JP2023523682A - Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ｂ－ａｌｌ）の処置のためのｃｄ２２標的化部分 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などのＣＤ２２陽性がんの処置のための治療薬を提供する。特に、本発明は、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体を提供し、そのｓｃＦｖは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の一部として、ＣＤ２２陽性がんの処置に使用するために、ＣＤ２２抗原の第１のＩｇ細胞外ドメイン（膜から最も遠いドメイン）を標的化することができる。

Description

本発明は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）などのＣＤ２２陽性がんの処置のための治療薬を提供する。特に、本発明は、ＣＤ２２陽性がんの処置に使用するための、Ｆ（ＡＢ’）２、特にｓｃＦｖ断片がＣＤ２２抗原を標的化することができる抗ＣＤ２２モノクローナル抗体を提供する。

Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）は、個体の寿命全体を通じていかなる年齢でも診断されるアグレッシブながんであり、小児において最も一般的な悪性腫瘍である。現在の５年無病生存率は約８０％であるが、難治性および再発性（Ｒ／Ｒ）患者は予後が悪い。成人のＢ－ＡＬＬは頻度が低いが、高用量化学療法レジメンの使用および同種幹細胞移植後でさえ、一般に好ましくない臨床転帰を伴う。

免疫療法は、がん処置において前例のない期待を生み出している。細胞表面の腫瘍抗原に対して再指向されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いたヒトＴ細胞の遺伝的操作に基づく養子細胞免疫療法は、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞の高い効力および特異性のためにＲ／Ｒ Ｂ－ＡＬＬにおいて大きな可能性を示し、１２ヶ月後に約９０％の応答率および約５０％の完全寛解率を示した。しかしながら、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞は必ずしも治癒的であるとは限らず、患者の約６０％は、主にＣＡＲ Ｔ細胞の低い持続性、またはＣＤ１９^－Ｂ－ＡＬＬクローンの出現のために、再発が避けられない。したがって、残念なことに、化学療法またはＣＤ１９指向性免疫療法のいずれかの後に、ＣＤ１９^－として再発するＢ－ＡＬＬ患者に対する治療選択肢はほとんどなく、したがって、新規標的抗原、共刺激ドメインまたはエフェクター細胞の開発を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能および持続性を増強するための新規戦略が研究されている。

ＣＤ１９と同様に、ＣＤ２２はＢ細胞系統に限定された様式で発現される。ＣＤ２２指向性Ｔ細胞は、ｉ）ＣＤ２２がそのような再発において保持されるので、ＣＤ１９^－／ｄｉｍ Ｂ－ＡＬＬの再発に対する代替物を構成し、ｉｉ）ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞療法において潜在的に回避することができる最も初期のプレＶＤＪ ＣＤ１９^－Ｂ系統前駆体を標的化し得るため、現在のＣＤ１９指向性Ｔ細胞戦略に対して魅力的な追加である。実際、ＣＤ２２は、免疫毒素に連結した抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（ｍｏＡｂ）を使用した臨床試験においてＢ－ＡＬＬに対する標的として用いられており、いくつかのＣＤ２２－ＣＡＲも報告されている。ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、ナイーブまたはＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞に抵抗性のＲ／Ｒ Ｂ－ＡＬＬ患者の約７０％において臨床的寛解を誘導する。

しかしながら、これらの研究は、Ｂ－ＡＬＬ芽球が、その後のＣＤ２２－／ｄｉｍ再発によりＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞媒介性溶解から逃れるかどうかに関して相反する結果を報告している（Ｆｒｙ ＴＪ、Ｓｈａｈ ＮＮ、Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ、Ｓｔｅｔｌｅｒ－Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｍ、Ｙｕａｎ ＣＭ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓら、ＣＤ２２－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂ－ＡＬＬ ｔｈａｔ ｉｓ ｎａｉｖｅ ｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＣＤ１９－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＡＲ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８；２４（１）：２０－８；およびＰａｎ Ｊ、Ｎｉｕ Ｑ、Ｄｅｎｇ Ｂ、Ｌｉｕ Ｓ、Ｗｕ Ｔ、Ｇａｏ Ｚら、ＣＤ２２ ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｏｒ ｒｅｌａｐｓｅｄ Ｂ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１９）。興味深いことに、Ｏｒｅｎｔａｓ研究室からの比較研究（Ｂｌｏｏｄ．２０１３年２月１４日；１２１（７）：１１６５－７４．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１２－０６－４３８００２．Ｅｐｕｂ ２０１２年１２月１４日；およびＡｄｒｉｅｎｎｅ Ｈ．Ｌｏｎｇ、Ｗａｌｅｅｄ Ｍ．Ｈａｓｏ＆Ｒｉｍａｓ Ｊ．Ｏｒｅｎｔａｓ（２０１３）Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈｌｙ－ａｃｔｉｖｅ ＣＤ２２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２：４、ｅ２３６２１）は、細胞表面の近位エピトープを標的化するか、またはＣＤ２２に対して高い結合親和性を示す抗ＣＤ２２抗体を使用すると、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞の最大効力が得られることを報告した。

