JP2023523238A - デンドリマーおよび治療剤を含む組成物および方法 - Google Patents

Abstract

エクソソーム分泌を減少させる１つまたは複数の治療剤にコンジュゲートされているデンドリマーの組成物、ならびに１つまたは複数の神経疾患もしくは障害、がん、炎症疾患、細菌およびウイルス感染症、ならびに他の障害に関連する１つまたは複数の症状を処置する、緩和する、および／または防止するためのその使用方法が開発された。好ましくは、治療剤は、中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）の活性および／または量を阻害または低減する１つまたは複数の作用物質、例えばｎＳＭａｓｅ２の低分子阻害剤である。組成物は、精神障害および神経障害を有する対象におけるＡβプラーク形成を低減する、タウ伝播を低減する、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行うために特に適している。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月２４日に提出された米国特許仮出願第６３／０１５，１１８号の利益を主張する。

発明の分野
本発明は一般的に、薬物送達の分野にあり、特にデンドリマー製剤を介して結合した薬物を、それを必要とする神経炎症部位または領域に選択的に送達するための方法である。

発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、世界中で３５００万人を超える人が罹っている進行性の多因子疾患であり、老年期認知症の最も一般的な原因である。ＡＤの平均発生率は、１～３％であり、年齢６５歳を超える人では、総有病率は１０～３０％に関連し、これは世界全体では２０年毎にほぼ倍加すると予測される。平均すると、人は１０年間ＡＤを抱えて生きる。米国では、６５歳およびそれより高齢のおよそ５４０万人がＡＤを有すると診断されており、この数は、２０５０年までに１６００万人に上ると予想されている。ＡＤを抱えて生きている５００万人を超える人をケアするのにかかる総費用は、２０００億ドルであると推定され、２０５０年までに１．１兆ドルに上ると見積もられている。今日まで、ＡＤを防止する、遅らせる、または処置するために実質的な治療有効性を実証した介入はなく、いくつかは、実際には疾患進行を加速している。

ＡＤの分野の研究は、複雑な疾患の病理生理学を包含し、疾患の複数の異なる態様を標的化するより多様な治療パイプラインを可能にしている。診療所で現在利用可能な治療剤、すなわちアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、およびＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるメマンチンのみが疾患の改善に役立つが、これは基礎となる疾患を低減も阻害もしない。アミロイドベータ（Ａβ）産生を阻害するためのＢＡＣＥ－１またはγ－セクレターゼ阻害剤、脳からＡβを除去するための抗Ａβ免疫療法、およびタウに基づく病態に対処するように設計された化合物を使用する最近の臨床試験は、有望な結果を生じていない。

著しい努力にもかかわらず、ＡＤの顕著な特徴であるニューロン損傷、または関連する認知低下もしくは認知機能障害を修復するまたはそれに対抗するために承認されている有効な治療剤も処置方法もない。新規疾患修飾処置が非常に必要である。

多くの疾患および障害は、それに対して有効な処置があったとしてもほとんどなく、衰弱性の副作用が必然的に問題となる。例としては、多くのがんおよび感染疾患が挙げられ、そのほとんどが一次構成要素として炎症を有する。

したがって、本発明の目的は、炎症全般、ならびにアルツハイマー病に関連するニューロン損傷および関連する認知低下もしくは認知機能障害の処置または防止のための組成物を提供することである。

したがって、本発明の目的は、病態の有意な関与因子として炎症を有するがん、感染疾患、および神経疾患、例えばアルツハイマー病の発生および進行に関連する病理プロセスを低減または防止する組成物、ならびにそれを作製および使用する方法を提供することである。

同様に本発明の目的は、アルツハイマー病に関連するニューロン損傷および関連する認知低下もしくは認知機能障害の処置または防止のための組成物、ならびにそれを作製および使用する方法を提供することである。

発明の概要
病態の有意な関与因子として炎症を有するがん、感染疾患、および神経疾患、例えばアルツハイマー病の発生および進行に関連する病理プロセスの処置のための治療剤にコンジュゲートされているデンドリマーの組成物が開発された。

エクソソーム分泌を減少させる、がんおよび一部の感染疾患に存在する炎症などの炎症を低減する、Ａβプラーク形成を低減する、タウ伝播を低減する、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行う１つまたは複数の治療剤にカップリングまたは封入されたデンドリマーを含む組成物ならびにその作製および使用する方法が提供される。一部の実施形態では、デンドリマーは、１つまたは複数の治療剤と複合体を形成している、それに共有結合によりコンジュゲートされている、それが分子内に分散している、またはそれが封入されている。

好ましくは、治療剤は、中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）の活性および／または量を阻害または低減する１つまたは複数の作用物質、例えば１つまたは複数のｎＳＭａｓｅ２の阻害剤である。例示的なｎＳＭａｓｅ２阻害剤としては、２，６－ジメトキシ－４－（５－フェニル－４－（チオフェン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェノール（ＤＰＴＩＰ）、フェニル（Ｒ）－（１－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）－２，６－ジメチルイミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－８－イル）ピロリジン－３－イル）－カルバメート（ＰＤＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ビス［４－（４，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェニル］－３，３’－ｐ－フェニレン－ビス－アクリルアミド二塩酸塩（ＧＷ４８６９）、およびカンビノールが挙げられる。

一部の実施形態では、デンドリマーは、世代４～８のデンドリマー、例えば世代４、世代５、世代６、世代７、または世代８のデンドリマーである。例示的なデンドリマーとしては、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、特にヒドロキシルで終端したＰＡＭＡＭデンドリマーが挙げられる。好ましい実施形態では、デンドリマーは、１つまたは複数の治療剤に共有結合によりコンジュゲートされている。

デンドリマー組成物および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物もまた提供される。特に、ハイドロゲル、ナノ粒子、またはマイクロ粒子、懸濁剤、散剤、錠剤、カプセル剤、および液剤を含む、非経口または経口投与にとって適した製剤が記載される。

対象における炎症、例えばがんおよび一部の感染疾患および神経障害、例えばアルツハイマー病に存在する炎症に関連する１つまたは複数の病理プロセスおよび／または症状を処置する、緩和する、および／または防止する、例えばＡβプラーク形成を低減する、タウ伝播を低減する、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行うための方法もまた提供される。方法は、炎症、がん、感染疾患、または神経疾患、例えばアルツハイマー病に関連する１つまたは複数の病理プロセスおよび／または症状を処置する、緩和する、および／または防止するために有効量のデンドリマー組成物を対象に全身投与することを含む。好ましくは、組成物は、脳におけるエクソソーム分泌を減少させる、脳におけるＡβプラーク形成および／もしくはタウ伝播を低減する、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行う；活性化ミクログリアにおける中性スフィンゴミエリナーゼ２の活性および／または量を阻害または低減する；あるいは対象の脳脊髄液および／または血清中のセラミドの濃度を低減する。方法は、ＡＤもしくは認知症、がん、炎症、または感染疾患の発生に関連する１つまたは複数の生物学的マーカーを有する対象を同定することを含み得る。好ましい実施形態では、デンドリマー組成物は、健康対照対象と比較して脳脊髄液および／または血清中の増加したセラミドレベルを有する対象に投与される。一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象において、脳および／もしくは血清中のエクソソームの量を低減する、脳および／もしくは血清中のセラミドレベルを低減する、血清中抗セラミドＩｇＧを低減する、グリア活性化を低減する、総Ａβ４２およびプラーク負荷を低減する、タウのリン酸化を低減する、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行う。他の実施形態では、方法は、対象の脳の活性化ミクログリアにおける中性スフィンゴミエリナーゼ２の活性を阻害する、新規ニューロンの生成を増加させる、または対象におけるニューロン喪失速度を低減もしくは防止する、脳重量を増加させる、および／または対象の脳重量の減少速度を低減もしくは防止する、海馬体積を増加させる、および／または対象の海馬体積の減少速度を低減もしくは防止する。方法は、有効量のデンドリマー組成物を対象、好ましくは健康対照対象と比較して脳脊髄液および／または血清中のセラミドレベルが増加している、ならびに／またはアルツハイマー病、がん、感染疾患および／もしくは炎症を有する対象に経口、または非経口、または静脈内投与することを含む。それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法は、がんを処置するため、腫瘍サイズを低減するため、または腫瘍の成長を阻害するために有効量のデンドリマー組成物を対象に全身投与することを含む。例示的ながんとしては、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮がん、膵臓がん、皮膚がん、多発性骨髄腫、前立腺がん、精巣胚細胞腫瘍、脳がん、口腔がん、食道がん、肺がん、肝臓がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、十二指腸がん、胃がん、および結腸がんが挙げられる。一部の実施形態では、方法は、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－１リガンドアンタゴニスト、およびＣＴＬＡ４アンタゴニストからなる群より選択される１つまたは複数の免疫チェックポイント調節剤を対象に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、養子Ｔ細胞療法および／またはがんワクチンを対象に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、手術または放射線療法も含む。方法は、がんを処置するために有効量のデンドリマー組成物を対象に経口または非経口投与することを含む。

それを必要とする対象における１つまたは複数の炎症疾患または障害を処置または緩和するための方法は、１つまたは複数の炎症疾患または障害に関連する１つまたは複数の症状を処置または緩和するために有効量のデンドリマー組成物を対象に投与することを含む。方法は、気道炎症、アレルギー性気道炎症、アテローム性動脈硬化症、脳虚血、肝虚血再灌流傷害、心筋梗塞、および敗血症を処置するために特に適している。一部の実施形態では、１つまたは複数の炎症疾患または障害に関連する１つまたは複数の炎症促進性細胞を抑制または阻害するために有効な量のデンドリマー組成物が投与される。一部の実施形態では、デンドリマー組成物は、炎症促進性細胞、例えば活性化マクロファージまたはミクログリアを抑制または阻害するために有効な量で投与される。

それを必要とする対象における１つまたは複数の細菌、寄生生物、またはウイルス感染症を処置または緩和するための方法も提供される。方法は、例えば１つまたは複数の原因因子、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ジカウイルス、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、狂犬病、ランガットウイルス（ＬＧＴＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のイプシロン毒素、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の志賀毒素によって引き起こされる１つまたは複数のウイルス、細菌、または寄生生物感染症に関連する１つまたは複数の症状を処置または緩和するために有効量のデンドリマー組成物を対象に投与することを含む。方法は、１つまたは複数の原因因子が、活性化マクロファージ／ミクログリア、またはアストロサイトを標的とするまたはそれらに感染する場合、１つまたは複数の症状を処置または緩和するために適している。典型的に、組成物は、感染性因子の複製、負荷、および／または放出を低減または阻害するために有効な量で投与される。

図１は、ＡＤを有する患者からの脳脊髄液（ＣＳＦ）中のセラミド含有量を対照個体と対比して示す棒グラフである。

図２Ａおよび２Ｂは、ＤＰＴＩＰ（ＩＣ５０＝３０ｎＭ）（図２Ａ）、およびその不活性な脱ヒドロキシルアナログ（ＩＣ５０＞１００μＭ）（図２Ｂ）によるｎＳＭａｓｅ２の阻害を示す線グラフである。

図３は、ＤＰＴＩＰの異なる濃度（０μＭ～１００μＭ）でマウス初代グリアによって放出されたエクソソームの量（ＥＶｓ／ｍｌ）を示す線グラフである。

図４は、８０時間の期間にわたる注射した用量のパーセントとして表現される世代４（Ｇ４）およびＧ６デンドリマーの血漿中薬物動態をＤＰＴＩＰと対比して示す線グラフである。

図５Ａおよび５Ｂは、デンドリマー－ＤＰＴＩＰ（Ｄ－ＤＰＴＩＰ）コンジュゲートの合成を示す概略図であり、切断可能なエステル結合を通して直交型リンカーをアジド末端に付着させるようにＤＰＴＩＰを修飾するステップ（図５Ａ）、およびデンドリマー表面を、相補的アルキン基を有するリンカーを付着するように修飾し、このように非常に効率的な銅（Ｉ）触媒アルキン－アジドクリック（ＣｕＡＡＣ）ケミストリーを可能にしてＤ－ＤＰＴＩＰコンジュゲートを産生するステップを含む（図５Ｂ）。

図６は、生理的温度でエステラーゼ（ｐＨ５．５）の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで６００時間の期間にわたるＤ－ＤＰＴＩＰコンジュゲートからのＤＰＴＩＰのパーセンテージを示す線グラフである。

図７は、経口投与後のビヒクル処置群およびＤ－ＤＰＴＩＰ処置群の脳のグリア細胞におけるＳＭｎａｓｅ２活性（ＲＦＵ／ｍｇ／ｈ）を示す棒グラフである。

図８Ａおよび８Ｂは、Ｄ－ＤＰＴＩＰの、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇ遊離薬物当量での経口投与の２４時間後、７２時間後、および１２０時間後の血漿（図８Ａ）および脳（図８Ｂ）におけるＤ－ＤＰＴＩＰからのＤＰＴＩＰ濃度（ｐｍｏｌ／ｍｌまたはｐｍｏｌ／ｇ）を示す棒グラフである。

図９Ａおよび９Ｂは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ Ｄ－ＤＰＴＩＰ、または１００ｍｇ／ｋｇ Ｄ－ＤＰＴＩＰの経口投与後のｈＴａｕ注射ＰＳ１９（ＡＤ）マウスおよびｈＴａｕを注射していない（注射なし）マウスの脳ミクログリア細胞（図９Ａ）および非ミクログリア細胞（図９Ｂ）におけるｎＳＭａｓｅ２活性（ＲＦＵ／ｍｇ／ｈ）を示す棒グラフである。

図１０は、アイソタイプ対照、抗ＰＤＬ１、Ｄ－ＤＰＴＩＰ対照、または抗ＰＤＬ１と組み合わせたＤ－ＤＰＴＩＰ（抗ＰＤＬ１＋Ｄ－ＤＰＴＩＰ）のｉ．ｐ．注射によって処置した６～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭ３８注射後２８日間にわたる腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す線グラフである。

図１１は、Ｄ－ＤＰＴＩＰの１０ｍｇ／ｋｇ遊離薬物（ＤＰＴＩＰ）当量での投与の６時間後、２４時間後、および４８時間後での血漿（図１１Ａ）および腫瘍（図１１Ｂ）におけるＤ－ＤＰＴＩＰからのＤＰＴＩＰの濃度（ｐｍｏｌ／ｍｌまたはｐｍｏｌ／ｇ）を示す棒グラフである。

図１２は、ビヒクル処置またはＤ－ＤＰＴＩＰ処置マウスにおける対側／同側歯状回（ＤＧ）のニューロンにおける平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「活性剤」または「生物学的作用物質」という用語は、予防的、治療的、または診断的であり得る所望の薬理学的および／または生理的効果を誘導する化学化合物(chemical compound)または生物学的化合物を指すために互換的に使用される治療剤、予防剤、または診断剤である。これらは、核酸、核酸アナログ、分子量２ｋＤ未満、より典型的には１ｋＤ未満を有する低分子、ペプチド模倣体、タンパク質もしくはペプチド、炭水化物もしくは糖、脂質、またはそれらの組合せであり得る。用語はまた、これらに限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、およびアナログを含む作用物質の薬学的に許容される、薬理学的に活性な誘導体も包含する。

「アナログ」という用語は、別の（参照化合物）の構造と類似であるが、特定の構成要素、官能基、原子等に関してそれとは異なる構造を有する化学化合物を指す。

「誘導体」という用語は、１つまたは複数の化学反応（複数可）によって親化合物から形成された化合物を指す。

「薬学的に許容される塩」という用語は、当技術分野で認識され、化合物の比較的非毒性の無機および有機酸付加塩を含む。薬学的に許容される塩の例としては、無機酸、例えば塩酸および硫酸に由来する塩、ならびに有機酸、例えばエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸に由来する塩が挙げられる。塩の形成に適した無機塩基の例としては、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、および亜鉛の塩酸塩、炭酸塩、および重炭酸塩が挙げられる。塩はまた、非毒性でそのような塩を形成するために十分に強い塩基を含む適した有機塩基からも形成され得る。例示目的のために、そのような有機塩基のクラスは、モノ、ジ、およびトリアルキルアミン、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、およびトリエチルアミン；モノ、ジ、またはトリヒドロキシアルキルアミン、例えばモノ、ジ、およびトリエタノールアミン；アミノ酸、例えばアルギニンおよびリシン；グアニジン；Ｎ－メチルグルコサミン；Ｎ－メチルグルカミン；Ｌ－グルタミン；Ｎ－メチルピペラジン；モルホリン；エチレンジアミン；Ｎ－ベンジルフェネチルアミンを含み得る。

「治療剤」という用語は、疾患または障害の１つまたは複数の症状を処置するために投与することができる作用物質を指す。

「診断剤」という用語は一般的に、病理プロセスの局在を明らかにする、位置を正確に示す、および画定するために投与することができる作用物質を指す。診断剤は、標的細胞を標識することができ、これによってこれらの標識された標的細胞のその後の検出またはイメージングを可能にする。一部の実施形態では、診断剤は、デンドリマーまたは適した送達ビヒクルを介して中枢神経系（ＣＮＳ）における活性化ミクログリアを標的化する／結合することができる。

「予防剤」という用語は一般的に、ワクチンなどの、疾患を防止するまたはある特定の状態を防止するために投与することができる作用物質を指す。

「薬学的に許容される」、または「生体適合性」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしに、妥当な利益／リスク比に見合う、人間および動物の組織と接触して使用するために適した組成物、ポリマー、および他の材料、および／または剤形を指す。「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば任意の対象組成物を、体の１つの臓器または部分から体の別の臓器または部分へと移動させるまたは輸送することに関係する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、溶媒、または封入材料を指す。各担体は、対象組成物の他の成分と適合性であり、患者に対して有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。

「治療有効量」という用語は、デンドリマーの中および／または上に組み込まれた場合に、任意の医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で、何らかの所望の効果を生じる治療剤の量を指す。有効量は、処置される疾患または状態、投与される特定の標的化構築物、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度などの要因に応じて変化し得る。当業者は経験的に、過度の実験を必要とすることなく特定の化合物の有効量を決定し得る。一部の実施形態では、「有効量」という用語は、１つまたは複数の疾患または障害の症状を低減するまたは減少させる、例えばアルツハイマー病等に罹患している個体における学習および／または記憶の欠如を低減する、防止する、または逆転させる治療剤または予防剤の量を指す。１つまたは複数の神経疾患または神経変性疾患では、薬物の有効量は、新規ニューロンの生成をもたらす神経有糸分裂の刺激または誘導の効果を有し得る、すなわち神経原性効果である、神経喪失速度の減少を含む神経喪失の防止または遅延を示し、すなわち神経保護効果を示す。有効量は、１回または複数回投与で投与することができる。

