JP2023526315A - 未成熟終止コドンの阻害剤としてのキナゾリン化合物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するための、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つの使用に関する。また、本発明は、式（ＩＩ）の化合物及びそれらの使用にも関する。【選択図】なし
Description
本発明は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つの使用に関する。また、本発明は、式（ＩＩ）の化合物及びそれらの使用にも関する。
特にナンセンス突然変異などの遺伝的態様を伴う疾患の治療は、興味深い課題である。
標準的な遺伝暗号を使用するヒトなどの真核生物の場合、翻訳終結は、ＵＡＡ、ＵＧＡ及びＵＡＧの３つの停止コドンのうちの１つがリボソームＡ部位に入り、終結因子（ｅＲＦ１）によって認識されると発生する。翻訳終結は正確ではあるが、１００％効果的ではなく、その効率は、ｅＲＦ１による停止コドンの認識と、近同族（ｎｅａｒ－ｃｏｇｎａｔｅ）ｔＲＮＡ（つまり、自然サプレッサーｔＲＮＡ）による停止コドンの解読との競合に依存する。後者の場合は、「リードスルー」とも呼ばれる翻訳終結の抑制につながり、この場合、停止コドンの代わりにアミノ酸が組み込まれる。
コード配列にナンセンス突然変異が出現すると、翻訳を中断し、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ、ＮＭＤ）経路を介して転写産物の分解を誘導することによって、対応するタンパク質の正しい産生を妨げる未成熟終止コドン（ＰＴＣ）が作製される。したがって、ＰＴＣは多数の遺伝性疾患及び癌に関連している。ヒトの遺伝疾患を引き起こすナンセンス突然変異のメタ分析により、遺伝性疾患の１１％がＰＴＣ突然変異に起因し、それらの８０％がＴＧＡ及びＴＡＧであることが明らかになった（Ｍｏｒｔ ｅｔ ａｌ，Ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃａｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２００８，Ａｕｇ；２９（８）：１０３７－４７）。
過去１０年間、潜在力のある治療標的としてインフレームＰＴＣに大きな関心が寄せられてきた。
実際、アミノグリコシド（パロモマイシン、ゲンタマイシン、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）とも呼ばれるＧ４１８、又はアミカシンなど）及びそれらの誘導体（ＮＢ系）は、哺乳動物のリボソームに結合し、培養された哺乳動物細胞及び動物モデルにおける完全長タンパク質の合成を部分的に回復させることによって、ＰＴＣリードスルーを促進することが示されている。このアプローチの潜在力は、Ｂａｒｔｏｎ－Ｄａｖｉ及び同僚によってインビボで最初に実証され、彼らは、ゲンタマイシンの皮下注射後、ｍｄｘマウスの骨格筋におけるジストロフィンレベルが野生型動物の１０～２０％まで回復したことを報告した（Ｂａｒｔｏｎ－Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｒｅｓｔｏｒｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１０４，３７５－３８１）。この戦略は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、筋ジストロフィー（Ｌｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｅｎｓｅ ｉｎｔｏ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，２４，５５２－５６３）及びムコ多糖症Ｉ型ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）（ＭＰＳ Ｉ－Ｈ）（Ｇｕｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１４ Ｍａｒ；１１１（３）：３７４－３８１，Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｏｄｅｒａｔｅｓ ＭＰＳ Ｉ－Ｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）などの多数の遺伝性疾患において評価されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｔｏ ｒｅｃｏｄｅ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ Ｎｏｖ；１３６（２）：２２７－６６）。成功率は様々であるが、いくつかの臨床試験がすでに実施されている（Ｂｏｒｄｅｉｒａ－Ｃａｒｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｓｔｏｐ－ｃｏｄｏｎ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，１８，６６７－６７８；Ｋｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５，３７１－３９４）。いくつかのケースでは、特にゲンタマイシンの存在下で高レベルのリードスルーを示す突然変異について、有望な結果が得られている（Ｓｅｒｍｅｔ－Ｇａｕｄｅｌｕｓ，Ｉ．，Ｒｅｎｏｕｉｌ，Ｍ．，Ｆａｊａｃ，Ａ．，Ｂｉｄｏｕ，Ｌ．，Ｐａｒｂａｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｐｉｅｒｒｏｔ，Ｓ．，Ｄａｖｙ，Ｎ．，Ｂｉｓｍｕｔｈ，Ｅ．，Ｒｅｉｎｅｒｔ，Ｐ．，Ｌｅｎｏｉｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｐ－ｃｏｄｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａ ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，５）。これらの治療の潜在力にもかかわらず、アミノグリコシドによる治療は、重度の副作用、特に耳毒性及び／又は腎毒性を伴う。
実際、アミノグリコシド（パロモマイシン、ゲンタマイシン、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）とも呼ばれるＧ４１８、又はアミカシンなど）及びそれらの誘導体（ＮＢ系）は、哺乳動物のリボソームに結合し、培養された哺乳動物細胞及び動物モデルにおける完全長タンパク質の合成を部分的に回復させることによって、ＰＴＣリードスルーを促進することが示されている。このアプローチの潜在力は、Ｂａｒｔｏｎ－Ｄａｖｉ及び同僚によってインビボで最初に実証され、彼らは、ゲンタマイシンの皮下注射後、ｍｄｘマウスの骨格筋におけるジストロフィンレベルが野生型動物の１０～２０％まで回復したことを報告した（Ｂａｒｔｏｎ－Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｒｅｓｔｏｒｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１０４，３７５－３８１）。この戦略は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、筋ジストロフィー（Ｌｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｅｎｓｅ ｉｎｔｏ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，２４，５５２－５６３）及びムコ多糖症Ｉ型ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）（ＭＰＳ Ｉ－Ｈ）（Ｇｕｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１４ Ｍａｒ；１１１（３）：３７４－３８１，Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｏｄｅｒａｔｅｓ ＭＰＳ Ｉ－Ｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）などの多数の遺伝性疾患において評価されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｔｏ ｒｅｃｏｄｅ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ Ｎｏｖ；１３６（２）：２２７－６６）。成功率は様々であるが、いくつかの臨床試験がすでに実施されている（Ｂｏｒｄｅｉｒａ－Ｃａｒｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｓｔｏｐ－ｃｏｄｏｎ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，１８，６６７－６７８；Ｋｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５，３７１－３９４）。いくつかのケースでは、特にゲンタマイシンの存在下で高レベルのリードスルーを示す突然変異について、有望な結果が得られている（Ｓｅｒｍｅｔ－Ｇａｕｄｅｌｕｓ，Ｉ．，Ｒｅｎｏｕｉｌ，Ｍ．，Ｆａｊａｃ，Ａ．，Ｂｉｄｏｕ，Ｌ．，Ｐａｒｂａｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｐｉｅｒｒｏｔ，Ｓ．，Ｄａｖｙ，Ｎ．，Ｂｉｓｍｕｔｈ，Ｅ．，Ｒｅｉｎｅｒｔ，Ｐ．，Ｌｅｎｏｉｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｐ－ｃｏｄｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａ ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，５）。これらの治療の潜在力にもかかわらず、アミノグリコシドによる治療は、重度の副作用、特に耳毒性及び／又は腎毒性を伴う。
したがって、毒性が低減された新規のＰＴＣリードスループロモーターの開発が必要である。
アタルレン、ネガマイシン、クリトシン、エスシンなど、アミノグリコシドとは構造的に異なる化合物が開発されている。
ＰＴＣ１２４としても知られるアタルレンは、当初、非常に有望であると考えられていた。その臨床的利点はいまだ議論されているが、最近ＥＭＡから条件付き承認を取得した。ネガマイシンは、ゲンタマイシンとは異なるリードスルーコンテキスト依存性を示す、リボソームＡ部位と結合するジペプチドである。クリトシンは、ＰＴＣリードスルー活性を実証したヌクレオシド類似体であるが、その作用機序は不明のままである。セイヨウトチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）種子から単離されたトリテルペノイドサポニンの天然混合物であるエスシンは、ＣＦＴＲ遺伝子に見られるＧ５４２Ｘ及びＷ１２８２Ｘ突然変異のリードスルーを促進することが最近示された。
ＰＴＣ１２４としても知られるアタルレンは、当初、非常に有望であると考えられていた。その臨床的利点はいまだ議論されているが、最近ＥＭＡから条件付き承認を取得した。ネガマイシンは、ゲンタマイシンとは異なるリードスルーコンテキスト依存性を示す、リボソームＡ部位と結合するジペプチドである。クリトシンは、ＰＴＣリードスルー活性を実証したヌクレオシド類似体であるが、その作用機序は不明のままである。セイヨウトチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）種子から単離されたトリテルペノイドサポニンの天然混合物であるエスシンは、ＣＦＴＲ遺伝子に見られるＧ５４２Ｘ及びＷ１２８２Ｘ突然変異のリードスルーを促進することが最近示された。
しかしながら、これらの化合物は全て、定義されたＰＴＣに特異的であり、そのため潜在的な臨床的利益が限られた数の患者に制限されており、かつ／又はリボソームを標的としている。
したがって、新たなリードスルー薬の同定は、この治療戦略の医学的応用を広げるのに役立つため、依然として最も重要である。
したがって、新たなリードスルー薬の同定は、この治療戦略の医学的応用を広げるのに役立つため、依然として最も重要である。
結果として、異なるセットのＰＴＣに対して、又は異なる作用スペクトルで効率的な、新たなＰＴＣリードスループロモーターが必要である。
本発明は、これらの必要性を満たす。
実際、驚くべきことに、本発明者らは、既知のリードスループロモーターといかなる類似性も共有しないトランスレクチン６８（ＴＬＮ６８）と呼ばれる化合物を同定し、この化合物をＤＭＤ遺伝子におけるデュシェンヌ型ミオパシーの原因となる４０個の最も頻繁に発生するナンセンス突然変異を使用して試験した。実施例１に示すように、この化合物が広範囲のナンセンス配列上でＰＴＣリードスルーを刺激することを確認した。
したがって、本発明は、遺伝性疾患又は癌などの、ナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つの使用に関し、
式中、
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカルであり、
Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである。
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカルであり、
Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである。
本発明において、前記遺伝性疾患又は癌は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる。
本発明の別の目的は、式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つに関し、
式中、
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチル又はエチルであり、
Ｒ２は、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、
Ｒ３は、Ｈ又はＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであり、
但し、Ｒ２がＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである場合、Ｒ１はエチルであり、
Ｒ２がハロゲンであり、Ｒ３がＨである場合、当該化合物は、ギ酸又はヨウ素との塩などの薬学的に許容される塩の形態である。
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチル又はエチルであり、
Ｒ２は、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、
Ｒ３は、Ｈ又はＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであり、
但し、Ｒ２がＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである場合、Ｒ１はエチルであり、
Ｒ２がハロゲンであり、Ｒ３がＨである場合、当該化合物は、ギ酸又はヨウ素との塩などの薬学的に許容される塩の形態である。
本発明の別の目的は、少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つを、療法において、又は薬物（又は医薬品）として使用することである。
本発明の別の目的は、薬学的に許容される担体中に、少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つを含む、組成物である。
本発明の別の目的は、薬学的に許容される担体中に、少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つを含む、組成物である。
本発明の別の目的は、
ａ）式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの他の薬物と、を
対象におけるナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患、特に癌若しくは遺伝性疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。
本発明の別の目的は、
ａ）式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの化学療法薬と、を
対象において、癌を治療するため、及び／又は癌転移を予防するため、及び／又は癌再発を予防するため、及び／又は化学療法薬ｂ）に対する耐性を低減するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。
ａ）式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの他の薬物と、を
対象におけるナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患、特に癌若しくは遺伝性疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。
本発明の別の目的は、
ａ）式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの化学療法薬と、を
対象において、癌を治療するため、及び／又は癌転移を予防するため、及び／又は癌再発を予防するため、及び／又は化学療法薬ｂ）に対する耐性を低減するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。
好ましくは、本発明は、
ａ）式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）アタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン、エスシン、及びＮＭＤ阻害剤から選択される少なくとも１つの薬物と、を
対象におけるナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患、特に癌若しくは遺伝性疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。
ａ）式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）アタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン、エスシン、及びＮＭＤ阻害剤から選択される少なくとも１つの薬物と、を
対象におけるナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患、特に癌若しくは遺伝性疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。
式（Ｉ）の化合物又はそれらの塩の治療的使用
第一に、本発明は、遺伝性疾患若しくは癌などのナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つの使用に関し、
式中、
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカルであり、
Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである。
好ましくは、疾患は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患、及び腫瘍抑制遺伝子に存在するナンセンス突然変異によって引き起こされる癌から選択される。
第一に、本発明は、遺伝性疾患若しくは癌などのナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つの使用に関し、
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカルであり、
Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである。
好ましくは、疾患は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患、及び腫瘍抑制遺伝子に存在するナンセンス突然変異によって引き起こされる癌から選択される。
「ナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患」とは、疾患の原因となるナンセンス突然変異がコード配列に存在し、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型の対応するタンパク質の産生及び／又はＮＭＤ経路による対応ｍＲＮＡの分解をもたらすことを意味する。ナンセンス突然変異は、遺伝性疾患の場合のように遺伝的に受け継がれる場合もあれば、癌で発生する場合のように自然発生的である場合もある。
本発明において、前記遺伝性疾患又は癌は、目的のコード配列におけるナンセンス突然変異の存在によって引き起こされる。
遺伝性疾患の場合、ナンセンス突然変異は、遺伝子ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子）、ＤＭＤ（ジストロフィン）、コラーゲン遺伝子（ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ６Ａ４、ＣＯＬ６Ａ５及び／又はＣＯＬ６Ａ６）、ＳＭＮ１（生存運動ニューロン１）、ＩＤＵＡ（アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ＵＳＨ１Ｃ（ＵＳＨ１タンパク質ネットワーク成分ハーモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）のうちのいずれか１つなどの遺伝子に存在する場合がある。例えば、ＳＭＮ１遺伝子のナンセンス突然変異は、脊髄性筋萎縮症又は筋萎縮性側索硬化症を引き起こす場合があり、ＩＤＵＡのナンセンス突然変異は、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ－Ｈ）などのムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を引き起こす場合があり、ＵＳＨ１Ｃのナンセンス突然変異は、アッシャー症候群を引き起こす場合がある。
癌の場合、ナンセンス突然変異は、例えばｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２又はＡＰＣ遺伝子などの腫瘍抑制遺伝子に存在する場合がある。
式（Ｉ）の化合物は、ＰＴＣリードスループロモーター又はＰＴＣリードスルー誘導因子とも呼ばれるＰＴＣの阻害剤である。
「リードスルー」とは、コード配列の翻訳中に未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を通過し、対応する全長ポリペプチドの翻訳をもたらす事象を意味する。コード配列にナンセンス突然変異が出現すると、ＰＴＣが作製される。その結果、対応するタンパク質が短縮型で産生され、ｍＲＮＡがＮＭＤ経路によって分解される場合がある。
リードスルーは、全長ポリペプチドの翻訳をもたらす。これは、ＰＴＣに近同族ｔＲＮＡが入り、翻訳を中断する代わりに、翻訳中にアミノ酸を導入することによって達成される場合がある。
本発明において、前記遺伝性疾患又は癌は、目的のコード配列におけるナンセンス突然変異の存在によって引き起こされる。
遺伝性疾患の場合、ナンセンス突然変異は、遺伝子ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子）、ＤＭＤ（ジストロフィン）、コラーゲン遺伝子（ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ６Ａ４、ＣＯＬ６Ａ５及び／又はＣＯＬ６Ａ６）、ＳＭＮ１（生存運動ニューロン１）、ＩＤＵＡ（アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ＵＳＨ１Ｃ（ＵＳＨ１タンパク質ネットワーク成分ハーモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）のうちのいずれか１つなどの遺伝子に存在する場合がある。例えば、ＳＭＮ１遺伝子のナンセンス突然変異は、脊髄性筋萎縮症又は筋萎縮性側索硬化症を引き起こす場合があり、ＩＤＵＡのナンセンス突然変異は、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ－Ｈ）などのムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を引き起こす場合があり、ＵＳＨ１Ｃのナンセンス突然変異は、アッシャー症候群を引き起こす場合がある。
癌の場合、ナンセンス突然変異は、例えばｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２又はＡＰＣ遺伝子などの腫瘍抑制遺伝子に存在する場合がある。
式（Ｉ）の化合物は、ＰＴＣリードスループロモーター又はＰＴＣリードスルー誘導因子とも呼ばれるＰＴＣの阻害剤である。
「リードスルー」とは、コード配列の翻訳中に未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を通過し、対応する全長ポリペプチドの翻訳をもたらす事象を意味する。コード配列にナンセンス突然変異が出現すると、ＰＴＣが作製される。その結果、対応するタンパク質が短縮型で産生され、ｍＲＮＡがＮＭＤ経路によって分解される場合がある。
リードスルーは、全長ポリペプチドの翻訳をもたらす。これは、ＰＴＣに近同族ｔＲＮＡが入り、翻訳を中断する代わりに、翻訳中にアミノ酸を導入することによって達成される場合がある。
実施例に示されるように、式（Ｉ）の化合物は、ＰＴＣリードスルーを誘導することが可能である。
疾患を「予防すること」又は疾患の「予防」とは、前記疾患の発生を軽減することを意味する。
疾患の「治療」又は疾患を「治療すること」とは、前記疾患の治癒的処置を意味する。治癒的処置とは、疾患を完全に治療する（治癒する）又は部分的に治療する処置と定義される。
前記癌は、腫瘍又は癌細胞がナンセンス突然変異を含む、任意の種類の癌又は新生物（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）である場合がある。特に、前記癌は、腫瘍若しくは癌細胞が腫瘍抑制遺伝子にナンセンス突然変異を含む癌又は新形成である。
前記癌は、例えば、扁平上皮癌、肝細胞癌、胃癌、食道癌、骨癌、黒色腫、乳癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、精巣癌、尿路上皮癌、又は副腎皮質癌、及びリンパ腫などの非固形癌から選択される。前記癌は、転移性癌である可能性も、ない可能性もある。
前記癌は、例えば、扁平上皮癌、肝細胞癌、胃癌、食道癌、骨癌、黒色腫、乳癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、精巣癌、尿路上皮癌、又は副腎皮質癌、及びリンパ腫などの非固形癌から選択される。前記癌は、転移性癌である可能性も、ない可能性もある。
前記遺伝性疾患は、目的の遺伝子のコード配列におけるナンセンス突然変異の存在に起因する任意の疾患である場合がある。
この疾患は、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節遺伝子におけるＧ５４２Ｘなどのナンセンス突然変異による）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィンのナンセンス突然変異による）、ベータサラセミア（β－グロビンのナンセンス突然変異による）、Ａ型、Ｂ型又はＣ型ニーマン・ピック病（酸性スフィンゴミエリナーゼのナンセンスＬ２６１Ｘ突然変異による）、ハーラー症候群、ドラベ症候群、脊髄性筋萎縮症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アポリポタンパク質欠損症（アポリポタンパク質ＡＩ、Ｂ、ＣＩＩ又はＥ）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）欠損症、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子のナンセンス突然変異による）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子のナンセンス突然変異による）、フォン・ヴィレブランド病（フォン・ヴィレブランド因子のナンセンス突然変異による）、ファンコニ貧血群Ｃ、マルファン症候群、ゴーシェ病、ドナヒュー症候群、ロウ（Ｌｏｗｅ）眼脳腎症候群、色素性乾皮症から選択される場合がある。
この疾患は、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節遺伝子におけるＧ５４２Ｘなどのナンセンス突然変異による）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィンのナンセンス突然変異による）、ベータサラセミア（β－グロビンのナンセンス突然変異による）、Ａ型、Ｂ型又はＣ型ニーマン・ピック病（酸性スフィンゴミエリナーゼのナンセンスＬ２６１Ｘ突然変異による）、ハーラー症候群、ドラベ症候群、脊髄性筋萎縮症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アポリポタンパク質欠損症（アポリポタンパク質ＡＩ、Ｂ、ＣＩＩ又はＥ）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）欠損症、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子のナンセンス突然変異による）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子のナンセンス突然変異による）、フォン・ヴィレブランド病（フォン・ヴィレブランド因子のナンセンス突然変異による）、ファンコニ貧血群Ｃ、マルファン症候群、ゴーシェ病、ドナヒュー症候群、ロウ（Ｌｏｗｅ）眼脳腎症候群、色素性乾皮症から選択される場合がある。
本発明による式（Ｉ）の化合物は、好ましくは実質的に純粋な形態である。
「薬学的に許容される塩」とは、ハロゲン、あるいはギ酸、塩酸、メタンスルホン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸若しくは安息香酸などの無機酸又は有機酸との任意の酸付加塩を意味する。好ましくは、式（Ｉ）の化合物の塩は、塩酸、ギ酸又はヨウ素、好ましくは塩酸との塩である。好ましくは、式（Ｉ）の化合物の塩は、塩酸との塩（すなわち、塩酸塩）である。
式（Ｉ）の化合物はまた、特に２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ及び１３Ｎから選択される少なくとも１つの同位体を含んでもよい。
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を意味する。好ましくは、ハロゲンは、フッ素又は塩素又は臭素である。
「Ｃ１-Ｃ６アルキル」とは、１～６個の炭素原子、特に１～３個の炭素原子を含む直鎖炭化水素基、又は３～６個の炭素原子を含む分岐若しくは環状炭化水素基を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎ－ヘキシル、及びシクロヘキシル基が挙げられ、好ましくはメチル又はエチルである。
「Ｃ１-Ｃ６アルコキシ」は、アルキル部分が上記で定義したようなＣ１-Ｃ６アルキルである、-Ｏ-アルキル基である。好ましくは、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基は、メトキシである。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチル又はエチルであり、
Ｒ２が、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル（好ましくはメトキシ）であり、
Ｒ３が、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル（好ましくはメチル）、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル（好ましくはメトキシ）であり、
Ｒ２及びＲ３が、それぞれ同時にＨではない、
ようなものである。
Ｒ２が、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル（好ましくはメトキシ）であり、
Ｒ３が、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル（好ましくはメチル）、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル（好ましくはメトキシ）であり、
Ｒ２及びＲ３が、それぞれ同時にＨではない、
ようなものである。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１が、メチル又はエチルであり、
Ｒ２が、Ｈ、ハロゲン原子又はメトキシラジカルであり、
Ｒ３が、Ｈ、メチルラジカル、又はメトキシラジカルである、
ようなものである。
Ｒ２が、Ｈ、ハロゲン原子又はメトキシラジカルであり、
Ｒ３が、Ｈ、メチルラジカル、又はメトキシラジカルである、
ようなものである。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１が、メチル又はエチル、好ましくはメチルであり、
Ｒ２が、ハロゲン原子、好ましくはフッ素、塩素若しくは臭素原子、又はメトキシラジカルであり、
Ｒ３が、Ｈ又はメチルラジカルである、
ようなものである。
Ｒ２が、ハロゲン原子、好ましくはフッ素、塩素若しくは臭素原子、又はメトキシラジカルであり、
Ｒ３が、Ｈ又はメチルラジカルである、
ようなものである。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１がメチルであり、Ｒ３がＨであるようなものである。この実施形態によれば、好ましくは、Ｒ２は、Ｈ又はＣ１-Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシである。
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
であるＴＬＮ６８、及び
であるＥＣ－１８。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１がメチルであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ２がＣ１-Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであるようなものである。そのような場合、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ＥＣ－１８である。
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１がメチルであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ２がＣ１-Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであるようなものである。そのような場合、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ＥＣ－１８である。
好ましくは、他の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＣ１～Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチル又はＣ１～Ｃ６アルコキシ基、好ましくはメトキシであるようなものである。
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
であるＥＣ－３５、及び
であるＥＣ－３０。
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
好ましくは、他の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がハロゲンであり、Ｒ３がＨ又はＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであるようなものである。好ましくは、Ｒ２は、フッ素、塩素又は臭素原子である。好ましくは、Ｒ３は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルである。
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
であるＥＣ－１４１、
であるＥＣ－８５、
であるＥＣ－１１、
であるＥＣ－２８８、
であるＥＣ－１３０、
であるＥＣ－３３５、及び
好ましくは、他の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１がエチルであり、Ｒ２がＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、Ｒ３がＨであるようなものである。
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
であるＥＣ－２６５、及び
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
好ましくは、式（Ｉ）の化合物又はそれらの塩は、
－Ｒ１がメチルであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ２がＣ１-Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、そのような場合、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ＥＣ－１８若しくはその塩のうちの１つであるか、又は
-Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がハロゲン、好ましくはフッ素、塩素若しくは臭素原子であり、Ｒ３がＨ若しくはＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであり、そのような場合、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ＥＣ－８５、ＥＣ－２８８、ＥＣ－１３０、ＥＣ－３３５若しくはそれらの塩のうちの１つであるか、又は
