JP2023526428A - 活性化可能なil-12ポリペプチド及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書において、IL-12またはIL-23、半減期延長エレメント、IL-12またはIL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む、IL-12ポリペプチド複合体及び/またはIL23ポリペプチド複合体を提供する。本明細書ではまた、その医薬組成物、ならびにそのようなポリペプチド複合体を作製するための核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞も提供する。また、疾患、病態及び障害の治療における、ポリペプチド複合体の使用方法も開示する。
Description
1.配列表
本出願は、2020年5月19日出願の米国仮特許出願第63/027,276号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、2020年5月19日出願の米国仮特許出願第63/027,276号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。2021年5月18日に作成された前記ASCIIコピーは、761146_02320_SL.txtという名前であり、サイズは1,294,403バイトである。
インターロイキン-12(IL-12)は、共有結合した2つのグリコシル化サブユニット(p35及びp40)からなるヘテロ二量体の70kDaサイトカインである(Lieschke et al.,1997;Jana et al.,2014)。IL-12は強力な免疫アンタゴニストであり、腫瘍学の有望な治療薬と考えられてきた。しかしながら、IL-12は非常に強力で血中半減期が短いため、治療濃度域が狭いことが示されている。結果として、IL-12の治療的投与により、望ましくない全身性の作用と毒性が生じる。これは、サイトカイン(例えば、IL-12)作用が意図される部位(例えば、腫瘍微小環境)において、所望のサイトカインレベルを達成するために大量のサイトカインを投与する必要性があるため、悪化する。残念なことに、サイトカインの生物学、及びそれらの活性を効果的に標的とし、制御できないために、サイトカインでは、腫瘍の治療において期待される臨床的利点は達成されなかった。
腫瘍学におけるIL-12の臨床使用を制限している毒性と短い半減期の問題を克服するために、誘導性IL-12タンパク質構築物が、国際出願第PCT/US2019/032320号及び第PCT/US2019/032322号に記載されている。前述の誘導性IL-12ポリペプチド構築物は、IL-12、遮断エレメント、及び半減期延長エレメントを含む単一のポリペプチドを含む。
本発明の発明者らは、驚くべきことに、2つ以上のポリペプチドを含むIL-12ポリペプチド複合体が、凝集の減少及び発現の向上などの特定の利点を有し、より高い収量をもたらすことを見出した。
本開示は、減弱化されたIL-12を含み、天然のIL-12と比較して長い半減期を有する誘導性IL-12ポリペプチド複合体に関する。所望により、IL-12はムテインであり得る。IL-12ムテインは、アグリコシル化または部分的にアグリコシル化されていてもよい。本明細書に開示されるポリペプチド複合体は、2つ以上のポリペプチド鎖を含み、複合体は、IL-12サブユニットp35及びp40、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、ならびにプロテアーゼ切断性リンカーを含む。
誘導性IL-12ポリペプチド複合体は、2つの異なるポリペプチドを含み得る。第1のポリペプチドは、IL-12サブユニット、及び任意選択でIL-12遮断エレメントを含み得る。IL-12遮断エレメントは、存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結される。第2のポリペプチド鎖は、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたIL-12サブユニット、及び任意選択でIL-12遮断エレメントを含み得る。存在する場合、IL-12遮断エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結され得るか、または任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結され得る。第1及び第2のポリペプチドの一方のみがIL-12遮断エレメントを含む。第1のポリペプチドのIL-12サブユニットがp35の場合、第2のポリペプチドのIL-12サブユニットはp40であり、第1のポリペプチドのIL-12サブユニットがp40の場合、第2のポリペプチドのIL-12サブユニットはp35である。この複合体の好ましい遮断エレメントは、IL-12またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体である。この複合体の切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
誘導性IL-12ポリペプチド複合体は、3つの異なるポリペプチドを含み得る。一般的には、一方のポリペプチド鎖はp35またはp40 IL-12サブユニットのいずれかを含むが両方は含まず、第2のポリペプチドは他方のIL-12サブユニットを含み、第3のポリペプチドは遮断エレメントの少なくとも一部(構成要素)を含む。第1のポリペプチドは、IL-12サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含み得る。存在する場合、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結される。
第2のポリペプチドは、IL-12サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分または抗体重鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含み得る。半減期延長エレメントが存在する場合、それはプロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結され、抗体の重鎖または軽鎖は、a)第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結されるか、またはb)任意選択で切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結される。
第3のポリペプチドは、第2のポリペプチドの軽鎖に相補的である抗体重鎖の抗原結合部分、または第2のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒にIL-12結合部位を形成する抗体軽鎖を含み得る。第1のポリペプチドのIL-12サブユニットがp35の場合、第2のポリペプチドのIL-12サブユニットはp40であり、第1のポリペプチドのIL-12サブユニットがp40の場合、第2のポリペプチドのIL-12サブユニットはp35である。この複合体において、IL-12遮断エレメントは、好ましくは抗体の抗原結合フラグメントである。抗原結合フラグメントは、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を別個の構成要素として含む。この誘導性IL-12ポリペプチド複合体中のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
誘導性ポリペプチド複合体は、p35及びp40が同じポリペプチド鎖上に位置する2つの異なるポリペプチドを含み得る。第1のポリペプチド鎖は、p35、p40、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。p35及びp40は作動可能に連結され得、半減期延長エレメントは第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分はプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結される。第2のポリペプチドは、第2のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-12結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む。この複合体のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
別の形態では、第1のポリペプチド鎖は、p35、p40、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。p35及びp40は作動可能に連結され得、半減期延長エレメントは第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分はプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結され得、抗体重鎖の抗原結合部分は、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結され得る。第2のポリペプチドは、第2のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-12結合部位を形成する抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む。この複合体のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
一例では、IL-12ポリペプチド複合体は、遮断エレメントを含まない第1のポリペプチドを含み、第2のポリペプチドは、式:[A]-[L1]-[B]-[L3]-[D]または[D]-[L3]-[B]-[L1]-[A]または[B]-[L1]-[A]-[L2]-[D]または[D]-[L1]-[A]-[L2]-[B]を含み、式中、AはIL-12サブユニットであり;L1は第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;L2は第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;L3は任意選択で切断性リンカーであり;Bは半減期延長エレメントであり;Dは遮断エレメントである。
別の例では、第1のポリペプチドは、式:[A]-[L1]-[D]または[D]-[L1]-[A]を含み;第2のポリペプチドは、式:[A’]-[L2]-[B]または[B]-[L2]-[A’]を含み、式中、Aは、p35またはp40のいずれかであり、Aがp35の場合、A’はp40であり、Aがp40の場合、A’はp35であり;A’はp35またはp40のいずれかであり;L1は第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;L2は第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;Bは半減期延長エレメントであり;Dは遮断エレメントである。
実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体は、配列番号95~110、配列番号119~126、及び配列番号135~143からなる群、または配列番号95~110、配列番号119~126、及び配列番号135~143に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第1のポリペプチドを含む。好ましいIL-12ポリペプチド複合体は、配列番号104または配列番号136を含む第1のポリペプチドを含む。好ましいIL-12ポリペプチド複合体は、配列番号104のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖及び配列番号18のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖を含む。別の好ましいポリペプチド複合体は、配列番号136のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖及び配列番号18のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖を含む。
上記のように、所望により、IL-12はムテインであり得る。IL-12ムテインは、IL-12活性、例えば、固有のIL-12受容体アゴニスト活性を保持している。IL-12サブユニット、p35及び/またはp40は、ムテインであり得る。好ましくは、IL-12ムテインは、改変されたグリコシル化パターンを有する。例えば、IL-12ムテインは、部分的にアグリコシル化または完全にアグリコシル化され得る。
p35及び/またはp40サブユニットは、1つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換を含み得る。例えば、p35及び/またはp40サブユニットは、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。通常は、p35及び/またはp40サブユニットは、約1~約7個のアミノ酸置換を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。一般的な修飾は、p35及び/またはp40サブユニットのグリコシル化パターンを改変し、それによりp35及び/またはp40サブユニットを部分的または完全にアグリコシル化する。好ましくは、アミノ酸改変は、アスパラギンアミノ酸の置換を含む。例えば、アスパラギンからグルタミンである。特定の例では、配列番号434のIL-12 p35のアミノ酸位置16、75、85、133、151、158、201、206、221、250、267、280、282、326、400、404、425、555、572、575、582、または602のアスパラギンを変異させることができる。特定の例では、配列番号18のIL-12 p40のアミノ酸位置103、114、163、219、227、または282のアスパラギンを変異させることができる。
例えば、部分的または完全にアグリコシル化されたIL-12ポリペプチドは、配列番号104、434もしくは442~445からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号104、434もしくは442~445に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本開示はまた、単鎖IL-12誘導性ポリペプチドにも関する。単鎖IL-12ポリペプチドは、好ましくは、配列番号7、9、10、18、24~94、配列番号110~118、及び配列番号127~134からなる群から選択されるアミノ酸を含むか、または配列番号7、9、10、18、24~94、配列番号110~118、及び配列番号127~134に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、減弱化されたIL-23を含み、天然のIL-23と比較して長い半減期を有する誘導性IL-23ポリペプチド複合体に関する。所望により、IL-23はムテインであり得る。IL-23ムテインは、アグリコシル化または部分的にアグリコシル化されていてもよい。本明細書に開示されるポリペプチド複合体は、1つ以上のポリペプチド鎖を含み、複合体は、IL-23サブユニットp19及びp40、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、ならびにプロテアーゼ切断性リンカーを含む。
誘導性IL-23ポリペプチド複合体は、2つの異なるポリペプチドを含み得る。第1のポリペプチドは、IL-23サブユニット、及び任意選択でIL-23遮断エレメントを含み得る。IL-23遮断エレメントは、存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結される。第2のポリペプチド鎖は、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたIL-23サブユニット、及び任意選択でIL-23遮断エレメントを含み得る。存在する場合、IL-23遮断エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結され得るか、または任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結され得る。第1及び第2のポリペプチドの一方のみがIL-23遮断エレメントを含む。第1のポリペプチドのIL-23サブユニットがp19の場合、第2のポリペプチドのIL-23サブユニットはp40であり、第1のポリペプチドのIL-23サブユニットがp40の場合、第2のポリペプチドのIL-23サブユニットはp40である。この複合体の好ましい遮断エレメントは、IL-23またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体である。この複合体の切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
誘導性IL-23ポリペプチド複合体は、3つの異なるポリペプチドを含み得る。一般的には、一方のポリペプチド鎖はp19またはp40 IL-23サブユニットのいずれかを含むが両方は含まず、第2のポリペプチドは他方のIL-23サブユニットを含み、第3のポリペプチドは遮断エレメントの少なくとも一部(構成要素)を含む。第1のポリペプチドは、IL-23サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含み得る。存在する場合、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結される。
第2のポリペプチドは、IL-23サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分または抗体重鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含み得る。半減期延長エレメントが存在する場合、それはプロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結され、抗体の重鎖または軽鎖は、a)第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結されるか、またはb)任意選択で切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結される。
第3のポリペプチドは、第2のポリペプチドの軽鎖に相補的である抗体重鎖の抗原結合部分、または第2のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒にIL-23結合部位を形成する抗体軽鎖を含み得る。第1のポリペプチドのIL-23サブユニットがp19の場合、第2のポリペプチドのIL-23サブユニットはp40であり、第1のポリペプチドのIL-23サブユニットがp40の場合、第2のポリペプチドのIL-23サブユニットはp19である。この複合体において、IL-23遮断エレメントは、好ましくは抗体の抗原結合フラグメントである。抗原結合フラグメントは、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を別個の構成要素として含む。この誘導性IL-23ポリペプチド複合体中のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
誘導性ポリペプチド複合体は、p19及びp40が同じポリペプチド鎖上に位置する2つの異なるポリペプチドを含み得る。第1のポリペプチド鎖は、p19、p40、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。p19及びp40は作動可能に連結され得、半減期延長エレメントは第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分はプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結され得、抗体軽鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結される。第2のポリペプチドは、第2のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-23結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む。この複合体のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
別の形式では、第1のポリペプチド鎖は、p19、p40、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。P19とp40は作動可能に連結され得、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結され得るか、または抗体重鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結され得、抗体重鎖の抗原結合部分は、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結され得る。第2のポリペプチドは、第2のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-23結合部位を形成する抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む。この複合体のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
一例では、IL-23ポリペプチド複合体は、遮断エレメントを含まない第1のポリペプチドを含み、第2のポリペプチドは、式:[A]-[L1]-[B]-[L3]-[D]または[D]-[L3]-[B]-[L1]-[A]または[B]-[L1]-[A]-[L2]-[D]または[D]-[L1]-[A]-[L2]-[B]を含み、式中、AはIL-23サブユニットであり;L1は第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;L2は第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;L3は任意選択で切断性リンカーであり;Bは半減期延長エレメントであり;Dは遮断エレメントである。
別の例では、第1のポリペプチドは、式:[A]-[L1]-[D]または[D]-[L1]-[A]を含み;第2のポリペプチドは、式:[A’]-[L2]-[B]または[B]-[L2]-[A’]を含み、式中、Aは、p19またはp40のいずれかであり、Aがp19の場合、A’はp40であり、Aがp40の場合、A’はp19であり;A’はp19またはp40のいずれかであり;L1は第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;L2は第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;Bは半減期延長エレメントであり;Dは遮断エレメントである。
実施形態では、IL-23ポリペプチド複合体は、配列番号423~428からなる群、または配列番号423~428に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第1のポリペプチドを含む。実施形態では、IL-23ポリペプチド複合体は、配列番号18または433からなる群から選択される第2のポリペプチドを含む。
上記のように、所望により、IL-23はムテインであり得る。IL-23ムテインは、IL-23活性、例えば、固有のIL-23受容体アゴニスト活性を保持している。IL-23サブユニット、p19及び/またはp40はムテインであり得る。好ましくは、IL-23ムテインは、改変されたグリコシル化パターンを有する。例えば、IL-23ムテインは、部分的にアグリコシル化または完全にアグリコシル化され得る。
p19及び/またはp40サブユニットは、1つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換を含み得る。例えば、p19及び/またはp40サブユニットは、約1、約2、約3、約4、約5またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。通常は、p19及び/またはp40サブユニットは、1つまたは2つのアミノ酸置換を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。一般的な修飾は、p19及び/またはp40サブユニットのグリコシル化パターンを改変し、それによりp19及び/またはp40サブユニットを部分的または完全にアグリコシル化する。好ましくは、アミノ酸改変は、アスパラギンアミノ酸の置換を含む。例えば、アスパラギンからグルタミンである。
本開示はまた、単鎖IL-23誘導性ポリペプチドにも関する。単鎖IL-23ポリペプチドは、好ましくは、配列番号422もしくは429~432からなる群から選択されるアミノ酸、または配列番号422もしくは配列番号429~432に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示される半減期延長エレメントは、好ましくは、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンFcもしくはそのフラグメントである。
プロテアーゼ切断性リンカーは、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼA、カテプシン、エラスターゼ、PR-3、グランザイムM、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、ADAM、FAP、プラスミノーゲン活性化因子、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍プロテアーゼから選択されるプロテアーゼによって切断され得る配列を含む。プロテアーゼは、好ましくは、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、またはカテプシンGから選択される。あるいは、プロテアーゼは、好ましくは、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)から選択され、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、またはMMP14である。
実施形態では、プロテアーゼ切断性リンカーは、プロテアーゼによって独立して切断され得る少なくとも2つの配列を含む。プロテアーゼ切断性リンカーは、合成配列を含み得る。実施形態では、プロテアーゼ切断性リンカーのそれぞれは、2つ以上の異なるプロテアーゼによって切断される。
本明細書に記載の遮断エレメントは、IL-12またはIL-23に結合する任意のエレメントであり得る。本明細書に開示される遮断エレメントは、p35、p40、またはp35p40ヘテロ二量体複合体に結合することができる。本明細書に開示される遮断エレメントは、p19、p40、または19p40ヘテロ二量体複合体に結合することができる。遮断エレメントは、好ましくは単鎖可変フラグメント(scFv)またはFabである。
本開示は、本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体をコードする核酸にも関する。本開示は、本明細書に記載のIL-23ポリペプチド複合体をコードする核酸にも関する。本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体をコードする核酸組成物は、環状ベクター、DNA、またはRNAを含み得る。本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体をコードする核酸を含む発現ベクターもまた、本明細書に提供する。実施形態では、ベクターを含む宿主細胞を本明細書に提供する。本開示はまた、ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で単離宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の作製方法に関する。
また、本明細書に開示されるIL-12ポリペプチド複合体を含む医薬組成物もまた、本明細書に提供する。また、IL-23ポリペプチド複合体を含む医薬組成物もまた、本明細書に提供する。
本開示はまた、治療を必要とする対象に、本明細書に開示される有効量のIL-12ポリペプチド複合体、IL-12ポリペプチド複合体をコードする核酸、またはその医薬組成物を投与することを含む、腫瘍の治療方法に関する。本開示はまた、治療を必要とする対象に、本明細書に開示される有効量のIL-23ポリペプチド複合体、IL-23ポリペプチド複合体をコードする核酸、またはその医薬組成物を投与することを含む、腫瘍の治療方法に関する。本明細書に開示される方法に従って、任意の好適な腫瘍、例えば黒色腫または乳癌を治療することができる。
図面は、必ずしも一定の比率ではない。それよりも、一般に、本明細書に記載される発明の原理を説明することに重点が置かれている。本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示と一致するいくつかの実施形態を示し、その記載と共に、本開示の原理を説明するのに役立つ。以下の図面において:
