１の以下の領域：３０５３６－３０５５３から選択される標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば完全な相補性を有する、１５～２２ヌクレオチド、例えば１５～１８ヌクレオチド、例えば１７又は１８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸又は標的配列の領域と、少なくとも９０％相補的であり、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）である場合、又はいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含み得る場合に有利である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１の対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１及び配列番号４の標的核酸に対して少なくとも９５％相補性、例えば完全に（又は１００％）相補的である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１に存在する対応する標的配列に対して少なくとも９０％相補的であり、例えば１００％の相補性を有する１５～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、標的配列は、配列番号１のヌクレオチド１６１８４～１６２０５、１６１８４～１６２００、１６１８６～１６２０３、１６１８８～１６２０５、１６１８９～１６２０５及び３０５３６～３０５５３から選択される。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１０の標的部位配列に対して少なくとも９０％相補的であり、有利には１００％相補的である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１１の標的部位配列に対して少なくとも９０％相補的であり、有利には１００％相補的である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１５の標的部位配列に対して少なくとも９０％相補的であり、有利には１００％相補的である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１９の標的部位配列に対して少なくとも９０％相補的であり、有利には１００％相補的である。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号６、７、８、９及び１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、又はその少なくとも１４個の連続ヌクレオチド、例えばその１７個又は１８個の連続ヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、例えば１２～２５、例えば１１～２２、例えば１２～２０、例えば１４～１８又は１６～１８連続ヌクレオチド長を含み、又はそれからなる。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下、又は１８以下のヌクレオチドを含むか又はそれからなる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、１４、１５、１６又は１７個のヌクレオチドを含み得る。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、オリゴヌクレオチドが１０～３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチド及び３０ヌクレオチドの両方が含まれる。

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号９に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２～２４ヌクレオチド長、例えば１２～１８ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１８に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個又は１８個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチド長、例えば１６、１７、又は１８個の連続ヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６、７、８、９及び１８から選択される配列を含むか、又はそれからなる。

有利な実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、例えば１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシド（複数可）の１つ又は複数がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。

有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の最も３’側のヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシドである。

有利には、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートなどの少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロジチオエートヌクレオシド間結合である。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。

いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列内のすべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

本発明の有利な実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーである。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるか、又はそれを含む。

いくつかの実施形態では、領域Ｇは、６～１６個のＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１２個のＤＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、領域Ｆは４～６個のヌクレオシドを含み、及び／又は、領域Ｆ’は２～６個のヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’はそれぞれ、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。

本発明のオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、すべてのＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、均一フランクを有するＬＮＡギャップマーである。

本発明のいくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、交互フランクＬＮＡギャップマーである。いくつかの実施形態では、交互フランクＬＮＡギャップマーは、少なくとも１つの交互フランク（フランクＦなど）を含む。いくつかの実施形態では、交互フランクＬＮＡギャップマーは、１つの交互フランク（フランクＦなど）及び１つの均一フランク（フランクＦ’など）を含む。いくつかの実施形態では、交互フランクＬＮＡギャップマーは、２つの交互フランクを含む。例えば、ＬＮＡギャップマーは、以下の設計から選択された設計を有することができる。３－２－１－９－２、３－１－１－１０－２、２－１－２－１０－３、２－１－１－１１－３、２－１－１－１０－１－１－２、２－１－１－１０－４、１－３－１－７－１－１－３、及び３－２－１－９－３．あるいは、ＬＮＡギャップマーは、以下の設計を有し得る：１－１－３－９－１－１－２。

表６は、各モチーフ配列の好ましい設計を列挙している。

本発明は、以下のオリゴヌクレオチド化合物を提供する（表６）：

表中の見出し「オリゴヌクレオチド化合物」とは、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、すべてのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。「設計」という見出しは、ギャップマー設計、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を指す。交互フランク設計のギャップマーでは、オリゴヌクレオチドのフランクは一連の整数として注釈が付けられ、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）の数とそれに続くＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）の数を表す。例えば、２－２－１モチーフを有するフランクは、ＬＬＤＤＬを表す。両方のフランクは５’末端及び３’末端にβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを有する。ギャップ領域（Ｇ）は、フランクの間に位置するいくつかのＤＮＡヌクレオシドで構成されている。

本発明のいくつかの実施形態について、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号６＿１、６＿２、７＿１、７＿２、７＿３、７＿４；８＿１及び９＿１を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される（表６参照）。例えば、化合物は、ＣＭＰ番号７＿３を有する化合物であり得る。

代替的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号１８＿１を有する化合物のオリゴヌクレオチドである（表６参照）。

全ての場合において、Ｆ－Ｇ－Ｆ’設計は、「オリゴヌクレオチド中の領域Ｄ’又はＤ’’」の「定義」セクションに記載されるように、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を更に含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマー領域の５’末端又は３’末端、例えば５’末端に、１、２、又は３個のホスホジエステル結合ヌクレオシド単位、例えばＤＮＡ単位を有する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２つの５’ホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドと、続いて上記に定義したＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域と、からなる。５’末端又は３’末端にホスホジエステル結合されたＤＮＡ単位を含むオリゴヌクレオチドは、コンジュゲーションに好適であり、本明細書に記載されるようなコンジュゲート部分を更に含み得る。肝臓への送達では、ＡＳＧＰＲ標的化部分は、コンジュゲート部分として特に有利である。さらなる詳細についてはコンジュゲート部分を参照されたい。

コンジュゲート
ＨＢＶ感染は主に肝臓内の肝細胞に影響を及ぼすので、本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、非コンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して肝臓へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を増加させるコンジュゲート部分にコンジュゲートすることが有利である。一実施形態では、肝臓標的化部分は、コレステロール若しくは他の脂質を含む部分、又はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合し得るコンジュゲート部分から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明は、コンジュゲート部分に共有結合した本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供する。

アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）コンジュゲート部分は、ガラクトースと同等以上の親和性でアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＲ標的化部分）に結合することができる、１つ以上の炭水化物部分を含む。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が研究されており（例えば、Ｊｏｂｓｔ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｋ．ＪＢ．Ｃ．１９９６，２７１，６６８６を参照）、又は当技術分野で典型的な方法を用いて容易に決定される。

一実施形態では、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群より選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。

ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分を生成するために、ＡＳＰＧＲ標的化部分（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ）をコンジュゲート足場に付着させることができる。一般に、ＡＳＰＧＲ標的化部分は、足場の同じ末端にあり得る。一実施形態では、コンジュゲート部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合され得るブランチャー分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を結合するスペーサーに結合された、２～４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分からなる。

さらなる実施形態では、コンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、又は四価である。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。

ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分としては、例えば、国際公開第２０１４／１７９６２０号及び同第２０１６／０５５６０１号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９０８０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、並びに、Ｔｙｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３などのＧａｌＮＡｃ部分が結合した小さなペプチド；肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合するグリコトリペプチド、例えば、Ｄｕｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０００，３１３，２９７；リシン系ガラクトースクラスター（例えば、Ｌ３Ｇ４；Ｂｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９９，２１４）；及びコラン系ガラクトースクラスター（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体に対する炭水化物認識モチーフ）を挙げることができる。

ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分、特に三価ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分は、当該技術分野で公知の方法を用いてオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端に結合することができる。一実施形態では、ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。

一実施形態では、コンジュゲート部分は、図９Ａ１、９Ａ２；９Ｃ１、９Ｃ２、９Ｄ１、９Ｄ２、９Ｅ１、９Ｆ１、９Ｇ１、９Ｈ１、９Ｉ１、９Ｊ１、９Ｌ１及び９Ｌ２に示すものなどの三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であるか、又は、コンジュゲート部分は、９Ａ１と９Ａ２の混合物；９Ｃ１と９Ｃ２の混合物又は９Ｄ１と９Ｄ２の混合物、特に、図９Ｄ１又は９Ｄ２に示される三価Ｎアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はその混合物である。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下からなる群から選択される。
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓＴ_ｓａ_ｓｔ_ｓＧ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓＴ_ｓａ_ｓＴ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓＡ_ｓＴ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓＧ_ｓｇ_ｓＴ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓＧ_ｓＧ_ｓＴ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ Ｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓＴ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｇ_ｓｔ_ｓＴ_ｓｔ_ｓ ^ｍＣ_ｓＡ_ｓ ^ｍＣ、及び
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ Ｔ_ｓＡ_ｓＴ_ｓｇ_ｓｃ_ｓＴ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｇ_ｓｔ_ｓＴ_ｓＴ_ｓ ^ｍＣ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ Ａ_Ｓｃ_Ｓ ^ｍＣ_ＳＡ_ＳＡ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓｃ_Ｓａ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓ ^ｍＣ_ＳｔＡ_Ｓ ^ｍＣ
大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し、下付き文字ｏはホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し、ＧＮ２－Ｃ６は、図９Ｄに示されるような三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、例えば図９Ｄ－１又は図９Ｄ２に示されるような三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又は両者の混合物であり、オリゴヌクレオチドの５’末端でホスホジエステル結合を介して結合していることが好ましい。いくつかの分子を表す化学図を図１～図８及び図８．１に示す。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図１に示されるコンジュゲートである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図２に示されるコンジュゲートである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図３に示されるコンジュゲートである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図４に示されるコンジュゲートである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図５に示されるコンジュゲートである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図６に示されるコンジュゲートである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図７に示されるコンジュゲートである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図８に示されるコンジュゲートである。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、図８．１に示されるコンジュゲートである。

図１－８及び図８．１に図示する化合物はプロトン化形態で示されており、すなわちホスホロチオエート結合上のＳ原子はプロトン化されている。プロトンの存在は、分子の環境の酸性度と、代替的なカチオン（例えば、オリゴヌクレオチドが塩形態である場合）の存在とに依存することが理解されるであろう。プロトン化ホスホロチオエートは互変異性形態で存在する。

薬学的に許容され得る塩
本発明による化合物は、その薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持し、適切な非毒性の有機若しくは無機酸又は有機若しくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸などの無機酸に由来するもの、並びにｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来するものなどが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム及び第四級アンモニウムヒドロキシド、例えば、テトラメチルアンモニウムヒドロキシドに由来するものが含まれる。医薬化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性並びに溶解性を改善するために、医薬系化学者に周知の技法である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００，４，４２７－４３５ ｏｒ ｉｎ Ａｎｓｅｌ，Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６ｔｈ ｅｄ．（１９９５），ｐｐ．１９６ ａｎｄ １４５６－１４５７に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩であり得る。

さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩、例えば薬学的に許容され得るナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。

製造方法
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１５４巻第２８７～３１３頁を参照のこと）。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。

医薬組成物
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩、アンモニウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。あるいは、希釈剤は水又は塩化ナトリウム溶液であってもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、薬学的に許容され得る希釈剤中５０～３００μＭ溶液の濃度で使用される。

本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単な総説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体及びアジュバントの適切で好ましいさらなる例を提供している（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはそのコンジュゲート、又はその薬学的に許容され得る塩は、固体形態、例えば粉末、例えば凍結乾燥粉末である。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、医薬組成物又は製剤の調製の調整のために、薬学的に許容され得る活性物質又は不活性物質と混合され得る。医薬組成物の調製のための組成物及び方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含む多くの基準に依存する。

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、又は滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９又は６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤又は薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートはプロドラッグである。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。

用途
本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防法のための研究試薬として利用され得る。

研究では、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＦＵＢＰ１タンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。

本発明はまた、ＦＵＢＰ１を発現している標的細胞においてＦＵＢＰ１発現を調節するためのインビボ又はインビトロの方法であって、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物を該細胞に投与することを含む、方法も包含する。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物又はインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、肝臓中に存在する。標的細胞は肝細胞であってもよい。

本発明の一態様は、医薬として使用する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物に関する。

本発明の一態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、感染細胞中のｃｃｃＤＮＡレベルを低下させることができ、したがってＨＢＶ感染を阻害することができる。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、感染細胞中における以下のパラメータ（ｉ）ｃｃｃＤＮＡの減少、及び／又は（ｉｉ）ｐｇＲＮＡの減少、及び／又は（ｉｉｉ）ＨＢＶ ＤＮＡの減少、及び／又は（ｉｖ）ＨＢＶウイルス抗原の減少のうちの１つ以上に影響を及ぼすことができる。

例えば、ＨＢＶ感染を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートは、（ｉ）感染細胞中のｃｃｃＤＮＡレベルを、対照と比較して、少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少、又は（ｉｉ）ｐｇＲＮＡレベルを、少なくとも４０％、対照と比較して、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少させることができる。対照は、未処理の細胞若しくは動物、又は適切な対照で処理された細胞若しくは動物であり得る。

ＨＢＶ感染の阻害は、ＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞を用いてインビトロで、又はヒト化肝細胞ＰＸＢマウスモデル（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏから入手可能、また、Ｋａｋｕｎｉら（２０１４年）「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．」第１５巻、第５８～７４も参照されたい）を用いてインビボで測定することができる。ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌阻害は、製造業者の指示に従って、例えばＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定することができる。細胞内ｃｃｃＤＮＡ又はＨＢＶ ｍＲＮＡ及びｐｇＲＮＡの減少は、例えば、材料及び方法セクションに記載されるように、ｑＰＣＲによって測定することができる。試験化合物がＨＢＶ感染を阻害するかどうかを評価するための更なる方法は、例えば国際公開第２０１５／１７３２０８号に記載されている通りｑＰＣＲにより、又はノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、又は免疫蛍光を用いて、ＨＢＶ ＤＮＡの分泌を測定することである。

ＦＵＢＰ１レベルの低下により、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物を使用して、ＨＢＶ感染の発症又は処置を阻害することができる。特に、本発明のｃｃｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の不安定化及び低減は、ＨＢｓＡｇの分泌のみを減少させる化合物と比較して、慢性ＨＢＶ感染の発症をより効率的に阻害又は処置する。

