JP2023530288A - 細胞変換のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、分化した幹細胞の大規模生成のための方法およびシステムを提供する。本開示は、バイオリアクターチャンバーを使用して、大規模培養において幹細胞を拡大増殖し、分化させるためのシステムおよび方法も対象とする。培養肉製品は、非効率的な従来の畜産農業とは対照的に、動物の筋肉細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養を通じて製造され得る新たな技術であり得る。従来の肉製品が、一般に、筋肉由来組織からだけはなく、数ある中でも脂肪および結合組織からも構成されているので、多数の細胞型が培養肉製品を作りだすのに望ましくあり得る。

Description

相互参照
本出願は、２０２０年６月１０日に出願された英国特許出願第２００８８２１．７号に基づく優先権を主張し、この特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景
世界人口は、２０５０年までに９０億人を超えると予想されている。食料製造は、増加する人口の需要を満たすために大幅に増加させる必要があり得るが、資源および耕作地の制約が、この需要を満たすための多くの形態の食料製造を実行不可能にする。中国、インドおよびロシアなどの急速に発展している国は、肉または他の動物製品（例えば、乳製品、卵）などのより豊富な食品製品の消費が増加し得、これらの品目に対する世界的な需要の増加をもたらしている。国連の食糧農業機関の報告によれば、家畜部門は、温室効果ガス（ＧＨＧ）排出量の１８％を占め、地球の地域の３０％、耕作地の７０％、および世界の淡水の８％を使用している。加えて、肉に対する世界の需要は、２０５０年までに二倍になると予想されており、従来の肉製造システムは維持できなくなる。いくつかの肉起源、特に牛肉製造と比較すると、培養肉は、エネルギー使用の７～４５％、ＧＨＧ排出量の７８～９６％、土地使用の９９％、および水使用の８２～９６％を減少させ得る。

要旨
培養肉製品は、非効率的な従来の畜産農業とは対照的に、動物の筋肉細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養を通じて製造され得る新たな技術であり得る。従来の肉製品が、一般に、筋肉由来組織からだけはなく、数ある中でも脂肪および結合組織からも構成されているので、多数の細胞型が培養肉製品を作りだすのに望ましくあり得る。幹細胞分化は、異種培養肉製品のために多数の細胞および組織型を製造する高効率の手段を提供し得る。幹細胞などの細胞における強制的な一過性遺伝子発現、ならびにバイオリアクターにおける同時に起こる条件付けおよび拡大増殖は、培養肉製品を開発するのに高効率なおよび全体的なアプローチをもたらし得る。食用肉製品を製造するための方法およびシステムが本明細書に提供される。

本開示の種々の態様は、細胞を分化または分化転換して、食用肉製品を製造するための方法であって、１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む核酸分子を細胞に送達するステップ、核酸分子の送達後に、核酸分子またはその発現産物の援助により細胞の遺伝子発現をモジュレートして、細胞の少なくともサブセットを分化または分化転換して、１種または複数の標的細胞を生成するステップであって、モジュレートする際に、核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれない、ステップ、および （ｂ）において生成された１種または複数の標的細胞を少なくとも部分的に使用して、食用肉製品を製造するステップを含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、核酸分子は、２種またはそれよりも多くの異なるＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、細胞は、動物細胞を含む。一部の実施形態では、動物細胞は、ブタ細胞を含む。

一部の実施形態では、（ｃ）は、１種または複数の標的細胞から組織を製造するステップを含む。一部の実施形態では、組織は、筋肉組織、脂肪組織、神経組織、血管組織、上皮組織、結合組織、骨、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、１種または複数の標的細胞は。一部の実施形態では、方法は、少なくとも２種類の標的細胞を共培養して、三次元組織を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、１種または複数の標的細胞は、筋肉細胞、脂肪細胞、体節細胞、神経細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨細胞、またはそれらの組合せを含む。

一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、もしくはＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、非ロックド核酸分子を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の少なくとも１種は、非ロックド核酸モノマー（ｕＲＮＡ）により改変されている。一部の実施形態では、ｕＲＮＡは、ＲＮＡ分子の少なくとも１種とともにさまざまなポイントで組み込まれている。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、化学的に改変されて、その安定性が改善されている。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の少なくとも１種に対する化学的改変は、アンチ－リバースキャップアナログ、３’－グロビンＵＴＲ、ポリＡテール改変、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはそれらの組合せを含む。

核酸分子は、相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子をさらに含む、請求項１６に記載の方法。一部の実施形態では、核酸分子は、合成核酸分子である。一部の実施形態では、核酸分子は、中性もしくはアニオン性リポソーム、カチオン性リポソーム、脂質ナノ粒子、イオン化可能脂質、またはそれらの任意の組合せもしくは変形形態を用いて、細胞に送達される。

一部の実施形態では、核酸分子は、単一用量で、細胞に送達される。一部の実施形態では、核酸分子は、少なくとも２用量で、細胞に送達される。一部の実施形態では、少なくとも２用量の個々の用量は、少なくとも３日離れて送達される。一部の実施形態では、少なくとも２用量の個々の用量は、異なる核酸分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、最高で５００ｎＭの濃度で送達される。一部の実施形態では、核酸分子は、ＰＯＵＦ５１（ＯＣＴ３／４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞、成熟細胞、またはそれらの組合せを含む。

本開示の種々の態様は、食用肉製品を細胞から生成する方法であって、細胞を足場と接触させるステップ、細胞の少なくともサブセットを、足場の存在下、増殖因子または核酸分子の使用により、分化または分化転換プロセスに付して、それによって組織を生成するステップ、および組織を使用して、食用肉製品を製造するステップを含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、足場は、分解可能である。一部の実施形態では、食用肉製品は、足場の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、足場は、（ｂ）の間に、１日あたり少なくとも１％の速度で分解する。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞または成熟細胞を含む。一部の実施形態では、細胞を培養するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を、１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付して、細胞を拡大増殖するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、足場は、バイオリアクターチャンバーにおける１つまたは複数の拡大増殖プロセスの間に、細胞の拡大増殖を容易にするように構成される。一部の実施形態では、（ｂ）は、分化または分化転換した細胞を細胞から生成するステップ、および必要に応じて、足場内の分化または分化転換した細胞の融合を含む。一部の実施形態では、（ａ）は、細胞の少なくともサブセットを足場の表面上に堆積させるステップを含む。一部の実施形態では、表面は、接着性表面である。

一部の実施形態では、方法は、細胞の少なくともサブセットの細胞を足場から放出させるステップ、および放出された細胞を別個の足場の表面上に堆積させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、放出させるステップは、（ｃ）の前である。一部の実施形態では、分化または分化転換した細胞の融合の少なくとも５０％は、放出させるステップの前に起こる。

一部の実施形態では、培養するステップは、足場の存在下で実施される。一部の実施形態では、１つまたは複数の拡大培養プロセスは、足場の存在下で実施される。一部の実施形態では、培養するステップおよび１つまたは複数の拡大増殖プロセスは、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われる。一部の実施形態では、培養するステップは、バイオリアクターチャンバーにおいて行われ、１つまたは複数の拡大増殖プロセスは、追加のバイオリアクターチャンバーにおいて行われる。一部の実施形態では、追加のバイオリアクターチャンバーは、個々の細胞の拡大増殖プロセスを容易にするようにそれぞれ構成された複数の追加のバイオリアクターチャンバーを含む。一部の実施形態では、方法は、培養された細胞の少なくともサブセットをバイオリアクターチャンバーから複数の追加のバイオリアクターチャンバーに向かわせて、複数の拡大増殖プロセスを行うステップをさらに含む。一部の実施形態では、複数の拡大増殖プロセスの拡大増殖プロセスは、順次に、同時に、またはそれらの組合せで行われる。一部の実施形態では、複数の追加のバイオリアクターチャンバーは、少なくとも２つのバイオリアクターチャンバーを含む。一部の実施形態では、方法は、培地をバイオリアクターチャンバーおよび追加のバイオリアクターチャンバーを通して向かわせて、培養するステップまたは１つもしくは複数の拡大増殖プロセスを容易にするステップをさらに含む。一部の実施形態では、培地は、連続層流下にある。一部の実施形態では、培地は、細胞の培養または拡大増殖プロセスを促進するように構成されている。一部の実施形態では、方法は、培地を追加のバイオリアクターチャンバー外に向かわせるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、追加のバイオリアクターチャンバー外に向かった培地を濾過して、望ましくない構成要素を培地から除去し、それによって濾過された培地を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、濾過された培地をバイオリアクターチャンバーにリサイクルするステップをさらに含む。

一部の実施形態では、細胞は、動物由来幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、ブタ細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む。一部の実施形態では、細胞は、初期化幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。

一部の実施形態では、足場は、ポリマー材料を含む。一部の実施形態では、ポリマー材料は、合成ポリマー材料を含む。一部の実施形態では、合成ポリマー材料は、ポリエチレングリコール生体材料を含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール生体材料は、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含む。一部の実施形態では、足場は、ジェランガム生体材料、キャッサバ生体材料、トウモロコシ生体材料、アルギン酸塩生体材料、コーンスターチ生体材料、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。

一部の実施形態では、食用肉製品は、少なくとも５０グラムの単位形態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、ロインを含むｉｎ ｖｉｖｏ由来ステーキのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来ベーコンのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来豚脇腹肉のテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来ミンチのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来ソーセージのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来リブのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来チョップのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来保存肉製品のテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である。一部の実施形態では、食用肉製品は、さらに加工された食品製品に組み込まれる。一部の実施形態では、食用肉製品は、ビタミンおよびミネラルを含む栄養添加物を含む。

一部の実施形態では、１つまたは複数の拡大増殖プロセスは、培養細胞の少なくともサブセットを継代するステップを含む。一部の実施形態では、継代するステップは、酵素を培養細胞の少なくともサブセット上を通過させて、細胞を足場の表面から取り外すステップを含む。

本開示の種々の態様は、食用肉製品を細胞から生成するための方法であって、２種またはそれよりも多くの異所性分化因子を使用して一過的な非組み込みの様式で細胞における１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートして、前駆細胞を生成するステップ、前駆細胞の少なくともサブセットを分化して、最終分化した細胞を生成するステップ、および最終分化した細胞に少なくとも部分的に基づいて、食用肉製品を製造するステップを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、方法は、細胞、前駆細胞、および最終分化した細胞のうちの１種または複数を、培養するステップおよび／または拡大増殖プロセスに付すステップをさらに含む。一部の実施形態では、培養するステップおよび拡大増殖プロセスは、同じまたは異なるバイオリアクターチャンバーにおいて行われる。一部の実施形態では、最終分化した細胞は、筋肉細胞、脂肪細胞、体節細胞、神経細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨細胞、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、異所性分化因子は、核酸、ポリペプチド、低分子、増殖因子、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、（ｂ）は、細胞の細胞周期を停止することによって前駆細胞を分化するステップを含む。

一部の実施形態では、異所性分化因子は、増殖因子を細胞から低減または除去することを通して、細胞の細胞周期を停止する。一部の実施形態では、増殖因子は、ＬＩＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、アクチビン、ＭＡＰＫ、ＴＧＦ－β、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、細胞の細胞周期を停止することは、細胞を培養するステップが実施される溶液中の血清レベルを低減または除去することによって起こる。

本開示の種々の態様は、細胞を使用して食用肉製品を生成するための方法であって、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を含む２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を細胞に送達するステップ、

２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子の送達後に、２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子またはその発現産物の援助により細胞の遺伝子発現をモジュレートして、１種または複数の標的細胞を生成するステップであって、モジュレートするステップは、核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれないような一過性の様式である、ステップ、（ｂ）において生成された１種または複数の標的細胞を少なくとも部分的に使用して、食用肉製品を製造するステップを含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスによって生成される。一部の実施形態では、２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子は、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＰＯＵＦ５１（ＯＣＴ３／４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを標的にする。一部の実施形態では、２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子は、ｃＤＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む。

一部の実施形態では、（ｂ）は、遺伝子発現を増強する、低減する、または阻害するステップを含む。一部の実施形態では、遺伝子発現は、細胞中の１種または複数の遺伝子の発現を含む。一部の実施形態では、（ｂ）は、１種または複数の遺伝子のうちの第１の遺伝子の発現を増強するステップ、および１種または複数の遺伝子のうちの第２の遺伝子の発現を阻害するステップを含む。

一部の実施形態では、送達するステップは、単一用量の２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を含む。一部の実施形態では、送達するステップは、少なくとも２用量の２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を含む。一部の実施形態では、少なくとも２用量の個々の用量は、異なる核酸分子を含む。一部の実施形態では、少なくとも２用量は、異なる濃度の２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を含む。

本開示の種々の態様は、複数の細胞を足場と接触させるステップ、複数の細胞の少なくともサブセットを、足場の存在下、増殖因子または核酸分子の使用により、分化または分化転換プロセスに付して、それによって組織を生成するステップ、および組織を使用して、食用肉製品を製造するステップを含むプロセスによって調製された食用肉製品を提供する。一部の実施形態では、組織は、少なくとも２種類の細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも２種類の細胞は、筋細胞および脂肪細胞を含む。一部の実施形態では、組織は、筋細胞および脂肪細胞を含み、筋細胞の脂肪細胞に対する比は、９９：１～８０：２０である。一部の実施形態では、食用肉製品は、足場の少なくとも２質量％を含む。一部の実施形態では、食用肉製品は、５質量％未満の筋肉細胞外基質を含む。一部の実施形態では、複数の細胞は、幹細胞または成熟細胞を含む。一部の実施形態では、プロセスは、複数の細胞の少なくともサブセットを培養するステップをさらに含む。一部の実施形態では、プロセスは、複数の細胞の少なくともサブセットを１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付すステップをさらに含む。一部の実施形態では、足場は、拡張３次元構造を含む。一部の実施形態では、（ｂ）は、分化または分化転換した細胞を細胞から生成するステップ、および必要に応じて、足場内の分化または分化転換した細胞の融合を含む。

本開示の別の態様は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサによる実行の際に、上記のまたは本明細書の他の箇所の方法のいずれかを実施する機械実行コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。

本開示の別の態様は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサおよびそれに連結されたコンピュータメモリを含むシステムを提供する。コンピュータメモリは、１つまたは複数のコンピュータプロセッサによる実行の際に、上記のまたは本明細書の他の箇所の方法のいずれかを実施する機械実行コードを含む。

本開示の追加の態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し、記載する以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、本開示からすべて逸脱することなく、さまざまな自明な事項において改変が可能である。したがって、図面および説明は、事実上例示として見なされるべきであり、制限的なものとして見なされるべきではない。
参照による組み込み

本明細書に挙げられるすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれるように具体的におよび個々に示されたのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する程度まで、本明細書は、任意のそのような矛盾する資料にとって代わるか、および／またはそれに優先することが意図される。

本発明の新規な特色は、添付される特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の特色および利点の良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面（また本明細書では「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」および「図（ＦＩＧ．）」）に対する参照によって得られるであろう。

図１は、本明細書に提供される方法を実施するようにプログラムされたか、またはそうでなければ構成されたコンピュータシステムを示す。

図２は、フローチャート概略図の例を示し、ここで、食用生体材料足場および種特異的構築物が製造され得、細胞は、足場および構築物と接触して、１つまたは複数のバイオリアクターにおいて拡大増殖され、１つまたは複数のバイオリアクターにおいて分化され、層流培地が流され、バイオリアクタータンク間でリサイクルされる。

図３Ａは、ＭＹＯＤ ｍＲＮＡによる分化１０日後の多核化したＭＹＯＤ１を発現する筋線維の形成の例を示す。図３Ｂは、ＭＹＯＤ ｍＲＮＡによる分化３０日後の多核化し、整列したＭＹＯＤ１を発現する筋線維の形成の例を示す。

図４は、本開示の例に従う使用のためのバイオリアクターシステムの例を実証する概略図を示す。

図５Ａは、バイオリアクター中の棚の構成の例を実証する概略図を示す。それぞれの棚を青色で示す。培地をピンク色で示し、矢印により培地の流れを示す。培地および棚の間の薄い黄色の層を示し、これは細胞表面コーティングを示す。細胞は、細胞表面コーティングの上部において成長し、培地はそれらの上を流れる。図５Ｂは、それぞれのバイオリアクター全体にわたる培地の流れの方向（矢印）および棚の幾何学的配置（水平の線）を示す。

図６Ａ～６Ｃは、ブタ特異的ＭＹＯＤ１ ｍＲＮＡによる分化１４日後の多核化した筋線維の３つの例を示す。図６Ａは、筋線維の位相差画像を提供する。図６Ｂは、ファロイジンアクチン、ＭＹＯＤ１およびＤＡＰＩ核染色を対比する筋線維の蛍光画像を提供する。図６Ｃは、ミオシン重鎖およびＤＡＰＩ核染色を対比する筋線維の蛍光画像を提供する。 図６Ａ～６Ｃは、ブタ特異的ＭＹＯＤ１ ｍＲＮＡによる分化１４日後の多核化した筋線維の３つの例を示す。図６Ａは、筋線維の位相差画像を提供する。図６Ｂは、ファロイジンアクチン、ＭＹＯＤ１およびＤＡＰＩ核染色を対比する筋線維の蛍光画像を提供する。図６Ｃは、ミオシン重鎖およびＤＡＰＩ核染色を対比する筋線維の蛍光画像を提供する。

詳細な説明

本発明のさまざまな実施形態を本明細書に示し、記載しているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には自明であろう。多くの変形形態、変更および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者に思い当たり得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対するさまざまな代替が用いられ得ることが理解されるべきである。

「少なくとも」、「より大きい」または「より大きいまたはそれと等しい」という用語が一連の２つまたはそれよりも多くの数値中の最初の数値に先行する場合は常に、「少なくとも」、「より大きい」または「より大きいまたはそれと等しい」という用語は、その一連の数値中の数値のそれぞれに適用される。例えば、１、２、もしくは３より大きいまたはそれと等しいとは、１より大きいもしくは１と等しい、２より大きいもしくは２と等しい、または３より大きいもしくは３と等しいと同意義である。

「以下」、「未満」または「未満またはそれと等しい」という用語が一連の２つまたはそれよりも多くの数値中の最初の数値に先行する場合は常に、「以下」、「未満」または「未満またはそれと等しい」という用語は、その一連の数値中の数値のそれぞれに適用される。例えば、３、２、もしくは１未満またはそれと等しいとは、３未満もしくは３と等しい、２未満もしくは２と等しい、または１未満もしくは１と等しいと同意義である。

「ａ」または「ａｎ」という語の使用は、特許請求の範囲および／または本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは２つ以上」という意味とも矛盾しない。

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明確に示されない限り、または代替物が相互に排他的ではない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれよりも多くを意味し得る。

「約」という用語は、値が、デバイス、値を決定するために用いられる方法、または研究対象の中に存在する変動についての誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。上記の値に基づいて他に規定されない限り、「約」という用語は、列挙される値の±５％を意味する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、オープンエンドな連結動詞である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの１つまたは複数のこれら動詞の任意の形態または時制も、オープンエンドである。例えば、１つまたは複数のステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の方法は、これらの１つまたは複数のステップのみを持つことに限定されず、他の列挙されていないステップも包含する。

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「香味料」という用語は、一般に、食品または飲料の味および／または香りを指す。

「食品製品」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、ヒト、または例えば、飼育動物（例えば、イヌ、ネコ）、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ）および野生動物（例えば、非飼育肉食動物）を含む動物によって摂取され得る組成物を指す。この用語は、食品としての使用のために使用または調製され得る任意の物質、例えば、ヒトまたは動物によって代謝されて、エネルギーを与え、組織を構築し得る任意の物質を指し得る。これは、栄養または楽しみのために任意のヒトまたは動物によって食べられてもよく、または飲まれてもよい。食品製品は、炭水化物、脂肪、タンパク質、水、またはヒトもしくは動物によって摂取され得る他の成分を含んでいてもよい。

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一般にデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれかの、さまざまな長さのヌクレオチド（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、５００、１０００個、またはそれよりも多くのヌクレオチド）のポリマー形態を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、またはそれらのバリアントから選択される１つまたは複数のサブユニットを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、成長している核酸鎖に組み込まれ得る任意のサブユニットを含み得る。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵ、あるいはより相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵのうちの１つに特異的であるか、またはプリン（例えば、ＡもしくはＧ、またはそれらのバリアント）もしくはピリミジン（例えば、Ｃ、ＴもしくはＵ、またはそれらのバリアント）に相補的である任意の他のサブユニットであり得る。一部の例では、核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、一部の場合では、核酸分子は環状である。核酸の非限定的な例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。核酸は、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（単数または複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含み得る。核酸分子は、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。核酸は合成であってもよい。

国連の食糧農業機関は、肉の需要が、世界人口の急上昇に伴って続く４０年に３分の２超まで増加する可能性があり得、現在の製造方法が、この需要を満たすように持続可能ではないと推定している。肉製品は、現在、動物の筋肉から取り出され、肉処理者が、ステーキ、鶏胸肉、ラムチョップ、３枚おろしの魚、ポークチョップなどとして販売されるように、家畜の対応するカットを行っている。肉製品は、肉製品派生物、例えば、ミートボール、ハンバーガーパティ、フィッシュボール、ソーセージ、サラミ、ボローニャ、ハムなどに加工され得る挽肉、ならびにジャーキーなどの味付けまたは乾燥された筋肉組織または肉も含み得る。動物を使用する肉製品は、米国単独において製造されるすべてのコムギ、トウモロコシおよび他の穀物の７０％および牛肉１ポンドを製造するために必要な千ポンドを上回る水を消費する家畜による非効率的な食品源であり得る。家畜は、温室効果ガス（ＧＨＧ）排出量の１８％の原因となり、地球の地域の３０％、耕作地の７０％、および世界の淡水の８％を使用している。

畜産農業における工場式農場および低い動物福祉の状況は、生肉に生得のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．ＣｏｌｉおよびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒなどの有害細菌による食品由来の病の原因である。ブロイラーの２５％および鶏挽肉の４５％もの量が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して陽性と試験され得、疾病対策センターは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒがすべての鶏肉の７０％～９０％に感染していると推定している。細菌における多剤耐性は、食品添加物として家畜に与えられる米国で使用されるすべての抗生物質の７０％を用いる工業的肉製造によって助長されている。抗生物質の過剰使用は、抗生物質耐性菌、および２０１６年の中国の豚農場において出現したグラム陰性感染症の処置におけるラストライン治療であるコリスチンに対して耐性の細菌の主要な原因であり得る。工業的な畜産経営は、鶏および豚農場において広く循環しているＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１およびＨ３Ｎ２インフルエンザ、ならびに生鮮市場の状況から生じた可能性のある２０１９～２０２０年のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックによる新規人畜共通感染症の発見において長い間ウイルス学者の標的になっている。現在の製造方法よりも高効率で、安全で、健康的な肉製造の方法が必要とされている。