本開示は、減弱化されたIL-12を含み、天然のIL-12と比較して長い半減期を有する誘導性IL-12ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示されるIL-12ポリペプチド複合体は、2つ以上のポリペプチド鎖を含み、複合体は、IL-12サブユニットp35及びp40、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、ならびにプロテアーゼ切断性リンカーを含む。複合体中のIL-12の活性(例えば、受容体結合活性及び/または受容体アゴニスト活性)は、プロテアーゼ切断性リンカーによって複合体につながれている遮断エレメントの作用によって減弱される。プロテアーゼ切断性リンカー(複数可)が切断されると、遮断エレメントと半減期延長エレメントがIL-12から分離し、IL-12から離れて拡散し、活性型IL-12を生成し得る。その活性型IL-12は、通常、天然IL-12と実質的に同様の生物学的活性及び半減期を有する。図1A~1Jは、本明細書に開示されるIL-12ポリペプチド複合体の非限定的な例を示す。本開示はさらに、誘導性IL-12ポリペプチド複合体、ならびにポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのようなポリペプチド及び複合体を作製するための組換え発現ベクター及び宿主細胞を含む医薬組成物に関する。また、本明細書では、疾患、病態、及び障害の治療における、開示されるIL-12ポリペプチド複合体の使用方法も提供する。
本明細書に開示されるIL-12ポリペプチド複合体は、特に腫瘍学の分野においてIL-12の臨床使用を著しく制限してきた毒性及び短い半減期の問題を克服する。IL-12ポリペプチド複合体は、受容体アゴニスト活性を有するIL-12ポリペプチドを含む。しかし、IL-12ポリペプチド複合体に関して、IL-12受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。
本明細書に開示されるIL-12ポリペプチド複合体は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含み、所望により3つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。
本開示はまた、減弱化されたIL-23を含み、天然のIL-23と比較して長い半減期を有する誘導性IL-23ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示されるIL-23ポリペプチド複合体は、1つ以上のポリペプチド鎖を含み、複合体は、IL-23サブユニットp19及びp40、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、ならびにプロテアーゼ切断性リンカーを含む。複合体中のIL-23の活性(例えば、受容体結合活性及び/または受容体アゴニスト活性)は、プロテアーゼ切断性リンカーによって複合体につながれている遮断エレメントの作用によって減弱される。プロテアーゼ切断性リンカー(複数可)が切断されると、遮断エレメントと半減期延長エレメントがIL-23から分離し、IL-23から離れて拡散し、活性型IL-23を生成し得る。その活性型IL-23は、通常、天然IL-23と実質的に同様の生物学的活性及び半減期を有する。本開示はさらに、誘導性IL-23ポリペプチド複合体、ならびにポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのようなポリペプチド及び複合体を作製するための組換え発現ベクター及び宿主細胞を含む医薬組成物に関する。また、本明細書では、疾患、病態、及び障害の治療における、開示されるIL-23ポリペプチド複合体の使用方法も提供する。
本明細書に開示されるIL-23ポリペプチド複合体は、特に腫瘍学の分野においてIL-23の臨床使用を著しく制限してきた毒性及び短い半減期の問題を克服する。IL-23ポリペプチド複合体は、受容体アゴニスト活性を有するIL-23ポリペプチドを含むが、IL-23ポリペプチド複合体に関して、IL-23受容体アゴニスト活性は減弱され、循環半減期が延長される。
本明細書に開示されるIL-23ポリペプチド複合体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖を含み、所望により2つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。
特定の例示的かつ好ましい実施形態を、本明細書に詳細に記載する。明細書内の実施形態は、開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
本明細書で引用されるすべての刊行物及び特許は、その全体が参照により援用される。参照により援用される文献が本明細書と矛盾するか、または不一致である場合、本明細書がそのような文献よりも優先される。本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本開示に対する先行技術であることを認めるものではない。値の範囲が表現される場合、それは範囲内の任意の特定の値を使用する実施形態を含む。さらに、範囲で述べられた値への言及は、その範囲内のすべての値を含む。すべての範囲はそれらの端点を含み、組み合わせ可能である。先行する「約(about)」の使用によって値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。特定の数値への言及は、文脈が明確に別の指示をしない限り、少なくともその特定の値を含む。「または」の使用は、その使用の特定の文脈が別の方法で指示しない限り、「及び/または」を表す。
本明細書及び特許請求の範囲にわたって、記載の態様に関連する様々な用語が用いられている。そのような用語には、別段に示されない限り、当技術分野における通常の意味が与えられるものとする。具体的に定義される他の用語は、本明細書に示されている定義と一致する形で解釈されるものとする。本明細書に記載または参照される技法及び手順は、当業者には一般に十分に理解されており、従来の方法論、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYに記載され、広く利用されている分子クローニング方法論などを使用して一般的に使用されている。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は一般に、特に断りのない限り、製造者が定義するプロトコル及び条件に従って行われる。
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明確に別途指示しない限り、複数形の形態を含む。用語「含む」、「など」などは、特に明記しない限り、限定することなく包含を伝えることを意図している。
別段の指示がない限り、一連の要素または範囲に先行する用語「少なくとも」、「未満」、及び「約」、または同様の用語は、一連または範囲内のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、用語「活性化可能」、「活性化する」、「誘導する」、及び「誘導性」とは、減弱化活性形態(例えば、減弱化受容体結合及び/またはアゴニスト活性)及び活性形態を有するポリペプチド複合体を指す。ポリペプチド複合体は、遮断エレメント及び半減期延長エレメントをポリペプチド複合体から解離させるリンカーのプロテアーゼ切断によって活性化される。誘導/活性化されたポリペプチド複合体は、増加した親和性/活性でIL-12受容体に結合することができる。誘導/活性化されたポリペプチド複合体は、増加した親和性/活性でIL-23受容体に結合することができる。
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では同じ意味で使用される。本明細書で使用される抗体または免疫グロブリンは、2つの重(H)鎖からなる免疫グロブリン分子を指すことを意図している。一般的には、哺乳動物(例えば、ヒト、齧歯類、及びサル)の抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖の4つのポリペプチド鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVRまたはVHと略す)及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CHI、CH2及びCH3からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVRまたはVLと略す)及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLからなる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と称されるより保存された領域と共に散在する、相補性決定領域(CDR)と称される超可変性の領域に、さらに細分することができる。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かってFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4という順序で並んでいる。抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、または2つの重鎖分子及び2つの軽鎖分子を含む四量体抗体が含まれ得る。当業者は、他の形態の抗体が存在することを認識するであろう(例えば、ラクダ及びサメの抗体)。
本明細書で使用される用語「減弱化された」とは、IL-12受容体またはIL-23受容体の天然のアゴニストと比較して、受容体アゴニスト活性が低下したIL-12受容体アゴニストまたはIL-23受容体アゴニストである。減弱化されたIL-12アゴニストまたは減弱化されたIL-23アゴニストは、その受容体の天然のアゴニストと比較して、少なくとも約10倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約250倍、少なくとも約500倍、少なくとも約1000倍またはそれより低いアゴニスト活性を有し得る。本明細書に記載のIL-12を含むIL-12ポリペプチド複合体が「減弱化」または「減弱化活性」を有すると記載されている場合、そのIL-12ポリペプチド複合体が減弱化IL-12受容体アゴニストであることを意味する。本明細書に記載のIL-23を含むIL-23ポリペプチド複合体が「減弱化」または「減弱化活性」を有すると記載されている場合、そのIL-23ポリペプチド複合体が減弱化IL-23受容体アゴニストであることを意味する。
用語「がん」とは、細胞集団が制御不能の増殖、不死性、転移能、急速な成長率及び増殖率及び/または特定の形態学的特徴を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す。多くの場合、がんは腫瘍または塊の形態であり得るが、対象内に単独で存在する場合もあれば、白血病細胞またはリンパ腫細胞などの独立した細胞として血流中を循環する場合もある。がんという用語には、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、がん腫、及び他の固形及び非固形腫瘍を含む、すべての種類のがん及び転移が含まれる。がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるがこれらに限定されない。そのようながんのさらに特定の例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌(例えば、三種陰性乳癌)、骨肉腫、黒色腫、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜(例えば、漿液性)癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、ならびに様々な種類の頭頸部癌が挙げられる。三種陰性乳癌は、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、及びHer2/neuの遺伝子の発現が陰性である乳癌を指す。
本明細書で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換とは、一般に、ペプチドの構造を変化させることができるが、ペプチドの生物学的活性は実質的に保持される、認識されたグループ内の1つのアミノ酸残基から別のアミノ酸残基への置換を指す。アミノ酸の保存的置換は、当業者に公知である。アミノ酸の保存的置換には、以下のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が含まれるが、これらに限定されない:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N;及び(g)E、D。例えば、当業者は、ロイシンからイソロイシンもしくはバリンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への、スレオニンからセリンへの単独の置換、または構造的に関連性のあるアミノ酸による同様のアミノ酸置換が、結果として得られる分子の生物学的活性に大きな影響を与えないことを合理的に予想する。
本明細書で使用する場合、本明細書に開示するポリペプチド複合体に関する用語「半減期延長エレメント」とは、例えば、そのサイズ(例えば、腎臓濾過カットオフ値を上回るように)、形状、流体力学的半径、電荷を改変するか、または吸収、生体内分布、代謝、及び消失というパラメータを改変することによって、化学要素、好ましくは血中半減期を延長させ、かつpKを向上させるポリペプチドを指す。
本明細書で使用する場合、ポリペプチド複合体に関する用語「作動可能に連結された」とは、ポリペプチド複合体の構成要素が意図した様式で機能することを可能にする、構成要素の配向を指す。例えば、IL-12サブユニットとIL-12遮断エレメントを含むポリペプチドは、IL-12遮断エレメントがIL-12ポリペプチドのIL-12受容体活性化活性を阻害できる場合、ポリペプチド複合体中のプロテアーゼ切断性リンカーによって作動可能に連結されるが、プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、遮断エレメントが、IL-12から拡散し得るため、IL-12遮断エレメントによるIL-12ポリペプチドのIL-12受容体活性化活性の阻害が減少または排除される。
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結される2つ以上のアミノ酸を意味するために広く使用される。タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドはまた、本明細書ではアミノ酸配列を指すために同じ意味で使用される。本明細書では、分子を構成するアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するためにはポリペプチドという用語は使用されないこと、本発明のペプチドは最大で数個からそれ以上のアミノ酸残基を含有することができることを認識されるべきである。
本明細書における用語「対象」とは、任意の動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」とは、投与条件下で所望の薬理学的または生理学的効果を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物(すなわち、IL-12ポリペプチド複合体)の量を指す。例えば、「治療有効量」は、疾患または病態(例えば、腫瘍)の徴候または症状を軽減するのに十分な量であり得る。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療効果が完全または治癒的である必要がないことを理解するであろう。医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに医薬組成物が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に従って変化し得る。当業者は、これら及び他の考慮事項に基づいて、所望の治療効果を達成するために適切な投与量を決定することができる。
A.IL-12ポリペプチド複合体
本開示は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含み、所望により3つのポリペプチド鎖またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る誘導性IL-12ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示される2つ以上のポリペプチド鎖は異なる、すなわち、複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などであり得る。誘導性IL-12ポリペプチド複合体は、p35 IL-12サブユニット、p40 IL-12サブユニット、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。p35サブユニットとp40サブユニットは会合してIL-12ヘテロ二量体を形成し、固有のIL-12受容体アゴニスト活性を有する。IL-12ポリペプチド複合体に関して、IL-12受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。IL-12受容体アゴニスト活性は、遮断エレメントによって減弱される。半減期延長エレメントはまた、例えば立体効果によって、減弱に寄与し得る。遮断エレメントは、立体的に遮断することにより、及び/またはIL-12(例えば、p35、p40、またはp35p40複合体)へ非共有結合することにより、IL-12の受容体アゴニスト活性のすべてまたは一部の活性を遮断することができる。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、IL-12ポリペプチド複合体から、活性な(例えば、IL-12ポリペプチド複合体より高活性な)形態のIL-12が遊離する。通常、遊離したIL-12は、IL-12ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも10倍活性が高い。好ましくは、遊離したIL-12は、IL-12ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも約10,000倍またはそれ以上の活性である。
本開示は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含み、所望により3つのポリペプチド鎖またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る誘導性IL-12ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示される2つ以上のポリペプチド鎖は異なる、すなわち、複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などであり得る。誘導性IL-12ポリペプチド複合体は、p35 IL-12サブユニット、p40 IL-12サブユニット、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。p35サブユニットとp40サブユニットは会合してIL-12ヘテロ二量体を形成し、固有のIL-12受容体アゴニスト活性を有する。IL-12ポリペプチド複合体に関して、IL-12受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。IL-12受容体アゴニスト活性は、遮断エレメントによって減弱される。半減期延長エレメントはまた、例えば立体効果によって、減弱に寄与し得る。遮断エレメントは、立体的に遮断することにより、及び/またはIL-12(例えば、p35、p40、またはp35p40複合体)へ非共有結合することにより、IL-12の受容体アゴニスト活性のすべてまたは一部の活性を遮断することができる。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、IL-12ポリペプチド複合体から、活性な(例えば、IL-12ポリペプチド複合体より高活性な)形態のIL-12が遊離する。通常、遊離したIL-12は、IL-12ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも10倍活性が高い。好ましくは、遊離したIL-12は、IL-12ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも約10,000倍またはそれ以上の活性である。
IL-12ポリペプチド複合体の切断時に遊離するIL-12の形態は、一般的には半減期が短く、多くの場合、天然のIL-12の半減期と実質的に同様である。IL-12ポリペプチド複合体の半減期は延長されるが、循環IL-12ポリペプチド複合体が減弱化され、活性型IL-12が目的の部位(例えば、腫瘍微小環境)に標的化されるため、毒性は軽減または排除される。
当業者であれば、ポリペプチド鎖の数、ならびにポリペプチド鎖上のp35及びp40サブユニット、半減期延長エレメント、プロテアーゼ切断性リンカー(複数可)、及び遮断エレメント(及びそのようなエレメントの構成要素、例えば、VHまたはVLドメイン)の位置が様々であり得、多くの場合、設計の好みの問題であることが理解されよう。そのような変形はすべて、本開示に包含される。
実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体は、2つの異なるポリペプチド鎖を含む。通常、第1のポリペプチド鎖はp35を含み、第2のポリペプチド鎖はp40を含む。p35及びp40サブユニットは結合して、生物学的に活性なヘテロ二量体を形成する。p35p40ヘテロ二量体複合体は、例えばジスルフィド結合を介して共有結合され得る。
実施形態では、第1及び第2のポリペプチドのいずれかが、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結されたIL-12遮断エレメント(例えば、IL-12に結合するscFV)を含み得る。他方のポリペプチド鎖は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結された半減期延長エレメントをさらに含み得る。好ましくは、複合体は、1つの機能的遮断エレメント及び1つの機能的半減期延長エレメントを含む。例えば、第1のポリペプチド鎖がIL-12遮断エレメントを含む場合、第2のポリペプチド鎖はIL-12遮断エレメントを含まない。他の実施形態では、一方のポリペプチド鎖が、p35またはp40のいずれかを含み、さらに半減期延長エレメント及び遮断エレメントを含み、これらのそれぞれが、プロテアーゼ切断性リンカー(例えば、1つ以上のプロテアーゼ切断性リンカー)を介してp35またはp40に作動可能に連結し、他方のポリペプチドが、相補的なIL-12サブユニット(例えば、p40またはp35のいずれか)を含む。第2のポリペプチド上のIL-12遮断エレメントを、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結することができる。あるいは、IL-12遮断エレメントを、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結することができる。第1及び第2のポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、第1及び第2のポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは同じである。このIL-12ポリペプチド複合体における遮断エレメントは、単鎖抗体であり得る。IL-12に対して結合特異性を有する任意の単鎖抗体は、遮断エレメントとなり得る。好ましくは、遮断エレメントはscFvである。
本明細書に開示される複合体は、好ましくは、1つの半減期延長エレメント及び1つの遮断エレメントを含むが、そのようなエレメントは、同じポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上に存在する2つ以上の構成要素を含み得る。これを示し、本明細書において開示し、例示するように、遮断エレメントの構成要素を、別個のポリペプチド鎖上に存在させることができる。例えば、第1のポリペプチド鎖に、抗体軽鎖(VL+CL)または軽鎖可変ドメイン(VL)を含ませることができ、第2のポリペプチドに、第1のポリペプチド上のVL+CLまたはVLに相補的な抗体重鎖Fabフラグメント(VH+CH1)または重鎖可変ドメイン(VH)を含ませることができる。そのような状況では、これらの構成要素がペプチド複合体中で会合して、IL-12に結合してIL-12活性を減弱するFabなどの抗原結合部位を形成することができる。
実施形態では、p35及びp40サブユニットは、同じポリペプチド鎖上に位置し、任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して連結され得る。二本鎖または多重鎖複合体のそのような実施形態では、半減期延長エレメント、遮断エレメント、または半減期延長エレメントもしくは遮断エレメントの構成要素のうちの少なくとも1つは別のポリペプチド上にある。例えば、第1のポリペプチドは、任意選択で切断可能ポリペプチド鎖を介して連結されたp35及びp40を含み得、IL-12ポリペプチド複合体の他のエレメントは第2のポリペプチド鎖上に位置する。別の例では、第1のポリペプチド鎖は、p35サブユニット、p40サブユニット、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の一部を含む。第2のポリペプチドは、抗体軽鎖に相補的な抗体重鎖の一部を含む。抗体軽鎖の一部は、相補的な重鎖と一緒になって複合中で会合し、IL-12の結合部位を形成する。別の例では、第1のポリペプチドは、p35サブユニット、p40サブユニット、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の一部を含む。この例では、第2のポリペプチドは、抗体重鎖に相補的な抗体軽鎖の一部を含む。抗体重鎖の一部は、相補的な軽鎖と一緒になって複合中で会合し、IL-12の結合部位を形成する。これらの複合体において、p35サブユニット及びp40サブユニットは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して作動可能に連結され得る。好ましくは、p35サブユニット及びp40サブユニットは、非切断性リンカーによって作動可能に連結される。
本明細書に開示される複合体において、半減期延長エレメントは、好ましくは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp35サブユニットまたはp40サブユニットのいずれかに作動可能に連結される。例えば、複合体は、p35またはp40がプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結された第1のポリペプチドを含み得る。別の例では、複合体は、p35またはp40がプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結され、半減期延長エレメントが任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して遮断エレメント(または遮断エレメントの構成要素)にさらに作動可能に連結された第1のポリペプチドを含み得る。そのような例示的な実施形態では、複合体は、第1のポリペプチドには存在しないIL-12サブユニット(p40またはp35)を含む少なくとも1つの追加のポリペプチドを含む。複合体のエレメントの追加の配置は、本開示によって想定され、包含される。例えば、遮断エレメントを、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp35サブユニットまたはp40サブユニットのいずれかに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントまたは遮断エレメントの一方を、p35サブユニットに作動可能に連結することができ、半減期延長エレメントまたは遮断エレメントの他方を、p40サブユニットに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントをp35サブユニットに作動可能に連結する場合、遮断エレメントをp40サブユニットに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントをp40サブユニットに作動可能に連結する場合、遮断エレメントをp35サブユニットに作動可能に連結することができる。この複合体における遮断エレメントは、好ましくはFabである。
誘導性IL-12ポリペプチド複合体は、3つのポリペプチド鎖を含み得る。一般的には、一方のポリペプチド鎖はp35またはp40 IL-12サブユニットのいずれかを含むが両方は含まず、第2のポリペプチドは他方のIL-12サブユニットを含み、第3のポリペプチドは遮断エレメントの少なくとも一部(構成要素)を含む。第1のポリペプチド上のIL-12サブユニットがp35である場合、第2のポリペプチド上のIL-12サブユニットはp40である。第1のポリペプチド上のIL-12サブユニットがp40である場合、第2のポリペプチド上のIL-12サブユニットはp35である。ポリペプチドが発現し、折り畳まれると、p35及びp40サブユニットが会合して生物学的に活性なヘテロ二量体が形成され得る。p35p40ヘテロ二量体複合体は、例えばジスルフィド結合を介して共有結合され得る。