-Ｒ１がエチルであり、Ｒ２がＣ１-Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、Ｒ３はＨであり、そのような場合、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ＥＣ-２６５若しくはその塩の１つであるようなものである。
－Ｒ１がメチルであり、Ｒ３がＨであり、Ｒ２がＣ１-Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、そのような場合、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ＥＣ－１８若しくはその塩のうちの１つであるか、又は
-Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がハロゲン、好ましくはフッ素、塩素若しくは臭素原子であり、Ｒ３がＨ若しくはＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであり、そのような場合、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ＥＣ－８５、ＥＣ－２８８、ＥＣ－１３０、ＥＣ－３３５若しくはそれらの塩のうちの１つであるか、又は
-Ｒ１がエチルであり、Ｒ２がＣ１-Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、Ｒ３はＨであり、そのような場合、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、ＥＣ-２６５若しくはその塩の１つであるようなものである。
より好ましくは、式（Ｉ）の化合物又はそれらの塩は、以下から選択される：
であるＥＣ－８５、
であるＥＣ－２８８、及びそれらの塩。
式（ＩＩ）の化合物又はそれらの塩
本発明は、式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つにも関し、
式中、
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチル又はエチルであり、
Ｒ２は、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、
Ｒ３は、Ｈ又はＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであり、
但し、Ｒ２がＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである場合、Ｒ１はエチルであり、
Ｒ２がハロゲンであり、Ｒ３がＨである場合、当該化合物は、ギ酸又はヨウ素との塩などの薬学的に許容される塩の形態である。
本発明は、式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つにも関し、
Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチル又はエチルであり、
Ｒ２は、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、
Ｒ３は、Ｈ又はＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであり、
但し、Ｒ２がＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである場合、Ｒ１はエチルであり、
Ｒ２がハロゲンであり、Ｒ３がＨである場合、当該化合物は、ギ酸又はヨウ素との塩などの薬学的に許容される塩の形態である。
式（ＩＩ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物のサブグループである。
薬学的に許容される塩、同位体、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル及びＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルに関する全ての定義は、ここでも式（ＩＩ）に適用可能である。同様に、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つの全ての使用は、式（ＩＩ）の化合物にも適用可能である。
好ましくは、式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２がハロゲンであり、Ｒ３がＨ又はＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであるようなものである。
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
であるＥＣ－１４１、
であるＥＣ－８５、
であるＥＣ－１１、
であるＥＣ－２８８、
であるＥＣ－１３０、
であるＥＣ－３３５、及び
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
であるＥＣ－１４１、
であるＥＣ－８５、
であるＥＣ－２８８、
であるＥＣ－１３０、
であるＥＣ－３３５、及び
好ましくは、他の実施形態によれば、式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ１がエチルであり、Ｒ２がＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、Ｒ３がＨであるようなものである。
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
であるＥＣ－２６５、及び
好ましくは、そのような化合物は、以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される：
本発明の別の目的は、少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つを、療法において、又は薬物（又は医薬品）として使用することである。
本発明の別の目的は、薬学的に許容される培地中に、少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つを含む、組成物である。
本発明の化合物の調製
本発明による式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、一般方法Ａ及び／又はＢに記載されているように、並びに以下のスキームに示されているように調製してもよい：
本発明による式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、一般方法Ａ及び／又はＢに記載されているように、並びに以下のスキームに示されているように調製してもよい：
一般方法Ａ。Ｃ７及び／又はＣ８位置で置換された化合物への合成経路（スキーム１）：
２，２，４－トリメチル－１，２－ジヒドロキノリン（１）。窒素注入口と磁気攪拌棒を備えた、オーブンで乾燥させたシュレンクチューブに、対応するアニリン（１０ｍｍｏｌ）、塩化インジウム（ＩＩＩ）（０．５ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）、及びアセトン（１２ｍＬ）を順次投入した。出発材料の完全な変換が観察されるまで混合物を５６℃で撹拌し、次いで全ての揮発物を真空で除去し、残留物をシクロヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配を使用する順相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
トランスレクチン６８誘導体（ＴＬＮ６８）（２）。乾燥アセトニトリル（１ｍＬ）中の対応する２，２，４－トリメチル－１，２－ジヒドロキノリン１（１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ２Ｏ中の１Ｍ ＨＣｌ（１当量）を添加した。１の塩酸塩が完全に沈殿したら、ガラスフリットフィルター上で真空吸引濾過により固体を収集し、ヘキサンで繰り返し洗浄した。この材料を更に精製することなく次のステップで使用した。
磁気攪拌棒及び還流凝縮器を備えた丸底フラスコに、１の対応する塩酸塩（１ｍｍｏｌ）、ジシアンジアミド（１．０１当量）、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）、及び水（１．５ｍＬ）を投入した。混合物を１８時間還流し、次いで室温に冷却し、ｐＨを９～１０に調整した。ガラスフリットフィルター上での真空吸引濾過により沈殿物を収集し、冷水で十分に洗浄した。０．１％ｖ／ｖギ酸を補充した水中のアセトニトリルの勾配を使用する逆相カラムクロマトグラフィーによる精製により、キナゾリル－２－グアニジン２をギ酸塩として得た。
スキーム１ 試薬及び条件：（ａ）ＩｎＣｌ３（５ｍｏｌ％）、アセトン、５６℃、２４～７２時間；（ｂ）Ｅｔ２Ｏ（１当量）中の１Ｍ ＨＣｌ、ＭｅＣＮ、室温、５～１０分；（ｃ）ジシアンジアミド（１．０１当量）、ＥｔＯＨ、Ｈ２Ｏ、還流、１８時間。
２，２，４－トリメチル－１，２－ジヒドロキノリン（１）。窒素注入口と磁気攪拌棒を備えた、オーブンで乾燥させたシュレンクチューブに、対応するアニリン（１０ｍｍｏｌ）、塩化インジウム（ＩＩＩ）（０．５ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）、及びアセトン（１２ｍＬ）を順次投入した。出発材料の完全な変換が観察されるまで混合物を５６℃で撹拌し、次いで全ての揮発物を真空で除去し、残留物をシクロヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配を使用する順相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
トランスレクチン６８誘導体（ＴＬＮ６８）（２）。乾燥アセトニトリル（１ｍＬ）中の対応する２，２，４－トリメチル－１，２－ジヒドロキノリン１（１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ２Ｏ中の１Ｍ ＨＣｌ（１当量）を添加した。１の塩酸塩が完全に沈殿したら、ガラスフリットフィルター上で真空吸引濾過により固体を収集し、ヘキサンで繰り返し洗浄した。この材料を更に精製することなく次のステップで使用した。
磁気攪拌棒及び還流凝縮器を備えた丸底フラスコに、１の対応する塩酸塩（１ｍｍｏｌ）、ジシアンジアミド（１．０１当量）、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）、及び水（１．５ｍＬ）を投入した。混合物を１８時間還流し、次いで室温に冷却し、ｐＨを９～１０に調整した。ガラスフリットフィルター上での真空吸引濾過により沈殿物を収集し、冷水で十分に洗浄した。０．１％ｖ／ｖギ酸を補充した水中のアセトニトリルの勾配を使用する逆相カラムクロマトグラフィーによる精製により、キナゾリル－２－グアニジン２をギ酸塩として得た。
一般方法Ｂ。Ｃ４及び／又はＣ７～Ｃ８位置で置換された化合物への合成経路（スキーム２）：
オルト－アミノフェノン（１）。窒素注入口及び磁気攪拌棒を備えた、オーブンで乾燥させた二口丸底フラスコに、乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の対応する２－アミノベンゾニトリル（５ｍｍｏｌ）の溶液を投入した。対応するグリニャール試薬（３当量）を、注射器を介して０℃で滴下した。混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで室温まで温め、この温度で１８時間撹拌した。塩化アンモニウムの飽和水溶液（１５ｍＬ）を添加し、二相混合物を１０分間激しく撹拌した。層を分離し、水相をＥｔＯＡｃで２回抽出した。組み合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮し、残留物を、シクロヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配を使用する順相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
トランスレクチン６８誘導体（２）。磁気攪拌棒と還流冷却器を備えた丸底フラスコに、対応するオルト－アミノフェノン１（１ｍｍｏｌ）、ジシアンジアミド（１．０５当量）、ｐＴＳＡ（５ｍｏｌ％）、及びＤＭＦ（３．５ｍＬ）を投入した。出発材料の完全な変換が観察されるまで混合物を１２０℃で撹拌し、次いで室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水及びブラインで繰り返し洗浄した。全ての揮発物を真空で除去し、０．１％ｖ／ｖギ酸を補充した水中のアセトニトリルの勾配を使用する逆相カラムクロマトグラフィーによって残留物を精製して、キナゾリル－２－グアニジン２をギ酸塩として得た。
スキーム２ 試薬及び条件：（ａ）Ｒ１ＭｇＢｒ又はＲ１ＭｇＣｌ（３当量）、ＴＨＦ、０℃～室温、１８時間；その後、ＮＨ４Ｃｌ飽和溶液、１０分；（ｂ）ジシアンジアミド（１．０５当量）、ｐＴＳＡ（５ｍｏｌ％）、ＤＭＦ、１２０℃、１２～２４時間。
オルト－アミノフェノン（１）。窒素注入口及び磁気攪拌棒を備えた、オーブンで乾燥させた二口丸底フラスコに、乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の対応する２－アミノベンゾニトリル（５ｍｍｏｌ）の溶液を投入した。対応するグリニャール試薬（３当量）を、注射器を介して０℃で滴下した。混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで室温まで温め、この温度で１８時間撹拌した。塩化アンモニウムの飽和水溶液（１５ｍＬ）を添加し、二相混合物を１０分間激しく撹拌した。層を分離し、水相をＥｔＯＡｃで２回抽出した。組み合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮し、残留物を、シクロヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配を使用する順相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
トランスレクチン６８誘導体（２）。磁気攪拌棒と還流冷却器を備えた丸底フラスコに、対応するオルト－アミノフェノン１（１ｍｍｏｌ）、ジシアンジアミド（１．０５当量）、ｐＴＳＡ（５ｍｏｌ％）、及びＤＭＦ（３．５ｍＬ）を投入した。出発材料の完全な変換が観察されるまで混合物を１２０℃で撹拌し、次いで室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水及びブラインで繰り返し洗浄した。全ての揮発物を真空で除去し、０．１％ｖ／ｖギ酸を補充した水中のアセトニトリルの勾配を使用する逆相カラムクロマトグラフィーによって残留物を精製して、キナゾリル－２－グアニジン２をギ酸塩として得た。
本発明の化合物との治療的組み合わせ
本発明の別の目的は、
ａ）式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの他の薬物と、を
対象におけるナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患、特に癌若しくは遺伝性疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。好ましくは、疾患は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患、及び腫瘍抑制遺伝子に存在するナンセンス突然変異によって引き起こされる癌から選択される。
本発明の別の目的は、
ａ）式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの他の薬物と、を
対象におけるナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患、特に癌若しくは遺伝性疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。好ましくは、疾患は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患、及び腫瘍抑制遺伝子に存在するナンセンス突然変異によって引き起こされる癌から選択される。
本発明の別の目的は、
ａ）式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの化学療法薬と、を
対象において、癌を治療するため、及び／又は癌転移を予防するため、及び／又は癌再発を予防するため、及び／又は化学療法薬ｂ）に対する耐性を低減するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。
ａ）式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの化学療法薬と、を
対象において、癌を治療するため、及び／又は癌転移を予防するため、及び／又は癌再発を予防するため、及び／又は化学療法薬ｂ）に対する耐性を低減するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物である。
好ましくは、本発明は、
ａ）式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）アタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン、エスシン、及びＮＭＤ阻害剤から選択される少なくとも１つの薬物と、を
対象におけるナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患、特に癌若しくは遺伝性疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物に関する。好ましくは、疾患は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患、及び腫瘍抑制遺伝子に存在するナンセンス突然変異によって引き起こされる癌から選択される。
ａ）式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）アタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン、エスシン、及びＮＭＤ阻害剤から選択される少なくとも１つの薬物と、を
対象におけるナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患、特に癌若しくは遺伝性疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物に関する。好ましくは、疾患は、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患、及び腫瘍抑制遺伝子に存在するナンセンス突然変異によって引き起こされる癌から選択される。
「対象」という用語は、任意の対象を指し、典型的には、患者、特に遺伝性疾患、又は化学療法及び／若しくは放射線療法などの癌の治療を受けている対象、あるいは癌を発症するリスクがあるか、又はその疑いがある対象を示す。
対象は、好ましくは哺乳動物であり、更により好ましくはヒトである。例えば、対象は、癌に罹患しているヒトである場合がある。
対象は、好ましくは哺乳動物であり、更により好ましくはヒトである。例えば、対象は、癌に罹患しているヒトである場合がある。
対象は、完全な従来の治療プロトコルの一部、例えば全治療プロトコルの少なくとも１回のサイクル、例えば全治療プロトコルの２回のサイクルに曝されている場合がある。
典型的には、他の薬物は、遺伝性疾患又は癌を治療するために使用される薬物であってもよい。