ここで、本発明者らは、膜遠位ＣＤ２２エピトープを標的化する新規ＣＤ２２－ＣＡＲを開発し、特徴付け、初代Ｂ－ＡＬＬ細胞の効率的な排除を報告する。

ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞の設計、検出および増殖。（Ａ）ＣＤ２２－ＣＡＲ構造および細胞内モック（モック－ＩＣ）のスキーム。（Ｂ）ＣＤ２２＋Ｂ細胞株であるＲａｊｉ細胞をｈＣＤ２２．７クローンとプレインキュベートした場合の抗ＣＤ２２ Ｓ－ＨＣＬ－１クローンの結合のブロッキングを示すヒストグラム（ＰＥシグナル）（左のパネル）。右のパネルは、ＣＤ２２構造を描写し、ｈＣＤ２２．７ ｓｃＦｖの結合部位（ならびにｍ９７１、ＨＡ２２およびＢＬ２２ ｓｃＦｖ）を指し示す。（Ｃ）初代Ｔ細胞における代表的なＣＡＲ検出。ＣＤ２２－ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、ＧＦＰ＋として検出され、抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２および抗Ｈｉｓ ｍｏＡｂ（ｒＣＤ２２－Ｈｉｓとのインキュベーション時）によって共認識される。（Ｄ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８への４８時間の曝露後に、ＣＤ２５およびＣＤ６９染色によって決定された適切なＴ細胞活性化（ｎ＝３の健常ドナー由来のＰＢＭＣ）。（Ｅ）形質導入されていない、またはモック－ＩＣもしくはＣＤ２２－ＣＡＲのいずれかで形質導入された活性化Ｔ細胞の堅固な増殖（ｎ＝３の健常ドナー由来のＰＢＭＣ）。ＴＭ、膜貫通；モック－ＩＣ、モック－細胞内；ｓｃＦｖ、一本鎖可変断片；ｒＣＤ２２－Ｈｉｓ、組換えＣＤ２２－Ｈｉｓ；Ｈｉｓ、ヒスチジン；ＦＳＣ、前方散乱；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞。プロットは平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝３の健常ドナー）。 ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビトロでＢ－ＡＬＬ細胞株を特異的に標的化し、排除する。（Ａ）インビトロ細胞傷害性アッセイの実験的設計。（Ｂ）細胞傷害性をＦＡＣＳ分析するために使用されるゲーティング戦略。生存標的細胞を、７ＡＡＤ－ＣＤ３－ＧＦＰ－ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋／ＣＤ１３＋（ＭＶ４－１１細胞株についてはＣＤ３３＋）として同定した。ＣＤ２２は、潜在的な抗原喪失のために標的細胞の交絡検出を回避するために使用されなかった。デュプレットを分析から除去した。（Ｃ）指し示されたＥ：Ｔ比でＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞との４８時間のインキュベーション後の生存標的細胞のパーセンテージ。結果を、モック－ＩＣデータ対して正規化する（ｎ＝３の健常ドナー由来のＰＢＭＣ）。異なる細胞株におけるＣＤ２２発現は、ヒストグラムで以前に示されている。（Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で作製した、ＣＤ１９－ＫＯおよびＣＤ２２－ＫＯ ＳＥＭ細胞５２９を使用したＣＤ２２－ＣＡＲの特異性（ｎ＝３の健常ドナー由来のＰＢＭＣ）。異なる細胞株におけるＣＤ２２発現は、ヒストグラムで以前に示されている。（Ｅ）１：１のＥ：Ｔ比での４８時間細胞傷害性アッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定された生存標的細胞の絶対数（ｎ＝３の健常ドナー由来のＰＢＭＣ）。（Ｆ）Ｂ－ＡＬＬおよびＡＭＬ細胞株（上のパネル）ならびにＣＤ２２－ＫＯまたはＣＤ１９－ＫＯ ＳＥＭ細胞株（下のパネル）への４８時間の曝露後のＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインの堅固な分泌を示すＥＬＩＳＡ（ｎ＝３人の健常ドナー由来のＰＢＭＣ）。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側方散乱；ＦＳＣ－Ｈ、前方散乱－高；ＦＳＣ－Ａ、前方散乱領域；Ｅ：Ｔ、エフェクター：標的比；ＫＯ、ノックアウト；ｗｔ、野生型；ＭＦＩ、蛍光強度中央値。データを平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝３の健常ドナー）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞はインビトロで初代Ｂ－ＡＬＬ細胞を効率的に標的化および排除するが、ＣＤ２２の発現レベルはそれらの効力に影響を及ぼす。（Ａ）使用した異なる初代Ｂ－ＡＬＬ試料におけるＣＤ２２の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）（ｎ＝９）。ＣＤ２２ ＭＦＩの平均値を使用して、初代Ｂ－ＡＬＬ試料をＣＤ２２ｈｉｇｈ（ＡＬＬ＃１～ＡＬＬ＃３）またはＣＤ２２ｌｏｗ（ＡＬＬ＃４～ＡＬＬ＃９）として分類した。（Ｂ）１：１のＥ：Ｔ比での２４時間および４８時間細胞傷害性アッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定された生存標的ＣＤ２２ｈｉｇｈおよびＣＤ２２ｌｏｗの絶対数。統計学的有意性を、各試料について指し示す。二元配置分散分析（シダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定）を使用した。（Ｃ）ＣＤ２２の発現レベルに関係なく、４８時間の曝露後のＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインの同様に堅固な分泌を示すＥＬＩＳＡ。データを平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝３の健常ドナー由来のＰＢＭＣ）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。 膜遠位ＣＤ２２エピトープに対して指向されたＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで示差的にアグレッシブなＰＤＸ Ｂ－ＡＬＬ芽球を効率的に排除する。（Ａ）インビボ実験の実験的設計。（Ｂ）インビボ実験からのＦＡＣＳデータを分析するために使用したゲーティング戦略。白血病細胞を、ｈＣＤ４５＋ｈＨＬＡ－ＡＢＣ＋ｈＣＤ３－ｈＣＤ１９＋ｈＣＤ１０＋として同定した。潜在的な抗原喪失による交絡分析を回避するために、ＣＤ２２は同定から除外した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＧＦＰの発現に基づいて同定した。デュプレットを分析から除去した。（Ｃ）２６週間のフォローアップ期間にわたってＰＢで測定された白血病負荷（上のパネル）およびＴ細胞の持続性（下のパネル）（ｎ＝４～５のマウス／群；ｎ＝３のＰＤＸ、ＣＤ２２ｈｉｇｈ（ＡＬＬ＃１およびＡＬＬ＃２）およびＣＤ２２ｌｏｗ（ＡＬＬ＃１０））。（Ｄ）ＰＢ、同側および対側のＢＭならびに脾臓における屠殺時の白血病負荷（３つのＰＤＸ由来のｎ＝１４のマウスをプールして示す）。（Ｅ）屠殺時のモック－ＩＣおよびＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスの脾臓（ＡＬＬ＃２マウス）の重量（全動物、ｎ＝１４）および巨視的画像。（Ｆ）屠殺時のモック－ＩＣおよびＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスにおけるＰＢ赤血球数（ｎ＝１４）。（Ｇ）屠殺時のモック－ＩＣおよびＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスにおける持続的初代Ｂ－ＡＬＬのＣＤ２２ ＭＦＩ（ＡＬＬ＃２マウス、ｎ＝４～５）、ならびに標的細胞集団内のモック－ＩＣおよびＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウスのＣＤ２２のレベルを示す対側ＢＭ試料の代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ、日；Ｗ、週；ｉｔ、脛骨内；ｉｖ、静脈内；ＢＭ、骨髄；ＲＢＣ、赤血球；ＭＦＩ、蛍光強度中央値。プロットは平均±ＳＥＭを示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 ｈＣＤ２２．７－ｓｃＦｖの免疫原性予測。ｈＣＤ２２．７、ｍ９７１およびＨＡ２２ ＣＤ２２－ｓｃＦｖの免疫原性の可能性をインシリコ予測分析によって比較した。ＣＤ２２－ｓｃＦｖは、ＨＬＡ分子が強い好選性を有する長さの９量体ペプチドに切断された。ペプチドは、半数阻害濃度（ＩＣ５０）が＜５００ｎＭである場合、ＭＨＣクラス－Ｉに結合すると考えられ、ＩＣ５０が＜５０ｎＭ（親和性値＞２、点線）およびアミノ酸配列が図に示されている場合に強力な結合因子と考えられる。最も代表的なＨＬＡスーパータイプのみを分析した。予測されたエピトープ結合親和性を（１／ＩＣ５０×１００）として計算した。予測されるエピトープは、タンパク質におけるそれらの分布に従い、ｘ軸に沿って分布する。 ＣＤ２２／ＣＤ１９－ｂｉＣＡＲ Ｔ細胞の作製、形質導入、増殖および検出。Ａ）使用したＣＡＲ構築物のスキーム。（Ｓ）および（Ｌ）はそれぞれ、ｓｃＦｖ間リンカーについての短い－（Ｇ_４Ｓ）_４－および長い－（Ｇ_４Ｓ）_７－のサイズを示す。Ｂ）ＦＡＣＳによるＣＤ２５およびＣＤ６９の発現（左のパネル）によって、ならびに光学顕微鏡による活性化Ｔ細胞クラスター（右のパネル）によって決定された、抗ＣＤ３／ＣＤ２８＋ＩＬ－７およびＩＬ－１５への４８時間の曝露後のＴ細胞活性化（ｎ＝５）。Ｃ）指し示されたＣＡＲで形質導入された活性化Ｔ細胞の形質導入効率（左のパネル）および増殖（右のパネル）（ｎ＝５）。矢印は、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ヒトＴ細胞上のＣＡＲ表面検出のために採取した時間を表す。Ｄ）ＧＦＰ＋（上のパネル）、抗ｓｃＦｖ（２行目）、ＣＤ１９－Ｆｃ／抗Ｆｃ（３行目）、およびＣＤ２２－Ｈｉｓタグ（下のパネル）として検出された、ヒトＴ細胞上のＣＡＲ発現の代表的なフローサイトメトリープロット。ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞を緑色で示す。Ｅ）ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞における代表的なＣＡＲ形質導入（ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして示す。 インビトロでのＣＤ２２／ＣＤ１９－ｂｉＣＡＲ Ｔ細胞の堅固な抗白血病効力および特異性。Ａ～Ｂ）指し示されたＣＡＲ Ｔ細胞およびＥ：Ｔ比で４８時間のインキュベーション後の生存標的細胞（ＳＥＭまたはＮＡＬＭ６）の絶対数（Ａ）および（Ｂ）パーセンテージ。Ａの結果を、モック－ＣＡＲデータに対して正規化する（ｎ＝３の独立した健常ドナーのＰＢＭＣ）。Ｃ）１：１のＥ：Ｔ比でＳＥＭまたはＮＡＬＭ６標的細胞への４８時間の曝露後のＣＡＲ Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインＩＬ－２、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの産生（ｎ＝３の独立した健常ドナーのＰＢＭＣ）。Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９編集されたＳＥＭ細胞の異なるＣＤ２２／ＣＤ１９コンビナトリアル表現型。Ｅ～Ｆ）指し示されたＣＡＲ Ｔ細胞およびＥ：Ｔ比で４８時間のインキュベーション後の生存標的細胞のパーセンテージ（Ｅ）および絶対数（Ｆ）。Ｅの結果を、モック－ＣＡＲデータに対して正規化する（ｎ＝５の独立した健常ドナーのＰＢＭＣ）。Ｇ）指し示されたＳＥＭ表現型への４８時間の曝露後のＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの産生（ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；テューキー事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ検定。 ＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＡＬＭ６およびＳＥＭ Ｂ－ＡＬＬ細胞株の両方を使用したインビボで、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞と同程度に効率的である。Ａ）インビボ実験の実験的設計。ＮＳＧマウス（ｎ＝６／群）に、１×１０^５個のＬｕｃ発現ＮＡＬＭ６／ＳＥＭ細胞をＢＭ内移植した。４日後、４×１０^６個のモック－ＣＡＲ、ＣＤ１９－ＣＡＲまたはＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲ Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。白血病負荷を、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用して生物発光（ＢＬＩ）によって毎週モニターした。モック－ＣＡＲ処置マウスがＢＬＩによって完全に白血病性であった場合、マウスを屠殺し、白血病負荷およびＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性についてＦＡＣＳ分析した。Ｂ）指し示された時点でＢＬＩによってモニターされたＮＡＬＭ６白血病負荷のＩＶＩＳ画像化。Ｃ）指し示された時点でのＮＡＬＭ６についての全放射輝度定量（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）。Ｄ、Ｅ）それぞれモック－ＣＡＲ、ＣＤ１９－ＣＡＲ、およびＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲで処置したマウスの屠殺時の末梢血（ＰＢ）（Ｄ）および対側骨髄（ＢＭ）（Ｅ）におけるＮＡＬＭ６白血病負荷。Ｆ）それぞれモック－ＣＡＲ、ＣＤ１９－ＣＡＲ、およびＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲで処置したマウスの屠殺時のＢＭにおける、ＮＡＬＭ６細胞（青色）およびヒトＴ細胞の持続性（赤色）を示す代表的なＦＡＣＳプロット。Ｇ～Ｋ）ＳＥＭ標的細胞についてはＢ～Ｆと同じ。各ドットはマウスを表す。データを平均±ＳＥＭとして示す、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；テューキー事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ検定。 ＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲ Ｔ細胞は、初代およびＰＤＸ Ｂ－ＡＬＬ細胞を排除する。Ａ）初代Ｂ－ＡＬＬ芽球におけるＣＤ２２およびＣＤ１９ ＦＡＣＳ発現（ｎ＝３）。Ｂ）２：１のＥ：Ｔ比でＣＡＲ Ｔ細胞との２４時間のインキュベーション後の生存初代Ｂ－ＡＬＬ芽球の絶対数。Ｃ）２：１のＥ：Ｔ比で初代Ｂ－ＡＬＬ芽球への２４時間の曝露後のＣＡＲ Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインＩＬ－２、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの産生（ｎ＝３の独立した健常ドナーのＰＢＭＣ）。Ｄ～Ｆ）ＰＤＸ Ｂ－ＡＬＬ試料についてはＡ～Ｂと同じ。データを平均±ＳＥＭとして示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１；テューキー事後検定による二元配置ＡＮＯＶＡ検定。 ＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲは、長期フォローアップのＢ－ＡＬＬ ＰＤＸにおいて再発を遅延させるのに有効である。Ａ）実験的設計を示すスキーム。ＮＳＧマウス（ｎ＝６～８／群）に、０．５×１０^６個のＢ－ＡＬＬ ＰＤＸ＃１および１×１０^６個のＢ－ＡＬＬ ＰＤＸ＃２細胞をｉ．ｖ．移植した。ＢＭにおけるＢ－ＡＬＬの生着の際に、マウスを無作為化し、１７日目または３１日目に、５×１０^６個のモック－ＣＡＲ、ＣＤ１９－ＣＡＲまたはＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲ Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。ＰＢにおける白血病負荷およびヒトＴ細胞の持続性を、ＦＡＣＳによって隔週でモニターした。モック－ＣＡＲ処置マウスを屠殺した時（４週目）およびエンドポイント分析時（１３週目）に、ＢＭ吸引物をＦＡＣＳ分析した。Ｂ）ＣＡＲ－Ｔ細胞注入後の指し示された時点でのＰＢ（左上のパネル）およびＢＭ（左下のパネル）における白血病負荷。右のパネルは、ＣＡＲ Ｔ細胞注入前（ＣＡＲ Ｔ細胞注入の３日前）およびモック－ＣＡＲ処置マウスを屠殺した時（４週目）の代表的なＢＭのＦＡＣＳ分析を示す。Ｃ）指し示された時点でのＣＤ１９－ＣＡＲ処置マウス対ＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲ処置マウスの白血病生着／再発（左のパネル）および持続性Ｔ細胞（右のパネル）のＰＢにおけるフォローアップ（ｎ＝７～８の動物／群）。Ｄ）ＣＤ１９－ＣＡＲ処置マウス対ＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲ処置マウスについてのＢＭにおける屠殺／エンドポイント（ＣＡＲ Ｔ細胞注入後の第１３週）時での白血病負荷（ｎ＝７のマウス／群）。ＢＭにおける芽球のパーセント（％）が＞１％（水平の点線）である場合、マウスは再発したと考えられる。下のパネルは、各独立したＣＤ１９－ＣＡＲ処置マウスおよびＣＤ２２／ＣＤ１９（Ｓ）－ＣＡＲ処置マウスについてのＢ－ＡＬＬ細胞（青色）およびヒトＴ細胞の持続性（赤色）を示すＦＡＣＳ分析を示す。各ドットはマウスを表す。データを平均±ＳＥＭとして示す。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；テューキー事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ検定。 ７つのドメインを有するＣＤ２２構造。抗ＣＤ２２抗体の結合が指し示されている。 イノツズマブ（ドメイン遠位）、ｈＣＤ２２．７（ドメイン１、遠位）の結合ドメイン。イノツズマブについて検出されたエピトープ（青色）は、ｈＣＤ２２．７（赤色）に対して同定されたものに隣接する露出領域と一致する。イノツズマブのエピトープは、ｈＣＤ２２．７によって認識されるものよりもわずかに延びており、主に酸／塩基性残基から構成される。現在、この図に示されているＣＤ２２の３つの第１のドメイン（１～３００）に関する構造情報のみが存在する。 ＣＤ２２－イノツズマブｓｃＦｖおよびＣＤ２２－ｈＣＤ２２．７ｓｃＦｖ複合体の構造モデル。ｈＣＤ２２．７の場合、構造は、ＣＤ２２の同定された結合エピトープ（赤色）ならびにｈＣＤ２２．７ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の配列（それぞれ青色およびピンク色）に基づいて予測される。イノツズマブの場合、構造は、ＣＤ２２の同定された結合エピトープ（青色）ならびにイノツズマブｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の配列（それぞれ黄色および緑色）に基づいて予測される。イノツズマブのモデリングは、重鎖および軽鎖の両方に対して高い配列同一性（重鎖：９０％；軽鎖：９２％）を有するＰＤＢデータバンクで利用可能な構造５ｃｚｘに基づいて行われている。 Ａ）細胞傷害性アッセイ。指し示された数（Ｅ：Ｔ比１／１、１／２、１／４および１／８）で１×１０^５個のＮＡＬＭ６細胞をＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞と２４～４８時間インキュベーション後の生存標的ＮＡＬＭ６（ＣＤ１ａ＋）およびＪｕｒｋａｔ（ＣＤ１ａ－、対照として）細胞のパーセンテージ。結果を、モックデータ（ｎ＝３の健常ドナーおよび２つの独立した実験からのＰＢＭＣを用いたデータ）に対して正規化する。Ｂ）ＮＡＬＭ６細胞への２４～４８時間の曝露後の異なるＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインの分泌を示すＥＬＩＳＡ。データを平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝３の健常ドナー）。 ＮＳＧマウスｎ＝４群に、２つの５×１０^６個のＬｕｃ／ＧＦＰ発現ＮＡＬＭ６細胞（図１６～図１８）またはＳＥＭ（図２０～図２２）細胞を脛骨内（ＩＴ）注射し、３日後に５×１０^６個のモックまたは異なるＣＤ２２ ＣＡＲＴの単回ＩＶ（静脈内）注射を行った。腫瘍負荷を、ＢＬＩ（ＩＶＩＳ画像化を使用）によって４日ごとにモニターした。モック処置された動物が完全に白血病性である場合、動物を安楽死させ、白血病負荷およびＣＡＲＴ持続性についてＦＡＣＳを使用することによって分析した。 Ａ）指し示された時点でＢＬＩによってモニターされたＮＡＬＭ６－Ｌｕｃ細胞由来の腫瘍負荷のＩＶＩＳ画像化。Ｂ）指し示された時点での平均放射輝度定量。左、線形スケール。右、対数スケール。 末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）および脾臓における屠殺時の白血病負荷（ＮＡＬＭ６－Ｌｕｃ細胞）。 屠殺時のＰＢ、ＢＭおよび脾臓におけるＴ細胞の持続性（ＮＡＬＭ６－Ｌｕｃ細胞）。 Ａ）指し示された時間で、標的細胞（Ｔ）として１×１０５個のＳＥＭ ＷＴ細胞（左）およびＣＤ２２に対するＫＯ ＳＥＭ細胞（ＣＤ２２ＫＯ）を用いた細胞傷害性アッセイ。指し示された細胞数（Ｅ：Ｔ比１／１、１／２、１／４および１／８）でエフェクター（Ｅ、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ）細胞との２４時間および４８時間のインキュベーション後の生存標的細胞のパーセンテージ。結果を、モックデータ（ｎ＝３の健常ドナーおよび１つの実験からのＰＢＭＣ）対して正規化する。Ｂ）ＳＥＭ細胞への２４～４８時間の曝露後の異なるＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインの分泌を示すＥＬＩＳＡ。データを平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝３の健常ドナー）。 Ａ）指し示された時点でＢＬＩによってモニターされたＳＥＭ－ｌｕｃ細胞由来の腫瘍負荷のＩＶＩＳ画像化。（Ｂ）指し示された時点での平均放射輝度定量。左、線形スケール。右、対数スケール。 ＰＢ、ＢＭおよび脾臓における屠殺時の白血病負荷（ＳＥＭ－Ｌｕｃ細胞）。 屠殺時のＰＢ、ＢＭおよび脾臓における屠殺時の負荷におけるＴ細胞の持続性（ＳＥＭ－Ｌｕｃ細胞）。 ｇ５／４４およびＣＤ２２．７タンパク質配列のｓｃＦｖを比較のためにアラインメントした。Ａ）重鎖の比較；Ｂ）これらのｓｃＦｖのそれぞれの軽鎖の比較。相同性の程度は、各アミノ酸について１～１０のスコアで指し示されている（１０は^＊である）。この図に示されるように、これらのｓｃＦｖ、ｇ５／４４およびＣＤ２２．７のそれぞれのＣＤＲが四角形を伴って指し示されている。Ｇ５／４４およびｍ５／４４は、同じ抗体（イノツズマブ）のヒトおよびマウスバージョンである。 配列ベースの（および構造アシストの）ＣＤＲグラフティングアプローチに従うヒト化プロセス。図２４は、新規抗ＣＤ２２（クローンｈＣＤ２２．７）の重鎖および軽鎖のマウスバージョンとヒト化バージョンとの間の比較を示す。図２５Ａ）はヒト化重鎖を示し、図２５Ｂ）はヒト化軽鎖を示す。 「脱マウス化（Ｄｅ－ｍｕｒｉｎｅｎｉｚａｔｉｏｎ）」アプローチに従うヒト化プロセス。図２５は、マウス配列上の免疫学的に責任がある領域の同定、およびそのような責任を取り除くための配列上の個々の変化（すなわち点変異）を示す。

