JP2023523320A - 癌関連活性センサ - Google Patents

Abstract

担体の存在を示す酵素に感受性を示す活性センサを使用して、免疫腫瘍学的治療が挙げられる種々の処置の適合性および有効性の決定に有用な、腫瘍の発生および抗癌治療に対する応答を非侵襲性に報告する。局在化されたレポーターは、臨床試験における患者の層別、薬物応答または疾患進行のモニタリング、ならびに抗腫瘍免疫応答、腫瘍進行、およびオフターゲット免疫応答の間の区別で使用される。活性センサは、組織の局在化および位置を調整する調整ドメインを含み得る。活性センサのレポーターの定期的な測定値を分析して、疾患進行を示す速度値が決定され得る。

Description

技術分野
本発明は、癌の診断および処置のための活性センサに関する。

背景
研究や処置に多額の資金を投入し、格段の努力が払われているにもかかわらず、癌は依然として多くの人々に苦痛と死をもたらしている。２０１９年の米国では新たに１７０万人が新たに癌と診断され、６００，０００人超が癌で死亡すると推定されている。癌免疫療法または癌免疫（Ｉ－Ｏ）は、最近発展した分野であり、種々の癌の形態を処置できる見込みがある。Ｉ－Ｏは、癌の攻撃に患者自身の免疫系を使用することを指す。Ｉ－Ｏは広範で、受動的技術および能動的技術が含まれる。受動的技術は、例えば、免疫系攻撃からの腫瘍による防御を破壊することができる免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ－４遮断薬、ＰＤ－１阻害剤、またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）による患者の既存の抗腫瘍免疫応答の増強に関与する。能動的技術としては、腫瘍特異的抗原を標的にするようにプログラムされた操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞などの標的免疫治療が挙げられる。

不運なことに、侵襲性の生検または誤診の可能性のあるイメージングを用いることなく腫瘍環境を洞察することは困難である。画像化したときに免疫療法に対する守備の良い応答が疾患の進行に類似する場合があり、有効な応答の機序はあまり理解されていない。特異的バイオマーカーおよび詳細な疾患の情報の欠如が、臨床試験、Ｉ－Ｏ治療の発展、および個別化処置への障壁となっている。

要旨
本発明は、癌進行、局在化された免疫系活性、および免疫治療反応の特徴の非侵襲性のモニタリングおよび／または検出を提供する。本発明によれば、活性モニタは、活性モニタが治療条件に応答して検出のために放出されるように担体にカップリングされたレポーターを含む。本発明の活性モニタは、病状の決定、疾患進行のモニタリング、再発の予測およびモニタリング、治療反応の査定、ならびに治療有効性の予測に有用である。例えば、免疫学的酵素および細胞死を示す酵素に感受性を示す切断可能なレポーターを有する腫瘍局在化活性センサを使用すると、治療反応を迅速に予測し、癌の進行および進化を詳細にモニタリングすることが可能である。したがって、うまくいかない治療をそのようなものとして迅速に同定することができ、任意の所与の腫瘍治療に対する耐性の発生を警告することができ、それにより、より応答する個別化医療を提供を提供し、無駄な時間が軽減され、腫瘍が進行する機会が減少する。本発明のシステムおよび方法は、炎症およびアポトーシスが挙げられる免疫応答において発現に差があるプロテアーゼに感受性を示す切断可能なリンカーを有する活性センサを含むことができる。また、癌進行に関するさらなる情報を提供するための、天然の腫瘍進行に関連する細胞の壊死に関連するプロテアーゼに感受性を示す活性センサを含めることができる。炎症／アポトーシス関連プロテアーゼレベルと壊死関連プロテアーゼレベルとを比較すると、癌進行のより詳細な所見およびＩ－Ｏ処置応答を得ることができる。また、本発明のセンサは、生体内分布をマッピングするのに有用である。したがって、本発明の構築物を使用して癌細胞の分布および疾患の転移状態を同定することが可能である。

カスパーゼ（システイン－アスパラギン酸プロテアーゼ、システインアスパルターゼ、またはシステイン依存性アスパラギン酸指向プロテアーゼ）は、プログラム細胞死（例えば、アポトーシス）および炎症に関連し、したがって、本明細書中に記載のカスパーゼ切断性レポーターを用いて操作された活性センサは、免疫応答を示す合成バイオマーカーを提供することができる。免疫応答を示す他のプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ（グランザイム、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼ３、チマーゼ、およびトリプターゼなど）が挙げられる。また、ある特定のプロテアーゼは、癌進行および腫瘍成長に関連する。腫瘍関連プロテアーゼは、癌のタイプに応じて発現に差があり得る（例えば、腫瘍関連発現変動遺伝子－１４（ＴＡＤＧ－１４）は、卵巣癌で非常に過剰発現する）。そのようなものとして、癌関連活性センサは、報告された重要酵素レベルに基づいて種々の癌の診断および予後の情報を提供することができる。癌関連活性センサは、任意の腫瘍関連プロテアーゼ（Ｖａｓｉｌｊｅｖａ，ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｎｄ ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｒｕｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，４００（８），ｐｐ．９６５－９７７およびＤｕｄａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｃａｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，２：３５３－７６（その各々の内容が本明細書中で参考として援用される）に記載のものが挙げられる）に感受性を示し得る。

以下に考察するように、癌関連合成バイオマーカーは、癌特異的治療効果と全身性免疫応答またはオフターゲット免疫応答の区別で有用な免疫応答の腫瘍に特異的な状況を提供するために、腫瘍に活性センサを局在化させるための調整ドメインを含むことができる。

活性センサは、切断可能なリンカーを介した１またはそれを超える検出可能な分析物に連結された分子担体構造を含むことができる。患者試料中の活性センサのレポーターレベルによって測定される免疫学的酵素の存在および量を使用して、患者における生得的または増強された免疫腫瘍学的応答を決定することができる。例えば、腫瘍局在化活性センサ由来のカスパーゼレポーターおよびセリンプロテアーゼレポーターのベースラインシグナルは、処置後に測定したときの非応答性腫瘍または処置前に測定したときの免疫学的にコールドな腫瘍を示すことができる。免疫学的にコールドな腫瘍の表示は、患者がチェックポイント阻害剤に応答しそうにないことを示すことができる。処置前に測定した腫瘍局在化活性センサ由来のカスパーゼレポーターおよびセリンプロテアーゼレポーターのシグナルのわずかな上昇は、患者がチェックポイント阻害剤の良好な候補であり得る免疫学的にホットな腫瘍を示すことができる。処置中または処置後に測定した腫瘍局在化活性センサ由来のカスパーゼレポーターおよびセリンプロテアーゼレポーターのシグナルが高い場合、望ましい免疫腫瘍学的治療反応を示し得る。

壊死関連プロテアーゼ（カルパインおよびカテプシンなど）レベルの報告は、免疫腫瘍学的情報を補完し、腫瘍の進行と偽進行との区別を補助するための細胞の壊死に関する情報を提供することができる。

上述の通り、本発明の活性センサおよび方法を、患者におけるＩ－Ｏ薬の応答を予測するか観察するためにＩ－Ｏ処置に適用することができる。個別の患者に関するより詳細かつ関連する情報を提供することにより、試験における応答者および非応答者の間の新規のパターンが同定され得、活性センサを介して得た情報は、臨床試験中のより良い患者の層別に使用することができ、特異的処置から恩恵を受ける状況にある患者亜集団の同定を補助し得る。したがって、本発明の活性センサおよび方法は、応答性または有害作用に関連する患者の特徴の理解が限定的であったために以前に破棄されてきたと考えられる役立つ治療を明らかにすることを支援し得る。

活性センサは、活性センサ中の酵素特異的切断部位の操作によって特異的標的組織中の任意の酵素レベルを非侵襲性に報告するようにプログラミングすることができる合成バイオマーカーとして作用する。例えば、活性センサは、切断可能な分析物として４つまたはそれを超えるポリペプチドレポーターに連結されたマルチアームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）骨格であり得る。切断可能なリンカーは、活性がモニタリングされるべき条件（例えば、癌組織におけるある特定の病期もしくは進行または免疫応答）の特徴を示す異なる酵素に特異的である。患者に投与されたときに、活性センサは標的組織に局在化し、標的組織で酵素によって切断されて検出可能な分析物を放出する。分析物は、尿などの患者試料中で検出される。検出された分析物は、どの酵素が組織中で活性であるのか、したがって、条件または活性に関連するのかについて報告として役立つ。