阻害の文脈における「阻害する」または「低減する」という用語は、活性および量を低減または減少させることを意味する。これは、活性または量の完全な阻害もしくは低減、または部分的阻害もしくは低減であり得る。阻害または低減は、対照または標準レベルと比較することができる。阻害は、５、１０、２５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％であり得る。例えば、１つまたは複数の阻害剤を含むデンドリマー組成物は、ｎＳＭａｓｅ２関連活性化ミクログリアの活性および／または量を、デンドリマー組成物を投与されなかったまたはデンドリマー組成物によって処置されなかった対象の同等の組織中の同じ細胞の活性および／または量から約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害または低減し得る。一部の実施形態では、阻害および低減は、ｍＲＮＡ、タンパク質、細胞、組織、および臓器レベルで比較される。例えば、無処置対照対象と比較した、神経喪失速度、脳重量の減少速度、または海馬体積の減少速度の阻害および低減。

疾患、障害、または状態が、疾患、障害、および／または状態に対する素因を有し得るが、まだそれらを有すると診断されていない動物に起こるのを「処置する」または「防止する」という用語は、疾患、障害、または状態を阻害する、例えばその進行を妨害する；および疾患、障害、または状態を緩和する、例えば疾患、障害、および／または状態の後退を引き起こすことを含む。疾患または状態を処置することは、たとえ基礎となる病理生理学が影響を受けていない場合であっても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を改善すること、例えばそのような作用物質が疼痛の原因を処置しない場合であっても鎮痛剤の投与によって対象の疼痛を処置することを含む。処置の望ましい効果は、疾患進行速度を減少させること、疾患状態を改善するまたは和らげること、および寛解または向上した予後を含む。例えば、これらに限定されないが、ニューロン喪失速度を低減すること、疾患に起因する症状を減少させること、疾患に罹患している個体の生活の質を増加させること、疾患を処置するために必要な他の薬物治療の用量を減少させること、疾患の進行を遅らせること、および／または個体の生存を延長させることを含む、アルツハイマー病に関連する１つまたは複数の症状が軽減されるまたは排除される場合、個体は首尾よく「処置されている」。

「生分解性」という用語は一般的に、生理的条件下で、対象によって代謝、排除、または排泄されることが可能なより小さい単位または化学種へと分解または腐食する材料を指す。分解時間は、組成および形態学の関数である。

「デンドリマー」という用語は、これらに限定されないが、内部コア、この開始コアに規則正しく付着した反復単位の内層（または「世代」）、および最も外側の世代に付着した末端基の外部表面を有する分子構造を含む。

「官能化する」という用語は、官能基または部分の付着をもたらすように化合物または分子を修飾することを意味する。例えば、分子は、分子を強い求核試薬または強い求電子試薬にする分子の導入によって官能化され得る。

「標的化部分」という用語は、特定の場所に局在するまたは特定の場所から離れて局在する部分を指す。部分は、例えばタンパク質、核酸、核酸アナログ、炭水化物、または低分子であり得る。実体は、例えば低分子などの治療化合物、または検出可能な標識などの診断的実体であり得る。場所は組織、特定の細胞タイプ、または細胞内区画であり得る。一実施形態では、標的化部分は、作用物質の局在を方向付ける。好ましい実施形態では、デンドリマー組成物は、追加の標的化部分の非存在下で活性化ミクログリアを選択的に標的化することができる。

「延長された滞留時間」という用語は、作用物質が患者の体、またはその患者の臓器もしくは組織から取り除かれるために要する時間の増加を指す。ある特定の実施形態では、「延長された滞留時間」は、デンドリマーなどの送達ビヒクルへのコンジュゲーションのない同等の作用物質などの比較標準よりも１０％、２０％、５０％、または７５％長い半減期で取り除かれる作用物質を指す。ある特定の実施形態では、「延長された滞留時間」は、特定の細胞タイプを特異的に標的化するデンドリマーを有しない同等の作用物質などの比較標準よりも２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、または１００００倍長い半減期で取り除かれる作用物質を指す。

「組み込まれた」および「封入された」という用語は、所望の適用におけるそのような作用物質の放出、例えば持続的な放出を可能にする組成物の中におよび／または組成物の上に作用物質を組み込む、製剤化する、またはそうでなければ含めることを指す。作用物質または他の材料は、そのようなデンドリマーの１つまたは複数の表面官能基に結合することによって（共有結合、イオン結合、または他の結合相互作用によって）、物理的混合によって、作用物質を樹枝状構造内に包むことによって、および／または作用物質を樹枝状構造の内部に封入することによって、デンドリマーに組み込むことができる。

ＩＩ．組成物
１つまたは複数の作用物質、特に１つまたは複数の神経疾患および神経変性疾患、特に認知症、がん、感染疾患、および炎症に関連する他の障害を防止する、処置する、または診断するための１つまたは複数の作用物質を送達するために適したデンドリマー複合体が開発された。

デンドリマー複合体の組成物は、デンドリマーに封入された、会合するおよび／またはコンジュゲートされている１つまたは複数の予防剤、治療剤、および／または診断剤を含む。一般的に、１つまたは複数の作用物質は、約０．０１重量％～約３０重量％、好ましくは約１重量％～約２０重量％、より好ましくは約５重量％～約２０重量％の濃度でデンドリマー複合体に封入される、会合する、および／またはコンジュゲートされている。好ましくは、作用物質は、必要に応じて１つまたは複数のスペーサーを介して、１つまたは複数の連結、例えばジスルフィド、エステル、エーテル、チオエステル、カルバメート、カーボネート、ヒドラジン、およびアミドを介してデンドリマーに共有結合によりコンジュゲートされている。一部の実施形態では、スペーサーは、作用物質、例えばＮ－アセチルシステインである。例示的な作用物質としては、抗炎症薬、化学療法剤、抗てんかん剤、血管拡張剤、および抗感染剤が挙げられる。

追加の作用物質の存在は、粒子のゼータ電位または表面電荷に影響を及ぼし得る。一実施形態では、デンドリマーのゼータ電位は、－１００ｍＶ～１００ｍＶの間、－５０ｍＶ～５０ｍＶの間、－２５ｍＶ～２５ｍＶの間、－２０ｍＶ～２０ｍＶの間、－１０ｍＶ～１０ｍＶの間、－１０ｍＶ～５ｍＶの間、－５ｍＶ～５ｍＶの間、または－２ｍＶ～２ｍＶの間である。好ましい実施形態では、表面電荷は中性またはほぼ中性である。上記の範囲は、－１００ｍＶ～１００ｍＶの全ての値を含む。

Ａ．デンドリマー
デンドリマーは、高密度の表面末端基を含む三次元の高分岐、単分散、球状かつ多価の高分子である（Tomalia, D. A., et al., Biochemical Society Transactions, 35, 61(2007);およびSharma, A., et al., ACS Macro Letters, 3, 1079 (2014)）。その独自の構造および物理的特色のために、デンドリマーは、標的化薬物／遺伝子送達、イメージングおよび診断を含む様々な生物医学的適用のためのナノ担体として有用である（Sharma,A., et al., RSC Advances, 4, 19242 (2014);Caminade, A.-M., et al., Journal ofMaterials Chemistry B, 2, 4055 (2014);Esfand, R., et al., Drug Discovery Today,6, 427 (2001);およびKannan, R. M., et al., Journal of Internal Medicine, 276, 579(2014)）。

デンドリマー表面基は、その生体分布に顕著な影響を有する（Nance, E., et al.,Biomaterials, 101, 96(2016)）。いかなる標的化リガンドも有しないヒドロキシルで終端した世代４のＰＡＭＡＭデンドリマー（約４ｎｍサイズ）は、脳麻痺（ＣＰ）のウサギモデルにおける全身投与の際、機能不全のＢＢＢを健康な対照と比較して大幅により多く（＞２０倍）通過し、活性化ミクログリアおよびアストロサイトを選択的に標的化する（Lesniak,W. G., et al., Mol Pharm, 10(2013)）。

「デンドリマー」という用語は、これらに限定されないが、内部コア、およびこの内部コアに付着し、そこから伸びる反復単位の層（または「世代」）を有する分子構造であって、各層が１つまたは複数の分岐点を有し、末端基の外部表面が最も外側の世代に付着している、分子構造を含む。一部の実施形態では、デンドリマーは、通常のデンドリマー分子構造または「スターバースト」分子構造を有する。

一般的に、デンドリマーは、約１ｎｍ～約５０ｎｍの間、より好ましくは約１ｎｍ～約２０ｎｍの間、約１ｎｍ～約１０ｎｍの間、または約１ｎｍ～約５ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、直径は、約１ｎｍ～約２ｎｍの間である。コンジュゲートは、一般的に同じサイズ範囲にあるが、大きいタンパク質、例えば抗体はサイズを５～１５ｎｍ増加させ得る。一般的に作用物質は、より大きい世代のデンドリマーの場合、１：１～４：１の間の作用物質のデンドリマーに対する比で封入される。好ましい実施形態では、デンドリマーは、脳組織を浸透するために、および標的細胞において長期間保持するために有効な直径を有する。

一部の実施形態では、デンドリマーは、約５００ダルトン～約１００，０００ダルトンの間、好ましくは約５００ダルトン～約５０，０００ダルトンの間、最も好ましくは約１，０００ダルトン～約２０，０００ダルトンの間の分子量を有する。

使用することができる適したデンドリマー足場は、ＰＡＭＡＭまたはＳＴＡＲＢＵＲＳＴ（商標）デンドリマーとしても公知のポリ（アミドアミン）デンドリマー；ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、および／または芳香族ポリエーテルデンドリマーを含む。デンドリマーは、カルボン酸、アミンおよび／またはヒドロキシルの終端を有し得る。デンドリマーは、全てまたはあるパーセンテージのこれらの終端を有し得る。好ましい実施形態では、デンドリマーは、主にヒドロキシルで終端する。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同じまたは類似のまたは異なる化学的性質のデンドリマーであり得る（例えば、第１のデンドリマーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーを含み得るが、第２のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーであり得る）。

「ＰＡＭＡＭデンドリマー」という用語は、アミドアミン構築ブロックを有する異なるコアを含有し得るポリ（アミドアミン）デンドリマーを意味し、これは、これらに限定されないが、世代１のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代２のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代３のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代４のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代５のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代６のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代７のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代８のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代９のＰＡＭＡＭデンドリマー、または世代１０のＰＡＭＡＭデンドリマーを含む任意の世代のカルボン酸、アミン、およびヒドロキシルの終端を有し得る。好ましい実施形態では、デンドリマーは製剤に可溶性であり、世代（「Ｇ」）４、５、または６のデンドリマーである。デンドリマーは、その機能的表面基に付着したヒドロキシル基を有し得る。

デンドリマーを作製するための方法は、当業者に公知であり、一般的に中心の開始コア（例えば、エチレンジアミンコア）周囲に樹枝状β－アラニン単位の同心円状のシェル（世代）を生じる２ステップ反復反応シーケンスを伴う。各その後の成長ステップは、より大きい分子直径を有するポリマーの新規「世代」を表し、これは反応性表面部位の数が２倍であり、その後の世代の分子量をおよそ倍加させる。使用に適したデンドリマー足場は、多様な世代で市販されている。好ましくは、デンドリマー組成物は、世代０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のデンドリマー足場に基づく。そのような足場はそれぞれ、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４、２０４８、および４０９６個の反応部位を有する。このように、これらの足場に基づくデンドリマー化合物は、対応する数までの組み合わせた標的化部分と作用物質（あるとすれば）を有し得る。

一部の実施形態では、デンドリマーは、複数のヒドロキシル基を含む。一部の例示的な高密度ヒドロキシル基含有デンドリマーは、市販のポリエステル樹枝状ポリマー、例えば高分岐２，２－ビス（ヒドロキシル－メチル）プロピオン酸ポリエステルポリマー（例えば、高分岐ビス－ＭＰＡポリエステル－６４－ヒドロキシル、世代４）、樹枝状ポリグリセロールを含む。

一部の実施形態では、高密度ヒドロキシル基含有デンドリマーは、オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）様デンドリマーである。例えば、世代２のＯＥＧデンドリマー（Ｄ２－ＯＨ－６０）は、非常に効率的、ロバストで、原子経済的な化学反応、例えばＣｕ（Ｉ）触媒アルキン－アジドクリックおよび光触媒チオール－エンクリックケミストリーを使用して合成することができる。最少の反応ステップでの非常に低い世代の高密度ポリオールデンドリマーは、例えば国際特許公開第ＷＯ２０１９０９４９５２号に記載される直交型ハイパーモノマーおよびハイパーコア戦略を使用することによって達成することができる。一部の実施形態では、デンドリマー骨格は、ｉｎ ｖｉｖｏでデンドリマーの崩壊を回避するために、およびそのようなデンドリマーの、体からの単一の実体としての排除（非生分解性）を可能にするために、構造全体に切断不能なポリエーテル結合を有する。

一部の実施形態では、デンドリマーは、特定の組織領域および／または細胞タイプ、好ましくはＣＮＳにおける活性化マクロファージを特異的に標的化する。好ましい実施形態では、デンドリマーは、標的化部分なしに特定の組織領域および／または細胞タイプを特異的に標的化する。

好ましい実施形態では、デンドリマーは、デンドリマーの辺縁部に複数のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有する。ヒドロキシル（－ＯＨ）基の好ましい表面密度は、少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ^２（ヒドロキシル表面基の数／表面積ｎｍ^２）である。例えば、一部の実施形態では、ヒドロキシル基の表面密度は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０よりも大きく；好ましくは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５０よりも大きい。さらなる実施形態では、ヒドロキシル（－ＯＨ）基の表面密度は、約１～約５０の間、好ましくは５～２０ＯＨ基／ｎｍ^２（ヒドロキシル表面基の数／表面積ｎｍ^２）であるが、約５００Ｄａ～約１０ｋＤａの間の分子量を有する。

一部の実施形態では、デンドリマーは、外部表面に露出した一部のヒドロキシル基を有し、その他はデンドリマーの内部コアに有し得る。好ましい実施形態では、デンドリマーは、少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ^３（ヒドロキシル基の数／体積ｎｍ^３）のヒドロキシル（－ＯＨ）基の体積密度を有する。例えば、一部の実施形態では、ヒドロキシル基の体積密度は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０よりも大きく、１５よりも大きく、２０よりも大きく、２５よりも大きく、３０よりも大きく、３５よりも大きく、４０よりも大きく、４５よりも大きく、および５０よりも大きい。一部の実施形態では、ヒドロキシル基の体積密度は、約４～約５０基／ｎｍ^３の間、好ましくは約５～約３０基／ｎｍ^３の間、より好ましくは約１０～約２０基／ｎｍ^３の間である。

Ｂ．カップリング剤およびスペーサー
デンドリマー複合体は、デンドリマー、樹枝状ポリマー、または高分岐ポリマーにコンジュゲートされているまたは付着している治療剤または化合物から形成することができる。必要に応じて、作用物質は、１つまたは複数のスペーサー／リンカーを介して、異なる連結、例えばジスルフィド、エステル、カーボネート、カルバメート、チオエステル、ヒドラジン、ヒドラジド、およびアミド連結を介してデンドリマーにコンジュゲートされている。デンドリマーと作用物質の間の１つまたは複数のスペーサー／リンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏでデンドリマー活性複合体の放出可能形態または放出不能形態を提供するように設計することができる。一部の実施形態では、付着は、作用物質とデンドリマーの間にエステル結合を提供する適切なスペーサーを介して起こる。一部の実施形態では、付着は、作用物質とデンドリマーの間にアミド結合を提供する適切なスペーサーを介して起こる。好ましい実施形態では、デンドリマーと作用物質の間の１つまたは複数のスペーサー／リンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏで所望かつ有効な放出動態を達成するために付加される。

「スペーサー」という用語は、治療剤をデンドリマーに連結するために使用される組成物を含む。スペーサーは、ポリマーと治療剤またはイメージング剤を架橋するために共に連結される単一の化学実体または２つもしくはそれより多くの化学実体のいずれかであり得る。スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、およびカーボネート終端を有する任意の低分子化学実体、ペプチド、またはポリマーを含み得る。

スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンおよびカーボネート基で終端する化合物のクラスの中から選択することができる。スペーサーは、チオピリジンで終端した化合物、例えばジチオジピリジン、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエートＬＣ－ＳＰＤＰまたはスルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰを含み得る。スペーサーはまた、本質的にスルフヒドリル基を有する直線状または環状である、例えばグルタチオン、ホモシステイン、システインおよびその誘導体、ａｒｇ－ｇｌｙ－ａｓｐ－ｃｙｓ（ＲＧＤＣ）、シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）（ｃ（ＲＧＤｆＣ））、シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ）、シクロ（Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｓｐ－ｄ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ）であるペプチドも含み得る。スペーサーは、メルカプト酸誘導体、例えば３メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、４メルカプト酪酸、チオラン－２－オン、６メルカプトヘキサン酸、５メルカプト吉草酸、および他のメルカプト誘導体、例えば２メルカプトエタノールおよび２メルカプトエチルアミンであり得る。スペーサーは、チオサリチル酸およびその誘導体、（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－メチル－アルファ－２－ピリジルチオ）トルエン、（３－［２－ピリジチオ］プロピオニルヒドラジドであり得る。スペーサーは、マレイミド終端を有し得、スペーサーは、ビス－マレイミドジエチレングリコールおよびビス－マレイミドトリエチレングリコール、ビス－マレイミドエタン、ビスマレイミドヘキサンなどのポリマーまたは低分子化学実体を含む。スペーサーは、ビニルスルホン、例えば１，６－ヘキサン－ビス－ビニルスルホンを含み得る。スペーサーは、チオグリコシド、例えばチオグルコースを含み得る。スペーサーは、還元型タンパク質、例えばウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン、ジスルフィド結合を形成することが可能な任意のチオールで終端した化合物であり得る。スペーサーは、マレイミド、スクシンイミジル、およびチオール終端を有するポリエチレングリコールを含み得る。

作用物質および／または標的化部分は、共有結合により付着させられるか、または分子内に分散されるか、または封入されるかのいずれかであり得る。デンドリマーは、好ましくはカルボン酸、ヒドロキシル、またはアミン終端を有する世代１０までのＰＡＭＡＭデンドリマーである。好ましい実施形態では、デンドリマーは、ジスルフィド、エステル、またはアミド結合で終わるスペーサーを介して作用物質に連結される。

