JP2023521632A - 高レベルのオメガ－３脂肪酸を有する微生物性油 - Google Patents

高レベルのオメガ－３脂肪酸を有する微生物性油 Download PDF

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Abstract

微生物性油ならびに、高レベルのオメガ－３脂肪酸を有する微生物性油を作る及び使用する方法を本明細書に提供する。具体的には、少なくとも８５％の総脂肪酸を含む微生物性油が提供され、総脂肪酸は、少なくとも５０％のＤＨＡを含む。また、バイオマスを作る方法も提供され、当該方法は、脂肪酸合成阻害剤を含む培養培地の中で油産生微生物を培養することを含み、バイオマスは、少なくとも５００ｍｇ／ｇの油を含む。【選択図】図７

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月３日に出願された米国仮出願第６３／００５，０５４号に基づく優先権を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に援用する。
微生物からの油は、２つの並行する脂肪酸合成経路の結果として産生される：古典的な脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路、及び多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）合成酵素経路。ミリスチン酸（Ｃ１４：０）及びパルミチン酸（Ｃ１６：０）のような中鎖脂肪酸は概してＦＡＳ経路から産生され、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ ｎ－３）及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、Ｃ２２：５ ｎ－６）のような長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）は概してＰＵＦＡ合成酵素経路から産生される。しかしながら、結果として得られる脂肪酸プロファイルは、これらの並行する経路の相対活性に応じて微生物にわたって実に様々である。
本明細書に提供されるのは、微生物性油ならびに、高レベルのオメガ－３脂肪酸を有する微生物性油を作る及び使用する方法である。具体的には、少なくとも８５重量％の総脂肪酸を含む微生物性油であって、総脂肪酸が、少なくとも５０重量％のＤＨＡを含む、当該微生物性油が提供される。さらに提供されるのは、バイオマスを作る方法であって、脂肪酸合成阻害剤を含む培養培地の中で油産生微生物（例えばＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属）を培養することを含み、バイオマスが、少なくとも５００ｍｇ／ｇの油を含む、当該方法である。
２０℃で異なる初回脂肪酸合成阻害剤投与時間点を採用したＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）の脂肪酸プロファイルを示すグラフである。 ２０℃での脂肪酸合成阻害剤の様々な濃度におけるＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）の脂肪酸プロファイルを示すグラフである。 ２０℃での様々な脂肪酸合成阻害剤投与方策におけるＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）の脂肪酸プロファイルを示すグラフである。３ｘ及び６ｘと示されている処理は、接種から２４時間後に開始される等しい時間間隔での複数回の脂肪酸合成阻害剤の添加である。３Ｘの実験では、間隔は２４時間ごとであった。６Ｘの実験では、間隔は１２時間ごとであった。 ２０℃での様々な脂肪酸合成阻害剤投与方策でのＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）における最終生成物（ＤＨＡ、総脂肪酸（ＴＦＡ）及び飽和脂肪酸（ＳＦＡ））濃度を示すグラフである。３ｘ及び６ｘと示されている処理は、接種から２４時間後に開始される等しい時間間隔（１２時間ごと）での複数回の脂肪酸合成阻害剤の添加である。 ２０℃での様々な脂肪酸合成阻害剤投与方策でＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）において消費されたグルコースの単位あたりで生成物（ＳＦＡ及びＤＨＡ）の収率を示すグラフである。３ｘ及び６ｘと示されている処理は、接種から２４時間後に開始される等しい時間間隔（１２時間ごと）での複数回の脂肪酸合成阻害剤の添加である。 フラスコ規模での２５℃及び２０℃培養条件からのＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）の脂肪酸プロファイルを示すグラフである。 Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）の脂肪酸プロファイルを示すグラフである。対照は、化学阻害剤を含まない２５℃のフラスコで培養された。全長にわたる発酵行程は、記された温度での３０Ｌ容の発酵槽における流加発酵であり、脂肪酸合成阻害剤処理は、フラスコ規模で合計１２μＭのセルレニンを間欠添加する２０℃での培養であった。
オメガ－３脂肪酸は、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）ファミリーからのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ ｎ－３）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ２０：５ ｎ－３）を含み、ヒト及び非ヒト哺乳動物にとっての必須脂肪酸である。微生物性油に求められるオメガ－３脂肪酸の量は、用途に応じて様々である。例えば、栄養補助食品及び医薬品においては油の単位あたりでより高い濃度のオメガ－３脂肪酸が好まれるのが典型的である。そのような濃度を実現するためにはオメガ－３脂肪酸をエステル交換及び分子蒸留によって濃縮するのが典型的である（Ｂｏｎｉｌｌａ－Ｍｅｎｄｅｚ ａｎｄ Ｈｏｙｏｓ－Ｃｏｎｃｈａ，Ｃｏｒｐｏｉｃａ Ｃｉｅｎｃ Ｔｅｃｎｏｌ Ａｇｒｏｐｅｃｕａｒｉａ，Ｍｏｓｑｕｅｒａ（Ｃｏｌｏｍｂｉａ），１９（３）：６４５－６６８（２０１８））。しかしながら、最終濃縮生成物は、微生物によって脂質が合成された時の天然の化学構造であるトリグリセリド（ＴＧ）形態とはならずにエチルエステル（ＥＥ）化学形態となるのが典型的である。ＥＥ形態は、その嗅覚的特徴を悪化させかねない付加的処理を必要とするのみならず、オメガ－３のＥＥ形態の人体に対する生物学的利用能が元のＴＧ形態に比べてより低いことが示されてもいる。
オメガ－３含有量を増加させるための一般的な方策としては、高オメガ－３微生物株を選択すること、古典的な変異誘発、及び遺伝子組換えが挙げられる（Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６２：９３５－９４１（２０１０））。あるいは、様々な機序の下にある脂肪酸合成代謝に影響を及ぼす可能性を有する化学物質が種々の微生物において試験されてきた。しかしながら、そのような原理を応用してＤＨＡ含有量における商業的に意味のある増加をもたらすと同時にＤＰＡ及び飽和脂肪酸を含めた他の脂肪酸成分における望ましくないいかなる変化も回避するかまたは最小限に抑える効率的かつ効果的な方法は、存在しない。
本明細書に記載されるのは、ＤＨＡが脂肪酸プロファイルのおよそ５０～７０％を占める、高レベルのオメガ－３脂肪酸を含有する油である。さらに記載されるのは、脂肪酸合成阻害剤を使用して、ＰＵＦＡ合成酵素経路からの価値の高いＰＵＦＡ生成物に有利となるようにＦＡＳ経路のあまり望ましくない生成物を抑制する方法である。提供される油は、微生物の生産性を犠牲にすることなく高濃度のＤＨＡを含有する。さらに記載されるのは、本明細書に記載される脂肪酸合成酵素の多酵素複合体を阻害する阻害剤を使用する方法である。実施例にＧ３の脂肪酸プロファイルを例示するが、これは、ＤＨＡ含有量のかなりの増加（対照と比較した場合に最大で８３．３％超）を示しており、脂肪酸合成阻害剤の間欠添加の場合にはよりいっそうの増加を示している。油中のＴＧ形態のＤＨＡがほぼ７０％であるという結果は、報告されたＤＨＡ濃度を超過している。