発明の詳細な説明

（定義）
患者へ医薬を「投与すること」または患者への医薬「の投与」（およびこの語句の文法的等価物）は、医療専門家による患者への投与であり得るか、または自己投与であり得る直接投与、および／または薬物を処方する行為であり得る間接投与を指す。例えば、患者に医薬を自己投与するように指示するか、または患者に薬物の処方箋を提供する医師が、患者へ薬物を投与している。

「アフィボディ」という用語は、プロテインＡのＺドメインに由来し、特定の標的に結合するように操作されたタンパク質を指す（Ｆｒｅｊｄ＆Ｋｉｍ、２０１７．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．４９（３）：ｅ３０６を参照）。

「抗体」という用語は、特定の標的に結合するか、または特定の標的と免疫学的に反応性である少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む分子を指す。用語は、全抗体および任意の抗原結合部分またはその単鎖ならびにそれらの組合せを含む。例えば、「抗体」という用語は、特に二価抗体および二価二重特異性抗体を含む。

典型的な種類の抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（「ＨＣ」）および２つの軽鎖（「ＬＣ」）を含む。

各「重鎖」は、「重鎖可変ドメイン」（本明細書では「ＶＨ」と略される）および「重鎖定常ドメイン」（本明細書では「ＣＨ」と略される）を含む。重鎖定常ドメインは、典型的には、３つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。

各「軽鎖」は、「軽鎖可変ドメイン」（本明細書では「ＶＬ」と略される）および「軽鎖定常ドメイン」（「ＣＬ」）を含む。軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパ型またはラムダ型のものであり得る。ＶＨおよびＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（「ＦＷ」）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変の領域にさらに細分することができる。

各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＷから構成される：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。本開示は、とりわけ、ＶＨおよびＶＬ配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する部分配列を提示する。

所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（’’Ｋａｂａｔ’’付番スキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７）ＪＭＢ ２７３、９２７－９４８（’’Ｃｈｏｔｈｉａ’’付番スキーム）によって記載されたものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。

したがって、当業者は、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４の配列が等しく開示されていることを理解するであろう。特定のＶＨについて、ＦＷ１は、ＶＨのＮ末端とＨ－ＣＤＲ１のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ２は、Ｈ－ＣＤＲ１のＣ末端とＨ－ＣＤＲ２のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ３は、Ｈ－ＣＤＲ２のＣ末端とＨ－ＣＤＲ３のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ４は、Ｈ－ＣＤＲ３のＣ末端とＶＨのＣ末端との間の部分配列である。同様に、特定のＶＬについて、ＦＷ１は、ＶＬのＮ末端とＬ－ＣＤＲ１のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ２は、Ｌ－ＣＤＲ１のＣ末端とＬ－ＣＤＲ２のＮ末端との間の部分配列である。ＦＷ３は、Ｌ－ＣＤＲ２のＣ末端とＬ－ＣＤＲ３のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ４は、Ｌ－ＣＤＲ３のＣ末端とＶＬのＣ末端との間の部分配列である。

重鎖および軽鎖の可変ドメインは、結合標的と相互作用する領域を含み、結合標的と相互作用するこの領域は、本明細書では「抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」または「抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」とも呼ばれる。抗体の定常ドメインは、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への抗体の結合を媒介することができる。本開示の例示的な抗体には、典型的な抗体だけでなく、Ｆ（ａｂ’）２などの二価断片およびその変形も含まれる。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、二価抗体断片（Ｆ（ａｂ’）２など）、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および抗原結合部位を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子を包含する。

抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス（アイソタイプ）：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかのものであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構成を有する。抗体は、裸であるか、または他の分子（治療剤または診断剤など）にコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを形成することができる。

「抗原結合断片」または「Ｆａｂ」という用語は、重鎖および軽鎖のそれぞれの１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ断片は、インタクトなモノクローナル抗体をパパインで消化することによって得ることができる。

「がん」という用語は、生理学的機能を有さず、制御されていない通常は急速な細胞増殖から生じ、身体の他の部分に浸潤または拡散する可能性を有する、組織の異常な良性または悪性の新しい成長として定義することができる疾患の群を指す。

「ＣＤ２２陽性」がん性疾患を含む「ＣＤ２２陽性」がんは、その細胞表面にＣＤ２２が存在する細胞を含むものである。「ＣＤ２２陽性」という用語はまた、本発明のＣＡＲ含有細胞がＣＤ２２へのＣＡＲの結合によって媒介される治療効果を有するように、細胞の表面に十分なレベルのＣＤ２２を産生するがんを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２陽性がんは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、より具体的にはＣＤ１９^－Ｂ－ＡＬＬの再発である。

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、Ｔ細胞を選択された抗原に対して標的化し、Ｔ細胞の機能、代謝および持続性を再プログラムする合成受容体を指す（Ｒｉｖｉｅｒｅ＆Ｓａｄｅｌａｉｎ、２０１７．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（５）：１１１７－１１２４を参照）。同様に、「ＣＡＲＴ」という用語は、ＣＡＲを含むＴ細胞を指す。

本明細書で使用される「併用療法」、「と組み合わせて」または「と併せて」は、少なくとも２つの別個の処置モダリティ（すなわち、化合物、構成要素、標的化剤または治療剤）による同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）、並列、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、逐次または断続的な処置の任意の形態を示す。したがって、用語は、対象への他の処置モダリティの投与前、投与中、または投与後の１つの処置モダリティの投与を指す。組み合わせたモダリティは、任意の順序で投与することができる。治療的に活性なモダリティは、医療従事者によってまたは規制当局に従って処方される様式および投薬レジメンで、一緒に（例えば、同じまたは別々の組成物、製剤または単位剤形で同時に）または別々に（例えば、同じ日または異なる日に、別々の組成物、製剤または単位剤形のための適切な投与プロトコルに従って任意の順序で）投与される。一般に、各処置モダリティは、その処置モダリティに対して決定された用量および／または時間スケジュールで投与され得る。場合により、３つ以上のモダリティが併用療法において使用されてもよい。さらに、本明細書で提供される併用療法は、他の種類の処置と併せて使用されてもよい。例えば、他の抗がん処置は、対象の現在の標準治療に関連する他の処置の中でも、化学療法、手術、放射線療法（放射線）および／またはホルモン療法からなる群より選択されてもよい。

「完全奏効」または「完全寛解」または「ＣＲ」は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインで定義されているように、すべての標的病変の消失を指し示す。これは、がんが治癒したことを必ずしも意味しない。

「共刺激シグナリングドメイン」という用語は、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３ζ鎖によって提供される一次シグナルに加えて、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルをＴ細胞に提供するシグナリング部分を指す。共刺激ドメインには、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、１ＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのすべてまたは一部分含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、他の細胞内メディエーターと相互作用して、活性化、増殖、分化およびサイトカイン分泌などを含む細胞応答を媒介する細胞内シグナリングドメインである。

本明細書で使用される場合、薬剤、例えば、ＣＡＲＴなどの治療剤の「有効量」という用語は、有益な結果または所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、Ｔ－ＡＬＬを処置する治療剤を投与する状況においては、有効量は、がん細胞の数を減少させる；腫瘍サイズまたは負荷を減少させる；末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、ある特定の実施形態では、停止させる）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、ある特定の実施形態では、停止させる）；腫瘍成長をある程度阻害する；がんに関連する症候の１つまたは複数をある程度緩和する；および／または良好な応答、例えば、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）もしくは全生存期間（ＯＳ）の延長、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、またはいくつかの場合には、安定疾患（ＳＤ）、進行疾患（ＰＤ）の減少、進行までの時間（ＴＴＰ）の短縮、またはそれらの任意の組合せをもたらすことができる。「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療有効量」または「治療有効用量」と互換的に使用され得る。

「個体」、「患者」または「対象」という用語は、本出願ではヒトを指定するために互換的に使用され、決して限定することを意味するものではない。「個体」、「患者」または「対象」は、任意の年齢、性別および体調のものであり得る。「それを必要とする患者」という用語は、通常、ＣＤ２２陽性がんに罹患している患者を指す。

「注入」または「注入する」とは、治療目的のために静脈を通して体内に治療剤含有溶液を導入することを指す。一般に、これは静脈内バッグを介して達成される。

本明細書で使用される「細胞内シグナリングドメイン」は、リンパ球の活性化をもたらす分子（ここではキメラ受容体分子）の１つまたは複数のドメインのすべてまたは一部分を指す。そのような分子の細胞内ドメインは、細胞メディエーターと相互作用することによってシグナルを媒介し、増殖、分化、活性化および他のエフェクター機能をもたらす。本発明のＣＡＲで使用するための細胞内シグナリングドメインの例としては、ＣＤ３ζ鎖の細胞内配列、および／またはＣＡＲ係合後にシグナル伝達を開始するために協調して作用する共受容体、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナリング配列：抗原依存性一次活性化を開始し、Ｔ細胞受容体様シグナルをもたらすもの（一次細胞質シグナリング配列）および抗原非依存的様式で作用し、二次または共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナリング配列）によって媒介されると言うことができる。刺激の様式で作用する一次細胞質シグナリング配列は、受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナリングモチーフを含み得る。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナルリング配列の例としては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。

「部分奏効」または「ＰＲ」は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインで定義されているように、ベースラインの合計直径を基準として、標的病変の直径の合計における処置に応答した少なくとも３０％の減少を指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される希釈剤とは、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を意味する。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、本発明の範囲を限定するものではないが、以下が含まれる：追加の緩衝剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生分解性ポリマー；ナトリウム、多価糖アルコールなどの塩形成対イオン；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、およびトレオニンなどのアミノ酸；ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖または糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［α］－モノチオグリセロール、チオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ならびにポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー。他の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に記載されているものはまた、医薬組成物の所望の特徴に悪影響を及ぼさないという条件で、本明細書に記載の医薬組成物に含まれてもよい。

「進行疾患」または「進行した疾患」とは、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインで定義されているように、もう１つの新しい病変もしくは腫瘍の出現および／または既存の非標的病変の明確な進行を指す。進行疾患または進行した疾患はまた、質量の増加または腫瘍の広がりのいずれかに起因して、処置を開始してから２０％を超える腫瘍成長を指し得る。