Ｃ．治療剤、予防剤、および診断剤
送達される粒子に含まれる作用物質は、タンパク質もしくはペプチド、糖もしくは炭水化物、核酸もしくはオリゴヌクレオチド、脂質、低分子（例えば、分子量２０００ダルトン未満、好ましくは１５００ダルトン未満、より好ましくは３００～７００ダルトン）、またはそれらの組合せであり得る。核酸は、タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡ発現カセットまたはｍＲＮＡであり得る。代表的なオリゴヌクレオチドとしては、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、作用物質は治療抗体である。

デンドリマーは、複数の治療剤、予防剤、および／または診断剤を同じデンドリマーによって送達することができるという利点を有する。１つまたは複数のタイプの作用物質を、デンドリマーに封入する、それと複合体を形成させる、またはそれにコンジュゲートすることができる。一実施形態では、デンドリマーは、２つまたはそれより多くの異なるクラスの作用物質と複合体を形成しているかまたはそれにコンジュゲートされており、標的部位で異なるまたは独立した放出動態での同時送達を提供する。別の実施形態では、デンドリマーは、少なくとも１つの検出可能な部分および少なくとも１つのクラスの作用物質に共有結合により連結される。さらなる実施形態では、各々が異なるクラスの作用物質を有するデンドリマー複合体は、併用処置のために同時に投与される。

治療剤または予防剤は、１つまたは複数の神経疾患の処置のために活性化ミクログリアにおいて酵素または受容体媒介機構を操作する作用物質を含み得る。例示的な酵素または受容体媒介機構としては、これらに限定されないが、中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）、骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、および受容体相互作用セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ１（ＲＩＰＫ１）のものが挙げられる。一部の実施形態では、作用物質は、ｎＳＭａｓｅ２、ＴＲＥＭ２、ＬＲＲＫ２、およびＲＩＰＫ１の１つまたは複数を伴う酵素または受容体媒介機構において変更された活性を回復することができる作用物質である。

１．中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤
Ａβ凝集およびタウタンパク質伝播はいずれも、アルツハイマー病の２つの主要な顕著な特徴であり、エクソソーム分泌に関係する。エクソソームは、様々な刺激に応答して細胞から脱落したタンパク質、脂質、およびＲＮＡを有する小さい細胞外小胞（ＥＶ）である。いくつかの神経疾患状態下では、ＥＶは、病的なカーゴを運び、疾患進行において能動的な役割を果たし得る。脳の酵素である中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）は、主要なＥＶ構成要素であるセラミドのその産生を通してＥＶ生物発生の極めて重要な調節因子であり、このように独自のＡＤ治療標的を表す。ｎＳＭａｓｅ２の薬理学的阻害および遺伝的欠失は、ＡＤのマウスモデルにおいて脳セラミドを低減させ、ＥＶ分泌を減少させ、Ａβプラーク形成およびタウ伝播を低減させ、ならびに認知を向上させることが示されている。このように、ｎＳＭａｓｅ阻害は、ＡＤおよび他の神経疾患の処置のための治療アプローチを表す。

セラミドは、エクソソームの生物発生にとって必須であり、ｎＳＭａｓｅ２の薬理学的阻害はエクソソーム分泌を低減させた。ｎＳＭａｓｅ２は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）のホスホリルコリンおよびセラミドへの加水分解を触媒する。ｎＳＭａｓｅ２活性化を通したセラミドの産生は、アポトーシスからセラミドに富むエクソソームの製造に対するシナプス可塑性のモジュレーションの範囲に及ぶ多様な機能に関連している。一過性のｎＳＭａｓｅ２活性化は、正常な脳の機能の一部であるが、酵素の慢性的な活性化は、神経変性を含む負の効果をもたらす。具体的には、増加したｎＳＭａｓｅ２活性は、変更されたスフィンゴリ脂質代謝、ニューロンのアポトーシス、慢性炎症、および酸化的ストレスに関連している。

ｎＳＭａｓｅ２の慢性的な活性化は、ＨＩＶ関連認知症（ＨＡＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の病因に関連することが報告されている。ヒトおよび動物においてｎＳＭａｓｅ２活性の慢性的な増加をＡＤと関連付ける証拠がある。今日まで３つの哺乳動物ｎＳＭａｓｅが同定されている：ｎＳＭａｓｅ１、ｎＳＭａｓｅ２、およびｎＳＭａｓｅ３。それらは全て、無細胞生化学アッセイにおいてスフィンゴミエリン（ＳＭ）のホスホリルコリンおよびセラミドへの加水分解を触媒するが、ｎＳＭａｓｅ１および３の生理的役割は、ｎＳＭａｓｅ２よりも解明することが困難であった。たとえ、ｎＳＭａｓｅ１が、ＳＭをｉｎ ｖｉｔｒｏで加水分解することができても、ｎＳＭａｓｅ１を過剰発現する細胞系は、ＳＭ代謝の変化を示さなかった。ｎＳＭａｓｅ３は、他の２つのｎＳＭａｓｅと低い配列同一性を有し、異なる機能を果たす可能性がある。これに対し、ｎＳＭａｓｅ２は、細胞におけるＳＭ代謝に対する影響を有することが示されており、その慢性的な活性化は、神経変性障害の病因に特異的に関係している。ｎＳＭａｓｅ２は、大部分がＣＮＳにおいて発現されている（Fensome AC et al. J Biol Chem. 2000;275(2):1128-36;Hofmann K et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(11):5895-900;Clarke CJ et al., BiochimBiophys Acta. 2006;1758(12):1893-901）。ｎＳＭａｓｅ２は、主にゴルジ体に位置するが、抗酸化剤であるグルタチオンに応答して核周囲領域に、および酸化的ストレスに応答して細胞膜の内葉にトランスロケーションすることができる。

ｎＳＭａｓｅ２活性の薬理学的阻害は、ｉｎ ｖｉｖｏでタウの伝播を遅らせることにおいて非常に有効であった（Asai H et al., Nat Neurosci. 2015;18(11):1584-93）。１つのモデルにおいて、嗅内皮質から歯状回（ＤＧ）へのタウの伝播後、プロトタイプｎＳＭａｓｅ２阻害剤ＧＷ４８６９は、歯状回におけるＡＴ８＋顆粒状ニューロン（すなわち、タウのリン酸化に対して特異的なモノクローナル抗体によって認識されるニューロン）の数を７５％抑制した。歯状回におけるＡＴ８＋細胞数もまた低減され、タウ伝播におけるエクソソーム合成の関与を実証している。第２のモデルでは、Ｐ３０１Ｓ／ＰＳ１９タウマウスのｎＳＭａｓｅ２阻害による処置は、ＤＧの顆粒細胞層（ＧＣＬ）においてＡＴ８＋細胞数を大幅に５２％低減させたが、内側嗅内皮質（ＭＥＣ）では低減させなかった。これらのデータと一致して、Ｔ２２抗体を使用するドットブロット分析は、阻害剤処置群において海馬領域におけるタウオリゴマー蓄積の大幅な低減を明らかにしたが、ＥＣ領域では低減を示さなかった。他のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、活性化グリア細胞の特異的役割を調べた。ＬＰＳ／ＡＴＰ活性化ミクログリアにおけるｎＳＭａｓｅ２発現をサイレンシングするかまたはｎＳＭａｓｅ２活性を阻害することは、エクソソームにおけるｈＴａｕの分泌を大幅に低減させることが示された。その上、ｎＳＭａｓｅ２ ｓｉＲＮＡまたはＧＷ４８６９によって処置したミクログリアからのタウ含有エクソソーム画分による初代培養ニューロンの処置はそれぞれ、対照群と比較してニューロンへのｈＴａｕの伝達の７０および６８％低減を示した（AsaiH et al., Nat Neurosci. 2015;18(11):1584-93）。

追加の研究は、エクソソームが、ＡＤの５ＸＦＡＤマウスモデルにおいてＡβ凝集を刺激することができることを示した（Dinkins MB et al., Neurobiol Aging. 2014;35(8):1792-800）。さらに、プロトタイプｎＳＭａｓｅ２阻害剤ＧＷ４８６９によるエクソソーム分泌の阻害は、脳および血清中エクソソームレベル、脳セラミド、ならびにＡβプラーク負荷の低減をもたらした。同様に５ＸＦＡＤマウスを使用するより最近の研究では、ｎＳＭａｓｅ２欠損は、ＡＤの病態を緩和し、認知を向上した。通常の５ＸＦＡＤマウスと比較して、ｎＳＭａｓｅ２欠損５ＸＦＡＤマウスは、低減された脳エクソソーム、セラミドレベル、血清中抗セラミドＩｇＧ、グリア活性化、総Ａβおよびプラーク負荷、タウのリン酸化、ならびに恐怖条件付け学習タスクにおいて向上された認知を示した。

要約すると、３つのマウスＡＤモデルを使用する結果は、ｎＳＭａｓｅ２が、Ａβプラーク凝集およびタウ伝播の両方に関係することを示している。その上、ｎＳＭａｓｅ２の薬理学的阻害または遺伝的欠失は、病理学的尺度および認知転帰の向上をもたらす。

したがって、一部の実施形態では、デンドリマー組成物は、エクソソーム分泌を減少させる、Ａβプラーク形成を低減させる、タウ伝播を低減させる、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行う１つまたは複数の治療剤を含む。一部の実施形態では、デンドリマー組成物は、ｎＳＭａｓｅ２の活性および／または量を阻害または低減する１つまたは複数の治療剤を含む。一部の実施形態では、デンドリマー組成物は、１つまたは複数の中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤を含む。一部の実施形態では、デンドリマー組成物は、分子量２０００ダルトン未満、好ましくは１５００ダルトン未満を有する１つまたは複数の低分子中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、デンドリマーとのコンジュゲーションを容易にするために、および／または所望の放出動態のために、例えばエーテル、エステル、またはアミド連結によって、必要に応じて１つまたは複数のスペーサー／リンカーによって官能化される。好ましい実施形態では、デンドリマーは、世代４、世代５、または世代６のヒドロキシルで終端したＰＡＭＡＭデンドリマーである。

一実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、２，６－ジメトキシ－４－（５－フェニル－４－（チオフェン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェノール（ＤＰＴＩＰ）、またはそのアナログである。ＤＰＴＩＰのアナログは、例えばＷＯ２０１９１６９２４７Ａ１に以前に記載されている。ＤＰＴＩＰの化学構造を構造Ｉに示す：
構造Ｉ：

一部の実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、４－（１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２，６－ジアルコキシフェノール足場、例えばその全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれるStepanek O et al., Eur J Med Chem. 2019 May 15;170:276-289に記載される足場に基づく化合物を含む、４－（１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２，６－ジアルコキシフェノール誘導体である。一実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、４－（４，５－ジイソプロピル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２，６－ジメトキシフェノールである。

フェニル（Ｒ）－（１－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）－２，６－ジメチルイミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－８－イル）ピロリジン－３－イル）－カルバメート（ＰＤＤＣ）は、Rojas C et al., Br J Pharmacol. 2019 Oct;176(19):3857-3870に記載されるようにｎＳＭａｓｅ２の強力（ｐＩＣ５０＝６．５７）かつ選択的な非競合的阻害剤である。したがって、一実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、フェニル（Ｒ）－（１－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）－２，６－ジメチルイミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－８－イル）ピロリジン－３－イル）－カルバメート（ＰＤＤＣ）、またはそのアナログである。ＰＤＤＣの化学構造を構造ＩＩに示す。
構造ＩＩ：

別の実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、カンビノールである。カンビノールの化学構造を構造ＩＩＩに示す。
構造ＩＩＩ：

さらなる実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、Ｎ，Ｎ’－ビス［４－（４，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェニル］－３，３’－ｐ－フェニレン－ビス－アクリルアミド二塩酸塩（ＧＷ４８６９）である。ＧＷ４８６９の化学構造を構造ＩＶに示す。
構造ＩＶ：

一部の実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、以下に示される構造Ｖ～ＶＩＩＩのうちの１つまたは複数である：
構造Ｖ（スキホスタチン（Ｓｃｙｐｈｏｓｔａｔｉｎ））：

構造ＶＩ：

構造ＶＩＩ：

構造ＶＩＩＩ：

Ｄ．送達される追加の治療剤および予防剤
デンドリマーを使用して、１つまたは複数の追加の治療剤または予防剤、特に神経または神経変性疾患、がん、感染疾患および／または炎症の１つまたは複数の症状を防止または処置するための１つまたは複数の作用物質を送達することができる。適した治療剤、診断剤、および／または予防剤は、生体分子、例えばペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチド、または有機、無機、および有機金属作用物質を含む低分子作用物質（例えば、分子量２０００ａｍｕ未満、好ましくは１５００ａｍｕ未満）であり得る。作用物質は、デンドリマー内に封入され得る、デンドリマー内に分散され得る、および／またはデンドリマーの表面と共有結合もしくは非共有結合のいずれかにより会合し得る。

１．治療剤および予防剤
デンドリマー複合体は、デンドリマーと複合体を形成しているまたはそれにコンジュゲートされている１つまたは複数の治療剤、予防剤、または予後判定剤を含む。代表的な治療剤としては、これらに限定されないが、神経保護剤、抗炎症剤、抗酸化剤、抗感染剤、およびそれらの組合せが挙げられる。

一実施形態では、追加の作用物質はステロイドである。適したステロイドとしては、ビタミンＤ３およびＤ２の生物活性型、例えば米国特許第４，８９７，３８８号および第５，９３９，４０７号に記載されるステロイドが挙げられる。ステロイドは、神経原性の刺激もしくは誘導、および／または神経喪失の防止、特にアルツハイマー病の処置をさらに助けるために同時投与され得る。エストロゲンおよびエストロゲン関連分子、例えばアロプレグナノロンを、Brinton(2001) Learning and Memory 8(3): 121-133に記載されるように神経保護を増強するために神経増強剤と同時投与することができる。

他の神経活性ステロイド、例えば米国特許第６，５５２，０１０号に記載されるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の様々な形態もまた、神経原性の刺激もしくは誘導および／または神経喪失の防止をさらに助けるために同時投与することができる。神経成長および神経ネットワークの伸長を引き起こす他の作用物質、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を、ＴＨＰの投与と同時または投与前または投与後のいずれかに投与することができる。加えて、神経アポトーシスの阻害剤、例えばカルパインおよびカスパーゼ、ならびに他の細胞死機構、例えば壊死の阻害剤を、神経増強剤と同時投与して、ある特定の神経疾患および神経欠損に関連する神経喪失をさらに防止することができる。

代表的な低分子としては、ステロイド、例えばメチルプレドニゾン、デキサメタゾン、ＣＯＸ－２阻害剤を含む非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、および抗血管新生剤、抗興奮毒性剤、例えばバルプロ酸、Ｄ－アミノホスホノバレレート、Ｄ－アミノホスホノヘプタノエート、グルタメート形成／放出の阻害剤、バクロフェン、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、サリチレート抗炎症剤、ラニビズマブ、アフリベルセプトおよびラパマイシンを含む抗ＶＥＧＦ剤が挙げられる。他の抗炎症薬としては、非ステロイド薬、例えばインドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウム、およびイブプロフェンが挙げられる。コルチコステロイドは、フルオシノロンアセトニドおよびメチルプレドニゾロンであり得る。

代表的なオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。

２．診断剤
一部の例では、作用物質は、単独の、または他の治療剤もしくは予防剤と組み合わせた診断剤である。診断剤の例としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、および放射性核種、Ｘ線イメージング剤、および造影剤が挙げられる。他の適した造影剤の例としては、放射線不透過性である気体または気体放出化合物が挙げられる。デンドリマー複合体は、投与した組成物の位置を決定するために有用な作用物質をさらに含み得る。この目的にとって有用な作用物質としては、蛍光タグ、放射性核種、および造影剤が挙げられる。

例示的な診断剤としては、色素、蛍光色素、近赤外線色素、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＰＥＴイメージング剤および放射性同位体が挙げられる。代表的な色素としては、カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキシカルボシアニン(oxacarbocyanine)、チオカルボシアニン（thueicarbocyanine）、およびメロシアニン、ポリメチン、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ボロンジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＶｉｖｏＴａｇ－６８０、ＶｉｖｏＴａｇ－Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ－Ｓ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、Ｄｙ６７７、Ｄｙ６７６、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、Ｄｙ７８０、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６８０、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ７５０、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳが挙げられる。

例示的なＳＰＥＣＴまたはＰＥＴイメージング剤としては、キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラ－アザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジアミンジチオール、活性化メルカプトアセチル－グリシル－グリシル－グリシン（ＭＡＧ３）、およびヒドラジドニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）が挙げられる。

例示的な同位体としては、Ｔｃ－９４ｍ、Ｔｃ－９９ｍ、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｇａ－６８、Ｇｄ３＋、Ｙ－８６、Ｙ－９０、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｃｕ－６４、Ｃｕ－６７、Ｃｏ－５５、Ｃｏ－５７、Ｆ－１８、Ｓｃ－４７、Ａｃ－２２５、Ｂｉ－２１３、Ｂｉ－２１２、Ｐｂ－２１２、Ｓｍ－１５３、Ｈｏ－１６６、およびＤｙ－１６６が挙げられる。

好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングにとって適した１つまたは複数の放射性同位体を含む。例示的な陽電子放出放射性同位体としては、炭素－１１（^１１Ｃ）、銅－６４（^６４Ｃｕ）、窒素－１３（^１３Ｎ）、酸素－１５（^１５Ｏ）、ガリウム－６８（^６８Ｇａ）、およびフッ素－１８（^１８Ｆ）、例えば、２－デオキシ－２－^１８Ｆ－フルオロ－β－Ｄ－グルコース（^１８Ｆ－ＦＤＧ）が挙げられる。

さらなる実施形態では、単一のデンドリマー複合体組成物は、体における１つまたは複数の位置で疾患または状態を同時に処置および／または診断することができる。

ＩＩＩ．医薬製剤
デンドリマーおよび１つまたは複数のスフィンゴミエリン、例えばｎＳＭａｓｅ２の阻害剤を含む医薬組成物は、１つまたは複数の生理的に許容される担体を使用して従来の方式で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。好ましい実施形態では、組成物は、非経口送達のために製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、静脈内注射のために製剤化される。典型的には、組成物は、処置される組織または細胞への注射のための滅菌食塩水または緩衝溶液中に製剤化される。組成物は、使用直前に再湿潤化（rehydration）するために１回使用バイアル中に凍結乾燥して保存することができる。再湿潤化および投与のための他の手段は、当業者に公知である。

