JP2023526501A - 金属有機構造体が癌免疫療法の為の低分子及びバイオ高分子を送達する - Google Patents

金属有機構造体が癌免疫療法の為の低分子及びバイオ高分子を送達する Download PDF

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Abstract

修飾された金属有機構造体（ＭＯＦ）が記載され、此れ等は、リン酸又はカルボン酸基を有する核酸及び低分子及び蛋白質等の治療薬剤と配位結合又は静電相互作用する増強された能力を有する表面を有する。修飾されたＭＯＦを提供する方法が記載され、此れ等は、強配位性金属オキソクラスターキャッピング基を弱配位性キャッピング基に依って置き換える事及び／又は電子求引性基を有する有機架橋リガンドを組み込む事を包含する。修飾されたＭＯＦから調製される表面に取り付けられた治療薬剤（例えば、免疫療法薬剤）を有するＭＯＦも又、別の治療薬剤、例えば化学療法薬剤又は免疫調節薬の併用投与有り又は無しで何方かで、例えば放射線治療－放射線力学的治療（ＲＴ－ＲＤＴ）に依って、癌を処置する為にＭＯＦを用いる方法と併せて記載される。其れ故に、記載される方法には癌免疫療法及びインサイチュ癌ワクチン接種が関わり得る。

Description

関連出願の相互参照
本開示の主題は２０２０年５月２２日出願の米国仮特許出願第６３／０２８，８９１号；及び２０２０年６月２９日出願の米国仮特許出願第６３／０４５，４９９号の利益を主張する。此れ等の夫々の開示は其れ等の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
政府の利害関係
本発明は、国立衛生研究所に依って授与された助成金Ｎｏ．ＣＡ２５３６５５及び国防総省に依って授与された助成金Ｎｏ．ＰＣ１７０９３４Ｐ２に依る政府の支援に依って成された。政府は本発明に或る種の権利を有する。
技術分野
本開示の主題は癌を処置する為の組成物及び方法を提供する。具体的には、本開示の主題は、種々の低分子、ペプチド、蛋白質、及び核酸治療薬剤に対する増強された結合の為の修飾された表面を有する金属有機構造体（ＭＯＦ）ナノ材料に関する。本開示の主題は、更に、治療薬剤表面修飾を有するＭＯＦと、例えば腫瘍に対して免疫系を活性化する事に依って癌を処置する事への其れ等の使用とに関する。
略語
℃ ＝ セルシウス度
％ ＝ パーセンテージ
μｇ ＝ マイクログラム
μｌ ＝ マイクロリットル
μｍｏｌ ＝ マイクロモル
μＭ ＝ マイクロモーラー
ＡＦＭ ＝ 原子間力顕微鏡
ＡＰＣ ＝ 抗原提示細胞
ＡＰＦ ＝ アミノフェニルフルオレセイン
ｂｐｙ ＝ ２，２’－ビピリジン
ＣＢＩ ＝ チェックポイントブロック免疫療法
ｃＧＡＭＰ ＝ 環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸
ＣＬＳＭ ＝ 共焦点レーザー走査型顕微鏡
ｃｍ ＝ センチメートル
ＣＲＴ ＝ カルレティキュリン
ＣＴＬ ＝ 細胞傷害性Ｔリンパ球
Ｃｕ ＝ 銅
ＤＡＭＰ ＝ 危険関連分子パターン
ＤＢＢ ＝ ４，４’－ジ（４－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン
ＤＢＰ ＝ ５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン
ＤＣ ＝ 樹状細胞
ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ ＝ ２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオロメチル）ピリジン
ＤＭＦ ＝ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ＝ ジメチルスルホキシド
ｅＶ ＝ 電子ボルト
ｇ ＝グラム
Ｇｙ ＝ グレイ
ｈ ＝ 時間
Ｈｆ ＝ ハフニウム
ＩＣ５０ ＝ ５０パーセント阻害濃度
ＩＣＤ ＝ 免疫原性細胞死
ＩＣＰ－ＭＳ ＝ 誘導結合プラズマ質量分析
ＩＦＮ ＝ インターフェロン
ＩＬ ＝ インターロイキン
ＩＭＤ ＝ イミキモド
Ｉｒ ＝ イリジウム
ｋｇ ＝ キログラム
ｋＶｐ ＝ ピークキロボルテージ
ｍＡ ＝ ミリアンペア
ｍｇ ＝ ミリグラム
ｍｉｎ ＝ 分
ｍＬ ＝ ミリリットル
ｍｍ ＝ ミリメートル
ｍＭ ＝ ミリモーラー
ｍｍｏｌ ＝ ミリモル
ＭＯＦ ＝ 金属有機構造体
ＭＯＬ ＝ 金属有機層
ＭＯＰ ＝ 金属有機ナノプレート
ＭＵＣ－１ ＝ ムチン－１
ｍＶ ＝ ミリボルト
ｎｇ ＝ ナノグラム
ＮＩＲ ＝ 近赤外
ｎｍ ＝ ナノメートル
ｎＭＯＦ ＝ ナノスケール金属有機構造体
ＮＭＲ ＝ 核磁気共鳴
ＯＤＮ ＝ オリゴデオキシヌクレオチド
ＰＡＭＰ ＝ 病原体関連分子パターン
ＰＢＳ ＝ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤ－１ ＝ プログラム死－１
ＰＤ－Ｌ１ ＝ プログラム死－リガンド１
ＰＤＴ ＝ 光線力学的治療
ｐｐｙ ＝ ２－フェニル－ピリジン
ＰＳ ＝ 光増感剤
Ｐｔ ＝ 白金
ＰＸＲＤ ＝ 粉末ｘ線回折
ＲＤＴ ＝ 放射線力学的治療
ＲＥＦ１０ ＝ １０％細胞生残に於ける放射線増感係数
ＲＯＳ ＝ 活性酸素種
ＲＴ ＝ 放射線治療
Ｒｕ ＝ ルテニウム
ＳＢＵ ＝ 二次構造単位
ｓ ＝ 秒
ＳＯＳＧ ＝ 一重項酸素センサーグリーン
ＳＴＩＮＧ ＝ インターフェロン遺伝子の刺激因子
ＴＥＭ ＝ 透過型電子顕微鏡法
ＴＦＡ ＝ トリフルオロ酢酸
ＴＢＰ ＝ ５，１０，１５，２０－テトラ（ｐ－ベンゾアート）－ポルフィリン
ＴＭＳ ＝ トリメチルシリル
ＴＧＩ ＝ 腫瘍成長阻害
ＴＬＲ９ ＝ ｔｏｌｌ様受容体９
ＴＭＥ ＝ 腫瘍微小環境
ＵＶ ＝ 紫外
ｗｔ ＝ 重量
Ｚ ＝ 原子番号
癌の為の免疫療法は患者自身の免疫系を利用して癌を認識及び処置する。癌免疫療法薬剤は、チェックポイントブロック、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、ワクチン接種、及び他を包含する種々の戦略を用いる。チェックポイントブロック免疫療法（ＣＢＩ）は、例えば、Ｔリンパ球制御経路、例えばプログラム死－１／プログラム死－リガンド１（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１）軸を標的化する薬剤を使用する。ＣＢＩは幾つかの固形腫瘍に於いて臨床的奏効を実証している。然し乍ら、多くの患者は現行の癌免疫療法には応答しない。
従って、癌免疫療法を提供し得る物を包含する癌を処置する為の追加の組成物及び方法の現下の必要が有る。
此の概要は、本開示の主題の幾つかの実施形態を列挙し、多くのケースでは此れ等の実施形態の変形及び並べ替えを列挙する。此の概要は数々の且つ様々な実施形態の単に例示である。所与の実施形態の１つ以上の代表的な特徴の言及は同様に例示である。斯かる実施形態は、典型的には、言及される特徴（単数又は複数）有りで又は無しで存在し得る；同様に、此の概要に列挙されるか否かに拘らず、其れ等の特徴は本開示の主題の他の実施形態に適用され得る。過剰な繰り返しを避ける為に、此の概要は斯かる特徴の全ての可能な組み合わせを列挙又は示唆しない。
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、目当ての１つ以上の治療薬剤に配位又は静電結合する様に修飾された表面を有する金属有機構造体（ＭＯＦ）を提供し、前記のＭＯＦは：（ａ）複数の金属オキソクラスター二次構造単位（ＳＢＵ）と（前記の金属オキソクラスターＳＢＵの夫々は１つ以上の第１の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記の１つ以上のアニオンの夫々は１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上に配位する）；（ｂ）二又は三次元のマトリックスを形成する様に複数のＳＢＵを一緒に連結する複数の有機架橋リガンドと；を含み、（ｉ）ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵが、夫々が弱配位性アニオンをＳＢＵキャッピング基アニオンとして含むか、或いは（ｉｉ）複数の有機架橋リガンドが、電子求引性基若しくはリガンド、正電荷、又は其れ等の組み合わせを含む有機架橋リガンドを含み、任意に、複数の有機架橋リガンドが、第２の金属イオンに配位結合した窒素ドナー基を含むリガンドを含み、前記の第２の金属イオンが、更に、１つ以上の電子求引性基を含む少なくとも１つの第２の金属リガンドに配位し；前記のＭＯＦの表面が、目当ての１つ以上の治療薬剤に配位又は静電結合する増強された能力を有する。
幾つかの実施形態では、前記の１つ以上の第１の金属イオンは、イオン化放射線、任意にＸ線を吸収する金属の少なくとも１つのイオンを含み、及び／又は前記の金属はＨｆ、ランタニド金属、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉを含む群から選択され；更に、任意に、第１の金属イオンはＨｆイオンである。幾つかの実施形態では、ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵは、夫々が、弱配位性アニオンをキャッピング基として含み、任意に、前記の弱配位性アニオンはトリフルオロ酢酸及びトリフラートから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、複数の有機架橋リガンドは、少なくとも２つのカルボン酸基に依って置換されたポルフィリンを含み、任意に、複数の有機架橋リガンドは５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（ＤＢＰ）を含む。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、更に、二又は三次元のネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された低分子治療薬剤を含み、任意に、前記の低分子治療薬剤は化学療法薬剤、低分子阻害剤、及び／又は低分子免疫調節薬である。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、二又は三次元のネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された化学療法薬剤を含み、任意に、前記の化学療法薬剤はシスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ＳＮ－３５、及びエトポシドから選択される。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、二又は三次元のネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された低分子阻害剤を含み、任意に、前記の低分子阻害剤はＰＬＫ１阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｂｃｌ－２阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＥＮＰＰ１阻害剤、及びＩＤＯ阻害剤から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、二又は三次元のネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された低分子免疫調節薬を含む。幾つかの実施形態では、低分子免疫調節薬はイミキモド（ＩＭＤ）である。
幾つかの実施形態では、複数の有機架橋リガンドは、窒素ドナー基を含む有機架橋リガンドを含み、前記の窒素ドナー基は第２の金属イオンに配位し、前記の第２の金属イオンは、更に、１つ以上の電子求引性基を含む少なくとも１つの第２の金属リガンドに配位し、任意に、１つ以上の電子求引性基はハロ及びペルハロアルキル基から選択される。幾つかの実施形態では、窒素ドナー基を含む有機架橋リガンドは４，４’－ジ（ｐ－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン（ＤＢＢ）である。幾つかの実施形態では、第２の金属イオンはイリジウム（Ｉｒ）イオン若しくはルテニウム（Ｒｕ）イオンであり、及び／又は前記の第２の金属イオンは２つの第２の金属リガンドに配位し、第２の金属リガンドの１つ又は両方は１つ以上の電子求引性基を含む。幾つかの実施形態では、第２の金属リガンドの１つ又は両方は２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオメチル）ピリジン（ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ）である。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは少なくとも約５ミリボルト（ｍＶ）のゼータ（ζ）電位値を有し、任意に、ＭＯＦは少なくとも約３０ｍＶのζ電位値を有する。
幾つかの実施形態では、前記のＭＯＦは三次元のネットワークを含み、前記の三次元のネットワークはナノ粒子の形態で提供される。
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、目当ての１つ以上の治療薬剤の送達の為のＭＯＦを提供し、前記のＭＯＦは：（ａ）複数の金属オキソクラスターＳＢＵと（前記の金属オキソクラスターＳＢＵの夫々は、１つ以上の第１の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記のアニオンの夫々は１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上に配位する）；（ｂ）二又は三次元のマトリックスを形成する様に複数のＳＢＵを一緒に連結する複数の有機架橋リガンドと；（ｃ）配位結合又は静電相互作用に依って前記のＭＯＦの表面に結合した目当ての１つ以上の治療薬剤とを含み、任意に、目当ての１つ以上の治療薬剤は、ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵの１つ以上の金属イオンに配位結合される。幾つかの実施形態では、前記の第１の金属イオンは、イオン化放射線、任意にＸ線を吸収する金属のイオンであり、並びに／又は第１の金属イオンは、Ｈｆ、ランタニド金属、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉから選択される金属のイオンであり；更に、任意に、第１の金属イオンはＨｆイオンである。
幾つかの実施形態では、前記の目当ての１つ以上の治療薬剤の夫々は、核酸、リン酸若しくはカルボン酸基を含む低分子、及び／又は表面のアクセス可能なリン酸若しくはカルボン酸基を含む高分子を含む群から選択される。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は、表面のアクセス可能なリン酸又はカルボン酸基を含む高分子を含み、前記の高分子は蛋白質であり、任意に、前記の蛋白質は抗体である。幾つかの実施形態では、前記の蛋白質は、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、及び抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む群から選択される。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は核酸を含み、前記の核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣｐＧ ＯＤＮ、及び環状ジヌクレオチドを含む群から選択され、任意に、核酸は環状ジヌクレオチドであり、前記の環状ジヌクレオチドはＳＴＩＮＧアゴニストであり、更に、任意に、前記のＳＴＩＮＧアゴニストはｃ－ジ－ＡＭＰ又はｃＧＡＭＰである。
幾つかの実施形態では、前記のＭＯＦは、二又は三次元のネットワークの細孔又は空洞部に封鎖された１つ以上の追加の治療薬剤を含み；任意に、前記のＭＯＦは約１ｗｔ％から約５０ｗｔ％の前記の１つ以上の追加の治療薬剤を含む。
幾つかの実施形態では、複数のＳＢＵはＨｆオキソクラスターを含み、前記の複数の有機架橋リガンドはＤＢＰを含み、目当ての１つ以上の治療薬剤は、表面のアクセス可能なＳＢＵのＨｆイオンに対する配位結合に依って前記のＭＯＦの表面に結合される。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は１つ以上の抗体を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の治療薬剤は抗ＣＤ４７抗体を含む。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、更に、二又は三次元のネットワークの細孔又は空洞部に封鎖されたＩＭＤを含む。
幾つかの実施形態では、前記のＭＯＦは三次元のネットワークであり、ナノ粒子として提供される。幾つかの実施形態では、前記のＭＯＦは約１ｗｔ％から約５０ｗｔ％のＩＭＤ又は抗ＣＤ４７抗体を含み；任意に、ＭＯＦは約９重量（ｗｔ）％ＩＭＤ及び約７．５ｗｔ％抗ＣＤ４７抗体を含む。
幾つかの実施形態では、複数のＳＢＵはＨｆオキソクラスターを含み、前記の複数の有機架橋リガンドはＩｒイオンに配位したＤＢＢを含み、前記のＩｒイオンは更に２つの（ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ）に配位し；目当ての１つ以上の治療薬剤は、静電相互作用に依って前記のＭＯＦの表面に結合される。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は核酸を含む。幾つかの実施形態では、核酸はＳＴＩＮＧアゴニスト又はＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であり、任意に、核酸はＣｐＧ－ＯＤＮである。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは約１ｗｔ％から約５０ｗｔ％の目当ての１つ以上の治療薬剤を含み、任意に、前記の目当ての１つ以上の治療薬剤は抗体を含む。
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、其れを必要とする対象の癌を処置する方法を提供し、方法は：（ａ）対象にＭＯＦを投与し、前記のＭＯＦが：（ｉ）複数の金属オキソクラスターＳＢＵと（前記の金属オキソクラスターＳＢＵの夫々は１つ以上の第１の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記のアニオンの夫々は１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上に配位する）；（ｉｉ）二又は三次元のマトリックスを形成する様に複数のＳＢＵを一緒に連結する複数の有機架橋リガンドと；（ｉｉｉ）配位結合又は静電相互作用に依って前記のＭＯＦの表面に結合された目当ての１つ以上の治療薬剤とを含み、任意に、目当ての１つ以上の治療薬剤が、ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵの１つ以上の金属イオンに配位結合する事；及び（ｂ）対象の少なくとも或る部分をイオン化放射線エネルギー、任意にＸ線に暴露する事を含む。幾つかの実施形態では、方法は、更に、追加の治療薬剤又は処置、任意に、免疫療法薬剤並びに／又は外科手術、化学療法、毒素治療、凍結療法、及び遺伝子治療を含む群から選択される癌処置を、前記の対象に投与する事を含む。
幾つかの実施形態では、追加の治療薬剤は免疫療法薬剤であり、任意に、前記の免疫療法薬剤は免疫チェックポイント阻害剤である。幾つかの実施形態では、免疫療法薬剤は抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
幾つかの実施形態では、癌は大腸癌、メラノーマ、頭頸部癌、脳の癌、乳癌、肝臓癌、子宮頸癌、肺癌、又は膵臓癌である。幾つかの実施形態では、ＭＯＦの投与は、目当ての１つ以上の治療薬剤の１つ以上について長期放出プロファイルを提供し、任意に、放出速度はチューニング可能であり、及び／又はＭＯＦは、数時間若しくは数日の期間に渡って目当ての１つ以上の治療薬剤の持続放出を提供する。幾つかの実施形態では、ＭＯＦの投与は、目当ての１つ以上の治療薬剤の治療上有効なドーズを低める。
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、ＭＯＦに対する目当ての１つ以上の治療薬剤の表面相互作用及び／又は結合を増強する方法を提供し、方法は、（ｉ）目当ての治療薬剤のカルボン酸若しくはリン酸置換基に依って置き換えられ得る弱配位したアニオンに配位結合した１つ以上の表面のアクセス可能な配位部位を提供する事又は（ｉｉ）１つ以上の電子求引性の架橋リガンド、正電荷を含む１つ以上の架橋リガンド、若しくは其れ等の組み合わせを含むＭＯＦを提供する事に依って、ＭＯＦの表面を修飾する事を含む。幾つかの実施形態では、ＭＯＦの表面を修飾する事は：（ｉａ）有機架橋リガンドに依って一緒に連結された金属オキソクラスターＳＢＵを含む親のＭＯＦを提供し、前記のＳＢＵの夫々が１つ以上の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記のＭＯＦが、複数の表面のアクセス可能な金属オキソクラスターＳＢＵを含み、此処で、前記の表面のアクセス可能な金属オキソクラスターＳＢＵの夫々の１つ以上のアニオンが、強配位性アニオンをＳＢＵキャッピング基として含み；任意に、前記の強配位性アニオンが酢酸又は蟻酸を含む事と；（ｉｂ）前記の強配位性アニオンを除去し、除去する事が、トリフルオロ酢酸トリメチルシリル、トリメチルシリルトリフラート、及び約３未満のｐＫａを有する鉱酸から選択される試薬と前記の親のＭＯＦを接触させる事を含み；其れに依って、前記の強配位性アニオンを弱配位性アニオンに依って置き換え、任意に、前記の強配位性アニオンが酢酸又は蟻酸アニオンから選択され、任意に、前記の弱配位性アニオンがトリフルオロ酢酸又はトリフラートアニオンから選択される事と、を含む。
幾つかの実施形態では、電子求引性基を含む１つ以上の架橋リガンド、正電荷を含む１つ以上の架橋リガンド、又は其れ等の組み合わせを含むＭＯＦを提供する事は、有機架橋リガンドに依って一緒に連結された金属オキソクラスターＳＢＵを含むＭＯＦを提供する事を含み、前記のＳＢＵの夫々は、１つ以上の第１の金属イオンと前記の１つ以上の第１の金属イオンに配位した１つ以上のアニオンとを含み、前記の有機架橋リガンドは、配位したＳＢＵに結びついていない第２の金属イオンを含む少なくとも１つの有機架橋リガンドを含み、前記の第２の金属イオンは更に１つ以上の電子求引性のリガンドに配位し、任意に、前記の電子求引性のリガンドはハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたビピリジンリガンドである。幾つかの実施形態では、ＭＯＦを提供する事は、ＤＢＢ架橋リガンドを含むＭＯＦを提供する事を含み、前記のＤＢＢ架橋リガンドは、２つの異なる金属オキソクラスターＳＢＵの第１の金属イオンに及び第２の金属イオンに配位し、前記の第２の金属イオンは、更に、２つのハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたピリジンリガンドに配位し、任意に、前記の２つのハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたピリジンリガンドは夫々が２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオロメチル）－ピリジンである。幾つかの実施形態では、前記の第２の金属イオンはＩｒ又はＲｕである。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、イオン化放射線、任意にｘ線を吸収する金属イオンを含む１つ以上のＳＢＵを含み、並びに／又は金属イオンは、Ｈｆ、ランタニド金属、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉを含む群から選択される元素のイオンであり；更に、任意に、前記の金属イオンはＨｆイオンである。幾つかの実施形態では、前記のＭＯＦは、表面修飾無しのＭＯＦと比較して目当ての１つ以上の治療薬剤に対する増強された相互作用及び／又は結合能力を有し、前記の目当ての１つ以上の治療薬剤は、表面のアクセス可能なリン酸又はカルボン酸基を含む核酸、低分子、及び／又は高分子から選択される。幾つかの実施形態では、前記の蛋白質は、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、及び抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む群から選択される。幾つかの実施形態では、前記の核酸はｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮ、及び環状ジヌクレオチドを含む群から選択され、任意に、前記の環状ジヌクレオチドはＳＴＩＮＧアゴニストであり、更に、任意に、前記のＳＴＩＮＧアゴニストはｃ－ジ－ＡＭＰ又はｃＧＡＭＰである。
従って、目当ての１つ以上の治療薬剤に結合及び送達する様に適応したＭＯＦ、ＭＯＦを用いて癌を処置する方法、並びにＭＯＦに対する治療薬剤の表面相互作用及び／又は結合を増強する方法を提供する事が本開示の主題の目的である。
全体的に又は部分的に本開示の主題に依って達成される本開示の主題の目的が本明細書に於いて上で申し立てられたが、他の目的は、本明細書に於いて下で最善に記載される通り付随する図面及び例に関連して取られる時に、記載が進むに連れて明らかになるであろう。
イミキモド（ＩＭＤ）がＭＯＦの細孔に封鎖され且つ抗分化抗原群４７（αＣＤ４７）抗体がＭＯＦの表面に取り付けられたハフニウム（Ｈｆ）オキソクラスターと５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（ＤＢＰ）架橋リガンドとを含む金属有機構造体（ＭＯＦ）（ＭＯＦはＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７と言われる）プラスＸ線放射線に依って腫瘍細胞上の「私を食べないで」シグナルをブロックする事に依る、Ｍ２からＭ１マクロファージへの再極性化と貪食の促進とを示す概略的な図面。此のマクロファージ治療は抗プログラム死－リガンド１抗体（αＰＤ－Ｌ１）チェックポイントブロック免疫療法（ＣＢＩ）と相乗作用して腫瘍を全身的に根絶する。 図２Ａは、抗分化抗原群４７抗体（αＣＤ４７）担持の為のハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）の金属オキソクラスターの表面修飾を示す概略的な図面である。ハフニウム（Ｈｆ）オキソクラスター上に酢酸キャッピング基を有する親のＨｆ－ＤＢＰ（左）がトリフルオロ酢酸トリメチルシリル（ＴＭＳ－ＴＦＡ）と接触させられ、酢酸キャッピング基をトリフルオロ酢酸キャッピング基に交換し（中央）、此れ等は其れからαＣＤ４７に依って置き換えられる。図２Ｂは、Ｈｆ－ＤＢＰ（右）及びＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰ（左）のαＣＤ４７担持効率を示すグラフである。図２Ｃは、ＩＭＤがＭＯＦ細孔に封鎖され且つαＣＤ４７が表面に取り付けられたＨｆ－ＤＢＰ－ＭＯＦからのイミキモド（ＩＭＤ、四角））及びαＣＤ４７（丸）の放出プロファイルを示すグラフである（即ち、此処で、ＭＯＦはＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７である）。 ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像。図３Ａは広視野ＴＥＭ画像である。下側左のスケールバーは２００ナノメートル（ｎｍ）である。図３Ｂは高解像度ＴＥＭ画像（下側左のスケールバーは２０ｎｍである）とクロップされた高速フーリエトランスファー（ＦＦＴ）画像（挿入写真、下側右）である。 トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）修飾されたハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像。図４Ａは広視野ＴＥＭ画像である。下側左のスケールバーは２００ナノメートル（ｎｍ）である。図４Ｂは高解像度ＴＥＭ画像（下側左のスケールバーは１０ｎｍである）とクロップされた高速フーリエトランスファー（ＦＦＴ）画像（挿入写真、下側右）である。 ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ、実線）金属有機構造体（ＭＯＦ）の及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）修飾されたＨｆ－ＤＢＰ－ＭＯＦ（点線）の粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示すグラフ。 トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）修飾されたハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン）（Ｈｆ－ＤＢＰ）ナノプレート上に担持されたイミキモド（ＩＭＤ）を示す概略的な図面。ハフニウム－１２（Ｈｆ１２）二次構造単位（ＳＢＵ）が多面体として示され、ＤＢＰ有機リガンドが棒として示されている。ＴＦＡ基のトリフルオロメチル部分及びＩＭＤは矢印に依って指示されている。 ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ、即ち、イミキモド（ＩＭＤ）担持ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像。図７Ａは広視野ＴＥＭ画像である。下側左のスケールバーは２００ナノメートル（ｎｍ）である。図７Ｂは高解像度ＴＥＭ画像（下側左のスケールバーは５０ｎｍである）とクロップされた高速フーリエトランスファー（ＦＦＴ）画像（挿入写真、下側右）である。 ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７、即ち、抗分化抗原群４７抗体（αＣＤ４７）が表面に取り付けられたイミキモド（ＩＭＤ）担持ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像。図８Ａは広視野ＴＥＭ画像である。下側左のスケールバーは１００ナノメートル（ｎｍ）である。図８Ｂは高解像度ＴＥＭ画像（下側左のスケールバーは５０ｎｍである）とクロップされた高速フーリエトランスファー（ＦＦＴ）画像（挿入写真、下側右）である。 イミキモド（ＩＭＤ）を担持したハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ、実線）金属有機構造体（ＭＯＦ）、即ちＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ（実線）の、及びＩＭＤを担持し且つＭＯＦ表面に取り付けられた抗分化抗原群４７抗体（αＣＤ４７）を有するＨｆ－ＤＢＰ－ＭＯＦ、即ちＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（点線）の粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示すグラフ。 血清含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に於けるＩｇＧ－ＦＩＴＣに依って表面修飾されたイミキモド（ＩＭＤ）担持ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン金属有機構造体（即ち、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／ＩｇＧ－ＦＩＴＣ）からのフルオレセイン－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識された免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ－ＦＩＴＣ）の放出（パーセンテージ対時間（時間（ｈｒ）に依る））を示すグラフ。ｎ＝３。 誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）に依って定量されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）細胞に於けるハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）の細胞取り込み（１０５細胞当たりのハフニウムのナノモル（ｎｍｏｌのＨｆ）として測定）を示すグラフ。細胞取り込みが、イミキモド（ＩＭＤ）担持Ｈｆ－ＤＢＰ（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ、暗色のバー）について及び表面に取り付けられた抗分化抗原群４７抗体（αＣＤ４７）を有するＩＭＤ担持Ｈｆ－ＤＢＰ（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７、明灰色のバー）について示されている。ｎ＝３。 ネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）細胞に於いて、イミキモド（ＩＭＤ）を担持したハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）－ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）（即ち、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ、丸）及び表面に取り付けられた抗分化抗原群４７抗体を有するＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ－ＭＯＦ（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７、四角）の暗毒性（Ｘ線照射無し）を示すグラフ。細胞生存率（パーセンテージ（％）として示される）が、（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム）（ＭＴＳ）アッセイに依って測定された。ｎ＝６。 マクロファージ並びに其れ等のサブタイプＭ１及びＭ２の代表的なゲーティング戦略。ヒストグラムは、夫々Ｍ１又はＭ２サブタイプに於ける分化抗原群８６（ＣＤ８６）又は分化抗原群２０６（ＣＤ２０６）の異なる発現レベルを指示している。 図１４Ａはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、イミキモド（ＩＭＤ）、ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）、又はＩＭＤ担持Ｈｆ－ＤＢＰ（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ）ＭＯＦに依って処置され、且つ０（－）又は２（＋）グレイ（Ｇｙ）の線量でＸ線を照射されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）細胞と共培養されたＭ２マクロファージの再極性化の、一連の代表的なフローサイトメトリー分析である。マクロファージは、フィコエリスリン－シアニン色素（ＰＥ－Ｃｙ７）コンジュゲート化分化抗原群２０６（ＣＤ２０６）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート化分化抗原群８６（ＣＤ８６）抗体に依って染色された。図１４Ｂは、ＰＢＳ、抗分化抗原群４７抗体（αＣＤ４７）、Ｈｆ－ＤＢＰ、又はαＣＤ４７表面修飾されたＨｆ－ＤＢＰ（Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７）に依って処置され、且つ０（－）又は２（＋）グレイ（Ｇｙ）の線量でＸ線を照射されたマクロファージに依るカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識されたＣＴ２６細胞の貪食の一連の代表的なフローサイトメトリー分析である。ＣＦＳＥ標識されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）細胞を、ペリジニン－クロロフィル蛋白質－シアニン色素５．５（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）標識されたマクロファージ集団からゲーティングした。図１４Ｃは、図１４Ａで記載されたマクロファージ再極性化の定量を示すグラフである。図１４Ｄは、図１４Ｂで記載された貪食の定量を示すグラフである。ｎ＝３；対照から＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００５。 図１５Ａは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）且つＸ線照射無し（ＰＢＳ（－））；ＰＢＳと照射（ＰＢＳ（＋））；イミキモド（ＩＭＤ）及び抗分化抗原群４７抗体（αＣＤ４７）の混合物と照射（ＩＭＤ／αＣＤ４７（＋））；表面に取り付けられたαＣＤ４７を有するＩＭＤ担持ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン金属有機構造体（Ｈｆ－ＤＢＰ）且つ照射無し（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７（－））；Ｈｆ－ＤＢＰ且つ照射（Ｈｆ－ＤＢＰ（＋））；ＩＭＤ担持Ｈｆ－ＤＢＰ且つ照射（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ（＋））；表面に取り付けられたαＣＤ４７を有するＨｆ－ＤＢＰ且つ照射（Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７（＋））；又はＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７且つ照射（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７（＋））に依って処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍に於けるマクロファージ再極性化の免疫分析を示す一連のヒストグラムである。図１５Ｂは、図１５Ａで記載された同じ腫瘍処置群に於ける主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。図１５Ｃは、図１５Ａで記載された種々の処置の効力曲線（立方センチメートル（ｃｍ３）に依る腫瘍体積に依って指示される）を示すグラフである。ｎ＝５又は６。 分化抗原群４５陽性（ＣＤ４５＋）細胞、分化抗原群１１ｂ陽性（ＣＤ１１ｂ＋）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、並びに其れ等のサブタイプＭ１及びＭ２の代表的なゲーティング戦略。 図１７Ａは、図１５Ａで記載された通り処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つマウスに於ける分化抗原群４５陽性（ＣＤ４５＋）細胞のパーセンテージを示すグラフである。図１７Ｂは、図１５Ａで記載された通り処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つマウスに於ける樹状細胞（ＤＣ）のパーセンテージを示すグラフである。図１７Ｃは、図１５Ａで記載された通り処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つマウスに於けるマクロファージのパーセンテージを示すグラフである。図１７Ｄは、図１５Ａで記載された通り処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つマウスに於けるＭ１マクロファージのパーセンテージを示すグラフである。図１７Ｅは、図１５Ａで記載された通り処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つマウスに於けるＭ２マクロファージのパーセンテージを示すグラフである。図１７Ｆは、図１５Ａで記載された通り処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つマウスに於けるＭ１対Ｍ２マクロファージの比を示すグラフである。（＋）及び（－）は夫々Ｘ線照射有り及び無しを言う。中心線、箱の境界、及び髭は、夫々、平均値、データの範囲の２５％から７５％、及び外れ値から四分位範囲の１．５倍遠くを表す。ｔ検定に依って＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。 屠殺後のＣＴ２６単一腫瘍モデルに於ける、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）且つＸ線照射無し（ＰＢＳ（－））；ＰＢＳと照射（ＰＢＳ（＋））；イミキモド（ＩＭＤ）及び抗分化抗原群４７抗体（αＣＤ４７）の混合物と照射（ＩＭＤ／αＣＤ４７（＋））；表面に取り付けられたαＣＤ４７を有するＩＭＤ担持ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン金属有機構造体（Ｈｆ－ＤＢＰ）且つ照射無し（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７（－））；Ｈｆ－ＤＢＰ且つ照射（Ｈｆ－ＤＢＰ（＋））；ＩＭＤ担持Ｈｆ－ＤＢＰ且つ照射（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ（＋））；表面に取り付けられたαＣＤ４７を有するＨｆ－ＤＢＰ且つ照射（Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７（＋））；又はＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７且つ照射（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７（＋））に依って処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つマウスからの切除された腫瘍の写真。ｎ＝６。 屠殺後のネズミ結腸腺癌腫瘍モデルに於ける図１８で記載された各処置群からの腫瘍重量（グラム（ｇ）に依る）のグラフ。Ｎ＝６。 図２０Ａは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）且つ照射無し（ＰＢＳ（－））；ＰＢＳとＸ線照射（ＰＢＳ（＋））；抗プログラム死リガンド１抗体（αＰＤ－Ｌ１）且つ照射（αＰＤ－Ｌ１（＋））；表面に取り付けられた抗分化抗原群４７抗体（αＣＤ４７）を有するイミキモド（ＩＭＤ）担持ハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）金属有機構造体（ＭＯＦ）且つ照射（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋））；表面に取り付けられたαＣＤ４７抗体を有するＨｆ－ＤＢＰ－ＭＯＦ、照射、且つ併用投与されたαＰＤ－Ｌ１（Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）＋αＰＤＬ１）；ＩＭＤ、αＣＤ４７、αＰＤＬ１、且つ照射（ＩＭＤ／αＣＤ４７（＋）＋αＰＤＬ１）；表面に取り付けられたαＣＤ４７を有するＩＭＤ担持Ｈｆ－ＤＢＰ－ＭＯＦ、照射無し、且つ併用投与されたαＰＤＬ１（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（－）＋αＰＤ－Ｌ１）；又は表面に取り付けられたαＣＤ４７を有するＩＭＤ担持Ｈｆ－ＤＢＰ－ＭＯＦと照射且つαＰＤ－Ｌ１の併用投与（ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）＋αＰＤ－Ｌ１）に依って処置された、両側のネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つマウスの原発腫瘍の成長曲線のグラフである。