JP2023529274A

JP2023529274A - 全血対照試料系ならびに前記を調製および使用する方法

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Publication number: JP2023529274A
Application number: JP2022565581A
Authority: JP
Inventors: ジャン，シューアン; チェン，リーロン; ワン，ヨンチェン; オスマニ，ダーダン; ザッペ，ステファン; バード，ランディ; バクル，サシャ・エイチ
Original assignee: ペロスフィア・テクノロジーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2023-07-10
Also published as: CA3180974A1; US20230204606A1; CN115605759A; EP4139689A1; WO2021216851A1; AU2021260947A1; MX2022013141A

Abstract

凝固アッセイにおいてヒト全血をシミュレートするために、凝固修飾因子を用いる代替全血対照を提供する系の調製および使用が開示される。

Description

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０１４，８５２号の利益を主張する。

[0002]本発明は、凝固アッセイにおいてヒト全血をシミュレートするための、代替全血対照を提供する系の調製および使用を対象とする。

[0003]米国において、抗凝固を必要とする患者の数は、年間数百万人に達し、血栓塞栓性イベントまたは肺塞栓を有する６００，０００人を超える患者（ＣＤＣＦａｓｔＳｔａｔｓ２０１２）および１００万件を上回る関節置換術（膝および臀部）（ＣＤＣＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ２０１０）が、予防的な術後抗凝固を必要とし、また、心房細動を有する２６６万人の患者の大部分が、予防的に抗凝固剤処置される（ＣＤＣＡｔｒｉａｌＦｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎＦａｃｔＳｈｅｅｔ）。

[0004]抗凝固は、医師と患者の両方にとって時間がかかり厄介である。伝統的な抗凝固剤（ヘパリンおよびワルファリン）は、かなりの出血リスクが認められているのと同時に、長年にわたり臨床使用での成功歴がある。（ＰａｌａｒｅｔｉＧ２０１１、ＦＤＡＳａｆｅｔｙＡｌｅｒｔ２０１２）伝統的な抗凝固剤に関連する大量出血の発生率により、新しい治療的抗凝固剤に対する需要は、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）生成物、ならびに凝固因子ＩＩａおよびＸａの選択的経口阻害剤の導入によって満たされてきた。非ビタミンＫ経口抗凝固剤（ＮＯＡＣ）は、迅速な治療効果、投薬のしやすさおよび監視が不要であることを含むいくつかの利点を有するが、各々、大量出血のリスクを伴う（ＩＳＭＰ２０１２）。

[0005]これに対して、その開示が、その全体において参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９１０，０５３号および第１０，５３４，００６号に記載されるようなポイントオブケア（ＰＯＣ）凝固計が開発された。例えば、ＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．（Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）は、凝固時間の測定のための、シリコンおよびガラス製の使い捨てマイクロ流体キュベットを使用する携帯用電池式装置である、ＰＯＣ凝固計を開発した。凝固は、血液試料とキュベット内側のガラス面との接触によって開始される。凝固計は、試験ストリップへの血液試料の添加と凝固カスケードの最終ステップであるフィブリン会合との間に経過した時間を求めるために、連続近赤外（ＩＲ）（１，３００ｎｍ）分光法を利用する。試験ストリップへの血液の添加は、血液による光の吸収によってＩＲ透過の減少を生じさせ、凝固時間の自動測定を開始する。最初に、ＩＲ透過信号は、赤血球が定着および凝集するにつれて経時的に立ち上がり、光路を遮断しにくくし、すなわちＩＲエミッタと検出器との間の不透明度を減少させることを可能にする。試験ストリップ内の活性化は、ガラス面への血液の曝露によって生じ、因子ＸＩＩから始まる固有経路を介して凝固を活性化する。凝固カスケードが因子ＩＩａによって媒介されるフィブリンへのフィブリノゲンの変換時点に進むと、フィブリンは会合し始める。会合したフィブリンネットワークは、ＩＲ光路を遮断し、すなわち不透明度が増加し、ＩＲ透過の減少が生じる。ＩＲ透過の経時的プロットにおいて、フィブリンが会合し、最大値またはピークとして登録する時点は、凝固時間として報告される。活性化が固有経路の最初に生じ、血餅の検出が共通経路の最後に生じるため、ＰＯＣ凝固計は、エドキサバン、リバロキサバン、アピキサバン、ダビガトラン、未分画ヘパリンおよび低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を含む広範な抗凝固剤に感受性を示した。

