JP2023528777A - ドナー由来無細胞ｄｎａの検出方法 - Google Patents
ドナー由来無細胞ｄｎａの検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023528777A JP2023528777A JP2022572339A JP2022572339A JP2023528777A JP 2023528777 A JP2023528777 A JP 2023528777A JP 2022572339 A JP2022572339 A JP 2022572339A JP 2022572339 A JP2022572339 A JP 2022572339A JP 2023528777 A JP2023528777 A JP 2023528777A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- free dna
- cell
- donor
- cfdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 202
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims abstract description 147
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 77
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 61
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 61
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 53
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 49
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 157
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 98
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims description 58
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 56
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 55
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 55
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 52
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 37
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 23
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 21
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 18
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 18
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 18
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 17
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 15
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 6
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims 1
- 206010023439 Kidney transplant rejection Diseases 0.000 claims 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 claims 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 36
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 26
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 24
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 24
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 23
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 23
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 17
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 16
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 238000012959 renal replacement therapy Methods 0.000 description 10
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 9
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 9
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 6
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 4
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 208000034841 Thrombotic Microangiopathies Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N mycophenolate mofetil Chemical compound COC1=C(C)C=2COC(=O)C=2C(O)=C1C\C=C(/C)CCC(=O)OCCN1CCOCC1 RTGDFNSFWBGLEC-SYZQJQIISA-N 0.000 description 3
- 229960004866 mycophenolate mofetil Drugs 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 3
- 208000027580 BK-virus nephropathy Diseases 0.000 description 2
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 2
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 2
- 208000021709 Delayed Graft Function Diseases 0.000 description 2
- 241000829111 Human polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 206010065381 Polyomavirus-associated nephropathy Diseases 0.000 description 2
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 2
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229940083410 myfortic Drugs 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 2
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 2
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000003918 Acute Kidney Tubular Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010068406 Capillaritis Diseases 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102220481335 G-protein coupled receptor family C group 5 member D_A18D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 1
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 241000691979 Halcyon Species 0.000 description 1
- 101000779641 Homo sapiens ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000032984 Intraoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 206010030216 Oesophagitis Diseases 0.000 description 1
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010038540 Renal tubular necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 1
- 206010048302 Tubulointerstitial nephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011366 aggressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003409 anti-rejection Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005347 belatacept Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006881 esophagitis Diseases 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011862 kidney biopsy Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000007854 ligation-mediated PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000005399 mechanical ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229940014456 mycophenolate Drugs 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000002640 oxygen therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- RWWYLEGWBNMMLJ-MEUHYHILSA-N remdesivir Drugs C([C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@](C#N)(O1)C=1N2N=CN=C(N)C2=CC=1)O)OP(=O)(N[C@@H](C)C(=O)OCC(CC)CC)OC1=CC=CC=C1 RWWYLEGWBNMMLJ-MEUHYHILSA-N 0.000 description 1
- RWWYLEGWBNMMLJ-YSOARWBDSA-N remdesivir Chemical compound NC1=NC=NN2C1=CC=C2[C@]1([C@@H]([C@@H]([C@H](O1)CO[P@](=O)(OC1=CC=CC=C1)N[C@H](C(=O)OCC(CC)CC)C)O)O)C#N RWWYLEGWBNMMLJ-YSOARWBDSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 102200006532 rs112445441 Human genes 0.000 description 1
- 102200006531 rs121913529 Human genes 0.000 description 1
- 102200006539 rs121913529 Human genes 0.000 description 1
- 102200006538 rs121913530 Human genes 0.000 description 1
- 102220014328 rs121913535 Human genes 0.000 description 1
- 102200007373 rs17851045 Human genes 0.000 description 1
- 102200007376 rs770248150 Human genes 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011301 standard therapy Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本開示は、生体サンプル中の全無細胞ＤＮＡの量を定量する方法であって、生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む、方法を提供する。【選択図】図１
Description
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）技術を用いた非侵襲的モニタリングは、出生前（胎児）、腫瘍学（腫瘍）、及び移植（ドナー）用途における非自己遺伝子型を検出するための有効な方法である。更に、ドナー由来ｃｆＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）は、活性型拒絶反応を特定するための移植（例えば、腎臓及び心臓移植などの臓器移植）における実証されたバイオマーカーである。既存の商業的アッセイは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの結果を、全ｃｆＤＮＡの割合として報告する。しかしながら、このようにして報告された結果は、多くの要因に影響され得るバックグラウンドｃｆＤＮＡレベルに起因する拒絶リスクの最も正確な描写を提供しない場合がある。いくつかの場合では、変則的に高いレベルのレシピエントｃｆＤＮＡは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの割合の低下、及び潜在的な偽陰性解釈につながる可能性がある。更に、より低い頻度で、平均より低いｃｆＤＮＡレベルは偽陽性結果をもたらす可能性がある。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年５月２６日に作成され、Ｎ＿０３３＿ＷＯ＿０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、１，３３２バイトのサイズである。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年５月２６日に作成され、Ｎ＿０３３＿ＷＯ＿０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、１，３３２バイトのサイズである。
一態様において、本発明は、生体サンプル中の全無細胞ＤＮＡの量を定量する方法であって、ａ）生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む方法に関する。
別の態様において、本発明は、移植レシピエントの生体サンプルにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量する方法であって、ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される方法に関する。
更なる態様では、本発明は、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定する方法であって、ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することであって、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される、定量することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を閾値と比較することによって、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を使用して移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定することであって、閾値は、全無細胞ＤＮＡの量に従って決定される、決定することと、を含む、方法に関する。
いくつかの実施形態において、閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの配列決定リード数の関数である。
いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の範囲外である場合、サンプルにフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値を上回る場合に、サンプルにフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値未満である場合に、サンプルにフラグを立てることを更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の前に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を全血サンプルに添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の後及び無細胞ＤＮＡの単離の前に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を血漿サンプルに添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡにアダプターを連結して、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物を得ることと、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅の前に、第２のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅の後に、第２のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを更に含む。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる配列を有する複数のＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる濃度を有する複数のＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる長さを有する複数のＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、異なる長さを有する複数のＤＮＡ分子を使用して、サンプル中の無細胞ＤＮＡのサイズ分布を決定する。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、非ヒト起源の複数のＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物はそれぞれ標的配列を含み、標的配列は、プライマー対のうちの１つに結合可能なプライマー結合部位の対の間に位置するバーコードを含む。いくつかの実施形態において、バーコードは、同じプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡのリード数とサンプルＤＮＡのリード数との間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量する。いくつかの実施形態において、バーコードのリード数と対応する内因性ゲノム配列のリード数との間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量する。
いくつかの実施形態において、標的配列に、内因性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、５０～５００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、７５～３００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、１００～２５０ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、１２５～２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約１６０ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約１２５ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、５００～１，０００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも１００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも２００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも５００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも１，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも２，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも５，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも１０，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。
いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約３５～２００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約５０～１００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６０～７５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、移植は、ヒト移植である。いくつかの実施形態において、移植は、ブタ移植である。いくつかの実施形態において、移植は、非ヒト動物からの移植である。
いくつかの実施形態において、移植は、臓器移植、組織移植、又は細胞移植である。いくつかの実施形態において、移植は、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、心臓／肺移植、胃移植、精巣移植、陰茎移植、卵巣移植、子宮移植、胸腺移植、顔面移植、手移植、脚移植、骨移植、骨髄移植、角膜移植、皮膚移植、膵島細胞移植、心臓弁移植、血管移植、又は血液輸血である。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植拒絶反応を、抗体媒介性移植拒絶反応、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応、移植片傷害、ウイルス感染、細菌感染、又は境界線拒絶反応として決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上のがんの可能性を定量することを更に含む。がんスクリーニング、検出、及びモニタリングは、ＰＣＴ特許公開第２０１５／１６４４３２号、同第２０１７／１８１２０２号、同第２０１８／０８３４６７号、及び同第２０１９／２００２２８号に開示されており、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態において、本発明は、患者をスクリーニングして、１つ以上のがん治療に対する患者の予測される応答性又は耐性を決定することに関する。この決定は、標的遺伝子の野生型対変異型の存在、又は場合によっては標的遺伝子の増加又は過剰発現を決定することによって行うことができる。そのような標的スクリーニングの例としては、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＫＩＴ等が挙げられる。例えば、様々なＫＲＡＳ変異が本発明によるスクリーニングに好適であり、これらに限定されないが、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ａ１８Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎを含む。加えて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第２０１５／１６４４３２号、同第２０１７／１８１２０２号、同第２０１８／０８３４６７号、及び同第２０１９／２００２２８号。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、レシピエント遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー及び／又はレシピエント遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法を実施する前に、ドナー又はレシピエントのいずれかの遺伝子型決定は必要とされない。
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血漿サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血清サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、尿サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、リンパ液である。いくつかの実施形態において、サンプルは、固形組織サンプルである。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントから複数の生体サンプルを長期的に収集することと、収集した各サンプルについてステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すこととを更に含む。
いくつかの実施形態において、定量ステップは、血液サンプル中のドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡの合計に対するドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを決定することを含む。いくつかの実施形態において、定量ステップは、ドナー由来無細胞ＤＮＡのコピー数を決定することを含む。いくつかの実施形態において、定量ステップは、血液サンプルの体積単位当たりのドナー由来無細胞ＤＮＡのコピー数を決定することを含む。
別の態様において、本発明は、移植レシピエントにおける移植を、急性拒絶反応を生じているものとして診断する方法であって、ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、閾値を超えるドナー由来無細胞ＤＮＡの量は、移植が急性拒絶反応を生じていることを示し、閾値は、全無細胞ＤＮＡの量に従って決定され、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列リードを使用して定量される方法に関する。
別の態様において、本発明は、移植レシピエントにおける免疫抑制療法をモニタリングする方法であって、ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、時間間隔にわたるドナー由来無細胞ＤＮＡのレベルの変化は、移植状態を示し、ドナー由来無細胞ＤＮＡのレベルは、全無細胞ＤＮＡの量に応じてスケーリングされ、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される方法に関する。
いくつかの実施形態において、本方法は、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルに基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む。
いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの増加は、移植拒絶反応及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化がないこと又は減少は、移植の寛容性又は安定性、及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡを濃縮し、白血球の破裂から配置レシピエント由来無細胞ＤＮＡの量を減少させるサイズ選択を更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、白血球を破裂又はアポトーシスさせることに起因するレシピエント由来無細胞ＤＮＡよりも、ドナー由来無細胞ＤＮＡを優先的に増幅する、ユニバーサル増幅ステップを更に含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、移植後に移植レシピエントから複数の血液、血漿、血清、固形組織、又は尿サンプルを長期的に収集することと、収集した各サンプルについてステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントからの血液、血漿、血清、固形組織、又は尿サンプルを、約３ヶ月、又は約６ヶ月、又は約１２ヶ月、又は約１８ヶ月、又は約２４ヶ月などの期間にわたって収集及び分析することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、約１週間、又は約２週間、又は約３週間、又は約１ヶ月、又は約２ヶ月、又は約３ヶ月等の間隔で、移植レシピエントから血液、血漿、血清、固形組織又は尿サンプルを収集することを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量がカットオフ閾値を上回るという決定は、移植の急性拒絶反応を示す。機械学習を使用して、拒絶反応と非拒絶反応とを判定してもよい。機械学習は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１９８１として２０１９年７月１６日に出願された、ＷＯ２０２０／０１８５２２、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃａｌｌｉｎｇ Ｐｌｏｉｄｙ Ｓｔａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ」に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされる。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液サンプル中のｄｄ－ｃｆＤＮＡのパーセンテージ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％）として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液サンプルの体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液サンプルの体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量に、移植レシピエントの体重、ＢＭＩ又は血液体積を乗じたものとして表される。
いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、患者の体重、ＢＭＩ又は血液量を考慮に入れる。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、以下のうちの１つ以上を考慮に入れる：血漿の体積当たりのドナーゲノムコピー、血漿の体積当たりの無細胞ＤＮＡ収率、ドナー身長、ドナー体重、ドナー年齢、ドナー性別、ドナー民族性、ドナー臓器質量、ドナー臓器、生体対死亡ドナー、ドナーとレシピエントとの家族関係（又はその欠如）、レシピエント身長、レシピエント体重、レシピエント年齢、レシピエント性別、レシピエント民族性、クレアチニン、ｅＧＦＲ（糸球体濾過率の推定値）、ｃｆＤＮＡメチル化、ＤＳＡ（ドナー特異的抗体）、ＫＤＰＩ（腎臓ドナープロファイル指標）、薬剤（免疫抑制、ステロイド、血液希釈剤など）、感染症（ＢＫＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＵＴＩ）、レシピエント及び／又はドナーＨＬＡ対立遺伝子又はエピトープミスマッチ、腎臓同種移植病理学のＢａｎｆｆ分類、並びに正当対監視又はプロトコル生検。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の感度が少なくとも５０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の感度が少なくとも６０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の感度が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の感度が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の感度が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の感度が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の感度が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の特異性が少なくとも５０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の特異性が少なくとも６０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の特異性が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の特異性が少なくとも７５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の特異性が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の特異性が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の特異性が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液サンプル中の全ｃｆＤＮＡ量に従ってスケール又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ＡＲ）に対するＡＲを同定する際の特異性が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、上昇した量の全無細胞ＤＮＡを有する。いくつかの実施形態において、上昇した量の全無細胞ＤＮＡは、活性ウイルス感染によって引き起こされる。いくつかの実施形態において、ウイルス感染は、ＣＯＶＩＤ－１９である。
いくつかの実施形態において、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を、第１のカットオフ閾値及び第２のカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定する。いくつかの実施形態において、第１のカットオフ閾値は、全無細胞ＤＮＡのうちドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージである。いくつかの実施形態において、第１のカットオフ閾値は、０．８％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、０．９％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．０％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．２％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．３％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．４％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．５％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．６％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．７％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．８％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、１．９％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ、又は２．０％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、第２のカットオフ閾値は、絶対ドナー由来無細胞ＤＮＡ濃度である。いくつかの実施形態において、第２のカットオフ閾値は、５０コピー／ｍｌ、５５コピー／ｍｌ、６０コピー／ｍｌ、６５コピー／ｍｌ、７０コピー／ｍｌ、７１コピー／ｍｌ、７２コピー／ｍｌ、７３コピー／ｍｌ、７４コピー／ｍｌ、７５コピー／ｍｌ、７６コピー／ｍｌ、７７コピー／ｍｌ、７８コピー／ｍｌ、７９コピー／ｍｌ、８０コピー／ｍｌ、８１コピー／ｍｌ、８２コピー／ｍｌ、８３コピー／ｍｌ、８４コピー／ｍｌ、８５コピー／ｍｌ、９０コピー／ｍｌ、９５コピー／ｍｌ又は１００コピー／ｍｌである。
いくつかの実施形態において、第２のカットオフ閾値は、第１のカットオフ閾値に定量値を乗算することによって計算され、定量値は、全無細胞ＤＮＡのリード数を血漿量当たりのトレーサーＤＮＡのリード数で除算することによって計算される。いくつかの実施形態において、第２のカットオフ閾値は、６．０ｍｌ、６．１ｍｌ、６．２ｍｌ、６．３ｍｌ、６．４ｍｌ、６．５ｍｌ、６．６ｍｌ、６．７ｍｌ、６．８ｍｌ、６．９ｍｌ、７．０ｍｌ、７．１ｍｌ、７．２ｍｌ、７．３ｍｌ、７．４ｍｌ、７．５ｍｌ、７．６ｍｌ、７．７ｍｌ、７．８ｍｌ、７．９ｍｌ、８．０ｍｌ、８．５ｍｌ、９．０ｍｌ、９．５ｍｌ、又は１０．０ｍｌである。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果が第１のカットオフ閾値又は第２のカットオフ閾値を超える場合、拒絶反応を呼び出すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果が第１のカットオフ閾値及び第２のカットオフ閾値を下回る場合、非拒絶反応を呼び出すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（Ａ）推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％＞０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、若しくは２．０％である、又は（Ｂ）ｄｄ－ｃｆＤＮＡ濃度＞５０コピー／ｍｌ、５５コピー／ｍｌ、６０コピー／ｍｌ、６５コピー／ｍｌ、７０コピー／ｍｌ、７１コピー／ｍｌ、７２コピー／ｍｌ、７３コピー／ｍｌ、７４コピー／ｍｌ、７５コピー／ｍｌ、７６コピー／ｍｌ、７７コピー／ｍｌ、７８コピー／ｍｌ、７９コピー／ｍｌ、８０コピー／ｍｌ、８１コピー／ｍｌ、８２コピー／ｍｌ、８３コピー／ｍｌ、８４コピー／ｍｌ、８５コピー／ｍｌ、９０コピー／ｍｌ、９５コピー／ｍｌ又は１００コピー／ｍｌの場合、拒絶反応を呼び出すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（Ａ）推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％＜０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、又は２．０％である、及び（Ｂ）ｄｄ－ｃｆＤＮＡ濃度＜５０コピー／ｍｌ、５５コピー／ｍｌ、６０コピー／ｍｌ、６５コピー／ｍｌ、７０コピー／ｍｌ、７１コピー／ｍｌ、７２コピー／ｍｌ、７３コピー／ｍｌ、７４コピー／ｍｌ、７５コピー／ｍｌ、７６コピー／ｍｌ、７７コピー／ｍｌ、７８コピー／ｍｌ、７９コピー／ｍｌ、８０コピー／ｍｌ、８１コピー／ｍｌ、８２コピー／ｍｌ、８３コピー／ｍｌ、８４コピー／ｍｌ、８５コピー／ｍｌ、９０コピー／ｍｌ、９５コピー／ｍｌ又は１００コピー／ｍｌの場合、非拒絶反応を呼び出すことを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果が第１のカットオフ閾値又は第２のカットオフ閾値を超える場合、拒絶反応を呼び出すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果が第１のカットオフ閾値及び第２のカットオフ閾値を下回る場合、非拒絶反応を呼び出すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（Ａ）推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％＞０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、若しくは２．０％である、又は（Ｂ）推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％×（全サンプル配列リード／トレーサー配列リード／血漿体積）＞６．０ｍｌ、６．１ｍｌ、６．２ｍｌ、６．３ｍｌ、６．４ｍｌ、６．５ｍｌ、６．６ｍｌ、６．７ｍｌ、６．８ｍｌ、６．９ｍｌ、７．０ｍｌ、７．１ｍｌ、７．２ｍｌ、７．３ｍｌ、７．４ｍｌ、７．５ｍｌ、７．６ｍｌ、７．７ｍｌ、７．８ｍｌ、７．９ｍｌ、８．０ｍｌ、８．５ｍｌ、９．０ｍｌ、９．５ｍｌ、又は１０．０ｍｌの場合、拒絶反応を呼び出すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（Ａ）推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％＜０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、又は２．０％である、及び（Ｂ）推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％×（全サンプル配列リード／トレーサー配列リード／血漿体積）＜６．０ｍｌ、６．１ｍｌ、６．２ｍｌ、６．３ｍｌ、６．４ｍｌ、６．５ｍｌ、６．６ｍｌ、６．７ｍｌ、６．８ｍｌ、６．９ｍｌ、７．０ｍｌ、７．１ｍｌ、７．２ｍｌ、７．３ｍｌ、７．４ｍｌ、７．５ｍｌ、７．６ｍｌ、７．７ｍｌ、７．８ｍｌ、７．９ｍｌ、８．０ｍｌ、８．５ｍｌ、９．０ｍｌ、９．５ｍｌ、又は１０．０ｍｌの場合、非拒絶反応を呼び出すことを含む。
いくつかの実施形態において、第１及び第２のカットオフ閾値は、単一の数又はスコアに組み合わされる。いくつかの実施形態において、第１のカットオフ閾値及び第２のカットオフ閾値は、１つの数又はスコア及び１つのカットオフを生成するように組み合わされて、この数値又はスコアは、２つの量（例えば、推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％又はｄｄ－ｃｆＤＮＡ濃度）（例えば、推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％又は推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％×全ｃｆＤＮＡ）のうちのいずれか１つがその閾値よりも高い場合、そのカットオフよりも高くなり、この数又はスコアは、両方の量がその閾値を下回る場合、そのカットオフよりも低くなる。
いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定し、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量の関数である。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイ結果をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定し、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数及び全無細胞ＤＮＡのリード数の関数である。