微生物は、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ類を含めて、様々な形態及び量の脂肪酸を含む多様な脂質を含有する油を産生する。本明細書で使用される場合、脂質という用語は、リン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸のエステル、トリアシルグリセロール、ステロール及びステロールエステル、カロテノイド、キサントフィル（例えばオキシカロテノイド）、炭化水素、ならびに当業者に知られている他の脂質を含む。脂肪酸は、カルボキシル基で終結する炭化水素鎖であり、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含有する場合にはる不飽和と呼称され、複数の炭素－炭素二重結合を含有する場合には多価不飽和と呼称される。例えば、微生物は、（ｉ）炭素数６未満の脂肪族尾部を有する脂肪酸である短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）（例えば酪酸）；（ｉｉ）炭素数６～１２の脂肪族尾部を有する脂肪酸である中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）；（ｉｉｉ）炭素数１３超の脂肪族尾部を有する脂肪酸である長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）を産生し得る。様々な微生物が様々な種類及び量のこれらの脂肪酸を産生する。本明細書に提供されるのは、これらの脂肪酸の産生を、ＦＡＳ経路によって産生される中鎖脂肪酸から、ＰＵＦＡ合成酵素経路によって産生される長鎖脂肪酸へとシフトさせる微生物及び方法である。脂肪酸合成（ＦＡＳ）は、脂肪酸合成酵素と呼ばれる酵素の作用によってアセチルＣｏＡ及びＮＡＤＰＨから脂肪酸を生み出すこととして定義される。ＰＵＦＡ合成酵素経路は、大型の多ドメイン多サブユニット酵素によってマロニルＣｏＡから新しく多価不飽和脂肪酸を合成することを可能にする。ＦＡＳ経路の主な最終生成物はパルミテートである一方、ＰＵＦＡ合成酵素の主な最終生成物はＰＵＦＡ、例えばＤＨＡ及びＤＰＡである。
かくして、本明細書に提供されるのは、微生物性油ならびに、微生物性油を作る及び使用する方法である。油は、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの形態の脂肪酸、ならびに遊離脂肪酸及びリン脂質を含む。任意選択的に、微生物性油は、少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）のトリグリセリドを含む。任意選択的に、微生物性油は少なくとも９５％のトリグリセリドを含む。
油はまた、重量表示で少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）の総脂肪酸（ＴＦＡ）も含有する。任意選択的に、油は８５重量％～９９重量％の間の総脂肪酸を含有する。任意選択的に、微生物性油は８５重量％～９５重量％の総脂肪酸を含む。任意選択的に、微生物性油は少なくとも９０重量％の総脂肪酸を含む。
油または総脂肪酸に関する百分率は、全体を通して重量パーセント表示で記述されている。例えば、微生物性油が少なくとも９０％の総脂肪酸を含むとき、油は、油に対して少なくとも９０重量％の総脂肪酸を含有する。また、総脂肪酸は特定の脂肪酸を含有し、特定の脂肪酸の百分率は、全体を通して総脂肪酸に対する重量％として表される。例えば、油中の総脂肪酸がＤＨＡを含有するとき、ＤＨＡの量は総脂肪酸に対する重量％として表される。例えば、総脂肪酸は少なくとも５０重量％のＤＨＡを含む。
記載されるとおり、提供される油の総脂肪酸はＤＨＡを含有する。任意選択的に、総脂肪酸は、少なくとも３５％、少なくとも４０％または少なくとも４５％のＤＨＡを含む。任意選択的に、総脂肪酸は、少なくとも５０％のＤＨＡを含む。任意選択的に、総脂肪酸は、少なくとも６０％のＤＨＡを含む。任意選択的に、総脂肪酸は５０％～７０％のＤＨＡを含む。任意選択的に、総脂肪酸は６０％～７０％のＤＨＡを含む。
任意選択的に、油は６％～１８％の間のＤＰＡも含有する。任意選択的に、油は１０％～１８％の間のＤＰＡを含有する。任意選択的に、油は６％～１０％の間のＤＰＡを含有する。任意選択的に、総脂肪酸は、少なくとも６０％のＤＨＡ、及び１０重量％～１８重量％の間のＤＰＡを含む。任意選択的に、ＤＨＡ対ＤＰＡの比は、７：１または６：１以下である。任意選択的に、総脂肪酸は、少なくとも５０％のＤＨＡを含み、ＤＨＡ対ＤＰＡの比は７：１以下である。任意選択的に、総脂肪酸は、少なくとも５０％のＤＨＡを含み、ＤＨＡ対ＤＰＡの比は６：１以下である。
任意選択的に、油は１％未満のステアリン酸を含有する。任意選択的に、総脂肪酸は、０．０１％～１％のステアリン酸、または０．００１重量％～１重量％のステアリン酸を含む。
任意選択的に、微生物性油は、少なくとも８５％の総脂肪酸を含み、総脂肪酸は、少なくとも５０％のＤＨＡ、６％～１８％のＤＰＡ、及び１％未満のステアリン酸を含む。任意選択的に、微生物性油は、少なくとも８５％の総脂肪酸を含み、総脂肪酸は、少なくとも６０％のＤＨＡを含む。
任意選択的に、総脂肪酸は、３％、２％または１％未満のエイコサペンタエン酸を含む。任意選択的に、総脂肪酸は０．０１％～１％のエイコサペンタエン酸、または０．００１％～１％のエイコサペンタエン酸を含む。任意選択的に、総脂肪酸は０．０１％～２％のエイコサペンタエン酸、または０．００１％～２％のエイコサペンタエン酸を含む。任意選択的に、総脂肪酸は、０．０１％～３％のエイコサペンタエン酸、または０．００１％～３％のエイコサペンタエン酸を含む。
任意選択的に、総脂肪酸は、５％未満、４％未満または３％未満のペンタデカン酸を含む。任意選択的に、任意選択的に、０．０１％～３％、０．０１％～４％、または０．０１％～５％のペンタデカン酸を含む。
任意選択的に、総脂肪酸は、４５％、４０％、３５％、３０％または２５％未満の飽和脂肪酸（ＳＦＡ）を含む。本明細書に記載の方法によって生産された油の中の飽和脂肪酸は、限定はされないが、Ｃ１２：０（ラウリン酸）、Ｃ１４：０（ミリスチン酸）、Ｃ１５：０（ペンタデカン酸）、Ｃ１６：０（パルミチン酸）、Ｃ１７：０（ヘプタデカン酸）、及びＣ１８：０（ステアリン酸）を含む。任意選択的に、総脂肪酸は、１０％～４５％の間の飽和脂肪酸（例えば、１０％～４０％、１０％～３０％、１０％～２０％、１５％～３０％、１５％～２０％、２０％～３０％、または２０％～２５％の飽和脂肪酸）を含む。
任意選択的に、総脂肪酸は、０．００１％～２．０％（例えば、０．０１％～２．０％、または０．０５％～２．０％）のアラキドン酸（Ｃ２０：４（ｎ－６））を含む。任意選択的に、総脂肪酸は０．００１％～１％（例えば、０．０１％～１％）のエイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４（ｎ－３））を含む。
任意選択的に、総脂肪酸は５重量％未満のミリスチン酸を含む。任意選択的に、総脂肪酸は、重量表示で０．００１％～５％（例えば、０．０１％～５％、０．１％～５％、０．０１％～４％、０．１％～４％、または１％～４％）のミリスチン酸を含む。
任意選択的に、総脂肪酸は４０重量％未満のパルミチン酸を含む。任意選択的に、総脂肪酸は、重量表示で５％～４０％、５％～３０％、１０％～４０％、１０％～３０％、２０％～４０％、２０％～３０％、２０％～４０％、２０％～２５％、または２５％～４０％の間のパルミチン酸を含む。
任意選択的に、総脂肪酸は、重量表示で０．１％～０．５％、または０．００１％～０．５％のヘプタデカン酸を含む。
任意選択的に、バイオマス中の、またはそこから単離された脂肪酸は、３重量％未満のエイコサペンタエン酸、５重量％未満のペンタデカン酸、及び４５％未満の飽和脂肪酸を含む。
任意選択的に、バイオマス中の、またはそこから単離された脂肪酸は、０．００１％～２．０％、０．０１％～２．０％、または０．０５％～２．０％のアラキドン酸、５重量％未満のミリスチン酸、及び４０重量％未満のパルミチン酸を含む。
さらに提供されるのは、油を含む微生物性バイオマスである。微生物性バイオマスは、バイオマス全体に対して４０重量％～７５重量％の総脂肪酸を含む。任意選択的に、バイオマス中の油はＤＨＡを含み、バイオマスは、バイオマスに対して２０重量％～５５重量％の間のＤＨＡを含む。任意選択的に、バイオマス中の油は、バイオマスに対して２．５重量％～８重量％のＤＰＡを含む。任意選択的に、油は、バイオマスに対して４重量％～８重量％の間のＤＰＡを含有する。任意選択的に、油は、バイオマスに対して２．５重量％～４重量％のＤＰＡを含有する。