「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）は、登録から疾患進行または死亡までの時間を指す。ＰＦＳは、一般に、カプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）法および固形腫瘍における応答評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）１．１規格を使用して測定される。一般に、無増悪生存期間は、患者ががんが悪化することなく生存したままである状況を指す。

「ＲＥＣＩＳＴ」という用語は、固形腫瘍における応答評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｕｒｓ）を意味する。ＲＥＣＩＳＴガイドライン、基準、または規格は、成人および小児がん臨床試験で使用するための固形腫瘍の測定に対する標準的なアプローチおよび腫瘍サイズの変化の客観的評価のための定義を記載している。ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１は、改訂ＲＥＣＩＳＴガイドラインのバージョン１．１を意味し、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒｓ ４５（２００９）２２８－２４７に公表されている。

「有利に応答する」という用語は、一般に、対象に有益な状態を引き起こすことを指す。がん処置に関して、用語は、対象に治療効果をもたらすことを指す。がんにおけるプラスの治療効果は、いくつかの方法で測定することができる（Ｗｅｂｅｒ、２００９．Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．５０Ｓｕｐｐｌ１：１Ｓ－１０Ｓを参照）。例えば、腫瘍成長阻害、分子マーカーの発現、血清マーカーの発現、および分子イメージング技術はすべて、抗がん治療薬の治療効力を評価するために使用することができる。腫瘍成長阻害に関して、ＮＣＩ規格によれば、Ｔ／Ｃ≦４２％が抗腫瘍活性の最小レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％は、高い抗腫瘍活性レベルと考えられ、Ｔ／Ｃ（％）＝（処置された腫瘍体積の中央値）／（対照の腫瘍体積の中央値）×１００である。好ましい応答は、例えば、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、もしくは全生存期間（ＯＳ）の延長、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、または、いくつかの場合では、安定疾患（ＳＤ）、進行疾患（ＰＤ）の減少、進行までの時間（ＴＴＰ）の短縮、またはそれらの任意の組合せによって評価することができる。

「配列同一性」という用語は、ペアワイズ配列アラインメントツールを使用して２つの配列を比較した場合に得られるパーセンテージ値を指す。この場合、配列同一性は、デフォルト設定を使用したグローバルアライメントツール「ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ」（Ｒｉｃｅら、２０００．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６（６）：２７６－７；Ｌｉら、２０１５．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３（Ｗ１）：Ｗ５８０－４）を使用して得られる。グローバルアライメントツールは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／で入手可能である。

「一本鎖抗原結合断片」または「ｓｃＦａｂ」という用語は、抗体の重鎖の１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインに結合した、抗体の軽鎖の１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含む融合タンパク質を指し、重鎖および軽鎖は短いペプチドを介して一緒に連結されている。

「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」という用語は、ペプチドリンカーで互いに連結された抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む融合タンパク質を指す。用語はまた、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）を含む。ジスルフィド結合でｓｃＦｖを安定化する方法は、Ｒｅｉｔｅｒら、１９９６．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１０）：１２３９－４５に開示されている。

「安定疾患」とは、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインで定義されているように、進行または再発のない疾患を指す。安定疾患では、部分奏効に適格となるのに十分な腫瘍縮小も、進行疾患として適格となるのに十分な腫瘍増加もない。

「腫瘍進行までの時間」（ＴＴＰ）は、登録から疾患進行までの時間として定義される。ＴＴＰは、一般に、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１基準を使用して測定される。

本出願で使用される場合、「処置」および「治療」という用語は、健康問題を改善する目的で疾患および／または症候を治癒および／または緩和する目的で使用される衛生的、薬理学的、外科的および／または物理的手段のセットを指す。「処置」および「治療」という用語は、両方とも個体または動物の健康の維持および／または再確立を指向するため、予防的および治癒的方法を含む。症候、疾患および障害の原因にかかわらず、健康問題を緩和および／または治癒するための適切な医薬の投与は、本出願の文脈内の処置または治療の形態として解釈されるべきである。
説明

ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、Ｒ／Ｒ Ｂ－ＡＬＬにおいて疑う余地のない可能性を示した。しかしながら、残念なことに、患者の４０～６０％は、ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性が低いため、またはＣＤ１９^－Ｂ－ＡＬＬクローンの出現のために最終的に再発する。ＣＤ１９^－Ｂ－ＡＬＬの再発には治療選択肢がほとんど存在しないため、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能および持続性を増強するためには、新しい標的抗原の開発を含む新規戦略を検討すべきである。ＣＤ２２は汎Ｂ細胞抗原であり、通常はＣＤ２２発現を保持するＣＤ１９^－再発を標的とするので、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に関してＣＤ１９に対する魅力的な代替物である。

これに沿って、いくつかのＣＤ２２－ＣＡＲが、ナイーブまたはＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞に抵抗性のＲ／Ｒ Ｂ－ＡＬＬ患者の７０％において臨床的寛解を誘導することが報告されている。しかし、異なるＣＤ２２ ｓｃＦｖ（ｍ９７１対ＹＫ－ＣＤ２２ＢＢ－００２）に基づく第Ｉ相臨床試験は、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞接触時のＣＤ２２喪失および免疫回避に関して相反する結果を報告している。いくつかの抗ＣＤ２２ ｍｏＡｂの以前の包括的な比較は、エピトープ選択がＣＤ２２－ＣＡＲの抗白血病活性に重要であること、およびＣＤ２２の最も膜近位のＩｇ細胞外ドメイン（５～７）を標的とするｍ９７１ ｓｃＦｖが、近位のＩｇドメイン３を標的とするＢＬ２２およびＨＡ２２ ｓｃＦｖよりも強力であろうことを指し示した。

本発明では、本発明者らは、ＣＤ２２－ＣＡＲの制限された最先端のアーセナルの拡大に寄与し得る、新規ＣＤ２２標的化部分、好ましくは抗ＣＤ２２抗体、より好ましくはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびｓｃＦａｂからなる群より選択される抗ＣＤ２２抗体断片の前臨床開発を報告する。この目的のために、従来のｍｏＡｂ作製技術を使用して３つのＣＤ２２反応性ハイブリドーマを作製し、３つの非常に特異的なＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ２２ ｍｏＡｂをもたらし、最後にＣＡＲの構築のためにｈＣＤ２２．７クローンを選択した。本発明者らの知る限りでは、このｈＣＤ２２．７ ｓｃＦｖは、ＣＤ２２の最も膜遠位のＩｇ細胞外ドメイン１の配列番号１５に列挙されるエピトープを認識するＣＤ２２－ＣＡＲの開発に使用された最初である。これらの膜遠位エピトープＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、臨床的に重要な初代Ｂ－ＡＬＬ細胞を使用したインビトロおよびインビボで、高性能を示した。実際、それらは、長期間（最大２６週間）のＴ細胞の持続性と相まって、多様なアグレッシブさを有するいくつかのＢ－ＡＬＬ ＰＤＸを制御するのに非常に効率的であった。重要なことに、本発明者らの実験的設計では、すべての構造モチーフ、細胞溶解モチーフおよび共刺激モチーフがエフェクターＴ細胞において発現されるが、細胞外抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ領域は発現されない、厳密な「モック」対照を使用した。この細胞内モック（モック－ＩＣ）は、本発明者らのＣＤ２２－ＣＡＲの高い特異性および感度を実証する。

本明細書で提供される実施例に示されるように、ＣＤ２２の発現レベルを使用して、９つの初代Ｂ－ＡＬＬ試料をＣＤ２２^ｈｉｇｈおよびＣＤ２２^ｌｏｗとして分類し、本発明者らは、すべてのＢ－ＡＬＬ初代細胞がインビトロでＣＤ２２－ＣＡＲによって効率的に認識され、排除されたことを示す。さらに、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、長期間（最大２６週間）にわたって様々なアグレッシブさを有するいくつかのＢ－ＡＬＬ ＰＤＸをインビボで制御することにおいて有能に機能し、これは、長期間のＴ細胞の持続性と相まって、生存／耐性Ｂ－ＡＬＬ細胞によるＣＤ２２抗原喪失の徴候がなかった。

したがって、本発明者らは、アブイニシオ（ａｂ ｉｎｉｔｉｏ）で、既存のＣＤ２２－ＣＡＲとは異なり、ＣＤ２２抗原の第１のＩｇ細胞外ドメイン（膜から最も遠いドメイン）を認識するように見える１つのＣＤ２２－ＣＡＲを作製した。

本発明の文脈において、「ＣＤ２２抗原の第１のＩｇ細胞外ドメイン（膜から最も遠いドメイン）」は、以下のアミノ酸配列［ＤＳＳＫＷＶＦＥＨＰＥＴＬＹＡＷＥＧＡＣＶＷＩＰＣＴＹＲＡＬＤＧＤＬＥＳＦＩＬＦＨＮＰＥＹＮＫＮＴＳＫＦＤＧＴＲＬＹＥＳＴＫＤＧＫＶＰＳＥＱＫＲＶＱＦＬＧＤＫＮＫＮＣＴＬＳＩＨＰＶＨＬＮＤＳＧＱＬＧＬＲＭＥＳＫＴＥＫＷＭＥＲＩＨＬＮＶＳＥ］（配列番号１４）を有するＣＤ２２ドメインとして理解される。

本発明の文脈において、「ＣＤ２２抗原の第１のＩｇ細胞外ドメイン（膜から最も遠いドメイン）からのエピトープ」は、以下のアミノ酸配列を有するエピトープ領域として理解される：［ＥＳＴＫＤＧＫＶＰ］（配列番号１５）

そのようなＣＤ２２－ＣＡＲは、Ｂ－ＡＬＬの臨床的に重要な患者試料を使用したインビトロおよびインビボで、効率的に機能する。特に、本発明者らのｈＣＤ２２．７由来の膜遠位標的化ＣＡＲは、ＣＤ２２－ＣＡＲの持続性と相まって、異なるＰＤＸを使用したインビボで、疾患を完全に制御する。

したがって、本発明の第１の態様は、ＣＤ２２標的化部分を提供し、ＣＤ２２標的化部分は、ＣＤ２２抗原の第１のＩｇ細胞外ドメイン（膜から最も遠いドメイン）に対して結合親和性を有し、具体的には配列番号１４に対して結合親和性を有し、より具体的には配列番号１５に対して結合親和性を有する。

本発明の好ましい実施形態では、本発明の第１の態様は、ＣＤ２２標的化部分を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、ＣＤ２２標的化部分は、ＣＤ２２抗原の第１のＩｇ細胞外ドメイン（膜から最も遠いドメイン）に対して結合親和性を有し、具体的には配列番号１４に対して結合親和性を有し、より具体的には配列番号１５に対して結合親和性を有する。ＣＤ２２抗原の第１のＩｇ細胞外ドメイン（膜から最も遠いドメイン）、より具体的には配列番号１５に特異的に結合する結合分子は、上記障害、特にＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、より具体的にはＣＤ１９^－Ｂ－ＡＬＬの再発の診断および処置において特に有用または好適であると考えられる。

上記抗体を作製するためのファージディスプレイおよびコンビナトリアル法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、国際公開第９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら、国際公開第９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒら、国際公開第９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら、国際公開第９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、国際公開第９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開第９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄら、国際公開第９２／０９６９０号；Ｌａｄｎｅｒら、国際公開第９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０－１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１－８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５－７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９－８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６－３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３－１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３－４１３７；およびＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８－７９８２に記載されているように（これらのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる））。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２標的化部分は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはｓｃＦａｂであり、前記ＶＬドメインは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、前記ＶＨドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１は［ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ］（配列番号１）からなり、ＬＣＤＲ２は［ＬＶＳ］（配列番号２）からなり、ＬＣＤＲ３は［ＷＱＧＴＨＦＰＷＴ］（配列番号３）からなり、ＨＣＤＲ１は［ＧＤＳＩＴＳＧＹ］（配列番号４）からなり、ＨＣＤＲ２は［ＩＳＹＳＧＳＴ］（配列番号５）からなり、ＨＣＤＲ３は［ＡＲＹＰＳＰＤＡＭＮＹ］（配列番号６）からなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２標的化部分は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む、抗体、Ｆ（ＡＢ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはｓｃＦａｂであり、ＶＬドメインは配列番号７からなり、ＶＨドメインは配列番号８からなる。いくつかのさらなる実施形態では、ＣＤ２２標的化部分は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む、抗体、Ｆ（ＡＢ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはｓｃＦａｂであり、ＶＬドメインは配列番号２３からなり、ＶＨドメインは配列番号２２からなる。いくつかのさらなる実施形態では、ＣＤ２２標的化部分は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む、抗体、Ｆ（ＡＢ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはｓｃＦａｂであり、ＶＬドメインは配列番号２１からなり、ＶＨドメインは配列番号２０からなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２標的化部分は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであり、ＶＬドメインは配列番号７からなり、ＶＨドメインは配列番号８からなる。いくつかのさらなる実施形態では、ＣＤ２２標的化部分は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであり、ＶＬドメインは配列番号２３からなり、ＶＨドメインは配列番号２２からなる。いくつかのさらなる実施形態では、ＣＤ２２標的化部分は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであり、ＶＬドメインは配列番号２１からなり、ＶＨドメインは配列番号２０からなる。