代表的な賦形剤としては、溶媒、希釈剤、ｐＨ調整剤、保存剤、抗酸化剤、懸濁化剤、湿潤剤、粘度調整剤、張度剤（tonicity agent）、安定化剤、およびそれらの組合せが挙げられる。適した薬学的に許容される賦形剤は、好ましくは、一般的に安全であると認識され（ＧＲＡＳ）望ましくない生物学的副作用または不必要な相互作用を引き起こすことなく個体に投与され得る材料から選択される。

一般的に、薬学的に許容される塩は、作用物質の遊離の酸または塩基型の、水中もしくは有機溶媒中、または両者の混合物中で化学量論量の適切な塩基または酸との反応によって調製することができ、一般的に、非水性媒体、例えばエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルが好ましい。薬学的に許容される塩としては、無機酸、有機酸に由来する作用物質の塩、アルカリ金属塩、およびアルカリ土類金属塩、ならびに薬物の適した有機リガンドとの反応によって形成される塩（例えば、第四級アンモニウム塩）が挙げられる。適した塩の一覧は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, MD, 2000, p. 704に見出される。時には薬学的に許容される塩の形態で投与される眼科用薬物の例としては、チモロールマレイン酸塩、ブリモニジン酒石酸塩、およびジクロフェナクナトリウムが挙げられる。

組成物は、好ましくは投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態で製剤化される。「投薬単位形態」という語句は、処置される患者にとって適切なコンジュゲートの物理的に別個の単位を指す。しかし、組成物の総１回投与は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解される。治療有効用量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタのいずれかにおいて最初に推定することができる。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するために使用される。そして、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために有用となるはずである。コンジュゲートの治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えばＥＤ５０（用量は、集団の５０％において治療的に有効である）およびＬＤ５０（用量は、集団の５０％において致死性である）によって決定することができる。毒性効果の治療効果に対する用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトの使用のための投薬量の範囲を公式化するために使用することができる。

ある特定の実施形態では、組成物は、局所に、例えば処置される部位への直接注射によって投与される。一部の実施形態では、組成物は、注射され、局部に適用され、またはそうでなければ傷害、手術、もしくは埋め込み部位のまたはそれに隣接する血管または粘膜組織の血管系に直接投与される。例えば、実施形態では、組成物は、外科手技の間に露出する血管組織に局部適用される。典型的に、局所投与は、組成物の増加した局所濃度を引き起こし、これは全身投与によって達成され得る濃度よりも大きい。

非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射）および経腸投与経路による投与のために製剤化されている医薬組成物を記載する。

Ａ．非経口投与
「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、当技術分野で認識される用語であり、経腸投与および局部投与以外の投与様式、例えば注射を含み、限定なしに、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内（intradennal）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、経気管、皮下（ｓ．ｃ．）、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入を含む。デンドリマーは、非経口、例えば硬膜下、静脈内、髄腔内、脳室内、動脈内、羊膜内、腹腔内、または皮下経路によって投与することができる。

液体製剤の場合、薬学的に許容される担体は、例えば水溶液もしくは非水性溶液、懸濁物、乳剤、または油であり得る。非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）は、例えば塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、および固定油を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、例えば、食塩水および緩衝化された媒体を含む、水、アルコール／水溶液、シクロデキストリン、乳剤または懸濁物を含む。デンドリマーはまた、乳剤、例えば油中水型乳剤で投与することもできる。油の例は、石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ワセリン、および鉱物である。非経口製剤における使用のための適した脂肪酸としては、例えばオレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適した脂肪酸エステルの例である。

非経口投与にとって適した製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁物を含み得る。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンゲルデキストロースに基づく補充剤を含み得る。一般的に、水、食塩水、水性デキストロース、および関連する糖溶液、およびグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射可能溶液に関して好ましい液体担体である。

注射可能組成物のための注射可能医薬担体は、当業者に周知である（例えば、Pharmaceuticsand Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker andChalmers, eds., pages 238-250(1982)、およびASHP Handbook on Injectable Drugs,Trissel, 15th ed., pages 622-630(2009)を参照されたい）。

Ｂ．経腸投与
組成物は、経腸投与することができる。担体または希釈剤は、固体担体、例えばカプセル剤または錠剤または固体製剤のための希釈剤、液体担体、または液体製剤のための希釈剤、またはそれらの混合物であり得る。

液体製剤の場合、薬学的に許容される担体は、例えば水性もしくは非水性溶液、懸濁物、乳剤、または油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、例えば食塩水および緩衝化された媒体を含む、水、アルコール／水溶液、シクロデキストリン、乳剤または懸濁物を含む。

油の例は、石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ワセリン、および鉱物である。非経口製剤における使用のために適した脂肪酸としては、例えば、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適した脂肪酸エステルの例である。

ビヒクルは、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、および固定油を含む。製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁物を含む。ビヒクルは、例えば流体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンゲルデキストロースに基づく補充剤を含み得る。一般的に、水、食塩水、水性デキストロース、および関連する糖溶液は、好ましい液体担体である。これらはまた、乳児用調製粉乳のタンパク質、脂肪、サッカリド、および他の構成要素と共に製剤化することができる。

一部の好ましい実施形態では、組成物は、経口投与のために製剤化される。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤、カプセル剤、またはトローチ剤の形態であり得る。腸溶コーティング経口製剤の調製のための封入物質は、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびメタクリル酸エステルコポリマーを含む。固体経口製剤、例えばカプセル剤または錠剤が好ましい。エリキシル剤およびシロップ剤もまた、周知の経口製剤である。

ＩＶ．デンドリマーおよびそのコンジュゲートまたは複合体を作製する方法
Ａ．デンドリマーを作製する方法
デンドリマーは、多様な化学反応ステップを介して調製することができる。デンドリマーは通常、あらゆる構築段階でその構造を制御することを可能にする方法に従って合成される。樹枝状構造は多くの場合、２つの主な異なるアプローチ：発散または収束によって合成される。

一部の実施形態では、デンドリマーは、デンドリマーが多官能性コアから組み立てられ、一連の反応、一般的にマイケル反応によって外側に伸長する発散法を使用して調製される。戦略は、反応基および保護基を保有する単量体分子の、多官能性コア部分とのカップリングを伴い、これはコア周囲の世代の段階的付加をもたらし、その後保護基が除去される。例えば、ＰＡＭＡＭ－ＮＨ_２デンドリマーは、Ｎ－（２－アミノエチル）アクリルアミド単量体をアンモニアコアにカップリングすることによって最初に合成される。

他の実施形態では、デンドリマーは、デンドリマーが球体の表面で終わる低分子から構築され、反応が内向きに進行して内向きに構築し、最終的にコアに付着する収束法を使用して調製される。

デンドリマーの調製のために多くの他の合成経路、例えば直交型アプローチ、加速アプローチ、二段階収束法、またはハイパーコアアプローチ（ｈｙｐｅｒｃｏｒｅ ａｐｐｒｏａｃｈ）、ハイパーモノマー法（ｈｙｐｅｒｍｏｎｏｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）、または分岐モノマーアプローチ、二重指数関数法、直交型カップリング法、または２ステップアプローチ、２モノマーアプローチ、ＡＢ_２－ＣＤ_２アプローチが存在する。

一部の実施形態では、デンドリマーのコア、１つもしくは複数の分岐単位、１つもしくは複数のリンカー／スペーサー、および／または１つもしくは複数の表面基を、１つまたは複数の銅補助アジド－アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）、ディールス－アルダー反応、チオール－エンおよびチオール－イン反応、ならびにアジド－アルキン反応を用いるクリックケミストリーを介してさらなる官能基（分岐単位、リンカー／スペーサー、表面基等）、単量体、および／または作用物質へのコンジュゲーションを可能にするように修飾することができる（Arseneault M et al., Molecules. 2015 May 20;20(5):9263-94）。一部の実施形態では、事前に作製されたデンドロンを、高密度ヒドロキシルポリマーにクリックする。「クリックケミストリー」は、例えば２つの異なる部分（例えば、コア基および分岐単位；または分岐単位および表面基）を、第１の部分の表面上のアルキン部分（またはその等価物）と、第２の部分上のアジド部分（例えば、トリアジン組成物に存在する、またはその等価物）または任意の活性な末端基、例えば第一級アミン末端基、ヒドロキシル末端基、カルボン酸末端基、チオール末端基等）の間の１，３－双極子付加環化反応を介したカップリングを伴う。

一部の実施形態では、デンドリマー合成は、１つまたは複数の反応、例えばチオール－エンクリック反応、チオール－インクリック反応、ＣｕＡＡＣ、ディールス－アルダークリック反応、アジド－アルキンクリック反応、マイケル付加、エポキシ開環、エステル化、シランケミストリー、およびそれらの組合せに依存する。

任意の既存の樹枝状プラットフォームを使用して、高ヒドロキシル含有部分、例えば１－チオ－グリセロールまたはペンタエリスリトールをコンジュゲートすることによって、所望の機能性の、すなわち高密度の表面ヒドロキシル基を有するデンドリマーを作製することができる。例示的な樹枝状プラットフォーム、例えばポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、ポリ－Ｌ－リシン、メラミン、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）、ポリ（エステルアミン）（ＰＥＡ）およびポリグリセロールを合成および調べることができる。

デンドリマーはまた、２つまたはそれより多くのデンドロンを組み合わせることによっても調製することができる。デンドロンは、反応性のフォーカルポイント（focal point）官能基を有するデンドリマーのくさび形状の区分である。多くのデンドロン足場が市販されている。それらは、第１、２、３、４、５、および６世代に入り、それぞれ２、４、８、１６、３２、および６４個の反応基を有する。ある特定の実施形態では、１つのタイプの作用物質が１つのタイプのデンドロンに連結され、異なるタイプの作用物質が別のタイプのデンドロンに連結される。次に、２つのデンドロンを接続してデンドリマーを形成する。２つのデンドロンを、クリックケミストリー、すなわち一方のデンドロン上のアジド部分と他方のデンドロン上のアルキン部分との間の１，３－双極子付加環化反応を介して連結して、トリアゾールリンカーを形成することができる。

デンドリマーを作製する例示的な方法は、国際特許公開第ＷＯ２００９／０４６４４６号、第ＷＯ２０１５１６８３４７号、第ＷＯ２０１６０２５７４５号、第ＷＯ２０１６０２５７４１号、第ＷＯ２０１９０９４９５２号、および米国特許第８，８８９，１０１号に詳細に記載されている。

Ｂ．デンドリマー複合体
デンドリマー複合体は、デンドリマー、樹枝状ポリマー、または高分岐ポリマーにコンジュゲートされているまたはそれと複合体を形成している治療剤、予防剤、または診断剤から形成することができる。１つまたは複数の作用物質のデンドリマーへのコンジュゲーションは、当技術分野で公知であり、米国公開第ＵＳ２０１１／００３４４２２号、第ＵＳ２０１２／０００３１５５号、および第ＵＳ２０１３／０１３６６９７号に詳細に記載されている。

一部の実施形態では、１つまたは複数の作用物質は、デンドリマーに共有結合により付着させられる。一部の実施形態では、作用物質は、ｉｎ ｖｉｖｏで切断されるように設計される連結部分を介してデンドリマーに付着させられる。連結部分は、加水分解により、酵素的に、またはそれらの組合せにより切断され、ｉｎ ｖｉｖｏで作用物質の持続的な放出を提供するように設計することができる。連結部分の組成および作用物質へのその付着点はいずれも、連結部分の切断によって作用物質またはその適したプロドラッグのいずれかが放出されるように選択される。連結部分の組成はまた、作用物質の所望の放出速度を考慮して選択することができる。

一部の実施形態では、付着は、ジスルフィド、エステル、エーテル、チオエステル、カルバメート、カーボネート、ヒドラジン、またはアミド連結のうちの１つまたは複数を介して起こる。好ましい実施形態では、付着は、作用物質の所望の放出動態に応じて、作用物質とデンドリマーとの間にエステル結合またはアミド結合を提供する適切なスペーサーを介して起こる。一部の場合では、エステル結合は、作用物質の放出可能形態のために導入される。他の場合では、アミド結合は、作用物質の放出不能形態のために導入される。

連結部分は一般的に、１つまたは複数の有機官能基を含む。適した有機官能基の例としては、第二級アミド（－ＣＯＮＨ－）、第三級アミド（－ＣＯＮＲ－）、スルホンアミド（－Ｓ（Ｏ）_２－ＮＲ－）、第二級カルバメート（－ＯＣＯＮＨ－；－ＮＨＣＯＯ－）、第三級カルバメート（－ＯＣＯＮＲ－；－ＮＲＣＯＯ－）、カーボネート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣＯＮＨ－；－ＮＲＣＯＮＨ－；－ＮＨＣＯＮＲ－、－ＮＲＣＯＮＲ－）、カルビノール（－ＣＨＯＨ－、－ＣＲＯＨ－）、ジスルフィド基、ヒドラゾン、ヒドラジド、エーテル（－Ｏ－）、およびエステル（－ＣＯＯ－、－ＣＨ_２Ｏ_２Ｃ－、ＣＨＲＯ_２Ｃ－）が挙げられ、式中Ｒは、アルキル基、アリール基、または複素環基である。一般的に、連結部分内の１つまたは複数の有機官能基の正体は、作用物質の所望の放出速度を考慮して選択される。加えて、１つまたは複数の有機官能基は、作用物質のデンドリマーへの共有結合による付着を容易にするように選択することができる。好ましい実施形態では、付着は、作用物質とデンドリマーとの間にジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサーを介して起こり得る。デンドリマー複合体は、体内で見出される還元条件下で、チオール交換反応によるｉｎ ｖｉｖｏでの作用物質の迅速な放出が可能である。

ある特定の実施形態では、連結部分は、スペーサー基と組み合わせた上記の有機官能基の１つまたは複数を含む。スペーサー基は、オリゴマー鎖およびポリマー鎖を含む原子の任意のアセンブリから構成され得る；しかし、スペーサー基中の原子の総数は、好ましくは３～２００個の原子の間、より好ましくは３～１５０個の原子の間、より好ましくは３～１００個の原子の間、最も好ましくは３～５０個の原子の間である。適したスペーサー基の例としては、アルキル基、ヘテロアルキル基、アルキルアリール基、オリゴおよびポリエチレングリコール鎖、ならびにオリゴおよびポリ（アミノ酸）鎖が挙げられる。スペーサー基の変形形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで作用物質の放出に対するさらなる制御を提供する。連結部分がスペーサー基を含む実施形態では、１つまたは複数の有機官能基は、一般的にスペーサー基を、抗炎症剤およびデンドリマーの両方に接続するために使用される。

作用物質のデンドリマーへの共有結合による付着のために有用な反応および戦略は、当技術分野で公知である。例えば、March, “Advanced Organic Chemistry,” 5th Edition, 2001, Wiley-IntersciencePublication, New York)およびHermanson, “Bioconjugate Techniques,” 1996, ElsevierAcademic Press, U.S.A.を参照されたい。所与の作用物質の共有結合による付着のための適切な方法は、それが官能基の適合性、保護基戦略、および不安定な結合の存在に関連することから、所望の連結部分、ならびに作用物質およびデンドリマーの全体としての構造を考慮して選択することができる。

最適な薬物負荷は、必然的に薬物の選択、デンドリマー構造およびサイズ、ならびに処置される組織を含む多くの要因に依存する。一部の実施形態では、１つまたは複数の作用物質は、約０．０１重量％～約４５重量％、好ましくは約０．１重量％～約３０重量％、約０．１重量％～約２０重量％、約０．１重量％～約１０重量％、約１重量％～約１０重量％、約１重量％～約５重量％、約３重量％～約２０重量％、および約３重量％～約１０重量％の濃度でデンドリマーに封入、会合、および／またはコンジュゲートされている。しかし、任意の所与の薬物、デンドリマー、および標的部位に関する最適な薬物負荷は、記載される方法などの通常の方法によって同定され得る。

一部の実施形態では、作用物質および／またはリンカーのコンジュゲーションは、１つまたは複数の表面基および／または内部基を通して起こる。このように、一部の実施形態では、作用物質／リンカーのコンジュゲーションは、コンジュゲーション前のデンドリマーの利用可能な総表面官能基、好ましくはヒドロキシル基の約１％、２％、３％、４％、または５％を介して起こる。他の実施形態では、作用物質／リンカーのコンジュゲーションは、コンジュゲーション前のデンドリマーの利用可能な総表面官能基の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満で起こる。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、特定の細胞タイプを標的化するために有効量の表面官能基を保持するが、疾患または障害を処置する、防止する、および／またはイメージングするために有効量の作用物質にコンジュゲートされている。

Ｖ．使用方法
デンドリマー複合体組成物を使用する方法もまた記載される。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、機能不全のまたは損傷したＢＢＢを通過し、活性化ミクログリアおよびアストロサイトを標的化する。方法は、中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）の上昇したレベルおよび／または活性に関連する１つまたは複数の状態および／または疾患を処置するために使用することができる。方法はまた、セラミドの上昇したレベルおよび／または活性に関連する１つまたは複数の状態および／または疾患を処置するためにも使用することができ、同様に提供される。一部の実施形態では、方法は、エクソソームの生合成を有効に低減するために使用される。方法は、１つまたは複数のｎＳＭａｓｅ２の阻害剤と複合体を形成した、それにコンジュゲートされている、またはそれが封入されているデンドリマーを含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。好ましい実施形態では、方法は、２，６－ジメトキシ－４－（５－フェニル－４－（チオフェン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェノール（ＤＰＴＩＰ）、またはその誘導体もしくはアナログ、もしくは薬学的に許容される塩と複合体を形成している、またはそれにコンジュゲートされているデンドリマーを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む。

Ａ．処置方法
デンドリマー組成物およびその製剤は、感染症、炎症、またはがんに関連する障害、特に神経系、特にＣＮＳへと広がる全身炎症を有する障害を処置するために投与することができる。組成物はまた、消化管障害、増殖疾患を含む他の疾患、障害、および傷害の処置、ならびに神経が疾患または障害において役割を果たす他の組織の処置のためにも使用することができる。組成物および方法はまた、予防的使用にとっても適している。

典型的に、デンドリマーの、１つまたは複数の治療、予防、および／または診断活性剤との組合せを含むデンドリマー複合体の有効量が、それを必要とする個体に投与される。デンドリマーはまた、標的化剤も含み得るが、実施例によって実証されるように、これらは脊髄および脳の傷害を受けた組織への送達にとって必要ではない。