培養肉は、従来の畜産農業とは対照的に、動物起源の細胞（例えば、動物筋肉細胞）が、組織培養技法を使用して制御されたｉｎ ｖｉｔｒｏ環境で製造される新たな技術であり得る。現在の肉起源と比較すると、培養肉は、エネルギー使用の７～４５％、ＧＨＧ排出量の７８～９６％、土地使用の９９％、および水使用の８２～９６％を減少させ得る。無菌の制御された環境で製造された肉は、食品安全性を改善し得る。食品消費のための肉製品を製造するためのシステムおよび方法が本明細書に提供される。テクスチャードタンパク質を含む食用製品は、細胞の拡大増殖および分化または分化転換に由来し得る。細胞は、動物細胞であってもよい。動物細胞は、非ヒト細胞であってもよい。細胞は、ブタ細胞を含んでいてもよい。細胞は、幹細胞または成熟細胞であってもよく、それらから、分化または分化転換した細胞が生成されてもよい。方法は、バイオリアクターにおいて、足場の援助により実施されてもよい。足場は、分解可能であってもよく、および／またはヒト食物摂取に好適であってもよい。拡大増殖は、より大きなシステムに指数関数的に細胞の集団を成長させることを含んでいてもよい。細胞の拡大増殖は、細胞の数の増加をもたらすプロセスであり得、細胞分裂および死または分化を通じた細胞喪失の間のバランスによって影響を受け得る。

一部の態様では、本開示は、組織工学によって製造された食品製品を製造するためのシステムおよび方法を提供し得る。食品製品は、エネルギーを与え、組織を構築するために、ヒトまたは動物によって摂取および代謝され得る任意の組成物であり得る。これは、栄養または楽しみのために任意のヒトまたは動物によって食べられてもよく、または飲まれてもよい。食品製品は、炭水化物、脂肪、タンパク質、水、または他の成分を含んでいてもよい。食品製品は、ヒトまたは動物によって摂取され得る組成物を作製するために、他の成分と組み合わされてもよく、またはそれらに添加されてもよい。食品製品は、肉製品であってもよい。肉製品は、ヒトの食品として使用できる任意の動物肉（例えば、牛肉、豚肉、鳥肉、魚）を包含し得る。肉製品は、異なる起源から生成されてもよい。例えば、肉製品は、全体的にまたは部分的に、任意のウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギまたは家禽の死体の任意の肉または他の部分からできていてもよい。肉製品は、動物肉様製品、例えば、培養肉であってもよく、これは、肉の官能特性を有する食品として食べられる。培養肉は、天然肉の１つまたは複数の特性を有し得る培養食品製品であってもよい。培養肉製品は、肉製品として使用される、筋肉細胞、脂肪細胞、結合組織、血液、または他の構成要素（例えば、タンパク質）などの動物細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物を含んでいてもよい。培養肉は、培養動物細胞を含んでいてもよい。培養肉は、最小限の加工を伴う無傷の肉様組成物を含んでいてもよく、またはすべての任意の種類の肉、鳥肉もしくは獲物の産物を、ピース、カット、または粉砕されて含んでいてもよく、これは、任意の度合いまで加工されてもよく、またはナゲットもしくはパティなどの不均一な組成の食品製品に組み込まれてもよい。培養肉は、牛肉、鳥肉、ラム、魚、豚肉、または他の畜産物の対応するカットと似ていてもよい。培養肉は、ステーキ（ロインを含む）、ミンチ、ソーセージ、リブ、チョップ、保存肉、豚脇腹肉、ベーコン、鶏胸肉、ラムチョップ、３枚おろしの魚、またはポークチョップなどの全肉製品と似ていてもよい。培養肉は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長した筋肉組織を粉砕または切り刻むことによって調製され、適切な香味料と混合された肉製品または肉製品派生物であってもよい。そのような肉製品は、挽肉、ミートボール、ハンバーガーパティ、フィッシュボール、ソーセージ、ナゲット、サラミ、ボローニャ、ハム、またはランチミートに加工されてもよい。肉製品は、ジャーキーなどの味付けまたは乾燥された製品も含み得る。肉製品を使用して、動物の肉が起源のまたはそれに類似する任意の種類の食品製品が生成されてもよい。肉製品は、植物起源物質、および植物起源物質に相互に組み込まれた培養された肉、細胞または物質を含むハイブリッド食品製品を含んで、単独の植物起源物質と比較して、官能性および栄養価が改善された一体化食品製品を形成してもよい。肉製品は、体液、例えば、唾液、血清、血漿、粘液、尿、糞便、涙液、乳などを含んでいなくてもよく、または体液を含んでいてもよい。

培養細胞または組織は、少なくとも１種の他の成分と組み合わされていてもよい。培養細胞または組織を、少なくとも１種の他の成分と組み合わせて、所望のテクスチャ、水分保持、製品接着、またはそれらの任意の組合せを有する食品製品を得てもよい。培養細胞は、制御された条件下、例えば、それらの天然環境外のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で成長した細胞であってもよい。成分は、バインダー、フィラー、または増量剤を含み得る。フィラーまたはバインダーは、デンプンなどの炭水化物を含む非肉物質を含んでいてもよい。フィラーおよびバインダーとしては、ジャガイモデンプン、小麦粉、卵、ゼラチン、カラギーナン、およびタピオカ粉が挙げられ得る。増量剤は、高タンパク質含有量を有していてもよい。増量剤は、ダイズタンパク質、乳タンパク質、または肉由来タンパク質を含んでいてもよい。風味、テクスチャまたは他の料理特性を提供する成分が、肉製品に添加されてもよい。例えば、細胞外基質タンパク質を使用して、構造的な堅さおよびテクスチャをモジュレートしてもよい。ヘムまたはコラーゲンなどのタンパク質が、細胞外基質に組み込まれて、最終食品製品の味およびテクスチャに寄与してもよい。全動物由来の肉製品において通常欠いているビタミンなどの栄養素が、添加されて、肉製品の栄養価を増加させてもよい。これは、成長培地への栄養素の連続した添加を通して、または代替法によってのいずれかで達成されてもよい。例えば、ビタミンＤ、Ａまたは異なるビタミンＢ複合体などの特定のビタミンの生合成に関与する酵素は、培養筋肉細胞にトランスフェクトされて、これらの細胞内で特定のビタミンを産生してもよい。

培養肉製品は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を組織産物まで培養することによって、製造されてもよい。細胞は、細胞膜、遺伝子材料を構成する少なくとも１種の染色体、細胞質、ならびにエネルギーおよびタンパク質合成、呼吸、消化、栄養素の貯蔵および輸送、自発運動または細胞分裂などの１つまたは複数の生体機能を行うように適合または特殊化されているさまざまな細胞小器官を含んでいてもよい。細胞は、１種または複数の細胞を含んでいてもよい。細胞は、体細胞、最終分化した細胞、幹細胞、胚細胞、成熟細胞などを含んでいてもよい。体細胞は、生殖細胞系列細胞ではない生物の身体を形成する任意の細胞であり得る。体細胞における突然変異は、個々の生物に影響を及ぼし得るが、子孫に受け継がれない。細胞は、衛星細胞、筋芽細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞、周皮細胞、胚体外細胞系、体細胞系、脂肪細胞、軟骨細胞、体節細胞、血液細胞、間葉系細胞、または幹細胞を含んでいてもよい。筋細胞は、すべての筋肉組織の最も小さなサブユニットであり得る。骨格筋の筋細胞は、間葉系幹細胞から骨格筋の筋芽細胞に分化し、ユニットとして振る舞う多核化した筋線維である筋原線維に融合し得る。これらの筋原線維は、重なりあっているフィラメントである筋フィラメントから構成され得、これは、厚いものおよび薄いものの両方であり、一連の運動タンパク質を使用してその長さの収縮を可能にする。脂肪細胞は、含脂肪組織から主に構成され、脂肪としての合成およびエネルギーの貯蔵に特殊化された細胞であり得る。脂肪細胞は、脂肪生成を通して間葉系幹細胞に由来し得る。脂肪細胞は、単一の大きな脂肪滴としてエネルギーを貯蔵し、重要な内分泌機能を有する白色脂肪細胞、および多数の小さな脂肪滴にエネルギーを貯蔵するが、特に身体の熱を生成するための燃料としての使用のための褐色脂肪細胞であってもよい。細胞は、筋原性細胞であってもよい。筋原性細胞は、ネイティブに筋原性であってもよい（例えば、培養基盤において培養される筋原性細胞である）。ネイティブな筋原性細胞としては、限定されるものではないが、筋芽細胞、筋細胞、衛星細胞、サイドポピュレーション細胞、筋肉由来幹細胞、間葉系幹細胞、筋原性周皮細胞、またはメソ血管芽細胞が挙げられる。筋原性細胞は、ネイティブに筋原性でなくてもよい（例えば、培養基盤において筋原性細胞になるように特殊化された非筋原性細胞である）。非筋原性細胞としては、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚体外細胞系、および筋肉細胞以外の体細胞が挙げられる。細胞は、野生型細胞であってもよく、または遺伝子改変された細胞（例えば、トランスジェニック、ゲノム編集されたもの）であってもよい。非筋原性細胞は、改変されて、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、パラログ、オルソログ、またはそれらの遺伝的変異体などの１種または複数の筋原性転写因子の発現を通して筋原性細胞になってもよい。筋芽細胞決定タンパク質（ＭＹＯＤ）は、骨格筋特異的転写因子、および筋肉分化の調節において重要な役割を果たす動物におけるタンパク質であり得る。ＭＹＯＤは、中胚葉細胞を骨格筋芽細胞系列にコミットさせ、筋芽細胞の分化および増殖を調節し得る。ＭＹＯＤは、骨格筋分化の主要調節遺伝子と考えられ得、線維芽細胞および他の細胞型を骨格筋に変換するその能力は、筋形成におけるその中心的な役割を支持する。

細胞は、骨格筋細胞または平滑筋細胞を含む筋肉細胞などの特定の種類の細胞に分化してもよい。分化は、若い特殊化されていない細胞が、個々の特徴を獲得し、それらの特殊化された形態および機能に達する間のプロセスを指し得る。細胞分化は、単一細胞および遺伝子型が、数十～数百の異なる細胞型および表現型を生じるのを可能にし得る。分化を通して、全能性細胞は、多能性または複能性を通して移動して、最終的に系列にコミットした状態に達し得る。細胞は、幹細胞を含んでいてもよく、これは、多数の細胞型に分化する発達可能性を有する、細胞分裂を通してそれら自身を再生することができる任意の特殊化されていない細胞であり得る。幹細胞は、発達可能性に関する特定の暗示的な意味なしに、多数の細胞型に分化する発達可能性を有し得る、細胞分裂を通して自己再生が可能な任意の特殊化されていない細胞であり得、例えば、幹細胞は、全能性、多能性、複能性などであり得る。幹細胞は、増殖でき、かつその発達可能性を維持しながらより多くのそのような幹細胞を生じることができる細胞であり得る。幹細胞は、特定の状況下で、より特殊化または分化した表現型に分化する発達可能性を有し、ある特定の状況下で、実質的に分化せずに増殖する能力を保持する、細胞の任意のサブセットを指し得る。幹細胞は、分化によって、例えば、胚細胞および組織の漸進的な多様化において起こるような個々の特徴を完全に獲得することによって、多くの場合異なる方向で、子孫（子孫細胞）を特殊化する天然に存在する親細胞を指し得る。一部の分化した細胞は、より多くの発達可能性の細胞を生じる能力を有し得る。そのような能力は、天然であってもよく、またはさまざまな因子による処理の際に人工的に誘導されてもよい。幹細胞として開始する細胞は、分化した表現型の方に進行する可能性があるが、次いで、「逆に」誘導され、幹細胞表現型を再発現することができる。

幹細胞は、全能性、多能性、複能性、寡能性、または単能性であってもよい。幹細胞は、胚性幹細胞、動物幹細胞、成体幹細胞、誘導多能性幹細胞、初期化幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、または前駆細胞を含み得る。胚性幹細胞は、３つすべての胚性生殖層（内胚葉、外胚葉および中胚葉）の細胞に分化することができるか、または非分化状態を残すことができる胚細胞を指し得る。胚性幹細胞は、着床前胚盤胞などの胚の着床前の妊娠後に形成される胚組織（例えば、胚盤胞）から得られる細胞、着床後／原腸形成前ステージの胚盤胞から得られる拡大胚盤胞細胞、胎児の生殖組織から得られる胚性生殖細胞、および単為生殖（単為生殖生物）によって刺激された未受精卵が起源の細胞を含み得る。胚性幹細胞は、限定されない自己再生能および多能性分化能力を有する。成体幹細胞は、出生後または出生前の動物のいずれかの体細胞組織に由来する任意の幹細胞であり得る。成体幹細胞は、その未分化状態を維持しながら、複能性である明確ではない自己再生が可能で、多数の細胞型に分化が可能であり得る。成体幹細胞は、任意の成体、新生児または胎児の組織、例えば、含脂肪組織、皮膚、腎臓、肝臓、前立腺、膵臓、腸、骨髄および胎盤に由来し得る。誘導多能性幹細胞またはｉＰＳＣは、多能性が授けられた成体体細胞の脱分化によって得られる任意の細胞を含み得、細胞は、内胚葉、外胚葉および中胚葉の３つの胚性生殖細胞層に分化することができる。そのような細胞は、分化した組織（例えば、皮膚などの体細胞組織）から得てもよく、細胞を初期化して、幹細胞様特徴を獲得する遺伝子操作による脱分化を受けてもよい。ｉＰＳＣは、細胞または細胞の集団（例えば、体細胞）の発達可能性を逆転させるプロセスを通して形成され得る。ｉＰＳＣは、より高い発達可能性を有する状態に細胞を駆動するプロセスを受けた細胞、例えば、低い分化状態へ逆行駆動されている細胞であり得る。ｉＰＳＣへの誘導前の体細胞は、部分的にまたは最終的に分化し得る。これらは、分化状態の完全なまたは部分的な復帰、すなわち、多能性状態を有する細胞への細胞の発達可能性の増加であり得る。体細胞は、多能性状態に駆動され得、その結果、細胞は、胚性幹細胞表現型に類似する胚性幹細胞の発達可能性を有する。体細胞の誘導は、複能性状態への、分化状態の部分的な復帰、または体細胞もしくは単能性細胞などの細胞の発達可能性の部分的な増加も包含し得る。誘導は、追加の操作に付された場合に、多能性状態への完全な誘導に対して細胞をより感受性にする状態への細胞の分化状態の部分的な復帰も包含し得る。幹細胞は、初期化細胞を含み得る。細胞の初期化は、細胞または細胞の集団（例えば、体細胞）の発達可能性を逆転させるプロセスであり得る。初期化は、より高い発達可能性を有する状態に細胞を駆動する、例えば、低い分化状態に細胞を逆行駆動するプロセスであり得る。初期化される細胞は、初期化の前に、部分的にまたは最終に分化され得る。初期化は、分化状態の完全なまたは部分的な復帰、例えば、多能性状態を有し、体細胞を多能性状態に駆動する細胞への細胞の発達可能性の増加が推測され得、その結果、細胞は、胚性幹細胞表現型などの胚性幹細胞の発達可能性を有するか、あるいは複能性状態への体細胞もしくは単能性細胞などの細胞の分化状態の部分的な復帰、またはその発達可能性の部分的な増加を包含し得る。初期化は、追加の操作に付された場合に、多能性状態への完全な初期化に対して細胞をより感受性にする状態への細胞の分化状態の部分的な復帰も包含し得る。造血幹細胞は、任意の年齢の個体の血液もしくは骨髄組織から、または新生個体の臍帯血から得られる幹細胞を含む、成体組織幹細胞であり得る。これらの細胞は、造血の間に他の血液細胞を生じ得る。造血幹細胞は、自己再生する能力を有し得、赤血球、血小板、好塩基球、好中球、好酸球、単球、Ｔリンパ球およびＢリンパ球などのありとあらゆる多様な成熟機能性造血細胞型を生成することが可能な多能性であり得る。間葉系幹細胞は、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（軟骨組織の細胞）、筋細胞（筋肉細胞）、脂肪細胞（髄含脂肪組織を生じる脂肪細胞）、およびニューロン様細胞を含む各種の細胞型に分化することができる複能性間質細胞であり得る。間葉系幹細胞は、髄および他の非髄組織、例えば、胎盤、臍帯血、含脂肪組織、成体筋肉、角膜実質、または乳歯の歯髄に由来していてもよい。細胞は、器官全体を再構築する能力を有していなくてもよいが、それらの複能性を維持しながら自己再生が可能であり得る。前駆細胞は、細胞の少なくとも１つの特定の種類に分化する能力を維持しているが、幹細胞よりも特殊化され、標的細胞に分化を推し進める任意の細胞を含み得る。前駆細胞は、不確定に複製することができなくてもよく、限定された回数のみ分裂してもよい。細胞はまた、分化転換された成熟細胞などの初期化細胞を含んでいてもよく、ここで、体細胞は、中間の増殖幹細胞段階を通ることなく、別の系列に初期化またはそうでなければ誘導されてもよい。分化転換した成熟細胞は、中間の増殖多能性幹細胞ステージを通ることなく、別の系列に初期化またはそうでなければ誘導される体細胞であってもよい。成熟細胞の直接分化転換は、転写因子の一過性の強制的な発現、異なるトランスフェクションの方法、培養条件および低分子または増殖因子の補充を通して起こり得る。

細胞は、哺乳類（例えば、ウシ、バッファロー、ブタ、ヒツジ、シカなど）、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ダチョウ、シチメンチョウ、キジなど）、魚類（例えば、メカジキ、サーモン、マグロ、シーバス、トラウト、ナマズなど）、無脊椎動物（例えば、ロブスター、カニ、エビ、二枚貝、カキ、ムール貝、ウニなど）、爬虫類（例えば、ヘビ、アリゲーター、カメなど）、または両生類（例えば、カエルの足）などの任意の非ヒト動物に由来していてもよい。細胞は、哺乳類細胞であってもよい。一部の場合では、哺乳類細胞は、ウシ細胞、バッファロー細胞、ブタ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、シカに似た細胞、バイソン細胞、ラクダ細胞、シカ細胞、またはラピーヌ細胞であってもよい。細胞は、鳥類細胞であってもよい。一部の場合では、鳥類細胞は、カモ細胞、ニワトリ細胞、ガチョウ細胞、シチメンチョウ細胞、ダチョウ細胞、またはキジ科細胞であってもよい。細胞は、魚細胞であってもよい。細胞は、無脊椎動物細胞であってもよい。一部の場合では、無脊椎動物細胞は、ロブスター細胞、カニ細胞、またはオストラシン（ｏｓｔｒａｃｉｎｅ）細胞であってもよい。細胞は、爬虫類細胞であってもよい。一部の場合では、爬虫類細胞は、ヘビ細胞、アリゲーター細胞、またはカメ細胞である。細胞は、両生類細胞であってもよい。一部の場合では、両生類細胞は、カエル細胞である。

細胞由来肉製品は、骨格筋の筋細胞などの１つの細胞型、または骨格筋の筋細胞および脂肪細胞の組成物などの異種共培養組成物を含んでいてもよい。複数の単一細胞型が、個々に培養され、次いで、最終製品に組み合わされてもよい。肉製品は、ｅｘ ｖｉｖｏで成長した筋肉細胞に由来していてもよく、任意の非ヒト動物にも由来する脂肪細胞を含んでいてもよい。筋肉細胞の脂肪細胞に対する比は、最適な風味および健康効果を有する肉製品を製造するために調節され得る。肉製品は、筋細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、ニューロン、内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、軟骨細胞、腎臓細胞、心筋細胞、またはそれらの組合せに由来していてもよい。組織は、筋肉組織、脂肪組織、神経組織、血管組織、上皮組織、結合組織、骨、またはそれらの組合せを含み得る。肉製品は、器官肉または結合組織肉、例えば、肝臓、腎臓、心臓、舌、脳、足、トリッパ、スイートミート、砂嚢、大網膜、子牛などの膵臓、膵臓、胃、肺、腸、胎盤、小腸、精巣、または足部を含んでいてもよい。調節は、培養において最初に播種される筋肉および脂肪細胞の比を制御することによって、および／または所望により、増殖因子もしくは分化因子（例えば、ｍＲＮＡ）、または筋肉細胞、脂肪細胞もしくは別の細胞型において作用する他の要素の濃度および比を変えることによって、達成されてもよい。
細胞分化

本開示の態様は、動物細胞（例えば、ブタ細胞）を使用する食用肉製品を製造する方法を提供する。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われ得る。方法は、核酸分子を細胞に送達するステップを含み得る。核酸分子は、１種または複数のＲＮＡ分子を含み得る。送達後、細胞の遺伝子発現（例えば、細胞における１種または複数の遺伝子の発現）が、核酸分子または核酸分子の発現産物（例えば、タンパク質）によってモジュレートされ得る。モジュレーションの際に、細胞は、例えば前駆細胞または最終分化した細胞を含む１種または複数の標的細胞に、分化または分化転換され得る。細胞分化または分化転換は、細胞に送達された核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれない間に、一過性の様式で実施され得る。標的細胞の生成の後、肉製品は、標的細胞の少なくとも一部分を使用して製造され得る。

一部の場合では、標的細胞は、食用肉製品を製造するための組織を製造するために使用され得る最終分化した細胞である。最終分化した細胞は、特殊化された機能を獲得する過程にあり、したがって、他の種類の細胞に転換することができなくてもよい、細胞であり得る。これらの細胞は、哺乳類の身体の大部分を構成し得、増殖することが不可能であり得る。最終分化した細胞は、１種類の最終分化した細胞を含んでいてもよく、または少なくとも２種類の最終分化した細胞を含んでいてもよい。２種またはそれよりも多くの種類の最終分化した細胞は、筋細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、ニューロン、内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、または軟骨細胞を含み得る。組織は、筋肉組織、脂肪組織、神経組織、血管組織、上皮組織、結合組織、骨、またはそれらの組合せを含み得る。筋肉組織は、運動能力を脊椎動物に提供するだけでなく、代謝および内分泌の役割を果たす横紋筋の形態であってもよい。骨格筋は、大きな力が動作を可能にする収縮の間に生じるのを可能にする、融合され、方向付けられた筋芽細胞から構成され得る。ヒトの食品を製造するために使用される家畜、魚および獲物の骨格筋の質量は、それらの体重の３５～６０％に相当し、形状、サイズ、解剖学的位置、および生理学的機能の幅広い多様性を示し得る。含脂肪組織または脂肪組織は、脂肪細胞から構成される緩い結合組織であり得る。含脂肪組織の主な機能は、脂肪の形態でエネルギーを貯蔵することであり得る。含脂肪組織は、筋肉内または筋肉外であり得る。筋肉内脂肪含有量は、肉の風味、ジューシーさ、柔らかさ、および視覚的な特徴に影響を及ぼし得る。筋肉内脂肪の増加の役割および食品製品に関する美味しさの間に一般的な関係が存在し得る。