本発明の特定の実施形態において、他の薬物は、好ましくはアタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン及びエスシンから選択される、別のＰＴＣリードスルー誘導因子である。本発明の別の特定の実施形態では、他の薬物は、ＮＭＤ阻害剤から選択される。
実際、本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、リボソームを標的としない場合がある。したがって、それらの化合物は、リボソームを標的とするアタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン又はエスシンなどの以前のリードスルー誘導因子と組み合わせて使用される可能性がある。
本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、ＮＭＤ阻害剤と組み合わせて使用される可能性がある。ＮＭＤ（ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解）阻害剤は、阻害のないそのような細胞と比較して、細胞中のＮＭＤの活性を低減する、及び／又は欠陥のあるｍＲＮＡの破壊を任意の測定可能な量だけ低減する化合物である。ＮＭＤ阻害は、様々な方法、例えば、ＮＭＤ経路のタンパク質成分の機能を阻止することによって、翻訳を阻害することによって、又は翻訳機械に未成熟終止コドンをバイパスさせることによって（リードスルー）達成できる。
ＮＭＤ阻害剤は、ウォルトマンニン、カフェイン、パテアミンＡ、ＮＭＤＩ－１、及び５－アザシチジンから選択することができる。
典型的には、他の薬物は、遺伝性疾患又は癌を治療するために使用される薬物であってもよい。
本発明の特定の実施形態において、他の薬物は、好ましくはアタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン及びエスシンから選択される、別のＰＴＣリードスルー誘導因子である。本発明の別の特定の実施形態では、他の薬物は、ＮＭＤ阻害剤から選択される。
実際、本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、リボソームを標的としない場合がある。したがって、それらの化合物は、リボソームを標的とするアタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン又はエスシンなどの以前のリードスルー誘導因子と組み合わせて使用される可能性がある。
本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、ＮＭＤ阻害剤と組み合わせて使用される可能性がある。ＮＭＤ（ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解）阻害剤は、阻害のないそのような細胞と比較して、細胞中のＮＭＤの活性を低減する、及び／又は欠陥のあるｍＲＮＡの破壊を任意の測定可能な量だけ低減する化合物である。ＮＭＤ阻害は、様々な方法、例えば、ＮＭＤ経路のタンパク質成分の機能を阻止することによって、翻訳を阻害することによって、又は翻訳機械に未成熟終止コドンをバイパスさせることによって（リードスルー）達成できる。
ＮＭＤ阻害剤は、ウォルトマンニン、カフェイン、パテアミンＡ、ＮＭＤＩ－１、及び５－アザシチジンから選択することができる。
本発明の特定の実施形態では、他の薬物は、化学療法薬である。
本発明の特定の実施形態では、化学療法薬は、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体毒などの抗有糸分裂剤、ＤＮＡ－挿入剤、タキサン、プラチンをベースとする成分、特定のキナーゼ阻害剤、アンドロゲン受容体アンタゴニスト、ホルモン、サイトカイン、抗血管新生剤、抗体、特にモノクローナル抗体、免疫系の調節剤、腫瘍溶解性ウイルス及びＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）－３リガンドから選択される。
化学療法薬は、予防又は治療する特定の癌に応じて選択してもよい。
本発明の特定の実施形態では、化学療法薬は、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体毒などの抗有糸分裂剤、ＤＮＡ－挿入剤、タキサン、プラチンをベースとする成分、特定のキナーゼ阻害剤、アンドロゲン受容体アンタゴニスト、ホルモン、サイトカイン、抗血管新生剤、抗体、特にモノクローナル抗体、免疫系の調節剤、腫瘍溶解性ウイルス及びＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）－３リガンドから選択される。
化学療法薬は、予防又は治療する特定の癌に応じて選択してもよい。
アントラサイクリンとしては、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、イダルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、ネモルビシン、サバルビシン又はバルルビシンが挙げられる。
抗腫瘍抗生物質としては、例えば、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、マイトマイシンＣ又はミトキサントロンが挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、ダカルバジン、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、オキサリプラチン、ウラムスチン又はテモゾロミドが挙げられる。
代謝拮抗剤の例は、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、フルオロウラシル（５－ＦＵ）又はペメトレキセドである。アルカロイドとしては、例えば、ビンブラスチン、又はビンクリスチン（ビノレルビン）が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、イリノテカン、トポテカン又はエトポシドが挙げられる。紡錘体毒は、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンから選択される。
タキサンは、例えば、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル、パクリタキセル（ＰＧ－パクリタキセル及びＤＨＡ－パクリタキセル）、オルタタキセル、テセタキセル、及びタキソプレキシンから選択される。
プラチンをベースとする成分の例は、ＣＤＤＰ及びＯＸＰである。
特定のキナーゼ阻害剤の例は、例えば、ベムラフェニブ及びダブラフェニブなどのＢＲＡＦキナーゼ阻害剤、又はトラメチニブなどのＭＥＫ阻害剤、又はボラセルチブなどのＰｌｋ１阻害剤である。
アンドロゲン受容体アンタゴニストは、例えば、ビカルタミド又はエンザルタミドである。
タモキシフェン及び抗アロマターゼ薬は通常、ホルモン療法との関連で使用される。
免疫療法との関連で使用可能なサイトカインの例は、ＩＬ－２（インターロイキン－２）及びＩＦＮ（インターフェロン）アルファ（ＩＦＮａ）である。
抗血管新生剤は、例えば、イトラコナゾール、ベバシズマブ又はラニビズマブなどのＶＥＧＦ阻害剤である。
抗ＣＤ２０（パンＢ細胞抗原）及び抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体－２／ＮＥＵ）は、モノクローナル抗体の例である。また、モノクローナル抗体としては、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＰＤＬ２、抗ＣＤ７３、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＴＩＧＩＴ、抗ガラクチン－３又は抗ＨＶＥＭ抗体などの抗免疫チェックポイント抗体が挙げられる。
抗ＰＤ１抗体としては、ペムブロリズマブ又はニボルマブが挙げられる。
免疫系調節剤は、例えば、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２若しくはＴＤＯ２阻害剤、Ａ２ａアンタゴニスト、又はＳＴＩＮＧアゴニストである。
腫瘍溶解性ウイルスは、例えばタリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）である。
抗腫瘍抗生物質としては、例えば、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、マイトマイシンＣ又はミトキサントロンが挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、ダカルバジン、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、オキサリプラチン、ウラムスチン又はテモゾロミドが挙げられる。
代謝拮抗剤の例は、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、フルオロウラシル（５－ＦＵ）又はペメトレキセドである。アルカロイドとしては、例えば、ビンブラスチン、又はビンクリスチン（ビノレルビン）が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、イリノテカン、トポテカン又はエトポシドが挙げられる。紡錘体毒は、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンから選択される。
タキサンは、例えば、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル、パクリタキセル（ＰＧ－パクリタキセル及びＤＨＡ－パクリタキセル）、オルタタキセル、テセタキセル、及びタキソプレキシンから選択される。
プラチンをベースとする成分の例は、ＣＤＤＰ及びＯＸＰである。
特定のキナーゼ阻害剤の例は、例えば、ベムラフェニブ及びダブラフェニブなどのＢＲＡＦキナーゼ阻害剤、又はトラメチニブなどのＭＥＫ阻害剤、又はボラセルチブなどのＰｌｋ１阻害剤である。
アンドロゲン受容体アンタゴニストは、例えば、ビカルタミド又はエンザルタミドである。
タモキシフェン及び抗アロマターゼ薬は通常、ホルモン療法との関連で使用される。
免疫療法との関連で使用可能なサイトカインの例は、ＩＬ－２（インターロイキン－２）及びＩＦＮ（インターフェロン）アルファ（ＩＦＮａ）である。
抗血管新生剤は、例えば、イトラコナゾール、ベバシズマブ又はラニビズマブなどのＶＥＧＦ阻害剤である。
抗ＣＤ２０（パンＢ細胞抗原）及び抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体－２／ＮＥＵ）は、モノクローナル抗体の例である。また、モノクローナル抗体としては、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＰＤＬ２、抗ＣＤ７３、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＴＩＧＩＴ、抗ガラクチン－３又は抗ＨＶＥＭ抗体などの抗免疫チェックポイント抗体が挙げられる。
抗ＰＤ１抗体としては、ペムブロリズマブ又はニボルマブが挙げられる。
免疫系調節剤は、例えば、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２若しくはＴＤＯ２阻害剤、Ａ２ａアンタゴニスト、又はＳＴＩＮＧアゴニストである。
腫瘍溶解性ウイルスは、例えばタリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）である。
好ましい実施形態では、化学療法薬は、シスプラチン、ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド、オキサリプラチン、イリノテカン、メトトレキセート、テモゾロミド、５－ＦＵ、ダカルバジン、及びベムラフェニブから選択される。
ナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患を治療する方法も本明細書に記載されており、この方法は、任意選択的には他の薬物と共に、有効量の、上記で定義したような式（Ｉ）又は（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物を、疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む。
本明細書で使用される場合、「治療有効量又は用量」とは、対象、好ましくはヒトにおいて癌を除去する、進行を遅らせる、あるいは前記疾患によって引き起こされるか前記疾患に関連する１つ以上の症状若しくは障害を軽減するか又は遅延させる本発明の化合物の量を指す。本発明の化合物及びその薬学的組成物の有効量、及びより一般的には投与計画は、当業者によって決定及び適合されてもよい。有効用量は、従来の技術を使用し、類似の状況下で得られた結果を観察することによって決定することができる。本発明の化合物の治療有効用量は、治療又は予防する疾患、その重篤性（ｇｒａｖｉｔｙ）、投与経路、関与する併用療法、患者の年齢、体重、全身病状、病歴などに応じて変化するであろう。
典型的には、患者に投与される化合物の量は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１～５００ｍｇの範囲であってもよい。特定の実施形態では、本発明による薬学的組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇ、例えば２５～３００ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物を含む。
特定の態様では、本発明の化合物は、非経口経路、局所経路、経口経路、又は静脈内（ＩＶ）注射によって対象に投与することができる。本発明の化合物又はナノ粒子は、連続した数日間、例えば連続した２～１０日間、好ましくは連続した３～６日の間、毎日（例えば、１日１、２、３、４、５、６、又は７回）対象に投与してもよい。前記治療は、１、２、３、４、５、６、若しくは７週間、又は２若しくは３週間ごとに、又は１、２若しくは３ヶ月ごとに繰り返してもよい。あるいは、任意選択的には２回の治療サイクルの間に、例えば１、２、３、４、又は５週間の休止期間を設けて、数回の治療サイクルを実行することができる。本発明の化合物又はナノ粒子は、例えば、週に１回、２週に１回、又は月に１回の単回用量として投与することができる。治療は、年に１回又は数回繰り返してもよい。
用量は、当業者が決定できる適切な間隔で投与される。選択される量は、投与経路、投与期間、投与時間、式（Ｉ）の選択された化合物若しくは前記化合物と組み合わせて使用される様々な製品の排出速度、患者の年齢、体重及び体調、及び患者の病歴、並びに医学で知られている任意の他の情報を含む複数の要因に依存する。
典型的には、患者に投与される化合物の量は、ヒト患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１～５００ｍｇの範囲であってもよい。特定の実施形態では、本発明による薬学的組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇ、例えば２５～３００ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物を含む。
特定の態様では、本発明の化合物は、非経口経路、局所経路、経口経路、又は静脈内（ＩＶ）注射によって対象に投与することができる。本発明の化合物又はナノ粒子は、連続した数日間、例えば連続した２～１０日間、好ましくは連続した３～６日の間、毎日（例えば、１日１、２、３、４、５、６、又は７回）対象に投与してもよい。前記治療は、１、２、３、４、５、６、若しくは７週間、又は２若しくは３週間ごとに、又は１、２若しくは３ヶ月ごとに繰り返してもよい。あるいは、任意選択的には２回の治療サイクルの間に、例えば１、２、３、４、又は５週間の休止期間を設けて、数回の治療サイクルを実行することができる。本発明の化合物又はナノ粒子は、例えば、週に１回、２週に１回、又は月に１回の単回用量として投与することができる。治療は、年に１回又は数回繰り返してもよい。
用量は、当業者が決定できる適切な間隔で投与される。選択される量は、投与経路、投与期間、投与時間、式（Ｉ）の選択された化合物若しくは前記化合物と組み合わせて使用される様々な製品の排出速度、患者の年齢、体重及び体調、及び患者の病歴、並びに医学で知られている任意の他の情報を含む複数の要因に依存する。
投与経路は、経口、局所又は非経口、典型的には直腸、舌下、鼻腔内、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、筋肉内（ＩＭ）、小脳内、髄腔内、腫瘍内及び／又は皮内であり得る。薬学的組成物は、上記経路のうちの１つ又はいくつかに適合する。薬学的組成物は、好ましくは、好適な無菌溶液の注射若しくは静脈内注入によって、又は消化管を介して液体若しくはは固体用量の形態で投与される。
本発明の製剤は、薬学的に許容される担体中に式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含む。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。
薬学的組成物は、薬学的に適合性である溶媒中の溶液として、あるいは好適な薬学的溶媒若しくはビヒクル中のゲル、油、エマルジョン、懸濁液又は分散液として、又は当技術分野で知られている様式で固体ビヒクルを含有する丸剤、錠剤、カプセル、粉末、座薬などとして、おそらくは徐放及び／若しくは遅延放出を提供する剤形又は装置により製剤化することができる。このタイプの製剤には、セルロース、脂質、炭酸塩又はデンプンなどの薬剤が有利に使用される。
製剤（液体及び／若しくは注射剤及び／若しくは固体）で使用できる薬剤又はビヒクルは、賦形剤又は不活性ビヒクル、すなわち、薬学的に不活性かつ非毒性のビヒクルである。
例えば、薬学的使用に適合性であり、当業者に知られている生理食塩水、生理溶液、等張液及び／又は緩衝液を挙げることができる。組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、防腐剤などから選択される１つ以上の薬剤又はビヒクルを含んでもよい。
特定の例は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、リポソーム、植物油又は動物、アカシアなどである。好ましくは、植物油が使用される。
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれ所定量の有効成分を含有するカプセル、小袋、錠剤又はトローチ剤などの別個の単位の形態；粉末又は顆粒の形態で；水性液体若しくは非水性液体中の溶液又は懸濁液の形態；あるいは水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンの形態であってもよい。
非経口投与に適した製剤は、好ましくはレシピエントの血液と等張である活性成分の滅菌油性又は水性調製物を好都合に含む。そのような製剤は全て、他の薬学的に適合性がありかつ毒性のない補助剤、例えば、安定剤、酸化防止剤、結合剤、染料、乳化剤又は香料物質を含むこともできる。
薬学的組成物は、薬学的に適合性である溶媒中の溶液として、あるいは好適な薬学的溶媒若しくはビヒクル中のゲル、油、エマルジョン、懸濁液又は分散液として、又は当技術分野で知られている様式で固体ビヒクルを含有する丸剤、錠剤、カプセル、粉末、座薬などとして、おそらくは徐放及び／若しくは遅延放出を提供する剤形又は装置により製剤化することができる。このタイプの製剤には、セルロース、脂質、炭酸塩又はデンプンなどの薬剤が有利に使用される。