酵素は抑制された免疫応答、活性な免疫応答、または腫瘍の拡大もしくは減少などの目的の生理学的状態下で発現に差があるので、試料の分析は、種々のＩ－Ｏ治療に対する患者の応答の査定または予測で有用な非侵襲性の試験を提供する。活性センサが腫瘍微小環境の非侵襲性の寸評を提供するので、頻繁なモニタリングが現実になる。疾患の進行および治療反応に関してアクセスする情報が最新であれば、安全性および有効性をより迅速に決断することが可能となり、特に、これは免疫耐性が生じた場合の免疫耐性のモニタリングで特に有用である。

ある特定の実施形態では、活性センサおよび方法を使用して、全身的免疫応答、腫瘍特異的免疫応答、および腫瘍進行を区別することができる。例えば、偽進行現象は、サイズの増加が実際は守備の良い免疫応答に応答した腫脹に原因するにもかかわらず、放射線イメージング下での見かけ上の腫瘍の進行と見なされることを指す。この誤解釈により、守備の良い処置が放棄され得る。癌組織における免疫系活性に関する詳細な情報を提供することにより、本発明の活性センサは、かかる誤解釈を予防し、伝統的なモニタリング法を補完する（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）ことができる。

他の例では、全身的免疫応答（例えば、ウイルス感染に起因する）を、真の抗腫瘍免疫応答と誤解釈し得る。本発明の活性センサを、標的環境での取り込みを増加させるための調整ドメインを使用することによって標的腫瘍を含む特異的組織に局在化することができる。したがって、無関係のオフターゲット免疫応答と対照的に、患者試料中の任意の観察される活性レポーターを、標的環境に安全に寄与させることができる。

さらに、活性センサを使用して提供される情報を使用して、ホットな腫瘍とコールドな腫瘍を区別することができる。免疫学的にコールドな腫瘍は、Ｔ細胞の浸潤はわずかであり、免疫系による強い応答が誘発されない腫瘍を指す。ホットな腫瘍は、対照的に、高レベルの浸潤Ｔ細胞およびより多くの抗原を含み、強力な免疫応答を誘発する可能性がより高い。したがって、患者の免疫系によって標的として既に認識されているホットな腫瘍は、患者の既存の免疫応答を簡潔に増強するためのチェックポイント阻害剤などの受動的処置の良好な候補であり得る。

本明細書中に記載のように、活性センサは、異なる酵素に対して感受性を示す種々の異なる切断可能なレポーターを含み得る。さらに、多数の異なる活性センサを、同時に投与し、分析することができる。レポーター分子は、種々のプロテアーゼ活性の複数の分析を行い、以前の天然バイオマーカーを使用して可能であった場合よりも詳細な腫瘍微小環境の実態を表すことができるように、相互に区別することができる。レポーターは、色素（近赤外色素など）、核酸、またはタンパク質バーコードなどを含み得る。

ある特定の実施形態では、合成バイオマーカーとして作用するＩ－Ｏ活性センサを投与し、定期的に測定して、種々の酵素レベルを時系列にマッピングし得る。時点での情報に加えて、種々の酵素レベルの測定値の変化率を試験して、速度情報を提供することができる。かかるパネルは、健康な個体にさえも適用可能な健康の表示に有用であり、疾患進行および治療反応についての伝統的な縦断的モニタリングを超える別のデータポイントを提供する。

種々の実施形態では、活性センサの担体構造は、複数の分子サブユニットを含むことができ、例えば、マルチアームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、脂質ナノ粒子、またはデンドリマーであり得る。検出可能な分析物は、例えば、免疫応答を経験しているか、疾患が進行している組織または器官で発現に差があるプロテアーゼによって切断されるポリペプチドであり得る。担体構造および検出可能な分析物が、標的組織に局在し、疾患または免疫応答に関連する酵素によって切断されて試料中に検出可能な分析物を放出する生体適合性分子構造であるので、本開示の組成物は、器官または組織の状態を検出および特徴づけるための非侵襲性の方法を提供する。組成物が酵素活性によって検出可能な分析物として放出される物質を提供するので、試料中の分析物の定量的検出により、器官または組織中の酵素の活性率の尺度が得られる。したがって、本開示の方法および組成物は、癌の状態および進行速度またはＩ－Ｏ治療に対する応答の両方を査定するための非侵襲性の技術を提供する。

活性センサは、オフターゲット分解に天然に耐性を示す環状ペプチドの形態を取り得る。標的環境は、特異的な酵素または酵素セットの発現に差がある腫瘍微小環境であり得る。環状ペプチドは、腫瘍中の酵素（例えば、腫瘍中で優先して発現される固有の酵素）に特異的な切断部位を用いて操作され得る。操作されたペプチドは、その環状の形態で、血液中および一般的な非特異的プロテアーゼによる分解から保護された他の潜在的に過酷な環境を、オフターゲット組織と意味のある方法で相互作用することなく移動することができる。特異的な標的組織内に到着し、必要な酵素または酵素の組み合わせに暴露された場合のみに、環状ペプチドが切断されて線状分子が産生され、この線状分子によりクリアランスおよび試料の観察が可能である。本出願の目的のために、その詳細な説明を考慮した場合に明らかであるように、線状ペプチドは、環状でない任意のペプチドである。したがって、例えば、線状化ペプチドは、種々の分枝鎖を有し得る。

環状ペプチドを、他の切断可能な連結（エステル結合など）を用いて、エステル結合が分解されると線状化ペプチドを放出し、その標的環境と反応する状態になる環状デプシペプチドの形態に操作することができる。血漿または他の環境で持続放出するように、チオエステルおよび他の調整可能な結合を、環状ペプチドに含めることができる。Ｌｉｎ ａｎｄ Ａｎｓｅｔｈ，２０１３ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），ｐａｇｅｓ ７１６－７２８（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

大環状ペプチドは、２またはそれを超えるプロテアーゼ特異的切断配列を含み得、レポーターペプチドまたは生物活性化合物を放出するための２またはそれを超えるプロテアーゼ依存性加水分解事象が必要であり得る。プロテアーゼ特異的配列は、種々の実施形態で異なり得る。線状化ペプチドを放出させるために複数の部位を切断する必要がある場合、プロテアーゼ特異的配列が異なると、少なくとも２つの異なる標的特異的酵素が存在することが必要であると考えられるので、放出特異性を増大させることができる。特異的および非特異的タンパク質分解の感受性および速度を、ペプチド配列含有量、長さ、および環化化学を操作することによって調整することができる。

活性センサは、体内のペプチドの移動、または粒子の酵素切断もしくは他の代謝分解のタイミングに影響を及ぼすためのさらなる分子構造を含み得る。分子構造は、身体によって、制御されたタイミングで活性センサを標的組織に配置するように作用される調整ドメイン、さらなる分子サブユニット、またはリンカーとして機能し得る。例えば、調整ドメインにより、粒子が特異的な組織または細胞型を標的にし得る。移動は、担体ポリマー中に分子構造を付加することによって、例えば、体内での分解を遅延させるためにＰＥＧ足場のサイズを増大させることによって影響を受け得る。

ある特定の実施形態では、本発明は、疾患などの生理学的状態に関連する酵素活性を明らかにする調整可能な活性センサを提供する。活性レポーターを患者に投与したときに、身体を通して活性レポーターが特異的細胞または特異的組織に移動する。例えば、肺癌患者では、活性センサは、例えば、肺組織または腫瘍組織に優先して移動される調整ドメインの使用によって、癌組織中に局在化するように調整され得る。活性センサは、免疫応答または腫瘍の進行もしくは退行の状態を示す酵素に感受性を示す切断可能なレポーター分子を含むことができる。次いで、その後に患者試料（例えば、尿）中のレポーターレベルを観察および／または追跡すれば、患者の肺癌の進行および／または治療反応を示すであろう。

センサは、循環中（例えば、血液中、またはリンパ中、またはその両方）にとどまるようにデザインまたは調整され得る。特定の疾患条件下で発現に差がある酵素が存在する場合、これらの酵素は、レポーターを切断し、検出可能な分析物を放出する。環状ペプチド活性センサを使用して、依然として標的プロテアーゼによる切断のための基質に接近可能である一方で、循環中のペプチドの非特異的分解に耐性を示し得る。

本発明の態様は、癌を有する疑いがある患者に、腫瘍環境の特徴を示す酵素の切断部位を含む切断可能なリンカーによってレポーター分子に連結された担体を含む活性センサを投与する工程を含む、癌進行をモニタリングする方法を含む。尿試料などの試料を、患者から回収し、分析することによってレポーターの存在または欠如を検出することができ、ここで、レポーターの存在は特徴を示す。