図２０Ｂは、図２０Ａで記載されたマウスに於ける遠隔腫瘍の成長曲線のグラフである。図２０Ｃは、図２０Ａで記載された８つの処置の６つの後の脾細胞に於いて、腫瘍特異的な応答を有するインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）産生Ｔ細胞を検出する為のＥＬＩＳｐｏｔアッセイ結果のグラフである。ペプチド無しで（左）又はＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号４）に依って（右）刺激された細胞の処置についての結果が示されている。図２０Ｄ～２０Ｆは、図２０Ａで記載された８つの処置群の６つについて、腫瘍細胞の総数に対する腫瘍浸潤分化抗原群８陽性（ＣＤ８＋、図２０Ｄ）、分化抗原群４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞（図２０Ｅ）、及びナチュラル（ＮＫ）細胞（図２０Ｆ）のパーセンテージのグラフである。ｎ＝５。対照から＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００５。 図２１は、分化抗原群４５陽性（ＣＤ４５＋）細胞、Ｔ細胞、分化抗原群８陽性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、並びにＭ１及びＭ２の其れ等のサブタイプの代表的なゲーティング戦略を示す一連のヒストグラムである。 図２０Ａの８つの処置群の６つについて記載された通り処置されたネズミ結腸腺癌（ＣＴ２６）両側腫瘍を持つマウスの原発及び遠隔腫瘍両方に於ける、分化抗原群４５陽性（ＣＤ４５＋）細胞（図２２Ａ）及びＢ細胞（図２２Ｂ）のパーセンテージの一対のグラフ。（＋）及び（－）は夫々照射有り及び無しを言う。中心線、箱の境界、及び髭は、夫々、平均値、データの範囲の２５％から７５％、及び外れ値から四分位範囲の１．５倍遠くを表す。ｔ検定に依って＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図２３は、ナノスケール金属有機構造体（ｎＭＯＦ）プラスチェックポイントブロック免疫療法（ＣＢＩ）に依るインサイチュ癌ワクチン接種の抗腫瘍効果の概略的な図解である。（１）Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（即ち、ハフニウム二次構造単位；２つの２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－トリフルオロメチル）ピリジンリガンドにも又配位結合したイリジウム（ＩＲ）に配位結合した４，４’－ジ（４－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン（ＤＢＢ）を含む有機架橋リガンドと；表面に結合したＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）とを有するＭＯＦ）が、原発腫瘍に腫瘍内投与された。（２）Ｘ線活性化に依って、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒは活性酸素種（ＲＯＳ）を生成して免疫原性細胞死を誘導して腫瘍抗原及び危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を暴露し、抗原提示細胞への病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）としてのＣｐＧ－ＯＤＮ送達はカチオン性Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒに依って援助される。（３）ＤＡＭＰ及びＰＡＭＰは樹状細胞（ＤＣ）成熟を促進する。（４）腫瘍抗原が成熟ＤＣに依って腫瘍所属リンパ節のＴ細胞に提示される。（５）Ｔ細胞は増殖し、原発腫瘍及び遠隔腫瘍へとプライミングされる。（６）全身投与された免疫チェックポイントブロック阻害剤の抗プログラム死リガンド１抗体（αＰＤ－Ｌ１）はＴ細胞疲弊を減衰させる。 図２４Ａ及び２４Ｂは、四塩化ハフニウム（ＨｆＣｌ４）及びＨ２ＤＢＢ－Ｉｒ－Ｆ（図２４Ａ）又はＨ２ＤＢＢ－Ｉｒ（図２４Ｂ）何方かからのＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（図２４Ａ）及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（図２４Ｂ）金属有機構造体（ＭＯＦ）の合成を示す一対の概略的なダイアグラムである。 図２５Ａは、モデル金属有機構造体の物（オスロ大学（ＵｉＯ）－６９）と比較して、新しく調製されたか又は０．６ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２４ｈインキュベーション後のＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒの粉末ｘ線回折パターン（ＰＸＲＤ）を示すグラフである。図２５Ｂは、エタノール（ＥｔＯＨ）中のＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（１１２．２±２．８ナノメートル（ｎｍ）、四角）及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（１１３．９±１．６ｎｍ、丸）の数平均直径を示すグラフである。ｎ＝３。 図２６Ａは、ハフニウム（Ｈｆ）－オキソクラスター及び夫々ＤＢＢＦ－Ｉｒ又はＤＢＢ－Ｉｒリガンドに基づくＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ－ｎＭＯＦのコントロールされた合成の概略的な図解である。Ｘ線照射に依って、Ｈｆ－オキソクラスターはＸ線を吸収して、放射線分解に依って・ＯＨを生成し、エネルギーを隣接する光増感性リガンドに移動させて、１Ｏ２及び／又はＯ２ －を生成する。図２６Ｂは、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（上段）及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（下段）の一対の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝１００ｎｍ。図２６Ｃ～２６Ｅは、Ｘ線照射に依るＤＢＢ－Ｉｒ、ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒの、蛍光イメージングシステムでアミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ）に依って探査された・ＯＨ生成（図２６Ｃ、ｎ＝６）、蛍光イメージングシステムで一重項酸素センサーグリーン（ＳＯＳＧ）に依って探査された１Ｏ２生成（図２６Ｄ、ｎ＝６）、及び電子スピン共鳴（ＥＰＲ）で５－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－５－メチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（ＢＭＰＯ）に依って探査されたＯ２ －生成（図２６Ｅ）を示すグラフである。 表面に取り付けられたＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）有り又は無しの、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ金属有機構造体（ＭＯＦ）の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像。図２７Ａ及び２７Ｂは、夫々Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒの広面積ＴＥＭ画像である。両方の画像の下側右のスケールバーは５００ナノメートル（ｎｍ）を表す。図２７Ｃ及び２７ＤはＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧのＴＥＭ画像である。図２７Ｃでは、下側右のスケールバーは１００ｎｍを表し、図２７Ｄの下側右のスケールバーは５００ｎｍを表す。 図２８Ａは、リガンドＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＤＢＢ－Ｉｒの物と比較して、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ金属有機構造体（ＭＯＦ）の紫外－可視（ＵＶ－ｖｉｓ）スペクトル（強度（任意の単位に依る）対ナノメートル（ｎｍ）の波長）を示すグラフである。図２８Ｂ及び２８Ｃは、夫々ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＤＢＢ－Ｉｒの物と比較して、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（図２８Ｂ）及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（図２８Ｃ）の励起（Ｅｘ）及び発光（Ｅｍ）スペクトルのグラフである。図２８Ｄは、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒの励起（Ｅｘ）及び発光（Ｅｍ）スペクトルを比較するグラフである。 Ｈｆに基づく、２０マイクロモーラー（μＭ）Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒとの１、２、４、又は８時間のインキュベーション後のネズミ結腸癌（ＭＣ３８）細胞に於けるＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒの細胞取り込みのグラフ。ｎ＝３。ハフニウム（Ｈｆ）濃度（１０％細胞当たりのナノモル（ｎｍｏｌ）に依る）が誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）に依って決定された。 危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）のインビトロ生成及び貪食。ネズミ結腸癌（ＭＣ３８）細胞が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リガンド（ＤＢＢ－Ｉｒ若しくはＤＢＢＦ－Ｉｒ）、又は金属有機構造体（ＭＯＦ）（Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ若しくはＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ）に依って４時間に渡って処置され、其れから、０（－）又は２（＋）グレイ（Ｇｙ）の線量のＸ線を照射された。図３０Ａは、Ｘ線照射に依るＭＣ３８細胞についてのＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒの放射線増感を評価する為のクローン形成性アッセイの結果のグラフである。ｎ＝６。図３０Ｂは、ＭＣ３８細胞に対する２Ｇｙの線量のＸ線照射に依るＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒの細胞傷害性のグラフである。ｎ＝６。図３０Ｃ及び３０Ｄは、樹状細胞（ＤＣ）に依るカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識されたＭＣ３８細胞の貪食のグラフである。照射無しで（－、図３０Ｃ）又は有りで（＋、図３０Ｄ）処置されたＭＣ３８細胞と共培養されたＤＣが、フィコエリスリン－シアニン色素５．５（ＰＥ－Ｃｙ５．５）コンジュゲート化分化抗原群１１ｃ（ＣＤ１１ｃ）抗体に依って染色された。ｎ＝３。データは平均±ｓ．ｄ．として表現されている。ｔ検定に依って＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。 危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の生成及び貪食。ネズミ結腸癌（ＭＣ３８）細胞が、ＰＢＳ、ＤＢＢ－Ｉｒ、ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒに依って４時間に渡って処置され、其れから、０（－）又は２（＋）グレイ（Ｇｙ）の線量のＸ線を照射され、貪食アッセイの為に樹状細胞（ＤＣ）と共培養された。図３１Ａは、処置されたＭＣ３８細胞に於けるカルレティキュリン暴露のフローサイトメトリー分析を示す一連のグラフである。明灰色のヒストグラム（対照）及び暗灰色のヒストグラムは、夫々、細胞に於けるカルレティキュリン（ＣＲＴ）レベルの違いを示している。図３１Ｂは、フローサイトメトリーに依って分析されたＤＣに依るカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識されたＭＣ３８細胞の貪食を示す一連のグラフである。処置されたＭＣ３８細胞と共培養されたＤＣが、フィコエリスリン－シアニン色素５．５（ＰＥ－Ｃｙ５．５）コンジュゲート化ＣＤ１１ｃ抗体に依って染色された。ＣＤ１１ｃ＋ＣＦＳＥ＋二重陽性集団が、ＤＣに依って貪食されたＭＣ３８細胞としてゲーティングされた。 病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）のインビトロ送達及び樹状細胞（ＤＣ）活性化。図３２Ａは、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ金属有機構造体（ＭＯＦ）のゼータ（ζ）電位（ミリボルト（ｍＶ）に依る）を示すグラフである。図３２Ｂは、遊離ＣｐＧ－ＯＤＮを対照とするＮａｎｏＤｒｏｐに依る、（左のレーン）吸着されたＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の定量とＤＮＡゲル（挿入写真）及び（右のレーン）吸収されないＣｐＧ－ＯＤＮを示すグラフである。図３２Ｃは、２０マイクロモーラー（μＭ）ハフニウム（Ｈｆ）及びミリリットル当たり０．１マイクログラム（μｇ／ｍＬ）ＣｐＧ－ＯＤＮの濃度の遊離ＣｐＧ－ＯＤＮ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧとインキュベーションされたＤＣに依る、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識されたＣｐＧ－ＯＤＮ取り込みの一連のグラフ及び蛍光顕微鏡写真画像である。フローサイトメトリーに依って定量され、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）に依って観察された。スケールバー＝４マイクロメートル（μｍ）。図３２Ｄ～３２Ｆは、フローサイトメトリーに依って定量された表面機能マーカーの分化抗原群８０（ＣＤ８０、図３２Ｄ）、分化抗原群８６（ＣＤ８６、図３２Ｅ）、及び主要組織適合遺伝子複合体ＩＩクラス（ＭＨＣ－ＩＩ、図３２Ｆ）の定量を示すグラフである。図３２Ｄの凡例は図３２Ｄ～３２Ｆの全ての３つに適用される。図３２Ｇ及び３２Ｈは、増大して行くＣｐＧ－ＯＤＮ濃度で遊離ＣｐＧ－ＯＤＮ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧに依って刺激されたＤＣの、バイオマーカーのインターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－α、図３２Ｇ）及びインターロイキン－６（ＩＬ－６、図３２Ｈ）の定量のグラフである。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に依る。ｎ＝６。図３２Ｉは、１：３比でＭＣ３８－ｏｖａ細胞と共培養されたＤＣのオボアルブミンＫｂ結合蛋白質（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３））発現レベルのグラフである。ｎ＝６。図３２Ｉの凡例は図３２Ｆ及び３２Ｈにも又適用される。 病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の送達及び樹状細胞（ＤＣ）成熟。図３３Ａ及び３３Ｂは、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に依って定量されたインターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－α、図３３Ａ）及びインターロイキン－６（ＩＬ－６、図３３Ｂ）発現レベルを示すグラフである。ｎ＝３。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）が遺伝子発現の比較の為のハウスキーピング遺伝子として用いられた。ＤＣが、遊離ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧプラス２グレイ（Ｇｙ）の線量のＸ線照射に依って前処置されたＭＣ３８－ｏｖａ細胞と１：３比で共培養された。図３３Ｃは、ＤＣのＫｂ－ｏｖａの発現レベルの定量分析を示すグラフである。ｎ＝３。データは平均±ｓ．ｄ．として表現されている（ｎ＝３）。ｔ検定に依って＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。 インビボ毒性及び効力。ネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）を持つＣ５７ＢＬ／６マウスが、ＰＢＳ（－）、ＰＢＳ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（－）、ＣｐＧ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）、及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）に依って処置された。ｎ＝６。図３４Ａは、サイズが１００～１５０立方ミリメートル（ｍｍ３）の７日及び１４日のＭＣ３８腫瘍モデルについての腫瘍微小環境の免疫分析の一連のグラフである。ｎ＝６。図３４ＢはＭＣ３８を持つマウスの切除された腫瘍の写真であり、図３４Ｃ及び図３４Ｃは重量（グラム（ｇ）に依る）のグラフである。膵臓腫瘍細胞（Ｐａｎｃ０２）を持つＣ５７ＢＬ／６マウスが、ＰＢＳ（－）、ＰＢＳ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（－）、ＣｐＧ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）、及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）に依って処置された。ｎ＝６。図３４ＤはＰａｎｃ０２を持つマウスの切除された腫瘍の写真であり、図３４Ｅは重量（ｇに依る）のグラフである。 インビボの抗癌処置の為に自然免疫をブーストする為のインサイチュの個別化された癌ワクチン接種の為のナノスケール金属有機構造体（ｎＭＯＦ）。図３５Ａ及び３５Ｂは、ＰＢＳ（－）、ＰＢＳ（＋）、ＣｐＧ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（－）、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）に依って処置されたネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）（図３５Ａ）及び膵臓癌（Ｐａｎｃ０２）（図３５Ｂ）腫瘍を持つマウスの腫瘍成長曲線のグラフである。Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）がＭＣ３８モデルについての対照群としての用を為した。ｎ＝６。図３５Ｃは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に依って定量された第１の照射の４８時間後のインターロイキン－６（ＩＬ－６）及びインターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－α）の血漿中濃度のグラフである（リットル当たりのナノグラム（ｎｇ／Ｌ）に依る。図３５Ｄ及び３５Ｅは、処置の２日後のＭＣ３８を持つマウスから切除された腫瘍及び腫瘍所属リンパ節（ＤＬＮ）のトータルの細胞に対するマクロファージ（図３５Ｄ）及び樹状細胞（ＤＣ、図３５Ｅ）のパーセンテージ（％）のグラフである。図３５Ｆは、処置後の第２日のＭＣ３８を持つマウスから切除された腫瘍及びＤＬＮのＤＣに対する腫瘍浸潤ＣＤ８０＋ＭＨＣＩＩ＋細胞のパーセンテージのグラフである。図３５Ｇ及び３５Ｈは、照射の２日及び１２日後の血漿中のリットル当たりのマイクログラム（μｇ／Ｌ）で測定されたトータルの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、図３５Ｇ）及びトータルの免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ、図３５Ｈ）のグラフである。ｎ＝６。図３５Ｉは、処置後の第６日のＭＣ３８－ｏｖａを持つマウスから切除されたＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）－Ｈ２Ｋｂ＋細胞のパーセンテージのグラフである。図３５Ｄの凡例は図３５Ｃ及び３５Ｅ～３５Ｉにも又適用される。図３５Ｊは、ＯＴ－ＩのＴ細胞移入研究有り又は無しでＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）に依って処置されたＭＣ３８－ｏｖａ腫瘍を持つＲａｇ２－／－マウスの腫瘍成長曲線のグラフである（立方センチメートル（ｃｍ３）で測定された。データは平均±ｓ．ｄ．として表現されている（ｎ＝６）。ｔ検定に依ってｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。中心線、箱の境界、及び髭は、夫々、平均値、データの範囲の２５％から７５％、及び外れ値から四分位範囲の１．５倍遠くを表す。 ネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）を持つＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍所属リンパ節の重量（ミリグラム（ｍｇ）に依る）のグラフ。ＰＢＳ（－）、ＰＢＳ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（－）、ＣｐＧ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）に依って処置された。ｎ＝６。ｔ検定に依って＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。 促進された適応免疫を有するインサイチュ癌ワクチン接種と相乗作用したチェックポイントブロック免疫療法（ＣＢＩ）のアブスコパル効果。図３７Ａ～３７Ｃは、ネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）腫瘍を持つマウスの、原発の処置された（図３７Ａ）及び遠隔の無処置の（図３７Ｂ）腫瘍の腫瘍成長曲線並びに生残曲線（図３７Ｃ）を示す。ＰＢＳ（－）、ＰＢＳ（＋）、αＰＤ－Ｌ１（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（－）＋αＰＤ－Ｌ１、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依って処置された。処置は、腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の体積に達した時に腫瘍接種後の第１４日に始まった。Ｘ線照射が、１グレイ（Ｇｙ）／フラクションの線量で、連続５日でＰＢＳ又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧのｉ．ｔ．注射の１２ｈ後のマウスに対して実施された。抗体（αＰＤ－Ｌ１）は７５マイクログラム（μｇ）／マウスのドーズで３日毎に腹腔内に与えられた。ｎ＝６。図３７Ａの凡例は図３７Ｂにも又適用される。図３７Ｄ～３７Ｉは、処置の１０日後のトータルの細胞に対する腫瘍浸潤ＣＤ４５＋細胞（図３７Ｄ）、樹状細胞（ＤＣ）（図３７Ｅ）、ＣＤ８０＋ＭＨＣＩＩ＋ＤＣ（図３７Ｆ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（図３７Ｇ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図３７Ｈ）、及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図３７Ｉ）のパーセンテージを示すグラフである。データは平均±ｓ．ｄ．として表現されている（ｎ＝６）。ｔ検定に依って＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。中心線、箱の境界、及び髭は、夫々、平均値、データの範囲の２５％から７５％、及び外れ値から四分位範囲の１．５倍遠くを表す。図３７Ｅの凡例は図３７Ｄ及び３７Ｆ～３７Ｉにも又適用される。 両側モデルに依る免疫分析。ネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）腫瘍を持つマウスが、ＰＢＳ（－）、ＰＢＳ（＋）、αＰＤ－Ｌ１（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ＋αＰＤ－Ｌ１（－）、及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ＋αＰＤ－Ｌ１（＋）に依って処置された。図３８Ａ及び３８Ｂは、第１の照射処置の１０日後の両側のＭＣ３８腫瘍を持つマウスから切除された腫瘍に浸潤したトータルの細胞に対する好中球（図３８Ａ）又はマクロファージ（図３８Ｂ）のパーセンテージ（％）を示すグラフである。ｎ＝６。図３８Ａの凡例は図３８Ｂにも又適用される。図３８Ｃはマウスの切除された腫瘍所属リンパ節の写真であり、図３８Ｄは重量（ミリグラム（ｍｇ）に依る）のグラフである。ｎ＝６。 インサイチュ癌ワクチン接種プラスチェックポイントブロック免疫療法（ＣＢＩ）の特異性及び免疫記憶効果。図３９Ａは、（左）コロニーの一連の代表的な画像（上段－対照、下段－ＫＳＰＷＦＴＴＬ（配列番号５）に依って刺激）及び（右）腫瘍特異的なインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）産生Ｔ細胞（対照、又は配列番号５に依って刺激）を検出する為に行なわれたＥＬＩＳｐｏｔアッセイの統計分析のグラフである。ｎ＝６。図３９Ｂは、両側モデルの概略的な図解である。夫々原発及び遠隔腫瘍としての脇腹へのＭＣ３８及びＢ１６Ｆ１０又はＬＬ２細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射に依って樹立された。図３９Ｃ～３９Ｆは、マッチしない両側腫瘍モデルに於ける原発の処置されたＭＣ３８（図３９Ｃ及び３９Ｅ）及び遠隔の無処置の（図３９ＤではＢ１６Ｆ１０、図３９ＦではＬＬ２）腫瘍成長曲線の腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＰＢＳ（＋）、αＰＤ－Ｌ１（＋）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依って処置された。ｎ＝４。図３９Ｇ及び３９Ｈは、ＰＢＳ（－）又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依って処置されたＭＣ３８を持つＲａｇ２－／－モデルについての原発（図３９Ｇ）及び遠隔（図３９Ｈ）腫瘍成長のグラフである。ｎ＝６。図３９Ｉは、図３７Ｃからの処置された治癒したマウスに於けるＭＣ３８腫瘍細胞に依る負荷及びＢ１６Ｆ１０細胞に依る再負荷後の腫瘍成長曲線のグラフである。図３９Ｊは、トータルの脾細胞に対するＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低細胞のパーセンテージ（％）のグラフである。ｎ＝６。図３９Ａのグラフの凡例は図３９Ｊにも又適用される。 共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）に依る細胞当たりのＦＩＴＣ－ムチン１（ＭＵＣ－１）からの定量されたフルオロセイン－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）シグナルを示すグラフ。Ｎ＝３。ＣＬＳＭは、ＦＩＴＣ－ＭＵＣ－１／Ｈｆ－ＤＢＰ－ＰｔがＭＵＣ－１ペプチドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に効率的に送達するという事を示した。 ３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホ－フェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイ結果のグラフ。ムチン－１（ＭＵＣ－１）ペプチドが、白金（Ｐｔ）を有するハフニウム－５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈｆ－ＤＢＰ）（Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ）に依って放射線治療－放射線力学的治療（ＲＴ－ＲＤＴ）と相乗作用して、より良好に癌細胞（ネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）細胞）をインビトロでＸ線照射に依って殺し得るという事を示す。 ネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）を持つＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍成長曲線のグラフ（腫瘍は立方ミリメートル（ｍｍ３）で測定された）。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ムチン－１ペプチド（ＭＵＣ－１）、及び表面に結び付いたＭＵＣ－１を有する金属有機構造体（即ち、Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ／ＭＵＣ－１）に依って腫瘍内処置された。全てのマウスは連続６日で各日に１グレイ（Ｇｙ）Ｘ線を受け、ＭＵＣ－１／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔシステムの最小限の毒性を有した。 異なるｎＭＯＦに依るＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド担持パーセンテージのグラフ。 ネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍成長曲線（腫瘍は立方ミリメートル（ｍｍ３）で測定された）のグラフ。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）、又は表面に結び付いたｃＧＡＭＰを有する金属有機構造体（ｃＧＡＭＰ／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ）に依って腫瘍内処置された。全てのマウスは第７日に開始して連続５日で各日に２グレイ（Ｇｙ）Ｘ線を受けた。ｃＧＡＭＰ／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔシステムは、定常的な体重傾向に依って指示される通り最小限の全身毒性を有する。 異なる緩衝液中に於けるｃＧＡＭＰ／ナノスケール金属有機層（ｎＭＯＬ）の環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）吸着パーセンテージ（図４５Ａ）及びｃＧＡＭＰ放出プロファイル（図４５Ｂ）の一対のグラフ。 水溶液中のナノスケール金属有機層（ｎＭＯＬ）への環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）滴定の等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）フィッティング結果のグラフ。 ＴＨＰ１－ＤＵＡＬ（商標）ＫＯ－ＭｙＤ８８レポーター細胞（インビボジェン（InvivoGen）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に依って測定されたインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）応答のグラフ。環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）／ナノスケール金属有機層（ｎＭＯＬ）は、遊離２’，３’－ｃＧＡＭＰよりももっと低い半数効果濃度（ＥＣ５０）を有し、高いＩＲＦ応答レベルを有した。 環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）－Ｃｙ５又はｃＧＡＭＰ－Ｃｙ５／ナノスケール金属有機層（ｎＭＯＬ）何方かの腫瘍内注射後の蛍光シグナルの定量。ｎＭＯＬは遊離ｃＧＡＭＰよりももっと長い期間に渡ってｃＧＡＭＰを保持及び保護した。 ネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウス（図４９Ａ）及びネズミ大腸癌（ＣＴ２６）腫瘍を持つＢＡＬＢ／ｃマウス（図４９Ｂ）の腫瘍成長曲線（腫瘍は立方センチメートル（ｃｍ３）で測定された）のグラフ。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）、ナノスケール金属有機層（ｎＭＯＬ）、及びｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬに依って照射有りで（＋）又は無しで（－）処置された。全てのマウスは、第７日に開始して連続６日に渡って各日に２グレイ（Ｇｙ）Ｘ線を受けた。ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬシステムは最小限の毒性を示した。 両側のネズミ結腸腺癌（ＭＣ３８）を持つＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍成長曲線（腫瘍は立方センチメートル（ｃｍ３）で測定された）を示すグラフ。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、抗プログラム死リガンド１抗体（αＰＤ－Ｌ１）、表面に結び付いた環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸を有するナノスケール金属有機層（ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬ）、及びαＰＤ－Ｌ１＋ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬに依って照射有りで処置された。図５０Ａは原発腫瘍の腫瘍成長曲線のグラフである。図５０Ｂは遠隔腫瘍の腫瘍成長曲線のグラフである。全てのマウスは第７日に開始して連続６日に渡って各日に２ＧｙのＸ線を受けた。αＰＤ－Ｌ１は第１０及び１３日に腹腔内注射された。
電子提出された配列表の参照
本願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルの電子提出された配列表の内容（名称：３０７２－１９－ＰＣＴ．ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：２キロバイト；作成日：２０２１年５月２１日）は、其の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
詳細な記載
本開示の主題は、此処で、代表的な実施形態が示される付随する例を参照して、本明細書に於いて以降でより詳しく記載される。然し乍ら、本開示の主題は異なる形態で実施され得、本明細書に於いて記述される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。寧ろ、此れ等の実施形態は、本開示が徹底的且つ完全であり、実施形態の範囲を当業者に詳しく伝えるであろう様に提供される。
別様に定義されない限り、本明細書に於いて用いられる全ての技術及び科学用語は、此の本記載の主題が属する分野の業者に依って普通に理解される同じ意味を有する。本明細書に記載される物に類似の又は同等の何れかの方法、デバイス、及び材料は本開示の主題の実施又は試験に用いられ得るが、代表的な方法、デバイス、及び材料が此処で記載される。本明細書に於いて言及される全ての公開、特許出願、特許、及び他の参照は、其れ等の全体が参照に依って組み込まれる。
本明細書及び請求項に於いて、所与の化学式又は名称は、全ての光学及び立体異性体、並びにラセミ混合物を、斯かる異性体及び混合物が存在する所では包摂する事とする。
Ｉ．定義
次の用語は当業者には良く理解されると思われるが、次の定義が本開示の主題の説明を容易化する為に記述される。
長年の特許法の慣習に従って、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、請求項を包含する本願に用いられる時には「１つ以上」を言う。其れ故に、例えば、「金属イオン」と言う事は複数の斯かる金属イオンを包含する等である。
別様に指示されない限り、本明細書及び請求項に於いて用いられるサイズ、反応条件等の数量を表現する全ての数は、全ての場合に、用語「約」に依って修飾されていると理解されるべきである。従って、其れと反対に指示されない限り、本明細書及び添付の請求項に於いて記述される数的パラメータは概算であり、此れ等は本開示の主題に依って得られる事を求められる所望の特性に依存して変動し得る。
本明細書に於いて用いられる用語「約」は、値を又はサイズ（即ち、直径）、重量、濃度、若しくはパーセンテージの量を言う時には、規定される量からの１つの例では±２０％又は±１０％、別の例では±５％、別の例では±１％、依然として別の例では±０．１％の変動を、斯かる変動が開示される方法を行なう為に適当である様に包摂する事を意味される。
本明細書に於いて用いられる用語「及び／又は」は、実体の列挙の文脈に於いて用いられる時には、実体が単体で又は組み合わせで存在する事を言う。其れ故に、例えば、言い回し「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」はＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個々に包含するが、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの何れか及び全ての組み合わせ及びサブコンビネーションをも又包含する。
「包含する」、「含有する」、又は「を特徴とする」と類義である用語「含む」は、包含的又は開放的であり、追加の記載されない要素又は方法のステップを排除しない。「含む」はクレーム用語に用いられる専門用語であり、此れは、名指しされる要素が存在するが、他の要素が追加され得、依然として請求項の範囲内の構成物又は方法を形成し得るという事を意味する。
本明細書に於いて用いられる言い回し「から成る」は、請求項に於いて規定されない何れかの要素、ステップ、又は成分を排除する。言い回し「から成る」がプリアンブルの直後よりも寧ろクレームボディのクローズに現れる時には、其れは其のクローズに記述される要素のみを限定する；他の要素は全体としての請求項からは排除されない。
本明細書に於いて用いられる言い回し「から本質的に成る」は、規定される材料又はステップ、プラス請求される主題の基本的な且つ新規の特徴（単数又は複数）に実質的に影響しない物に請求項の範囲を限定する。
用語「含む」、「から成る」、及び「から本質的に成る」について、此れ等の３つの用語の１つが本明細書に於いて用いられる所では、本開示の及び請求される主題は他の２つの用語の何方かの使用を包含し得る。
本明細書に於いて用いられる用語「アルキル」は、包含的にＣ１－２０の線形（即ち、「直鎖」）、分枝、又は環状の飽和の又は少なくとも部分的に及び幾つかのケースでは完全に不飽和の（即ち、アルケニル及びアルキニル）炭化水素鎖を言い得、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、及びアレニル基を包含する。「分枝」は、低級アルキル基、例えばメチル、エチル、又はプロピルが線形のアルキル鎖に取り付けられているアルキル基を言う。「低級アルキル」は、１から約８つの炭素原子（即ち、Ｃ１－８アルキル）、例えば１、２、３、４、５、６、７、又は８つの炭素原子を有するアルキル基を言う。「高級アルキル」は、約１０から約２０個の炭素原子、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の炭素原子を有するアルキル基を言う。或る種の実施形態では、「アルキル」は具体的にはＣ１－８直鎖アルキルを言う。他の実施形態では、「アルキル」は具体的にはＣ１－８分枝鎖アルキルを言う。
アルキル基は、同じか又は異なり得る１つ以上のアルキル基置換基に依って任意に置換され得る（「置換アルキル」）。用語「アルキル基置換基」は、アルキル、置換アルキル、ハロ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシル、アリールオキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシル、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、オキソ、及びシクロアルキルを包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの実施形態では、任意にアルキル鎖上に１つ以上の酸素、硫黄、又は置換若しくは無置換の窒素原子が挿入され得、窒素置換基は水素、低級アルキル（本明細書に於いては「アルキルアミノアルキル」とも又言われる）、又はアリールである。
其れ故に、本明細書に於いて用いられる用語「置換アルキル」は、アルキル基の１つ以上の原子又は官能基が、例えばアルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、硫酸、及びメルカプトを包含する別の原子又は官能基に依って置き換えられている本明細書に於いて定義されるアルキル基を包含する。
用語「アリール」は、芳香族置換基を言う為に本明細書に於いて用いられ、此れは、単一の芳香族環、又は一緒に縮合、共有結合的に連結、又はメチレン若しくはエチレン部分等だが此れ等に限定されない共通の基に連結されている複数の芳香族環であり得る。共通の連結基は、ベンゾフェノンの様にカルボニル、又はジフェニルエーテルの様に酸素、又はジフェニルアミンの様に窒素でも又あり得る。用語「アリール」は特に複素環式芳香族化合物を包摂する。芳香族環（単数又は複数）は、中でも、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン、及びベンゾフェノンを含み得る。具体的な実施形態に於いて、用語「アリール」は、約５から約１０個の炭素原子、例えば５、６、７、８、９、又は１０個の炭素原子を含む環状の芳香族を意味し、５及び６員炭化水素及び複素環式芳香族環を包含する。
アリール基は、同じか又は異なり得る１つ以上のアリール基置換基に依って任意に置換され得（「置換アリール」）、「アリール基置換基」は、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、アラルキルオキシル、カルボキシル、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシ、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、及び－ＮＲ’Ｒ”を包含し、Ｒ’及びＲ”は夫々が独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、及びアラルキルであり得る。
其れ故に、本明細書に於いて用いられる用語「置換アリール」は、アリール基の１つ以上の原子又は官能基が、例えばアルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、硫酸、及びメルカプトを包含する別の原子又は官能基に依って置き換えられている本明細書に於いて定義されるアリール基を包含する。