細胞の表現型または遺伝子型は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、免疫組織化学的検査、または質量分析を使用して決定されてもよい。異なる細胞で得られる質量スペクトルは、細胞培養のプロテオミクス状態のきめの細かい記載、または細胞の分化状態を特定するために使用され得る細胞型のフィンガープリントを提供し得る。決定された細胞のプロテオミクスフィンガープリントを使用して、他の化合物および抗菌薬標的に対する精密なそれらの効果を特徴付けてもよい。細胞培養物の質量スペクトルは、最小限の試料調製、少量の試料を必要とし得、細胞型の迅速な特定を可能にする大規模細胞培養のための特定のハイスループット方法を提供する。類似の分子量を有するペプチドおよびタンパク質のいくつかの対のマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）における異なる脱着およびイオン化能力は、互いについての、特に類似の構造を共有するものについての内部標準として見なされ得る。細胞系において検出されるピーク対の相対強度は、高度に保存され得る。異なる種の細胞が混合または共培養された場合、比例計測ピーク情報を、定量分析のための細胞フィンガープリントとして利用することができ、このようにして、質量スペクトルのこれらのピーク対の比の値に従って、異なる細胞型の迅速な特定および定量化が可能になる。イメージング技術と一緒に、肉製品中の異種組織における異なる細胞型の比を可能にする全組織中の細胞型の分布および割合を推定し得る。

従来の畜産農業とは対照的に、自己再生能を有する細胞は、単離され得るか、または作出され得、肉に類似する組織構造に無期限で細胞培養において成長し得る。胚性幹細胞および多能性前駆細胞などのそのような細胞は、天然に、自己再生が可能であり得るか、または自己再生する能力を獲得するように操作され得る。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、人工的に誘導された胚性幹細胞様細胞である。これらの細胞は、初期化因子（多能性遺伝子の発現を駆動する転写因子）の導入により体細胞を初期化することによって作出され得る。ｉＰＳＣは、自己複製性であり、拡大増殖して、集団を増加させ得る。骨格筋の筋細胞または脂肪細胞などの所望の細胞型が、細胞の環境および分化因子の操作を使用して、ｉＰＳＣから生成され得る。培養細胞は、筋肉細胞、脂肪細胞または器官細胞などの所望の細胞型を生成する分化経路が下向きに方向付けられてもよい。従来の肉製品は、多数の組織および細胞型の不均一な組合せよりもむしろ、均一な組成物ではなく、細胞の集団は、多数の細胞型に分化されてもよく、または独立した細胞集団は、異なる細胞型に分化され、その後組み合わされて、筋肉および脂肪細胞の両方、または他の所望の細胞型を含む組成物が製造され得る。

細胞の指向性分化は、分化因子および低分子を使用する化学的方法、細胞内での遺伝子発現を強制する遺伝子編集技法を使用する遺伝的方法、または目的の遺伝子挿入物をコードするウイルス構築物を使用して、感染および強制的な遺伝子発現を促進するウイルス形質導入により起こり得る。幹細胞において１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートするステップは、ＲＮＡの導入を含み得る。「発現」、「細胞発現」または「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が、機能的遺伝子産物の合成において使用され得るプロセスを指し得る。これらの産物は、タンパク質であってもよく、または機能的ＲＮＡであってもよい。発現は、遺伝子が、ｍＲＮＡに転写され、次いで、タンパク質に、またはＲＮＡに転写されたが、タンパク質に翻訳されていない遺伝子に翻訳されることを含み得る。導入されたＲＮＡは、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、またはそれらの任意のバリアント、アナログもしくは組合せなどの筋原性遺伝子を含み得る。

ＲＮＡは、発現ベクターを使用して、細胞に導入または送達されてもよい。ベクターは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる任意の核酸分子を含み得る。ベクターは、プラスミドを含み得、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形の二本鎖ＤＮＡループであり得るが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅から、または円形プラスミドの制限酵素による処理から生じるものなどの直線状の二本鎖分子も含む。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人口染色体（ＹＡＣ）が挙げられ得る。ベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得るウイルスベクターを含み得る。一部のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製が可能であり得る（例えば、宿主細胞において機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入の際に、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製される。一部のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能であり得る。発現は、安定または一過性であり得る。安定発現または一過性発現は、安定なもしくは一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、または組み換えウイルスベクターによる感染により達成され得る。トランスフェクションは、高等および下等な真核細胞の両方である真核細胞、ならびに酵母および真菌細胞への異種核酸の導入であり得る。トランスフェクションは、意図的に、核酸を真核細胞に人工的に導入して、細胞自身の機構を使用してタンパク質の発現もしくは産生を可能にするか、または翻訳を停止することによって特定のタンパク質の産生を下方調節する。

ウイルス感染による核酸の導入は、リポフェクションおよび電気穿孔などの他の手段よりも高いトランスフェクション効率を有し得る。ウイルスまたは非ウイルス構築物によるトランスフェクションは、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および脂質に基づく系を使用することを含み得る。脂質は、脂肪酸アシル基（例えば、飽和または不飽和アシル鎖）を含む１種または複数の分子（例えば、生体分子）であり得る。脂質としては、油、リン脂質、遊離脂肪酸、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドが挙げられ得る。遺伝子の脂質媒介移入のための有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ－Ｃｈｏｉを含み得る。ヌクレオチドは、中性もしくはアニオン性リポソーム、カチオン性リポソーム、脂質ナノ粒子、イオン化可能脂質、またはそれらの任意の組合せもしくは変形形態によって送達され得る。好ましい構築物は、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス構築物などのウイルス構築物は、少なくとも１種の転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座を規定するエレメント、または選択的スプライシング、核ＲＮＡ搬出、またはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他のアプローチによって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含んでいてもよい。ベクター構築物は、パッケージングシグナル、長い末端反復配列（ＬＴＲ）またはその部分、または使用されるウイルスに適切なプラスおよびマイナス鎖のプライマー結合部位をさらに含んでいてもよい。構築物はまた、それが置かれる宿主細胞からのペプチドの分泌のためのシグナル配列を含んでいてもよい。シグナル配列は、哺乳類シグナルを含み得る。カチオン性脂質のポリリシンまたはデンドリマーなどの他の非ウイルスベクターを使用することができる。発現構築物は、挿入されるコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含んでいてもよい。発現構築物は、発現されるペプチドの安定性、産生、精製または収量を増強するために遺伝子操作された配列をさらに含んでいてもよい。例えば、一部のＭＹＯＤ１および／またはミオゲニンタンパク質および異種タンパク質を含む融合タンパク質または切断可能融合タンパク質の発現を、遺伝子操作することができる。原核細胞または真核細胞は、目的のポリペプチドを発現するための宿主発現系、例えば、微生物、例えば、コード配列を含有する、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；コード配列を含有する、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染したか、または組み換えプラスミド発現ベクター、例えば、Ｔｉプラスミドで形質転換された植物細胞系として使用することができる。哺乳類発現系を使用して、目的のポリペプチドを発現させることもできる。

本明細書に記載されるように、強制的な、一過性の非組み込み遺伝子発現は、さまざまな核酸分子、例えば、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ｍＲＮＡ、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはそれらの任意のバリアント、組合せもしくはアナログを使用して達成することができる。核酸は、天然が起源であってもよく、または合成核酸分子であってもよい。遺伝子発現は、細胞に送達される核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれないような一過性の非組み込みであってもよい。細胞に導入されるｍＲＮＡは、ナイーブ幹細胞が成熟細胞型に分化するのに十分であり得る翻訳によってタンパク質を作製してもよい。ｍＲＮＡを使用して、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの細胞を骨格筋の筋細胞に分化するか、または線維芽細胞などの成熟細胞を骨格筋の筋細胞に分化転換することができる。ｍＲＮＡ分化プロトコールは、短くてもよく（例えば、約１５日未満もしくはそれに等しい、１４日、１３日、１２日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、またはそれ未満）、ｍＲＮＡが、そうでなければ分解され、宿主細胞ゲノムに組み込まれないので、有害効果を引き起こさないか、またはそれを保有することはなくてもよい。ｍＲＮＡは、遺伝子の遺伝子配列に対応する一本鎖ＲＮＡ分子であり得、転写のプロセスにおいてリボソームによって読み取られ得る。ｍＲＮＡは、遺伝子のＤＮＡ鎖の１つに相補的であり得る。ｍＲＮＡ分子は、ＤＮＡコードの一部分を、プロセシングのために細胞の他の部分に運び得る。ｍＲＮＡは、転写の間に作出され得、ここで、ＤＮＡの一本鎖は、ＲＮＡポリメラーゼによって解読され、ｍＲＮＡを合成する。

核酸分子は、配列特異的な様式で、遺伝子発現を、抑制、増強または阻害し得る。核酸分子は、エンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）を含んでいてもよく、これは、特定の遺伝子または遺伝子のセットの発現を増加させ得る。核酸分子は、遺伝子または遺伝子転写物に結合し、それによってその発現を阻害するように構成された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得る。ｓｉＲＮＡは、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨げ得る短い二本鎖ＲＮＡの非コードＲＮＡ分子のクラスであり得る。ｓｉＲＮＡは、転写後にｍＲＮＡを分解することによって、遺伝子発現を妨げ、翻訳を防止し得る。一部の場合では、ｓｉＲＮＡ分子は、２０～２４塩基対を含む。一部の場合では、ｓｉＲＮＡ分子は、リン酸化された５’末端およびヒドロキシル化された３’末端を含む。ｓｉＲＮＡは、分解のために相補的ｍＲＮＡを標的にし、このようにして翻訳を防止し得る。核酸分子は、ｓｉＲＮＡ前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ配列を含み、細胞との接触の際の切断のために構成されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含み得る。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節において機能する小型の非コードＲＮＡ分子であり得る。ｍＲＮＡ分子内の相補的配列とのｍｉＲＮＡ塩基対は、ｍＲＮＡ分子をサイレンシングする。サイレンシングは、ｍｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する際に、ｍＲＮＡ鎖の２片への切断、ポリＡテールの短縮によるｍＲＮＡの不安定化、またはリボソームによるｍＲＮＡのタンパク質への非効率的な翻訳を通して達成され得る。筋原性遺伝子発現のモジュレーションは、ｍｉＲＮＡにより起こり得る。筋原性遺伝子発現をモジュレートし得るｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－２９ｂ／ｃ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ｂ／４９９、ｍｉＲ－２１４、ｍｉＲ－２２１／２２２、ｍｉＲ－３２２／４２４、ｍｉ４８６、またはｍｉＲ－５０３を含み得る。これらのｍｉＲＮＡは、筋芽細胞／衛星細胞の増殖および分化などの骨格筋形成のプロセスを調節し得る筋原性転写因子であるＳＲＦ、ＭｙｏＤまたはＭＥＦ２の制御下で心筋および骨格筋において特異的に発現され得る。

トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、ｍＲＮＡ中の３－ヌクレオチドコドンによって方向付けられるように、アミノ酸をリボソームに運ぶことによって、ｍＲＮＡおよびタンパク質のアミノ酸配列の間の物理的連結として機能するＲＮＡから構成された翻訳に重要なアダプター分子である。ｔＲＮＡは、それぞれのアミノ酸のそのコグネートｔＲＮＡへのライゲーションを触媒することによって、タンパク質合成の開始に必須であり得る。これらの実体の翻訳機能は、筋形成および筋原性分化／増殖に必要であり得る。筋原性遺伝子発現をモジュレートし得るｔＲＮＡは、ロイシル－ｔＲＮＡシンテターゼ、リシンに対するｔＲＮＡ遺伝子、またはフェニルアラニンに対するｔＲＮＡ遺伝子を含み得る。

ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ分子から合成され、逆転写酵素によって産生するＤＮＡコピーであって、鋳型としてＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを使用し得るＤＮＡポリマーであり得る。ｃＤＮＡは、細胞に送達（例えば、トランスフェクト）されて、目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡはレシピエント細胞に移入され得る。核酸分子は、細胞または幹細胞に送達されて、細胞において１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートし得る。モジュレーションは、核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれないような一過性の非組み込み様式であってもよい。前駆細胞は、ｃＤＮＡ分子の送達後に生成され得る。

強制的なヒトＭＹＯＤ１発現は、時々、ヒトｉＰＳＣおよび線維芽細胞を、ある特定の構築物により、７日で骨格筋の筋細胞に分化させ得る。しかしながら、ヒト細胞のために使用されるプロトコールは、非ヒト種に直接移転可能でないことがある。加えて、新規ｍＲＮＡ転写物は、５’から３’へのシス作用性エレメント、キャップ構造、５’ＵＴＲ、改変ヌクレオチドを有するコード領域、３’ＵＴＲおよびポリＡテールなどのさまざまなｍＲＮＡ発現構造に基づいて、個々の種に対する異なる遺伝子配列を使用して、種特異的発現を改善および保証するように産生されることが必要であり得る。種の正確さは、発現系の全体的な効率を改善し得る。例えば、ウシウイルスベクターおよびウシ細胞培養物におけるｍＲＮＡ配列は、ヒトウイルスベクターおよびウシ細胞培養物におけるｍＲＮＡ配列よりもより効率的な発現系を提供し得る。

一部の態様では、本開示は、幹細胞を分化して、食用肉製品を製造するための方法であって、方法が、１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む核酸分子を幹細胞に送達するステップ、核酸分子の送達後に、核酸分子の援助により幹細胞における１種または複数の遺伝子発現をモジュレートして、幹細胞の少なくとも１つのサブセットに１種または複数の前駆細胞を生じさせるステップであって、モジュレートする際に、核酸分子が、幹細胞のゲノムに組み込まれない、ステップ、１種または複数の前駆細胞を培養して、１種または複数の培養細胞を生成するステップ、および１種または複数の培養細胞を分化して、１種または複数の最終分化した細胞を生成して、食用肉製品を製造するステップを含む、方法を提供する。一部の場合では、核酸分子は、１種または複数の異なるリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む。一部の場合では、核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を介して生成される。一部の場合では、方法は、１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む核酸分子の第２のセットを細胞（例えば、幹細胞、成熟細胞、前駆細胞、または最終分化した細胞）に送達するステップをさらに含む。一部の場合では、前駆細胞または培養細胞に送達される核酸分子の第２のセットは、幹細胞に送達される核酸分子と異なる。例えば、幹細胞に送達される核酸分子は、筋細胞分化因子をコードしてもよく、核酸分子の第２のセットは、前駆細胞の安定性を増強するために多能性遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡを含んでいてもよい。１種または複数の培養細胞を分化して、１種または複数の最終分化した細胞を生成して、食用肉製品を製造するステップは、１種または複数の最終分化した細胞から組織を製造するステップを含んでいてもよい。

細胞を培養するステップおよび分化するステップは、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよい。バイオリアクターは、生物学的に活性な環境を支持する任意の製造デバイスまたはシステムであってもよい。バイオリアクターは、哺乳動物細胞などの真核細胞、または細胞培養の文脈における組織の培養に好適な容器であってもよい。バイオリアクターは、さまざまな細胞型を一緒に並行して培養してもよく、または１つの細胞型のみを単独で培養してもよい。バイオリアクターは、１つの容器または複数の容器を含んでいてもよく、培養の間に使用される培地をリサイクルしてもよい。前駆細胞の少なくともサブセットもしくはすべての前駆細胞を培養して、培養細胞を生成するステップ、および培養細胞の少なくともサブセットを分化して、最終分化した細胞を生成して、食用肉製品を製造するステップは、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよく、または培養細胞の少なくともサブセットを分化して、最終分化した細胞を生成して、食用肉製品を製造するステップは、追加のバイオリアクターにおいて行われてもよい。

ある特定の条件下で、ＭＹＯＤ単独を標的にするｍＲＮＡは、幹細胞を分化するまたは成熟細胞を分化転換するために（例えば、異種細胞および組織型の産生において）非効率的であり得る。幹細胞における１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートするステップは、１種または複数のＲＮＡ（例えば、２種またはそれよりも多くの異なるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を使用して、前駆細胞を生成するステップを含んでいてもよい。例えば、ＰＡＸ７およびＭＹＯＤ１の両方一緒の強制的な発現は、ＰＡＸ７だけの強制的な発現またはＭＹＯＤ１だけの強制的な発現よりも、培養において、より高いパーセンテージの全体的な骨格筋細胞をもたらし得る。幹細胞における１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートするステップは、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、またはＰＡＸ７のうちの１種または複数をコードする１種または複数のメッセンジャーＲＮＡを使用して、前駆細胞を生成するステップを含んでいてもよい。

さらにまた、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による多能性遺伝子の抑制は、ｉＰＳＣからの骨格筋形成を増強することができる。幹細胞における１種または複数の遺伝子の発現の一過性モジュレーションは、ｓｉＲＮＡ、または細胞取り込みの際にｓｉＲＮＡから自発的に構成されるマイクロＲＮＡを使用するＲＮＡ改変を含み得る。ｓｉＲＮＡは、ＰＯＵＦ５１（ＯＣＴ３／４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはそれらの任意のバリアント、組合せもしくはアナログを標的にしてもよい。ｓｉＲＮＡは、分化効率を増加させ得、分化した細胞の安定性または生存率を増強し得る。例えば、多能性マスター調節因子であるＯＣＴ３／４（ＰＯＵＦ５１）を標的にするｓｉＲＮＡは、ＭＹＯＤ１ ｍＲＮＡの強制的な発現の効率を増加させ得る。

核酸分子は、非ロックド核酸分子を含んでいてもよい。ＲＮＡ分子は、改変されていてもよい。ＲＮＡ分子などの核酸に対する改変は、非ロックド核酸モノマー（ｕＲＮＡ）による改変を含んでいてもよい。個々のまたは複数の核酸が、ｕＲＮＡにより改変されていてもよい。ｕＲＮＡは、スプライシングスペックルおよび真核細胞中の細胞核のカハール体内で見出される小型のＲＮＡ分子であり得る。ｕＲＮＡは、一般に、短く、１５０ヌクレオチド長周辺で、核におけるプレメッセンジャーＲＮＡのプロセシングにおいて機能する。ｕＲＮＡは、豊富で、非コード性である。ｕＲＮＡは、リン酸転移反応の成功によりプレｍＲＮＡからイントロンを除去し、スプライソソーム複合体を作り、多様なｍＲＮＡアイソフォームをそれぞれのコード遺伝子から生成し得る。ｕＲＮＡは、リボヌクレオシドにおいて見出されるＣ２’－Ｃ４’結合を欠くリボヌクレオシドホモログであり、したがって可撓性である。ｕＲＮＡは、Ｃ３’エンドコンフォメーションでリボース部分をロックしなくてもよく、ｕＲＮＡの二重鎖への組み込みは、不安定化され得る。ｕＲＮＡモノマーは、細胞生存率に影響を及ぼすことなく、ｓｉＲＮＡの特異性および効力を調整するのに有用であり得る。

核酸分子は、非ロックド核酸分子を含んでいてもよい。少なくとも１種の核酸分子は、非ロックド核酸モノマーにより改変されていてもよい。ｕＲＮＡは、少なくとも１種のＲＮＡ分子などの少なくとも１種の核酸分子とともにさまざまなポイントで組み込まれていてもよい。

ＲＮＡは、化学的に改変されて、例えば、その安定性を改善し得る。真核ｍＲＮＡは、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびに５’７－メチルグアノシン三リン酸キャップおよび３’ポリＡテールに隣接するコード領域を含んでいてもよく、これは、ｍＲＮＡの安定性および翻訳において必要であり得る。ＲＮＡ安定性を改善するための化学的改変は、アンチリバースキャップアナログ、３’－グロビンＵＴＲ、またはポリＡテール改変を含み得る。キャップされたまたはアンチリバースキャップされたｍＲＮＡは、翻訳効率が増強されていてもよい。キャップアナログは、７－メチルグアノシン（Ｎ^７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ））の付加によるｍＲＮＡの５’末端に対する改変を含んでいてもよい。キャップアナログは、ｍＲＮＡ転写物の翻訳不能をもたらし得るＲＮＡの近位のメチル化Ｇにより、逆方向に組み込まれていてもよい。アンチリバースキャップされたアナログは、それらが、最初のキャップアナログにおける２つの３’－ＯＨ基ではなく１つの３’－ＯＨ基のみを含有するので、逆方向に組み込まれていなくてもよく、従来のキャップアナログよりも翻訳効率が増加し得る。アンチリバースキャップされたアナログは、７－メチルグアノシンにおける３’－Ｏ－メチル、３’－Ｈもしくは２’－Ｏ－メチル改変、またはＮ２改変（ベンジルまたは４－メトキシベンジル）を含んでいてもよい。真核ｍＲＮＡ転写物は、調節エレメントを含んでいてもよい５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ＲＮＡの安定性および転写効率は、５’および３’ＵＴＲを組み込むことによって改善され得る。ＵＴＲは、アルファ－グロビンまたはベータ－グロビンｍＲＮＡを含んでいてもよい。ベータ－グロビン５’および３’ＵＴＲは、翻訳効率を改善し得、アルファ－グロビン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡを安定化し得る。ポリＡテールは、転写の間に真核ｍＲＮＡ転写物の３’末端に付加され得、これは、ｍ^７Ｇキャップと複合体を形成するポリＡ結合タンパク質に結合することによって、ｍ^７Ｇキャップにより相乗的にｍＲＮＡの安定性および翻訳を調節し得る。ポリＡテールは、ｍＲＮＡが転写されるＤＮＡ鋳型においてコードされてもよく、または組み換えポリＡポリメラーゼを使用して、転写後にｍＲＮＡを伸長してもよい。ポリＡテールの長さを増加させることで、ポリソーム形成の効率、およびタンパク質発現のレベルを増加させ得る。

一部の態様では、本開示は、幹細胞を使用して、食用肉製品を生成するための方法を提供する。方法は、２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を幹細胞に送達するステップを含み得る。細胞に送達され得る核酸分子の非限定的な例は、例えば、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、エンハンサーリボ核酸（ｅＲＮＡ）、相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む。核酸分子を、細胞に送達することができる。核酸は、細胞において分解されてもよい。核酸分子は、細胞に対する任意の重大な有害作用を持っていなくてもよい。核酸分子の送達後、細胞における１つまたは複数の遺伝子の発現が、変更またはモジュレートされてもよい（例えば、核酸分子の援助により、またはその存在に起因して）。変更またはモジュレーションは、遺伝子発現を増強、低減または阻害することを含み得る。変更またはモジュレーションは、核酸分子が幹細胞のゲノムに組み込まれないような一過性のまたは非組み込みの様式であってもよい。遺伝子発現のそのような変更またはモジュレーションは、細胞の少なくともサブセットに１種または複数の前駆細胞を生じさせ得る。前駆細胞の一部または全部が、その後、培養されて、培養細胞が生成され得、この培養細胞は、分化して、最終分化した細胞が生成され得る。最終分化した細胞を使用して、食用肉製品を製造することができる。

２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスによって生成されてもよい。２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子は、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含んでいてもよい。ｍＲＮＡは、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含んでいてもよい。ｓｉＲＮＡは、ＰＯＵＦ５１（ＯＣＴ３／４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを標的にしてもよい。２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子は、ｃＤＮＡおよびｓｉＲＮＡを含んでいてもよい。ｃＤＮＡは、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含んでいてもよい。２種またはそれよりも多くの異なる核酸は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｕＲＮＡ、ｅＲＮＡ、またはそれらの任意のバリアント、組合せもしくはアナログを含んでいてもよい。