提供される微生物性油及びバイオマスを生産するのに有用となる真核微生物としては、Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属及びＵｌｋｅｎｉａ属から選択される微生物、またはその任意の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意選択的に、油産生真核微生物は、配列番号１に示される核酸配列との少なくとも９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する１８Ｓ配列を有する微生物である。任意選択的に、油産生微生物は、株Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍの微生物である。任意選択的に、真核微生物は、２０１６年７月２２日にカナダ公衆衛生庁国立微生物研究所のカナダ国際寄託局（ＩＤＡＣ）、１０１５ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ Ｃａｎａｄａ Ｒ３Ｅ ３Ｒ２に寄託されてＩＤＡＣ指定の受託番号２２０７１６－０１を有する微生物と同じである。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に管理されることになる。この寄託物は、例示的なものであり、単に当業者のための便宜として作られたにすぎず、寄託物が特許性のために必要とされることを容認するものではない。本明細書において、「Ｇ３」、「Ｇ３－１」または「Ｇ３－１株」または「株Ｇ３－１」という用語は、ＩＤＡＣ受託番号２２０７１６－０１を有する真核微生物を指して互換的に使用される。
核酸は、本明細書で使用される場合、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ならびにそのポリマー及び相補体を指す。当該用語は、一本鎖または二本鎖のどちらかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む。当該用語は、合成のもの、天然に存在するもの、及び天然に存在しないものであり、基準核酸に類似する結合特性を有し、基準ヌクレオチドに類似する方法で代謝される、既知のヌクレオチド類縁体または修飾主鎖残基またはリンケージを含有する核酸を包含する。そのような類縁体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、ホスホン酸メチル、キラルホスホン酸メチル、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。特に示されていない限り、本明細書に列挙される特定の核酸配列の代わりに、核酸配列の保存的に改変された多様体（例えば縮重コドン置換体）及び相補配列を使用してよい。具体的には、縮重コドン置換体は、選択された１つ以上の（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって得られ得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、同一である、または同一性パーセントという用語は、以下に記載される既定のパラメータを使用するＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手作業でのアライメント及び目視検査によって測定した場合に、同じであるかまたは特定の百分率のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが同じである（つまり、比較窓または指定の領域にわたって一致が最大になるように比較及びアライメントを行ったときに特定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはより高い同一性を有する）２つ以上の配列または部分配列を指す（例えばＮＣＢＩウェブサイトなどを参照されたい）。そうして、そのような配列は、実質的に同一であると言われる。この定義は、試験配列の相補体にも当てはまる、または適用され得る。当該定義はまた、欠失及び／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含む。本明細書に記載される場合、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮し得るものである。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５個のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さが５０～１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
配列比較では、典型的には１つの配列が、試験配列と比較される基準配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び基準配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、既定のプログラムパラメータが使用され得るか、または代替パラメータが適切に指定され得る。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて基準配列と比較したときの試験配列について配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される場合、比較窓は、配列と連続位置を同じ数だけ有する基準配列とが２つの配列の最適なアライメントの後に比較され得る、連続位置を２０～６００、多くの場合において約５０～約２００、より多くの場合において約１００～約１５０からなる群から選択されるいずれか１つの数だけ有するセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアライメントの方法は当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または手作業によるアライメント及び目視検査によって行われ得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを参照されたい）。
配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであるが、これらについてはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載がある。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書に記載のパラメータを使用して、核酸またはタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野で知られているように国立生物工学情報センターで公的に利用可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列中の選択された長さ（Ｗ）の短いワードを特定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず特定することを含んでいるが、当該短いワードは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントされたときにいくらかの正の値を有する閾値スコアＴに一致するかそれを満たすかのどちらかとなるものである。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．）。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含んだより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加する限り目一杯、各配列に沿って両方向に伸張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（一致残基の対に対する報酬スコア、常に０を上回る）及びＮ（不一致残基に対するペナルティスコア、常に０未満）を使用して計算される。アミノ酸配列に関しては、スコア行列を使用して累積スコアが計算される。ワードヒットの各方向への伸張は、累積アライメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ減少した時、負のスコアを有する１つ以上の残基アライメントが蓄積したために累積スコアがゼロ以下になった時、またはどちらかの配列の末端に到達した時に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定付ける。期待値（Ｅ）は、データベース検索において偶然起こることが予期されるスコアに等しいかまたはそれよりも良いスコアを有する異なるアライメントの数を表す。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、既定値として１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、既定値として３のワード長さ、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）参照）、５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。