アリール基の具体例は、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、インドール、カルバゾール、及び同類を包含するが、此れ等に限定されない。
本明細書に於いて用いられる「ヘテロアリール」は、１つ以上の非炭素原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅ等）を環構造のバックボーン上に含有するアリール基を言う。窒素含有ヘテロアリール部分は、ピリジン、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、及び同類を包含するが、此れ等に限定されない。
「アラルキル」は－アルキル－アリール基を言い、任意に、アルキル及び／又はアリール部分は置換される。
「アルキレン」は、１から約２０個の炭素原子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の炭素原子を有する直鎖又は分枝の二価脂肪族炭化水素基を言う。アルキレン基は直鎖、分枝、又は環状であり得る。アルキレン基は、又、任意に不飽和であり得、及び／又は１つ以上の「アルキル基置換基」に依って置換され得る。任意に、アルキレン基上に１つ以上の酸素、硫黄、又は置換若しくは無置換の窒素原子が挿入され得（本明細書に於いては「アルキルアミノアルキル」とも又言われる）、窒素置換基は先に記載されたアルキルである。例示的なアルキレン基は、メチレン（－ＣＨ２－）；エチレン（－ＣＨ２－ＣＨ２－）；プロピレン（－（ＣＨ２）３－）；シクロヘキシレン（－Ｃ６Ｈ１０－）；－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－；－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－；－（ＣＨ２）ｑ－Ｎ（Ｒ）－（ＣＨ２）ｒ－（式中、ｑ及びｒの夫々は、独立して０から約２０の整数、例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０であり、Ｒは水素又は低級アルキルである）；メチレンジオキシル（－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－）；及びエチレンジオキシル（－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－）を包含する。アルキレン基は約２から約３つの炭素原子を有し得、更に６～２０個の炭素を有し得る。
用語「アリーレン」は、二価芳香族基、例えば二価フェニル又はナプチル基を言う。アリーレン基は、任意に、１つ以上のアリール基置換基に依って置換され得、及び／又は１つ以上のヘテロ原子を包含し得る。
用語「アミノ」は基－Ｎ（Ｒ）２を言い、各Ｒは独立してＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである。用語「アミノアルキル」及び「アルキルアミノ」は基－Ｎ（Ｒ）２を言い得、各ＲはＨ、アルキル、又は置換アルキルであり、少なくとも１つのＲはアルキル又は置換アルキルである。「アリールアミン」及び「アミノアリール」は基－Ｎ（Ｒ）２を言い、各ＲはＨ、アリール、又は置換アリールであり、少なくとも１つのＲはアリール又は置換アリール、例えばアニリン（即ち、－ＮＨＣ６Ｈ５）である。
用語「チオアルキル」は基－ＳＲを言い得、ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールから選択される。類似に、用語「チオアラルキル」及び「チオアリール」は－ＳＲ基を言い、Ｒは夫々アラルキル及びアリールである。
本明細書に於いて用いられる用語「ハロ」、「ハロゲン化物」、又は「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード基を言う。
「ハロアルキル」は、１つ以上のハロ基に依って置換されたアルキル基を言う。「ペルハロアルキル」基は、炭素原子に取り付けられている水素原子の全てがハロ基に依って置き換えられるアルキル基を言う。例示的なペルハロアルキル基はトリフルオロメチル（即ち、－ＣＦ３）である。
用語「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」は－ＯＨ基を言う。
用語「メルカプト」又は「チオール」は－ＳＨ基を言う。
用語「カルボン酸（carboxylate）」及び「カルボン酸（carboxylic acid）」は夫々基－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－及び－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨを言い得る。用語「カルボキシル」も又－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基を言い得る。幾つかの実施形態では、「カルボン酸」又は「カルボキシル」は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－又は－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基何方かを言い得る。幾つかの実施形態では、用語「カルボン酸」がＳＢＵのアニオンを参照して用いられる時には、用語「カルボン酸」はアニオンＨＣＯ２ －を言う為に用いられ得、其れ故に用語「蟻酸」と類義であり得る。
用語「カルボニル」は－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ基を言い、此処で、ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、又は置換アリールである。
用語「ホスホネート」は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２基を言い、各Ｒは独立してＨ、アルキル、アラルキル、アリール、又は負電荷（即ち、有効には、酸素原子に結合するべきＲ基が存在せず、酸素原子上の非共有電子対の存在を齎す）であり得る。其れ故に、別の遣り方で申し立てられると、各Ｒは存在又は不在であり得、存在する時には、Ｈ、アルキル、アラルキル、又はアリールから選択される。
用語「リン酸（phosphate）」は－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２基を言い、此処で、Ｒ’はＨ又は負電荷である。
用語「脂質」は、脂肪酸、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、又はポリケチド等だが此れ等に限定されない疎水性又は両親媒性低分子を言い得る。
用語「結合する」又は「結合される」及び其れ等の変形は、共有又は非共有結合何方かを言い得る（例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用等）。幾つかのケースでは、用語「結合」は、配位結合に依る又は静電相互作用に依る結合を言う。
用語「コンジュゲート化」も、共有結合的な連結部又は配位結合の形成等の結合プロセスを言い得る。
本明細書に於いて用いられる用語「金属有機構造体」又は「ＭＯＦ」は、金属及び有機コンポーネント両方を含む固体の二又は三次元のネットワークを言い、有機コンポーネントは、少なくとも１つの、典型的には１つよりも多くの炭素原子を包含する。幾つかの実施形態では、材料は結晶質である。幾つかの実施形態では、材料は非晶質である。幾つかの実施形態では、材料は多孔性である。幾つかの実施形態では、金属有機マトリックス材料は配位ポリマーであり、此れは、金属に基づく二次構造単位（ＳＢＵ）、例えば金属イオン又は金属錯体を含む配位錯体の繰り返し単位と架橋多座（例えば、二座又は三座）有機リガンドとを含む。幾つかの実施形態では、材料は１つよりも多くの型のＳＢＵ又は金属イオンを含有する。幾つかの実施形態では、材料は１つよりも多くの型の有機架橋リガンドを含有し得る。
用語「ナノスケール金属有機構造体」は、ＭＯＦを含むか、本質的に其れから成るか、又は其れから成るナノスケール構造を言い得る。
用語「ナノスケール」、「ナノ材料」、及び「ナノ粒子」は、約１，０００ｎｍ未満の寸法を有する少なくとも１つの領域（例えば、長さ、幅、直径等）を有する構造を言う。幾つかの実施形態では、寸法はより小さい（例えば、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１２５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、又は更には約３０ｎｍ未満）。幾つかの実施形態では、寸法は約３０ｎｍ及び約２５０ｎｍの間である（例えば、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０ｎｍ）。
幾つかの実施形態では、ナノ粒子は凡そ球状である。ナノ粒子が凡そ球状である時に、特徴的な寸法は球の直径に対応し得る。球状の形状に加えて、ナノ材料／ナノ粒子はディスク形状、プレート形状（例えば、六角形プレート様）、長方形、多面体、棒形状、立方体、又は不規則な形状であり得る。
本明細書に於いて用いられる用語「ナノプレート」、「金属有機ナノプレート」、及び「ＭＯＰ」は、プレート又はディスク様の形状を有するＭＯＦを言い、即ち、ＭＯＦは其れの厚さよりも実質的に長く且つ幅広い。幾つかの実施形態では、ＭＯＰは其れの厚さよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、又は５０倍長い及び／又は幅広い。幾つかの実施形態では、ＭＯＰは約１００ｎｍ、５０ｎｍ、又は約３０ｎｍ未満の厚さである。幾つかの実施形態では、ＭＯＰは約３ｎｍ及び約３０ｎｍの間の厚さである（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、又は３０ｎｍの厚さ）。幾つかの実施形態では、ＭＯＰは約３ｎｍ及び約１２ｎｍの間の厚さである（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ｎｍの厚さ）。幾つかの実施形態では、ＭＯＰは約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０層の厚さである。幾つかの実施形態では、ＭＯＰは約２及び約５層の間の厚さであり、各層は約ＳＢＵの厚さである。幾つかの実施形態では、ＭＯＰは結晶質である。幾つかの実施形態では、ＭＯＰは非晶質である。幾つかの実施形態ではＭＯＰは多孔性である。幾つかの実施形態では、強配位性調節剤、例えば酢酸（ＡｃＯＨ）、蟻酸、安息香酸、又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の様なモノカルボン酸が用いられて、ＭＯＰのナノプレート形態学をコントロールし、欠陥（欠けている架橋リガンド）を導入して、ＭＯＰチャネル内のＲＯＳの拡散を増強する。
本明細書に於いて用いられる用語「金属有機層」（又は「ＭＯＬ」）は、金属及び有機コンポーネント両方を含む固体の主に二次元のネットワークを言い、有機コンポーネントは、少なくとも１つの、典型的には１つよりも多くの炭素原子を包含する。幾つかの実施形態では、ＭＯＬは結晶質である。幾つかの実施形態では、ＭＯＬは非晶質である。幾つかの実施形態では、ＭＯＬは多孔性である。
幾つかの実施形態では、ＭＯＬは配位ポリマーであり、此れは、金属に基づく二次構造単位（ＳＢＵ）、例えば金属イオン又は金属錯体を含む配位錯体の繰り返し単位と、架橋多座（例えば、二座又は三座）有機リガンドとを含む。幾つかの実施形態では、架橋リガンドは本質的に平面的である。幾つかの実施形態では、架橋リガンドの大多数は少なくとも３つのＳＢＵに結合する。幾つかの実施形態では、材料は１つよりも多くの型のＳＢＵ又は金属イオンを含有する。幾つかの実施形態では、材料は１つよりも多くの型の架橋リガンドを含有し得る。
幾つかの実施形態では、ＭＯＬは、本質的に、ＳＢＵ及び架橋リガンドの間の配位錯体ネットワークの単層であり得、此処では、単層がｘ及びｙ平面上に拡がるが、約１つのＳＢＵのみの厚さを有する。
幾つかの実施形態では、ＭＯＬは、ＳＢＵ及び架橋リガンドの間の実質的に平面的な配位錯体ネットワークの単層であり得、架橋リガンドの実質的に全てが同じ平面上に在る。幾つかの実施形態では、架橋リガンドの８０％よりも多く、８５％、９０％、又は９５％が実質的に同じ平面上に在る。幾つかの実施形態では、架橋リガンドの９５％よりも多く、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％が同じ平面上に在る。其れ故に、複数のＳＢＵ及び架橋リガンドの長さ及び／又は直径を含み得る距離に渡って、ＭＯＬはｘ及びｙ平面上に拡がり得るが、幾つかの実施形態では、ＭＯＬは約１つのＳＢＵのみの厚さを有し得る。幾つかの実施形態では、ＭＯＬの厚さは約３ｎｍ以下であり（例えば、約３、２、又は約１ｎｍ以下）、ＭＯＬの幅、長さ、及び／又は直径は、ＭＯＬの厚さの少なくとも約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は約１００倍以上である。幾つかの実施形態では、ＭＯＬはシート様の形状を有する。幾つかの実施形態では、ＭＯＬはプレート様又はディスク様の形状を有する。幾つかの実施形態では、配位調節剤、例えば酢酸（ＡｃＯＨ）、蟻酸、安息香酸、又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の様なモノカルボン酸が用いられて、ＭＯＬのナノプレート形態学をコントロール及び／又は欠陥（欠けている架橋リガンド）を導入して、ＭＯＬチャネル内のＲＯＳの拡散を増強するか又はＭＯＬの他の特性を調節する。
ＭＯＬ及び／又はＭＯＰとは対照的に、本明細書に於いて用いられる用語「金属有機構造体」、「ナノスケール金属有機構造体」、「ＭＯＦ」、及び／又は「ｎＭＯＦ」は、典型的には、ＭＯＦの長さ、幅、厚さ、及び／又は直径の夫々が約３０又は３１ｎｍよりも多大（又は約５０ｎｍよりも多大若しくは約１００ｎｍよりも多大）である並びに／或いはＭＯＦの幅、長さ、及び／又は直径の何れもＭＯＦの厚さよりも５倍以上多大ではない固体金属有機マトリックス材料粒子を言う。
「配位錯体」は、金属イオンと電子対ドナー、リガンド、又はキレート基との間に配位結合が有る化合物である。其れ故に、リガンド又はキレート基は、一般的には、金属イオンへの供与に利用可能な非共有電子対を有する電子対ドナー、分子、又は分子イオンである。
用語「配位結合」は、電子対ドナー及び金属イオンの間の引力を齎す電子対ドナーと金属イオン上の配位部位との間の相互作用を言う。或る種の配位結合が、金属イオン及び電子対ドナーの特徴に依存して（全く共有結合的な性格ではなくとも）多かれ少なかれ共有結合的な性格をも又有するとして分類され得る限りでは、此の用語の使用は限定する事を意図されない。
本明細書に於いて用いられる用語「リガンド」は、一般的には、何等かの遣り方で別の種と相互作用、例えば結合する分子又はイオン等の種を言う。より具体的には、本明細書に於いて用いられる「リガンド」は、溶液中の金属イオンに結合して「配位錯体」を形成する分子又はイオンを言い得る。マーテル（Martell），Ａ．Ｅ．，及びハンコック（Hancock），Ｒ．Ｄ．著，「水溶液中の金属錯体（Metal Complexes in Aqueous Solutions）」，プレナム（Plenum）：ニューヨーク（１９９６年）を見よ。此れは其の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。用語「リガンド」及び「キレート基」は交換可能に用いられ得る。用語「架橋リガンド」は、１つよりも多くの金属イオン又は錯体に結合し、其れ故に金属イオン又は錯体間の「架橋」を提供する基を言い得る。有機架橋リガンドは、例えばアルキレン又はアリーレン基に依って離間された非共有電子対を有する２つ以上の基を有し得る。非共有電子対を有する基は、－ＣＯ２Ｈ、－ＮＯ２、アミノ、ヒドロキシル、チオ、チオアルキル、－Ｂ（ＯＨ）２、－ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ホスホネート、及び複素環上のヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、又は硫黄）を包含するが、此れ等に限定されない。
用語「配位部位」は、リガンド、例えば架橋リガンドについて本明細書に於いて用いられる時には、非共有電子対、負電荷、又は非共有電子対若しくは負電荷を形成する事が出来る原子若しくは官能基（例えば、特定のｐＨに於ける脱プロトン化に依る）を言う。
「静電結合」は、反対の電荷を有する２つの完全に又は部分的にイオン化された種間の引力を言う。
用語「低分子」は非ポリマー系の天然に生起する又は合成の分子を言う。低分子は典型的には約９００ダルトン（Ｄａ）以下の分子量を有する（例えば、約８００Ｄａ、約７５０Ｄａ、約７００Ｄａ、約６５０Ｄａ、約６００Ｄａ、約５５０Ｄａ、又は約５００Ｄａ以下）。
本明細書に於いて用いられる用語「高分子」は、約９００Ｄａよりも大きい分子を言う。幾つかの実施形態では、高分子はポリマー又はバイオポリマー、例えば蛋白質又は核酸である。
用語「ポリマー」及び「ポリマー系」は、繰り返し単位を有する化学構造を言う（即ち、所与の化学構造の複数コピー）。ポリマーは重合可能なモノマーから形成され得る。重合可能なモノマーは、重合可能なモノマーの他の分子上の部分と反応して結合（例えば、共有又は配位結合）を形成し得る１つ以上の部分を含む分子である。一般的に、各重合可能なモノマー分子は２つ以上の他の分子に結合し得る。幾つかのケースでは、重合可能なモノマーは１つのみの他の分子に結合してポリマー系材料の末端を形成するであろう。
ポリマーは、有機若しくは無機、又は其れ等の組み合わせであり得る。本明細書に於いて用いられる用語「無機」は、炭素、水素、窒素、酸素、硫黄、リン、又はハロゲン化物の１つ以外の少なくとも幾つかの原子を含有する化合物又は組成物を言う。其れ故に、例えば、無機化合物又は組成物は１つ以上の珪素原子及び／又は１つ以上の金属原子を含有し得る。
本明細書に於いて用いられる「有機ポリマー」は、其れ等の繰り返し単位上にシリカ又は金属原子を包含しない物である。例示的な有機ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＯ）、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリジエン、及び同類を包含する。幾つかの有機ポリマーは、其れ等が生物学的条件下で経時的に分解し得る様に、エステル又はアミド等の生分解性の結合部を含有する。
本明細書に於いて用いられる用語「親水性ポリマー」は、一般的には、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシ－プロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメチアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシルプルピルメタクリレート、ポリヒドロキシ－エチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレングリコール（即ち、ＰＥＧ）又は別の親水性ポリ（アルキレンオキシド）、ポリグリセリン、及びポリアスパルトアミド等だが此れ等に限定されない親水性有機ポリマーを言う。用語「親水性」は、分子又は化学種が水と相互作用する能力を言う。其れ故に、親水性ポリマーは典型的には極性であるか、又は水と水素結合し得る基を有する。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、ペプチド（アミド）結合に依って連結されたアミノ酸残基、関係する天然に生起する構造バリアント、及び其れ等の合成の天然に生起しないアナログから組成されるポリマーを言う。幾つかの実施形態では、「ペプチド」は２及び５０の間のアミノ酸残基から組成されるポリマーを言う。
「合成ペプチド又はポリペプチド」は天然に生起しないペプチド又はポリペプチドを言う。合成ペプチド又はポリペプチドは例えば自動ポリペプチド合成機を用いて合成され得る。種々の固相ペプチド合成方法が当業者には公知である。
用語「蛋白質」は典型的には大きいポリペプチドを言う（例えば、＞５０アミノ酸残基）。ポリペプチド配列を描写する為の従来の表記法が本明細書に於いて用いられる：ポリペプチド配列の左端はアミノ末端である；ポリペプチド配列の右端はカルボキシル末端である。
本明細書に於いて用いられる用語「防止する」は、何かが起こる事を止める事、又は可能な若しくは見込まれる何かが起こる事に対する事前措置を取る事を意味する。医学の文脈に於いて、「防止」は、一般的に、疾患又は状態に成る可能性を減少させる為に取られる行為を言う。「防止」は絶対的である必要はなく、其れ故に程度の問題として生起し得るという事が指摘される。
幾つかの実施形態では、「防止的な」又は「予防的な」処置は、状態、疾患、又は障害の徴候を見せないか又は早期の徴候のみを見せる対象に投与される処置である。其れ故に、予防的な又は防止的な処置は、状態、疾患、又は障害を発生する事に関連する病理を発生するリスクを減少させる目的で投与され得る。
用語「光増感剤」（ＰＳ）は、特定の波長の光、典型的には可視又は近赤外（ＮＩＲ）光に依って励起され、活性酸素種（ＲＯＳ）を生じ得る化学的な化合物又は部分を言う。例えば、其の励起状態では、光増感剤は項間交差を経過し、エネルギーを酸素（Ｏ２）に移動させて（例えば、ＰＤＴに依って処置されようとする組織に於いて）、一重項酸素（１Ｏ２）等のＲＯＳを生じ得る。
幾つかの実施形態では、光増感剤は、ポルフィリン、クロロフィル、色素、或いは其の誘導体又はアナログ、例えばポルフィリン、クロロフィル、或いは１つ以上の追加のアリール若しくはアルキル基置換基を含む、炭素－炭素単結合に依って置き換えられた１つ以上の炭素－炭素二重結合を有する、及び／又は有機架橋リガンドに対する結合に依って共有結合的に置換され得る置換基（例えば、置換アルキレン基）を含む色素である）。幾つかの実施形態では、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、又はポルフィセンが用いられ得る。幾つかの実施形態では、例えば、有機架橋リガンド若しくはＳＢＵ等の別の分子若しくは部分に光増感剤を取り付ける事に用いる為に、及び／又は追加の金属（単数又は複数）に対して配位を増強するか若しくは配位する為の追加の部位（単数若しくは複数）を提供する為に、光増感剤はカルボン酸、アミン、又はイソチオシアネート等の１つ以上の官能基を有し得る。幾つかの実施形態では、光増感剤はポルフィリン又は其の誘導体若しくはアナログである。例示的なポルフィリンは、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、及びテトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）を包含するが、此れ等に限定されない。例示的なポルフィリン誘導体は、ピロフェオホルバイド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルａ、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルディン、ローディン、オキソクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、及びベンゾバクテリオクロリンを包含するが、此れ等に限定されない。ポルフィリンアナログは、拡張ポルフィリンファミリーメンバー（例えばテキサフィリン、サフィリン、及びヘキサフィリン）、ポルフィリン異性体（例えばポルフィセン、反転ポルフィリン、フタロシアニン、及びナフタロシアニン）、及び１つ以上の官能基に依って置換されたＴＰＰを包含するが、此れ等に限定されない。
幾つかの実施形態では、ＰＳは、金属（例えば、Ｒｕ又はＩｒ）と１つ以上の窒素ドナーリガンド、例えば１つ以上の窒素含有芳香族基とを含む金属配位錯体である。幾つかの実施形態では、１つ以上の窒素ドナーリガンドは、ビピリジン（ｂｐｙ）、フェナントロリン、テルピリジン、又はフェニル－ピリジン（ｐｐｙ）を包含するが此れ等に限定されない群から選択され、此れ等の夫々は任意に１つ以上のアリール基置換基に依って置換され得る（例えば、芳香族基の炭素原子上）。
本明細書に於いて用いられる用語「癌」は、コントロールされない細胞分裂及び／又は細胞が転移若しくは追加の部位に於いて新たな成長を樹立する能力に依って引き起こされる疾患を言う。用語「悪性」、「悪性物」、「新生物」、「腫瘍」、「癌」、及び其れ等の変形は、癌性の細胞、又は癌性の細胞の群を言う。
癌の特定の型は、皮膚癌（例えば、メラノーマ）、結合組織癌（例えば、肉腫）、脂肪癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌（例えば、中皮腫）、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、肛門性器癌（例えば、精巣癌）、腎臓癌、膀胱癌、大腸癌（即ち、結腸癌又は直腸癌）、前立腺癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、網膜癌、血液、神経芽腫、多発性骨髄腫、及びリンパ癌（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）を包含するが、此れ等に限定されない。
用語「転移癌」は、患者の体内に於いて其の当初の部位（即ち、原発部位）から広がった癌を言う。
用語「抗癌薬物」、「化学療法薬」、及び「抗癌プロドラッグ」は、癌を処置する事が公知の又は其の能力が有ると疑われる薬物（即ち、化学的な化合物）又はプロドラッグを言う（即ち、癌細胞を殺すか、癌細胞の増殖を妨げるか、又は癌に関係する症状を処置する為に）。幾つかの実施形態では、本明細書に於いて用いられる用語「化学療法薬」は、癌を処置する為に用いられる及び／又は細胞傷害能力を有する非ＰＳ分子を言う。斯かるより伝統的な又は従来の化学療法薬剤は、作用機序に依って又は化学的な化合物のクラスに依って記載され得、アルキル化剤（例えば、メルファラン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）、細胞骨格破壊剤（例えば、パクリタキセル）、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット）、トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤（例えば、イリノテカン又はエトポシド）、キナーゼ阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ヌクレオチドアナログ又は其れ等の前駆体（例えば、メトトレキサート）、ペプチド抗生物質（例えば、ブレオマイシン）、白金に基づく薬剤（例えば、シスプラチン又はオキサリプラチン）、レチノイド（例えば、トレチノイン）、及びビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン）を包含し得るが、此れ等に限定されない。
ＩＩ．一般的な考慮事項
数十年に渡って、腫瘍特異的なＴ細胞応答を増幅する為の癌ワクチンが開発されている（ゴールドマン（Goldman）及びデフランセスコ（DeFrancesco）著，２００９年）。具体的には、腫瘍抗原に基づく癌ワクチンが臨床に於いて幅広く検討され、米国食品医薬品局に依る前立腺酸性ホスファターゼに基づく前立腺癌ワクチンシプリューセルＴの承認に至っている（フー（Hu）等著，２０１８年）。然し乍ら、癌ワクチン開発への伝統的アプローチは幾つかのハードルに直面している。患者間に於ける異なる体細胞変異、故に様々な腫瘍抗原に依る腫瘍不均質性（タニ（Tanyi）等著，２０１８年；サヒン（Sahin）及びテュレジ（Tureci）著，２０１８年）、急速な腎クリアランス及び酵素的分解を原因とするリンパ節へのペプチドに基づく腫瘍抗原の有効でない送達（パーセル（Purcell）等著，２００７年；ドゥ（Du）等著，２０１８年）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に依る腫瘍抗原の非効率的な内在化（リウ（Liu）等著，２０１４年）、及び腫瘍がプログラム死－１／プログラム死－リガンド１（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１）軸等のメカニズムに依って免疫監視からエスケープする能力（ジョイス（Joyce）及びフィーロン（Fearon）著，２０１５年）を包含する。
ネオアンチゲン又は自家全腫瘍ライセートに依る個別化ワクチンは腫瘍不均質性を克服し得るが（クアイ（Kuai）等著，２０１７年）、其れ等の産生プロセスは冗長、複雑、且つ高価である（シーツ（Scheetz）等著，２０１９年）。個別化された癌ワクチン接種を改善する為の１つの有望な戦略は、免疫刺激処置を用いて腫瘍抗原をインサイチュで生成し、此れは、全身的な抗腫瘍免疫応答を個別化された様式で提供し得、局所的な腫瘍微小環境を調節して免疫抑制を緩和し得る（ワン（Wang）等著，２０１８年）。例えば、タリモジンラヘルパレプベク（Ｔ－ＶＥＣ）等の腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内注射は、直接的な細胞傷害性効果を癌細胞に課し、抗原提示の為にＤＣをリクルートし、縮減された副作用を有するインサイチュ癌ワクチンとして作用する（ギリエ（Gilliet）等著，２００８年）。強力な抗腫瘍効果を有する非ウイルス系の処置、例えば光線療法（カスターノ（Castano）等著，２００６年）、放射線治療（ＲＴ）（ヴァイクセルバウム（Weichselbaum）等著，２０１４年；チャオ（Chao）等著，２０１８年）、及び幾つかの化学療法も又、免疫原性細胞死を誘導する事に依って危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）及び腫瘍抗原を生成し得る（ケップ（Kepp）等著，２０１９年）。
インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト（シャエ（Shae）等著，２０１９年；ルオ（Luo）等著，２０１７年）又はＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）等の免疫アジュバントに依るＤＣの刺激は、更に抗原提示及び免疫応答を促進する（クリンマン（Klinman）著，２００４年）。病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として公知の微生物ＤＮＡとして天然に存在するＣｐＧは短いＤＮＡ鎖であり、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）刺激、ＤＣ成熟、抗原提示、及び腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のプライミングの為のワクチンアジュバントとして幅広く探求されている（フィグダー（Figdor）等著，２００４年）。加えて、免疫アジュバントの不在下に於ける未成熟ＤＣに依る抗原提示は、免疫反応を刺激するよりも寧ろ寛容を誘導する（ルッツ（Lutz）及びシューラー（Schuler）著，２００２年）。具体的には、クラスＣのＣｐＧはＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）産生を増強してＤＣを活性化及びＢ細胞を刺激し得、此れは翻って共刺激分子を上方制御し、炎症促進性サイトカインを分泌して、素晴らしい抗癌効果を提供する（ラドヴィッチ（Radovic）－モレノ（Moreno）等著，２０１５年；ブロディ（Brody）等著，２０１０年）。然し乍ら、ペプチドワクチンに類似に、局所投与されたＣｐＧであっても酵素的分解を受け易く、其れ等のアニオン性の性質を原因としてＡＰＣに依って効率的に内在化され得ない（ブロディ（Brody）等著，２０１０年；ロシ（Rosi）等著，２００６年）。
抗原及びアジュバント送達の文脈に於いては、ナノテクノロジーが、癌ワクチン接種の為の抗腫瘍活性を誘起する為に薬物送達及び免疫刺激を合併する最前線に在る（ジャン（Jiang）等著，２０１７年；ナム（Nam）等著，２０１９年；ソン（Song）等著，２０１７年；ツァン（Zhang）等著，２０１９年；マ（Ma）等著，２０１９年；ルー（Lou）等著，２０１９年；及びウィルソン（Wilson）等著，２０１９年）。本開示の主題は、１つの態様では、ＤＡＭＰ及び腫瘍抗原のＸ線に依って活性化される生成、並びにＰＡＭＰとしてのＡＰＣへのＣｐＧの効率的送達に依る個別化された癌ワクチン接種への、ナノスケール金属有機構造体（ｎＭＯＦ）の使用に基づく。然し乍ら、ＣｐＧは、ｎＭＯＦに依って送達され得る単に１つの例示的な薬剤である。多様な低分子又は高分子を包含する他の免疫療法薬剤が、本明細書に於いて下で更に記載される通り、本開示の主題に従うｎＭＯＦを用いて送達され得る。
チューニング可能な金属オキソクラスター及び機能的な有機リガンドから組み立てられるｎＭＯＦは、バイオメディカル適用に於ける興味深いポテンシャルを有する新たな型の多孔性の且つ結晶質の分子ナノ材料として出現した（フルカワ（Furukawa）等著，２０１３年；ワン（Wang）等著，２０１７年）。ｎＭＯＦは、外部光又はＸ線照射に依って高度に細胞傷害性の且つ免疫原性の活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する事に依って、強力な抗腫瘍活性を示している（ラン（Lan）等著，２０１９年ａ；ニ（Ni）等著，２０１８年ａ）。ｎＭＯＦは、ユニークな放射線治療－放射線力学的治療（ＲＴ－ＲＤＴ）に依って、Ｘ線エネルギーをＲＯＳに直接的に変換する能力も又ある（ニ（Ni）等著，２０１８年ｂ）。本開示の主題の１つの態様に従って、Ｘ線に依って活性化されるＲＴ－ＲＤＴに依ってＤＡＭＰ及び腫瘍抗原を放出する為の、其れ故に例えば静電相互作用に依ってＣｐＧを送達する為のカチオン性ｎＭＯＦが分子工学に依って設計された。ｎＭＯＦに依って提供されるインサイチュワクチン接種は、腫瘍所属リンパ節に於いて細胞傷害性Ｔ細胞を有効に増殖させて、腫瘍退縮の為に適応免疫系を再活性化する。図２３を見よ。ｎＭＯＦに基づくインサイチュワクチンの局所的な治療効果は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（αＰＤ－Ｌ１）との組み合わせ処置に依って遠隔腫瘍迄拡げられて、ＭＣ３８大腸癌モデルに於いて８３．３％の治癒率を提供した。
本明細書に於いては、免疫系を活性化する事に依って癌を処置する為の追加の例示的なｎＭＯＦも又記載される。例えば、本明細書に於いて下では、（ｉ）病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）としてのＴｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストイミキモド（ＩＭＤ）と（ｉｉ）マクロファージ調節及び免疫抑制の後退の為の抗分化抗原群４６抗体（αＣＤ４７）とを同時送達するｎＭＯＦが記載される。図１を見よ。ＩＭＤは免疫抑制型Ｍ２マクロファージを免疫刺激性Ｍ１マクロファージへと再極性化させ、抗体はＣＤ４７腫瘍細胞表面マーカーをブロックして貪食を促進する。ＩＭＤはｎＭＯＦコアの細孔に封鎖され得、ｎＭＯＦの表面は抗体に結合する其の能力を増強する様に修飾される。ＩＭＤ及びαＣＤ４７の送達を組み合わせるｎＭＯＦが腫瘍内注射され、次に低グレードＸ線照射をされ、αＣＤ４７、ＩＭＤ、又は裸のｎＭＯＦ処置単独と比べて増強された腫瘍退縮を示した。Ｘ線照射に依って、ｎＭＯＦに依って誘発されるＲＴ－ＲＤＴ、ＩＭＤ、及びαＣＤ４７は、抗ＰＤＬ１免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせで用いられる時に、一緒に、免疫抑制性の腫瘍微小環境及び活性な自然免疫を調節して、適応免疫を編成する。此れは、両側大腸腫瘍モデルの原発及び遠隔腫瘍両方の完全な根絶に至り得る。其れ故に、ｎＭＯＦは、全身的な免疫応答を誘導及び改善された抗腫瘍効力を提供する為の複数の免疫アジュバントを同時送達する為の有効なプラットフォームを提供する。
ＩＩＩ．ナノスケール金属有機構造体
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、親の修飾されていないＭＯＦと比較して治療薬剤の改善された表面吸収が出来る様に修飾されている金属有機構造体（ＭＯＦ）（例えば、ナノスケールＭＯＦ（ｎＭＯＦ）、例えば、ＭＯＦナノ粒子又はナノスケール金属有機層（ＭＯＬ））に関する。修飾されたＭＯＦは、低分子及び／又は高分子治療薬剤の増大した表面吸収が出来得る。表面吸収には、ＭＯＦの表面の金属イオンに対する治療薬剤の配位結合、又は治療薬剤及びＭＯＦの表面の間の静電相互作用が関わり得る。幾つかの実施形態では、此れ等の治療薬剤は：（１）核酸、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャー（ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びＣｐＧ－ＯＤＮ；（２）ポリヌクレオチド及び環状ジヌクレオチド（例えばＳＴＩＮＧアゴニストｃ－ジ－ＡＭＰ及びｃＧＡＭＰ）；（３）アクセス可能なリン酸又はカルボキシル基を有する低分子及び高分子（例えばリン酸エトポシド）；（４）ペプチド及び蛋白質、例えば抗ＣＤ３７、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ７３、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＬＡＧ３、抗ＣＴＬＡ－４抗体；並びに（５）（１）～（４）の何れかの組み合わせを包含し得るが、此れ等に限定されない。
幾つかの実施形態では、治療薬剤は免疫系を標的化する。斯かる治療薬剤は、ＰＡＭＰＳ、例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト及びＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）アゴニスト及びＳＴＩＮＧアゴニスト；リソソームを標的化するＰＶ－１０等の低分子腫瘍溶解性分子とミトコンドリアを標的化するルキソテミチド等のペプチドとを両方包含する腫瘍溶解性分子；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及び他のインターロイキン並びに其れ等の天然又は合成誘導体）、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、及び他のＩＦＮ、並びに其れ等の天然又は合成誘導体を包含するＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型ＩＦＮ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦ－α及び其れ等の天然又は合成誘導体）を包含するが此れ等に限定されないサイトカイン；ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ１２７、及びＣＤ４０を標的化するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、並びに二重特異性モノクローナル抗体を包含する抗体；並びにｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）等だが此れ等に限定されない核酸を包含するが、此れ等に限定されない。例示的なＴＬＲアゴニスト及びＲＬＲアゴニストは、ＴＬＲ３アゴニスト、例えばポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ（Ａ：Ｕ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、及び其れ等の天然又は合成誘導体；ＴＬＲ４アゴニスト、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）、及びモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、ＣＲＸ－５２７、Ｇ１００等の様な其れ等の天然及び合成誘導体；イミダゾキノリン化合物を包含するＴＬＲ７／８アゴニスト、例えばイミキモド（ＩＭＤ）、ガルディキモド、レシキモド、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＣＬ３０７；ベンゾアゼピンアナログ、例えばＶＴＸ－２３３７、ＴＬ８－５０６；一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び其れ等の天然及び合成誘導体；ＴＬＲ－９アゴニスト、例えばクラスＡ、Ｂ、及びＣのＣｐＧ－ＯＤＮを包含するＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、並びに其れ等の天然及び合成誘導体；並びにＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）を標的化する為のＲＬＲリガンド、例えばｄｓＲＮＡ、例えば５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ；３ｐ－ヘアピンＲＮＡ；ポリ（ｄＡ：ｄＴ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）；並びに其れ等の天然及び合成誘導体を包含する。例示的なＳＴＩＮＧアゴニストは、天然ＣＤＮを包含する環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、例えば２’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ；環状アデニン一リン酸－イノシン一リン酸（ｃＡＩＭＰ）；キサンテノンアナログ、例えばＤＭＸＡＡ；並びに其れ等の天然及び合成誘導体、例えばＣＬ６５６及びＡＤＵ－Ｓ１００；並びにホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばＥＮＰＰ１／２阻害剤及びＳＶＰＤ阻害剤を包含するが、此れ等に限定されない。
ＩＩＩ．Ａ．修飾された金属有機構造体
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、修飾された金属有機構造体（ＭＯＦ）、例えば、有機架橋リガンドに依って一緒に連結された金属含有二次構造単位（ＳＢＵ）を含むｎＭＯＦに関する。例えば、有機架橋リガンドは、金属イオンに対する配位結合を形成する事が出来る少なくとも２つの官能基（例えば、カルボン酸又はリン酸）を包含し得、此れ等の２つの官能基の１つに依って２つのＳＢＵの夫々の上の金属イオンとの配位結合を形成する事に依って、２つのＳＢＵを一緒に連結し得る。幾つかの実施形態では、ＳＢＵは金属オキソクラスターである。幾つかの実施形態では、ＳＢＵの金属イオンはｘ線を吸収する事が出来る。親の未修飾のＭＯＦでは、ＳＢＵは、金属イオンに配位した強配位性キャッピング基、例えば酢酸又は蟻酸基を包含し得る。此の強配位性キャッピング基は、トリフルオロ酢酸トリメチルシリル、トリメチルシリルトリフラート、又は好適な酸強度を有する鉱酸に依る処置に依って除去され、其れに依って、修飾されたＭＯＦ上の強配位性キャッピング基を弱配位性基、例えばトリフルオロ酢酸又はトリフラート基に交換し得る。其れから、弱配位性基は、蛋白質若しくはカルボン酸基含有低分子のカルボン酸基又は核酸のリン酸基に依って置き換えられ、金属イオンに対する配位に依って、蛋白質、ペプチド、低分子、又は核酸をＭＯＦの表面に取り付け得る。代替的には、電子求引性の架橋リガンドの組み合わせが用いられて、架橋リガンド上のカチオン性電荷及びキャッピング基の欠陥を増大させて、ＭＯＦ及び高分子の間の静電相互作用を増大させ得る。其れ故に、用語「修飾されたＭＯＦ」は、電子求引性の架橋リガンドを有するＭＯＦをも又言う。修飾されるべき親のＭＯＦを調製する方法は例えば米国特許第１０，２０６，８７１号明細書に記載されている。此れの開示は其の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