一部の実施形態では、デンドリマー複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで見出される還元条件下で細胞内に薬物を優先的に放出することが可能なデンドリマーに付着またはコンジュゲートされている作用物質（複数可）を含む。作用物質は、共有結合により付着させられるか、または分子内に分散されるか、または封入され得る。対象に投与されるデンドリマー複合体の量は、対照、例えばデンドリマーを含まない活性剤によって処置した対象と比較して、処置される疾患または障害の１つまたは複数の臨床または分子的症状を低減する、防止する、またはそうでなければ緩和するために有効な量を送達するように選択される。

Ｂ．処置される状態
組成物は、眼、脳、および神経系における１つまたは複数の疾患、状態、および傷害、特にミクログリアおよびアストロサイトの病的な活性化に関連するもの、がん、感染疾患、ならびに炎症障害を処置するために適している。

ミクログリアは、脳および脊髄全体に位置する１つのタイプのニューログリア（グリア細胞）である。ミクログリアは、脳内で見出される全ての細胞の１０～１５％を占める。常在マクロファージ細胞として、それらは中枢神経系（ＣＮＳ）における最初の主な形態の活性な免疫防御として作用する。ミクログリアは、ＣＮＳ傷害後に重要な役割を果たし、傷害の時期およびタイプに基づいて保護効果および有害な効果の両方を有し得る（Kreutzberg, G. W. Trends in Neurosciences, 19, 312(1996);Watanabe,H., et al., Neuroscience Letters, 289, 53(2000);Polazzi, E., et al., Glia, 36,271(2001);Mallard, C., et al., Pediatric Research, 75, 234(2014);Faustino, J.V., et al., The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The SocietyFor Neuroscience, 31, 12992(2011);Tabas, I., et al., Science, 339, 166(2013);およびAguzzi,A., et al., Science, 339, 156(2013)）。ミクログリア機能における変化もまた、正常なニューロンの発達およびシナプス刈り込みに影響を及ぼす（Lawson,L. J., et al., Neuroscience, 39, 151(1990);Giulian, D., et al., The Journal OfNeuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience, 13,29(1993);Cunningham, T. J., et al., The Journal of Neuroscience : The OfficialJournal Of The Society For Neuroscience, 18, 7047(1998);Zietlow, R., et al.,The European Journal Of Neuroscience, 11, 1657(1999);およびPaolicelli, R. C., etal., Science, 333, 1456(2011)）。ミクログリアは、傷害後に形態学における、枝状に分かれた構造からアメーバ様構造への顕著な変化を経て、増殖する。結果としての神経炎症が、傷害部位で血液脳関門を破壊し、急性および慢性のニューロンおよび希突起膠細胞の死を引き起こす。したがって、炎症促進性ミクログリアを標的化することは、強力かつ有効な治療戦略となるはずである。神経炎症疾患において機能不全のＢＢＢは、ナノ粒子を運ぶ薬物の脳への輸送のために利用することができる。

１．神経疾患および神経変性疾患
デンドリマー組成物およびその製剤を使用して、１つまたは複数の神経疾患および神経変性疾患を診断および／または処置することができる。組成物および方法は、スフィンゴミエリンを含むスフィンゴ脂質の代謝および機能の欠陥に関連する１つまたは複数の神経疾患または神経変性疾患を処置するために特に適している。一部の実施形態では、疾患または障害は、これらに限定されないが、一部の精神障害（例えば、うつ病、統合失調症（ＳＺ）、アルコール使用障害、およびモルヒネ抗侵害受容耐性）および神経障害（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ））から選択される。一実施形態では、デンドリマー複合体は、アルツハイマー病（ＡＤ）または認知症を処置するために使用される。

神経変性疾患は、神経学的および行動機能に影響を及ぼし、別個の組織病理学および臨床症状をもたらす生化学変化を伴う神経系の慢性の進行性障害である（Hardy H, et al., Science. 1998;282:1075-9）。細胞分解機構に抵抗性の異常なタンパク質が、細胞内に蓄積する。ニューロン喪失パターンは、１つの群が影響を受けるが、他は無傷のままであるという意味において選択的である。疾患の明確な誘発事象はないことが多い。神経変性として古典的に記載される疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、およびパーキンソン病である。

活性化ミクログリアおよびアストロサイトによって媒介される神経炎症は、様々な神経障害の主な顕著な特徴であり、それによって可能性がある治療標的となる（Hagberg, H et al., Annals of Neurology 2012, 71, 444;Vargas, DL etal., Annals of Neurology 2005, 57, 67;およびPardo, CA et al., International Reviewof Psychiatry 2005, 17, 485）。これらの細胞を標的化することによって初期に神経炎症を軽減すると、疾患の開始を遅らせることができ、そして処置に関してより長い治療域を提供することができることは、複数の科学的な報告が示唆している（Dommergues,MA et al., Neuroscience 2003, 121, 619;Perry, VH et al., Nat Rev Neurol 2010,6, 193;Kannan, S et al., Sci. Transl. Med. 2012, 4, 130ra46;およびBlock, ML etal., Nat Rev Neurosci 2007, 8, 57）。血液脳関門を超える治療薬の送達は、難しい問題である。神経炎症は、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊を引き起こす。神経炎症障害における機能不全のＢＢＢを利用して、薬物を負荷したナノ粒子を脳にわたり輸送することができる（Stolp,HB et al., Cardiovascular Psychiatry and Neurology 2011, 2011, 10;およびAhishali,B et al., International Journal of Neuroscience 2005, 115, 151）。

組成物および方法を使用して、神経もしくは神経変性疾患もしくは障害、または中枢神経系の障害の処置のために活性剤を送達することもできる。好ましい実施形態では、組成物および方法は、神経もしくは神経変性疾患もしくは障害、または中枢神経系の障害に関連する神経炎症を処置するおよび／または緩和するために有効である。方法は典型的に、認知を増加させる、または認知の低下を低減する、認知機能を増加させる、または認知機能の低下を低減させる、記憶を増加させる、または記憶の低下を低減する、学習能もしくは学習能力を増加させる、または学習能もしくは学習能力の低下を低減する、またはそれらの組合せを行うために有効量の組成物を対象に投与することを含む。

神経変性は、ニューロンの死滅を含むニューロンの構造または機能の進行性の喪失を指す。例えば、組成物および方法を使用して、疾患または障害、例えばパーキンソン病（ＰＤ）およびＰＤ関連障害、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）および他の認知症、プリオン病、例えばクロイツフェルト－ヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭型認知症、ＨＩＶ関連認知障害、軽度の認知障害、運動ニューロン病（ＭＮＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ運動失調症、レビー小体病、アルパース病、バッテン病、脳－眼－顔－骨格症候群、大脳皮質基底核変性症、ゲルストマン－ストロイスラー－シャインカー病、クールー、リー病、単肢性筋萎縮症、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症（シャイ－ドレーガー症候群）、多発性硬化症（ＭＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、脳内鉄蓄積を伴う神経変性、オプソクローヌスミオクローヌス、後部皮質萎縮症、原発性進行性失語症、進行性核上性麻痺、脳血管性認知症、進行性多巣性白質脳症、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、ラクナ症候群、水頭症、ウェルニッケ－コルサコフ症候群、脳炎後認知症、がん、および化学療法関連認知障害および認知症、ならびにうつ病誘発性認知症および仮性認知症を有する対象を処置することができる。

さらなる実施形態では、疾患または障害は、これらに限定されないが、注射部位アミロイドーシス（injection-localized amyloidosis）、脳アミロイド血管障害、ミオパチー、ニューロパチー、脳外傷、前頭側頭型認知症、ピック病、多発性硬化症、プリオン障害、２型真性糖尿病、致死性家族性不眠症、心不整脈、孤立性心房性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、家族性アミロイドポリニューロパチー、遺伝性非ニューロパチー性全身アミロイドーシス、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィ、全身性ＡＬアミロイドーシス、およびダウン症候群から選択される。好ましい実施形態では、疾患または障害は、アルツハイマー病または認知症である。

特定の神経学的要因の向上を評価する基準は、認知スキル、運動スキル、記憶能力等を評価する方法、ならびに中枢神経系の選択された領域の物理的変化を評価するための方法、例えば磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）およびコンピューター断層撮影（ＣＴ）、または他のイメージング方法を含む。そのような評価方法は、医学、神経学、心理学等の分野において周知であり、特定の神経機能不全の状態を診断するために適切に選択することができる。アルツハイマー病の変化または関連する神経学的変化を評価するために、選択された評価（assessment）もしくは評価(evaluation)試験または複数の試験を、デンドリマー組成物の投与開始前に行う。この最初の評価後、デンドリマー組成物の投与のための処置方法を開始し、様々な期間継続する。神経欠損障害が最初に評価された後の選択された期間で、同じ評価（assessment）もしくは評価(evaluation)試験（複数可）を再度使用して、選択された神経学的基準の変化または向上を再評価する。

ａ．アルツハイマー病および認知症
アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳は、エクソソーム膜の必須の構成要素であるセラミドの上昇を示す。セラミドの１つの主要な供給源は、中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）によって触媒されるスフィンゴミエリンの加水分解を通してである。最近の研究は、慢性的に活性化されたｎＳＭａｓｅ２が、エクソソーム分泌におけるその役割を通してＡｂ凝集およびタウ伝播の両方に関係することを示している。

デンドリマー組成物は、神経疾患、例えばアルツハイマー病および認知症の発生および進行に関連する１つまたは複数の病理プロセスを低減または防止するために適している。このように、アルツハイマー病に関連する病理プロセスの処置、低減、および防止のための方法であって、アルツハイマー病または認知症に罹患している個体における脳および／または血清中のエクソソーム、脳および／または血清中のセラミドレベル、血清中の抗セラミドＩｇＧ、グリア活性化、総Ａβ４２、およびプラーク負荷、タウのリン酸化／伝播を低減させるために、ならびに学習タスク、例えば恐怖条件付け学習タスクにおける認知の向上のために有効な量および投薬レジメンでデンドリマー組成物を投与することを含む方法が提供される。アルツハイマー病または認知症に罹患している個体における学習および／または記憶の欠如を低減する、防止する、または逆転させるための方法が提供される。方法は、スフィンゴミエリナーゼの１つまたは複数の阻害剤と複合体を形成している、それにコンジュゲートされている、またはそれが封入されているデンドリマーを含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。好ましい実施形態では、方法は、２，６－ジメトキシ－４－（５－フェニル－４－（チオフェン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェノール（ＤＰＴＩＰ）、またはその誘導体もしくはアナログ、もしくは薬学的に許容される塩と複合体を形成しているまたはそれにコンジュゲートされているデンドリマーを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む。

一部の実施形態では、デンドリマー組成物は、それを必要とする対象における神経増強を誘導するために有効な量および投薬レジメンで投与される。デンドリマー組成物の投与に起因する神経増強は、新規ニューロンの生成をもたらす神経有糸分裂の刺激または誘導、すなわち神経原性効果を示すこと、神経喪失速度の減少を含む神経喪失の防止または遅延、すなわち神経保護効果を示すこと、またはこれらの作用機序の１つまたは複数を含む。「神経保護効果」という用語は、個体のニューロン、神経突起、および神経ネットワークの劣化、機能不全、または死滅の防止、遅延、および／または終止を含むと意図される。組成物の投与は、神経疾患、神経傷害、または加齢関連ニューロン減少もしくは機能不全を有する個体における神経機能の向上、または増強をもたらす。

神経の劣化は、神経喪失をもたらす可能性が高い、神経機能を損なう任意の状態の結果であり得る。神経機能は、例えばその神経突起を含むニューロンの変更された生化学、生理学、または解剖学的構造によって損なわれ得る。ニューロンの劣化は、膜、樹状突起、またはシナプスの変化を含み得るが、これらはニューロンが正常に機能するために有害である。ニューロンの劣化、機能不全、および／または死滅の原因は不明であり得る。あるいは、これは、個体の神経系で起こる加齢、傷害、および／または疾患に関連する神経学的変化の結果であり得る。

アルツハイマーの患者では、神経喪失は、海馬、前頭葉、頭頂、および前頭側頭皮質、扁桃体、および嗅覚系において最も顕著である。最も顕著に影響を受ける海馬の区域は、ＣＡ１領域、海馬台、および嗅内皮質を含む。海馬は、記憶において決定的な役割を果たすことが周知であることから、記憶喪失は、最も初期の最も代表的な認知変化であると考えられている。

疾患、加齢関連減少または物理的傷害を通しての神経喪失は、神経疾患および機能不全をもたらす。組成物は、新規ニューロン、新規神経突起、および／または神経接続の発達を促進して、既存の神経細胞、神経突起、および／もしくは神経接続の神経保護、または１つもしくは複数のこれらのプロセスをもたらすことによって、神経喪失の有害な効果に対抗することができる。このように、組成物の神経増強特性は、変性疾患、加齢、および物理的傷害または外傷に関連する神経喪失を一般的に逆転するための有効な戦略を提供する。

デンドリマー組成物の、アルツハイマー病の結果として神経喪失を受けているまたは受けた個体への投与は、アルツハイマー病または認知症を含む関連する認知障害の任意の１つまたは複数の症状を低減する。処置、低減、または防止することができるＡＤまたは認知症の臨床症状は、軽度のＡＤ、中等度のＡＤ、および／もしくは重度のＡＤ、または認知症の臨床症状を含む。

軽度のアルツハイマー病では、当人は健康であるように見えるかもしれないが、自身の周囲の世界の意味を理解することが次第に難しくなる。何かが間違っているという認識がしばしば、当人およびその家族に徐々に起こる。軽度のアルツハイマー病／軽度の認知症の例示的な症状としては、これらに限定されないが、記憶喪失；間違った決定をもたらす判断不良；自発性および率先性（initiative）の感覚の喪失；通常の日常タスクを完了するためにより長い時間がかかる；繰り返し質問する；お金を扱うおよび料金を支払うことが難しい；徘徊し、迷子になる；ものを忘れる、または間違った場所に置く；気分および人格の変化、ならびに不安および／または攻撃性の増加が挙げられる。

中等度のアルツハイマー病／中等度の認知症の症状としては、これらに限定されないが、物忘れ；記憶喪失および錯乱の増加；新しいことを学習できない；発語困難および読み、書き、および数を扱うことが難しい；思考を整理することおよび論理的に考えることが難しい；集中する期間が短い；新しい状況に対処することが難しい；多段階タスク、例えば服を着ることを行うことが難しい；家族および友人を認識することが難しい；幻覚、妄想、およびパラノイア；不適切な時間もしくは場所で服を脱ぐまたは下品な言葉を使うなどの衝動行動；不適切な怒りの爆発；落ち着きのなさ、激越、不安、涙もろい、徘徊（特に、午後遅くまたは夜）；発言または動作の繰り返し、時に筋肉の単収縮が挙げられる。

重度のアルツハイマー病／重度の認知症の症状としては、これらに限定されないが、コミュニケーションできない；体重減少；発作；皮膚感染症；嚥下困難；うめき声、愚痴、またはうなり声（grunting）；睡眠の増加；腸および膀胱制御の喪失が挙げられる。

アルツハイマー病／認知症の生理的症状は、脳質量の低減、例えば海馬体積の低減を含む。したがって、一部の実施形態では、本開示の組成物を投与する方法は、無処置対照対象と比較して、対象の脳質量を増加させる、および／または脳質量の減少速度を低減もしくは防止する；対象の海馬体積を増加させる、海馬体積の減少速度を低減もしくは防止する。

組成物は、脳エクソソーム、セラミドレベル、血清中抗セラミドＩｇＧ、グリア活性化、総Ａβ_４２およびプラーク負荷、タウのリン酸化を低減する、恐怖条件付け学習タスクにおける認知を向上させる、およびその組合せを行うために有効な量で投与される。

デンドリマー組成物は、個体への投与の際に、１つまたは複数の治療剤（例えば、スフィンゴミエリナーゼの阻害剤）の有効量を提供するように投与される。この文脈で使用される場合、１つまたは複数の治療剤の「有効量」は、神経欠損または認知低下もしくは認知機能障害を含む、アルツハイマー病または認知症に関連する１つまたは複数の症状を向上させるまたは改善するために有効な量である。そのような治療効果は一般的に、１つまたは複数の神経増強剤の有効量を含有する組成物の投与を開始して約１２～約２４週間以内に観察されるが、治療効果は、１２週未満または２４週より後に観察され得る。

個体は、好ましくは成人であり、より好ましくは、ヒトはアルツハイマー病または認知症の結果としてある程度の量の神経機能を失っている年齢３０歳を超えているヒトである。一般的に、神経喪失は、神経突起、神経組織化、または神経ネットワークの喪失を含む、細胞レベルでの任意の神経喪失を意味する。

他の実施形態では、方法は、デンドリマー組成物による処置から利益が得られる可能性が高い対象を選択することを含む。例えば、患者のＣＳＦ中のセラミドレベルを最初に決定し、健康な対照のレベルと比較する。一部の実施形態では、デンドリマー組成物は、健康な対照のものと比べてＣＳＦまたは血清中の上昇したセラミド濃度を有する患者に投与される。他の実施形態では、デンドリマー組成物は、健康な対照のものと比べて脳および／または血清中エクソソームの量が増加した患者に投与される。他の実施形態では、デンドリマー組成物は、健康な対照のものと比べて血清中抗セラミドＩｇＧレベルが増加した患者に投与される。他の実施形態では、デンドリマー組成物は、ｎＳＭａｓｅ２、ＴＲＥＭ２、ＬＲＲＫ２、およびＲＩＰＫ１などのミクログリアにおける１つまたは複数の酵素または受容体媒介機構を伴う変更されたまたは異常な代謝活性を有する患者に投与される。

２．がん
一部の実施形態では、デンドリマー組成物およびその製剤は、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法において使用される。それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法は、治療有効量のデンドリマー組成物を対象に投与することを含む。

好ましい場合では、デンドリマー組成物およびその製剤は、腫瘍の成長を阻害する、腫瘍のサイズを低減する、長期の生存率を増加させる、免疫チェックポイント遮断に対する応答を向上させる、および／または腫瘍再チャレンジに対して保護する免疫学的記憶を誘導するために有効な量で投与される。

