JP2023521388A - 脂肪肝疾患に対する修飾キスペプチン受容体作用薬 - Google Patents

Abstract

キスペプチン１受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）は、５４アミノ酸のペプチドホルモンであるキスペプチン（メタスチン）を結合するＧ蛋白質共役受容体である。ＴＡＫ－４４８は、強力なキスペプチン１受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ、またはＧＰＲ５４）作用薬である。脳におけるキスペプチンおよびＫＩＳＳ１Ｒは、思春期の発現と視床下部－下垂体－性腺軸の制御におけるそれらの関与のため、哺乳動物の生殖に重要な役割を担う。本明細書は、非アルコール性脂肪肝疾患の発症における末梢キスペプチン／Ｋｉｓｓ１Ｒ経路を暗示する結果を考察し、肝臓において脂肪を減らす方法を提供する。【選択図】図３０

Description

関連する出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月８日付けで出願された米国仮出願番号第６３／００７，０７１号に基づく優先権を主張するものである。その優先出願の開示内容全体が参照として本出願に組み入れられる。

本発明は、医薬の分野、特に、対象の肝臓脂肪を減らす方法に関する。本方法は、対象にＴＡＫ－４４８またはその任意の塩；ＴＡＫ－４４８の保存的変異体またはその任意の塩；キスペプチン１０またはその任意の塩；あるいはキスペプチン１０の保存的変異体またはその任意の塩を投与することを含む。

肝臓は、脂質代謝に関与する主要な臓器である。脂質異常症は、世界中でおおよそ１０億人が罹患し公衆衛生上の問題としてますます懸念が高まりつつある、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などの代謝障害に至る病態である。米国では、ＮＡＦＬＤは、全国的に蔓延する疾患であり、１２００万人を超える成人および８００万人の小児が罹患し、それに伴う年間の医療費は１千３０億ドルにも上る。

ＮＡＦＬＤは、世界における肝臓疾患の主要原因である。ＮＡＦＬＤは、肝脂肪蓄積（脂肪症）を特徴とし、細胞毒性である脂質酸化副産物の生成をもたらし、これは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と定義される、肝細胞傷害を伴う慢性炎症状態へと進行する。この疾患が進行するにつれ、患者の一部は、線維症、肝硬変および肝不全または肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症する。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨが、次の１０年で、肝臓移植の最も多い適応であるＣ型肝炎に取って代わるであろう。このように、ＮＡＦＬＤは、脂肪症（脂肪肝）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ならびに線維症および肝硬変（肝臓の過剰な非可逆性瘢痕化）を含む多様な病態を含む。

キスペプチン（ＫＰ）は、ＫＩＳＳ１遺伝子のペプチド産物であり、Ｇ蛋白質共役受容体の１つであるキスペプチン１受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）の内因性リガンドである。ＫＰ／ＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達系は、中枢（脳において）および末梢の両方で発現され、それはそこで生殖および代謝に主要な役割を担う。実際に、肝臓のＫｉｓｓ１発現は、肥満の遺伝的モデル（ｄｂ／ｄｂおよびｏｂ／ｏｂマウス）において増加されることが明らかにされた。ＫＩＳＳ１およびＫＩＳＳ１Ｒは肝臓で発現されるが、脂質生成制御における肝ＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達の役割には未解明である。

ＮＡＦＬＤ有病率は、肥満とＩＩ型糖尿病の増加の反映であり、約１億人のアメリカ人が罹患する。しかし、ＩＩ型糖尿病の治療に利用される医薬品は、ＮＡＦＬＤを治療するために承認されていない。この疾患の初期段階では有益である体重の減量および肥満症治療手術は別として、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを治療するためのＦＤＡ承認薬は現在のところ存在しない。ＦＤＡの業界向けガイダンスは、「ＦＤＡは、ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤの進行を緩徐、停止、または逆転させる治療法を確立することが、満たされていない医学的必要性に対処するであろうと考える」と述べている。ｆｄａ．ｇｏｖ（２０１８年１２月）を参照のこと。肥満率が上昇し続けているので、米国におけるＮＡＦＬＤ関連肝疾患および死亡率は増加するであろう。ＮＡＳＨ治療薬の世界市場および肝硬変薬市場は、２０２６年までにそれぞれ、米ドルで１８３億ドルおよび６６０億１千ドルに達すると予想される。

このように、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの新規治療法を開発する臨床的必要性が存在する。

本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨにおいてＴＡＫ－４４８の利用を別の目的に使うことを含む。本研究では、ＮＡＦＬＤの高脂肪食餌誘導性前臨床マウスモデルを、Ｋｉｓｓ１ｒの肝ノックアウトが脂肪症を促進することを実証するために用いた。さらに、肥満の野生型糖尿病マウスでのＫＰ類似体（ＴＡＫ－４４８）の点滴が、疾患の進行を防ぐ。機構的に、ＫＰシグナル伝達は、ＡＭＰ活性化蛋白質キナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化すること、ならびにペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）シグナル伝達経路を抑制することに加えて、ミトコンドリアにおける脂肪のベータ酸化または分解を促進することによって、デノボ脂質生成（脂肪形成）を負に制御することが示された。本研究は、ＫＩＳＳ１Ｒを対象とする薬理学的介入および遺伝的介入の両方が、ＮＡＦＬＤ発症を予防でき、かつＮＡＦＬＤがＮＡＳＨおよび線維症へと進行するのを抑え得るという直接的な証拠を提供する。