１種または複数の遺伝子は、１種、２種、または複数の核酸分子により、標的にされ、モジュレートされてもよい。１種または複数の遺伝子は、約１よりも多くもしくはそれと等しい、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くの遺伝子を含んでいてもよい。前記幹細胞において１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートするステップは、少なくとも２種の遺伝子の第１の遺伝子の発現を増強するステップ、および少なくとも２種の遺伝子の第２の遺伝子の発現を阻害するステップを含んでいてもよい。

ＲＮＡトランスフェクションは、細胞分化のための投薬要件を低下させ得る。低い細胞取り込みおよび弱い効果サイズのせいで、一部の分化因子は、細胞分化に影響を及ぼす頻繁な投薬および高濃度を必要とする。高コストに加えて、集中的な投薬レジメンは、細胞生存率を低下させる細胞毒性条件を作り出し得る。本明細書に開示されるＲＮＡに基づく分化方法の多くの低い投薬要件は、これらのコストおよび毒性の課題を軽減することができ、分化細胞集団に増強された安定性を付与することができ、進行中の投薬のための要件をさらに減少させる。例えば、筋原性因子（例えば、ＭＹＦ５）により分化した筋芽細胞は、それらの分化状態を維持するために拡大増殖の間に反復投薬を必要とし得るが、ＭＹＦ５をコードするｍＲＮＡの単一用量により分化した筋芽細胞は、拡大増殖全体にわたって安定であり得る。ＲＮＡトランスフェクションはまた、迅速な分化および細胞発達を容易にし得る。例えば、単一用量のＭＹＯＤ１をコードするｍＲＮＡの送達の方法は、ほんの短い期間（例えば、約１４日未満もしくはそれに等しい、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、またはそれ未満）の後に、ｉＰＳＣから筋肉組織を生成し得る。

本開示に相応の細胞分化方法は、１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む核酸分子を細胞に送達するステップ、核酸分子の送達後に、核酸分子の援助により細胞における１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートするステップであって、モジュレートする際に、核酸分子が、細胞のゲノムに組み込まれない、ステップ、細胞を培養するステップ、および細胞を分化して、１種または複数の最終分化した細胞を生成して、食用肉製品を製造するステップを含んでいてもよく、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる単一の例を含む。本開示に相応の細胞分化方法は、１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む核酸分子を細胞に送達するステップ、核酸分子の送達後に、核酸分子の援助により細胞における１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートするステップであって、モジュレートする際に、核酸分子が、細胞のゲノムに組み込まれない、ステップ、細胞を培養するステップ、および細胞を分化して、１種または複数の最終分化した細胞を生成して、食用肉製品を製造するステップを含んでいてもよく、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる複数の例を含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる最大で２つの例を含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる最大で３つの例を含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる最大で４つの例を含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる少なくとも１つの例を含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる少なくとも２つの例を含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる少なくとも３つの例を含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を核酸分子と接触させる少なくとも４つの例を含む。一部の場合では、細胞を核酸分子と接触させる２つまたはそれよりも多くの例は、細胞を異なる核酸分子と接触させるステップを含む。例えば、細胞を接触させる第１の例は、ＭＹＯＤ１をコードするｍＲＮＡおよびＰＯＵＦ５１を標的にするｓｉＲＮＡを含んでいてもよく、細胞を接触させる第２の例（例えば、細胞を接触させる第１の例の７日後）は、ＭＹＯＤ１をコードするｍＲＮＡおよび、ＭＹＦ６をコードするｍＲＮＡを含んでいてもよい。一部の場合では、細胞を核酸分子と接触させる２つまたはそれよりも多くの例は、細胞を異なる量の核酸分子と接触させるステップを含む。細胞を核酸分子と接触させる第２の例は、細胞を核酸分子と接触させる第１の例としての核酸分子の最大で８０％、最大で６０％、最大で５０％、最大で４０％、最大で３０％、最大で２５％、最大で２０％、最大で１５％、または最大で１０％の量（例えば、モル量による）を含んでいてもよい。細胞を核酸分子と接触させる第１の例は、すべてのその後の接触させる例の核酸分子の少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％の量を含んでいてもよい。例えば、２００ｎＭのＰＡＸ７およびＭＹＯＤ１ ｍＲＮＡと接触したｉＰＳＣは、筋芽細胞を生成し得、これは、効率的に分化を継続するために４０ｎＭ未満のＰＡＸ７およびＭＹＯＤ１ ｍＲＮＡを必要とする。

一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で３日ごとに１回接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５日ごとに１回接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で７日ごとに１回接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１０日ごとに１回接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１４日ごとに１回接触させるステップを含む。

一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２０μＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１０μＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５μＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２μＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１μＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５０ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２０ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１０ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を１０ｎＭ～５００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を１０ｎＭ～２００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を２０ｎＭ～２００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を５０ｎＭ～２００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を１０ｎＭ～１００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を２０ｎＭ～１００ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を１０ｎＭ～５０ｎＭのＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を１０ｎＭ～５００ｎＭの複数のＲＮＡ分子のそれぞれと接触させるステップを含む。例えば、送達するステップは、細胞を、２５０ｎＭのＭＹＯＤ１をコードするｍＲＮＡ、２５０ｎＭのＰＡＸ７をコードするｍＲＮＡ、および１０ｎＭのＰＯＵＦ５１を標的にするｓｉＲＮＡと接触させるステップを含んでいてもよい。一部の場合では、送達するステップは、細胞を１０ｎＭ～２００ｎＭの複数のＲＮＡ分子のそれぞれと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を２０ｎＭ～２００ｎＭの複数のＲＮＡ分子のそれぞれと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を５０ｎＭ～２００ｎＭの複数のＲＮＡ分子のそれぞれと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を１０ｎＭ～１００ｎＭの複数のＲＮＡ分子のそれぞれと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を２０ｎＭ～１００ｎＭの複数のＲＮＡ分子のそれぞれと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を１０ｎＭ～５０ｎＭの複数のＲＮＡ分子のそれぞれと接触させるステップを含む。

一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５μＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２μＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１μＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５００ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２００ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１００ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５０ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２０ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１０ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１ｎＭのｍＲＮＡと接触させるステップを含む。

一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５００ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２００ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１００ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５０ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２０ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１０ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で５ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で２ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の場合では、送達するステップは、細胞を最大で１ｎＭのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと接触させるステップを含む。

本開示のさらなる態様は、本明細書に開示される方法から生成された食用肉製品を提供する。本開示の方法は、食用肉製品を生成するための人道的で、リソース効率が良く、低コストの方法を提供するだけでなく、天然肉のものと一致するまたはそれを卓越する品質を有する製品を生成するために使用されてもよい。動物の死の直後に、その筋肉細胞は、典型的には、アポトーシス、オートファジーおよびネクロシスだけでなく、肉の風味およびプロファイルに悪影響を及ぼし得る幅広いオミック（ｏｍｉｃ）変化を受け始める。本開示の方法により生成された食用肉製品は、食物摂取のためにより望ましい制御されたオミックおよび形態学的プロファイルを含み得る。本開示の方法により生成された食用肉製品は、高度の細胞の均一性（例えば、筋肉のサイズ、筋節およびフィラメントの発達）および整列を含み得る。本開示の方法により生成された食用肉製品は、制御された比および／またはパターンの多数の細胞型、例えば、多数の細胞型の交互の縞または層を含み得る。例えば、本開示の方法により生成された食用肉製品は、９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、もしくは４０：６０、またはそれら中の任意の範囲の制御された比で筋細胞および脂肪細胞を含み得る。

本開示の方法により生成された食用肉製品は、分化、培養または拡大増殖のために使用される足場または足場の一部分を含んでいてもよい。食用肉製品は、少なくとも１重量％の食用足場、少なくとも２重量％の食用足場、少なくとも３重量％の食用足場、少なくとも４重量％の食用足場、少なくとも５重量％の食用足場、少なくとも６重量％の食用足場、少なくとも７重量％の食用足場、少なくとも８重量％の食用足場、少なくとも９重量％の食用足場、少なくとも１０重量％の食用足場、少なくとも１２重量％の食用足場、少なくとも１５重量％の食用足場、少なくとも２０重量％の食用足場、少なくとも２５重量％の食用足場、少なくとも３０重量％の食用足場、少なくとも３５重量％の食用足場、少なくとも４０重量％の食用足場、または少なくとも５０重量％の食用足場を含んでいてもよい。食用肉製品は、最大で５０重量％の食用足場、最大で４０重量％の食用足場、最大で３５重量％の食用足場、最大で３０重量％の食用足場、最大で２５重量％の食用足場、最大で２０重量％の食用足場、最大で１５重量％の食用足場、最大で１２重量％の食用足場、最大で１０重量％の食用足場、最大で８重量％の食用足場、最大で６重量％の食用足場、最大で５重量％の食用足場、最大で４重量％の食用足場、最大で３重量％の食用足場、最大で２重量％の食用足場、最大で１重量％の食用足場を含んでいてもよい。食用肉製品中の食用足場の量および種類は、その風味、テクスチャ、厚さおよび強度に影響を及ぼし得る。

加えて、足場による影響を受ける細胞間の空間は、筋肉細胞質量の細胞外筋肉基質（ＥＣＭ）に対する比に影響を及ぼし得る。ＥＣＭは、典型的には、筋肉組織の質量の２～１０％を占め、望ましくない風味およびテクスチャに寄与し得る。足場上または足場内で成長した筋肉細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで発達した筋肉細胞と比べて減少したＥＣＭ質量を含み得（例えば、足場接着に起因する）、それによって、より柔らかく、より風味豊かな肉に発達し得る。本開示の方法により生成された食用肉製品は、１０質量％未満のＥＣＭ、８質量％未満のＥＣＭ、６質量％未満のＥＣＭ、５質量％未満のＥＣＭ、４質量％未満のＥＣＭ、３質量％未満のＥＣＭ、２質量％未満のＥＣＭ、１質量％未満のＥＣＭ、または０．５質量％未満のＥＣＭを含んでいてもよい。本開示の方法により生成された食用肉製品は、ＥＣＭよりも多くの質量の食用足場を含んでいてもよい。

図６Ａ～Ｃは、本開示の方法による多核化した筋線維の形成の３つの例を提供する。細胞は、伸長され、単一用量のブタ特異的ＭＹＯＤ１ ｍＲＮＡによる分化１４日後にＭＹＯＤ１およびミオシン重鎖を発現し、本開示の方法が迅速に成熟筋肉組織を生成し得ることを示す。図６Ａは、筋線維の位相差画像を提供し、筋線維の高度の多核化、伸長、および整列を示す。図６Ｂは、アクチン（ファロイジン染色、６０１）、ＭＹＯＤ（６０２）、および核（ＤＡＰＩ染色、６０３）を示す細胞染色の画像を提供する。図６Ｃは、ミオシン重鎖（６０４）および核（ＤＡＰＩ、６０５）を示す細胞染色の画像を提供する。
生体材料

一部の培養肉技術は、二次元フラスコ、または懸濁液中のマイクロキャリアにおいて成長した細胞を有する衛星細胞培養物に焦点を合わせている。本明細書に提供されるように、三次元（３Ｄ）足場化および組織を遺伝子操作するプラットフォームを使用して、大規模成長を容易にし得る。食品に安全な足場は、構造支持を提供し得、培養細胞の成長を従来の方法を使用して製造された同等の食品製品と類似の所望の構造および／またはテクスチャに導き得る。細胞または組織を培養するステップは、バイオリアクター内で足場上の細胞の集団を成長させるステップを含み得る。

一部の態様では、本開示は、幹細胞から食用肉製品を生成する方法を提供する。方法は、幹細胞を足場と接触させるステップ、幹細胞の少なくともサブセットを、分解可能な足場の存在下、増殖因子または核酸分子の使用により、分化プロセスに付して、組織を生成するステップ、および組織を使用して、食用肉製品を生成するステップを含んでいてもよく、ここで、食用肉製品は、必要に応じて、足場の少なくとも一部分を含み得る。一部の場合では、幹細胞を、分化プロセスに付される前に、足場と接触させる。一部の場合では、幹細胞を、足場と接触させ、同様の時（例えば、互いに３時間以内）に分化プロセスに付す。一部の場合では、幹細胞を、足場と接触する前に、分化プロセスに付す。一部の場合では、方法は、幹細胞を培養して、培養幹細胞を生成するステップをさらに含む。一部の場合では、培養するステップは、足場を接触させた後である。一部の場合では、培養幹細胞を、１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付す。足場は、遺伝子操作されて、幹細胞増殖を増強し、細胞分化を関連する系列に方向付け、または最終肉製品の風味、テクスチャおよび引張弾性をモジュレートし得る。足場は分解可能であってもよい。足場は食用であってもよい。

幹細胞の少なくともサブセットを分化プロセスに付すステップは、複数の増殖因子、複数の核酸分子、またはそれらの組合せの使用を含んでいてもよい。複数の核酸分子は、分化因子をコードするｍＲＮＡを含んでいてもよい。複数の核酸分子は、干渉ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ）を含んでいてもよい。複数の核酸分子は、トランスファーＲＮＡを含んでいてもよい。複数の核酸分子は、エンハンサーＲＮＡを含んでいてもよい。幹細胞の少なくともサブセットを分化プロセスに付すステップは、少なくとも２種の核酸分子の使用を含んでいてもよい。少なくとも２種の核酸分子は、少なくとも２種の分化因子をコードしてもよい。少なくとも２種の核酸分子は、少なくとも１種の分化因子をコードし、少なくとも１種の干渉ＲＮＡを含んでいてもよい。

足場は、細胞培養において細胞接着を可能にしてもよい。足場は、接着細胞が、バイオリアクターシステムにおいて成長することを可能にしてもよい。バイオリアクターシステムは、接着または懸濁液バイオリアクターシステムであってもよい。分解可能な足場と接触させて幹細胞を培養するステップは、バイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよく、培養幹細胞の少なくともサブセットを１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付すステップは、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよい。分解可能な足場と接触させて幹細胞を培養するステップは、バイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよく、培養幹細胞の少なくともサブセットを１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付すステップは、追加のバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよい。細胞培養、拡大増殖および分化プロセスのうちの１つまたは複数は、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよく、またはそれぞれが、異なるバイオリアクターチャンバーにおいて実施されてもよい。一部の場合では、細胞培養は、バイオリアクターチャンバーにおいて行われ、細胞の拡大増殖は、異なるバイオリアクターチャンバーにおいて行われる。

培養細胞は、細胞が培養の間に付着し得る足場からある程度の構造完全性を受け取り得る。あるいは、足場は、懸濁細胞培養において必要でなくてもよい。非接着細胞は、付着のための基材または表面を必要としなくてもよい。細胞は、接着基材をもはや必要としないように、改変または遺伝子操作されてもよい。例えば、肝細胞は、通常、接着細胞であるが、生存および増殖のための付着のための細胞外基質をもはや必要としないように、改変されていてもよい。培養細胞は、二次元もしくは三次元足場、または支持構造などの支持構造に接着する培養組織に成長してもよい。培養細胞は、ペトリ皿などの二次元支持構造上で成長してもよく、ここで、それらは、食物摂取のために剥がされ、加工され得るいくつかの細胞の層を形成し得る。二次元支持構造としては、膜の一面上の培養培地から、細胞が接着する別の面に栄養素の拡散を可能にする、多孔性膜を含んでいてもよい。そのような組成物では、追加の細胞の層は、細胞を膜の両面から培養培地に曝露することによって達成されてもよく、例えば、細胞は、膜の一面から、また膜上で成長している細胞を覆う培養培地からの拡散により栄養素を受け取ってもよい。

培養細胞は、三次元支持構造の上、その周囲、またはその内部で成長してもよい。支持構造は、異なるサイズ、形状および形態に形を変えて、培養細胞のための形状および形態を提供して、異なる種類の組織、例えば、ステーキ、テンダーロイン、脛肉、鶏胸肉、鶏下脚、ラムチョップ、３枚おろしの魚、ロブスターの尾などに成長させ、それらに似ていてもよい。支持構造は、天然または合成の生体材料であり得る。生体材料は、許容される生物学的応答のレベルなどの生体適合性の様式で、任意の組織、器官または機能を評価、処理、向上または置き換えるために生物システムの仲立ちをすることが意図される任意の物質を含み得る。生体材料は、細胞および組織と受動的に相互作用してもよく、または特異的で意図される生物学的応答を誘導する生体活性材料を含んでいてもよい。生体材料は、複合系単独またはその部分として、生物系の構成要素との相互作用の制御によって、使用されて、方向付けられる形態をとるように遺伝子操作されている基材を含み得る。生体材料は、天然、合成、またはそれらの一部の組合せであってもよい。足場は、１種の材料、または１種もしくは複数の異なる材料から構成されてもよい。支持構造は、非毒性で食用であり得、その結果、それらは、摂取された場合に有害でなくてもよく、追加の栄養素、テクスチャ、風味、または最終食品製品への形態を提供してもよい。足場は、ヒドロゲル、細胞外基質分子（ＥＣＭ）などの生体材料、または生体適合性合成材料を含んでいてもよい。ＥＣＭ分子は、プロテオグリカン、非プロテオグリカン多糖、またはタンパク質を含み得る。マイクロ足場は、細胞集団のための巨視的構造および／または形状を提供し得る従来の組織培養足場よりも小さくてもよい。マイクロ足場は、マイクロ足場それ自身が懸濁液中にある間でさえ、付着するために接着細胞のための表面を提供し得る。マイクロ足場は、撹拌により懸濁液中に留まるのに十分に小さいままの間に付着する接着細胞のためのシードまたはコア構造を提供し得る。マイクロ足場の使用は、懸濁培養において接着細胞の培養を可能にし、これは、接着細胞の大規模製造を可能にし得る。食用肉製品は、製造された組織および分解可能な足場を使用して生成されてもよい。例として、足場を使用して、肉製品の製造を導き得るか（枠として）、または容易にし得る。

分解可能な足場は、ポリマー材料を含んでいてもよい。ポリマー材料は、天然ポリマー材料または合成ポリマー材料を含み得る。天然生体材料は、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギン酸塩、寒天、キャッサバ、トウモロコシ、キトサン、ジェランガム、コーンスターチ、キチン、セルロース、チア（Ｓａｌｖｉａ ｈｉｓｐａｎｉｃａ）組み換えシルク、脱細胞化組織（植物または動物）、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、ヘミセルロース、グルコマンナン、テクスチャード植物性タンパク質、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、テンペ、ケラタン硫酸、またはそれらの任意の組合せを含み得る。植物系足場が、３Ｄ培養のために使用されてもよい。植物系足場は、リンゴ、海藻、またはジャックフルーツなどの植物から得られた足場を含んでいてもよい。植物系足場は、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニン、アルギン酸塩、またはそれらの任意の組合せなどの少なくとも１種の植物系材料を含んでいてもよい。テクスチャードダイズタンパク質（ＴＳＰ）などのテクスチャード植物性タンパク質（ＴＶＰ）は、高パーセンテージのダイズタンパク質、ダイズ粉、またはダイズ濃縮物を含み得る。ＴＶＰおよびＴＳＰを使用して、肉製品に肉様テクスチャおよび堅さを提供することができる。合成生体材料は、ヒドロキシアパタイト、ポリエチレンテレフタレート、アクリレート、ポリエチレングリコール、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、それらのコポリマー、またはそれらの任意の組合せを含み得る。

支持構造（例えば、足場）は、支持構造と共有結合的または非共有結合的に会合した、接着ペプチド、細胞接着分子、または他の増殖因子を含んでいてもよい。細胞認識部位は、細胞接着および遊走を促進し得る。細胞認識部位は、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）またはＡｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ配列などの配列を含んでいてもよい。合成ポリマー材料は、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含むポリエチレングリコール生体材料を含み得る。足場化材料を含む肉製品は、肉のような味わいに味付けされてもよい（例えば、さまざまな塩、ハーブおよび／またはスパイスを使用して）。足場は、細胞または組織培養製品から構成されてもよい。例えば、軟骨細胞に由来する軟骨は、支持構造と一緒に、下部の支持層または構造を形成してもよい。その後、筋肉細胞もしくは脂肪細胞、またはその両方は、軟骨細胞層上に播種されてもよい。筋肉細胞および軟骨細胞の相互作用は、組織形成のために必要な調節シグナルを提供し得る。

支持構造は、固体または半固体支持として形成されてもよい。支持構造は、固体の非多孔質構造または多孔質構造を含んでいてもよく、例えば、高い多孔性は、細胞付着のための最大表面積を提供し得る。多孔質足場は、細胞遊走または細孔への浸潤を可能にし得る。多孔質足場は、食用であってもよい。多孔質足場は、天然生体材料また合成生体材料、テクスチャードタンパク質を含んでいてもよい。多孔質足場は、平均細孔直径を有し得る。多孔質足場の平均細孔直径は、２０マイクロメートル（μｍ）～１０００μｍ、２０μｍ～９００μｍ、２０μｍ～８００μｍ、２０μｍ～７００μｍ、２０μｍ～６００μｍ、２０μｍ～５００μｍ、２０μｍ～４００μｍ、２０μｍ～３００μｍ、２０μｍ～２００μｍ、２０μｍ～１００μｍ、５０μｍ～１０００μｍ、５０μｍ～９００μｍ、５０μｍ～８００μｍ、５０μｍ～７００μｍ、５０μｍ～６００μｍ、５０μｍ～５００μｍ、５０μｍ～４００μｍ、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２００μｍ、５０μｍ～１００μｍ、１００μｍ～１０００μｍ、１００μｍ～９００μｍ、１００μｍ～８００μｍ、１００μｍ～７００μｍ、１００μｍ～６００μｍ、１００μｍ～５００μｍ、１００μｍ～４００μｍ、１００μｍ～３００μｍ、１００μｍ～２００μｍ、５００μｍ～１０００μｍ、５００μｍ～９００μｍ、５００μｍ～８００μｍ、５００μｍ～７００μｍ、または５００μｍ～６００μｍの範囲であってもよい。多孔質足場の平均細孔直径は、約２０μｍ～約１０００μｍの範囲であってもよい。平均細孔直径は、２０μｍ未満であってもよく、または１０００μｍより大きくてもよい。

足場は、細胞の培養または分化の間に分解され、足場内で凝集またはクラスター化する細胞が利用可能な空間を増加させてもよい。加えてまたは代わりに、足場は、細胞成長または凝集に応答して分解されるように構成されていてもよい。細胞の培養または分化の間に、足場は、１日あたり少なくとも０．２５％、１日あたり少なくとも０．５％、１日あたり少なくとも１％、１日あたり少なくとも２％、１日あたり少なくとも３％、１日あたり少なくとも４％、１日あたり少なくとも５％、１日あたり少なくとも６％、１日あたり少なくとも８％、１日あたり少なくとも１０％、１日あたり少なくとも１２％、１日あたり少なくとも１５％、または１日あたり少なくとも２０％の平均速度（例えば、質量の喪失として測定される）で分解されてもよい。細胞の培養または分化の間に、足場の平均細孔直径は、１日あたり少なくとも０．２５％、１日あたり少なくとも０．５％、１日あたり少なくとも１％、１日あたり少なくとも２％、１日あたり少なくとも３％、１日あたり少なくとも４％、１日あたり少なくとも５％、１日あたり少なくとも６％、１日あたり少なくとも８％、１日あたり少なくとも１０％、１日あたり少なくとも１２％、１日あたり少なくとも１５％、または１日あたり少なくとも２０％、増加してもよい。例えば、細胞を含むアルギン酸塩足場のグリコシド結合は、細胞、培地の状態、またはそれらの組合せによって課せられる機械的ストレスに起因して、１日あたり約０．５％の速度で分解され得る。