本明細書に提供されるのは、油産生微生物を使用してバイオマスを作る方法である。具体的には、提供されるのは、バイオマスを作る方法であって、脂肪酸合成阻害剤を含む培養培地の中で油産生Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属微生物を培養することを含み、バイオマスが、少なくとも３５０、４００、４５０または５００ｍｇ／ｇの油を含む、当該方法である。バイオマスは、本明細書に記載される特徴を有する油を作るために使用され得る。方法は、バイオマスから油を単離することをさらに含む。
培養工程は、１５℃～２８℃（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８℃）の温度で行われ得る。任意選択的に、培養培地の温度は１８℃～２２℃、２２℃～２８℃、２２℃～２５℃、または２５℃～２８℃である。
脂肪酸合成阻害剤は、培養培地への微生物の添加の前に、後に、またはそれに並行して添加され得る。任意選択的に、脂肪酸合成阻害剤は、連続的に、あるいは断続的に培養培地に流加される。任意選択的に、方法は、微生物を培養培地に添加すること、及びその後、培養培地への微生物の添加から少なくとも６、１２、２４または４８時間後に脂肪酸合成阻害剤を培養培地に添加することをさらに含む。任意選択的に、方法は、微生物を培養培地に添加すること、及びその後、培養培地への微生物の添加後２４～４８時間の間に脂肪酸合成阻害剤を培養培地に添加することをさらに含む。任意選択的に、方法は、微生物を培養培地に添加すること、及びその後、培養培地への微生物の添加から６～２４時間後に脂肪酸合成阻害剤を培養培地に添加することをさらに含む。任意選択的に、方法は、微生物を培養培地に添加すること、及びその後、培養培地への微生物の添加から１２～２４時間後に脂肪酸合成阻害剤を培養培地に添加することをさらに含む。
脂肪酸合成阻害剤は培養培地に１回以上の投与量で添加され得る。任意選択的に、方法は、微生物を培養培地に添加することをさらに含み、培養することは、脂肪酸合成阻害剤を、例えば培養培地への微生物の添加から６、１２、２４または４８時間後に開始される、１、２、３、４、５または６回の投与量で添加することを含む。任意選択的に、１回以上の投与量は、６、１２または２４時間ごとに添加される。例を示すと、培養培地に３回の投与量の脂肪酸阻害剤の添加が、培養培地への微生物の添加から２４時間後に開始して１２時間ごとに行われ得る。
培養培地に添加される脂肪酸合成阻害剤の総量は、３μＭ～４０μＭの間を含む。任意選択的に、脂肪酸合成阻害剤は、阻害剤の合計を３μＭ～４０μＭの間とする１回または複数回の投与量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回の投与量）で施される。例えば、脂肪酸合成阻害剤は、合計を１２μＭとする６回にわたる２μＭの投与量で施され得る。他の例を示すと、脂肪酸合成阻害剤は、１、２、３または８μＭの投与量で３回添加され得る。任意選択的に、脂肪酸合成阻害剤は、０．５、１、２、３及び４μＭの投与量で６回添加され得る。任意選択的に、培養する間に培養培地に添加される脂肪酸合成阻害剤の総濃度は、バイオマス１グラムあたり３０μｇ～７００μｇの間の阻害剤を含む。任意選択的に、脂肪酸合成阻害剤は、バイオマス１グラムあたりでの合計を３０μｇ～７００μｇの間とする１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回の投与量で施される。例を示すと、脂肪酸合成阻害剤は、合計を２４０μｇとして、バイオマス１グラムあたり４０μｇの投与量で６回にわたって添加され得る。他の例を示すと、脂肪酸合成阻害剤は、バイオマス１グラムあたりおよそ１２、２４、４２及び１２０μｇの投与量で３回添加され得る。任意選択的に、脂肪酸合成阻害剤は、バイオマス１グラムあたり５．５、１１、２５、４０及び６２μｇの投与量で６回添加され得る。
好適な脂肪酸合成阻害剤としては、脂肪酸合成酵素阻害剤が挙げられるが、これに限定されない。任意選択的に、脂肪酸合成酵素阻害剤は、ケルセチン、α－マンゴスチン、チオラクトマイシン、トリクロサン、イソニアジド、デシノイル－Ｎ－アセチルシステアミン（ＮＡＣ）、及びセルレニンからなる群から選択される。
上記のとおり、提供される方法に有用となる真核微生物としては、Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属及びＵｌｋｅｎｉａ属から選択される微生物、またはその任意の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意選択的に、油産生真核微生物は、配列番号１に示される配列との少なくとも９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する１８Ｓ配列を有する微生物である。任意選択的に、真核微生物はＩＤＡＣ受託番号２２０７１６－０１を有する。
本明細書に記載される場合、バイオマスは、脂肪酸、例えば、上に記載されるように少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のトリグリセリドを含む脂肪酸を含む。バイオマス中の油も、上に記載されるように少なくとも８５重量％の総脂肪酸を含有する。
任意選択的に、バイオマスから単離された脂肪酸は、上に記載されるように少なくとも５０重量％のＤＨＡを含む。
バイオマス中の脂肪酸は、任意選択的に、上に記載されるように６重量％～１８重量％の間のＤＰＡを含む。任意選択的に、脂肪酸、バイオマス中の、またはそこから単離された油において、ＤＨＡ対ＤＰＡの比は、上に記載されるように、７：１または６：１以下である。
バイオマス中の、またはそこから単離された油は、任意選択的に、上に記載されるように１重量％未満のステアリン酸を含有する。
任意選択的に、バイオマス中の、またはそこから単離された脂肪酸は、上に記載されるように、３重量％未満のエイコサペンタエン酸、５重量％未満のペンタデカン酸、及び４５％未満の飽和脂肪酸を含有する。
任意選択的に、バイオマス中の、またはそこから単離された脂肪酸は、０．００１％～２．０％、または０．０１％～２．０％、または０．０５％～２．０％のアラキドン酸、５重量％未満のミリスチン酸、及び４０重量％未満のパルミチン酸を含む。任意選択的に、脂肪酸は、重量表示で０．１％～０．５％、または０．００１％～０．５％のヘプタデカン酸を含む。
記載される方法に使用される培養培地は、炭素源及び窒素源を含めた様々な栄養成分を微生物に供給する。培養のための培地は、様々な炭素源のいずれかを含み得る。炭素源の例としては、脂肪酸、脂質、グリセロール、トリグリセロール、炭水化物、ポリオール、アミノ糖、及び任意の種類のバイオマスまたは廃棄流が挙げられる。脂肪酸としては、例えばオレイン酸が挙げられる。炭水化物としては、グルコース、セルロース、ヘミセルロース、フルクトース、デキストロース、キシロース、ラクツロース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトース、ラクトース、グリコーゲン、ゼラチン、（トウモロコシまたはコムギ）澱粉、アセテート、ｍ－イノシトール（例えばコーンスティープリカー由来のもの）、ガラクツロン酸（例えばペクチン由来のもの）、Ｌ－フコース（例えばガラクトース由来のもの）、ゲンチオビオース、グルコサミン、アルファ－Ｄ－グルコース－１－ホスフェート（例えばグルコース由来のもの）、セロビオース、デキストリン、アルファ－シクロデキストリン（例えば澱粉由来のもの）、及びスクロース（例えば糖蜜からのもの）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリオールとしては、マルチトール、エリスリトール及びアドニトールが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ糖としては、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、及びＮ－アセチル－ベータ－Ｄ－マンノースアミンが挙げられるが、これらに限定されない。炭素源は、２００ｇ／Ｌ以下、１７５ｇ／Ｌ以下、１５０ｇ／Ｌ以下、１００ｇ／Ｌ以下、６０ｇ／Ｌ以下の濃度、例えば、１～２００ｇ／Ｌ、５～２００ｇ／Ｌ、１０～２００ｇ／Ｌ、５０～２００ｇ／Ｌ、または１００～２００ｇ／Ｌの濃度で従属栄養培地中に存在し得る。