修飾されたＭＯＦは、１つ以上のＭＯＦ表面に取り付けられた治療薬剤（例えば、免疫系を標的化する１つ以上の治療薬剤）の為の送達プラットフォームとして作用し得る。幾つかの実施形態では、修飾されたＭＯＦは、表面に取り付けられた治療薬剤の改善された吸収を提供し得る。加えて、ＭＯＦの細孔／空洞部は、更に、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ＳＮ－３５、エトポシド、及び同類等だが此れ等に限定されない低分子化学療法薬剤；又はＰＬＫ１阻害剤（ＴＡＫ－９６０、ＯＮ０１９１０、ＢＩ２５３６等）、Ｗｎｔ阻害剤（ＣＣＴ０３６４７７等）、Ｂｃｌ－２阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＥＮＰＰ１阻害剤、若しくはＩＤＯ阻害剤等だが此れ等に限定されない低分子阻害剤を担持し得る。其れ故に、修飾されたＭＯＦは、様々な可溶性を有する薬剤の組み合わせの為の多剤送達プラットフォームとして作用し得る。
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、癌を処置する為のナノ粒子（例えば、ＭＯＦナノ粒子（ｎＭＯＦ））又はナノ粒子製剤を提供する。ナノ粒子（例えば、ｎＭＯＦ）は金属含有二次構造単位（例えば、金属オキソクラスター、例えばＨｆ－金属オキソクラスター）及び有機架橋リガンドを含み得る。１つ以上の高分子、例えばαＣＤ４７若しくはＣｐＧ－ＯＤＮ、及び／又は１つ以上の低分子治療薬剤がｎＭＯＦの表面に取り付けられて、腫瘍に対して免疫系を活性化し得る。追加の治療薬剤（例えば、追加の化学療法又は免疫療法薬剤）、例えばＩＭＤが、ＭＯＦの細孔及び／又は空洞部に担持され得る。
例えば、下の例に記載される通り、例示的なＩＭＤ－ｎＭＯＦ－ＤＢＰ－ＣＤ４７ナノ粒子が調製された。大腸癌腫瘍モデルでは、腫瘍内に於けるＩＭＤ－ｎＭＯＦ－ＤＢＰ－ＣＤ４７に依る処置、次に低グレードＸ線照射は、ＣＤ４７、イミキモド、又はｎＭＯＦ－ＤＢＰ処置単独と比べて増強された腫瘍退縮を提供した。従って、幾つかの実施形態では、本開示の主題は腫瘍の改善された処置を提供し、現行の全身ドーズで送達される時には毒性であり得るＣＤ４７及びイミキモドのより低いドーズを用いる。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、ペプチド（例えば、ムチン－１ペプチド）又はＳＴＩＮＧ活性化因子／アゴニスト、例えば環状グアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（ｃＧＡＭＰ）又はＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を送達し得る。
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、インサイチュの個別化された癌ワクチン接種の為に、危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）及び腫瘍抗原を放出する為の及び病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を送達する為の局所的に活性化可能な免疫療法薬としてのＭＯＦ（例えば、ｎＭＯＦ）に関する。下の例に記載される通り、Ｘ線に依って活性化される時に、カチオン性ｎＭＯＦは活性酸素種を有効に生成してＤＡＭＰ及び腫瘍抗原を放出し乍ら、アニオン性ＣｐＧ－ＯＤＮをＰＡＭＰとして送達して、抗原提示細胞の成熟を容易化し得る。
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、目当ての１つ以上の治療薬剤に配位又は静電結合する様に修飾された表面を有するＭＯＦ（例えばｎＭＯＦ、例えばＭＯＦナノ粒子又はＭＯＬ）を提供する。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは：（ａ）複数の金属オキソクラスター二次構造単位（ＳＢＵ）と（前記の金属オキソクラスターＳＢＵの夫々は、１つ以上の第１の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記の１つ以上のアニオンの夫々は、１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上に配位する）；（ｂ）二又は三次元のマトリックスを形成する様に複数のＳＢＵを一緒に連結する複数の有機架橋リガンドとを含む。幾つかの実施形態では、ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵは、夫々が、ＳＢＵキャッピング基アニオンとして弱配位性アニオンを含む。代替的には、幾つかの実施形態では、複数の有機架橋リガンドは、電子求引性基若しくはリガンド、正電荷、又は其れ等の組み合わせを含む有機架橋リガンドを含む。幾つかの実施形態では、複数の有機架橋リガンドは、第２の金属イオンに配位結合した窒素ドナー基を含むリガンドを含み、前記の第２の金属イオンは、１つ以上の電子求引性基を含む少なくとも１つの第２の金属リガンドに更に配位する。本開示の修飾されたＭＯＦは、例えば、弱配位性キャッピング基又は電子求引性基若しくはリガンドを含む有機架橋リガンドを含まないＭＯＦの表面と比較して、目当ての１つ以上の治療薬剤に配位又は静電結合する増強された（即ち、増大した）能力を有する表面を有し得る。例えば、ＭＯＦは、配位又は静電相互作用に依って治療薬剤と結合し得る其の表面上のより多大な数の部位を有し得る。
幾つかの実施形態では、１つ以上の第１の金属イオンは、イオン化放射線を吸収する金属である。幾つかの実施形態では、金属イオンに依って吸収可能なイオン化放射線はＸ線である。幾つかの実施形態では、１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上は、Ｈｆ、ランタニド金属（Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、又はＬｕ）、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉを包含するが此れ等に限定されない群から選択される元素のイオンである。幾つかの実施形態では、ＭＯＦはＢｉ及び／又はＷイオンを不含である。幾つかの実施形態では、第１の金属イオンはＨｆイオンである。幾つかの実施形態では、複数のＳＢＵは、金属オキソクラスター、例えばＨｆ－オキソクラスターである。幾つかの実施形態では、オキソクラスターは、酸化物（Ｏ２ －）、水酸化物（ＯＨ－）、Ｓ２－、ＳＨ－、及び蟻酸（ＨＣＯ２ －）から選択されるアニオンを含む。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵは、夫々が、キャッピング基としての弱配位性アニオンを含む。「キャッピング基」に依って、ＳＢＵ上の１つの金属イオンのみに配位する金属リガンドが意味される。幾つかの実施形態では、キャッピング基は、ＭＯＦの表面、例えばＭＯＬの上側若しくは下側表面又はＭＯＦナノ粒子の外側表面に所在するＭＯＦのＳＢＵ上の金属リガンドである。幾つかの実施形態では、弱配位性アニオンはトリフルオロ酢酸及びトリフラートを含む群から選択される。此れ等の弱配位性アニオンは、酢酸、蟻酸、又は安息香酸等のより強配位性のキャッピング基を含むＭＯＦの修飾に依って導入され得る。幾つかの実施形態では、ＭＯＦはＨｆ１２オキソクラスター又はＨｆ６オキソクラスターを含む。
各ＳＢＵは、同じ架橋リガンドに対する配位結合に依って少なくとも１つの他のＳＢＵに結合される。別の遣り方で申し立てられると、各ＳＢＵは配位結合に依って少なくとも１つの架橋リガンドに結合され、此れは少なくとも１つの他のＳＢＵにも又配位結合する。
何れかの好適な架橋リガンド（単数又は複数）が用いられ得る。幾つかの実施形態では、各架橋リガンドは、複数の配位部位を含む有機化合物である。配位部位は、夫々が、金属カチオンとの配位結合を形成する事が出来る基、又は斯かる基を形成する事が出来る基を含み得る。其れ故に、各配位部位は、非共有電子対、負電荷、又は非共有電子対若しくは負電荷を形成する事が出来る原子若しくは官能基を含み得る。典型的な配位部位は、カルボン酸及び其処の誘導体（例えば、エステル、アミド、酸無水物）、窒素含有基（例えば、アミン、窒素含有芳香族及び非芳香族複素環）、アルコール、フェノール、及び他のヒドロキシル置換された芳香族基；エーテル、ホスホネート、リン酸、チオール、及び同類等の官能基を包含するが、此れ等に限定されない。
幾つかの実施形態では、各架橋リガンドは２及び１０個の間の配位部位を含む（即ち、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の配位部位）。幾つかの実施形態では、各架橋リガンドは２つ又は３つのＳＢＵに結合する事が出来る。幾つかの実施形態では、有機架橋リガンドの夫々はジカルボン酸又はトリカルボン酸である。例えば、有機架橋リガンドは、２つのカルボン酸基に依って又は夫々がカルボン酸基を含む２つの置換基に依って置換されたポルフィリン、クロリン、又はバクテリオクロリンであり得る。幾つかの実施形態では、２つのカルボン酸基の夫々は２つの別個のＳＢＵの金属イオンに対する配位結合を形成し得、ポルフィリン、クロリン、又はバクテリオクロリン窒素原子は別のカチオン（単数又は複数）（例えば、別の金属カチオン）に対する配位結合を形成し得る。
幾つかの実施形態では、各有機架橋リガンドは少なくとも２つの基を含み、前記の２つの基の夫々は、個々に、カルボン酸、芳香族又は非芳香族窒素含有基（例えば、ピリジン、ピペリジン、インドール、アクリジン、キノロン、ピロール、ピロリジン、イミダゾール、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアゾール、及びオキサゾール）、フェノール、アセチルアセトナート（ａｃａｃ）、ホスホネート、及びリン酸を含む群から選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの架橋リガンドは、カルボン酸含有リガンド、ピリジン含有架橋リガンド、フェノール含有リガンド、アセチルアセトナート含有架橋リガンド、ホスホネート含有架橋リガンド、又はリン酸含有架橋リガンドである。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの架橋リガンドは少なくとも２つのカルボン酸基を含む。
幾つかの実施形態では、複数の有機架橋リガンドは、少なくとも２つのカルボン酸基に依って置換されたポルフィリンを含み、任意に、複数の有機架橋リガンドは５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（ＤＢＰ）を含む。
幾つかの実施形態では、各架橋リガンドは、複数の配位部位を含む有機化合物であり、複数の配位部位は本質的に同一平面であるか、又は同一平面である配位結合を形成する事が出来る。
例示的な有機架橋リガンドは、
Figure 2023526501000002
Figure 2023526501000003
Figure 2023526501000004
Figure 2023526501000005
 を包含するが、此れ等に限定されず、式中、Ｘは、存在する場合には、Ｈ、ハロ（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ニトロ（ＮＯ２）、アルキル、置換アルキル（例えば、ヒドロキシ置換アルキル、チオール置換アルキル、又はアミノ置換アルキル）、及び同類から選択される。幾つかの実施形態では、Ｘは、色素、ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、ポルフィセン、若しくはクロロフィル、又は其の誘導体若しくはアナログ等だが此れ等に限定されない共有結合的に取り付けられた光増感剤を含む。例えば、Ｘは、アルキレンリンカー部分及びアミド、エステル、チオ尿素、ジスルフィド、又はエーテル結合に依って架橋リガンドに共有結合的に取り付けられたポルフィリンであり得る。
幾つかの実施形態では、有機架橋リガンドの連結基は窒素ドナー部分を含む。幾つかの実施形態では、有機架橋リガンドは、ビピリジン、フェニル－ピリジン、フェナントロリン、及びテルピリジンを含むが此れ等に限定されない群から選択される窒素ドナー部分を含み得、此れは、窒素ドナー部分の炭素原子の１つ以上に於いて１つ以上のアリール基置換基に依って任意に置換され得る。幾つかの実施形態では、有機架橋リガンドの少なくとも１つは、４，４’－ジ（４－ベンゾアート）－２，２’ビピリジン（ＤＢＢ）、４’，６’－ジベンゾアート－［２，２’－ビピリジン］－４－カルボキシレート（ＢＰＹ）、及び４’－（４－カルボキシフェニル）－［２，２’：６’，２”－テルピリジン］－５，５”－ジカルボキシレート（ＴＰＹ）から成る群から選択されるリガンドを含む。幾つかの実施形態では、有機架橋リガンドの少なくとも１つはＤＢＢを含む。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、更に、二又は三次元のＭＯＦネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された低分子治療薬剤（例えば、低分子化学療法薬剤）を含む。幾つかの実施形態では、低分子治療薬剤は化学療法薬剤、低分子阻害剤、及び／又は低分子免疫調節薬である。幾つかの実施形態では、低分子治療薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ＳＮ－３５、及びエトポシド等だが此れ等に限定されない低分子化学療法薬剤である。幾つかの実施形態では、低分子治療薬剤は、ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｂ細胞リンパ腫２蛋白質（Ｂｃｌ－２）阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）阻害剤、及びインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤等だが此れ等に限定されない低分子阻害剤である。幾つかの実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、インドキシモド（即ち、１－メチル－Ｄ－トリプトファン）、ＢＭＳ－９８６２０５、エパカドスタット（即ち、ＩＣＢＮ２４３６０）、及び１－メチル－Ｌ－トリプトファンを包含するが、此れ等に限定されない群から選択される。幾つかの実施形態では、低分子治療薬剤は低分子免疫調節薬である。幾つかの実施形態では、低分子免疫調節薬はイミキモド（ＩＭＤ）である。
幾つかの実施形態では、複数の有機架橋リガンドは、窒素ドナー基を含む有機架橋リガンドを含み、前記の窒素ドナー基は第２の金属イオンに配位し、前記の第２の金属イオンは、更に、１つ以上の電子求引性基を含む少なくとも１つの第２の金属リガンドに配位し、任意に、１つ以上の電子求引性基はハロ又はハロアルキル（例えば、ペルハロアルキル）基である。例えば、幾つかの実施形態では、窒素ドナー基を含む有機架橋リガンドはピリジン又はビピリジン部分を含む。幾つかの実施形態では、窒素ドナー基を含む有機架橋リガンドは４，４’－ジ（ｐ－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン（ＤＢＢ）である。幾つかの実施形態では、第２の金属イオンはイリジウム（Ｉｒ）又はルテニウム（Ｒｕ）イオンである。幾つかの実施形態では、第２の金属イオンはＩｒイオンである。幾つかの実施形態では、第２の金属イオンは２つの第２の金属リガンドに配位し、第２の金属リガンドの１つ又は両方は、ハロ、カルボニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、及びハロアルキル（例えば、ペルハロアルキル）等だが此れ等に限定されない１つ以上の電子求引性基を含む。幾つかの実施形態では、ハロアルキル基はハロ置換されたメチル基である。幾つかの実施形態では、ハロアルキルはペルハロアルキル基である（即ち、アルキル基の水素原子の全てがハロに依って置き換えられている）。幾つかの実施形態では、第２の金属リガンドの１つ又は両方は、１つ以上の電子求引性基に依って置換されたビピリジン（ｂｐｙ）又はフェニルピリジン（ｐｐｙ）である。幾つかの実施形態では、ｂｐｙ又はｐｐｙは、ハロ及びハロアルキルから選択される少なくとも２つの基に依って置換される。幾つかの実施形態では、ｂｐｙ又はｐｐｙは、フルオロ（Ｆ）及びトリフルオロメチルから選択される少なくとも２つの又は３つの基に依って置換される。幾つかの実施形態では、第２の金属リガンドの１つ又は両方は２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオメチル）ピリジン（ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ）である。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは少なくとも約５ミリボルト（ｍＶ）のゼータ（ζ）電位値を有する（例えば、少なくとも約５ｍＶ、少なくとも約１０ｍＶ、少なくとも約１５ｍＶ、少なくとも約２０ｍＶ、又は少なくとも約２５ｍＶ。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは少なくとも約３０ｍＶのζ電位値を有する。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは三次元ネットワークを含む。幾つかの実施形態では、三次元ネットワークはナノ粒子の形態で提供される。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは二次元ネットワークを含む。幾つかの実施形態では、ＭＯＦはナノスケールＭＯＬを含む。
ＩＩＩ．Ｂ．表面に結合した治療薬剤を有する金属有機構造体
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、目当ての１つ以上の治療薬剤の送達の為のＭＯＦ（例えば、ＭＯＦナノ粒子又はＭＯＬ）を提供する。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤の１つ以上は、配位結合又は静電相互作用に依ってＭＯＦの表面に取り付けられる。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは：（ａ）複数の金属オキソクラスター二次構造単位（ＳＢＵ）と（前記の金属オキソクラスターＳＢＵの夫々は１つ以上の第１の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記のアニオンの夫々は１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上に配位する）；（ｂ）二又は三次元のマトリックスを形成する様に複数のＳＢＵを一緒に連結する複数の有機架橋リガンドと；（ｃ）配位結合又は静電相互作用に依って前記のＭＯＦの表面に結合した目当ての１つ以上の治療薬剤とを含み、任意に、目当ての１つ以上の治療薬剤はＭＯＦの表面の複数のＳＢＵの１つ以上の金属イオンに配位結合する。
幾つかの実施形態では、第１の金属イオンは、イオン化放射線を吸収する金属のイオンである。イオン化放射線を吸収する金属は高Ｚ金属を包含する（即ち、Ｚ（即ち、原子番号又は陽子数）が４０よりも多大である元素）。イオン化放射線エネルギーは例えばＸ線、ガンマ（γ）線、ベータ（β）放射線、又は陽子放射線を包含し得る。幾つかの実施形態では、第１の金属イオンはＸ線を吸収する金属のイオンである。幾つかの実施形態では、第１の金属イオンは、Ｈｆ、ランタニド金属、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉから選択される金属のイオンである。幾つかの実施形態では、第１の金属イオンはＨｆイオンである。
目当ての何れかの好適な治療薬剤は表面に結合され得る。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は、核酸、リン酸又はカルボン酸基を含む低分子治療薬剤、及び表面のアクセス可能なリン酸又はカルボン酸基を含む高分子から選択される。幾つかの実施形態では、治療薬剤は、免疫系を標的化する治療薬剤、例えば本明細書に於いて上で記載された薬剤の１つである。幾つかの実施形態では、高分子は蛋白質又はペプチドである。幾つかの実施形態では、蛋白質は抗体又は抗体断片（例えば、抗原結合領域を包含する抗体断片）である。幾つかの実施形態では、蛋白質は、抗分化抗原群３７（ＣＤ３７）抗体、抗分化抗原群４４（ＣＤ４４）抗体、抗分化抗原群４７（ＣＤ４７）抗体、抗分化抗原群７３（ＣＤ７３）抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）抗体、及び抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連蛋白質４（ＣＴＬＡ－４）抗体等だが此れ等に限定されない抗体から選択される。幾つかの実施形態では、蛋白質は抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤の１つはペプチドである。幾つかの実施形態では、ペプチドは膜ムチン－１（ＭＵＣ－１）ムチンを標的化するペプチドである。幾つかの実施形態では、ペプチドはシステイン－グルタミン－システイン（ＣＱＣ）モチーフを有する。幾つかの実施形態では、ペプチドはＤ－アミノ酸配列である。幾つかの実施形態では、Ｄ－アミノ酸配列はアミノ酸配列ｄ－ＣＱＣＲＲＫＮ（配列番号１）を含むか又は其れから成る。幾つかの実施形態では、ペプチドは膜透過ペプチドである。幾つかの実施形態では、ペプチドはアミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ（配列番号２）を含むか又は其れから成る。
幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤の１つは核酸を含むか又は其れから成る。例えば、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ、又は環状ジヌクレオチドであり得る。幾つかの実施形態では、ＯＤＮはＣｐＧ－ＯＤＮである（即ち、シトシン、次にグアニンを含む短い一本鎖ＤＮＡ）。幾つかの実施形態では、環状ジヌクレオチドは、ｃ－ジ－ＡＭＰ又はｃＧＡＭＰ等だが此れ等に限定されないＳＴＩＮＧアゴニストである。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、更に、二又は三次元のネットワークの細孔又は空洞部に（例えば、ＭＯＦナノ粒子のコアの細孔に）封鎖された１つ以上の追加の治療薬剤を含む。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、約１ｗｔ％及び約５０ｗｔ％の間（例えば、約１ｗｔ％、約５ｗｔ％、約１０ｗｔ％、約１５ｗｔ％、約２０ｗｔ％、約２５ｗｔ％、約３０ｗｔ％、約３５ｗｔ％、約４０ｗｔ％、約４５ｗｔ％、又は約５０ｗｔ％）の前記の１つ以上の追加の治療薬剤を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬剤は低分子化学療法薬剤、低分子阻害剤、及び低分子免疫調節薬から選択され得る。低分子化学療法薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ＳＮ－３５、及びエトポシドを包含するが、此れ等に限定されない。幾つかの実施形態では、低分子阻害剤はＰＬＫ１阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｂｃｌ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＥＮＰＰ１阻害剤、及びＩＤＯ阻害剤から選択され得る。幾つかの実施形態では、追加の治療薬剤は低分子免疫調節薬を包含する。幾つかの実施形態では、低分子免疫調節薬はＩＭＤである。
幾つかの実施形態では、複数のＳＢＵはＨｆオキソクラスターを含み、複数の有機架橋リガンドはＤＢＰを含む。其れ故に、幾つかの実施形態では、ＭＯＦはＨｆ－ＤＢＰナノ粒子又はＭＯＬを含み、目当ての１つ以上の治療薬剤は、表面のアクセス可能なＳＢＵのＨｆイオンに対する配位結合に依って前記のＭＯＦの表面に結合される。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は１つ以上の抗体を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の治療薬剤は抗ＣＤ４７抗体を含む。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、更に、ＭＯＦの二又は三次元のネットワークの細孔又は空洞部に封鎖されたＩＭＤを含む。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは三次元のネットワークであり、ナノ粒子として提供される。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは約１ｗｔ％から約５０ｗｔ％のＩＭＤ又は抗ＣＤ４７抗体を含む。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは約１ｗｔ％から約２５ｗｔ％のＩＤＭ又は抗ＣＤ４７抗体を含む。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは約９ｗｔ％のＩＭＤ及び約７．５ｗｔ％の抗ＣＤ４７抗体を含む。
幾つかの実施形態では、複数のＳＢＵはＨｆオキソクラスターを含み、複数の有機架橋リガンドは第２の金属イオン（例えば、Ｉｒ又はＲｕイオン）に配位したＤＢＢを含み、前記の第２の金属イオン（例えば、Ｉｒ又はＲｕイオン）は更に２つの（ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ）に配位し；目当ての１つ以上の治療薬剤は静電相互作用に依って前記のＭＯＦの表面に結合される。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は核酸を含む。幾つかの実施形態では、核酸はＳＴＩＮＧアゴニスト又はＣｐＧ－ＯＤＮである。幾つかの実施形態では、核酸はＣｐＧ－ＯＤＮである。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは約１ｗｔ％から約５０ｗｔ％の目当ての１つ以上の治療薬剤を含む（例えば、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、又は約５０ｗｔ％の目当ての１つ以上の治療薬剤）。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは約１ｗｔ％から約２５ｗｔ％の目当ての１つ以上の治療薬剤を含む。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は抗体を含む。
幾つかの実施形態では、複数のＳＢＵはＨｆオキソクラスターを含み、複数の有機架橋リガンドはＤＢＰを含み、ＤＢＰの窒素原子は金属イオン（例えば、Ｐｔイオン）に配位し、目当ての１つ以上の治療薬剤はＭＯＦの表面に結合される。幾つかの実施形態では、ＭＯＦはナノ粒子を含む。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の薬剤は、１つ以上のＭＵＣ－１ペプチド（即ち、ＭＵＣ－１を標的化する１つ以上のペプチド）、ＣｐＧ－ＯＤＮ、及びｃＧＡＭＰから選択される。幾つかの実施形態では、１つ以上のＳＢＵはＨｆオキソクラスターを含み、１つ以上の有機架橋リガンドはＩｒ（ＤＢＢ）［ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ］２ ＋（即ち、ＤＢＢＦ－Ｉｒ）を含み、ｃＧＡＭＰはＭＯＦの表面に結合される。幾つかの実施形態では、ＭＯＦはＭＯＬである。
ＩＩＩ．Ｃ．医薬製剤
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、医薬組成物又は製剤を提供し、（ｉ）ＭＯＦの表面に結合した目当ての１つ以上の治療薬剤を含む本明細書に於いて上で記載されたＭＯＦと（ｉｉ）薬学的に許容される担体、例えばヒトに於いて薬学的に許容される薬学的に許容される担体とを含む。幾つかの実施形態では、組成物は、脂質、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性の抗生物質、懸濁剤、増粘剤、及び組成物を組成物が投与されるべき対象の体液と等張にする溶質等だが此れ等に限定されない他のコンポーネントをも又包含し得る。幾つかの実施形態では、医薬組成物又は製剤は、更に、追加の治療薬剤、例えば従来の化学療法薬剤又は免疫療法薬剤を包含する。例えば、幾つかの実施形態では、医薬組成物又は製剤は、更に、抗体免疫療法薬剤を包含する（例えば、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＯＸ４０抗体（即ち、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）としても又公知の分化抗原群１３４（ＣＤ１３４）に対する抗体）、抗Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３）抗体、抗ＬＡＧ３抗体、並びに抗ＣＤ４７抗体等だが此れ等に限定されない抗体免疫チェックポイント阻害剤。
本開示の主題の組成物は、幾つかの実施形態では、薬学的に許容される担体を包含する組成物を含む。何れかの好適な医薬製剤が、対象への投与の為の組成物を調製する為に用いられ得る。幾つかの実施形態では、組成物及び／又は担体はヒトに於いて薬学的に許容され得る。
例えば、好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性の抗生物質、及び製剤を対象の体液と等張にする溶質を含有し得る水系及び非水系の無菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を包含し得る水系及び非水系の無菌の懸濁液を包含し得る。製剤は、ユニットドーズ又はマルチドーズ容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルとして提示され得、凍結又はフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され、使用に直ちに先立っての無菌の液体担体、例えば注射用の水の追加のみを要求し得る。幾つかの例示的な成分は、１つの例では０．１から１０ｍｇ／ｍｌの範囲、別の例では約２．０ｍｇ／ｍｌのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり；及び／又は例えば１０から１００ｍｇ／ｍｌの範囲、別の例では約３０ｍｇ／ｍｌのマンニトール若しくは別の糖；及び／又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
上で具体的に言及された成分に加えて、此の本開示の主題の製剤は、当該製剤の型に配慮して当分野の従来の他の薬剤を包含し得るという事は理解されるべきである。例えば、無菌のパイロジェンフリーの水系及び非水系溶液が用いられ得る。
ＩＶ．処置の方法
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、其れを必要とする対象の癌を処置する方法を提供する。幾つかの実施形態では、方法は、本明細書に於いて上で記載されたＭＯＦを前記の対象に投与する事を含み、此処で、ＭＯＦは、複数の金属オキソクラスターＳＢＵと（各金属オキソクラスターＳＢＵは１つ以上の第１の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記のアニオンの夫々は１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上に配位する）；複数のＳＢＵを一緒に連結して二又は三次元のネットワークを形成する複数の有機架橋リガンドと；配位結合又は静電相互作用に依って前記のＭＯＦの表面に（例えば、ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵの１つ以上の金属イオンに）結合した目当ての１つ以上の治療薬剤とを含む。幾つかの実施形態では、方法は、更に、対象（即ち、対象の少なくとも或る部分）をイオン化放射線エネルギー（例えば、Ｘ線、γ線、β放射線、又は陽子放射線）に暴露する事を含む。例えば、ＭＯＦが局所的な腫瘍に局在する事を許す為にＭＯＦの投与後に或る期間（例えば、数分から最高で数時間）に渡って待った後に、対象はイオン化放射線エネルギーに暴露され得る。期間は、ＭＯＦの投与の方法に基づいて調整され得る。幾つかの実施形態では、イオン化放射線エネルギーはＸ線である。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは直接的に腫瘍に又は静脈内投与される。幾つかの実施形態では、癌に罹ったか又は癌に罹った部位の近くの対象の解剖学の部分が、イオン化放射線に暴露される。
対象は、何れかの好適な様式で及び／又は何れかの好適な装置、例えば医学的若しくは獣医学的環境でＸ線を送達する為に現行で用いられている物を用いて、イオン化放射線エネルギーに暴露され得る。幾つかの実施形態では、Ｘ線源及び／又は出力は、疾患処置を増強する為に改良され得る。例えば、Ｘ線は、Ｘ線放射線を原因とする患者のＤＮＡ損傷を最小化及びシンチレータに依るＸ線吸収を最大化する様に選ばれたピーク電圧、電流、及び／又は任意にフィルターを用いて生成され得る。
幾つかの実施形態では、対象は、線形加速器（ＬＩＮＡＣ）に依って、従来の技術、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）、画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ）、又は体幹部定位放射線治療（ＳＢＲＴ）、６０Ｃｏ放射線源、インプラントされた放射性シード、例えば小線源療法に用いられる物、慣用電圧若しくは超高圧Ｘ線照射装置、ＬＩＮＡＣから生成する高エネルギー電子線、又は陽子源を用いて照射される。幾つかの実施形態では、照射は、タングステン又は別の金属ターゲット、コバルト－６０源（コバルトユニット）、線形加速器（リニアック）、Ｉｒ－１９２源、及びセシウム－１３７源を用いてＸ線を生成する事を含み得る。幾つかの実施形態では、照射は、対象の照射に先立って、Ｘ線（例えば、タングステンターゲットを用いて生成したＸ線）又は他のイオン化放射線をフィルターに通す事を含む。幾つかの実施形態では、フィルターは、少なくとも２０の原子番号を有する元素を含み得る。幾つかの実施形態では、フィルターは銅（Ｃｕ）を含む。幾つかの実施形態では、フィルターは約５ミリメートル（ｍｍ）未満である厚さを有し得る。幾つかの実施形態では、フィルターは約４ｍｍ未満の厚さを有し得る（例えば、約３ｍｍ未満、１ｍｍ未満、約０．５ｍｍ未満、約０．４ｍｍ未満、約０．３ｍｍ未満、約０．２ｍｍ未満、又は約０．１ｍｍ未満）。
Ｘ線は、Ｘ線放射線を原因とする患者のＤＮＡ損傷を最小化及びシンチレータに依るＸ線吸収を最大化する様に選ばれたピーク電圧、電流、及び／又は任意にフィルターを用いて生成され得る。幾つかの実施形態では、Ｘ線は、約２３０ｋＶｐ未満であるピーク電圧を用いて生成される。幾つかの実施形態では、ピーク電圧は約２２５ｋＶｐ未満、約２００ｋＶｐ未満、約１８０ｋＶｐ未満、約１６０ｋＶｐ未満、約１４０ｋＶｐ未満、約１２０ｋＶｐ未満、約１００ｋＶｐ未満、又は約８０ｋＶｐ未満である。幾つかの実施形態では、Ｘ線は、約１２０ｋＶｐであるピーク電圧を用いて生成される。
幾つかの実施形態では、Ｘ線は、放射線源を一時的な又は永久的な基準で対象内に置く事に依って生成される。幾つかの実施形態では、本開示の主題のＭＯＦは放射線源のインプラントと併せて注射される。
本開示の主題の幾つかの実施形態では、Ｘ線（又は他のイオン化放射線エネルギー）源は、より効率的な殺癌細胞を可能化する為にＭＯＦのＲＴ－ＲＤＴ効果を増強する様に改良され得る。幾つかの実施形態では、Ｘ線照射装置は、遮蔽されたエンクロージャー内に少なくとも１つのＸ線源を含むパノラマ照射装置を包含し得、１つ以上の線源は、夫々が、腫瘍の最も近い直面する表面積に等しい面積上にＸ線フラックスを発光する様に作動可能である。米国特許出願公開第２０１０／０１８９２２２号及び国際公開第２０１１／０４９７４３号を見よ。此れ等の夫々は其の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。タングステンターゲット発光に基づくＸ線生成装置は此の適用に適する。出力エネルギーは典型的には１００から５００ｋＶの範囲である。ある種の実施形態では、原子番号＞２０を有する少なくとも１つの金属を含有する選択された材料の少なくとも１つの可撤性の減衰器又はフィルターが、此の適用に関わる。各減衰器は、平たい板、又は勾配の厚さを有する板であり得る。其の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる米国特許第７，４３０，２８２号を見よ。減衰器は周期的な間隔のグリッド／ホールに依っても又調節され得る。出力Ｘ線エネルギーは、此の適用に於ける放射線増感剤／ラジオシンチレータのエネルギー吸収を最大化する為に、減衰器に依るフィルター処理後に調整され得る。ｘ線を屈折させる為のｘ線屈折レンズを有するＸ線バンドパスフィルターも又用いられ得る。其の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１０２６３２号を見よ。
幾つかの実施形態では、方法は、更に、追加の治療薬剤又は処置、例えば免疫療法薬剤及び／又は癌処置を対象に投与する事を含む。幾つかの実施形態では、追加の治療薬剤又は処置は、外科手術、化学療法、毒素治療、凍結療法、及び遺伝子治療を含む群から選択される。追加の癌処置は、処置されようとする癌及び／又は他の因子、例えば患者の処置既往、健康全般等に基づいて、主治医の最善の判断に従って選択され得る。
幾つかの実施形態では、追加の癌処置は、白金含有薬剤（例えば、シスプラチン若しくはオキサリプラチン又は其のプロドラッグ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ミトキサントロン、パクリタキセル、ジギトキシン、ジゴキシン、及びセプタシジン等だが此れ等に限定されない従来の化学療法薬、又は当分野に於いて公知の別の従来の化学療法薬を患者に投与する事を含み得る。追加の化学療法薬剤はＭＯＦ上に存在し得る（例えば、封入されるか、又はＭＯＦに配位若しくは共有結合する）。代替的には、追加の化学療法薬剤は、ＭＯＦと同じ医薬組成物又は製剤中に、或いはＭＯＦを含む医薬組成物若しくは製剤及び／又は放射線の投与に先立って、同時に、又は後に投与される別個の医薬組成物又は製剤中に存在し得る。
幾つかの実施形態では、追加の癌処置には、ポリマー系ミセル製剤、非対称脂質二重層、リポソーム製剤、デンドリマー製剤、ポリマーに基づくナノ粒子製剤、シリカに基づくナノ粒子製剤、ナノスケール配位ポリマー製剤、ナノスケール金属有機構造体製剤、及び無機ナノ粒子（金、酸化鉄ナノ粒子等）製剤を含む群から選択される薬物製剤を患者に投与する事が関わり得る。幾つかの実施形態では、薬物製剤は従来の化学療法薬を包含する製剤であり得る。
本開示の主題に従う使用の為の免疫療法薬剤は、当分野に於いて公知の何れかの好適な免疫療法薬剤であり得る。本開示の主題への使用に好適な免疫療法薬剤は：ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、及びＣＣＲ７阻害剤、詰まり、標的又は標的関連リガンドをコードするポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能、転写、転写安定性、翻訳、修飾、局在、又は分泌を阻害又は改変する組成物、例えば抗標的抗体、標的の低分子アンタゴニスト、標的をブロックするペプチド、標的のブロック融合蛋白質、又は標的を抑制する短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）／ｓｈＲＮＡ／マイクロＲＮＡ／ｐＤＮＡを包含するが、此れ等に限定されない。本開示の主題に従って用いられ得る抗体は：抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）、抗ＣＤ２０（オファツムマブ）、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＣＤ４７抗体、抗ＧＤ２抗体等を包含するが、此れ等に限定されない。本開示の主題に従う使用の為のコンジュゲート化モノクローナル抗体は：放射性標識抗体（例えば、イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン）等）、化学標識抗体（抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ））、（例えば、ブレンツキシマブベドチン（アドセトリス）、アドトラスツズマブエムタンシン（カドサイラ）、デニロイキンジフチトクス（オンタック）等）を包含するが、此れ等に限定されない。本開示の主題に従う使用の為のサイトカインは：インターフェロン（即ち、ＩＦＮ－α、ＩＮＦ－γ）、インターロイキン（即ち、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）、ＴＮＦ－α等を包含するが、此れ等に限定されない。本開示の主題に従う使用の為の他の免疫療法薬剤は、多糖－Ｋ、ネオアンチゲン等を包含するが、此れ等に限定されない。
幾つかの実施形態では、免疫療法薬剤は、ＤＮＡ又はＲＮＡセンサーのアゴニスト、例えばＲＩＧ－Ｉアゴニスト（例えば、其の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる米国特許第７，２７１，１５６号に記載されている化合物）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、ポリイノシン：ポリシチジル酸）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ＩＭＤ）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ－ＯＤＮ）、及びＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ＳＴＩＮＧＶＡＸ又はＡＤＵ－Ｓ１００）から選択され得る。幾つかの実施形態では、免疫療法薬剤は、ＰＤ－１阻害剤（例えば、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、又はデュルバルマブ）、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、イピリムマブ）、ＩＤＯ阻害剤（例えば、インドキシモド、ＢＭＳ－９８６２０５、又はエパカドスタット）、及びＣＣＲ７阻害剤を含む群から選択される。幾つかの実施形態では、免疫療法薬剤は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ阻害剤、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的化するｓｉＲＮＡ、ＩＤＯを標的化するｓｉＲＮＡ、及びＣＣケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）を標的化するｓｉＲＮＡ、並びに本明細書に於いて他所に記載されるか又は当分野に於いて公知である何れかの他の免疫療法薬剤を包含するが此れ等に限定されない群から選択される。