いくつかの実施形態において、関数は、多項式関数である。いくつかの実施形態において、関数は、対数関数である。いくつかの実施形態において、関数は、指数関数である。いくつかの実施形態において、関数は、線形関数である。いくつかの実施形態において、関数は、非線形関数である。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、（ａｘ＾ｎ＋ｂｙ＾ｎ）＾（１／ｎ）＞Ｔである場合、移植拒絶反応の高いリスクを有すると決定され、式中、ｘ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％であり、ｙ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％×（全無細胞ＤＮＡのリード数／トレーサーのリード数／血漿体積）であり、ａ及びｂはそれぞれ任意の数値であり、ｎは整数であり、Ｔは閾値である。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ｌｏｇ（ａｘ＾ｎ＋ｂｙ＾ｎ）＞Ｔである場合、移植拒絶反応の高いリスクを有すると決定され、式中、ｘ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％であり、ｙ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％×（全無細胞ＤＮＡのリード数／トレーサーのリード数／血漿体積）であり、ａ及びｂはそれぞれ任意の数値であり、ｎは整数であり、Ｔは閾値である。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ｘ×ｙ＞Ｔである場合、移植拒絶反応の高いリスクを有すると決定され、式中、ｘ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％であり、ｙ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％×（全無細胞ＤＮＡのリード数／トレーサーのリード数／血漿体積）であり、Ｔは閾値である。
いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ａｘ－ｂｙ＞Ｔである場合、移植拒絶反応の高いリスクを有すると決定され、式中、ｘｘ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％であり、ｙ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％×（全無細胞ＤＮＡのリード数／トレーサーのリード数／血漿体積）であり、ａ及びｂはそれぞれ任意の数値であり、Ｔは閾値である。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージを、全無細胞ＤＮＡ濃度の測定値と組み合わせて使用して、臓器不全の可能性を決定することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、絶対ドナー由来無細胞ＤＮＡ濃度又はその関数を、全無細胞ＤＮＡ濃度の測定値と組み合わせて使用して、臓器不全の可能性を決定することを含む。
ここに開示される実施形態は、添付の図面を参照しつつ更に説明され、同様の構造は、いくつかの図面全体で同様の数字によって参照される。示される図面は、必ずしも縮尺どおりではなく、その代わりに、ここに開示される実施形態の原理を説明する際に一般的に強調される。
上記で特定された図面は、本明細書に開示される実施形態を示しているが、説明に記載されるように、他の実施形態もまた企図される。本開示は、限定ではなく例示を目的として例示的実施形態示している。本明細書に開示される実施形態の原理の範囲及び趣旨に含まれる多数の他の修正及び実施形態が、当業者によって考案され得る。
Ｓｉｇｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｄｎｅｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖｉａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８（１）：１９（２０１９）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４０６０３として２０１９年７月３日に出願された、ＷＯ２０２０／０１０２５５、名称「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＤＯＮＯＲ－ＤＥＲＩＶＥＤ ＣＥＬＬ－ＦＲＥＥ ＤＮＡ」は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される方法は、いくつかの実施形態において、高度に最適化された新規のｃｆＤＮＡ技術によって機能し、現在、合理化された方法で絶対的なバックグラウンドｃｆＤＮＡを定量することができる新規の技術によって強化されている。この改善は、変則的なバックグラウンドｃｆＤＮＡレベルを有し、拒絶反応を見逃す可能性がある偽陰性結果を有し得る患者を特定することによって、臨床的意思決定のための追加情報を提供する。
本明細書に記載される方法は、全てのタイプの移植拒絶反応を非常に正確に評価する。単一の採血から、本明細書に記載される方法のある特定の実施形態は、患者の血液中の移植された臓器からのドナーｃｆＤＮＡの量を測定する。多数の一塩基多型（ＳＮＰ）（例えば、１３，０００超のＳＮＰ）及び高度なバイオインフォマティクスを使用して、これらの実施形態は、ドナー及びレシピエントｃｆＤＮＡを差別化し、移植レシピエントの血液中のｄｄ－ｃｆＤＮＡのパーセンテージとして結果を提供することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、（１）新規ライブラリ調製及び／又は（２）バックグラウンドｃｆＤＮＡの定量を組み込む。いくつかの実施形態において、ライブラリ調製技術は、標準的なｃｆＤＮＡ試験よりも高い収率でより高い品質のＤＮＡをもたらす。いくつかの実施形態において、それは、収集及び輸送中にサンプルに導入され得る追加のｃｆＤＮＡを説明する。いくつかの実施形態において、バックグラウンドｃｆＤＮＡの定量は、特定の患者についての報告された結果に影響を及ぼし得るバックグラウンドｃｆＤＮＡの変則的なレベルを特定する。両方の技法を適用すると、誤った否定的解釈が少なくなり得る。
本明細書に開示されるのは、生体サンプル中の全無細胞ＤＮＡの量を定量するための方法、並びに移植レシピエントからの生体サンプル中の移植ドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の検出方法の、非網羅的な実施形態である。
一実施形態において、本方法は、生体サンプル中の全無細胞ＤＮＡの量の定量であって、ａ）生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む定量に関する。
別の実施形態において、本方法は、移植レシピエントの生体サンプルにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量の定量であって、ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される定量に関する。
別の実施形態において、本方法は、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生の決定であって、ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することであって、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される、定量することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を閾値と比較することによって、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を使用して移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定することであって、閾値は、全無細胞ＤＮＡの量に従って決定される、決定することと、を含む決定に関する。
定義
トレーサーＤＮＡ、又は内部キャリブレーションＤＮＡは、以下のうちの１つ以上が事前に知られているＤＮＡの組成物を指す：長さ、配列、ヌクレオチド組成、量、又は生物学的起源。トレーサーＤＮＡは、ヒト対象に由来する生体サンプルに添加して、当該サンプル中の全ｃｆＤＮＡの量を推定するのに役立てることができる。また、生体サンプル自体以外の反応混合物に添加することもできる。
トレーサーＤＮＡ、又は内部キャリブレーションＤＮＡは、以下のうちの１つ以上が事前に知られているＤＮＡの組成物を指す：長さ、配列、ヌクレオチド組成、量、又は生物学的起源。トレーサーＤＮＡは、ヒト対象に由来する生体サンプルに添加して、当該サンプル中の全ｃｆＤＮＡの量を推定するのに役立てることができる。また、生体サンプル自体以外の反応混合物に添加することもできる。
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、同じ種の２つのメンバーのゲノム間で異なり得る単一ヌクレオチドを指す。この用語の使用は、各バリアントが生じる頻度のいかなる制限も意味しない。
配列は、ＤＮＡ配列又は遺伝子配列を指す。これは、個体におけるＤＮＡ分子又は鎖の一次的な物理的構造を指し得る。これは、そのＤＮＡ分子内に見出されるヌクレオチドの配列、又はＤＮＡ分子に対する相補鎖を指し得る。これは、コンピュータでのその表現としてのＤＮＡ分子に含まれる情報を指し得る。
遺伝子座は、個体のＤＮＡ上の特定の目的領域を指し、１つ以上のＳＮＰ、可能性のある挿入若しくは欠失の部位、又はいくつかの他の関連する遺伝子変異の部位を含むが、これらに限定されない。疾患関連ＳＮＰはまた、疾患関連遺伝子座を指し得る。
多型対立遺伝子、別名「多型遺伝子座」は、遺伝子型が所与の種内の個体間で変化する対立遺伝子又は遺伝子座を指す。多型対立遺伝子のいくつかの例としては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、短いタンデム反復、欠失、重複及び反転が挙げられる。
対立遺伝子は、特定の遺伝子座を占めるヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。
遺伝子データ、別名「遺伝子型データ」は、１つ以上の個体のゲノムの態様を記述するデータを指す。これは、遺伝子座の１つ又は１セット、部分的又は全体的な配列、部分的又は全体的な染色体、又はゲノム全体を指し得る。これは、１つ又は複数のヌクレオチドの同一性を指し得、これは、一連の連続したヌクレオチド、又はゲノム内の異なる位置からのヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを指し得る。遺伝子型データはコンピュータ上であるが、配列中の物理的ヌクレオチドを化学的にコードされた遺伝子データとみなすことも可能である。遺伝子型データは、個体「に関する」、個体「の」、個体「での」、個体「からの」又は個体「に関する」と言うことができる。遺伝子型データは、遺伝物質に対してこれらの測定が行われる遺伝子型決定プラットフォームからの出力測定を指し得る。
遺伝物質、別名「遺伝子サンプル」は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）を含む１つ以上の個体からの、組織又は血液などの物理的物質を指す。
ノイズの多い遺伝子データは、以下のいずれかを有する遺伝子データを指す：対立遺伝子ドロップアウト、不確実な塩基対測定値、不正確な塩基対測定値、欠損した塩基対測定値、挿入若しくは欠失の不確実な測定値、染色体セグメントコピー数の不確実な測定値、偽シグナル、欠損した測定値、他のエラー、又はそれらの組み合わせ。
対立遺伝子データは、１つ以上の対立遺伝子のセットに関する遺伝子型データのセットを指す。これは、段階的なハプロタイプのデータを指し得る。これは、ＳＮＰ同一性を指し得、挿入、欠失、反復及び変異を含む、核酸の配列データを指し得る。
対立遺伝子状態とは、１つ以上の対立遺伝子のセットにおける遺伝子の実際の状態を指す。これは、対立遺伝子データによって説明される遺伝子の実際の状態を指し得る。
対立遺伝子の比率又は対立遺伝子比率は、サンプル又は個体中に存在する遺伝子座における各対立遺伝子の量間の比率を指す。サンプルが配列決定によって測定された場合、対立遺伝子の比率は、遺伝子座における各対立遺伝子にマッピングする配列リードの比率を指し得る。サンプルが強度ベースの測定方法によって測定された場合、対立遺伝子比率は、測定方法によって推定される、その遺伝子座に存在する各対立遺伝子の量の比率を指し得る。
対立遺伝子数は、特定の遺伝子座にマッピングする配列の数を指し、その遺伝子座が多型である場合、対立遺伝子のそれぞれにマッピングする配列の数を指す。各対立遺伝子がバイナリ方式でカウントされる場合、対立遺伝子数は整数となる。対立遺伝子が確率的にカウントされる場合、対立遺伝子数は、分数であってもよい。
プライマー、別名「ＰＣＲプローブ」は、ＤＮＡ分子が同一又はほぼ同一であり、プライマーが標的多型遺伝子座にハイブリダイズするように設計された領域を含み、ＰＣＲ増幅を可能にするように設計されたプライミング配列を含む、単一のＤＮＡ分子（ＤＮＡオリゴマー）又はＤＮＡ分子（ＤＮＡオリゴマー）の集合体を指す。プライマーはまた、分子バーコードを含んでいてもよい。プライマーは、個々の分子ごとに異なるランダム領域を含んでいてもよい。
ハイブリッド捕捉プローブは、ＰＣＲ又は直接合成などの様々な方法によって生成され、サンプル中の特定の標的ＤＮＡ配列の１つの鎖に相補的であることを意図している、場合によっては修飾された任意の核酸配列を指す。外因性ハイブリッド捕捉プローブを調製したサンプルに添加し、変性－アニールプロセスを通じてハイブリダイゼーションして、外因性－内因性断片の二本鎖を形成してもよい。次いで、これらの二本鎖は、様々な手段によってサンプルから物理的に分離され得る。
配列リードは、クローン配列決定方法を用いて測定した、ヌクレオチド塩基の配列を表すデータを指す。クローン配列決定は、単一の、又はクローンの、又はクラスターの１つの元のＤＮＡ分子を表す配列データを生成し得る。配列リードはまた、ヌクレオチドが正しく呼び出された可能性を示す配列の各塩基位置に、関連する品質スコアを有し得る。
配列リードをマッピングすることは、特定の生物のゲノム配列における配列リードの起点の位置を決定するプロセスである。配列リードの起点の位置は、リード及びゲノム配列のヌクレオチド配列の類似性に基づく。
ドナー起源のＤＮＡとは、元々遺伝子型が移植ドナーのものと本質的に同等であった細胞の一部であったＤＮＡを指す。
レシピエント起源のＤＮＡとは、元々遺伝子型が移植レシピエントのものと本質的に同等であった細胞の一部であったＤＮＡを指す。
移植レシピエント血漿とは、同種移植片を受けた患者、例えば臓器移植レシピエントの女性からの血液の血漿部分を指す。
遺伝子座に対応するＤＮＡの優先的濃縮、又は遺伝子座におけるＤＮＡの優先的濃縮とは、遺伝子座に対応する濃縮前ＤＮＡ混合物中のＤＮＡの分子のパーセンテージよりも高い、遺伝子座に対応する濃縮後ＤＮＡ混合物中のＤＮＡの分子のパーセンテージをもたらす任意の技術を指す。この技術は、遺伝子座に対応するＤＮＡ分子の選択的増幅を含んでもよい。この技術は、遺伝子座に対応しないＤＮＡ分子を除去することを含んでもよい。この技術は、方法の組み合わせを含んでもよい。濃縮度は、遺伝子座に対応する濃縮後混合物中のＤＮＡ分子のパーセンテージを、遺伝子座に対応する濃縮前混合物中のＤＮＡ分子のパーセンテージで割ったものとして定義される。優先的濃縮は、複数の遺伝子座で行われてもよい。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２０を超える。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２００を超える。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２，０００を超える。優先濃縮が複数の遺伝子座で行われる場合、濃縮度は、遺伝子座のセット中の全ての遺伝子座の平均濃縮度を指し得る。
増幅とは、ＤＮＡの分子のコピー数を増加させる技術を指す。
選択的増幅とは、ＤＮＡの特定の領域に対応する、ＤＮＡの特定の分子、又はＤＮＡの分子のコピー数を増加させる技術を指し得る。また、ＤＮＡの非標的分子又は領域を増加させるよりも、ＤＮＡの特定の標的分子、又はＤＮＡの標的領域のコピー数を増加させる技術を指し得る。選択的増幅は、優先的濃縮方法であり得る。
ユニバーサルプライミング配列とは、例えば、ライゲーション、ＰＣＲ、又はライゲーション媒介ＰＣＲによって標的ＤＮＡ分子の集団に付加され得るＤＮＡ配列を指す。標的分子の集団に加えられると、ユニバーサルプライミング配列に特異的なプライマーを使用して、単一の増幅プライマー対を使用して標的集団を増幅することができる。ユニバーサルプライミング配列は、標的配列に関連する必要はない。
ユニバーサルアダプター、又は「ライゲーションアダプタ」若しくは「ライブラリタグ」とは、標的二本鎖ＤＮＡ分子の集団の５’末端及び３’末端に共有結合可能なユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡ分子である。アダプターの添加は、ＰＣＲ増幅が行われ得る標的集団の５’末端及び３’末端にユニバーサルプライミング配列を提供し、単一の増幅プライマー対を使用して、標的集団由来の全ての分子を増幅する。
標的化とは、ＤＮＡの混合物中の遺伝子座のセットに対応するＤＮＡの分子を選択的に増幅するか、又は別様に優先的に濃縮するために使用される方法を指す。
トレーサーＤＮＡ及びその使用
トレーサーＤＮＡの例を、図３及び図４に示す。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、非ヒト起源のＤＮＡ分子を含む。
トレーサーＤＮＡの例を、図３及び図４に示す。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、非ヒト起源のＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、約５０～５００ｂｐ、又は約７５～３００ｂｐ、又は約１００～２５０ｂｐ、又は約１２５～２００ｂｐ、又は約１２５ｂｐ、又は約１６０ｂｐ、又は約２００ｂｐ、又は約５００～１，０００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、同じ又は実質的に同じ長さを有するＤＮＡ分子、例えば約１２５ｂｐ、又は約１６０ｂｐ、又は約２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、異なる長さを有するＤＮＡ分子、例えば、約１２５ｂｐの長さを有する第１のＤＮＡ分子、約１６０ｂｐの長さを有する第２のＤＮＡ分子、及び約２００ｂｐの長さを有する第３のＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、異なる長さを有するＤＮＡ分子を使用して、サンプル中の無細胞ＤＮＡのサイズ分布を決定する。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは標的配列を含み、標的配列は、プライマーの対に結合可能なプライマー結合部位の対の間に位置するバーコードを含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡの少なくとも一部は、ＳＮＰ遺伝子座を含む内因性配列をバーコードで置き換えることによって、内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計される。ｍｍＰＣＲ標的濃縮ステップの間、ＳＮＰ遺伝子座を標的とするプライマー対はまた、バーコードを含むトレーサーＤＮＡの一部を増幅することもできる。
いくつかの実施形態において、バーコードは、任意のバーコードである。いくつかの実施形態において、バーコードは、同じプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の標的配列に、内在性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、複数の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、プライマーの第１の対に結合可能なプライマー結合部位の第１の対の間に位置する第１のバーコードと、プライマーの第２の対に結合可能なプライマー結合部位の第２の対の間に位置する第２のバーコードを含む、第１の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２の標的配列は、ＳＮＰ遺伝子座を含む内因性配列をバーコードで置き換えることによって、１つ以上の内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計される。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のバーコードは、任意のバーコードである。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のバーコードは、第１又は第２のプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の第１及び／又は第２の標的配列に、内因性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の第１及び／又は第２の標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、図３に示されるトレーサーＤＮＡ配列等の、同じ又は実質的に同じ配列を有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、異なる配列を有するＤＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、第１の標的配列を含む第１のＤＮＡと、第２の標的配列を含む第２のＤＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に位置する異なるバーコードを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に配置された異なるバーコードを有し、異なるバーコードは、同じ長さ又は実質的に同じ長さを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に配置された異なるバーコードを有し、異なるバーコードは、異なる長さを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、異なる内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計され、したがって、異なるプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡの量及び第２のＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡにおいて同じ又は実質的に同じである。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡの量及び第２のＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡにおいて異なる。
トレーサーＤＮＡを使用した全無細胞ＤＮＡの量の決定