微生物は、約０．５ｇ／Ｌ～約５０．０ｇ／Ｌの塩化物濃度（例えば、約０．５ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約１８ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、または約２ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌの塩化物濃度）を有する培地において培養され得る。本明細書に記載の微生物は、低塩化物条件、例えば、約０．５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、または約０．５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌにおいて成長し得る。
培養培地は任意選択的にＮａＣｌを含む。培養培地は、ナトリウムの供給源として、非塩化物含有ナトリウム塩を含み得る。本発明の方法に従って使用するのに適する非塩化物ナトリウム塩の例としては、ソーダ灰（炭酸ナトリウムと酸化ナトリウムとの混合物）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及びその混合物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，３４０，７４２号及び第６，６０７，９００号を参照されたく、参照によりそれらの各々の内容全体を本明細書に援用する。任意選択的に、培地は、２０ｇ／Ｌの炭素、２０ｇ／Ｌの大豆ペプトン、及び５ｇ／Ｌの酵母抽出物を使用するとき、９ｇ／Ｌの塩化物を含む。培地が１０ｇ／Ｌの炭素、５ｇ／Ｌの大豆ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母及び１０ｇ／Ｌの寒天を含有するとき、培地は３５ｇ／Ｌの塩化物を含み得る。培地が２０～４０ｇ／Ｌの炭素、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、１～２０ｇ／Ｌのグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、０．３～２．０ｇ／Ｌのリン酸塩、４ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、５～１０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１．５ｍＬ／Ｌの微量元素溶液、１ｍＬ／ＬのビタミンＢ溶液、及び０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ２を含有するとき、培地は２ｇ／Ｌの塩化物を含み得る。
微生物培養のための培地は、様々な窒素源のいずれかを含み得る。例示的な窒素源としては、アンモニウム溶液（例えば、Ｈ２Ｏ中にＮＨ４を含むもの）、アンモニウムまたはアミン塩（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、（ＮＨ４）３ＰＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＯＯＣＨ２ＣＨ３（ＮＨ４Ａｃ））、ペプトン、大豆ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、大豆抽出物、カサミノ酸及び醸造粕が挙げられる。好適な培地において窒素源の濃度は、典型的には、端点を含めた約１ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌの間の範囲（例えば、約５～２０ｇ／Ｌ、約１０～１５ｇ／Ｌ、または約２０ｇ／Ｌ）である。任意選択的に、酵母抽出物が培地中の複合窒素の供給源であるときに窒素の濃度は約１０～１５ｇ／Ｌである。任意選択的に、培地中に大豆ペプトンがＬ－グルタミン酸一ナトリウム塩水和物（ＭＳＧ）または硫酸アンモニウムと共に存在するときに窒素の濃度は約１～５ｇ／Ｌである。
培地は任意選択的に、リン酸塩、例えばリン酸カリウムまたはリン酸ナトリウム（例えば一塩基性リン酸カリウム）を含む。
培地中の無機塩及び微量栄養素には、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、オルトバナジン酸ナトリウム、クロム酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン、塩化カルシウム及びＥＤＴＡが含まれ得る。任意選択的に、培地は、少なくとも１．５ｍｌ／Ｌの微量元素溶液を含む。任意選択的に、微量元素溶液は、２ｍｇ／ｍＬの硫酸銅（ＩＩ）五水和物、２ｍｇ／ｍＬの硫酸亜鉛七水和物、１ｍｇ／ｍＬの塩化コバルト（ＩＩ）六水和物、１ｍｇ／ｍＬの塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、１ｍｇ／ｍＬのモリブデン酸ナトリウム二水和物、及び１ｍｇ／ｍＬの硫酸ニッケル（ＩＩ）を含む。
培地は、微量元素溶液及び／または一塩基性リン酸カリウムと共に、硫酸マグネシウムを任意選択的に含み得る。
ビタミン、例えば、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、パントテン酸カルシウム、ｐ－アミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸及びビタミンＢ１２が培養培地中に含まれていてもよい。
培地のｐＨは、酸または塩基を適切に使用して、及び／または窒素源を使用して、端点を含めた３．０～１０．０の間に調整され得る。任意選択的に、培地は滅菌される。
通常、微生物の培養のために使用される培地は液体培地である。しかしながら、微生物の培養のために使用される培地は固体培地であってもよい。固体培地は、本明細書に論述されている炭素源及び窒素源に加えて、構造的支持を提供する及び／または培地を固体形態にする１つ以上の成分（例えば、寒天及び／またはアガロース）を含有し得る。
微生物の培養は、既知の条件、例えば、国際公開第ＷＯ２００７／０６９０７８号及び第ＷＯ２００８／１２９３５８号に記載されている条件を用いて行われ得る。例えば、培養は１～３０日間（例えば、１～２１日間、１～１５日間、１～１２日間、１～９日間、または３～５日間）にわたって行われ得る。培養は４～３０℃の温度で行われ得る。任意選択的に、培養は、曝気振盪培養、振盪培養、静置培養、回分培養、流加培養、連続培養、回転回分培養、波型振盪培養などによって行われる。任意選択的に、培養は、培養培地の溶存酸素含有量を１～２０％の間、１～１０％の間、または１～５％の間として行われる。
本明細書に記載のバイオマスは、最終製品（例えば、食品または飼料栄養補助剤、バイオ燃料など）に組み込まれ得る。かくして、タンパク質に富むバイオマスを使用する方法が提供される。方法は、任意選択的に、タンパク質に富むバイオマスを食料品（例えば、ペットフード、畜産飼料または水産飼料）に組み込むことを含む。
油または脂質は、記載の微生物培養物から単離され得、様々な食品及び飼料栄養補助剤に使用され得る。油が組み込まれ得る好適な食品または飼料栄養補助剤には、乳、水、スポーツドリンク、栄養ドリンク、茶及びジュースなどの飲料、飴、ゼリー及びビスケットなどの菓子、乳製品などの脂肪含有食品及び飲料、粥（またはポリッジ）などの加工食品製品、調製粉乳、朝食用シリアル、または類似するものが含まれる。任意選択的に、１つ以上の生産された脂質が栄養補助食品、例えばビタミンまたはマルチビタミンなどに組み込まれ得る。任意選択的に、本明細書に記載の方法に従って生産された油を、栄養補助食品の中に含ませてもよく、任意選択的に直接、食品または飼料の成分（例えば食品栄養補助剤）に組み込んでもよい。