ＶＬドメイン（配列番号７）
［ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳ ＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ］

ＶＨドメイン（配列番号８）
［ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＳＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＫＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＹＹＭＱＬＫＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＹＰＳＰＤＡＭＮＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ］

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２標的化部分は、配列番号９を含むかまたは配列番号９からなるｓｃＦｖである。

クローンｈＣＤ２２．７に由来するｓｃＦｖ（配列番号９）
［ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＳＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＫＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＹＹＭＱＬＫＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＹＰＳＰＤＡＭＮＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ］

本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、少なくとも、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４のα鎖、β鎖またはζ鎖の膜貫通領域（複数可）を含み得る。

膜貫通ドメインは、合成の膜貫通ドメインまたは天然に存在する膜貫通ドメインのバリアントであってもよい。いくつかの実施形態では、合成貫通ドメインまたはバリアントの膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通ドメイン、またはそのバリアントを含み、そのバリアントは９５％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通ドメイン、またはそのバリアントを含み、そのバリアントは９８％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４の膜貫通ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９５％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９８％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８の膜貫通ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１０、または配列番号１０に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１０、または配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは配列番号１０を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは配列番号１０からなる。

ＣＤ８由来の膜貫通ドメイン（配列番号１０）
［ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ］

別の好ましい実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の細胞内シグナリングドメインは、腫瘍細胞に発現されたリガンドに結合すると、ＣＡＲを発現する細胞の少なくとも１つの機能の活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、１つまたは複数の細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＡＲ含有細胞の少なくとも１つの機能の活性化をもたらす細胞内シグナリングドメインの一部分および／またはバリアントである。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｂの細胞内ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９５％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｂの細胞内ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９８％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ６６ｂの細胞内ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζの細胞内ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９５％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζの細胞内ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９８％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインはＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、配列番号１１、または配列番号１１に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、配列番号１１、または配列番号１１に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、配列番号１１、または配列番号１１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは配列番号１１を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナリングドメインは配列番号１１からなる。

ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナリングドメイン（配列番号１１）
［ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ］

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは共刺激シグナリングドメインをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（ヒト４－１ＢＢとしても公知）、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７６の細胞内ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９５％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（ヒト４－１ＢＢとしても公知）、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７６の細胞内ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９８％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＣＤ２７６の細胞内ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、ＣＤ１３７の細胞内ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９５％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、ＣＤ１３７の細胞内ドメインまたはそのバリアントを含み、そのバリアントは９８％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインはＣＤ１３７の細胞内ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、配列番号１２、または配列番号１２に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、配列番号１２、または配列番号１２に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは、配列番号１２、または配列番号１２に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは配列番号１２を含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナリングドメインは配列番号１２からなる。

ＣＤ１３７由来の共刺激シグナリングドメイン（配列番号１２）
［ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ］

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、前記ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、前記ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１からなり、ＬＣＤＲ２が配列番号２からなり、ＬＣＤＲ３が配列番号３からなり、ＨＣＤＲ１が配列番号４からなり、ＨＣＤＲ２が配列番号５からなり、ＨＣＤＲ３が配列番号６からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０、または配列番号１０に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１、または配列番号１１に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナリングドメイン；ならびに
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、前記ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、前記ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１からなり、ＬＣＤＲ２が配列番号２からなり、ＬＣＤＲ３が配列番号３からなり、ＨＣＤＲ１が配列番号４からなり、ＨＣＤＲ２が配列番号５からなり、ＨＣＤＲ３が配列番号６からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０、または配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１、または配列番号１１に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナリングドメイン；ならびに
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、前記ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、前記ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１からなり、ＬＣＤＲ２が配列番号２からなり、ＬＣＤＲ３が配列番号３からなり、ＨＣＤＲ１が配列番号４からなり、ＨＣＤＲ２が配列番号５からなり、ＨＣＤＲ３が配列番号６からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０、または配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１、または配列番号１１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナリングドメイン；ならびに
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、前記ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、前記ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１からなり、ＬＣＤＲ２が配列番号２からなり、ＬＣＤＲ３が配列番号３からなり、ＨＣＤＲ１が配列番号４からなり、ＨＣＤＲ２が配列番号５からなり、ＨＣＤＲ３が配列番号６からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１を含む細胞内シグナリングドメイン；ならびに
（ｉｖ）配列番号１２を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、前記ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、前記ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１からなり、ＬＣＤＲ２が配列番号２からなり、ＬＣＤＲ３が配列番号３からなり、ＨＣＤＲ１が配列番号４からなり、ＨＣＤＲ２が配列番号５からなり、ＨＣＤＲ３が配列番号６からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０からなる膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１からなる細胞内シグナリングドメイン；ならびに
（ｉｖ）配列番号１２からなる共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７からなり、ＶＨドメインが配列番号８からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０、または配列番号１０に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１、または配列番号１１に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナリングドメイン；ならびに
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号２３からなり、ＶＨドメインが配列番号２２からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０、または配列番号１０に対して９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１、または配列番号１１に対して９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナリングドメイン；および
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２に対して９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号２１からなり、ＶＨドメインが配列番号２０からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０、または配列番号１０に対して９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１、または配列番号１１に対して９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる細胞内シグナリングドメイン；および
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２に対して９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むかそれからなる共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７からなり、ＶＨドメインが配列番号８からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０、または配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１、または配列番号１１に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナリングドメイン；および
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７からなり、ＶＨドメインが配列番号８からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０、または配列番号１０に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１、または配列番号１１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナリングドメイン；および
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７からなり、ＶＨドメインが配列番号８からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０を含む膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１を含む細胞内シグナリングドメイン；および
（ｉｖ）配列番号１２を含む共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは以下を含む：
（ｉ）ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７からなり、ＶＨドメインが配列番号８からなる、ｓｃＦｖ；
（ｉｉ）配列番号１０からなる膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１１からなる細胞内シグナリングドメイン；および
（ｉｖ）配列番号１２からなる共刺激シグナリングドメイン。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３、または配列番号１３と９５％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３、または配列番号１３と９８％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３、または配列番号１３と９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは配列番号１３を含むかまたはそれからなる。

ＣＡＲの完全配列（配列番号１３）
［ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＳＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＫＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＹＹＭＱＬＫＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＹＰＳＰＤＡＭＮＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ］

いくつかのさらなる実施形態では、上記のＣＡＲのいずれかは、ＣＤ１９標的化部分または任意の他の標的化部分、例えばＣＤ２０標的化部分をさらに含んでもよい。特に、ＣＡＲは、好ましくは二重特異性ＣＤ２２／ＣＤ１９－ｂｉＣＡＲである。

本発明の第２の態様では、本発明は、上記に開示されるＣＡＲのいずれか１つを含む、本発明のＣＡＲのいずれか１つをコードする核酸を提供する。キメラ受容体をコードする核酸配列は、キメラ受容体をカスタマイズするために切除し、他の構成要素と置き換えることができるいくつかのモジュール構成要素を一緒に連結する。

いくつかの実施形態では、核酸は、細胞を形質導入または形質転換するのに適している。いくつかの実施形態では、核酸は、養子免疫療法に使用するためのＴ細胞を形質導入または形質転換するのに適している。

いくつかの実施形態では、核酸は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化方法は当技術分野で公知である（例えば、Ｐａｒｒｅｔら、２０１６．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．３９：１５５－１６２を参照）。

本発明の核酸は、Ｔ細胞を形質導入または形質転換するために使用され得るγ－レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターに含まれてもよい（Ｒｉｖｉｅｒｅ＆Ｓａｄｅｌａｉｎ、２０１７．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（５）：１１１７－１１２４を参照）。核酸はまた、ＤＮＡトランスポゾン、ＲＮＡトランスフェクション、またはＴＡＬＥＮ、ＺＦＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集技術の使用によって細胞に挿入されてもよい（Ｒｉｖｉｅｒｅ＆Ｓａｄｅｌａｉｎ、２０１７．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（５）：１１１７－１１２４を参照）。

本発明の第３の態様は、本発明の核酸および／または本発明のＣＡＲを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞（ＣＡＲＴと呼ばれる）である。

いくつかの実施形態では、細胞は、ナイーブＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞またはセントラルメモリーＴ細胞である。これらの細胞は適応免疫療法により適していると現在考えられている（Ｒｉｖｉｅｒｅ＆Ｓａｄｅｌａｉｎ、２０１７．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（５）：１１１７－１１２４を参照）。

いくつかの実施形態では、細胞は自家Ｔ細胞である。「自家細胞」という用語は、本発明の方法のいずれか１つを使用して処置されるその同じ患者から得られる細胞を指す。

いくつかの実施形態では、細胞はアロ寛容Ｔ細胞である。「全寛容細胞」という用語は、移植片対宿主病応答のリスクを低下させるように操作された細胞を指す。いくつかの実施形態では、これは、ＴＣＲおよび／またはβ２－ミクログロブリンのゲノム編集媒介の欠失によって達成される^{１５、１９}。アロ寛容細胞は当技術分野で公知である（Ｒｉｖｉｅｒｅ＆Ｓａｄｅｌａｉｎ、２０１７．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（５）：１１１７－１１２４における同種異系Ｔ細胞のセクションを参照）。

いくつかのさらなる実施形態では、細胞は、ＣＤ１９標的化部分を含むＣＡＲをさらに含んでもよい。好ましくは、ＣＡＲは、好ましくは二重特異性ＣＤ２２／ＣＤ１９－ｂｉＣＡＲである。

本発明の第４の態様は、本発明で定義されるＣＤ２２標的化部分および／または本発明の複数の細胞、および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

本明細書に記載の医薬組成物はまた、他の物質を含有してもよい。これらの物質には、凍結保護剤、界面活性剤、抗酸化剤、および安定化剤が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「凍結保護剤」という用語は、凍結誘発ストレスに対してＣＡＲＴに安定性をもたらす薬剤を含む。凍結保護剤の非限定的な例としては、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノースおよびラクトースなどの糖；デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンおよびポリエチレングリコールなどのポリマー；ポリソルベート（例えば、ＰＳ－２０またはＰＳ－８０）などの界面活性剤；ならびにグリシン、アルギニン、ロイシンおよびセリンなどのアミノ酸が挙げられる。生体系において低い毒性を示す凍結保護剤が、一般的に使用される。

いくつかの実施形態では、細胞は、最初にそれらをそれらの培養培地から採取し、次いで、洗浄し、投与に適した媒体および容器系（「薬学的に許容される」担体）中、治療有効量で細胞を濃縮することによって製剤化される。適切な注入媒体は、任意の等張性媒体製剤、典型的には生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であり得るが、水中の５％デキストロースまたは乳酸リンゲルも利用することができる。注入媒体は、ヒト血清アルブミン、ウシ胎児血清または他のヒト血清構成要素を補充することができる。

一態様では、本発明は、医薬として使用するための、本発明による細胞または本発明による医薬組成物を提供する。

本発明の第５の態様は、本発明の細胞または本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＣＤ２２陽性がん（好ましくはＣＤ２２陽性がんがＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）であり、より具体的にはＣＤ１９^－Ｂ－ＡＬＬの再発である）を処置する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、患者には、治療有効量の細胞が投与される。いくつかの実施形態では、患者には、少なくとも１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９個または１０^１０個の細胞が投与される。細胞の数は、その中に含まれる細胞の種類と同様に、意図される組成物の最終用途に依存し得る。例えば、特定の抗原に特異的な細胞が望まれる場合、集団は、７０％超、一般に８０％超、８５％および９０～９５％のそのような細胞を含む。本明細書で提供される使用の場合、細胞は、一般に、１リットルまたはそれ以下の体積であり、５００ｍｌ以下、さらには２５０ｍｌ以下、または１００ｍｌ以下であり得る。臨床的に重要な数の細胞は、累積的に１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９個または１０^１０個の細胞に等しいかまたはそれを超える複数の注入に配分することができる。