患者におけるがんは、がんを引き起こす細胞の典型である特徴、例えば制御されない増殖、特殊化した機能の喪失、不死性、顕著な転移能、抗アポトーシス活性の大幅な増加、急速な成長および増殖速度、ならびにある特定の特徴的な形態学および細胞マーカーを保有する細胞の存在を指す。一部の状況では、がん細胞は、腫瘍の形態である；そのような細胞は、動物内の局所に存在するか、または独立した細胞、例えば白血病細胞として血流中を循環し得る。腫瘍は、悪性であるか良性であるかによらず、全ての新生物細胞の成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。固形腫瘍は、一般的に嚢胞も液体領域も含有しない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、非限定的な例として、脳、結腸、乳房、前立腺、肝臓、腎臓、肺、食道、頭頸部、卵巣、子宮頸部、胃、結腸、直腸、膀胱、子宮、精巣、および膵臓に存在し得る。一部の実施形態では、固形腫瘍は、固形腫瘍を本開示の方法によって処置した後に退縮するかまたはその成長が遅くなるもしくは停止する。他の実施形態では、固形腫瘍は悪性である。一部の実施形態では、がんはステージ０のがんを含む。一部の実施形態では、がんはステージＩのがんを含む。一部の実施形態では、がんはステージＩＩのがんを含む。一部の実施形態では、がんはステージＩＩＩのがんを含む。一部の実施形態では、がんはステージＩＶのがんを含む。一部の実施形態では、がんは、不応性および／または転移性である、例えば、がんは、放射線療法、化学療法による処置、または免疫療法による単独処置に対して不応性であり得る。がんは、新たに診断されたまたは再発性のがんを含み、これらは、以下に限定せず、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、進行性軟部組織肉腫、脳がん、転移性または侵襲性乳がん、乳癌、気管支原性癌、絨毛癌、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸直腸癌、ユーイング肉腫、消化管癌、神経膠腫、多形膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、ホジキン病、頭蓋内上衣芽腫、大腸がん、白血病、肝臓がん、肺癌、ルイス肺癌、リンパ腫、悪性線維性組織球腫、乳腺腫瘍、黒色腫、中皮腫、神経芽腫、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、脳橋腫瘍、閉経前乳がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、細網肉腫、肉腫、小細胞肺がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、および子宮癌を含む。一部の実施形態では、がんは急性白血病である。一部の実施形態では、がんは急性リンパ芽球性白血病である。一部の実施形態では、がんは急性骨髄性白血病である。一部の実施形態では、がんは進行性軟部組織肉腫である。一部の実施形態では、がんは脳がんである。一部の実施形態では、がんは乳がん（例えば、転移性または侵襲性乳がん）である。一部の実施形態では、がんは乳癌である。一部の実施形態では、がんは気管支原性癌である。一部の実施形態では、がんは絨毛癌である。一部の実施形態では、がんは慢性骨髄性白血病である。一部の実施形態では、がんは結腸癌（例えば、腺癌）である。一部の実施形態では、がんは結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）である。一部の実施形態では、がんはユーイング肉腫である。一部の実施形態では、がんは消化管癌である。一部の実施形態では、がんは神経膠腫である。一部の実施形態では、がんは多形膠芽腫である。一部の実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。一部の実施形態では、がんは肝細胞癌である。一部の実施形態では、がんはホジキン病である。一部の実施形態では、がんは頭蓋内上衣芽腫である。一部の実施形態では、がんは大腸がんである。一部の実施形態では、がんは白血病である。一部の実施形態では、がんは肝臓がんである。一部の実施形態では、がんは肺がん（例えば、肺癌）である。一部の実施形態では、がんはルイス肺癌である。一部の実施形態では、がんはリンパ腫である。一部の実施形態では、がんは悪性線維性組織球腫である。一部の実施形態では、がんは、乳腺腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんは黒色腫である。一部の実施形態では、がんは中皮腫である。一部の実施形態では、がんは神経芽腫である。一部の実施形態では、がんは骨肉腫である。一部の実施形態では、がんは卵巣がんである。一部の実施形態では、がんは膵臓がんである。一部の実施形態では、がんは脳橋腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんは閉経前乳がんである。一部の実施形態では、がんは前立腺がんである。一部の実施形態では、がんは横紋筋肉腫である。一部の実施形態では、がんは細網肉腫である。一部の実施形態では、がんは肉腫である。一部の実施形態では、がんは小細胞肺がんである。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍を含む。一部の実施形態では、がんは胃がんである。一部の実施形態では、がんは精巣がんである。一部の実施形態では、がんは子宮癌である。一部の実施形態では、がんは多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは皮膚がんである。一部の実施形態では、がんは十二指腸がんである。

３．心疾患
一部の実施形態では、デンドリマー組成物およびその製剤は、それを必要とする対象における心疾患を処置するための方法に使用される。心疾患を処置するための方法は、治療有効量のデンドリマー組成物を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、心疾患は、心筋細胞肥大、線維芽細胞由来心肥大、心不全、心肥大、拡張型および／もしくは収縮型心室機能不全を伴う心筋疾患、ならびに／または線維症、大動脈狭窄、心房細動、心筋症の遺伝性形態、心蓄積病（cardiac storage disease）、および／もしくはファブリー病を伴う心血管疾患である。

４．感染疾患
製剤は、ウイルス、細菌、寄生生物、および真菌感染症に起因する疾患、またはそれに関連する炎症を処置するために有効である。

例示的な感染症を引き起こす因子としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ジカウイルス、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、狂犬病、ランガットウイルス（ＬＧＴＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のイプシロン毒素、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の志賀毒素が挙げられる。例えば、ＥＶは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症の伝播に関係している（Caobi, A. et al., Viruses 12(10), 1200(2020)において論評されている）。ＨＩＶ感染細胞から放出されたＥＶは、ＨＩＶアクセサリタンパク質および標的細胞をＨＩＶ感染症に対してより受容性にする共受容体を有する。加えて、ビリオンは、ＥＶと物理的に会合し得、それによって免疫の監視を回避し、感染力を増加させることが可能となり得る。ＨＩＶ－１感染ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＥＶが、休止ＣＤ４＋Ｔリンパ球における休眠期ウイルスリザーバーからのＨＩＶ－１再活性化を誘導することができることも示されている（Chiozzini,C. et al. Archives of Virology 162(9), 2565-2577(2017)）。細胞培養実験では、感染ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＥＶの放出をｎＳＭａｓｅ２阻害剤ＧＷ４８６９およびスピロエポキシドによって遮断すると、健康なＣＤ４＋Ｔリンパ球の樹状細胞媒介性の感染が低減した。

ＨＩＶに加えて、ｎＳＭａｓｅ２阻害剤は、ジカウイルスに対しても治療の有望性を示している。ヒト胎児アストロサイトにおけるジカ感染症は、ＥＶおよびウイルス粒子の放出を増加させることが示された；ウイルス粒子の一部は、ＥＶ内にパッケージングされた。ＧＷ４８６９を介してＥＶ放出を阻害することは、ジカウイルス伝播の減少をもたらした（Huang, Y. et al., Cell discovery 4, 19-19(2018)）。類似の知見は、ジカウイルスがウイルスＲＮＡを含有するＥＶ放出の増強をもたらすマウスニューロン細胞培養において観察された。ｓｉＲＮＡを使用してｎＳＭａｓｅ２をサイレンシングするかまたはＧＷ４８６９により酵素を薬理学的に阻害することは、ＥＶ放出を低減させ、ウイルスＲＮＡレベルを減少させた［１０１］。ｎＳＭａｓｅ２阻害剤の有効性はまた、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、狂犬病、ランガットウイルス（ＬＧＴＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）においても調べられている。

一部の実施形態では、デンドリマー組成物およびその製剤は、特に活性化ミクログリアおよびアストロサイトがウイルスによって標的化される／ウイルスに感染する場合に、ウイルス複製、ウイルス負荷、および／またはウイルス放出を低減または阻害するために使用される。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって産生されるイプシロン毒素は、有蹄類（undulates）の致死性細菌感染症であり、曝露された腎細胞においてセラミド産生を増強することが示された。曝露された腎細胞のＧＷ４８６９による処置により、細胞死を低減した（Takagishi, T. et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes1858(11), 2681-2688 (2016)）。ＧＩ、腎臓、およびＣＮＳの病態に関連するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのある特定の株によって放出される細菌志賀毒素は、曝露されたマクロファージに由来するＥＶにパッケージングされることが見出された。これらのＥＶは、ナイーブなＨＫ－２腎上皮細胞において細胞死を誘導した。腎上皮細胞死の割合は、ＥＶ放出がｎＳＭａｓｅ２阻害によって遮断されると改善した（Lee,K.-S. et al., Cellular Microbiology n/a(n/a), e13249(2020)）。

したがって、デンドリマー組成物およびその製剤は、１つまたは複数の細菌、寄生生物、真菌、もしくはウイルス感染症、またはそれに関連する炎症を処置するための方法において使用される。

５．炎症疾患
ＥＶは、気道疾患に対する炎症応答に関係することが示されている。アレルギー性気道炎症のマウスモデルでは、ｎＳＭａｓｅ２阻害剤ＧＷ４８６９による処置は、より少ない肺マクロファージ、ならびに改善された気道過敏応答性および気管支病態をもたらした（Kulshreshtha, A. et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology131(4), 1194-1203.e1114(2013)）。

ｎＳＭａｓｅ２を阻害することは、虚血－再灌流（ＩＲ）傷害の転帰を改善することができる。前臨床での脳虚血モデルでは、脳組織からの炎症促進性ＥＶ放出をＧＷ４８６９によって遮断すると、ＣＤ８６レベルの減少およびＣＤ２０６レベルの増加、ならびに炎症マーカーの低減によって測定した場合に、皮質および海馬においてより少ないＩｂａ１＋細胞、ならびにミクログリアの炎症促進性状態から抗炎症状態へのシフトがもたらされた（Gao, G. et al., Frontiers in immunology 11, 161-161(2020);Gu, L. etal., Journal of Neuroinflammation 10(1), 879(2013)）。

慢性の内皮炎症は、アテローム性動脈硬化症に関係する。高血圧の患者では、エンドセリン－１が上昇し、ｎＳＭａｓｅ２を活性化し、これが血管細胞接着タンパク質１（ＶＣＡＭ－１）および血管炎症を増加させ、小動脈のリモデリングをもたらす。ｎＳＭａｓｅ２をＧＷ４８６９によって阻害すると、ラット腸間膜の小動脈においてＶＣＡＭ－１発現が低下する（Ohanian, J. et al., Journal of Vascular Research 49(4),353-362(2012)）。

したがって、デンドリマー組成物およびその製剤は、１つまたは複数の炎症疾患を処置するための方法において使用される。例示的な炎症疾患としては、気道炎症、アレルギー性気道炎症、アテローム性動脈硬化症、脳虚血、肝虚血再灌流傷害、心筋梗塞、および敗血症が挙げられる。

Ｃ．投薬量および有効量
投薬量および投薬レジメンは、障害または傷害の重症度および性質、ならびに投与の経路およびタイミングに依存し、当業者によって決定され得る。神経疾患または神経変性疾患の処置に使用されるデンドリマー組成物の治療有効量は、典型的には、神経疾患もしくは神経変性疾患の１つもしくは複数の症状を低減または緩和するために、または他の状態における疾患の炎症もしくは重症度を低減するために十分である。

好ましくは、作用物質は、罹患したもしくは標的の組織内にあるわけでも、それに関連するわけでもない健康な細胞の活性または量を、標的化も別の方法でモジュレートもせず、あるいはＣＮＳにおいて活性化ミクログリア細胞を含む標的細胞と比較して低減されたレベルで標的化もしくはモジュレートする。このように、組成物に関連する副産物および他の副作用が低減される。

組成物の投与は、神経疾患、神経傷害、または加齢関連ニューロン減少もしくは機能不全を有する個体における神経機能の向上または増強をもたらす。一部のｉｎ ｖｉｖｏアプローチでは、デンドリマー複合体は、神経有糸分裂を刺激または誘導して新規ニューロンの生成をもたらし、神経原性効果を提供するために治療有効量で対象に投与される。同様に、個体のニューロン、神経突起、および神経ネットワークの劣化、機能不全、または死滅を防止、低減、または停止させて、神経保護効果を提供するための組成物の有効量も提供される。

デンドリマー複合体の実際の有効量は、投与される具体的な作用物質、製剤化される特定の組成物、投与様式、および処置される対象の年齢、体重、状態、ならびに投与経路および疾患または障害を含む要因に従って変化し得る。組成物の用量は、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ体重、および約２ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的に、静脈内注射または注入の場合、投薬量は、経口投与の場合よりも低くなり得る。

一般的に、投与のタイミングおよび頻度は、所与の処置または診断スケジュールの有効性の、所与の送達系の副作用とのバランスをとるように調整される。例示的な投薬頻度は、持続的注入、１回および複数回投与、例えば毎時間、毎日、毎週、または毎月の投薬を含む。

組成物は、毎日、週２回（biweekly）、毎週、２週間に１回、またはそれより少ない頻度で、治療剤の血中レベルの治療的に有効な増加を提供する量で投与することができる。投与が経口経路以外による場合、組成物は、２４時間以内に治療有効用量を生じるように、１時間より長い期間で、例えば３～１０時間をかけて送達され得る。あるいは、組成物は、制御放出のために製剤化することができ、この場合組成物は、１週間に１回またはそれより少ない頻度のレジメンで繰り返される１回用量として投与される。

投薬量は変化してもよく、１つまたは複数の用量の毎日投与を１日または数日間投与することができる。所与のクラスの医薬製品の適切な投薬量に関する指針が文献に見出され得る。最適な投薬スケジュールは、対象または患者の体における薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論および反復数を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々の医薬組成物の相対強度に応じて変化し得、一般的にｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であることが見出されるＥＣ_５０に基づいて推定することができる。

Ｄ．併用療法および手順
一部の実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ２の、１つもしくは複数の低分子阻害剤および／または追加の治療剤もしくは診断剤にコンジュゲートされているかまたはそれと複合体を形成しているデンドリマーの組成物を、１つまたは複数の従来の治療、例えば従来のがん、抗感染症剤、または抗炎症療法と併用して投与する。一部の実施形態では、従来の治療は、組成物の１つまたは複数の、１つまたは複数の追加の活性剤と併用した投与を含む。併用療法は、同じ混合物中で共にまたは別個の混合物中での活性剤の投与を含み得る。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、２つ、３つ、またはそれより多くの活性剤を含む。そのような製剤は典型的に、腫瘍の微小環境を標的化する免疫調整剤の有効量を含む。追加の活性剤（複数可）は、同じまたは異なる作用機序を有し得る。一部の実施形態では、併用は、がんの処置に対して相加効果をもたらす。一部の実施形態では、併用は、疾患または障害の処置に対して相加効果よりも大きい効果をもたらす。

一部の実施形態では、製剤は、対象への静脈内、皮下、もしくは筋肉内投与のために、または経腸投与のために製剤化される。一部の実施形態では、製剤は、１つまたは複数の追加の治療または手順による処置の前に、処置と共に、処置の後に、または処置と交互に投与される。一部の実施形態では、追加の治療は、薬物サイクルの間にまたは投薬レジメンの一部である休薬期間の間に行われる。例えば、一部の実施形態では、追加の治療または手順は、手術、放射線療法、または化学療法である。好ましい追加の治療剤の例としては、所望の疾患、障害、または状態を処置するために当技術分野で公知の他の従来の治療が挙げられる。

アルツハイマー病の文脈では、他の治療剤は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、タクリン、リバスチグミン、ガランタミン、またはドネペジル）、ベータ－セクレターゼ阻害剤、例えばＪＮＪ－５４８６１９１１、アデュカヌマブなどの抗体、５－ＨＴ２Ａ受容体のアゴニスト、例えばピマバンセリン、サルグラモスチム、ＡＡＤｖａｃ１、ＣＡＤ１０６、ＣＮＰ５２０、ガンテネルマブ、ソラネズマブ、およびメマンチンのうちの１つまたは複数を含み得る。

レビー小体型認知症の文脈では、他の治療剤は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えばタクリン、リバスチグミン、ガランタミン、またはドネペジル；Ｎ－メチルｄ－アスパラギン酸受容体アンタゴニストであるメマンチン；ドーパミン作動薬療法、例えばレボドパまたはセレギリン；抗精神病薬、例えばオランザピンまたはクロザピン；ＲＥＭ障害療法、例えばクロナゼパム、メラトニン、またはクエチアピン；抗うつおよび抗不安療法、例えば選択的セロトニン再取り込み阻害剤（シタロプラム、エスシタロプラム、セルトラリン、パロキセチン等）またはセロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ベンラファキシン、ミルタザピン、およびブプロピオン）（例えば、Macijauskiene, et al., Medicina(Kaunas), 48(1):1-8(2012)を参照されたい）のうちの１つまたは複数を含み得る。

例示的な神経保護剤もまた、当技術分野で公知であり、例えば、グルタメートアンタゴニスト、抗酸化剤、およびＮＭＤＡ受容体刺激剤が挙げられる。他の神経保護剤および処置は、カスパーゼ阻害剤、栄養因子、抗タンパク質凝集剤、低体温療法、およびエリスロポエチンを含む。

神経機能障害を処置するための他の一般的な活性剤は、運動症状を処置するためのアマンタジンおよび抗コリン作動薬、精神病を処置するためのクロザピン、認知症を処置するためのコリンエステラーゼ阻害剤、ならびに日中の眠気を処置するためのモダフィニルを含む。

がんの処置の文脈では、他の治療は、従来の化学療法、チェックポイントタンパク質の阻害、養子Ｔ細胞療法、放射線療法、および腫瘍の外科的切除のうちの１つまたは複数を含む。

一部の実施形態では、組成物および方法は、免疫療法、例えば１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節剤（例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－１リガンドアンタゴニスト、およびＣＴＬＡ４アンタゴニスト）を使用するチェックポイントタンパク質、例えばＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸もしくはＣＤ２８－ＣＴＬＡ－４軸の構成要素の阻害、養子Ｔ細胞療法、および／またはがんワクチンによる処置の前に、処置と共に、処置の後に、または処置と交互に使用される。免疫療法において使用される例示的な免疫チェックポイント調節剤としては、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ１ ｍＡｂ）、デュルバルマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、ＰＤＲ００１（抗ＰＤ１ ｍＡｂ）、アテゾリズマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、ニボルマブ（抗ＰＤ１ ｍＡｂ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、アベルマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、およびＲＧ７８７６（ＣＤ４０アゴニストｍＡｂ）が挙げられる。特定の実施形態では、組成物および方法は、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストを使用する免疫療法による処置と交互に使用される。