本明細書に記載の方法によって生産された油または脂質が組み込まれ得る飼料品としては、キャットフード、ドッグフードなどのペットフード、観賞魚、養殖の魚もしくは甲殻類などのための飼料、または農場で飼育された動物（家畜、及び水産養殖の魚または甲殻類を含む）のための飼料が挙げられる。本明細書に記載の方法に従って生産された油または脂質が組み込まれ得る食品または飼料原料は、意図したレシピエントである生物の嗜好に合うことが好ましい。この食品または飼料原料は、食品原料について現在知られている任意の物理特性（例えば、固形状、液状、軟性）を有し得る。
任意選択的に、生産された化合物（例えばＰＵＦＡ）の１つ以上は機能性食品または医薬品に組み込まれ得る。そのような機能性食品または医薬品の形態の例には、様々な種類の錠剤、カプセル剤、飲用薬剤などが含まれる。任意選択的に、機能性食品または医薬品は、局所塗布に適するもの（例えばローション剤の形態）である。剤形には、例えば、カプセル剤、油剤、錠剤または類似するものが含まれ得る。
本明細書に記載の方法に従って生産された油または脂質は、他の様々な薬剤のいずれかと組み合わせて製品に組み込まれ得る。例えば、そのような化合物は、１つ以上の結合剤またはフィラー、キレート剤、色素、塩、界面活性剤、保湿剤、粘度調整剤、増量剤、軟化剤、香料、保存剤など、またはその任意の組合せと組み合わされ得る。
本開示の方法及び組成物のために使用され得る、それと一緒に使用され得る、その調製のために使用され得る、またはその製品である材料、組成物及び成分を、開示する。これら及び他の材料を本明細書に開示しているが、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合、これらの化合物の様々な個別及び集合的な組合せ及び並べ替えの各々についての具体的言及を明示的に開示していないことがあるにもかかわらず各々が本明細書において具体的に企図及び記載されていることは理解される。例えば、方法について開示及び論述されており、方法を含む複数の分子に対してなされ得る複数の改変について論述されている場合、方法のありとあらゆる組合せ及び並べ替え、ならびに可能な改変は、相反する指示が具体的になされているのでない限り具体的に企図されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも具体的に企図及び開示されている。この概念は、限定はされないが本開示の組成物を使用する方法の中の工程を含めた本開示の全ての態様に当てはまる。したがって、実施され得る様々な付加的工程が存在する場合、これらの付加的工程の各々が本開示の方法の任意の特定の方法工程または方法工程の組合せによって実施され得ること、及びそのような組合せまたは組合せのサブセットの各々が具体的に企図されており、開示されているとみなされるべきであることは、理解される。
本明細書において引用される刊行物、及びそれらを引用する目的であった材料は、これをもって参照によりその全体が具体的に援用される。
以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物の特定の態様をさらに例示することを意図したものであり、特許請求の範囲を限定する意図はない。
実施例１．脂肪酸合成阻害剤の投与適時選択方策。
細胞成長を抑制するなどの過度の損失を伴わない、脂肪酸合成酵素阻害剤セルレニンの添加のための理想的な時間を決定するために、設定量のセルレニンを様々な量の接種後時間において添加することによって実験を行った。全ての実験において対照実験を、ＦＡＳ阻害剤の添加を行わずに同じ培地及び成長条件で実施した。結果は、いかなる添加時間においても細胞成長が阻害されなかったが、脂肪酸プロファイルにはそれが著しい影響を及ぼしたことを示した（図１）。表２は、接種から２４時間後にセルレニンを添加することでＤＨＡ及びＤＰＡ含有量（ＴＦＡに対する％）がより高くなり、脂肪酸合成経路生成物Ｃ１４：０及びＣ１６：０がそれぞれ２１．１％及び２７．９％だけ減少したことを示す。
Figure 2023521632000002
Figure 2023521632000003
実施例２．脂肪酸合成阻害剤濃度
セルレニンの最適濃度を決定して最良の結果をもたらすべく、１μＭ～４０μＭの範囲の濃度を試験した。一貫性を保つために、全てのセルレニン添加は接種から２４時間後に行った。図２は、２０℃でのセルレニンの様々な濃度におけるＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）の脂肪酸プロファイルを示す。表５は、セルレニン濃度を上昇させることが、細胞内に蓄積するＣ１６：０及びＤＰＡの量に対して明瞭な影響を及ぼすことを示す。総脂肪酸に対する百分率に関して、特定の脂肪酸におけるそれらの変化は、２５μＭのセルレニンを使用したときにＤＨＡ含有量（ＴＦＡに対する％）が４４．７１％から５０．９２％もの高さまで増加したことに対応している（表４）。
Figure 2023521632000004
Figure 2023521632000005
実施例３．脂肪酸合成阻害剤の投与計画
セルレニンへの長期反復曝露の効果を調べるために、実験中に３～６回にわたって投与量を等しく散開させた。各場合において、合計添加量は、２４時間目に全部を添加した対応する処理と等価であった。全ての添加は接種から２４時間後に開始した。図３及び図４において、セルレニン濃度の増加、及びセルレニンの複数回の等価な間欠投与のどちらによっても、ＤＨＡ及びＤＰＡが増加する明らかな傾向がみられた。さらには、表５は、反復的投与量添加が採用されるときに総脂肪酸に対する悪影響がない一方、ＤＨＡの実際の量（ｍｇ／ｇ表示）がセルレニンの増加に伴って増加していたことを示している。最高実測ＤＨＡは、合計を１２μＭとする６回の等価投与量のセルレニンを使用した場合であり、結果として５１．６％のＤＨＡ増加がもたらされた。また、Ｃ１４：０及びＣ１６：０における最大限の８５．１％及び８３．９％の減少もみられ、これらの条件の下でのセルレニンによるＦＡＳ経路の非常に効果的な阻害が示唆された。
Figure 2023521632000006
Figure 2023521632000007
実施例４．生成物収率に対する脂肪酸合成阻害剤の効果。
ＰＵＦＡ増強方策のための本明細書に記載の方法の影響を評価するために、Ｇ３細胞によって同化された炭素の量に対する相対的な生成物（すなわち、ＴＦＡ、ＤＨＡまたはＤＰＡ）の収率を調べた。図５に、合成された生成物（総脂肪酸（ＴＦＡ）、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）またはＤＨＡとして分類される）の総量を示す。特定の頻度及び濃度で投与された脂肪酸合成阻害剤の存在下において、ＴＦＡ及びＤＨＡの濃度はどちらも上昇した一方、ＳＦＡ濃度は低下した。例えば、セルレニンを毎回１μＭとして１２時間間隔で６回投与した条件の下では、ＴＦＡ及びＤＨＡは対照実験の結果と比較してそれぞれ１５％及び７１％だけ増加した（図５）。結果を脂肪酸収率（グラム生成物／グラム消費炭素）として計算すると、どのセルレニン投与条件下においても、ＤＨＡ収率は総じて著しく増加した一方、ＳＦＡ収率は減少した。例えば、６ｘ１μＭの最適条件の１つにおいては、対照実験の結果と比較してＤＨＡ収率における５３％の増加及びＳＦＡ収率における６４％の減少がみられ、それによって、細胞がＦＡＳ経路に対する阻害を受けていただけでなくＰＵＦＡ合成酵素経路を上方制御して有効炭素をより効率的に利用していたことが示唆された。
実施例５．Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）からのＤＨＡ％に対する温度の効果。
培養温度を（２５℃から２０℃に）低下させることがＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）の脂肪酸プロファイル及び生産性に及ぼす影響を調べるために、フラスコ規模の実験を実施した。図６中のデータは、培養温度が２０℃に低下することによってＤＨＡ及びＤＰＡの割合が増加することを示している。表７及び表８は、Ｃ１４：０及びＣ１６：０におけるそれぞれ２７．５％及び１０．６％の減少と対になったＤＨＡにおける１４．７％の増加を提示している要約データを示す。
Figure 2023521632000008
Figure 2023521632000009
実施例６．Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）からのＤＨＡ％に対する全長にわたる発酵の効果。