特徴は活性な免疫応答であり得、患者は免疫腫瘍学的処置を受けており、ここで、レポーターの存在は、免疫腫瘍学的処置の治療効果を示す。また、レポーターの存在は、他の処置法（例えば、化学療法、標的療法、または放射線療法など）を示し得る。活性センサは、標的腫瘍中に活性センサを局在させるように操作可能な調整ドメインを含み得る。特徴は、チェックポイント阻害免疫応答であり得、ここで、レポーターの存在は、チェックポイント阻害剤治療に対する予想される治療反応を示す。方法は、試料中のレポーターの検出に基づいて臨床試験において患者を層別する工程を含み得る。

ある特定の実施形態では、分析する工程は、試料中のレポーターのレベルを定量することを含み得、方法は、投与する工程、回収する工程、および分析する工程を定期的に繰り返して、経時的な一連のレポーターレベルを調製する、定期的に繰り返す工程を含むことができ、その結果から、患者における癌進行を示す特徴の速度を決定することができる。

ある特定の態様では、本発明は、癌進行をモニタリングするための活性センサを含み得、前述の活性センサは、１またはそれを超える分子サブユニットを含む担体；腫瘍環境の特徴を示す酵素の切断部位を含む切断可能なリンカーによって担体に各々が連結された複数の検出可能なレポーター；および標的腫瘍中に活性センサを局在化するように操作可能な調整ドメインを含み、ここで、活性センサは、１またはそれを超える酵素による切断の際にレポーターが放出されることによって１またはそれを超える酵素の活性を報告する。特徴は、免疫腫瘍学的処置を受けている患者における活性な免疫応答であり得る。種々の実施形態では、特徴は、チェックポイント阻害免疫応答であり得る。

調整ドメインは、標的腫瘍の受容体のリガンドを含み得る。担体は、共有結合したＰＥＧサブユニットのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）骨格を含み得る。ある特定の実施形態では、担体は、マルチアームＰＥＧ足場を含み、検出可能なレポーターおよび切断可能なリンカーの各々はＰＥＧ足場に連結したポリペプチドを含む。リガンドは、小分子、ペプチド、抗体、抗体の断片、核酸、またはアプタマーを各々含み得る。活性センサは、複数のレポーターおよび複数の調整ドメインを含み得、ここで、調整ドメインは、レポーターに連結された生体適合性ポリマーを含む。活性センサは、切断可能なリンカーの切断の際に線状化される環状ペプチドを含み得る。

図１は、癌進行をモニタリングする方法の工程の線図を図示する。

図２は、活性センサを示す。

図３は、操作された大環状ペプチドを示す。

詳細な説明
本発明は、免疫学的に関連する酵素の発現差について報告するための局在化された活性センサを使用して癌関連免疫応答に関する詳細な情報を提供する。かかる活性センサは、尿などの体液試料中で検出可能であるが、局在化された免疫応答または癌進行に関連する切断酵素と接触した際にのみ身体から放出される種々のレポーター分子を含むことができる。したがって、試料中のレポーターの検出は、標的組織中の酵素の発現差および関連する免疫活性（例えば、免疫治療反応または免疫学的にホットな腫瘍）の存在を示す。優先的に癌組織を標的にし、種々の条件下で発現に差がある酵素に特異的な切断部位を操作することにより、本発明の活性センサは、既存のイメージング技術または体系的なモニタリング技術を用いて不可能であった癌進行および予想されるか実際の免疫治療反応を洞察することができる。

いくつかのプロテアーゼは、炎症およびプログラム細胞死（例えば、アポトーシス、ピロトーシス、およびネクロトーシスが挙げられる）に関連することが知られている。したがって、これらのプロテアーゼの局在化レベルは、免疫系活性を示す。カスパーゼ（システイン－アスパラギン酸プロテアーゼ、システインアスパルターゼ、またはシステイン依存性アスパラギン酸指向プロテアーゼ）は、標的タンパク質のアスパラギン酸残基後のみを求核切断する活性部位中にシステインを含むプロテアーゼ酵素のファミリーである。カスパーゼ－１、カスパーゼ－４、カスパーゼ－５、およびカスパーゼ－１１は、炎症に関連する。また、セリンプロテアーゼは、アポトーシスおよび炎症で機能し、したがって、その発現差は、免疫応答も示す。免疫細胞は、セリンプロテアーゼ（グランザイム、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼ３、チマーゼ、およびトリプターゼなど）を発現する。

種々の実施形態では、免疫応答を示すプログラム細胞死と腫瘍進行中に天然に見出される壊死とを区別するのに有用であり得る。プログラム細胞死と対照的に、カスパーゼおよびセリンプロテアーゼが主なプロテアーゼである場合、カルパインおよびリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシンＢおよびＤ）は、壊死における重要なプロテアーゼである。したがって、活性センサのレポーターの測定によって示されたカルパインおよびカテプシンのレベルは、免疫腫瘍学的情報を補完するための細胞の壊死に関する情報を提供することができる。

本発明の活性センサおよび方法を、患者におけるＩ－Ｏ薬の応答を観察するためにＩ－Ｏ処置に適用することができる。例えば、カスパーゼ、セリンプロテアーゼ、カルパイン、およびカテプシンに感受性を示す切断部位を有する活性センサを、Ｉ－Ｏ処置中またはＩ－Ｏ処置後に投与することができ、患者試料中のレポーターレベルを使用して、治療反応をモニタリングすることができる。患者試料中のカスパーゼまたはセリンプロテアーゼのベースラインシグナルは、非応答性腫瘍を示す。ベースラインレベルを、患者集団から収集したデータまたは処置を受けていない患者由来の処置前データから実験的に決定することができる。ベースラインと比較した処置中または処置後のカスパーゼシグナルおよびセリンプロテアーゼシグナルの増加は、望ましい免疫腫瘍学的応答を示すことができる。カルパインシグナルまたはカテプシンシグナルのレベルを追跡すると、腫瘍進行に関連し得る非免疫学的細胞死に関するさらなる情報を得ることができる。

腫瘍の特徴および処置に対する患者の応答に関する活性センサから提供された情報の深さは、例えば、臨床試験のための患者の層別で用いる新規の要因を提供することができる。層別は、与えられた処置以外の因子による被験体および結果の区分化である。層別は、伝統的には性別、年齢、または他の人口統計上の詳細などの因子によって行われるが、本発明の活性センサから得た詳細な患者および腫瘍の情報を加えることにより、層別化のためのより実用的で意味のある群を提供することができる。かかるグループ化を考慮した患者応答の試験を使用して、ばらつきを排除し、それにより、結果をより良好に解釈し、有害事象または治療有効性を原因となる患者の特徴にマッピングすることができる。また、活性センサを介して得た情報を分析し、処置の結果（正の結果または逆の結果）と組み合わせて、有害反応を経験することなく応答する可能性が高い癌処置の良好な候補のさらなる試験および同定で使用することができる。

活性センサは、活性センサ中の酵素特異的切断部位の操作によって特異的標的組織中の任意の酵素レベルを非侵襲性に報告するようにプログラミングすることができる合成バイオマーカーとして作用する。患者に投与したときに、活性センサは、例えば、標的特異的調整ドメインを使用して標的組織に配置される。局在化された時点で、活性センサは酵素によって切断されて、検出可能な分析物を放出する。分析物は、尿試料などの患者試料中に検出される。検出された分析物は、どの酵素が組織中で活性であるのか、したがって、条件または活性に関連するのかについて報告として役立つ。局在化すると、活性センサは、オフターゲット情報で汚染されることなく標的組織の症状について報告することが可能である。この能力は、首尾の良いＩ－Ｏ処置を示す抗腫瘍免疫応答を、例えば、ウイルス感染に応答して起こり得るオフターゲット免疫応答と区別するのに有用である。例えば、免疫学的酵素（例えば、カスパーゼまたはセリンプロテアーゼ）の一般的な増加は、全身免疫応答またはオフターゲット免疫応答（ウイルス感染など）に起因し得る。本発明が免疫系活性に関する腫瘍特異的情報を提供することができることにより、全身的免疫応答を望ましい抗腫瘍応答と誤解することが回避される。

さらに、活性センサによるモニタリングが非侵襲性であるので、頻繁なモニタリングがより実現可能であり、疾患進行および治療反応に関する最新情報を、より迅速な意思決定ならびに安全性および有効性の査定のために使用することができる。Ｉ－Ｏ処置の文脈では、頻繁なモニタリングを使用して、処置に対する耐性が生じた場合に耐性を迅速に同定することができる。例えば、癌が進行するにつれて、癌は変異し続け、免疫治療が標的にするために使用される新生抗原がもはや発現されない場合があり、治療有効性が小さくなる。免疫学的酵素の発現レベルの変化によってかかる変化を迅速に同定できれば、より迅速に、おそらく著しい癌進行または再発の前に治療を変更することができる。