一部の実施形態では、組成物および方法は、養子Ｔ細胞療法による処置の前に、処置と共に、処置の後に、または処置と交互に使用される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞、またはＣＡＲＴ）を発現する。人為的なＴ細胞受容体は、特定の特異性を免疫エフェクター細胞に移植する操作された受容体である。典型的には、これらの受容体を使用して、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植し、実質的にいかなる腫瘍関連抗原も標的化するように操作することができる。第一世代ＣＡＲは典型的に、ＣＤ３ζ鎖からの細胞内ドメインを有し、これは内因性のＴＣＲからのシグナルの一次伝達物質である。第二世代ＣＡＲは、様々な共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）からの細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質テールに付加してＴ細胞に追加のシグナルを提供し、第三世代ＣＡＲは、複数のシグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢ、またはＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０を組み合わせて、有効性をさらに増強する。

一部の実施形態では、組成物および方法は、がんワクチン、例えば樹状細胞がんワクチンによる処置の前に、処置と共に、処置の後に、または処置と交互に使用される。ワクチン接種は典型的に、ｉｎ ｖｉｖｏで治療的Ｔ細胞を誘発するために、抗原（例えば、がん抗原）をアジュバントと共に対象に投与することを含む。一部の実施形態では、がんワクチンは、ｅｘ ｖｉｖｏでプライミングされた樹状細胞によって送達される抗原ががん抗原を提示する樹状細胞がんワクチンである。例としては、前立腺がんの処置のための樹状細胞に基づくワクチンであるＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（シプリューセル－Ｔ）が挙げられる（Ledford, et al., Nature, 519, 17-18(05 March 2015)。そのようなワクチンならびに免疫療法のための他の組成物および方法は、Palucka,et al., Nature Reviews Cancer, 12, 265-277(April 2012)において論評されている。

一部の実施形態では、組成物および方法は、例えば原発腫瘍転移を防止するために、腫瘍の外科的切除の前に、切除と共に、または切除の後に使用される。一部の実施形態では、組成物および方法は、体自身の抗腫瘍免疫機能を増強するために使用される。

Ｅ．対照
１つまたは複数の作用物質を含むデンドリマー複合体組成物の治療結果を、対照と比較することができる。適した対照は当技術分野で公知であり、例えば無処置対象または無処置細胞または処置前の同じ個体を含む。

ＶＩ．キット
組成物を、キットに包装することができる。キットは、デンドリマーに封入されている、会合している、またはコンジュゲートされている１つまたは複数の中性スフィンゴミエリナーゼ２の阻害剤を含む組成物の単一用量または複数用量、および組成物を投与することについての指示を含み得る。具体的には、指示は、組成物の有効量が、示されるように、特定の神経疾患、欠損または機能不全を有する個体に投与されることを指示する。組成物は、特定の処置方法を参照して上記のように製剤化することができ、任意の従来の様式で包装され得る。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。

（実施例１）
中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）阻害剤によるＡＤの処置
ＡＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のセラミドレベルは、対照として表される他の神経疾患を有する患者のレベルよりも大幅に高いことが示されている（図２）。その上、免疫組織化学研究により、セラミドが、死後ＡＤ脳からのグリアにおいて異常に発現されているが、対照脳では発現されていないことが示された。二重標識免疫組織化学は、セラミドおよびＡβプラークの限局的な共存を示している。より最近の研究は、非常に長い鎖の血漿中セラミド（Ｃ２２：０およびＣ２４：０）が、予測される記憶喪失および減少した右海馬体積に加えて軽度の認知障害（ＭＣＩ）対象において変更されていることを示している。認知症を有しない７０～７９歳の９９人の女性を９年間にわたってモニターした別個の縦断研究は、より高いベースライン血清中セラミドがＡＤへの進行のリスクの増加に関連することを明らかにした。これらの知見は、血漿中のセラミド定量および活性化グリアがＡＤ進行のバイオマーカーとして役立ち得ることを示している。

中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）は、ＡＤの病因の重要な関与因子である。しかし、現在利用可能なｎＳＭａｓｅ２阻害剤は、可能性がある処置を開発するためには不適切であり、新規ｎＳＭａｓｅ２阻害剤が開発され、試験されている。ｎＳＭａｓｅ２阻害剤ＧＷ４８６９は、概念証明研究を行うための試験化合物として用いられている。これは、明白な行動上もしくは生理学的毒性または体重変化を示さない長期的な研究において使用されており、認容可能な治療アプローチとしてのｎＳＭａｓｅ２阻害の可能性を裏付ける。しかし、ＧＷ４８６９はμＭ濃度では強力ではなく、その高度に親油性の性質により、乏しい溶解度（ＤＭＳＯ中でさえ０．２ｍｇ／ｍＬ）を含む非常に乏しい物理化学特性を示す。１０年以上前に同定されたが、向上された効力または溶解度を有するアナログは記載されていない。

方法
ｎＳＭａｓｅ２阻害剤としてカンビノールを同定した初回の予備的スクリーニング後、＞３５０，０００個の化合物のヒトｎＳＭａｓｅ２ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を、酵素にカップリングした蛍光に基づくヒトｎＳＭａｓｅ２アッセイを使用して行った。カウンターアッセイおよび薬らしさパラメータを使用するヒット化合物の篩い分けにより、効力および化学的最適化実現可能性に基づいて、最も有望な化合物として２，６－ジメトキシ－４－（５－フェニル－４－（チオフェン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェノール（ＤＰＴＩＰ）の発見に至った。ＤＰＴＩＰのＩＣ５０は、３０ｎＭ（図３Ａ）であった。このＩＣ５０は、プロトタイプ阻害剤ＧＷ４８６９（１μＭ）およびカンビノール（５μＭ）よりもそれぞれ、３０倍および１６０倍強力である。これは、ナノモル濃度の効力で記載された最初のｎＳＭａｓｅ２阻害剤である。

ＤＰＴＩＰの脱ヒドロキシルアナログもまた、阻害活性に関するヒドロキシル基の重要性を確立するために合成したが、これはヒトｎＳＭａｓｅ２に対して不活性であることが示された（ＩＣ５０＞１００μＭ）（図３Ｂ）。次に、この化合物を、その後の薬理学的アッセイにおける比較のための構造的に類似の不活性なＤＰＴＩＰアナログとして使用した。

ＤＰＴＩＰは、選択的であり、アルカリホスファターゼ（ＩＣ５０＞１００μＭ）、ホスホモノエステラーゼ、または酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＩＣ５０＞１００μＭ）、ｎＳＭａｓｅ２に近縁のホスホジエステラーゼを含む２つの関連する酵素ファミリーのメンバーを阻害しない。同様に、ＤＰＴＩＰを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＣＡＴＳ）において７５９個のバイオアッセイにおいてスクリーニングし、ごく弱い活性（μＭ）が、これらのアッセイの＜２．５％に観察された（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5446044）。他のｐ３８阻害剤に対するＤＰＴＩＰの構造類似性により、ｐ３８キナーゼに対するＤＰＴＩＰキナーゼのプロファイリングを実施した。

結果
以下の表１に示すように、ＤＰＴＩＰは、０．００１～１００μＭの濃度で４つのｐ３８キナーゼのいずれの阻害も示さなかった（ＩＣ５０は定量不能であった）。陽性対照ＳＢ２０２１９０およびスタウロスポリンは、それぞれのｐ３８Ｍａｐキナーゼの強力な阻害を示した。

（実施例２）
グリア細胞からのエクソソーム放出のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害
方法
ＤＰＴＩＰがグリア細胞からのエクソソームの放出を阻害する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。マウス初代グリアを、ＦＢＳによって活性化し、ＤＰＴＩＰまたはその近縁の不活性な脱ヒドロキシルアナログによって０．０３～１００μＭの濃度範囲でＤＭＳＯ（０．０２％）をビヒクル対照として使用して処置した。処置の２時間後、エクソソームを培地から単離し、ナノ粒子トラッキング分析によって定量した。

結果
ＤＰＴＩＰは、エクソソーム放出を用量依存的に阻害した（図４）。これに対し、近縁の不活性なアナログは効果を有さず、ＤＰＴＩＰのエクソソーム阻害機構がｎＳＭａｓｅ２を介して起こることを裏付ける。

ＧＷ４８６９（公知のｎＳＭａｓｅ２阻害剤）は、増加したシナプス後タンパク質ＰＳＤ－９５、増加したＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ２Ａ、ならびにＡＭＰＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ１を含むシナプスタンパク質の大幅な変化を示した。ＤＰＴＩＰ（１０ｍｇ／ｋｇ毎日；腹腔内）による類似の予備的研究は、ＰＳＤ９５またはＮＲ２Ａに対して顕著な効果を示さなかった。ニューロンの機能を測定する電圧のトレースを、多重電極アレイ（ＭＥＡ）プレートにおいて１０ｕＭ ＤＰＴＩＰ処置の前および後に酸素付加人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）によって連続的に灌流した３００μｍの水平方向脳スライスにおいて記録した。トレースに有意差は観察されず、ＤＰＴＩＰによるｎＳＭａｓｅ２阻害後のニューロン機能に対する効果がないことを示唆した。

（実施例３）
ＤＰＴＩＰおよびそのアナログの薬物動態および生物学的利用能
方法
ＤＰＴＩＰのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態特性を評価した。

結果
マウスおよびヒト肝ミクロソームにおけるフェーズＩ代謝安定性研究は、ＤＰＴＩＰがＣＹＰ依存的酸化に対して完全に安定である（１時間で１００％残存している）ことを示した。これは、ＤＰＴＩＰがフェーズＩ酸化反応を介して反応性代謝物（例えば、チオフェン－Ｓ酸化物、チオフェンエポキシド）を形成することができる「チオフェン」環を含有することから有望であった。加えて、ＤＰＴＩＰはまた、フェーズＩＩグルクロン酸化（glucuronidation）（１時間で＞５０％残存している）に対しても中等度に安定であった。しかし、マウスでの経口（１０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ；図６Ｃ）投与後の経口生物学的利用能および脳浸透は、最適ではなかった（Ｆ＜５％、ＡＵＣ脳／血漿比＜０．２）。さらに、ＤＰＴＩＰのレベルは、急速なクリアランス（Ｃｌａｐｐ＝９２ｍＬ／分／ｋｇ）および短い血漿中半減期（ｔ１／２＝約０．５時間）により、投与後２時間で検出不能であった。これらの結果は、ＤＰＴＩＰ（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）投与後のＡＤマウス（３×Ｔｇ）において確認された。ＡＤマウスは、野生型（ＷＴ）マウスと同等の乏しい脳ＤＰＴＩＰ浸透（＜０．２）を示した。

ＤＰＴＩＰの乏しい経口生物学的利用能（Ｆ＜５％）および限定的な脳浸透（Ｂ／Ｐ比＜０．２）および急速なクリアランス（血漿中半減期ｔ１／２＝約０．５時間）を考慮して、その薬物動態特性を向上させるために広範囲のＳＡＲの試み（＞２００個のアナログを合成した）を実施した。阻害活性にとって重要であるファーマコフォアの部分を同定すること、および類似の効力を有するアナログを合成することが可能であったが、向上した経口生物学的利用能またはクリアランスを有するアナログを同定することは不可能であった。

（実施例４）
ヒドロキシルＰＡＭＡＭデンドリマーの使用は、低分子の送達および保持を向上させる
ヒドロキシルＰＡＭＡＭデンドリマーは、前臨床モデルにおける＞５００ｍｇ／ｋｇの複数回用量であっても非毒性であり、ヒトを含む腎臓を通して無傷で（代謝されずに）取り除かれる。これらのデンドリマーは、いかなる標的化リガンドがなくとも、脳における活性化グリアに選択的に局在し、傷害部位に薬物を送達して正の治療転帰を生じることができる。重要なことに、そのような細胞取り込みは健康な対照動物では観察されない。この選択的取り込み機構は、他のタイプのナノ粒子では認められていない。デンドリマーは、機能不全のＢＢＢを通過して、脳組織内に急速に拡散することができ、最終的に、増加するエンドサイトーシスにより活性化されたグリアによって取り込まれる。デンドリマー－Ｎ－アセチルシステインは１０ｍｇ／ｋｇ薬物（経口またはＩＶ）で、運動機能、神経炎症の低減、酸化的ストレス、および神経傷害において顕著な治療利益を示した。この化合物は、ＧＭＰ製造および毒性研究の成功の後、臨床試験中であり、健康な成人ボランディア研究を完了した。脳傷害の小動物および大型動物モデルを使用する複数の研究は、ヒドロキシルで終端したデンドリマーが、標的化傷害を受けた複数の種において機能不全のＢＢＢを通過することを実証した。

方法
脳取り込みに対するデンドリマーサイズの効果を調べ、Ｃｙ５標識を有する世代６（Ｇ６、約６．７ｎｍ、約５６ｋＤａ）および世代４（Ｇ４、約４．３ｎｍ、約１４ｋＤａ）のＰＡＭＡＭデンドリマーを使用して脳傷害のイヌおよび齧歯類モデルの両方における薬物動態、ならびに蛍光定量を調べた。

Ｇ６デンドリマーは、Ｇ４デンドリマー（ｔ１／２は約６時間、７２時間で注射した用量の約５％）と比較して血漿中循環時間を延長させた（血漿中半減期、ｔ１／２は約２４時間、７２時間で注射した用量の約３０％；図４）。これは、Ｇ６デンドリマーに関して脳ＡＵＣの約１０倍増加を伴う（Mishra MK, et al., ACS nano. 2014; Zhang F, et al., Journal ofControlled Release. 249:173-82(2017)）。ラットでは、Ｇ６デンドリマーのＡＵＣもまた、Ｇ４デンドリマーの約１０倍だった。直接比較ではないが、デンドリマーのいずれの血漿中ＡＵＣも、デンドリマーによって与えられた循環時間の増強により、全身投与後にＤＰＴＩＰのＡＵＣよりも大幅に高い。加えて、ＤＰＴＩＰは、Ｇ４／Ｇ６デンドリマー（ｔ１／２＝６～２４時間）と対比して短い血漿中半減期（ｔ１／２＝約０．５時間）を有する。

予備的規模の合成を行って、ＤＰＴＩＰをデンドリマーとコンジュゲートすることができるか否かを確認した。Ｄ－ＤＰＴＩＰの合成は、非常に効率的な銅（Ｉ）触媒アルキン－アジドクリック（ＣｕＡＡＣ）ケミストリー（Franc G and Kakkar A. Chemical Communications. 2008(42):5267-76）を使用して達成された。合成は、切断可能エステル結合を通して直交型リンカーをアジド末端と付着させるＤＰＴＩＰの修飾によって始まった（図５Ａ）。アジド基の目的は、デンドリマーの表面上のアルキン官能基とのＣｕＡＡＣ反応に関与することである。ＤＰＴＩＰ（１）におけるヒドロキシル基を、カップリング剤としてのＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下でアジド－ＰＥＧ４－酸（２）と反応させた。粗産物を、カラムクロマトグラフィーを使用して精製して、ＤＰＴＩＰ－アジド（３）を得た。産物（３）を、ＮＭＲ、質量、およびＨＰＬＣ技術を介して特徴付けた。一方、デンドリマー表面を修飾して、相補的アルキン基を有するリンカーを付着させた（図５Ｂ）。受領したままの世代４のヒドロキシルＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｄ－ＯＨ；４）を、透析、遠心濾過、および二量体／後続世代（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を除去するために以前に確立された半分取ＨＰＬＣ分画技術によって精製した。精製されたＤ－ＯＨを、カップリング剤の存在下でペンチン酸と反応させて、７個のリンカーが付着した部分的にアルキンで終端したデンドリマー（５）を得た。最後に、ＣｕＡＡＣクリック反応をデンドリマー（５）とＤＰＴＩＰ－アジド（３）の間で実施して、７個の薬物分子が付着したＤ－ＤＰＴＩＰコンジュゲートを得た。最終的なコンジュゲートを透析により精製した。全ての中間体および最終的なコンジュゲートを、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を使用して特徴付けた。切断可能なエステル連結を通しての遊離の薬物の放出を、ＨＰＬＣによって分析した。

結果
デンドリマーアミドプロトンの統合をエステルメチレンプロトンおよびトリアゾール環プロトンと比較する１Ｈ ＮＭＲを使用して計算すると、平均で７個の薬物分子がデンドリマーにコンジュゲートされていた（１３重量％）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物放出を、エステラーゼ（ｐＨ５．５）の存在下、生理的温度で分析した。Ｄ－ＤＰＴＩＰは、およそ１０日間にわたって＞８０％の薬物放出を示した（図６）。デンドリマーの辺縁部での多様な治療分子のコンジュゲーションは、当業者に公知の方法を使用して行うことができる。

（実施例５）
ＡＤマウスに経口投与したＣｙ５－デンドリマー－ＤＰＴＩＰは、脳グリア細胞に送達され、ｎＳＭａｓｅ２活性の顕著な阻害によりターゲットエンゲージメント（ｔａｒｇｅｔ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を示す
方法
ＡＤマウスの活性化ミクログリアにおける経口投与したＣｙ５－Ｄ－ＤＰＴＩＰコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ取り込みおよび保持を、蛍光分光法を使用して評価した。前後して、単離されたＣＤ１１ｂ＋細胞における機能的ｎＳＭａｓｅ２阻害を用いるターゲットエンゲージメントを実施した。簡単に説明すると、９カ月齢のＰ３０１Ｓ ＡＤマウスにＣｙ５－Ｄ－ＤＰＴＩＰを投与し、２４時間（イメージングのため）および９６時間（ターゲットエンゲージメントのため）後に、氷冷ＰＢＳの経心臓灌流を介して屠殺した。イメージングのために、脳を、１０％ホルマリン中、４℃で４８時間、後固定し、瞬間凍結し、－８０℃で保存し、厚さ３０μｍの切片にし、ＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｉｂａ１）およびＤＡＰＩに関して染色した。ターゲットエンゲージメントのために、グリア細胞を、新鮮な脳から単離した。

結果
ＡＤマウス脳における活性化ミクログリアは、Ｃｙ５－Ｄ－ＤＰＴＩＰを選択的に取り込んだ。陽性Ｃｙ５シグナルが、ＡＤマウスの脳における海馬体の歯状回領域付近で観察された。陽性Ｃｙ５シグナルはＩｂａ－１染色と重複し、このことは活性化ミクログリア細胞における取り込みを示している。その上、ｎＳＭａｓｅ２活性の顕著な阻害が、Ｄ－ＤＰＴＩＰシグナルによって処置したグリア細胞において観察された（図７）。