３０Ｌ容のステンレス鋼製発酵槽を様々な（２５℃から２０℃までの）温度で使用して、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種Ｇ３の全長にわたる発酵を行った。これらの発酵は、概して１５０～２００時間続けられてバイオマス及びＴＦＡがそれぞれ１３０ｇ／Ｌ及び５５％に達するものであった。図７から見て取れるように、２５℃の典型的な温度での全長にわたる発酵は、フラスコを使用する典型的な対照培養による場合と比較して最終ＤＨＡ含有量を改善することができた一方、より低い温度での全長にわたる発酵は、よりいっそう高いＤＨＡ％に到達することができた。図７に含まれている例において２５℃での発酵は４５％のＤＨＡに到達し、これはフラスコ対照の場合の３７％に比べて約８％高かった。２２℃及び２０℃での発酵はさらなるＤＨＡ％増加をそれぞれ５９．７％及び６０．０％で達成した。しかしながら、セルレニンの複数回の間欠投与を用いるフラスコ実験によるＤＨＡ含有量はなおいっそうの６８．７％の最高ＤＨＡ％に到達した。
実施例７．Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属種（Ｇ３）に対する上昇した温度の効果。
２２℃、２５℃及び２８℃でのバイオマス及び脂肪酸の生産増強のために３０Ｌ容の発酵槽でＧ３株を培養した。５００ｍＬの基礎培地（５０ｇ／Ｌのグルコース、６．２５ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２ｍｇ／Ｌの硫酸銅、２ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛、１ｍｇ／Ｌのモリブデン酸ナトリウム、１ｍｇ／Ｌの塩化コバルト（ＩＩ）、１ｍｇ／Ｌの塩化マンガン、及び１ｍｇ／Ｌの硫酸ニッケル）が入った４本の三角フラスコでＧ３を前培養した。フラスコを２５℃及び２００ｒｐｍの撹拌下で２日間インキュベートした。インキュベーション期間後、３本のフラスコ（１．５Ｌ分）を使用して、３０Ｌ容のバイオリアクターにおいて１７５ｇ／Ｌのグルコース、９．６６ｇ／Ｌの酵母抽出物、２．５７ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．４５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、６．４４ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１．６ｇ／Ｌの一塩基性リン酸カリウム、１．７４ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム、１２．８７ｇ／Ｌのグルタミン酸一ナトリウム、０．１ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、１ｍｇ／Ｌの硫酸銅、１ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛、０．５ｍｇ／Ｌのモリブデン酸ナトリウム、０．５ｍｇ／Ｌの塩化コバルト（ＩＩ）、０．５ｍｇ／Ｌの塩化マンガン、０．５ｍｇ／Ｌの硫酸ニッケル、０．０３ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、０．０３ｍｇ／Ｌのビオチン及び６ｍｇ／Ｌのチアミン塩酸塩を含有する２０Ｌの培地に接種し、２２℃、２５℃及び２８℃の条件の下で３０Ｌ容の発酵槽で培養した。撹拌を３２５ｒｐｍで開始し、３６５ｒｐｍに上昇させ、ｐＨ６．０で大気中の空気によって０．３ｖｖｍで曝気を維持した。ｐＨは塩基（２７％のＮＨ４ＯＨ）の添加によって維持した。容器に流加を行って７５０ｇ／Ｌのグルコース溶液によるおよそ３ｇ／Ｌ／時のグルコース消費速度を維持した。細胞を様々な間隔で採取し、バイオマス、ＴＦＡ及び脂質プロファイルを測定した。２５及び２８℃での最終Ｇ３プロファイルの特徴を表９に示す。脂質プロファイルを表１０、表１１及び表１２に示す。
Figure 2023521632000010
Figure 2023521632000011
Figure 2023521632000012
Figure 2023521632000013
提供される微生物性油及びバイオマスを生産するのに有用となる真核微生物としては、Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属及びＵｌｋｅｎｉａ属から選択される微生物、またはその任意の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意選択的に、油産生真核微生物は、寄託された微生物の１８Ｓ配列に示される核酸配列との少なくとも９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する１８Ｓ配列を有する微生物である。任意選択的に、油産生微生物は、株Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍの微生物である。任意選択的に、真核微生物は、２０１６年７月２２日にカナダ公衆衛生庁国立微生物研究所のカナダ国際寄託局（ＩＤＡＣ）、１０１５ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ Ｃａｎａｄａ Ｒ３Ｅ ３Ｒ２に寄託されてＩＤＡＣ指定の受託番号２２０７１６－０１を有する微生物と同じである。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に管理されることになる。この寄託物は、例示的なものであり、単に当業者のための便宜として作られたにすぎず、寄託物が特許性のために必要とされることを容認するものではない。本明細書において、「Ｇ３」、「Ｇ３－１」または「Ｇ３－１株」または「株Ｇ３－１」という用語は、ＩＤＡＣ受託番号２２０７１６－０１を有する真核微生物を指して互換的に使用される。
上記のとおり、提供される方法に有用となる真核微生物としては、Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属及びＵｌｋｅｎｉａ属から選択される微生物、またはその任意の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意選択的に、油産生真核微生物は、寄託された微生物の１８Ｓ配列に示される配列との少なくとも９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する１８Ｓ配列を有する微生物である。任意選択的に、真核微生物はＩＤＡＣ受託番号２２０７１６－０１を有する。

Claims (45)

  1. 少なくとも８５重量％の総脂肪酸を含む微生物性油であって、前記総脂肪酸が、少なくとも５０重量％のドコサヘキサエン酸、６重量％～１８重量％の間のドコサペンタエン酸ｎ－６、及び１重量％未満のステアリン酸を含む、前記微生物性油。
  2. 少なくとも８５重量％の総脂肪酸を含む微生物性油であって、前記総脂肪酸が、少なくとも６０重量％のドコサヘキサエン酸を含む、前記微生物性油。
  3. 前記総脂肪酸が０．０１重量％～１重量％のステアリン酸を含む、請求項１または請求項２に記載の微生物性油。
  4. 前記総脂肪酸が１０重量％～１８重量％の間のドコサペンタエン酸ｎ－６を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物性油。
  5. 前記微生物性油が８５重量％～９５重量％の総脂肪酸を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の微生物性油。
  6. 前記微生物性油が、少なくとも９０重量％の総脂肪酸を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の微生物性油。
  7. 前記総脂肪酸が１重量％未満のエイコサペンタエン酸を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の微生物性油。
  8. 前記総脂肪酸が３重量％未満のペンタデカン酸を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物性油。
  9. 前記総脂肪酸が４０％未満の飽和脂肪酸を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の微生物性油。