また、特異的組織（例えば、腫瘍）における免疫応答をモニタリングすることができれば、偽進行として公知の腫瘍サイズの増加が認められるという誤解釈を防止することができる。抗腫瘍免疫応答を追跡すると、望ましい抗腫瘍免疫応答に起因する腫脹が疾患進行に起因する腫瘍成長と区別可能である。例えば、Ｉ－Ｏ処置中の腫瘍サイズの増加を示す放射線イメージングから、癌が進行しており、治療は有効ではないとの結論が論理的に導かれるであろう。しかしながら、腫瘍は、実際に、首尾の良いＩ－Ｏ処置を示す炎症応答に対して腫脹し得る。この混乱により、歴史的に、有効な処置が放棄されていたかもしれない。本発明の方法を使用して、腫瘍イメージングおよび他の指標を、腫瘍特異的免疫学的酵素活性レベルで補完することができ、その結果、腫瘍サイズの増加に伴うカスパーゼレベルまたはセリンプロテアーゼレベルの増加を望ましいＩ－Ｏ治療反応と正しく解釈することができる。

免疫学的酵素は、免疫応答の一部として産生された酵素であり得る。例えば、免疫学的酵素は、免疫細胞によって産生された酵素を含み得る。

いくつかの実施形態では、癌特異的酵素（免疫由来の酵素または細胞死に関与する酵素ではない）は、治療効果を示し得る。例えば、ある特定の例では、癌の成長または血管形成に関連する酵素活性の減少は、処置応答を示す。当業者は、本明細書中に記載の活性センサおよび方法を使用して、本明細書中に記載の活性センサを用いて１またはそれを超える癌特異的酵素を測定することによって治療反応が決定され得ると認識するであろう。

また、本発明の活性センサおよび方法を使用して、Ｉ－Ｏ治療に対する患者の適合性を評価することができる。例えば、活性センサは、患者の天然の免疫認識および癌組織に対する応答において発現に差がある酵素について報告することができる。かかる活性センサを、ホットな腫瘍とコールドな腫瘍を区別するために任意のＩ－Ｏ処置前に投与することができる。患者が高レベルの浸潤Ｔ細胞およびより多くの抗原を含む腫瘍を有する場合、これらは患者の既存の免疫応答を増強するためのチェックポイント阻害剤などの受動的処置の良好な候補であり得る。チェックポイントタンパク質としては、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）、およびＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）が挙げられ、これらは、免疫検出または免疫応答から腫瘍をマスクすることが知られており、各々について種々の阻害剤が知られている。免疫系認識に感受性を示す活性センサがホットな腫瘍を示す場合、かかるチェックポイント阻害剤治療の適応となり得る。例えば、ベースラインレベルを超える処置前腫瘍中のカスパーゼまたはセリンプロテアーゼの活性レベルの増加を、本明細書中で考察するように活性センサを使用して観察することができ、このレベルは、腫瘍部位でのいくらかの免疫系の認識および活性を示すであろう。先天性免疫の認識および応答の存在は、癌進行がチェックポイントタンパク質の操作に依存するという結論を支持し、チェックポイント阻害剤の投与が患者に有効であることを証明し得る。

酵素特異的レポーターは、単一の活性センサに多重化することができるか、多数の異なる活性センサに含めて、同時に投与され、分析される。レポーター分子は、多重分析で区別することができるように各酵素に対して特異的であり得る。ある特定の実施形態では、合成バイオマーカーとして作用するＩ－Ｏ活性センサを投与し、定期的に測定して、種々の酵素レベルを時系列にマッピングし得る。研究において、バイオマーカーの速度（バイオマーカーレベルの経時変化率）がいかなる単一の閾値よりも疾患の進行（または後退）の良好な指標であり得ることが見出されている。同一の原理を、合成バイオマーカーとして作用する本発明の活性センサに適用することができる。

活性センサは、担体、少なくとも１つの、担体に連結したレポーター、および少なくとも１つの、被験体に投与されたときに被験体内の活性センサの分布時間または滞留時間を調整する調整ドメインを含むことができる。活性センサは、体内の酵素活性（例えば、免疫応答中または腫瘍の進行もしくは退行中に発現に差がある酵素）を検出および報告するように設計され得る。無制御のプロテアーゼは、これらのプロテアーゼが、細胞シグナル伝達を変化させ、癌細胞の増殖、侵入、血管形成、アポトーシスの回避、および転移の推進を補助し得るという点で、癌などの疾患の進行の重要な結果である。

活性センサは、体内の特異的細胞または特異的組織における酵素活性の検出を容易にする多数の方法で調整ドメインを介して調整され得る。例えば、活性センサは、活性センサの特異的組織への分布を促進するか、被験体中または特異的組織中の活性センサの滞留時間を改善するように調整され得る。調整ドメインとしては、例えば、腫瘍組織をより良好に標的にするための迅速に複製されている細胞中に局在化された分子が挙げられ得る。

被験体に投与されたときに、活性センサは体中を移動し、体循環から特異的な組織に拡散し得、前述の組織でレポーターが、癌進行または免疫応答を示す酵素を介して切断され得る。次いで、検出可能な分析物は、拡散されて循環に戻り得、腎臓によって濾過されて尿に排出され得、それにより、尿試料中の検出可能な分析物の検出は、標的組織中の酵素活性を示す。

担体は、被験体に投与されたときに被験体の体中をレポーターが移動するのに好適な任意のプラットフォームであり得る。担体は、担体またはプラットフォームとしての機能を果たすのに好適な任意の材料またはサイズであり得る。好ましくは、担体は、生体適合性であり、無毒であり、非免疫原性であり、担体が投与された被験体の身体で免疫応答を引き起こさない。また、担体は、活性センサが組織、細胞、または分子を標的するための標的化手段として機能し得る。いくつかの実施形態では、担体ドメインは、ポリマー足場などの粒子である。担体は、例えば、循環によって腫瘍または他の特異的組織を受動的に標的にし得る。他のタイプの担体としては、例えば、組織、細胞、または分子の能動的な標的化を容易にする化合物が挙げられる。担体の例としては、ナノ粒子（酸化鉄または金ナノ粒子など）、アプタマー、ペプチド、タンパク質、核酸、ポリサッカリド、ポリマー、抗体または抗体断片、および小分子が挙げられるが、これらに限定されない。

担体は、種々の材料（鉄、セラミック、金属、天然ポリマー材料（ヒアルロン酸など）、合成ポリマー材料（ポリ－グリセロールセバカートなど）、および非ポリマー材料、またはその組み合わせなど）を含み得る。担体は、全体または一部が、ポリマーまたは非ポリマー材料（アルミナ、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リンケイ酸カルシウム、リン酸ナトリウム、アルミン酸カルシウム、およびシリカートなど）から構成され得る。ポリマーとしては、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。非生分解性ポリマーの例としては、エチレンビニルアセタート、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、そのコポリマーおよび混合物が挙げられる。

生分解性ポリマーの例としては、合成ポリマー（乳酸とグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリウレタンなど）、および天然ポリマー（アルギナートなど）および他のポリサッカリド（デキストランおよびセルロースが挙げられる）、コラーゲン、アルブミン、および他のタンパク質、そのコポリマーおよび混合物が挙げられる。一般に、これらの生分解性ポリマーは、酵素加水分解もしくはｉｎ ｖｉｖｏでの水への曝露、表面侵食もしくはバルク侵食のいずれかによって分解する。これらの生分解性ポリマーは、単独でか、物理的混合物（ブレンド）としてか、コポリマーとして単独で使用され得る。

好ましい実施形態では、担体は生分解性ポリマーを含み、その結果、レポーターが担体から切断されるか、担体は体内で分解されるであろう。生分解性担体を提供することにより、体内に残存するインタクトな活性センサの蓄積および任意の関連する免疫応答または意図しない効果が最小にされ得る。

他の生体適合性ポリマーとしては、ＰＥＧ、ＰＶＡ、およびＰＶＰが挙げられ、これらは全て市販されている。ＰＶＰは、平均分子量がおよそ１０，０００～７００，０００の範囲であり、化学式（Ｃ６Ｈ９ＮＯ）［ｎ］を有する非イオン生成性の親水性ポリマーである。また、ＰＶＰは、ポリ［１（２オキソ１ピロリジニル）エチレン］として公知である。ＰＶＰは、無毒で吸湿性が高く、水または有機溶媒に容易に溶解する。

ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、アセタート基のヒドロキシル基との置換によってポリ酢酸ビニルから調整されるポリマーであり、化学式（ＣＨ２ＣＨＯＨ）［ｎ］を有する。大部分のポリビニルアルコールは水溶性である。

ポリ（オキシエチレン）グリコールとしても公知のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーである。ＰＥＧは、エチレングリコールの繰り返し単位を含む化合物を指す。ＰＥＧの構造は、Ｈ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨとして表され得る。ＰＥＧは、生物学的に不活性であり（すなわち、非免疫原性）、一般的にヒトへの投与に安全と見なされている親水性化合物である。

ＰＥＧが粒子に連結されるとき、ＰＥＧは、溶解性の改良、循環寿命の増大、安定性、タンパク質分解からの保護、マクロファージによる細胞取り込みの減少、ならびに免疫原性および抗原性の欠如などの有利な性質を提供する。また、ＰＥＧは、可動性が高く、立体障害を起こすことなくバイオコンジュゲーションおよび粒子の表面処理を行える。ＰＥＧは、化合物の分子特性を特定の適用に合わせるための生物学的に活性な化合物（ペプチド、タンパク質、抗体断片、アプタマー、酵素、および小分子など）の化学修飾のために使用され得る。さらに、ＰＥＧ分子は、ＰＥＧ分子の末端への種々の官能基の化学的付加によって官能化され得る（例えば、アミン反応性ＰＥＧ（ＢＳ（ＰＥＧ）ｎ）またはスルフヒドリル反応性ＰＥＧ（ＢＭ（ＰＥＧ）ｎ））。

ある特定の実施形態では、担体は、生体適合性足場（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む足場など）である。好ましい実施形態では、担体は、共有結合したポリエチレングリコールマレイミド（ＰＥＧ－ＭＡＬ）の複数のサブユニットを含む生体適合性足場（例えば、８アームＰＥＧ－ＭＡＬ足場）である。ＰＥＧ含有足場は、生体適合性であり、安価であり、容易に購入でき、細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みが最小であり、多くの有利な挙動を示すので、選択され得る。例えば、ＰＥＧ足場は、多数の細胞型（マクロファージなど）による粒子の細胞取り込みを阻害し、特異的組織への適切な分布を容易にし、組織中の滞留時間を増大させる。

８アームＰＥＧ－ＭＡＬは、ヘキサグリセロールコアに接続した８つのアームの各末端にマレイミド基を有するマルチアームＰＥＧ誘導体の１つの型である。マレイミド基は、マイケル付加を介して遊離チオール基、ＳＨ基、スルフヒドリル基、またはメルカプト基と選択的に反応して、安定な炭素－硫黄結合を形成する。８アームＰＥＧ－ＭＡＬ足場の各アームは、ペプチドに、例えば、マレイミド－チオールカップリングまたはアミド結合を介して抱合され得る。

ＰＥＧ－ＭＡＬ足場は、種々のサイズの足場であり得る（例えば、１０ｋＤａの足場、２０ｋＤａの足場、４０ｋＤａの足場、または４０ｋＤａを超える足場）。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＰＥＧ足場の流体力学直径は、当該分野で公知の種々の方法によって（例えば、動的光散乱によって）決定され得る。かかる技術を使用して、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＭＡＬ足場の流体力学直径は、およそ８ｎｍと測定された。好ましい実施形態では、活性センサが体循環に容易に分散されるが、細網内皮系によって容易にクリアランスされないので、活性センサが皮下投与されるとき、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＭＡＬ足場は担体として提供される。

直径が約５ｎｍより小さい粒子はタンパク質分解によって切断されなくとも身体の腎臓濾過によって効率的にクリアランスされるので、ＰＥＧ－ＭＡＬ足場のサイズは、活性センサの体内の分布および滞留に影響を及ぼす。さらに、直径が約１０ｎｍを超える粒子はリンパ管に排出されることが多い。一例を挙げれば、４０ｋＤａの８アームＰＥＧ－ＭＡＬ足場が静脈内投与された場合、足場は、腎臓によって尿中にクリアランスされなかった。

レポーターは、酵素活性に感受性を示す任意のレポーターであってよく、したがって、レポーターの切断は酵素活性を示す。レポーターは、特異的病状で活性な酵素に依存する。例えば、腫瘍は、特異的な一連の酵素に関連する。腫瘍について、活性センサは、腫瘍または他の罹患組織によって発現される酵素部位に適合する酵素感受性部位を用いてデザインされ得る。あるいは、酵素特異的部位は、通常は存在するが、特定の病状においては存在しない酵素に関連し得る。この例では、病状は、酵素に関連するシグナルの欠如、または通常の参照もしくは健康な被験体における事前の測定値と比較したシグナルレベルの低下に関連するであろう。

種々の実施形態では、レポーターは、天然に存在する分子（ペプチド、核酸、小分子、揮発性有機化合物、元素質量タグ、または新生抗原など）を含む。他の実施形態では、レポーターは、天然に存在しない分子（Ｄ－アミノ酸、合成元素、または合成化合物など）を含む。レポーターは、質量コード化レポーター（例えば、既知の質量または同位体を有するポリペプチドなどの既知かつ個別に同定可能な質量を有するレポーター）であり得る。

酵素は、生物の代謝過程を促進または触媒する生細胞で産生される種々のタンパク質のうちのいずれかであり得る。酵素は、基質に作用する。基質は、酵素による触媒反応が起こる前に活性部位と呼ばれる位置で酵素に結合する。一般に、酵素としては、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ヘパリナーゼ、およびホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。被験体における疾患に関連する酵素の例としては、ＭＭＰ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－９、カリクレイン、カテプシン、セプラーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、グルコセレブロシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１５、ならびにマトリプターゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出された酵素活性は、任意の型の酵素（例えば、プロテアーゼ、キナーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リサーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼ）の活性であり得る。

疾患関連酵素の基質の例としては、インターロイキン１ベータ、ＩＧＦＢＰ－３、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ、ＦＡＳＬ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＦＧＦＲ１、デコリン、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＰＤＧＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、およびＭＭＰの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答を示す酵素としては、例えば、組織リモデリング酵素が挙げられる。

調整ドメインは、活性センサが被験体に投与されたときに被験体内の活性センサの分布または滞留時間を改変する任意の好適な材料を含み得る。例えば、調整ドメインは、ＰＥＧ、ＰＶＡ、またはＰＶＰを含み得る。別の例では、調整ドメインは、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ポリサッカリド、揮発性有機化合物、疎水性鎖、または小分子を含み得る。

図１は、癌進行のモニタリングのための方法１００を図示する。工程１０５では、活性センサを患者に投与する。患者は、癌を有する疑いがあり、癌を有することが知られおり（活動期または寛解期）、癌発症のリスクが有り、そして／または免疫腫瘍学的（Ｉ－Ｏ）治療が挙げられる癌の処置を受けている可能性がある。活性センサは、切断可能なリンカーによって担体に連結されたレポーターを含む（例えば、図２および３に示す）。切断可能なリンカーは、酵素レベルが腫瘍環境における特徴を示す酵素（例えば、拡大している腫瘍もしくは後退した腫瘍で上方制御される酵素、または活性なもしくは阻害された免疫応答を示す酵素）に感受性を示す。本明細書中で考察されるように、酵素活性に応じて、活性センサは、患者の疾患および処置状態について報告されるように操作され、患者試料中のレポーターレベルから収集した情報を使用して、疾患を診断および／または病期分類し、進行をモニタリングし、所与の治療に対する応答性を予測し、治療有効性（抗腫瘍免疫応答と、全身的免疫応答と、腫瘍進行との間の差が挙げられる）をモニタリングすることができる。活性センサを、任意の好適な方法で投与することができる。好ましい実施形態では、活性センサは、静脈内に送達されるか、エアロゾル化して、例えば、ネブライザーを介して肺に送達させる。他の例では、活性センサは、被験体に、経皮、皮内、動脈内、病巣内、腫瘍内、頭蓋内、関節内、腫瘍内、筋肉内、皮下、経口、局所、局部に投与され得るか、吸入、注射、注入で投与され得るか、当該分野で公知の他の方法もしくは任意の組み合わせによって投与され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）（参考として援用される）を参照のこと）。

工程１１０では、活性センサの投与および標的組織中の活性センサの局在化後に、レポーターは、特徴を示す酵素の存在下でリンカーが切断されたときに選択的に放出される。調整ドメイン（標的組織（例えば、癌細胞を保有することが疑われる特異的組織）中に優先的に濃縮されるか、一般に腫瘍中に濃縮される部分が挙げられる）を使用して局在化することができる。レポーターが放出されると、レポーターは、身体によって、血流への輸送および腎クリアランス後に尿などの非侵襲性に回収可能な流体中にクリアランスされ得る。