其れ故に、幾つかの実施形態では、本開示の主題は癌を処置する方法を提供し、此れはＸ線に依って誘導されるＲＤＴ及び免疫療法を組み合わせる。従って、幾つかの実施形態では、本開示の主題は：１つ以上の表面に結合した治療薬剤を含む本明細書に記載されるＭＯＦ又はＭＯＬを患者に投与し、患者の少なくとも或る部分にＸ線を（例えば、１から５０フラクションで）照射する事と；患者に免疫療法薬剤を投与する事とを含む方法を提供する。免疫療法薬剤は、ＭＯＦ及び／若しくは照射と同時に、又はＭＯＦを投与する事及び／若しくは照射に先立って若しくは後に、何方かで投与され得る。幾つかの実施形態では、免疫療法薬剤は、ＤＮＡ又はＲＮＡセンサーのアゴニスト、例えばＲＩＧ－１アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）アゴニスト（例えば、ポリイノシン：ポリシチジル酸）、Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニスト（例えばＩＭＤ）、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニスト（例えば、ＣｐＧ－ＯＤＮ）、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト（例えば、ＳＴＩＮＧＶＡＸ又はＡＤＵ－Ｓ１００）、又はＩＤＯ阻害剤を包含するが此れ等に限定されない群から選択される。幾つかの実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、インドキシモド（即ち、１－メチル－Ｄ－トリプトファン）、ＢＭＳ－９８６２０５、エパカドスタット（即ち、ＩＣＢＮ２４３６０）、及び１－メチル－Ｌ－トリプトファンを包含するが此れ等に限定されない群から選択される。幾つかの実施形態では、免疫療法薬剤は免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、例えば抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体（即ち、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、又は抗ＣＤ４７抗体であり得る。幾つかの実施形態では、免疫療法薬剤は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
幾つかの実施形態では、癌は、頭部腫瘍、頚部腫瘍、乳癌、婦人科腫瘍、脳腫瘍、大腸癌、肺癌、中皮腫、軟部肉腫、皮膚癌、結合組織癌、脂肪癌、胃癌、肛門性器癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、中枢神経系癌、網膜癌、血液癌、神経芽腫、多発性骨髄腫、リンパ癌、及び膵臓癌から選択される。幾つかの実施形態では、疾患は、大腸癌、メラノーマ、頭頸部癌、脳の癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、及び膵臓癌から選択される。幾つかの実施形態では、疾患は大腸癌、メラノーマ、肺癌、及び膵臓癌から選択される。幾つかの実施形態では、疾患は転移癌である。
幾つかの実施形態では、本開示のＭＯＦの使用は、目当ての１つ以上の治療薬剤の１つ以上について長期放出プロファイルを提供する（例えば、目当ての遊離のＭＯＦに結合していない治療薬剤の投与と比較して）。幾つかの実施形態では、放出速度はチューニング可能である。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは数時間又は数日の期間に渡って目当ての１つ以上の治療薬剤の持続放出を提供する。幾つかの実施形態では、ＭＯＦの投与は、目当ての１つ以上の治療薬剤の治療上有効なドーズを低める（例えば、目当ての同じ治療薬剤がＭＯＦに結びついていない遊離の形態で投与される時と比較して）。幾つかの実施形態では、治療薬の持続放出は４時間から２週迄チューニングされ得る。幾つかの実施形態では、此れは、ＳＢＵ上の金属の開放された配位部位数及び電荷数と有機リガンドの電荷数及び電子密度とをチューニングする事に依って、並びに適切な電荷、配位の強さ、及び多価性の治療薬剤を選択する事に依って、達成され得る。
Ｖ．対象
本明細書に於いて開示される方法及び組成物は、インビトロのサンプルに対して（例えば、単離された細胞又は組織に対して）又はインビボで対象（即ち生きている生物、例えば患者）に何方かで用いられ得る。幾つかの実施形態では、対象又は患者はヒト対象であるが、本開示の主題の原理は、本開示の主題が哺乳動物を包含する全ての脊椎動物種について有効であるという事を指示しているという事は理解されるべきである。此れ等は用語「対象」及び「患者」に包含される事を意図される。其の上、哺乳動物は、本明細書に於いて開示される組成物及び方法を使用する事が望ましい何かの哺乳類種、具体的には農業用の及び家庭用の哺乳類種を包含すると理解される。
斯くして、本開示の主題の方法は温血脊椎動物に特に有用である。其れ故に、本開示の主題は哺乳動物及び鳥に関する。より具体的には、哺乳動物、例えばヒト、並びにヒトにとって絶滅危惧である事を原因として重要な（例えばシベリアトラ）、経済的に重要な（ヒトに依る消費の為に農場で育てられる動物）、及び／又は社会的に重要な（ペットとして又は動物園で飼われている動物）哺乳動物、例えばヒト以外の肉食動物（例えば猫及び犬）、豚（育成豚、成豚、及び猪）、齧歯類（例えばラット、マウス、ハムスター、モルモット等）、反芻動物（例えば畜牛、雄牛、羊、麒麟、鹿、山羊、野牛、及び駱駝）、及び馬の為の方法及び組成物が提供される。鳥の処置も又提供され、絶滅危惧であるか、動物園で飼われているか、又はペットとしての種類の鳥（例えば鸚鵡）、並びに食用鳥、より具体的には飼育食用鳥、例えば家禽、例えば七面鳥、鶏、家鴨、鴨、ホロホロチョウ、及び同類の処置を包含する。何故なら、其れ等も又ヒトにとって経済的に重要であるからである。其れ故に、家畜豚（育成豚及び成豚）、反芻動物、馬、家禽、及び同類を包含するが此れ等に限定されない家畜の処置も又提供される。
ＶＩ．投与
本開示の主題の組成物の投与の為の好適な方法は、静脈内及び腫瘍内注射、経口投与、皮下投与、腹腔内注射、頭蓋内注射、並びに直腸投与を包含するが、此れ等に限定されない。代替的には、組成物は、何れかの他の様式で、例えば組成物を肺経路にスプレーする事に依って、処置が必要な部位に堆積させられ得る。本開示の主題の組成物を投与する特定のモードは、処置されるべき細胞の分布及び存在量、並びに其の投与部位からの組成物の代謝又は除去のメカニズムを包含する種々の因子に依存する。例えば、比較的表層の腫瘍は腫瘍内注射され得る。対照的に、内部の腫瘍は静脈内注射に従って処置され得る。
幾つかの実施形態では、投与の方法は、処置されるべき部位に於ける局所化された送達又は蓄積の為の特徴を包摂する。幾つかの実施形態では、組成物は腫瘍内に送達される。幾つかの実施形態では、対象への組成物の選択的送達は、組成物の静脈内注射、次に対象のイオン化放射線処置（例えば、Ｘ線放射線）に依って達成される。
肺経路への組成物の送達の為には、本開示の主題の組成物はエアロゾル又は粗粒スプレーとして製剤され得る。エアロゾル又はスプレー製剤の調製及び投与の為の方法は、例えば米国特許第５，８５８，７８４号；米国特許第６，０１３，６３８号；米国特許第６，０２２，７３７号；及び米国特許第６，１３６，２９５号に見出され得る。
ＶＩＩ．ドーズ
有効なドーズの本開示の主題の組成物が対象に投与される。「有効量」は、検出可能な処置を生ずる為に十分な組成物の量である。特定の対象及び／又は標的について所望の効果を達成する為に有効である組成物の量を投与する為には、本開示の主題の組成物の構成成分の実際の用量レベルは様々であり得る。選択される用量レベルは組成物の活性（例えば、ＲＴ－ＲＤＴ活性又はＭＯＦ及び／若しくはＭＯＬ担持）及び投与経路に依存し得る。
本開示の主題の本明細書に於ける開示の吟味後に、当業者は、特定の製剤、組成物に用いられるべき投与の方法、及び処置されるべき標的の性質を考慮に入れて、用量を個々の対象に合わせて仕立て得る。斯かる調整又は変形、並びに斯かる調整又は変形を何時及び如何に為すかの評価は、当業者には周知である。
ＶＩＩＩ．金属有機構造体を修飾する方法
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、ＭＯＦに対する目当ての１つ以上の治療薬剤の表面相互作用及び／又は結合を増強する方法を提供する。幾つかの実施形態では、方法は、（ｉ）目当ての治療薬剤のカルボン酸若しくはリン酸置換基に依って置き換えられ得る弱配位アニオンに配位結合した１つ以上の表面のアクセス可能な配位部位を提供する事、又は（ｉｉ）１つ以上の電子求引性の架橋リガンド、正電荷を含む１つ以上の架橋リガンド、又は其れ等の組み合わせを含むＭＯＦを提供する事に依って、ＭＯＦ（即ち、複数の金属オキソクラスターＳＢＵと複数のＳＢＵを一緒に連結する複数の有機架橋リガンドとを含むＭＯＦ）の表面を修飾する事を含む。
幾つかの実施形態では、方法は、（ｉａ）有機架橋リガンドに依って一緒に連結された金属オキソクラスターＳＢＵを含む親のＭＯＦを提供し、前記のＳＢＵの夫々は１つ以上の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記のＭＯＦは複数の表面のアクセス可能な金属オキソクラスターＳＢＵを含み、此処で、前記の表面のアクセス可能な金属オキソクラスターＳＢＵの夫々の１つ以上のアニオンはＳＢＵキャッピング基として強配位性アニオンを含む事と；（ｉｂ）強配位性アニオンを弱配位性アニオンに依って置き換える為の好適な試薬と親のＭＯＦを接触させる事に依って、強配位性アニオンを除去する事とを含む。幾つかの実施形態では、強配位性アニオンは酢酸又は蟻酸アニオンである。幾つかの実施形態では、試薬は、トリフルオロ酢酸トリメチルシリル（ＴＭＳ－ＴＦＡ）、トリメチルシリルトリフラート、及び約３未満のｐＫａを有する鉱酸から選択される。幾つかの実施形態では、弱配位性アニオンはトリフルオロ酢酸アニオン又はトリフラートアニオンである。
幾つかの実施形態では、方法は、電子求引性基を含む１つ以上の架橋リガンド、正電荷を含む１つ以上の架橋リガンド、又は其れ等の組み合わせを含むＭＯＦを提供する事を含む。幾つかの実施形態では、電子求引性基は、ハロ、カルボニル、スルホニル、シアノ、ニトロ、及びハロアルキル（例えば、ペルハロアルキル）から選択される。幾つかの実施形態では、電子求引性基はフルオロ又はトリフルオロメチルである。幾つかの実施形態では、方法は、有機架橋リガンドに依って一緒に連結された金属オキソクラスターＳＢＵを含むＭＯＦを提供する事を含み、前記のＳＢＵの夫々は、１つ以上の第１の金属イオン（例えば、Ｈｆ）と前記の１つ以上の第１の金属イオンに配位した１つ以上のアニオンとを含み、前記の有機架橋リガンドは、配位したＳＢＵに結びついていない第２の金属イオン（例えば、Ｉｒ、Ｒｕ、又はＰｔ）を含む少なくとも１つの有機架橋リガンドを含み、前記の第２の金属イオンは、更に、１つ以上の電子求引性のリガンドに配位し、任意に、前記の電子求引性のリガンドは、ハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたビピリジン又はフェニルピリジンリガンドである。幾つかの実施形態では、電子求引性のリガンドは、ハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたビピリジンリガンドである。幾つかの実施形態では、ＭＯＦを提供する事は、ジ（４－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン（ＤＢＢ）架橋リガンドを含むＭＯＦを提供する事を含み、前記のＤＢＢ架橋リガンドは、２つの異なる金属オキソクラスターＳＢＵの第１の金属イオンに及び第２の金属イオンに配位し、前記の第２の金属イオンは、更に、２つのハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたピリジンリガンドに配位する。幾つかの実施形態では、ハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたピリジンリガンドは夫々が２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオロメチル）－ピリジンである。幾つかの実施形態では、第２の金属イオンはＩｒである。幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、イオン化放射線を吸収する金属イオンを含む１つ以上のＳＢＵを含む。幾つかの実施形態では、イオン化放射線はｘ線である。幾つかの実施形態では、金属イオンは、Ｈｆ、ランタニド金属、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉから選択される元素のイオンである。幾つかの実施形態では、金属イオンはＢｉイオン又はＷイオンではない。幾つかの実施形態では、金属イオンはＨｆイオンである。
幾つかの実施形態では、ＭＯＦは、表面修飾無しのＭＯＦと比較して、目当ての１つ以上の治療薬剤に対する増強された相互作用及び／又は結合能力を有する。幾つかの実施形態では、目当ての１つ以上の治療薬剤は、表面のアクセス可能なリン酸又はカルボン酸基を含む核酸、低分子、及び／又は高分子から選択される。幾つかの実施形態では、蛋白質は、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、及び抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む群から選択される。幾つかの実施形態では、核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮ、及び環状ジヌクレオチドを含む群から選択される。幾つかの実施形態では、環状ジヌクレオチドはＳＴＩＮＧアゴニストである。幾つかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストはｃ－ジ－ＡＭＰ又はｃＧＡＭＰである。
次の例は、本開示の主題の代表的な実施形態を実施する為の手引きを当業者に提供する為に包含されている。本開示及び一般的な技術水準に照らして、当業者は、次の例が例示的である事のみを意図されるという事と、数々の変更、改変、及び変調が本開示の主題の範囲から逸脱する事無しに使用され得るという事とを了解し得る。
例１
例１～８の材料及び方法
全ての化学物質は、別様に言及されない限り、シグマアルドリッチ（Sigma－Aldrich）（セントルイス、ミズーリ、米国）及びフィッシャー（Fisher）（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）から購入し、更なる精製無しで用いた。イミキモド（粉末、９５％）はケイマンケミカル（Cayman Chemical）（アナーバー、ミシガン、米国）から購入した。インビボＭＡｂ抗マウスＣＤ４７ポリクローナル抗体（αＣＤ４７、ＭＩＡＰ３０１）はバイオエクセル（Bio X Cell）（レバノン、ニューハンプシャー、米国）から購入した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、商標ＡｖａｎｃｅＩＩ（商標）で販売されている５００ＭＨｚＮＭＲスペクトロメーター（ブルカー（Bruker）、ビレリカ、マサチューセッツ、米国）を用いてデフォルトブルカーＱＮＰプローブ１９Ｆ｛１Ｈ｝（ブルカー（Bruker）、ビレリカ、マサチューセッツ、米国）に依って収集し、ＤＭＳＯ－Ｄ６の不完全な重水素化からの１Ｈ共鳴を参照した。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）はＴＥＣＮＡＩスピリットＴＥＭ（ＦＥＩカンパニー（FEI Company）、ヒルズボロ、オレゴン、米国）に依って行なった。紫外－可視（ＵＶ－ｖｉｓ）吸収スペクトルはＵＶ－２６００－ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（株式会社島津製作所、京都、日本）に依って取得した。粒子サイズは動的光散乱（ＤＬＳ）に依って収集し、ζ電位はナノシリーズゼータサイザー（マルバーン・パナリティカル（Malvern Panalytical）、ウェストボロー、マサチューセッツ、米国）に依る電気泳動に依って測定した。粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）データはＤ８ベンチャー回折装置（ブルカー（Bruker）、ビレリカ、マサチューセッツ、米国）に依ってＣｕＫα放射線源（λ＝１．５４１７８Å）を用いて収集し、ＰｏｗｄｅｒＸソフトウェアに依って処理した。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）データは７７００ｘＩＣＰ－ＭＳ（アジレントテクノロジーズ（Agilent Technologies）、サンタクララ、カリフォルニア、米国）から得、ＩＣＰ－ＭＳマスハンターバージョンＢ０１．０３を用いて分析した。サンプルを２％ＨＮＯ３マトリックスに依って希釈し、０．１ｐｐｂから５００ｐｐｂの範囲の１０点標準曲線に対して１１５Ｉｎ内部標準に依って分析した。相関は目当ての全ての分析について＞０．９９９であった。データ収集はスペクトルモードに於いてサンプル当たり５レプリケート且つレプリケート当たり１００スイープで行なった。ＬＣ－ＭＳデータは、１２９０ＵＨＰＬＣ（Ｃ１８リバース）に依るアジレント６５４０Ｑ－Ｔｏｆ－ＭＳ－ＭＳスペクトロメーター（アジレントテクノロジーズ（Agilent Technologies）、サンタクララ、カリフォルニア、米国）に依って収集した。移動相は３５％ＭｅＯＨ／６５％Ｈ２Ｏであり、イミキモド（ＩＭＤ）検量線の線形範囲は１０μＬ注射体積を用いて０から２００ｎｇ／ｍｌであった。熱重量分析（ＴＧＡ）は空気中に於いて白金パンを備えた島津ＴＧＡ－５０（株式会社島津製作所、京都、日本）を用いて行ない、ｍｉｎ当たり１℃の速度で加熱した。フローサイトメトリーデータはＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ４－１５（ＢＤバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、サンノゼ、カリフォルニア、米国）に依って収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター（Tree Star）、アシュランド、オレゴン、米国）に依って分析した。共焦点レーザー走査顕微鏡画像はオリンパスＦＶ１０００で収集し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド、米国）に依って分析した。ａＣＤ４７の濃度は、商標ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００で販売されている分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）又は商標ピアース（商標）ＢＣＡ蛋白質アッセイキットで販売されている蛋白質アッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）何方かに依って測定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、商標ＥＬＩＳｐｏｔ－ＲＥＡＤＹ－ＳＥＴ－ＧＯ！（商標）で販売されているマウスＩＦＮ－γアッセイ（イーバイオサイエンス（eBioscience）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に依って行なった。
ネズミ結腸腺癌細胞ＣＴ２６はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア、米国）から得、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、シカゴ、イリノイ、米国）に依って、１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧナトリウム、及び１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンで、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で３７℃に於いて培養した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週）はハーラン・エンビゴラボラトリーズインク（Harlan－Envigo Laboratories, Inc）（インディアナポリス、インディアナ、米国）から得られた。
ＲＴ２５０慣用電圧Ｘ線機モデル（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）を、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、及びビルトインの１ｍｍのＣｕフィルターの固定された設定で、インビトロアッセイに用いた。Ｘ－ＲＡＤ２２５画像誘導生体照射装置（プレシジョンエックスレイインク（Precision X-ray Inc.）、ノースブランフォード、コネチカット、米国）をインビボ研究に用いた。装置は２２５ｋＶｐ且つ１３ｍＡに設定し、０．３ｍｍ平板Ｃｕフィルターを２５ｍｍコリメーターの前にインストールした。
例２
Ｈｆ－ＤＢＰ及びＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰの合成及びキャラクタリゼーション
ＴＦＡに依るＨｆ－ＤＢＰの表面修飾：５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（Ｈ２ＤＢＰ）及びＨｆ－ＤＢＰを、先に報告された通り合成した（ル（Lu）等著，米国化学会誌（Journal of the American Chemical Society），２０１４年，第１３６巻（４８），ｐ．１６７１２－１６７１５）。ＥｔＯＨ中のＨｆ－ＤＢＰ懸濁液をソニケーション及び遠心に依ってアセトニトリル及びベンゼンで逐次的に洗浄して、溶媒の極性を低めた。ベンゼン中のＨｆ－ＤＢＰをＮ２に依って脱気し、表面修飾反応の為にグローブボックスに移動した。撹拌子を有する１ドラムバイアルに、ベンゼン（２ｍＭ）中の１ｍＬのＨｆ－ＤＢＰ懸濁液及び１０倍のトリフルオロ酢酸トリメチルシリル（ＴＦＡ－ＴＭＳ）を追加し、バイアルを密封した。反応混合物を１２時間に渡って撹拌して、ＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰを得た。グローブボックスの外で、懸濁液をＣＨ３ＣＮ及びＥｔＯＨに依って逐次的に洗浄し、ＥｔＯＨ中で更なる使用の為に保存した。
ＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰのダイジェスチョン及びＮＭＲ分析：約１．０ｍｇのＨｆ－ＤＢＰ又はＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰを真空乾燥し、５００ｍＬのＤＭＳＯ－Ｄ６及び５０ｍＬのＤ３ＰＯ４の混合物中に再懸濁した。混合物を１５ｍｉｎに渡ってソニケーションし、追加の５０ｍＬのＤ２Ｏを追加した。齎された混合物をソニケーションして、１Ｈ及び１９Ｆ－ＮＭＲ分析の為の均質な溶液を提供した。ダイジェスチョンされたＨｆ－ＤＢＰの１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－Ｄ６，ｐｐｍ）：δ＝１０．６５（ｓ，２Ｈ），９．６７（ｄ，４Ｈ），９．０３（ｄ，４Ｈ），８．４０（ｍ，８Ｈ）．ダイジェスチョンされたＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰの１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－Ｄ６，ｐｐｍ）：δ＝１０．６５（ｓ，２Ｈ），９．６７（ｄ，４Ｈ），９．０３（ｄ，４Ｈ），８．４０（ｍ，８Ｈ）（ＤＢＰアリールＨ），δ＝１．８９（ｓ）（ＨＯＡｃアルキルＨ）．ダイジェスチョンされたＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰの１９Ｆ－ＮＭＲ（４７１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－Ｄ６，ｐｐｍ）：δ＝－７４．２５（ｓ）．Ｈｆ－ＤＢＰでは、表面調節剤はＨＯＡｃであり、１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの強いシグナルδ＝１．８９（ｓ，１．２Ｈ）を与えた。Ｈｆ－ＤＢＰ－ＴＦＡでは、δ＝１．８９（ｓ，０．１１Ｈ）は有意に縮減されたシグナルを示し、此れは、表面調節剤ＯＡｃが殆ど（＞９０％）ＴＦＡに交換されたという事を指示した。δ＝－７４．２５（ｓ）１９Ｆ－ＮＭＲも又ＭＯＦ表面のＴＦＡの存在を確認した。
例３
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰの合成及びキャラクタリゼーション
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰの合成：２０ｍＬガラスバイアルに、１０ｍｇのＩＭＤ及びＥｔＯＨ中の５ｍＬの２ｍＭのＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰを追加した。混合物を１時間に渡って４０～５０℃でソニケーションした。反応を室温で別の１２時間に渡って撹拌し、其れから、遠心及びソニケーションに依って、ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ＝１：１及びＥｔＯＨに依って逐次的に洗浄して、過剰なイミキモドを除去した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰの上清をＵＶ－Ｖｉｓに依って検出して、遊離イミキモドが存在しないという事を確認した。
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰのダイジェスチョン及びＵＶ－Ｖｉｓ分析：コンポーネントを決定し、ＩＭＤの担持パーセンテージを評価する為に、５ｍＬの２ｍＭのＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰを９００ｍＬのＤＭＳＯ及び１００ｍＬのＨ３ＰＯ４に追加した。混合物を２時間に渡ってソニケーションし、其れからＵＶ－Ｖｉｓ分光法に依って分析した。
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰのダイジェスチョン及びＮＭＲ分析：約１．０ｍｇのＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰを真空乾燥し、５００μＬのＤＭＳＯ－Ｄ６及び５０ｍＬのＤ３ＰＯ４の混合物中に再懸濁した。混合物を１５ｍｉｎに渡ってソニケーションし、追加の５０ｍＬのＤ２Ｏを追加した。混合物をボルテックスして、均質な溶液を提供した。サンプルを１Ｈ及び１９Ｆ－ＮＭＲに依って分析した。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－Ｄ６，ｐｐｍ）：δ＝１０．６５（ｓ，２Ｈ），９．６７（ｄ，４Ｈ），９．０３（ｄ，４Ｈ），８．４０（ｍ，８Ｈ）（ＤＢＰアリールＨ），δ＝１．８９（ｓ）（ＨＯＡｃアルキルＨ），δ＝８．４１（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｄ，１Ｈ），７．７７（ｄ，１Ｈ），７．７０（ｔ，１Ｈ），７．５９（ｔ，１Ｈ），４．４４（ｄ，２Ｈ），２．１０（ｍ，１Ｈ），０．９０（ｄ，２Ｈ）（ＩＭＤＨ）．１９Ｆ－ＮＭＲ（４７１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－Ｄ６，ｐｐｍ）：δ＝－７４．２５（ｓ）（ＴＦＡＦ）．担持されたＩＭＤの重量パーセンテージは、δ＝０．９０の積分に依って８．８％であると計算された。
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰのＴＧＡ分析：約２ｍｇのＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰを真空乾燥し、ＴＧＡ分析に用いた。理論上の重量損失は６２．０％であり、実験上の重量損失は６６．２％であった。ＴＧＡに依る計算された担持パーセンテージは～１１．１％であった。
例４
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７の合成及びキャラクタリゼーション
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７の合成：ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰを１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内で２ｍＭの同等のＨｆ濃度で１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。７５０ｍｇのαＣＤ４７（ＰＢＳ中に８．８ｍｇ／ｍＬ、８５．２ｍＬ）をチューブに追加し、１５秒に渡ってボルテックスした。αＣＤ４７の担持をＮａｎｏＤｒｏｐに依って確認した。此れは遠心後の上清ＩｇＧ濃度を決定した。
Ｈｆ－ＤＢＰ、ＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰ、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ、及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７の粒子サイズ及びζ電位を精製水（ミリＱ（登録商標）水、ミリポアシグマ（Millipore Sigma）、バーリントン、マサチューセッツ、米国）中に於いて測定した。結果を下で表１に要約する。
Figure 2023526501000006
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７の放出プロファイル：
αＣＤ４７の定量方法：ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７を２７ｍＬのＰＢＳ中に０．５ｍＭの同等のＨｆ濃度で再懸濁し、２７個のエッペンドルフチューブに小分けした（各時点についてＮ＝３）。チューブを３７℃のインキュベータに移動し、０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、及び４８ｈに測定した。各時点に於いて、３つのエッペンドルフチューブを取り出し、１２０００ｒｐｍでスピンダウンした。其れから、上清をイミキモドのＬＣ－ＭＳ分析及びαＣＤ４７のＢＣＡアッセイの為に収集した。
ＩＭＤの定量方法：イミキモドの標準曲線は、純粋なイミキモドをＰＢＳ中に溶解する事に依って作成し（１ｐｐｍストック溶液及び勾配希釈）、線形範囲は１０ｐｐｂ及び５００ｐｐｂの間であった。ＬＣ－ＭＳの勾配溶出は：１）０～３ｍｉｎ、１００％Ｈ２Ｏ；２）３～８ｍｉｎ、６５％Ｈ２Ｏ及び３５％ＭｅＯＨ；３）８～１０ｍｉｎ、１００％ＭｅＯＨとして設定した。流量は１０ｍＬの注入体積で０．５ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプルをＬＣ－ＭＳ分析の為に１０倍希釈した。
血清含有ＰＢＳ中のＩｇＧ－ＦＩＴＣの放出プロファイル：ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／ＩｇＧ－ＦＩＴＣをＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７と同じ遣り方で調製し、１０％ＦＢＳを有する２７ｍＬのＰＢＳ中に０．１ｍＭの同等のＨｆ濃度で再懸濁し、２７個のエッペンドルフチューブに小分けした（各時点についてＮ＝３）。チューブを３７℃のインキュベータに移動し、０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、及び４８ｈに測定した。各時点に於いて、３つのエッペンドルフチューブを取り出し、１２０００ｒｐｍでスピンダウンした。其れから、上清をマイクロプレートリーダーに依る蛍光検出の為に収集した。放出パーセンテージは、ＩｇＧ－ＦＩＴＣ標準曲線にフィッティングされた相対的な蛍光に基づいて計算された。ＩｇＧは最初の約１０時間には比較的迅速に放出され、其れから横這いに成り始めた。放出パーセンテージは１２時間後に約５０％であり、４８時間後に約６０％であった。
例５
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７のインビトロ研究
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７の細胞取り込み：ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７の細胞取り込みを、ＲＰＭＩ培地中の２．５×１０５／ｍｌの密度の６ウェルプレート上のＣＴ２６細胞に依って評価した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７を培地中の２０μＭの同等のＨｆ濃度で各ウェルに追加し、プレートを１５０ｒｐｍで１ｍｉｎに渡って振盪した。其れから、細胞を３７℃インキュベータに戻し、１、２、４、及び８時間に渡ってインキュベーションした。各時点に於いて、培地を除去し、細胞を２ｍＬのＤＰＢＳに依って３回洗浄し、トリプシン処理し、３０００ｒｐｍの遠心に依って収集し、血球計数板に依ってカウントした。細胞ペレットを、１ｍＬの９９％濃ＨＮＯ３（６７～７０％微量金属グレード）及び１％ＨＦに依って、１．５ｍＬのｅｐチューブ内で４８時間に渡って、１２時間毎の強いボルテックス及びソニケーションに依ってダイジェスチョンした。其れから、Ｈｆ濃度をＩＣＰ－ＭＳに依って決定した。
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７の細胞傷害性：ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７の暗毒性を、ＣＴ２６細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞で、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホ－フェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイ（プロメガコーポレーション（Promega Corporation）、マディソン、ウィスコンシン、米国、ＤＭＥＭ中に１／１０希釈）に依って評価した。細胞を、先ず、ウェル当たり１００μＬのＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ培地に依って１５０００細胞／ｍＬの密度で９６ウェルプレートに播種し、更に一晩培養した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７を、０、０．５、１、２、５，１０、２０、５０、１００μＭの同等のＨｆ濃度でウェルに追加し、ＭＴＳアッセイに依って細胞生存率を決定する前に７２時間に渡って更にインキュベーションした。Ｘ線照射の不在下では、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７はＣＴ２６結腸癌細胞に対してやや毒性であったが（図１２を見よ）、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞では毒性を示さなかった。
マクロファージ活性化：ＢＡＬｂ／ｃ骨髄由来単球細胞を収穫、培養、及び活性化した。古典的活性化Ｍ１マクロファージでは、骨髄細胞を、４８ｈに渡って、２０％ｖ／ｖ牛胎児血清、１００ｎｇ／ｍＬリポ多糖、及び２５ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γを補った新しいダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地とインキュベーションした。接着細胞を次の研究の為に収穫した。Ｍ２マクロファージでは、１００ｎｇ／ｍＬのネズミ顆粒球－マクロファージコロニー刺激顆粒球因子及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４を追加した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２に於いてインキュベーションした。培地は２～３日毎に取り替え、細胞は６及び８日の培養の間に用いた。
マクロファージ再極性化：ＣＴ２６細胞を６ウェルプレート上で一晩培養し、ＰＢＳ、ＩＭＤ、Ｈｆ－ＤＢＰ、又はＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰと２０μＭの同等のドーズで４ｈに渡ってインキュベーションし、次に０又は２Ｇｙの線量でＸ線照射をした。分化したＭ２マクロファージを追加し、処置されたＣＴ２６細胞と３７℃で１２ｈに渡って共培養した。其れから、細胞を収集し、冷ＰＢＳに依って２回洗浄し、抗ＣＤ１６／３２に依ってブロッキングしてＦｃＲに対する非特異的結合を縮減し、ＣＤ８６（ＧＬ１）、ＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）に依って染色し、フローサイトメトリーに依って分析した。
カルレティキュリン移行：ＲＴ－ＲＤＴ処置に依って誘導される免疫原性細胞死を、細胞表面上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）の暴露を検出する事に依って検討した。ＣＴ２６細胞を６ウェルプレート上で一晩培養し、ＰＢＳ、αＣＤ４７、Ｈｆ－ＤＢＰ、又はＨｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７と２０μＭの同等のドーズで４ｈに渡ってインキュベーションし、次に、０又は２Ｇｙの線量でＸ線照射をした。其れから、細胞を別の４時間に渡ってインキュベータで培養してＣＲＴ移行を誘導し、次に、共焦点イメージング又はフローサイトメトリー分析の為のカバースライド上に於ける固定、並びにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＣＲＴ抗体（エンゾライフサイエンス（Enzo Life Science）、ファーミングデール、ニューヨーク、米国）及びＤＡＰＩに依る染色をした。
貪食：５×１０５のＣＦＳＥ標識されたＣＴ２６細胞を６ウェルプレート上で一晩培養し、ＰＢＳ、αＣＤ４７、Ｈｆ－ＤＢＰ、又はＨｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７と２０μＭの同等のドーズで４ｈに渡ってインキュベーションし、次に、０又は２Ｇｙの線量でＸ線照射をした。１．５×１０６のＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識されたマクロファージを追加し、処置されたＣＴ２６細胞と３７℃で４ｈに渡って共培養した。其れから、細胞を収集し、冷ＰＢＳに依って２回洗浄し、ＣＬＳＭに依ってイメージング又はフローサイトメトリーに依って分析した。
例６
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７のインビボ研究
自然免疫のプロファイリング：腫瘍を収穫し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩ（ギブコラボラトリーズ（Gibco Laboratories）、ゲイザースバーグ、メリーランド、米国）に依って１ｈに渡って３７℃水浴上で処置し、シリンジのゴム端を用いて粉砕した。細胞を７０μｍのサイズのナイロンメッシュフィルターに依って濾過し、ＰＢＳに依って洗浄した。単細胞懸濁液を抗ＣＤ１６／３２（クローン９３；イーバイオサイエンシズ（eBiosciences）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）とインキュベーションして、ＦｃＲに対する非特異的結合を縮減した。細胞を次の蛍光色素コンジュゲート化抗体に依って更に染色した：ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、ＣＤ３ｅ（１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ８６（ＧＬ１）、ＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）、ＭＨＣ－ＩＩ（ＡＦ６－１２０）、及び黄色蛍光（全てイーバイオサイエンス（eBioscience）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国から）。商標ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）で販売されているフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、サンノゼ、カリフォルニア、米国）を細胞取得に用い、データ分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター（Tree Star）、アシュランド、オレゴン、米国）に依って実施した。
免疫蛍光アッセイ：腫瘍切片を少なくとも１ｈに渡って風乾し、其れからアセトン中に於いて１０ｍｉｎに渡って２０℃で固定した。２０％驢馬血清に依ってブロッキングした後に、切片は、ＣＤ４７（ＭＩＡＰ３０１、バイオレジェンド（Biolegend）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）、又は全てイーバイオサイエンシズ（eBiosciences）（サンディエゴ、カリフォルニア、米国）からのＦ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ８６（ＧＬ１）、ＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）に対する個々の一次抗体と４℃で一晩インキュベーションし、次に、ｒ．ｔ．での１ｈの色素コンジュゲート化二次抗体とのインキュベーションをした。其れから、別の１０ｍｉｎに渡ってＤＡＰＩに依って染色した後に、切片をＰＢＳに依って２回洗浄し、ＣＬＳＭに依って観察した。
抗腫瘍効力：Ｈｆ－ＤＢＰに依って調節されるマクロファージ治療の評価の為に、２×１０６のＣＴ２６細胞を、単一腫瘍ＣＴ２６モデルとして第０日のＢａｌｂ／ｃマウスの右脇腹皮下組織に注射した。腫瘍が体積が１００～１５０ｍｍ３に達した時に、Ｈｆ－ＤＢＰ、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ、Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７、若しくはＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／ａＣＤ４７を０．１μｍｏｌの同等のＨｆドーズで、又は同等の量のＩＭＤ若しくはａＣＤ４７を、腫瘍内注射した。何れかの処置無しのマウスが対照としての用を為した。注射の１２時間後に、マウスを２．５％（ｖ／ｖ）イソフルランに依って麻酔し、腫瘍に連続２日に渡って２Ｇｙの線量でＸ線を照射した。腫瘍サイズをカリパーに依って毎日測定し、腫瘍体積を（幅２×長さ）／２として計算した。各群の体重を毎日モニタリングした。マウスを第２５日に屠殺し、切除された腫瘍を撮影及び秤量した。腫瘍をヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ）及び免疫蛍光分析の為に切片化した。
例７
チェックポイントブロック免疫療法とのＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／α－ＣＤ４７の組み合わせ
アブスコパル効果：チェックポイントブロック免疫療法と組み合わせられたｎＭＯＦに依って媒介されるマクロファージ治療の評価の為に、夫々原発及び遠隔腫瘍を模倣する為に第０日のＢａｌｂ／ｃマウスの右及び左脇腹皮下組織に２×１０６及び１×１０６細胞を注射する事に依って、両側同系ＣＴ２６モデルを樹立した。原発腫瘍が体積が１００～１５０ｍｍ３に達した時に、ＩＭＤ／αＣＤ４７、Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ、若しくはＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７を０．２μｍｏｌの同等のドーズで、又はＰＢＳを腫瘍内注射した。注射の１２時間後に、マウスを２％（ｖ／ｖ）イソフルランに依って麻酔し、原発腫瘍に、連続２日の照射で２Ｇｙの線量のＸ線を１回照射した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、２つの注射で７５μｇ／マウスのドーズで腹腔内注射に依って３日毎に与えた。処置無しのマウスが対照としての用を為した。マウスを第２５日に安楽死させた。腫瘍及び主要器官を免疫分析の為に収穫した。
