JP2023526428A - 活性化可能なｉｌ－１２ポリペプチド及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書において、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体及び／またはＩＬ２３ポリペプチド複合体を提供する。本明細書ではまた、その医薬組成物、ならびにそのようなポリペプチド複合体を作製するための核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞も提供する。また、疾患、病態及び障害の治療における、ポリペプチド複合体の使用方法も開示する。
Description
１．配列表
本出願は、２０２０年５月１９日出願の米国仮特許出願第６３／０２７，２７６号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年５月１９日出願の米国仮特許出願第６３／０２７，２７６号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０２１年５月１８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、７６１１４６＿０２３２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズは１，２９４，４０３バイトである。
インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、共有結合した２つのグリコシル化サブユニット（ｐ３５及びｐ４０）からなるヘテロ二量体の７０ｋＤａサイトカインである（Ｌｉｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＩＬ－１２は強力な免疫アンタゴニストであり、腫瘍学の有望な治療薬と考えられてきた。しかしながら、ＩＬ－１２は非常に強力で血中半減期が短いため、治療濃度域が狭いことが示されている。結果として、ＩＬ－１２の治療的投与により、望ましくない全身性の作用と毒性が生じる。これは、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）作用が意図される部位（例えば、腫瘍微小環境）において、所望のサイトカインレベルを達成するために大量のサイトカインを投与する必要性があるため、悪化する。残念なことに、サイトカインの生物学、及びそれらの活性を効果的に標的とし、制御できないために、サイトカインでは、腫瘍の治療において期待される臨床的利点は達成されなかった。
腫瘍学におけるＩＬ－１２の臨床使用を制限している毒性と短い半減期の問題を克服するために、誘導性ＩＬ－１２タンパク質構築物が、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２３２０号及び第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２３２２号に記載されている。前述の誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド構築物は、ＩＬ－１２、遮断エレメント、及び半減期延長エレメントを含む単一のポリペプチドを含む。
本発明の発明者らは、驚くべきことに、２つ以上のポリペプチドを含むＩＬ－１２ポリペプチド複合体が、凝集の減少及び発現の向上などの特定の利点を有し、より高い収量をもたらすことを見出した。
本開示は、減弱化されたＩＬ－１２を含み、天然のＩＬ－１２と比較して長い半減期を有する誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に関する。所望により、ＩＬ－１２はムテインであり得る。ＩＬ－１２ムテインは、アグリコシル化または部分的にアグリコシル化されていてもよい。本明細書に開示されるポリペプチド複合体は、２つ以上のポリペプチド鎖を含み、複合体は、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５及びｐ４０、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、ならびにプロテアーゼ切断性リンカーを含む。
誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、２つの異なるポリペプチドを含み得る。第１のポリペプチドは、ＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択でＩＬ－１２遮断エレメントを含み得る。ＩＬ－１２遮断エレメントは、存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結される。第２のポリペプチド鎖は、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択でＩＬ－１２遮断エレメントを含み得る。存在する場合、ＩＬ－１２遮断エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結され得るか、または任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結され得る。第１及び第２のポリペプチドの一方のみがＩＬ－１２遮断エレメントを含む。第１のポリペプチドのＩＬ－１２サブユニットがｐ３５の場合、第２のポリペプチドのＩＬ－１２サブユニットはｐ４０であり、第１のポリペプチドのＩＬ－１２サブユニットがｐ４０の場合、第２のポリペプチドのＩＬ－１２サブユニットはｐ３５である。この複合体の好ましい遮断エレメントは、ＩＬ－１２またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体である。この複合体の切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、３つの異なるポリペプチドを含み得る。一般的には、一方のポリペプチド鎖はｐ３５またはｐ４０ ＩＬ－１２サブユニットのいずれかを含むが両方は含まず、第２のポリペプチドは他方のＩＬ－１２サブユニットを含み、第３のポリペプチドは遮断エレメントの少なくとも一部（構成要素）を含む。第１のポリペプチドは、ＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含み得る。存在する場合、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結される。
第２のポリペプチドは、ＩＬ－１２サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分または抗体重鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含み得る。半減期延長エレメントが存在する場合、それはプロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結され、抗体の重鎖または軽鎖は、ａ）第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結されるか、またはｂ）任意選択で切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結される。
第３のポリペプチドは、第２のポリペプチドの軽鎖に相補的である抗体重鎖の抗原結合部分、または第２のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒にＩＬ－１２結合部位を形成する抗体軽鎖を含み得る。第１のポリペプチドのＩＬ－１２サブユニットがｐ３５の場合、第２のポリペプチドのＩＬ－１２サブユニットはｐ４０であり、第１のポリペプチドのＩＬ－１２サブユニットがｐ４０の場合、第２のポリペプチドのＩＬ－１２サブユニットはｐ３５である。この複合体において、ＩＬ－１２遮断エレメントは、好ましくは抗体の抗原結合フラグメントである。抗原結合フラグメントは、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を別個の構成要素として含む。この誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体中のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
誘導性ポリペプチド複合体は、ｐ３５及びｐ４０が同じポリペプチド鎖上に位置する２つの異なるポリペプチドを含み得る。第１のポリペプチド鎖は、ｐ３５、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。ｐ３５及びｐ４０は作動可能に連結され得、半減期延長エレメントは第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分はプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結される。第２のポリペプチドは、第２のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－１２結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む。この複合体のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
別の形態では、第１のポリペプチド鎖は、ｐ３５、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。ｐ３５及びｐ４０は作動可能に連結され得、半減期延長エレメントは第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分はプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結され得、抗体重鎖の抗原結合部分は、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結され得る。第２のポリペプチドは、第２のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－１２結合部位を形成する抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む。この複合体のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
一例では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、遮断エレメントを含まない第１のポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、式：［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｂ］－［Ｌ３］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ３］－［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］または［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｂ］を含み、式中、ＡはＩＬ－１２サブユニットであり；Ｌ１は第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；Ｌ２は第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；Ｌ３は任意選択で切断性リンカーであり；Ｂは半減期延長エレメントであり；Ｄは遮断エレメントである。
別の例では、第１のポリペプチドは、式：［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］を含み；第２のポリペプチドは、式：［Ａ’］－［Ｌ２］－［Ｂ］または［Ｂ］－［Ｌ２］－［Ａ’］を含み、式中、Ａは、ｐ３５またはｐ４０のいずれかであり、Ａがｐ３５の場合、Ａ’はｐ４０であり、Ａがｐ４０の場合、Ａ’はｐ３５であり；Ａ’はｐ３５またはｐ４０のいずれかであり；Ｌ１は第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；Ｌ２は第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；Ｂは半減期延長エレメントであり；Ｄは遮断エレメントである。
実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、配列番号９５～１１０、配列番号１１９～１２６、及び配列番号１３５～１４３からなる群、または配列番号９５～１１０、配列番号１１９～１２６、及び配列番号１３５～１４３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第１のポリペプチドを含む。好ましいＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、配列番号１０４または配列番号１３６を含む第１のポリペプチドを含む。好ましいＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む。別の好ましいポリペプチド複合体は、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む。
上記のように、所望により、ＩＬ－１２はムテインであり得る。ＩＬ－１２ムテインは、ＩＬ－１２活性、例えば、固有のＩＬ－１２受容体アゴニスト活性を保持している。ＩＬ－１２サブユニット、ｐ３５及び／またはｐ４０は、ムテインであり得る。好ましくは、ＩＬ－１２ムテインは、改変されたグリコシル化パターンを有する。例えば、ＩＬ－１２ムテインは、部分的にアグリコシル化または完全にアグリコシル化され得る。
ｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットは、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換を含み得る。例えば、ｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。通常は、ｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットは、約１～約７個のアミノ酸置換を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。一般的な修飾は、ｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットのグリコシル化パターンを改変し、それによりｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットを部分的または完全にアグリコシル化する。好ましくは、アミノ酸改変は、アスパラギンアミノ酸の置換を含む。例えば、アスパラギンからグルタミンである。特定の例では、配列番号４３４のＩＬ－１２ ｐ３５のアミノ酸位置１６、７５、８５、１３３、１５１、１５８、２０１、２０６、２２１、２５０、２６７、２８０、２８２、３２６、４００、４０４、４２５、５５５、５７２、５７５、５８２、または６０２のアスパラギンを変異させることができる。特定の例では、配列番号１８のＩＬ－１２ ｐ４０のアミノ酸位置１０３、１１４、１６３、２１９、２２７、または２８２のアスパラギンを変異させることができる。
例えば、部分的または完全にアグリコシル化されたＩＬ－１２ポリペプチドは、配列番号１０４、４３４もしくは４４２～４４５からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号１０４、４３４もしくは４４２～４４５に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本開示はまた、単鎖ＩＬ－１２誘導性ポリペプチドにも関する。単鎖ＩＬ－１２ポリペプチドは、好ましくは、配列番号７、９、１０、１８、２４～９４、配列番号１１０～１１８、及び配列番号１２７～１３４からなる群から選択されるアミノ酸を含むか、または配列番号７、９、１０、１８、２４～９４、配列番号１１０～１１８、及び配列番号１２７～１３４に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、減弱化されたＩＬ－２３を含み、天然のＩＬ－２３と比較して長い半減期を有する誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に関する。所望により、ＩＬ－２３はムテインであり得る。ＩＬ－２３ムテインは、アグリコシル化または部分的にアグリコシル化されていてもよい。本明細書に開示されるポリペプチド複合体は、１つ以上のポリペプチド鎖を含み、複合体は、ＩＬ－２３サブユニットｐ１９及びｐ４０、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、ならびにプロテアーゼ切断性リンカーを含む。
誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、２つの異なるポリペプチドを含み得る。第１のポリペプチドは、ＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択でＩＬ－２３遮断エレメントを含み得る。ＩＬ－２３遮断エレメントは、存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結される。第２のポリペプチド鎖は、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択でＩＬ－２３遮断エレメントを含み得る。存在する場合、ＩＬ－２３遮断エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結され得るか、または任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結され得る。第１及び第２のポリペプチドの一方のみがＩＬ－２３遮断エレメントを含む。第１のポリペプチドのＩＬ－２３サブユニットがｐ１９の場合、第２のポリペプチドのＩＬ－２３サブユニットはｐ４０であり、第１のポリペプチドのＩＬ－２３サブユニットがｐ４０の場合、第２のポリペプチドのＩＬ－２３サブユニットはｐ４０である。この複合体の好ましい遮断エレメントは、ＩＬ－２３またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体である。この複合体の切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、３つの異なるポリペプチドを含み得る。一般的には、一方のポリペプチド鎖はｐ１９またはｐ４０ ＩＬ－２３サブユニットのいずれかを含むが両方は含まず、第２のポリペプチドは他方のＩＬ－２３サブユニットを含み、第３のポリペプチドは遮断エレメントの少なくとも一部（構成要素）を含む。第１のポリペプチドは、ＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含み得る。存在する場合、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結される。
第２のポリペプチドは、ＩＬ－２３サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分または抗体重鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含み得る。半減期延長エレメントが存在する場合、それはプロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結され、抗体の重鎖または軽鎖は、ａ）第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結されるか、またはｂ）任意選択で切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結される。
第３のポリペプチドは、第２のポリペプチドの軽鎖に相補的である抗体重鎖の抗原結合部分、または第２のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒にＩＬ－２３結合部位を形成する抗体軽鎖を含み得る。第１のポリペプチドのＩＬ－２３サブユニットがｐ１９の場合、第２のポリペプチドのＩＬ－２３サブユニットはｐ４０であり、第１のポリペプチドのＩＬ－２３サブユニットがｐ４０の場合、第２のポリペプチドのＩＬ－２３サブユニットはｐ１９である。この複合体において、ＩＬ－２３遮断エレメントは、好ましくは抗体の抗原結合フラグメントである。抗原結合フラグメントは、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を別個の構成要素として含む。この誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体中のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
誘導性ポリペプチド複合体は、ｐ１９及びｐ４０が同じポリペプチド鎖上に位置する２つの異なるポリペプチドを含み得る。第１のポリペプチド鎖は、ｐ１９、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。ｐ１９及びｐ４０は作動可能に連結され得、半減期延長エレメントは第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分はプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結される。第２のポリペプチドは、第２のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－２３結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む。この複合体のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
別の形式では、第１のポリペプチド鎖は、ｐ１９、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。Ｐ１９とｐ４０は作動可能に連結され得、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結され得るか、または抗体重鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結され得、抗体重鎖の抗原結合部分は、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結され得る。第２のポリペプチドは、第２のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－２３結合部位を形成する抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む。この複合体のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
一例では、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、遮断エレメントを含まない第１のポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、式：［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｂ］－［Ｌ３］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ３］－［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］または［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｂ］を含み、式中、ＡはＩＬ－２３サブユニットであり；Ｌ１は第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；Ｌ２は第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；Ｌ３は任意選択で切断性リンカーであり；Ｂは半減期延長エレメントであり；Ｄは遮断エレメントである。
別の例では、第１のポリペプチドは、式：［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］を含み；第２のポリペプチドは、式：［Ａ’］－［Ｌ２］－［Ｂ］または［Ｂ］－［Ｌ２］－［Ａ’］を含み、式中、Ａは、ｐ１９またはｐ４０のいずれかであり、Ａがｐ１９の場合、Ａ’はｐ４０であり、Ａがｐ４０の場合、Ａ’はｐ１９であり；Ａ’はｐ１９またはｐ４０のいずれかであり；Ｌ１は第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；Ｌ２は第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；Ｂは半減期延長エレメントであり；Ｄは遮断エレメントである。
実施形態では、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、配列番号４２３～４２８からなる群、または配列番号４２３～４２８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第１のポリペプチドを含む。実施形態では、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、配列番号１８または４３３からなる群から選択される第２のポリペプチドを含む。
上記のように、所望により、ＩＬ－２３はムテインであり得る。ＩＬ－２３ムテインは、ＩＬ－２３活性、例えば、固有のＩＬ－２３受容体アゴニスト活性を保持している。ＩＬ－２３サブユニット、ｐ１９及び／またはｐ４０はムテインであり得る。好ましくは、ＩＬ－２３ムテインは、改変されたグリコシル化パターンを有する。例えば、ＩＬ－２３ムテインは、部分的にアグリコシル化または完全にアグリコシル化され得る。
ｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットは、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換を含み得る。例えば、ｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットは、約１、約２、約３、約４、約５またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。通常は、ｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットは、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。一般的な修飾は、ｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットのグリコシル化パターンを改変し、それによりｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットを部分的または完全にアグリコシル化する。好ましくは、アミノ酸改変は、アスパラギンアミノ酸の置換を含む。例えば、アスパラギンからグルタミンである。
本開示はまた、単鎖ＩＬ－２３誘導性ポリペプチドにも関する。単鎖ＩＬ－２３ポリペプチドは、好ましくは、配列番号４２２もしくは４２９～４３２からなる群から選択されるアミノ酸、または配列番号４２２もしくは配列番号４２９～４３２に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示される半減期延長エレメントは、好ましくは、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンＦｃもしくはそのフラグメントである。
プロテアーゼ切断性リンカーは、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシン、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ、ＦＡＰ、プラスミノーゲン活性化因子、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍プロテアーゼから選択されるプロテアーゼによって切断され得る配列を含む。プロテアーゼは、好ましくは、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、またはカテプシンＧから選択される。あるいは、プロテアーゼは、好ましくは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）から選択され、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４である。
実施形態では、プロテアーゼ切断性リンカーは、プロテアーゼによって独立して切断され得る少なくとも２つの配列を含む。プロテアーゼ切断性リンカーは、合成配列を含み得る。実施形態では、プロテアーゼ切断性リンカーのそれぞれは、２つ以上の異なるプロテアーゼによって切断される。
本明細書に記載の遮断エレメントは、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３に結合する任意のエレメントであり得る。本明細書に開示される遮断エレメントは、ｐ３５、ｐ４０、またはｐ３５ｐ４０ヘテロ二量体複合体に結合することができる。本明細書に開示される遮断エレメントは、ｐ１９、ｐ４０、または１９ｐ４０ヘテロ二量体複合体に結合することができる。遮断エレメントは、好ましくは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはＦａｂである。
本開示は、本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体をコードする核酸にも関する。本開示は、本明細書に記載のＩＬ－２３ポリペプチド複合体をコードする核酸にも関する。本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体をコードする核酸組成物は、環状ベクター、ＤＮＡ、またはＲＮＡを含み得る。本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体をコードする核酸を含む発現ベクターもまた、本明細書に提供する。実施形態では、ベクターを含む宿主細胞を本明細書に提供する。本開示はまた、ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で単離宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の作製方法に関する。