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、存在する場合、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結される半減期延長エレメントをさらに含み得る。第2のポリペプチドは遮断エレメントの一部をさらに含み、第3のポリペプチドは遮断エレメントの残りを含み得る。そのような複合体において、IL-12遮断エレメントは、ポリペプチド2とポリペプチド3との相互作用によって形成される抗体の抗原結合フラグメント、例えばFabフラグメントであり得る。実施形態では、第2のポリペプチドは、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。あるいは、第2のポリペプチドは、抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。抗体軽鎖の抗原結合部分または重鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、第2のポリペプチドは、半減期延長エレメントを含み得る。第2のポリペプチドが半減期延長エレメントを含む場合、第1のポリペプチドは半減期延長エレメントを含まない。半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結され得る。あるいは、またはさらに、半減期延長エレメントは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して遮断エレメントの一部(例えば、抗体軽鎖の抗原結合部分または重鎖の抗原結合部分)に作動可能に連結され得る。半減期延長エレメントが存在し、IL-12サブユニットに作動可能に連結されている場合、抗体の重鎖または軽鎖は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントが存在し、IL-12サブユニットに作動可能に連結されている場合、抗体重鎖または軽鎖は、任意選択で切断性リンカーを介してIL-12サブユニットに作動可能に連結され得る。第1、第2、及び/またはポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体は、配列番号95~110、配列番号119~126、及び配列番号135~143から選択されるアミノ酸を含む第1のポリペプチド鎖を含む。特定の好ましいIL-12ポリペプチド複合体は、配列番号104または配列番号136のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体は、配列番号119~126、及び配列番号135~143から選択されるアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド配列と、配列番号18のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチドを含む。好ましいIL-12ポリペプチド複合体は、配列番号104のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖及び配列番号18のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖を含む。別の好ましいIL-12ポリペプチドは、配列番号136のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖と、配列番号18のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体の第1のポリペプチド鎖は、配列番号95~110、配列番号119~126、及び配列番号135~143から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体の第2のポリペプチド鎖は、配列番号18のアミノ酸配列に対して、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む。
上記のように、所望により、IL-12はムテインであり得る。IL-12ムテインは、IL-12活性、例えば、固有のIL-12受容体アゴニスト活性を保持している。IL-12サブユニット、p35及び/またはp40は、ムテインであり得る。好ましくは、IL-12ムテインは、改変されたグリコシル化パターンを有する。例えば、IL-12ムテインは、部分的にアグリコシル化または完全にアグリコシル化され得る。例えば、部分的または完全にアグリコシル化されたIL-12ポリペプチドは、配列番号104、434もしくは442~445からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号104、434もしくは442~445に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
p35及び/またはp40サブユニットは、1つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換を含み得る。例えば、p35及び/またはp40サブユニットは、約1、約2、約3、約4、約5またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。通常は、p35及び/またはp40サブユニットは、1つまたは2つのアミノ酸置換を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。一般的な修飾は、p35及び/またはp40サブユニットのグリコシル化パターンを改変し、それによりp35及び/またはp40サブユニットを部分的または完全にアグリコシル化する。好ましくは、アミノ酸改変は、アスパラギンアミノ酸の置換を含む。例えば、アスパラギンからグルタミンである。特定の例では、配列番号434のIL-12 p35のアミノ酸位置16、75、85、133、151、158、201、206、221、250、267、280、282、326、400、404、425、555、572、575、582、または602のアスパラギンを変異させることができる。特定の例では、配列番号18のIL-12 p40のアミノ酸位置103、114、163、219、227、または282のアスパラギンを変異させることができる。
本発明はまた、特定の単鎖IL-12誘導性ポリペプチドにも関する。本明細書に開示される単鎖IL-12ポリペプチドは、IL-12、遮断エレメント、半減期延長エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。IL-12は、同種のIL-12受容体に対する受容体アゴニスト活性を有する。遮断エレメントがIL-12に結合すると、IL-12受容体活性化活性は減弱する。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、活性型IL-12ポリペプチドが遊離する。単鎖誘導性IL-12ポリペプチドは、国際出願第PCT/US2019/032320号及び国際出願第PCT/US2019/032322号に開示されている。
本明細書に開示される単鎖IL-12誘導性ポリペプチドは、配列番号7、9、10、18、24~94、配列番号110~118、及び配列番号127~134から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単鎖IL-12誘導性ポリペプチドは、配列番号7、9、10、18、24~94、配列番号110~118、及び配列番号127~134と、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも99%同一である配列を含む。
B.IL-23ポリペプチド複合体
本開示は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含み、所望により3つのポリペプチド鎖またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る誘導性IL-23ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示される2つ以上のポリペプチド鎖は異なる、すなわち、複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などであり得る。誘導性IL-23ポリペプチド複合体は、p19 IL-23サブユニット、p40 IL-23サブユニット、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。p19サブユニットとp40サブユニットは会合してIL-23ヘテロ二量体を形成し、固有のIL-23受容体アゴニスト活性を有する。当業者によく理解されるように、IL-23及びIL-12は同じp40サブユニットを共有する。IL-23ポリペプチド複合体に関して、IL-23受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。IL-23受容体アゴニスト活性は、遮断エレメントによって減弱される。半減期延長エレメントはまた、例えば立体効果によって、減弱に寄与し得る。遮断エレメントは、立体的に遮断することにより、及び/またはIL-23(例えば、p19、p40、またはp19p40複合体)へ非共有結合することにより、IL-23の受容体アゴニスト活性のすべてまたは一部の活性を遮断することができる。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、IL-23ポリペプチド複合体から、活性な(例えば、IL-23ポリペプチド複合体より高活性な)形態のIL-23が遊離する。通常、遊離したIL-23は、IL-23ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも10倍活性が高い。好ましくは、遊離したIL-23は、IL-23ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも約10,000倍またはそれ以上の活性である。
本開示は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含み、所望により3つのポリペプチド鎖またはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る誘導性IL-23ポリペプチド複合体に関する。本明細書に開示される2つ以上のポリペプチド鎖は異なる、すなわち、複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などであり得る。誘導性IL-23ポリペプチド複合体は、p19 IL-23サブユニット、p40 IL-23サブユニット、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。p19サブユニットとp40サブユニットは会合してIL-23ヘテロ二量体を形成し、固有のIL-23受容体アゴニスト活性を有する。当業者によく理解されるように、IL-23及びIL-12は同じp40サブユニットを共有する。IL-23ポリペプチド複合体に関して、IL-23受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。IL-23受容体アゴニスト活性は、遮断エレメントによって減弱される。半減期延長エレメントはまた、例えば立体効果によって、減弱に寄与し得る。遮断エレメントは、立体的に遮断することにより、及び/またはIL-23(例えば、p19、p40、またはp19p40複合体)へ非共有結合することにより、IL-23の受容体アゴニスト活性のすべてまたは一部の活性を遮断することができる。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、IL-23ポリペプチド複合体から、活性な(例えば、IL-23ポリペプチド複合体より高活性な)形態のIL-23が遊離する。通常、遊離したIL-23は、IL-23ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも10倍活性が高い。好ましくは、遊離したIL-23は、IL-23ポリペプチド複合体に比べて、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも約10,000倍またはそれ以上の活性である。
融合タンパク質の切断時に遊離するIL-23の形態は典型的には半減期が短く、天然に存在するIL-23の半減期と実質的に同様であることが多く、IL-23サイトカイン活性を腫瘍微小環境にさらに制限する。IL-23ポリペプチド複合体の半減期は延長されるが、循環IL-23ポリペプチド複合体が減弱化され、活性型IL-23が目的の部位(例えば、腫瘍微小環境)に標的化されるため、毒性は軽減または排除される。
当業者であれば、ポリペプチド鎖の数、ならびにポリペプチド鎖上のp19及びp40サブユニット、半減期延長エレメント、プロテアーゼ切断性リンカー(複数可)、及び遮断エレメント(及びそのようなエレメントの構成要素、例えば、VHまたはVLドメイン)の位置が様々であり得、多くの場合、設計の好みの問題であることが理解されよう。そのような変形はすべて、本開示に包含される。
実施形態では、IL-23ポリペプチド複合体は、2つの異なるポリペプチド鎖を含む。通常、第1のポリペプチド鎖はp19を含み、第2のポリペプチド鎖はp40を含む。p19及びp40サブユニットは結合して、生物学的に活性なヘテロ二量体を形成する。p19p40ヘテロ二量体複合体は、例えばジスルフィド結合を介して共有結合され得る。
実施形態では、第1及び第2のポリペプチドのいずれかが、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結されたIL-23遮断エレメント(例えば、IL-23に結合するscFV)を含み得る。他方のポリペプチド鎖は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結された半減期延長エレメントをさらに含み得る。好ましくは、複合体は、1つの機能的遮断エレメント及び1つの機能的半減期延長エレメントを含む。例えば、第1のポリペプチド鎖がIL-23遮断エレメントを含む場合、第2のポリペプチド鎖はIL-23遮断エレメントを含まない。他の実施形態では、一方のポリペプチド鎖が、p19またはp40のいずれかを含み、さらに半減期延長エレメント及び遮断エレメントを含み、これらのそれぞれが、プロテアーゼ切断性リンカー(例えば、1つ以上のプロテアーゼ切断性リンカー)を介してp19またはp40に作動可能に連結し、他方のポリペプチドが、相補的なIL-23サブユニット(例えば、p40またはp19のいずれか)を含む。第2のポリペプチド上のIL-23遮断エレメントを、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結することができる。あるいは、IL-23遮断エレメントを、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結することができる。第1及び第2のポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、第1及び第2のポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは同じである。このIL-23ポリペプチド複合体における遮断エレメントは、単鎖抗体であり得る。IL-23に対して結合特異性を有する任意の単鎖抗体は、遮断エレメントとなり得る。好ましくは、遮断エレメントはscFvである。
本明細書に開示される複合体は、好ましくは、1つの半減期延長エレメント及び1つの遮断エレメントを含むが、そのようなエレメントは、同じポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上に存在する2つ以上の構成要素を含み得る。これを示し、本明細書において開示し、例示するように、遮断エレメントの構成要素を、別個のポリペプチド鎖上に存在させることができる。例えば、第1のポリペプチド鎖に、抗体軽鎖(VL+CL)または軽鎖可変ドメイン(VL)を含ませることができ、第2のポリペプチドに、第1のポリペプチド上のVL+CLまたはVLに相補的な抗体重鎖Fabフラグメント(VH+CH1)または重鎖可変ドメイン(VH)を含ませることができる。そのような状況では、これらの構成要素がペプチド複合体中で会合して、IL-23に結合してIL-23活性を減弱するFabなどの抗原結合部位を形成することができる。
実施形態では、p19及びp40サブユニットは、同じポリペプチド鎖上に位置し、任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して連結され得る。二本鎖または多重鎖複合体のそのような実施形態では、半減期延長エレメント、遮断エレメント、または半減期延長エレメントもしくは遮断エレメントの構成要素のうちの少なくとも1つは別のポリペプチド上にある。例えば、第1のポリペプチドは、任意選択で切断可能ポリペプチド鎖を介して連結されたp19及びp40を含み得、IL-23ポリペプチド複合体の他のエレメントは第2のポリペプチド鎖上に位置する。別の例では、第1のポリペプチド鎖は、p19サブユニット、p40サブユニット、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の一部を含む。第2のポリペプチドは、抗体軽鎖に相補的な抗体重鎖の一部を含む。抗体軽鎖の一部は、相補的な重鎖と一緒になって複合中で会合し、IL-23の結合部位を形成する。別の例では、第1のポリペプチドは、p19サブユニット、p40サブユニット、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の一部を含む。この例では、第2のポリペプチドは、抗体重鎖に相補的な抗体軽鎖の一部を含む。抗体重鎖の一部は、相補的な軽鎖と一緒になって複合中で会合し、IL-23の結合部位を形成する。これらの複合体において、p19サブユニット及びp40サブユニットは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して作動可能に連結され得る。好ましくは、p19サブユニット及びp40サブユニットは、非切断性リンカーによって作動可能に連結される。
本明細書に開示される複合体において、半減期延長エレメントは、好ましくは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp19サブユニットまたはp40サブユニットのいずれかに作動可能に連結される。例えば、複合体は、p19またはp40がプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結された第1のポリペプチドを含み得る。別の例では、複合体は、p19またはp40がプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結され、半減期延長エレメントが任意選択でプロテアーゼ切断性リンカーを介して遮断エレメント(または遮断エレメントの構成要素)にさらに作動可能に連結された第1のポリペプチドを含み得る。そのような例示的な実施形態では、複合体は、第1のポリペプチドには存在しないIL-23サブユニット(p40またはp19)を含む少なくとも1つの追加のポリペプチドを含む。複合体のエレメントの追加の配置は、本開示によって想定され、包含される。例えば、遮断エレメントを、プロテアーゼ切断性リンカーを介してp19サブユニットまたはp40サブユニットのいずれかに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントまたは遮断エレメントの一方を、p19サブユニットに作動可能に連結することができ、半減期延長エレメントまたは遮断エレメントの他方を、p40サブユニットに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントをp19サブユニットに作動可能に連結する場合、遮断エレメントをp40サブユニットに作動可能に連結することができる。半減期延長エレメントをp40サブユニットに作動可能に連結する場合、遮断エレメントをp19サブユニットに作動可能に連結することができる。この複合体における遮断エレメントは、好ましくはFabである。
誘導性IL-23ポリペプチド複合体は、3つのポリペプチド鎖を含み得る。一般的には、一方のポリペプチド鎖はp19またはp40 IL-23サブユニットのいずれかを含むが両方は含まず、第2のポリペプチドは他方のIL-23サブユニットを含み、第3のポリペプチドは遮断エレメントの少なくとも一部(構成要素)を含む。第1のポリペプチド上のIL-23サブユニットがp19である場合、第2のポリペプチド上のIL-23サブユニットはp40である。第1のポリペプチド上のIL-23サブユニットがp40である場合、第2のポリペプチド上のIL-23サブユニットはp19である。ポリペプチドが発現し、折り畳まれると、p19及びp40サブユニットが会合して生物学的に活性なヘテロ二量体が形成され得る。p19p40ヘテロ二量体複合体は、例えばジスルフィド結合を介して共有結合され得る。
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、存在する場合、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結される半減期延長エレメントをさらに含み得る。第2のポリペプチドは遮断エレメントの一部をさらに含み、第3のポリペプチドは遮断エレメントの残りを含み得る。そのような複合体において、IL-23遮断エレメントは、ポリペプチド2とポリペプチド3との相互作用によって形成される抗体の抗原結合フラグメント、例えばFabフラグメントであり得る。実施形態では、第2のポリペプチドは、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。あるいは、第2のポリペプチドは、抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み得る。抗体軽鎖の抗原結合部分または重鎖の抗原結合部分は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、第2のポリペプチドは、半減期延長エレメントを含み得る。第2のポリペプチドが半減期延長エレメントを含む場合、第1のポリペプチドは半減期延長エレメントを含まない。半減期延長エレメントは、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結され得る。あるいは、またはさらに、半減期延長エレメントは、任意選択のプロテアーゼ切断性リンカーを介して遮断エレメントの一部(例えば、抗体軽鎖の抗原結合部分または重鎖の抗原結合部分)に作動可能に連結され得る。半減期延長エレメントが存在し、IL-23サブユニットに作動可能に連結されている場合、抗体の重鎖または軽鎖は、プロテアーゼ切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結され得る。あるいは、半減期延長エレメントが存在し、IL-23サブユニットに作動可能に連結されている場合、抗体重鎖または軽鎖は、任意選択で切断性リンカーを介してIL-23サブユニットに作動可能に連結され得る。第1、第2、及び/またはポリペプチド鎖上のプロテアーゼ切断性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。
実施形態では、IL-23ポリペプチド複合体は、配列番号423~428からなる群、または配列番号423~428に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第1のポリペプチドを含む。実施形態では、IL-23ポリペプチド複合体は、配列番号18または433からなる群から選択される第2のポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、IL-23ポリペプチド複合体の第1のポリペプチド鎖は、配列番号423~428から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL-23ポリペプチド複合体の第2のポリペプチド鎖は、配列番号18または433のアミノ酸配列に対して、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む。
上記のように、所望により、IL-23はムテインであり得る。IL-23ムテインは、IL-23活性、例えば、固有のIL-23受容体アゴニスト活性を保持している。IL-23サブユニット、p19及び/またはp40はムテインであり得る。好ましくは、IL-23ムテインは、改変されたグリコシル化パターンを有する。例えば、IL-23ムテインは、部分的にアグリコシル化または完全にアグリコシル化され得る。
p19及び/またはp40サブユニットは、1つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換を含み得る。例えば、p19及び/またはp40サブユニットは、約1、約2、約3、約4、約5またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。通常は、p19及び/またはp40サブユニットは、1つまたは2つのアミノ酸置換を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。一般的な修飾は、p19及び/またはp40サブユニットのグリコシル化パターンを改変し、それによりp19及び/またはp40サブユニットを部分的または完全にアグリコシル化する。好ましくは、アミノ酸改変は、アスパラギンアミノ酸の置換を含む。例えば、アスパラギンからグルタミンである。例えば、アスパラギンからグルタミンである。特定の例では、配列番号424のIL-12 p19上のアミノ酸位置47または66のアスパラギンを変異させることができる。特定の例では、配列番号18のIL-12 p40のアミノ酸位置103、114、163、219、227、または282のアスパラギンを変異させることができる。
本発明はまた、特定の単鎖IL-23誘導性ポリペプチドにも関する。本明細書に開示される単鎖IL-23ポリペプチドは、IL-23、遮断エレメント、半減期延長エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含む。IL-23は、同種のIL-23受容体に対する受容体アゴニスト活性を有する。遮断エレメントがIL-23に結合すると、IL-23受容体活性化活性は減弱する。プロテアーゼ切断性リンカーが切断されると、活性型IL-23ポリペプチドが遊離する。
本明細書に開示される単鎖IL-23誘導性ポリペプチドは、配列番号422または429~432から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単鎖IL-23誘導性ポリペプチドは、配列番号422または429~432と、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも99%同一である配列を含む。
C.半減期延長エレメント
本明細書において、IL-12ポリペプチド複合体の半減期を延長するドメインが企図される。本明細書ではまた、IL-23ポリペプチドの半減期を延長するドメインも企図される。天然では半減期が短い治療用分子のインビボ半減期を増加させることにより、有効性を犠牲にすることなく、より許容できる管理可能な投与レジメンが可能になる。
本明細書において、IL-12ポリペプチド複合体の半減期を延長するドメインが企図される。本明細書ではまた、IL-23ポリペプチドの半減期を延長するドメインも企図される。天然では半減期が短い治療用分子のインビボ半減期を増加させることにより、有効性を犠牲にすることなく、より許容できる管理可能な投与レジメンが可能になる。
半減期延長エレメントは、in vivo半減期を延長させ、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体の改変された薬力学及び薬物動態を提供する。理論に拘束されるものではないが、半減期延長エレメントは、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体の組織分布、浸透、及び拡散の変化を含む薬力学特性を変化させる。いくつかの実施形態では、半減期延長エレメントは、半減期延長エレメントを含まないタンパク質と比較して、組織標的化、組織浸透、組織内での拡散を向上させ、効力を増強することができる。理論に拘束されるものではないが、ポリペプチドの薬物動態を向上させる例示的方法は、内皮細胞上のFcRn受容体及びトランスフェリン受容体等、リソソームで分解されるのではなく細胞の形質膜に再利用される受容体に結合するポリペプチド鎖のエレメントの発現によるものである。3種のタンパク質、例えば、ヒトIgG、HSA(またはフラグメント)、及びトランスフェリンは、ヒト血清中では、そのサイズだけから予測されるよりはるかに長く存続し、これは、リソソームで分解されるのではなく再利用される受容体に対するそれらの結合能の作用である。これらのタンパク質、またはフラグメントは、FcRn結合を保持しており、日常的な方法で他のポリペプチドに連結され、それらの血中半減期を延長させる。HSAはまた、医薬組成物に直接結合させても短いリンカーを介して結合させてもよい。HSAのフラグメントを使用してもよい。HSA及びそのフラグメントは、遮断エレメントとしても半減期延長エレメントとしても機能することができる。ヒトIgG及びFcフラグメントもまた同様の機能を実行することができる。