[0006]ポイントオブケア診断装置として、ＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｏＣ凝固計は、凝固時間の測定に採取したばかりのヒト全血を必要とする。しかし、新鮮なヒト全血は、不安定な性質であり、それによりアリコート、貯蔵および移送できない。したがって、米国特許第９，９１０，０５３号および第１０，５３４，００６号に記載されるものなどのＰＯＣ凝固計、特にＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．によって開発されたＰＯＣ凝固計の正確さの評価およびその性能の日常的な検証のために代替の全血対照を調製する必要がある。本発明の目的は、使用した際、新鮮なヒト全血の凝固特性を模倣し、異なる抗凝固剤で抗凝固剤処置されたヒト全血に類似した凝固時間を媒介することができ、また貯蔵および運搬に対して優れた安定性を有する、代替の全血対照試料系を調製することである。

[0007]全血対照試料を提供するための代替の全血対照系の調製およびその使用が、本明細書に記載される。典型的な代替の全血対照系は、３つの成分：動物の赤血球および血漿で調製される凍結乾燥物、希釈剤溶液および活性化溶液を含み、３つの成分が組み合わされると、全血対照試料を提供する。特に、本発明の全血対照試料系は、（ａ）（ｉ）１つまたは複数の哺乳動物種由来の固定赤血球、および（ｉｉ）１つまたは複数の哺乳動物種由来の血漿を含む、少なくとも１種の凍結乾燥物と、（ｂ）少なくとも１種の希釈剤と、（ｃ）少なくとも１種の活性化溶液とを含み、ここにおいて、凍結乾燥物、希釈剤または活性化溶液のうちの少なくとも１つが、凝固調節因子を含有する。本発明の有利な全血対照系は、２つの成分のみ、すなわち哺乳動物の赤血球および血漿で調製された凍結乾燥物、ならびに血液混合物を再水和し、凝固カスケードを再開するための活性化剤を含有する希釈剤溶液を含む典型的な全血対照系と異なる。有意には、本発明の全血対照系は、希釈剤および活性化剤を分離し、最も好ましくは凍結乾燥物および希釈剤が凝固活性化剤を実質的に含まない。これは、先行技術の系と比較して、凍結乾燥物を希釈剤でより完全に再水和させるので、より正確で一貫した全血対照系が提供される。

[0008]一態様において、単一の哺乳動物種からの赤血球は、脂肪族アルデヒドを含む架橋試薬で固定される。赤血球の固定化は、凍結乾燥および長期貯蔵中の赤血球の安定性を高める一助となる。固定された赤血球は、単一種からの哺乳動物の血漿、または凝固時間が異なる、異なる種からの血漿の混合物と混合される。次いで、赤血球／血漿混合物は、凍結乾燥物を得るために凍結乾燥される。一部の態様では、異なる種からの血漿混合物が用いられる場合、異なる血漿の混合比は、全血対照の異なる凝固時間を達成するために変更されてもよい。一部の態様では、哺乳動物のフィブリノゲンは、代替の全血対照の凝固時間を変更するために赤血球／血漿混合物に添加されてもよい。一部の態様では、トロンボプラスチン、セファリンまたはカオリンを含む活性化剤は、凝固の活性化を促進するために赤血球／血漿混合物に添加される。他の態様では、活性化溶液は、塩化カルシウム、ならびにウサギ脳セファリンおよび／またはベンズアミジンなどの例えばトリプシン阻害剤を含むセリンプロテアーゼ阻害剤のような凝固調節因子を含む。塩化カルシウムまたは凝固調節因子であるプロテアーゼ阻害剤の濃度を変更することによって、代替の全血対照の凝固時間は、抗凝固剤を受けていない（非治療の）患者から採取された全血試料から得られるものを表し、かつ異なるレベルの治療範囲で抗凝固剤を受ける患者で観察される凝固時間の範囲を表す、値の範囲を提供するように調整されてもよい。特定の態様では、本明細書に記載されるように調製された代替の全血対照は、全血ＰＴ、ＡＣＴまたはＰＴＴアッセイを含む他の全血凝固アッセイの対照として用いられてもよい。