また、本明細書に開示されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体を含む医薬組成物もまた、本明細書に提供する。また、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体を含む医薬組成物もまた、本明細書に提供する。
本開示はまた、治療を必要とする対象に、本明細書に開示される有効量のＩＬ－１２ポリペプチド複合体、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体をコードする核酸、またはその医薬組成物を投与することを含む、腫瘍の治療方法に関する。本開示はまた、治療を必要とする対象に、本明細書に開示される有効量のＩＬ－２３ポリペプチド複合体、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体をコードする核酸、またはその医薬組成物を投与することを含む、腫瘍の治療方法に関する。本明細書に開示される方法に従って、任意の好適な腫瘍、例えば黒色腫または乳癌を治療することができる。
図面は、必ずしも一定の比率ではない。それよりも、一般に、本明細書に記載される発明の原理を説明することに重点が置かれている。本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示と一致するいくつかの実施形態を示し、その記載と共に、本開示の原理を説明するのに役立つ。以下の図面において：
本開示は、減弱化されたＩＬ－１２を含み、天然のＩＬ－１２と比較して長い半減期を有する誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、２つ以上のポリペプチド鎖を含み、複合体は、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５及びｐ４０、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、ならびにプロテアーゼ切断性リンカーを含む。複合体中のＩＬ－１２の活性（例えば、受容体結合活性及び／または受容体アゴニスト活性）は、プロテアーゼ切断性リンカーによって複合体につながれている遮断エレメントの作用によって減弱される。プロテアーゼ切断性リンカー（複数可）が切断されると、遮断エレメントと半減期延長エレメントがＩＬ－１２から分離し、ＩＬ－１２から離れて拡散し、活性型ＩＬ－１２を生成し得る。その活性型ＩＬ－１２は、通常、天然ＩＬ－１２と実質的に同様の生物学的活性及び半減期を有する。図１Ａ～１Ｊは、本明細書に開示されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体の非限定的な例を示す。本開示はさらに、誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体、ならびにポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのようなポリペプチド及び複合体を作製するための組換え発現ベクター及び宿主細胞を含む医薬組成物に関する。また、本明細書では、疾患、病態、及び障害の治療における、開示されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体の使用方法も提供する。
本明細書に開示されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、特に腫瘍学の分野においてＩＬ－１２の臨床使用を著しく制限してきた毒性及び短い半減期の問題を克服する。ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、受容体アゴニスト活性を有するＩＬ－１２ポリペプチドを含む。しかし、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に関して、ＩＬ－１２受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。
本明細書に開示されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、所望により３つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。
本開示はまた、減弱化されたＩＬ－２３を含み、天然のＩＬ－２３と比較して長い半減期を有する誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示されるＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、１つ以上のポリペプチド鎖を含み、複合体は、ＩＬ－２３サブユニットｐ１９及びｐ４０、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、ならびにプロテアーゼ切断性リンカーを含む。複合体中のＩＬ－２３の活性（例えば、受容体結合活性及び／または受容体アゴニスト活性）は、プロテアーゼ切断性リンカーによって複合体につながれている遮断エレメントの作用によって減弱される。プロテアーゼ切断性リンカー（複数可）が切断されると、遮断エレメントと半減期延長エレメントがＩＬ－２３から分離し、ＩＬ－２３から離れて拡散し、活性型ＩＬ－２３を生成し得る。その活性型ＩＬ－２３は、通常、天然ＩＬ－２３と実質的に同様の生物学的活性及び半減期を有する。本開示はさらに、誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体、ならびにポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのようなポリペプチド及び複合体を作製するための組換え発現ベクター及び宿主細胞を含む医薬組成物に関する。また、本明細書では、疾患、病態、及び障害の治療における、開示されるＩＬ－２３ポリペプチド複合体の使用方法も提供する。
本明細書に開示されるＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、特に腫瘍学の分野においてＩＬ－２３の臨床使用を著しく制限してきた毒性及び短い半減期の問題を克服する。ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、受容体アゴニスト活性を有するＩＬ－２３ポリペプチドを含むが、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に関して、ＩＬ－２３受容体アゴニスト活性は減弱され、循環半減期が延長される。
本明細書に開示されるＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖を含み、所望により２つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。
特定の例示的かつ好ましい実施形態を、本明細書に詳細に記載する。明細書内の実施形態は、開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
本明細書で引用されるすべての刊行物及び特許は、その全体が参照により援用される。参照により援用される文献が本明細書と矛盾するか、または不一致である場合、本明細書がそのような文献よりも優先される。本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本開示に対する先行技術であることを認めるものではない。値の範囲が表現される場合、それは範囲内の任意の特定の値を使用する実施形態を含む。さらに、範囲で述べられた値への言及は、その範囲内のすべての値を含む。すべての範囲はそれらの端点を含み、組み合わせ可能である。先行する「約（ａｂｏｕｔ）」の使用によって値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。特定の数値への言及は、文脈が明確に別の指示をしない限り、少なくともその特定の値を含む。「または」の使用は、その使用の特定の文脈が別の方法で指示しない限り、「及び／または」を表す。
本明細書及び特許請求の範囲にわたって、記載の態様に関連する様々な用語が用いられている。そのような用語には、別段に示されない限り、当技術分野における通常の意味が与えられるものとする。具体的に定義される他の用語は、本明細書に示されている定義と一致する形で解釈されるものとする。本明細書に記載または参照される技法及び手順は、当業者には一般に十分に理解されており、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載され、広く利用されている分子クローニング方法論などを使用して一般的に使用されている。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は一般に、特に断りのない限り、製造者が定義するプロトコル及び条件に従って行われる。
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途指示しない限り、複数形の形態を含む。用語「含む」、「など」などは、特に明記しない限り、限定することなく包含を伝えることを意図している。
別段の指示がない限り、一連の要素または範囲に先行する用語「少なくとも」、「未満」、及び「約」、または同様の用語は、一連または範囲内のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、用語「活性化可能」、「活性化する」、「誘導する」、及び「誘導性」とは、減弱化活性形態（例えば、減弱化受容体結合及び／またはアゴニスト活性）及び活性形態を有するポリペプチド複合体を指す。ポリペプチド複合体は、遮断エレメント及び半減期延長エレメントをポリペプチド複合体から解離させるリンカーのプロテアーゼ切断によって活性化される。誘導／活性化されたポリペプチド複合体は、増加した親和性／活性でＩＬ－１２受容体に結合することができる。誘導／活性化されたポリペプチド複合体は、増加した親和性／活性でＩＬ－２３受容体に結合することができる。
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では同じ意味で使用される。本明細書で使用される抗体または免疫グロブリンは、２つの重（Ｈ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指すことを意図している。一般的には、哺乳動物（例えば、ヒト、齧歯類、及びサル）の抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨＩ、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域と共に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に、さらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４という順序で並んでいる。抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、または２つの重鎖分子及び２つの軽鎖分子を含む四量体抗体が含まれ得る。当業者は、他の形態の抗体が存在することを認識するであろう（例えば、ラクダ及びサメの抗体）。
本明細書で使用される用語「減弱化された」とは、ＩＬ－１２受容体またはＩＬ－２３受容体の天然のアゴニストと比較して、受容体アゴニスト活性が低下したＩＬ－１２受容体アゴニストまたはＩＬ－２３受容体アゴニストである。減弱化されたＩＬ－１２アゴニストまたは減弱化されたＩＬ－２３アゴニストは、その受容体の天然のアゴニストと比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍またはそれより低いアゴニスト活性を有し得る。本明細書に記載のＩＬ－１２を含むＩＬ－１２ポリペプチド複合体が「減弱化」または「減弱化活性」を有すると記載されている場合、そのＩＬ－１２ポリペプチド複合体が減弱化ＩＬ－１２受容体アゴニストであることを意味する。本明細書に記載のＩＬ－２３を含むＩＬ－２３ポリペプチド複合体が「減弱化」または「減弱化活性」を有すると記載されている場合、そのＩＬ－２３ポリペプチド複合体が減弱化ＩＬ－２３受容体アゴニストであることを意味する。
用語「がん」とは、細胞集団が制御不能の増殖、不死性、転移能、急速な成長率及び増殖率及び／または特定の形態学的特徴を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す。多くの場合、がんは腫瘍または塊の形態であり得るが、対象内に単独で存在する場合もあれば、白血病細胞またはリンパ腫細胞などの独立した細胞として血流中を循環する場合もある。がんという用語には、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、がん腫、及び他の固形及び非固形腫瘍を含む、すべての種類のがん及び転移が含まれる。がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるがこれらに限定されない。そのようながんのさらに特定の例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌（例えば、三種陰性乳癌）、骨肉腫、黒色腫、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜（例えば、漿液性）癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、ならびに様々な種類の頭頸部癌が挙げられる。三種陰性乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びＨｅｒ２／ｎｅｕの遺伝子の発現が陰性である乳癌を指す。
本明細書で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換とは、一般に、ペプチドの構造を変化させることができるが、ペプチドの生物学的活性は実質的に保持される、認識されたグループ内の１つのアミノ酸残基から別のアミノ酸残基への置換を指す。アミノ酸の保存的置換は、当業者に公知である。アミノ酸の保存的置換には、以下のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が含まれるが、これらに限定されない：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。例えば、当業者は、ロイシンからイソロイシンもしくはバリンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への、スレオニンからセリンへの単独の置換、または構造的に関連性のあるアミノ酸による同様のアミノ酸置換が、結果として得られる分子の生物学的活性に大きな影響を与えないことを合理的に予想する。
本明細書で使用する場合、本明細書に開示するポリペプチド複合体に関する用語「半減期延長エレメント」とは、例えば、そのサイズ（例えば、腎臓濾過カットオフ値を上回るように）、形状、流体力学的半径、電荷を改変するか、または吸収、生体内分布、代謝、及び消失というパラメータを改変することによって、化学要素、好ましくは血中半減期を延長させ、かつｐＫを向上させるポリペプチドを指す。
本明細書で使用する場合、ポリペプチド複合体に関する用語「作動可能に連結された」とは、ポリペプチド複合体の構成要素が意図した様式で機能することを可能にする、構成要素の配向を指す。例えば、ＩＬ－１２サブユニットとＩＬ－１２遮断エレメントを含むポリペプチドは、ＩＬ－１２遮断エレメントがＩＬ－１２ポリペプチドのＩＬ－１２受容体活性化活性を阻害できる場合、ポリペプチド複合体中のプロテアーゼ切断性リンカーによって作動可能に連結されるが、プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、遮断エレメントが、ＩＬ－１２から拡散し得るため、ＩＬ－１２遮断エレメントによるＩＬ－１２ポリペプチドのＩＬ－１２受容体活性化活性の阻害が減少または排除される。
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結される２つ以上のアミノ酸を意味するために広く使用される。タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドはまた、本明細書ではアミノ酸配列を指すために同じ意味で使用される。本明細書では、分子を構成するアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するためにはポリペプチドという用語は使用されないこと、本発明のペプチドは最大で数個からそれ以上のアミノ酸残基を含有することができることを認識されるべきである。
本明細書における用語「対象」とは、任意の動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」とは、投与条件下で所望の薬理学的または生理学的効果を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物（すなわち、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体）の量を指す。例えば、「治療有効量」は、疾患または病態（例えば、腫瘍）の徴候または症状を軽減するのに十分な量であり得る。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療効果が完全または治癒的である必要がないことを理解するであろう。医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに医薬組成物が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に従って変化し得る。当業者は、これら及び他の考慮事項に基づいて、所望の治療効果を達成するために適切な投与量を決定することができる。
Ａ．ＩＬ－１２ポリペプチド複合体
本開示は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、所望により３つのポリペプチド鎖またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示される２つ以上のポリペプチド鎖は異なる、すなわち、複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などであり得る。誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、ｐ３５ ＩＬ－１２サブユニット、ｐ４０ ＩＬ－１２サブユニット、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。ｐ３５サブユニットとｐ４０サブユニットは会合してＩＬ－１２ヘテロ二量体を形成し、固有のＩＬ－１２受容体アゴニスト活性を有する。ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に関して、ＩＬ－１２受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。ＩＬ－１２受容体アゴニスト活性は、遮断エレメントによって減弱される。半減期延長エレメントはまた、例えば立体効果によって、減弱に寄与し得る。遮断エレメントは、立体的に遮断することにより、及び／またはＩＬ－１２（例えば、ｐ３５、ｐ４０、またはｐ３５ｐ４０複合体）へ非共有結合することにより、ＩＬ－１２の受容体アゴニスト活性のすべてまたは一部の活性を遮断することができる。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体から、活性な（例えば、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体より高活性な）形態のＩＬ－１２が遊離する。通常、遊離したＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも１０倍活性が高い。好ましくは、遊離したＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも約１０，０００倍またはそれ以上の活性である。
本開示は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、所望により３つのポリペプチド鎖またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示される２つ以上のポリペプチド鎖は異なる、すなわち、複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などであり得る。誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、ｐ３５ ＩＬ－１２サブユニット、ｐ４０ ＩＬ－１２サブユニット、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。ｐ３５サブユニットとｐ４０サブユニットは会合してＩＬ－１２ヘテロ二量体を形成し、固有のＩＬ－１２受容体アゴニスト活性を有する。ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に関して、ＩＬ－１２受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。ＩＬ－１２受容体アゴニスト活性は、遮断エレメントによって減弱される。半減期延長エレメントはまた、例えば立体効果によって、減弱に寄与し得る。遮断エレメントは、立体的に遮断することにより、及び／またはＩＬ－１２（例えば、ｐ３５、ｐ４０、またはｐ３５ｐ４０複合体）へ非共有結合することにより、ＩＬ－１２の受容体アゴニスト活性のすべてまたは一部の活性を遮断することができる。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体から、活性な（例えば、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体より高活性な）形態のＩＬ－１２が遊離する。通常、遊離したＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも１０倍活性が高い。好ましくは、遊離したＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも約１０，０００倍またはそれ以上の活性である。
ＩＬ－１２ポリペプチド複合体の切断時に遊離するＩＬ－１２の形態は、一般的には半減期が短く、多くの場合、天然のＩＬ－１２の半減期と実質的に同様である。ＩＬ－１２ポリペプチド複合体の半減期は延長されるが、循環ＩＬ－１２ポリペプチド複合体が減弱化され、活性型ＩＬ－１２が目的の部位（例えば、腫瘍微小環境）に標的化されるため、毒性は軽減または排除される。
当業者であれば、ポリペプチド鎖の数、ならびにポリペプチド鎖上のｐ３５及びｐ４０サブユニット、半減期延長エレメント、プロテアーゼ切断性リンカー（複数可）、及び遮断エレメント（及びそのようなエレメントの構成要素、例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）の位置が様々であり得、多くの場合、設計の好みの問題であることが理解されよう。そのような変形はすべて、本開示に包含される。
実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、２つの異なるポリペプチド鎖を含む。通常、第１のポリペプチド鎖はｐ３５を含み、第２のポリペプチド鎖はｐ４０を含む。ｐ３５及びｐ４０サブユニットは結合して、生物学的に活性なヘテロ二量体を形成する。ｐ３５ｐ４０ヘテロ二量体複合体は、例えばジスルフィド結合を介して共有結合され得る。
実施形態では、第１及び第２のポリペプチドのいずれかが、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結されたＩＬ－１２遮断エレメント（例えば、ＩＬ－１２に結合するｓｃＦＶ）を含み得る。他方のポリペプチド鎖は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結された半減期延長エレメントをさらに含み得る。好ましくは、複合体は、１つの機能的遮断エレメント及び１つの機能的半減期延長エレメントを含む。例えば、第１のポリペプチド鎖がＩＬ－１２遮断エレメントを含む場合、第２のポリペプチド鎖はＩＬ－１２遮断エレメントを含まない。他の実施形態では、一方のポリペプチド鎖が、ｐ３５またはｐ４０のいずれかを含み、さらに半減期延長エレメント及び遮断エレメントを含み、これらのそれぞれが、プロテアーゼ切断性リンカー（例えば、１つ以上のプロテアーゼ切断性リンカー）を介してｐ３５またはｐ４０に作動可能に連結し、他方のポリペプチドが、相補的なＩＬ－１２サブユニット（例えば、ｐ４０またはｐ３５のいずれか）を含む。第２のポリペプチド上のＩＬ－１２遮断エレメントを、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結することができる。あるいは、ＩＬ－１２遮断エレメントを、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結することができる。第１及び第２のポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは同じである。このＩＬ－１２ポリペプチド複合体における遮断エレメントは、単鎖抗体であり得る。ＩＬ－１２に対して結合特異性を有する任意の単鎖抗体は、遮断エレメントとなり得る。好ましくは、遮断エレメントはｓｃＦｖである。
本明細書に開示される複合体は、好ましくは、１つの半減期延長エレメント及び１つの遮断エレメントを含むが、そのようなエレメントは、同じポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上に存在する２つ以上の構成要素を含み得る。これを示し、本明細書において開示し、例示するように、遮断エレメントの構成要素を、別個のポリペプチド鎖上に存在させることができる。例えば、第１のポリペプチド鎖に、抗体軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含ませることができ、第２のポリペプチドに、第１のポリペプチド上のＶＬ＋ＣＬまたはＶＬに相補的な抗体重鎖Ｆａｂフラグメント（ＶＨ＋ＣＨ１）または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含ませることができる。そのような状況では、これらの構成要素がペプチド複合体中で会合して、ＩＬ－１２に結合してＩＬ－１２活性を減弱するＦａｂなどの抗原結合部位を形成することができる。
実施形態では、ｐ３５及びｐ４０サブユニットは、同じポリペプチド鎖上に位置し、任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して連結され得る。二本鎖または多重鎖複合体のそのような実施形態では、半減期延長エレメント、遮断エレメント、または半減期延長エレメントもしくは遮断エレメントの構成要素のうちの少なくとも１つは別のポリペプチド上にある。例えば、第１のポリペプチドは、任意選択で切断可能ポリペプチド鎖を介して連結されたｐ３５及びｐ４０を含み得、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体の他のエレメントは第２のポリペプチド鎖上に位置する。別の例では、第１のポリペプチド鎖は、ｐ３５サブユニット、ｐ４０サブユニット、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の一部を含む。第２のポリペプチドは、抗体軽鎖に相補的な抗体重鎖の一部を含む。抗体軽鎖の一部は、相補的な重鎖と一緒になって複合中で会合し、ＩＬ－１２の結合部位を形成する。別の例では、第１のポリペプチドは、ｐ３５サブユニット、ｐ４０サブユニット、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の一部を含む。この例では、第２のポリペプチドは、抗体重鎖に相補的な抗体軽鎖の一部を含む。抗体重鎖の一部は、相補的な軽鎖と一緒になって複合中で会合し、ＩＬ－１２の結合部位を形成する。これらの複合体において、ｐ３５サブユニット及びｐ４０サブユニットは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して作動可能に連結され得る。好ましくは、ｐ３５サブユニット及びｐ４０サブユニットは、非切断性リンカーによって作動可能に連結される。
本明細書に開示される複合体において、半減期延長エレメントは、好ましくは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５サブユニットまたはｐ４０サブユニットのいずれかに作動可能に連結される。例えば、複合体は、ｐ３５またはｐ４０がプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含み得る。別の例では、複合体は、ｐ３５またはｐ４０がプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結され、半減期延長エレメントが任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して遮断エレメント（または遮断エレメントの構成要素）にさらに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含み得る。そのような例示的な実施形態では、複合体は、第１のポリペプチドには存在しないＩＬ－１２サブユニット（ｐ４０またはｐ３５）を含む少なくとも１つの追加のポリペプチドを含む。複合体のエレメントの追加の配置は、本開示によって想定され、包含される。例えば、遮断エレメントを、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５サブユニットまたはｐ４０サブユニットのいずれかに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントまたは遮断エレメントの一方を、ｐ３５サブユニットに作動可能に連結することができ、半減期延長エレメントまたは遮断エレメントの他方を、ｐ４０サブユニットに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントをｐ３５サブユニットに作動可能に連結する場合、遮断エレメントをｐ４０サブユニットに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントをｐ４０サブユニットに作動可能に連結する場合、遮断エレメントをｐ３５サブユニットに作動可能に連結することができる。この複合体における遮断エレメントは、好ましくはＦａｂである。
誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、３つのポリペプチド鎖を含み得る。一般的には、一方のポリペプチド鎖はｐ３５またはｐ４０ ＩＬ－１２サブユニットのいずれかを含むが両方は含まず、第２のポリペプチドは他方のＩＬ－１２サブユニットを含み、第３のポリペプチドは遮断エレメントの少なくとも一部（構成要素）を含む。第１のポリペプチド上のＩＬ－１２サブユニットがｐ３５である場合、第２のポリペプチド上のＩＬ－１２サブユニットはｐ４０である。第１のポリペプチド上のＩＬ－１２サブユニットがｐ４０である場合、第２のポリペプチド上のＩＬ－１２サブユニットはｐ３５である。ポリペプチドが発現し、折り畳まれると、ｐ３５及びｐ４０サブユニットが会合して生物学的に活性なヘテロ二量体が形成され得る。ｐ３５ｐ４０ヘテロ二量体複合体は、例えばジスルフィド結合を介して共有結合され得る。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、存在する場合、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結される半減期延長エレメントをさらに含み得る。第２のポリペプチドは遮断エレメントの一部をさらに含み、第３のポリペプチドは遮断エレメントの残りを含み得る。そのような複合体において、ＩＬ－１２遮断エレメントは、ポリペプチド２とポリペプチド３との相互作用によって形成される抗体の抗原結合フラグメント、例えばＦａｂフラグメントであり得る。実施形態では、第２のポリペプチドは、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。あるいは、第２のポリペプチドは、抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。抗体軽鎖の抗原結合部分または重鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、半減期延長エレメントを含み得る。第２のポリペプチドが半減期延長エレメントを含む場合、第１のポリペプチドは半減期延長エレメントを含まない。半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結され得る。あるいは、またはさらに、半減期延長エレメントは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して遮断エレメントの一部（例えば、抗体軽鎖の抗原結合部分または重鎖の抗原結合部分）に作動可能に連結され得る。半減期延長エレメントが存在し、ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結されている場合、抗体の重鎖または軽鎖は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントが存在し、ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結されている場合、抗体重鎖または軽鎖は、任意選択で切断性リンカーを介してＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結され得る。第１、第２、及び／またはポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、配列番号９５～１１０、配列番号１１９～１２６、及び配列番号１３５～１４３から選択されるアミノ酸を含む第１のポリペプチド鎖を含む。特定の好ましいＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、配列番号１０４または配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、配列番号１１９～１２６、及び配列番号１３５～１４３から選択されるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド配列と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。好ましいＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む。別の好ましいＩＬ－１２ポリペプチドは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体の第１のポリペプチド鎖は、配列番号９５～１１０、配列番号１１９～１２６、及び配列番号１３５～１４３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体の第２のポリペプチド鎖は、配列番号１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
上記のように、所望により、ＩＬ－１２はムテインであり得る。ＩＬ－１２ムテインは、ＩＬ－１２活性、例えば、固有のＩＬ－１２受容体アゴニスト活性を保持している。ＩＬ－１２サブユニット、ｐ３５及び／またはｐ４０は、ムテインであり得る。好ましくは、ＩＬ－１２ムテインは、改変されたグリコシル化パターンを有する。例えば、ＩＬ－１２ムテインは、部分的にアグリコシル化または完全にアグリコシル化され得る。例えば、部分的または完全にアグリコシル化されたＩＬ－１２ポリペプチドは、配列番号１０４、４３４もしくは４４２～４４５からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号１０４、４３４もしくは４４２～４４５に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
ｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットは、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換を含み得る。例えば、ｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットは、約１、約２、約３、約４、約５またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。通常は、ｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットは、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。一般的な修飾は、ｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットのグリコシル化パターンを改変し、それによりｐ３５及び／またはｐ４０サブユニットを部分的または完全にアグリコシル化する。好ましくは、アミノ酸改変は、アスパラギンアミノ酸の置換を含む。例えば、アスパラギンからグルタミンである。特定の例では、配列番号４３４のＩＬ－１２ ｐ３５のアミノ酸位置１６、７５、８５、１３３、１５１、１５８、２０１、２０６、２２１、２５０、２６７、２８０、２８２、３２６、４００、４０４、４２５、５５５、５７２、５７５、５８２、または６０２のアスパラギンを変異させることができる。特定の例では、配列番号１８のＩＬ－１２ ｐ４０のアミノ酸位置１０３、１１４、１６３、２１９、２２７、または２８２のアスパラギンを変異させることができる。
本発明はまた、特定の単鎖ＩＬ－１２誘導性ポリペプチドにも関する。本明細書に開示される単鎖ＩＬ－１２ポリペプチドは、ＩＬ－１２、遮断エレメント、半減期延長エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。ＩＬ－１２は、同種のＩＬ－１２受容体に対する受容体アゴニスト活性を有する。遮断エレメントがＩＬ－１２に結合すると、ＩＬ－１２受容体活性化活性は減弱する。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、活性型ＩＬ－１２ポリペプチドが遊離する。単鎖誘導性ＩＬ－１２ポリペプチドは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２３２０号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２３２２号に開示されている。
本明細書に開示される単鎖ＩＬ－１２誘導性ポリペプチドは、配列番号７、９、１０、１８、２４～９４、配列番号１１０～１１８、及び配列番号１２７～１３４から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単鎖ＩＬ－１２誘導性ポリペプチドは、配列番号７、９、１０、１８、２４～９４、配列番号１１０～１１８、及び配列番号１２７～１３４と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
Ｂ．ＩＬ－２３ポリペプチド複合体
本開示は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、所望により３つのポリペプチド鎖またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示される２つ以上のポリペプチド鎖は異なる、すなわち、複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などであり得る。誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、ｐ１９ ＩＬ－２３サブユニット、ｐ４０ ＩＬ－２３サブユニット、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。ｐ１９サブユニットとｐ４０サブユニットは会合してＩＬ－２３ヘテロ二量体を形成し、固有のＩＬ－２３受容体アゴニスト活性を有する。当業者によく理解されるように、ＩＬ－２３及びＩＬ－１２は同じｐ４０サブユニットを共有する。ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に関して、ＩＬ－２３受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。ＩＬ－２３受容体アゴニスト活性は、遮断エレメントによって減弱される。半減期延長エレメントはまた、例えば立体効果によって、減弱に寄与し得る。遮断エレメントは、立体的に遮断することにより、及び／またはＩＬ－２３（例えば、ｐ１９、ｐ４０、またはｐ１９ｐ４０複合体）へ非共有結合することにより、ＩＬ－２３の受容体アゴニスト活性のすべてまたは一部の活性を遮断することができる。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体から、活性な（例えば、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体より高活性な）形態のＩＬ－２３が遊離する。通常、遊離したＩＬ－２３は、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも１０倍活性が高い。好ましくは、遊離したＩＬ－２３は、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも約１０，０００倍またはそれ以上の活性である。
本開示は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、所望により３つのポリペプチド鎖またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示される２つ以上のポリペプチド鎖は異なる、すなわち、複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などであり得る。誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、ｐ１９ ＩＬ－２３サブユニット、ｐ４０ ＩＬ－２３サブユニット、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。ｐ１９サブユニットとｐ４０サブユニットは会合してＩＬ－２３ヘテロ二量体を形成し、固有のＩＬ－２３受容体アゴニスト活性を有する。当業者によく理解されるように、ＩＬ－２３及びＩＬ－１２は同じｐ４０サブユニットを共有する。ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に関して、ＩＬ－２３受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。ＩＬ－２３受容体アゴニスト活性は、遮断エレメントによって減弱される。半減期延長エレメントはまた、例えば立体効果によって、減弱に寄与し得る。遮断エレメントは、立体的に遮断することにより、及び／またはＩＬ－２３（例えば、ｐ１９、ｐ４０、またはｐ１９ｐ４０複合体）へ非共有結合することにより、ＩＬ－２３の受容体アゴニスト活性のすべてまたは一部の活性を遮断することができる。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体から、活性な（例えば、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体より高活性な）形態のＩＬ－２３が遊離する。通常、遊離したＩＬ－２３は、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも１０倍活性が高い。好ましくは、遊離したＩＬ－２３は、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも約１０，０００倍またはそれ以上の活性である。
融合タンパク質の切断時に遊離するＩＬ－２３の形態は典型的には半減期が短く、天然に存在するＩＬ－２３の半減期と実質的に同様であることが多く、ＩＬ－２３サイトカイン活性を腫瘍微小環境にさらに制限する。ＩＬ－２３ポリペプチド複合体の半減期は延長されるが、循環ＩＬ－２３ポリペプチド複合体が減弱化され、活性型ＩＬ－２３が目的の部位（例えば、腫瘍微小環境）に標的化されるため、毒性は軽減または排除される。
当業者であれば、ポリペプチド鎖の数、ならびにポリペプチド鎖上のｐ１９及びｐ４０サブユニット、半減期延長エレメント、プロテアーゼ切断性リンカー（複数可）、及び遮断エレメント（及びそのようなエレメントの構成要素、例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）の位置が様々であり得、多くの場合、設計の好みの問題であることが理解されよう。そのような変形はすべて、本開示に包含される。
実施形態では、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、２つの異なるポリペプチド鎖を含む。通常、第１のポリペプチド鎖はｐ１９を含み、第２のポリペプチド鎖はｐ４０を含む。ｐ１９及びｐ４０サブユニットは結合して、生物学的に活性なヘテロ二量体を形成する。ｐ１９ｐ４０ヘテロ二量体複合体は、例えばジスルフィド結合を介して共有結合され得る。
実施形態では、第１及び第２のポリペプチドのいずれかが、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結されたＩＬ－２３遮断エレメント（例えば、ＩＬ－２３に結合するｓｃＦＶ）を含み得る。他方のポリペプチド鎖は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結された半減期延長エレメントをさらに含み得る。好ましくは、複合体は、１つの機能的遮断エレメント及び１つの機能的半減期延長エレメントを含む。例えば、第１のポリペプチド鎖がＩＬ－２３遮断エレメントを含む場合、第２のポリペプチド鎖はＩＬ－２３遮断エレメントを含まない。他の実施形態では、一方のポリペプチド鎖が、ｐ１９またはｐ４０のいずれかを含み、さらに半減期延長エレメント及び遮断エレメントを含み、これらのそれぞれが、プロテアーゼ切断性リンカー（例えば、１つ以上のプロテアーゼ切断性リンカー）を介してｐ１９またはｐ４０に作動可能に連結し、他方のポリペプチドが、相補的なＩＬ－２３サブユニット（例えば、ｐ４０またはｐ１９のいずれか）を含む。第２のポリペプチド上のＩＬ－２３遮断エレメントを、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結することができる。あるいは、ＩＬ－２３遮断エレメントを、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結することができる。第１及び第２のポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは同じである。このＩＬ－２３ポリペプチド複合体における遮断エレメントは、単鎖抗体であり得る。ＩＬ－２３に対して結合特異性を有する任意の単鎖抗体は、遮断エレメントとなり得る。好ましくは、遮断エレメントはｓｃＦｖである。
本明細書に開示される複合体は、好ましくは、１つの半減期延長エレメント及び１つの遮断エレメントを含むが、そのようなエレメントは、同じポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上に存在する２つ以上の構成要素を含み得る。これを示し、本明細書において開示し、例示するように、遮断エレメントの構成要素を、別個のポリペプチド鎖上に存在させることができる。例えば、第１のポリペプチド鎖に、抗体軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含ませることができ、第２のポリペプチドに、第１のポリペプチド上のＶＬ＋ＣＬまたはＶＬに相補的な抗体重鎖Ｆａｂフラグメント（ＶＨ＋ＣＨ１）または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含ませることができる。そのような状況では、これらの構成要素がペプチド複合体中で会合して、ＩＬ－２３に結合してＩＬ－２３活性を減弱するＦａｂなどの抗原結合部位を形成することができる。
実施形態では、ｐ１９及びｐ４０サブユニットは、同じポリペプチド鎖上に位置し、任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して連結され得る。二本鎖または多重鎖複合体のそのような実施形態では、半減期延長エレメント、遮断エレメント、または半減期延長エレメントもしくは遮断エレメントの構成要素のうちの少なくとも１つは別のポリペプチド上にある。例えば、第１のポリペプチドは、任意選択で切断可能ポリペプチド鎖を介して連結されたｐ１９及びｐ４０を含み得、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体の他のエレメントは第２のポリペプチド鎖上に位置する。別の例では、第１のポリペプチド鎖は、ｐ１９サブユニット、ｐ４０サブユニット、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の一部を含む。第２のポリペプチドは、抗体軽鎖に相補的な抗体重鎖の一部を含む。抗体軽鎖の一部は、相補的な重鎖と一緒になって複合中で会合し、ＩＬ－２３の結合部位を形成する。別の例では、第１のポリペプチドは、ｐ１９サブユニット、ｐ４０サブユニット、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の一部を含む。この例では、第２のポリペプチドは、抗体重鎖に相補的な抗体軽鎖の一部を含む。抗体重鎖の一部は、相補的な軽鎖と一緒になって複合中で会合し、ＩＬ－２３の結合部位を形成する。これらの複合体において、ｐ１９サブユニット及びｐ４０サブユニットは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して作動可能に連結され得る。好ましくは、ｐ１９サブユニット及びｐ４０サブユニットは、非切断性リンカーによって作動可能に連結される。
本明細書に開示される複合体において、半減期延長エレメントは、好ましくは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９サブユニットまたはｐ４０サブユニットのいずれかに作動可能に連結される。例えば、複合体は、ｐ１９またはｐ４０がプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含み得る。別の例では、複合体は、ｐ１９またはｐ４０がプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結され、半減期延長エレメントが任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して遮断エレメント（または遮断エレメントの構成要素）にさらに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含み得る。そのような例示的な実施形態では、複合体は、第１のポリペプチドには存在しないＩＬ－２３サブユニット（ｐ４０またはｐ１９）を含む少なくとも１つの追加のポリペプチドを含む。複合体のエレメントの追加の配置は、本開示によって想定され、包含される。例えば、遮断エレメントを、プロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９サブユニットまたはｐ４０サブユニットのいずれかに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントまたは遮断エレメントの一方を、ｐ１９サブユニットに作動可能に連結することができ、半減期延長エレメントまたは遮断エレメントの他方を、ｐ４０サブユニットに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントをｐ１９サブユニットに作動可能に連結する場合、遮断エレメントをｐ４０サブユニットに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントをｐ４０サブユニットに作動可能に連結する場合、遮断エレメントをｐ１９サブユニットに作動可能に連結することができる。この複合体における遮断エレメントは、好ましくはＦａｂである。
誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、３つのポリペプチド鎖を含み得る。一般的には、一方のポリペプチド鎖はｐ１９またはｐ４０ ＩＬ－２３サブユニットのいずれかを含むが両方は含まず、第２のポリペプチドは他方のＩＬ－２３サブユニットを含み、第３のポリペプチドは遮断エレメントの少なくとも一部（構成要素）を含む。第１のポリペプチド上のＩＬ－２３サブユニットがｐ１９である場合、第２のポリペプチド上のＩＬ－２３サブユニットはｐ４０である。第１のポリペプチド上のＩＬ－２３サブユニットがｐ４０である場合、第２のポリペプチド上のＩＬ－２３サブユニットはｐ１９である。ポリペプチドが発現し、折り畳まれると、ｐ１９及びｐ４０サブユニットが会合して生物学的に活性なヘテロ二量体が形成され得る。ｐ１９ｐ４０ヘテロ二量体複合体は、例えばジスルフィド結合を介して共有結合され得る。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、存在する場合、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結される半減期延長エレメントをさらに含み得る。第２のポリペプチドは遮断エレメントの一部をさらに含み、第３のポリペプチドは遮断エレメントの残りを含み得る。そのような複合体において、ＩＬ－２３遮断エレメントは、ポリペプチド２とポリペプチド３との相互作用によって形成される抗体の抗原結合フラグメント、例えばＦａｂフラグメントであり得る。実施形態では、第２のポリペプチドは、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。あるいは、第２のポリペプチドは、抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。抗体軽鎖の抗原結合部分または重鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、半減期延長エレメントを含み得る。第２のポリペプチドが半減期延長エレメントを含む場合、第１のポリペプチドは半減期延長エレメントを含まない。半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結され得る。あるいは、またはさらに、半減期延長エレメントは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して遮断エレメントの一部（例えば、抗体軽鎖の抗原結合部分または重鎖の抗原結合部分）に作動可能に連結され得る。半減期延長エレメントが存在し、ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結されている場合、抗体の重鎖または軽鎖は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントが存在し、ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結されている場合、抗体重鎖または軽鎖は、任意選択で切断性リンカーを介してＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結され得る。第１、第２、及び／またはポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
実施形態では、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、配列番号４２３～４２８からなる群、または配列番号４２３～４２８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第１のポリペプチドを含む。実施形態では、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、配列番号１８または４３３からなる群から選択される第２のポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体の第１のポリペプチド鎖は、配列番号４２３～４２８から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体の第２のポリペプチド鎖は、配列番号１８または４３３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
上記のように、所望により、ＩＬ－２３はムテインであり得る。ＩＬ－２３ムテインは、ＩＬ－２３活性、例えば、固有のＩＬ－２３受容体アゴニスト活性を保持している。ＩＬ－２３サブユニット、ｐ１９及び／またはｐ４０はムテインであり得る。好ましくは、ＩＬ－２３ムテインは、改変されたグリコシル化パターンを有する。例えば、ＩＬ－２３ムテインは、部分的にアグリコシル化または完全にアグリコシル化され得る。
ｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットは、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換を含み得る。例えば、ｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットは、約１、約２、約３、約４、約５またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。通常は、ｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットは、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。一般的な修飾は、ｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットのグリコシル化パターンを改変し、それによりｐ１９及び／またはｐ４０サブユニットを部分的または完全にアグリコシル化する。好ましくは、アミノ酸改変は、アスパラギンアミノ酸の置換を含む。例えば、アスパラギンからグルタミンである。例えば、アスパラギンからグルタミンである。特定の例では、配列番号４２４のＩＬ－１２ ｐ１９上のアミノ酸位置４７または６６のアスパラギンを変異させることができる。特定の例では、配列番号１８のＩＬ－１２ ｐ４０のアミノ酸位置１０３、１１４、１６３、２１９、２２７、または２８２のアスパラギンを変異させることができる。
本発明はまた、特定の単鎖ＩＬ－２３誘導性ポリペプチドにも関する。本明細書に開示される単鎖ＩＬ－２３ポリペプチドは、ＩＬ－２３、遮断エレメント、半減期延長エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。ＩＬ－２３は、同種のＩＬ－２３受容体に対する受容体アゴニスト活性を有する。遮断エレメントがＩＬ－２３に結合すると、ＩＬ－２３受容体活性化活性は減弱する。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、活性型ＩＬ－２３ポリペプチドが遊離する。
本明細書に開示される単鎖ＩＬ－２３誘導性ポリペプチドは、配列番号４２２または４２９～４３２から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単鎖ＩＬ－２３誘導性ポリペプチドは、配列番号４２２または４２９～４３２と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
Ｃ．半減期延長エレメント
本明細書において、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体の半減期を延長するドメインが企図される。本明細書ではまた、ＩＬ－２３ポリペプチドの半減期を延長するドメインも企図される。天然では半減期が短い治療用分子のインビボ半減期を増加させることにより、有効性を犠牲にすることなく、より許容できる管理可能な投与レジメンが可能になる。
本明細書において、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体の半減期を延長するドメインが企図される。本明細書ではまた、ＩＬ－２３ポリペプチドの半減期を延長するドメインも企図される。天然では半減期が短い治療用分子のインビボ半減期を増加させることにより、有効性を犠牲にすることなく、より許容できる管理可能な投与レジメンが可能になる。
半減期延長エレメントは、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させ、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体の改変された薬力学及び薬物動態を提供する。理論に拘束されるものではないが、半減期延長エレメントは、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体の組織分布、浸透、及び拡散の変化を含む薬力学特性を変化させる。いくつかの実施形態では、半減期延長エレメントは、半減期延長エレメントを含まないタンパク質と比較して、組織標的化、組織浸透、組織内での拡散を向上させ、効力を増強することができる。理論に拘束されるものではないが、ポリペプチドの薬物動態を向上させる例示的方法は、内皮細胞上のＦｃＲｎ受容体及びトランスフェリン受容体等、リソソームで分解されるのではなく細胞の形質膜に再利用される受容体に結合するポリペプチド鎖のエレメントの発現によるものである。３種のタンパク質、例えば、ヒトＩｇＧ、ＨＳＡ（またはフラグメント）、及びトランスフェリンは、ヒト血清中では、そのサイズだけから予測されるよりはるかに長く存続し、これは、リソソームで分解されるのではなく再利用される受容体に対するそれらの結合能の作用である。これらのタンパク質、またはフラグメントは、ＦｃＲｎ結合を保持しており、日常的な方法で他のポリペプチドに連結され、それらの血中半減期を延長させる。ＨＳＡはまた、医薬組成物に直接結合させても短いリンカーを介して結合させてもよい。ＨＳＡのフラグメントを使用してもよい。ＨＳＡ及びそのフラグメントは、遮断エレメントとしても半減期延長エレメントとしても機能することができる。ヒトＩｇＧ及びＦｃフラグメントもまた同様の機能を実行することができる。