  10. 前記総脂肪酸が１０％～４０％の間の飽和脂肪酸を含む、請求項９に記載の微生物性油。
  11. 前記総脂肪酸が１０％～３０％の間の飽和脂肪酸を含む、請求項９に記載の微生物性油。
  12. 前記総脂肪酸が６０重量％～７０重量％のドコサヘキサエン酸を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の微生物性油。
  13. 前記総脂肪酸が０．０１重量％～２．０重量％のアラキドン酸を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の微生物性油。
  14. 前記総脂肪酸が０．０１重量％～１重量％のエイコサテトラエン酸を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の微生物性油。
  15. 前記微生物性油が、少なくとも９０％のトリグリセリドを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の微生物性油。
  16. 前記微生物性油が、少なくとも９５％のトリグリセリドを含む、請求項１５に記載の微生物性油。
  17. ドコサヘキサエン酸対ドコサペンタエン酸ｎ－６の比が７：１以下である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の微生物性油。
  18. 前記総脂肪酸が４重量％未満のミリスチン酸を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の微生物性油。
  19. 前記総脂肪酸が３０重量％未満のパルミチン酸を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の微生物性油。
  20. 前記総脂肪酸が、少なくとも６０重量％のドコサヘキサエン酸、及び１０重量％～１８重量％の間のドコサペンタエン酸ｎ－６を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の微生物性油。
  21. 前記総脂肪酸が０．１重量％～０．５重量％のヘプタデカン酸を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の微生物性油。
  22. 前記油が、培養培地中でＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属微生物を２２℃～２８℃の温度で培養することによって生産される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の微生物性油。
  23. 前記油が、培養培地中でＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属微生物を２５℃～２８℃の温度で培養することによって生産される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の微生物性油。
  24. バイオマスを作る方法であって、
    脂肪酸合成阻害剤を含む培養培地の中で油産生Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属微生物を培養すること
    を含み、前記バイオマスが、少なくとも５００ｍｇ／ｇの油を含む、前記方法。
  25. 前記培養培地の温度が１８℃～２２℃である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記培養培地の温度が２２℃～２８℃である、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記培養培地の温度が２５℃～２８℃である、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記方法が、
    前記微生物を前記培養培地に添加すること
    をさらに含み、前記脂肪酸合成阻害剤が、前記培養培地への前記微生物の添加後２４～４８時間の間に前記培養培地に添加される、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記方法が、
    前記微生物を前記培養培地に添加すること
    をさらに含み、前記脂肪酸合成阻害剤が、前記培養培地への前記微生物の添加から少なくとも６、１２、２４または４８時間後に前記培養培地に添加される、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記培養することが、
    前記培養培地に１回以上の投与量の前記脂肪酸合成阻害剤を添加すること
    を含む、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記方法が、
    前記微生物を前記培養培地に添加すること
    をさらに含み、前記培養することが、
    前記脂肪酸合成阻害剤を、前記培養培地への前記微生物の添加から１２時間後に開始される２、３、４、５または６回の投与量で添加すること
    を含む、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記投与量が、６、１２または２４時間ごとに添加される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記培養する間に前記培養培地に添加される前記脂肪酸合成阻害剤の総濃度が３～４０μＭの間を含む、請求項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記培養する間に前記培養培地に添加される前記脂肪酸合成阻害剤の総濃度が、バイオマス１グラムあたり３０μｇ～７００μｇの間の阻害剤を含む、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記脂肪酸合成阻害剤が前記培養培地に流加される、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記微生物がＩＤＡＣ受託番号２２０７１６－０１を有する、請求項２４～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記方法が、
    前記バイオマスから前記油を単離すること
    をさらに含む、請求項２４～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記油が脂肪酸を含み、前記脂肪酸が、少なくとも５０重量％のドコサヘキサエン酸、６重量％～１８重量％の間のドコサペンタエン酸ｎ－６、及び１重量％未満のステアリン酸を含む、請求項２４～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記油が脂肪酸を含み、前記脂肪酸が１０重量％～１８重量％の間のドコサペンタエン酸ｎ－６を含む、請求項２４～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記油が脂肪酸を含み、前記脂肪酸が１重量％未満のエイコサペンタエン酸を含む、請求項２４～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記油が脂肪酸を含み、前記脂肪酸が１０％～４０％の間の飽和脂肪酸を含む、請求項２４～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記油が脂肪酸を含み、前記脂肪酸が５０重量％～７０重量％のドコサヘキサエン酸を含む、請求項２４～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記油が脂肪酸を含み、前記脂肪酸が、少なくとも９５重量％のトリグリセリドを含む、請求項２４～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記油が脂肪酸を含み、前記脂肪酸が、少なくとも６０重量％のドコサヘキサエン酸、及び１０重量％～１８重量％の間のドコサペンタエン酸ｎ－６を含む、請求項２４～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記油が脂肪酸を含み、前記脂肪酸が０．１重量％～０．５重量％のヘプタデカン酸を含む、請求項２４～４４のいずれか１項に記載の方法。
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