[0009]本発明のさらに別の態様は、全血対照試料系を調製する方法であって、（ａ）（ｉ）１つまたは複数の哺乳動物種由来の固定赤血球、および（ｉｉ）１つまたは複数の種由来の血漿を含む、少なくとも１種の凍結乾燥物を提供するステップ、（ｂ）少なくとも１種の希釈剤を提供するステップ、（ｃ）少なくとも１種の活性化溶液を提供するステップ、ここにおいて、凍結乾燥物、希釈剤または活性化溶液のうちの少なくとも１つが、凝固調節因子を含有する、ならびに、（ｄ）凝固調節因子の濃度を調整して、凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液の測定されたアリコートを組み合わせると、定義された凝固時間を有する全血対照試料になる全血対照系を提供するステップ、を含む方法を対象とする。最も好ましくは、方法は、活性化溶液だけに凝固調節因子を提供するステップを含む。

[0010]さらに別の態様では、本発明は、凍結乾燥物のアリコート、希釈剤のアリコートおよび活性化溶液のアリコートの組合せによって生じる全血対照試料を対象とする。有利には、全血対照系は、最も好ましくは活性化溶液中の異なる濃度の凝固調節因子を備えていてもよく、したがって系で調製された各得られた全血対照試料は異なる凝固時間を有する。好ましくは、本発明の全血対照系を使用した場合、凍結乾燥物は最初に、凍結乾燥物の実質的に十分な再水和を可能にする時間にわたって希釈剤と混合された後、活性化溶液が添加される。

[0011]本発明は、例示目的のみである下記の図面を参照してより十分に理解されるであろう。

[0012]代替の全血対照の凝固時間が、凍結乾燥物中のベンズアミジンの濃度に対して線形応答を示すことを示すグラフである。 [0013]代替の全血対照の凝固時間が、活性化溶液中のベンズアミジンの濃度に対して線形応答を示すことを示すグラフである。

Ｉ．定義
[0014]本明細書で使用する「固定液」は、赤血球の表面の架橋タンパク質または他の分子によって赤血球を固定する化学物質を指す。

[0015]本明細書で使用する「活性化剤」は、代替の全血対照の凝固を加速できる試薬を指す。
[0016]本明細書で使用する「セリンプロテアーゼ阻害剤」は、セリンプロテアーゼの活性に拮抗するタンパク質および小分子のファミリーを指す。

[0017]本明細書で使用する「アリコート」は、全血対照系を提供するために組み合わされる凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液の測定量を指す。
[0018]本明細書で使用する「凝固調節因子」は、全血対照中の異なる濃度の調節因子によって凝固時間を調整するのに効果的である１種または複数のセリンプロテアーゼ阻害剤および／またはウサギ脳セファリンを指す。活性化溶液で必要とされる塩化カルシウムは、濃度を変更して凝固時間を調整できるが、塩化カルシウムは、本明細書で用いられる凝固調節因子とみなされず、すなわち本発明の全血対照系は、塩化カルシウムと凝固調節因子の両方を含まなければならない。
ＩＩ．調製
Ａ．固定赤血球
[0019]固定赤血球を調製するために、哺乳動物の赤血球は遠心分離によって採取され得、残留血漿タンパク質を除去するために生理食塩水で洗浄され得る。分離された赤血球は、凍結乾燥時の赤血球の溶解を防止するために固定液で固定される。グルタルアルデヒドは、好ましい固定液である。グルタルアルデヒドの固定時間および濃度は、赤血球の安定性を最適化するように変更されてもよい。固定後、固定化溶液は除去され、固定赤血球は、残留固定液を除去するために生理食塩水で数回洗浄される。固定赤血球は、典型的には４℃での貯蔵時に安定である。固定赤血球は簡単に購入できる。
Ｂ．固定赤血球の再懸濁のための血漿基剤
[0020]代替の全血対照の凝固に必要とされる凝固因子およびフィブリノゲンを提供するために、単一種からの哺乳動物の血漿が、固定赤血球を再懸濁するために用いられてもよい。哺乳動物の全血から新たに調製された血漿は、固定赤血球を再懸濁するために直ちに用いられる。代替的に、新たに調製された哺乳動物の血漿は、貯蔵および運搬のために調製直後に凍結されてもよい。凍結された血漿は、凝固因子の活性を保つために３７℃の水浴で使用前に解凍される。一部の態様では、血漿基剤は、異なる哺乳動物種からの血漿を異なる混合比で混合して、全血対照の凝固時間を調整することによって調製される。これは、異なる種からの血漿が、異なる凝固時間を有するためである。特定の態様では、セファリン、トロンボプラスチンまたはカオリンなどの活性化剤が血漿基剤に添加されてもよい。これらの活性化剤は、凝固の開始プロセスを加速し、それにより代替の全血対照の凝固時間を減少させる。他の態様では、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えばベンズアミジン）などの凝固調節因子が、異なる濃度で活性化溶液に添加される。ベンズアミジンは、因子ＸａおよびＩＩａなどの凝固因子の活性を阻害し、それにより代替の全血対照の凝固時間を延長する。有意には、ベンズアミジンの濃度を変更することによって、得られた代替の全血対照の凝固時間は、異なる抗凝固剤を異なる用量で受ける患者で観察される凝固時間の範囲を表すように調整できることが分かっている。所望される場合、凝固調節因子は、凍結乾燥物またはさらには希釈剤に含まれていてもよい。しかし、最も好ましくは、凝固調節因子は、活性化溶液に含まれる。