血中半減期延長エレメントはまた、血清アルブミン、トランスフェリンなどの長い血中半減期のタンパク質に結合する抗原結合ポリペプチドでもあり得る。そのようなポリペプチドの例には、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ｄＡｂを含む、抗体及びそのフラグメントが含まれる。他の好適な抗原結合ドメインとして、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４足場などの他の改変された足場に基づく結合ドメインが挙げられる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例には、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原に結合するかまたは会合するペプチドが含まれる。
本明細書に提供される半減期延長エレメントは、好ましくは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、及びヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンＦｃもしくはそのフラグメントである。
ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体の半減期延長エレメントは、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体の半減期を、少なくとも約２日、約３日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日またはそれ以上延長させる。いくつかの実施形態では、半減期延長エレメントは、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体の半減期を、少なくとも２～３日、３～４日、４～５日、５～６日、６～７日、７～８日またはそれ以上延長させる。
Ｄ．遮断エレメント
遮断エレメントは、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３に結合し、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体がその受容体に結合して活性化する能力を阻害する任意のエレメントであり得る。遮断エレメントは、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３がその受容体に結合し、及び／または活性化する能力を、例えば、立体的に遮断することによって、及び／またはＩＬ－１２ポリペプチド複合体に共有結合で結合することによって阻害することができる。本明細書に開示される遮断エレメントは、ｐ１９、ｐ３５、ｐ４０、ｐ３５ｐ４０ヘテロ二量体複合体、またはｐ１９ｐ４０ヘテロ二量体複合体に結合することができる。
遮断エレメントは、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３に結合し、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体がその受容体に結合して活性化する能力を阻害する任意のエレメントであり得る。遮断エレメントは、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３がその受容体に結合し、及び／または活性化する能力を、例えば、立体的に遮断することによって、及び／またはＩＬ－１２ポリペプチド複合体に共有結合で結合することによって阻害することができる。本明細書に開示される遮断エレメントは、ｐ１９、ｐ３５、ｐ４０、ｐ３５ｐ４０ヘテロ二量体複合体、またはｐ１９ｐ４０ヘテロ二量体複合体に結合することができる。
好適な遮断エレメントの例として、ＩＬ－１２の同族受容体の全長またはＩＬ－１２結合フラグメントまたはムテインが挙げられる。好適な遮断エレメントの他の例として、ＩＬ－２３の同族受容体の全長またはＩＬ－２３結合フラグメントまたはムテインが挙げられる。ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ｄＡｂなどを含む、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３に結合する抗体及び抗体結合フラグメントもまた、使用することができる。ＩＬ－１２またはＩＬ－２３と結合する他の好適な抗原結合ドメインも使用することができ、これには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４足場などの他の改変された足場に基づく結合ドメインが含まれる。好適な遮断ポリペプチドのさらなる例には、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３のその同族受容体への結合を立体的に阻害または遮断するポリペプチドが含まれる。有利なことに、そのような部分はまた、半減期延長エレメントとしても機能する。例えば、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーへの結合により修飾されているペプチドは、サイトカインのその受容体への結合を立体的に阻害または防止することができる。血清アルブミン（ヒト血清アルブミン）、免疫グロブリンＦｃ、トランスフェリンなど、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント及びムテインなど、長い血中半減期を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを使用することもできる。
好ましいＩＬ－１２遮断エレメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメントである。好ましいＩＬ－２３遮断エレメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメントである。ｓｃＦｖ遮断エレメントは、配列番号１４５～１８８に記載のアミノ酸配列を含む。あるいは、Ｆａｂ遮断エレメントは、配列番号１８９～１９４に記載のアミノ酸配列を含む。配列番号１４５～１９４に包含されるＩＬ－１２抗体フラグメントは、本明細書に開示するＩＬ－１２ポリペプチド複合体の発展性を高めるために最適化されている。
好ましい抗体軽鎖遮断エレメントは、配列番号１９２～１９３を含む。これらの好ましい構成要素を、１つのポリペプチド鎖上に配置することができ、重鎖の相補的な抗原結合部分を、第２のポリペプチド鎖上に配置することができる。好ましい重鎖遮断エレメントは、配列番号１８９～１９１及び１９４を含む。これらの好ましい構成要素を、１つのポリペプチド鎖上に配置することができ、相補的な軽鎖を第２のポリペプチド鎖上に配置する。抗体の軽鎖と抗体の重鎖が一緒になって、ＩＬ－１２の結合部位を形成する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２遮断エレメントは、配列番号１４５～１９４と、例えば、配列番号１４５～１９４の全長にわたって、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一般的には、ＣＤＲのアミノ酸配列は改変されておらず、アミノ酸置換がフレームワーク領域に存在する。
本開示はまた、配列番号１４５～１９４を含むＩＬ－１２遮断エレメントの機能的バリアントに関する。配列番号１４５～１９４を含むＩＬ－１２遮断エレメントの機能的バリアントは、一般に、配列番号１４５～１９４とは、１つまたはいくつかのアミノ酸（置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを含む）だけ異なり、実質的にＩＬ－１２ポリペプチド（例えば、ｐ３５サブユニット、ｐ４０サブユニット、またはｐ３５ｐ４０複合体）に結合する能力を保持し、ＩＬ－１２が同族受容体へ結合することを阻害する。
機能的バリアントは、配列番号１４５～１９４を含むＩＬ－１２遮断エレメントと比較して、少なくとも１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得る。機能的バリアントは、配列番号１４５～１９４を含むＩＬ－１２遮断エレメントと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸変化を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１４５～１９４を含むＩＬ－１２遮断エレメントとは、１０未満、８未満、５未満、４未満、３未満、２未満、または１つのアミノ酸の変化、例えば、アミノ酸の置換または欠失だけ異なっている。他の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１４５～１９４と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。
他の実施形態では、ＩＬ－１２遮断エレメントの機能的バリアントは、配列番号１４５～１９４を含むＩＬ－１２遮断エレメントと比較して、１、２、３、４、または５個以上の非保存的アミノ酸置換を含み得る。非保存的アミノ酸置換は、当業者によって認識され得る。分離部分の機能的バリアントは、好ましくは、１、２、３、４、または５個以下のアミノ酸欠失を含む。
ＩＬ－１２に対する特異性を有する遮断エレメントを含み、半減期延長エレメントを含む誘導性ＩＬ－１２ポリペプチドも本明細書に開示される。ＩＬ－２３に対する特異性を有する遮断エレメントを含み、半減期延長エレメントを含む誘導性ＩＬ－１２ポリペプチドも本明細書に開示される。遮断エレメントは、ＩＬ－１２、特に本明細書に開示される配列番号４２１によって定義されるＩＬ－１２サブユニットβ前駆体（ｐ４０）に対する結合特異性を有する抗体または抗原結合フラグメントである。抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４２１の表１に示される残基に結合する抗原結合ドメインを含む。本開示は、表１に示されるアミノ酸残基によって定義されるＩＬ－１２エピトープに結合する抗体または抗原結合フラグメント、及びそのような抗体または抗原結合フラグメントを含む誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体、ならびに誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体、またはそのような誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド複合体を含む薬剤を調製するための、そのような抗体または抗原結合フラグメントの使用に関する。
Ｅ．プロテアーゼ切断性リンカー
本明細書に開示されるように、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、ポリペプチド間に柔軟性を提供するのに役立ち、それにより、例えば、遮断エレメントは、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３の活性を阻害することができる。リンカーは、ＩＬ－１２サブユニットまたはＩＬ－２３サブユニット、半減期延長エレメント、及び／または遮断エレメントの間に配置することができる。本明細書に記載されるように、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。本明細書に記載されるように、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。プロテアーゼ切断性リンカーは、１つ以上の所望のプロテアーゼのための１つ以上の切断部位を含み得る。好ましくは、所望のプロテアーゼを、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３活性の所望の標的部位（例えば、腫瘍微小環境）において濃縮するかまたは選択的に発現させる。したがって、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、所望のＩＬ－１２活性またはＩＬ－２３活性の標的部位で優先的または選択的に切断する。
本明細書に開示されるように、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、ポリペプチド間に柔軟性を提供するのに役立ち、それにより、例えば、遮断エレメントは、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３の活性を阻害することができる。リンカーは、ＩＬ－１２サブユニットまたはＩＬ－２３サブユニット、半減期延長エレメント、及び／または遮断エレメントの間に配置することができる。本明細書に記載されるように、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。本明細書に記載されるように、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。プロテアーゼ切断性リンカーは、１つ以上の所望のプロテアーゼのための１つ以上の切断部位を含み得る。好ましくは、所望のプロテアーゼを、ＩＬ－１２またはＩＬ－２３活性の所望の標的部位（例えば、腫瘍微小環境）において濃縮するかまたは選択的に発現させる。したがって、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、所望のＩＬ－１２活性またはＩＬ－２３活性の標的部位で優先的または選択的に切断する。
好適なリンカーは、一般的には約１００未満のアミノ酸である。そのようなリンカーは、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～３０アミノ酸、１アミノ酸～４０アミノ酸、１アミノ酸～５０アミノ酸、１アミノ酸～６０アミノ酸、１～７０アミノ酸、１～８０アミノ酸、１～９０アミノ酸、及び１～１００アミノ酸などの異なる長さであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００アミノ酸長である。好ましいリンカーは、一般的には、約５アミノ酸～約３０アミノ酸である。
好ましくは、リンカーの長さは、リンカーが連結ドメインの立体配座または相互作用にいかなる制約も課さないように、条件ごとに最適化された、２～３０アミノ酸の間で様々に異なり得る。好ましい実施形態では、リンカーは、切断剤、例えば酵素によって切断可能である。好ましくは、分離部分は、プロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合では、分離部分は、１つ以上の切断部位を含む。分離部分は、単一のプロテアーゼ切断部位を含み得る。分離部分はまた、２つ以上のプロテアーゼ切断部位を含み得る。例えば、２つの切断部位、３つの切断部位、４つの切断部位、５つの切断部位、またはそれ以上である。分離部分が２つ以上のプロテアーゼ切断部位を含む場合、切断部位は同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼによって切断し得る。２つ以上の切断部位を含む分離部分は、「タンデムリンカー」と呼ばれる。２つ以上の切断部位は、別の切断部位に隣接する１つの切断部位、別の切断部位と重なる１つの切断部位、または２つの切断部位の間に介在アミノ酸を有する別の切断部位が続く１つの切断部位を含むがこれらに限定されない、任意の所望の方向に配置することができる。
本発明において特に興味深いのは、疾患特異的プロテアーゼ切断性リンカーである。末梢循環と比較して、腫瘍微小環境などの体内の所望の位置で優先的に切断されるプロテアーゼ切断性リンカーも好ましい。例えば、プロテアーゼ切断性リンカーが腫瘍微小環境で切断される速度は、末梢循環中（例えば、血漿中）と比較して、体内の所望の位置、例えば、腫瘍微小環境において、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１０，０００倍速くなり得る。
罹患した細胞または組織に関連することが知られているプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫｌ、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒｌ－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰα）、ジペプチジルペプチダーゼ、メプリン、グランザイム及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーアミノ酸配列（本明細書で提供されるキメラ核酸配列によりコードされ得る）を切断することができるプロテアーゼは、例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、Ａディスインチグリン及びメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、腫瘍細胞表面プロテアーゼ、及びエラスターゼからなる群から選択され得る。ＭＭＰは、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）、マトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ１４）であり得る。さらに、またはあるいは、リンカーは、カテプシン、例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＫ、及び／またはカテプシンＬによって切断され得る。好ましくは、リンカーは、ＭＭＰ１４またはカテプシンＬによって切断され得る。
リンカーの切断及び本明細書に開示されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体での使用に有用なプロテアーゼを表２に示し、例示的なプロテアーゼ及びそれらの切断部位を表３に示す。
例示的なプロテアーゼ切断性リンカーとして、カリクレイン切断性リンカー、トロンビン切断性リンカー、キマーゼ切断性リンカー、カルボキシペプチダーゼＡ切断性リンカー、カテプシン切断性リンカー、エラスターゼ切断性リンカー、ＦＡＰ切断性リンカー、ＡＤＡＭ切断性リンカー、ＰＲ－３切断性リンカー、グランザイムＭ切断性リンカー、カルパイン切断性リンカー、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断性リンカー、プラスミノーゲン活性化因子切断性リンカー、カスパーゼ切断性リンカー、トリプターゼ切断性リンカー、または腫瘍細胞表面プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ＭＭＰ９切断性リンカー、ＡＤＡＭ切断性リンカー、ＣＴＳＬ１切断性リンカー、ＦＡＰα切断性リンカー、及びカテプシン切断性リンカーである。いくつかの好ましいプロテアーゼ切断性リンカーは、ＭＭＰ及び／またはカテプシンによって切断される。
本明細書に開示される分離部分は、一般的には１００未満のアミノ酸である。そのような分離部分は、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～３０アミノ酸、１アミノ酸～４０アミノ酸、１アミノ酸～５０アミノ酸、１アミノ酸～６０アミノ酸、１～７０アミノ酸、１～８０アミノ酸、１～９０アミノ酸、及び１～１００アミノ酸などの異なる長さであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００アミノ酸長である。好ましいリンカーは、一般的には、約５アミノ酸～約３０アミノ酸である。
好ましくは、リンカーの長さは、リンカーが連結ドメインの立体配座または相互作用にいかなる制約も課さないように、条件ごとに最適化された、２～３０アミノ酸の間で様々に異なり得る。
いくつかの実施形態では、分離部分は、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）；ＧＰＡＧＭＫＧＬ（配列番号１９６）；ＰＧＧＰＡＧＩＧ（配列番号１９７）；ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）；ＡＬＦＦＳＳＰＰ（配列番号１９９）；ＬＡＱＲＬＲＳＳ（配列番号２００）；ＬＡＱＫＬＫＳＳ（配列番号２０１）；ＧＡＬＦＫＳＳＦＰＳＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＳＧＫＧＧＳＧＫ（配列番号２０２）；ＲＧＳＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＳＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＳＧＫ（配列番号２０３）；ＫＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＰＡＧＬＹＡＱＧＰＡＧＬＹＡＱＧＳＲ（配列番号２０４）；ＲＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＫ（配列番号２０５）；ＫＧＧＡＬＦＫＳＳＦＰＧＧＰＡＧＩＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＳ（配列番号２０６）；ＳＧＧＰＧＧＰＡＧＩＧＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＧ（配列番号２０７）；ＲＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＧＰＡＧＩＧＧＧＧＫ（配列番号２０８）；ＧＧＧＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＰＧＧＰＡＧＩＧＧＧＲ（配列番号２０９）；ＲＧＰＧＧＰＡＧＩＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＧＧ（配列番号２１０）；ＲＧＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＰＧＧＰＡＧＩＧＡＬＦＫＳＳＦＰＧＫ（配列番号２１１）；ＲＳＧＧＰＡＧＬＹＡＱＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＧ（配列番号２１２）；ＧＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＲ（配列番号２１３）；ＧＧＡＬＦＫＳＳＦＰＧＰＡＧＬＹＡＱＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＫ（配列番号２１４）；ＲＧＧＡＬＦＫＳＳＦＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＰＡＧＬＹＡＱＧＧＫ（配列番号２１５）；ＲＧＧＧＰＡＧＬＹＡＱＰＬＡＱＫＬＫＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＧ（配列番号２１６）；ＳＧＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＰＡＧＬＹＡＱＡＬＦＫＳＳＦＰＧＳＫ（配列番号２１７）；ＫＧＧＰＧＧＰＡＧＩＧＰＬＡＱＲＬＲＳＳＡＬＦＫＳＳＦＰＧＲ（配列番号２１８）；ＫＳＧＰＧＧＰＡＧＩＧＡＬＦＦＳＳＰＰＬＡＱＫＬＫＳＳＧＧＲ（配列番号２１９）；またはＳＧＧＦＰＲＳＧＧＳＦＮＰＲＴＦＧＳＫＲＫＲＲＧＳＲＧＧＧＧ（配列番号２２０）を含む。
特定の好ましい分離部分は、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を含む。本明細書に開示される分離部分は、同一または異なる１つ以上の切断モチーフまたは機能的バリアントを含み得る。分離部分は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の切断モチーフまたは機能的バリアントを含み得る。３０個のアミノ酸を含む分離部分は、２つの切断モチーフまたは機能的バリアント、３つの切断モチーフまたは機能的バリアント、またはそれ以上を含み得る。分離部分の「機能的バリアント」は、標的部位（例えば、高レベルのプロテアーゼを発現する腫瘍微小環境）で高効率で切断される能力を保持し、末梢（例えば、血清）では切断されないか、または低効率で切断される。例えば、機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０または４４７～４４８のいずれか１つを含む分離部分の切断効率の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９５％またはそれ以上を保持する。
複数の切断モチーフを含む分離部分は、配列番号１９５～２０１または４４７～４４８及びそれらの組み合わせから選択され得る。複数の切断モチーフを含む好ましい分離部分は、配列番号２０２～２２０から選択されるアミノ酸を含む。
分離部分は、ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）及びＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の両方を含み得る。分離部分は、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）をそれぞれ有する２つの切断モチーフを含み得る。あるいは、またはさらに、分離部分は、それぞれが配列ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を有する２つの切断モチーフを含み得る。分離部分は、同じかまたは異なる第３の切断モチーフを含み得る。
いくつかの実施形態では、分離部分は、配列番号１９５～配列番号２２０または４４７～４４８と、配列番号１９５～２２０または配列番号４４７～４４８の全長にわたって、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、配列番号１９５～２２０または４４７～４４８を含む分離部分の機能的バリアントにも関する。配列番号１９５～２２０または４４７～４４８を含む分離部分の機能的バリアントは、一般に、配列番号１９５～２２０または４４７～４４８と、１つまたはいくつかのアミノ酸（置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを含む）だけ異なっており、プロテアーゼによって切断される能力を実質的に保持している。
機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０または４４７～４４８を含む分離部分に対して、少なくとも１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得る。機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０または４４７～４４８を含む分離部分に細分された１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸改変を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０を含む分離部分とは、１０未満、８未満、５未満、４未満、３未満、２未満、または１つのアミノ酸の変化、例えば、アミノ酸の置換または欠失だけ異なっている。他の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０または４４７～４４８と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。
他の実施形態では、分離部分の機能的バリアントは、配列番号１９５～２２０または４４７～４４８を含む分離部分と比較して、１、２、３、４、または５個以上の非保存的アミノ酸置換を含み得る。非保存的アミノ酸置換は、当業者によって認識され得る。分離部分の機能的バリアントは、好ましくは、１、２、３、４、または５個以下のアミノ酸欠失を含む。
分離部分に開示されたアミノ酸配列は、被切断結合に対する分離部分の相対的な直線的位置によって説明することができる。当業者によって十分に理解されるように、８個のアミノ酸プロテアーゼ基質を含む分離部分（例えば、配列番号１９５～２０１または４４７～４４８）は、位置Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’であり、被切断結合はＰ１とＰ１’の間にある。例えば、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）を含む分離部分のアミノ酸位置は、以下のように記載することができる：
配列ＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を含む分離部分のアミノ酸位置は、以下のように記載され得る：
好ましくは、切断部位を取り囲むアミノ酸（例えば、配列番号１９５～２０１または４４７～４４８のＰ１及びＰ１’位）は置換されない。
実施形態では、分離部分は、配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）もしくはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）または配列番号１９５の機能的バリアントもしくは配列番号１９８の機能的バリアントを含む。本明細書に記載されるように、ＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号４４７）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、１つ以上のアミノ酸置換を含み得、プロテアーゼによって切断される能力を実質的に保持している。具体的には、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントはＭＭＰ１４によって切断され、ＡＬＦＫＳＳＦＰの機能的バリアント（配列番号１９８）は、カプテプシンＬ（ＣＴＳＬ１）によって切断される。機能的バリアントは、標的部位（例えば、高レベルのプロテアーゼを発現する腫瘍微小環境）で高効率で切断される能力も保持している。例えば、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、それぞれ、アミノ酸配列ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）を含む分離部分の切断効率の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９５％またはそれ以上を保持している。