したがって、本発明の一態様は、ＨＢＶ感染個体におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを減少させるための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の使用に関する。

本発明の更なる態様は、慢性ＨＢＶ感染の発症を阻害又は処置するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の使用に関する。

本発明の更なる態様は、ＨＢＶ感染者の感染性を低下させるための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の使用に関する。本発明の特定の態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、慢性ＨＢＶ感染の発症を阻害する。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物（又は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、若しくは医薬組成物を予防的に受容するもの）で処置される対象は、好ましくはヒトであり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及び／又はＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者であり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及びＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者である。

したがって、本発明は、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物を投与することを含む、ＨＢＶ感染を処置する方法に関する。本発明は更に、慢性ＨＢＶ感染に起因する肝硬変及び肝細胞癌腫を予防する方法に関する。

本発明はまた、医薬、特にＨＢＶ感染若しくは慢性ＨＢＶ感染の処置、又はＨＢＶ感染者の感染性の低減に使用する医薬の製造のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物の使用を提供する。好ましい実施形態では、医薬は、皮下投与のための剤形で製造される。

本発明はまた、医薬を製造するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、医薬組成物の使用を提供する。ここで、該医薬は静脈内投与のための剤形である。

併用療法
いくつかの実施形態では、本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療薬との併用処置で使用するためのものである。治療薬は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療薬であり得る。

例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、アンチセンス（他のＬＮＡオリゴマーを含む）、ｓｉＲＮＡ（ＡＲＣ５２０など）、アプタマ、モルホリノ、又は任意の他の抗ウイルス、ヌクレオチド配列依存性作用様式のいずれかを介して作用する、オリゴヌクレオチド系抗ウイルス剤、例えば配列特異的オリゴヌクレオチド系抗ウイルス剤などの他の活性剤と組み合わせて使用することができる。

更なる例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、インターフェロン（例えば、ペグ化インターフェロンα）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ＧＳ－９６２０）、又は治療ワクチンなどの免疫刺激抗ウイルス化合物といった他の活性物質と組み合わせて使用することができる。

更なる例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、抗ウイルス活性を有する他の活性物質、例えば小分子と組み合わせて使用することができる。これらの他の活性物質は、例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド阻害剤（例えば、エンテカビル又はテノホビル・ジソプロキシルフマル酸塩）、封入阻害剤、侵入阻害剤（例えば、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ）であり得る。

特定の実施形態では、追加の治療剤は、ＨＢＶ薬、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）薬、化学療法薬、抗生物質、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗真菌薬、抗寄生虫薬、制吐薬、下痢止め薬、又は免疫抑制薬であり得る。

特に、関連する実施形態では、追加のＨＢＶ剤は、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン；ＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害薬；第２のアンチセンスオリゴマー；ＨＢＶ治療ワクチン；ＨＢＶ予防ワクチン；ラミブジン（３ＴＣ）；エンテカビル（ＥＴＶ）；フマル酸テノホビルジイソプロキシル（ＴＤＦ）；テルビブジン（ＬｄＴ）；アデホビル；又はＨＢＶ抗体療法（単クローン性又は多クローン性）であり得る。

他の特定の関連する実施形態では、更なるＨＣＶ剤は、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａｃｏｎ）－１（ペグ化及び非ペグ化）；リバビリン；ペガシス；ＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ社製ＶＰ５０４０６シリーズ）；ＨＣＶアンチセンス剤；ＨＣＶ治療ワクチン；ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤；ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤；又はＨＣＶモノクローナル抗体療法若しくはＨＣＶポリクローナル抗体療法であり得る。

投与
本発明の増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート、又は医薬組成物は、優れた医療行為と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与される。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、患者の年齢及び性別、並びに医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。本明細書では、「有効量」（「（治療的に）有効な用量」としても知られる）は、医師又は他の臨床医によって求められている対象の生物学的又は医学的応答を誘発する化合物の量を意味する。本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物又は医薬組成物の「有効量」は、そのような考慮事項によって左右され、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇを阻害するのに必要な最小量である。例えば、そのような量は、レシピエントの細胞又は哺乳動物全体に対して毒性である量未満であり得る。

いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は医薬組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、又は月に１回であり得る。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は医薬組成物は、局所（例えば、皮膚に対して、吸入、眼又は耳など）又は経腸（例えば、経口的に、又は消化管を通して）又は非経口（例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内）で投与され得る。

好ましい実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのコンジュゲート又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射若しくは注入を含む非経口経路によって投与される。一実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。ＧａｌＮＡｃコンジュゲート化合物では、ＡＳＧＰ受容体の飽和を遅延させるために皮下投与することが有利であり得る。

本発明の実施形態
本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用することができる。上記の、特に「発明の概要」、「定義」及び「発明の詳細な説明」の項で提供される定義及び説明は、以下に準用される。

１． ＦＵＢＰ１核酸に対して少なくとも９０％相補的である、例えば完全に相補的である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、細胞におけるヒトＦＵＢＰ１などのＦＵＢＰ１の発現を阻害することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。

２． 実施形態１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
ａ）連続ヌクレオチド配列が、ヒトＦＵＢＰ１のエクソン１４内の領域（表３を参照）に対して少なくとも９０％相補的である、例えば完全に相補的であるか、又は
ｂ）連続ヌクレオチド配列が、ヒトＦＵＢＰ１のエクソン２０内の領域（表３参照）に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。

３． 実施形態１及び２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
ａ）連続ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡのヌクレオチド１６１８４～１６２０５の領域、例えば、配列番号１のヌクレオチド１６１８４～１６２００、ヌクレオチド１６１８６～１６２０３、ヌクレオチド１６１８８～１６２０５及びヌクレオチド１６１８９～１６２０５の領域から選択される領域に対して完全に相補的であるか、又は
ｂ）連続ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡのヌクレオチド３０５３６～３０５５３からの領域に対して完全に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。

４． ａ）連続ヌクレオチド配列が、配列番号１０及び／又は配列番号１１に対して完全に相補的であるか、又はｂ）連続ヌクレオチド配列が、配列番号１９に対して完全に相補的である、実施形態１～３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５． １２～３０ヌクレオチド長、例えば１２～２２ヌクレオチド長、例えば１６～２０ヌクレオチド長である、実施形態１～４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

６． 連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１２ヌクレオチド、例えば１４、１５、１６、１７又は１８ヌクレオチドの連続配列である、実施形態１～４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

７． 連続ヌクレオチド配列が１７又は１８ヌクレオチドの連続配列である、実施形態６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

８． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号６、７、８、９及び１８からなる群から選択される配列、又はそれらの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドと１００％同一である、実施形態１～７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

９． 連続ヌクレオチド配列中に１つ又は複数の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１０． 連続ヌクレオチド配列中の１つ又は複数の修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態９のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１１． １つ又は複数の２’－糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１２． １つ又は複数の修飾ヌクレオシドが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ_２－を有するオキシ－ＬＮＡなどのＬＮＡヌクレオシドである、実施形態９～１１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１３． １つ又は複数の修飾ヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施形態１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１４． 連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１５． 連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロジチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１６． 連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１７． 連続ヌクレオチド配列中のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１８． アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨ１などのＲＮアーゼＨを動員することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