[0021]上記で考察される全血および血漿は、カルシウムをキレート化して凝固カスケードを破壊し、凝固を防止して貯蔵および処理を可能にする、クエン酸ナトリウムもしくは酸－クエン酸－デキストロースの形態のクエン酸、またはＥＤＴＡなどの抗凝固剤を含む容器に回収されることが理解されるべきである。
Ｃ．活性化溶液
[0022]活性化溶液は、血漿基剤中のクエン酸ナトリウムを中和し、代替の全血対照の凝固の活性化をもたらす塩化カルシウムを含む。一態様では、塩化カルシウムの濃度は、代替の全血対照の凝固時間を調整するために変更される。特定の態様では、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えばベンズアミジン）は、異なる濃度で活性化溶液に添加される。セリンプロテアーゼ阻害剤の濃度を変更することによって、代替の全血対照の凝固時間は、異なる抗凝固剤を異なる用量で受ける患者で観察される凝固時間の範囲を表すように調整できる。

[0023]本発明の全血対照系を調製する場合、一般に、凍結乾燥物中での固定赤血球と血漿との比は、重量で約０．２：０．８～約０．５：０．５、好ましくは約０．２５：０．７５～約０．４５：０．５５、最も好ましくは約０．３：０．７～約０．４：０．６の範囲である。希釈剤は、一般に水、好ましくは注射用水（ＷＦＩ）である。活性化溶液は、塩化カルシウムを一般に約１４ｍＭ～約４０ｍＭ、好ましくは約１８ｍＭ～約３６ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭの量の濃度で含有する。凝固調節因子がベンズアミジンなどのセリンプロテアーゼ阻害剤であり、凍結乾燥物、希釈剤または活性化溶液、より好ましくは凍結乾燥物または活性化溶液、最も好ましくは活性化溶液中に存在し得る場合、ベンズアミジンなどのセリンプロテアーゼ阻害剤は、一般に約０．１１ｍＭ～約１１ｍＭ、好ましくは約０．２２ｍＭ～約８．８ｍＭ、より好ましくは約０．３３ｍＭ～約６．６ｍＭの範囲で存在する。凝固調節因子がウサギ脳セファリンであり、凍結乾燥物、希釈剤または活性化溶液、より好ましくは凍結乾燥物または活性化溶液、最も好ましくは凍結乾燥物中に存在し得る場合、ウサギ脳セファリンは、一般に約０．０４８ｍｇ／ｍＬ～約０．９６ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０９６ｍｇ／ｍＬ～０．４８ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ～０．３６ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。

[0024]一態様では、全血対照試料系は、凍結乾燥物のアリコート、希釈剤のアリコートおよび活性化溶液のアリコートを含み、凝固計への導入前に一緒に混合される。好ましくは、凍結乾燥物は、最初に希釈剤に添加され、次いで凍結乾燥物が希釈剤によって実質的に再水和された後、活性化溶液が混合物に添加される。典型的には、凍結乾燥物と希釈剤と活性化溶液との比は、体積で約１：０．２：０．８～約１：０．８：０．２、好ましくは約１：０．３：０．７～約１：０．７：０．３、最も好ましくは１：０．４：０．６～約１：０．６：０．４の範囲である。全血対照試料系の凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液の各アリコートが、別個の容器で供給されてもよいことが理解されるべきであり、使用時に混合されて全血対照系を提供することを意味する。また、３つの区画すべてを混合させる手段を有した３つの別個の区画を有する単一の容器を提供することも可能である。本発明の一態様では、全血対照試料系は、凍結乾燥物の２つのアリコート、希釈剤の２つのアリコートおよび活性化溶液の２つのアリコートを含有し、凍結乾燥物中、希釈剤中または活性化溶液中いずれかの凝固調節因子の濃度は異なり、したがって、凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液各々のアリコートを組み合わせると、ある組合せからの得られた全血対照系の得られた凝固時間は、他の組合せのものと異なる。別の態様では、全血対照試料系は、凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液の各アリコートの３または４または５つ以上を含んでもよく、各組合せは、異なる濃度の凝固調節因子を有する。好ましくは、凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液の複数のアリコートを有する全血対照系は、活性化溶液中に存在するが、凍結乾燥物および希釈剤中には存在しない凝固調節因子を有する。このような全血対照系は、好ましくは、凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液を混合するための指示書を含むキットとして提供される。凝固調節因子が活性化溶液中に存在する場合、最初に凍結乾燥物および希釈剤を混合し、続いて活性化溶液を導入することが好ましい。