いくつかの実施形態では、細胞または医薬組成物は、静脈内、腹腔内、骨髄内、リンパ節内、および／または脳脊髄液内に投与される。

いくつかの実施形態では、方法は併用療法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞をさらに投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞または医薬組成物は、化学療法剤および／または免疫抑制剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、患者は、最初に、他の免疫細胞を阻害または破壊する化学療法剤で処置され、続いて本明細書に記載の細胞または医薬組成物で処置される。いくつかの場合では、化学療法は完全に回避されてもよい。

いくつかの実施形態では、本発明の方法で処置される患者は、別の療法による処置後に完全またはほぼ完全な寛解にある。いくつかの実施形態では、本発明の方法で処置される患者は、部分奏効、完全奏効、安定疾患、進行疾患の減少、腫瘍進行までの時間の短縮またはそれらの任意の組合せをもたらした別の療法で以前に処置されている。

以下の実施例は、本発明を例示するにすぎず、本発明を限定するものではない。

実施例１．
材料および方法
ＣＤ２２一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の作製

ヒトＣＤ２２に反応性なＭｏＡｂを、ＮＳ－１骨髄腫細胞と、３０×１０^６個のＣＤ２２トランスフェクトされた３００．１９細胞で予め３回免疫したＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾細胞との融合によって作製した。ハイブリドーマ含有ウェルからの上清を、ＣＤ２２トランスフェクトされた３００．１９細胞に反応性なｍｏＡｂについて、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。３つの反応性ハイブリドーマをさらなる特徴付けのために選択し、限界希釈によってサブクローニングした（クローンｈＣＤ２２．７、ｈＣＤ２２．３１６およびｈＣＤ２２．４０１）。３つの抗体は、マウスｍｏＡｂアイソタイピングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定したところ、ＩｇＧ１κアイソタイプのものであった。抗体特異性を、ＣＤ２２トランスフェクトされたＣＯＳ細胞株（ｐＵＮＯ１－ｈＣＤ２２；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、細胞株Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、ＰＲＭＩ８２２２９、Ｕ２６６およびＪｕｒｋａｔ、ならびに末梢血（ＰＢ）単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用してさらに検証した。ｈＣＤ２２．７クローンに結合するＣＤ２２エピトープを、ＣＤ２２のＮ末端ドメインに対する抗体（Ｓ－ＨＣＬ－１）によるクロスブロックによって決定した。マウスＩｇＧライブラリープライマーセット（Ｐｒｏｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ｈＣＤ２２．７クローン由来のＣＤ２２特異的ｓｃＦｖを得た。
ＣＡＲ設計およびベクター、レンチウイルス産生およびＴ細胞形質導入

ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖを、ヒトＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ヒト４－１ＢＢおよびＣＤ３ζエンドドメイン（第２世代ＣＡＲ）、ならびにＴ２Ａ－ＧＦＰカセットを含むｐＣＣＬレンチウイルスベースの骨格にクローニングした。Ｈｉｓタグに連結されたＣＤ８ ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζドメインを有する同一のレンチウイルスベクターを、モック細胞内（モック－ＩＣ）対照として使用した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を使用して、ｐＣＣＬベクターおよびパッケージングプラスミドＶＳＶ－ＧおよびｐｓＰＡＸ２でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクションすることによって、ＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化されたＣＡＲ発現ウイルス粒子を作製した。上清を、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に回収し、超遠心分離によって濃縮した。

Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）によって健常ボランティアのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。バフィーコートは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの承認（ＨＣＢ／２０１８／００３０）を受けて、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋから得た。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で２日間プレートコーティングすることによって活性化し、インターロイキン－７（ＩＬ７）およびＩＬ１５（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、１０の感染多重度においてＣＡＲ発現レンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにＩＬ７およびＩＬ１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で最大１０日間増殖させた。ＣＤ２２－ＣＡＲの表面発現を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって追跡した。
細胞株

ＳＥＭ、ＮＡＬＭ６、ＭＶ４－１１およびＲＥＨ細胞株を、ＤＳＭＺ細胞株バンク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＣＤ１９－ノックアウト（ＫＯ）およびＣＤ２２－ＫＯ ＳＥＭ細胞を、ＣＲＩＳＰＲ媒介のゲノム編集によって作製した。簡単に説明すると、２００，０００個の細胞にＣａｓ９タンパク質／ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）でエレクトロポレート（Ｎｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）した。各遺伝子について２つのガイドを設計した：ＣＤ１９－エクソン２．１、ＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＣＡＴＧおよびＣＤ１９－エクソン１４．１、ＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＣＧＡＴ；ならびにＣＤ２２－エクソン３．２、ＴＣＡＡＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧおよびＣＤ２２－エクソン９、ＣＡＧＧＴＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＡＣＧＧＧ。エレクトロポレーション後、細胞を回収し、次いで、ＣＤ１９^－またはＣＤ２２^－細胞をＦＡＣＳ選別した（純度＞９９％）。
インビトロ細胞傷害性アッセイおよびサイトカイン放出の判定

標的細胞（細胞株または初代Ｂ－ＡＬＬ細胞；１００，０００標的細胞／９６ウェルプレートのウェル）を、ＣＤ２２－ＣＡＲまたはモック－ＩＣ Ｔ細胞と共に、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で指し示された期間インキュベートした。細胞株を、ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳおよびペニシリン－ストレプトマイシン中で培養した。初代細胞を、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）、２０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｈＦＬＴ３Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｈＩＬ３（１０ｎｇ／ｍＬ）およびｈＩＬ７（１０ｎｇ／ｍＬ）（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ製）中で培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞媒介の細胞傷害性を、各時点およびＥ：Ｔ比での残存する生存（７－アミノアクチノマイシンＤ^－；７－ＡＡＤ^－）標的細胞を分析することによって決定した。絶対細胞の計数のために、ＢＤ ＴｒｕＣｏｕｎｔ（商標）絶対数チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。炎症促進性サイトカインＩＬ２、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの定量を、１：１のＥ：Ｔ比を使用して、Ｔ細胞曝露後２４時間（細胞株）および４８時間（初代細胞）に採取した上清において、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＥＬＩＳＡによって測定した。
フローサイトメトリー

ＣＤ２２－ＣＡＲの細胞表面発現を、ＧＦＰ発現、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）への結合、および抗Ｈｉｓ－ＡＰＣ（Ｊ０９５Ｇ４６；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって、ヒト組換えＣＤ２２－Ｈｉｓ（ｒＣＤ２２－Ｈｉｓ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との事前のインキュベーション後に確認した。形質導入されたＴ細胞の活性化を、ＰＢＭＣのプレーティングの４８時間後に、ＣＤ３－ＰＥ（ＵＣＨＴ１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５－ＡＰＣ（Ｍ－Ａ２５１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ６９－ＶｉｏＢｌｕｅ（ＲＥＡ８２４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた表面染色によって確認した。Ｔ細胞および標的細胞を、以下のヒト抗体を使用するインビトロアッセイで同定した：ＣＤ３－ＰＥ（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ２２－ＡＰＣ（ＨＩＢ２２）、ＣＤ１９－ＢＶ４２１（ＨＩＢ１９）およびＣＤ１０－ＰＥＣｙ７（ＨＩ１０ａ）またはＣＤ１３－ＰＥＣｙ７（ＷＭ１５）（ＳＥＭ細胞株用）もしくはＣＤ３３－ＡＰＣ（ＷＭ５３）（ＭＶ４－１１細胞株用）（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。死細胞を７ＡＡＤ染色によって廃棄した。マウスＰＢ、骨髄（ＢＭ）および脾臓から回収した細胞を、ＨＬＡ－ＡＢＣ－ＰＥ（Ｇ４６－２．６）、ＣＤ４５－ＢＶ５１０（ＨＩ３０）、ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ（ＳＫ７）、ＣＤ２２－ＡＰＣ、ＣＤ１９－ＢＶ４２１およびＣＤ１０－ＰＥＣｙ７（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）で染色した。細胞を３０分間インキュベートし、次いで溶解し、ＢＤ ＦＡＣＳ（商標）溶解溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照を使用してゲートを設定した。ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを備えたＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）－ＩＩフローサイトメーターを分析に使用した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
Ｂ－ＡＬＬおよびＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ異種移植モデル

１２週齢の非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を繁殖させ、病原体フリーの条件下で飼育した。すべてのインビボ手順は、地域倫理委員会（ＨＲＨ－１７－００２９－Ｐ１）によって承認された。合計で０．５～１．５×１０^６個のＰＤＸ Ｂ－ＡＬＬ細胞を、亜致死的に照射（２Ｇｙ）されたＮＳＧマウスにＢＭ内移植し、続いて２週間後に４×１０^６個のＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞（平均形質導入約５１．３％）またはモック－ＩＣ Ｔ細胞（平均形質導入約５４．２％）を静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。Ｂ－ＡＬＬの生着を、ＰＢにおいて１週間ごとにモニターした。ＢＭ吸引物を、脾臓と共に、移植の６週間後および屠殺時に分析した。赤血球（ＲＢＣ）計数は、血球計２８００ＶＥＴ Ｖ－Ｓｉｇｈｔ（Ａ．Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｄａｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）で決定した。
統計解析

すべてのデータを平均±ＳＥＭとして表す。群間の差異は、特に異なって記載しない限り、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して評価した。すべての分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて行った。
結果
ＣＤ２２．７－ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビトロでＢ－ＡＬＬ細胞を効率的に排除する

本発明者らの新規抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ（クローンｈＣＤ２２．７）を、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通スペーサー、ならびにＴ２Ａ配列を介してＧＦＰとインフレームでカップリングされた、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζ由来の細胞内シグナリングドメインからなる第二世代ＣＡＲ構築物にクローニングした（図１ａ）。

ｈＣＤ２２．７ ｍｏＡｂによって認識されるＣＤ２２のドメインを同定するために、本発明者らは、ＣＤ２２の最も遠位のＩｇ細胞外ドメイン１に結合することが公知な抗ＣＤ２２クローンＨ－ＳＣＬ－１（Ｅｎｇｅｌ Ｐ、Ｗａｇｎｅｒ Ｎ、Ｍｉｌｌｅｒ ＡＳ、Ｔｅｄｄｅｒ ＴＦ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＣＤ２２，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｕｎｉｑｕｅｌｙ ｂｉｎｄｓ ａ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｉｇａｎｄ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９５；１８１（４）：１５８１－６）を用いてクロスブロッキングアッセイを行った。抗体ｈＣＤ２２．７とプレインキュベートした細胞では、標識されたＨ－ＳＣＬ－１クローンの結合が妨げられ、ＣＤ２２の最も遠位のＩｇドメインに対する両ｍｏＡｂの重複結合を指し示した（図１ｂ）。健常なヒトＴ細胞を、２０～５０％の形質導入効率にてＣＤ２２－ＣＡＲおよびモック－ＩＣレンチベクターの両方で首尾よく形質導入した。Ｔ細胞におけるＣＤ２２－ＣＡＲの発現を、ｓｃＦｖおよびＧＦＰの同時検出によって、ならびにヒトｒＣＤ２２－Ｈｉｓとのインキュベーションで抗Ｈｉｓ ｍｏＡｂを使用することによって確認した（図１ｃ）。重要なことに、活性化（ＣＤ６９^＋ＣＤ２５^＋）ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞（図１ｄ）は、モック－ＩＣ Ｔ細胞（図１ｅ）と同様に、１５日の期間にわたって１００倍を超えて連続的に増殖し、ＣＡＲ発現がＴ細胞増殖を妨げないことを実証した。

次いで、３人の異なる健常ドナー由来のＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞を、増加するＥ：Ｔ比で、Ｂ－ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６、ＳＥＭおよびＲＥＨ、ならびに陰性対照としてのＡＭＬ細胞株ＭＶ４－１１に対する細胞傷害性アッセイにおいてインビトロで機能的に試験した（図２ａ）。ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞曝露後に生存している標的細胞を、７ＡＡＤ^－ＣＤ３^－ＣＤ１９^＋ＣＤ１０^＋（またはＳＥＭ細胞株の場合はＣＤ１３^＋、ＭＶ４－１１細胞株の場合は７ＡＡＤ^－ＣＤ３^－ＣＤ３３^＋）として同定した（図２ｂ）。モック－ＩＣ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、比較的低いＥ：Ｔ比依存的様式でＣＤ２２^＋Ｂ－ＡＬＬ細胞を特異的に排除した（図２ｃ）。ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介のＣＤ１９－ＫＯおよびＣＤ２２－ＫＯ ＳＥＭ細胞を使用してさらに実証した（図２ｄ）。