好ましくは、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）の機能的バリアントは、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）またはＡＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号１９８）と比較して、１、２、３、４、または５個以下の保存的アミノ酸置換を含む。好ましくは、位置Ｐ１及びＰ１’のアミノ酸は置換されない。配列番号１９５のＰ１位及びＰ１’位のアミノ酸はＧ及びＬであり、配列番号１９８のＰ１位及びＰ１’位のアミノ酸はＫ及びＳである。
ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、好ましくは、以下の１つ以上を含み得る：ａ）位置Ｐ４でのアルギニンアミノ酸置換、ｂ）位置Ｐ３でのロイシン、バリン、アスパラギン、またはプロリンアミノ酸置換、ｃ）位置Ｐ２でのアスパラギンアミノ酸置換、ｄ）位置Ｐ１でのヒスチジン、アスパラギン、またはグリシンアミノ酸置換、ｅ）位置Ｐ１’でのアスパラギン、イソロイシン、またはロイシンアミノ酸置換、ｆ）位置Ｐ２’でのチロシンまたはアルギニンアミノ酸置換、ｇ）位置Ｐ３’でのグリシン、アルギニン、またはアラニンアミノ酸置換、ｈ）位置Ｐ４’でのセリン、グルタミン、またはリジンアミノ酸置換。以下のアミノ酸置換は、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントにおいて好ましくない：ａ）Ｐ３位のアルギニンまたはイソロイシン、ｂ）Ｐ２位のアラニン、ｃ）Ｐ１位のバリン、ｄ）Ｐ１’位のアルギニン、グリシン、アスパラギン、またはスレオニン、ｅ）Ｐ２’位のアスパラギン酸またはグルタミン酸、ｆ）Ｐ３’位のイソロイシン、ｇ）Ｐ４’位のバリン。いくつかの実施形態では、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、Ｐ１及び／またはＰ１’位にアミノ酸置換を含まない。
ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントのアミノ酸置換は、好ましくは位置Ｐ４及び／またはＰ４’でのアミノ酸置換を含む。例えば、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、位置Ｐ４にロイシン、または位置Ｐ４にセリン、グルタミン、リジン、もしくはフェニルアラニンを含み得る。あるいは、またはさらに、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、位置Ｐ４’にグリシン、フェニルアラニン、またはプロリンを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の位置Ｐ２またはＰ２’でのアミノ酸置換は好ましくない。
いくつかの実施形態では、ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の機能的バリアントは、配列番号２２１～２９５から選択されるアミノ酸配列を含む。ＧＰＡＧＬＹＡＱ（配列番号１９５）の特定の機能的バリアントには、ＧＰＬＧＬＹＡＱ（配列番号２５９）、及びＧＰＡＧＬＫＧＡ（配列番号２４９）が含まれる。
ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号４４８）の機能的バリアントは、好ましくは疎水性アミノ酸置換を含む。ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号４４８）の機能的バリアントは、好ましくは、以下のうちの１つ以上を含み得る：（ａ）Ｐ４位のリジン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、ロイシン、プロリン、またはフェニルアラニン；（ｂ）Ｐ３位のリジン、ヒスチジン、グリシン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン；（ｃ）Ｐ２位のアルギニン、ロイシン、アラニン、グルタミン、またはヒスタチン；（ｄ）Ｐ１位のフェニルアラニン、ヒスチジン、スレオニン、アラニン、またはグルタミン；（ｅ）Ｐ１’位のヒスチジン、ロイシン、リジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、フェニルアラニン、アスパラギン、グルタミン酸、またはグリシン；（ｆ）Ｐ２’位のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アラニン、グルタミン、またはプロリン；（ｇ）Ｐ３’位のフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、セリン、バリン、ヒスチジン、アラニン、またはアスパラギン；及びフェニルアラニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、セリン、バリン、グルタミン、リジン、またはロイシン。
配列番号４４８の機能的バリアントにおけるアスパラギン酸及び／またはグルタミン酸の含有は、一般に好ましくなく、回避される。ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号４４８）の機能的バリアントにおいて、以下のアミノ酸置換も好ましくない：（ａ）Ｐ３位のアラニン、セリン、またはグルタミン酸；（ｂ）Ｐ２位のプロリン、スレオニン、グリシン、またはアスパラギン酸；（ｃ）Ｐ１位のプロリン；（ｄ）Ｐ１’位のプロリン；（ｅ）Ｐ２’位のグリシン；（ｆ）Ｐ３’位のリジンまたはグルタミン酸；（ｇ）Ｐ４’位のアスパラギン酸。
ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号４４８）の機能的バリアントのアミノ酸置換は、好ましくは位置Ｐ４及び／またはＰ１でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号４４８）の機能的バリアントの位置Ｐ４’でのアミノ酸置換は好ましくない。
いくつかの実施形態では、ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号４４８）の機能的バリアントは、配列番号２９６～３７４から選択されるアミノ酸配列を含む。ＬＦＫＳＳＦＰ（配列番号４４８）の特定の機能的バリアントには、ＡＬＦＦＳＳＰＰ（配列番号１９９）、ＡＬＦＫＳＦＰＰ（配列番号３４６）、ＡＬＦＫＳＬＰＰ（配列番号３４７）；ＡＬＦＫＨＳＰＰ（配列番号３３５）；ＡＬＦＫＳＩＰＰ（配列番号３４８）；ＡＬＦＫＳＳＬＰ（配列番号３５６）；またはＳＰＦＲＳＳＲＱ（配列番号２９７）が含まれる。
本明細書に開示される分離部分は、生理学的条件下でそれらが連結するアミノ酸配列（例えばドメイン）と安定な複合体を形成し得るが、プロテアーゼによって切断され得る。例えば、分離部分は、循環中で安定であり（例えば、切断されないか、または低効率で切断される）、標的部位（すなわち、腫瘍微小環境）でより高い効率で切断される。したがって、本明細書に開示されるリンカーを含む融合ポリペプチドは、所望により、別個の分子実体としての融合ポリペプチドの構成要素と比較して、延長された循環半減期及び／または循環中での低い生物学的活性を有し得る。しかし、所望の位置（例えば、腫瘍微小環境）にある場合、リンカーは効率的に切断されて、リンカーによって接続されている構成要素を遊離させ、別個の分子実体として構成要素の半減期及び生物学的活性を回復させるか、またはほぼ回復させることができる。
分離部分は、望ましくは、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、少なくとも４５時間、少なくとも５０時間、少なくとも６０時間、少なくとも６５時間、少なくとも７０時間、少なくとも８０時間、少なくとも９０時間、またはそれ以上、循環中で安定なままである。
いくつかの実施形態では、分離部分は、標的位置と比較して、循環中では、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、２０％、５％、または１％未満で切断される。分離部分はまた、リンカーを切断することができる酵素の非存在下でも安定である。しかしながら、好適な酵素（すなわち、プロテアーゼ）にさらされると、分離部分が切断され、連結されたドメインが分離される。
Ｆ．医薬組成物
本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を含む医薬組成物、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはこのベクターによって形質転換された宿主細胞及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体も、本明細書に提供する。
本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を含む医薬組成物、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはこのベクターによって形質転換された宿主細胞及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体も、本明細書に提供する。
本明細書において、本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤または組成物を提供する。本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を含む組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適している。用語「薬学的に許容される担体」には、成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される対象に対して毒性ではない任意の担体が含まれるが、これらに限定されない。好適な薬学的担体の例は、当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物はまた、防腐剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによって確保され得る。
好適な担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。一般的には、適切な量の薬理学的に許容される塩を製剤中に用いて製剤を等張性にするが、所望であれば、製剤は高張性または低張性であり得る。薬理学的に許容される担体の例としては、滅菌水、生理食塩水、リンゲル液のような緩衝液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは一般に、約５～約８または約７～７．５である。他の担体には、免疫原性ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス等の徐放性調製物が含まれる。マトリクスは、例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子などの成形物品の形態にある。例えば、投与経路及び投与する組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましい場合がある。担体は、ヒトまたは他の対象に対するＩＬ－１２またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体またはＩＬ－１２またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体をコードする核酸配列の投与に適した担体である。
医薬組成物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、ナノ粒子にカプセル化する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、またはナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体をリポソームに結合させる。いくつかの例では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、リポソームの表面に複合体化する。いくつかの例では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、リポソームのシェル内にカプセル化する。いくつかの例では、リポソームはカチオン性リポソームである。
本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、医薬品としての使用が意図されている。投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって行われる。いくつかの実施形態では、投与経路は、治療の種類及び医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは、主治医及び他の臨床的要因によって決定される。１人の患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与する特定の化合物、投与の時間と経路、治療の種類、全般的な健康状態、及び同時に投与される他の薬剤など、多くの要因によって異なる。「有効用量」とは、疾患の経過及び重症度に影響を与え、そのような病状の軽減または寛解をもたらすのに十分な活性成分の量を指し、既知の方法を使用して決定され得る。
任意選択で、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－１２ポリペプチドをコードする核酸配列を、ベクターによって投与する。任意選択で、ＩＬ－２３ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチドをコードする核酸配列を、ベクターによって投与する。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、例えば、発現ベクターを介して、核酸分子及び／またはポリペプチドを細胞に送達するために用いることができる、多数の組成物及び方法がある。これらの方法及び組成物は、ウイルスベースの送達系と非ウイルスベースの送達系の２つの種類に大別することができる。そのような方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載する組成物及び方法とともに使用するために容易に適合可能である。そのような組成物及び方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞をトランスフェクトまたは形質導入するため、例えば、コードされたキメラポリペプチドを発現し、好ましくは分泌する細胞株を製造するため、または核酸を対象に治療的に送達するために使用することができる。本明細書に開示されるＩＬ－１２ポリペプチドまたはＩＬ－２３ポリペプチドの構成要素は、通常、融合タンパク質をコードするようにインフレームで作動可能に連結される。
本明細書で使用する場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示される核酸を分解されない状態で細胞に輸送し、かつ、送達先の細胞に核酸分子及び／またはポリペプチドの発現をもたらすプロモーターを含む物質である。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビス、及び他のＲＮＡウイルスなどであり、これらのウイルスでＨＩＶ骨格を有するものが含まれる。また、これらのウイルスの特性を共有し、ベクターとしての使用に適した任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスベクターは、概説及びその製造方法が、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）に記載されている。複製欠損型アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２１３－２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．６：２８７２－８３（１９８６）；Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７－７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２２６－３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８－７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの利点及び用途は、それらが最初の感染細胞内で複製することができるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないため、他の細胞型に伝播することができる範囲が制限されることである。組換え型アデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、及び他の多くの組織部位への直接のｉｎ ｖｉｖｏ送達後に高効率を達成することが示されている。他の有用な系として、例えば、複製ワクシニアウイルスベクター及び宿主限定非複製ワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
提供されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体及び／または核酸分子は、ウイルス様粒子を介して送達することができる。提供されるＩＬ－２３ポリペプチド複合体及び／または核酸分子は、ウイルス様粒子を介して送達することができる。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスタンパク質（複数可）からなる。ウイルス様粒子を作製及び使用するための方法は、例えば、Ｇａｒｃｅａ ａｎｄ Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５１３－７（２００４）に記載されている。
本明細書に開示されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、サブウイルスデンスボディ（ＤＢ）によって送達され得る。ＤＢは、膜融合によってタンパク質を標的細胞に輸送する。ＤＢを作製及び使用するための方法は、例えば、Ｐｅｐｐｅｒｌ－Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２７８－８４（２００３）に記載されている。提供されるポリペプチドは、外被凝集体によって送達することができる。外被凝集体を作製及び使用するための方法は、国際公開公報第ＷＯ２００６／１１０７２８号に記載されている。
非ウイルス系送達方法には、核酸分子及びポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含めることができ、ここで、核酸は、発現制御配列に機能的に連結される。好適なベクター骨格には、例えば、プラスミド、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣなどの当技術分野で日常的に使用されるものが含まれる。多数のベクター及び発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）などの企業から市販されている。ベクターは、通常、１つ以上の調節領域を含有する。調節領域には、限定されないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、及びイントロンが含まれる。そのようなベクターはまた、ＣＨＯ細胞などの好適な宿主細胞で発現させることによって、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を作製するために使用することもできる。
哺乳類宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源から得てよく、例えば、ポリオーマウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルスのゲノムから得るか、または異種哺乳類プロモーター、例えば、β－アクチンプロモーターもしくはＥＦ１αプロモーターから得るか、またはハイブリッドもしくキメラプロモーター（例えば、β－アクチンプロモーターに融合させたＣＭＶプロモーター）から得てよい。当然のことながら、宿主細胞または関連種由来のプロモーターもまた本明細書では有用である。
エンハンサーとは、一般に、機能する転写開始部位からの距離が一定ではなく、転写単位に対して５’でも３’でもあり得るＤＮＡ配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内部にあり得、またコード配列自体の内部にもあり得る。それらは、通常、長さが１０～３００塩基対（ｂｐ）であり、シスで機能する。エンハンサーは通常、近傍のプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーには、転写の調節を媒介する応答配列を含有させることもできる。哺乳類の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られており、通常、一般的な発現には真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーター及び／またはエンハンサーは誘導性であり得る（例えば、化学的または物理的に調節される）。化学的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、または金属の存在によって調節され得る。物理的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、温度及び光などの環境要因によって調節され得る。任意選択で、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、構成的プロモーター及び／またはエンハンサーとして作用して、転写される転写単位の領域の発現を最大化することができる。特定のベクターでは、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、細胞型特異的な様態で活性であり得る。任意選択で、特定のベクターでは、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、細胞型に関係なく、すべての真核細胞において活性であり得る。この種の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、及びレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）である。
ベクターにはまた、例えば、複製起点及び／またはマーカーも含めることができる。マーカー遺伝子は、細胞に対し、選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性などを付与することができる。マーカー産物は、ベクターが細胞に送達されたかどうか、送達された後は、それが発現されているかどうかを判定するために使用される。哺乳類細胞の選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、及びブラストサイジンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生き残ることができる。他のマーカーの例として、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェラーゼが挙げられる。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を容易にするように設計されたタグ配列が含まれ得る。タグ配列、例えば、ＧＦＰ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ；Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）などの配列は、通常、コードされたポリペプチドとの融合体として発現させる。そのようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含め、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
Ｇ．治療への適用
本明細書ではまた、本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的抗原に関連する疾患、障害または病態の治療のための方法及び使用も提供する。疾患、障害、または病態には、がん、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症（すなわち、細菌、ウイルス、または寄生虫疾患）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、疾患、障害、または病態は、がんである。
本明細書ではまた、本明細書に記載のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的抗原に関連する疾患、障害または病態の治療のための方法及び使用も提供する。疾患、障害、または病態には、がん、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症（すなわち、細菌、ウイルス、または寄生虫疾患）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、疾患、障害、または病態は、がんである。
任意の好適ながんは、本明細書に提供されるＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体で治療され得る。例示的な好適ながんとして、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管癌、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭頸部癌、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、口唇癌及び口腔癌、肝臓癌、上皮内小葉癌、肺癌、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頸部癌、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線管癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、鼻腔癌及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂癌及び尿管癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、脊髄腫瘍、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。実施形態では、がんは黒色腫または乳癌である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する有効量のＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を対象に投与することによって、それを必要とする対象における免疫応答の増強方法を本明細書に提供する。強化された免疫応答は、がん、腫瘍、またはウイルス性疾患の発症を予防、遅延、または治療し得る。理論に拘束されるものではないが、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、自然免疫及び適応免疫を活性化することによって免疫応答を増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ナチュラルキラー細胞及びＴリンパ球の活性を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体は、ナチュラルキラー細胞ならびにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を誘導することができる。
方法ではさらに、がんを治療する１つ以上の追加の薬剤、例えば、化学療法薬（例えば、アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、チオテパ、メトトレキサート、ビサントレン、ノアントロン（Ｎｏａｎｔｒｏｎｅ）、チグアニン（Ｔｈｉｇｕａｎｉｎｅ）、シタリビン（Ｃｙｔａｒｉｂｉｎｅ）、プロカラビジン（Ｐｒｏｃａｒａｂｉｚｉｎｅ））、腫瘍免疫療法薬（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１、抗ＣＤ４７、抗ＧＤ２）、細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、Ｔ細胞療法）、腫瘍溶解性ウイルス等の投与を行うことを含む。使用可能な抗がん剤の非限定的な例として、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン（Ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ（Ａｚｅｔｅｐａ）；アゾトマイシン（Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カーベタイマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（Ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール（Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；塩酸エソルビシン（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン（Ｅｔｏｐｒｉｎｅ）；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ、すなわちｒＩＬ２を含む），インターフェロンα－２ａ；インターフェロンα－２ｂ；インターフェロンα－ｎｌ インターフェロンα－ｎ３；インターフェロンβ－Ｉａ；インターフェロンγ－Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン（Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；マイトクロミン（Ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）；マイトジリン；マイトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；マイトスパー（Ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパラガーゼ；ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン（Ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）；プレドニムスチン（Ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン（Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バブレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート（Ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ Ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンゾリジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；及び塩酸ゾルビシンなどの抗腫瘍薬が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、特定の疾患、障害、または病態を治療するための薬剤と併用して投与する。薬剤には、抗体、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線療法（γ線、Ｃ線、及び／または放射性同位体、マイクロ波、紫外線などの直接送達）、遺伝子治療（例えば、アンチセンス、レトロウイルス治療など）、及び他の免疫療法を含む療法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体またはＩＬ－２３ポリペプチド複合体を、下痢止め剤、制吐剤、鎮痛剤及び／または非ステロイド性抗炎症剤と併用して投与する。