製剤（液体及び／若しくは注射剤及び／若しくは固体）で使用できる薬剤又はビヒクルは、賦形剤又は不活性ビヒクル、すなわち、薬学的に不活性かつ非毒性のビヒクルである。
例えば、薬学的使用に適合性であり、当業者に知られている生理食塩水、生理溶液、等張液及び／又は緩衝液を挙げることができる。組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、防腐剤などから選択される１つ以上の薬剤又はビヒクルを含んでもよい。
特定の例は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、リポソーム、植物油又は動物、アカシアなどである。好ましくは、植物油が使用される。
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれ所定量の有効成分を含有するカプセル、小袋、錠剤又はトローチ剤などの別個の単位の形態；粉末又は顆粒の形態で；水性液体若しくは非水性液体中の溶液又は懸濁液の形態；あるいは水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンの形態であってもよい。
非経口投与に適した製剤は、好ましくはレシピエントの血液と等張である活性成分の滅菌油性又は水性調製物を好都合に含む。そのような製剤は全て、他の薬学的に適合性がありかつ毒性のない補助剤、例えば、安定剤、酸化防止剤、結合剤、染料、乳化剤又は香料物質を含むこともできる。
本発明の更なる態様及び利点が以下の実験セクションにおいて開示されるが、これらは単なる例示と見なされるものとする。
なお、図中のＴＬＮ６８は、「ＴＬＮ４６８」と同じ分子である。
実施例１：本発明による式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の調製
以下の例が、上記のプロトコルに従って調製される：
以下の例が、上記のプロトコルに従って調製される：
１－（７－メトキシ－４－メチルキナゾリン－２－イル）グアニジンＥＣ－１８（Ｃ１１Ｈ１３Ｎ５Ｏ、２３１．２６ｇ／ｍｏｌ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：８．４５（ｓ、１Ｈ）、８．０８（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．３５（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．１５（ｄｄ、Ｊ＝９．１、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．９３（ｓ、３Ｈ）、２．７９（ｓ、３Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１６９．７、１６７．４、１６４．２、１５６．４、１５５．５、１５１．４、１２７．５、１１７．７、１１５．８、１０５．５、５５．８、２１．３。
ＩＲ（ニート）：３２４０（ブロード）、２９７４、１６８６、１５６２、１３４０、１２１５、１０１８、６９９。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１４Ｎ５Ｏ（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２３２．１１９３；実測値：２３２．１１９４。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１６９．７、１６７．４、１６４．２、１５６．４、１５５．５、１５１．４、１２７．５、１１７．７、１１５．８、１０５．５、５５．８、２１．３。
ＩＲ（ニート）：３２４０（ブロード）、２９７４、１６８６、１５６２、１３４０、１２１５、１０１８、６９９。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１４Ｎ５Ｏ（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２３２．１１９３；実測値：２３２．１１９４。
１－（４，８－ジメチルキナゾリン－２－イル）グアニジンＥＣ－３５（Ｃ１１Ｈ１３Ｎ５、２１５．２６ｇ／ｍｏｌ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：９．２３（ｂｒ ｓ、３Ｈ）、８．４５（ｓ、１Ｈ）、８．０３（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９－７．４２（ｍ、１Ｈ）、２．８６（ｓ、３Ｈ）、２．５５（ｓ、３Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１７１．６、１６７．６、１５６．６、１５４．２、１４７．５、１３４．６、１３３．７、１２５．１、１２３．７、１２０．４、２１．７、１７．２。
ＩＲ（ニート）：３２１０（ブロード）、２９８１、１６９７、１５８６、１３５３、１１５３、７５９。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１４Ｎ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２１６．１２４４；実測値：２１６．１２４６。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１７１．６、１６７．６、１５６．６、１５４．２、１４７．５、１３４．６、１３３．７、１２５．１、１２３．７、１２０．４、２１．７、１７．２。
ＩＲ（ニート）：３２１０（ブロード）、２９８１、１６９７、１５８６、１３５３、１１５３、７５９。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１４Ｎ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２１６．１２４４；実測値：２１６．１２４６。
１－（７－ブロモ－４，８－ジメチルキナゾリン－２－イル）グアニジンＥＣ－１３０（Ｃ１１Ｈ１２ＢｒＮ５、２９４．１６ｇ／ｍｏｌ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：８．４２（ｓ、１Ｈ）、７．９３（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．６７（ｄ、Ｊ＝８．９、１Ｈ）、２．８３（ｓ、３Ｈ）、２．６３（ｓ、３Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１７１．４、１６６．９、１５７．２、１５６．３、１４８．７、１３３．３、１３０．０、１２８．４、１２４．９、１１９．４、２１．７、１７．１。
ＩＲ（ニート）：３３０５（ブロード）、２９７２、１６９４、１５６０、１３２３、１０３２、７８０。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１３ＢｒＮ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２９４．０３４９；実測値：２９４．０３５０。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１７１．４、１６６．９、１５７．２、１５６．３、１４８．７、１３３．３、１３０．０、１２８．４、１２４．９、１１９．４、２１．７、１７．１。
ＩＲ（ニート）：３３０５（ブロード）、２９７２、１６９４、１５６０、１３２３、１０３２、７８０。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１３ＢｒＮ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２９４．０３４９；実測値：２９４．０３５０。
１－（７－フルオロ－４、８－ジメチルキナゾリン－２－イル）グアニジンＥＣ－２８８（Ｃ１１Ｈ１２ＦＮ５、２３３．２５ｇ／ｍｏｌ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：８．４１（ｓ、１Ｈ）、８．１１（ｄ、Ｊ＝９．１、６．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１（ｄ、Ｊ＝９．３、１Ｈ）、２．８３（ｓ、３Ｈ）、２．４１（ｓ、３Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１７１．５、１６７．２、１６４．４、１６１．９、１５６．０、１５５．１、１４９．５、１２６．０（３ＪＣＦ＝１０．８Ｈｚ）、１１７．９（２ＪＣＦ＝１６．１Ｈｚ）、１１５．０（２ＪＣＦ＝２６．５Ｈｚ）、３８．９（溶媒残留ピークとの重複）、８．５８（３ＪＣＦ＝４．０Ｈｚ）。
１９Ｆ（３７６ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：－１０６．５。
ＩＲ（ニート）：３３１８（ブロード）、２９２２、１６９５、１５８７、１３３６、１０５９、７８８。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１３ＦＮ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２３４．１１５０；実測値：２３４．１１５３。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１７１．５、１６７．２、１６４．４、１６１．９、１５６．０、１５５．１、１４９．５、１２６．０（３ＪＣＦ＝１０．８Ｈｚ）、１１７．９（２ＪＣＦ＝１６．１Ｈｚ）、１１５．０（２ＪＣＦ＝２６．５Ｈｚ）、３８．９（溶媒残留ピークとの重複）、８．５８（３ＪＣＦ＝４．０Ｈｚ）。
１９Ｆ（３７６ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：－１０６．５。
ＩＲ（ニート）：３３１８（ブロード）、２９２２、１６９５、１５８７、１３３６、１０５９、７８８。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１３ＦＮ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２３４．１１５０；実測値：２３４．１１５３。
１－（７－クロロ－４、８－ジメチルキナゾリン－２－イル）グアニジンＥＣ－３３５（Ｃ１１Ｈ１２ＣｌＮ５、２４９．７０ｇ／ｍｏｌ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：８．４１（ｓ、１Ｈ）、８．０２（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．５２（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．８４（ｓ、３Ｈ）、２．６０（ｓ、３Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１７０．９、１６６．６、１５７．４、１４９．０、１３８．３、１３１．０、１２５．４、１２４．８、１２４．７、１１８．７、２１．７、１４．０。
ＩＲ（ニート）：３３０１（ブロード）、２９７０、１６９４、１５７１、１３２５、１０２２、７８２。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１３ＣｌＮ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２５０．０８５４；実測値：２５０．０８５８。
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ）：１７０．９、１６６．６、１５７．４、１４９．０、１３８．３、１３１．０、１２５．４、１２４．８、１２４．７、１１８．７、２１．７、１４．０。
ＩＲ（ニート）：３３０１（ブロード）、２９７０、１６９４、１５７１、１３２５、１０２２、７８２。
ＨＲＭＳＣ１１Ｈ１３ＣｌＮ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値：２５０．０８５４；実測値：２５０．０８５８。
実施例２：デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）におけるＰＴＣ突然変異の翻訳抑制
材料及び方法
細胞株及びプラスミド
ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養したＨ１２９９細胞を除いて、全ての細胞をＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。培地には、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。３７℃で５．５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で細胞を保持した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、胚性マウス線維芽細胞である。Ｈ１２９９は、ヒト肺癌腫から樹立されたｐ５３ヌル細胞株である（ＡＴＣＣによって提供）。ＨＤＱ－Ｐ１は、ｐ５３遺伝子のコドン２１３（ＣＧＡ→ＴＧＡ）でのナンセンス突然変異についてホモ接合性である。この細胞株は、ヒト原発性乳癌腫から樹立され、ＤＳＭＺ－ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）によって提供された。安定な哺乳動物細胞株を生成するために、本発明者らは、ｐＭｅｔＬｕｃ２（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に由来する分泌型メトリディア（Ｍｅｔｒｉｄｉａ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用した。この遺伝子のコード配列を、独自のヌクレオチドコンテキストを持つＴＰ５３ナンセンス突然変異Ｒ２１３Ｘによって中断し、ヌクレオチド５７での定方向突然変異誘発によって作製されたＥｃｏ５３ＫＩ部位でクローン化した。最終構築物をｐＭＬ２１３と命名し、これを使用して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＪｅｔＰｅｉ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で安定にトランスフェクトした。７つのネオマイシン耐性クローンを、１．６ｍＭゲンタマイシンの存在下で２４時間リードスルー誘導した後、活性なメトリディアを発現する能力について試験した。次に、５０μＬの培養培地を各ウェルから採取し、供給者が推奨する条件に従って（Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｌｏｗ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））、基質：セレンテラジンの存在下でインキュベートした。反応によって生成された光子放出は、プレートルミノメーター（Ｔｅｃａｎ）で測定した。
ＨＴＳを実現するために、処理条件と対照との間で最高の増加係数を示すクローンを選択した。
材料及び方法
細胞株及びプラスミド
ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養したＨ１２９９細胞を除いて、全ての細胞をＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。培地には、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。３７℃で５．５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で細胞を保持した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、胚性マウス線維芽細胞である。Ｈ１２９９は、ヒト肺癌腫から樹立されたｐ５３ヌル細胞株である（ＡＴＣＣによって提供）。ＨＤＱ－Ｐ１は、ｐ５３遺伝子のコドン２１３（ＣＧＡ→ＴＧＡ）でのナンセンス突然変異についてホモ接合性である。この細胞株は、ヒト原発性乳癌腫から樹立され、ＤＳＭＺ－ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）によって提供された。安定な哺乳動物細胞株を生成するために、本発明者らは、ｐＭｅｔＬｕｃ２（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に由来する分泌型メトリディア（Ｍｅｔｒｉｄｉａ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用した。この遺伝子のコード配列を、独自のヌクレオチドコンテキストを持つＴＰ５３ナンセンス突然変異Ｒ２１３Ｘによって中断し、ヌクレオチド５７での定方向突然変異誘発によって作製されたＥｃｏ５３ＫＩ部位でクローン化した。最終構築物をｐＭＬ２１３と命名し、これを使用して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＪｅｔＰｅｉ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で安定にトランスフェクトした。７つのネオマイシン耐性クローンを、１．６ｍＭゲンタマイシンの存在下で２４時間リードスルー誘導した後、活性なメトリディアを発現する能力について試験した。次に、５０μＬの培養培地を各ウェルから採取し、供給者が推奨する条件に従って（Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｌｏｗ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））、基質：セレンテラジンの存在下でインキュベートした。反応によって生成された光子放出は、プレートルミノメーター（Ｔｅｃａｎ）で測定した。
ＨＴＳを実現するために、処理条件と対照との間で最高の増加係数を示すクローンを選択した。
ＨＴＳスクリーニング
２つのライブラリの各分子を、５０μＭで試験した。各プレートにおいて、８０個を超えるウェルのうち８ウェルを陽性対照（ゲンタマイシン）用に、８ウェルを陰性対照（ＤＭＳＯ）用に確保した。Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ化学ライブラリは、ＦＤＡ、ＥＭＡ及び他の機関によって既に承認されている１，２８０個の小分子のユニークなコレクションである。２つ目のライブラリは、これまでに１００万個を超える化合物を含むＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリから、化学的及び薬理学的多様性の基準に基づいて選択された１６，４８０個の化合物のサブグループである。本発明者らはまた、光子放出を人為的に増加させることができる薬物を排除するために、レポーター遺伝子を含まないＮＩＨ３Ｔ３親細胞系に対して全ての選択された薬物を試験することにより、偽陽性ヒットをチェックした。
２つのライブラリの各分子を、５０μＭで試験した。各プレートにおいて、８０個を超えるウェルのうち８ウェルを陽性対照（ゲンタマイシン）用に、８ウェルを陰性対照（ＤＭＳＯ）用に確保した。Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ化学ライブラリは、ＦＤＡ、ＥＭＡ及び他の機関によって既に承認されている１，２８０個の小分子のユニークなコレクションである。２つ目のライブラリは、これまでに１００万個を超える化合物を含むＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリから、化学的及び薬理学的多様性の基準に基づいて選択された１６，４８０個の化合物のサブグループである。本発明者らはまた、光子放出を人為的に増加させることができる薬物を排除するために、レポーター遺伝子を含まないＮＩＨ３Ｔ３親細胞系に対して全ての選択された薬物を試験することにより、偽陽性ヒットをチェックした。