血中半減期延長エレメントはまた、血清アルブミン、トランスフェリンなどの長い血中半減期のタンパク質に結合する抗原結合ポリペプチドでもあり得る。そのようなポリペプチドの例には、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 単鎖可変フラグメント(scFv)、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)及びラクダ型ナノボディの可変ドメイン(VHH)、dAbを含む、抗体及びそのフラグメントが含まれる。他の好適な抗原結合ドメインとして、抗体の結合及び/または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、DARPin、フィノマー(fynomer)、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにSpA、GroEL、フィブロネクチン、リポカリン及びCTLA4足場などの他の改変された足場に基づく結合ドメインが挙げられる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例には、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び1つ以上の標的抗原に結合するかまたは会合するペプチドが含まれる。
本明細書に提供される半減期延長エレメントは、好ましくは、ヒト血清アルブミン(HSA)結合ドメイン、及びヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンFcもしくはそのフラグメントである。
IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体の半減期延長エレメントは、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体の半減期を、少なくとも約2日、約3日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日またはそれ以上延長させる。いくつかの実施形態では、半減期延長エレメントは、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体の半減期を、少なくとも2~3日、3~4日、4~5日、5~6日、6~7日、7~8日またはそれ以上延長させる。
D.遮断エレメント
遮断エレメントは、IL-12またはIL-23に結合し、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体がその受容体に結合して活性化する能力を阻害する任意のエレメントであり得る。遮断エレメントは、IL-12またはIL-23がその受容体に結合し、及び/または活性化する能力を、例えば、立体的に遮断することによって、及び/またはIL-12ポリペプチド複合体に共有結合で結合することによって阻害することができる。本明細書に開示される遮断エレメントは、p19、p35、p40、p35p40ヘテロ二量体複合体、またはp19p40ヘテロ二量体複合体に結合することができる。
遮断エレメントは、IL-12またはIL-23に結合し、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体がその受容体に結合して活性化する能力を阻害する任意のエレメントであり得る。遮断エレメントは、IL-12またはIL-23がその受容体に結合し、及び/または活性化する能力を、例えば、立体的に遮断することによって、及び/またはIL-12ポリペプチド複合体に共有結合で結合することによって阻害することができる。本明細書に開示される遮断エレメントは、p19、p35、p40、p35p40ヘテロ二量体複合体、またはp19p40ヘテロ二量体複合体に結合することができる。
好適な遮断エレメントの例として、IL-12の同族受容体の全長またはIL-12結合フラグメントまたはムテインが挙げられる。好適な遮断エレメントの他の例として、IL-23の同族受容体の全長またはIL-23結合フラグメントまたはムテインが挙げられる。ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 単鎖可変フラグメント(scFv)、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)及びラクダ型ナノボディの可変ドメイン(VHH)、dAbなどを含む、IL-12またはIL-23に結合する抗体及び抗体結合フラグメントもまた、使用することができる。IL-12またはIL-23と結合する他の好適な抗原結合ドメインも使用することができ、これには、抗体の結合及び/または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、DARPin、フィノマー(fynomer)、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにSpA、GroEL、フィブロネクチン、リポカリン及びCTLA4足場などの他の改変された足場に基づく結合ドメインが含まれる。好適な遮断ポリペプチドのさらなる例には、IL-12またはIL-23のその同族受容体への結合を立体的に阻害または遮断するポリペプチドが含まれる。有利なことに、そのような部分はまた、半減期延長エレメントとしても機能する。例えば、PEGなどの水溶性ポリマーへの結合により修飾されているペプチドは、サイトカインのその受容体への結合を立体的に阻害または防止することができる。血清アルブミン(ヒト血清アルブミン)、免疫グロブリンFc、トランスフェリンなど、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント及びムテインなど、長い血中半減期を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを使用することもできる。
好ましいIL-12遮断エレメントは、単鎖可変フラグメント(scFv)またはFabフラグメントである。好ましいIL-23遮断エレメントは、単鎖可変フラグメント(scFv)またはFabフラグメントである。scFv遮断エレメントは、配列番号145~188に記載のアミノ酸配列を含む。あるいは、Fab遮断エレメントは、配列番号189~194に記載のアミノ酸配列を含む。配列番号145~194に包含されるIL-12抗体フラグメントは、本明細書に開示するIL-12ポリペプチド複合体の発展性を高めるために最適化されている。
好ましい抗体軽鎖遮断エレメントは、配列番号192~193を含む。これらの好ましい構成要素を、1つのポリペプチド鎖上に配置することができ、重鎖の相補的な抗原結合部分を、第2のポリペプチド鎖上に配置することができる。好ましい重鎖遮断エレメントは、配列番号189~191及び194を含む。これらの好ましい構成要素を、1つのポリペプチド鎖上に配置することができ、相補的な軽鎖を第2のポリペプチド鎖上に配置する。抗体の軽鎖と抗体の重鎖が一緒になって、IL-12の結合部位を形成する。
いくつかの実施形態では、IL-12遮断エレメントは、配列番号145~194と、例えば、配列番号145~194の全長にわたって、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む。一般的には、CDRのアミノ酸配列は改変されておらず、アミノ酸置換がフレームワーク領域に存在する。
本開示はまた、配列番号145~194を含むIL-12遮断エレメントの機能的バリアントに関する。配列番号145~194を含むIL-12遮断エレメントの機能的バリアントは、一般に、配列番号145~194とは、1つまたはいくつかのアミノ酸(置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを含む)だけ異なり、実質的にIL-12ポリペプチド(例えば、p35サブユニット、p40サブユニット、またはp35p40複合体)に結合する能力を保持し、IL-12が同族受容体へ結合することを阻害する。
機能的バリアントは、配列番号145~194を含むIL-12遮断エレメントと比較して、少なくとも1つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得る。機能的バリアントは、配列番号145~194を含むIL-12遮断エレメントと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸変化を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、機能的バリアントは、配列番号145~194を含むIL-12遮断エレメントとは、10未満、8未満、5未満、4未満、3未満、2未満、または1つのアミノ酸の変化、例えば、アミノ酸の置換または欠失だけ異なっている。他の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号145~194と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。
他の実施形態では、IL-12遮断エレメントの機能的バリアントは、配列番号145~194を含むIL-12遮断エレメントと比較して、1、2、3、4、または5個以上の非保存的アミノ酸置換を含み得る。非保存的アミノ酸置換は、当業者によって認識され得る。分離部分の機能的バリアントは、好ましくは、1、2、3、4、または5個以下のアミノ酸欠失を含む。
IL-12に対する特異性を有する遮断エレメントを含み、半減期延長エレメントを含む誘導性IL-12ポリペプチドも本明細書に開示される。IL-23に対する特異性を有する遮断エレメントを含み、半減期延長エレメントを含む誘導性IL-12ポリペプチドも本明細書に開示される。遮断エレメントは、IL-12、特に本明細書に開示される配列番号421によって定義されるIL-12サブユニットβ前駆体(p40)に対する結合特異性を有する抗体または抗原結合フラグメントである。抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号421の表1に示される残基に結合する抗原結合ドメインを含む。本開示は、表1に示されるアミノ酸残基によって定義されるIL-12エピトープに結合する抗体または抗原結合フラグメント、及びそのような抗体または抗原結合フラグメントを含む誘導性IL-12ポリペプチド複合体、ならびに誘導性IL-12ポリペプチド複合体、またはそのような誘導性IL-12ポリペプチド複合体を含む薬剤を調製するための、そのような抗体または抗原結合フラグメントの使用に関する。
E.プロテアーゼ切断性リンカー
本明細書に開示されるように、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体は、1つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、ポリペプチド間に柔軟性を提供するのに役立ち、それにより、例えば、遮断エレメントは、IL-12またはIL-23の活性を阻害することができる。リンカーは、IL-12サブユニットまたはIL-23サブユニット、半減期延長エレメント、及び/または遮断エレメントの間に配置することができる。本明細書に記載されるように、IL-12ポリペプチド複合体は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。本明細書に記載されるように、IL-23ポリペプチド複合体は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。プロテアーゼ切断性リンカーは、1つ以上の所望のプロテアーゼのための1つ以上の切断部位を含み得る。好ましくは、所望のプロテアーゼを、IL-12またはIL-23活性の所望の標的部位(例えば、腫瘍微小環境)において濃縮するかまたは選択的に発現させる。したがって、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、所望のIL-12活性またはIL-23活性の標的部位で優先的または選択的に切断する。
本明細書に開示されるように、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体は、1つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、ポリペプチド間に柔軟性を提供するのに役立ち、それにより、例えば、遮断エレメントは、IL-12またはIL-23の活性を阻害することができる。リンカーは、IL-12サブユニットまたはIL-23サブユニット、半減期延長エレメント、及び/または遮断エレメントの間に配置することができる。本明細書に記載されるように、IL-12ポリペプチド複合体は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。本明細書に記載されるように、IL-23ポリペプチド複合体は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。プロテアーゼ切断性リンカーは、1つ以上の所望のプロテアーゼのための1つ以上の切断部位を含み得る。好ましくは、所望のプロテアーゼを、IL-12またはIL-23活性の所望の標的部位(例えば、腫瘍微小環境)において濃縮するかまたは選択的に発現させる。したがって、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、所望のIL-12活性またはIL-23活性の標的部位で優先的または選択的に切断する。
好適なリンカーは、一般的には約100未満のアミノ酸である。そのようなリンカーは、1アミノ酸(例えば、Gly)~30アミノ酸、1アミノ酸~40アミノ酸、1アミノ酸~50アミノ酸、1アミノ酸~60アミノ酸、1~70アミノ酸、1~80アミノ酸、1~90アミノ酸、及び1~100アミノ酸などの異なる長さであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約1、約2、約3、約4、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、または約100アミノ酸長である。好ましいリンカーは、一般的には、約5アミノ酸~約30アミノ酸である。
好ましくは、リンカーの長さは、リンカーが連結ドメインの立体配座または相互作用にいかなる制約も課さないように、条件ごとに最適化された、2~30アミノ酸の間で様々に異なり得る。好ましい実施形態では、リンカーは、切断剤、例えば酵素によって切断可能である。好ましくは、分離部分は、プロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合では、分離部分は、1つ以上の切断部位を含む。分離部分は、単一のプロテアーゼ切断部位を含み得る。分離部分はまた、2つ以上のプロテアーゼ切断部位を含み得る。例えば、2つの切断部位、3つの切断部位、4つの切断部位、5つの切断部位、またはそれ以上である。分離部分が2つ以上のプロテアーゼ切断部位を含む場合、切断部位は同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼによって切断し得る。2つ以上の切断部位を含む分離部分は、「タンデムリンカー」と呼ばれる。2つ以上の切断部位は、別の切断部位に隣接する1つの切断部位、別の切断部位と重なる1つの切断部位、または2つの切断部位の間に介在アミノ酸を有する別の切断部位が続く1つの切断部位を含むがこれらに限定されない、任意の所望の方向に配置することができる。
本発明において特に興味深いのは、疾患特異的プロテアーゼ切断性リンカーである。末梢循環と比較して、腫瘍微小環境などの体内の所望の位置で優先的に切断されるプロテアーゼ切断性リンカーも好ましい。例えば、プロテアーゼ切断性リンカーが腫瘍微小環境で切断される速度は、末梢循環中(例えば、血漿中)と比較して、体内の所望の位置、例えば、腫瘍微小環境において、少なくとも約10倍、少なくとも約100倍、少なくとも約1000倍、または少なくとも約10,000倍速くなり得る。
罹患した細胞または組織に関連することが知られているプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンG、カテプシンK、カテプシンL、カリクレイン、hKl、hK10、hK15、プラスミン、コラゲナーゼ、IV型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Xa因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ-3、Mirl-CP、パパイン、HIV-1プロテアーゼ、HSVプロテアーゼ、CMVプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP13、MMP11、MMP14、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原(PSA、hK3)、インターロイキン-1β変換酵素、トロンビン、FAP(FAPα)、ジペプチジルペプチダーゼ、メプリン、グランザイム及びジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーアミノ酸配列(本明細書で提供されるキメラ核酸配列によりコードされ得る)を切断することができるプロテアーゼは、例えば、前立腺特異抗原(PSA)、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、Aディスインチグリン及びメタロプロテアーゼ(ADAM)、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、腫瘍細胞表面プロテアーゼ、及びエラスターゼからなる群から選択され得る。MMPは、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ2(MMP2)、マトリックスメタロプロテアーゼ9(MMP9)、マトリックスメタロプロテアーゼ14(MMP14)であり得る。さらに、またはあるいは、リンカーは、カテプシン、例えば、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンG、カテプシンK、及び/またはカテプシンLによって切断され得る。好ましくは、リンカーは、MMP14またはカテプシンLによって切断され得る。
例示的なプロテアーゼ切断性リンカーとして、カリクレイン切断性リンカー、トロンビン切断性リンカー、キマーゼ切断性リンカー、カルボキシペプチダーゼA切断性リンカー、カテプシン切断性リンカー、エラスターゼ切断性リンカー、FAP切断性リンカー、ADAM切断性リンカー、PR-3切断性リンカー、グランザイムM切断性リンカー、カルパイン切断性リンカー、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)切断性リンカー、プラスミノーゲン活性化因子切断性リンカー、カスパーゼ切断性リンカー、トリプターゼ切断性リンカー、または腫瘍細胞表面プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特に、MMP9切断性リンカー、ADAM切断性リンカー、CTSL1切断性リンカー、FAPα切断性リンカー、及びカテプシン切断性リンカーである。いくつかの好ましいプロテアーゼ切断性リンカーは、MMP及び/またはカテプシンによって切断される。
本明細書に開示される分離部分は、一般的には100未満のアミノ酸である。そのような分離部分は、1アミノ酸(例えば、Gly)~30アミノ酸、1アミノ酸~40アミノ酸、1アミノ酸~50アミノ酸、1アミノ酸~60アミノ酸、1~70アミノ酸、1~80アミノ酸、1~90アミノ酸、及び1~100アミノ酸などの異なる長さであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約1、約2、約3、約4、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、または約100アミノ酸長である。好ましいリンカーは、一般的には、約5アミノ酸~約30アミノ酸である。
好ましくは、リンカーの長さは、リンカーが連結ドメインの立体配座または相互作用にいかなる制約も課さないように、条件ごとに最適化された、2~30アミノ酸の間で様々に異なり得る。
いくつかの実施形態では、分離部分は、配列GPAGLYAQ(配列番号195);GPAGMKGL(配列番号196);PGGPAGIG(配列番号197);ALFKSSFP(配列番号198);ALFFSSPP(配列番号199);LAQRLRSS(配列番号200);LAQKLKSS(配列番号201);GALFKSSFPSGGGPAGLYAQGGSGKGGSGK(配列番号202);RGSGGGPAGLYAQGSGGGPAGLYAQGGSGK(配列番号203);KGGGPAGLYAQGPAGLYAQGPAGLYAQGSR(配列番号204);RGGPAGLYAQGGPAGLYAQGGGPAGLYAQK(配列番号205);KGGALFKSSFPGGPAGIGPLAQKLKSSGGS(配列番号206);SGGPGGPAGIGALFKSSFPLAQKLKSSGGG(配列番号207);RGPLAQKLKSSALFKSSFPGGPAGIGGGGK(配列番号208);GGGALFKSSFPLAQKLKSSPGGPAGIGGGR(配列番号209);RGPGGPAGIGPLAQKLKSSALFKSSFPGGG(配列番号210);RGGPLAQKLKSSPGGPAGIGALFKSSFPGK(配列番号211);RSGGPAGLYAQALFKSSFPLAQKLKSSGGG(配列番号212);GGPLAQKLKSSALFKSSFPGPAGLYAQGGR(配列番号213);GGALFKSSFPGPAGLYAQPLAQKLKSSGGK(配列番号214);RGGALFKSSFPLAQKLKSSGPAGLYAQGGK(配列番号215);RGGGPAGLYAQPLAQKLKSSALFKSSFPGG(配列番号216);SGPLAQKLKSSGPAGLYAQALFKSSFPGSK(配列番号217);KGGPGGPAGIGPLAQRLRSSALFKSSFPGR(配列番号218);KSGPGGPAGIGALFFSSPPLAQKLKSSGGR(配列番号219);またはSGGFPRSGGSFNPRTFGSKRKRRGSRGGGG(配列番号220)を含む。
特定の好ましい分離部分は、配列GPAGLYAQ(配列番号195)またはALFKSSFP(配列番号198)を含む。本明細書に開示される分離部分は、同一または異なる1つ以上の切断モチーフまたは機能的バリアントを含み得る。分離部分は、1、2、3、4、5、またはそれ以上の切断モチーフまたは機能的バリアントを含み得る。30個のアミノ酸を含む分離部分は、2つの切断モチーフまたは機能的バリアント、3つの切断モチーフまたは機能的バリアント、またはそれ以上を含み得る。分離部分の「機能的バリアント」は、標的部位(例えば、高レベルのプロテアーゼを発現する腫瘍微小環境)で高効率で切断される能力を保持し、末梢(例えば、血清)では切断されないか、または低効率で切断される。例えば、機能的バリアントは、配列番号195~220または447~448のいずれか1つを含む分離部分の切断効率の少なくとも約50%、約55%、約60%、約70%、約80%、約85%、約95%またはそれ以上を保持する。
複数の切断モチーフを含む分離部分は、配列番号195~201または447~448及びそれらの組み合わせから選択され得る。複数の切断モチーフを含む好ましい分離部分は、配列番号202~220から選択されるアミノ酸を含む。
分離部分は、ALFKSSFP(配列番号198)及びGPAGLYAQ(配列番号195)の両方を含み得る。分離部分は、配列GPAGLYAQ(配列番号195)をそれぞれ有する2つの切断モチーフを含み得る。あるいは、またはさらに、分離部分は、それぞれが配列ALFKSSFP(配列番号198)を有する2つの切断モチーフを含み得る。分離部分は、同じかまたは異なる第3の切断モチーフを含み得る。
いくつかの実施形態では、分離部分は、配列番号195~配列番号220または447~448と、配列番号195~220または配列番号447~448の全長にわたって、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、配列番号195~220または447~448を含む分離部分の機能的バリアントにも関する。配列番号195~220または447~448を含む分離部分の機能的バリアントは、一般に、配列番号195~220または447~448と、1つまたはいくつかのアミノ酸(置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを含む)だけ異なっており、プロテアーゼによって切断される能力を実質的に保持している。
機能的バリアントは、配列番号195~220または447~448を含む分離部分に対して、少なくとも1つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得る。機能的バリアントは、配列番号195~220または447~448を含む分離部分に細分された1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸改変を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、機能的バリアントは、配列番号195~220を含む分離部分とは、10未満、8未満、5未満、4未満、3未満、2未満、または1つのアミノ酸の変化、例えば、アミノ酸の置換または欠失だけ異なっている。他の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号195~220または447~448と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換であり得るが、好ましくは保存的置換である。
他の実施形態では、分離部分の機能的バリアントは、配列番号195~220または447~448を含む分離部分と比較して、1、2、3、4、または5個以上の非保存的アミノ酸置換を含み得る。非保存的アミノ酸置換は、当業者によって認識され得る。分離部分の機能的バリアントは、好ましくは、1、2、3、4、または5個以下のアミノ酸欠失を含む。
分離部分に開示されたアミノ酸配列は、被切断結合に対する分離部分の相対的な直線的位置によって説明することができる。当業者によって十分に理解されるように、8個のアミノ酸プロテアーゼ基質を含む分離部分(例えば、配列番号195~201または447~448)は、位置P4、P3、P2、P1、P1’、P2’、P3’、P4’であり、被切断結合はP1とP1’の間にある。例えば、配列GPAGLYAQ(配列番号195)を含む分離部分のアミノ酸位置は、以下のように記載することができる:
好ましくは、切断部位を取り囲むアミノ酸(例えば、配列番号195~201または447~448のP1及びP1’位)は置換されない。
実施形態では、分離部分は、配列GPAGLYAQ(配列番号195)もしくはALFKSSFP(配列番号198)または配列番号195の機能的バリアントもしくは配列番号198の機能的バリアントを含む。本明細書に記載されるように、PAGLYAQ(配列番号447)またはALFKSSFP(配列番号198)の機能的バリアントは、1つ以上のアミノ酸置換を含み得、プロテアーゼによって切断される能力を実質的に保持している。具体的には、GPAGLYAQ(配列番号195)の機能的バリアントはMMP14によって切断され、ALFKSSFPの機能的バリアント(配列番号198)は、カプテプシンL(CTSL1)によって切断される。機能的バリアントは、標的部位(例えば、高レベルのプロテアーゼを発現する腫瘍微小環境)で高効率で切断される能力も保持している。例えば、GPAGLYAQ(配列番号195)またはALFKSSFP(配列番号198)の機能的バリアントは、それぞれ、アミノ酸配列GPAGLYAQ(配列番号195)またはALFKSSFP(配列番号198)を含む分離部分の切断効率の少なくとも約50%、約55%、約60%、約70%、約80%、約85%、約95%またはそれ以上を保持している。
好ましくは、GPAGLYAQ(配列番号195)またはALFKSSFP(配列番号198)の機能的バリアントは、GPAGLYAQ(配列番号195)またはALFKSSFP(配列番号198)と比較して、1、2、3、4、または5個以下の保存的アミノ酸置換を含む。好ましくは、位置P1及びP1’のアミノ酸は置換されない。配列番号195のP1位及びP1’位のアミノ酸はG及びLであり、配列番号198のP1位及びP1’位のアミノ酸はK及びSである。
GPAGLYAQ(配列番号195)の機能的バリアントは、好ましくは、以下の1つ以上を含み得る:a)位置P4でのアルギニンアミノ酸置換、b)位置P3でのロイシン、バリン、アスパラギン、またはプロリンアミノ酸置換、c)位置P2でのアスパラギンアミノ酸置換、d)位置P1でのヒスチジン、アスパラギン、またはグリシンアミノ酸置換、e)位置P1’でのアスパラギン、イソロイシン、またはロイシンアミノ酸置換、f)位置P2’でのチロシンまたはアルギニンアミノ酸置換、g)位置P3’でのグリシン、アルギニン、またはアラニンアミノ酸置換、h)位置P4’でのセリン、グルタミン、またはリジンアミノ酸置換。以下のアミノ酸置換は、GPAGLYAQ(配列番号195)の機能的バリアントにおいて好ましくない:a)P3位のアルギニンまたはイソロイシン、b)P2位のアラニン、c)P1位のバリン、d)P1’位のアルギニン、グリシン、アスパラギン、またはスレオニン、e)P2’位のアスパラギン酸またはグルタミン酸、f)P3’位のイソロイシン、g)P4’位のバリン。いくつかの実施形態では、GPAGLYAQ(配列番号195)の機能的バリアントは、P1及び/またはP1’位にアミノ酸置換を含まない。
GPAGLYAQ(配列番号195)の機能的バリアントのアミノ酸置換は、好ましくは位置P4及び/またはP4’でのアミノ酸置換を含む。例えば、GPAGLYAQ(配列番号195)の機能的バリアントは、位置P4にロイシン、または位置P4にセリン、グルタミン、リジン、もしくはフェニルアラニンを含み得る。あるいは、またはさらに、GPAGLYAQ(配列番号195)の機能的バリアントは、位置P4’にグリシン、フェニルアラニン、またはプロリンを含み得る。