１９． アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなる、又はそれを含む、実施形態１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

２０． 領域Ｇが、６～１６個のＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１２個のＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１１個のＤＮＡヌクレオシドの長さを有する、実施形態１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

２１． 領域Ｆ及びＦ’がそれぞれ少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含み、例えば、領域Ｆ及びＦ’がそれぞれ少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１８～２０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

２２． 領域Ｆが、１～８個のＤＮＡヌクレオシド、例えば４～６個のＤＮＡヌクレオシドの長さを有する、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

２３． 領域Ｆ’が、１～８個のＤＮＡヌクレオシド、例えば２～６個のＤＮＡヌクレオシドの長さを有する、実施形態１８～２２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

２４． アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、式Ｆ_４－６－Ｇ_７－１１－Ｆ’_２－６のギャップマーからなり、又はそれを含み、好ましくは、ギャップマーが少なくとも１つの交互フランクを含む、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

２５． 以下
ＣＴＴａｔＧｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴ（配列番号６）、
ＣＴＴａＴｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴ（配列番号６）、
ＣＴｔＡＴｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴＴ（配列番号７）、
ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴＴ（配列番号７）、
ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔＧｇＴＴ（配列番号７）、
ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔＧＧＴＴ（配列番号７）、
ＧｃｔｔＴｔｔａｔｇｇｔＴｔＣＡＣ（配列番号８）、
ＴＡＴｇｃＴｔｔｔｔａｔｇｇｔＴＴＣ（配列番号９）、及び
ＡｃＣＡＡｔｔｔｔｃａｔｔｔＣｔＡＣ（配列番号１８）
からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの群から選択される、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、すべてのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。

２６． 実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲート。

２７． コンジュゲート部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群から選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む、実施形態２７に記載のコンジュゲート。

２８． アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分が、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、実施形態２７に記載のコンジュゲート化合物。

２９． コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、又は四価である、実施形態２７又は２８のコンジュゲート化合物。

３０． コンジュゲート部分が、２～４つの末端ＧａｌＮＡｃ部分と、アンチセンス化合物にコンジュゲートされ得るブランチャー分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を結合するスペーサーと、からなる、実施形態２９に記載のコンジュゲート化合物。

３１． スペーサーが、ＰＥＧスペーサーである、実施形態３０に記載のコンジュゲート化合物。

３２． コンジュゲート部分が、三価のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、実施形態２６～３１のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

３３． コンジュゲート部分が、図９Ａ１、９Ａ２；９Ｃ１、９Ｃ２、９Ｄ１、９Ｄ２、９Ｅ１、９Ｆ１、９Ｇ１、９Ｈ１、９Ｉ１、９Ｊ１、９Ｌ１及び９Ｌ２における三価ＧａｌＮＡｃ部分のうちの１つから選択される、実施形態２６～３２のいずれか１つに記載のコンジュゲート化合物。

３４． コンジュゲート部分が、図９Ｄ１若しくは９Ｄ２の三価ＧａｌＮＡｃ部分又はそれらの混合物である、実施形態３３に記載のコンジュゲート化合物。

３５． アンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に配置されたリンカーを含む、実施形態２６～３４のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

３６． リンカーが、２～５個の連続したホスホジエステル結合ヌクレオシド、例えば２個の連続したホスホジエステル結合ヌクレオシド、例えばホスホジエステル結合ヌクレオシドを含むか、又はそれからなる、実施形態３５に記載のコンジュゲート化合物。

３７． 以下からなる群から選択される、実施形態２６～３６のいずれか１つに記載のコンジュゲートであって、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓＴ_ｓａ_ｓｔ_ｓＧ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓＴ_ｓａ_ｓＴ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓＡ_ｓＴ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓＧ_ｓＴ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓＧ_ｓｇ_ｓＴ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ ^ｍＣ_ｓＴ_ｓｔ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓＧ_ｓＧ_ｓＴ_ｓＴ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ Ｇ_ｓｃ_ｓｔ_ｓｔ_ｓＴ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｇ_ｓｔ_ｓＴ_ｓｔ_ｓ ^ｍＣ_ｓＡ_ｓ ^ｍＣ、
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ Ｔ_ｓＡ_ｓＴ_ｓｇ_ｓｃ_ｓＴ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓｔ_ｓａ_ｓｔ_ｓｇ_ｓｇ_ｓｔ_ｓＴ_ｓＴ_ｓ ^ｍＣ、及び
５’－ＧＮ２－Ｃ６_ｏｃ_ｏａ_ｏ Ａ_Ｓｃ_Ｓ ^ｍＣ_ＳＡ_ＳＡ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓｃ_Ｓａ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓｔ_Ｓ ^ｍＣ_ＳｔＡ_Ｓ ^ｍＣ
好ましくは、大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、^ｍｃは５－メチルシトシンＤＮＡであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し、下付き文字ｏはホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し、ＧＮ２－Ｃ６は、図９Ｄに示されるような三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、例えば図９Ｄ－１又は図９Ｄ２に示されるような三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又は両者の混合物であり、オリゴヌクレオチドの５’末端でホスホジエステル結合を介して結合していることが好ましい。

３８． 図１に示すコンジュゲート。

３９． 図２に示すコンジュゲート。

４０． 図３に示すコンジュゲート。

４１． 図４に示すコンジュゲート。

４２． 図５に示すコンジュゲート。

４３． 図６に示すコンジュゲート。

４４． 図７に示すコンジュゲート。

４５． 図８に示すコンジュゲート。

４６． 図８．１に示すコンジュゲート。

４７． 実施形態１～２５のいずれか１つのオリゴヌクレオチド又は実施形態２６～４６のいずれか１つに記載のコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩。

４８． 実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２６～４６のいずれか１つに記載のコンジュゲート、又は実施形態４８に記載の薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物。

４９． ＦＵＢＰ１を発現している標的細胞においてＦＵＢＰ１発現を調節するためのインビボ又はインビトロでの方法であって、該細胞に、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２６～４６のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４８に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４８に記載の医薬組成物を有効量で投与することを含む、方法。

５０． 疾患を処置又は予防するための方法であって、疾患に罹患している、又は罹患しやすい対象に、治療有効量又は予防有効量の実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２６～４６のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４７に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４８に記載の医薬組成物を投与することを含み、疾患が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染及び／又はがんである、方法。

５１． 薬に使用するための、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２６～４６のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４７に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４８に記載の医薬組成物。

５２． Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染及び／又はがんの処置又は予防に使用するための、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２６～４６のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４７に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４８に記載の医薬組成物。

５３． Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染及び／又はがんを処置又は予防するための医薬を調製するための、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態２６～４６のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４７に記載の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４８に記載の医薬組成物の使用。

５４． 疾患がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、例えば慢性ＨＢＶ感染である、実施形態５０に記載の方法、実施形態５２に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、医薬組成物、若しくは薬学的に許容され得る塩、又は実施形態５３に記載の使用。