新たなレポーター細胞株の統計的検証
スクリーニング戦略を検証するために、本発明者らはまず、陽性対照としてゲンタマイシン及び陰性対照としてＤＭＳＯを使用して、ライブラリからの５つの９６ウェルプレートにスクリーニングプロトコルを適用した。統計的検証のために、本発明者らは、１９９９年にＺｈａｎｇらによって提示されたＳＳＭＤパラメータを使用した。厳密に標準化された平均差（ＳＳＭＤ）は、測定単位と陽性対照の強度の両方に対して堅牢である。比較された両方の群のデータ変動性が考慮され、確率解釈がある。本発明者らは、スクリーニングプロトコルを実証するＳＳＭＤ≧２を取得する（図７）。
スクリーニング戦略を検証するために、本発明者らはまず、陽性対照としてゲンタマイシン及び陰性対照としてＤＭＳＯを使用して、ライブラリからの５つの９６ウェルプレートにスクリーニングプロトコルを適用した。統計的検証のために、本発明者らは、１９９９年にＺｈａｎｇらによって提示されたＳＳＭＤパラメータを使用した。厳密に標準化された平均差（ＳＳＭＤ）は、測定単位と陽性対照の強度の両方に対して堅牢である。比較された両方の群のデータ変動性が考慮され、確率解釈がある。本発明者らは、スクリーニングプロトコルを実証するＳＳＭＤ≧２を取得する（図７）。
リードスルーの定量
前述のように、ＴＰ５３ Ｒ２１３Ｘナンセンス突然変異及び両側の９ヌクレオチドに対応する相補オリゴヌクレオチドをｐＡＣ９９デュアルレポータープラスミドに結合する（筋ジストロフィーに関与する未成熟停止コドンは、ゲンタマイシン処理に応答して広範囲のリードスルー効率を示す；Ｂｉｄｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １ Ａｐｒ ２００４，１１（７）：６１９－６２７）。このデュアルレポーターを使用して、前述のように、ルシフェラーゼ及びベータ－ガラクトシダーゼ（内部較正）活性の測定を通じて停止コドンリードスルーを定量する（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｒｅｃｏｄｉｎｇ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｌｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９５；２３：１５５７－６０）。ナンセンス突然変異のリードスルーレベルを、試験分子の存在下又は不在下で分析した。細胞を６ウェルプレートに播種した。翌日、ＪｅｔＰｅｉ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下でレポータープラスミドを細胞にトランスフェクトする。翌日、リードスルー誘導因子の有無にかかわらず、細胞を新鮮な培地ですすぐ。細胞を２４時間後に回収し、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解し、Ｇｌｏ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ベータ－ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼ活性を、前に記載されたようにアッセイした（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｒｅｃｏｄｉｎｇ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｌｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９５；２３：１５５７－６０）。リードスルー効率は、試験構築物を用いて得られたルシフェラーゼ活性とβ－ガラクトシダーゼ活性との比を、インフレーム対照構築物に対して正規化して計算することによって推定した。各アッセイについて、少なくとも５回の独立したトランスフェクション実験を実行した。
前述のように、ＴＰ５３ Ｒ２１３Ｘナンセンス突然変異及び両側の９ヌクレオチドに対応する相補オリゴヌクレオチドをｐＡＣ９９デュアルレポータープラスミドに結合する（筋ジストロフィーに関与する未成熟停止コドンは、ゲンタマイシン処理に応答して広範囲のリードスルー効率を示す；Ｂｉｄｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １ Ａｐｒ ２００４，１１（７）：６１９－６２７）。このデュアルレポーターを使用して、前述のように、ルシフェラーゼ及びベータ－ガラクトシダーゼ（内部較正）活性の測定を通じて停止コドンリードスルーを定量する（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｒｅｃｏｄｉｎｇ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｌｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９５；２３：１５５７－６０）。ナンセンス突然変異のリードスルーレベルを、試験分子の存在下又は不在下で分析した。細胞を６ウェルプレートに播種した。翌日、ＪｅｔＰｅｉ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下でレポータープラスミドを細胞にトランスフェクトする。翌日、リードスルー誘導因子の有無にかかわらず、細胞を新鮮な培地ですすぐ。細胞を２４時間後に回収し、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解し、Ｇｌｏ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ベータ－ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼ活性を、前に記載されたようにアッセイした（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｒｅｃｏｄｉｎｇ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｌｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９５；２３：１５５７－６０）。リードスルー効率は、試験構築物を用いて得られたルシフェラーゼ活性とβ－ガラクトシダーゼ活性との比を、インフレーム対照構築物に対して正規化して計算することによって推定した。各アッセイについて、少なくとも５回の独立したトランスフェクション実験を実行した。
ＲＮＡ抽出及びＲＴ－ｑＰＣＲ
ｐ５３及びその転写標的遺伝子であるＢａｘのｍＲＮＡレベルの分析のために、本発明者らは、Ｇ４１８（４００μＭ）又はＴＬＮ６８（８０μＭ）で４８時間処理したか、又は処理していないＨＤＱ－Ｐ１細胞から全ＲＮＡを抽出した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。ＲＮＡをＤＮＡｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ）で処理し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量した。ＲＮＡ分解が行われていないことは、アガロースゲル電気泳動によって確認した。ファーストストランドｃＤＮＡは、ランダムプライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造元の推奨に従って、２μｇの全ＲＮＡから合成した。次に、ＣＦＸ９６サーモサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、等量の様々なｃＤＮＡに対して定量的ＰＣＲを実施し、挿入色素ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、生成物の蓄積を監視した。本発明者らは、ＲＰＬ３２、Ｈｐｒｔ１及びＨＭＢＳの３つの参照ｍＲＮＡに対するｍＲＮＡレベルを定量した。各実験では、結果は、得られた値を１に設定した未処理細胞の結果と比較して表される。遺伝子発現の相対レベルは、増幅が指数関数的であり、転写産物の最初のコピー数と相関している可能性があるＰＣＲの初期段階で計算した。定量ＰＣＲの特異性は、アガロースゲル電気泳動によってチェックされ、各遺伝子について目的の長さの単一の産物が産生されることを示した。融解曲線分析も実行した。各遺伝子について、単一の産物固有の融解温度が特定された。各ｍＲＮＡを定量するために、（生物学的複製からの）３回の独立した実験を三度実行した。本発明者らは、増幅のために以下のオリゴヌクレオチド対を使用した：
ｐ５３順方向：５’ＣＣＧＣＡＧＴ ＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧ ３’（配列番号１）及び逆方向：５’ＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧ ３’（配列番号２）；
Ｂａｘ順方向：５’ＧＣＴＧＴＴＧ ＧＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧ ３’（配列番号３）及び逆方向：５’ＴＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡ（配列番号４）。
ｐ５３及びその転写標的遺伝子であるＢａｘのｍＲＮＡレベルの分析のために、本発明者らは、Ｇ４１８（４００μＭ）又はＴＬＮ６８（８０μＭ）で４８時間処理したか、又は処理していないＨＤＱ－Ｐ１細胞から全ＲＮＡを抽出した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。ＲＮＡをＤＮＡｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ）で処理し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量した。ＲＮＡ分解が行われていないことは、アガロースゲル電気泳動によって確認した。ファーストストランドｃＤＮＡは、ランダムプライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造元の推奨に従って、２μｇの全ＲＮＡから合成した。次に、ＣＦＸ９６サーモサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、等量の様々なｃＤＮＡに対して定量的ＰＣＲを実施し、挿入色素ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、生成物の蓄積を監視した。本発明者らは、ＲＰＬ３２、Ｈｐｒｔ１及びＨＭＢＳの３つの参照ｍＲＮＡに対するｍＲＮＡレベルを定量した。各実験では、結果は、得られた値を１に設定した未処理細胞の結果と比較して表される。遺伝子発現の相対レベルは、増幅が指数関数的であり、転写産物の最初のコピー数と相関している可能性があるＰＣＲの初期段階で計算した。定量ＰＣＲの特異性は、アガロースゲル電気泳動によってチェックされ、各遺伝子について目的の長さの単一の産物が産生されることを示した。融解曲線分析も実行した。各遺伝子について、単一の産物固有の融解温度が特定された。各ｍＲＮＡを定量するために、（生物学的複製からの）３回の独立した実験を三度実行した。本発明者らは、増幅のために以下のオリゴヌクレオチド対を使用した：
ｐ５３順方向：５’ＣＣＧＣＡＧＴ ＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧ ３’（配列番号１）及び逆方向：５’ＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧ ３’（配列番号２）；
Ｂａｘ順方向：５’ＧＣＴＧＴＴＧ ＧＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧ ３’（配列番号３）及び逆方向：５’ＴＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡ（配列番号４）。
ウエスタンブロット分析
ＨＤＱ－Ｐ１細胞（Ｒ２１３Ｘ）をＧ４１８（１０及び２０ｍＭ）又は選択した分子（ＴＬＮ６８ ５０μＭ、ＴＬＮ１３９９ ５０μＭ、ＴＬＮ２３６ ３０μＭ、及びＴＬＮ３０９ ４０μＭ）で４８時間処理した。トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理することにより細胞を回収し、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１％ ＮＰ－４０、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）で溶解し、シリンジを通過させることによって破壊した。
ＴＬＮ１３９９（本発明に含まれない）は、以下の構造を有する。
ＴＬＮ２３６（本発明に含まれない）は、以下の構造を有する。
全タンパク質をブラッドフォード試薬（Ｂｉｏｒａｄ）で定量し、抽出物をレムリ緩衝液中９０℃で５分間インキュベートすることにより変性させた。本発明者らは、ＨＤＱ－１細胞からの全タンパク質３０μｇを４／１０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル中でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。製造元（Ｂｉｏｒａｄ）の説明書に従って、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳中で一晩インキュベートすることによって膜を飽和させ、一次モノクローナル抗体、ＤＯ－１（ｐ５３のアミノ酸残基１１と２５との間のＮ末端エピトープマッピング；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１／４００）又はマウスアクチンに対するモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１／２０００）と共に１時間インキュベートした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を補充したＰＢＳで３回洗浄した後、膜を二次抗体［西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（１／２５００）］と共に４５分間インキュベートした。膜を５回洗浄し、化学発光をＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。信号を、ＩｍａｇｅＪ ソフトウェアを用いて定量した。
ＨＤＱ－Ｐ１細胞（Ｒ２１３Ｘ）をＧ４１８（１０及び２０ｍＭ）又は選択した分子（ＴＬＮ６８ ５０μＭ、ＴＬＮ１３９９ ５０μＭ、ＴＬＮ２３６ ３０μＭ、及びＴＬＮ３０９ ４０μＭ）で４８時間処理した。トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理することにより細胞を回収し、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１％ ＮＰ－４０、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）で溶解し、シリンジを通過させることによって破壊した。
ＴＬＮ１３９９（本発明に含まれない）は、以下の構造を有する。
ＴＰ５３タンパク質活性アッセイ
本発明者らは、ｐ５３ヌル細胞系であるＨ１２９９におけるｐ５３タンパク質の転写活性を調査した。７つのｐ５３結合部位の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するｐ５３ＢＳ－ｌｕｃレポータープラスミド、ｐＣＭＶＬａｃＺ、及び停止突然変異Ｒ２１３Ｘによって中断されたｐ５３ ｃＤＮＡを含有するｐＣＭＶｐ５３Ｒ２１３Ｘを、ＪｅｔＰｅｉ法によって細胞に同時トランスフェクトした。ＴＬＮ６８（２０、５０、８０及び１００ｍＭ）をトランスフェクションの直前に培地に添加し、合計２０時間処理した。次に、タンパク質抽出物を調製し、酵素活性を測定した。ｐＣＭＶＬａｃＺによるトランスフェクションを使用して、トランスフェクション効率、細胞生存率、及びタンパク質抽出を正規化した。各条件群について、少なくとも６回の独立したトランスフェクション実験を実行した。
本発明者らは、ｐ５３ヌル細胞系であるＨ１２９９におけるｐ５３タンパク質の転写活性を調査した。７つのｐ５３結合部位の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するｐ５３ＢＳ－ｌｕｃレポータープラスミド、ｐＣＭＶＬａｃＺ、及び停止突然変異Ｒ２１３Ｘによって中断されたｐ５３ ｃＤＮＡを含有するｐＣＭＶｐ５３Ｒ２１３Ｘを、ＪｅｔＰｅｉ法によって細胞に同時トランスフェクトした。ＴＬＮ６８（２０、５０、８０及び１００ｍＭ）をトランスフェクションの直前に培地に添加し、合計２０時間処理した。次に、タンパク質抽出物を調製し、酵素活性を測定した。ｐＣＭＶＬａｃＺによるトランスフェクションを使用して、トランスフェクション効率、細胞生存率、及びタンパク質抽出を正規化した。各条件群について、少なくとも６回の独立したトランスフェクション実験を実行した。
結果
ルシフェラーゼアッセイのための安定細胞株の開発及び検証
既知の薬物とは無関係の新たなリードスルー化合物を特定するために、本発明者らは、ＨＴＳアプローチを選択する。リードスルー活性に基づいて薬物を選択するために、本発明者らはまず、ナンセンス突然変異（Ｒ２１３Ｘ）によって中断された分泌型メトリディアルシフェラーゼレポーター遺伝子を組み込むことにより、安定した哺乳動物細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３由来）を生成した。この系は、生細胞アッセイの利点と酵素ベース系の感度を兼ね備えている。この遺伝子のコード配列は、独自のヌクレオチドコンテキストに埋め込まれたＴＰ５３ナンセンス突然変異Ｒ２１３Ｘによって中断される。この突然変異には、簡単に測定可能な基礎リードスルーレベルを提示するという利点がある。本発明者らは、ルシフェラーゼの発現が実際にＲ２１３Ｘ停止コドンのリードスルーによるものである場合、ゲンタマイシンの添加はルシフェラーゼの活性を有意に増加させるはずであると推論した。そこで本発明者らは、１．６ｍＭのゲンタマイシンを含むレポーター遺伝子が安定して組み込まれた７つの独立したクローンを試験した。全てのクローンで有意な誘導が得られ、更に開発するために最も強力な誘導を示すもの（Ｃ１４）を選択した（図６）。
ルシフェラーゼアッセイのための安定細胞株の開発及び検証
既知の薬物とは無関係の新たなリードスルー化合物を特定するために、本発明者らは、ＨＴＳアプローチを選択する。リードスルー活性に基づいて薬物を選択するために、本発明者らはまず、ナンセンス突然変異（Ｒ２１３Ｘ）によって中断された分泌型メトリディアルシフェラーゼレポーター遺伝子を組み込むことにより、安定した哺乳動物細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３由来）を生成した。この系は、生細胞アッセイの利点と酵素ベース系の感度を兼ね備えている。この遺伝子のコード配列は、独自のヌクレオチドコンテキストに埋め込まれたＴＰ５３ナンセンス突然変異Ｒ２１３Ｘによって中断される。この突然変異には、簡単に測定可能な基礎リードスルーレベルを提示するという利点がある。本発明者らは、ルシフェラーゼの発現が実際にＲ２１３Ｘ停止コドンのリードスルーによるものである場合、ゲンタマイシンの添加はルシフェラーゼの活性を有意に増加させるはずであると推論した。そこで本発明者らは、１．６ｍＭのゲンタマイシンを含むレポーター遺伝子が安定して組み込まれた７つの独立したクローンを試験した。全てのクローンで有意な誘導が得られ、更に開発するために最も強力な誘導を示すもの（Ｃ１４）を選択した（図６）。