ＥＬＩＳＰｐｏｔアッセイ：ＩＦＮ－γに対する腫瘍特異的な免疫応答を、インビトロでＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（マウスＩＦＮ－γ－ＥＬＩＳＰＯＴ－ＲＥＡＤＹ－ＳＥＴ－ＧＯ！（商標）；Ｃａｔ．Ｎｏ．８８－７３８４－８８；イーバイオサイエンス（eBioscience）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に依って測定した。ミリポアマルチスクリーンＨＴＳ－ＩＰプレート（ミリポアシグマ（Millipore Sigma）、バーリントン、マサチューセッツ、米国）を抗マウスＩＦＮ－γ捕捉抗体に依って４℃で一晩コーティングした。脾細胞の単細胞懸濁液を、ＰＢＳ（－）、ＰＢＳ（＋）、αＰＤ－Ｌ１（＋）、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（－）＋ａＰＤ－Ｌ１、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（－）＋αＰＤ－Ｌ１に依って処置されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスから得、抗体コーティングプレートにウェル当たり２×１０５細胞で播種した。細胞をＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号４）刺激（１０ｍｇ／ｍｌ；純度＞９５％；ペプチド２．０（PEPTIDE 2.0）、シャンティリー、バージニア、米国）有り又は無しで３７℃に於いて４２ｈに渡ってインキュベーションし、其れから、懸濁液を捨てた。其れから、プレートをビオチンコンジュゲート化抗ＩＦＮ－γ検出抗体とｒ．ｔ．で２ｈに渡ってインキュベーションし、次に、２ｈのｒ．ｔ．でのアビジン－ＨＲＰとのインキュベーションをした。３－アミノ－９－エチルカルバゾール基質溶液（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ、米国、Ｃａｔ．ＡＥＣ１０１）をサイトカインスポット検出の為に追加した。
適応免疫のプロファイリング：腫瘍を収穫し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩ（ギブコラボラトリーズ（Gibco Laboratories）、ゲイザースバーグ、メリーランド、米国）に依って１ｈに渡って３７℃水浴上で処置し、シリンジのゴム端に依って粉砕した。細胞を７０μｍナイロンメッシュフィルターに依って濾過し、ＰＢＳに依って洗浄した。単細胞懸濁液を抗ＣＤ１６／３２（クローン９３；イーバイオサイエンシズ（eBiosciences）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）とインキュベーションして、ＦｃＲに対する非特異的結合を縮減した。細胞を次の蛍光色素コンジュゲート化抗体に依って更に染色した：ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、ＣＤ３ｅ（１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（５３－６．７）、Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、Ｎｋｐ４６（２９Ａ１．４）、及び黄色蛍光染色溶液（全てイーバイオサイエンス（eBioscience）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国から）。商標ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）で販売されているフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、サンノゼ、カリフォルニア、米国）を細胞取得に用い、データ分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター（Tree Star）、アシュランド、オレゴン、米国）に依って実施した。
例８
例１～７の考察
免疫系の一次防御として、マクロファージは新生の癌性の細胞を貪食して、ホストのホメオスタシスを維持する（アラベナ（Alavena）等著，２００８年）。然し乍ら、癌細胞を標的化する為のマクロファージの能力は、免疫監視をエスケープし（ジャイスワル（Jaiswal）等著，２００９年）、抗炎症性（腫瘍促進性）Ｍ２マクロファージの圧倒的優位を有する免疫抑制性の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を促進する為の腫瘍細胞表面上の「私を食べないで」ＣＤ４７チェックポイントシグナル伝達分子の過剰発現に依って限定される（チャオ（Chao）等著，２０１０年）。抗腫瘍免疫応答を活性化するというゴールの為に、ＴＭＥを作り変え、免疫抑制を後退させる為の免疫刺激治療が探求されている（ルー（Lou）等著，２０１９年；チェン（Chen）等著，２０１５年；ルティット（Louttit）等著，２０１９年；及びナム（Nam）等著，２０１９年）。
１つの斯かる処置は、ｔｏｌｌ様受容体－７（ＴＬＲ－７）経路を活性化する事に依って自然免疫を再極性化させる事が出来る疎水性低分子薬物ＩＭＢである（ロデル（Rodell）等著，２０１８年；及びオニール（O’Neill）等著，２０１３年）。ＩＭＤ等のＴＬＲ－７アゴニストはＭ２マクロファージを炎症促進性（抗腫瘍）Ｍ１マクロファージへと再極性化させ得る。此れは貪食、炎症、及び抗原提示を容易化する。加えて、マクロファージチェックポイント阻害は、死んで行く腫瘍細胞の貪食及び放出腫瘍抗原を促進する事に依って、抗腫瘍処置として提案されている（チェン（Chen）等著，２０１９年ａ；及びリウ（Liu）等著，２０１５年）。実に、抗ＣＤ４７抗体（αＣＤ４７）に依るＣＤ－４７シグナル伝達経路のブロックが臨床検討中である（チェン（Chen）等著，２０１９年ｂ；コジマ（Kojima）等著，２０１６年；及びフェン（Feng）等著，２０１９年）。然し乍ら、全身毒性のＩＭＤ及びαＣＤ４７治療は、腫瘍内注射に依ってであっても、不充分な抗腫瘍効力及び望まれない副作用に依って限定されている（リウ（Liu）等著，２０１５年；カマス（Kamath）等著，２０１８年；及びション（Xiong）等著，２０１１年）。
本開示の主題は、ｎＭＯＦ及び低線量Ｘ線照射からの放射線治療－放射線力学的治療（ＲＴ－ＲＤＴ）効果を強化する為の、腫瘍細胞へのＩＭＤ及びαＣＤ４７の同時送達の為のｎＭＯＦの使用を記載する。具体的には、重金属二次構造単位（ＳＢＵ）及び光増感性リガンドを有するｎＭＯＦは、Ｘ線エネルギー付与を増強及び複数の活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する事に依ってＲＴ－ＲＤＴを媒介し得る。
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７を、逐次的なＨｆ－ＤＢＰ－ｎＭＯＦ表面修飾、ＩＭＤ担持、及びαＣＤ４７吸着に依って合成した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７プラスＸ線照射は強いＲＴ－ＲＤＴ効果を誘起して、腫瘍細胞のＩＣＤを引き起こし、ＴＬＲ－７アゴニスト及びＣＤ－４７ブロッカーの免疫調節効果を増強した。図１を見よ。抗ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイントブロック（ＣＢＩ）との更なる組み合わせは、両側大腸腫瘍モデルの原発及び遠隔腫瘍両方を完全に根絶した。
酢酸（ＯＡｃ）キャッピング基を有するＨｆ－ＤＢＰ－ｎＭＯＦが、先に報告された通り合成され（ル（Lu）等著，２０１４年）、Ｈｆ１２（μ３－Ｏ）８（μ３－ＯＨ）８（μ２－ＯＨ）６（ＡｃＯ）３．５（ＤＢＰ）６．８（ＯＨ）０．９（ＯＨ２）０．９の実験式を見せた。Ｈｆ－ＤＢＰのナノプレートを、ｈｃｐ様の積層パターンでＤＢＰリガンドに依ってＨｆ１２－ＳＢＵを接続する事に依って形成した。表面上のＨｆ１２－ＳＢＵはＯＡｃ基に依って終結し（図２Ａを見よ）、Ｈ２Ｏ中で－２３．３±１．０ｍＶのζ電位を有し、此れは、Ｈｆ－ＤＢＰナノプレートの表面上のαＣＤ４７の担持を防止した。図２Ｂを見よ。Ｈｆ－ＤＢＰをトリフルオロ酢酸トリメチルシリル（ＴＭＳ－ＴＦＡ）に依って処置して、１Ｈ及び１９Ｆ－ＮＭＲ分光法に依って決定される通りＯＡｃ基の＞９０％をＴＦＡ基に依って置き換える事に依って、ＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰを提供した。ＴＥＭイメージング及びＰＸＲＤ研究は、Ｈｆ－ＤＢＰの形態学及び結晶化度が表面修飾後に維持されるという事を示した。図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、及び５を見よ。弱配位性のＴＦＡ基は蛋白質上のカルボン酸基又は核酸上のリン酸基に依って置き換えられ得る。Ｈｆ－ＤＢＰ－ＴＦＡは、ＢＣＡアッセイに依ってαＣＤ４７（９７．２％）の完全に近い吸着を示した。図２Ｂを見よ。
ＩＭＤを、エタノール中に於けるソニケーションに依ってＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰの細孔に担持させて、１Ｈ－ＮＭＲ及びＵＶ－ｖｉｓ分光法並びに熱重量分析に依って決定される通り～９ｗｔ％のＩＭＤ担持を有するＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰを提供した（図６を見よ）。ボルテックスに依るＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰのＰＢＳ懸濁液へのαＣＤ４７の追加は、７．５ｗｔ％のαＣＤ４７担持を有するＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７を提供した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７は、ＴＥＭ画像及びＰＸＲＤパターンに基づくＨｆ－ＤＢＰの形態学及び結晶化度を維持した。図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、及び９を見よ。上の表１をも又見よ。
３７℃でのＰＢＳ中のＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７のＩＭＤ及びαＣＤ４７の放出プロファイルを、夫々液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイに依って決定した。図２Ｃを見よ。凡そ８％のＩＭＤが４８時間でゆっくり放出された。此れは、Ｍ２をＭ１マクロファージへと継続的に再極性化する為の高い局所的なＩＭＤ濃度を維持する事にとって理想的である。蓋然的にはＨｆ１２－ＳＢＵに対するリン酸配位に依る置換に依って、凡そ３０％及び６０％のαＣＤ４７が、夫々ＰＢＳ又は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを有するＰＢＳ中に於いて４８時間で放出された。図１０を見よ。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７は高い細胞取り込みを示した。図１１を見よ。
放出されたＩＭＤ及びαＣＤ４７がインビトロの抗腫瘍効果の為に夫々マクロファージ及び腫瘍細胞を標的化し得るかどうかを決定する為の研究を行なった。第１に、骨髄由来単球を収穫して、其れ等をＭ１又はＭ２マクロファージ何方かに分化させた。Ｆ４／８０＋細胞からゲーティングされたＭ１又はＭ２細胞は、夫々ＣＤ８６＋ＣＤ２０６－又はＣＤ８６－ＣＤ２０６＋表現型を提示した。図１３を見よ。ネズミ大腸癌ＣＴ２６細胞をＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ、Ｈｆ－ＤＢＰ、又はＩＭＤに依って処置し、其れから２ＧｙのＸ線を照射した（以降では＋はＸ線照射を示す）。其れから、Ｍ２マクロファージを処置されたＣＴ２６細胞と２４ｈに渡って共培養し、フローサイトメトリー分析の為に免疫染色した。図１４Ａに示される通り、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）に依って処置されたＣＴ２６細胞は、他の群（０．０１から１．１５）と比べて３８２というより高いＭ１／Ｍ２比で、より強いマクロファージ再極性化を誘導した。興味深い事に、Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）はＩＭＤ（＋）よりも高いＭ１集団を誘導し（図１４Ｃを見よ）、ＲＴ－ＲＤＴがマクロファージをＭ２からＭ１表現型へと再極性化する本来的な特性を反映した。
次に、ＣＴ２６細胞をＨｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７、Ｈｆ－ＤＢＰ、又はαＣＤ４７に依って処置して、貪食を評価した。「私を食べて」シグナルとしての細胞表面へのカルレティキュリンの移行を、Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）及びＨｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）群に於いて確認した。Ｍ１マクロファージを処置されたＣＴ２６細胞と共培養し、ＣＦＳＥ標識されたＣＴ２６細胞の有意に増大した貪食が、Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）群のＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲート化Ｆ４／８０標識されたＭ１マクロファージに依って観察され、腫瘍細胞表面の「私を食べて」シグナル（カルレティキュリン）の暴露及び「私を食べないで」シグナル（ＣＤ４７）のブロックに依って促進される増強された貪食を指示した。図１４Ｂ及び１４Ｄを見よ。類似の結果がＣＬＳＭに依って観察された。此れに於いては、Ｈｆ－ＤＢＰ－αＣＤ４７（＋）群が、殆どのＣＴ２６細胞がＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識されたＭ１マクロファージに依って貪食される事を示した。
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７プラスＸ線を試験して、其れが抗腫瘍免疫活性化の為にマクロファージを調節する事に依ってＴＭＥを作り変え得るかどうかを見た。ＰＢＳ、ＩＭＤ／αＣＤ４７、Ｈｆ－ＤＢＰ、Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７、又はＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７を、ＣＴ２６腫瘍を持つＢＡＬＢ／ｃに腫瘍内注射し、次に、連続２日の２Ｇｙ／フラクションのＸ線照射をした。腫瘍切片スライドを免疫染色して、第１の照射の４８ｈ後にＣＤ４７ブロックを検出した。ＩＭＤ／αＣＤ４７（＋）はＰＢＳ対照と比較してＣＤ４７の蛍光シグナルをやや低めたが、Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）はＣＤ４７を強くブロックし、Ｈｆ－ＤＢＰに依って送達されるαＣＤ４７のより高いブロック効力を指示した。興味深い事に、Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）処置も又ＣＤ４７を減少させた。腫瘍浸潤自然免疫細胞を第１の照射の４８時間後にプロファイリングした。図１６を見よ。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）処置は腫瘍浸潤白血球、樹状細胞、及びマクロファージを統計的に増大させ（図１５Ａ及び１７Ａ～１７Ｃを見よ）、抗原提示細胞の増強された浸潤を有する炎症性のＴＭＥを指示した。更に其の上、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）処置は有意にＭ１マクロファージを増大させ、Ｍ２マクロファージを減少させ、相乗的なｎＭＯＦに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴ、ＴＬＲ－７アゴニスト、及びＣＤ－４７ブロックに依るインビボのマクロファージ再極性化を指示した。図１５Ａ及び図１７Ｄ～７Ｆを見よ。興味深い事に、Ｍ２表現型の有意な増大がＰＢＳ（＋）群で観察され、低線量Ｘ線単独に依って誘導されるより免疫抑制性のＴＭＥを示唆した。図１７Ｅを見よ。加えて、トータルのマクロファージ（図１７Ｃを見よ）及びＭ１表現型（図１７Ｄを見よ）の有意な増大が、夫々Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）又はＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）群に於いて見出され、ｎＭＯＦ送達がＩＭＤ及びαＣＤ４７のマクロファージ調節効果を増強するという事を指示した。マクロファージ再極性化が、免疫染色された腫瘍切片スライドのＣＬＳＭイメージングに依って確認された。其の上、Ｍ１マクロファージは、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）群両方に於いて有意に増大したＭＨＣ－ＩＩ発現を示し（図１５Ｂを見よ）、抗原提示に於ける其れ等の増強された機能を示唆した。
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）の抗腫瘍効力をＣＴ２６腫瘍モデルに依って評価した。腫瘍が～１５０ｍｍ３に達した時に、ＩＭＤ／αＣＤ４７、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ、Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７、又はＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７を腫瘍内注射し、其れから、連続２日に渡って２Ｇｙ／フラクションのＸ線を照射した。此れ等の処置は、定常的な体重を証拠とする通り全身毒性を示さなかった。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）及びＨｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）は強い腫瘍抑制を示し、第２５日にＰＢＳ（－）対照と比べて夫々８３．３％及び８９．３％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）指数を有した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）処置は腫瘍を有効に根絶し、９８．２％のＴＧＩ及び５０％の治癒率を有した。図１５Ｃを見よ。下の表２をも又見よ。Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（－）は程々の効力を示し、夫々５２．８％及び３３．８％のＴＧＩ値を有したが、ＩＭＤ／αＣＤ４７（＋）は最小限の効果を示し、２．１％のＴＧＩを有した。此れ等の結果は、ｎＭＯＦに依って送達されるＩＭＤ及びαＣＤ４７の増強された抗腫瘍効力を支持している。第２５日の切除された腫瘍の平均重量は、夫々ＰＢＳ（－）、ＰＢＳ（＋）、ＩＭＤ／αＣＤ４７（＋）、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（－）、Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ（＋）、Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）、及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）群について、２．３４±０．７３、２．４４±０．８６、２．１８±０．６０、１．３８±０．１５、０．８７±０．２６、０．５８±０．２１、０．４１±０．０８、及び０．１２±０．１５ｇであった。図１８及び１９を見よ。Ｈ＆Ｅ染色は、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）処置からの腫瘍スライスの重度の壊死を指示した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）処置は、其れ故に、マクロファージを再極性化して腫瘍内免疫を作り変えて素晴らしい抗腫瘍効力を提供する。
Figure 2023526501000007
マクロファージ治療及びＣＢＩの間の相乗作用を検討した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）又は対照の夫々を両側ＣＴ２６腫瘍モデルの原発腫瘍に注射し、次に、αＰＤＬ１の２つの腹腔内注射及び２Ｇｙ／フラクションのＸ線の２つのフラクションをした。図２０Ａに示される通り、αＰＤＬ１（＋）処置はＰＢＳ（＋／－）対照から有意な違いを見せなかった。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）処置は原発腫瘍を有効に抑制したが、遠隔腫瘍に対する効果を有さなかった。対照的に、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）＋αＰＤＬ１処置は原発及び遠隔腫瘍両方を完全に根絶した。ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）又はＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（－）＋ａＰＤＬ１は腫瘍成長を程々にのみコントロールした。図２０Ｂを見よ。下の表３をも又見よ。Ｈｆ－ＤＢＰに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴ、ＩＭＤに依るマクロファージが関係する免疫抑制の後退、及びαＣＤ４７に依るマクロファージチェックポイントのブロックの相乗的な作用は、其れ故に、有効なＣＢＩの為の免疫学的な温床を形成して、素晴らしいアブスコパル効果に至る。
Figure 2023526501000008
ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）＋αＰＤＬ１に依って誘導される抗腫瘍免疫を探査した。第１に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行なって、第１の照射の１２日後の脾細胞に於けるＩＦＮ－γ産生細胞傷害性Ｔ細胞を検出する事に依って、特異的な抗腫瘍免疫を決定した。ＣＴ２６腫瘍細胞に依って発現される細胞傷害性Ｔ細胞エピトープＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）（配列番号４）に依って刺激される細胞傷害性Ｔ細胞は、カウントの為のＩＦＮ－γスポットを形成した。抗原特異的なＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の有意な増大が、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）（６１．６±２８．６）及びＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）＋αＰＤ－Ｌ１（２１３．８±１２６．９／１０６細胞）群に於いて、ＰＢＳ（－）の８．０±９．３／１０６細胞と比較して観察され、強い腫瘍特異的な適応免疫の誘導を示唆した。図２０Ｃを見よ。フローサイトメトリー分析（図２１を見よ）は、腫瘍浸潤白血球（図２２Ａを見よ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２０Ｄを見よ）、及びＣＤ４＋Ｔ細胞（図２０Ｅを見よ）の有意な増大を、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）＋αＰＤ－Ｌ１群の原発及び遠隔腫瘍両方に於いて示した。興味深い事に、ナチュラルキラー（ＮＫ、図２０Ｆを見よ）及びＢ細胞（図２２Ｂを見よ）も又原発及び遠隔腫瘍両方に於いて有意に増大した。此れ等の結果は、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）に依って媒介される局所的なマクロファージ治療及び全身的なＣＢＩが、エフェクターＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞の浸潤を強化して、抗腫瘍免疫を活性化し、強いアブスコパル効果を生成するという事を確認している。
概要として、本開示の主題は、バイオ高分子送達の為にｎＭＯＦ表面を修飾する為の新たな戦略を提供する。修飾されたＨｆ－ＤＢＰの細孔に於けるＩＭＤ及び表面上のαＣＤ４７の担持は、マクロファージの免疫調節及び自然免疫の活性化に依って素晴らしい抗腫瘍効力に至った。Ｈｆ－ＤＢＰに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴ及びゆっくり放出されるＩＭＤは、免疫抑制性のＭ２マクロファージを免疫刺激性Ｍ１マクロファージへと再極性化させ、放出されたαＣＤ４７は改善された貪食の為に腫瘍細胞上の「私を食べないで」シグナルをブロックした。αＰＤ－Ｌ１と組み合わせられた時に、ＩＭＤ＠Ｈｆ－ＤＢＰ／αＣＤ４７（＋）に依って媒介されるマクロファージ治療は、両側ＣＴ２６腫瘍モデルの腫瘍を全身的に根絶する迄拡げられた。従って、マクロファージ調節の為の「スリーインワン」処置は、免疫療法との相乗的な組み合わせの為にＴＭＥをチューニングする為の戦略としての用を為し得る様に見える。
例９
例１０～１６の材料及び方法
細胞株及び動物：ネズミ大腸腺癌細胞株ＭＣ３８、ルイス肺癌細胞株ＬＬ２、及びメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド、米国）から購入した。ネズミ膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ０２はシカゴ大学病理学部門（シカゴ、イリノイ、米国）のハンス・シュライバー（Hans Schreiber）博士から供与された。ＭＣ３８－ｏｖａ細胞株［ＯＶＡ（２５７－２６４）－ＺＳＧＲＥＥＮ］は、ＬＺＲＳに基づくレトロウイルスに依るＭＣ３８細胞のトランスフェクションに依って生成した。細胞の全てはダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、シカゴ、イリノイ、米国）に依って培養し、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウム及び１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを補った。細胞は５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気に於いて３７℃で培養した。マイコプラズマを、使用前に、商標ＭＹＣＯＡＬＥＲＴ（商標）で販売されているキット（ロンザウォーカーズビルインク（Lonza Walkersville, Inc.）、ウォーカーズビル、メリーランド、米国）に依って検査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週）はハーラン・エンビゴラボラトリーズインク（Harlan－Envigo Laboratories, Inc）（インディアナポリス、インディアナ、米国）から得られた。
Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ－Ｆ及びＨ２ＤＢＢ－Ｉｒの合成 Ｉｒ（ＤＢＢ）［ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ］２ ＋［Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、ＤＢＢ＝４，４’－ジ（４－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン；ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ＝２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオロメチル）－ピリジン］を、文献の報告に従って、下のスキーム１に示されている通り合成した（ズー（Zhu）等著，２０１８年）。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ９．０８（ｄ，２Ｈ），８．７６（ｄ，２Ｈ），８．４９（ｄ，２Ｈ），８．４４（ｄ，２Ｈ），８．１５（ｓ，２Ｈ），８．０２（ｄ，４Ｈ），７．８２（ｓ，２Ｈ），７．６２（ｄ，４Ｈ），７．１２（ｔ，２Ｈ），５．９１（ｄ，２Ｈ）．Ｉｒ（Ｈ２ＤＢＢ）（ｐｐｙ）２ ＋（Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、ＤＢＢ＝４，４’－ジ（４－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン；ｐｐｙ＝２－フェニルピリジン）を、文献の報告に従って、下のスキーム１に示されている通り合成した（ラン（Lan）等著，２０１９年ｂ）。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ９．０５（ｄ，２Ｈ），８．６７（ｄ，２Ｈ），８．２８（ｄ，２Ｈ），８．０７（ｓ，２Ｈ），７．９６（ｍ，８Ｈ），７．８９（ｄ，２Ｈ），７．５２（ｄ，４Ｈ），７．１７（ｔ，２Ｈ），７．０９（ｔ，２Ｈ），６．９８（ｔ，２Ｈ），６．３３（ｄ，２Ｈ）．
Figure 2023526501000009
Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒの合成 ４ｍＬガラスバイアルに、０．５ｍＬのＨｆＣｌ４溶液（ＤＭＦ中に２．０ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍＬのＨ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ溶液（ＤＭＦ中に４．０ｍｇ／ｍＬ）、２．６μＬのＴＦＡ、及び２μＬの水を追加した。反応混合物を２４時間に渡って７０℃オーブンに保った。黄色の沈殿を遠心に依って収集し、ＤＭＦ及びエタノールに依って洗浄した。収率は、ＩＣＰ－ＭＳに依って決定される通りＨｆに基づいて６１％であった。４ｍＬガラスバイアルに、０．５ｍＬのＨｆＣｌ４溶液（ＤＭＦ中に１．６ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍＬのＨ２ＤＢＢ－Ｉｒ溶液（ＤＭＦ中に６．４ｍｇ／ｍＬ）、及び１００μＬのＡｃＯＨを追加した。反応混合物を７２時間に渡って７０℃オーブンに保った。橙色の沈殿を遠心に依って収集し、ＤＭＦ及びエタノールに依って洗浄した。収率は、ＩＣＰ－ＭＳに依って決定される通りＨｆに基づいて５２％であった。
Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒのダイジェスチョン １．０ｍｇのＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒを真空乾燥した。齎された固体を５００μＬのＤＭＳＯ－ｄ６及び５０μＬのＤ３ＰＯ４の溶液中でダイジェスチョンし、１０ｍｉｎに渡ってソニケーションした。其れから、混合物を５０μＬのＤ２Ｏに追加し、１Ｈ－ＮＭＲに依って分析した。ダイジェスチョンされたＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒは、何れかの他の芳香族シグナル無しに、Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒに対応する全てのシグナルを示した。此れはＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ中のＤＢＢＦ－Ｉｒリガンドのみの存在を確認している。１．０ｍｇのＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒを真空乾燥した。齎された固体を５００μＬのＤＭＳＯ－ｄ６及び５０μＬのＤ３ＰＯ４の溶液中でダイジェスチョンし、１０ｍｉｎに渡ってソニケーションした。其れから、混合物を５０μＬのＤ２Ｏに追加し、１Ｈ－ＮＭＲに依って分析した。ダイジェスチョンされたＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒは、何れかの他の芳香族シグナル無しに、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒに対応する全てのシグナルを示した。此れはＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ中のＤＢＢ－Ｉｒリガンドのみの存在を確認している。
ＡＰＦアッセイに依る・ＯＨ生成 アミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）は、・ＯＨと反応して、明るい緑色蛍光を与える（最大励起／発光４９０／５１５ｎｍ）。Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ、及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒを、５μＭのＡＰＦの存在下に於いて２０μＭの同等の濃度で水中に懸濁した。５μＭのＡＰＦの水溶液をブランク対照として用いた。１００μＬの各懸濁液を９６ウェルプレートに追加し、其れから０、１、２、３、５、又は１０ＧｙのＸ線を照射した（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。蛍光シグナルを直ちにＩＶＩＳ２００イメージングシステム（ゼノジェン（Xenogen）、ホプキントン、マサチューセッツ、米国）に依って収集した。
ＳＯＳＧアッセイに依る１Ｏ２生成 一重項酸素センサーグリーン（ＳＯＳＧ、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）は、１Ｏ２と反応して、明るい緑色蛍光を与える（最大励起／発光５０４／５２５ｎｍ）。Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ、及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒを、１２．５μＭのＳＯＳＧの存在下に於いて２０μＭの同等の濃度で水中に懸濁した。１２．５μＭのＳＯＳＧの水溶液をブランク対照として用いた。１００μＬの各懸濁液を９６ウェルプレートに追加し、其れから、Ｘ線を０、１、２、３、５、又は１０Ｇｙで照射した（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ＫＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。蛍光シグナルを直ちにＩＶＩＳ２００イメージングシステム（ゼノジェン（Xenogen）、ホプキントン、マサチューセッツ、米国）に依って収集した。
ＢＭＰＯアッセイに依って決定されたＯ２ －生成 ５－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル５－メチル－１－ピロリンＮ－オキシド（ＢＭＰＯ）はニトロンスピントラップであり、此れは、長い半減期（ｔ１／２＝２３分）を有するＯ２ －との判別可能なアダクト（ＢＮＰＯ－Ｏ２ －）を形成し得る。Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ、及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒを、２５ｍＭのＢＭＰＯの存在下に於いて２００μＭの同等の濃度でベンゼン中に懸濁した。２５ｍＭのＢＭＰＯのベンゼン溶液をブランク対照として用いた。１ｍＬの各懸濁液を４ｍＬバイアルに追加し、其れから、５ＧｙのＸ線を照射した（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。電子スピン共鳴（ＥＰＲ）シグナルを直ちにＸ－バンドＥＬＥＸＳＹＳ－ＩＩ５００ＥＰＲ（ブルカー（Bruker）、ビレリカ、マサチューセッツ、米国）に依って収集した。
ＤＮＡ二本鎖切断 ＤＮＡ二本鎖切断は、リン酸化γ－Ｈ２ＡＸを探査する事に依って分析した。ＭＣ３８細胞を６ウェルプレート上に於いて５×１０５／ウェルで一晩培養し、ＰＢＳ、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒと２０μＭの同等の濃度でインキュベーションし、次に、０及び２Ｇｙで照射をした（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。細胞は、照射の２ｈ後に、ＨＣＳ－ＤＮＡ損傷キット（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、カールスバッド、カリフォルニア、米国）に依って１：５００希釈でフローサイトメトリー分析の為に染色した。
クローン形成性アッセイ ＭＣ３８細胞を６ウェルプレート上で一晩培養し、粒子と２０μＭのＨｆ濃度で４ｈに渡ってインキュベーションし、次に、０、１、２、４、８、及び１６Ｇｙで照射をした（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ＫＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。照射された細胞をトリプシン処理し、直ちにカウントした。２００～２０００細胞を６ウェルプレートに播種し、２ｍＬ培地に依って１４日に渡って培養して、可視のコロニーを形成した。此れ等をカウントして生残割合を決定した。一度コロニー形成が観察されたら、培養培地を捨てた。プレートをＰＢＳに依って２回リンスし、其れから、５０％メタノール／Ｈ２Ｏ中の５００μＬの０．５％ｗ／ｖクリスタルバイオレットに依って染色した。ウェルを水に依って３回リンスし、コロニーをマニュアルでカウントした。１０％生残ドーズに於ける放射線増感係数（ＲＥＦ１０）を、実験群の物と比べてＰＢＳ対照群の１０％生残率を与える為に必要とされる同等の照射線量の比として計算した。
細胞傷害性アッセイ ３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシ－フェニル）－２－（４－スルホ－フェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイ（プロメガ（Promega）、マディソン、ウィスコンシン、米国）を用いて、Ｘ線照射に依る細胞傷害性を評価した。ＭＣ３８細胞を９６ウェルプレートに１×１０４／ウェルで播種し、更に１２ｈに渡って培養した。ＰＢＳ、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒを、細胞に０、１、２、５、１０、２０、５０、及び１００μＭの同等のリガンドドーズで追加し、４ｈに渡ってインキュベーションした。其れから、細胞に２Ｇｙの線量でＸ線を照射した（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ＫＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。細胞を、ＭＴＳアッセイに依って細胞生存率を決定する前に７２ｈに渡って更にインキュベーションした。
生／死細胞分析 生／死細胞分析は細胞透過性色素カルセインＡＭ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）キットに依って評価した。ＭＣ３８細胞を６ウェルプレート上に於いて５×１０５／ウェルで一晩培養し、ＰＢＳ、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒと、２０μＭの同等の濃度で４ｈに渡って、０又は２Ｇｙの照射に依ってインキュベーションした（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。其れから、細胞をＰＢＳに依って穏やかに洗浄し、商標ＦＬＵＯＶＩＥＷ（商標）ＦＶ１０００で販売されている共焦点顕微鏡（オリンパス株式会社、東京、日本）を用いる共焦点レーザー走査型顕微鏡法に依る生細胞の可視化の為のカルセインＡＭ（緑色）及び死細胞の可視化の為のＰＩ（赤色）に依って染色した。
アポトーシス／壊死 細胞死分析はアポトーシス細胞死キットに依って評価した。ＭＣ３８細胞を６ウェルプレート上に於いて５×１０５／ウェルで一晩培養し、ＰＢＳ、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒと２０μＭの同等の濃度で４ｈに渡ってインキュベーションし、次に、０又は２Ｇｙの照射をした（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。２４ｈ後に、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８アネキシンＶ／死細胞アポトーシスキット（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、カールスバッド、カリフォルニア、米国）に従って染色し、ＣＬＳＭに依ってイメージングし、商標ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）４－１５で販売されているフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、サンノゼ、カリフォルニア、米国）を用いて定量した。
免疫原性細胞死 免疫原性細胞死はカルレティキュリン（ＣＲＴ）暴露に依って調べた。ＭＣ３８細胞を６ウェルプレート上に於いて５×１０５／ウェルで一晩培養し、ＰＢＳ、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒと２０μＭの同等の濃度でインキュベーションし、次に、０又は２Ｇｙの照射をした（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。其れから、細胞をＰＢＳに依って穏やかに洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＣＲＴ抗体（エンゾライフサイエンシズ（Enzo Life Sciences）、ファーミングデール、ニューヨーク、米国）に依って１：１００希釈でフローサイトメトリー分析の為に染色した。
貪食 Ｃ５７ＢＬ／Ｃ骨髄由来単球細胞を収穫、培養、及び活性化した。ネズミ顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及びＩＬ－４を１％の終濃度で１６８ｈに渡って供給し、未成熟ＤＣとしての非接着細胞を次の研究の為に収穫した。細胞を５％ＣＯ２に於いて３７℃でインキュベーションした。培地は２～３日毎に取り替え、細胞は６から８日の培養後に用いた。５×１０５のＣＦＳＥ標識された（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、カールスバッド、カリフォルニア、米国）ＭＣ３８細胞を６ウェルプレート上で一晩培養し、Ｈ２ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈ２ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒと２０μＭの同等のドーズで４ｈに渡ってインキュベーションし、次に、０又は２Ｇｙの線量でＸ線照射をした（ＲＴ２５０Ｘ線生成装置（フィリップス（Philips）、アンドーバー、マサチューセッツ、米国）、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、１ｍｍのＣｕフィルター）。１×１０６のＰＥ－Ｃｙ５．５標識されたＤＣを追加し、処置されたＭＣ３８細胞と３７℃で４ｈに渡って共培養した。其れから、細胞を収集し、冷ＰＢＳに依って２回洗浄し、ＣＬＳＭに依ってイメージング又はフローサイトメトリーに依って分析した。