５５． 疾患ががん、例えば肝細胞癌腫である、実施形態５０に記載の方法、実施形態５２に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、医薬組成物、若しくは薬学的に許容され得る塩、又は実施形態５３に記載の使用。

５６． アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡｃＣＡＡｔｔｔｔｃａｔｔｔＣｔＡＣ（配列番号１８）である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２６～３３及び４５のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４７の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４８に記載の医薬組成物、請求項５３に記載の使用、又は請求項５４及び５４に記載の方法。

５７． アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔＧｇＴＴ（配列番号７）である、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２６～３３及び４２のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態４７の薬学的に許容され得る塩、又は実施形態４８に記載の医薬組成物、請求項５３に記載の使用、又は請求項５４及び５４に記載の方法。

序論
ＦＵＢＰ１の過剰発現及び突然変異は、長年にわたりがんに関連することが知られている。特に、ヒト肝細胞癌腫（ＨＣＣ）におけるＦＵＢＰ１の強い過剰発現は、腫瘍成長を支持し、患者の予後不良と相関する。

感染肝細胞におけるＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡは持続的な慢性感染及び再活性化に関与し、全てのウイルスサブゲノム転写物及びプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の鋳型であって、新たに合成されたウイルス子孫と細胞内ヌクレオカプシド再循環を介したｃｃｃＤＮＡプール補充との両方を確実にする。

国際公開第２０１９／１９３１６５号では、ＦＵＢＰ１がｃｃｃＤＮＡ安定性に関連することが示された。この知識により、ＨＢＶ感染対象におけるｃｃｃＤＮＡを不安定化する機会が生まれ、慢性感染ＨＢＶ患者の完全治癒の機会が開ける。

本研究では、ヒトＦＵＢＰ１を標的とする２０００個を超えるアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングした。このスクリーニングでは、ヒトＦＵＢＰ１を標的とするのに特に強力かつ有効な化合物を同定した。具体的には、ヒトＦＵＢＰ１のエクソン１４内の領域を標的とし、インビトロでヒトＦＵＢＰ１の強い下方制御を付与する、９つの交互フランクギャップマーＬＮＡオリゴヌクレオチドを同定した。さらに、ヒトＦＵＢＰ１のエクソン２０内の領域を標的とし、ヒトＦＵＢＰ１の強い下方制御も付与する、１つの交互フランクギャップマーＬＮＡオリゴヌクレオチドを同定した。同定された９つの化合物の概要を上記の表６に示す。

同定された化合物の標的配列は、国際公開第２０１９／１９３１６５号に開示されているＣＭＰ番号５３＿１及び５４＿１の標的配列と重複する。これら２つの化合物は、ＨｅＬａ細胞中のＦＵＢＰ１を５μＭで約７０％に阻害する。しかしながら、９つの同定された化合物は、ＨｅＬａ細胞中のＦＵＢＰ１を３．３μＭで約２５％～３５％まで、又は５μＭで約２７％まで阻害するので、明らかにより有効である（ＣＭＰ番号１８＿１。加えて、それらは、国際公開第２０１９／１９３１６５号の最良の化合物であるＣＭＰ番号５０＿１よりも、ＨｅＬａ細胞におけるＦＵＢＰ１の標的化においてより効率的である（実施例１参照）。

国際公開第２０１９／１９３１６５号の先行技術化合物３５＿１、５０＿１、５３＿１、５４＿１、７８＿１及び７９＿１の概要を以下の表７に提供する。化合物は、均一フランクを有するギャップマーである。ＣＭＰ番号５０＿１はＰＨＨ細胞において最良の化合物であり、ＣＭＰ番号３５＿１はＨｅＬａ細胞において最良の化合物であった。ＣＭＰ番号５３＿１及び５４＿１は、ＣＭＰ番号６＿１、６＿２、７＿１、７＿２、７＿３、７＿４；８＿１及び９＿１に最も近い化合物である。ＣＭＰ番号７８＿１及び７９＿１は、ＣＭＰ番号１８＿１に最も近い化合物である。

化合物について：大文字はＬＮＡヌクレオシドを表し（β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを使用した）、すべてのＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

実施例１：Ｈｅｌａ細胞におけるヒトＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
ＦＵＢＰ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＥＣＡＣＣから取得したヒトＨｅｌａ細胞（カタログ番号９３０２１０１３）におけるＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ発現を低下させる能力について試験した。

Ｈｅｌａ細胞を細胞培養培地（１０％ウシ胎児血清［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ７５２４］、２ｍＭグルタミン［Ｓｉｇｍａ、Ｇ７５１３］、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ［Ｓｉｇｍａ、Ｍ７１４５］及び０．０２５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ１３９７］を補充したＥＭＥＭ［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ２２７９］）中で増殖させた。細胞は、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）［Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ １４１９０－０９４］で洗浄し、次に０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３９２４）を添加して３７℃で２～３分インキュベートし、摩砕することによって、５日毎にトリプシン処理した後、細胞播種した。

実験に使用するために、ウェルあたり２５００個の細胞を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃカタログ番号１６７００８）内で１９０μＬの成長培地中で播種した。細胞を播種して最終的なカスタム濃度に達した約２４時間後に、ＰＢＳに溶解したＡＳＯを添加した。培地を交換せずに細胞を３日間インキュベートした。

インキュベーション後、培地を除去し、続いて１２５μＬのＲＬＴ Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ ７９２１６）及び１２５μＬの７０％エタノールを添加することによって細胞を回収した。ＲＮＡを製造者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ９６キット）に従って精製し、２００μＬのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ非含有水（Ｇｉｂｃｏ）の最終容量で溶出した。

ＲＮＡに９０℃で４０秒間熱ショックを与えて、ＲＮＡ：ＬＮＡ二重鎖を融解させ、氷に直接移動させ、使用前にスピンダウンした。一段階ｑＰＣＲ反応のために、ｑＰＣＲ－ミックス（ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＥ １ステップＲＴ－ｑＰＣＲ ＴＯＵＧＨＭＩＸ（登録商標）Ｌｏｗ ＲＯＸ（ＱａｕｎｔａＢｉｏ製、カタログ番号９５１３４－５００））を２つのＩＤＴプローブ（最終濃度１Ｘ）と混合してマスターミックスを生成した。Ｔａｑｍａｎプローブは、ＩＤＴ：ＦＵＢＰ１：Ｈｓ．ＰＴ．５８．２６８８３７７５（プライマー・プローブ比２、ＦＡＭ）又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：ＧＵＳＢ：４３２６３２０Ｅ．から入手した。次に、マスターミックス（６μＬ）及びＲＮＡ（４μＬ、１～２ｎｇ／μＬ）を定量的ＰＣＲプレート（ＭＩＣＲＯＡＭＰ（登録商標）光学３８４ウェル、４３０９８４９）内で混合した。密封後、プレートを急速回転させ（室温で１分間１０００ｇ）、Ｖｉｉａ（商標）７システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）に移し、以下のＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分間；９５℃ ３分；以下を４０サイクル：９５℃で５秒間、続いて１．６℃／秒の温度低下、続いて６０℃で４５秒間。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ＿ｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェアを使用してデータを分析した。