目的の細胞型のための適正な微細構造および剛性を有する柔らかい多孔質材料が、より好ましくあり得る。足場は、機械的特性を付与して、肉製品のテクスチャおよび口当たりを改善し得る。足場はまた、機械的特性を付与して、所望の細胞型の前駆体細胞からの増殖、遊走、成長または分化を促し得る。機械的特性は、圧縮、膨張、ひずみ、伸縮性、弾力性、せん断強度、剛性率、粘弾性、または引張強度を含み得る。足場は、細胞から生成される所望の組織型に好適な機械的特性および分解動態を有する材料を含んでいてもよい。例えば、より柔らかい表面が、筋細胞と比較して、脂肪細胞の分化および培養において必要であり得る。

足場は、材料を変換することによって製造されてもよい。足場の製造方法は、材料を細胞または組織培養に使用可能にするために材料に対して行われる物理的および／または化学的なものを含み得る。すべての生体材料が、所与の製造方法に好適でなくてもよく、または生体材料が、製造方法におけるそれらの使用を可能にするように改変することが必要であってもよい。足場の製造方法は、エレクトロスピニング、相分離、凍結乾燥、リソグラフィ、印刷、押出、自己組織化、溶媒キャスティング、テキスタイル技術、材料注入、レーザー焼結、相分離、ポロゲン浸出、ガス発泡、繊維メッシング、超臨界流体処理、または追加の製造を含み得る。

支持構造は、分解可能な足場を含んでいてもよい。分解可能な足場は、バイオリアクターチャンバーなどの培養容器において細胞の拡大増殖を容易にするように構成されてもよい。分解可能な足場は、バイオリアクターチャンバー内部で細胞の拡大増殖を容易にするように構成されてもよい。幹細胞は、分解可能な足場の存在下で培養されて、培養幹細胞が作出され得る。幹細胞は、培養幹細胞に培養され得、培養幹細胞は、１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付されて、分解可能な足場の存在下で拡大増殖された幹細胞が生成され得る。分解可能な足場は、組織形成とおよそ等しい速度で分解されてもよい。分解可能な材料は、培養食品製品における足場の再構成および／または排除が可能であってもよい。例えば、一部の場合では、培養筋細胞をステーキの形状に成形する３Ｄ足場は、筋細胞が拡大増殖した後に生物分解されて、足場の内部空間に充填されてもよい。足場はまた、培養食品製品中に残る材料を含んでいてもよい。例えば、培養筋細胞に支持を提供するコラーゲン足場の一部分は、最終ステーキ中に残って、培養食品製品においてテクスチャおよび継続して構造支持を提供してもよい。足場は、食物摂取のために培養食品製品において生分解性ではないおよび／または残らない材料を含んでいてもよい。例えば、分解なしに特定の構造、テクスチャ、味または他の所望の特性を付与するために、ある特定の材料を使用して、足場を生成することができる。足場は、テクスチャ改変特性を有する材料を含んでいてもよい。

さまざまな組成物の足場を使用して、最終食品製品における所望のテクスチャおよび／または堅さを生じさせることができる。ジェランガム、コーンスターチ、チア、アルギン酸塩、ゼラチン、コンドロイチン、フィブリノーゲン、またはキャッサバ材料などの天然生体材料は、最終食品製品に所望のテクスチャ、堅さ、または風味プロファイルを生じさせ得る。足場は、食品製品にテクスチャを提供するためのフィラーもしくはバインダー材料を含んでいてもよく、または最終食品製品にテクスチャを提供するためのフィラーもしくはバインダー材料であってもよい。足場材料は、完成した食品製品がもはや任意の残った足場構造を有さないように、生分解性であってもよい。例えば、細胞の集団は、バイオリアクターにおいて足場上に播種されてもよい。細胞が、足場に接着し、増殖するにつれて、残ったすべてのものが、現在互いに接着している細胞の塊およびそれらが分泌する細胞外基質材料になるまで、足場は、徐々に生物分解した。足場を使用して、得られる培養食品製品の構造を導くことができ、これは、ヒトによる食物摂取のための食品製品に留まっていてもよい。例えば、筋細胞の増殖のための足場は、ジェランガム材料を含んでいてもよい。この材料は、肉製品が培養において製造されるときまで、部分的にのみ生物分解されるように、遺伝子操作されていてもよい。ジェランガムは、肉製品に留まって、フィラーとして、およびテクスチャおよび風味増強剤として作用してもよい。
バイオリアクター

細胞は、例えば、大規模製造を可能にするためにバイオリアクターを使用してスケーラブルな様式で、所望の量まで培養および拡大増殖されてもよい。バイオリアクター装置は、工業的製造に必要な成長を伴って、幹細胞を組織に分化および拡大増殖するためのスケーラブルな方法を提供し得る。さらに、そのような装置の機械的条件付けは、競争力の高い価格でのその外観、テクスチャおよび風味の観点から、標準的な肉をまねるバイオ人工筋肉を製造する均一な方法を提供し得る。例えば、ヒト食物摂取のための培養肉を製造する一部の方法は、ａ）動物に由来する自己再生性細胞の集団を得るステップ、ｂ）バイオリアクター内で、足場を含む培養培地中、自己再生性細胞の集団を培養するステップ、ｃ）バイオリアクター内で、細胞の集団において分化を誘導して、筋細胞および脂肪細胞などの少なくとも１種の最終分化した細胞を形成するステップ、ならびにｄ）バイオリアクター内で、細胞を組織に培養し、そのようにして、細胞の集団をヒト食物摂取のための肉に加工するステップを含む。

バイオリアクターシステムは、少なくとも１つのバイオリアクター、バイオリアクタータンク、またはリアクターチャンバーを含んでいてもよい。例えば、バイオリアクターシステムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、または１００より多くのリアクターチャンバーを含んでいてもよい。バイオリアクターシステムは、約１つのリアクターチャンバー～１，０００超のリアクターチャンバーを含んでいてもよい。バイオリアクターシステムは、約１つのリアクターチャンバーまたは１超のリアクターチャンバーを含んでいてもよい。リアクターチャンバーは、大規模細胞培養に好適な内部体積を有していてもよい。リアクターチャンバーは、約０．１リットル（Ｌ）～約１，０００，０００Ｌの内部体積を有していてもよい。リアクターチャンバーは、１Ｌ未満の内部体積、または１，０００，０００Ｌ超の内部体積を有していてもよい。リアクターチャンバーは、約１Ｌ未満～約１Ｌ、約１Ｌ～約１０Ｌ、約１Ｌ～約５０Ｌ、約１Ｌ～約１００Ｌ、約１Ｌ～約５００Ｌ、約１Ｌ～約１，０００Ｌ、約１Ｌ～約５，０００Ｌ、約１Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１Ｌ～約５０，０００Ｌ、約１Ｌ～約１，０００，０００Ｌ、約１０Ｌ～約５０Ｌ、約１０Ｌ～約１００Ｌ、約１０Ｌ～約５００Ｌ、約１０Ｌ～約１，０００Ｌ、約１０Ｌ～約５，０００Ｌ、約１０Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１０Ｌ～約５０，０００Ｌ、約１０Ｌ～約１，０００，０００Ｌ、約５０Ｌ～約１００Ｌ、約５０Ｌ～約５００Ｌ、約５０Ｌ～約１，０００Ｌ、約５０Ｌ～約５，０００Ｌ、約５０Ｌ～約１０，０００Ｌ、約５０Ｌ～約５０，０００Ｌ、約５０Ｌ～約１，０００，０００Ｌ、約１００Ｌ～約５００Ｌ、約１００Ｌ～約１，０００Ｌ、約１００Ｌ～約５，０００Ｌ、約１００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１００Ｌ～約５０，０００Ｌ、約１００Ｌ～約１，０００，０００Ｌ、約５００Ｌ～約１，０００Ｌ、約５００Ｌ～約５，０００Ｌ、約５００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約５００Ｌ～約５０，０００Ｌ、約５００Ｌ～約１，０００，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約５０，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１，０００，０００Ｌ、約５，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約５，０００Ｌ～約５０，０００Ｌ、約５，０００Ｌ～約１，０００，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ～約５０，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ～約１，０００，０００Ｌ、もしくは約５０，０００Ｌ～約１００，０００Ｌ、または１，０００，０００Ｌ超の内部体積を有していてもよい。

上記にまたは本明細書の他の箇所に記載されるように、細胞培養、分化および／または拡大増殖は、それぞれ、別個のバイオリアクターチャンバーにおいて実施されてもよい。一部の例では、すべてのプロセス（例えば、培養、拡大増殖、分化）は、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよい。別の例として、細胞培養が、バイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよく、拡大増殖および／または分化が、追加のバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよい。バイオリアクターチャンバーまたは追加のバイオリアクターチャンバーは、複数のバイオリアクターチャンバーを含んでいてもよい。複数のバイオリアクターチャンバーまたは追加のバイオリアクターチャンバーのそれぞれは、特定のプロセス（例えば、培養、拡大増殖、分化）を容易にするように構成されていてもよい。一部の場合では、バイオリアクターチャンバーからの培養幹細胞のサブセットまたはすべてを、複数の追加のバイオリアクターチャンバーに向かわせて、複数の拡大増殖プロセスを行ってもよく、これは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０超もしくはそれに等しい拡大増殖プロセス、またはそれよりも多くを含んでいてもよい。複数の拡大増殖プロセスは、順次に、同時に、またはそれらの組合せで行われてもよい。

一部の態様では、本開示は、幹細胞を分化して、食用肉製品を製造するための方法を提供する。方法は、１種または複数の前駆細胞を培養して、１種または複数の培養細胞を生成するステップ、および１種または複数の培養細胞を分化して、食用肉製品を製造するために使用され得る１種または複数の最終分化した細胞を生成するステップを含んでいてもよい。上記にまたは本明細書の他の箇所に記載されるように、１種または複数の前駆細胞を培養して、１種または複数の培養細胞を生成するステップ、および１種または複数の培養細胞を分化して、１種または複数の最終分化した細胞を生成するステップは、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよく、または異なるバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよい。

バイオリアクターシステムは、食品製品の生成のための培養細胞の大規模製造に好適であり得る。細胞は、バッチ基準で培養されてもよい。あるいは、または組み合わせて、細胞は、連続的に培養されてもよい。バッチおよび連続培養の両方で、新鮮な栄養素が、所望の食品製品を製造するための適切な栄養素の濃度を確実にするために供給されてもよい。例として、フェドバッチ培養では、栄養素（例えば、新鮮な培養培地）は、バイオリアクターに供給され、培養細胞は、それらが、完成した食品製品に加工するための準備ができるまで、バイオリアクター中に留まる。半バッチ培養では、基本培地が、バイオリアクターに供給され得、最初の細胞培養を支持し得るが、追加の供給培地が、次いで、枯渇した栄養素を補給するために供給される。バイオリアクターシステムは、バッチあたり少なくともある特定の量の細胞を製造し得る。バイオリアクターシステムは、約１０億個細胞～約１０京個細胞のバッチを製造してもよい。バイオリアクターシステムは、少なくとも約１０億個細胞のバッチを製造してもよい。バイオリアクターシステムは、約１０京個細胞のバッチを製造してもよい。バイオリアクターシステムは、１０億個細胞未満～約１０億個細胞、約１０億個細胞～１００億個細胞、約１０億個細胞～約５００億個細胞、約１０億個細胞～約１０００億個細胞、約１０億個細胞～約５０００億個細胞、約１０億個細胞～約１兆個細胞、約１０億個細胞～約５兆個細胞、約１０億個細胞～約１０兆個細胞、約１０億個細胞～約１００兆個細胞、約１０億個細胞～約１０００兆個細胞、約１０億個細胞～約１京個細胞、約１０億個細胞～約１０京個細胞、約１００億個細胞～約５００億個細胞、約１００億個細胞～約１０００億個細胞、約１００億個細胞～約５０００億個細胞、約１００億個細胞～約１兆個細胞、約１００億個細胞～約５兆個細胞、約１００億個細胞～約１０兆個細胞、約１００億個細胞～約１００兆個細胞、約１００億個細胞～約１０００兆個細胞、約１００億個細胞～約１京個細胞、約１００億個細胞～約１０京個細胞、約５００億個細胞～約１０００億個細胞、約５００億個細胞～約５０００億個細胞、約５００億個細胞～約１兆個細胞、約５００億個細胞～約５兆個細胞、約５００億個細胞～約１０兆個細胞、約５００億個細胞～約１００兆個細胞、約５００億個細胞～約１０００兆個細胞、約５００億個細胞～約１京個細胞、約５００億個細胞～約１０京個細胞、約１０００億個細胞～約５０００億個細胞、約１０００億個細胞～約１兆個細胞、約１０００億個細胞～約５兆個細胞、約１０００億個細胞～約１０兆個細胞、約１０００億個細胞～約１００兆個細胞、約１０００億個細胞～約１０００兆個細胞、約１０００億個細胞～約１京個細胞、約１０００億個細胞～約１０京個細胞、約５０００億個細胞～約１兆個細胞、約５０００億個細胞～約５兆個細胞、約５０００億個細胞～約１０兆個細胞、約５０００億個細胞～約１００兆個細胞、約５０００億個細胞～約１０００兆個細胞、約５０００億個細胞～約１京個細胞、約５０００億個細胞～約１０京個細胞、約１兆個細胞～約５兆個細胞、約１兆個細胞～約１０兆個細胞、約１兆個細胞～約１００兆個細胞、約１兆個細胞～約１０００兆個細胞、約１兆個細胞～約１京個細胞、約１兆個細胞～約１０京個細胞、約５兆個細胞～約１０兆個細胞、約５兆個細胞～約１００兆個細胞、約５兆個細胞～約１０００兆個細胞、約５兆個細胞～約１京個細胞、約５兆個細胞～約１０京個細胞、約１０兆個細胞～約１００兆個細胞、約１０兆個細胞～約１０００兆個細胞、約１０兆個細胞～約１京個細胞、約１０兆個細胞～約１０京個細胞、約１００兆個細胞～約１０００兆個細胞、約１００兆個細胞～約１京個細胞、約１００兆個細胞～約１０京個細胞、約１０００兆個細胞～約１京個細胞、約１０００兆個細胞～約１０京個細胞、もしくは約１京個細胞～約１０京個細胞、または１０京個細胞超のバッチを製造してもよい。

バイオリアクターシステムは、ある特定の期間の間、培養細胞のバッチを製造し得る。例えば、一部の場合では、バイオリアクターシステムは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日、またはそれよりも長い日数ごとに少なくとも１回、培養細胞のバッチを製造してもよい。バイオリアクターシステムは、少なくともある特定の質量を有する培養細胞のバッチを製造し得る。時々、質量は、過剰の培地または除去される上清を伴って、乾燥重量として測定される。バイオリアクターシステムは、約１キログラム（ｋｇ）～約１００，０００ｋｇの培養細胞のバッチを製造してもよい。ある特定の例では、バイオリアクターシステムは、少なくとも約１ｋｇのバッチを製造する。バイオリアクターシステムは、約１００，０００ｋｇ、または１００，０００ｋｇ超のバッチを製造してもよい。バイオリアクターシステムは、約１ｋｇ未満～１ｋｇ、約１ｋｇ～約５ｋｇ、約１ｋｇ～約１０ｋｇ、約１ｋｇ～約２０ｋｇ、約１ｋｇ～約３０ｋｇ、約１ｋｇ～約４０ｋｇ、約１ｋｇ～約５０ｋｇ、約１ｋｇ～約１００ｋｇ、約１ｋｇ～約５００ｋｇ、約１ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約１ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約１ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約５ｋｇ～約１０ｋｇ、約５ｋｇ～約２０ｋｇ、約５ｋｇ～約３０ｋｇ、約５ｋｇ～約４０ｋｇ、約５ｋｇ～約５０ｋｇ、約５ｋｇ～約１００ｋｇ、約５ｋｇ～約５００ｋｇ、約５ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約５ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約５ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約１０ｋｇ～約２０ｋｇ、約１０ｋｇ～約３０ｋｇ、約１０ｋｇ～約４０ｋｇ、約１０ｋｇ～約５０ｋｇ、約１０ｋｇ～約１００ｋｇ、約１０ｋｇ～約５００ｋｇ、約１０ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約１０ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約１０ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約２０ｋｇ～約３０ｋｇ、約２０ｋｇ～約４０ｋｇ、約２０ｋｇ～約５０ｋｇ、約２０ｋｇ～約１００ｋｇ、約２０ｋｇ～約５００ｋｇ、約２０ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約２０ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約２０ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約３０ｋｇ～約４０ｋｇ、約３０ｋｇ～約５０ｋｇ、約３０ｋｇ～約１００ｋｇ、約３０ｋｇ～約５００ｋｇ、約３０ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約３０ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約３０ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約４０ｋｇ～約５０ｋｇ、約４０ｋｇ～約１００ｋｇ、約４０ｋｇ～約５００ｋｇ、約４０ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約４０ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約４０ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約５０ｋｇ～約１００ｋｇ、約５０ｋｇ～約５００ｋｇ、約５０ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約５０ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約５０ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約１００ｋｇ～約５００ｋｇ、約１００ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約１００ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約１００ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約５００ｋｇ～約１，０００ｋｇ、約５００ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約５００ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、約１，０００ｋｇ～約５，０００ｋｇ、約１，０００ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、もしくは約５，０００ｋｇ～約１００，０００ｋｇ、または１００，０００ｋｇ超のバッチを製造してもよい。

細胞および組織培養は、成長、拡大増殖および分化全体にわたって、１つまたは複数のバイオリアクターまたはバイオリアクターチャンバーにおいて起こり得る。細胞または組織培養において使用される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０超のバイオリアクターまたはバイオリアクターチャンバーが存在していてもよい。バイオリアクターシステムは、約１リアクターチャンバー～約５リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約１０リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約２０リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約５０リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約１００リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約２００リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約３００リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約４００リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約１リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約１０リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約２０リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約５０リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約１００リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約２００リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約３００リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約４００リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約５リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、約１０リアクターチャンバー～約２０リアクターチャンバー、約１０リアクターチャンバー～約５０リアクターチャンバー、約１０リアクターチャンバー～約１００リアクターチャンバー、約１０リアクターチャンバー～約２００リアクターチャンバー、約１０リアクターチャンバー～約３００リアクターチャンバー、約１０リアクターチャンバー～約４００リアクターチャンバー、約１０リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約１０リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、約２０リアクターチャンバー～約５０リアクターチャンバー、約２０リアクターチャンバー～約１００リアクターチャンバー、約２０リアクターチャンバー～約２００リアクターチャンバー、約２０リアクターチャンバー～約３００リアクターチャンバー、約２０リアクターチャンバー～約４００リアクターチャンバー、約２０リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約２０リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、約５０リアクターチャンバー～約１００リアクターチャンバー、約５０リアクターチャンバー～約２００リアクターチャンバー、約５０リアクターチャンバー～約３００リアクターチャンバー、約５０リアクターチャンバー～約４００リアクターチャンバー、約５０リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約５０リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、約１００リアクターチャンバー～約２００リアクターチャンバー、約１００リアクターチャンバー～約３００リアクターチャンバー、約１００リアクターチャンバー～約４００リアクターチャンバー、約１００リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約１００リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、約２００リアクターチャンバー～約３００リアクターチャンバー、約２００リアクターチャンバー～約４００リアクターチャンバー、約２００リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約２００リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、約３００リアクターチャンバー～約４００リアクターチャンバー、約３００リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約３００リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、約４００リアクターチャンバー～約５００リアクターチャンバー、約４００リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、もしくは約５００リアクターチャンバー～約１，０００リアクターチャンバー、または１，０００超のリアクターチャンバーを含む。

成長、培養、拡大増殖、および分化は、同じまたは異なるバイオリアクターまたはバイオリアクターチャンバーにおいて、同時的または並行であってもよい。例えば、バイオリアクターシステムは、ｉＰＳＣの拡大増殖が起こる２つのバイオリアクター、およびｉＰＳＣの分化が起こる４つのバイオリアクターが存在するように設計されていてもよい。細胞は、およそ７日の期間、スケーラブルなサイズの第１のバイオリアクター内で成長してもよい。細胞は、およそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０日、または９０日超の間、成長してもよい。１つまたは複数の拡大増殖プロセスは、培養幹細胞の少なくともサブセットまたはすべてを継代するステップを含んでいてもよい。細胞は、スケーラブルなサイズの第１のバイオリアクターのおよそ４倍のサイズの次のバイオリアクターに継代されてもよい。次のバイオリアクターは、スケーラブルなサイズの第１のバイオリアクターの２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または１０倍超のサイズであってもよい。次のバイオリアクターは、スケーラブルなサイズの第１のバイオリアクターの１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１倍未満のサイズであってもよい。培養細胞は、およそ７日ごとに「分割」または「継代」されてもよいが、細胞を、特定の必要性および培養の状況に応じて、より高い頻度でまたはより低い頻度で分割することができる。例えば、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、もしくはそれよりも長い日数ごとに、またはその間の任意のタイムフレームで分割されてもよい。細胞の分割または継代は、以前の培養からの細胞の収集、および収集した（回収した）細胞の新しい細胞培養容器へのその後の移動を含み得る。継代は、健康な細胞培養環境で、細胞が成長し続けることを可能にし得る。細胞培養物の継代のプロセスおよび方法は、それらの成長拡大の間に一緒に塊になった細胞を脱凝集するための酵素的または非酵素的方法の使用を含んでいてもよい。継代は、酵素を培養幹細胞のサブセットまたはすべての上を通過させて、それらを分解可能な足場の表面から取り外すステップを含んでいてもよい。細胞を、定義された培地との接触の前および／または後に、酵素的な、非酵素的なまたは手作業の解離方法を使用して継代することができる。酵素的解離方法の非限定的な例としては、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥ、コラゲナーゼ、ディスパーゼおよびアキュターゼなどのプロテアーゼの使用が挙げられる。酵素的継代方法が使用される場合、得られる培養物は、使用される酵素的方法に応じて、サイズが変わる細胞のシングレット、ダブレット、トリプレットおよび塊の混合物を含み得る。非酵素的解離方法の非限定的な例は、細胞分散緩衝液またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。継代方法の選択は、存在する場合、細胞型、細胞外基質または生体材料足場の選択によって影響を受け得る。