６．均等物
本明細書に記載された本発明の方法の他の好適な改変及び適合が自明であり、本開示または実施形態の範囲から逸脱することなく好適な均等物を使用して行い得ることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書において、特定の化合物及び方法を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、同じことがより明確に理解されるであろう。これらは例示のみを目的として導入され、限定することを意図するものではない。
本明細書に記載された本発明の方法の他の好適な改変及び適合が自明であり、本開示または実施形態の範囲から逸脱することなく好適な均等物を使用して行い得ることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書において、特定の化合物及び方法を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、同じことがより明確に理解されるであろう。これらは例示のみを目的として導入され、限定することを意図するものではない。
７.実施例
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは決して限定することを意図するものではない。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは決して限定することを意図するものではない。
実施例１：ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１５または４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地中に５０，０００細胞／ウェルの濃度にて懸濁播種し、組換え型ｈＩＬ－１２、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）、活性化可能なキメラＩＬ－１２、または活性化可能なｈＩＬ－１２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて２０～２４時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なｈＩＬ－１２の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ－１２を、活性型ＭＭＰ９またはＣＴＳＬ－１とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ－１２活性を、比色に基づくアッセイである試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量により評価した。結果から、ＩＬ－１２融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図２Ａ～２Ｓに示す。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１５または４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地中に５０，０００細胞／ウェルの濃度にて懸濁播種し、組換え型ｈＩＬ－１２、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）、活性化可能なキメラＩＬ－１２、または活性化可能なｈＩＬ－１２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて２０～２４時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なｈＩＬ－１２の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ－１２を、活性型ＭＭＰ９またはＣＴＳＬ－１とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ－１２活性を、比色に基づくアッセイである試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量により評価した。結果から、ＩＬ－１２融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図２Ａ～２Ｓに示す。
実施例２：ＩＬ－１２ルシフェラーゼレポーターアッセイ
製造業者から「解凍して使用する」形式で購入したＩＬ－１２ルシフェラーゼレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者の指示に従ってプレーティングし、組換えｈＩＬ－１２または活性化可能なｈＩＬ－１２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で６時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なｈＩＬ－１２の活性を試験した。切断型誘導性ＩＬ－１２を、活性型ＭＭＰ９またはＣＴＳＬ－１とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ－１２活性を、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用したルシフェラーゼ活性の定量化によって評価した。これにより、発光読み出しによるルシフェラーゼ活性の測定が可能になる。結果から、ＩＬ－１２タンパク質の融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図３Ａ～３Ｆに示す。
製造業者から「解凍して使用する」形式で購入したＩＬ－１２ルシフェラーゼレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者の指示に従ってプレーティングし、組換えｈＩＬ－１２または活性化可能なｈＩＬ－１２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で６時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なｈＩＬ－１２の活性を試験した。切断型誘導性ＩＬ－１２を、活性型ＭＭＰ９またはＣＴＳＬ－１とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ－１２活性を、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用したルシフェラーゼ活性の定量化によって評価した。これにより、発光読み出しによるルシフェラーゼ活性の測定が可能になる。結果から、ＩＬ－１２タンパク質の融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図３Ａ～３Ｆに示す。
実施例３：ヒトＴ－Ｂｌａｓｔアッセイ
Ｔ－Ｂｌａｓｔは、７２時間のＰＨＡ刺激により、ヒトＰＢＭＣから誘導された。次いで、Ｔ－Ｂｌａｓｔを洗浄し、使用前に凍結した。アッセイのために、Ｔ－Ｂｌａｓｔを解凍し、ヒトアルブミンを含む培地に１００，０００細胞／ウェルで懸濁してプレーティングし、組換えｈＩＬ－１２またはキメラ活性化可能ＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または活性化可能ヒトＩＬ－１２を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間刺激した。非切断型及び切断型のＩＬ－１２融合タンパク質の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ－１２を、活性型ＭＭＰ９またはＣＴＳＬ－１酵素とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ－１２活性を、ｈＩＦＮγ Ａｌｐｈａ－ＬＩＳＡキットを使用した上清中のＩＦＮγ産生の定量によって評価した。結果から、ＩＬ－１２融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図４Ａ～４Ｇに示す。
Ｔ－Ｂｌａｓｔは、７２時間のＰＨＡ刺激により、ヒトＰＢＭＣから誘導された。次いで、Ｔ－Ｂｌａｓｔを洗浄し、使用前に凍結した。アッセイのために、Ｔ－Ｂｌａｓｔを解凍し、ヒトアルブミンを含む培地に１００，０００細胞／ウェルで懸濁してプレーティングし、組換えｈＩＬ－１２またはキメラ活性化可能ＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または活性化可能ヒトＩＬ－１２を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間刺激した。非切断型及び切断型のＩＬ－１２融合タンパク質の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ－１２を、活性型ＭＭＰ９またはＣＴＳＬ－１酵素とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ－１２活性を、ｈＩＦＮγ Ａｌｐｈａ－ＬＩＳＡキットを使用した上清中のＩＦＮγ産生の定量によって評価した。結果から、ＩＬ－１２融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図４Ａ～４Ｇに示す。
実施例４：ＭＭＰ９プロテアーゼによる融合タンパク質のプロテアーゼ切断
当業者であれば、タンパク質切断アッセイを設定する方法に精通しているであろう。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１００μｇのタンパク質を１μｇの活性ＭＭＰ９（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＡＥ００７８－５０またはＥｎｚｏカタログＢＭＬ－ＳＥ３６０）で切断し、室温で最大１６時間インキュベートした。消化されたタンパク質を、その後、機能解析で使用するか、または試験前に－８０℃で保存した。当技術分野で周知の方法を使用してＳＤＳ ＰＡＧＥにより切断の程度をモニタリングした。ＭＭＰ９による融合タンパク質の完全な切断が認められた。
当業者であれば、タンパク質切断アッセイを設定する方法に精通しているであろう。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１００μｇのタンパク質を１μｇの活性ＭＭＰ９（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＡＥ００７８－５０またはＥｎｚｏカタログＢＭＬ－ＳＥ３６０）で切断し、室温で最大１６時間インキュベートした。消化されたタンパク質を、その後、機能解析で使用するか、または試験前に－８０℃で保存した。当技術分野で周知の方法を使用してＳＤＳ ＰＡＧＥにより切断の程度をモニタリングした。ＭＭＰ９による融合タンパク質の完全な切断が認められた。
実施例５：哺乳類宿主細胞株における発現比較
ヒトｐ４０及びｐ３５サブユニットが非切断性リンカーによって接続されているＩＬ－１２融合タンパク質であるＷＷ０６６３の発現プラスミドを、哺乳類発現宿主細胞株に一過性にトランスフェクトし、プロテインＡクロマトグラフィーによって細胞上清から精製した。同様に、ＷＷ０７５０及びＷＷ０６３６の発現プラスミドを、上記と同じ親哺乳動物宿主細胞株に一過性に同時トランスフェクトしてＩＬ－１２融合タンパク質を発現させたが、ヒトｐ４０及びｐ３５サブユニットは、リンカー配列によって接続されておらず、天然のジスルフィド結合によって組み立てられた。ＷＷ０７５０／ＷＷ０６３６をプロテインＡクロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。ＷＷ０６６３とＷＷ０７５０／ＷＷ０６３６の両方を、非還元及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で実施して、適切な組立て及び任意の意図しない切断産物を比較した（図５）。ＷＷ０６６３では、意図しない分子量のフラグメント（切断産物）が２つ存在する。さらに、還元条件ではＷＷ０６６３のインタクトなバンドが減少しており、これは、ｐ４０サブユニットとｐ３５サブユニットの間のリンカーまたはその近位で意図しない切断があり、２つの等しいサイズの生成物（レーン４に示す最小分子量）が生成し、ｐ４０／ｐ３５ジスルフィドバンドの還元によってｐ４０とｐ３５が切り離されていることが示唆されている。ＷＷ０７５０／ＷＷ０６３６の還元条件及び非還元条件（それぞれ、レーン６及び７）は、予想されるサイズを示している。
ヒトｐ４０及びｐ３５サブユニットが非切断性リンカーによって接続されているＩＬ－１２融合タンパク質であるＷＷ０６６３の発現プラスミドを、哺乳類発現宿主細胞株に一過性にトランスフェクトし、プロテインＡクロマトグラフィーによって細胞上清から精製した。同様に、ＷＷ０７５０及びＷＷ０６３６の発現プラスミドを、上記と同じ親哺乳動物宿主細胞株に一過性に同時トランスフェクトしてＩＬ－１２融合タンパク質を発現させたが、ヒトｐ４０及びｐ３５サブユニットは、リンカー配列によって接続されておらず、天然のジスルフィド結合によって組み立てられた。ＷＷ０７５０／ＷＷ０６３６をプロテインＡクロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。ＷＷ０６６３とＷＷ０７５０／ＷＷ０６３６の両方を、非還元及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で実施して、適切な組立て及び任意の意図しない切断産物を比較した（図５）。ＷＷ０６６３では、意図しない分子量のフラグメント（切断産物）が２つ存在する。さらに、還元条件ではＷＷ０６６３のインタクトなバンドが減少しており、これは、ｐ４０サブユニットとｐ３５サブユニットの間のリンカーまたはその近位で意図しない切断があり、２つの等しいサイズの生成物（レーン４に示す最小分子量）が生成し、ｐ４０／ｐ３５ジスルフィドバンドの還元によってｐ４０とｐ３５が切り離されていることが示唆されている。ＷＷ０７５０／ＷＷ０６３６の還元条件及び非還元条件（それぞれ、レーン６及び７）は、予想されるサイズを示している。
実施例６：ＭＣ３８実験（研究ＭＣ３８－ｅ４９３）
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖及び体重に影響を与える能力を調べた。
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖及び体重に影響を与える能力を調べた。
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。３２６匹のＣＲメスＣ５７ＢＬ／６マウスを、側腹皮下への５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞含有０％マトリゲルにより準備した。細胞注入量は０．１ｍＬ／マウスであった。マウスは開始日に８～１２週齢であった。腫瘍が平均サイズ１００～１５０ｍｍ３に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始１日目である。体重は、開始時、その後は週２回、終了まで測定した。キャリパーでの測定を週２回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。２５％超の体重減少が１回観察されたか、または２０％超の体重減少が３回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超のいかなる群も投与を中止し；その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が２０％超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の１０％以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復％の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が１５００ｍｍ３または４０日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。
実施例７：ＭＣ３８実験（研究ＭＣ３８－ｅ４９５）
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖及び体重に影響を与える能力を調べた。
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖及び体重に影響を与える能力を調べた。
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。３２６匹のＣＲメスＣ５７ＢＬ／６マウスを、側腹皮下への５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞含有０％マトリゲルにより準備した。細胞注入量は０．１ｍＬ／マウスであった。マウスは開始日に８～１２週齢であった。腫瘍が平均サイズ１００～１５０ｍｍ３に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始１日目である。体重は、開始時、その後は週２回、終了まで測定した。キャリパーでの測定を週２回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。２５％超の体重減少が１回観察されたか、または２０％超の体重減少が３回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超のいかなる群も投与を中止し；その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が２０％超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の１０％以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復％の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が１５００ｍｍ３または４０日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。
実施例８：ＭＣ３８実験（研究ＭＣ３８－ｅ５０３）
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖及び体重に影響を与える能力を調べた。
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖及び体重に影響を与える能力を調べた。
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。３２６匹のＣＲメスＣ５７ＢＬ／６マウスを、側腹皮下への５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞含有０％マトリゲルにより準備した。細胞注入量は０．１ｍＬ／マウスであった。マウスは開始日に８～１２週齢であった。腫瘍が平均サイズ１００～１５０ｍｍ３に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。学習開始１日目である。体重は、開始時、その後は週２回、終了まで測定した。キャリパーでの測定を週２回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。２５％超の体重減少が１回観察されたか、または２０％超の体重減少が３回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超のいかなる群も投与を中止し；その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が２０％超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の１０％以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復％の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が１５００ｍｍ３または４０日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。
実施例９：オクテット結合動態アッセイ
ＫＤ測定を、ｓｃＦｖを用いて多濃度動態を使用して実行した。ヒトＩＬ－１２に対する結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定した。センサー上の６×Ｈｉｓタグ付き（配列番号４４６）ｓｃＦｖを捕捉し、続いてＩＬ－１２の結合／解離を捕捉する戦略を使用した。アッセイ緩衝液として１×動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、ＢＬＩ分析を３０℃で実施した。Ｎｉ－ＮＴＡ（ＮＴＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、最初にアッセイ緩衝液に５分超の間、浸した。被験ｓｃＦｖ（５μｇ／ｍＬ）を、センサー上で３００秒間捕捉した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液に１２０秒間浸してベースラインを確立した後、ＩＬ－１２への結合を測定した。次いでセンサーを様々な濃度のＩＬ－１２（５０～０．７８ｎＭ、アッセイ緩衝液で２倍希釈）及び参照減算補正用のブランク緩衝液ウェルに３００秒間浸して、関連性を測定した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液に３００秒間浸すことにより、ＩＬ－１２の解離を測定した。すべてのステップでの攪拌は１０００ｒｐｍであった。動態パラメータは、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン８．２を使用して、参照減算補正（緩衝液へのｓｃＦｖの「結合」）、ステップ間補正に基づく解離、１対１結合モデル、及びグローバルフィット（センサーによってリンクされていないＲｍａｘ）を使用して生成した。ＫＤ値を表７に示す。
表７．ｓｃＦｖ ＩＬ－１２遮断因子動態の要約
ＫＤ測定を、ｓｃＦｖを用いて多濃度動態を使用して実行した。ヒトＩＬ－１２に対する結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定した。センサー上の６×Ｈｉｓタグ付き（配列番号４４６）ｓｃＦｖを捕捉し、続いてＩＬ－１２の結合／解離を捕捉する戦略を使用した。アッセイ緩衝液として１×動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、ＢＬＩ分析を３０℃で実施した。Ｎｉ－ＮＴＡ（ＮＴＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、最初にアッセイ緩衝液に５分超の間、浸した。被験ｓｃＦｖ（５μｇ／ｍＬ）を、センサー上で３００秒間捕捉した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液に１２０秒間浸してベースラインを確立した後、ＩＬ－１２への結合を測定した。次いでセンサーを様々な濃度のＩＬ－１２（５０～０．７８ｎＭ、アッセイ緩衝液で２倍希釈）及び参照減算補正用のブランク緩衝液ウェルに３００秒間浸して、関連性を測定した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液に３００秒間浸すことにより、ＩＬ－１２の解離を測定した。すべてのステップでの攪拌は１０００ｒｐｍであった。動態パラメータは、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン８．２を使用して、参照減算補正（緩衝液へのｓｃＦｖの「結合」）、ステップ間補正に基づく解離、１対１結合モデル、及びグローバルフィット（センサーによってリンクされていないＲｍａｘ）を使用して生成した。ＫＤ値を表７に示す。
表７．ｓｃＦｖ ＩＬ－１２遮断因子動態の要約
実施例１０：ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２３レポーターアッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ２３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養液に５０，０００細胞／ウェルの密度で懸濁して播種し、組換えマウスＩＬ－２３または半減期延長マウスＩＬ２３（抗ＨＳＡ－Ｌ－ｍＩＬ２３）の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で２０～２４時間刺激した。ＩＬ－２３活性を、比色に基づくアッセイである試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量により評価した。結果を図４０Ａ及び４０Ｂに示す。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ２３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むまたは含まない培養液に５０，０００細胞／ウェルの密度で懸濁して播種し、組換えマウスＩＬ－２３または半減期延長マウスＩＬ２３（抗ＨＳＡ－Ｌ－ｍＩＬ２３）の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で２０～２４時間刺激した。ＩＬ－２３活性を、比色に基づくアッセイである試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量により評価した。結果を図４０Ａ及び４０Ｂに示す。
実施例１１：半減期延長ＩＬ－２３タンパク質ＷＷ５００９を使用したＭＣ３８効力試験
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒメスＣ５７ＢＬ／６マウスを、側腹皮下への５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞含有０％マトリゲルにより準備した。細胞注入量は０．１ｍＬ／マウスであった。マウスは開始日に８～１２週齢であった。腫瘍が平均サイズ１００～１５０ｍｍ３に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。体重は、開始時、その後は週２回、終了まで測定した。キャリパーでの測定を週２回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。３０％超の体重減少が１回観察されたか、または２５％超の体重減少が３回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超のいかなる群も投与を中止し；その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が２０％超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の１０％以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復％の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が１５００ｍｍ３または４５日目のいずれか早く達した方とした。レスポンダーを、その後も追跡した。終点に達した際、動物を安楽死させた。結果を図４９Ａ、４９Ｂ、及び５０Ａ～５０Ｄに示す。
実施例１２：ＣＴ２６実験（研究 ＣＴ２６－ｅ６７６）
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＣＴ２６細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるＣＴ２６細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
３０匹のＣＲメスＢＡＬＢ／ｃマウスを、側腹皮下への３×１０５のＣＴ２６腫瘍細胞含有０％マトリゲルにより準備した。細胞注入量は０．１ｍＬ／マウスであった。マウスは開始日に８～１２週齢であった。腫瘍が平均サイズ３０～６０ｍｍ３に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始１日目である。キャリパーでの測定を週２回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。２５％超の体重減少が１回観察されたか、または２０％超の体重減少が３回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超のいかなる群も投与を中止し；その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が２０％超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の１０％以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復％の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が２０００ｍｍ３または２２日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。結果を図４１、及び図４２Ａ～４２Ｃに示す。