いくつかの実施形態では、GPAGLYAQ(配列番号195)の位置P2またはP2’でのアミノ酸置換は好ましくない。
いくつかの実施形態では、GPAGLYAQ(配列番号195)の機能的バリアントは、配列番号221~295から選択されるアミノ酸配列を含む。GPAGLYAQ(配列番号195)の特定の機能的バリアントには、GPLGLYAQ(配列番号259)、及びGPAGLKGA(配列番号249)が含まれる。
LFKSSFP(配列番号448)の機能的バリアントは、好ましくは疎水性アミノ酸置換を含む。LFKSSFP(配列番号448)の機能的バリアントは、好ましくは、以下のうちの1つ以上を含み得る:(a)P4位のリジン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、ロイシン、プロリン、またはフェニルアラニン;(b)P3位のリジン、ヒスチジン、グリシン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン;(c)P2位のアルギニン、ロイシン、アラニン、グルタミン、またはヒスタチン;(d)P1位のフェニルアラニン、ヒスチジン、スレオニン、アラニン、またはグルタミン;(e)P1’位のヒスチジン、ロイシン、リジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、フェニルアラニン、アスパラギン、グルタミン酸、またはグリシン;(f)P2’位のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アラニン、グルタミン、またはプロリン;(g)P3’位のフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、セリン、バリン、ヒスチジン、アラニン、またはアスパラギン;及びフェニルアラニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、セリン、バリン、グルタミン、リジン、またはロイシン。
配列番号448の機能的バリアントにおけるアスパラギン酸及び/またはグルタミン酸の含有は、一般に好ましくなく、回避される。LFKSSFP(配列番号448)の機能的バリアントにおいて、以下のアミノ酸置換も好ましくない:(a)P3位のアラニン、セリン、またはグルタミン酸;(b)P2位のプロリン、スレオニン、グリシン、またはアスパラギン酸;(c)P1位のプロリン;(d)P1’位のプロリン;(e)P2’位のグリシン;(f)P3’位のリジンまたはグルタミン酸;(g)P4’位のアスパラギン酸。
LFKSSFP(配列番号448)の機能的バリアントのアミノ酸置換は、好ましくは位置P4及び/またはP1でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、LFKSSFP(配列番号448)の機能的バリアントの位置P4’でのアミノ酸置換は好ましくない。
いくつかの実施形態では、LFKSSFP(配列番号448)の機能的バリアントは、配列番号296~374から選択されるアミノ酸配列を含む。LFKSSFP(配列番号448)の特定の機能的バリアントには、ALFFSSPP(配列番号199)、ALFKSFPP(配列番号346)、ALFKSLPP(配列番号347);ALFKHSPP(配列番号335);ALFKSIPP(配列番号348);ALFKSSLP(配列番号356);またはSPFRSSRQ(配列番号297)が含まれる。
本明細書に開示される分離部分は、生理学的条件下でそれらが連結するアミノ酸配列(例えばドメイン)と安定な複合体を形成し得るが、プロテアーゼによって切断され得る。例えば、分離部分は、循環中で安定であり(例えば、切断されないか、または低効率で切断される)、標的部位(すなわち、腫瘍微小環境)でより高い効率で切断される。したがって、本明細書に開示されるリンカーを含む融合ポリペプチドは、所望により、別個の分子実体としての融合ポリペプチドの構成要素と比較して、延長された循環半減期及び/または循環中での低い生物学的活性を有し得る。しかし、所望の位置(例えば、腫瘍微小環境)にある場合、リンカーは効率的に切断されて、リンカーによって接続されている構成要素を遊離させ、別個の分子実体として構成要素の半減期及び生物学的活性を回復させるか、またはほぼ回復させることができる。
分離部分は、望ましくは、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも10時間、少なくとも15時間、少なくとも20時間、少なくとも24時間、少なくとも30時間、少なくとも35時間、少なくとも40時間、少なくとも45時間、少なくとも50時間、少なくとも60時間、少なくとも65時間、少なくとも70時間、少なくとも80時間、少なくとも90時間、またはそれ以上、循環中で安定なままである。
いくつかの実施形態では、分離部分は、標的位置と比較して、循環中では、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、20%、5%、または1%未満で切断される。分離部分はまた、リンカーを切断することができる酵素の非存在下でも安定である。しかしながら、好適な酵素(すなわち、プロテアーゼ)にさらされると、分離部分が切断され、連結されたドメインが分離される。
F.医薬組成物
本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を含む医薬組成物、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはこのベクターによって形質転換された宿主細胞及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体も、本明細書に提供する。
本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を含む医薬組成物、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはこのベクターによって形質転換された宿主細胞及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体も、本明細書に提供する。
本明細書において、本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤または組成物を提供する。本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を含む組成物は、in vitroまたはin vivoでの投与に適している。用語「薬学的に許容される担体」には、成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される対象に対して毒性ではない任意の担体が含まれるが、これらに限定されない。好適な薬学的担体の例は、当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば、油/水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物はまた、防腐剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによって確保され得る。
好適な担体及びそれらの製剤は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,David B.Troy,ed.,Lippicott Williams & Wilkins(2005)に記載されている。一般的には、適切な量の薬理学的に許容される塩を製剤中に用いて製剤を等張性にするが、所望であれば、製剤は高張性または低張性であり得る。薬理学的に許容される担体の例としては、滅菌水、生理食塩水、リンゲル液のような緩衝液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のpHは一般に、約5~約8または約7~7.5である。他の担体には、免疫原性ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス等の徐放性調製物が含まれる。マトリクスは、例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子などの成形物品の形態にある。例えば、投与経路及び投与する組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましい場合がある。担体は、ヒトまたは他の対象に対するIL-12またはIL-23ポリペプチド複合体またはIL-12またはIL-23ポリペプチド複合体をコードする核酸配列の投与に適した担体である。
医薬組成物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、ナノ粒子にカプセル化する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、またはナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体をリポソームに結合させる。いくつかの例では、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、リポソームの表面に複合体化する。いくつかの例では、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、リポソームのシェル内にカプセル化する。いくつかの例では、リポソームはカチオン性リポソームである。
本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体は、医薬品としての使用が意図されている。投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって行われる。いくつかの実施形態では、投与経路は、治療の種類及び医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは、主治医及び他の臨床的要因によって決定される。1人の患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与する特定の化合物、投与の時間と経路、治療の種類、全般的な健康状態、及び同時に投与される他の薬剤など、多くの要因によって異なる。「有効用量」とは、疾患の経過及び重症度に影響を与え、そのような病状の軽減または寛解をもたらすのに十分な活性成分の量を指し、既知の方法を使用して決定され得る。
任意選択で、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-12ポリペプチドをコードする核酸配列を、ベクターによって投与する。任意選択で、IL-23ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチドをコードする核酸配列を、ベクターによって投与する。in vitroまたはin vivoのいずれかで、例えば、発現ベクターを介して、核酸分子及び/またはポリペプチドを細胞に送達するために用いることができる、多数の組成物及び方法がある。これらの方法及び組成物は、ウイルスベースの送達系と非ウイルスベースの送達系の2つの種類に大別することができる。そのような方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載する組成物及び方法とともに使用するために容易に適合可能である。そのような組成物及び方法は、in vitroまたはin vivoで細胞をトランスフェクトまたは形質導入するため、例えば、コードされたキメラポリペプチドを発現し、好ましくは分泌する細胞株を製造するため、または核酸を対象に治療的に送達するために使用することができる。本明細書に開示されるIL-12ポリペプチドまたはIL-23ポリペプチドの構成要素は、通常、融合タンパク質をコードするようにインフレームで作動可能に連結される。
本明細書で使用する場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示される核酸を分解されない状態で細胞に輸送し、かつ、送達先の細胞に核酸分子及び/またはポリペプチドの発現をもたらすプロモーターを含む物質である。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビス、及び他のRNAウイルスなどであり、これらのウイルスでHIV骨格を有するものが含まれる。また、これらのウイルスの特性を共有し、ベクターとしての使用に適した任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスベクターは、概説及びその製造方法が、Coffin et al.,Retroviruses,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)に記載されている。複製欠損型アデノウイルスの構築が記載されている(Berkner et al.,J.Virol.61:1213-20(1987);Massie et al.,Mol.Cell. Biol.6:2872-83(1986);Haj-Ahmad et al.,J.Virol.57:267-74(1986);Davidson et al.,J.Virol.61:1226-39(1987);Zhang et al.,BioTechniques 15:868-72(1993))。ベクターとしてのこれらのウイルスの利点及び用途は、それらが最初の感染細胞内で複製することができるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないため、他の細胞型に伝播することができる範囲が制限されることである。組換え型アデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質、及び他の多くの組織部位への直接のin vivo送達後に高効率を達成することが示されている。他の有用な系として、例えば、複製ワクシニアウイルスベクター及び宿主限定非複製ワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
提供されるIL-12ポリペプチド複合体及び/または核酸分子は、ウイルス様粒子を介して送達することができる。提供されるIL-23ポリペプチド複合体及び/または核酸分子は、ウイルス様粒子を介して送達することができる。ウイルス様粒子(VLP)は、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスタンパク質(複数可)からなる。ウイルス様粒子を作製及び使用するための方法は、例えば、Garcea and Gissmann,Current Opinion in Biotechnology 15:513-7(2004)に記載されている。
本明細書に開示されるIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体は、サブウイルスデンスボディ(DB)によって送達され得る。DBは、膜融合によってタンパク質を標的細胞に輸送する。DBを作製及び使用するための方法は、例えば、Pepperl-Klindworth et al.,Gene Therapy 10:278-84(2003)に記載されている。提供されるポリペプチドは、外被凝集体によって送達することができる。外被凝集体を作製及び使用するための方法は、国際公開公報第WO2006/110728号に記載されている。
非ウイルス系送達方法には、核酸分子及びポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含めることができ、ここで、核酸は、発現制御配列に機能的に連結される。好適なベクター骨格には、例えば、プラスミド、人工染色体、BAC、YAC、またはPACなどの当技術分野で日常的に使用されるものが含まれる。多数のベクター及び発現系が、Novagen(Madison,Wis.)、Clonetech(Pal Alto,Calif.)、Stratagene(La Jolla,Calif.)、及びInvitrogen/Life Technologies(Carlsbad,Calif.)などの企業から市販されている。ベクターは、通常、1つ以上の調節領域を含有する。調節領域には、限定されないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、5’及び3’の非翻訳領域(UTR)、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、及びイントロンが含まれる。そのようなベクターはまた、CHO細胞などの好適な宿主細胞で発現させることによって、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を作製するために使用することもできる。
哺乳類宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源から得てよく、例えば、ポリオーマウイルス、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルス(CMV)などのウイルスのゲノムから得るか、または異種哺乳類プロモーター、例えば、β-アクチンプロモーターもしくはEF1αプロモーターから得るか、またはハイブリッドもしくキメラプロモーター(例えば、β-アクチンプロモーターに融合させたCMVプロモーター)から得てよい。当然のことながら、宿主細胞または関連種由来のプロモーターもまた本明細書では有用である。
エンハンサーとは、一般に、機能する転写開始部位からの距離が一定ではなく、転写単位に対して5’でも3’でもあり得るDNA配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内部にあり得、またコード配列自体の内部にもあり得る。それらは、通常、長さが10~300塩基対(bp)であり、シスで機能する。エンハンサーは通常、近傍のプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーには、転写の調節を媒介する応答配列を含有させることもできる。哺乳類の遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、及びインスリン)由来の多くのエンハンサー配列が知られており、通常、一般的な発現には真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーター及び/またはエンハンサーは誘導性であり得る(例えば、化学的または物理的に調節される)。化学的に調節されるプロモーター及び/またはエンハンサーは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、または金属の存在によって調節され得る。物理的に調節されるプロモーター及び/またはエンハンサーは、例えば、温度及び光などの環境要因によって調節され得る。任意選択で、プロモーター領域及び/またはエンハンサー領域は、構成的プロモーター及び/またはエンハンサーとして作用して、転写される転写単位の領域の発現を最大化することができる。特定のベクターでは、プロモーター領域及び/またはエンハンサー領域は、細胞型特異的な様態で活性であり得る。任意選択で、特定のベクターでは、プロモーター領域及び/またはエンハンサー領域は、細胞型に関係なく、すべての真核細胞において活性であり得る。この種の好ましいプロモーターは、CMVプロモーター、SV40プロモーター、β-アクチンプロモーター、EF1αプロモーター、及びレトロウイルスの長い末端反復配列(LTR)である。
ベクターにはまた、例えば、複製起点及び/またはマーカーも含めることができる。マーカー遺伝子は、細胞に対し、選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性などを付与することができる。マーカー産物は、ベクターが細胞に送達されたかどうか、送達された後は、それが発現されているかどうかを判定するために使用される。哺乳類細胞の選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体G418、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、及びブラストサイジンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生き残ることができる。他のマーカーの例として、例えば、E.coli lacZ遺伝子、緑色蛍光タンパク質(GFP)、及びルシフェラーゼが挙げられる。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの操作または検出(例えば、精製または局在化)を容易にするように設計されたタグ配列が含まれ得る。タグ配列、例えば、GFP、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c-myc、ヘマグルチニン、またはFLAG(商標)タグ(Kodak;New Haven,Conn.)などの配列は、通常、コードされたポリペプチドとの融合体として発現させる。そのようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含め、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
G.治療への適用
本明細書ではまた、本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的抗原に関連する疾患、障害または病態の治療のための方法及び使用も提供する。疾患、障害、または病態には、がん、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症(すなわち、細菌、ウイルス、または寄生虫疾患)が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、疾患、障害、または病態は、がんである。
本明細書ではまた、本明細書に記載のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的抗原に関連する疾患、障害または病態の治療のための方法及び使用も提供する。疾患、障害、または病態には、がん、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、感染症(すなわち、細菌、ウイルス、または寄生虫疾患)が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、疾患、障害、または病態は、がんである。
任意の好適ながんは、本明細書に提供されるIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体で治療され得る。例示的な好適ながんとして、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管癌、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭頸部癌、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、口唇癌及び口腔癌、肝臓癌、上皮内小葉癌、肺癌、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頸部癌、NUT遺伝子が関与する正中線管癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性腫瘍、鼻腔癌及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂癌及び尿管癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、脊髄腫瘍、胃癌、T細胞リンパ腫、奇形腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。実施形態では、がんは黒色腫または乳癌である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する有効量のIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を対象に投与することによって、それを必要とする対象における免疫応答の増強方法を本明細書に提供する。強化された免疫応答は、がん、腫瘍、またはウイルス性疾患の発症を予防、遅延、または治療し得る。理論に拘束されるものではないが、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体は、自然免疫及び適応免疫を活性化することによって免疫応答を増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ナチュラルキラー細胞及びTリンパ球の活性を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するIL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体は、ナチュラルキラー細胞ならびにCD4+及びCD8+T細胞からのIFNγ放出を誘導することができる。
方法ではさらに、がんを治療する1つ以上の追加の薬剤、例えば、化学療法薬(例えば、アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、チオテパ、メトトレキサート、ビサントレン、ノアントロン(Noantrone)、チグアニン(Thiguanine)、シタリビン(Cytaribine)、プロカラビジン(Procarabizine))、腫瘍免疫療法薬(例えば、抗PD-L1、抗CTLA4、抗PD-1、抗CD47、抗GD2)、細胞治療薬(例えば、CAR-T、T細胞療法)、腫瘍溶解性ウイルス等の投与を行うことを含む。使用可能な抗がん剤の非限定的な例として、アシビシン;アクラルビシン;塩酸アコダゾール;アクロニン;アドゼレシン;アルデスロイキン;アルトレタミン;アンボマイシン(Ambomycin);酢酸アメタントロン;アミノグルテチミド;アムサクリン;アナストロゾール;アントラマイシン(Anthramycin);アスパラギナーゼ;アスペルリン;アザシチジン;アゼテパ(Azetepa);アゾトマイシン(Azotomycin);バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;塩酸ビサントレン;ビスナフィドジメシレート;ビゼレシン;硫酸ブレオマイシン;ブレキナールナトリウム;ブロピリミン;ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド;カーベタイマー;カルボプラチン;カルムスチン;塩酸カルビシン;カルゼレシン;セデフィンゴール;クロラムブシル;シロレマイシン(Cirolemycin);シスプラチン;クラドリビン;クリスナトールメシレート;シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;塩酸ダウノルビシン;デシタビン;デキソルマプラチン;デザグアニン;メシル酸デザグアニン;ジアジコン;ドセタキセル;ドキソルビシン;塩酸ドキソルビシン;ドロロキシフェン;クエン酸ドロロキシフェン;プロピオン酸ドロモスタノロン;デュアゾマイシン(Duazomycin);エダトレキサート;塩酸エフロルニチン;エルサミトルシン(Elsamitrucin);エンロプラチン;エンプロマート;エピプロピジン;塩酸エピルビシン;エルブロゾール(Erbulozole);塩酸エソルビシン(Esorubicin Hydrochloride);エストラムスチン;リン酸エストラムスチンナトリウム;エタニダゾール;エトポシド;リン酸エトポシド;エトプリン(Etoprine);塩酸ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル;フルロシタビン;ホスキドン;ホストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;塩酸ゲムシタビン;ヒドロキシウレア;塩酸イダルビシン;イホスファミド;イルモホシン;インターロイキンII(組換えインターロイキンII、すなわちrIL2を含む),インターフェロンα-2a;インターフェロンα-2b;インターフェロンα-nl インターフェロンα-n3;インターフェロンβ-Ia;インターフェロンγ-Ib;イプロプラチン;塩酸イリノテカン;酢酸ランレオチド;レトロゾール;酢酸ロイプロリド;塩酸リアロゾール;ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプロコール;マイタンシン;塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロール;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキサート;メトトレキサートナトリウム;メトプリン;メツレデパ;ミチンドミド;マイトカルシン(Mitocarcin);マイトクロミン(Mitocromin);マイトジリン;マイトマルシン(Mitomalcin);マイトマイシン;マイトスパー(Mitosper);ミトタン;塩酸ミトキサントロン;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペグアスパラガーゼ;ペリオマイシン(Peliomycin);ペンタムスチン(Pentamustine);硫酸ペプロマイシン;ペルホスファミド;ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン(Porfiromycin);プレドニムスチン(Prednimustine);塩酸プロカルバジン;ピューロマイシン;塩酸ピューロマイシン;ピラゾフリン(Pyrazofurin);リボプリン;ログレチミド;サフィンゴール;塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン;スパルフォセートナトリウム;スパルソマイシン;塩酸スピロゲルマニウム;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;スロフェヌル;タリソマイシン(Talisomycin);テコガランナトリウム;テガフール;塩酸テロキサントロン;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テストラクトン;チアミプリン(Thiamiprine);チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;塩酸トポテカン;クエン酸トレミフェン;酢酸トレストロン;リン酸トリシリビン;トリメトレキサート;グルクロン酸トリメトレキサート;トリプトレリン;塩酸ツブロゾール;ウラシルマスタード;ウレデパ;バブレオチド;ベルテポルフィン;硫酸ビンブラスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;硫酸ビンデシン;硫酸ビネピジン;硫酸ビングリシネート(Vinglycinate Sulfate);硫酸ビンロイロシン;酒石酸ビノレルビン;硫酸ビンゾリジン;硫酸ビンゾリジン;ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;及び塩酸ゾルビシンなどの抗腫瘍薬が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、特定の疾患、障害、または病態を治療するための薬剤と併用して投与する。薬剤には、抗体、小分子(例えば、化学療法剤)、ホルモン(ステロイド、ペプチドなど)、放射線療法(γ線、C線、及び/または放射性同位体、マイクロ波、紫外線などの直接送達)、遺伝子治療(例えば、アンチセンス、レトロウイルス治療など)、及び他の免疫療法を含む療法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、IL-12ポリペプチド複合体またはIL-23ポリペプチド複合体を、下痢止め剤、制吐剤、鎮痛剤及び/または非ステロイド性抗炎症剤と併用して投与する。