ｑＰＣＲデータを捕捉し、生データの品質管理をＱｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ７ソフトウェアで行った。

次いで、データをＥ－Ｗｏｒｋｂｏｏｋにインポートし、ＢｉｏＢｏｏｋテンプレートを使用してデータを捕捉及び分析した。以下の工程を使用してデータを分析した：
１．デルタデルタＣｔ法により量を算出（量＝２＾（－Ｃｔ）＊１０００００００００）
２．同じウェルで実行するハウスキーピング遺伝子アッセイ用に計算した量に対して、量を正規化。相対標的量＝量＿標的／量＿ハウスキーピング
３．同じプレート上の全てのＰＢＳ処理ウェルの平均で割ることにより、各ウェルについてＲＮＡノックダウンを計算した。正規化標的量＝（相対標的量／［平均］相対標的量］＿ｐｂｓ＿ウェル）＊１００
４．最終データを未処理（ＰＢＳ）ウェルのパーセンテージとして示す。

５．濃度応答実験のために、各化合物［希釈モデルに応じて、８又は１０の濃度のいずれか］についてＲＮＡノックダウン値（工程３～４）から曲線をフィッティングした。曲線は、Ｂｉｏｂｏｏｋの４パラメータ・シグモイド用量応答モデルを使用してフィッティングされる。

相対的なＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ発現レベルを表８に、対照の割合として示す。即ち、値が小さいほど、阻害は大きい。さらに、結果を図１１に示す。

実施例２：初代ヒト肝細胞（ＰＸＢ－ＰＨＨ）におけるヒトＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
ヒト化マウス（ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス）（本明細書ではＰＨＨと呼ばれる）から採取した新鮮な初代ヒト肝細胞（ＰＸＢ－ＰＨＨ）を、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（日本）から９６ウェル形式で入手し、改変肝細胞クローン増殖培地（ｄＨＣＧＭ）中で培養した。ｄＨＣＧＭは、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、４４ｍＭのＮａＨＣＯ_３、１５μｇ／ｍｌのＬ－プロリン、０．２５μｇ／ｍｌのインスリン、５０ｎＭのデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、０．１ｍＭのＡｓｃ－２Ｐ、２％のＤＭＳＯ及び１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地である（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下において３７℃で培養した。回収まで培養培地を週に２回交換した。

非感染細胞を５ μＭで１回処理し、７日後に回収した。すべての処理において、細胞に、１２０μＩ／ウェルのｄＨＣＧＭ培地の最終容量でオリゴヌクレオチド化合物を投与した。ＲＮＡ測定のための実験は、生物学的に二連で行った。

その後、ＦＵＢＰ１ ＲＮＡのリアルタイムＰＣＲを行った。製造業者のプロトコルに従って、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅロボット及びＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，番号０５４６７５３５００１）を用いて全ｍＲＮＡを細胞から抽出した。ｍＲＮＡ発現レベルを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３９２９３８）、及びヒトＧｕｓＢ内因性対照（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃Ｈｓ００９３９６２７＿ｍ１）を使用してｑＰＣＲによって技術的に二連で定量した。ｍＲＮＡ発現は、参照遺伝子ＧｕｓＢ及び非処理細胞に対して正規化した比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて分析した。ＧｕｓＢ ＲＮＡ及びＦＵＢＰ１ ＲＮＡの定量に使用されるＴａｑＭａｎプライマーを以下の表に列挙する。

ＰＸＢ－ＰＨＨ細胞における８つの化合物（ＣＭＰ番号：６＿１、６＿２、７＿１、７＿２、７＿３、７＿４；８＿１及び９＿１．ＣＭＰ番号７８＿１及び７９＿１）の相対的なＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ発現レベルを対照の％として表１０に示す。すなわち、値が低いほど阻害は大きくなる。ＰＸＢ－ＰＨＨ細胞におけるＣＭＰ番号１８＿１）のＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ発現レベルを実施例３で分析する。

実施例１及び２から導き出される結論
実施例１及び２のデータは、表６に示すようにＬＮＡ ＡＳＯでＦＵＢＰ１を標的化することが、ＦＵＢＰ１の効率的な低減につながることを示している。

実施例３：ＣＭＰ番号７＿１及び１８＿１のさらなる分析
以下では、９つの同定された化合物のうちの２つを用いた追加の実験を記載する。ＣＭＰ番号７＿３及び１８＿１．これらの実験では、２つの化合物を、国際公開第２０１９／１９３１６５号において最良の結果を与えた２つの先行化合物と比較した。

材料及び方法
初代ヒト肝細胞（ＰＸＢ－ＰＨＨ）
新鮮な初代ヒト肝細胞（ＰＸＢ－ＰＨＨ）を、２４ウェルフォーマットを使用したことを除いて、実施例２に記載されるように培養した。

ＡＳＯ配列及び化合物
表１１は、実施例３で試験した化合物の概要を提供する。

ＨＢＶ感染及びオリゴヌクレオチド処置
到着したら、ＰＨＨ培地中の４％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ中でＰＨＨ細胞をＨＢＶと共に１６時間インキュベートすることによって、慢性患者由来の精製接種物（遺伝子型Ｃ）を使用してＰＨＨにＭＯＩ １１０を感染させた。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮なＰＨＨ培地中で５％ ＣＯ_２の加湿雰囲気で培養した。感染の４日後、細胞を、１０μＭの最終濃度のＦＵＢＰ１ ＬＮＡ（表１１参照）で二連で、又は薬物なし対照（ＮＤＣ）としてＰＢＳで処理した。処理の当日に、古い培地を細胞から除去し、４００μｌ／ウェルの新鮮なＰＨＨ培地と交換した。ウェルごとに、１００μＬの５０μＭの各ＦＵＢＰ１ ＬＮＡ又はＮＤＣとしてのＰＢＳを４００μＬのＰＨＨ培地に添加した。感染後４、１１及び１８日目に同じ処置を３回繰り返した。細胞培養培地を、感染後７、１４及び２１日目に、３日毎に新鮮培地と交換した。

細胞内ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ及びＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ
細胞生存率の決定後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。製造業者のプロトコルに従って、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅロボット及びＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，番号０５４６７５３５００１）を用いて全ＲＮＡを細胞から抽出した。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ及びウイルスｐｇＲＮＡ発現レベルを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３９２９３８）、及びヒトＧｕｓＢ内因性対照（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃Ｈｓ００９３９６２７＿ｍ１）を使用してｑＰＣＲによって技術的に二連で定量した。参照遺伝子ＧｕｓＢ及び非処理細胞に対して正規化された比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を使用して、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ及びウイルスｐｇＲＮＡの相対発現を分析した。ＧｕｓＢ ＲＮＡ、ＦＵＢＰ１ ＲＮＡ及びＨＢＶ ｐｇＲＮＡの定量に使用したＴａｑＭａｎプライマーを表１２に列挙する。