工程１１５では、尿試料などの試料を、分析のために回収することができる。工程１２０では、試料を分析することができ、試料中のレポーターの存在および／またはレベルを検出することができる。工程１２５では、レポーターの存在によって示された酵素レベルを使用して、認められた発現差に関連する特徴を決定することができる。上で述べたように、使用した活性センサにおいて操作された酵素感受性に応じて、レポーターレベルを使用して、疾患進行またはＩ－Ｏ治療応答をモニタリングするか、種々の処置に対する応答性を予測する（例えば、腫瘍のホット状態またはコールド状態を決定する）ことができる。

図２は、担体２０５、レポーター２０７、および調整ドメイン２１５を有する活性センサ２００を示す。図示するように、担体２０５は、共有結合したポリエチレングリコールマレイミド（ＰＥＧ－ＭＡＬ）の複数のサブユニットを含む生体適合性足場である。担体２０５は、分子量が約２０ｋＤａと８０ｋＤａとの間の８アームＰＥＧ－ＭＡＬ足場である。レポーター２０７は、同定されたプロテアーゼに感受性を示す領域を含むポリペプチドである。同定されたプロテアーゼのレポーターを切断する活性は、疾患を示す。レポーター２０７は、検出可能な分析物２１０に接続された切断可能な基質２２１を含む。同定されたプロテアーゼによる切断が切断可能な基質２２１で起こるとき、検出可能な分析物２１０は、活性センサ２００から放出され、組織を通過し、身体から排出され、検出され得る。

種々の実施形態では、活性センサは、体内での非特異的なタンパク質分解および分解に構造的に耐性を示す環状ペプチドを含み得る。環状ペプチドは、本来は非反応性の環状ペプチドを本明細書中で考察した酵素の存在に応答して反応性レポーター分子を放出させるプロテアーゼ特異的基質またはｐＨ感受性結合を含むことができる。環状ペプチドは、特異性を増大させるために複数の切断部位で切断されることが必要であり得る。複数の部位が、同一または異なるプロテアーゼに特異的であり得る。機能的なペプチドまたは他の分子を線状化するか放出させるために必要な種々の酵素または環境条件の組み合わせを備えた２、３、４、またはそれを超える環状ペプチド構造を含むポリ環状ペプチドを使用することができる。環状ペプチドは、１またはそれを超えるエステル結合が加水分解して線状化ペプチドを放出させるデプシペプチドを含むことができる。かかる実施形態を使用して、血漿などの環境におけるペプチド放出のタイミングを調整することができる。

図３は、プロテアーゼ特異的基質３０９および安定な環化リンカー３０３を有する例示的な環状ペプチド３０１を示す。プロテアーゼ特異的基質３０９は、任意の数のアミノ酸を任意の順序で含み得る。例えば、Ｘ_１はグリシンであり得る。Ｘ_２はセリンであり得る。Ｘ_３はアスパラギン酸であり得る。Ｘ_４はフェニルアラニンであり得る。Ｘ_５はグルタミン酸であり得る。Ｘ_６はイソロイシンであり得る。環化リンカー３０３にカップリングしたＮ末端およびＣ末端は、環化残基３０５を含む。ペプチドは、プロテアーゼ安定性、切断部位周囲の立体障害、大員環の構造、およびペプチド鎖の剛性／可動性などの検討事項に対処するように操作され得る。スペーサー残基３０７のタイプおよび数を、環状ペプチドの種々の機能的部位の間の間隔を変化させることによって前述の性質の多くに対処し、変化させるように選択することができる。また、環化リンカーならびに環化残基の配置および選択により、上で考察した検討事項に影響を及ぼすことができる。ＰＥＧなどの調整ドメインおよび／またはＦＡＭなどのレポーターを、環状ペプチドに含めることができる。

生物試料は、レポーターが検出され得る被験体由来の任意の試料であり得る。例えば、試料は、組織試料（血液試料、硬組織試料、軟組織試料など）、尿試料、唾液試料、筋肉試料、糞便試料、精液試料、または脳脊髄液試料であり得る。

レポーターの検出
本発明の活性センサから放出されたレポーター分子は、検出可能な分析物内の分子の量の存在を直接または間接的に検出できる任意の好適な検出方法によって検出され得る。例えば、レポーターは、親和性因子への捕捉リガンドの結合を含む試験であるリガンド結合アッセイによって検出され得る。レポーターは、捕捉後、光学密度、放射線放射、または非放射性エネルギー移動によって直接検出され得る。あるいは、レポーターは、抗体抱合体、親和性カラム、ストレプトアビジン－ビオチン抱合体、ＰＣＲ分析、ＤＮＡマイクロアレイ、または蛍光分析を用いて間接的に検出され得る。

リガンド結合アッセイは、しばしば、ＥＬＩＳＡ（蛍光、比色、生物発光、および化学発光によるＥＬＩＳＡが挙げられる）、試験紙もしくは側方流動アッセイ、またはビーズベースの蛍光アッセイなどの検出工程を含む。

一例を挙げれば、ペーパーベースのＥＬＩＳＡ試験を使用して、尿中の遊離レポーターが検出され得る。ペーパーベースのＥＬＩＳＡは、市販の固体インクプリンターから堆積したワックスを再流して単一の紙片上に試験スポットのアレイを作成することなどによって安価に作成され得る。固形インクが液体または半固体の状態に加熱されたとき、プリントされたワックスがペーパーに浸透し、疎水性のバリアが作成される。次いで、疎水性バリアの間の空間は、個別の反応ウェルとして使用され得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、個別の反応ウェル上で検出抗体を乾燥させ、ペーパー上に試験スポットを構成し、その後にブロッキングおよび洗浄することによって行われ得る。次いで、被験体から採取した尿試料由来の尿が、試験スポットに添加され得、次いで、検出抗体としてストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）抱合体が試験スポットに添加され得る。次いで、結合したＡＬＰが発色反応剤（紫色の沈殿を生じ、レポーターの存在を示すＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５－ブロモ－４－クロロ－３’－インドリルホスファート（ｉｎｄｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｐ－トルイジン塩／ニトロ－ブルーテトラゾリウムクロリド）など）に曝露され得る。

別の例では、揮発性有機化合物は、ガスクロマトグラフィ装置、ブレサライザー、質量分析計などの分析プラットフォームによるか、光センサまたは音響センサを使用することによって検出され得る。

ガスクロマトグラフィを使用して、分解することなく気化することができる化合物（例えば、揮発性有機化合物）が検出され得る。ガスクロマトグラフィ装置は、キャリアガス（例えば、ヘリウムなどの不活性ガスまたは窒素などの非反応性ガス）であるモバイル相（または移動相）、およびカラムと呼ばれるガラス製または金属製の管の一部の内側にある不活性固体支持体上の液体またはポリマーの微視的層である固定相を含む。カラムには固定相がコーティングされており、分析されるガス状化合物がカラムの壁と相互作用して、前述の化合物が異なる時間に溶出される（すなわち、カラム内での保持時間が様々である）。化合物は、その保持時間によって区別され得る。

また、改良型のブレサライザー装置を使用して、揮発性有機化合物が検出され得る。血中アルコールレベルを検出するために使用される伝統的なブレサライザーでは、被験体は、呼気を装置に吐き出し、被験体の呼気中に存在する任意のエタノールがアノードで酢酸に酸化される。カソードでは、大気中の酸素が還元される。反応全体としてはエタノールが酢酸および水に酸化され、それにより電流が発生し、この電流がマイクロコントローラによって検出および定量され得る。他の反応を活用する改良型のブレサライザー装置を使用して、種々の揮発性有機化合物が検出され得る。

質量分析を使用して、質量の相違に基づいてレポーターが検出および区別され得る。質量分析では、サンプルは、例えば、電子線を衝突させることによってイオン化される。試料は、固体、液体、または気体であり得る。試料をイオン化することにより、試料の分子のうちのいくつかが荷電断片に破壊される。次いで、これらのイオンは、質量電荷比に応じて分離され得る。しばしば、イオンを加速して電場または磁場に供することによって分離され、ここで、同一の質量電荷比を有するイオンは、同量の偏向を受けるであろう。偏向したときに、イオンは、荷電粒子を検出することができる機構（例えば、電子増倍管）によって検出され得る。検出結果は、質量電荷比の関数として検出されたイオンの相対存在量の範囲として表示され得る。次いで、試料中の分子を、既知の質量との相関（同定された質量に対する全体の質量など）または特徴的なフラグメンテーションパターンによって同定することができる。