ある特定の実施形態において、トレーサーＤＮＡを使用して、本明細書に記載の方法の正確さ及び精度を改善し、より広い入力範囲にわたる定量に役立ち、異なるサイズ範囲での異なるステップの効率を評価し、及び／又は入力材料の断片サイズ分布を計算することができる。
ある特定の実施形態において、トレーサーＤＮＡを使用して、本明細書に記載の方法の正確さ及び精度を改善し、より広い入力範囲にわたる定量に役立ち、異なるサイズ範囲での異なるステップの効率を評価し、及び／又は入力材料の断片サイズ分布を計算することができる。
本発明のいくつかの実施形態は、生体サンプル中の全無細胞ＤＮＡの量を定量する方法であって、ａ）生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡが、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）第１のトレーサーＤＮＡに由来する配列決定リードを使用して全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む方法に関する。
いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の前に、第１のトレーサーＤＮＡを全血サンプルに添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の後及び無細胞ＤＮＡの単離の前に、第１のトレーサーＤＮＡを血漿サンプルに添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡを添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡにアダプターを連結して、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物を得ることと、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡを添加することと、を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅の前に、第２のトレーサーＤＮＡを添加することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅の後に、第２のトレーサーＤＮＡを添加することを更に含む。
いくつかの実施形態において、サンプル中の全ｃｆＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡのＮＯＲ（バーコードによって識別可能）、サンプルＤＮＡのＮＯＲ、及び血漿サンプルに添加されたトレーサーＤＮＡの既知の量を使用して推定される。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡのＮＯＲとサンプルＤＮＡのＮＯＲとの間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量する。いくつかの実施形態において、バーコードのＮＯＲと対応する内因性ゲノム配列のＮＯＲとの間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量する。いくつかの実施形態において、この情報を血漿体積とともに使用して、血漿の体積当たりのｃｆＤＮＡの量を計算することもできる。いくつかの実施形態において、これらは、ドナーＤＮＡのパーセンテージを乗じて、全ドナーｃｆＤＮＡ及び血漿の体積当たりのドナーｃｆＤＮＡを計算することができる。
全無細胞ＤＮＡの量を使用して移植拒絶反応を呼び出すための閾値の調整
本発明のいくつかの実施形態は、移植レシピエントの生体サンプルにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量する方法であって、ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される方法に関する。
本発明のいくつかの実施形態は、移植レシピエントの生体サンプルにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量する方法であって、ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される方法に関する。
いくつかの実施形態は、血漿量当たりのドナーＤＮＡの固定閾値、又は本明細書に記載されるように調整又はスケーリングされたもの等の固定されていないもののいずれかを使用する。これを決定する方法は、トレーニングデータセットを使用してパフォーマンスを最大化するアルゴリズムを構築することに基づいてもよい。また、患者の体重、年齢、又は他の臨床的要因などの他のデータを考慮してもよい。
いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を使用して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定し、カットオフ閾値を全無細胞ＤＮＡの量に従って調整又はスケーリングする。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数の関数である。
いくつかの実施形態において、本方法は、より正確に移植拒絶反応を評価するために、サンプル中の全ｃｆＤＮＡの量を考慮したスケール又は動的閾値メトリックを適用することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値を上回る場合に、サンプルにフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値未満である場合に、サンプルにフラグを立てることを更に含む。
多重増幅
いくつかの実施形態において、本方法は、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列を決定する前に、１つの反応混合物中の複数の多型遺伝子座を増幅するための多重増幅反応を行うことを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列を決定する前に、１つの反応混合物中の複数の多型遺伝子座を増幅するための多重増幅反応を行うことを含む。
特定の例示的な実施形態において、核酸配列データは、多重増幅反応を用いて作成される一連のアンプリコンの複数のコピーの高スループットＤＮＡ配列決定を行うことによって作成され、一連のアンプリコンのそれぞれのアンプリコンは、多型遺伝子座のセットの少なくとも１つの多型遺伝子座に広がり、このセットの多型遺伝子座のそれぞれが増幅される。例えば、これらの実施形態において、少なくとも１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００の多型遺伝子座（例えば、ＳＮＰ遺伝子座）にわたってアンプリコンを増幅する多重ＰＣＲを実行してもよい。この多重反応は、単一の反応として、又は異なる部分集合の多重反応のプールとして設定することができる。本明細書で提供される多重反応方法（例えば、本明細書に開示される大規模マルチプレックスＰＣＲ）は、改良された多重化、したがって、感度レベルを達成するのに役立つように増幅反応を行う例示的なプロセスを提供する。
いくつかの実施形態において、増幅は、直接多重化ＰＣＲ、連続ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、二重ネスティッドＰＣＲ、片側及び片側半（ｏｎｅ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ｓｉｄｅｄ）ネスティッドＰＣＲ、完全ネスティッドＰＣＲ、片側完全ネスティッドＰＣＲ、片側ネスティッドＰＣＲ、ヘミネスティッドＰＣＲ、ヘミネスティッドＰＣＲ、三重ヘミネスティッドＰＣＲ、セミネスティッドＰＣＲ、片側セミネスティッドＰＣＲ、逆セミネスティッドＰＣＲ法、又は片側ＰＣＲを用いて行われ、これらは、２０１２年１１月２１日に出願された米国出願第１３／６８３，６０４号、米国公開第２０１３／０１２３１２０号、２０１１年１１月１８日に出願された米国出願第１３／３００，２３５号、米国公開第２０１２／０２７０２１２号及び２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７９１号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲが使用される。いくつかの実施形態において、核酸サンプルにおいて標的遺伝子座を増幅する方法は、（ｉ）核酸サンプルと、少なくとも１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００個の異なる標的遺伝子座を同時にハイブリダイズするプライマーのライブラリとを接触させ、単一反応混合物を生成することと、（ｉｉ）この反応混合物をプライマー伸長反応条件（例えばＰＣＲ条件）に供して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することとを伴う。いくつかの実施形態において、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．５％が増幅される。様々な実施形態において、増幅産物の６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１又は０．０５％未満が、プライマーダイマーである。いくつかの実施形態において、プライマーは、溶液状態である（例えば、固相ではなく液相に溶解する）。いくつかの実施形態において、プライマーは、溶液状態であり、固体支持体に固定されていない。いくつかの実施形態において、プライマーは、マイクロアレイの一部ではない。
特定の実施形態において、多重増幅反応は、反応の少なくとも１／２について、制限されたプライマー条件で行われる。いくつかの実施形態において、制限されたプライマー濃度は、多重反応のうちの反応の１／１０、１／５、１／４、１／３、１／２、又は全てで使用される。ＰＣＲなどの増幅反応において制限されたプライマー条件を達成する上で考慮すべき因子が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態について、多重増幅反応は、例えば、２，５００～５０，０００の多重反応を含んでいてもよい。特定の実施形態において、以下の範囲の多重反応が行われる。範囲の下限で１００、２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５０００、５００００から、範囲の上限で２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５０００、５００００及び１００，０００まで。
一実施形態において、マルチプレックスＰＣＲアッセイは、１つ以上の染色体上の潜在的にヘテロ接合性のＳＮＰ又は他の多型若しくは非多型の遺伝子座を増幅するように設計され、これらのアッセイは、単一反応で使用され、ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲアッセイの数は、５０～２００ＰＣＲアッセイ、２００～１，０００ＰＣＲアッセイ、１，０００～５，０００ＰＣＲアッセイ又は５，０００～２０，０００ＰＣＲアッセイ（それぞれ、５０～２００反応分、２００～１，０００反応分、１，０００～５，０００反応分、５，０００～２０，０００反応分、２０，０００より多い反応分）であってもよい。一実施形態において、少なくとも１０，０００ＰＣＲアッセイ（１０，０００反応分）のマルチプレックスプールは、潜在的にヘテロ接合性のＳＮＰ遺伝子座単一反応を増幅し、血液、血漿、血清、固形組織、又は尿サンプルから得られたｃｆＤＮＡを増幅するように設計される。各遺伝子座のＳＮＰ頻度は、クローンによって、又はアンプリコンを配列決定するいくつかの他の方法によって決定されてもよい。別の実施形態において、元々のｃｆＤＮＡサンプルは、２つのサンプルに分割され、並行な５，０００反応分のアッセイが行われる。別の実施形態において、元々のｃｆＤＮＡサンプルは、ｎ個のサンプルに分割され、並行な（約１０，０００／ｎ）反応分のアッセイが行われ、ここで、ｎは、２～１２又は１２～２４又は２４～４８又は４８～９６である。
一実施形態において、本明細書に開示される方法は、高効率な高度に多重化された標的化ＰＣＲを使用してＤＮＡを増幅し、その後、高スループット配列決定によって、各標的遺伝子座での対立遺伝子頻度を決定する。高度に多重化された標的化ＰＣＲを高効率な方法で行うことを可能にする１つの技術は、互いにハイブリダイズする可能性が低いプライマーを設計することを伴う。ＰＣＲプローブは、典型的にはプライマーと呼ばれ、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、又は少なくとも５０，０００の潜在的なプライマー対との間の潜在的に有害な相互作用又はプライマーとサンプルＤＮＡとの間の意図していない相互作用の熱力学的モデルを作成し、次いで、このモデルを用いて、プール中の他の設計と不適合な設計を除外することによって選択される。高度に多重化された標的化ＰＣＲを高効率な方法で行うことを可能にする別の技術は、標的化ＰＣＲに対して、部分的又は完全なネスティング手法を用いることである。これらの手法の１つ又は組み合わせを用いることで、単一のプールにおいて、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００又は少なくとも５０，０００のプライマーの多重化が可能になり、得られた大部分のＤＮＡを含む増幅ＤＮＡは、配列決定されると、標的遺伝子座にマッピングする。これらの手法の１つ又は組み合わせを用いることで、単一のプールにおいて多数のプライマーの多重化が可能になり、得られた増幅ＤＮＡは、標的遺伝子座にマッピングする５０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９８％より多く、又は９９％より多いＤＮＡ分子を含む。
マルチプレックスＰＣＲから得られた遺伝子データを分析するために、バイオインフォマティクス法が使用される。本明細書に開示される方法に有用及び関連するバイオインフォマティクス法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１８／００２５１０９号に見出すことができる。
高スループット配列決定
いくつかの実施形態において、アンプリコンの配列は、高スループット配列決定を行うことにより決定される。
いくつかの実施形態において、アンプリコンの配列は、高スループット配列決定を行うことにより決定される。
移植された臓器及び／又は移植レシピエントの遺伝子データは、これらに限定されないが、遺伝子型決定マイクロアレイ、及び高スループット配列決定を含む群から得られるツール及び／又は技術を使用して、適切な遺伝子材料を測定することによって、分子状態から電子状態に変換され得る。いくつかの高スループット配列決定法としては、Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定、パイロシーケンシング、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＯＬＥＸＡプラットフォーム、ＩＬＬＵＭＩＮＡのゲノムアナライザ、又はＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭの４５４配列決定プラットフォーム、ＨＥＬＩＣＯＳのＴＲＵＥ ＳＩＮＧＬＥ ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧプラットフォーム、ＨＡＬＣＹＯＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲの電子顕微鏡配列決定法、又は任意の他の配列決定法が挙げられる。いくつかの実施形態において、高スループット配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）上で行われ、続いて、ヒト参照ゲノムへの脱多重化及びマッピングが行われる。これらの方法は全て、ＤＮＡのサンプルに格納された遺伝子データを、処理される途中のメモリデバイスに典型的に格納される遺伝子データのセットに物理的に変換する。
いくつかの実施形態において、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列は、マイクロアレイ分析を行うことによって決定される。一実施形態において、マイクロアレイは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＮＰマイクロアレイ、又はＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＳＮＰマイクロアレイであってもよい。
いくつかの実施形態において、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析を行うことによって決定される。ｑＰＣＲは、特定の時間（概して増幅サイクルごとに）における蛍光の強度を測定し、標的分子（ＤＮＡ）の相対量を決定する。ｄｄＰＣＲは、各分子が１つのドロップレット内にあるため、実際の分子数（標的ＤＮＡ）を測定し、したがってそれを別個の「デジタル」測定値とする。これは、ｄｄＰＣＲがサンプルの陽性分率、すなわち適切な増幅により蛍光している液滴の数を測定するため、絶対的な定量を提供する。この陽性分率は、鋳型核酸の初期量を正確に示す。
実施例
実施例１．
この非限定的な例のワークフローは、Ｓｉｇｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｄｎｅｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖｉａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８（１）：１９（２０１９）に開示されているワークフローに対応し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
実施例１．
この非限定的な例のワークフローは、Ｓｉｇｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｄｎｅｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖｉａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８（１）：１９（２０１９）に開示されているワークフローに対応し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
血液サンプル
男性及び女性の成人又は若年成人の患者が、関連した、若しくは関連していない生体ドナー、又は関連していない死亡したドナーから腎臓を移植された。移植手術後の患者の採血の時点は、同種移植片生検の時点、又はラボプロトコルに基づいて事前に指定された様々な時間間隔であった。典型的には、サンプルは生検マッチングされ、臨床的機能障害及び生検時、又はプロトコル生検時（この時点では、ほとんどの患者は臨床的機能障害を有していなかった）に採血された。更に、一部の患者は移植後に連続血液採取を受けた。試験サンプルの選択は、（ａ）適切な血漿が利用可能であること、及び（ｂ）サンプルが生検情報と関連付けられているかに基づく。完全な３００サンプルコホートのうち、７２．３％は、生検の日に採血された。
男性及び女性の成人又は若年成人の患者が、関連した、若しくは関連していない生体ドナー、又は関連していない死亡したドナーから腎臓を移植された。移植手術後の患者の採血の時点は、同種移植片生検の時点、又はラボプロトコルに基づいて事前に指定された様々な時間間隔であった。典型的には、サンプルは生検マッチングされ、臨床的機能障害及び生検時、又はプロトコル生検時（この時点では、ほとんどの患者は臨床的機能障害を有していなかった）に採血された。更に、一部の患者は移植後に連続血液採取を受けた。試験サンプルの選択は、（ａ）適切な血漿が利用可能であること、及び（ｂ）サンプルが生検情報と関連付けられているかに基づく。完全な３００サンプルコホートのうち、７２．３％は、生検の日に採血された。
血液サンプル中のｄｄ－ｃｆＤＮＡ測定
無細胞ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて血漿サンプルから抽出し、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で製造業者の指示に従って定量化した。無細胞ＤＮＡを、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されるように、ライブラリをプラトー化するための１８サイクルのライブラリ増幅の改変を用いて、Ｎａｔｅｒａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキットを使用してライブラリ調製に入力した。精製されたライブラリは、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されるように、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋを使用して定量した。標的濃縮は、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．３２：１２３３－１２４１（２０１２）に記載の修正バージョンを使用して、１３，３９２個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を標的としてマルチプレックスＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ）を用いて達成した。次いで、サンプル当たり１０００万～１１００万リードで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎ（登録商標）で５０サイクルの単一末端でアンプリコンを配列決定した。
無細胞ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて血漿サンプルから抽出し、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で製造業者の指示に従って定量化した。無細胞ＤＮＡを、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されるように、ライブラリをプラトー化するための１８サイクルのライブラリ増幅の改変を用いて、Ｎａｔｅｒａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキットを使用してライブラリ調製に入力した。精製されたライブラリは、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されるように、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋを使用して定量した。標的濃縮は、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．３２：１２３３－１２４１（２０１２）に記載の修正バージョンを使用して、１３，３９２個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を標的としてマルチプレックスＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ）を用いて達成した。次いで、サンプル当たり１０００万～１１００万リードで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎ（登録商標）で５０サイクルの単一末端でアンプリコンを配列決定した。
ｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲの統計分析
各サンプルにおいて、ｄｄ－ｃｆＤＮＡを測定し、拒絶状態と相関させ、結果をｅＧＦＲと比較した。該当する場合、全ての統計的検定は両側であった。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。患者におけるｄｄ－ｃｆＤＮＡの分布は、群間で激しく歪んでいたため、データは、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定、続いてＤｕｎｎ多重比較検定を用いて、Ｈｏｌｍ補正ありで分析した。ｅＧＦＲ（ｍｇ／ｄＬでの血清クレアチニン）は、成人及び小児患者について前述のように計算した。簡単に述べると、ｅＧＦＲ＝１８６×血清クレアチニン－１．１５４×年齢－０．２０３×（黒人の場合は１．２１０）×（女性の場合は０．７４２）である。
各サンプルにおいて、ｄｄ－ｃｆＤＮＡを測定し、拒絶状態と相関させ、結果をｅＧＦＲと比較した。該当する場合、全ての統計的検定は両側であった。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。患者におけるｄｄ－ｃｆＤＮＡの分布は、群間で激しく歪んでいたため、データは、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定、続いてＤｕｎｎ多重比較検定を用いて、Ｈｏｌｍ補正ありで分析した。ｅＧＦＲ（ｍｇ／ｄＬでの血清クレアチニン）は、成人及び小児患者について前述のように計算した。簡単に述べると、ｅＧＦＲ＝１８６×血清クレアチニン－１．１５４×年齢－０．２０３×（黒人の場合は１．２１０）×（女性の場合は０．７４２）である。
拒絶マーカーとしてのｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲ（ｍＬ／分／１．７３ｍ２）のパフォーマンスを評価するために、サンプルをＡＲ群及び非拒絶群（ＢＬ＋ＳＴＡ＋ＯＩ）に分けた。この分類を使用して、以下の所定のカットオフを用いてサンプルをＡＲとして分類した：ｄｄ－ｃｆＤＮＡについては１％超、ｅＧＦＲについては６０．０未満。
各マーカーの性能パラメータ（感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）、陰性予測値（ＮＰＶ）及び曲線下面積（ＡＵＣ））を計算するために、ブートストラップ法を使用して、患者内の反復測定を考慮した。簡単に説明すると、各ブートストラップステップにおいて、各患者から単一のサンプルを選択した。患者間の独立性を仮定することにより、パフォーマンスパラメータ及びその標準誤差を計算した。これを１０，０００回繰り返した。最終信頼区間は、標準正規分位のブートストラップ標準誤差の平均を有するパラメータのブートストラップ平均を用いて計算した。感度及び特異性の標準誤差は、二項分布を仮定して計算し、ＰＰＶ及びＮＰＶについては正規近似を使用し、ＡＵＣについてはＤｅＬｏｎｇ法を使用した。パフォーマンスは、プロトコル生検と同時に採取されたサンプルからなるサブコホートを含む、一致した生検を有する全てのサンプルについて計算した。
ドナータイプ（生存する関連者、生存する非関連者、及び死亡した非関連者）によるｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルの差異もまた評価した。有意性は、上述のように、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定を用いて決定された。経時的なｄｄ－ｃｆＤＮＡの相互及び内部変動性を、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ上の対数変換を有する混合効果モデルを用いて評価し、患者内及び患者間標準偏差の９５％信頼区間（ＣＩ）を、尤度プロファイル法を用いて計算した。
事後分析は、（ａ）ＮＰＶを最大化するための異なるｄｄ－ｃｆＤＮＡ閾値、並びに（ｂ）ＡＲ診断のためのＰＰＶを改善し得る経験的拒絶ゾーンを定義するためのｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲを組み合わせたものを評価した。全ての分析は、ＦＳＡ（Ｄｕｎｎ検定の場合）、ｌｍｅ４（混合効果モデリングの場合）、及びｐＲＯＣ（ＡＵＣ計算の場合）パッケージを使用してＲ３．３．２を用いて行った。
生検サンプル
任意選択で、腎生検を、病理学者によって盲検様式で分析し、活性拒絶反応（ＡＲ）について２０１７年のＢａｎｆｆ分類によって分類し、グラフト内Ｃ４ｄ染色を行って、急性体液性拒絶反応を評価した。活動性尿路感染症（ＵＴＩ）又は他の感染症の症例では、生検は行わなかった。移植「傷害」は、その以前の定常状態ベースライン値からの血清クレアチニンの２０％超の増加、及び活性拒絶（ＡＲ）、境界拒絶（ＢＬ）、又は他の傷害（ＯＩ）（例えば、薬物毒性、ウイルス感染）のいずれかとして分類される関連する生検として定義された。活性拒絶反応は、最低でも以下の基準によって定義された：（１）間質性炎症（ｉ）スコア＞２若しくは血管変化（ｖ）スコア＞０を伴う尿細管炎（ｔ）スコア＞２のいずれかからなるＴ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）、（２）糸球体炎（ｇ）スコア＞０を伴う陽性ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）からなるＣ４ｄ陽性抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）、又はＣ４ｄ＝２を伴う原因不明の急性尿細管壊死／血栓性微小血管症（ＡＴＮ／ＴＭＡ）を伴う尿細管周囲毛細血管炎（ｐｔｃ）＞０若しくはｖ＞０、或いは（３）ｇ＋ｐｔｃ≧２である、及びＣ４ｄが０又は１のいずれかである原因不明のＡＴＮ／ＴＭＡを伴う陽性ＤＳＡからなるＣ４ｄ陰性ＡＢＭＲ。境界変化（ＢＬ）は、説明される原因（例えば、ポリオマウイルス関連腎症（ＰＶＡＮ）／感染性原因／ＡＴＮ）なしで、ｔ１＋ｉ０、又はｔ１＋ｉ１、又はｔ２＋ｉ０によって定義された。ＢＬ変化に使用される他の基準は、ｇ＞０及び／若しくはｐｔｃ＞０、又はＤＳＡを伴わないｖ＞０、又はＣ４ｄ若しくは陽性ＤＳＡ、又は非ゼロｇ又はｐｔｃスコアを伴わない陽性Ｃ４ｄであった。正常（ＳＴＡ）同種移植片は、Ｂａｎｆｆスキーマによって定義されるような顕著な損傷病理の不在によって定義された。
任意選択で、腎生検を、病理学者によって盲検様式で分析し、活性拒絶反応（ＡＲ）について２０１７年のＢａｎｆｆ分類によって分類し、グラフト内Ｃ４ｄ染色を行って、急性体液性拒絶反応を評価した。活動性尿路感染症（ＵＴＩ）又は他の感染症の症例では、生検は行わなかった。移植「傷害」は、その以前の定常状態ベースライン値からの血清クレアチニンの２０％超の増加、及び活性拒絶（ＡＲ）、境界拒絶（ＢＬ）、又は他の傷害（ＯＩ）（例えば、薬物毒性、ウイルス感染）のいずれかとして分類される関連する生検として定義された。活性拒絶反応は、最低でも以下の基準によって定義された：（１）間質性炎症（ｉ）スコア＞２若しくは血管変化（ｖ）スコア＞０を伴う尿細管炎（ｔ）スコア＞２のいずれかからなるＴ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）、（２）糸球体炎（ｇ）スコア＞０を伴う陽性ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）からなるＣ４ｄ陽性抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）、又はＣ４ｄ＝２を伴う原因不明の急性尿細管壊死／血栓性微小血管症（ＡＴＮ／ＴＭＡ）を伴う尿細管周囲毛細血管炎（ｐｔｃ）＞０若しくはｖ＞０、或いは（３）ｇ＋ｐｔｃ≧２である、及びＣ４ｄが０又は１のいずれかである原因不明のＡＴＮ／ＴＭＡを伴う陽性ＤＳＡからなるＣ４ｄ陰性ＡＢＭＲ。境界変化（ＢＬ）は、説明される原因（例えば、ポリオマウイルス関連腎症（ＰＶＡＮ）／感染性原因／ＡＴＮ）なしで、ｔ１＋ｉ０、又はｔ１＋ｉ１、又はｔ２＋ｉ０によって定義された。ＢＬ変化に使用される他の基準は、ｇ＞０及び／若しくはｐｔｃ＞０、又はＤＳＡを伴わないｖ＞０、又はＣ４ｄ若しくは陽性ＤＳＡ、又は非ゼロｇ又はｐｔｃスコアを伴わない陽性Ｃ４ｄであった。正常（ＳＴＡ）同種移植片は、Ｂａｎｆｆスキーマによって定義されるような顕著な損傷病理の不在によって定義された。
実施例２
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
実施例１に記載のワークフローが、図１に示されるように、無細胞ＤＮＡの抽出の前に血漿サンプルに１６０ｂｐのトレーサーＤＮＡを添加することによって修正される。このトレーサーＤＮＡの構造は、ＳＮＰ ｒｓ３０３９３５及びｒｓ７４７２０５０６に由来する、図４の設計１に示されている。ＳＮＰ ｒｓ３０３９３５に基づくトレーサーＤＮＡの一部は、ＳＮＰ遺伝子座（ＧＣＭ）を含む３ヌクレオチド内因性配列を９ヌクレオチドバーコード（ＣＧＴＴＡＧＧＡＴ）で置き換えるように修正される。ｍｍＰＣＲ標的濃縮ステップの間、ＳＮＰ ｒｓ３０３９３５を標的とするプライマー対もまた、トレーサーＤＮＡを増幅する。サンプル中の全ｃｆＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡの配列リード数（バーコードによって識別可能）、サンプルＤＮＡの配列リード数、及び血漿サンプルに添加されたトレーサーＤＮＡの既知の量を使用して推定される。
実施例３
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
実施例１に記載のワークフローが、図２に示されるように、無細胞ＤＮＡの抽出の前に血漿サンプルに２００ｂｐのトレーサーＤＮＡ、１６０ｂｐのトレーサーＤＮＡ、及び１２５ｂｐのトレーサーＤＮＡを添加することによって修正される。３つのトレーサーＤＮＡの構造は、それぞれＳＮＰ遺伝子座に由来する、図４の設計２に示されている。ＳＮＰ遺伝子座に基づくトレーサーＤＮＡの一部は、ＳＮＰ遺伝子座を含む内因性配列を、内因性配列の逆相補体に対応するバーコードで置き換えるように修飾される。ｍｍＰＣＲ標的濃縮ステップの間、ＳＮＰ遺伝子座を標的とするプライマー対もまた、トレーサーＤＮＡを増幅する。サンプル中の全ｃｆＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡの配列リード数（バーコードによって識別可能）、サンプルＤＮＡの配列リード数、及び血漿サンプルに添加されたトレーサーＤＮＡの既知の量を使用して推定される。３つのトレーサーＤＮＡは異なる長さを有するため、それらのＮＯＲを使用して、血漿サンプル中のｃｆＤＮＡのサイズ分布を推定することもできる。
実施例４
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
３つの方法を使用して、高いｃｆＤＮＡ外れ値をスクリーニングすることができるワークフローを評価した。これは、トレーサーメトリック、Ｋａｐａ ｑＰＣＲ、及びＬａｂＣｈｉｐである。トレーサーメトリック及びｑＰＣＲを、直交法としてＬａｂＣｈｉｐと比較した。３つの方法全てを血漿体積で除し、収率を測定した。
合計４５個の市販のＰｒｏｓｐｅｒａサンプルを、トレーサーメトリック、ｑＰＣＲ（３回）、及びＬａｂＣｈｉｐ（３回）によって定量した。定量法は、高ｃｆＤＮＡ濃度及び低ｃｆＤＮＡ濃度の両方で相関した。図９及び図１０に示されるように、トレーサーメトリック及びｑＰＣＲの両方は、Ｒ２＞０．９（Ｋａｐａ複製物内Ｒ２＝０．９３；ＬａｂＣｈｉｐ複製物内Ｒ２＝０．９４）を有する。図１１は、ＰｒｏｓｐｅｒａサンプルがＬＤＯＲ及びＨＤＯＲの両方で実行される場合の一貫したトレーサーメトリックＮＯＲを示す（Ｒ２＝０．９９）。トレーサーメトリックは、２つの間で非常に良好に相関しており、我々の処理において安定であることを示している。
図１３は、商業データの遡及的分析に基づくＰｒｏｓｐｅｒａトレーサーメトリック及びパノラマトレーサーメトリックのヒストグラムを示す。パノラマでは観測されていない高い外れ値がＰｒｏｓｐｅｒａに存在する。プロスペラサンプルの３％は、中央値の７倍超である（Ｐａｎｏサンプルの０．１％に対して）。図１４は、パノラマｃｆＤＮＡ定量及びパノラマトレーサーメトリックのヒストグラムを示す。パノラマトレーサーメトリック分布は、ハイエンド及びローエンドの両方の濃度分布を反映している。
図１５は、商業データの遡及的分析に基づく、９５個の個々のトレーサーのリード数（ＮＯＲ）を示す。９５個のトレーサーは全て、トレーサー当たり約～１５０個のデータポイントで同様のパフォーマンスを発揮する。外れ値は、個々のトレーサーにクラスター化されていない。図１６は、四半期で分割された１０個の個々のトレーサーのリード数（ＮＯＲ）を示し、トレーサー当たり約～３００個のデータポイントを有する。トレーサーメトリックの性能は、いくつかのロット間変動にもかかわらず、かなり安定している。
全体的に、本実施例は、トレーサーメトリックがｑＰＣＲと同様のパフォーマンスを発揮することを示す。トレーサーは、実装がかなり容易であり、履歴データを活用することができる。
実施例５
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
序論：腎移植拒絶反応のバイオマーカーであるドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）は、全ｃｆＤＮＡのパーセンテージとして報告される。様々な要因（感染、損傷、年齢、新生児、及び肥満）は、全ｃｆＤＮＡレベルに影響を及ぼす。我々は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡが拒絶評価のためにアッセイされた背景ｃｆＤＮＡが上昇した３つのケーススタディを提示する。
症例１：末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する７８歳の男性が腎移植を受けた。生検は、急性Ｔ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）を示すクレアチニンレベルの上昇により、＋６ヶ月（ｍ、記載されている全ての時点が移植日と相対的である）で行った。＋７ｍで、患者はＢＫウイルス血症の陽性を試験し、これを治療した。彼は、＋１４ｍで天然の腎臓の選択的腎摘出術のために入院し、治療されたヘルペス及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）食道炎の陽性を試験した。当時のｃｆＤＮＡ分析は、拒絶反応の陰性結果を示したが、バックグラウンドｃｆＤＮＡレベルは、１０，３２６任意単位（ＡＵ）／ｍＬ（約２１×中央ｃｆＤＮＡ）であった。その後の生検から、Ｂａｎｆｆの慢性的な活性細胞拒絶反応が確認された。
症例２：腎移植を受けたＥＳＲＤを有する６２歳の女性が、陰性結果として報告されたｃｆＤＮＡアッセイ＋３年を有した。しかしながら、バックグラウンドは、３，４６６ＡＵ／ｍＬ（約７×中央値）で上昇した。彼女は、ＢＫウイルス関連腎症及びＴＣＭＲを示す経皮的腎移植生検を受けた。
症例３：ＥＳＲＤを有する５３歳の女性が、ＡＢＯ不適合ドナーから腎臓移植を受けた。１ヶ月後、彼女はデング熱と診断され、その後急性同種移植片機能障害と診断された。＋６ｍでの生検は、活性抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）を示した。＋７ｍでのｃｆＤＮＡアッセイでは、陰性の結果が示されたが、バックグラウンドが上昇した（６３４４ＡＵ／ｍＬ、約１３×の中央値）。生検では、ＡＢＭＲの解消及び境界急性細胞拒絶反応が示された。
考察：３つの症例全てにおいて、活動性ウイルス感染症は、２つの症例において偽陰性の結果をもたらす全ｃｆＤＮＡの上昇を引き起こした可能性がある。ＣｆＤＮＡベースの拒絶アッセイは、特にウイルス感染症の患者において、全ｃｆＤＮＡのパーセンテージのみを報告することは不正確であり得る。ｄｄ－ｃｆＤＮＡ拒絶アッセイは、結果を報告する場合に、可変バックグラウンドの全ｃｆＤＮＡを考慮する必要がある。
実施例６
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
序論：移植レシピエントの血漿中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の増加した割合の検出は、免疫拒絶反応による移植片損傷を決定するためのメトリックとして使用されている。拒絶状態をモニタリングするアッセイは、拒絶反応を示すために１％超のカットオフを使用して、バックグラウンドｃｆＤＮＡのパーセンテージとしてｄｄ－ｃｆＤＮＡを報告し、臨床実用性試験において最大８９％の活性拒絶反応を検出するための感度を示している。しかしながら、バックグラウンドｃｆＤＮＡレベルは、様々な疾患状態において著しく変動し得、臨床及び治療関連因子の変化によって影響を受ける。これは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの割合に影響を及ぼし、誤った結果をもたらす可能性がある。バックグラウンドｃｆＤＮＡに関してｄｄ－ｃｆＤＮＡの定量を臨床的に解釈するために、我々は、様々な臨床的及び治療関連因子がｃｆＤＮＡレベルにどのように影響を及ぼし得るかを調査しようとした。
目的：様々な臨床因子及び治療関連因子が、バックグラウンドｃｆＤＮＡレベルにどのように影響を及ぼし得るかを調査すること。バックグラウンドｃｆＤＮＡレベルの上昇を臨床的に解釈する方法を理解し、バックグラウンドｃｆＤＮＡレベルの上昇がｄｄ－ｃｆＤＮＡ検出を用いた拒絶反応の検出にどのように影響するかを調査すること。
方法：ｃｆＤＮＡ量の定量は、次世代配列決定を使用して血漿サンプル上で行われ、全てのサンプルコホートについて以前に記載されている。ｃｆＤＮＡ量は、３つの異なるサンプルコホート：腎移植レシピエント（ｎ＝１１５３）、妊婦（ｎ＝２０，５１７）、早期がん患者（ｎ＝１，１２８）について遡及的に分析された。ＣｆＤＮＡ濃度と患者の体重、がんの種類、手術からの時間、及び治療状況との間の関連性の分析は、ｃｆＤＮＡレベルの絶対的又は間接的測定値（任意単位［ＡＵ］として報告）を用いて行われた。
結果：腎移植及び早期がん患者（不健康）における血漿ｃｆＤＮＡ分布は、妊婦（健康、図５）よりも劇的に上昇したバックグラウンドｃｆＤＮＡレベルを有する外れ値の割合が高いことを示している。バックグラウンドｃｆＤＮＡレベルの増加は、活性拒絶反応を生じる移植レシピエントにおいて観察されている。バックグラウンドｃｆＤＮＡのレベルの上昇は、患者の体重の増加と関連する（図６）。ｃｆＤＮＡの濃度は、能動的治療及び転移症例中に収集されたサンプルにおいて有意に増加した（図７）。手術などの重大な外傷は、血漿中のバックグラウンドｃｆＤＮＡのレベルの上昇につながり、術後最初の２週間以内で最も高い（図７；ｐ＜０．０００１）。我々の分析では、ｃｆＤＮＡのレベルと患者の性別、年齢、及びがんの種類との間に統計的に有意な関連は明らかにならなかった。全ｃｆＤＮＡ定量を用いたｄｄ－ｃｆＤＮＡの初期試験は、全ｃｆＤＮＡの上昇が７～２１×中央値から変動する３症例を特定した（図８）。
結論：バックグラウンドｃｆＤＮＡレベルは可変であり、患者の体重、医薬、最近の手術、体重、ウイルス感染、疾患の重症度、外科的傷害、及び医学的合併症を含む複数の要因によって影響され得る。腎移植患者のうち、バックグラウンドｃｆＤＮＡレベルの上昇は、臨床的又は無症候性拒絶反応を有する患者での、試験メトリックとしてｄｄ－ｃｆＤＮＡ割合を用いたアッセイにおいて、偽陰性結果をもたらし得る。我々のデータは、ウイルス感染を有する患者が、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイにおける不正確さにつながる可能性のある非常に高いバックグラウンドｃｆＤＮＡレベルを有し得ることを示している。Ｄｄ－ｃｆＤＮＡベースの腎移植拒絶アッセイは、結果を報告する場合、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの割合及びバックグラウンドｃｆＤＮＡレベルの両方を考慮すべきである。
実施例７
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
序論：腎移植レシピエントからの血液サンプル中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の存在は、移植拒絶のバイオマーカーとして利用することができる。拒絶反応、感染症、又は再発疾患に起因する元の同種移植片の失敗は再移植につながり、全腎移植患者の最大１０％で観察される。これらの症例において、移植された元の腎臓は、一般に、原位置に残される。一塩基多型（ＳＮＰ）ベースの大規模多重ＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ）試験（Ｐｒｏｓｐｅｒａ（商標））を使用してｄｄ－ｃｆＤＮＡを評価する迅速、正確、及び非侵襲的診断試験を利用して、同種移植片拒絶反応を検出することができる。再移植患者の間で、この試験は、新たに移植された腎臓及び以前に移植された腎臓の両方がｃｆＤＮＡを放出している場合、血漿中のドナー分率の両方を検出することができる。
目的：同種移植片が２つの遺伝的に異なるドナーから存在する腎臓再移植を有する患者からのサンプルにおける、ＳＮＰベースのｍｍＰＣＲ試験分析アルゴリズムの臨床パフォーマンスを提示すること。
材料及び方法：第２の移植患者のコホートから血漿サンプルを収集し、前述のように処理した。ＳＮＰベースのｍｍＰＣＲ試験アルゴリズムは、新たに移植された腎臓及び以前に移植された腎臓の両方が血漿中にｃｆＤＮＡを放出し得る場合、血漿中の全てのドナー分率を検出するように設計される。このアルゴリズムは、全てのドナー分率を合わせたものに起因するＤＮＡの全分率を推定する。
結果：本再移植アルゴリズムにより、第２の腎移植患者の臨床パフォーマンスを提示する。これまでの我々のデータセットでは、単一の同種移植レシピエントと比較して、ｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルに有意な差は観察されず、移植された初期腎臓からの限定的なｃｆＤＮＡ脱落を示唆していた。我々の結果は、腎臓再移植患者におけるｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルを分析及び定量するこのアッセイの能力を裏付けている。
結論：我々の結果は、このＳＮＰベースのｍｍＰＣＲ試験のパフォーマンスが、反復移植レシピエントにおいて維持されることを示している。再移植患者におけるｄｄ－ｃｆＤＮＡの非侵襲的評価を使用して、早期に移植された臓器の傷害又は拒絶反応の存在を検出し、抗拒絶反応療法の変更をめぐる医師の管理を容易化することができる。
実施例８
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の様式で実践され得ることを理解するであろう。
序論
腎同種移植片は、移植が患者の生存及び生活の質の実質的な改善をもたらす、末期腎臓病を有する患者にとって理想的な治療と考えられる。残念ながら、レシピエント媒介性同種移植片の損傷及び失敗は一般的であり、レシピエントの２０～２８％が移植維持段階（移植後３ヶ月以上）、ほとんどの場合２年以内に急性腎臓損傷（ＡＫＩ）を経験すると報告されている。更に、約３～５％の同種移植は、１年目を超えて年ごとに機能低下し、１０年間の移植消耗率は約５５％である。慢性免疫抑制は、同種移植レシピエントによって開始された炎症反応及び免疫応答に機能的に対抗する、移植拒絶反応を防止するのに役立つ主な治療戦略である。