重要なことに、Ｂ－ＡＬＬ細胞は、１：１のＥ：Ｔ比での４８時間絶対数アッセイにおいて、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞への曝露に対してかろうじて生き残った（図２ｅ）。ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞との共培養後に高レベルの炎症促進性サイトカインＩＬ２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγを産生し、それらの細胞傷害性を確認した（図２ｆ）。
ＣＤ２２の発現レベルは、Ｂ－ＡＬＬ初代細胞を死滅させる際のＣＤ２２．７－ＣＡＲ Ｔ細胞の効率に影響を及ぼす

ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞療法後の寛解は短く、ＣＤ２２の発現低下に関連する一方、ＣＤ２２の高発現がＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞の活性に好ましいという報告がある。さらに、ＣＤ２２^{－／ｄｉｍ} Ｂ－ＡＬＬの再発がＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞処置後に一般的であるかどうかについては議論がある。この情報を考慮して、本発明者らは次に、ＣＤ２２の変化した発現レベルを有する９つの初代Ｂ－ＡＬＬ試料において、インビトロで本発明者らのＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞の効力を試験した。平均値（ＭＦＩ＝６７５２）を上回るまたは下回るＣＤ２２の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）レベルを使用して、初代Ｂ－ＡＬＬをＣＤ２２^ｈｉｇｈまたはＣＤ２２^ｌｏｗとして分類した（図３ａ）。

細胞傷害性を、ＣＤ２２－ＣＡＲ／モック－ＩＣ Ｔ細胞への２４時間および４８時間の曝露後に測定した。全体として、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、初代Ｂ－ＡＬＬ芽球を有意に排除した（図３ｂ）。しかしながら、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞曝露ウィンドウ全体にわたって一貫してＣＤ２２^ｈｉｇｈ Ｂ－ＡＬＬ芽球（ｎ＝３）を排除したが（図３ｂ、左のパネル）、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞媒介のＣＤ２２^ｌｏｗ Ｂ－ＡＬＬ芽球（ｎ＝６）の死滅は、有意ではあるが、それほど堅固ではなく、ＡＬＬ＃７を除いて、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞への曝露の最初または最後の２４時間のいずれかの間に排他的に起こった（図３ｂ、右のパネル）。それにもかかわらず、炎症促進性サイトカインＩＬ２、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの同様の堅固な産生が、ＣＤ２２^ｈｉｇｈおよびＣＤ２２^ｌｏｗの両方のＢ－ＡＬＬ芽球に対して観察され（図３ｃ）、本発明者らのＣＤ２２．７－ＣＡＲ Ｔ細胞によるＢ－ＡＬＬ初代細胞の効率的な認識および死滅を確認した。
膜遠位ＣＤ２２エピトープ指向ＣＡＲ Ｔ細胞は、臨床的に重要な患者由来の異種移植片においてインビボでＢ－ＡＬＬ芽球を効率的に排除する

次に、本発明者らは、ＣＤ２２^ｈｉｇｈ（ＡＬＬ＃１およびＡＬＬ＃２）およびＣＤ２２^ｌｏｗ（ＡＬＬ＃１０）ＰＤＸ Ｂ－ＡＬＬ試料の両方を使用して、インビボで本発明者らのＣＤ２２－ＣＡＲの活性を評価した（図４）。ＮＳＧマウスに、０．５～１．５×１０^６個の初代ＣＤ２２^＋Ｂ－ＡＬＬ芽球をＢＭ内移植し、続いて２週間後に４×１０^６個のＣＤ２２－ＣＡＲ／モック－ＩＣ Ｔ細胞を注入した。白血病の生着およびＴ細胞の持続性を、ＰＢにおいてＦＡＣＳによって隔週でモニターし、いずれかの動物が明白な疾患の徴候を発症した場合、屠殺時にＢＭおよび脾臓で分析した（図４ａ～図４ｂ）。移植後４～２０週の間の検出可能な白血病再構成（アグレッシブさ）の動態は各ＰＤＸに固有であり、ＣＤ２２^ｈｉｇｈおよびＣＤ２２^ｌｏｗ ＰＤＸの両方の生着は、モック－ＩＣ Ｔ細胞処置マウスにおいて経時的に徐々に増加する傾向があった（図４ｃ）。しかしながら、重要なことに、ＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｂ－ＡＬＬ細胞の成長を完全に消失させた（ＡＬＬ＃１およびＡＬＬ＃１０）か、または大きく制御した（ＡＬＬ＃２）（図４ｃ、上のパネル）。各ＰＤＸの再構成動態に適合したＴ細胞の持続性が、ＣＡＲ Ｔ細胞注入の２６週間後でさえも、３つすべてのＰＤＸにおいて検出された（範囲、第６週（ｎ＝１５）～第２６週（ｎ＝５）：モック－ＩＣ群２．３８％±０．６５～０．３４％±０．３４；ＣＡＲ Ｔ細胞群２．７９％±１．１３～０．１４％±０．０９）（図４ｃ、下のパネル）。腫瘍負荷のＦＡＣＳ定量（図４ｄ）、脾腫の欠如（図４ｅ）、および造血置換の徴候（図４ｆ）を通して、同側（注射された脛骨）および対側（大腿骨および非注射脛骨の両方）のＢＭ、ＰＢ、および脾臓において屠殺時に疾患制御をさらに確認した。重要なことに、屠殺時の持続性白血病細胞はＣＤ２２の完全な発現を維持し、抗原喪失による免疫回避を除外した（図４ｇ）。

最後に、自家Ｔ細胞において発現されるマウスまたはヒト起源のいずれかの操作されたｓｃＦｖは、それに由来するペプチドが適応免疫系によって「非自己」抗原として認識され得るので、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）上に提示される場合、免疫原性であり得る。したがって、本発明者らは、最も代表的なＨＬＡスーパータイプに結合するペプチドの親和性を予測するインシリコツールＮｅｔＭＨＣ４．０を使用して、本発明者らのｈＣＤ２２．７－ｓｃＦｖの免疫原性能力を、ｍ９７１およびＨＡ２２クローンの免疫原性能力と並べて比較した。図５に示されるように、本発明者らは、ｈＣＤ２２．７、ｍ９７１およびＨＡ２２それぞれについて、非常に類似した数の合計（２９、２３、２６）および強い（８、９および６）結合９量体ペプチドを見出した。まとめると、提示されたデータは、別様にアグレッシブな初代Ｂ－ＡＬＬ ＰＤＸの白血病成長の制御において、膜遠位エピトープを標的とするこの新規４－１ＢＢベースのＣＤ２２－ＣＡＲの高い性能を指し示している。
実施例２．イノツズマブおよびＣＤ２２に対する新規抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ（クローンｈＣＤ２２．７）のエピトープのマッピング。

ＣＤ２２の配列を、それぞれ６、９および１２個のアミノ酸のペプチド－ペプチド重複を有する７、１０および１３個のアミノ酸ペプチドに翻訳した。得られたＣＤ２２ペプチドの立体配座マイクロアレイは、二連でプリントされた２，５５６個の異なるペプチドを含み、さらなる対照ペプチドによってフレーム化された。インキュベーション緩衝液中、１０μｇ／ｍｌおよび６５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧ４抗体イノツズマブを用いたＣＤ２２ペプチドマイクロアレイのインキュベーションに続いて、二次抗体および対照抗体で染色し、ならびに７／７（赤色／緑色）のスキャン強度でＬＩ ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いてマイクロアレイを読み取った。

スポット強度の定量は、ＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。強度マップを作製し、ペプチドマップにおいて相互作用を強調した。図１１および図１２に指し示されるように、検出されたイノツズマブのエピトープ（青色）は、ｈＣＤ２２．７（赤色）に対して同定されたものに隣接する露出領域に一致する。イノツズマブのエピトープは、ｈＣＤ２２．７によって認識されるものよりもわずかに延びており、主に酸／塩基性残基から構成される。さらに、図１３では、ＣＤ２２イノツズマブｓｃＦｖおよびＣＤ２２ ｈＣＤ２２．７ ｓｃＦｖ複合体の構造モデルが示されている。ｈＣＤ２２．７の場合、構造は、ＣＤ２２の同定された結合エピトープ（赤色）ならびにｈＣＤ２２．７ ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の配列（それぞれ青色およびピンク色）に基づいて予測される。イノツズマブの場合、構造は、ＣＤ２２の同定された結合エピトープ（青色）ならびにイノツズマブｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の配列（それぞれ黄色および緑色）に基づいて予測される。

異なるバイオインフォマティクス分析は、Ｋｃａｌ／ｍｏｌでの予測結合エネルギーが、ｈＣＤ２２．７がイノツズマブよりも好ましい結合エネルギーを有することを示すことを指し示す。さらに、ｈＣＤ２２．７の接触面はイノツズマブよりも小さいが、エネルギーはより良好である。
実施例３．Ｂ細胞白血病細胞株ＮＡＬＭ６を用いた実験
材料および方法

－ＣＡＲベクター、レンチウイルス産生およびＴ細胞形質導入

次のＣＤ２２ ｓｃＦｖを、ＣＡＲカセット（ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζエンドドメインならびにＴ２Ａ－ＧＦＰ）の上流のｐＣＣＬレンチウイルスベクターにクローニングした：ＣＤ２２．７、ｇ５／４４（特許ＷＯ２０１７２１６５６１）、Ｍ９７１（Ｔ．Ｊ．Ｆｒｙら；Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１８、第２４巻、第１号、２０－２８頁）。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して、ｐＣＣＬベクターおよびパッケージングプラスミドＶＳＶ－Ｇ、ｐＭＤＬ／ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－ＲｅｖでＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞をコトランスフェクションすることによって、ＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化されたＣＡＲ発現ウイルス粒子を作製した。上清を、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に回収し、超遠心分離によって濃縮した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）によって健常ボランティアのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）で２日間プレートコーティングすることによって活性化し、インターロイキン７（ＩＬ－７）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、１０の感染多重度においてＣＡＲ発現レンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにＩＬ－７およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で最大１０日間増殖させた。ＣＤ２２－ＣＡＲの発現を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によりＧＦＰ陽性細胞を決定することによって追跡した。典型的な実験では、形質導入効率は３０～７０％で変動し得る。同じパーセンテージの感染（ＧＦＰ陽性）した細胞をすべてのインビトロおよびインビボ実験で使用し、必要に応じて形質導入されていない細胞（ＵＴ）で釣り合わせた。形質導入された細胞の最小パーセンテージは３０％であった。ＣＤ２２－ＣＡＲの細胞表面発現を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ならびにヒト組換えＣＤ２２－Ｈｉｓ（ｒＣＤ２２－Ｈｉｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および抗Ｈｉｓ－ＡＰＣ（Ｊ０９５Ｇ４６；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）への結合によって確認した。形質導入されたＴ細胞の活性化を、ＰＢＭＣのプレーティングの４８時間後に、ＣＤ３－ＰＥ（ＵＣＨＴ１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５－ＡＰＣ（Ｍ－Ａ２５１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ６９－ＶｉｏＢｌｕｅ（ＲＥＡ８２４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた表面染色によって確認した。

－インビトロ細胞傷害性アッセイ、サイトカイン放出の判定およびインビボ異種移植モデル

細胞ＮＡＬＭ６をＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ＤＳＭＺの推奨に従って増殖させた。標的細胞を、異なるＣＡＲ２２またはモックＴ細胞と共に、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、指し示された期間（２４および４８時間）インキュベートした。各時点での残存生存（７－ＡＡＤ－）標的細胞およびＥ：Ｔ比を分析することによって、ＣＡＲＴ媒介の細胞傷害性を決定した。標的細胞（１×１０^５個）を、すべての細胞傷害性アッセイに使用した。Ｔ細胞および標的細胞を、以下のヒト抗体を使用したフローサイトメトリーによるインビトロアッセイで同定した：ＣＤ３－ＰＥ（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ２２－ＡＰＣ（ＨＩＢ２２）、ＣＤ１９－ＢＶ４２１（ＨＩＢ１９）およびＣＤ１０－ＰＥＣｙ７（ＨＩ１０ａ）。炎症促進性サイトカインＩＬ－２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の産生を、Ｔ細胞曝露の２４～４８時間後に採取したインビトロでの上清を使用してＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ ＳＥＴ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって評価した。

インビボ実験の実験的設計（異種移植モデル）を以下のように行った。健常ＰＢＭＣ由来の５×１０^６個のＣＤ２２－ＣＡＲＴの静脈内注入（ＩＶ）の３日前、ＮＳＧマウス（８～１２週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｎ＝４群）に、１×１０^５個のＬｕｃ－ＧＦＰ（ＮＡＬＭ６）細胞を脛骨内移植（ＩＴ）した。腫瘍負荷を、Ｘｅｎｏｇｅｎインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）５０イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した生物発光（ＢＬＩ）によって、指し示された時点でモニターした。モック処置された動物が完全に白血病性である場合、動物を安楽死させ、白血病負荷およびＣＡＲＴ持続性についてＦＡＣＳを使用することによって分析した。骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）および脾臓を屠殺時にヒトキメラ現象についてＦＡＣＳ分析した。細胞を、リンパ系細胞に対する抗ＨＬＡ．ＡＢＣ－ＰＥ、ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ１０－ＰＥＣｙ７、ＣＤ４５－ＡｍＣｙａｎおよびＣＤ１９－ＢＶ４２１で染色した（図１５を参照）。
結果