レポーターが核酸を含むとき、レポーターは、当該分野で公知の種々の配列決定法（例えば、伝統的なサンガー配列決定法または次世代配列決定（ＮＧＳ））によって検出され得る。ＮＧＳは、一般に、非サンガーベースのハイスループット核酸配列決定テクノロジーを指し、多数（すなわち、数千、数百万、または数十億）の核酸ストランドを並行して配列決定することができる。かかるＮＧＳ配列決定の例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のプラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、ＭｉｎｉＳｅｑ、およびｉＳｅｑ１００）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＳｅｑｕｅｌおよびＲＳＩＩ）、およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（例えば、Ｉｏｎ Ｓ５、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ、Ｉｏｎ ＰＧＭ、およびＩｏｎ Ｃｈｅｆシステム）が挙げられる。任意の好適なＮＧＳ配列決定プラットフォームをＮＧＳのために使用して本明細書中に記載の検出可能な分析物の核酸が検出され得ると理解される。

生物試料が直接分析され得るか、検出可能な分析物が最初にいくらか精製され得る。例えば、精製工程は、生物試料中の他の構成要素から検出可能な分析物を単離することを含み得る。精製は、アフィニティクロマトグラフィなどの方法を含み得る。単離または精製された検出可能な分析物は、分析前に純度１００％であったり、実質的に純粋であることさえ必要としない。

検出可能な分析物を検出すると、酵素の活性レベルを比較するための定性的査定（例えば、検出可能な分析物が存在するか非存在であるかかどうか）または定量的査定（例えば、検出可能な分析物の存在量）が可能である。定量値を、任意の手段（試料中に存在する各画分の相対量を百分率で決定することなど）によって計算することができる。これらのタイプの計算方法は、当該分野で公知である。

検出可能な分析物は標識され得る。例えば、標識は、単離された検出可能な分析物がＰＣＲに供されるときに核酸に直接付加され得る。例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを使用してＰＣＲ反応を行うと、標識された産物が得られるであろう。標識されたヌクレオチド（フルオレセイン標識ＣＴＰなど）は、市販されている。核酸への標識の付着方法は当業者に周知であり、ＰＣＲ法に加えて、例えば、ニック翻訳および末端標識が挙げられる。

レポーターでの使用に好適な標識は、標準的な方法（分光学的方法、光化学的方法、生化学的方法、電気的方法、光学的方法、または化学的方法が挙げられる）によって検出可能な任意のタイプの標識を含む。標識は、蛍光標識であり得る。蛍光標識は、少なくとも１つのフルオロフォアを含む化合物である。市販の蛍光標識としては、例えば、フルオレセインホスホルアミダイト、ローダミン、ポリメタジン色素誘導体、リン光、テキサスレッド、緑色蛍光タンパク質、ＣＹ３、およびＣＹＳが挙げられる。

また、他の公知の技術（化学発光または比色（酵素呈色反応）など）を使用して、レポーターを検出することができる。また、「ドナー」フルオロフォアが酵素の結合部位である短い架橋によって「アクセプター」発色団に連結されたクエンチャー組成物が使用され得る。ドナーフルオロフォアのシグナルは、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）（蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）など）が関与すると考えられる過程によってアクセプター発色団によりクエンチされる。ペプチドが切断されると、発色団およびフルオロフォアが分離し、クエンチが除去され、その後にドナーフルオロフォアからシグナルが生成され、このシグナルが測定される。ＦＲＥＴ対の例としては、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）とＣＰＱ２、ＦＡＭとＤＡＢＣＹＬ、Ｃｙ５とＱＳＹ２１、Ｃｙ３とＱＳＹ７が挙げられる。

種々の実施形態では、活性センサは、活性センサが特定の組織または器官を標的にするのを補助するためのリガンドを含み得る。被験体に投与されたときに、活性センサは、体内への侵入方法に応じた種々の経路を介して体内に移動する。例えば、活性センサが静脈内投与された場合、活性センサが注射点から体循環に入り、体中を受動的に移動し得る。

特異的細胞内の酵素活性に応答するための活性センサについて、体内でのその滞留時間中のある時点で、活性センサは、酵素と出会い、酵素によって切断および線状化されて線状化されたレポーターまたは治療分子が放出される機会がなければならない。ターゲティングの観点から、かかる目的の酵素が存在し得る特異的細胞型または特異的組織型を標的にするための手段が活性センサに提供されることが有利である。これを達成するために、特異的細胞型または特異的組織型の受容体のリガンドが、調整ドメインとして提供され、ポリペプチドに連結され得る。

細胞表面受容体は、細胞外表面上のリガンドに結合する膜係留タンパク質である。一例を挙げれば、リガンドは、リガンド結合に応答して開口するイオンチャネルであるリガンド開口型イオンチャネルに結合し得る。リガンド開口型イオンチャネルは、細胞膜にまたがり、その中央部に疎水性チャネルを有する。チャネルの細胞外領域へのリガンド結合に応答して、タンパク質の構造は、ある特定の粒子またはイオンが通過し得るような方法で変化する。細胞表面上に存在するタンパク質のリガンドを含む調整ドメインを活性センサに提供することにより、活性センサは、細胞内の酵素活性を検出するための特異的細胞に到達して侵入する機会が増大する。

リガンドは、標的にされた細胞上の細胞表面タンパク質へのリガンドの結合を介して活性センサが被験体中の特異的細胞または特異的組織を標的にし得るので、活性センサに調整ドメインを提供することによって活性センサの分布が修正され得る。調整ドメインのリガンドは、小分子；ペプチド；抗体；抗体の断片；核酸；およびアプタマーを含む群から選択され得る。

活性センサが特異的組織に到達した時点で、リガンドはまた、特異的組織型中の活性センサの蓄積を促進し得る。特異的組織中に活性センサが蓄積されると、活性センサの滞留時間が増大し、プロテアーゼが存在する場合に活性センサが組織中のプロテアーゼによって酵素切断される機会が増加する。

活性センサが被験体に投与されたときに、活性センサは、免疫系によって外来物質として認識されて免疫クリアランスに供され得、それにより、特異的酵素活性が治療化合物またはレポーター分子を放出することができる特異的細胞または特異的組織に到達することは決して無い。さらに、免疫応答が生じることにより、免疫応答感受性活性センサの目的を果たすことができない。免疫による検出を阻害するために、免疫応答を誘発しないような生体適合性担体を使用することが好ましい（例えば、生体適合性担体は、１またはそれを超えるポリエチレングリコールマレイミドのサブユニットを含み得る）。さらに、ポリエチレングリコールマレイミド担体の分子量は、体内の移動を容易にし、かつ細網内皮系による活性センサのクリアランスを予防するように改変され得る。かかる改変により、体内または特異的組織中の活性センサの分布および滞留時間が改善され得る。

種々の実施形態では、活性センサは、細胞膜を横切った分散を促進するように操作され得る。上で考察されるように、活性センサの細胞取り込みは、十分に実証されている。Ｇａｎｇ．を参照のこと。また、細胞膜を横切った活性センサの拡散を容易にするための調整ドメインが活性センサに連結され得るように、疎水性鎖が提供され得る。

調整ドメインは、拡散を容易にする任意の好適な疎水性鎖（例えば、脂肪酸鎖（中性、飽和、（多価／一価）不飽和油脂（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド）が挙げられる）、リン脂質、ステロール（ステロイドアルコール）、動物ステロール（コレステロール）、ワックス、および脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫ））を含み得る。

いくつかの実施形態では、調整ドメインは、細胞透過性ペプチドを含む。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、開示の活性センサの細胞取り入れ／取り込みを容易にする短いペプチドである。ＣＰＰは、好ましくは、正電荷のアミノ酸（リジンまたはアルギニンなど）の相対存在量が高いか、極性／荷電アミノ酸および非極性の疎水性アミノ酸が交互になるパターンで含む配列を有するアミノ酸組成を有する。Ｍｉｌｌｅｔｔｉ，２０１２，Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｃｌａｓｓｅｓ，ｏｒｉｇｉｎ，ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １７：８５０－８６０（参考として援用される）を参照のこと。好適なＣＰＰとしては、文献中にＴａｔ、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ｐＶＥｃ、ＲＲＬヘリックス、Ｓｈｕｆｆｌｅ、およびＰｅｎｅｔｒａｍａｘとして公知のものが挙げられる。Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，２０１６，Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｎｏｎ－ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ ４（２）：ｅ１１７８３６９（参考として援用される）を参照のこと。