6.均等物
本明細書に記載された本発明の方法の他の好適な改変及び適合が自明であり、本開示または実施形態の範囲から逸脱することなく好適な均等物を使用して行い得ることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書において、特定の化合物及び方法を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、同じことがより明確に理解されるであろう。これらは例示のみを目的として導入され、限定することを意図するものではない。
本明細書に記載された本発明の方法の他の好適な改変及び適合が自明であり、本開示または実施形態の範囲から逸脱することなく好適な均等物を使用して行い得ることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書において、特定の化合物及び方法を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、同じことがより明確に理解されるであろう。これらは例示のみを目的として導入され、限定することを意図するものではない。
7.実施例
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは決して限定することを意図するものではない。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは決して限定することを意図するものではない。
実施例1:HEK-Blueアッセイ
HEK-Blue IL-12細胞(InvivoGen)を、15または40mg/mlのヒト血清アルブミン(HSA)を含むかまたは含まない培地中に50,000細胞/ウェルの濃度にて懸濁播種し、組換え型hIL-12、キメラIL-12(マウスp35/ヒトp40)、活性化可能なキメラIL-12、または活性化可能なhIL-12の希釈系列を用いて、37℃、5%CO2にて20~24時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なhIL-12の活性を試験した。切断型誘導性hIL-12を、活性型MMP9またはCTSL-1とのインキュベーションによって生成した。IL-12活性を、比色に基づくアッセイである試薬QUANTI-Blue(InvivoGen)を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)活性の定量により評価した。結果から、IL-12融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図2A~2Sに示す。
HEK-Blue IL-12細胞(InvivoGen)を、15または40mg/mlのヒト血清アルブミン(HSA)を含むかまたは含まない培地中に50,000細胞/ウェルの濃度にて懸濁播種し、組換え型hIL-12、キメラIL-12(マウスp35/ヒトp40)、活性化可能なキメラIL-12、または活性化可能なhIL-12の希釈系列を用いて、37℃、5%CO2にて20~24時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なhIL-12の活性を試験した。切断型誘導性hIL-12を、活性型MMP9またはCTSL-1とのインキュベーションによって生成した。IL-12活性を、比色に基づくアッセイである試薬QUANTI-Blue(InvivoGen)を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)活性の定量により評価した。結果から、IL-12融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図2A~2Sに示す。
実施例2:IL-12ルシフェラーゼレポーターアッセイ
製造業者から「解凍して使用する」形式で購入したIL-12ルシフェラーゼレポーター細胞(Promega)を、製造業者の指示に従ってプレーティングし、組換えhIL-12または活性化可能なhIL-12の希釈系列を用いて、37℃、5%CO2で6時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なhIL-12の活性を試験した。切断型誘導性IL-12を、活性型MMP9またはCTSL-1とのインキュベーションによって生成した。IL-12活性を、Bio-Glo(商標)試薬(Promega)を使用したルシフェラーゼ活性の定量化によって評価した。これにより、発光読み出しによるルシフェラーゼ活性の測定が可能になる。結果から、IL-12タンパク質の融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図3A~3Fに示す。
製造業者から「解凍して使用する」形式で購入したIL-12ルシフェラーゼレポーター細胞(Promega)を、製造業者の指示に従ってプレーティングし、組換えhIL-12または活性化可能なhIL-12の希釈系列を用いて、37℃、5%CO2で6時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なhIL-12の活性を試験した。切断型誘導性IL-12を、活性型MMP9またはCTSL-1とのインキュベーションによって生成した。IL-12活性を、Bio-Glo(商標)試薬(Promega)を使用したルシフェラーゼ活性の定量化によって評価した。これにより、発光読み出しによるルシフェラーゼ活性の測定が可能になる。結果から、IL-12タンパク質の融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図3A~3Fに示す。
実施例3:ヒトT-Blastアッセイ
T-Blastは、72時間のPHA刺激により、ヒトPBMCから誘導された。次いで、T-Blastを洗浄し、使用前に凍結した。アッセイのために、T-Blastを解凍し、ヒトアルブミンを含む培地に100,000細胞/ウェルで懸濁してプレーティングし、組換えhIL-12またはキメラ活性化可能IL-12(マウスp35/ヒトp40)または活性化可能ヒトIL-12を用いて、37℃、5%CO2で72時間刺激した。非切断型及び切断型のIL-12融合タンパク質の活性を試験した。切断型誘導性hIL-12を、活性型MMP9またはCTSL-1酵素とのインキュベーションによって生成した。IL-12活性を、hIFNγ Alpha-LISAキットを使用した上清中のIFNγ産生の定量によって評価した。結果から、IL-12融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図4A~4Gに示す。
T-Blastは、72時間のPHA刺激により、ヒトPBMCから誘導された。次いで、T-Blastを洗浄し、使用前に凍結した。アッセイのために、T-Blastを解凍し、ヒトアルブミンを含む培地に100,000細胞/ウェルで懸濁してプレーティングし、組換えhIL-12またはキメラ活性化可能IL-12(マウスp35/ヒトp40)または活性化可能ヒトIL-12を用いて、37℃、5%CO2で72時間刺激した。非切断型及び切断型のIL-12融合タンパク質の活性を試験した。切断型誘導性hIL-12を、活性型MMP9またはCTSL-1酵素とのインキュベーションによって生成した。IL-12活性を、hIFNγ Alpha-LISAキットを使用した上清中のIFNγ産生の定量によって評価した。結果から、IL-12融合タンパク質が、活性かつ誘導性であることが確認される。結果を図4A~4Gに示す。
実施例4:MMP9プロテアーゼによる融合タンパク質のプロテアーゼ切断
当業者であれば、タンパク質切断アッセイを設定する方法に精通しているであろう。1×PBS(pH7.4)中の100μgのタンパク質を1μgの活性MMP9(Sigmaカタログ番号SAE0078-50またはEnzoカタログBML-SE360)で切断し、室温で最大16時間インキュベートした。消化されたタンパク質を、その後、機能解析で使用するか、または試験前に-80℃で保存した。当技術分野で周知の方法を使用してSDS PAGEにより切断の程度をモニタリングした。MMP9による融合タンパク質の完全な切断が認められた。
当業者であれば、タンパク質切断アッセイを設定する方法に精通しているであろう。1×PBS(pH7.4)中の100μgのタンパク質を1μgの活性MMP9(Sigmaカタログ番号SAE0078-50またはEnzoカタログBML-SE360)で切断し、室温で最大16時間インキュベートした。消化されたタンパク質を、その後、機能解析で使用するか、または試験前に-80℃で保存した。当技術分野で周知の方法を使用してSDS PAGEにより切断の程度をモニタリングした。MMP9による融合タンパク質の完全な切断が認められた。
実施例5:哺乳類宿主細胞株における発現比較
ヒトp40及びp35サブユニットが非切断性リンカーによって接続されているIL-12融合タンパク質であるWW0663の発現プラスミドを、哺乳類発現宿主細胞株に一過性にトランスフェクトし、プロテインAクロマトグラフィーによって細胞上清から精製した。同様に、WW0750及びWW0636の発現プラスミドを、上記と同じ親哺乳動物宿主細胞株に一過性に同時トランスフェクトしてIL-12融合タンパク質を発現させたが、ヒトp40及びp35サブユニットは、リンカー配列によって接続されておらず、天然のジスルフィド結合によって組み立てられた。WW0750/WW0636をプロテインAクロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。WW0663とWW0750/WW0636の両方を、非還元及び還元SDS-PAGEゲル上で実施して、適切な組立て及び任意の意図しない切断産物を比較した(図5)。WW0663では、意図しない分子量のフラグメント(切断産物)が2つ存在する。さらに、還元条件ではWW0663のインタクトなバンドが減少しており、これは、p40サブユニットとp35サブユニットの間のリンカーまたはその近位で意図しない切断があり、2つの等しいサイズの生成物(レーン4に示す最小分子量)が生成し、p40/p35ジスルフィドバンドの還元によってp40とp35が切り離されていることが示唆されている。WW0750/WW0636の還元条件及び非還元条件(それぞれ、レーン6及び7)は、予想されるサイズを示している。
ヒトp40及びp35サブユニットが非切断性リンカーによって接続されているIL-12融合タンパク質であるWW0663の発現プラスミドを、哺乳類発現宿主細胞株に一過性にトランスフェクトし、プロテインAクロマトグラフィーによって細胞上清から精製した。同様に、WW0750及びWW0636の発現プラスミドを、上記と同じ親哺乳動物宿主細胞株に一過性に同時トランスフェクトしてIL-12融合タンパク質を発現させたが、ヒトp40及びp35サブユニットは、リンカー配列によって接続されておらず、天然のジスルフィド結合によって組み立てられた。WW0750/WW0636をプロテインAクロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。WW0663とWW0750/WW0636の両方を、非還元及び還元SDS-PAGEゲル上で実施して、適切な組立て及び任意の意図しない切断産物を比較した(図5)。WW0663では、意図しない分子量のフラグメント(切断産物)が2つ存在する。さらに、還元条件ではWW0663のインタクトなバンドが減少しており、これは、p40サブユニットとp35サブユニットの間のリンカーまたはその近位で意図しない切断があり、2つの等しいサイズの生成物(レーン4に示す最小分子量)が生成し、p40/p35ジスルフィドバンドの還元によってp40とp35が切り離されていることが示唆されている。WW0750/WW0636の還元条件及び非還元条件(それぞれ、レーン6及び7)は、予想されるサイズを示している。
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。326匹のCRメスC57BL/6マウスを、側腹皮下への5×105のMC38腫瘍細胞含有0%マトリゲルにより準備した。細胞注入量は0.1mL/マウスであった。マウスは開始日に8~12週齢であった。腫瘍が平均サイズ100~150mm3に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始1日目である。体重は、開始時、その後は週2回、終了まで測定した。キャリパーでの測定を週2回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。25%超の体重減少が1回観察されたか、または20%超の体重減少が3回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が20%超であるかまたは死亡率が10%超のいかなる群も投与を中止し;その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が20%超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の10%以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復%の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延(TGD)であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が1500mm3または40日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。326匹のCRメスC57BL/6マウスを、側腹皮下への5×105のMC38腫瘍細胞含有0%マトリゲルにより準備した。細胞注入量は0.1mL/マウスであった。マウスは開始日に8~12週齢であった。腫瘍が平均サイズ100~150mm3に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始1日目である。体重は、開始時、その後は週2回、終了まで測定した。キャリパーでの測定を週2回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。25%超の体重減少が1回観察されたか、または20%超の体重減少が3回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が20%超であるかまたは死亡率が10%超のいかなる群も投与を中止し;その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が20%超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の10%以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復%の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延(TGD)であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が1500mm3または40日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。326匹のCRメスC57BL/6マウスを、側腹皮下への5×105のMC38腫瘍細胞含有0%マトリゲルにより準備した。細胞注入量は0.1mL/マウスであった。マウスは開始日に8~12週齢であった。腫瘍が平均サイズ100~150mm3に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。学習開始1日目である。体重は、開始時、その後は週2回、終了まで測定した。キャリパーでの測定を週2回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。25%超の体重減少が1回観察されたか、または20%超の体重減少が3回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が20%超であるかまたは死亡率が10%超のいかなる群も投与を中止し;その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が20%超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の10%以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復%の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延(TGD)であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が1500mm3または40日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。
実施例9:オクテット結合動態アッセイ
KD測定を、scFvを用いて多濃度動態を使用して実行した。ヒトIL-12に対する結合親和性を、Octet QKe機器(ForteBio)を使用して測定した。センサー上の6×Hisタグ付き(配列番号446)scFvを捕捉し、続いてIL-12の結合/解離を捕捉する戦略を使用した。アッセイ緩衝液として1×動態緩衝液(ForteBio)を使用して、BLI分析を30℃で実施した。Ni-NTA(NTA)バイオセンサー(ForteBio)を、最初にアッセイ緩衝液に5分超の間、浸した。被験scFv(5μg/mL)を、センサー上で300秒間捕捉した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液に120秒間浸してベースラインを確立した後、IL-12への結合を測定した。次いでセンサーを様々な濃度のIL-12(50~0.78nM、アッセイ緩衝液で2倍希釈)及び参照減算補正用のブランク緩衝液ウェルに300秒間浸して、関連性を測定した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液に300秒間浸すことにより、IL-12の解離を測定した。すべてのステップでの攪拌は1000rpmであった。動態パラメータは、Octet Data Analysis Softwareバージョン8.2を使用して、参照減算補正(緩衝液へのscFvの「結合」)、ステップ間補正に基づく解離、1対1結合モデル、及びグローバルフィット(センサーによってリンクされていないRmax)を使用して生成した。KD値を表7に示す。
表7.scFv IL-12遮断因子動態の要約
KD測定を、scFvを用いて多濃度動態を使用して実行した。ヒトIL-12に対する結合親和性を、Octet QKe機器(ForteBio)を使用して測定した。センサー上の6×Hisタグ付き(配列番号446)scFvを捕捉し、続いてIL-12の結合/解離を捕捉する戦略を使用した。アッセイ緩衝液として1×動態緩衝液(ForteBio)を使用して、BLI分析を30℃で実施した。Ni-NTA(NTA)バイオセンサー(ForteBio)を、最初にアッセイ緩衝液に5分超の間、浸した。被験scFv(5μg/mL)を、センサー上で300秒間捕捉した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液に120秒間浸してベースラインを確立した後、IL-12への結合を測定した。次いでセンサーを様々な濃度のIL-12(50~0.78nM、アッセイ緩衝液で2倍希釈)及び参照減算補正用のブランク緩衝液ウェルに300秒間浸して、関連性を測定した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液に300秒間浸すことにより、IL-12の解離を測定した。すべてのステップでの攪拌は1000rpmであった。動態パラメータは、Octet Data Analysis Softwareバージョン8.2を使用して、参照減算補正(緩衝液へのscFvの「結合」)、ステップ間補正に基づく解離、1対1結合モデル、及びグローバルフィット(センサーによってリンクされていないRmax)を使用して生成した。KD値を表7に示す。
表7.scFv IL-12遮断因子動態の要約
実施例10:HEKBlue IL-23レポーターアッセイ
HEK-Blue IL23細胞(InvivoGen)を、15mg/mlヒト血清アルブミン(HSA)を含むまたは含まない培養液に50,000細胞/ウェルの密度で懸濁して播種し、組換えマウスIL-23または半減期延長マウスIL23(抗HSA-L-mIL23)の希釈系列を用いて、37℃、5%CO2で20~24時間刺激した。IL-23活性を、比色に基づくアッセイである試薬QUANTI-Blue(InvivoGen)を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)活性の定量により評価した。結果を図40A及び40Bに示す。
HEK-Blue IL23細胞(InvivoGen)を、15mg/mlヒト血清アルブミン(HSA)を含むまたは含まない培養液に50,000細胞/ウェルの密度で懸濁して播種し、組換えマウスIL-23または半減期延長マウスIL23(抗HSA-L-mIL23)の希釈系列を用いて、37℃、5%CO2で20~24時間刺激した。IL-23活性を、比色に基づくアッセイである試薬QUANTI-Blue(InvivoGen)を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)活性の定量により評価した。結果を図40A及び40Bに示す。
実施例11:半減期延長IL-23タンパク質WW5009を使用したMC38効力試験
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるMC38細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
急速増殖性の結腸腺癌細胞株であるMC38細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
潰瘍形成を低減する細胞を移植するためマウスにイソフルランによる麻酔をかけた。Charles RiverメスC57BL/6マウスを、側腹皮下への5×105のMC38腫瘍細胞含有0%マトリゲルにより準備した。細胞注入量は0.1mL/マウスであった。マウスは開始日に8~12週齢であった。腫瘍が平均サイズ100~150mm3に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。体重は、開始時、その後は週2回、終了まで測定した。キャリパーでの測定を週2回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。30%超の体重減少が1回観察されたか、または25%超の体重減少が3回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が20%超であるかまたは死亡率が10%超のいかなる群も投与を中止し;その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が20%超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の10%以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復%の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延(TGD)であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が1500mm3または45日目のいずれか早く達した方とした。レスポンダーを、その後も追跡した。終点に達した際、動物を安楽死させた。結果を図49A、49B、及び50A~50Dに示す。
30匹のCRメスBALB/cマウスを、側腹皮下への3×105のCT26腫瘍細胞含有0%マトリゲルにより準備した。細胞注入量は0.1mL/マウスであった。マウスは開始日に8~12週齢であった。腫瘍が平均サイズ30~60mm3に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始1日目である。キャリパーでの測定を週2回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。25%超の体重減少が1回観察されたか、または20%超の体重減少が3回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が20%超であるかまたは死亡率が10%超のいかなる群も投与を中止し;その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が20%超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の10%以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復%の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延(TGD)であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が2000mm3または22日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。結果を図41、及び図42A~42Cに示す。
実施例13:B16F10実験(研究 B16F10-ITAA-0215)
急速に増殖するメラノーマ細胞株であるB16F10細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
急速に増殖するメラノーマ細胞株であるB16F10細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
30匹のCRメスC57Bl/6マウスを、側腹皮下への1×105のB16F10腫瘍細胞含有50%マトリゲルにより準備した。細胞注入量は0.1mL/マウスであった。マウスは開始日に8~12週齢であった。腫瘍が平均サイズ100mm3に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始1日目である。キャリパーでの測定を週2回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。25%超の体重減少が1回観察されたか、または20%超の体重減少が3回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が20%超であるかまたは死亡率が10%超のいかなる群も投与を中止し;その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が20%超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の10%以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復%の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延(TGD)であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が2000mm3または22日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。結果を図43、及び図44A~44Cに示す。