図１４は、細胞傷害性アッセイを示す。図１４Ａ）では、指し示された数（Ｅ：Ｔ比１／１、１／２、１／４および１／８）で１×１０^５個のＮＡＬＭ６細胞をＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞と２４～４８時間インキュベーション後の生存標的ＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋）およびＪｕｒｋａｔ（対照として）細胞のパーセンテージを指し示している。結果を、モックデータ（ｎ＝３の健常ドナーおよび２つの独立した実験からのＰＢＭＣを用いたデータ）に関して正規化した。さらに、図１４Ｂ）では、ＮＡＬＭ６細胞への２４～４８時間の曝露後の異なるＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインの分泌を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果が示されている。データを平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝３の健常ドナー）。さらに、異種移植モデルを使用したインビボ実験から得られた結果を図１６～図１８に示す。

図１４Ａ）に示されるように、１×１０^５個のＮＡＬＭ６細胞をＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞と１／１および１／２のＥ：Ｔ比で２４～４８時間インキュベーション後、生存標的ＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋）細胞のパーセンテージは、ＣＤ２２．７（１／１の比、２４および４８時間で、それぞれ３７対１２％の生存細胞）およびＣＤ２２－Ｍ９７１（ゴールドスタンダード）（１／１の比、２４および４８時間で、それぞれ５５対２７％の生存細胞）について同様に減少したが、ＣＤ２２－Ｇ５／４４を使用することによって得られた生存標的ＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋）細胞のパーセンテージは、ＣＤ２２．７またはＣＤ２２－Ｍ９７１のいずれかで得られたパーセンテージよりも著しく高かった。対照として、Ｊｕｒｋａｔ細胞の生存度は、使用したＣＡＲＴ細胞のいずれによっても有意には影響されなかった（図１４Ａ）。図１４Ｂに示されるように、炎症促進性サイトカインの放出は、ＣＤ２２－Ｍ９７１またはＣＤ２２－Ｇ５／４４を用いた場合よりもＣＤ２２．７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在下において高かった。図１６に示されるように、指し示された時点でＢＬＩによってモニターされた腫瘍負荷は、ＣＤ２２．７またはＣＤ２２－Ｍ９７１のいずれかを使用することによって得られた腫瘍負荷と比較して、ＣＤ２２－Ｇ５／４４の場合に著しく高かった。最後に、図１７に示されるように、末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）および脾臓における屠殺時の白血病負荷は、ＣＤ２２．７またはＣＤ２２－Ｍ９７１のいずれかを使用することによって得られる白血病負荷と比較して、ＣＤ２２－Ｇ５／４４の場合に著しく高かった。

これらの結果は、インビトロ（シトキシティ（ｃｉｔｏｘｉｃｉｔｙ））およびインビボモデル（異種移植モデル）において、ＣＤ２２．７がＣＤ２２－Ｇ５／４４よりも顕著に有効であろうことを明確に示す。したがって、結果はまた、炎症促進性サイトカインの放出がＣＤ２２．７の存在下でより高いことを示す。
実施例４．急性リンパ芽球性白血病細胞株ＳＥＭ（ＣＤ２２陽性）を用いた実験
材料および方法

－ＣＡＲベクター、レンチウイルス産生およびＴ細胞形質導入

ｐＣＣＬベクター、レンチウイルス粒子の産生およびＴ細胞の形質導入法は、実施例３に記載したものと同じであった。

－インビトロ細胞傷害性アッセイ、サイトカイン放出の判定およびインビボ異種移植モデル

細胞ＳＥＭをＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ＤＳＭＺの推奨に従って増殖させた。標的細胞を、異なるＣＡＲ２２またはモックＴ細胞と共に、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、指し示された期間（２４および４８時間）インキュベートした。各時点での残存生存（７－ＡＡＤ－）標的細胞およびＥ：Ｔ比を分析することによって、ＣＡＲＴ媒介の細胞傷害性を決定した。標的細胞（１×１０^５個）を、すべての細胞傷害性アッセイに使用した。Ｔ細胞および標的細胞を、以下のヒト抗体を使用したフローサイトメトリーによるインビトロアッセイで同定した：ＣＤ３－ＰＥ（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ２２－ＡＰＣ（ＨＩＢ２２）、ＣＤ１９－ＢＶ４２１（ＨＩＢ１９）およびＣＤ１３－ＰＥＣｙ７（ＷＭ１５）（図１９Ａを参照）。炎症促進性サイトカインＩＬ－２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の産生を、Ｔ細胞曝露の２４～４８時間後に採取したインビトロでの上清を使用してＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ ＳＥＴ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって評価した（図１９Ｂを参照）。

インビボ実験の実験的設計（異種移植モデル）を以下のように行った。健常ＰＢＭＣ由来の５×１０^６個のＣＤ２２－ＣＡＲＴの静脈内注入（ＩＶ）の３日前、ＮＳＧマウス（８～１２週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｎ＝４群）に、１×１０^５個のＬｕｃ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＳＥＭ）細胞を脛骨内移植（ＩＴ）した。腫瘍負荷を、Ｘｅｎｏｇｅｎインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）５０イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した生物発光（ＢＬＩ）によって、指し示された時点でモニターした。モック処置された動物が完全に白血病性である場合、動物を安楽死させ、白血病負荷およびＣＡＲＴ持続性についてＦＡＣＳを使用することによって分析した。骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）および脾臓を屠殺時にヒトキメラ現象についてＦＡＣＳ分析した。細胞を、リンパ系細胞に対する抗ＨＬＡ．ＡＢＣ－ＰＥ、ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４５－ＡｍＣｙａｎ、およびＣＤ１９－ＢＶ４２１で染色した（図２０を参照）。
結果

指し示された時間で、標的細胞（Ｔ）として１×１０^５個のＳＥＭ ＷＴ細胞（左）およびＣＤ２２に対するＫＯ ＳＥＭ細胞（ＣＤ２２ＫＯ）を用いた細胞傷害性アッセイ（Ａ）を行った、インビトロでの結果を図１９に示す。図１９Ｂ）では、ＳＥＭ ＷＴ細胞またはＣＤ２２ ＫＯ細胞への２４～４８時間の曝露後の異なるＣＤ２２－ＣＡＲ Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインの分泌を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果が示されている。インビボでの結果を図２０～図２３に示す。

図１９Ａ）に示されるように、２４～４８時間後、ＣＤ２２ ＫＯ細胞ではなく生存標的ＳＥＭ ＷＴ細胞のパーセンテージは、ＣＤ２２．７およびＣＤ２２－Ｍ９７１（ゴールドスタンダード）の存在下で同様に減少し、ＣＤ２２－Ｇ５／４４を使用することによって得られた生存標的ＳＥＭ ＷＴ細胞のパーセンテージは、特に１：４および１：８の比で、ＣＤ２２．７またはＣＤ２２－Ｍ９７１のいずれかで得られたパーセンテージよりも著しく高かった（ＳＥＭ ＷＴ細胞の結果（左）を参照）。これによれば、図１９Ｂに示されるように、炎症促進性サイトカインの放出は、ＣＤ２２．７またはＣＤ２２－Ｍ９７１によって強くかつ同様に誘導された。図２０に示されるように、指し示された時点でＢＬＩによってモニターされた腫瘍負荷は、ＣＤ２２．７またはＣＤ２２－Ｍ９７１のいずれかを使用することによって得られた腫瘍負荷と比較して、ＣＤ２２－Ｇ５／４４の場合に著しく高かった。さらに、図２１に示されるように、末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）および脾臓における屠殺時の白血病負荷は、ＣＤ２２．７またはＣＤ２２－Ｍ９７１のいずれかを使用することによって得られる白血病負荷と比較して、ＣＤ２２－Ｇ５／４４の場合に著しく高かった。
実施例５．新規抗ＣＤ２２（クローンｈＣＤ２２．７）のｓｃＦｖのヒト化

ヒト化のために、２つの異なるアプローチを使用した：
１．配列ベースの（および構造アシストの）ＣＤＲグラフティング；および
２．「脱マウス化（Ｄｅ－ｍｕｒｉｎｅｎｉｚａｔｉｏｎ）」。

配列ベースの（および構造アシストの）ＣＤＲグラフティングは、厳密に言えば、唯一の「ヒト化」アプローチ、すなわちマウスのＣＤＲをヒトｓｃＦｖシャーシに移すことである。「脱マウス化（Ｄｅ－ｍｕｒｉｎｅｎｉｚａｔｉｏｎ）」は、それ自体、ｓｃＦｖのヒト化ではない。このアプローチは、免疫学的に責任があり、そのような責任を取り除くために配列上で個々の変化（すなわち点変異）を行う、マウス配列上の領域を同定することに依存する。

配列ベースの（および構造アシストの）ＣＤＲグラフティングアプローチは、以下のヒト化重鎖および軽鎖を生じた：

重鎖（配列番号２０）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＧＮＫＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＹＳＬＫＬＳＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＹＰＳＰＤＡＭＮＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ

軽鎖（配列番号２１）：
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＱＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ

図２４は、新規抗ＣＤ２２（クローンｈＣＤ２２．７）の重鎖と軽鎖のマウスバージョンとヒト化バージョンとの間の比較を示す。

「Ｄｅ－ｍｕｒｉｎｅｎｉｚａｔｉｏｎ」アプローチは、以下のヒト化重鎖および軽鎖を生じた：

重鎖（配列番号２２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＳＬＶＫＰＧＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＱＳＰＧＮＫＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＴＬＫＧＲＩＳＩＴＲＤＮＳＳＳＱＹＹＬＱＬＫＳＶＴＳＥＤＴＡＴＦＹＣＡＲＹＰＳＰＤＡＭＮＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ

軽鎖（配列番号２３）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＤＤＬＧＶＹＦＣＷＱＧＴＨＦＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ

図２５は、マウス配列上の免疫学的に責任がある領域の同定、およびそのような責任を取り除くための配列上の個々の変化（すなわち点変異）を示す。

Claims (14)

1. 配列番号１５として記載されるＣＤ２２抗原の第１のＩｇ細胞外ドメインの領域に対して結合親和性を有し、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む、抗体、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂまたはｓｃＦｖであるＣＤ２２標的化部分であって、前記ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、前記ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ＣＤ２２標的化部分。
2. 前記ＣＤ２２標的化部分が、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｓｃＦｖであり、前記ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、前記ＶＨドメインが配列番号８からなる、請求項１に記載のＣＤ２２標的化部分。
3. 前記ＣＤ２２標的化部分が、配列番号９のみからなるｓｃＦｖである、請求項２に記載のＣＤ２２標的化部分。
4. ａ．請求項１に記載のＣＤ２２標的化部分を含む細胞外ドメイン；
   ｂ．膜貫通ドメイン；および
   ｃ．細胞内シグナリングドメイン
   を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
5. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４の膜貫通ドメインを含む、請求項４に記載のＣＡＲ。
6. 前記膜貫通ドメインがＣＤ８の膜貫通ドメインを含む、請求項５に記載のＣＡＲ。
7. 前記細胞内シグナリングドメインが、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ６６ｂの細胞内ドメインを含む、請求項４から６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
8. 前記細胞内シグナリングドメインがＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
9. 前記ＣＡＲが共刺激シグナリングドメインをさらに含み、好ましくは、前記共刺激シグナリングドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＣＤ２７６の細胞内ドメインを含む、請求項４から８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
10. 前記共刺激シグナリングドメインがＣＤ１３７の細胞内ドメインを含む、請求項９に記載のＣＡＲ。
11. 前記ＣＤ２２標的化部分がｓｃＦＶであり、好ましくは、前記ｓｃＦＶが、配列番号７のみからなるＶＬドメインおよび配列番号８のみからなるＶＨドメインを含む、請求項４から１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
12. 請求項４から１１のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸。
13. 請求項１２に記載の核酸を含むＴ細胞。
14. ＣＤ２２陽性がんを処置する方法において使用するための、請求項１３に記載の細胞または請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＤ２２標的化部分であって、前記方法が、前記細胞または組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記ＣＤ２２陽性がんが、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、より具体的にはＣＤ１９^－Ｂ－ＡＬＬの再発である、細胞またはＣＤ２２標的化部分。

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