ある特定の実施形態では、活性センサは、活性センサを免疫検出から保護するか、マクロファージによる活性センサの細胞取り込みを阻害するための調整ドメインとして生体適合性ポリマーを含み得る。

外来物質が抗原として認識されるとき、抗体応答は、免疫系によって引き起こされ得る。一般に、次いで、抗体は外来物質に付着し、抗原－抗体複合体を形成し、次いで、この複合体がマクロファージおよび他の貪食細胞によって取り込まれて、身体からこれらの外来物質が除去されるであろう。そのようなものとして、活性センサが身体に侵入するとき、活性センサは抗原として認識され、免疫クリアランスに供され、活性センサが特異的組織に到達して酵素活性を検出することを阻止し得る。活性センサの免疫検出を阻害するために、例えば、ＰＥＧ調整ドメインが活性センサに連結され得る。ＰＥＧは、遮蔽物として作用し、免疫系によって活性センサが外来物質として認識されるのを阻害する。免疫検出を阻害することにより、調整ドメインは、体内または特異的組織中の活性センサの滞留時間を改善する。

酵素は、特異的基質に相補的な形状、電荷、および親水性／疎水性を有する結合ポケットによって、特異的基質に対する特異性が高い。そのようなものとして、酵素は、非常に類似する基質分子を、化学選択的に（すなわち、化学反応の結果が別の反応より優先される）、位置選択的に（すなわち、化学結合が生じるか破壊される方向が全ての他の可能な方向より優先される）、および立体特異的に（すなわち、１つの立体異性体またはそのサブセットのみと反応する）区別することができる。

立体効果は、立体障害を生じるイオンおよび分子の形状（すなわち、高次構造）および反応性に影響を及ぼす非結合相互作用である。立体障害は、分子間反応に影響を及ぼす立体容積に起因する化学反応の遅延である。種々の分子群は、群間の立体障害を制御するように（例えば、望ましくない副反応を阻害するために選択性を制御するように）改変され得る。活性センサの担体と切断部位および／または任意の生体抱合残基との間にスペーサー残基などの調整ドメインを提供することにより、活性センサの構成要素間の立体障害を最小にして、特異的プロテアーゼが切断部位により接近可能となり得る。あるいは、立体障害を上記のように使用して、不安定な環化リンカー（例えば、環状デプシペプチドのエステル結合）が分解されるまで、切断部位への接近を防止することができる。かかる不安定な環化リンカーは、標的環境の特異的な特徴に応答して選択され得る規定の条件（例えば、ｐＨまたはある特定の分析物の存在）で加水分解する他の公知の化学的部分であり得る。

種々の実施形態では、活性センサは、非特異的プロテアーゼ活性をさらに防止するために、標的切断部位とは別のＤ－アミノ酸を含み得る。他の非天然アミノ酸（合成ノンネイティブアミノ酸、置換アミノ酸、または１またはそれを超えるＤ－アミノ酸が挙げられる）がペプチドに組み込まれ得る。

いくつかの実施形態では、調整ドメインは、合成ポリマー（乳酸とグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリウレタンなど）、および天然ポリマー（アルギナートおよび他のポリサッカリド（デキストランおよびセルロースが挙げられる）、コラーゲン、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質など）、そのコポリマーおよび混合物を含み得る。

当業者は、本開示の活性センサ中のプロテアーゼ切断部位としてどのペプチドセグメントを含めるかを承知しているであろう。当業者は、切断部位を同定するためのオンラインツールまたは刊行物を使用することができる。例えば、切断部位は、Ｓｏｎｇ，２０１２，ＰＲＯＳＰＥＲ：Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｆｅａｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ，ＰＬｏＳＯｎｅ ７（１１）：ｅ５０３００（参考として援用される）に記載のオンラインデータベースＰＲＯＳＰＥＲにおいて予想される。本明細書中で考察された組成物、構造、方法、または活性センサのうちのいずれかは、例えば、任意の好適な切断部位、および任意の望ましい分子量を得るための任意のさらなる無作為なポリペプチドセグメントを含み得る。オフターゲット切断を防止するために、切断部位の外側の１つまたは任意の数のアミノ酸は、任意の量のＤ型および／またはＬ型の混合物であり得る。

参照による援用
本開示を通して、特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書が参照および引用されている。かかる文書はすべて、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される。

均等物
本明細書に表示されて記載されたものに加えて、本発明の種々の修正およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書中に引用された科学文献および特許文献の参照が含まれる本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書中の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な情報、例示、およびガイダンスを含む。

Claims (24)

1. 癌の進行を検出またはモニタリングする方法であって、
   癌の疑いがある患者に、癌関連酵素の切断部位を含む切断可能なリンカーによってレポーター分子に連結した担体を含む活性センサを投与する工程；
   前記患者から試料を回収する工程；
   前記試料を、前記レポーターの存在または欠如を検出するために分析する工程であって、前記レポーターの存在または欠如が前記患者の癌の状態を示す工程
   を含む、方法。
2. 前記癌関連酵素が免疫学的酵素であり、前記レポーターの存在が抗腫瘍免疫応答を示す、請求項１に記載の方法。
3. 前記レポーターの存在が、癌免疫処置の治療効果を示す、請求項２に記載の方法。
4. 前記治療効果が、薬学的処置に対する耐性の尺度である、請求項３に記載の方法。
5. 前記レポーターが、近赤外色素、核酸バーコード、またはタンパク質バイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
6. 前記担体が合成担体である、請求項１に記載の方法。
7. 前記担体が天然に存在する担体である、請求項１に記載の方法。
8. 前記投与する工程が、静脈内、経口、経皮、吸入、および脳内からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記活性センサが、標的腫瘍中に前記活性センサを局在化するように操作可能な調整ドメインをさらに含む、請求項３に記載の方法。
10. 前記癌関連酵素が、腫瘍成長中の発現に差がある酵素であり、前記レポーターの存在が、腫瘍成長を示す、請求項１に記載の方法。
11. 前記癌関連酵素が、細胞死中の発現に差がある酵素であり、前記レポーターの存在が、抗癌治療に対する治療反応を示す、請求項１に記載の方法。
12. 前記患者が癌免疫処置を受けておらず、前記レポーターの存在が、チェックポイント阻害剤治療に対する予想される治療反応を示す、請求項１に記載の方法。
13. 前記試料中の前記レポーターの検出に基づいて、臨床試験において前記患者を層別する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記分析する工程が、前記試料中のレポーターのレベルを定量する工程をさらに含み、前記方法が、
    前記投与する工程、回収する工程、および分析する工程を定期的に繰り返す工程であって、経時的な一連のレポーターレベルを調製する工程、および
    前記患者における癌進行を示す特徴の速度を決定する工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記免疫学的酵素が、カスパーゼおよびセリンプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
16. 癌進行をモニタリングするための活性センサであって、前記活性センサが、
    １またはそれを超える分子サブユニットを含む担体；
    複数の検出可能なレポーターであって、癌関連酵素の切断部位を含む切断可能なリンカーによって前記担体に各々が連結された、複数の検出可能なレポーター；および
    標的腫瘍中に前記活性センサを局在化するように操作可能な調整ドメイン
    を含み、前記活性センサが、１またはそれを超える癌関連酵素による切断の際の前記レポーターの放出によって前記１またはそれを超える癌関連酵素の活性を報告する、活性センサ。
17. 前記癌関連酵素が免疫学的酵素である、請求項１６に記載の活性センサ。
18. 前記免疫学的酵素が、カスパーゼおよびセリンプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１７に記載の活性センサ。
19. 前記調整ドメインが、前記標的腫瘍の受容体のリガンドを含む、請求項１６に記載の活性センサ。
20. 前記担体が、共有結合したＰＥＧサブユニットのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）足場を含む、請求項１６に記載の活性センサ。
21. 前記担体が、マルチアームＰＥＧ足場を含み、前記検出可能なレポーターおよび切断可能なリンカーの各々が、前記ＰＥＧ足場に連結したポリペプチドを含む、請求項１６に記載の活性センサ。
22. 前記リガンドの各々が、小分子；ペプチド；抗体；抗体の断片；核酸；またはアプタマーを含む、請求項１９に記載の活性センサ。
23. 複数のレポーターおよび複数の調整ドメインを含み、前記調整ドメインが、レポーターに連結した生体適合性ポリマーを含む、請求項１６に記載の活性センサ。
24. 前記活性センサが、前記切断可能なリンカーの切断の際に線状化される環状ペプチドを含む、請求項１６に記載の活性センサ。

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