腎同種移植片は、移植が患者の生存及び生活の質の実質的な改善をもたらす、末期腎臓病を有する患者にとって理想的な治療と考えられる。残念ながら、レシピエント媒介性同種移植片の損傷及び失敗は一般的であり、レシピエントの２０～２８％が移植維持段階（移植後３ヶ月以上）、ほとんどの場合２年以内に急性腎臓損傷（ＡＫＩ）を経験すると報告されている。更に、約３～５％の同種移植は、１年目を超えて年ごとに機能低下し、１０年間の移植消耗率は約５５％である。慢性免疫抑制は、同種移植レシピエントによって開始された炎症反応及び免疫応答に機能的に対抗する、移植拒絶反応を防止するのに役立つ主な治療戦略である。
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、腎移植レシピエントの治療及び管理に大きな課題をもたらした。慢性的な免疫抑制は、移植レシピエントをＣＯＶＩＤ－１９のより重篤な経過を発症する高いリスクにさらす可能性があり、ウイルス陽性の移植レシピエントは、健康な個体と比較してより低い生存転帰を有することが知られている。その結果、医師は典型的に、ＣＯＶＩＤ－１９患者の免疫抑制を低下させ、同種移植片拒絶反応のリスクを増加させる。更に、糖尿病、肥満、及び心疾患などの腎移植患者に一般的な併存疾患は、重篤なＣＯＶＩＤ－１９症状及び転帰不良の主要なリスク因子でもある。
これを複合すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２自体が、ウイルス誘発性多臓器不全、腎灌流低下、及びサイトカインストームに起因する急性腎障害／不全（ＡＫＩ／ＡＫＦ）を含む腎障害を引き起こすことが報告されている。腎障害はＣＯＶＩＤ－１９の重症度とともに増加し、ＡＫＩ／ＡＫＦは予後不良と関係がある。重度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染では、免疫抑制治療は、疾患の炎症段階中のサイトカインストーム及び結果的な腎臓損傷を軽減するのに役立ち得る。ウイルス感染腎移植患者をＡＫＩ／ＡＫＦの高リスク群及び低リスク群に層別化することは、免疫抑制剤の使用、用量、及びタイミングを含む患者の管理及び治療に関する医師の意思決定を支援することができる。
組織生検は、ＡＫＩ／ＡＫＦ及び腎移植拒絶反応を検証するための判断基準である。しかしながら、生検手順は、侵襲性が高く、コストが高く、したがって、腎臓の健康の日常的なモニタリングには実用的ではない。特にＣＯＶＩＤ－１９の時代において、ＡＫＩ／ＡＫＦを早期にかつ高精度に検出するために使用することができる改良されたバイオマーカーが大いに必要とされている。循環するドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）は、現在、ＡＫＩ／ＡＫＦを確実に、かつ高感度で検出することができる実証されたバイオマーカーである。ｄｄ－ｃｆＤＮＡは、血液中でのその循環のため、単純な血液検査を通じて非侵襲的かつ連続的に測定することができ、血清クレアチニンの測定よりも正確であると報告されている。現在の商業的試験では、概して、ｄｄ－ｃｆＤＮＡは全循環ｃｆＤＮＡの分率として報告される。
ここで、ＣＯＶＩＤ－１９を有する一連の入院腎臓同種移植レシピエントにおけるｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験の結果を提示し、経時的なｃｆＤＮＡの変化を検査する。
方法
患者及びサンプル。ＣＯＶＩＤ－１９と診断され、臨床治療の一環としてＰｒｏｓｐｅｒａ（商標）（Ｎａｔｅｒａ，Ｉｎｃ．）を用いて行われたｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験を受けた腎臓同種移植患者から採取した血液サンプルに対して、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験結果の遡及的分析を行った。患者は、感染直後に行われた初期ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験を受け、患者の部分集合は、ＣＯＶＩＤ－１９クリアランス後にフォローアップ試験を受けた。各患者の人口統計学的、臨床的、及び転帰データを収集し、分析前に匿名化した。
患者及びサンプル。ＣＯＶＩＤ－１９と診断され、臨床治療の一環としてＰｒｏｓｐｅｒａ（商標）（Ｎａｔｅｒａ，Ｉｎｃ．）を用いて行われたｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験を受けた腎臓同種移植患者から採取した血液サンプルに対して、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験結果の遡及的分析を行った。患者は、感染直後に行われた初期ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験を受け、患者の部分集合は、ＣＯＶＩＤ－１９クリアランス後にフォローアップ試験を受けた。各患者の人口統計学的、臨床的、及び転帰データを収集し、分析前に匿名化した。
１８歳未満、１つより多くの臓器を移植した、妊娠した、又は登録から２週間以内に輸血した個体は除外した。サンプルを一次解析に含めることは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイを実行するのに適切な血漿の利用可能性、及び臨床フォローアップの利用可能性に基づいていた。
ｍｍＰＣＲ ＮＧＳアッセイを使用したｄｄ－ｃｆＤＮＡの分析。血液サンプルを処理し、Ｎａｔｅｒａ，Ｉｎｃ．のＣＬＩＡ認定及びＣｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＣＡＰ）の認可を受けた研究所（（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）で分析した。研究所の試験は、１３，０００を超える一塩基多型を標的とする、大規模多重ＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ）を用いて行った。サンプル当たり１０００万～１１００万リードの平均を用いた配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００で迅速ランで行った。全ての患者について、全ｃｆＤＮＡレベル（中央値の倍数；ＭｏＭで分析）及びドナー由来ｃｆＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）分率（全ｃｆＤＮＡのパーセンテージとして分析）の両方を測定した。
生検サンプルは、Ｂａｎｆｆ ２０１７分類を使用して、それぞれの病理学者によって、各サイトでの標準的な診療に従って分析及びグレーディングされた。ＡＫＩは、１２時間超で血清クレアチニンレベル＞２．０×ベースライン又は尿出力＜０．５ｍｌ／ｋｇ／ｈとして定義された。ＣＯＶＩＤ－１９の診断及びその重症度は、世界保健機関（ＷＨＯ）が２０２０年２月に公表した臨床改善の順序尺度に基づいて分類した。
統計分析。全ｃｆＤＮＡレベル又はｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率のいずれかの差異を、対応のあるｔ検定を使用して、ＣＯＶＩＤ－１９症状の発症に最も近い試験とフォローアップ時点（ベースラインレベルのプロキシ）との間で評価した。ｃｆＤＮＡレベルの上昇がＡＫＩ又は腎補充療法（ＲＲＴ）のいずれに起因するかを決定するために、時間周期にわたって対応のあるｔ検定を行い、時間周期内比較のためにＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を行った。段階的回帰を使用して、ｃｆＤＮＡ測定値（全ｃｆＤＮＡ及びｄｄ－ｃｆＤＮＡの両方）の、ＣＯＶＩＤ－１９重症度スコア（線形）及び死亡率（ロジスティック回帰）との関連性を調査した。全ｃｆＤＮＡレベル及びｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率に加え、これらのモデルに含まれる潜在的な予測因子変数は、年齢、ドナータイプ、及びＡＫＩであった。ドナーの種類及びＡＫＩを、バイナリ変数として入力した。全ｃｆＤＮＡ、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ及び年齢を、連続変数としてモデルに入力した。変数を入力し、それぞれＰ≦０．１０及びＰ＜０．１５でモデルで保持した。ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）及びベースラインのクレアチニンは、分析に含めることが検討されたが、全てのモデルにおいて推定不可能であった。
結果
臨床的特徴及び転帰。合計２９名の腎移植患者がＣＯＶＩＤ－１９を呈した。これらの患者のうち６名は他の理由（２名は腎移植手術のため）で入院し、院内でＣＯＶＩＤ－１９に感染した。１名の患者は、ＣＯＶＩＤ－１９症状の発症の２週間前に腎移植を受けた。コホートの中央値年齢は５８歳（範囲：２１～７３歳）であり、移植からＣＯＶＩＤ－１９発症までの期間の中央値は７８１日（範囲：６～６６９４）であった。コホートは、主に男性（６２．１％）、白人（４１．４％）であり、同種移植片は死亡したドナー（７９．３％）から受け取った。
臨床的特徴及び転帰。合計２９名の腎移植患者がＣＯＶＩＤ－１９を呈した。これらの患者のうち６名は他の理由（２名は腎移植手術のため）で入院し、院内でＣＯＶＩＤ－１９に感染した。１名の患者は、ＣＯＶＩＤ－１９症状の発症の２週間前に腎移植を受けた。コホートの中央値年齢は５８歳（範囲：２１～７３歳）であり、移植からＣＯＶＩＤ－１９発症までの期間の中央値は７８１日（範囲：６～６６９４）であった。コホートは、主に男性（６２．１％）、白人（４１．４％）であり、同種移植片は死亡したドナー（７９．３％）から受け取った。
症状の発症から入院までの期間の中央値は６日間であり、ＣＯＶＩＤ－１９症状の最も初期の発症は入院の１７日前、最も遅いものは入院の１３日後であった。
ＡＫＩは１９名（６５．５％）で診断された。ＲＲＴを必要とした１０名（３４．４％）の患者のうち、１名はＡＫＩの兆しがなく、３名は腎移植後の移植片機能（ＤＧＦ）の遅延により、ＣＯＶＩＤ－１９診断前にＲＲＴで開始された。ＡＫＩを有する５人の個体に対して生検を行い、これらの患者のうちの２人で急性細胞拒絶反応を確認し、それにもかかわらず可能性のある急性拒絶反応のために治療された１人の個体では結論の出ない所見を確認した。１名の患者がグラフトの生着不全を経験したが、拒絶反応の兆候はなかった。１２名（４１％）が人工換気を必要とし、その後、これらの患者のうち７名が死亡した。症状の発症から死亡までの期間の中央値は２９日であった（範囲：２０～５３日）。
患者管理。ＣＯＶＩＤ－１９診断の時点で、コホートの中で最も一般的な維持免疫抑制剤には、２６／２９（９０％）患者に対するマイコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、マイコフェノール酸（Ｍｙｆｏｒｔｉｃ）、又はマイコフェノール酸ナトリウム（ＭＰＳ）、２３／２９（７９％）患者に対するタクロリムス又はエンバルス（タクロリムス徐放）、及び２１／２９（７２％）患者に対するプレドニゾンが含まれた。コホート間のあまり一般的でない治療には、維持ベラタセプト（１／２９）、シロリムス（１／２９）、アザチオプリン（２／２９）、及びシクロスポリンＡ（４／２９）が含まれた。大部分の患者において、免疫抑制の主な変化は、ＭＭＦ／ＭＰＳ／Ｍｙｆｏｒｔｉｃの減少又は中止、及びステロイド治療（プレドニゾン又はヒドロコルチゾン）の開始であった。ＣＯＶＩＤ－１９の治療のために、４名の患者はレムデシビル及び／又はデキサメタゾンを投与され、５名は回復期血漿を投与された。１名の患者はヒドロキシクロロキンで治療した。
ＣＯＶＩＤ－１９発症時の全無細胞ＤＮＡレベルの上昇。入院後、全ての患者は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験を用いて同種移植片拒絶反応をモニタリングした。これらの患者について、ＣＯＶＩＤ－１９症状の発現から最初のｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験のリーディングまでの中央値は、１４日（範囲：５～７２）であり、これらの試験のうち２５回（８６％）が３０日以内に行われた。２９名の患者のうち１５人（５１．７％）は、ＣＯＶＩＤ－１９症状が落ち着いた後に、第２のフォローアップｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験を受け、その期間の中央値は、採血間の７１日（範囲：２７～１１２）であり、ＣＯＶＩＤ－１９の発症からの期間の中央値は９０日であった（範囲：６４～１２９）。ＣＯＶＩＤ－１９の発症から行われた各ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験までの日数での時間の計算（ｎ＝４４）は、２つの試験期間の間の最小限の重複を示した。これらの期間と各試験の全ｃｆＤＮＡ値との比較により、ＣＯＶＩＤ－１９の発症に最も近い採血に存在する全ｃｆＤＮＡレベルの上昇が明らかになった（図１８Ａ）。更なる解析により、初期全ｃｆＤＮＡリーディングの２１／２９（７２．４％）は、≧４ＭｏＭであり、１４（４８％）は、≧８ＭｏＭであることが明らかとなり、フォローアップ時点からの１回のリーディングは、４ＭｏＭを上回って上昇した。
全ｃｆＤＮＡレベルの中央値は、初期試験（７．９ＭｏＭ；ｎ＝２９）において、フォローアップ試験（１．０１ＭｏＭ；ｎ＝１５；図１８Ｂ）と比較して、ＣＯＶＩＤ－１９症状の発症に最も近い時期に生じた。２つの試験を行った１５名の患者について、１回目の時点でのリーディングは、フォローアップ時点（中央値＝１．０１ＭｏＭ）と比較して有意に高かった（中央値＝６．２ＭｏＭ；ｐ＝０．０００９）。更に、全ｃｆＤＮＡレベルは、１個体を除く全ての個体について、第１の時点と第２の時点との間で低下した。
初期試験の結果のうち、第１のｃｆＤＮＡ測定前にＲＲＴを受けた患者（ｎ＝７）は、有意に高い全ｃｆＤＮＡレベル（中央値：１７．８ＭｏＭ、範囲：６．８～５３．４）を有していた（ＲＲＴを受けなかった人（ｎ＝２１）と比較して（中央値：５．２ＭｏＭ、範囲：０．６～２９．２）（Ｐ＝０．０１））。全ｃｆＤＮＡレベルは、ＡＫＩを有する患者（中央値：７．９ＭｏＭ、範囲：０．６～５３．４；ｎ＝１９）及びＡＫＩを有さない患者（中央値：７．４ＭｏＭ、範囲：１．１～２９．２；ｎ＝１０）において同様であった（Ｐ＝０．９５）。ＲＲＴを受けなかった個体（ｎ＝１３；ｐ＝０．００３）、ＡＫＩを経験した個体（ｎ＝９；ｐ＝０．０１）、及びＡＫＩを経験しなかった個体（ｎ＝６；ｐ＝０．０６）について、初期時点とフォローアップ時点との間で、ｃｆＤＮＡレベルの低下の同様の傾向が観察された。
２９名の患者からの初回試験結果のｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率の中央値は０．１１％（範囲：０．０１％～１．５４％）であり、一方１５回のフォローアップ試験のｄｄ－ｃｆＤＮＡリーディングの中央値は０．３２％（範囲：０．０３％～０．９８％）であった。対応ありの試験結果を有する１５名の個体についてのｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率の比較は、２つの時点でのｄｄ－ｃｆＤＮＡリーディングに有意差はないことを示した（ｐ＝０．６７；図１８Ｃ）。
全ｃｆＤＮＡレベルの上昇は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験による拒絶反応の兆しを不明瞭にした。生検では、我々のコホートの２名の個体で急性細胞拒絶反応が示された。最初の時点からの試験は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率が０．２％及び０．４８であり、それに付随して全ｃｆＤＮＡレベルがそれぞれ７．９ＭｏＭ及び４１．８ＭｏＭであることを示した。最初の個体について、生検で確認された拒絶反応は、最初のｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験の１０日後に生じた。この患者は、全ｃｆＤＮＡレベルの０．６０ＭｏＭへの低下を経験し、拒絶反応の処置後、フォローアップ時点で０．４８％のｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率を伴った。第２の個体について、生検で確認された拒絶反応は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験の７２日後に生じた。この個体については、フォローアップのｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験は行われなかった。
全ｃｆＤＮＡレベルは、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度と関係がある。このコホートにおける臨床的ＣＯＶＩＤ－１９重症度スコアは、１～８のスケールで３（酸素療法なしでの入院を示す）～８（死亡率を示す）の範囲であり、中央スコアは５であった。段階的回帰は、全ｃｆＤＮＡレベルとＣＯＶＩＤ－１９重症度スコアとの間の有意な正の関連性を特定した（Ｐ＝０．０３；Ｒ２＝０．１９；図１９）。他の共変量は、モデルに含めるために必要なＰ≦０．１０の有意水準を達成しなかった。
ｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルの低下は、ＣＯＶＩＤ－１９による死亡の可能性と関係がある。段階的回帰分析は、死亡率の唯一の予測因子として、全ｃｆＤＮＡ及びｄｄ－ｃｆＤＮＡを選択した。これらの変数はいずれも、Ｐ＜０．０５レベルで統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．０８、全ｃｆＤＮＡ及びｄｄ－ｃｆＤＮＡの両方）。死亡の確率は、全ｃｆＤＮＡレベルの増加とともに増加した（図２０）。対照的に、死亡の確率は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率が減少するにつれて増加したが、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ値が０．２５％未満の場合のみ増加した。０．２５％を超えると、死亡の確率は０であると推定された（図２１）。
考察
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、腎同種移植片を有する患者にとって特に危険である。第一に、ＡＫＩと強く相関することが示されており、第二に、免疫抑制は、典型的には、ウイルスに対する免疫応答を可能にするために感染中に漸減され、拒絶反応のリスクを増加させる。ｃｆＤＮＡは、同種移植片傷害及び拒絶反応のリスクをモニタリングするための新興の非侵襲性マーカーである。ここで、我々は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する２９名の入院腎同種移植患者における全ｃｆＤＮＡレベル及びｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率を分析した。患者の部分集合をフォローアップし、初回試験から約２ヶ月後のｄｄ－ｃｆＤＮＡ及び全ｃｆＤＮＡレベルの変化を追跡した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、腎同種移植片を有する患者にとって特に危険である。第一に、ＡＫＩと強く相関することが示されており、第二に、免疫抑制は、典型的には、ウイルスに対する免疫応答を可能にするために感染中に漸減され、拒絶反応のリスクを増加させる。ｃｆＤＮＡは、同種移植片傷害及び拒絶反応のリスクをモニタリングするための新興の非侵襲性マーカーである。ここで、我々は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する２９名の入院腎同種移植患者における全ｃｆＤＮＡレベル及びｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率を分析した。患者の部分集合をフォローアップし、初回試験から約２ヶ月後のｄｄ－ｃｆＤＮＡ及び全ｃｆＤＮＡレベルの変化を追跡した。
全ｃｆＤＮＡレベルは、ＣＯＶＩＤ－１９の発症に近い最初の試験の時点で、患者において高度に上昇していた。このコホートでは、初期試験からの全ｃｆＤＮＡリーディングの７５％及び４８％が、日常的なケアの間にｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験を受けた未選択の腎移植レシピエントのコホートにおけるそれぞれ４．８％及び１．２％と比較して、４及び８ＭｏＭを超えて上昇した。これは、全ｃｆＤＮＡとウイルス感染との間の相関関係を示す文献と一致する。また、患者がＣＯＶＩＤ－１９から回復したと予測された後、フォローアップ時点での１回のリーディング（６．７％）≧４ＭｏＭのみで、全ｃｆＤＮＡレベルの有意な低下が観察された。更に、２つの試験を行った１５名の患者のうちの１４名は、時点間の全ｃｆＤＮＡレベルの低下を経験した。この傾向は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する単一の腎移植レシピエントが、感染中に全ｃｆＤＮＡレベルが５７ＭｏＭに上昇し、感染のクリアランス中に１ヶ月半にわたってレベルが２．９ＭｏＭに低下したという最近のケーススタディに一致する。
このコホートにおいて、全ｃｆＤＮＡレベルの上昇を有するサンプルの大部分は、ＣＯＶＩＤ－１９症状の発症から３２日以内に抽出された。報告によると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性の中央持続期間は、一般集団において約２０日であり、５３日まで持続し得ることが示されている。感染は、免疫不全患者及び臓器移植患者、並びに重症患者において有意に長く持続することが観察されており、患者のおよそ６０％が３０日以内にウイルスを排除する。フォローアップ時点での全ての検査は、ＣＯＶＩＤ－１９の発症から６０日後超で発生した。したがって、これらのデータは、症状発症から３２日以内に見られたｃｆＤＮＡレベルの上昇が、活性型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって引き起こされたという仮説を裏付けている。
我々の分析はまた、全ｃｆＤＮＡレベルとＣＯＶＩＤ－１９重症度との間の有意な相関関係を実証し、入院患者におけるｃｆＤＮＡ濃度とＷＨＯの臨床進行スコアとの間の関連性を同様に特定した別の研究を裏付けた。また、症状の重症度のピーク時に測定された初期全ｃｆＤＮＡレベルは、ＲＲＴを必要とする、又は必要としない個体、及びＡＫＩを有する、及び有さない患者を含む、照会された個体の全てのサブセットにおいて高かったことも見出された。研究では、血液透析などのＲＲＴがｃｆＤＮＡの上昇に関与しているが、我々の所見は、ＲＲＴが観察された変化を完全に説明できないことを示唆している。加えて、我々の分析では、ＡＫＩを有する個体と有さない個体との間のｃｆＤＮＡレベルの差は有意ではなく、この変数がまた、全ｃｆＤＮＡレベルの上昇を説明しなかったことを示している。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が、我々が観察した初期のｃｆＤＮＡレベルの上昇に実質的に寄与したという更なる証拠を提供する。