あるバイオリアクターから次に細胞を継代するために、培地を、バイオリアクターの棚から排出してもよく、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって置き換えて、細胞を洗浄してもよい。バイオリアクター中のそれぞれの棚が、少なくとも１５秒間、ＰＢＳに浸けられ得るように、ＰＢＳが、細胞上を流れてもよく、その後、ＰＢＳは除去および廃棄されてもよい。バイオリアクター中のそれぞれの棚は、少なくとも約１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、６０秒、７０秒、８０秒、９０秒、または９０秒超の間、ＰＢＳに浸けられてもよい。バイオリアクター中のそれぞれの棚は、約１秒未満の間、浸けられてもよい。酵素、またはＰＢＳ中のＥＤＴＡなどの化学溶液を、細胞上を通過させて、それらの接着の表面、例えば、バイオリアクター中の棚、足場、または表面から細胞を取り外してもよい。細胞は、一定の間、例えば、４～８分間、酵素または化学溶液中でインキュベートされてもよく、その後、溶液は除去および廃棄される。細胞は、少なくとも約１分～２分、１分～３分、１分～４分、１分～５分、１分～６分、１分～７分、１分～８分、１分～９分、１分～１０分、もしくは１分～１０分超、２分～３分、２分～４分、２分～５分、２分～６分、２分～７分、２分～８分、２分～９分、２分～１０分、２分～１０分超、３分～４分、３分～５分、３分～６分、３分～７分、３分～８分、３分～９分、３分～１０分、３分～１０分超、４分～５分、４分～６分、４分～７分、４分～８分、４分～９分、４分～１０分、４分～１０分超、５分～６分、５分～７分、５分～８分、５分～９分、５分～１０分、５分～１０分超、６分～７分、６分～８分、６分～９分、６分～１０分、６分～１０分超、７分～８分、７分～９分、７分～１０分、７分～１０分超、８分～９分、８分～１０分、８分～１０分超、９分～１０分、または９分～１０分超の間、酵素または化学溶液中でインキュベートされてもよい。細胞は、１分未満または１０分超の間、酵素または化学溶液中でインキュベートされてもよい。培地貯蔵タンクからの培地を使用して、培地を細胞の上を通過させることによって、取り外された細胞を収集してもよく、培地中の細胞は、追加のタンクに収集されて、遠心分離／細胞濾過システムを通過させて、培地から細胞およびコロニー片を単離してもよい。次いで、凝縮された細胞／培地溶液を、バイオリアクターの棚を均等にコーティングできるように流量の減少を使用して、次のバイオリアクターにそれが流れるように、培地貯蔵タンクからの培地とさらに混合してもよい。細胞は、遠心分離を使用して、またはｉＰＳＣなどの目的外の細胞のサイズの細胞を分離し得る細胞濾過などの代替方法により、分離されてもよい。

細胞を、次のバイオリアクターにおいて、およそ７日間の間、拡大増殖してもよく、または同じバイオリアクターにおいて、およそ７日間の間、拡大増殖してもよい。細胞は、およそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０日、または９０日超の間、拡大増殖してもよい。細胞は、スケーラブルなサイズの前のバイオリアクターの２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または１０倍超のサイズであり得る１つまたは複数のバイオリアクターにさらに継代されてもよい。次のバイオリアクターは、スケーラブルなサイズの前のバイオリアクターの１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１倍未満のサイズであってもよく、このようにして、バイオリアクターのサイズおよび得られた培養細胞の密度に応じた比によって細胞を分割する。

分化は、最後のバイオリアクターにおいて起こってもよく、または前のバイオリアクターにおいて起こってもよい。幹細胞または前駆細胞の最終分化した細胞への分化は、およそ１４～２１日、またはそれよりも長くかかってもよい。幹細胞または前駆細胞の最終分化した細胞への分化は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０日、または９０日超かかってもよい。幹細胞または前駆細胞の最終分化した細胞への分化は、９０日未満、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１日、または１日未満かかってもよい。例えば、間葉系幹細胞は、バイオリアクターにおける適切な培養の１７日後に、骨格筋の筋細胞から構成される組織に分化してもよい。成熟組織が製造された場合、これは、それぞれの層をドローとして引き抜き、食品製品を抽出することによって、システムから除去してもよい。成熟組織は、肉を抽出することによって引き延ばされ得る成熟骨格筋線維を含んでいてもよい。

拡大増殖および分化段階は、１種または異なる種類の培地を使用してもよい。培地および成長条件は、異なる培地、温度、条件または組成を使用して、最適化されてもよい。１種または多数の培地貯蔵タンクを使用して、１種または多数の種類の培地を貯蔵してもよい。培地貯蔵タンクは、溶液中の分化因子または低分子の貯蔵のための領域を含んでいてもよい。培地貯蔵タンクは、温度制御されていてもよく、複数のタンクにおける個々のタンクは、異なる温度で培地を貯蔵していてもよい。例えば、培地は、４℃で貯蔵されていてもよく、培地と混合される分化因子は、－２０℃で貯蔵されていてもよい。凍結温度または凍結温度未満で貯蔵された分化因子、培地構成要素または培地は、自動的に解凍され、必要な時に適切な培地貯蔵タンクに添加されてもよい。一部の培地構成要素は、数週間新鮮なままであり得るが、一部の分化因子またはヌクレオチドは、２４時間未満で迅速に分解され得るので、凍結されて維持されていてもよい。培地は、血清を含んでいてもよく、または無血清培地を利用してもよい。培養培地は、維持培地、分化培地、脂肪培地、増殖培地、または任意の他の培地処方を含んでいてもよい。培養培地は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、もしくは２４時間超ごとに、またはそれらの任意の分数ごとにリフレッシュされてもよい。追加の例では、培地は、より低い頻度で、例えば、限定されるものではないが、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９日ごとに、または２日もしくはそれよりも長い日数ごとに、あるいはそれらの間の任意のタイムフレームで、リフレッシュされてもよい。

一部の態様では、本開示は、食用肉製品を製造するための方法を提供する。方法は、１種もしくは複数または２種もしくはそれよりも多くの異なる組成物（例えば、異所性分化因子）を使用して一過的な非組み込みの様式で幹細胞における１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートして、前駆細胞を生成するステップ、前駆細胞の少なくともサブセットを培養して、培養細胞を生成するステップ、および培養細胞の少なくともサブセットを分化して、最終分化した細胞を生成して、食用肉製品を製造するステップを含んでいてもよい。培養するステップおよび分化するステップは、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよく、または異なるバイオリアクターチャンバーにおいて行われてもよい。最終分化した細胞は、筋肉細胞、脂肪細胞、骨細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、神経細胞、体節細胞、またはそれらの組合せを含み得る。

異所性分化因子は、生化学系による非ネイティブ誘導を使用して、一過的な非組み込みの様式で分化を誘導し得る。異所性分化因子は、核酸、ポリペプチド、低分子、増殖因子、またはそれらの任意の組合せを含み得る。培養幹細胞または前駆細胞は、幹細胞または前駆細胞の細胞周期を停止することによって、分化されてもよい。異所性分化因子は、増殖因子を低減または除去することによって、細胞の細胞周期を停止してもよい。異所性分化因子は、増殖因子を培養細胞のサブセットから低減または除去することにより、細胞の細胞周期を停止してもよい。増殖因子は、培養細胞のサブセットから低減または除去されてもよい。幹細胞の自己再生および多能性は、Ｏｃｔ３／４またはＳｏｘ２などのコア転写因子のセットからなる内因性の多能性遺伝子調節ネットワークにより媒介される外因性シグナルによって支配されていてもよい。転写因子相互作用は、転写装置をモジュレートする活性化因子および抑制因子をリクルートすることによって、負および正のフィードバックループならびに転写の両方を確立することによって、ゲノム機能を調節し得る。多能性幹細胞における自己再生および分化の幹細胞の特徴を維持するには、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＦＧＦ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）経路、Ｗｎｔ／グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）、および形質転換増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）シグナル伝達を含む異なる外因性シグナル伝達経路を必要とし得る。幹細胞または前駆細胞の分化に影響を及ぼし得る増殖因子は、ＬＩＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、アクチビン、ＭＡＰＫ、およびＴＧＦ－βを含み得る。白血病阻害因子は、多くの骨髄性白血病細胞系における分化の誘導、正常な胚性幹細胞における分化の抑制、骨芽細胞および造血細胞の増殖の刺激を含む広い範囲の組織および細胞型において作用する多機能糖タンパク質であり得る。ＬＩＦは、分化した体細胞からｉＰＳＣを確立するのに必要であり得る。ＬＩＦの細胞培養物への添加は、体細胞からのｉＰＳＣの初期化を改善するだけでなく、幹細胞増殖の維持に役立ち得る。活性化された線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達は、自己再生性増殖を促進し、細胞老化を阻害することによって、幹細胞の能力を維持し得る。ＬＩＦの除去は、プライミングされた多能性の特色の特徴を有する４つのＦＧＦ受容体／ＥＲＫがコミットされた初期分化状態へのナイーブ状態からの胚性幹細胞の可逆性の変換をもたらし得る。ＬＩＦによる分化経路のＳＭＡＤ阻害剤を通じた骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、幹細胞の自己再生および幹細胞における分化可能性を維持し得る。ＦＧＦシグナル伝達の下流のＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化の阻害は、幹細胞の安定性および幹細胞性を改善し得る。ＦＧＦ４／ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化は、幹細胞の多系列分化において必要であり得る。ＦＧＦ２およびアクチビンは、Ｏｃｔ４の発現を増強し、それによって、幹細胞においてプライミングから多能性のナイーブ状態への復帰を可能にし得る。ＳＭＡＤ２／３を介したＴＧＦβ／アクチビン／ｎｏｄａｌシグナルは、幹細胞の多能性に関連し得、プライミングされた幹細胞および前駆細胞の維持のために必要であり得る。幹細胞または前駆細胞の細胞周期を停止させることは、培養が実施される溶液中の血清レベルを低減または除去することによって起こり得る。例えば、血清分子を含む培地と無血清培地を置き換えることで、ｉＰＳＣの細胞周期を停止させ、細胞の分化可能性を増強し得る。

バイオリアクターシステムは、大規模細胞培養のためにスケーラブルであってもよい。バイオリアクターシステムは、細胞を培養するためのリアクターチャンバーを含んでいてもよい。バイオリアクターシステムは、リアクターチャンバーの内容物のかき混ぜ、またはそうでなければ、リアクターチャンバーの内容物の機械的もしくは電気的刺激のためのエレメントを含んでいてもよい。新鮮な培地が、少なくとも１つの投入口を介して、リアクターチャンバーに添加されてもよい。枯渇した培地または廃液は、少なくとも１つの取出口を介してリアクターチャンバーから除去されてもよい。酸素、二酸化炭素および／または他のガスが、少なくとも１つのガス投入口を通じて導入されてもよい。ガス投入口は、リアクターチャンバーの内側に位置するエアレータに連結されていてもよい。バイオリアクターシステムは、制御ユニット（例えば、コンピュータ）と通信し得るリアクターチャンバーをモニタリングするための少なくとも１つのセンサーを含んでいてもよい。バイオリアクターシステムは、ヒト食物摂取のための培養組織の製造を容易にし得る。バイオリアクターは、細胞付着のための接着表面を提供する複数の足場または表面を含むリアクターチャンバー、バイオリアクター内の培養された自己再生性細胞の集団、自発的な分化なしで自己再生性細胞の集団を維持するための構成要素を含む少なくとも１種の維持培地を提供する第１の起源、および自己再生性細胞の集団の特定の系列に分化するための構成要素を含む少なくとも１種の分化培地を提供する第２の起源を含んでいてもよい。リアクターチャンバーは、ある特定の接着細胞の接着を可能にする複数の足場または棚を含んでいてもよい。細胞が付着し、成長し得る一連の足場、棚または培養表面が、存在していてもよい。バイオリアクターシステムは、少なくとも１種の分解可能な食品に安全な足場を含んでいてもよい。これらの棚は、棚が互いに逆の角度になるように配置されていてもよい。棚の角度は、１°未満、約１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°、１０°、または１０°超の角度であってもよい。

細胞の上の培地の重力によって支援された灌流層流が存在していてもよい。培地は、バイオリアクターの上部からバイオリアクターの底部に流れてもよく、そこで、培地はリサイクルされてもよい。培地が、バイオリアクターの最後の棚に達すると、流出は、培地からの廃棄物の透析を可能にするダイアフラムシステムを通して重力に対して上向きにポンプで送られてもよい。重力を利用するリアクターの上部からのバイオリアクター再侵入の前に、濾過後の培地は、失われた栄養素および他の培地構成要素が補給されてもよい。二酸化炭素などのガスの除去および酸素などのガスの補給は、リサイクルの間に行われてもよい。ガスは、カスタムシステム、または１つの透析膜もしくは複数の透析膜が並行した市販システムを使用して、培地内で管理されてもよい。

幹細胞を培養して、培養幹細胞を生成するステップ、および培養幹細胞の少なくともサブセットを１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付して、拡大増殖した幹細胞を生成するステップは、培地をバイオリアクターチャンバーおよび追加のバイオリアクターチャンバーを通じて向かわせて、幹細胞を培養するステップまたは１つもしくは複数の拡大増殖プロセスを容易にするステップを含んでいてもよい。培地は、連続層流または振動流下にあってもよい。培地は、細胞培養または拡大増殖を促進するように構成されていてもよい。培地は、追加のバイオリアクターチャンバー外に向かわせてもよい。培地は、追加のバイオリアクターチャンバーからの方向付けの間に濾過されて、望ましくない構成要素を培地から除去し、それによって、濾過された培地が生成されてもよい。濾過するステップにより、アンモニウム、乳酸塩、アラニン、メチルグリオキシレート、および他の細胞廃棄物が除去され得る。濾過するステップは、核酸および分化因子の濃度に最小限の影響を及ぼし得る。濾過された培地は、バイオリアクターチャンバーに戻ってリサイクルされてもよい。培地を濾過するステップは、夾雑物および不純物を除去することができる任意の濾過の種類、例えば、炭素濾過またはゼオライト濾過を使用することを含んでいてもよい。培地のリサイクルは、閉鎖ループ灌流システム、例えば、生理学的な栄養素の添加および毒素の除去を可能にする透析ユニットを含んでいてもよい。リサイクルシステム内の温度は、３７℃などの一定の温度で維持されていてもよく、または可変温度を含んでいてもよい。リアクター全体を流れる培地は、必要な溶存酸素を含有していてもよく、または培地の上および棚の下のギャップは、空気循環のために利用されてもよい。灌流システムは、一次組織灌流回路、ならびに栄養素および毒素の交換のための二次透析回路を含んでいてもよい。一次回路は、ポンプを使用して、組織成長チャンバー、膜酸素供給器、熱交換器、またはバブルトラップを通して再循環される培養培地灌流液を含んでいてもよい。ポンプは、一定、振動または蠕動であってもよい。膜酸素供給器は、一定ｐＨを維持して、８０％のＯ_２／５％のＣＯ_２／１５％のＮ_２の混合物でガス供給してもよい。灌流液の一部または全部が、二次回路に方向転換されてもよい。二次回路は、ホローファイバー透析装置などの透析装置を含んでいてもよい。二次回路は、例えば、無タンパク質透析液への逆流曝露、およびポンプを使用してフィルターを通した灌流液の再循環を使用することによって、灌流液を透析してもよい。

灌流溶液の送達は、送達システムにおけるポンプの使用によるコントローラーによって制御され得る流体回路を介して起こってもよい。灌流溶液の送達は、培養培地、および酸素、二酸化炭素または窒素などの１種または複数のガス媒体により灌流溶液を富化するように構築されてもよい。灌流溶液は、培養培地によって、および酸素供給器などによる１種または複数のガス媒体によって灌流溶液を富化するリザーバーに作動可能に連結されていてもよい。培地中のガスバランスは、約２１％～約９５％の酸素、約０％～約１０％の二酸化炭素、および１００％までつり合いをとった窒素の混合物を含んでいてもよい。例えば、バイオリアクターは、３７℃、ｐＨ７．２で保持された約８０％の酸素、約５％の二酸化炭素、および約１５％の窒素の媒体の混合物を提供し得る。

培地は、所定の時間間隔で、または細胞密度もしくは条件付け培地の組成などの確立されたベンチマークに基づいてリサイクルされてもよい。バイオリアクターチャンバーとの流体連通中に、廃棄培地容器または新鮮培地容器が存在していてもよい。廃棄培地容器は、制御された様式で培地の排出および置き換えを容易にするようにリサイクルされない培地を収集し得る。廃棄培地容器は、廃棄培地を濾過し、処理された培地をシステムに戻す透析装置との流体連通中にあってもよい。培地のリサイクルの間、あるパーセンテージの培地が、除去され、添加される新鮮な基礎培地で置き換えられ、および／または使用された培地が除去され、精製され、バイオリアクターチャンバーまたは新鮮培地容器に戻ってもよい。交換される培地は、バイオリアクターチャンバーにおける元の体積の少なくとも１％、少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも７．５％、少なくとも１０％、少なくとも１２．５％、少なくとも１５％、少なくとも１７．５％、少なくとも２０％、または２０％超を含んでいてもよい。交換される培地は、バイオリアクターチャンバーにおける元の体積の１％未満を含んでいてもよい。

バイオリアクターにおける培養条件は、無菌の、撹拌または動的流れ条件を含み得る。バイオリアクターは、サイズを調整して、より多くの体積の細胞を製造してもよく、または栄養素、ガス、代謝産物、および調節分子の流れに対するより大きな制御を可能にしてもよい。バイオリアクターは、圧縮、伸縮性、または流れの変更などの物理的および機械的シグナルを提供して、細胞を刺激して、特定の生体分子を製造するか、または特定の細胞型に分化させてもよい。動物全体に由来する組織とは違って、ｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで成長した組織は、運動したことがなくてもよく（例えば、足を動かすために使用されたことがない）、そのため、運動の効果を模倣し得る刺激なしで、風味またはテクスチャに相違を有していてもよい。細胞もしくは組織培養物、または肉製品全体が、ｅｘ ｖｉｖｏで成長した肉または動物全体に由来する肉の間のテクスチャまたは風味の類似性を増加させる刺激に曝露されてもよい。細胞または組織培養物は、機械的または電気的刺激に曝露されてもよい。機械的刺激は、圧縮、膨張、せん断流、伸長、振動流、または動的伸長を含み得る。電気的刺激は、電流または振動電流を含み得る。培養細胞、組織または肉製品をｉｎ ｖｉｔｒｏで機械的または電気的刺激に曝露することで、培養細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの成長速度が増加し得る。機械的または電気的刺激は、幹細胞もしくは前駆細胞、またはそれらの前駆体細胞から分化した後の細胞に適用されてもよい。

培養肉は、筋細胞および脂肪細胞などの細胞の混合集団を含んでいてもよい。前脂肪細胞または衛星細胞などの前駆細胞は、起源から単離されてもよく、一部の自己再生能を有していてもよい。これらの自己再生性細胞は、バイオリアクターにおいて、培養され、拡大増殖され、その後分化されてもよい。一部の場合では、自己再生性細胞の不均一な組成物は、一緒に培養されてもよく、またはそれらは、分化後にそれらがある特定の比で一緒に共培養されて、最終肉製品において所望の比を生じ得る時まで、別個に培養されてもよい。細胞の集団は、同じ培養物中で異なる細胞型に分化するように誘導されてもよい。例えば、前駆細胞からの一部の細胞が、脂肪細胞を形成し、一部が、筋細胞を形成してもよい。これらの筋細胞および脂肪細胞は、別個に培養され、その後混合されてもよく、または等しい割合で均一に混合されてもよい。筋細胞および脂肪細胞は、同等でない割合で不均一に混合されてもよい。共培養または加工のために、筋細胞および脂肪細胞は、ある特定の比または割合で組み合わされてもよい。例えば、一部の場合では、筋細胞および脂肪細胞は、それぞれ、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、または少なくとも１００：１の比で組み合わされてもよい。

肉製品は、ある特定の比の速筋および遅筋の細胞および／または線維を有する肉を含んでいてもよい。肉製品は、ある特定の比または割合の速筋線維（ＩＩ型）および遅筋線維（Ｉ型）を有する筋細胞または骨格筋細胞を含んでいてもよい。遅筋線維は、酸化的経路によって煽られた低強度の収縮を示し得、比較的高い耐久性を実証し得るが、速筋線維は、解糖経路によって煽られたより高い強度の収縮を有し得る。速筋は、高い解糖性および嫌気性の筋線維によって特徴付けられ得る。筋肉組織における速筋線維および遅筋線維の比は、味、色、テクスチャ、および肉の他の料理特性において役割を果たし得る。

バイオリアクターシステムは、無病原体環境における食品製造のために、細胞の培養を可能にし得る。細胞は、ヒトの健康に影響を及ぼす危険な夾雑物を含まない培養環境において成長し得る。細胞培養プレート、フラスコ、およびバイオリアクターは、危険な病原体（例えば、Ｈ１Ｎ１）、寄生生物、重金属、または毒素（例えば、細菌エンドトキシン、農薬など）を含まない細胞培養条件を提供し得る。細胞培養システムは、従来の畜産農業とは対照的に、抗生物質を利用しなくてもよい。分化因子、培地構成要素もしくはヌクレオチド分子、またはそうでなければ細胞培養において使用される誘導モダリティは、一過的であってもよく、または細胞もしくは組織が食品製品に加工される前に除去されてもよい。

食用肉製品は、およそ５０グラム（ｇ）またはそれよりも大きい単位形態であってもよい。食用肉製品は、少なくとも約１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、６０ｇ、７０ｇ、８０ｇ、９０ｇ、１００ｇ、１５０ｇ、２００ｇ、２５０ｇ、３００ｇ、３５０ｇ、４００ｇ、４５０ｇ、５００ｇ、６００ｇ、７００ｇ、８００ｇ、９００ｇ、１０００ｇ、または１０００ｇ超の単位形態であってもよい。食用肉製品は、１ｇ未満の単位形態であってもよい。ハンバーガーパティは、例えば、ダイナースタイルで出される場合、８５ｇ～１１３ｇ（３～４オンス）、またはよりヘビーなパブスタイルで出される場合、１９８ｇ～２２６ｇ（７～８オンス）の事前調理された重量を有していてもよい。
コンピュータシステム

本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図１は、本明細書に記載される方法を行うようにプログラムされたか、またはそうでなければ構成されたコンピュータシステム１０１を示す。コンピュータシステム１０１は、例えば、バイオリアクターにおける供給される培地の培養物に対する比を決定することなどの本開示のさまざまな態様を調節することができる。コンピュータシステム１０１は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに関して遠く離れて位置するコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは、携帯型電子デバイスであってもよい。