実施例１３：Ｂ１６Ｆ１０実験（研究 Ｂ１６Ｆ１０－ＩＴＡＡ－０２１５）
急速に増殖するメラノーマ細胞株であるＢ１６Ｆ１０細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
急速に増殖するメラノーマ細胞株であるＢ１６Ｆ１０細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
３０匹のＣＲメスＣ５７Ｂｌ／６マウスを、側腹皮下への１×１０５のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞含有５０％マトリゲルにより準備した。細胞注入量は０．１ｍＬ／マウスであった。マウスは開始日に８～１２週齢であった。腫瘍が平均サイズ１００ｍｍ３に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始１日目である。キャリパーでの測定を週２回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。２５％超の体重減少が１回観察されたか、または２０％超の体重減少が３回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超のいかなる群も投与を中止し；その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が２０％超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の１０％以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復％の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が２０００ｍｍ３または２２日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。結果を図４３、及び図４４Ａ～４４Ｃに示す。
実施例１４：ＥＭＴ６実験（研究 ＥＭＴ６－ＩＴＡＡ－０２１６）
急速増殖性の乳房腺癌細胞株であるＥＭＴ６細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
急速増殖性の乳房腺癌細胞株であるＥＭＴ６細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
３０匹のＣＲメスＢＡＬＢ／ｃマウスを、側腹皮下への１×１０５のＥＭＴ６腫瘍細胞含有５０％マトリゲルにより準備した。細胞注入量は０．１ｍＬ／マウスであった。マウスは開始日に８～１２週齢であった。腫瘍が平均サイズ１００ｍｍ３に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始１日目である。キャリパーでの測定を週２回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。２５％超の体重減少が１回観察されたか、または２０％超の体重減少が３回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超のいかなる群も投与を中止し；その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が２０％超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の１０％以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復％の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が２０００ｍｍ３または２２日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。結果を図４５、及び図４６Ａ～４６Ｃに示す。
実施例１５：全腫瘍ＲＮＡのナノストリング分析
処置した動物からマウス腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液に解離した。簡潔に述べると、酵素的に消化する前に、腫瘍を５ｍｍ３未満に細かく刻んだ。試料を３ｍｇ／ｍコラゲナーゼＩＶと共に３７℃で３５分間振とうした後、７０μＭナイロンメッシュフィルターで機械的に分離した。次いで、試料を洗浄して計数し、各試料から合計３～５ｅ５の生細胞をスピンダウンし、後のＲＮＡ抽出のためにＲＬＴ＋緩衝液中で凍結させた。ＲＮＡの分離とナノストリング処理は、ＬａｋｅＰｈａｒｍａによって実行した。ＲＮＥａｓｙ Ｍｉｃｒｏキットを使用して製造元のプロトコルに従ってＲＮＡを分離し、マウスＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｃｏｄｅｓｅｔを使用して１００ｎｇの全ＲＮＡをｎＣｏｕｎｔｅｒシステム上で流した。高度な分析モジュールがインストールされたｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアを使用して、Ｗｅｒｅｗｏｌｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによってデータ分析を実施した。すべての統計解析は、ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアから取得している（ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェア用のｎＣｏｕｎｔｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２．０ Ｐｌｕｇｉｎ，ユーザーマニュアル，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０１８を参照のこと）。ヒートマップ及び他のグラフは、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して生成した。
処置した動物からマウス腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液に解離した。簡潔に述べると、酵素的に消化する前に、腫瘍を５ｍｍ３未満に細かく刻んだ。試料を３ｍｇ／ｍコラゲナーゼＩＶと共に３７℃で３５分間振とうした後、７０μＭナイロンメッシュフィルターで機械的に分離した。次いで、試料を洗浄して計数し、各試料から合計３～５ｅ５の生細胞をスピンダウンし、後のＲＮＡ抽出のためにＲＬＴ＋緩衝液中で凍結させた。ＲＮＡの分離とナノストリング処理は、ＬａｋｅＰｈａｒｍａによって実行した。ＲＮＥａｓｙ Ｍｉｃｒｏキットを使用して製造元のプロトコルに従ってＲＮＡを分離し、マウスＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｃｏｄｅｓｅｔを使用して１００ｎｇの全ＲＮＡをｎＣｏｕｎｔｅｒシステム上で流した。高度な分析モジュールがインストールされたｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアを使用して、Ｗｅｒｅｗｏｌｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによってデータ分析を実施した。すべての統計解析は、ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェアから取得している（ｎＳｏｌｖｅｒソフトウェア用のｎＣｏｕｎｔｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２．０ Ｐｌｕｇｉｎ，ユーザーマニュアル，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０１８を参照のこと）。ヒートマップ及び他のグラフは、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して生成した。
実施例１６：マウス腫瘍処理及びフローサイトメトリー分析
ＭＣ３８腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスに移植し、平均サイズ１５０ｍｍ３まで成長させた後、マウスを無作為に処置群に分けた（０日目）。１日目及び４日目にマウスをビヒクルまたは減弱化ＩＬ－１２で腹腔内注射により処置し、２回目の投与の２４時間後に腫瘍を採取した（５日目）。腫瘍を採取し、フェノールフリーのＲＰＭＩ中で酵素的に消化する前に、５ｍｍ３未満に細かく刻んだ。試料を３ｍｇ／ｍコラゲナーゼＩＶと共に３７℃で３５分間振とうした後、７０μＭナイロンメッシュフィルターで機械的に分離した。次いで、試料を洗浄し、計数し、フローサイトメトリー分析のためにプレーティングした。９６ウェル丸底プレートに１ウェルあたり最大５×１０６個の細胞を播種した。細胞内サイトカイン染色では、染色前に、試料をホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、及びブレフェルジンＡで４時間刺激した。細胞染色では、まずＦＣ受容体をブロッキングした後、細胞外マーカーを染色した。細胞外染色の後、細胞を洗浄、固定、及び透過処理し、その後、細胞内マーカーを染色した。ＳｐｅｃｔｒｏＦｌｏ（登録商標）ソフトウェアを実行するＣｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａシステム上で試料を流し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析した。すべてのグラフと統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実行した。
ＭＣ３８腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスに移植し、平均サイズ１５０ｍｍ３まで成長させた後、マウスを無作為に処置群に分けた（０日目）。１日目及び４日目にマウスをビヒクルまたは減弱化ＩＬ－１２で腹腔内注射により処置し、２回目の投与の２４時間後に腫瘍を採取した（５日目）。腫瘍を採取し、フェノールフリーのＲＰＭＩ中で酵素的に消化する前に、５ｍｍ３未満に細かく刻んだ。試料を３ｍｇ／ｍコラゲナーゼＩＶと共に３７℃で３５分間振とうした後、７０μＭナイロンメッシュフィルターで機械的に分離した。次いで、試料を洗浄し、計数し、フローサイトメトリー分析のためにプレーティングした。９６ウェル丸底プレートに１ウェルあたり最大５×１０６個の細胞を播種した。細胞内サイトカイン染色では、染色前に、試料をホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、及びブレフェルジンＡで４時間刺激した。細胞染色では、まずＦＣ受容体をブロッキングした後、細胞外マーカーを染色した。細胞外染色の後、細胞を洗浄、固定、及び透過処理し、その後、細胞内マーカーを染色した。ＳｐｅｃｔｒｏＦｌｏ（登録商標）ソフトウェアを実行するＣｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａシステム上で試料を流し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析した。すべてのグラフと統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実行した。
８．構築物の順列
表８に示すポリペプチド構築物のエレメントは、以下の略語を含む：それぞれリンカーを指す「Ｌ」、「Ｘ」、「ＬＸ」、及び「ＸＬ」。「Ｘ」は、切断性リンカーを指す。「Ｌ」は、任意選択で切断性リンカーを指す。Ｌがポリペプチド中の唯一のリンカーである場合、Ｌは切断可能である。「ＬＸ」または「ＸＬ」はそれぞれ、それに隣接する拡張された非切断性配列を有する切断性リンカーを指す。リンカー１は、ＭＭＰ９基質モチーフ配列を含むリンカーを指し、リンカー２は、ＭＭＰ１４基質モチーフ配列を含むリンカーを指す。リンカー３は、ＣＴＳＬ－１基質モチーフ配列を含むリンカーを指す。
表８に示すポリペプチド構築物のエレメントは、以下の略語を含む：それぞれリンカーを指す「Ｌ」、「Ｘ」、「ＬＸ」、及び「ＸＬ」。「Ｘ」は、切断性リンカーを指す。「Ｌ」は、任意選択で切断性リンカーを指す。Ｌがポリペプチド中の唯一のリンカーである場合、Ｌは切断可能である。「ＬＸ」または「ＸＬ」はそれぞれ、それに隣接する拡張された非切断性配列を有する切断性リンカーを指す。リンカー１は、ＭＭＰ９基質モチーフ配列を含むリンカーを指し、リンカー２は、ＭＭＰ１４基質モチーフ配列を含むリンカーを指す。リンカー３は、ＣＴＳＬ－１基質モチーフ配列を含むリンカーを指す。
Claims (110)
- ＩＬ－１２、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが、ＩＬ－１２またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体であり、前記複合体が：
ｉ． ＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択で前記ＩＬ－１２遮断エレメントを含む第１のポリペプチドであって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド；
ｉｉ． 第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択で前記ＩＬ－１２遮断エレメントを含む第２のポリペプチド鎖であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して、前記ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結するか、または任意選択でプロテアーゼ切断性であるリンカーを介して、前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第２のポリペプチド鎖を含み；
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの一方のみが前記ＩＬ－１２遮断エレメントを含み；
前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ３５の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ４０であり、前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ４０の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ３５である、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第１のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項１に記載のポリペプチド。
- ＩＬ－１２、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｉ． ＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第１のポリペプチドであって、前記半減期延長エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド；
ｉｉ． ＩＬ－１２サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分または抗体重鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第２のポリペプチドであって；前記半減期延長エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結し、前記抗体重鎖または前記抗体軽鎖が、ａ）第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－１２サブユニットと作動可能に連結するか、またはｂ）任意選択で切断可能性リンカーを介して前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第２のポリペプチド；ならびに
ｉｉｉ． 前記第２のポリペプチドの前記軽鎖に相補的である抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分、または前記第２のポリペプチドの前記重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－１２結合部位を形成する抗体軽鎖を含む、第３のポリペプチドを含み；
前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ３５の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ４０であり、前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ４０の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ３５である、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第１のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項３に記載のポリペプチド。
- ＩＬ－１２、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｉ． ｐ３５、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第１のポリペプチド鎖であって、ｐ３５及びｐ４０が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結するか；または、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド鎖；ならびに
ｉｉ． 第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－１２結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第２のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド複合体。 - ＩＬ－１２、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｉｉｉ． ｐ３５、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第１のポリペプチド鎖であって、ｐ３５及びｐ４０が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結するか；または、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド鎖；ならびに
ｉｖ． 第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの重鎖に相補的であり、抗体軽鎖と一緒になってＩＬ－１２結合部位を形成する前記軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第２のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第１のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項５または６に記載のポリペプチド。
- 前記第１のポリペプチドが、遮断エレメントを含まず、前記第２のポリペプチドが、式：
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｂ］－［Ｌ３］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ３］－［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］または［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｄ］または
［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｂ］を有し、式中、
Ａが、前記ＩＬ－１２サブユニットであり；
Ｌ１が、前記第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｌ２が、前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｌ３が、前記任意選択で切断可能性リンカーであり；
Ｂが、前記半減期延長エレメントであり；
Ｄが、前記遮断エレメントである、請求項１または３に記載のポリペプチド複合体。 - 前記第１のポリペプチドが、式：
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］を含み；前記第２のポリペプチドが、式：
［Ａ’］－［Ｌ２］－［Ｂ］または［Ｂ］－［Ｌ２］－［Ａ’］を有し、式中、
Ａが、ｐ３５またはｐ４０のいずれかであり、Ａがｐ３５の場合、Ａ’がｐ４０であり、Ａがｐ４０の場合、Ａ’がｐ３５であり；
Ａ’が、ｐ３５またはｐ４０のいずれかであり；
Ｌ１が、前記第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｌ２が、前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｂが、前記半減期延長エレメントであり；
Ｄが、前記遮断エレメントである、請求項１に記載のポリペプチド複合体。 - 前記第１のポリペプチドが、式：［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｂ］または［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］を含み；前記第２のポリペプチドが、式［Ａ’］－［Ｌ２］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ａ’］を有し、式中、
Ａが、ｐ３５またはｐ４０のいずれかであり；
Ａ’が、ｐ３５またはｐ４０のいずれかであり、Ａがｐ３５の場合、Ａ’がｐ４０であり、Ａがｐ４０の場合、Ａ’がｐ３５であり；
Ｌ１が、前記第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｌ２が、前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｂが、前記半減期延長エレメントであり；
Ｄが、前記遮断エレメントである、請求項３に記載のポリペプチド複合体。 - 前記半減期延長エレメントが、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンＦｃもしくはそのフラグメントである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシン、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ、ＦＡＰ、プラスミノーゲン活性化因子、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍プロテアーゼから選択されるプロテアーゼによって切断され得る配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼが、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、またはカテプシンＧから選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４であるＭＭＰから選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、プロテアーゼによって独立して切断され得る少なくとも２つの配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、合成配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーのそれぞれが、２つ以上の異なるプロテアーゼによって切断される、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記単鎖抗体が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載のポリペプチド複合体。
- 前記抗体の抗原結合フラグメントがＦａｂである、請求項３、５または６に記載のポリペプチド複合体。
- 前記遮断エレメントが、前記ＩＬ－１２に結合する、請求項１、３、５、または６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記遮断エレメントが、ｐ３５、ｐ４０、またはｐ３５ｐ４０複合体に結合する、請求項１７または１８に記載のポリペプチド複合体。
- 請求項１～２１のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする核酸。
- 前記核酸が、ｐ３５またはｐ４０のみをコードしない、請求項２２に記載の核酸。
- ＩＬ－１２、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが、ＩＬ－１２またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体であり、前記複合体が：
ｉｉｉ． ＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択で前記ＩＬ－１２遮断エレメントを含む第１のポリペプチドであって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド；
ｉｖ． 第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択で前記ＩＬ－１２遮断エレメントを含む第２のポリペプチド鎖であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して、前記ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結するか、または任意選択でプロテアーゼ切断性であるリンカーを介して、前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第２のポリペプチド鎖を含み；
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの一方のみが前記ＩＬ－１２遮断エレメントを含み；
前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ３５の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ４０であり、前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ４０の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ３５である、前記核酸組成物。 - ＩＬ－１２、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｉ． ＩＬ－１２サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第１のポリペプチドであって、前記半減期延長エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド；
ｉｉ． ＩＬ－１２サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第２のポリペプチドであって；前記半減期延長エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－１２サブユニットに作動可能に連結し、前記抗体重鎖または前記抗体軽鎖が、ａ）第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－１２サブユニットと作動可能に連結するか、またはｂ）任意選択で切断可能性リンカーを介して前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第２のポリペプチド；ならびに
ｉｉｉ． 前記第２のポリペプチドの前記軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－１２結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、第３のポリペプチドを含み、
前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ３５の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ４０であり、前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ４０の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－１２サブユニットがｐ３５である、前記核酸組成物。 - ＩＬ－１２、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｉ． ｐ３５、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第１のポリペプチド鎖であって、ｐ３５及びｐ４０が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結するか；または、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド鎖；ならびに
ｉｉ． 第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－１２結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第２のポリペプチドを含む、前記核酸組成物。 - ＩＬ－１２、半減期延長エレメント、ＩＬ－１２遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記ＩＬ－１２遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｉｉｉ． ｐ３５、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第１のポリペプチド鎖であって、ｐ３５及びｐ４０が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結するか；または、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ３５に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド鎖；ならびに