全ｃｆＤＮＡレベルとは対照的に、我々は、患者がＣＯＶＩＤ－１９症状を経験していた最初の時点で、ｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルの上昇を観察しなかった。全ｃｆＤＮＡレベルの上昇は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの割合を低下させると予測されるため、これは不思議ではない。実際、同種移植片傷害／拒絶反応の適応のための１％の閾値を超えるｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルを有する患者は、臨床的に安定した患者において典型的に約１０％の検出率を有する臨床コホート、及び拒絶反応の臨床的疑いを有する患者において約２５％である臨床コホートと比較して、１人のみであった（３．４％）。
我々のコホートの２名の個体は、生検によって活性拒絶反応を有することが見出された。これらの個体の両方は、最初の時点で全ｃｆＤＮＡ及びｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルが１％未満上昇しており、これらの場合において、全ｃｆＤＮＡの上昇がｄｄ－ｃｆＤＮＡの結果を複雑化した可能性があることを示唆している。両方の患者について、ｃｆＤＮＡレベルの上昇をもたらす試験は、ＣＯＶＩＤ－１９の発症から１１日後及び１２日後に生じたため、これらの試験の時点で活発に感染した可能性が高い。他の研究は、全レベルの分率としてｄｄ－ｃｆＤＮＡを表すことは、同種移植片から放出されるｄｄ－ｃｆＤＮＡの量の微妙であるが重要な変化を隠す可能性があるため、絶対ｄｄ－ｃｆＤＮＡ濃度の定量は、同種移植片拒絶反応を評価する上でより価値のあるマーカーであったことを示唆している。したがって、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対濃度を考慮することは、特にＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染を含む全ｃｆＤＮＡレベルが影響を受け得る条件下において、同種移植片拒絶反応のより良好な検出を提供し得る。
我々は、全ｃｆＤＮＡの上昇が入院腎移植患者におけるＣＯＶＩＤ－１９と関連しており、全ｃｆＤＮＡレベルがＣＯＶＩＤ－１９の重症度と相関していると結論付ける。更に、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験は、ＣＯＶＩＤ－１９の重症患者の同種移植片拒絶反応をモニタリングし、生検などのより侵襲的な手順の必要性を知らせるために、依然として有用な非侵襲的ツールである。ウイルス感染症を有し得る個体の管理において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率とともに、全ｃｆＤＮＡレベルを考慮することが重要である。
実施例９
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。
ＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染中に生じる全ｃｆＤＮＡの上昇（実施例５及び８を参照されたい）は、移植拒絶反応を示す唯一のカットオフ閾値としてのｄｄ－ｃｆＤＮＡの推定パーセンテージに依存するｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイにおいて偽陰性をもたらし得る。血漿サンプル中の高い全ｃｆＤＮＡの存在下で、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイの感度及び正確さを改善し、偽陰性を低減するために、絶対ドナー由来ＤＮＡ濃度に比例する追加のカットオフ閾値ＡＤＤＤを追加した。追加のカットオフ閾値は、ＡＤＤＤ＝推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％×（全サンプル配列リード／トレーサー配列リード／血漿体積）として計算することができる。
ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％及びＡＤＤＤの両方を適用して、活性ウイルス感染を患っている腎移植レシピエントからの血漿サンプルを分析した。推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％のみに依存する（例えば、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ＞１％である場合に拒絶反応を呼び出す）と比較して、上記の追加のカットオフ閾値（例えば、推定ｄｄ－ｃｆＤＮＡ＞１％又はＡＤＤＤ＞６．９ｍｌである場合に拒絶反応を呼び指す）を組み込むことは、偽陰性を有意に低減し、ｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイの感度及び正確さを向上させた。
実施例１０
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。この実施例は、ドナー分率及び絶対ｄｄ－ｃｆＤＮＡを組み合わせたアルゴリズムを使用した、腎移植患者における拒絶反応の検出を実証する。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。この実施例は、ドナー分率及び絶対ｄｄ－ｃｆＤＮＡを組み合わせたアルゴリズムを使用した、腎移植患者における拒絶反応の検出を実証する。
腎臓同種移植患者の血漿中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）は、同種移植傷害及び拒絶反応に関する臨床的に検証されたバイオマーカーである。いくつかのｄｄ－ｃｆＤＮＡアッセイは、１％超のｄｄ－ｃｆＤＮＡが活性拒絶反応（ＡＲ）の高いリスクに関連することを示している。更なる研究は、宿主由来のｃｆＤＮＡ成分に起因してｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率に生じる変動を回避するために、絶対ｄｄ－ｃｆＤＮＡ濃度を測定することの利点を示している。本明細書では、血漿中のｄｄ－ｃｆＤＮＡドナー分率及びｄｄ－ｃｆＤＮＡ（ＡＤＤ－ｃｆＤＮＡ）の絶対量の両方を組み合わせた新しいアルゴリズムからの結果を提示しており、その結果を以前のアルゴリズムと比較した。
４０個の血漿サンプルを、日常的な臨床ケアの一部として腎移植レシピエントから採取した。マッチした生検サンプルを入手し（入手可能な場合）、ａ）ＴＣＭＲ及び／又はＡＢＭＲ拒絶反応を伴うＡＲ、並びにｂ）臨床的に安定として定義した。２閾値アルゴリズムのパフォーマンスは、以前の検証ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率カットオフ（≧１％）及びＡＤＤ－ｃｆＤＮＡ（＞７．０）に基づく第２のカットオフを使用して推定した（図２２）。１％のｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率又は新しいＡＤＤ－ｃｆＤＮＡカットオフのいずれかを超えたサンプルは、拒絶反応の高いリスクとみなされた。更新されたアルゴリズムのパフォーマンスを、１％ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率閾値を単独で使用した以前のアルゴリズムと比較した。
６名の患者はＴＣＭＲ（２×ＩＡ、２×ＩＢ、１×ＩＩＢ）を有し、１名はＡＢＭＲを有し、２名は混合拒絶反応を有した。図２３に示すように、更新されたアルゴリズムは、特異性を損なうことなく（９０．３％；２８／３１）、１％ｄｄ－ｃｆＤＮＡ閾値、７／９（７７．８％）を有する以前のアルゴリズムと比較して、９／９（１００％）の観察された感度で、改善されたパフォーマンスを示した。結論として、宿主由来ｃｆＤＮＡは、いくつかの生理学的因子及び病理学的因子に影響され得、これは、報告されるｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率に影響を及ぼし得、試験の正確さを潜在的に低下させる可能性がある。ｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対量をｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率とともに組み込んだアルゴリズムは、特異性に影響を与えることなく、腎同種移植患者における拒絶反応の検出における感度を増加させるため、臨床的に有意義である。
実施例１１
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。この実施例は、ドナー分率及び絶対ｄｄ－ｃｆＤＮＡを組み合わせたアルゴリズムを使用した、腎移植患者における拒絶反応の検出を実証する。
この実施例は例示に過ぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。この実施例は、ドナー分率及び絶対ｄｄ－ｃｆＤＮＡを組み合わせたアルゴリズムを使用した、腎移植患者における拒絶反応の検出を実証する。
腎臓同種移植患者の血漿中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）は、同種移植傷害及び拒絶反応に関する臨床的に検証されたバイオマーカーである。いくつかの研究は、≧１％のｄｄ－ｃｆＤＮＡが活性拒絶反応（ＡＲ）の高いリスクに関連することを示している。他の研究は、宿主由来のｃｆＤＮＡ成分の変動に起因するｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率の変化を回避するために、絶対ｄｄ－ｃｆＤＮＡ濃度を測定する利点を報告した。本明細書では、血漿中のｄｄ－ｃｆＤＮＡドナー分率及びｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対濃度の両方を組み合わせた新しい２閾値アルゴリズムからの結果を提示し、結果を以前のアルゴリズムと比較する。
４１個の血漿サンプルを、日常的な臨床ケアの一部として腎移植レシピエントから採取した。マッチした生検サンプルを入手し（入手可能な場合）、ａ）ＴＣＭＲ及び／又はＡＢＭＲ拒絶反応を伴うＡＲ、並びにｂ）臨床的に安定として定義した。２閾値アルゴリズムのパフォーマンスは、以前に検証されたｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率カットオフ（≧１％）及びｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対濃度（≧７８コピー／ｍＬ）に基づく第２のカットオフを使用して推定した（図２４）。１％のｄｄ－ｃｆＤＮＡ又は新しい７８ｃｐ／ｍＬのｄｄ－ｃｆＤＮＡカットオフのいずれかを超えたサンプルは、拒絶反応の高リスクとみなされた。更新されたアルゴリズムのパフォーマンスを、１％ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率閾値を単独で使用した以前のアルゴリズムと比較した。
５名の患者はＴＣＭＲ（２×ＩＡ、２×ＩＢ、１×ＩＩＡ）を有し、１名はＡＢＭＲを有し、３名は混合拒絶反応を有した。２閾値アルゴリズムの感度は、以前のアルゴリズム（１％のｄｄ－ｃｆＤＮＡ閾値）での７／９（７７．８％）と比較して、９／９（１００％）であった。更新されたアルゴリズム及び以前のアルゴリズムの特異性は、それぞれ２８／３２（８７．５％）及び２９／３２（９０．６％）であった（図２５）。結論として、宿主由来ｃｆＤＮＡは、ＣＯＶＩＤ－１９を含むいくつかの生理学的因子及び病理学的因子に影響され得、これは、報告されるｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率に影響を及ぼし得、試験の正確さを潜在的に低下させる可能性がある。ｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対濃度をｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率とともに組み込んだアルゴリズムは、腎同種移植患者における拒絶反応の検出における感度を増加させるため、臨床的に有意義である。
Claims (67)
- 方法又は実験技法であって、
ａ）生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、前記無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、
ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での前記単離された無細胞ＤＮＡの標的増幅を行うことと、
ｃ）高スループット配列決定によって増幅産物を配列決定して、１つ以上の配列決定リードを生成することと、
ｄ）前記第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む、方法又は実験技法。 - 方法又は実験技法であって、
ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、前記単離された無細胞ＤＮＡは、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、前記無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、
ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での前記単離された無細胞ＤＮＡの標的増幅を行うことと、
ｃ）高スループット配列決定によって増幅産物を配列決定して、１つ以上の配列決定リードを生成することと、
ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することであって、前記第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して、全無細胞ＤＮＡの量が定量される、定量することと、を含む、方法又は実験技法。 - 前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を使用して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定することを更に含む、請求項２に記載の方法。
- 前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量をカットオフ閾値と比較して、前記移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定し、前記カットオフ閾値を前記全無細胞ＤＮＡの量に従って決定する、請求項３に記載の方法。
- 前記カットオフ閾値が、前記ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数の関数である、請求項４に記載の方法。
- 前記全無細胞ＤＮＡの量が所定の範囲外である場合、前記サンプルにフラグを立てることを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 血漿抽出の前に、前記第１のトレーサーＤＮＡ組成物を全血サンプルに添加することを更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 血漿抽出の後及び前記無細胞ＤＮＡの単離の前に、前記第１のトレーサーＤＮＡ組成物を血漿サンプルに添加することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離された無細胞ＤＮＡを含む組成物に、前記第１のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離された無細胞ＤＮＡにアダプターを連結して、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物を得ることと、前記アダプター連結ＤＮＡを含む組成物に、前記第１のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することと、を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 標的増幅の前に、第２のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 標的増幅の後に、第２のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、異なる配列を有する複数のＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、異なる濃度を有する複数のＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、異なる長さを有する複数のＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、非ヒト起源の配列を有する複数のＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、非ヒト起源の複数のＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、人工配列を有する複数のＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 異なる長さを有する前記複数のＤＮＡ分子を使用して、前記サンプル中の前記無細胞ＤＮＡのサイズ分布を決定する、請求項１５に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物がそれぞれ標的配列を含み、前記標的配列は、前記プライマー対のうちの１つに結合可能なプライマー結合部位の対の間に位置するバーコードを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バーコードが、同じプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノムＤＮＡ配列の逆相補体を含む、請求項２０に記載の方法。
- 前記トレーサーＤＮＡのリード数とサンプルＤＮＡのリード数との間の比率が、全無細胞ＤＮＡの量を定量するために使用される、請求項２０又は２１に記載の方法。
- 前記バーコードのリード数と前記対応する内因性ゲノムＤＮＡ配列のリード数との間の比率が、全無細胞ＤＮＡの量を定量するために使用される、請求項２０又は２１に記載の方法。
- 前記標的配列に、内因性ゲノムＤＮＡ配列が片側又は両側で隣接している、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、２５０～５００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、１００～２５０ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、１２５～２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物が、約１６０ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的増幅が、単一反応体積において少なくとも１００個のＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的増幅が、単一反応体積において少なくとも１，０００個のＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的増幅が、単一反応体積において少なくとも１０，０００個のＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 各プライマー対が、約３５～２００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 各プライマー対が、約５０～１００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 各プライマー対が、約６０～７５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植レシピエントが、ヒト対象である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植が、臓器移植、組織移植、又は細胞移植である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植が、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、心臓／肺移植、胃移植、精巣移植、陰茎移植、卵巣移植、子宮移植、胸腺移植、顔面移植、手移植、脚移植、骨移植、骨髄移植、角膜移植、皮膚移植、膵島細胞移植、心臓弁移植、血管移植、又は血液輸血である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植拒絶反応を、抗体媒介性移植拒絶反応、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応、移植片傷害、ウイルス感染、細菌感染、又は境界線拒絶反応として決定することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- １つ以上のがんの可能性を定量することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 任意の可能性のあるがんの特定の治療に対する感受性を定量することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
- ウイルス感染の可能性を決定することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌感染の可能性を決定することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 傷害に起因する炎症の可能性を決定することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体サンプルが、血液、血漿、血清、固形組織、又は尿サンプルである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植レシピエントから複数の生体サンプルを長期的に収集することと、収集した各サンプルについてステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すこととを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離された無細胞ＤＮＡは、第１のドナーに由来するドナー由来無細胞ＤＮＡ、第２のドナーに由来するドナー由来無細胞ＤＮＡ、及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 生体サンプル中の無細胞ＤＮＡを定量するためにトレーサーＤＮＡを利用する方法であって、
ａ）前記生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、前記無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、
ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での前記無細胞ＤＮＡの標的増幅を行うことと、
ｃ）高スループット配列決定によって増幅産物を配列決定して、１つ以上の配列決定リードを生成することと、
ｄ）前記第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する前記配列決定リードを使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む、方法。 - 方法又は実験技法であって、
ａ）移植レシピエントの生体サンプルから無細胞ＤＮＡを単離することであって、前記単離された無細胞ＤＮＡは、第１のドナーに由来するドナー由来無細胞ＤＮＡ、第２のドナーに由来するドナー由来無細胞ＤＮＡ、及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、単離することと、
ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での前記無細胞ＤＮＡの標的増幅を行うことと、
ｃ）高スループット配列決定によって増幅産物を配列決定して、１つ以上の配列決定リードを生成することと、
ｄ）全ドナー由来無細胞ＤＮＡの量、第１のドナーからのドナー由来無細胞ＤＮＡの量、及び／又は第２のドナーからのドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む、方法又は実験技法。 - 前記移植レシピエントが、上昇した量のバックグラウンド無細胞ＤＮＡを有する、請求項３に記載の方法。
- 上昇した量の全無細胞ＤＮＡが、活性ウイルス感染によって引き起こされる、請求項５１に記載の方法。
- ウイルス感染が、ＣＯＶＩＤ－１９である、請求項５２に記載の方法。
- 第１のカットオフ閾値及び第２のカットオフ閾値を使用して、移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定することを含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のカットオフ閾値が、全無細胞ＤＮＡのうちドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージである、請求項５４に記載の方法。
- 前記第２のカットオフ閾値が、絶対ドナー由来無細胞ＤＮＡ濃度に比例する、請求項５４に記載の方法。
- 前記第２のカットオフ閾値が、前記第１のカットオフ閾値に定量値を乗算することによって計算され、前記定量値は、全無細胞ＤＮＡのリード数を血漿量当たりのトレーサーＤＮＡのリード数で除算することによって計算される、請求項５４に記載の方法。
- 前記第１のカットオフ閾値が、全無細胞ＤＮＡのうちドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージであり、前記第２のカットオフ閾値が、前記第１のカットオフ閾値に定量値を乗算することによって計算され、前記定量値は、全無細胞ＤＮＡのリード数を血漿量当たりのトレーサーＤＮＡのリード数で除算することによって計算される、請求項５４に記載の方法。
- 前記第１のカットオフ閾値が、全無細胞ＤＮＡのうちドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージであり、前記第２のカットオフ閾値が、ドナー由来無細胞ＤＮＡの濃度である、請求項５４に記載の方法。
- 前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量が前記第１のカットオフ閾値又は前記第２のカットオフ閾値を超える場合、前記移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を呼び出すことを含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。
- カットオフ閾値を使用して移植拒絶反応の発生又は可能性のある発生を決定することを含み、前記カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量の関数であるか、又は、前記カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数及び全無細胞ＤＮＡのリード数の関数である、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
- ドナー由来無細胞ＤＮＡの推定パーセンテージが、臓器不全の可能性を決定するために、前記全無細胞ＤＮＡ濃度の測定値と組み合わせて使用される、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
- 絶対ドナー由来無細胞ＤＮＡ濃度又はその関数が、臓器不全の可能性を決定するために、前記全無細胞ＤＮＡ濃度の測定と組み合わせて使用される、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
- ＤＮＡを増幅及び配列決定するための方法であって、
（ａ）移植レシピエントの血液サンプルからＤＮＡを抽出することであって、前記ＤＮＡは、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
（ｂ）５００～５０，０００個のプライマー対を使用して、単一反応体積における５００～５０，０００個の標的遺伝子座での標的増幅を行い、アンプリコンを得ることと、
（ｃ）高スループット配列決定によって前記アンプリコンを配列決定することと、
（ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの絶対量及び全無細胞ＤＮＡのうちドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを定量することと、を含み、（ｉ）第１の閾値を超える前記ドナー由来無細胞ＤＮＡ若しくはその関数のパーセンテージ、及び／又は（ｉｉ）第２の閾値を超える前記ドナー由来無細胞ＤＮＡ若しくはその関数の絶対量が、移植拒絶反応を示す、方法。 - ＤＮＡを増幅及び配列決定するための方法であって、
（ａ）腎臓移植レシピエントの血液サンプルからＤＮＡを抽出することであって、前記ＤＮＡは、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
（ｂ）５００～５０，０００個のプライマー対を使用して、単一反応体積における５００～５０，０００個の標的遺伝子座での標的増幅を行い、アンプリコンを得ることと、
（ｃ）高スループット配列決定によって前記アンプリコンを配列決定することと、
（ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの絶対量及び全無細胞ＤＮＡのうちドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを定量することと、を含み、（ｉ）１％を超える前記ドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージ、及び／又は（ｉｉ）７８コピー／ｍｌを超えるドナー由来無細胞ＤＮＡの濃度が、腎臓移植拒絶反応を示す、方法。 - ＤＮＡを増幅及び配列決定するための方法であって、
（ａ）腎臓移植レシピエントの血液サンプルからＤＮＡを抽出することであって、前記ＤＮＡは、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
（ｂ）５００～５０，０００個のプライマー対を使用して、単一反応体積における５００～５０，０００個の標的遺伝子座での標的増幅を行い、アンプリコンを得ることと、
（ｃ）高スループット配列決定によって前記アンプリコンを配列決定することと、
（ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの絶対量及び全無細胞ＤＮＡのうちドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを定量することと、を含み、（ｉ）１％を超える前記ドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージ及び／又は（ｉｉ）７．０を超える前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの絶対量の関数が、腎移植拒絶反応を示し、前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの絶対量の前記関数は、前記ドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージに、血漿量当たりのトレーサーＤＮＡのリード数で除算した全無細胞ＤＮＡのリード数を乗算することによって計算される、方法。 - 前記移植が非ヒト動物由来であり、好ましくは、前記移植がブタ移植である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063031879P | 2020-05-29 | 2020-05-29 | |
| US63/031,879 | 2020-05-29 | ||
| US202163155717P | 2021-03-02 | 2021-03-02 | |
| US63/155,717 | 2021-03-02 | ||
| US202163186735P | 2021-05-10 | 2021-05-10 | |
| US63/186,735 | 2021-05-10 | ||
| PCT/US2021/034561 WO2021243045A1 (en) | 2020-05-29 | 2021-05-27 | Methods for detection of donor-derived cell-free dna |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023528777A true JP2023528777A (ja) | 2023-07-06 |
Family
ID=76601743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022572339A Pending JP2023528777A (ja) | 2020-05-29 | 2021-05-27 | ドナー由来無細胞ｄｎａの検出方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230203573A1 (ja) |
| EP (1) | EP4158060A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023528777A (ja) |
| CN (1) | CN115917001A (ja) |
| AU (1) | AU2021280311A1 (ja) |
| CA (1) | CA3180334A1 (ja) |
| WO (1) | WO2021243045A1 (ja) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| EP2572003A4 (en) | 2010-05-18 | 2016-01-13 | Natera Inc | METHOD FOR NONINVASIVE PRANATAL PLOIDIE ASSIGNMENT |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| BR112013020220B1 (pt) | 2011-02-09 | 2020-03-17 | Natera, Inc. | Método para determinar o estado de ploidia de um cromossomo em um feto em gestação |
| US20140100126A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-04-10 | Natera, Inc. | Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data |
| AU2015249846B2 (en) | 2014-04-21 | 2021-07-22 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| EP4428863A2 (en) | 2015-05-11 | 2024-09-11 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| WO2019118926A1 (en) | 2017-12-14 | 2019-06-20 | Tai Diagnostics, Inc. | Assessing graft suitability for transplantation |
| EP3781714A1 (en) | 2018-04-14 | 2021-02-24 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna |
| US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| EP4127214A4 (en) * | 2020-03-27 | 2024-05-29 | Chronix Biomedical | METHODS FOR PRECISE AND BIAS-FREE QUANTIFICATION OF CELL-FREE DNA |
| JP2024507536A (ja) * | 2021-02-25 | 2024-02-20 | ナテラ， インコーポレイテッド | 複数の臓器の移植レシピエントにおけるドナー由来無細胞ｄｎａの検出方法 |
| WO2023244735A2 (en) * | 2022-06-15 | 2023-12-21 | Natera, Inc. | Methods for determination and monitoring of transplant rejection by measuring rna |
| WO2024076469A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Natera, Inc. | Non-invasive methods of assessing transplant rejection in pregnant transplant recipients |
| WO2024076484A1 (en) * | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Natera, Inc. | Methods for determination and monitoring of xenotransplant rejection by measuring nucleic acids or proteins derived from the xenotransplant |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2564656T3 (es) * | 2009-10-26 | 2016-03-28 | Lifecodexx Ag | Medios y métodos para el diagnóstico no invasivo de la aneuploidía cromosómica |
| US20130123120A1 (en) | 2010-05-18 | 2013-05-16 | Natera, Inc. | Highly Multiplex PCR Methods and Compositions |
| BR112013020220B1 (pt) | 2011-02-09 | 2020-03-17 | Natera, Inc. | Método para determinar o estado de ploidia de um cromossomo em um feto em gestação |
| WO2015164432A1 (en) | 2014-04-21 | 2015-10-29 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| RU2760913C2 (ru) | 2016-04-15 | 2021-12-01 | Натера, Инк. | Способы выявления рака легкого |
| GB201618485D0 (en) | 2016-11-02 | 2016-12-14 | Ucl Business Plc | Method of detecting tumour recurrence |
| EP3781714A1 (en) | 2018-04-14 | 2021-02-24 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna |
| WO2020010255A1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free dna |
| US20210327538A1 (en) | 2018-07-17 | 2021-10-21 | Natera, Inc. | Methods and systems for calling ploidy states using a neural network |
| WO2020041449A1 (en) * | 2018-08-21 | 2020-02-27 | Zymo Research Corporation | Methods and compositions for tracking sample quality |
| WO2020106987A1 (en) * | 2018-11-21 | 2020-05-28 | Karius, Inc. | Detection and prediction of infectious disease |
-
2021
- 2021-05-27 US US17/925,693 patent/US20230203573A1/en active Pending
- 2021-05-27 AU AU2021280311A patent/AU2021280311A1/en active Pending
- 2021-05-27 WO PCT/US2021/034561 patent/WO2021243045A1/en unknown
- 2021-05-27 JP JP2022572339A patent/JP2023528777A/ja active Pending
- 2021-05-27 CA CA3180334A patent/CA3180334A1/en active Pending
- 2021-05-27 EP EP21734623.8A patent/EP4158060A1/en active Pending
- 2021-05-27 CN CN202180037971.1A patent/CN115917001A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2021280311A1 (en) | 2022-11-24 |
| CN115917001A (zh) | 2023-04-04 |
| WO2021243045A1 (en) | 2021-12-02 |
| EP4158060A1 (en) | 2023-04-05 |
| US20230203573A1 (en) | 2023-06-29 |
| CA3180334A1 (en) | 2021-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230203573A1 (en) | Methods for detection of donor-derived cell-free dna | |
| JP7119014B2 (ja) | まれな変異およびコピー数多型を検出するためのシステムおよび方法 | |
| US20240309472A1 (en) | Methods for determination of transplant rejection | |
| CN112752852A (zh) | 用于检测供体来源的细胞游离dna的方法 | |
| US20240132960A1 (en) | Methods for detection of donor-derived cell-free dna in transplant recipients of multiple organs | |
| WO2017156290A9 (en) | A novel algorithm for smn1 and smn2 copy number analysis using coverage depth data from next generation sequencing | |
| WO2021016441A1 (en) | Systems and methods for determining tumor fraction | |
| US20210285042A1 (en) | Systems and methods for calling variants using methylation sequencing data | |
| EA038117B1 (ru) | Мультиплексный параллельный анализ целевых геномных областей с целью неинвазивного пренатального тестирования | |
| KR20220060198A (ko) | 유전자 복제수 변이 정보를 이용하여 췌장암 환자의 생존 예후를 예측하는 방법 | |
| CN117425734A (zh) | 用于确定移植排斥的方法 | |
| US20230348985A1 (en) | Methods for non-invasively monitoring organ health in cross-species transplantation | |
| WO2024076469A1 (en) | Non-invasive methods of assessing transplant rejection in pregnant transplant recipients | |
| WO2023244735A2 (en) | Methods for determination and monitoring of transplant rejection by measuring rna | |
| WO2023244735A9 (en) | Methods for determination and monitoring of transplant rejection by measuring rna | |
| WO2020132349A2 (en) | Optimizing detection of transplant injury by donor-derived cell-free dna |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240419 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20240419 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20240521 |