免疫蛍光染色 腫瘍及びリンパ節を収集し、爾後に凍結した。５μｍの厚さの組織切片を、ＣＭ１９５０クリオスタット（ライカカメラ（Leica Camera）、ヴェッツラー、ドイツ）を用いて調製した。此れ等の切片を少なくとも１ｈに渡って風乾し、其れから、２０℃のアセトン中で２０ｍｉｎに渡って固定した。２０％驢馬血清に依るブロッキング後に、切片を、ＣＤ１１ｂ（５３－６．７）、Ｆ４／８０（Ｈ５７－５９７）、ＣＤ１１ｂ（５３－６．７）、ＭＨＣ－ＩＩ（５３－６．７）、ＣＤ８６（５３－６．７）、ＣＤ２０６（５３－６．７）、及びＣＤ８α（５３－６．７）に対する個々の一次抗体と４℃で一晩インキュベーションし、次に、ｒ．ｔ．で１ｈの色素コンジュゲート化二次抗体とのインキュベーションをした。其れから、別の１０ｍｉｎのＤＡＰＩに依る染色後に、切片をＰＢＳに依って２回洗浄し、ＳＰ８ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ共焦点顕微鏡（ライカカメラ（Leica Camera）、ヴェッツラー、ドイツ）に依って観察した。
同系モデルに於けるインサイチュワクチン接種．相乗的な腫瘍モデルＭＣ３８、ＭＣ３８－ｏｖａ、及びＰａｎｃ０２を樹立して、ｎＭＯＦに依って媒介されるインサイチュワクチン接種のインビボの抗癌効力を評価した。単一腫瘍モデルでは、５×１０５のＭＣ３８細胞、１×１０６のＭＣ３８－ｏｖａ細胞、又は１×１０６のＰａｎｃ０２細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下接種した。腫瘍が体積が１００～１５０ｍｍ３に達した時に、マウスに０．２μｍｏｌのＨｆのドーズのｎＭＯＦ、１μｇのドーズのＣｐＧ、又はＰＢＳを腫瘍内注射した。注射の１２ｈ後に、マウスを２％（ｖ／ｖ）イソフルランに依って麻酔し、腫瘍に１ＧｙのＸ線／フラクション（２２５ｋＶｐ、１３ｍＡ、０．３ｍｍのＣｕフィルター）をトータルで５つの毎日のフラクションで照射した。両側腫瘍モデルでは、５×１０５のＭＣ３８細胞を原発腫瘍として右脇腹に皮下接種し、２×１０５のＭＣ３８細胞、２×１０５のＢ１６Ｆ１０細胞又は５×１０５のＬＬ２細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの遠隔腫瘍として左脇腹に皮下接種した。αＰＤ－Ｌ１（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２、カタログＮｏ．ＢＥ０１０１、バイオエクセル（BioXCell）、レバノン、ニューハンプシャー、米国）を３日毎に腹腔内注射に依って７５μｇ／マウスのドーズで与えた。腫瘍サイズをカリパーに依って毎日測定した。此処で、腫瘍体積は（幅２×長さ）／２に等しい。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ．ＩＦＮ－γに対する腫瘍特異的な免疫応答はＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（商標ＥＬＩＳＰＯＴ－ＲＥＡＤＹ－ＳＥＴ－ＧＯ！（商標）で販売されているマウスＩＦＮ－γアッセイ；Ｃａｔ．Ｎｏ．８８－７３８４－８８；イーバイオサイエンス（eBioscience）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に依ってインビトロで測定した。ミリポアマルチスクリーンＨＴＳ－ＩＰプレート（ミリポアシグマ（MilliporeSigma）、バーリントン、マサチューセッツ、米国）を抗マウスＩＦＮ－γ捕捉抗体に依って４℃で一晩コーティングした。脾細胞の単細胞懸濁液を、ＭＣ３８腫瘍を持つマウスから得、抗体コーティングプレートにウェル当たり２×１０５細胞の濃度で播種した。細胞をペプチド配列（ＫＳＰＷＦＴＴＬ）（配列番号５有りで又は無しで４２ｈに渡って３７℃でインキュベーションし、其れから捨てた。其れから、プレートをビオチンコンジュゲート化抗ＩＦＮ－γ検出抗体とｒ．ｔ．で２ｈに渡ってインキュベーションし、次に、２ｈのｒ．ｔ．でのアビジン－ＨＲＰとのインキュベーションをした。３－アミノ－９－エチルカルバゾール基質溶液（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ、米国、Ｃａｔ．ＡＥＣ１０１）をサイトカインスポット検出の為に追加した。スポットは、商標ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（商標）で販売されている分析器（セルラーテクノロジー（Cellular Technology）Ｌｔｄ、シェーカーハイツ、オハイオ、米国）に依ってイメージング及び定量された。
リンパ球プロファイリング．腫瘍及びリンパ節を収穫し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩ（ギブコラボラトリーズ（Gibco Laboratories）、ゲイザースバーグ、メリーランド、米国）に依って１ｈに渡って３７℃で処置した。細胞を４０μｍのサイズのナイロンメッシュフィルターに依って濾過し、ＰＢＳに依って洗浄した。腫瘍所属リンパ節を収集し、直接的にセルストレーナーに依って粉砕した。単細胞懸濁液を抗ＣＤ１６／３２（クローン９３）とインキュベーションして、ＦｃＲに対する非特異的結合を縮減した。細胞を次の蛍光色素コンジュゲート化抗体に依って更に染色した：ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、ＣＤ３ｅ（１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（５３－６．７）、Ｎｋｐ４６（２９Ａ１．４）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｇｒ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）、ＭＨＣ－ＩＩ（ＡＦ６－１２０）、ＣＤ８０（１６－１０Ａ１）、ＣＤ８６（ＧＬ１）、ＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、Ｈ－２ＫｂのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）（２５－Ｄ１．１６）、ＰＩ、及び黄色蛍光反応性色素（ＣＤ４５はＢＤバイオサイエンス（BD Bioscience）（サンノゼ、カリフォルニア、米国）から、ＣＤ２０６及びＣＤ６２Ｌはバイオレジェンド（Biolegend）（サンディエゴ、カリフォルニア、米国）から、他はイーバイオサイエンス（eBioscience）（サンディエゴ、カリフォルニア、米国）から）。抗体は１：２００の希釈で用いた。異なる免疫細胞についての代表的なゲーティング戦略が補足図３１～３２に示されている。商標ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）４－１５で販売されているフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、サンノゼ、カリフォルニア、米国）を細胞取得の為に用い、データ分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター（Tree Star）、アシュランド、オレゴン、米国）に依って実施した。
養子ＯＴ－ＩのＴ細胞移入 ２×１０６のＭＣ３８－ｏｖａ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６のＲａｇ２－／－マウスの右脇腹に皮下注射した。１４日後に、マウスにＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒを０．２μｍｏｌのＨｆのドーズで１μｇのドーズのＣｐＧ有り又は無しで腫瘍内注射し、次に、トータルで５つの毎日のフラクションで１ＧｙのＸ線／フラクションをした。第１の照射の２日後に、脾臓及びリンパ節をＯＴ－Ｉマウスから単離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞をマウスＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク（Miltenyi Biotec）、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を用いてネガティブソーティングし、１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞をＭＣ３８－ｏｖａを持つＲａｇ２－／－マウスに静脈内注射した。腫瘍サイズをカリパーに依って毎日測定した。此処で、腫瘍体積は（幅２×長さ）／２に等しい。
統計分析．群のサイズ（ｎ≧５）は、効力研究の為の適切な統計ＡＮＯＶＡ分析を保証する様に選んだ。スチューデントのｔ検定を用いて、群間の分散が類似であるかどうかを決定した。統計分析はＯｒｉｇｉｎＰｒｏ（オリジンラブ・コープ（OriginLab Corp.）、ノーサンプトン、マサチューセッツ、米国）を用いて行なった。統計的有意は、両側のスチューデントのｔ検定を用いて計算し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１として定義した。動物実験は盲検の様式では行われなかった。平均±ＳＤとして表されている。免疫分析は盲検の様式で行なった。メジアン±ＳＤとして表されている。
例１０
Ｈｆ－ＤＢＢ Ｆ －Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ－ｎＭＯＦの合成及びキャラクタリゼーション
本開示の主題の１つの態様に従って、ＤＡＭＰ及び腫瘍抗原のＸ線に依って活性化される生成とＰＡＭＰとしてのＡＰＣへのＣｐＧの効率的な送達とに依る個別化された癌ワクチン接種の為にナノスケール金属有機構造体（ｎＭＯＦ）を用いる新規の戦略が記載される。Ｘ線に依って活性化されるＲＴ－ＲＤＴに依ってＤＡＭＰ及び腫瘍抗原を放出する為の且つ静電相互作用に依ってＣｐＧを送達する為のカチオン性ｎＭＯＦを、分子工学に依って設計した。ｎＭＯＦに依って提供されるインサイチュワクチン接種は、腫瘍所属リンパ節に於いて細胞傷害性Ｔ細胞を有効に増殖させて、腫瘍退縮の為に適応免疫系を再活性化する。図２３を見よ。ｎＭＯＦに基づくインサイチュワクチンの局所的な治療効果は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（αＰＤ－Ｌ１）との組み合わせ処置に依って遠隔腫瘍に迄拡げられて、ＭＣ３８大腸癌モデルに於いて８３．３％治癒率を提供した。
より具体的には、ＲＴ－ＲＤＴに依ってＤＡＭＰ及び腫瘍抗原をを生成し、高いＣｐＧ担持に依るＰＡＭＰを送達する為に、２つの正荷電ｎＭＯＦを設計した：夫々高Ｚ金属Ｈｆ６二次構造単位（ＳＢＵ）及び光増感性ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＤＢＢ－Ｉｒリガンドを有するＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ。上のスキーム１並びに図２４Ａ及び２４Ｂを見よ。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ－ｎＭＯＦはＨｆ６（μ３－Ｏ）４（μ３－ＯＨ）４Ｌ６の式のＵｉＯ様の構造を所有し、此処で、Ｌ＝ＤＢＢＦ－Ｉｒ又はＤＢＢ－Ｉｒであった。図２５Ａを見よ。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒは、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）イメージング（図２６Ｂ及び２７Ａ～２７Ｄを見よ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）測定に依って明らかにされる通り、球状から八面体の形態学を見せ、～１００ｎｍの直径を有した。図２５Ｂを見よ。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒの光増感性の特徴を、ＵＶ－Ｖｉｓ吸収及びルミネセンス分光法に依って確認した。此処で、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒは、夫々ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＤＢＢ－Ｉｒの物に類似の吸光度及びルミネセンスを示した。図２８Ａ～２８Ｄを見よ。
例１１
活性酸素種、ＤＡＭＰ、及びインビトロ免疫原性
活性酸素種の検出：何れか１つの理論に拘束されようとする事無しに、光増感性Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒは、Ｘ線照射に依って、Ｈｆ６－ＳＢＵの水放射線分解に依るヒドロキシラジカル（・ＯＨ）並びに光増感性リガンドの励起に依る一重項酸素（１Ｏ２）及びスーパーオキシドアニオン（Ｏ２ －）を包含する複数の活性酸素種（ＲＯＳ）を生成し得ると思われる。図２６Ａを見よ。ＡＰＦ及びＳＯＳＧアッセイに依って定量される通り、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－ＩｒプラスＸ線照射［Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）と示される］及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）両方は、其れ等のリガンド対照と比較して有意に増強された・ＯＨ及び１Ｏ２生成を見せた。図２６Ｃ及び２６Ｄを見よ。然し乍ら、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）のみが、ＢＭＰＯアッセイに依って決定される効率的なＯ２ －生成を呈した。此れはＤＢＢ－Ｉｒよりも高いＤＢＢＦ－Ｉｒの還元電位に帰せられる。図２６Ｅを見よ。
インビトロの活性酸素種の生成：ＭＣ３８細胞に依るＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒの取り込みを評価した。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）研究は、２つのｎＭＯＦが４ｈインキュベーション後に類似の細胞内Ｈｆレベルに達するという事を示した。図２９を見よ。其れから、インビトロの１Ｏ２及びＯ２ －生成を夫々ＳＯＳＧ及びスーパーオキシドアッセイキットに依って探査した。Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）両方は強い緑色蛍光を誘導し、有意な１Ｏ２生成を指示した。然し乍ら、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）のみが強い赤色蛍光を見せ、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴプロセスに依るＯ２ －の生成を指示した。図３０Ａを見よ。ＲＴ効果を確認する為に、・ＯＨに依って誘導されるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を、リン酸化γ－Ｈ２ＡＸのフローサイトメトリー分析に依って、ＰＢＳ、リガンド、又はｎＭＯＦに依ってＸ線有り又は無しで処置された細胞に於いて定量した。興味深い事に、照射の２ｈ後に、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）よりも有意に高い赤色のγ－Ｈ２ＡＸ蛍光が、蓋然的にはスーパーオキシドジスムターゼに依るバイオトランスフォーメーションＯ２ －から・ＯＨを原因として、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）に依って処置された群で観察された。蛍光はＸ線照射無しの又はｎＭＯＦインキュベーション無しの群では観察されなかった。
ＤＡＭＰの放出及びインビトロ免疫原性：Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒに依って生成する無数のＲＯＳが他の処置よりも有効に癌細胞を損傷するという仮説を試験する為に、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒに依って媒介される細胞損傷及びＤＡＭＰ生成を評価した。クローン形成性アッセイは、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）がＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）をやや上回り、１．６８に対して１．７５のＲＥＦ１０値を有するという事を示した。図３０Ｂを見よ。ＭＴＳアッセイは、更に、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）がＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）よりも高い細胞傷害性を見せ、夫々４．２８±１．１５μＭ及び７．８５±２．４１μＭのＩＣ５０値を２Ｇｙに於いて有するという事を示した。図３０Ｃを見よ。より多大なレベルの細胞死は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）について、ＣＬＳＭ及びフローサイトメトリーに依る生／死細胞イメージング及びアポトーシス細胞定量に依っても又観察された。図３０Ｄを見よ。此れ等の結果は、ＲＴ－ＲＤＴプロセスに依るＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）に依るより強い殺細胞効果を指示している。
次に、ｎＭＯＦに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴからのＤＡＭＰの生成を、腫瘍細胞の免疫原性細胞死（ＩＣＤ）並びにＡＰＣに依る死んで行く腫瘍細胞及び其れ等のアポトーシス性デブリの貪食を調べる事に依って検討した。ＩＣＤプロセスでは、カルレティキュリン（ＣＲＴ）が「私を食べて」シグナルとして細胞膜に移行し、此れがマクロファージ及びＤＣに依って認識されて、死んで行く腫瘍細胞及び其れ等のアポトーシス性デブリを貪食する。フローサイトメトリー定量は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）処置された細胞がより高いＣＲＴ蛍光を見せるという事を明らかにし、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）がより高い細胞傷害性に依ってより強いＩＣＤを誘導するという事を示唆した。図３１Ａを見よ。
ＡＰＣに依る抗原プロセシング及び其の免疫活性化に対するｎＭＯＦに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴのインパクトを評価する為に、骨髄細胞から分化したＤＣを、ＰＢＳ、ＤＢＢ－Ｉｒ、ＤＢＢＦ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒに依ってＸ線照射有りで又は無しで処置されたＣＦＳＥ標識されたＭＣ３８細胞と共培養した。フローサイトメトリーは、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）処置が、他の処置群よりも、貪食されたＣＦＳＥ標識されたＭＣ３８細胞を有するＰＥ－Ｃｙ５．５コンジュゲート化ＣＤ１１ｃ標識されたＤＣの有意に高い集団を誘導するという事を示し、カチオン性ｎＭＯＦに依って媒介される増強された免疫刺激を指示した。図３１Ｂを見よ。ＣＬＳＭイメージングは、より多くのＣＤ１１ｃ＋ＤＣがＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）処置されたＣＦＳＥ＋ＭＣ３８細胞を貪食するという事を確認した。
ＰＡＭＰのインビトロ送達：何れか１つの理論に拘束されようとする事無しに、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－ＩｒのＤＢＢＦリガンドのフッ素化は電子求引効果を導入して、ＣｐＧのより効率的な送達の為に表面電荷を増大させ得るという事が正当化された。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒは夫々３１．６±１．２ｍＶ及び２３．８±０．８ｍＶのζ電位値を見せ、アニオン性ＣｐＧの静電吸着の為のＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒのよりカチオン性の骨格を確認した。図３２Ａを見よ。１ｍｇのＣｐＧを、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ又はＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒの２０ｍＬのＰＢＳ溶液中に於いて１０ｍＭのＨｆ濃度で１０ｍｉｎに渡ってインキュベーションした。遠心後に、ＤＮＡゲル電気泳動は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ上への８２．７％のＣｐＧ及びＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ上への４６．５％のＣｐＧの吸着を示し、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光測色法に依って定量される通り、ＣｐＧの８．６％及び４３．８％が対応する上清中に留まった。図３２Ｂを見よ。ＤＣに依るＣｐＧ内在化を次に調べた。フローサイトメトリー及びＣＬＳＭイメージングは、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒが、其れ等がＦＩＴＣ標識された遊離ＣｐＧ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧと培養された後に、最も高い量のＣｐＧをＤＣに送達するという事を示した。図３２Ｃを見よ。此れ等の結果は、ＡＰＣにＰＡＭＰとしてのＣｐＧを送達する事に於けるＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒの優れた能力を確認している。
インビトロＤＣ成熟：ＤＣ成熟に対するＣｐＧ送達の効果を評価する為に、骨髄由来ＤＣを、ＣｐＧ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧと０、６２．５、１２５、２５０、５００、及び１０００ｎｇ／ｍＬのＣｐＧ濃度で６０ｈに渡ってインキュベーションした。細胞を収穫し、ＭＨＣ－ＩＩ並びに共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６を包含するＤＣ成熟マーカーの検出の為に染色した。上清をも又収集し、サイトカインのインターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－α）及びインターロイキン－６（ＩＬ－６）の存在についてアッセイした。Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧ及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ両方は、ＤＣ成熟を有効に促進し、遊離のアニオン性ＣｐＧと比較して、ＣＤ８０（図３２Ｄを見よ）、ＣＤ８６（図３２Ｅを見よ）、及びＭＨＣ－ＩＩの増大したＭＦＩシグナルを有した。図３２Ｆを見よ。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧは、其のより有効なＣｐＧ送達の結果として、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＭＨＣ－ＩＩシグナルの上方制御に於いてＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧを上回った。カチオン性ｎＭＯＦに依って送達されたＣｐＧのみが、上昇したＩＦＮ－αレベルを示し、遊離ＣｐＧは効果を完全に有さなかった。図３２Ｇを見よ。其の上、遊離ＣｐＧに依って処置されたＤＣはＩＬ－６を高いＣｐＧ濃度でのみ分泌し、ｎＭＯＦ／ＣｐＧに依って処置されると、ＩＬ－６を低いＣｐＧ濃度で分泌した。図３２Ｈを見よ。ＩＬ－６及びＩＦＮ－α発現のｑＰＣＲは、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒが、ＤＣを活性化する為のＰＡＭＰとしてのＣｐＧをより効率的に送達するという事を確認した。図３３Ａ及び３３Ｂを見よ。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ刺激後のＤＣの増強された抗原提示特性を直接的に実証する為に、オボアルブミン抗原（ＯＶＡ、細胞株はＭＣ３８－ｏｖａと示される）に依ってトランスフェクションされたＭＣ３８細胞を、ＣｐＧ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧに依って刺激されたＤＣと３：１比で培養した。腫瘍抗原取り込み及び提示を、ＤＣ表面のＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）複合体（Ｋｂ－ｏｖａ）の発現を検出する事に依って調べた。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧは、蓋然的にはより効率的なＰＡＭＰの送達及び抗原提示の結果として、ＤＣに依る抗原取り込み及び提示を促進する事に於いてＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ＠ＣｐＧ及び遊離ＣｐＧを上回った（図３２Ｉ及び３３Ｃを見よ）。
例１２
インサイチュ癌ワクチン
Ｘ線に依って誘発されるインサイチュ癌ワクチン：Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）の局所的な抗癌効果をインサイチュ癌ワクチンとして検討した。トータルで４ドーズの隔週の２μｍｏｌのＤＢＢＦ－Ｉｒ又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒの静脈内注射は、定常的な体重増加から判断してＣ５７ＢＬ／６マウスに対する毒性を引き起こさなかった。次に、右脇腹への５×１０５のＭＣ３８細胞の皮下注射に依る、Ｃ５７ＢＬ／６ｃマウスに於けるＴ細胞排除ネズミ大腸モデルＭＣ３８であった。先の研究では、皮下ＭＣ３８腫瘍が、２×１０６のＭＣ３８細胞を接種する事に依って樹立され、処置の開始前に第７日にサイズが１００～１５０ｍｍ３に達した。対照的に、より少数の細胞を接種された時には、ＭＣ３８腫瘍は１４日で１００～１５０ｍｍ３迄成長し、７日モデルよりももっと免疫抑制性の腫瘍微小環境を示した。図３４Ａを見よ。ＰＢＳ、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ、又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧを０．２μｍｏｌのＨｆドーズ及び／又は１μｇのＣｐＧドーズで腫瘍内注射した。１２ｈ後に、腫瘍に１ＧｙのＸ線（２２５ｋＶｐ、１３ｍＡ、１Ｇｙ）を照射し、次に、Ｘ線（１Ｇｙ）の更に４つの毎日の照射をした。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）はＨｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ（＋）を上回り、６４．７％に対して８１．９％の腫瘍成長阻害指数（ＴＧＩ）を有し、インビボのＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴに依るＤＡＭＰのより効率的な放出を示唆した。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）は、増強された腫瘍退縮をＣｐＧ（＋）（３４．８％に対して９９．６％のＴＧＩ）又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）と比べて第３１日に示し、ｎＭＯＦに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴに依って放出されるＤＡＭＰ及びカチオン性ｎＭＯＦに依って送達されるＰＡＭＰの相乗作用を指示した。図３５Ａを見よ。下の表４をも又見よ。抗癌効力を、第３１日の切除された腫瘍の光学画像及び平均重量に依って確認した。図３４Ｂ及び３４Ｃを見よ。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）の免疫蛍光及びＨ＆Ｅ染色は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）処置に依る腫瘍細胞の有意なアポトーシスを指示した。全身毒性は全ての処置群で観察されなかった。抗腫瘍活性を、高い放射線耐性及び不良な免疫原性を有するＣ５７ＢＬ／６ｃマウスのネズミ膵臓癌モデルＰａｎｃ０２についても又評価した。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）は他の群と比べて優れた腫瘍成長阻害を提供し（図３４Ｄ、３４Ｅ、３５Ｂ、及び表４を見よ）、様々な免疫原性を有する広いスペクトルの癌にインサイチュ癌ワクチンとしてＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）を用いる事のポテンシャルを示唆した。
Figure 2023526501000010
インサイチュ癌ワクチン接種後の自然免疫：血漿中ＩＬ－６及びＩＦＮ－α濃度をＥＬＩＳＡに依ってアッセイし、遺伝子発現を腫瘍及び腫瘍所属リンパ節（ＤＬＮ）に於いてｑＰＣＲに依って処置の２４ｈ後に決定して、自然免疫応答を評価した。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）処置は、有意に上昇したレベルの血漿中及び腫瘍内ＩＬ－６及びＩＦＮ－αをＣｐＧ（＋）又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）処置と比べて示した。図３５Ｃを見よ。更に其の上、フローサイトメトリー及びＣＬＳＭ研究は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）処置群に於いて、マクロファージ（図３５Ｄを見よ）及びＤＣ（図３５Ｅを見よ）を包含する腫瘍及びＤＬＮ浸潤ＡＰＣの有意な増大を示した。此れは、ｎＭＯＦに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴに依って放出されるＤＡＭＰ及び腫瘍抗原並びにカチオン性ｎＭＯＦに依って送達されるＰＡＭＰの相乗的な効果を指示している。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）に依って促進されるＤＣ成熟は、ＭＨＣ－ＩＩ及び共刺激性ＣＤ８０分子の上昇した発現に依って更に実証された。図３５Ｆを見よ。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）処置の２及び１２日後の血漿中のトータルのＩｇＧ（図３５Ｇを見よ）及びＩｇＭ（図３５Ｈを見よ）の上昇は、Ｂ細胞に依って媒介される液性免疫の有効な促進を示唆する。ＩｇＭは補体系に結合及び其れを活性化して抗原のオプソニン化及び分解並びに食細胞に依る抗原提示を促進し得るので、血漿中ＩｇＧ及びＩｇＭの増大したレベルの結果は、インサイチュワクチン接種後の抗原提示を促進する事に於けるＢ細胞の重要な役割を示唆する。Ｋｂ－ｏｖａ複合体の発現（ＣＤ４５＋細胞からゲーティングされたＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）－Ｈ２Ｋｂ）はＭＣ３８－ｏｖａモデルに於いてＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）処置後に有意に上方制御され、抗原提示プロセスを確認した。図３５Ｉを見よ。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）群は肥大したＤＬＮをも又見せ（図３６を見よ）、ＤＬＮに於けるＴ細胞増殖を示唆した。ＣＬＳＭに依るＤＬＮに於けるＫｉ６７の増大した発現は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）処置後のＤＬＮに於けるＴ細胞増殖を支持した。最後に、ＭＣ３８－ｏｖａ腫瘍を免疫不全Ｒａｇ２－／－マウスに於いて樹立し、其れから、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）プラスＯＴ－ＩのＴ細胞の養子移入に依って処置した。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）プラスＯＴ－ＩのＴ細胞移入に依って処置されたマウスは、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ（＋）プラスＯＴ－ＩのＴ細胞移入又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）単独何方かよりも有効な腫瘍抑制を示し（図３５Ｊを見よ）、インサイチュ癌ワクチンとしてのＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）処置後の有効な抗原提示プロセスを支持した。興味深い事に、抗炎症性（腫瘍促進性）Ｍ２サブタイプに対する炎症促進性Ｍ１サブタイプの増大した比を有するマクロファージ再極性化が、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）処置後に観察された。
例１３
アブスコパル効果
其れから、ＭＣ３８の両側モデルを樹立して、抗ＰＤ－Ｌ１（αＰＤ－Ｌ１）抗体との組み合わせでのＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）の全身的な抗癌効力を評価した。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧを、原発腫瘍に０．２μｍｏｌのＨｆ及び１μｇのＣｐＧのドーズで腫瘍接種の１４日後に腫瘍内注射し、１Ｇｙ／フラクションの線量の毎日のＸ線照射がトータルで５フラクションで第１５日に始まった。７５μｇのαＰＤ－Ｌ１を３日毎に腹腔内注射に依ってトータルで３ドーズで投与した。αＰＤ－Ｌ１無しでは、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）は原発腫瘍を殆ど根絶したが、遠隔腫瘍の進行は程々にのみ遅らせた。極めて対照的に、Ｈｆ－ＤＢＢ－Ｉｒ－Ｆ＠ＣｐＧ（＋）及びαＰＤ－Ｌ１の組み合わせは、原発及び遠隔腫瘍両方を有意に退縮させ、８３．３％の治癒率を有した。此の結果は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）に基づくインサイチュ癌ワクチン接種及びＣＢＩの間の強い相乗作用を指示している。図３７Ａ～３７Ｃを見よ。
例１４
適応免疫
浸潤白血球を照射の１０日後の原発及び遠隔腫瘍両方に於いてプロファイリングした。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ＋αＰＤ－Ｌ１（＋）処置群は、腫瘍浸潤ＣＤ４５＋白血球（図３７Ｄを見よ）、ＤＣ（図３７Ｅを見よ）、マクロファージ（図３８Ａ及び３８Ｂを見よ）、及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図３７Ｆを見よ）の有意な増大を原発及び遠隔腫瘍両方に於いて示し、インサイチュワクチン接種後の強められた自然免疫応答を示唆した。特に、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依る処置後には、トータルの原発及び遠隔腫瘍細胞のナチュラルキル細胞（ＮＫ細胞、図３７Ｇを見よ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図３７Ｈを見よ）、及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図３７Ｉを見よ）のパーセンテージは、夫々ＰＢＳ（－）群に於ける０．０６±０．０５％及び０．１３±０．１９％、０．０５±０．０４％及び０．０３±０．０２％、並びに０．４１±０．３０％及び０．３６±０．２７％から、０．５２±０．４２％及び１．２１±０．８９％、０．２５±０．２３％及び１．１５±１．１４％、並びに１．４６±０．５９％及び１．４３±０．５５％迄有意に増大した。エフェクターＴ細胞浸潤はフローサイトメトリー及びＣＬＳＭ両方に依って示された。両側のＤＬＮを、Ｔ細胞増殖を検出する為に収穫、秤量、及び免疫染色し、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ＋αＰＤ－Ｌ１（＋）処置が両側ＤＬＮに於けるＴ細胞増殖を促進するという事を示唆した。図３８Ｃ及び３８Ｄを見よ。此れ等の結果は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１の組み合わせが自然免疫応答を誘導するのみならず、処置された局所的な及び無処置の遠隔腫瘍両方に於ける適応免疫をも又強化するという事を示唆している。
例１５
誘導される及び長期的な免疫
誘導される免疫の特異性：腫瘍抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の存在をＩＦＮ－γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイに依って決定した。脾細胞を第１の照射の１０日後にＭＣ３８を持つマウスから収穫し、ペプチド配列ＫＳＰＷＦＴＴＬ（配列番号５）に依って４２時間に渡って刺激した。ＩＦＮ－γスポット形成細胞を免疫スポットリーダーに依ってカウントした。１０６脾細胞当たりの抗原特異的なＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の数は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依って処置された腫瘍を持つマウスに於いて有意に増大し（ＰＢＳ（－）の１６．４±５．９と比較して６０．２±３９．６及び１３９．０±５２．４、図３９Ａを見よ）、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１両方が腫瘍特異的なＴ細胞応答を有効に生成するという事を示唆した。特異的な抗腫瘍免疫を更に検討する為に、ＭＣ３８原発腫瘍をＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）又はＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依って処置して、処置が遠隔の脇腹のマッチしない同系腫瘍を退縮させ得るかどうかを観察した。図３９Ｂに図解される通り、ＭＣ３８を原発の処置された腫瘍として用い、同系腫瘍細胞株Ｂ１６Ｆ１０及びＬＬ２を遠隔の無処置の腫瘍と同時的にインプラントした。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）及びＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１処置両方は原発ＭＣ３８腫瘍を有効に退縮させたが、遠隔のＢ１６Ｆ１０又はＬＬ２腫瘍に対する効果は有さなかった。図３９Ｃ～３９Ｆを見よ。此れ等の実験は、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１処置に依るインサイチュワクチン接種後の新たに増殖したＴ細胞の腫瘍特異性及び個別化された性質を指示している。
長期的な抗腫瘍免疫：効率的なアブスコパル効果に於ける細胞傷害性Ｔ細胞の関わりは、成熟Ｔ及びＢ細胞を欠損したＲａｇ２－／－Ｃ５７ＢＬ／６マウスに於けるＭＣ３８の両側皮下モデルに対するＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１処置の効力の欠如に依って更に支持された。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依って処置された原発腫瘍は当初には抑制されたが（図３９Ｇを見よ）、Ｘ線照射の終了後には急速に成長した。遠隔腫瘍に対するアブスコパル効果は観察されなかった。図３９Ｈを見よ。此の結果は、アブスコパル効果及び局所的な腫瘍退縮／根絶の両方が腫瘍特異的な適応免疫の存在を要求するという事を確認している。最後に、腫瘍再負荷研究を実施して、長期的な免疫記憶効果を確認した。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依る処置後に完全に治癒したマウスでは、５×１０５のＭＣ３８細胞を腫瘍根絶の３０日後に反対側の左脇腹に接種し、其れ等の治癒したマウスは第１の負荷後に腫瘍不含に留まり、強い抗腫瘍免疫記憶効果を指示した。第１の負荷の２ヶ月後に、２×１０６のＢ１６Ｆ１０細胞を右脇腹に接種し、治癒したマウスはナイーブマウスに類似に腫瘍を樹立し、免疫記憶効果の腫瘍特異性を示唆した。図３９Ｉを見よ。メモリーエフェクター細胞（ＣＤ３ε＋ＣＤ８α＋ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低表現型）をも又組み合わせ処置後の脾細胞に於いてプロファイリングした。図３９Ｊに示される通り、メモリーエフェクター細胞の有意な増大がＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１処置後の脾臓に於いて観察された。
例１６
例９～１５の考察
進行した腫瘍は、ホスト免疫系を不活性化、制御不全化、及びハイジャックする事に依って免疫監視をエスケープする（マホーニー（Mahoney）等著，２０１５年；ダン（Dunn）等著，２００２年）。此れと戦う為に、抗ＰＤ－（Ｌ）１－ＣＢＩは、低い副作用で耐久性の抗癌効力を提供する為にＴ細胞阻害チェックポイントシグナル伝達経路を標的化する事に依って、幾つかの癌の標準治療に成っている（ブラマー（Brahmer）等著，２０１２年；エリコ（Errico）著，２０１５年）。然し乍ら、免疫チェックポイント阻害は、免疫原性の腫瘍微小環境、所謂「ホットな」腫瘍への依拠を原因として、癌患者の少数に於いてのみ耐久性の応答を誘起する。比較的「コールドな」腫瘍、例えば低い腫瘍変異量、低いＰＤ－Ｌ１発現レベル、及び／又は既存のＴ細胞の低い存在量の患者では、「コールドな」腫瘍を「ホット」に変える為の免疫アジュバント処置が、ホスト系の免疫寛容を克服及び抗腫瘍免疫を強化する為に、チェックポイント阻害剤との組み合わせで活発に調べられている。
本開示の主題に従って、腫瘍抗原暴露に依って自然免疫を生成する為の局所的な処置は、「コールドな」腫瘍を免疫原性の温床へと有効に再活性化し得るという事が提案される。更に其の上、２つのパターン認識受容体（ＰＲＲ）経路（カワイ（Kawai）及びアキラ（Akira）著，２０１０年；ゴン（Gong）等著，２０１９年）、ＲＴ損傷後のＤＡＭＰに依って誘導されるｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ（デン（Deng）等著，２０１４年）及びＣｐＧの様なＰＡＭＰに依って誘導されるＴＬＲ経路（ウェイナー（Weiner）等著，１９９７年）は、独立して作動し（エミング（Emming）及びシュローダー（Schroder）著，２０１９年）、其れ等が同時に活性化されて免疫刺激に対する相加的又は相乗的な効果を達成し得るという事を示唆する。Ｈｆ－オキソＳＢＵ及び光増感性リガンドから構築された多孔性のｎＭＯＦは、増強されたＸ線エネルギー付与、簡単なＲＯＳ拡散、及びユニークなＲＴ－ＲＤＴ作用機序に依って、イオン化放射線の放射線治療効果を増強し得る（ラン（Lan）等著，２０１８年；ニ（Ni）等著，２０１９年；ル（Lu）等著，２０１８年）。本開示の主題は、効率的なＲＴ－ＲＤＴを媒介する事に依る非ウイルス系インサイチュワクチン接種の為の新たなカチオン性のＨｆに基づくｎＭＯＦ、Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒを提供して、免疫原性の腫瘍抗原及びＤＡＭＰを生成し、ＰＡＭＰとしてのアニオン性ＣｐＧを送達する。本開示のＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）は、抗原提示の為にリンパ器官に関与してＣＢＩと相乗作用して遠隔腫瘍に於けるＣＴＬ浸潤を誘導し乍ら、局所的な腫瘍のインサイチュ癌ワクチンにパッケージされた相乗的なＤＡＭＰ及びＰＡＭＰに依る初めての処置を提供すると思われる。更に其の上、比較的免疫抑制性の１４日ＭＣ３８大腸癌モデルに於いてＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒ＠ＣｐＧ（＋）＋αＰＤ－Ｌ１に依って達成された８３．３％の治癒率は、免疫学的に「コールドな」腫瘍に対するｎＭＯＦに基づくインサイチュワクチンの可能性としての使用を示唆している。