具体的には、本発明は、治療有効量のＴＡＫ－４４８を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの治療または予防の方法に関する。好ましくは、対象は、ＮＡＦＬＤ患者またはＮＡＳＨ患者である。投与はいかなる経路であってもよいが、好ましくは皮下投与である。

本発明の特定の実施態様は、ＴＡＫ－４４８およびその任意の塩；ＴＡＫ－４４８の保存的変異体およびその任意の塩；キスペプチン１０およびその任意の塩；ならびにキスペプチン１０の保存的変異体およびその任意の塩から選択される化合物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の肝臓において脂肪を減らす方法を含む。対象は、好ましくはアルコール依存症、肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＬＦＤ）、または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される脂肪肝および／または病態に罹患しており；最も好ましくは、対象は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＬＦＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している。

本発明のいくつかの実施態様は、ＡＫＲ－００１、アラムコール（ａｒａｍｃｈｏｌ）、ＡＳＣ４０、ＡＺＤ７６８７、ＢＩ０８９－１００、ＢＭＳ－９８６０３６、カナグリフロジン（ｃａｎａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、セニクリビロック（ｃｅｎｉｃｒｉｖｉｒｏｃ）、シロフェキソール（ｃｉｌｏｆｅｘｏｒ）、ダパグリフロジン（ｄａｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ＥＤＰ－３０５、エラフィブラノール（ｅｌａｆｉｂｒａｎｏｒ）、エムリカサン（ｅｍｒｉｃａｓａｎ）、ＥＹＰ００１ａ、フェノフィブラート、フィルソコスタット（ｆｉｒｓｏｃｏｓｔａｔ）、ＧＲ－ＭＤ－０２、ＩＯＮＩＳ－ＤＧＡＴ２ｒ_ｘ、イプラグリフロジン（ｉｐｒａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、リコグリフロジン（ｌｉｃｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ルセオグリフロジン（ｌｕｓｅｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ＬＹ３２０２３２８、ＭＥＴ４０９、メトホルミン、ＭＧＬ－３１９６、ＭＫ－４０７４、ＭＳＤＣ－０６０２Ｋ、ＭＴ－３９９５、ＮＧＭ２８２、ニドゥフェキソル（ｎｉｄｕｆｅｘｏｒ）、ＰＦ－０５２２１３０４、ＰＦ－０６８３５９１９、ＰＦ－０６８６５５７１、ＰＦ－０６８８２９６１、ＰＸ－１０２、ＰＸＬ７７０、ＰＸＳ－５１５３Ａ、セロンセルチブ（ｓｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ）、シムツズマブ、セマグルチド（ｓｉｍａｇｌｕｔｉｄｅ）、ＴＥＲＮ－１０１、ＴＥＲＮ－２０１、トロピフェクサー（ｔｒｏｉｆｅｘｏｒ）、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびＶＫ２８０９から選択される第２の化合物の治療的量を対象に投与することをさらに含む方法に関する。