（実施例６）
ＰＳ１９マウスに経口投与したＣｙ５－デンドリマー－ＤＰＴＩＰは、脳組織に選択的に蓄積する
方法
Ｄ－ＤＰＴＩＰの用量依存的薬物動態を、３～４カ月齢のＰＳ１９マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ．００８１６９）において評価した。Ｄ－ＤＰＴＩＰを、ＰＳ１９マウスに経口胃管栄養によって投与した（１０、３０、および１００ｍｇ／ｋｇ遊離薬物当量；１０ｍＬ／ｋｇ）。所定の時点（投与の２４、７２、１２０時間後）で、動物を安楽死させ、血液収集後に脳組織を採取した。低速遠心分離（３０００ｇ）によって、血液から血漿を生成した。血漿および脳組織を、液体窒素中で直ちに瞬間凍結し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ生体分析によるＤＰＴＩＰ定量のために－８０℃で保存した。脳試料を、ＰＢＳ中でホモジナイズし、２ｍｇ／ｍＬ肝ＣＥＳ酵素と共に６０分間インキュベートし、脳に存在するＤ－ＤＰＴＩＰからのＤＰＴＩＰの放出を確実にした。脳の較正標準物質（１ｎＭ～１０，０００ｎＭ）を、脳ホモジネート（ＰＢＳ中）にＤＰＴＩＰを添加することによって調製した。血漿中の定量に関して、ＤＰＴＩＰを添加したナイーブマウス血漿を使用してＤＰＴＩＰ較正標準物質（１ｎＭ～１０，０００ｎＭ）を調製した。ＤＰＴＩＰ標準物質および試料を、内部標準物質（ロサルタン約０．５μＭ）を含有するアセトニトリル（１００％ｖ／ｖ）を使用して１ステップタンパク質沈殿により血漿および脳から抽出した。試料を、ボルテックスミキサーにより混合し、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）し、上清を、以前に記載したようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してＤＰＴＩＰに関して分析した（Rojas C, et al., Sci Rep. 2018 Dec 7;8(1):17715）。

結果
Ｄ－ＤＰＴＩＰコンジュゲート（１０、３０、および１００ｍｇ／ｋｇ ＤＰＴＩＰ当量）を、経口胃管栄養を介して投与し、ＤＰＴＩＰ放出を、投与の２４、７２、および１２０時間後に測定した。血漿中では、Ｄ－ＤＰＴＩＰは、いずれの時点でも用量レベルでもＤＰＴＩＰの測定可能なレベルを示さなかった（図８Ａ）。これに対し、１００ｍｇ／ｋｇ用量は、７２時間までそのｎＳＭａｓｅ２ ＩＣ５０（２０～３５ｎＭ）でＤＰＴＩＰの脳内濃度を提供した（図８Ｂ）。しかし、Ｄ－ＤＰＴＩＰは、いかなる用量レベルでも１２０時間において、ＤＰＴＩＰの測定可能な脳内濃度を示さなかった。

（実施例７）
ＰＳ１９マウスに経口投与したＣｙ５－デンドリマー－ＤＰＴＩＰは、活性化ミクログリアにおけるｎＳＭａｓｅ２活性を選択的に阻害する
方法
ターゲットエンゲージメント評価に関して、３～４カ月齢のＰＳ１９マウスに、Ｄ－ＤＰＴＩＰを経口投与（１０および１００ｍｇ／ｋｇ）し、投与の７２時間後に屠殺した。ミクログリア（ＣＤ１１ｂ＋）細胞を以前に記載された方法に従って軽微な変更を加えて全脳から単離し（Zhu X, et al., Neuropsychopharmacology. 2019 Mar;44(4):683-694）、ｎＳｍａｓｅ２活性を、蛍光アッセイを使用して測定した（Figuera-LosadaM, et al., PLoS One. 2015 May 26;10(5):e0124481）。イメージング研究を、蛍光タグをつけたデンドリマー－ＣＹ５－ＤＰＴＩＰを使用して単離されたグリア細胞においても実施し、Ｄ－ＤＰＴＩＰのミクログリア蓄積を確認した。

結果
経口Ｄ－ＤＰＴＩＰは、１００ｍｇ／ｋｇ用量の投与の７２時間後にミクログリアｎＳＭａｓｅ２活性を大幅に阻害したが、１０ｍｇ／ｋｇでは阻害は観察されなかった（図９Ａ）。非ミクログリア細胞では阻害は観察されず（図９Ｂ）、Ｄ－ＤＰＴＩＰからのミクログリアへの特異的標的化を示唆している。加えて、ＡＤマウス脳における活性化ミクログリアがＣｙ５－Ｄ－ＤＰＴＩＰを選択的に取り込んだことが観察された。陽性Ｃｙ５シグナルがＡＤマウスの脳における海馬体の歯状回領域付近で観察された。陽性Ｃｙ５シグナルは、Ｉｂａ－１染色と重複し、ミクログリアの取り込みを示した。

（実施例８）
腫瘍の成長および生存実験
方法
６～８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、この研究のために使用した。マウスの手順は全てＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。ＭＣ３８細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞系を、Ｍｙｃｏ Ａｌｅｒｔマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を使用して定期的に試験して、マイコプラズマフリーであることを確認した。細胞は培養において３週間以内で維持した。ＭＣ３８（マウスあたり２００μｌ中に５×１０^５個の細胞）細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。処置の開始日に、群を腫瘍サイズに基づいて無作為化した。マウスに、アイソタイプ対照（２００μｇ／マウス）もしくは抗ＰＤＬ１（２００μｇ／マウス）をそれぞれ、１２、１５、および１８日目にｉ．ｐ．注射によって投与（処置）するか、またはＤ－ＤＰＴＩＰ対照（３００μｌ／マウス）、または抗ＰＤＬ１（２００μｇ／マウス）とＤ－ＤＰＴＩＰ（２．３ｍｇ／マウス）を組み合わせて１日おきに投与した。腫瘍の負荷を、腫瘍の長さおよび幅を測定することによって２～４日毎にモニターした。腫瘍体積は、キャリパーでの測定に関して以下の式を使用して計算した：腫瘍体積＝（Ｌ×Ｗ２）／２、（式中、Ｌは腫瘍の長さであり、２つの測定値の長いほうであり、Ｗは腫瘍の幅であり、腫瘍面積＝Ｌ×Ｗである）。腫瘍サイズがいずれかの寸法で２ｃｍを超える場合、またはマウスが体を丸める、波だった被毛（ruffled coat）、神経症状、重度の体重減少、呼吸困難、衰弱、もしくは疼痛を示した場合、マウスを安楽死させた。

ＥＬ４リンパ腫を接種したマウスにおけるＧ６ Ｄ－ＤＰＴＩＰ薬物動態に関して、６～８週齢のナイーブの雄性および雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（体重は２５～３０ｇの間）を使用した。動物を、飼料および水を自由に与えて１２時間の明暗サイクルで維持した。コンフルエンスに達したＥＬ４マウスリンパ腫細胞を、ｓ．ｃ．注射し（０．３×１０^６個の細胞）、腫瘍の成長をモニターした。腫瘍体積は、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ）／２（式中、Ｖは腫瘍の体積であり、Ｗは腫瘍の幅であり、Ｌは腫瘍の長さである）を使用して計算し、およそ４００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有するマウスを、薬物動態研究のために考慮した（時点あたりｎ＝３マウス、雄性２例および雌性１例）。動物に、Ｇ６－ＤＰＴＩＰの１０ｍｇ／ｋｇ ＤＰＴＩＰ当量を投与し、血漿および腫瘍を様々な時点で収集した。血漿および腫瘍試料を、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳを使用してＤＰＴＩＰに関して分析した。

結果
ＭＣ３８腫瘍モデルにおける－ＤＰＴＩＰまたは抗ＰＤＬ１単独による単剤療法は、アイソタイプ対照と比較した場合に腫瘍の成長に対して有意な阻害効果を示した。Ｄ－ＤＰＴＩＰの抗ＰＤＬ１との併用療法は、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて－ＤＰＴＩＰまたは抗ＰＤＬ１単独によるそれぞれの単剤療法と比較した場合に腫瘍の成長に対して最大の阻害効果を示した（図１０）。

ＥＬ４リンパ腫を接種したマウスにおけるＧ６ Ｄ－ＤＰＴＩＰ薬物動態に関して、Ｇ６－ＤＰＴＩＰは、投与後４８時間まで血漿および腫瘍において検出可能なレベルで優れた薬物動態を示した。特に、Ｇ６－Ｄ－ＤＰＴＩＰは、投与後４８時間まで＞４００ｎＭ（ＩＣ５０の約１３倍）の持続的な腫瘍レベルを与えた（図１１）。

（実施例９）
Ｄ－ＤＰＴＩＰ処置は、対側の歯状回のニューロンへのタウ伝播を低減した
方法
全てのマウスの手順は、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスに、６×１０^１２ウイルス粒子のＡＡＶ１－ＣＢＡ－Ｐ３０１Ｌ／Ｓ３２０Ｆ ｈＴａｕ－ＷＰＲＥベクターを左海馬に定位的に注射した（座標、ブレグマから：ＡＰ：－２．３５；ＭＬ：－２．１０；ＤＶ：－１．８５）。マウスを術後２日間休ませた後、空のデンドリマービヒクル（ｎ＝９）、または７６９ｍｇ／ｋｇ Ｄ－ＤＰＴＩＰ（１００ｍｇ／ｋｇ ＤＰＴＩＰ当量の用量）（ｎ＝８）のいずれかの、週に２回６週間にわたるＰＯでの処置を開始した。６週間後、マウスを、イソフルランによって深部麻酔した後、１×ＰＢＳ、その後２％パラホルムアルデヒドを経心臓灌流して、イメージング研究のために組織を固定した。次に脳を３０％スクロース中で凍結保護した後、３０μｍの凍結切片にした。切片を、１×ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中の５％正常ヤギ血清により、室温で１時間ブロックして透過性にした。切片を、ニューロンに対する一次抗体（ＮｅｕＮ）と共に４℃で一晩インキュベートして、タウ陽性がニューロンにあり、リン酸化タウ（ｐＴｈｒ１８１）を確認した後、適切なフルオロフォアコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。画像を、ピクセルが確実に飽和しないように全ての画像獲得に関して同一の設定を用いて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡を使用して撮影した。ｐＴｈｒ１８１ ｈＴａｕ蛍光シグナルがその最大である単一の焦点面をイメージングし、８～１０個の画像を、各マウスから注射部位および対側の両方の同じ海馬位置で得た。画像の獲得および分析は、処置の状態に対して盲検で行った。生のＴＩＦＦ画像を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）定量のために使用し、ビヒクル（ｎ＝６）およびＤ－ＤＰＴＩＰ（ｎ＝４）処置マウスを比較した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、歯状回の同側の錐体細胞層を各画像においてトレースし、ｐＴｈｒ１８１ ｈＴａｕシグナルのＭＦＩを決定した。対側のｈＴａｕシグナルのＭＦＩを、軸索および細胞体タウシグナルを説明するために画像全体に対して決定した。ＡＡＶ注射体積、取り込み、および発現レベルの変動を説明するために、本発明者らは、対側と同側のＭＦＩの間の比をとった。混合効果二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計学ソフトウェアを使用して統計学的有意性を決定した。３例のビヒクル処置動物および４例のＤ－ＤＰＴＩＰ処置動物は、不適切な注射位置に起因して研究から除外した。

結果
処置開始から６週間後、空のデンドリマービヒクル処置マウスは、対側ＤＧの門領域（hilusregion）においてニューロンＴｈｒ１８１リン酸化タウシグナルを有したが、Ｄ－ＤＰＴＩＰ処置動物は、同じ領域においてより低いタウシグナルを有した。ＤＧの門領域における対側／同側ＭＦＩの定量は、Ｄ－ＤＰＴＩＰ処置動物では２．４分の１への低減を示した（図１２；ビヒクル＝０．１１４４、ｎ＝５７個の画像／６匹のマウス；Ｄ－ＤＰＴＩＰ＝０．０４７５、ｎ＝４０個の画像／４匹のマウス；ｐ＝０．０３４４）。

特にそれ以外であることを定義していない限り、本明細書で使用した全ての科学技術用語は、開示される本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において引用した刊行物およびそれらが引用される材料は参照により具体的に組み込まれる。

当業者は、単なる通常の実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識する、または確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されると意図される。

Claims (42)

1. 神経疾患、がん、感染疾患、またはそれに関連する炎症の処置のための、エクソソーム分泌を減少させる、Ａβプラーク形成を低減する、タウ伝播を低減する、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行う１つまたは複数の治療剤または予防剤と複合体を形成している、前記治療剤または前記予防剤に共有結合によりコンジュゲートされている、または前記治療剤または前記予防剤が分子内に分散している、または前記治療剤または前記予防剤が封入されているデンドリマーを含む組成物。
2. 前記作用物質が、中性スフィンゴミエリナーゼ２の活性および／または量を阻害または低減する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記作用物質が、中性スフィンゴミエリナーゼ２の低分子阻害剤である、請求項１または２に記載の組成物。
4. 中性スフィンゴミエリナーゼ２の１つまたは複数の前記低分子阻害剤が、２，６－ジメトキシ－４－（５－フェニル－４－（チオフェン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェノール（ＤＰＴＩＰ）、フェニル（Ｒ）－（１－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）－２，６－ジメチルイミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－８－イル）ピロリジン－３－イル）－カルバメート（ＰＤＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ビス［４－（４，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）フェニル］－３，３’－ｐ－フェニレン－ビス－アクリルアミド二塩酸塩（ＧＷ４８６９）、カンビノール、４－（４，５－ジイソプロピル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２，６－ジメトキシフェノール、ならびにその誘導体およびアナログからなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
5. 前記中性スフィンゴミエリナーゼ２の阻害剤が、ＤＰＴＩＰ、またはその誘導体もしくはアナログである、請求項３または４に記載の組成物。
6. 前記デンドリマーが、世代４、世代５、世代６、世代７、または世代８のデンドリマーである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記デンドリマーが、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記デンドリマーが、ヒドロキシルで終端したＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記デンドリマーが、前記１つまたは複数の治療剤または予防剤に共有結合によりコンジュゲートされている、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
11. 非経口または経口投与のために製剤化されている、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. ヒドロゲル、ナノ粒子、またはマイクロ粒子、懸濁剤、散剤、錠剤、カプセル剤、および液剤からなる群より選択される形態の、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
13. 対象において脳および／もしくは血清中エクソソームの量、脳および／もしくは血清中セラミドレベル、血清中抗セラミドＩｇＧ、グリア活性化、総Ａβ４２およびプラーク負荷、タウのリン酸化を低減させる、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行うための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれかに記載の組成物を前記対象に全身投与することを含む、方法。
14. 前記方法が、対象においてアルツハイマー病または認知症を処置するためのものであり、アルツハイマー病または認知症に関連する１つまたは複数の症状を処置する、緩和する、および／または防止するために、有効量の請求項１～１２のいずれかに記載の組成物を前記対象に全身投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記組成物が、脳におけるエクソソーム分泌を減少させる、脳におけるＡβプラーク形成および／もしくはタウ伝播を低減する、認知を向上させる、またはそれらの組合せを行うために有効な量で投与される、請求項１３～１４に記載の方法。
16. 前記組成物が、活性化ミクログリアにおける中性スフィンゴミエリナーゼ２の活性および／または量を阻害または低減するために有効な量で投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
17. 前記組成物が、前記対象の脳脊髄液および／または血清中のセラミドの濃度を低減するために有効な量で投与される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記組成物が、前記対象の脳におけるエクソソームの量を低減するために有効な量で存在する、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記対象が、健康対照対象と比較して脳脊髄液および／または血清中の増加したセラミドレベルを有する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記方法が、対象の脳の活性化ミクログリアにおける中性スフィンゴミエリナーゼ２の活性を阻害するためのものであり、有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に全身投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
21. 前記方法が、対象における新規ニューロンの生成を増加させる、またはニューロン喪失速度を低減もしくは防止するためのものであり、有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に全身投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
22. 前記方法が、対象の海馬体積を増加させる、または海馬体積の減少速度を低減もしくは防止するためのものであり、有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に全身投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
23. 前記対象が、健康対照対象と比較して脳脊髄液および／または血清中の増加したセラミドレベルを有する、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記対象が、アルツハイマー病または認知症を有する、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記組成物が、経口または非経口投与される、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記組成物が、静脈内投与される、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の方法。
27. がん、感染疾患、または炎症の１つまたは複数の症状の処置を必要とする対象においてがん、感染疾患、または炎症の１つまたは複数の症状を処置する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
28. 前記がんが、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮がん、膵臓がん、皮膚がん、多発性骨髄腫、前立腺がん、精巣胚細胞腫瘍、脳がん、口腔がん、食道がん、肺がん、肝臓がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、十二指腸がん、胃がん、および結腸がんである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記有効量が、腫瘍サイズを低減するまたは腫瘍成長を阻害するために有効である、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
30. ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－１リガンドアンタゴニスト、およびＣＴＬＡ４アンタゴニストからなる群より選択される１つまたは複数の免疫チェックポイント調節剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 養子Ｔ細胞療法および／またはがんワクチンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 手術または放射線療法を前記対象に実施することをさらに含む、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記組成物が、経口または非経口投与される、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記方法が、それを必要とする対象における１つまたは複数の炎症疾患または障害を処置または緩和するためのものであり、前記１つまたは複数の炎症疾患または障害に関連する１つまたは複数の症状を処置または緩和するために、有効量の請求項１～１２のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
35. 前記１つまたは複数の炎症疾患または障害が、気道炎症、アレルギー性気道炎症、アテローム性動脈硬化症、脳虚血、肝虚血再灌流傷害、心筋梗塞、および敗血症からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記組成物が、前記１つまたは複数の炎症疾患または障害に関連する１つまたは複数の炎症促進性細胞を抑制または阻害するために有効な量で投与される、請求項３４または３５に記載の方法。
37. 前記炎症促進性細胞が、活性化マクロファージまたはミクログリアである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記方法が、それを必要とする対象における１つまたは複数の細菌、寄生生物、真菌、またはウイルス感染症を処置または緩和するためのものであり、前記１つまたは複数の細菌またはウイルス感染症に関連する１つまたは複数の症状を処置または緩和するために、有効量の請求項１～１２のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
39. 前記１つまたは複数の細菌またはウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ジカウイルス、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、狂犬病、ランガットウイルス（ＬＧＴＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のイプシロン毒素、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の志賀毒素からなる群より選択される１つまたは複数の原因因子によって引き起こされる、請求項３８に記載の方法。
40. 前記１つまたは複数の原因因子が、活性化ミクログリアおよびアストロサイトを標的とするまたはそれらに感染する、請求項３９に記載の方法。
41. 前記組成物が、ウイルス複製、ウイルス負荷、および／もしくはウイルス放出、またはそれらの組合せを低減または阻害するために有効な量で投与される、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記組成物が、経口または非経口投与される、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。

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