ｎＭＯＦに依って提供されるインサイチュ癌ワクチン接種は、伝統的な癌ワクチンと比べて、幾つかの可能性としての利点を有する。第１に、ｎＭＯＦに依って提供されるインサイチュワクチンは、無数のＲＯＳに依って腫瘍から放出される自家抗原から個別化され、伝統的に製造されるペプチドワクチンに直面する腫瘍不均質性の問題を克服し得る。第２に、カチオン性ｎＭＯＦは、静電相互作用に依って死んで行く癌細胞からのＤＡＭＰ及び腫瘍抗原を捕捉し得（ミン（Min）等著，２０１７年）、ウイルス様のサイズ分布に依って、効率的な抗原提示の為にＡＰＣに依って認識され、取り込まれて、強い細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激し得る。第３に、カチオン性ｎＭＯＦは、ＴＬＲ刺激及び下流の免疫学的プロセスの為に、アニオン性ＣｐＧを送達し、酵素分解から保護する。第４に、ｎＭＯＦに依って媒介されるＲＴ－ＲＤＴプロセスに依って放出される腫瘍抗原及びＤＡＭＰ、並びにカチオン性ｎＭＯＦに依って送達されるＣｐＧに基づくＰＡＭＰは、相乗的に働いてＤＣ成熟を刺激して抗原提示及び適応免疫を促進する。第５に、ｎＭＯＦに基づくワクチンは、Ｘ線に依って活性化されてＤＡＭＰ及び腫瘍抗原を放出し、比較的非毒性のコンポーネントを有し、其れ故に、少数の副作用を有する事が予想される。更に其の上、αＰＤ－Ｌ１の全身投与は免疫抑制性の共阻害マーカーＰＤ－Ｌ１をブロックして、抗原提示を強化し、Ｔ細胞疲弊を減衰させる。ＣＢＩとのｎＭＯＦに依って媒介されるインサイチュ癌ワクチンの組み合わせは、腫瘍特異的な且つ長期的な抗腫瘍免疫を提供する。
概要として、本開示の主題は、ＲＴ－ＲＤＴに依る有効なＲＯＳ生成の為に光増感性リガンドを合理的にフッ素化する事及び効率的なＣｐＧ担持の為にｎＭＯＦ表面電荷をチューニングする事に依って、新規のｎＭＯＦを提供する。Ｈｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒの腫瘍内投与及びＸ線照射後に、インサイチュで放出されたＤＡＭＰ及び腫瘍抗原とＨｆ－ＤＢＢＦ－Ｉｒに依って送達されたＣｐＧとは、強力な個別化された癌ワクチンとして相乗的に機能して、ＡＰＣを活性化し、腫瘍所属リンパ節に於いて細胞傷害性Ｔ細胞を増殖させて、局所的な腫瘍退縮の為に適応免疫系を再活性化する。免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせられた時に、ｎＭＯＦに基づく癌ワクチンからの自然及び適応免疫は、更に増強されて、腫瘍特異性及び長期的な免疫記憶効果を有する素晴らしい抗腫瘍効力を生成した。此の組み合わせ処置は、ＣＴＬを再活性化する事に依って、全身的な抗腫瘍免疫に依ってインサイチュ癌ワクチンの局所的な治療効果を遠隔腫瘍に迄拡げる。此の研究は、ｎＭＯＦに基づく個別化されたワクチンの概念を進行した癌の処置の為のヒト治験へと前進させる為の道を敷く。
例１７
ｎＭＯＦ及びペプチド
酢酸（ＯＡｃ）キャッピング基を有するＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ－ｎＭＯＦをＨｆ－ＤＢＰと類似の様式で合成した。Ｈｆ－ＤＢＰに類似に、Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔを、ｈｃｐ様の積層パターンでＤＢＰ－Ｐｔリガンドに依ってＨｆ１２－ＳＢＵを接続する事に依って形成した。表面上のＨｆ１２－ＳＢＵも又ＯＡｃ基に依って終結し、Ｈ２Ｏ中で－２２．５±０．５ｍＶのζ電位を有した。Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔをトリフルオロ酢酸トリメチルシリル（ＴＭＳ－ＴＦＡ）に依って処置して、１Ｈ及び１９Ｆ－ＮＭＲ分光法に依って決定される通りＯＡｃ基をＴＦＡ基に依って置き換える事に依って、ＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔを提供した。ＴＥＭイメージング及びＰＸＲＤ研究は、Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔの形態学及び結晶化度が表面修飾後に維持されるという事を示した。弱配位性のＴＦＡ基は蛋白質上のカルボン酸基又は核酸上のリン酸基に依って置き換えられ得る。
ＭＵＣ－１ペプチドは膜ＭＵＣ－１ムチンを標的化する短いペプチド（ｄ－ＣＱＣＲＲＫＮ）（配列番号１）であり（ＣＱＣモチーフ）、此れは細胞アポトーシスを誘導及びホスト抗癌免疫応答を開始し得る。治療薬ペプチドは低い細胞取り込み及び低いインビボ安定性の様な多大な難問に直面している。ＭＵＣ－１ムチンを標的化する為の膜透過ペプチドＧＯ－２０３（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ）（配列番号２）を開発したが、臨床効力は特記事項無しであった。ＭＵＣ－１ペプチドとのｎＭＯＦコンジュゲート化に依って、Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ－ＴＦＡはＭＵＣ－１をインビトロでより効率的に送達する能力が有るのみならず、ＭＵＣ－１ペプチドも又ＲＴ－ＲＤＴと相乗作用してＭＣ３８を持つＣ５７ＢＬ／６皮下モデルに於いてより良好な抗癌効力を果たし得るという事が見出された。
ＭＵＣ－１／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔを、１ｍＭのＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ及び２ｍＭのＭＵＣ－１ペプチドを水溶液中で混合する事に依って調製した。懸濁液をトータルで１５分に渡って５分毎にボルテックスして、ＭＵＣ－１／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔを提供した。ＴＥＭイメージング及びＰＸＲＤ研究は、形態学及び結晶化度が調節剤交換後に維持されるという事を示した。
細胞取り込み：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をカバースリップを有する６ウェルプレートに２×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、一晩培養した。１０μＭのＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ及び２０μＭのＦＩＴＣ－ＭＵＣ－１を水中で混合し、ボルテックスし、混合物を１５分に渡って静置した。其れから、４０μＬの混合物を２ｍＬ培地に追加し、対照のウェルには同じ濃度のＦＩＴＣ－ＭＵＣ－１又はＭＵＣ－１／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ（蛍光標識無し）を追加した。４時間後に、細胞を洗浄し、４％ＰＦＡに依って固定し、共焦点レーザー走査顕微鏡に依って観察した。緑のチャンネルは、ＦＩＴＣ－ＭＵＣ－１がＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔに依ってもっと効率的に送達されるという事を示した。図４０を見よ。
細胞傷害性：ＭＣ３８細胞を１５００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。１０００μＭのＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ及び２０００μＭのＭＵＣ－１を水中で混合し、ボルテックスし、混合物を１５分に渡って静置した。其れから、混合物を種々の濃度で各ウェルに追加した。３つのプレートを薬物追加の４時間後に４ＧｙのＸ線の為に取った。ＭＴＳアッセイを３日後に行ない、ＭＵＣ－１／Ｈｆ－ＤＢＰ－ＰｔはＸ線照射に依ってＭＵＣ－１及びＲＴ－ＲＤＴの相乗的な効果を示した。図４１を見よ。
インビボの効力：６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０６のＭＣ３８細胞を皮下接種した。腫瘍が～１００ｍｍ３に達した時に、ＭＵＣ－１／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ（０．４μｍｏｌ／０．２μｍｏｌ）を腫瘍内注射した。８時間後に、マウスを麻酔し、初回の１ＧｙのＸ線を照射した。其れから、マウスに１ＧｙのＸ線を次の連続５日にトータルで６Ｇｙの線量で照射した。腫瘍体積及び体重を毎日測定した。ＭＵＣ－１／Ｈｆ－ＤＢＰ－ＰｔはＲＴ－ＲＤＴ及びＭＵＣ－１の相乗的な治療効果を示した。図４２を見よ。定常的な体重傾向は此のシステムの最小限の毒性及び良好な生体適合性を示した。
例１８
ｎＭＯＦ及びＣｐＧ－ＯＤＮ
異なるｎＭＯＦに依るＣｐＧ吸着：ＣｐＧ－ＯＤＮ２３９５（３μｇ）及び異なるｎＭＯＦ（Ｈｆ－ＤＢＰ、Ｈｆ－ＤＢＰ－ＴＦＡ、又はＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ－ＴＦＡ；０．１μｍｏｌ）を水中で混合して、ＣｐＧ／ｎＭＯＦを別個の１．５ｍＬｅｐチューブに調製した。混合物を１５分に渡って静置し、混合物を１４５００ｒｐｍで１５分に渡って遠心した。上清のＤＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐに依って決定した。其れから、ＣｐＧ担持をｎＭＯＦの各種類について計算した。Ｈｆ－ＴＢＰ及びＨｆ－ＴＢＰ－ＰｔはＣｐＧの～８０％を吸着し得、Ｈｆ－ＤＢＰ－ＴＦＡ、Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ、及びＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ－ＴＦＡはＣｐＧの＞９０％を吸着し得る。図４３を見よ。然し乍ら、ＴＦＡ修飾無しのＨｆ－ＤＢＰは此のケースではＣｐＧを吸着し得ない。
例１９
ｎＭＯＦ及びＳＴＩＮＧアゴニスト
ｃＧＡＭＰ／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔの調製：０．２μｍｏｌのＴＦＡ修飾されたＨｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ及び５μｇの２’，３’－ｃＧＡＭＰを、３０μＬの水懸濁液として混合し、トータルで１５ｍｉｎに渡って５ｍｉｎ毎にボルテックスした。
インビボの効力：６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０６のＭＣ３８細胞を皮下接種した。腫瘍が第７日に～１００ｍｍ３に達した時に、ＰＢＳ、ｃＧＡＭＰ、又はｃＧＡＭＰ／Ｈｆ－ＤＢＰ－Ｐｔ（５μｇ／０．２μｍｏｌ）を腫瘍内注射した。８時間後に、マウスを麻酔し、２ＧｙのＸ線を照射した。マウスに更に２ＧｙのＸ線を連続４日に渡ってトータルで１０ＧｙのＸ線線量で照射した。腫瘍体積及び体重を毎日測定した。図４４に示される通り、ｃＧＡＭＰ／Ｈｆ－ＤＢＰ－ＰｔはＲＴ－ＲＤＴ及びＳＴＩＮＧアゴニストの相乗的な治療効果を示した。定常的な体重傾向は此のシステムの最小限の毒性及び良好な生体適合性を示した。
Ｈｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬの調製：ＭＯＬは単層の厚さを有するＭＯＦのサブクラスである。Ｈｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬを次の通り合成した：５００μＬのＨｆＣｌ４溶液［Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に２．０ｍｇ／ｍＬ］、５００μＬのＨ２ＤＢＢ－Ｉｒ－Ｆ溶液（ＤＭＦ中に４．０ｍｇ／ｍＬ）、２μＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及び５μＬの水を、１ドラムガラスバイアルに追加した。混合物をソニケーションし、８０℃オーブンで１日に渡って加熱した。黄色懸濁液を遠心に依って収集し、ＤＭＦ及びエタノールに依って洗浄した。最終生成物のＨｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬをキャラクタリゼーション及び更なる使用の為にエタノール中に分散した。
Ｈｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬは、Ｈｆ１２二次構造単位（ＳＢＵ）及びＩｒ（ＤＢＢ）［ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ］２ ＋光増感性リガンドを含有する。ＰＸＲＤパターンは結晶質材料としてのＨｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬを証明した。ＴＥＭ及びＡＦＭは、厚さが＜２ｎｍ且つ直径が大体１００～２００ｎｍの超薄型プレートのＨｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬの形態学を明らかにした。
ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬの調製：ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬを調製する為には、Ｈｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬを先ず１００μＬのヌクレアーゼフリー水中に２ｍＭの同等のＨｆ濃度で分散した。其れから、１μｇの２’３’－ｃＧＡＭＰをｎＭＯＬ懸濁液に追加した。混合物を５分毎に３回ボルテックスして、ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬナノコンジュゲートを提供した。Ｈｆの濃度を、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）に依ってアジレント７７００ｘＩＣＰ－ＭＳ（アジレントテクノロジーズ（Agilent Technologies）、サンタクララ、カリフォルニア、米国）を用いて検出し、ＩＣＰ－ＭＳマスハンターバージョンＢ０１．０３（アジレントテクノロジーズ（Agilent Technologies）、サンタクララ、カリフォルニア、米国）を用いて分析した。サンプルを濃ＨＮＯ３（微量金属グレード）中で１％ＨＦ酸溶液に依って２日に渡ってダイジェスチョンし、其れから２％ＨＮＯ３マトリックスの終濃度で希釈した。両方のナノ粒子の結晶化度を、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）に依ってブルカーＤ８ベンチャー回折装置（ブルカー（Bruker）、ビレリカ、マサチューセッツ、米国）でＣｕＫα放射線源（λ＝１．５４１７８Å）を用いて調べた。サイズ及びζ電位をマルバーンナノシリーズゼータサイザー（マルバーン・パナリティカル（Malvern Panalytical）、マルバーン、英国）に依って測定した。形態学を、ＴＥＣＮＡＩスピリットＴＥＭ（ＦＥＩカンパニー（FEI Company）、ヒルズボロ、オレゴン、米国）に依る透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）及びブルカーＶ／マルチモード８装置（ブルカー（Bruker）、ビレリカ、米国）に依る原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）に依って観察した。ＡＦＭ、ＴＥＭイメージング、及びＰＸＲＤ研究は、形態学及び結晶化度がｃＧＡＭＰコンジュゲート化後に維持されるという事を示した。
ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬのｃＧＡＭＰ担持効率及び放出プロファイル：２’３’－ｃＧＡＭＰの濃度を、ＬＣ－ＭＳに依って、アジレント６５４０Ｑ－Ｔｏｆ－ＭＳ－ＭＳで１２９０ＵＨＰＬＣ（５μｍアジレントＣ１８逆相カラム）（アジレントテクノロジーズ（Agilent Technologies）、サンタクララ、カリフォルニア、米国）に依って定量した。２’３’－ｃＧＡＭＰの標準曲線は、凍結乾燥２’３’－ｃＧＡＭＰ粉末をヌクレアーゼフリー水に溶解して１０００ｐｐｍストック溶液を提供する事に依って作成した。勾配希釈を調製し、線形範囲は５０ｐｐｂ及び２０ｐｐｍの間であった。ＬＣ－ＭＳの溶出は：０～５ｍｉｎ、９５％Ｈ２Ｏ、５％ＭｅＯＨとして設定した。流量は２０μＬの注入体積で０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。Ｈｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬ上の２’３’－ｃＧＡＭＰの担持効率を決定する為に、ＧＡＭＰ／ｎＭＯＬを上の通り新しく調製し、上清を１４０００ｇの遠心に依って収集した。上清中の２’３’－ｃＧＡＭＰ濃度をＬＣ－ＭＳに依って定量した。Ｎ＝３。放出プロファイルの為に、ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬを新しく調製し、夫々１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（各時点について３レプリケート）内の同じ体積の１×ＰＢＳ、０．１×ＰＢＳ、及びＦＢＳ（１００μＬ／チューブ）に再分散した。エッペンドルフチューブを３７℃ヒートブロックに移動し、上清（８０μＬ／チューブ）を０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、及び４８ｈに於いて１４０００ｇの遠心に依って収集した。１×ＰＢＳ及び０．１ＰＢＳ群の上清をＬＣ－ＭＳに依って分析した。ＦＢＳ群の上清をチューブ当たり３２０μＬのメタノールと混合し、１分に渡ってソニケーションして白色沈殿を提供し、１４０００ｇで再び遠心し、其れから、上清をＬＣ－ＭＳに依って分析した。図４５Ａに示される通り、ＴＦＡ修飾されたｎＭＯＬは１００％に近い吸着効率を有した。此れは、ｃＧＡＭＰ上のリン酸基及びｎＭＯＬ上のＨｆ１２－ＳＢＵの間のコンジュゲート化を証明している。１×ＰＢＳ中に於ける速い放出がＳＢＵのリン酸交換に依って引き起こされた。然し乍ら、バイオメディカル適用に於ける現実のリン酸濃度を模倣する０．１×ＰＢＳ及びＦＢＳ中では、ｃＧＡＭＰの放出は有意によりゆっくりであった。図４５Ｂを見よ。
等温滴定カロリメトリー：２’３’－ｃＧＡＭＰ及びＨｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬの間の相互作用を、参照及びサンプルセルを備えたＭｉｃｒｏＣａｌ－ｉＴＣ２００システム（マルバーンインストルメンツ（Malvern Instruments）、マルバーン、英国）に依って測定及び分析した（Ｖ＝４０μＬ）。全ての滴定は４０μＬシリンジを２９８．１５Ｋに於いて２５０ｒｐｍの撹拌速度で用いて実施した。７５μＭのＨｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬ水溶液を２３５μＭのｃＧＡＭＰ水溶液に依って滴定した。データ分析はＭｉｃｒｏＣａｌ ｉＴＣ２００ソフトウェア（マルバーンインストルメンツ（Malvern Instruments）、マルバーン、英国）を用いて行ない、全てのデータは独立した単一部位モデルにフィッティングした。程々の結合相互作用（Ｋ＝３．８０×１０３Ｍ－１）は、ｃＧＡＭＰ及びｎＭＯＬの間の動的結合を証明している。図４６を見よ。
インビトロのＳＴＩＮＧ活性化：商標ＴＨＰ１－ＤＵＡＬ（商標）ＫＯ－ＭｙＤ８８細胞で販売されているレポーター細胞（インビボジェン（InvivoGen）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を用いて、インビトロの遊離２’３’－ｃＧＡＭＰ及びｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬのＳＴＩＮＧ活性化を定量した。細胞を９６ウェルプレートに１０５細胞／ｍＬの密度で播種し（Ｎ＝６）、最高で１０μＭの２’３’－ｃＧＡＭＰ及びｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬを追加し、２４時間に渡ってインキュベーションした。インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）経路の刺激を、商標ＱＵＡＮＴＩ－ＬＵＣ（商標）で販売されているアッセイ（インビボジェン（InvivoGen）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に依って、商標ＳＹＮＥＲＧＹ（商標）ＨＴＸで販売されているプレートリーダー（バイオテック（BioTek）、ウィヌースキー、バーモント、米国）上で、ベンダーのプロトコールに従って定量した。図４７に示される通り、ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬはインビトロでＳＴＩＮＧ経路を活性化する為のもっと低いＥＣ５０（＜１／６）を有した。此れは、有望なナノＳＴＩＮＧアゴニストとしてのｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬのポテンシャルを示している。
腫瘍に於けるｃＧＡＭＰ保持のインビボイメージング：皮下ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスモデルを、上の例１７に記載された通り樹立した。腫瘍が～１５０ｍｍ３に達した時に、２０μＬのｃＧＡＭＰ－Ｃｙ５／ｎＭＯＬ（２μｇ／０．５μｍｏｌのＨｆ）及びｃＧＡＭＰ－Ｃｙ５（２μｇ）をマウスに腫瘍内注射した。マウスを２％（ｖ／ｖ）イソフルラン／酸素に依って麻酔し、ＩＶＩＳスペクトラム２００（ゼノジェン（Xenogen）、ホプキントン、マサチューセッツ、米国；ｅｘ．６４０ｎｍ／ｅｍ．６８０ｎｍ）に依って、注射後の１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、及び９６時間にイメージングした。画像は、商標ＬＩＶＩＮＧ－ＩＭＡＧＥ（登録商標）４．７．２で販売されているソフトウェア（パーキンエルマー（PerkinElmer）、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）に依って処理及び分析した。８時間後に、ｃＧＡＭＰ－Ｃｙ５／ｎＭＯＬは遊離ｃＧＡＭＰよりも少なくとも１桁高い蛍光シグナル保持を有した。図４８を見よ。遊離ｃＧＡＭＰはインビボで迅速に拡散し消失したが、ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬはより長いＳＴＩＮＧ活性化の為にｃＧＡＭＰをゆっくり放出した。
インビボ抗腫瘍効力：ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬの抗腫瘍効力を、皮下ＣＴ２６腫瘍を持つＢＡＬＢ／ｃ及びＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスモデルについて評価した。単一腫瘍モデルでは、２×１０６のＣＴ２６細胞又はＭＣ３８細胞を夫々ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注射した（両方Ｎ＝６）。腫瘍が第７日に７５～１００ｍｍ３に達した時に、２０μＬのＨｆ１２－Ｉｒ－ｎＭＯＬ（０．５μｍｏｌのＨｆ）、ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬ（２μｇ／０．５μｍｏｌのＨｆ）、ｃＧＡＭＰ（２μｇ）、又はＰＢＳをマウスに腫瘍内注射した。８時間後に、マウスを２．５％（ｖ／ｖ）イソフルラン／酸素に依って麻酔し、腫瘍に２ＧｙのＸ線／フラクションを連続６日に渡って照射した。マウスの腫瘍体積、体重、及び健康状態を緊密にモニタリングした。図４９Ａ及び４９Ｂに示される通り、ＲＴ－ＲＤＴ及びＳＴＩＮＧ活性化の間の相乗的な効果は、ｃＧＡＭＰの典型的なドーズ（１０μｇ）の１／５に於いて局所的な腫瘍コントロールを達成した。
アブスコパル効果：両側ＭＣ３８腫瘍モデルでは、２×１０６のＭＣ３８細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注射し、１×１０６のＭＣ３８細胞を左脇腹に注射した（Ｎ＝６）。原発腫瘍（右）が第７日に１００～１２５ｍｍ３に達した時に、原発腫瘍に２０μＬのｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬ（２μｇ／０．５μｍｏｌのＨｆ）又はＰＢＳを注射した。マウスは、単一腫瘍モデルについての上と同じＸ線処置の手続きを受けた。αＰＤ－Ｌ１又はｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬ＋αＰＤ－Ｌ１群のマウスに、第１のＸ線処置後の第３日及び第６日に２×７５μｇ／マウスのαＰＤ－Ｌ１抗体を腹腔内注射した。αＰＤ－Ｌ１に依るチェックポイントブロック免疫療法は、局所的な及び遠隔部位両方のより良好な疾患コントロールの為にｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬを増強した。図５０Ａ及び５０Ｂを見よ。ＰＤ－Ｌ１ブロックはＲＴ－ＲＤＴ及びＳＴＩＮＧの間の局所的な相乗作用を全身的な抗癌免疫応答に迄拡げた。ｃＧＡＭＰ／ｎＭＯＬ＋αＰＤ－Ｌ１の治療薬組み合わせは：１）強化された放射線増感に依る癌塊の増殖阻害；２）ＲＴ－ＲＤＴに依る腫瘍抗原暴露；３）ＳＴＩＮＧアゴニストに依るＡＰＣ及びＴ細胞の成熟及び活性化；４）ＣＢＩに依るＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイントブロックを提供した。此れ等の４つのコンパートメントは編成され、２Ｄナノプラットフォームに統合されて、最後に好都合な免疫応答及び治療アウトカムを実現した。
参照
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本開示の主題の種々の詳細は、本開示の主題の範囲から逸脱する事無しに変更され得るという事は理解されるであろう。更に其の上、上述の記載は例解の目的の為のみであり、限定の目的の為ではない。

Claims (48)

  1. 目当ての１つ以上の治療薬剤に配位又は静電結合する様に修飾された表面を有する金属有機構造体（ＭＯＦ）であって、
    前記のＭＯＦが：
    （ａ）複数の金属オキソクラスター二次構造単位（ＳＢＵ）であって、前記の金属オキソクラスターＳＢＵの夫々は１つ以上の第１の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記の１つ以上のアニオンの夫々は１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上に配位する、金属オキソクラスターＳＢＵと；
    （ｂ）二又は三次元のマトリックスを形成する様に複数のＳＢＵを一緒に連結する複数の有機架橋リガンドと、
    を含み；
    （ｉ）ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵが、夫々が、弱配位性アニオンをＳＢＵキャッピング基アニオンとして含むか、或いは（ｉｉ）複数の有機架橋リガンドが、電子求引性基若しくはリガンド、正電荷、又は其れ等の組み合わせを含む有機架橋リガンドを含み、任意に、複数の有機架橋リガンドが、第２の金属イオンに配位結合した窒素ドナー基を含むリガンドを含み、前記の第２の金属イオンが、更に、１つ以上の電子求引性基を含む少なくとも１つの第２の金属リガンドに配位し；前記のＭＯＦの表面が、目当ての１つ以上の治療薬剤に配位又は静電結合する増強された能力を有する、
    目当ての１つ以上の治療薬剤に配位又は静電結合する様に修飾された表面を有する金属有機構造体（ＭＯＦ）。
  2. 前記の１つ以上の第１の金属イオンが、イオン化放射線、任意にＸ線を吸収する金属の少なくとも１つのイオンを含み、並びに／又は前記の金属が、Ｈｆ、ランタニド金属、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉから成る群から選択され；更に、任意に、第１の金属イオンがＨｆイオンである、請求項1に記載のＭＯＦ。
  3. ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵが、夫々が、弱配位性アニオンをキャッピング基として含み、任意に、前記の弱配位性アニオンが、トリフルオロ酢酸及びトリフラートから成る群から選択される、請求項１又は２に記載のＭＯＦ。
  4. 複数の有機架橋リガンドが、少なくとも２つのカルボン酸基に依って置換されたポルフィリンを含み、任意に、複数の有機架橋リガンドが５，１５－ジ（ｐ－ベンゾアート）ポルフィリン（ＤＢＰ）を含む、請求項３に記載のＭＯＦ。
  5. ＭＯＦが、更に、二又は三次元のネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された低分子治療薬剤を含み、任意に、前記の低分子治療薬剤が化学療法薬剤、低分子阻害剤、及び／又は低分子免疫調節薬である、請求項３又は４に記載のＭＯＦ。
  6. ＭＯＦが、二又は三次元のネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された化学療法薬剤を含み、任意に、前記の化学療法薬剤がシスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ＳＮ－３５、及びエトポシドから選択される、請求項５に記載のＭＯＦ。
  7. ＭＯＦが、二又は三次元のネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された低分子阻害剤を含み、任意に、前記の低分子阻害剤がＰＬＫ１阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｂｃｌ－２阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＥＮＰＰ１阻害剤、及びＩＤＯ阻害剤から成る群から選択される、請求項５に記載のＭＯＦ。
  8. ＭＯＦが、二又は三次元のネットワークの細孔及び／又は空洞部に封鎖された低分子免疫調節薬を含む、請求項５に記載のＭＯＦ。
  9. 低分子免疫調節薬がイミキモド（ＩＭＤ）である、請求項８に記載のＭＯＦ。
  10. 複数の有機架橋リガンドが、窒素ドナー基を含む有機架橋リガンドを含み、前記の窒素ドナー基が第２の金属イオンに配位し、前記の第２の金属イオンが、更に、１つ以上の電子求引性基を含む少なくとも１つの第２の金属リガンドに配位し、任意に、１つ以上の電子求引性基がハロ及びペルハロアルキル基から選択される、請求項１又は２に記載のＭＯＦ。
  11. 窒素ドナー基を含む有機架橋リガンドが４，４’－ジ（ｐ－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン（ＤＢＢ）である、請求項１０に記載のＭＯＦ。
  12. 第２の金属イオンがイリジウム（Ｉｒ）イオン若しくはルテニウム（Ｒｕ）イオンであり、及び／又は前記の第２の金属イオンが２つの第２の金属リガンドに配位し、第２の金属リガンドの１つ又は両方が１つ以上の電子求引性基を含む、請求項１０又は１１に記載のＭＯＦ。
  13. 第２の金属リガンドの１つ又は両方が２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオメチル）ピリジン（ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ）である、請求項１２に記載のＭＯＦ。
  14. ＭＯＦが少なくとも約５ミリボルト（ｍＶ）のゼータ（ζ）電位値を有し、任意に、ＭＯＦが少なくとも約３０ｍＶのζ電位値を有する、請求項１０～１３の何れか１項に記載のＭＯＦ。
  15. 前記のＭＯＦが三次元のネットワークを含み、前記の三次元のネットワークがナノ粒子の形態で提供される、請求項１～１４の何れか１項に記載のＭＯＦ。
  16. 目当ての１つ以上の治療薬剤の送達の為の金属有機構造体（ＭＯＦ）であって、前記のＭＯＦが：
    （ａ）複数の金属オキソクラスター二次構造単位（ＳＢＵ）であって、前記の金属オキソクラスターＳＢＵの夫々は１つ以上の第１の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記のアニオンの夫々は１つ以上の第１の金属イオンの１つ以上に配位する、金属オキソクラスターＳＢＵと；
    （ｂ）二又は三次元のマトリックスを形成する様に複数のＳＢＵを一緒に連結する複数の有機架橋リガンドと；
    （ｃ）配位結合又は静電相互作用に依って前記のＭＯＦの表面に結合された目当ての１つ以上の治療薬剤であって、任意に、目当ての１つ以上の治療薬剤は、ＭＯＦの表面の複数のＳＢＵの１つ以上の金属イオンに配位結合される、治療薬剤と、
    を含む、
    目当ての１つ以上の治療薬剤の送達の為の金属有機構造体（ＭＯＦ）。
  17. 前記の第１の金属イオンが、イオン化放射線、任意にＸ線を吸収する金属のイオンであり、並びに／又は第１の金属イオンが、Ｈｆ、ランタニド金属、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉから選択される金属のイオンであり；更に、任意に、第１の金属イオンがＨｆイオンである、請求項１６に記載のＭＯＦ。
  18. 前記の目当ての１つ以上の治療薬剤の夫々が、核酸、リン酸若しくはカルボン酸基を含む低分子、及び／又は表面のアクセス可能なリン酸若しくはカルボン酸基を含む高分子から成る群から選択される、請求項１６又は１７に記載のＭＯＦ。
  19. 目当ての１つ以上の治療薬剤が、表面のアクセス可能なリン酸又はカルボン酸基を含む高分子を含み、前記の高分子が蛋白質であり、任意に、前記の蛋白質が抗体である、請求項１８に記載のＭＯＦ。
  20. 前記の蛋白質が、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から成る群から選択される、請求項１９に記載のＭＯＦ。
  21. 目当ての１つ以上の治療薬剤が核酸を含み、前記の核酸が、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮ、及び環状ジヌクレオチドから成る群から選択され、任意に、核酸が環状ジヌクレオチドであり、前記の環状ジヌクレオチドがＳＴＩＮＧアゴニストであり、更に、任意に、前記のＳＴＩＮＧアゴニストがｃ－ジ－ＡＭＰ又はｃＧＡＭＰである、請求項１８に記載のＭＯＦ。
  22. 前記のＭＯＦが、二又は三次元のネットワークの細孔又は空洞部に封鎖された１つ以上の追加の治療薬剤を含み；任意に、前記のＭＯＦが約１ｗｔ％から約５０ｗｔ％の前記の１つ以上の追加の治療薬剤を含む、請求項１６～２１の何れか１項に記載のＭＯＦ。
  23. 複数のＳＢＵがＨｆオキソクラスターを含み、前記の複数の有機架橋リガンドがＤＢＰを含み、目当ての１つ以上の治療薬剤が、表面のアクセス可能なＳＢＵのＨｆイオンに対する配位結合に依って前記のＭＯＦの表面に結合される、請求項１６に記載のＭＯＦ。
  24. 目当ての１つ以上の治療薬剤が１つ以上の抗体を含む、請求項２３に記載のＭＯＦ。
  25. １つ以上の治療薬剤が抗ＣＤ４７抗体を含む、請求項２４に記載のＭＯＦ。
  26. ＭＯＦが、更に、二又は三次元のネットワークの細孔又は空洞部に封鎖されたＩＭＤを含む、請求項２５に記載のＭＯＦ。
  27. 前記のＭＯＦが三次元ネットワークであり、ナノ粒子として提供される、請求項２６に記載のＭＯＦ。
  28. 前記のＭＯＦが約１ｗｔ％から約５０ｗｔ％のＩＭＤ又は抗ＣＤ４７抗体を含み；任意に、ＭＯＦが約９重量（ｗｔ）％のＩＭＤ及び約７．５ｗｔ％の抗ＣＤ４７抗体を含む、請求項２７に記載のＭＯＦ。
  29. 複数のＳＢＵがＨｆオキソクラスターを含み、前記の複数の有機架橋リガンドが、Ｉｒイオンに配位したＤＢＢを含み、前記のＩｒイオンが更に２つの（ｄＦ（ＣＦ３）ｐｐｙ）に配位し；目当ての１つ以上の治療薬剤が、静電相互作用に依って前記のＭＯＦの表面に結合される、請求項１６に記載のＭＯＦ。
  30. 目当ての１つ以上の治療薬剤が核酸を含む、請求項２９に記載のＭＯＦ。
  31. 核酸がＳＴＩＮＧアゴニスト又はＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であり、任意に、核酸がＣｐＧ－ＯＤＮである、請求項３０に記載のＭＯＦ。
  32. ＭＯＦが約１ｗｔ％から約５０ｗｔ％の目当ての１つ以上の治療薬剤を含み、任意に、前記の目当ての１つ以上の治療薬剤が抗体を含む、請求項１６～３１の何れか１項に記載のＭＯＦ。
  33. 其れを必要とする対象の癌を処置する方法であって、
    方法が：
    （ａ）請求項１６～３２の何れか１項に記載のＭＯＦを対象に投与する事と；
    （ｂ）対象の少なくとも或る部分をイオン化放射線エネルギー、任意にＸ線に暴露する事と、
    を含む、
    其れを必要とする対象の癌を処置する方法。
  34. 方法が、更に、追加の治療薬剤又は処置、任意に、免疫療法薬剤並びに／又は外科手術、化学療法、毒素治療、凍結療法、及び遺伝子治療から成る群から選択される癌処置を、前記の対象に投与する事を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 追加の治療薬剤が免疫療法薬剤であり、任意に、前記の免疫療法薬剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項３４に記載の方法。
  36. 免疫療法薬剤が抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項３５に記載の方法。
  37. 癌が大腸癌、メラノーマ、頭頸部癌、脳の癌、乳癌、肝臓癌、子宮頸癌、肺癌、又は膵臓癌である、請求項３３～３６の何れか１項に記載の方法。
  38. ＭＯＦの投与が、目当ての１つ以上の治療薬剤の１つ以上について長期放出プロファイルを提供し、任意に、放出速度がチューニング可能であり、及び／又はＭＯＦが、数時間若しくは数日の期間に渡って目当ての１つ以上の治療薬剤の持続放出を提供する、請求項３３～３７の何れか１項に記載の方法。
  39. ＭＯＦの投与が、目当ての１つ以上の治療薬剤の治療上有効なドーズを低める、請求項３３～３８の何れか１項に記載の方法。
  40. 方法が、（ｉ）目当ての治療薬剤のカルボン酸若しくはリン酸置換基に依って置き換えられ得る弱配位したアニオンに配位結合した１つ以上の表面のアクセス可能な配位部位を提供する事又は（ｉｉ）１つ以上の電子求引性の架橋リガンド、正電荷を含む１つ以上の架橋リガンド、若しくは其れ等の組み合わせを含むＭＯＦを提供する事に依って、ＭＯＦの表面を修飾する事を含む、金属有機構造体（ＭＯＦ）に対する目当ての１つ以上の治療薬剤の表面相互作用及び／又は結合を増強する方法。
  41. ＭＯＦの表面を修飾する事が：
    （ｉａ）有機架橋リガンドに依って一緒に連結された金属オキソクラスターＳＢＵを含む親のＭＯＦを提供し、前記のＳＢＵの夫々が１つ以上の金属イオン及び１つ以上のアニオンを含み、前記のＭＯＦが、複数の表面のアクセス可能な金属オキソクラスターＳＢＵを含み、此処で、前記の表面のアクセス可能な金属オキソクラスターＳＢＵの夫々の１つ以上のアニオンが、強配位性アニオンをＳＢＵキャッピング基として含み；任意に、前記の強配位性アニオンが酢酸又は蟻酸を含む事と；
    （ｉｂ）前記の強配位性アニオンを除去し、除去する事が、トリフルオロ酢酸トリメチルシリル、トリメチルシリルトリフラート、及び約３未満のｐＫａを有する鉱酸から選択される試薬と前記の親のＭＯＦを接触させる事を含み；其れに依って、前記の強配位性アニオンを弱配位性アニオンに依って置き換え、任意に、前記の強配位性アニオンが酢酸又は蟻酸アニオンから選択され、任意に、前記の弱配位性アニオンがトリフルオロ酢酸又はトリフラートアニオンから選択される事と、
    を含む、
    請求項４０に記載の方法。
  42. 電子求引性基を含む１つ以上の架橋リガンド、正電荷を含む１つ以上の架橋リガンド、又は其れ等の組み合わせを含むＭＯＦを提供する事が、有機架橋リガンドに依って一緒に連結された金属オキソクラスターＳＢＵを含むＭＯＦを提供する事を含み、前記のＳＢＵの夫々が、１つ以上の第１の金属イオンと前記の１つ以上の第１の金属イオンに配位した１つ以上のアニオンとを含み、前記の有機架橋リガンドが、配位したＳＢＵに結びついていない第２の金属イオンを含む少なくとも１つの有機架橋リガンドを含み、前記の第２の金属イオンが、更に、１つ以上の電子求引性のリガンドに配位し、任意に、前記の電子求引性のリガンドが、ハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたビピリジンリガンドである、請求項４０に記載の方法。
  43. ＭＯＦを提供する事が、ジ（４－ベンゾアート）－２，２’－ビピリジン（ＤＢＢ）架橋リガンドを含むＭＯＦを提供する事を含み、前記のＤＢＢ架橋リガンドが、２つの異なる金属オキソクラスターＳＢＵの第１の金属イオンに及び第２の金属イオンに配位し、前記の第２の金属イオンが、更に、２つのハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたピリジンリガンドに配位し、任意に、前記の２つのハロ及び／又はペルハロアルキル置換されたピリジンリガンドが、夫々が２－（２，４－ジフルオロフェニル）－５－（トリフルオロメチル）－ピリジンである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記の第２の金属イオンがイリジウム（Ｉｒ）又はルテニウム（Ｒｕ）である、請求項４２又は４３に記載の方法。
  45. ＭＯＦが、イオン化放射線、任意にｘ線を吸収する金属イオンを含む１つ以上のＳＢＵを含み、及び／又は金属イオンが、Ｈｆ、ランタニド金属、Ｂａ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｐｂ、及びＢｉから成る群から選択される元素のイオンであり；更に、任意に、前記の金属イオンがＨｆイオンである、請求項４０～４４の何れか１項に記載の方法。
  46. 前記のＭＯＦが、表面修飾無しのＭＯＦと比較して目当ての１つ以上の治療薬剤について増強された相互作用及び／又は結合能力を有し、前記の目当ての１つ以上の治療薬剤が、表面のアクセス可能なリン酸又はカルボン酸基を含む核酸、低分子、及び／又は高分子から選択される、請求項４０～４５の何れか１項に記載の方法。
  47. 前記の蛋白質が、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から成る群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記の核酸が、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮ、及び環状ジヌクレオチドから成る群から選択され、任意に、前記の環状ジヌクレオチドがＳＴＩＮＧアゴニストであり、更に、任意に、前記のＳＴＩＮＧアゴニストがｃ－ジ－ＡＭＰ又はｃＧＡＭＰである、請求項４６に記載の方法。
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