[0025]典型的には、凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液各々の１つより多くのアリコートを有する各全血対照系中のベンズアミジンなどの凝固調節因子の量の差は、約０．５５ｍＭ～約４．４ｍＭ、好ましくは約１．１ｍＭ～約３．３ｍＭ、最も好ましくは約１．１ｍＭ～約２．２ｍＭである。

[0026]特に好ましい態様では、凝固調節因子の濃度が異なる複数の活性化溶液を有することは、各系が単一の凍結乾燥物および単一の希釈剤を利用することを可能にし、すなわち全血対照系中の凍結乾燥物の各アリコートは同一であり、全血対照系中の希釈剤の各アリコートは同一である。系中の複数の活性化溶液は、有利には得られた凝固時間の範囲を可能にする。さらに、活性化溶液中の凝固活性化剤が希釈剤から分離されると、凍結乾燥物への希釈剤の添加後、より多くの時間が確保され、凍結乾燥物のより完全で一貫した再水和がもたらされる。これは、希釈剤中の活性化剤とともに単一の希釈剤を有し、したがって、再構成後すぐに測定装置に導入されなければならない既存の凝固対照と比較して著しい利点を提供する。特に、全血対照系が３つの別個の成分、すなわち凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液として提供される上記の発明は、凍結乾燥物のより完全かつ一貫した再水和を達成する能力によって先行技術の系よりも精度および正確さが改善された全血対照系を提供する。

[0027]本発明のさらに別の態様では、本発明の全血対照試料系は、（ａ）（ｉ）１つまたは複数の哺乳動物種由来の固定赤血球、および（ｉｉ）１つまたは複数の哺乳動物種由来の血漿を含む、単一の凍結乾燥物と、（ｂ）単一の希釈剤と、（ｃ）少なくとも１種の活性化溶液とから本質的になり、凍結乾燥物および希釈剤は、凝固活性化剤を実質的に含まない。好ましくは、活性化溶液は、凝固調節因子をさらに含む。凍結乾燥物および希釈剤が凝固活性化剤を含まないことは、全血対照試料を調製する際、凍結乾燥物が希釈剤によってより一貫して完全に再水和された後、活性化溶液を添加することを可能にする。

実施例１
異なる哺乳動物種からの血漿を用いて異なる混合比で調製した血漿基剤を使用することによって、代替の全血対照の凝固時間を調整する
[0028]ヒツジ血漿およびウマ血漿を９：１、７：３、３：７および１：９の異なる混合比で混合することによって、血漿を調製した。７０％（ｗ／ｖ）血漿、１８％（ｗ／ｖ）ヒツジフィブリノゲン溶液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム－ＨＣｌ中４５．７２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）および１２％（ｗ／ｖ）生理食塩水を混合することによって、血漿基剤をさらに調製した。３５％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒド－固定ウマ赤血球および６５％（ｗ／ｖ）血漿基剤を含有する全血対照を、０．２Ｍ塩化カルシウムによって１７：１の体積比で再石灰化し、試料をＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｏＣ凝固計で直ちに試験した。表１に示すように、ウマ血漿の割合が高いほど、凝固時間が長くなった。