実施例14:EMT6実験(研究 EMT6-ITAA-0216)
急速増殖性の乳房腺癌細胞株であるEMT6細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
急速増殖性の乳房腺癌細胞株であるEMT6細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
30匹のCRメスBALB/cマウスを、側腹皮下への1×105のEMT6腫瘍細胞含有50%マトリゲルにより準備した。細胞注入量は0.1mL/マウスであった。マウスは開始日に8~12週齢であった。腫瘍が平均サイズ100mm3に達した時点でペアマッチを実施し、処置を開始した。これが学習開始1日目である。キャリパーでの測定を週2回、終了まで行った。いかなる有害反応も直ちに報告した。25%超の体重減少が1回観察されたか、または20%超の体重減少が3回連続して測定された個々の動物は、安楽死させた。平均体重減少が20%超であるかまたは死亡率が10%超のいかなる群も投与を中止し;その群は安楽死させず、回復させることが許可される。体重減少が20%超である群内で、個々の体重減少のエンドポイントに達した個体は安楽死させた。体重減少に関連する群処置が元の体重の10%以内の減少まで回復した場合、より低い用量またはより少ない頻度の投与スケジュールで投与を再開した。非処置の体重回復%の例外は、個々の場合に応じて許可された。エンドポイントは腫瘍増殖遅延(TGD)であった。動物を個々にモニタリングした。実験の終点は、腫瘍体積が2000mm3または22日目のいずれか早く達した方とした。終点に達した際、動物を安楽死させた。結果を図45、及び図46A~46Cに示す。
実施例15:全腫瘍RNAのナノストリング分析
処置した動物からマウス腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液に解離した。簡潔に述べると、酵素的に消化する前に、腫瘍を5mm3未満に細かく刻んだ。試料を3mg/mコラゲナーゼIVと共に37℃で35分間振とうした後、70μMナイロンメッシュフィルターで機械的に分離した。次いで、試料を洗浄して計数し、各試料から合計3~5e5の生細胞をスピンダウンし、後のRNA抽出のためにRLT+緩衝液中で凍結させた。RNAの分離とナノストリング処理は、LakePharmaによって実行した。RNEasy Microキットを使用して製造元のプロトコルに従ってRNAを分離し、マウスPanCancer Immune Profiling Codesetを使用して100ngの全RNAをnCounterシステム上で流した。高度な分析モジュールがインストールされたnSolverソフトウェアを使用して、Werewolf Therapeuticsによってデータ分析を実施した。すべての統計解析は、nSolverソフトウェアから取得している(nSolverソフトウェア用のnCounter Advanced Analysis 2.0 Plugin,ユーザーマニュアル,NanoString Technologies,2018を参照のこと)。ヒートマップ及び他のグラフは、Prismソフトウェアを使用して生成した。
処置した動物からマウス腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液に解離した。簡潔に述べると、酵素的に消化する前に、腫瘍を5mm3未満に細かく刻んだ。試料を3mg/mコラゲナーゼIVと共に37℃で35分間振とうした後、70μMナイロンメッシュフィルターで機械的に分離した。次いで、試料を洗浄して計数し、各試料から合計3~5e5の生細胞をスピンダウンし、後のRNA抽出のためにRLT+緩衝液中で凍結させた。RNAの分離とナノストリング処理は、LakePharmaによって実行した。RNEasy Microキットを使用して製造元のプロトコルに従ってRNAを分離し、マウスPanCancer Immune Profiling Codesetを使用して100ngの全RNAをnCounterシステム上で流した。高度な分析モジュールがインストールされたnSolverソフトウェアを使用して、Werewolf Therapeuticsによってデータ分析を実施した。すべての統計解析は、nSolverソフトウェアから取得している(nSolverソフトウェア用のnCounter Advanced Analysis 2.0 Plugin,ユーザーマニュアル,NanoString Technologies,2018を参照のこと)。ヒートマップ及び他のグラフは、Prismソフトウェアを使用して生成した。
実施例16:マウス腫瘍処理及びフローサイトメトリー分析
MC38腫瘍をC57BL/6マウスに移植し、平均サイズ150mm3まで成長させた後、マウスを無作為に処置群に分けた(0日目)。1日目及び4日目にマウスをビヒクルまたは減弱化IL-12で腹腔内注射により処置し、2回目の投与の24時間後に腫瘍を採取した(5日目)。腫瘍を採取し、フェノールフリーのRPMI中で酵素的に消化する前に、5mm3未満に細かく刻んだ。試料を3mg/mコラゲナーゼIVと共に37℃で35分間振とうした後、70μMナイロンメッシュフィルターで機械的に分離した。次いで、試料を洗浄し、計数し、フローサイトメトリー分析のためにプレーティングした。96ウェル丸底プレートに1ウェルあたり最大5×106個の細胞を播種した。細胞内サイトカイン染色では、染色前に、試料をホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)、イオノマイシン、及びブレフェルジンAで4時間刺激した。細胞染色では、まずFC受容体をブロッキングした後、細胞外マーカーを染色した。細胞外染色の後、細胞を洗浄、固定、及び透過処理し、その後、細胞内マーカーを染色した。SpectroFlo(登録商標)ソフトウェアを実行するCytek Auroraシステム上で試料を流し、FlowJo(商標)ソフトウェアを使用してデータを分析した。すべてのグラフと統計解析を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して実行した。
MC38腫瘍をC57BL/6マウスに移植し、平均サイズ150mm3まで成長させた後、マウスを無作為に処置群に分けた(0日目)。1日目及び4日目にマウスをビヒクルまたは減弱化IL-12で腹腔内注射により処置し、2回目の投与の24時間後に腫瘍を採取した(5日目)。腫瘍を採取し、フェノールフリーのRPMI中で酵素的に消化する前に、5mm3未満に細かく刻んだ。試料を3mg/mコラゲナーゼIVと共に37℃で35分間振とうした後、70μMナイロンメッシュフィルターで機械的に分離した。次いで、試料を洗浄し、計数し、フローサイトメトリー分析のためにプレーティングした。96ウェル丸底プレートに1ウェルあたり最大5×106個の細胞を播種した。細胞内サイトカイン染色では、染色前に、試料をホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)、イオノマイシン、及びブレフェルジンAで4時間刺激した。細胞染色では、まずFC受容体をブロッキングした後、細胞外マーカーを染色した。細胞外染色の後、細胞を洗浄、固定、及び透過処理し、その後、細胞内マーカーを染色した。SpectroFlo(登録商標)ソフトウェアを実行するCytek Auroraシステム上で試料を流し、FlowJo(商標)ソフトウェアを使用してデータを分析した。すべてのグラフと統計解析を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して実行した。
Claims (110)
- IL-12、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記IL-12遮断エレメントが、IL-12またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体であり、前記複合体が:
i. IL-12サブユニット、及び任意選択で前記IL-12遮断エレメントを含む第1のポリペプチドであって、前記IL-12遮断エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-12サブユニットに作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド;
ii. 第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたIL-12サブユニット、及び任意選択で前記IL-12遮断エレメントを含む第2のポリペプチド鎖であって、前記IL-12遮断エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して、前記IL-12サブユニットに作動可能に連結するか、または任意選択でプロテアーゼ切断性であるリンカーを介して、前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第2のポリペプチド鎖を含み;
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの一方のみが前記IL-12遮断エレメントを含み;
前記第1のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp35の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp40であり、前記第1のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp40の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp35である、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第1のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項1に記載のポリペプチド。
- IL-12、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記IL-12遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
i. IL-12サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第1のポリペプチドであって、前記半減期延長エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-12サブユニットに作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド;
ii. IL-12サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分または抗体重鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第2のポリペプチドであって;前記半減期延長エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-12サブユニットに作動可能に連結し、前記抗体重鎖または前記抗体軽鎖が、a)第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-12サブユニットと作動可能に連結するか、またはb)任意選択で切断可能性リンカーを介して前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第2のポリペプチド;ならびに
iii. 前記第2のポリペプチドの前記軽鎖に相補的である抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分、または前記第2のポリペプチドの前記重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-12結合部位を形成する抗体軽鎖を含む、第3のポリペプチドを含み;
前記第1のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp35の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp40であり、前記第1のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp40の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp35である、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第1のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項3に記載のポリペプチド。
- IL-12、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記IL-12遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
i. p35、p40、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第1のポリペプチド鎖であって、p35及びp40が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結するか;または、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド鎖;ならびに
ii. 第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-12結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第2のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド複合体。 - IL-12、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記IL-12遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
iii. p35、p40、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第1のポリペプチド鎖であって、p35及びp40が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結するか;または、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド鎖;ならびに
iv. 第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドの重鎖に相補的であり、抗体軽鎖と一緒になってIL-12結合部位を形成する前記軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第2のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第1のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項5または6に記載のポリペプチド。
- 前記第1のポリペプチドが、遮断エレメントを含まず、前記第2のポリペプチドが、式:
[A]-[L1]-[B]-[L3]-[D]または[D]-[L3]-[B]-[L1]-[A]または[B]-[L1]-[A]-[L2]-[D]または
[D]-[L1]-[A]-[L2]-[B]を有し、式中、
Aが、前記IL-12サブユニットであり;
L1が、前記第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
L2が、前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
L3が、前記任意選択で切断可能性リンカーであり;
Bが、前記半減期延長エレメントであり;
Dが、前記遮断エレメントである、請求項1または3に記載のポリペプチド複合体。 - 前記第1のポリペプチドが、式:
[A]-[L1]-[D]または[D]-[L1]-[A]を含み;前記第2のポリペプチドが、式:
[A’]-[L2]-[B]または[B]-[L2]-[A’]を有し、式中、
Aが、p35またはp40のいずれかであり、Aがp35の場合、A’がp40であり、Aがp40の場合、A’がp35であり;
A’が、p35またはp40のいずれかであり;
L1が、前記第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
L2が、前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
Bが、前記半減期延長エレメントであり;
Dが、前記遮断エレメントである、請求項1に記載のポリペプチド複合体。 - 前記第1のポリペプチドが、式:[A]-[L1]-[B]または[B]-[L1]-[A]を含み;前記第2のポリペプチドが、式[A’]-[L2]-[D]または[D]-[L2]-[A’]を有し、式中、
Aが、p35またはp40のいずれかであり;
A’が、p35またはp40のいずれかであり、Aがp35の場合、A’がp40であり、Aがp40の場合、A’がp35であり;
L1が、前記第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
L2が、前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
Bが、前記半減期延長エレメントであり;
Dが、前記遮断エレメントである、請求項3に記載のポリペプチド複合体。 - 前記半減期延長エレメントが、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンFcもしくはそのフラグメントである、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼA、カテプシン、エラスターゼ、PR-3、グランザイムM、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、ADAM、FAP、プラスミノーゲン活性化因子、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍プロテアーゼから選択されるプロテアーゼによって切断され得る配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼが、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、またはカテプシンGから選択される、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、またはMMP14であるMMPから選択される、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、プロテアーゼによって独立して切断され得る少なくとも2つの配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、合成配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーのそれぞれが、2つ以上の異なるプロテアーゼによって切断される、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記単鎖抗体が単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項1に記載のポリペプチド複合体。
- 前記抗体の抗原結合フラグメントがFabである、請求項3、5または6に記載のポリペプチド複合体。
- 前記遮断エレメントが、前記IL-12に結合する、請求項1、3、5、または6のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記遮断エレメントが、p35、p40、またはp35p40複合体に結合する、請求項17または18に記載のポリペプチド複合体。
- 請求項1~21のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする核酸。
- 前記核酸が、p35またはp40のみをコードしない、請求項22に記載の核酸。
- IL-12、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記IL-12遮断エレメントが、IL-12またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体であり、前記複合体が:
iii. IL-12サブユニット、及び任意選択で前記IL-12遮断エレメントを含む第1のポリペプチドであって、前記IL-12遮断エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-12サブユニットに作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド;
iv. 第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたIL-12サブユニット、及び任意選択で前記IL-12遮断エレメントを含む第2のポリペプチド鎖であって、前記IL-12遮断エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して、前記IL-12サブユニットに作動可能に連結するか、または任意選択でプロテアーゼ切断性であるリンカーを介して、前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第2のポリペプチド鎖を含み;
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの一方のみが前記IL-12遮断エレメントを含み;
前記第1のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp35の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp40であり、前記第1のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp40の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp35である、前記核酸組成物。 - IL-12、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記IL-12遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
i. IL-12サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第1のポリペプチドであって、前記半減期延長エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-12サブユニットに作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド;
ii. IL-12サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第2のポリペプチドであって;前記半減期延長エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-12サブユニットに作動可能に連結し、前記抗体重鎖または前記抗体軽鎖が、a)第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-12サブユニットと作動可能に連結するか、またはb)任意選択で切断可能性リンカーを介して前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第2のポリペプチド;ならびに
iii. 前記第2のポリペプチドの前記軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-12結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、第3のポリペプチドを含み、
前記第1のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp35の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp40であり、前記第1のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp40の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-12サブユニットがp35である、前記核酸組成物。 - IL-12、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記IL-12遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
i. p35、p40、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第1のポリペプチド鎖であって、p35及びp40が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結するか;または、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド鎖;ならびに
ii. 第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-12結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第2のポリペプチドを含む、前記核酸組成物。 - IL-12、半減期延長エレメント、IL-12遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記IL-12遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
iii. p35、p40、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第1のポリペプチド鎖であって、p35及びp40が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結するか;または、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp35に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド鎖;ならびに
iv. 第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記重鎖と一緒になってIL-12結合部位を形成する抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第2のポリペプチドを含む、前記核酸組成物。 - 環状ベクターを含む、請求項22~27のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- DNAを含む、請求項22~27のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- RNAを含む、請求項22~27のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 請求項22~27のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項31に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で、請求項32に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の製造方法。
- 前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 請求項1~21のいずれか一項に記載のタンパク質複合体または請求項22~31のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬組成物。
- 請求項1~21のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項22~30のいずれか一項に記載の核酸、請求項31に記載の発現ベクター、または請求項34に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
- 配列番号95~110、配列番号119~126、及び配列番号135~143からなる群、または配列番号95~110、配列番号119~126、及び配列番号135~143に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第1のポリペプチドを含む、IL-12ポリペプチド複合体。
- 配列番号104または配列番号136を含む第1のポリペプチドを含む、IL-12ポリペプチド複合体。
- 配列番号104のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖及び配列番号18のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖を含む、IL-12ポリペプチド複合体。