結果
試験した化合物の相対的なＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ発現レベルを表１３及び図１２に示す。表及び図１３から導き出すことができるように、本発明の両方の化合物（ＣＭＰ番号７＿３及び１８＿１）は、ＮＤＣと比較して標的ｍＲＮＡ発現を約８０％低下させる。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果は、先行技術の化合物（ＣＭＰ番号５０＿１及び３５＿１）の効果よりもはるかに強い。

表１４は、異なる濃度のアンチセンス化合物で処理したＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞におけるｐｇＲＮＡを示す。表から導き出せるように、下方制御はアンチセンス化合物の濃度に関連していた。１０μＭの濃度で、最も低いｐｇＲＮＡレベルがＣＭＰ番号７＿３について観察された。さらに、ＣＭＰ番号３５＿１を有する先行技術化合物について最も高いｐｇＲＮＡレベルが観察された。ＣＭＰ番号１８＿１は、従来技術の化合物ＣＭＰ番号５０＿１と同様の方法でＨＢＶ ｐｇＲＮＡを下方制御した。

細胞を２μＭの濃度でも１週間に１回、３週間試験した。２μＭでは、ＣＭＰ番号７＿３は、最良のＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ ＫＤを示し、ｍＲＮＡ発現の５０％の減少を示した。したがって、効果は濃度に依存する（２μＭで８０％の減少が観察されたため）。さらに、ＣＭＰ番号１８＿１は、先行技術のオリゴと比較して、標的ｍＲＮＡ発現レベルに対して同様の効果を示した（２μＭで）。

実施例４：ＦＵＢＰ１ ＡＳＯのインビボＰＫ／ＰＤ
ホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを介してＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートしたＣＭＰ番号：７＿３及び１８＿１を有するオリゴヌクレオチドのインビボ肝臓ＰＫ／ＰＤ相関を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した単回投与マウス試験で評価した（コンジュゲートの構造については、例えば、図５及び図８．１を参照）。マウスに３ｍｇ／ｋｇを皮下投与し、異なる時点で終了させた。Ｆｕｂｐ１ ｍＲＮＡノックダウン、化合物曝露及びＰＫＰＤを下記のように測定した

材料及び方法
組織試料の処理

肝臓試料を２ｍｌの丸底エッペンドルフチューブ内で凍結させ、５ｍｍのホモジナイゼーションビーズを添加した後、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）上のＭａｇＮａ純粋緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）中で２×１．５分間ホモジナイズした。試料の均質化が完了した後、ホモジネートを室温（ＲＴ）で３０分間放置して組織溶解を完了させた。均質化プロセスのすべての工程は、緩衝チオシアネート塩及びメルカプトエタノール含有量のためにフローフード内で実施した。溶解後、ホモジネートを１７．０００ｇで３分間遠心分離した。

ＭａｇＮａ ｐｕｒｅ器具の過負荷を回避するために、ホモジネートを４００μＬあたり約２０ｍｇ組織に希釈した。３５０μＬのホモジネートを、その後のｑＰＣＲ分析のためにＭａｇＮＡ ｐｕｒｅ ９６装置でのＲＮＡ抽出に使用した。ホモジネートの残りのアリコートをｈＥＬＩＳＡ分析に使用した。

ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ
以下のオリゴ及び（全ＬＮＡホスホ－ジエステル）ＥＬＩＳＡプローブをｈＥＬＩＳＡ分析に使用し、これらは全て、Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ａ／Ｓで設計され、合成され、認定された。

ｈＥＬＩＳＡ分析の前に、ホモジネートをＲＴにし、使用前にボルテックスした。試料を５×ＳＳＣＴ緩衝液で少なくとも１０倍希釈した。

適切な標準に適合する試料マトリックス及び希釈係数をすべてのプレートで実行し、関連するオリゴ（品質及び同一性がチェックされた製剤由来）を使用して試料と並行して調製した。各化合物の標準を、投与されていない試料由来の試料プールにスパイクした。スパイクイン濃度は、試料のオリゴ含有量の約１０倍以内になるようにした。

試料及び標準を所望の設定で希釈プレートに添加し、希釈系列を作成した。３００μＬの試料／標準＋捕捉検出溶液を第一ウェルに添加し、１５０μＬの捕捉検出溶液を残りのウェルに添加した。

１５０μＬの液体を順次移すことによって、標準及び試料の二倍希釈系列を作製した。ブランク用（捕捉検出溶液のみ）に、２～４ウェルを保持した。最適な結果のために、少なくとも６ウェルの２倍試料希釈系列が推奨される。

希釈プレート中の試料を室温で３０分間インキュベートした。１００μＬの液体を希釈プレートからストレプトアビジンプレートに移した。プレートを穏やかに撹拌しながら（プレートシェーカー）室温で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬの２×ＳＳＣＴ緩衝液で３回洗浄した。

ＰＢＳＴ（同日に作製）で１：４０００に希釈した１００μＬの抗ＤＩＧ－ＡＰを各ウェルに添加し、穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬの２×ＳＳＣＴ緩衝液で３回洗浄した。

１００μＬの基質（ＡＰ）溶液（新たに調製）を各ウェルに添加した。穏やかに撹拌しながら３０分間インキュベートした後、色の強度を６１５ｎｍで分光光度的に測定した。

生データをリーダー（Ｇｅｎ５ ２．０ソフトウェア）からエクセルフォーマットにエクスポートし、さらにエクセルで分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア及びロジスティック４ＰＬ回帰モデルを使用して、標準曲線を生成した。

データ点は、技術的レプリケートの平均値として報告した。

ＲＮＡ精製
全ての試料を、製造業者のプロトコルを使用してＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して精製した。

３５０μＬの組織ホモジネートをＭａｇＮａＰｕｒｅ ９６処理カートリッジに移した。残りの溶解物は、後のオリゴヌクレオチド曝露分析の分析のために保存した。キットＣｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔを備えたＭａｇＮａ Ｐｕｒｅ ９６を使用し、プロトコル「ＲＮＡ組織ＦＦ標準ＬＶ ３．１」を使用してＲＮＡを精製した。ＲＮＡを５０μＬの溶出緩衝液（キットより、０５４６７５３５００１）で溶出した。

Ｅｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、ＲＮＡ濃度及びＡ２６０／２８０比（全試料の約２．０）を決定した。これらの濃度に基づいて、試料をＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ非含有水中での希釈によって２５ｎｇ／μＬに正規化し、さらに ２．５ｎｇ／μｌの作業濃度まで希釈した。

次いで、試料を１ステップｑＰＣＲ分析のためのインプットとして使用した。アッセイの詳細を以下に示す。

ｑＰＣＲ分析
ｑＰＣＲを、以下の材料を使用して１ステップｑＰＣＲフォーマットとして実行した。

ｑＰＣＲ分析のためのＲＮＡの調製
望ましくないＲＴ酵素活性を回避するために、このプロトコルの全ての工程について反応物を冷却し続けた。次いで、希釈したＲＮＡを９０℃で４０秒間ヒートショックしてＲＮＡ：ＡＳＯ二重鎖を解離させ、氷上に置いた。分析の前に、ＲＮＡ試料をウェルの底部にスピンした。