実施例２
凍結乾燥物中のベンズアミジンの濃度を変更することによって代替の全血対照の凝固時間を調整する
[0029]ヒツジ血漿およびウマ血漿を１：９の混合比で混合することによって、血漿を調製した。ヒツジフィブリノゲン溶液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム－ＨＣｌ中４５．７２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）を、生理食塩水によって４０ｍｇ／ｍＬに希釈した。７７％（ｗ／ｖ）血漿および２３％（ｗ／ｖ）ヒツジフィブリノゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）を混合することによって、血漿基剤をさらに調製した。３５％（ｗ／ｖ）２％グルタルアルデヒド－固定ウマ赤血球を６５％（ｗ／ｖ）血漿基剤に再懸濁し、０．１４４ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるようにウサギ脳セファリンを添加することによって、全血対照を調製した。異なる濃度のベンズアミジンを調製物に添加した。次いで、全血対照を、ガラスバイアル中で凍結乾燥した。凝固時間に対する凍結乾燥物中のベンズアミジンの影響を試験するために、凍結乾燥した代替の全血対照を、その元の体積の半分になるように希釈剤溶液中で再構成し、室温で６分間インキュベートし、ガラスバイアルを静かにさらに１分間回転させることによって混合した。次いで、２２ｍＭ塩化カルシウムを１：１の体積比で添加し、続いて６回急速に反転させることによって、対照を活性化した。試料を、ＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｏＣ凝固計で、活性化後直ちに試験した。表２に示すように、凝固時間は、ベンズアミジンの濃度の増加と共に増加し、用量応答曲線は線形となった（図１）。

[0030]図１に例示するように、代替の全血対照の凝固時間は、凍結乾燥物中のベンズアミジンの濃度に対して線形応答を示した。
実施例３
活性化溶液中の塩化カルシウムの濃度を変更することによって全血対照の凝固時間を調整する
[0031]ヒツジ血漿およびウマ血漿を１：９の混合比で混合することによって、血漿を調製した。ヒツジフィブリノゲン溶液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム－ＨＣｌ中４５．７２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）を、生理食塩水によって４０ｍｇ／ｍＬに希釈した。７７％（ｗ／ｖ）血漿および２３％（ｗ／ｖ）ヒツジフィブリノゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）を混合することによって、血漿基剤をさらに調製した。３５％（ｗ／ｖ）２％グルタルアルデヒド－固定ウマ赤血球を６５％（ｗ／ｖ）血漿基剤に再懸濁し、０．１４４ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるようにウサギ脳セファリンを添加することによって、全血対照を調製した。次いで、全血対照を、一旦凍結解凍し、ガラスバイアル中で凍結乾燥した。凝固時間に対する活性化溶液中の塩化カルシウムの濃度の影響を試験するために、凍結乾燥した代替の全血対照を、その元の体積の半分になるように希釈剤溶液中で再構成し、室温で６分間インキュベートし、ガラスバイアルを静かにさらに１分間回転させることによって混合した。次いで、異なる濃度の塩化カルシウム溶液を１：１の体積比で添加し、続いて６回急速に反転させることによって、対照を活性化した。試料を、ＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｏＣ凝固計で活性化後直ちに試験した。表３に示すように、凝固時間は、活性化溶液中の塩化カルシウムの濃度を変更することによって調整できる。

実施例４
活性化溶液中のベンズアミジンの濃度を変更することによって代替の全血対照の凝固時間を調整する
[0032]ヒツジ血漿およびウマ血漿を１：９の混合比で混合することによって、血漿を調製した。ヒツジフィブリノゲン溶液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム－ＨＣｌ中４５．７２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）を、生理食塩水によって４０ｍｇ／ｍＬに希釈した。７７％（ｗ／ｖ）血漿および２３％（ｗ／ｖ）ヒツジフィブリノゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）を混合することによって、血漿基剤をさらに調製した。３５％（ｗ／ｖ）３％グルタルアルデヒド－固定ウマ赤血球を６５％（ｗ／ｖ）血漿基剤に再懸濁し、０．１４４ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるようにウサギ脳セファリンを添加することによって、全血対照を調製した。次いで、全血対照を、一旦凍結解凍し、ガラスバイアル中で凍結乾燥した。凝固時間に対する活性化溶液中のベンズアミジンの濃度の影響を試験するために、凍結乾燥した代替の全血対照を、その元の体積の半分になるように希釈剤溶液中で構成し、室温で６分間インキュベートし、ガラスバイアルを静かにさらに１分間回転させることによって混合した。次いで、２２ｍＭＣａＣｌ_２および異なる濃度のベンズアミジンを含有する活性化溶液を１：１の体積比で添加し、続いて６回急速に反転させることによって、対照を活性化した。試料を、ＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｏＣ凝固計で、活性化後直ちに試験した。表４に示すように、凝固時間は、活性化溶液中のベンズアミジンの濃度に対して線形応答を示した。