ｉｖ． 第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記重鎖と一緒になってＩＬ－１２結合部位を形成する抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第２のポリペプチドを含む、前記核酸組成物。 - 環状ベクターを含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- ＤＮＡを含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- ＲＮＡを含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 請求項２２～２７のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項３１に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で、請求項３２に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の製造方法。
- 前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
- 請求項１～２１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体または請求項２２～３１のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬組成物。
- 請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の核酸、請求項３１に記載の発現ベクター、または請求項３４に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
- 配列番号９５～１１０、配列番号１１９～１２６、及び配列番号１３５～１４３からなる群、または配列番号９５～１１０、配列番号１１９～１２６、及び配列番号１３５～１４３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第１のポリペプチドを含む、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体。
- 配列番号１０４または配列番号１３６を含む第１のポリペプチドを含む、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体。
- 配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む、ＩＬ－１２ポリペプチド複合体。
- 配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む、ポリペプチド複合体。
- 配列番号７、９、１０、１８、２４～９４、配列番号１１０～１１８、及び配列番号１２７～１３４からなる群から選択されるアミノ酸を含むか、または配列番号７、９、１０、１８、２４～９４、配列番号１１０～１１８、及び配列番号１２７～１３４に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単鎖ＩＬ－１２誘導性ポリペプチド。
- ｐ３５、ｐ４０、遮断エレメント、及び半減期延長エレメントを含む誘導性ＩＬ－１２ポリペプチドであって、前記遮断エレメントが、表１のアミノ酸によって定義されるＩＬ－１２上のエピトープに対する結合特異性を有する抗体または抗原結合フラグメントである、前記誘導性ＩＬ－１２ポリペプチド。
- 請求項３７～４２のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする核酸。
- 環状ベクターを含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- ＤＮＡを含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- ＲＮＡを含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 請求項３７～４２のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項４７に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で、請求項４８に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の製造方法。
- 前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
- 請求項３７～４０もしくは４２のいずれか一項に記載のタンパク質複合体、または請求項４１に記載のポリペプチド、または請求項４３～４７のいずれか一項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
- 請求項３７～４０もしくは４２のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の核酸、請求項４８に記載の発現ベクター、または請求項５１に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
- 前記ＩＬ－１２がムテインである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２４～２７のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記ＩＬ－１２が、部分的または完全にアグリコシル化されている、請求項５３に記載のポリペプチドまたは請求項５３に記載の核酸組成物。
- 前記ｐ３５及び／または前記ｐ４０が、部分的または完全にアグリコシル化されている、請求項５４に記載のポリペプチドまたは請求項５４に記載の核酸組成物。
- 前記ｐ３５及び／または前記ｐ４０が、完全にアグリコシル化されている、請求項５５に記載のポリペプチドまたは請求項５５に記載の核酸組成物。
- ＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが、ＩＬ－２３またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体であり、前記複合体が：
ｖ． ＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択で前記ＩＬ－２３遮断エレメントを含む第１のポリペプチドであって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド；
ｖｉ． 第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択で前記ＩＬ－２３遮断エレメントを含む第２のポリペプチド鎖であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して、前記ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結するか、または任意選択でプロテアーゼ切断性であるリンカーを介して、前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第２のポリペプチド鎖を含み；
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの一方のみが前記ＩＬ－２３遮断エレメントを含み；
前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ１９の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ４０であり、前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ４０の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ１９である、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第１のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項５７に記載のポリペプチド。
- ＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｉｖ． ＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第１のポリペプチドであって、前記半減期延長エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド；
ｖ． ＩＬ－１２サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分または抗体重鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第２のポリペプチドであって；前記半減期延長エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結し、前記抗体重鎖または前記抗体軽鎖が、ａ）第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－２３サブユニットと作動可能に連結するか、またはｂ）任意選択で切断可能性リンカーを介して前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第２のポリペプチド；ならびに
ｖｉ． 前記第２のポリペプチドの前記軽鎖に相補的である抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分、または前記第２のポリペプチドの前記重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－２３結合部位を形成する抗体軽鎖を含む、第３のポリペプチドを含み；
前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ１９の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ４０であり、前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ４０の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ１９である、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第１のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項５９に記載のポリペプチド。
- ＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｖ． ｐ１９、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第１のポリペプチド鎖であって、ｐ１９及びｐ４０が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結するか；または、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド鎖；ならびに
ｖｉ． 第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－２３結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第２のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド複合体。 - ＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｖｉｉ． ｐ１９、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第１のポリペプチド鎖であって、ｐ１９及びｐ４０が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結するか；または、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド鎖；ならびに
ｖｉｉｉ． 第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの重鎖に相補的であり、抗体軽鎖と一緒になってＩＬ－２３結合部位を形成する前記軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第２のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第１のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項６１または６２に記載のポリペプチド。
- 前記第１のポリペプチドが、遮断エレメントを含まず、前記第２のポリペプチドが、式：
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｂ］－［Ｌ３］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ３］－［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］または［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｄ］または
［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２］－［Ｂ］を有し、式中、
Ａが、前記ＩＬ－２３サブユニットであり；
Ｌ１が、前記第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｌ２が、前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｌ３が、前記任意選択で切断可能性リンカーであり；
Ｂが、前記半減期延長エレメントであり；
Ｄが、前記遮断エレメントである、請求項５７または５９に記載のポリペプチド複合体。 - 前記第１のポリペプチドが、式：
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］を含み；前記第２のポリペプチドが、式：
［Ａ’］－［Ｌ２］－［Ｂ］または［Ｂ］－［Ｌ２］－［Ａ’］を有し、式中、
Ａが、ｐ１９またはｐ４０のいずれかであり、Ａがｐ１９の場合、Ａ’がｐ４０であり、Ａがｐ４０の場合、Ａ’がｐ１９であり；
Ａ’が、ｐ１９またはｐ４０のいずれかであり；
Ｌ１が、前記第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｌ２が、前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｂが、前記半減期延長エレメントであり；
Ｄが、前記遮断エレメントである、請求項５７に記載のポリペプチド複合体。 - 前記第１のポリペプチドが、式：［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｂ］または［Ｂ］－［Ｌ１］－［Ａ］を含み；前記第２のポリペプチドが、式［Ａ’］－［Ｌ２］－［Ｄ］または［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ａ’］を有し、式中、
Ａが、ｐ１９またはｐ４０のいずれかであり；
Ａ’が、ｐ１９またはｐ４０のいずれかであり、Ａがｐ１９の場合、Ａ’がｐ４０であり、Ａがｐ４０の場合、Ａ’がｐ１９であり；
Ｌ１が、前記第１のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｌ２が、前記第２のプロテアーゼ切断性リンカーであり；
Ｂが、前記半減期延長エレメントであり；
Ｄが、前記遮断エレメントである、請求項５９に記載のポリペプチド複合体。 - 前記半減期延長エレメントが、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンＦｃもしくはそのフラグメントである、請求項５７～６６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシン、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ、ＦＡＰ、プラスミノーゲン活性化因子、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍プロテアーゼから選択されるプロテアーゼによって切断され得る配列を含む、請求項５７～６６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼが、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、またはカテプシンＧから選択される、請求項５７～６６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４であるＭＭＰから選択される、請求項５７～６６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、プロテアーゼによって独立して切断され得る少なくとも２つの配列を含む、請求項５７～６６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、合成配列を含む、請求項５７～６６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーのそれぞれが、２つ以上の異なるプロテアーゼによって切断される、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記単鎖抗体が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項５７に記載のポリペプチド複合体。
- 前記抗体の抗原結合フラグメントがＦａｂである、請求項５９、６１または６２に記載のポリペプチド複合体。
- 前記遮断エレメントが、前記ＩＬ－２３に結合する、請求項５７、５９、６１、または６２のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記遮断エレメントが、ｐ１９、ｐ４０、またはｐ１９ｐ４０複合体に結合する、請求項７３または７４に記載のポリペプチド複合体。
- 請求項５７～７７のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする核酸。
- 前記核酸が、ｐ１９またはｐ４０のみをコードしない、請求項７８に記載の核酸。
- ＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが、ＩＬ－２３またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体であり、前記複合体が：
ｖｉｉ． ＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択で前記ＩＬ－２３遮断エレメントを含む第１のポリペプチドであって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド；
ｖｉｉｉ． 第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択で前記ＩＬ－２３遮断エレメントを含む第２のポリペプチド鎖であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して、前記ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結するか、または任意選択でプロテアーゼ切断性であるリンカーを介して、前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第２のポリペプチド鎖を含み；
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの一方のみが前記ＩＬ－２３遮断エレメントを含み；
前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ１９の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ４０であり、前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ４０の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ１９である、前記核酸組成物。 - ＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｉｖ． ＩＬ－２３サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第１のポリペプチドであって、前記半減期延長エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド；
ｖ． ＩＬ－１２サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第２のポリペプチドであって；前記半減期延長エレメントが存在する場合、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－２３サブユニットに作動可能に連結し、前記抗体重鎖または前記抗体軽鎖が、ａ）第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記ＩＬ－２３サブユニットと作動可能に連結するか、またはｂ）任意選択で切断可能性リンカーを介して前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第２のポリペプチド；ならびに
ｖｉ． 前記第２のポリペプチドの前記軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－２３結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、第３のポリペプチドを含み、
前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ１９の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ４０であり、前記第１のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ４０の場合、前記第２のポリペプチドの前記ＩＬ－２３サブユニットがｐ１９である、前記核酸組成物。 - ＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｖ． ｐ１９、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第１のポリペプチド鎖であって、ｐ１９及びｐ４０が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結するか；または、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド鎖；ならびに
ｖｉ． 第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってＩＬ－２３結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第２のポリペプチドを含む、前記核酸組成物。 - ＩＬ－２３、半減期延長エレメント、ＩＬ－２３遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記ＩＬ－２３遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が：
ｖｉｉ． ｐ１９、ｐ４０、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第１のポリペプチド鎖であって、ｐ１９及びｐ４０が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結するか；または、前記半減期延長エレメントが、第１のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ１９に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第２のプロテアーゼ切断性リンカーを介してｐ４０に作動可能に連結する、前記第１のポリペプチド鎖；ならびに
ｖｉｉｉ． 第２のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記重鎖と一緒になってＩＬ－２３結合部位を形成する抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第２のポリペプチドを含む、前記核酸組成物。 - 環状ベクターを含む、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- ＤＮＡを含む、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- ＲＮＡを含む、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 請求項７８～８３のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項８７に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で、請求項８８に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の製造方法。
- 前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
- 請求項５７～７７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体または請求項７８～８６のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬組成物。
- 請求項５７～７７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項７８～８６のいずれか一項に記載の核酸、請求項８７に記載の発現ベクター、または請求項９１に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
- 配列番号４２３～４２８からなる群、または配列番号４２３～４２８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第１のポリペプチドを含むＩＬ－２３ポリペプチド複合体。
- 配列番号１０４、４３４もしくは４４２～４４５のアミノ酸配列、または配列番号１０４、４３４もしくは４４２～４４５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖をさらに含む、請求項９３に記載のＩＬ－２３ポリペプチド複合体。
- 配列番号４２２もしくは４２９～４３２からなる群から選択されるアミノ酸、または配列番号４２２もしくは配列番号４２９～４３２に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単鎖ＩＬ－２３誘導性ポリペプチド。
- ｐ１９、ｐ４０、遮断エレメント、及び半減期延長エレメントを含む誘導性ＩＬ－２３ポリペプチドであって、前記遮断エレメントが、ＩＬ－２３上のエピトープに対する結合特異性を有する抗体または抗原結合フラグメントである、前記誘導性ＩＬ－２３ポリペプチド。
- 請求項９３～９６のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする核酸。
- 環状ベクターを含む、請求項９３～９７のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- ＤＮＡを含む、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- ＲＮＡを含む、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 請求項９７～１００のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項１０１に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で、請求項１０２に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の製造方法。
- 前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項１０３に記載の方法。
- 請求項９３～９６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、または請求項９７～１００のいずれか一項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
- 請求項９３～９６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項９７～１００のいずれか一項に記載の核酸、請求項１０１に記載の発現ベクター、または請求項１０５に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
- 前記ＩＬ－２３がムテインである、請求項５７～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項８０～８６のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記ＩＬ－２３が、部分的または完全にアグリコシル化されている、請求項５３に記載のポリペプチドまたは請求項１０７に記載の核酸組成物。
- 前記ｐ１９及び／または前記ｐ４０が、部分的または完全にアグリコシル化されている、請求項１０８に記載のポリペプチドまたは請求項１０８に記載の核酸組成物。
- 前記ｐ１９及び／または前記ｐ４０が、完全にアグリコシル化されている、請求項１０９に記載のポリペプチドまたは請求項１０９に記載の核酸組成物。
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