標準曲線を各プレートに流し、定量及び増幅効率測定に使用した。４ｕＬの１０ｎｇ／ｕＬのＰＢＳ試料を１０ｕＬの反応における投入物として使用した。２倍希釈系列をＲＮａｓｅ非含有水中で調製して、７点標準曲線を作成した。

２つの別個のマウスＦｕｂｐ１アッセイ及び４つの対照アッセイを、各動物について２つの技術的レプリケートを用いて二重反応で行った。

ｑＰＣＲについては、以下の工程に従った：
各ｑＰＣＲウェルについて、５μＬのＸＬＴ １ステップミックス、０．５μＬのＰｒｏｂｅミックス１（２０倍）、０．５μＬのＰｒｏｂｅミックス２（２０倍）を含むストックマスターミックスを調製した。ストックマスターミックスから、３８４ウェルプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４ウェルプレート－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０９８４９）中の各ウェルに６ μＬを添加した。

ＲＮＡ希釈プレートから、４ μＬの希釈ＲＮＡ（２．５ｎｇ／ｕＬ）をマスターミックスの各ウェルに添加した。次いで、プレートを密封し、ボルテックスした。次いで、プレートを高速で３分間遠心分離した。ｑＰＣＲ反応物を、以下のプログラムを実行するように設定されたｑＰＣＲ装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｉｉａ７；ソフトウェア：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ｖ．１．３）に移すまで低温に保った：５０℃で１５分、次いで９５℃で３分、設定温度変化速度１．９℃／秒。その後、温度変化速度を１．６℃／秒に設定して、９５℃で５秒間及び６０℃で４５秒間の４０サイクルを行った。

技術的変動を最小限に制限する同じ実行で、すべての試料を分析した。

ｑＰＣＲデータ処理
ｑＰＣＲデータをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でレビューした。増幅曲線の不規則性に基づいて、可能性のある外れ値のウェルを特定し、除去した。各プレートのこのレビューに続いて、各ｑＰＣＲアッセイについて標準曲線に基づいて各試料のｃｔ値から計算された量でエクスポートファイルを生成し、Ｅｘｃｅｌを使用して分析した。

一般に、標準曲線は、推奨された９５～１０５％の間の効率で高品質であり、高性能アッセイを示した。

４つの異なるＨＫ遺伝子（Ｇｕｓｂ、Ｒｐｌｐ０、Ｒｐｓ２９及びＴｂｐ）をアッセイし、これらの幾何平均を正規化に使用した。ＨＫ遺伝子の安定性は、Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅらによって公開された方法（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）を使用して、組み入れ前に評価した。４つのＨＫ遺伝子を使用することにより、ペアワイズＨＫ遺伝子変異は、すべての組織について０．１５の推奨閾値を下回る。

「残存Ｆｕｂｐ１（％）」は以下のように計算した：Ｆｕｂｐ１ ｑＰＣＲアッセイのそれぞれからの量をＨＫアッセイの幾何平均に対して正規化し、さらに未処理群の平均で割ると、残存ｍＲＮＡ（％）が得られた。２つの残存Ｆｕｂｐ１ ｍＲＮＡ（％）の結果の平均を最終読み出しとして使用した。

ＰＫＰＤのプロット及び計算
肝臓組織曝露値を、組織（ｇ）当たりの化合物ｎｍｏｌ（ｎｍｏｌ／ｇ）として計算した。それらをさらにｌｏｇ１０転換し、残存Ｆｕｂｐ１ ｍＲＮＡ（％）に対してプロットした（図１３）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して、非線形回帰曲線（４ＰＬ回帰モデル、上＝１００で制約）を当てはめた。最良適合推定ＰＫＰＤ ＩＣ５０をソフトウェア（回帰ＩＣ５０：ＣＭＰ番号１８＿１のコンジュゲート：０．０９２ｎｍｏｌ／ｇ；ＣＭＰ番号７＿３のコンジュゲート：０．０６８ｎｍｏｌ／ｇ）によって計算した。

結果：試験したコンジュゲートは両方とも、良好なＰＫプロフィールを有する。ＣＭＰ番号７＿３のコンジュゲートは、標的ＫＤの早期発現に関してＣＭＰ番号１８＿１のコンジュゲートよりもわずかに優れている。

Claims (17)

1. 以下
   ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔＧｇＴＴ（配列番号７）、
   ＡｃＣＡＡｔｔｔｔｃａｔｔｔＣｔＡＣ（配列番号１８）、
   ＣＴＴａｔＧｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴ（配列番号６）、
   ＣＴＴａＴｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴ（配列番号６）、
   ＣＴｔＡＴｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴＴ（配列番号７）、
   ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔｇＧＴＴ（配列番号７）、
   ＣＴｔＡｔｇｃｔｔｔｔｔａｔＧＧＴＴ（配列番号７）、
   ＧｃｔｔＴｔｔａｔｇｇｔＴｔＣＡＣ（配列番号８）、及び
   ＴＡＴｇｃＴｔｔｔｔａｔｇｇｔＴＴＣ（配列番号９）
   からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
   大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、すべてのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
3. 前記少なくとも１つのコンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる、請求項２に記載のコンジュゲート。
4. 前記コンジュゲート部分が、図９の三価ＧａｌＮＡｃ部分のうち１つから選択される、請求項２又は３に記載のコンジュゲート。
5. 前記コンジュゲート部分が、図９Ｄ１若しくは９Ｄ２の三価ＧａｌＮＡｃ部分又はそれらの混合物である、請求項４に記載のコンジュゲート。
6. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと前記コンジュゲート部分との間に位置するリンカーを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
7. 前記リンカーが、２～５個の連続するホスホジエステル結合ヌクレオシドを含むか、又はそれからなる、請求項６に記載のコンジュゲート。
8. 図１、図２、図３、図４、図５、図６、図７、図８及び図８．１に示されるコンジュゲートの群から選択されるコンジュゲート。
9. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩。
10. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩と、及び薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物。
11. ＦＵＢＰ１を発現している標的細胞におけるＦＵＢＰ１発現を調節するためのインビボ又はインビトロでの方法であって、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
12. 疾患を処置又は予防するための方法であって、前記疾患に罹患している、又は罹患しやすい対象に、治療有効量又は予防有効量の請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記疾患が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染及び／又はがんである、方法。
13. 薬に使用するための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物。
14. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染及び／又はがんの処置又は予防に使用するための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物。
15. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染及び／又はがんを処置又は予防するための医薬を調製するための、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項１０に記載の医薬組成物の使用。
16. 前記疾患がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、例えば慢性ＨＢＶ感染である、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、医薬組成物、若しくは薬学的に許容され得る塩、又は請求項１５に記載の使用。
17. 前記疾患ががん、例えば肝細胞癌腫である、請求項１２に記載の方法、請求項１４に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、医薬組成物、若しくは薬学的に許容され得る塩、又は請求項１５に記載の使用。

Images