[0033]図２は、代替の全血対照の凝固時間が、活性化溶液中のベンズアミジンの濃度に対して線形応答を示すことを例示する。
実施例５
ウサギ脳セファリンを添加することによって代替の全血対照の凝固時間を調整する
[0034]ヒツジ血漿およびウマ血漿を１：９の混合比で混合することによって、血漿を調製した。ヒツジフィブリノゲン溶液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム－ＨＣｌ中４５．７２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）を、生理食塩水によって４０ｍｇ／ｍＬに希釈した。７７％（ｗ／ｖ）血漿および２３％（ｗ／ｖ）ヒツジフィブリノゲン溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）を混合することによって、血漿基剤をさらに調製した。３５％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒド－固定ウマ赤血球および６５％（ｗ／ｖ）血漿基剤を含有し、０．１４４ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるようにウサギ脳セファリンを添加したまたは添加しなかった全血対照を、０．２Ｍ塩化カルシウムによって１７：１の体積比で再石灰化し、試料を、ＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｏＣ凝固計で直ちに試験した。表５に示すように、ウサギ脳セファリンの添加は、凝固時間を大幅に減少させた。

実施例６
全血液体対照の凝固時間の範囲を満たすように異なる濃度のベンズアミジンを含有する活性化剤溶液を調製する
[0035]下記の成分：１）生理食塩水中の０ｍＭベンズアミジン、２２ｍＭＣａＣｌ_２；２）生理食塩水中の２．５ｍＭベンズアミジン、２２ｍＭＣａＣｌ_２；３）生理食塩水中の５ｍＭベンズアミジン、２２ｍＭＣａＣｌ_２；４）生理食塩水中の１０ｍＭベンズアミジン、２２ｍＭＣａＣｌ_２を有する４つの活性化剤溶液を調製した。

[0036]ＤＩ水を、希釈剤溶液として使用した。０．５ｍＬの希釈剤を各対照に添加し、対照を室温で６分間インキュベートすることによって、凍結乾燥した全血対照を再構成した。各バイアルを１分間回転させて再構成を確実にし、次いで、各々０．５ｍｌの上記の活性化剤溶液を、再構成した全血対照の別個のバイアルに個々に添加した。バイアルを閉じ、振とうした後、各試料を３つのＰｅｒｏｓｐｈｅｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＰｏＣ凝固計に充填した。上述の４つの活性化剤各々の凝固時間の平均値を求め、平均凝固時間を、各活性化剤中のベンズアミジンの濃度に対してプロットした。得られたプロットで定義された方程式を使用して、以下に記載する４つの凝固時間の範囲に対するベンズアミジン濃度を計算した。

[0037]使用した凝固時間の範囲は、下記の通りであった：レベル１の１５０～２５０秒の凝固時間の範囲；レベル２の２２０～３２０秒の凝固時間の範囲；レベル３の２９０～３９０秒の凝固時間の範囲；およびレベル４の３７０～４７０秒の凝固時間の範囲。次いで、各個々の溶液が各所望のレベルの凝固時間を提供するように、上記で計算された方程式に基づくベンズアミジンの適当量を秤量することによって、４つの活性化剤溶液を調製した。計算量のベンズアミジンを有し、また２２ｍＭＣａＣｌ_２を含有する１リットルの各活性化剤溶液（レベル１、２、３および４）を調製した。
参考文献