- 配列番号136のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖及び配列番号18のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖を含む、ポリペプチド複合体。
- 配列番号7、9、10、18、24~94、配列番号110~118、及び配列番号127~134からなる群から選択されるアミノ酸を含むか、または配列番号7、9、10、18、24~94、配列番号110~118、及び配列番号127~134に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単鎖IL-12誘導性ポリペプチド。
- p35、p40、遮断エレメント、及び半減期延長エレメントを含む誘導性IL-12ポリペプチドであって、前記遮断エレメントが、表1のアミノ酸によって定義されるIL-12上のエピトープに対する結合特異性を有する抗体または抗原結合フラグメントである、前記誘導性IL-12ポリペプチド。
- 請求項37~42のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする核酸。
- 環状ベクターを含む、請求項37~42のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- DNAを含む、請求項37~42のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- RNAを含む、請求項37~42のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 請求項37~42のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項47に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で、請求項48に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の製造方法。
- 前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項49に記載の方法。
- 請求項37~40もしくは42のいずれか一項に記載のタンパク質複合体、または請求項41に記載のポリペプチド、または請求項43~47のいずれか一項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
- 請求項37~40もしくは42のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項43~47のいずれか一項に記載の核酸、請求項48に記載の発現ベクター、または請求項51に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
- 前記IL-12がムテインである、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項24~27のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記IL-12が、部分的または完全にアグリコシル化されている、請求項53に記載のポリペプチドまたは請求項53に記載の核酸組成物。
- 前記p35及び/または前記p40が、部分的または完全にアグリコシル化されている、請求項54に記載のポリペプチドまたは請求項54に記載の核酸組成物。
- 前記p35及び/または前記p40が、完全にアグリコシル化されている、請求項55に記載のポリペプチドまたは請求項55に記載の核酸組成物。
- IL-23、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記IL-23遮断エレメントが、IL-23またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体であり、前記複合体が:
v. IL-23サブユニット、及び任意選択で前記IL-23遮断エレメントを含む第1のポリペプチドであって、前記IL-23遮断エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-23サブユニットに作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド;
vi. 第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたIL-23サブユニット、及び任意選択で前記IL-23遮断エレメントを含む第2のポリペプチド鎖であって、前記IL-23遮断エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して、前記IL-23サブユニットに作動可能に連結するか、または任意選択でプロテアーゼ切断性であるリンカーを介して、前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第2のポリペプチド鎖を含み;
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの一方のみが前記IL-23遮断エレメントを含み;
前記第1のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp19の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp40であり、前記第1のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp40の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp19である、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第1のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項57に記載のポリペプチド。
- IL-23、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記IL-23遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
iv. IL-23サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第1のポリペプチドであって、前記半減期延長エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-23サブユニットに作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド;
v. IL-12サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分または抗体重鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第2のポリペプチドであって;前記半減期延長エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-23サブユニットに作動可能に連結し、前記抗体重鎖または前記抗体軽鎖が、a)第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-23サブユニットと作動可能に連結するか、またはb)任意選択で切断可能性リンカーを介して前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第2のポリペプチド;ならびに
vi. 前記第2のポリペプチドの前記軽鎖に相補的である抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分、または前記第2のポリペプチドの前記重鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-23結合部位を形成する抗体軽鎖を含む、第3のポリペプチドを含み;
前記第1のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp19の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp40であり、前記第1のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp40の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp19である、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第1のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項59に記載のポリペプチド。
- IL-23、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記IL-23遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
v. p19、p40、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第1のポリペプチド鎖であって、p19及びp40が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結するか;または、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド鎖;ならびに
vi. 第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-23結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第2のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド複合体。 - IL-23、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体であって、前記IL-23遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
vii. p19、p40、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第1のポリペプチド鎖であって、p19及びp40が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結するか;または、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド鎖;ならびに
viii. 第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドの重鎖に相補的であり、抗体軽鎖と一緒になってIL-23結合部位を形成する前記軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第2のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド複合体。 - 前記第1のプロテアーゼ切断性リンカー及び前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーが同じである、請求項61または62に記載のポリペプチド。
- 前記第1のポリペプチドが、遮断エレメントを含まず、前記第2のポリペプチドが、式:
[A]-[L1]-[B]-[L3]-[D]または[D]-[L3]-[B]-[L1]-[A]または[B]-[L1]-[A]-[L2]-[D]または
[D]-[L1]-[A]-[L2]-[B]を有し、式中、
Aが、前記IL-23サブユニットであり;
L1が、前記第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
L2が、前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
L3が、前記任意選択で切断可能性リンカーであり;
Bが、前記半減期延長エレメントであり;
Dが、前記遮断エレメントである、請求項57または59に記載のポリペプチド複合体。 - 前記第1のポリペプチドが、式:
[A]-[L1]-[D]または[D]-[L1]-[A]を含み;前記第2のポリペプチドが、式:
[A’]-[L2]-[B]または[B]-[L2]-[A’]を有し、式中、
Aが、p19またはp40のいずれかであり、Aがp19の場合、A’がp40であり、Aがp40の場合、A’がp19であり;
A’が、p19またはp40のいずれかであり;
L1が、前記第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
L2が、前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
Bが、前記半減期延長エレメントであり;
Dが、前記遮断エレメントである、請求項57に記載のポリペプチド複合体。 - 前記第1のポリペプチドが、式:[A]-[L1]-[B]または[B]-[L1]-[A]を含み;前記第2のポリペプチドが、式[A’]-[L2]-[D]または[D]-[L2]-[A’]を有し、式中、
Aが、p19またはp40のいずれかであり;
A’が、p19またはp40のいずれかであり、Aがp19の場合、A’がp40であり、Aがp40の場合、A’がp19であり;
L1が、前記第1のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
L2が、前記第2のプロテアーゼ切断性リンカーであり;
Bが、前記半減期延長エレメントであり;
Dが、前記遮断エレメントである、請求項59に記載のポリペプチド複合体。 - 前記半減期延長エレメントが、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合ポリペプチド、または免疫グロブリンFcもしくはそのフラグメントである、請求項57~66のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼA、カテプシン、エラスターゼ、PR-3、グランザイムM、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、ADAM、FAP、プラスミノーゲン活性化因子、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍プロテアーゼから選択されるプロテアーゼによって切断され得る配列を含む、請求項57~66のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼが、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、またはカテプシンGから選択される、請求項57~66のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、またはMMP14であるMMPから選択される、請求項57~66のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、プロテアーゼによって独立して切断され得る少なくとも2つの配列を含む、請求項57~66のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーが、合成配列を含む、請求項57~66のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記プロテアーゼ切断性リンカーのそれぞれが、2つ以上の異なるプロテアーゼによって切断される、先行請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記単鎖抗体が単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項57に記載のポリペプチド複合体。
- 前記抗体の抗原結合フラグメントがFabである、請求項59、61または62に記載のポリペプチド複合体。
- 前記遮断エレメントが、前記IL-23に結合する、請求項57、59、61、または62のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- 前記遮断エレメントが、p19、p40、またはp19p40複合体に結合する、請求項73または74に記載のポリペプチド複合体。
- 請求項57~77のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする核酸。
- 前記核酸が、p19またはp40のみをコードしない、請求項78に記載の核酸。
- IL-23、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記IL-23遮断エレメントが、IL-23またはその抗原結合フラグメントに結合する単鎖抗体であり、前記複合体が:
vii. IL-23サブユニット、及び任意選択で前記IL-23遮断エレメントを含む第1のポリペプチドであって、前記IL-23遮断エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-23サブユニットに作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド;
viii. 第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して半減期延長エレメントに作動可能に連結されたIL-23サブユニット、及び任意選択で前記IL-23遮断エレメントを含む第2のポリペプチド鎖であって、前記IL-23遮断エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して、前記IL-23サブユニットに作動可能に連結するか、または任意選択でプロテアーゼ切断性であるリンカーを介して、前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第2のポリペプチド鎖を含み;
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドの一方のみが前記IL-23遮断エレメントを含み;
前記第1のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp19の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp40であり、前記第1のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp40の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp19である、前記核酸組成物。 - IL-23、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記IL-23遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
iv. IL-23サブユニット、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第1のポリペプチドであって、前記半減期延長エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-23サブユニットに作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド;
v. IL-12サブユニット、少なくとも抗体軽鎖の抗原結合部分、及び任意選択で半減期延長エレメントを含む第2のポリペプチドであって;前記半減期延長エレメントが存在する場合、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-23サブユニットに作動可能に連結し、前記抗体重鎖または前記抗体軽鎖が、a)第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介して前記IL-23サブユニットと作動可能に連結するか、またはb)任意選択で切断可能性リンカーを介して前記半減期延長エレメントに作動可能に連結する、前記第2のポリペプチド;ならびに
vi. 前記第2のポリペプチドの前記軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-23結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、第3のポリペプチドを含み、
前記第1のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp19の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp40であり、前記第1のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp40の場合、前記第2のポリペプチドの前記IL-23サブユニットがp19である、前記核酸組成物。 - IL-23、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記IL-23遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
v. p19、p40、半減期延長エレメント、及び抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第1のポリペプチド鎖であって、p19及びp40が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結するか;または、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結し、前記抗体軽鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド鎖;ならびに
vi. 第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドの軽鎖に相補的であり、前記軽鎖と一緒になってIL-23結合部位を形成する抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第2のポリペプチドを含む、前記核酸組成物。 - IL-23、半減期延長エレメント、IL-23遮断エレメント、及びプロテアーゼ切断性リンカーを含むポリペプチド複合体をコードする1つ以上の核酸配列を含む核酸組成物であって、前記IL-23遮断エレメントが、抗体の抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントが、別個の構成要素として、抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分及び相補的抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含み、前記複合体が:
vii. p19、p40、半減期延長エレメント、及び抗体重鎖の少なくとも抗原結合部分を含む第1のポリペプチド鎖であって、p19及びp40が作動可能に連結し、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結するか;または、前記半減期延長エレメントが、第1のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp19に作動可能に連結し、前記抗体重鎖の抗原結合部分が、第2のプロテアーゼ切断性リンカーを介してp40に作動可能に連結する、前記第1のポリペプチド鎖;ならびに
viii. 第2のポリペプチドであって、前記第2のポリペプチドの重鎖に相補的であり、前記重鎖と一緒になってIL-23結合部位を形成する抗体軽鎖の少なくとも抗原結合部分を含む、前記第2のポリペプチドを含む、前記核酸組成物。 - 環状ベクターを含む、請求項78~83のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- DNAを含む、請求項78~83のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- RNAを含む、請求項78~83のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 請求項78~83のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項87に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で、請求項88に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の製造方法。
- 前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項89に記載の方法。
- 請求項57~77のいずれか一項に記載のタンパク質複合体または請求項78~86のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬組成物。
- 請求項57~77のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項78~86のいずれか一項に記載の核酸、請求項87に記載の発現ベクター、または請求項91に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
- 配列番号423~428からなる群、または配列番号423~428に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列から選択される第1のポリペプチドを含むIL-23ポリペプチド複合体。
- 配列番号104、434もしくは442~445のアミノ酸配列、または配列番号104、434もしくは442~445と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖をさらに含む、請求項93に記載のIL-23ポリペプチド複合体。
- 配列番号422もしくは429~432からなる群から選択されるアミノ酸、または配列番号422もしくは配列番号429~432に対して少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単鎖IL-23誘導性ポリペプチド。
- p19、p40、遮断エレメント、及び半減期延長エレメントを含む誘導性IL-23ポリペプチドであって、前記遮断エレメントが、IL-23上のエピトープに対する結合特異性を有する抗体または抗原結合フラグメントである、前記誘導性IL-23ポリペプチド。
- 請求項93~96のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする核酸。
- 環状ベクターを含む、請求項93~97のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- DNAを含む、請求項93~98のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- RNAを含む、請求項93~98のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 請求項97~100のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項101に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 前記ポリペプチド複合体の発現に適した条件下で、請求項102に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、医薬組成物の製造方法。
- 前記ポリペプチド複合体を単離することをさらに含む、請求項103に記載の方法。
- 請求項93~96のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、または請求項97~100のいずれか一項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
- 請求項93~96のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項97~100のいずれか一項に記載の核酸、請求項101に記載の発現ベクター、または請求項105に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
- 前記IL-23がムテインである、請求項57~66のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項80~86のいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記IL-23が、部分的または完全にアグリコシル化されている、請求項53に記載のポリペプチドまたは請求項107に記載の核酸組成物。
- 前記p19及び/または前記p40が、部分的または完全にアグリコシル化されている、請求項108に記載のポリペプチドまたは請求項108に記載の核酸組成物。
- 前記p19及び/または前記p40が、完全にアグリコシル化されている、請求項109に記載のポリペプチドまたは請求項109に記載の核酸組成物。
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