コンピュータシステム１０１は、中央演算処理装置（ＣＰＵ、また本明細書では「プロセッサ」または「コンピュータプロセッサ」）１０５を含み、これは、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並行処理のための複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム１０１はまた、メモリまたはメモリ位置１１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インタフェース１２０（例えば、ネットワークアダプター）、ならびに周辺デバイス１２５、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データストレージおよび／または電子ディスプレイアダプターを含む。メモリ１１０、記憶装置１１５、インタフェース１２０および周辺デバイス１２５は、通信バス（実線）、例えば、マザーボードを通じてＣＰＵ１０５と通信する。記憶装置１１５は、データを保存するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１０１は、通信インタフェース１２０の援助によりコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１３０に作動可能に連結され得る。ネットワーク１３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得、これは、インターネットにより通信する。ネットワーク１３０は、一部の場合では、遠距離通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１３０は、１つまたは複数のコンピュータサーバーを含むことができ、これは、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る。ネットワーク１１３０は、一部の場合ではコンピュータシステム１０１の援助により、ピアツーピアネットワークを実施することができ、これは、クライアントまたはサーバーとして振る舞うコンピュータシステム１０１に連結されたデバイスを可能にし得る。

ＣＰＵ１０５は、一続きの機械可読命令を実行することができ、これは、プログラムまたはソフトウェアに具現化され得る。命令は、メモリ１１０などのメモリ位置に保存されていてもよい。命令は、ＣＰＵ１０５に指示することができ、これは、その後プログラムするか、またはそうでなければＣＰＵ１０５を設定して、本開示の方法を実施することができる。ＣＰＵ１０５によって行われる操作の例としては、データ取得、デコード、実行、およびライトバックが挙げられ得る。

ＣＰＵ１０５は、集積回路などの回路の部分であり得る。システム１０１の１つまたは複数の他の構成要素は、回路に含まれ得る。一部の場合では、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。

記憶装置１１５は、ドライバー、ライブラリおよびセーブされたプログラムなどのファイルを保存することができる。記憶装置１１５は、ユーザーのデータ、例えば、ユーザーのパフォーマンスおよびユーザーのプログラムを保存することができる。コンピュータシステム１０１は、一部の場合では、例えばイントラネットまたはインターネットを通じてコンピュータシステム１０１と通信するリモートサーバーに位置するコンピュータシステム１０１の外にある１つまたは複数の追加のデータ記憶装置を含むことができる。

コンピュータシステム１０１は、ネットワーク１３０を通して、１つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１０１は、ユーザーのリモートコンピュータシステム（例えば、セルラーネットワーク）と通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が挙げられる。ユーザーは、ネットワーク１３０を介してコンピュータシステム１０１にアクセスすることができる。

本明細書に記載される方法は、例えば、メモリ１１０または電子記憶装置１１５などのコンピュータシステム１０１の電子記憶位置に保存された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行コードによって実施することができる。機械実行コードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用の間、コードは、プロセッサ１０５によって実行され得る。一部の場合では、コードは、記憶装置１１５から検索され、プロセッサ１０５による容易なアクセスのためにメモリ１１０に保存され得る。一部の状態では、電子記憶装置１１５は、排除することができ、機械実行命令は、メモリ１１０に保存される。

コードは、コードを実行するように改造されたプロセッサを有する機械による使用のためにプレコンパイルおよび構成され得るか、ランタイムの間にコンパイルされ得る。コードは、プレコンパイルまたはコンパイルされた方法でコードを実行することが可能であるように選択され得るプログラミング言語で供給され得る。

本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様、例えば、コンピュータシステム１１０１は、プログラミングで具現化され得る。さまざまな技術の態様は、典型的には、機械（またはプロセッサ）実行コード、および／またはある種類の機械可読媒体において運ばれるかまたは具現化される関連するデータの形態の「製品」または「製造品」として考えられてもよい。機械実行コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に保存され得る。「ストレージ」型媒体は、コンピュータ、プロセッサなど、またはそれらの関連モジュール、例えば、ソフトウェアのプログラミングのための任意の時に非一時的ストレージを提供し得るさまざまな半導体メモリ、テープデバイス、ディスクデバイスなどの有体メモリのいずれかまたはすべてを含み得る。ソフトウェアのすべてまたは部分は、時々、インターネットまたはさまざまな他の通信ネットワークを通じて通信してもよい。そのような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のものへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへの、ソフトウェアのロードを可能にしてもよい。そのため、ソフトウェアエレメントを持ち得る別の種類の媒体は、例えば、有線および光固定電話ネットワークを通じて、およびさまざまなエアリンクの上を、ローカルデバイス間の物理インタフェースを横断して使用される、光学波、電波および電磁波を含む。そのような波、例えば、有線または無線リンク、光リンクなどを運ぶ物理的エレメントも、ソフトウェアを持つ媒体と考えられ得る。本明細書で使用される場合、非一時的な有体「ストレージ」媒体に制限されない限り、コンピュータまたは機械の「可読媒体」などの用語は、実行のためのプロセッサへの命令の提供に関係する任意の媒体を指す。

そのため、コンピュータ実行コードなどの機械可読媒体は、限定されるものではないが、有体ストレージ媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含む多くの形態をとり得る。不揮発性ストレージ媒体としては、例えば、光ディスクまたは磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータなどにおけるストレージデバイスのいずれか、例えば、図面に示されるデータベースなどを実行するために使用され得る媒体が挙げられる。揮発性ストレージ媒体としては、ダイナミックメモリ、例えば、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリが挙げられる。有体伝送媒体としては、同軸ケーブル、銅線およびファイバーオプティックスが挙げられ、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤを含む。搬送波伝送媒体は、電気シグナルもしくは電磁シグナル、または音波もしくは光波、例えば、ラジオ波（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信の間に発生するものの形態をとってもよい。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理ストレージ媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を運ぶ搬送波、そのような搬送波を運ぶケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取り得る任意の他の媒体が挙げられる。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のために、一続きのまたはそれよりも多くの１つまたは複数の命令をプロセッサに運ぶのに関与し得る。

コンピュータシステム１０１は、ユーザーインタフェース（ＵＩ）１４０を含む電子ディスプレイ１３５を含むか、またはそれと通信することができ、例えば、バイオリアクターにおけるリサイクルの間に、供給される培地の培養物または培地の流量に対する比を決定する。ＵＩの例としては、限定されないが、グラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）およびウェブに基づくユーザーインタフェースが挙げられる。

本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムによって実施することができる。アルゴリズムは、中央演算処理装置１０５による実行の際に、ソフトウェアによって実施することができる。アルゴリズムは、例えば、バイオリアクターにおけるリサイクルの間に、供給される培地の培養物または培地の流量に対する比を決定することができる。

以下の実施例は、本開示の一部の態様をさらに記載するために含まれ、本開示の範囲を限定するものとして使用されるべきではない。
（実施例１）
食用肉製品の製造における細胞培養方法論の概要

図２に示されるように、食用生体材料足場は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｕＲＮＡについての種特異的構築物製造の開発とは別個にまたは並行してのいずれかで製造される。細胞を食用足場に播種し、足場をバイオリアクターに設置する。次いで、細胞を、バイオリアクターまたは多数のバイオリアクターにおいて拡大増殖する。これらのリアクターは、単一容器のバイオリアクターのいずれかであるか、または複数のバイオリアクター容器を含み得る。拡大増殖バイオリアクターは、層流培地の流れと流体接触しており、培地リサイクルは、細胞分化のための単一容器バイオリアクターまたは複数のバイオリアクター容器のいずれかと流体接触している。細胞分化は、培地の変更、遺伝子操作、または培養の間に添加される異所性分化因子を含んでいてもよい。次いで、分化した細胞は、それらが足場上に組織を形成するまでさらに拡大増殖され、その時点で、組織は、それを抜き取ることによってリアクターから除去されてもよく、そこで、食用肉製品として直接使用されてもよく、または肉製品にさらに加工されてもよい。
食用肉製品のための培養における幹細胞の拡大増殖および分化

ブタｉＰＳＣを、ｇｅｌｔｒｅｘコーティングプレート上で、ｉＰＳＣ培地（１０％のＫＯ血清、１ミリリットルあたり１０ナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）のｂＦＧＦ２、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＬＩＦ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミンで補充されたＫＯ ＤＭＥＭ）中で維持および拡大増殖する。細胞を、ｇｅｌｔｒｅｘコーティングプレートおよびカバースリップ上に播種し、分化を、下記の通り６０％のコンフルエンスで開始する。

２４時間前に、細胞を、１０ｕＭのＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充されたＯＰＴＩ－ＭＥＭ血清低減培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とともに供給する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、製造業者の説明書に従って使用する。簡潔には、７５ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）のｍＲＮＡを、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ血清低減培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と混合し、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｓｔｅｍ試薬と室温で１０分間混ぜ合わせた後、細胞に添加する。細胞を、３７℃で２４時間インキュベートし、プロセスを、３連続日繰り返す。４日目に、細胞を、成熟および拡大増殖のために、筋原性培地（１０％のＫＯ血清、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノールで補充されたＫＯ ＤＭＥＭ）に切り替える。細胞を、処理後７～２１日の間に分析のために取り出す。

分析を、免疫組織学的染色を使用して実施し得る。カバースリップ上の細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで、４℃で終夜固定し得る。次いで、細胞を、室温で２時間（または４℃で終夜）、ブロッキング剤（ＰＢＳ＋１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ＋１０％の正常ヤギ血清）とともにインキュベートする。一次抗体を、１：１０００でブロッキング血清に、室温で終夜、直接すべて添加する。カバースリップを、揺らしながらＰＢＳで４回洗浄し、二次抗体を、１：５０００でブロッキング血清に、室温で２～４時間添加し、光から保護する。使用した一次抗体は、ウサギミオシン重鎖／ＭＹＨ３（ａｂ１２４２０５、Ａｂｃａｍ）；ウサギＭＹＯＤ１（ａｂ２０３３８３、Ａｂｃａｍ）；マウスＰＡＸ７（ａｂ１９９０１０、Ａｂｃａｍ）であった。使用した二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）（ａｂ１５００７７、Ａｂｃａｍ）；ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８）（ａｂ１７５４７３、Ａｂｃａｍ）である。カバースリップを、ＰＢＳで４～５回、完全に洗浄した後、顕微鏡法のための調製物中のＤＡＰＩ（Ｈ－１２００、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を有するＡｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを使用して、ガラススライド上に載せる。分析を、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ Ｘ ＷｉｄｅｆｉｅｌｄシステムおよびＬｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｘ（ＬＡＳ Ｘ）を使用して実施する。

遺伝子発現を決定するためのＰＣＲによる分析を実施する。細胞溶解を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）＋１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用して達成する。タンパク質を、プロテイナーゼＫ（２００μｇ／ｍＬ）を使用して、５６℃で１０分間、消化する。０．２Ｍの塩化ナトリウムおよび１００％の無水エタノールによりＤＮＡを沈殿させる。５μＬのＤＮＡを、表１に概説するプライマー配列を使用して、下記の通り、それぞれのＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲを、１分および９４℃の変性ステップ、２分および５５℃のアニーリングステップ、ならびに３分および７２℃の伸長ステップで行った。

他のｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを、順列でこの方法論に対して使用してもよい。実験の変更は、同じ材料および方法を使用し得るが、異なる化合物が導入され得る。
ブタｉＰＳＣにおけるＭＹＯＤ１の一過性発現

ヒトＭＹＯＤ１を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬を使用して、３日間、ブタｉＰＳＣにおいて一過性に発現させる。細胞を、さらに７日間、成熟させる。この成熟後、細胞の６０％が、ＭＹＯＤ１またはＭｙＨＣ（ミオシン重鎖）のいずれかに対して免疫反応性である。ＭＹＯＤ１を、ブタ細胞において発現させることができ、結果として、ｉＰＳＣの骨格筋の筋細胞への分化をもたらすことができる。ＳＯＸ２を発現した細胞は、初期分化ステージが、依然として多能性のウィンドウにあり得ることを示し、筋肉前駆細胞の成熟が、筋原性マーカーの増加および前駆幹細胞マーカーの喪失または減少をもたらし得ると予想され得る。これは、分化のすべての発達ステージにおいて観察され得、予想され得る。これは、ブタｉＰＳＣを骨格筋の筋細胞に分化させる低分子を使用して対照と比較することができ、ここで、６０～７０％の効率を有する作業モデルがある。
ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用する細胞分化の誘導

細胞（ｉＰＳＣｓ／線維芽細胞）を、構成要素（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ）により、１～７日の間、毎日トランスフェクトする。ＧＦＰ／ＲＦＰ／ＹＦＰ ｍＲＮＡ、またはスクランブルされたｓｉＲＮＡを、トランスフェクション対照として使用する。トランスフェクションを、以下の技術のいずれかを使用して行う：従来の化学物質に基づく方法（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、非化学的方法（例えば、電気穿孔またはヌクレオフェクション）、ナノ粒子法（例えば、リポソーム、ポリマーナノ粒子、ミセル、または脂質ナノ粒子）、または磁石支援トランスフェクションによる。

血清低減培地と同時のトランスフェクションの停止は、１４～５０日の過程にわたる培養物の成熟を伴って、細胞が筋原性系列の下方に方向付けられ、多核化筋管の形成が促進される。

トランスフェクションを、２Ｄ（生体材料の有無にかかわらず）または３Ｄ（生体材料の有無にかかわらず、限定されるものではないが、スフェロイド、胚様体、懸濁液または接着剤を含む）培養条件下で行う。培養物の成熟を、生体材料の有無にかかわらず、または筋原線維の成熟を促進する電気刺激もしくは伸縮性の引張力の有無にかかわらず、記載されている２Ｄまたは３Ｄ条件下で行う。

ヌクレオチドの多様な特質は、ヌクレオチドの長さ、二本鎖対一本鎖核酸、およびヌクレオチドの用量範囲の相違において見られ得るように、選択された送達方法に影響を及ぼす：
サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：２０～４０ｂｐｓ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：５００ｂｐ～２～４ｋｂｐの範囲、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子
ヌクレオチドの用量範囲：ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）あたり０．５μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬ。
例えば、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、ナノ粒子トランスフェクションの選択肢を使用して、一緒に送達されてもよい。

設定されたチェックポイントでの分析を、分子生物学的技法を使用して行う。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を使用して、転写因子について、例えば、前駆体マーカーＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２の減少、ならびに筋原性マーカーＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、ミオゲニン、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、デスミン、ミオシン重鎖、およびミオシン軽鎖の発現の増加、ならびに対照についてチェックする。ＩＨＣ（免疫組織化学的検査）は、ミオシン重鎖、ＭＹＯＤ１、デスミン、ＰＸ７、ミオゲニン、ならびに対照のタンパク質発現を検出する一次抗体を使用する。図３において見られ得るように、多核化ＭＹＯＤ１を発現する筋線維は、ＭＹＯＤ ｍＲＮＡによる分化１０日後に形成され、多核化し整列したＭＹＯＤ１を発現する筋線維は、ＭＹＯＤ ｍＲＮＡによる分化３０日後に形成される。
スケーラブルなバイオリアクターを使用する細胞培養

バイオリアクターシステムは、ｉＰＳＣの拡大増殖が起こる２つのバイオリアクター、およびｉＰＳＣの分化が起こる４つのバイオリアクターが存在するように設計される。

細胞は、最初に、およそ７日の期間、サイズｘの第１のバイオリアクター内で成長する。このおよその時間の値は、ラボインキュベーター内のプラスチックプレートにおいてこれらの細胞を培養した経験に由来する。この時に、細胞を、ラボで使用されたおよその分割値に基づいて、サイズ４ｘのバイオリアクターに継代する。ｉＰＳＣを、この４ｘバイオリアクター内で、７日間、さらに拡大増殖する。次いで、細胞を、４つの４ｘバイオリアクターにさらに継代して、細胞を、再び１：４の比に分割する。これらの最終の４つのバイオリアクターにおいて、分化が行われる。これらの細胞を分化して、成熟骨格筋線維を製造するまでのおよその時間は、１４～２１日およびさらなる日数であると推定される。成熟骨格筋線維が製造されたら、それらを、それぞれの層をドローとして引き抜き、肉を抽出することによって、システムから除去する。設計のこの部分は、特に、変更する対象である。

拡大増殖および分化段階は２つの異なる種類の培地を必要とするので、２つの培地貯蔵タンクが必要である。これらのタンク内の培地は、４℃で貯蔵され、培地と混合される分化因子は、－２０℃で貯蔵され、これは、自動的に解凍され、必要な時に適切な培地貯蔵タンクに添加される。培地構成要素が、少なくとも２週間新鮮なままであり得るが、一部の分化因子および低分子が、２４時間未満で分解されるので、凍結されて維持され得ることがこの理由である。

図４において見られ得るように、バイオリアクター内で、細胞が付着し、成長する一連の棚または培養表面が存在する。これらの棚は、棚が互いに逆の角度になるように配置される（３°～６°の角度と推定される）。図５において見られ得るように、細胞の上の培地の重力によって支援された灌流層流が存在する。培地が、バイオリアクターの上部からバイオリアクターの底部に流れて底部に達したら、培地はリサイクルされる。図５Ａにおいて見られ得るように、それぞれの棚の組成物は、その生体適合性のためにダイヤモンドから作製され、青色で図示される。培地をピンク色で示し、矢印により培地の流れを示す。培地および棚の間の薄い黄色の層を示し、これは、ビトロネクチンの細胞表面コーティングを示す。細胞は、細胞表面コーティングの上部において成長し、培地は、それらの上を流れる。図５Ｂにおいて見られ得るように、培地の流れの方向は、それぞれのバイオリアクター全体にわたって矢印によって表され、棚の方向は、水平の線によって表される。
培地のリサイクル、灌流、および失った構成要素の再導入

それぞれのバイオリアクターへの細胞の最初の継代後、バイオリアクター内の培地は、毎日置き換えるのではなく、リサイクルされる。培地は、連続的な層流下にあり、その結果、培地がバイオリアクターの最後の棚に達すると、流出物は、ダイアフラムシステムを通して重力に対して上向きにポンプで送られる（図４では、培地からの廃棄物の透析を可能にするそれぞれのバイオリアクターの隣のオレンジ色の長方形として示される）。次いで、透析後、重力の利点を得るリアクターの上部でのバイオリアクター再侵入の前に、培地は、失われた栄養素および他の培地構成要素が補給される。透析を通じてシステムから廃棄物と一緒に失われた培地構成要素が置き換えられる。システムからのＣＯ_２の除去およびＯ_２レベルの補給は、重要な考慮事項である。ガスは、透析膜と一緒に膜接触装置システムを使用して、培地内で管理される。
１つのバイオリアクターから次への細胞の継代

１つのバイオリアクターから次に細胞を継代するために、培地をバイオリアクターの棚から排出し、ＰＢＳによって置き換え、３～２０秒の短い遅延の後、同じ時に細胞が洗浄される。それぞれの棚が、１５秒間、ＰＢＳに浸けられるように、ＰＢＳが、細胞の上を流れ、その後、ＰＢＳは廃棄物パイプを通じて除去および廃棄されてもよい。次いで、酵素、またはＰＢＳ中のＥＤＴＡ（１：１０００）などの化学物質を、細胞の上を通過させて、プレートの表面から細胞を取り外してもよい。細胞は、４～８分間、酵素／化学溶液中でインキュベートされてもよく、その後、この溶液は、同じ廃棄物パイプを通じて除去および廃棄される。次いで、培地貯蔵タンクからの培地を使用して、培地を細胞の上を強制的に（より高い流量で）通過させることによって、取り外された細胞を収集してもよく、培地中の細胞は、追加のタンク（分離前／遠心分離タンク）に収集されて、遠心分離／細胞濾過システムを通過させて、培地から細胞およびコロニー片を単離してもよい。次いで、凝縮された細胞／培地溶液を、それぞれの棚における細胞表面が均等にコーティングされることを確実にするように流量の減少を使用して、次のバイオリアクターに流れるように、培地貯蔵タンク２からの培地とさらに混合する。細胞を、遠心分離により、またはｉＰＳＣのサイズの細胞を分離する細胞濾過などの代替法により、分離する。バイオリアクターのプロトタイプは、１リットル（Ｌ）の体積であるが、最終製造システムは、３７５０Ｌの内部体積である。
番号付け実施形態

本明細書で企図される実施形態としては、実施形態Ｐ１～Ｐ１１２が挙げられる。

実施形態Ｐ１．細胞を分化または分化転換して、食用肉製品を製造するための方法であって、
（ａ）１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む核酸分子を前記細胞に送達するステップ、
（ｂ）前記核酸分子の送達後に、前記核酸分子またはその発現産物の援助により前記細胞の遺伝子発現をモジュレートして、前記細胞の少なくともサブセットを分化または分化転換して、１種または複数の標的細胞を生成するステップであって、前記モジュレートする際に、前記核酸分子が、前記細胞のゲノムに組み込まれない、ステップ、および
（ｂ）において生成された前記１種または複数の標的細胞を少なくとも部分的に使用して、前記食用肉製品を製造するステップ
を含む、方法。

実施形態Ｐ２．前記核酸分子が、２種またはそれよりも多くの異なるＲＮＡ分子を含む、実施形態１に記載の方法。

実施形態Ｐ３．前記細胞が、動物細胞を含む、実施形態１または２に記載の方法。

実施形態Ｐ４．前記動物細胞が、ブタ細胞を含む、実施形態３に記載の方法。

実施形態Ｐ５．（ｃ）が、前記１種または複数の標的細胞から組織を製造するステップを含む、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ６．前記組織が、筋肉組織、脂肪組織、神経組織、血管組織、上皮組織、結合組織、骨、またはそれらの組合せを含む、実施形態５に記載の方法。

実施形態Ｐ７．前記１種または複数の標的細胞が、少なくとも２種の異なる種類の細胞を含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ８．前記少なくとも２種類の標的細胞を共培養して、三次元組織を生成するステップをさらに含む、実施形態７に記載の方法。

実施形態Ｐ９．前記１種または複数の標的細胞が、筋肉細胞、脂肪細胞、体節細胞、神経細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨細胞、またはそれらの組合せを含む、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ１０．前記ＲＮＡ分子が、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、もしくはＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ１１．前記核酸分子が、非ロックド核酸分子を含む、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ１２．前記ＲＮＡ分子の少なくとも１種が、非ロックド核酸モノマー（ｕＲＮＡ）により改変されている、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ１３．前記ｕＲＮＡが、前記ＲＮＡ分子の前記少なくとも１種とともにさまざまなポイントで組み込まれている、実施形態１２に記載の方法。

実施形態Ｐ１４．前記ＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、化学的に改変されて、その安定性が改善されている、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ１５．前記ＲＮＡ分子の前記少なくとも１種に対する化学的改変が、アンチ－リバースキャップアナログ、３’－グロビンＵＴＲ、ポリＡテール改変、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態１４に記載の方法。

実施形態Ｐ１６．前記ＲＮＡ分子が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはそれらの組合せを含む、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ１７．前記核酸分子が、相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子をさらに含む、実施形態１６に記載の方法。

実施形態Ｐ１８．前記核酸分子が、合成核酸分子である、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ１９．前記核酸分子が、中性もしくはアニオン性リポソーム、カチオン性リポソーム、脂質ナノ粒子、イオン化可能脂質、またはそれらの任意の組合せもしくは変形形態を用いて、前記細胞に送達される、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ２０．前記核酸分子が、単一用量で、前記細胞に送達される、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ２１．前記核酸分子が、少なくとも２用量で、前記細胞に送達される、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ２２．前記少なくとも２用量の個々の用量が、少なくとも３日離れて送達される、実施形態２１に記載の方法。