Claims

全血対照試料系であって、
ａ．ｉ．１つまたは複数の哺乳動物種由来の固定赤血球、および
ｉｉ．１つまたは複数の哺乳動物種由来の血漿
を含む、少なくとも１種の凍結乾燥物と、
ｂ．少なくとも１種の希釈剤と、
ｃ．少なくとも１種の活性化溶液と
を含み、凍結乾燥物、希釈剤または活性化溶液のうちの少なくとも１つが、凝固調節因子を含有する、全血対照試料系。
凝固調節因子が、セリンプロテアーゼ阻害剤および／またはウサギ脳セファリンである、請求項１に記載の全血対照試料系。
凝固調節因子がセリンプロテアーゼ阻害剤である、請求項２に記載の全血対照試料系。
セリンプロテアーゼ阻害剤がベンズアミジンである、請求項３に記載の全血対照試料系。
凝固調節因子が、少なくとも１種の活性化溶液中に存在し、少なくとも１種の希釈剤および少なくとも１種の凍結乾燥物中には存在しない、請求項１から４のいずれか一項に記載の全血対照試料系。
系が、２種以上の活性化溶液を含み、各活性化溶液が、異なる濃度の凝固調節因子、単一の凍結乾燥物および単一の希釈剤を含有する、請求項５に記載の全血対照試料系。
系が、活性化溶液の２つ以上のアリコート、凍結乾燥物の２つ以上のアリコートおよび希釈剤の２つ以上のアリコートを有するキットとして提供される、請求項６に記載の全血対照試料系。
系が２種の活性化溶液を含み、各活性化溶液が、異なる濃度の凝固調節因子を有する、請求項６に記載の全血対照試料系。
系が、活性化溶液の２つのアリコート、凍結乾燥物の２つのアリコートおよび希釈剤の２つのアリコートを有するキットとして提供される、請求項８に記載の全血対照試料系。
凝固調節因子が、少なくとも１種の凍結乾燥物中に存在し、少なくとも１種の希釈剤および少なくとも１種の活性化溶液中には存在しない、請求項１から４のいずれか一項に記載の全血対照試料系。
系が、２種以上の凍結乾燥物を含み、各凍結乾燥物が、異なる濃度の凝固調節因子、単一の希釈剤および単一の活性化溶液を含有する、請求項１０に記載の全血対照試料系。
系が、活性化溶液の２つ以上のアリコート、凍結乾燥物の２つ以上のアリコートおよび希釈剤の２つ以上のアリコートを有するキットとして提供される、請求項１１に記載の全血対照試料系。
系が２種の凍結乾燥物を含み、各凍結乾燥物が、異なる濃度の凝固調節因子を有する、請求項１１に記載の全血対照試料系。
系が、活性化溶液の２つのアリコート、凍結乾燥物の２つのアリコートおよび希釈剤の２つのアリコートを有するキットとして提供される、請求項１３に記載の全血対照試料系。
活性化溶液が塩化カルシウムを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の全血対照試料系。
少なくとも１種の凍結乾燥物または少なくとも１種の活性化溶液のいずれかが、全血対照試料系の凝固時間をさらに調節するために有効量のウサギ脳セファリンを含む、請求項３または４に記載の全血対照試料系。
全血対照試料系を調製する方法であって、
ａ．ｉ．１つまたは複数の哺乳動物種由来の固定赤血球、および
ｉｉ．１つまたは複数の種由来の血漿
を含む、少なくとも１種の凍結乾燥物を提供するステップ、
ｂ．少なくとも１種の希釈剤を提供するステップ、
ｃ．少なくとも１種の活性化溶液を提供するステップ、
ここにおいて、凍結乾燥物、希釈剤または活性化溶液のうちの少なくとも１つが、凝固調節因子を含有する、
ならびに、
ｄ．凝固調節因子の濃度を調整して、定義された凝固時間を有する全血対照試料を提供するステップ、
を含む、方法。
凝固調節因子が、セリンプロテアーゼ阻害剤および／またはウサギ脳セファリンである、請求項１７に記載の方法。
凝固調節因子がセリンプロテアーゼ阻害剤である、請求項１８に記載の方法。
セリンプロテアーゼ阻害剤がベンズアミジンである、請求項１９に記載の方法。
凝固調節因子が、少なくとも１種の活性化溶液中に存在する、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも２つの同一の凍結乾燥物のアリコートが提供され、少なくとも２種の活性化溶液が提供され、各活性化溶液が、凍結乾燥物、希釈剤および活性化溶液のアリコートを組み合わせた場合に異なる凝固時間を提供するように異なる量の凝固調節因子を含有する、請求項２１に記載の方法。
系が、２つの同一の凍結乾燥物のアリコート、２つの同一の希釈剤のアリコートおよび活性化溶液の２つのアリコートを含有し、活性化溶液の２つのアリコート各々が、異なる濃度の凝固調節因子を有する、請求項２２に記載の方法。
凝固調節因子が、少なくとも１種の凍結乾燥物中に存在する、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも２つの同一の活性化溶液のアリコートが提供され、少なくとも２つの凍結乾燥物のアリコートが提供され、凍結乾燥物の各アリコートが、凍結乾燥物、希釈剤および活性化剤溶液のアリコートを組み合わせた場合に異なる凝固時間を提供するように異なる量の凝固調節因子を含有する、請求項２４に記載の方法。
系が、活性化剤溶液の２つの同一のアリコート、２つの同一の希釈剤のアリコートおよび２つの凍結乾燥物のアリコートを含有し、２つの凍結乾燥物のアリコート各々が、異なる濃度の凝固調節因子を含有する、請求項２５に記載の方法。
少なくとも１種の凍結乾燥物のアリコート、少なくとも１種の希釈剤のアリコートおよび少なくとも１種の活性化剤溶液のアリコートを混合して、全血対照試料を提供するステップをさらに含む、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。