２つの化学ライブラリのスクリーニング
本発明者らは、１７，７６０個の分子（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリから１６，４８０個及びＰｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリから１，２８０個）を、停止コドンのリードスルーを効率的に刺激する能力についてスクリーニングした。この最初のスクリーニングから、１．４以上の増加係数又は２以上のＳＳＭＤを示す４６５個の分子を選択した（図１．Ａ）。次に、これらの最初のヒットを、各分子の複製を使用して、同じ条件で２回目のスクリーニングにかけた。本発明者らは、ルシフェラーゼ活性を少なくとも２倍誘導する能力について、４３個の分子を保持した。このようなスクリーニングが多数の偽陽性ヒットの特定につながる可能性があることはよく知られている。これを制限し、正真正銘のリードスルー誘導因子のみを選択するために、これら４３個の分子のそれぞれをいくつかの独立したアッセイにかけて、停止コドンのリードスルーに明確な効果を持つものだけを保持した。
本発明者らは、１７，７６０個の分子（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリから１６，４８０個及びＰｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリから１，２８０個）を、停止コドンのリードスルーを効率的に刺激する能力についてスクリーニングした。この最初のスクリーニングから、１．４以上の増加係数又は２以上のＳＳＭＤを示す４６５個の分子を選択した（図１．Ａ）。次に、これらの最初のヒットを、各分子の複製を使用して、同じ条件で２回目のスクリーニングにかけた。本発明者らは、ルシフェラーゼ活性を少なくとも２倍誘導する能力について、４３個の分子を保持した。このようなスクリーニングが多数の偽陽性ヒットの特定につながる可能性があることはよく知られている。これを制限し、正真正銘のリードスルー誘導因子のみを選択するために、これら４３個の分子のそれぞれをいくつかの独立したアッセイにかけて、停止コドンのリードスルーに明確な効果を持つものだけを保持した。
停止コドンのリードスルーの定量
最初のスクリーニングは、感度が高く非常に便利であるが、いくつかの固有のバイアスを受ける。実際、Ｍｅｔ－ルシフェラーゼ（ｍＲＮＡ転写、安定性、翻訳）の産生又はその分泌を増加させる任意の分子により、偽陽性ヒットが識別されてしまうだろう。これを回避するために、本発明者らは、停止コドンのリードスルー効率を定量するために、デュアルレポーター系においてリードスルーを刺激する各薬物の能力をチェックした（図１．Ｂ）。
まず、このレポーター系は、最初のスクリーニングで使用されたものとは異なる酵素活性（β－ガラクトシダーゼ及びホタルルシフェラーゼ）を持っている。次に、β－ガラクトシダーゼを内部対照として使用して、発現レベルを正規化する。したがって、この２番目のレポーター系を使用することにより、最初のスクリーニングで選択される可能性のある多くの偽陽性ヒットが排除される。試験した分子ごとに、３つの独立した測定値が得られている（図１．Ｂ）。ＰＴＣリードスルーで２倍以上の変化を誘導する分子は４つのみである（データは示さず）。この２番目のレポーター系は、偽陽性ヒットを排除するのに非常に効率的であったが、やはり酵素活性を使用するレポーター系である。本発明者らは、より生理学的な系を使用して、最後の６つの潜在的なヒットを試験した。
最初のスクリーニングは、感度が高く非常に便利であるが、いくつかの固有のバイアスを受ける。実際、Ｍｅｔ－ルシフェラーゼ（ｍＲＮＡ転写、安定性、翻訳）の産生又はその分泌を増加させる任意の分子により、偽陽性ヒットが識別されてしまうだろう。これを回避するために、本発明者らは、停止コドンのリードスルー効率を定量するために、デュアルレポーター系においてリードスルーを刺激する各薬物の能力をチェックした（図１．Ｂ）。
まず、このレポーター系は、最初のスクリーニングで使用されたものとは異なる酵素活性（β－ガラクトシダーゼ及びホタルルシフェラーゼ）を持っている。次に、β－ガラクトシダーゼを内部対照として使用して、発現レベルを正規化する。したがって、この２番目のレポーター系を使用することにより、最初のスクリーニングで選択される可能性のある多くの偽陽性ヒットが排除される。試験した分子ごとに、３つの独立した測定値が得られている（図１．Ｂ）。ＰＴＣリードスルーで２倍以上の変化を誘導する分子は４つのみである（データは示さず）。この２番目のレポーター系は、偽陽性ヒットを排除するのに非常に効率的であったが、やはり酵素活性を使用するレポーター系である。本発明者らは、より生理学的な系を使用して、最後の６つの潜在的なヒットを試験した。
ＨＤＱＰ－１細胞におけるＴＰ５３タンパク質発現の回復
本発明者らは、内因性ＴＰ５３遺伝子にナンセンス突然変異Ｒ２１３Ｘを保有するヒト細胞株ＨＤＱ－Ｐ１を使用した。全長ｐ５３の発現はウエスタンブロットによって行われる。この３番目の系の利点は、内因性のナンセンス突然変異の使用と、潜在的なヒット（つまり、全長タンパク質）によって誘導される最終産物の直接的な視覚化である。結果は、図２．Ａに示され、ＴＬＮ６８及びＴＬＮ３０９の２つの分子が完全長ｐ５３の産生を刺激することを明確に示している。誘導レベルは、Ｇ４１８（より効率的な既知のリードスルー誘導因子のうちの１つ）の存在下で得られるレベルよりも更に高い。興味深いことに、本発明者らは、ＮＭＤの阻害によるＴＰ５３ ｍＲＮＡの安定化に対応し得る短縮型の蓄積を同時に観察した。これを確認するために、本発明者らは、ＴＰ５３－Ｒ２１３Ｘ ｍＲＮＡに対してＲＴ－ｑＰＣＲを実行し、ＴＬＮ６８がこのｍＲＮＡを６倍安定化することを示したが、ＴＬＮ３０９が示すｍＲＮＡの安定化はわずかである（図２．Ｂ）。
これら２つの最後の候補の構造レビュー（図２．Ｃ）により、ＴＬＮ３０９が、オートファジー－リソソーム阻害活性を示し、リボソーム生合成ストレスを促進するクロロキンに類似した４－アミノキノリンであることが示される。本発明者らは、トランスレクチンと命名された２－グアニジノキナゾリンであるＴＬＮ６８のみを用いて、この分析を更に追求することにした（図２．Ｃ）。
本発明者らは、内因性ＴＰ５３遺伝子にナンセンス突然変異Ｒ２１３Ｘを保有するヒト細胞株ＨＤＱ－Ｐ１を使用した。全長ｐ５３の発現はウエスタンブロットによって行われる。この３番目の系の利点は、内因性のナンセンス突然変異の使用と、潜在的なヒット（つまり、全長タンパク質）によって誘導される最終産物の直接的な視覚化である。結果は、図２．Ａに示され、ＴＬＮ６８及びＴＬＮ３０９の２つの分子が完全長ｐ５３の産生を刺激することを明確に示している。誘導レベルは、Ｇ４１８（より効率的な既知のリードスルー誘導因子のうちの１つ）の存在下で得られるレベルよりも更に高い。興味深いことに、本発明者らは、ＮＭＤの阻害によるＴＰ５３ ｍＲＮＡの安定化に対応し得る短縮型の蓄積を同時に観察した。これを確認するために、本発明者らは、ＴＰ５３－Ｒ２１３Ｘ ｍＲＮＡに対してＲＴ－ｑＰＣＲを実行し、ＴＬＮ６８がこのｍＲＮＡを６倍安定化することを示したが、ＴＬＮ３０９が示すｍＲＮＡの安定化はわずかである（図２．Ｂ）。
これら２つの最後の候補の構造レビュー（図２．Ｃ）により、ＴＬＮ３０９が、オートファジー－リソソーム阻害活性を示し、リボソーム生合成ストレスを促進するクロロキンに類似した４－アミノキノリンであることが示される。本発明者らは、トランスレクチンと命名された２－グアニジノキナゾリンであるＴＬＮ６８のみを用いて、この分析を更に追求することにした（図２．Ｃ）。
停止コドンのリードスルーにより機能的なＴＰ５３発現が回復した
ＴＬＮ６８は、ナンセンス突然変異によって中断された遺伝子からタンパク質の発現を回復させるための非常に有望なヒットである。しかしながら、完全長タンパク質の発現を回復することは、欠陥のある遺伝子を修正するための前提条件であるが、これはリードスルータンパク質の機能性を保証するには十分ではない。実際、本発明者らは、少なくとも３つのｔＲＮＡ（Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ）を使用してＵＡＧコドンを読み飛ばすことができることを示している。明らかに、アミノ酸の同一性は、回復された全長タンパク質の活性を大きく改変する可能性がある。そこで本発明者らは、ＴＬＮ６８の存在下で発現した全長ｐ５３が機能するかどうかを２つの異なる系で試験した。まず、ｐ５３プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子を担持するプラスミドを使用し（図３．Ａ）、次に、ｐ５３の主要な標的のうちの１つであるＢａｘ ｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって定量した（図３．Ｂ）。ＴＬＮ６８による処理は、ｐ５３依存性ルシフェラーゼの３．５倍の増加を誘導する。これは、Ｂａｘ ｍＲＮＡレベルで観察される３倍の誘導と一致している。これにより、リードスルーｐ５３が少なくとも部分的に活性であることが確認される。全体として、これらの独立したアッセイは、ＴＬＮ６８が有望なリードスルー誘導因子であることを示している。これら全てのアッセイの間、本発明者らは、同じ突然変異（Ｒ２１３Ｘ）を体系的に使用した。ＴＬＮ６８がこの未成熟停止コドン上で停止コドンのリードスルーを誘導することが確立されたので、様々な停止コドンに対するその作用範囲について調べてもよい。
反対に、ＴＬＮ２３６の存在下ではタンパク質は現れず、この薬剤は停止コドンのリードスルーに対して効率的に作用しないことが示唆される。
ＴＬＮ６８は、ナンセンス突然変異によって中断された遺伝子からタンパク質の発現を回復させるための非常に有望なヒットである。しかしながら、完全長タンパク質の発現を回復することは、欠陥のある遺伝子を修正するための前提条件であるが、これはリードスルータンパク質の機能性を保証するには十分ではない。実際、本発明者らは、少なくとも３つのｔＲＮＡ（Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ）を使用してＵＡＧコドンを読み飛ばすことができることを示している。明らかに、アミノ酸の同一性は、回復された全長タンパク質の活性を大きく改変する可能性がある。そこで本発明者らは、ＴＬＮ６８の存在下で発現した全長ｐ５３が機能するかどうかを２つの異なる系で試験した。まず、ｐ５３プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子を担持するプラスミドを使用し（図３．Ａ）、次に、ｐ５３の主要な標的のうちの１つであるＢａｘ ｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって定量した（図３．Ｂ）。ＴＬＮ６８による処理は、ｐ５３依存性ルシフェラーゼの３．５倍の増加を誘導する。これは、Ｂａｘ ｍＲＮＡレベルで観察される３倍の誘導と一致している。これにより、リードスルーｐ５３が少なくとも部分的に活性であることが確認される。全体として、これらの独立したアッセイは、ＴＬＮ６８が有望なリードスルー誘導因子であることを示している。これら全てのアッセイの間、本発明者らは、同じ突然変異（Ｒ２１３Ｘ）を体系的に使用した。ＴＬＮ６８がこの未成熟停止コドン上で停止コドンのリードスルーを誘導することが確立されたので、様々な停止コドンに対するその作用範囲について調べてもよい。
反対に、ＴＬＮ２３６の存在下ではタンパク質は現れず、この薬剤は停止コドンのリードスルーに対して効率的に作用しないことが示唆される。
ＴＬＮ６８の特異性
ＴＬＮ６８特異性の問題に答えるために、本発明者らは、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィーの原因となるＤＭＤ遺伝子に見られるより頻繁な４０個の未成熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）ナンセンス突然変異を選択した（表１、図４．Ａ）。
ＴＬＮ６８特異性の問題に答えるために、本発明者らは、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィーの原因となるＤＭＤ遺伝子に見られるより頻繁な４０個の未成熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）ナンセンス突然変異を選択した（表１、図４．Ａ）。
各ナンセンス突然変異（各側で＋９ヌクレオチド）は、以前に使用したデュアルレポーターにクローニングされている。停止コドンのリードスルー効率は、６回の独立した実験で、薬物を使用せずに、又はゲンタマイシン若しくはＴＬＮ６８の存在下で定量されている。図４．Ｂに示す結果は、ＴＬＮ６８が多種多様な配列（試験した４０個のうち２８個）で停止コドンのリードスルーを促進するだけでなく、この一連の配列でゲンタマイシンよりも優れていることを示している。本発明者らは、ＴＬＮ６８が広範な配列に対して活性であるが、その作用は大半の既知のリードスルー誘導因子と同様に配列依存性であると結論付けている。
ＴＬＮ６８は、リードスルーを誘導するゲンタマイシンとの相加効果を有する
次に、本発明者らは、ＴＬＮ６８と最も使用されるリードスルー分子のうちの１つであるゲンタマイシンとの併用処置の効果を試験する。Ｒ２１３Ｘ突然変異を保有するデュアルレポーターベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、これらの細胞を各薬剤で別々に又は一緒に２４時間処理した。ゲンタマイシン及びＴＬＮ６８はそれぞれ１０％及び１１％のリードスルーレベルを誘導し、２つの薬剤を組み合わせると、２１％のリードスルーレベルが得られ、これらの分子間の相加効果が示唆される（図５）。
次に、本発明者らは、ＴＬＮ６８と最も使用されるリードスルー分子のうちの１つであるゲンタマイシンとの併用処置の効果を試験する。Ｒ２１３Ｘ突然変異を保有するデュアルレポーターベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、これらの細胞を各薬剤で別々に又は一緒に２４時間処理した。ゲンタマイシン及びＴＬＮ６８はそれぞれ１０％及び１１％のリードスルーレベルを誘導し、２つの薬剤を組み合わせると、２１％のリードスルーレベルが得られ、これらの分子間の相加効果が示唆される（図５）。
翻訳に対するＴＬＮ６８の影響は、リードスルー事象に特異的である
ＴＬＮ６８が全体的な翻訳忠実度を変更するかどうか、又はそれがリードスルー事象に特異的であるかどうかを決定するために、本発明者らは、フレームシフトを誘導するこの分子の能力を試験した。本発明者らは、レトロウイルスＨＩＶ－１のマイナス１フレームシフトシグナルの研究に既に使用されているフレームシフト標的を使用した（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ，１９９５）。この５４ヌクレオチド配列をデュアルレポーターベクターに挿入し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクトに使用した。トランスフェクトされた細胞を、８０μＭのＴＬＮ６８で処理したか、又は処理しなかった。結果は、ＴＬＮ６８が翻訳フレームシフトに影響を及ぼさないことを実証し、この分子が翻訳忠実度に全体的な影響を与えず、むしろリードスルーに特異的に作用する可能性があることを示唆している（図８）。
ＴＬＮ６８が全体的な翻訳忠実度を変更するかどうか、又はそれがリードスルー事象に特異的であるかどうかを決定するために、本発明者らは、フレームシフトを誘導するこの分子の能力を試験した。本発明者らは、レトロウイルスＨＩＶ－１のマイナス１フレームシフトシグナルの研究に既に使用されているフレームシフト標的を使用した（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ，１９９５）。この５４ヌクレオチド配列をデュアルレポーターベクターに挿入し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクトに使用した。トランスフェクトされた細胞を、８０μＭのＴＬＮ６８で処理したか、又は処理しなかった。結果は、ＴＬＮ６８が翻訳フレームシフトに影響を及ぼさないことを実証し、この分子が翻訳忠実度に全体的な影響を与えず、むしろリードスルーに特異的に作用する可能性があることを示唆している（図８）。
ＴＬＮ６８は哺乳類細胞株に対して中程度の毒性を有する
本発明者らは、代謝的に活性な細胞によってのみ切断されるテトラゾリウム塩を使用することにより、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＤＱ－Ｐ１及びＨｅＬａ細胞株の生存率に対するＴＬＮ６８の影響を試験した。細胞を２４時間、様々なＴＬＮ６８用量で処理するか、又は処理せずに、生存率を測定した。
図９は、ＴＬＮ６８濃度が増加するにつれて細胞生存率がゆっくりと低下して、使用される最大用量で最も耐性のある細胞株細胞であるＮＩＨ３Ｔ３の生細胞の８０％及びＨＤＱ－Ｐ１細胞の生細胞の７０％に達することを示す。
本発明者らは、代謝的に活性な細胞によってのみ切断されるテトラゾリウム塩を使用することにより、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＤＱ－Ｐ１及びＨｅＬａ細胞株の生存率に対するＴＬＮ６８の影響を試験した。細胞を２４時間、様々なＴＬＮ６８用量で処理するか、又は処理せずに、生存率を測定した。
図９は、ＴＬＮ６８濃度が増加するにつれて細胞生存率がゆっくりと低下して、使用される最大用量で最も耐性のある細胞株細胞であるＮＩＨ３Ｔ３の生細胞の８０％及びＨＤＱ－Ｐ１細胞の生細胞の７０％に達することを示す。
実施例３：本発明による異なる化合物のＰＴＣリードスルーを誘導する能力の試験
プロトコル：
ＨｅＬａ細胞におけるナンセンス突然変異Ｗ１２６８Ｘ又はＲ２１３Ｘ上でリードスルーを誘導する能力について、本発明の種々の化合物を試験した。
この目的のために、本発明者らは、ｐＡＣ９９デュアルレポータープラスミドを使用した。このデュアルレポーターを使用して、ルシフェラーゼ及びベータ－ガラクトシダーゼ（内部正規化）活性の測定を通じて停止コドンのリードスルーを定量する。ナンセンス突然変異のリードスルーレベルを、試験分子の存在下又は不在下で分析した。細胞を６ウェルプレートに播種する。翌日、ＪｅｔＰｅｉ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してレポータープラスミドを細胞にトランスフェクトする。翌日、リードスルー誘導因子の有無にかかわらず、細胞を新鮮な培地ですすぐ。２４時間後にトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により細胞を回収し、Ｇｌｏ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ベータ－ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼ活性を前述のようにアッセイした。リードスルー効率は、試験構築物を用いて得られたルシフェラーゼ活性とβ－ガラクトシダーゼ活性との比を、インフレーム対照構築物に対して正規化して計算することによって推定した。各アッセイについて、少なくとも５回の独立したトランスフェクション実験を実行した。