実施形態Ｐ２３．前記少なくとも２用量の個々の用量が、異なる核酸分子を含む、実施形態２１または２２に記載の方法。

実施形態Ｐ２４．前記核酸分子が、最高で５００ｎＭの濃度で送達される、実施形態１～２３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ２５．前記核酸分子が、ＰＯＵＦ５１（ＯＣＴ３／４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含む、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ２６．前記細胞が、幹細胞、成熟細胞、またはそれらの組合せを含む、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ２７．食用肉製品を細胞から生成する方法であって、
（ａ）前記細胞を足場と接触させるステップ、
（ｂ）前記細胞の少なくともサブセットを、前記足場の存在下、増殖因子または核酸分子の使用により、分化または分化転換プロセスに付して、それによって組織を生成するステップ、および（ｃ）前記組織を使用して、前記食用肉製品を製造するステップ
を含む、方法。

実施形態Ｐ２８．前記足場が、分解可能であり、前記食用肉製品が、必要に応じて、前記足場の少なくとも一部分を含む、実施形態２７に記載の方法。

実施形態Ｐ２９．前記足場が、（ｂ）の間に、１日あたり少なくとも１％の速度で分解する、実施形態２８に記載の方法。

実施形態Ｐ３０．前記細胞が、幹細胞または成熟細胞を含む、実施形態２７～２９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ３１．前記細胞を培養するステップをさらに含む、実施形態２７～３０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ３２．前記細胞を、１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付して、前記細胞を拡大増殖するステップをさらに含む、実施形態２７～３１のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ３３．前記足場が、バイオリアクターチャンバーにおける前記１つまたは複数の拡大増殖プロセスの間に、細胞の拡大増殖を容易にするように構成される、実施形態３２に記載の方法。

実施形態Ｐ３４．（ｂ）が、分化または分化転換した細胞を前記細胞から生成するステップ、および必要に応じて、前記足場内の前記分化または分化転換した細胞の融合を含む、実施形態２７～３３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ３５．（ａ）が、前記細胞の少なくともサブセットを足場の表面上に堆積させるステップを含む、実施形態２７～３４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ３６．前記表面が、接着性表面である、実施形態３５に記載の方法。

実施形態Ｐ３７．前記細胞の前記少なくとも前記サブセットの細胞を前記足場から放出させるステップ、および前記放出された細胞を別個の足場の表面上に堆積させるステップをさらに含む、実施形態３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ３８．前記放出させるステップが、（ｃ）の前である、実施形態３７に記載の方法。

実施形態Ｐ３９．前記分化または分化転換した細胞の融合の少なくとも５０％が、前記放出させるステップの前に起こる、実施形態３８に記載の方法。

実施形態Ｐ４０．前記培養するステップが、前記足場の存在下で実施される、実施形態３１～３９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ４１．前記１つまたは複数の拡大培養プロセスが、前記足場の存在下で実施される、実施形態３２～４０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ４２．前記培養するステップおよび前記１つまたは複数の拡大増殖プロセスが、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われる、実施形態３２～４１のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ４３．前記培養するステップが、バイオリアクターチャンバーにおいて行われ、前記１つまたは複数の拡大増殖プロセスが、追加のバイオリアクターチャンバーにおいて行われる、実施形態３２～４２のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ４４．前記追加のバイオリアクターチャンバーが、個々の細胞の拡大増殖プロセスを容易にするようにそれぞれ構成された複数の追加のバイオリアクターチャンバーを含む、実施形態４３に記載の方法。

実施形態Ｐ４５．培養された細胞の少なくともサブセットを前記バイオリアクターチャンバーから前記複数の追加のバイオリアクターチャンバーに向かわせて、複数の拡大増殖プロセスを行うステップをさらに含む、実施形態４３または４４に記載の方法。

実施形態Ｐ４６．前記複数の拡大増殖プロセスの拡大増殖プロセスが、順次に、同時に、またはそれらの組合せで行われる、実施形態４５に記載の方法。

実施形態Ｐ４７．前記複数の追加のバイオリアクターチャンバーが、少なくとも２つのバイオリアクターチャンバーを含む、実施形態４５または４６に記載の方法。

実施形態Ｐ４８．培地を前記バイオリアクターチャンバーおよび前記複数の追加のバイオリアクターチャンバーの追加のバイオリアクターチャンバーを通して向かわせて、前記培養するステップまたは前記１つもしくは複数の拡大増殖プロセスを容易にするステップをさらに含む、実施形態４７に記載の方法。

実施形態Ｐ４９．前記培地が、連続層流下にある、実施形態４８に記載の方法。

実施形態Ｐ５０．前記培地が、細胞の培養または拡大増殖プロセスを促進するように構成されている、実施形態４８または４９に記載の方法。

実施形態Ｐ５１．前記培地を前記追加のバイオリアクターチャンバー外に向かわせるステップをさらに含む、実施形態４８～５０のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ５２．前記追加のバイオリアクターチャンバー外に向かった前記培地を濾過して、望ましくない構成要素を前記培地から除去し、それによって濾過された培地を生成するステップをさらに含む、実施形態４８～５１のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ５３．前記濾過された培地を前記バイオリアクターチャンバーにリサイクルするステップをさらに含む、実施形態５２に記載の方法。

実施形態Ｐ５４．前記細胞が、動物由来幹細胞を含む、実施形態２７～５３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ５５．前記細胞が、ブタ細胞を含む、実施形態２７～５４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ５６．前記細胞が、多能性幹細胞を含む、実施形態２７～５５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ５７．前記細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む、実施形態２７～５６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ５８．前記細胞が、初期化幹細胞を含む、実施形態２７～５７に記載の方法。

実施形態Ｐ５９．前記細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、実施形態２７～５８のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ６０．前記足場が、ポリマー材料を含む、実施形態２７～５９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ６１．前記ポリマー材料が、合成ポリマー材料を含む、実施形態６０に記載の方法。

実施形態Ｐ６２．前記合成ポリマー材料が、ポリエチレングリコール生体材料を含む、実施形態６１に記載の方法。

実施形態Ｐ６３．前記ポリエチレングリコール生体材料が、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含む、実施形態６２に記載の方法。

実施形態Ｐ６４．前記足場が、ジェランガム生体材料、キャッサバ生体材料、トウモロコシ生体材料、アルギン酸塩生体材料、コーンスターチ生体材料、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む、実施形態２７～６３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ６５．前記方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、実施形態２７～６４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ６６．前記食用肉製品が、少なくとも５０グラムの単位形態である、実施形態２７～６５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ６７．前記食用肉製品が、ロインを含むｉｎ ｖｉｖｏ由来ステーキのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、実施形態２７～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ６８．前記食用肉製品が、ｉｎ ｖｉｖｏ由来ベーコンのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、実施形態２７～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ６９．前記食用肉製品が、ｉｎ ｖｉｖｏ由来豚脇腹肉のテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、実施形態２７～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７０．前記食用肉製品が、ｉｎ ｖｉｖｏ由来ミンチのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、実施形態２７～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７１．前記食用肉製品が、ｉｎ ｖｉｖｏ由来ソーセージのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、実施形態２７～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７２．前記食用肉製品が、ｉｎ ｖｉｖｏ由来リブのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、実施形態２７～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７３．前記食用肉製品が、ｉｎ ｖｉｖｏ由来チョップのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、実施形態２７～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７４．前記食用肉製品が、ｉｎ ｖｉｖｏ由来保存肉製品のテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、実施形態２７～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７５．前記食用肉製品が、さらに加工された食品製品に組み込まれる、実施形態２７～７４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７６．前記食用肉製品が、ビタミンおよびミネラルを含む栄養添加物を含む、実施形態２７～７５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７７．前記１つまたは複数の拡大増殖プロセスが、培養細胞の少なくともサブセットを継代するステップを含む、実施形態３２～７６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ７８．前記継代するステップが、酵素を前記培養細胞の前記少なくとも前記サブセット上を通過させて、前記細胞を前記足場の表面から取り外すステップを含む、実施形態７７に記載の方法。

実施形態Ｐ７９．食用肉製品を細胞から生成するための方法であって、（ａ）２種またはそれよりも多くの異所性分化因子を使用して一過的な非組み込みの様式で前記細胞における１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートして、前駆細胞を生成するステップ、（ｂ）前記前駆細胞の少なくともサブセットを分化して、最終分化した細胞を生成するステップ、および（ｃ）前記最終分化した細胞に少なくとも部分的に基づいて、前記食用肉製品を製造するステップを含む方法。

実施形態Ｐ８０．前記細胞、前記前駆細胞、および前記最終分化した細胞のうちの１種または複数を、培養するステップおよび／または拡大増殖プロセスに付すステップをさらに含む、実施形態７９に記載の方法。

実施形態Ｐ８１．前記培養するステップおよび前記拡大増殖プロセスが、同じまたは異なるバイオリアクターチャンバーにおいて行われる、実施形態８０に記載の方法。

実施形態Ｐ８２．前記最終分化した細胞が、筋肉細胞、脂肪細胞、体節細胞、神経細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨細胞、またはそれらの組合せを含む、実施形態７９～８１のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ８３．前記異所性分化因子が、核酸、ポリペプチド、低分子、増殖因子、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態７９～８２のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ８４．（ｂ）が、細胞の細胞周期を停止することによって前記前駆細胞を分化するステップを含む、実施形態７９～８３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ８５．前記異所性分化因子が、増殖因子を前記細胞から低減または除去することを通して、細胞の細胞周期を停止する、実施形態７９～８４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ８６．前記増殖因子が、ＬＩＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、アクチビン、ＭＡＰＫ、ＴＧＦ－β、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態７９～８５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ８７．前記細胞の細胞周期を停止することが、細胞を培養するステップが実施される溶液中の血清レベルを低減または除去することによって起こる、実施形態７９～８６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ８８．細胞を使用して食用肉製品を生成するための方法であって、（ａ）メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を含む２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を前記細胞に送達するステップ、（ｂ）前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子の送達後に、前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子またはその発現産物の援助により前記細胞の遺伝子発現をモジュレートして、１種または複数の標的細胞を生成するステップであって、前記モジュレートするステップが、前記核酸分子が、前記細胞のゲノムに組み込まれないような一過性の様式である、ステップ、（ｃ）（ｂ）において生成された前記１種または複数の標的細胞を少なくとも部分的に使用して、前記食用肉製品を製造するステップを含む、方法。

実施形態Ｐ８９．前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスによって生成される、実施形態８８に記載の方法。

実施形態Ｐ９０．前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子が、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む、実施形態８８または８９に記載の方法。

実施形態Ｐ９１．前記ｍＲＮＡが、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む、実施形態９０に記載の方法。

実施形態Ｐ９２．前記ｓｉＲＮＡが、ＰＯＵＦ５１（ＯＣＴ３／４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを標的にする、実施形態９０または９１に記載の方法。

実施形態Ｐ９３．前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子が、ｃＤＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む、実施形態８８～９２のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ９４．前記ｃＤＮＡが、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む、実施形態９３に記載の方法。

実施形態Ｐ９５．（ｂ）が、前記遺伝子発現を増強する、低減する、または阻害するステップを含む、実施形態８８～９４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ９６．前記遺伝子発現が、前記細胞中の１種または複数の遺伝子の発現を含む、実施形態８８～９５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態Ｐ９７．（ｂ）が、前記１種または複数の遺伝子のうちの第１の遺伝子の発現を増強するステップ、および前記１種または複数の遺伝子のうちの第２の遺伝子の発現を阻害するステップを含む、実施形態９６に記載の方法。

実施形態Ｐ９８．前記送達するステップが、単一用量の前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を含む、実施形態９７に記載の方法。

実施形態Ｐ９９．前記送達するステップが、少なくとも２用量の前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を含む、実施形態９７に記載の方法。

実施形態Ｐ１００．前記少なくとも２用量の個々の用量が、異なる核酸分子を含む、実施形態９９に記載の方法。

実施形態Ｐ１０１．前記少なくとも２用量が、異なる濃度の前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を含む、実施形態９９または１００に記載の方法。

実施形態Ｐ１０２．（ａ）複数の細胞を足場と接触させるステップ、（ｂ）前記複数の細胞の少なくともサブセットを、前記足場の存在下、増殖因子または核酸分子の使用により、分化または分化転換プロセスに付して、それによって組織を生成するステップ、および（ｃ）前記組織を使用して、前記食用肉製品を製造するステップを含むプロセスによって調製された食用肉製品。

実施形態Ｐ１０３．前記組織が、少なくとも２種類の細胞を含む、実施形態１０２に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１０４．前記少なくとも２種類の細胞が、筋細胞および脂肪細胞を含む、実施形態１０３に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１０５．前記組織が、筋細胞および脂肪細胞を含み、前記筋細胞の前記脂肪細胞に対する比が、９９：１～８０：２０である、実施形態１０４に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１０６．前記食用肉製品が、前記足場の少なくとも２質量％を含む、実施形態１０２～１０５のいずれか一項に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１０７．前記食用肉製品が、５質量％未満の筋肉細胞外基質を含む、実施形態１０２～１０６のいずれか一項に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１０８．前記複数の細胞が、幹細胞または成熟細胞を含む、実施形態１０２～１０７のいずれか一項に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１０９．前記プロセスが、前記複数の細胞の少なくともサブセットを培養するステップをさらに含む、実施形態１０２～１０８のいずれか一項に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１１０．前記プロセスが、前記複数の細胞の少なくともサブセットを１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付すステップをさらに含む、実施形態１０２～１０９のいずれか一項に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１１１．前記足場が、拡張３次元構造を含む、実施形態１０２～１１０のいずれか一項に記載の食用肉製品。

実施形態Ｐ１１２．（ｂ）が、分化または分化転換した細胞を前記細胞から生成するステップ、および必要に応じて、前記足場内の前記分化または分化転換した細胞の融合を含む、実施形態１０２～１１１のいずれか一項に記載の食用肉製品。

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載しているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には自明であろう。本発明が、明細書内に提供される具体的な例によって限定されることは意図されない。本発明を前述の明細書を参照して記載したが、本明細書の実施形態の記載および説明は、限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。多くの変形形態、変更および置換は、ここに、本発明から逸脱することなく、当業者に思い当たるであろう。さらにまた、本発明のすべての態様が、各種の条件および変数に依存する本明細書に示される具体的な表現、構成または相対的割合に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に記載される本発明の実施形態に対するさまざまな代替が本発明の実施において用いられ得ることが理解されるべきである。したがって、本発明が、任意のそのような代替、改変、変形形態または等価物も包含するべきであることが企図される。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造とそれらの等価物とがそれらによって包含されることが意図される。

Claims (50)

1. 細胞を分化または分化転換して、食用肉製品を製造するための方法であって、
   （ａ）１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む核酸分子を前記細胞に送達するステップ、
   （ｂ）前記核酸分子の送達後に、前記核酸分子またはその発現産物の援助により前記細胞の遺伝子発現をモジュレートして、前記細胞の少なくともサブセットを分化または分化転換して、１種または複数の標的細胞を生成するステップであって、前記モジュレートする際に、前記核酸分子が、前記細胞のゲノムに組み込まれない、ステップ、および
   （ｃ）（ｂ）において生成された前記１種または複数の標的細胞を少なくとも部分的に使用して、前記食用肉製品を製造するステップ
   を含む、方法。
2. 前記核酸分子が、２種またはそれよりも多くの異なるＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞が、ブタ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
4. （ｃ）が、前記１種または複数の標的細胞から組織を製造するステップを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記１種または複数の標的細胞が、少なくとも２種の異なる種類の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記少なくとも２種類の標的細胞を共培養して、三次元組織を生成するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＲＮＡ分子が、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、もしくはＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記ＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、化学的に改変されて、その安定性が改善されている、請求項１に記載の方法。
9. 前記核酸分子が、中性もしくはアニオン性リポソーム、カチオン性リポソーム、脂質ナノ粒子、イオン化可能脂質、またはそれらの任意の組合せもしくは変形形態を用いて、前記細胞に送達される、請求項１に記載の方法。
10. 前記核酸分子が、単一用量で、前記細胞に送達される、請求項１に記載の方法。
11. 前記核酸分子が、少なくとも２用量で、前記細胞に送達される、請求項１に記載の方法。
12. 前記少なくとも２用量の個々の用量が、少なくとも３日離れて送達される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記核酸分子が、最高で５００ｎＭの濃度で送達される、請求項１に記載の方法。
14. 前記核酸分子が、ＰＯＵＦ５１（ＯＣＴ３／４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
15. 食用肉製品を細胞から生成する方法であって、
    （ａ）前記細胞を足場と接触させるステップ、
    （ｂ）前記細胞の少なくともサブセットを、前記足場の存在下、増殖因子または核酸分子の使用により、分化または分化転換プロセスに付して、それによって組織を生成するステップ、および
    （ｃ）前記組織を使用して、前記食用肉製品を製造するステップ
    を含む、方法。
16. 前記足場が、分解可能であり、前記食用肉製品が、必要に応じて、前記足場の少なくとも一部分を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記足場が、（ｂ）の間に、１日あたり少なくとも１％の速度で分解する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記細胞を培養するステップ、および前記細胞を、１つまたは複数の拡大増殖プロセスに付して、前記細胞を拡大増殖するステップのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
19. 前記足場が、バイオリアクターチャンバーにおける前記１つまたは複数の拡大増殖プロセスの間に、細胞の拡大増殖を容易にするように構成される、請求項１６に記載の方法。
20. （ｂ）が、分化または分化転換した細胞を前記細胞から生成するステップ、および必要に応じて、前記足場内の前記分化または分化転換した細胞の融合を含む、請求項１５に記載の方法。
21. 前記細胞の前記少なくとも前記サブセットの細胞を前記足場から放出させるステップ、および前記放出された細胞を別個の足場の表面上に堆積させるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
22. 前記分化または分化転換した細胞の融合の少なくとも５０％が、前記放出させるステップの前に起こる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記培養するステップ、および前記拡大増殖プロセスのうちの少なくとも１つが、前記足場の存在下で実施される、請求項１８に記載の方法。
24. 前記培養するステップおよび前記１つまたは複数の拡大増殖プロセスが、同じバイオリアクターチャンバーにおいて行われる、請求項１８に記載の方法。
25. 前記培養するステップが、バイオリアクターチャンバーにおいて行われ、前記１つまたは複数の拡大増殖プロセスが、追加のバイオリアクターチャンバーにおいて行われる、請求項１８に記載の方法。
26. 培養された細胞の少なくともサブセットを前記バイオリアクターチャンバーから前記複数の追加のバイオリアクターチャンバーに向かわせて、複数の拡大増殖プロセスを行うステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記複数の拡大増殖プロセスの拡大増殖プロセスが、順次に、同時に、またはそれらの組合せで行われる、請求項２６に記載の方法。
28. 培地を前記バイオリアクターチャンバーおよび前記複数の追加のバイオリアクターチャンバーの追加のバイオリアクターチャンバーを通して向かわせて、前記培養するステップまたは前記１つもしくは複数の拡大増殖プロセスを容易にするステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
29. 前記追加のバイオリアクターチャンバー外に向かった前記培地を濾過して、望ましくない構成要素を前記培地から除去し、それによって濾過された培地を生成するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記濾過された培地を前記バイオリアクターチャンバーにリサイクルするステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記細胞が、動物由来幹細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
32. 前記細胞が、ブタ細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 前記食用肉製品が、少なくとも５０グラムの単位形態である、請求項１５に記載の方法。
34. 前記食用肉製品が、ロインを含むｉｎ ｖｉｖｏ由来ステーキのテクスチャと同等のテクスチャを有する固体状態である、請求項１５に記載の方法。
35. 前記食用肉製品が、さらに加工された食品製品に組み込まれる、請求項１５に記載の方法。
36. 食用肉製品を細胞から生成するための方法であって、
    （ａ）２種またはそれよりも多くの異所性分化因子を使用して一過的な非組み込みの様式で前記細胞における１種または複数の遺伝子の発現をモジュレートして、前駆細胞を生成するステップ、
    （ｂ）前記前駆細胞の少なくともサブセットを分化して、最終分化した細胞を生成するステップ、および
    （ｃ）前記最終分化した細胞に少なくとも部分的に基づいて、前記食用肉製品を製造するステップ
    を含む方法。
37. 前記細胞、前記前駆細胞、および前記最終分化した細胞のうちの１種または複数を、培養するステップおよび／または拡大増殖プロセスに付すステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
38. 前記培養するステップおよび前記拡大増殖プロセスが、同じまたは異なるバイオリアクターチャンバーにおいて行われる、請求項３７に記載の方法。
39. 前記最終分化した細胞が、筋肉細胞、脂肪細胞、体節細胞、神経細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項３６に記載の方法。
40. （ｂ）が、細胞の細胞周期を停止することによって前記前駆細胞を分化するステップを含む、請求項３６に記載の方法。
41. 前記異所性分化因子が、増殖因子を前記細胞から低減または除去することを通して、細胞の細胞周期を停止する、請求項３６に記載の方法。
42. 前記増殖因子が、ＬＩＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、アクチビン、ＭＡＰＫ、ＴＧＦ－β、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項３６に記載の方法。
43. 細胞を使用して食用肉製品を生成するための方法であって、
    （ａ）メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を含む２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を前記細胞に送達するステップ、
    （ｂ）前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子の送達後に、前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子またはその発現産物の援助により前記細胞の遺伝子発現をモジュレートして、１種または複数の標的細胞を生成するステップであって、前記モジュレートするステップが、前記核酸分子が、前記細胞のゲノムに組み込まれないような一過性の様式である、ステップ、
    （ｃ）（ｂ）において生成された前記１種または複数の標的細胞を少なくとも部分的に使用して、前記食用肉製品を製造するステップ
    を含む、方法。
44. 前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子が、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記ｍＲＮＡが、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＭＹＦ５、ＭＹＦ６、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを含む、請求項４４に記載の方法。
46. 前記ｓｉＲＮＡが、ＰＯＵＦ５１（ＯＣＴ３／４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、またはそれらの任意の組合せもしくはバリアントを標的にする、請求項４４に記載の方法。
47. 前記送達するステップが、単一用量の前記２種またはそれよりも多くの異なる種類の核酸分子を含む、請求項４４に記載の方法。
48. （ａ）複数の細胞を足場と接触させるステップ、
    （ｂ）前記複数の細胞の少なくともサブセットを、前記足場の存在下、増殖因子または核酸分子の使用により、分化または分化転換プロセスに付して、それによって組織を生成するステップ、および
    （ｃ）前記組織を使用して、前記食用肉製品を製造するステップ
    を含むプロセスによって調製された食用肉製品。
49. 前記組織が、筋細胞および脂肪細胞を含み、前記筋細胞の前記脂肪細胞に対する比が、９９：１～８０：２０である、請求項４８に記載の食用肉製品。
50. 前記食用肉製品が、前記足場の少なくとも２質量％を含む、請求項４８～４９のいずれか一項に記載の食用肉製品。

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