プロトコル：
ＨｅＬａ細胞におけるナンセンス突然変異Ｗ１２６８Ｘ又はＲ２１３Ｘ上でリードスルーを誘導する能力について、本発明の種々の化合物を試験した。
この目的のために、本発明者らは、ｐＡＣ９９デュアルレポータープラスミドを使用した。このデュアルレポーターを使用して、ルシフェラーゼ及びベータ－ガラクトシダーゼ（内部正規化）活性の測定を通じて停止コドンのリードスルーを定量する。ナンセンス突然変異のリードスルーレベルを、試験分子の存在下又は不在下で分析した。細胞を６ウェルプレートに播種する。翌日、ＪｅｔＰｅｉ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してレポータープラスミドを細胞にトランスフェクトする。翌日、リードスルー誘導因子の有無にかかわらず、細胞を新鮮な培地ですすぐ。２４時間後にトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により細胞を回収し、Ｇｌｏ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ベータ－ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼ活性を前述のようにアッセイした。リードスルー効率は、試験構築物を用いて得られたルシフェラーゼ活性とβ－ガラクトシダーゼ活性との比を、インフレーム対照構築物に対して正規化して計算することによって推定した。各アッセイについて、少なくとも５回の独立したトランスフェクション実験を実行した。
結果：
結果は以下の通りである。
結果は以下の通りである。
結論として、本発明の化合物は、非常に効率的なＰＴＣリードスループロモーターである。
実施例４：ＴＬＮ６８を用いたリボソームプロファイリング実験
目的
ＴＬＮ６８が未成熟終止コドン（ＰＴＣ）に特異的に作用し、天然停止コドンには影響を及ぼさないことを実証することが重要である。この疑問に答えるために、本発明者らは、全てのリボソームフットプリントのゲノム全体のマッピングを可能にするリボソームプロファイリング（ＲｉｂｏＳｅｑ）実験を実行した。本発明者らは、３つの異なる条件：未処理細胞、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、８０ｍＭのＴＬＮ４６８を２４時間試験した。統計上の理由から、各条件について３回実行している。
目的
ＴＬＮ６８が未成熟終止コドン（ＰＴＣ）に特異的に作用し、天然停止コドンには影響を及ぼさないことを実証することが重要である。この疑問に答えるために、本発明者らは、全てのリボソームフットプリントのゲノム全体のマッピングを可能にするリボソームプロファイリング（ＲｉｂｏＳｅｑ）実験を実行した。本発明者らは、３つの異なる条件：未処理細胞、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、８０ｍＭのＴＬＮ４６８を２４時間試験した。統計上の理由から、各条件について３回実行している。
リボソームプロファイリング実験
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％グルタミン、非必須アミノ酸及び抗生物質－抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）を補充した１０ｍｌのＭＥＭで、プレートあたり１００万個の細胞にてＪ０でプレーティングした。Ｊ＋１で、８０ｍＭのＴＬＮ４６８を添加する。Ｊ＋２で、細胞を収集する。培地を除去し、液体窒素浴に直接置き、－７０℃にしてから、引っ掻いた。Ｐｏｌｙｓｏｍｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ７．６）；１０ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２ Ｍｇ；１０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ；１％ Ｔｒｉｔｏｎ；２ｍＭ ＤＴＴ）を添加して細胞を収集した。
２×完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤Ｒｏｃｈｅ及び１Ｕ Ｒｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｕｒｉｎｅ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加して、ポリソームを抽出した。リボソーム保護断片（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＲＰＦ）を、１５Ｕ Ｒｎａｓｅ Ｉ （Ａｍｂｉｏｎ）／ＯＤ２６０ｎｍで、２５℃で１時間消化することによって生成した。モノソームを、＋４℃の２４％スクロースクッションで分離し、ＤＮａｓｅＩで処理する。ＲＮＡを、６５℃、ＣＨＣＬ３で、フェノールで抽出し、０．３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．２）中のエタノールによって沈殿させ、次いで、７Ｍ尿素と１×Ｔｒｉｓ－アセテート－ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）を加えた１７％アクリルアミド－ビスアクリルアミド（１９：１）ゲル上に装填した。２８～３４ｎｔのＲＰＦを、ゲルから切り出し、グリコーゲン存在下、エタノール中で沈殿させる。ＲＰＦを、製造元の推奨に従って、Ｒｉｂｏ－ｚｅｒｏ Ｈｕｍａｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してリボソームＲＮＡから取り出す。ＲＰＦライブラリを、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＴｒｕＳｅｑ修正キットを使用して作製し、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００ Ｈｉｇｈ Ｓｉｎｇｌｅ Ｒｅａｄ７５塩基で配列決定する。
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％グルタミン、非必須アミノ酸及び抗生物質－抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）を補充した１０ｍｌのＭＥＭで、プレートあたり１００万個の細胞にてＪ０でプレーティングした。Ｊ＋１で、８０ｍＭのＴＬＮ４６８を添加する。Ｊ＋２で、細胞を収集する。培地を除去し、液体窒素浴に直接置き、－７０℃にしてから、引っ掻いた。Ｐｏｌｙｓｏｍｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ７．６）；１０ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２ Ｍｇ；１０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ；１％ Ｔｒｉｔｏｎ；２ｍＭ ＤＴＴ）を添加して細胞を収集した。
２×完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤Ｒｏｃｈｅ及び１Ｕ Ｒｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｕｒｉｎｅ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加して、ポリソームを抽出した。リボソーム保護断片（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＲＰＦ）を、１５Ｕ Ｒｎａｓｅ Ｉ （Ａｍｂｉｏｎ）／ＯＤ２６０ｎｍで、２５℃で１時間消化することによって生成した。モノソームを、＋４℃の２４％スクロースクッションで分離し、ＤＮａｓｅＩで処理する。ＲＮＡを、６５℃、ＣＨＣＬ３で、フェノールで抽出し、０．３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．２）中のエタノールによって沈殿させ、次いで、７Ｍ尿素と１×Ｔｒｉｓ－アセテート－ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）を加えた１７％アクリルアミド－ビスアクリルアミド（１９：１）ゲル上に装填した。２８～３４ｎｔのＲＰＦを、ゲルから切り出し、グリコーゲン存在下、エタノール中で沈殿させる。ＲＰＦを、製造元の推奨に従って、Ｒｉｂｏ－ｚｅｒｏ Ｈｕｍａｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してリボソームＲＮＡから取り出す。ＲＰＦライブラリを、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＴｒｕＳｅｑ修正キットを使用して作製し、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００ Ｈｉｇｈ Ｓｉｎｇｌｅ Ｒｅａｄ７５塩基で配列決定する。
結果
データを、自家製スクリプトによって分析する。細胞を液体窒素で瞬間凍結し、ポリソームを抽出する。データが得られると、本発明者らは全ての混入ｒＲＮＡ断片を情報的に除去し、自家製ドッカーパッケージ（ＲｉｂｏＤｏｃ）を使用することにより、参照としてヒトゲノム（ｈｇ３８）を用いてヒトトランスクリプトームのリードをマッピングした。本発明者らは、未処理、Ｇ４１８及びＴＬＮ６８それぞれについて、合計１２２ ４９７ ３８８、１６０ ４８１ ９２５及び５１ ８６０ ６０６の一か所のみにマッピングされた（ｕｎｉｑｕｅｌｙ ｍａｐｐｅｄ）リードを取得した。まず、リボソームのフットプリント長の分布をチェックした。結果は、未処理細胞（Ｈｅｌａ）及びＧ４１８で処理した細胞のフットプリントの大部分が３０ヌクレオチド（３０ｎｔ）長であるのに対し、ＴＬＮ６８で処理した細胞のフットプリントは２９ヌクレオチド（２９ｎｔ）長であることを示している。この長さは、２８～３１ヌクレオチドで構成される必要があるリボソームフットプリントに期待される長さである。ＴＬＮ６８と他のサンプルとの間で観察された違いは、生物学的な意味を持たずに、おそらくはＲＰＦ調製中の変動を反映しているにすぎない。
データを、自家製スクリプトによって分析する。細胞を液体窒素で瞬間凍結し、ポリソームを抽出する。データが得られると、本発明者らは全ての混入ｒＲＮＡ断片を情報的に除去し、自家製ドッカーパッケージ（ＲｉｂｏＤｏｃ）を使用することにより、参照としてヒトゲノム（ｈｇ３８）を用いてヒトトランスクリプトームのリードをマッピングした。本発明者らは、未処理、Ｇ４１８及びＴＬＮ６８それぞれについて、合計１２２ ４９７ ３８８、１６０ ４８１ ９２５及び５１ ８６０ ６０６の一か所のみにマッピングされた（ｕｎｉｑｕｅｌｙ ｍａｐｐｅｄ）リードを取得した。まず、リボソームのフットプリント長の分布をチェックした。結果は、未処理細胞（Ｈｅｌａ）及びＧ４１８で処理した細胞のフットプリントの大部分が３０ヌクレオチド（３０ｎｔ）長であるのに対し、ＴＬＮ６８で処理した細胞のフットプリントは２９ヌクレオチド（２９ｎｔ）長であることを示している。この長さは、２８～３１ヌクレオチドで構成される必要があるリボソームフットプリントに期待される長さである。ＴＬＮ６８と他のサンプルとの間で観察された違いは、生物学的な意味を持たずに、おそらくはＲＰＦ調製中の変動を反映しているにすぎない。
本発明者らは、ＴＬＮ６８サンプル及びＨｅＬａ／Ｇ４１８サンプルについてそれぞれ２９ｎｔ及び３０ｎｔ長のリボソームフットプリントのみを選択して、全ての注釈付きＣＤＳがプールされ、各ヌクレオチド位置でのリボソームフットプリント５’末端の数が決定されるメタ遺伝子分析を実行した。このステップでは、積極的に翻訳するリボソームに対して分析が実行されていることを確認できる。実際、周期性が３の信号を明確に観察することができる（データは示さず）。この周期性は、リボソームがｍＲＮＡに沿ってコドンごとに移動することを表している。開始及び停止ステップは伸長ステップより速度が遅く、開始及び停止コドンでのリボソームの蓄積を促進するため、本発明者らは古典的に開始及び停止コドンでピークを観察する。また、５’ＵＴＲの開始コドンの上流に弱いシグナルを観察することもできる。このシグナルは、ｕＯＲＦに対応している可能性がある。Ｇ４１８で処理したサンプルを除き、停止コドンのすぐ下流で、翻訳シグナルが消失する。このシグナルは、Ｇ４１８によって促進されるゲノム全体の停止コドンのリードスルーを表している。リードスルー効率が低く、リボソームがすぐに２番目の停止コドンに遭遇するため、シグナルはすぐに消失する（通常の停止コドンと次のインフレームコドンとの間の距離の中央値は、ヒトゲノムでは１８コドンである）。興味深いことに、、未処理細胞及びＴＬＮ６８で処理した細胞について、ゲノム全体でのリードスルーは観察されなかった。
これは、ＴＬＮ６８が未成熟停止コドンを特異的に標的とし、天然の終止コドンには影響を及ぼさないことを示している。
ＴＬＮ６８の代わりに、本発明の式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の他の化合物又はそれらの塩のうちの１つ、好ましくは化合物ＥＣ－１８又はＥＣ－２８８を使用して、同じ実験を実行した。
Claims (15)
- ナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するための使用のための、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つであって、前記疾患が、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患及び腫瘍抑制遺伝子に存在するナンセンス突然変異によって引き起こされる癌から選択され、
Ｒ１が、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカルであり、
Ｒ２が、Ｈ、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルであり、
Ｒ３が、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである、
化合物。 - 前記遺伝性疾患又は癌が、目的のコード配列におけるナンセンス突然変異の存在によって引き起こされる、請求項１に記載の使用のための化合物。
- Ｒ２及びＲ３が、それぞれ同時にＨではない、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
- Ｒ１が、メチル又はエチル、好ましくはメチルであり、
Ｒ２が、Ｈ、ハロゲン原子又はメトキシラジカルであり、
Ｒ３が、Ｈ、メチルラジカル、又はメトキシラジカルである、
請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。 - Ｒ１が、メチル又はエチル、好ましくはメチルであり、
Ｒ２が、ハロゲン原子、好ましくはフッ素、塩素若しくは臭素原子、又はメトキシラジカルであり、
Ｒ３が、Ｈ又はメチルラジカルである、
請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。 - 以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１又は２に記載の使用のための化合物：
- 以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための化合物：
- ナンセンス突然変異によって引き起こされる前記遺伝性疾患が、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節遺伝子におけるＧ５４２Ｘなどのナンセンス突然変異による）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィンのナンセンス突然変異による）、ベータサラセミア（β－グロビンのナンセンス突然変異による）、Ａ型、Ｂ型又はＣ型ニーマン・ピック病（酸性スフィンゴミエリナーゼのナンセンスＬ２６１Ｘ突然変異による）、ハーラー症候群、ドラベ症候群、脊髄性筋萎縮症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アポリポタンパク質欠損症（アポリポタンパク質ＡＩ、Ｂ、ＣＩＩ又はＥ）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）欠損症、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子のナンセンス突然変異による）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子のナンセンス突然変異による）、フォン・ヴィレブランド病（フォン・ヴィレブランド因子のナンセンス突然変異による）、ファンコニ貧血群Ｃ、マルファン症候群、ゴーシェ病、ドナヒュー症候群、ロウ（Ｌｏｗｅ）眼脳腎症候群、及び色素性乾皮症から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- 式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つであって、
Ｒ１が、Ｃ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチル又はエチルであり、
Ｒ２が、ハロゲン原子、又はＣ１－Ｃ６アルコキシラジカル、好ましくはメトキシであり、
Ｒ３が、Ｈ又はＣ１－Ｃ６アルキルラジカル、好ましくはメチルであり、
但し、Ｒ２がＣ１－Ｃ６アルコキシラジカルである場合、Ｒ１がエチルであり、
Ｒ２がハロゲンであり、Ｒ３がＨである場合、前記化合物が、ギ酸又はヨウ素との塩などの薬学的に許容される塩の形態である、
化合物。 - 以下の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項９に記載の化合物：
- 療法での使用のための、請求項９又は１０に記載の化合物。
- 薬学的に許容される担体中に、請求項９又は１０に記載の少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つを含む、組成物。
- ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの他の薬物と、を
ナンセンス突然変異によって引き起こされる疾患を治療するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物であって、
前記疾患が、対象において、ナンセンス突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患及び腫瘍抑制遺伝子に存在するナンセンス突然変異によって引き起こされる癌から選択される、物。 - ａ）請求項５又は請求項７～１０のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩のうちの１つと、
ｂ）少なくとも１つの化学療法薬と、を
対象において、癌を治療するため、及び／又は癌転移を予防するため、及び／又は癌再発を予防するため、及び／又は前記化学療法薬ｂ）に対する耐性を低減するための同時、個別又は逐次使用のための組み合わせ物として含む、物。 - 前記薬物が、アタルレン、ゲンタマイシン、ネガマイシン、クリトシン、エスシン、及びＮＭＤ阻害剤から選択される、請求項１３又は１４に記載の物。
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