投与する方法は、皮下投与、静脈内投与、または経口投与であり得る。

ＴＡＫ－４４８は、ＮＡＦＬＤの前臨床マウスモデルにおいて肝臓の脂肪蓄積（脂肪症）を低下させ代謝プロファイルを改善する。図１Ａは、高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えた対照（媒体、リン酸緩衝性生理食塩水またはＰＢＳ）およびＴＡＫ－４４８処置マウスの肝臓（５匹／群）についての、ヘマトキシリンとエオシンで染色したマウス肝臓の組織学的写真、ここで脂肪症（肝臓における小さな白色領域）を示す、黒い矢じりが示される；および灰色の点で示される、オイルレッドＯによる肝臓脂質染色である。ＴＡＫ－４４８処置は、ＨＦＤの同腹仔対照に比較して、ＨＦＤ誘導性肝脂肪症を軽減する。図１Ｂ～図１Ｇは、終点の肝臓トリグリセリド（ＴＧ）（図１Ｂ）；終点の血中トリグリセリド（図１Ｃ）；血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）（図１Ｄ）；終点の体重（図１Ｅ）；ならびに、動物における末梢脂肪蓄積（図１Ｆ（精巣上体の白色脂肪組織またはｅＷＡＴ）および図１Ｇ（鼠径部の白色脂肪組織またはｉＷＡＴ））を低下させるＴＡＫ－４４８の有益な効果を示す。終点は、マウスの安楽死後と定義される。図１Ｈ～図１Ｊは、ＴＡＫ－４４８処置が、空腹時血糖の上昇を抑えたこと（図１Ｈ）、耐糖能試験（ＧＴＴ）を用いて決定される不耐糖を抑えたこと（糖尿病の改善）（図１Ｉ）、およびインスリン耐性試験（ＩＴＴ）を用いるインスリン抵抗性を抑えたこと（図１Ｊ）を示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、媒体（ＶＥＨ、ＰＢＳ）またはＴａｋｅｄａ－４４８（ＴＡＫ、０．３ｎｍｏｌ／ｈ）で処置する前の野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの体重（図２Ａ）および空腹時血糖（図２Ｂ）を示す。図２Ｃは、処置後４週間；ＲＤ／ＨＦＤで１０週間；マウス５匹／群で、臨床実験動物モニターシステム（ＣＬＡＭＳ）で測定されるように、ＴＡＫまたは対照で処置されたマウスで、食物摂取に差がないことを示す。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、ＶＥＨ対照との比較。 ＲＤ／ＨＦＤ（１０週間）での対照およびＴＡＫ処置マウス（処置後４週間）における、脂肪肝マーカーである、血清酵素アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）のレベル（図３Ａ）、血清コレステロールのレベル（図３Ｂ）、および血清グリセロールのレベル（図３Ｃ）を示す。ＴＡＫ－４４８の投与は、ＨＦＤ対照と比較して、高脂肪給餌（ＨＦＤ）マウスにおいて、ＡＬＴ、コレステロールおよびグリセロールの各レベルを低下させる。 媒体（ＶＥＨ、ＰＢＳ）対照およびＴＡＫ－４４８処置マウス（処置後４週間、ＲＤ／ＨＦＤで１０週間；マウス５匹／群）における熱発生（図４Ａ）および呼吸商（ＲＥＲ（図４Ｂ）を示すＣＬＡＭＳ分析を示す。 図５Ａは、Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡ発現に対し正規化された、高脂肪給餌肝臓試料におけるＲＴ－ｑＰＣＲによる表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。ＴＡＫ－４４８処置は、肝臓における脂肪産生（トリグリセリド合成および脂質生成）を制御する主要な遺伝子のレベルを低下させる。図５Ｂは、高脂肪給餌肝臓マウスにおける、表示される蛋白質の発現を示す代表的なウエスタンブロットである。ＴＡＫ－４４８処置は、肝臓における脂肪産生の主要制御因子の蛋白質レベルを低下させる。 図５Ｂに示されるウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を示す。 ｐＡＭＰＫおよび総ＡＭＰＫを示すウエスタンブロットである。ＴＡＫ－４４８処置は、重要なエネルギーセンサーであるＡＭＰＫを活性化し、それは次いで、脂肪形成を阻害する。 それぞれ図７および図５Ｂに示されるウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を示す。 Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡの発現に対し正規化された、ＶＥＨ処置（対照）またはＴＡＫで処置されたマウスからの高脂肪給餌肝臓試料におけるＲＴ－ｑＰＣＲによる炎症性マーカー（図９Ａ）ならびに線維症と酸化ストレスのマーカー（図９Ｂ）の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。ＴＡＫ－４４８処置は、肝臓において、炎症および線維症を制御する主要遺伝子のレベルを低下させる。平均値±平均値の標準誤差を示す。対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、ＶＥＨ対照との比較。 肝臓のトリグリセリド合成およびデノボ脂質生成の主要制御因子の発現に対する、ＴＡＫ－４４８処置の阻害効果に関するグラフである。 肝臓の炎症の主要制御因子の発現に対する、ＴＡＫ－４４８処置の阻害効果に関するグラフである。 肝線維症の主要制御因子の発現に対する、ＴＡＫ－４４８処置の効果に関するグラフである。 脂肪のミトコンドリアおよびペルオキシソームにおけるベータ酸化を制御する肝臓遺伝子の発現に対する、ＴＡＫ－４４８処置の効果に関するグラフである。 図１４Ａは、ＨＦＤでの経時的な対照（ＣＴＲＬ）および肝ＫＩＳＳ１Ｒノックアウト（ＬＫＯ）マウスの体重（ＢＷ）を示すグラフである。図１４Ｂは、対照およびＬＫＯマウスについての、終点の体重を示す棒グラフである。図１４Ｃは、ＨＦＤでのマウスの写真（ＣＴＲＬおよびＬＫＯ）である。図１４Ｄは、４日間にわたり平均した対照およびＬＫＯマウスの毎日の食物摂取を示す棒グラフである。 高脂質の食餌（図３Ａ）および通常の食餌（図１５）でのＣＴＲＬおよびＬＫＯ（ＨＤＦおよびＲＤ）マウスについて脂肪症を示すヘマトキシリン－エオシン染色されたマウス肝臓の顕微鏡写真である。図１５Ｂにおいて四角で囲った領域を、下で拡大する。 ＣＴＲＬおよびＬＫＯ（ＲＤおよびＨＦＤ）マウスにおける肝臓トリグリセリドを示す棒グラフである。ＨＦＤでのＬＫＯマウスは、やはりＨＦＤでの対照と比較して、上昇された肝臓トリグリセリドを有する。 ８週間通常食（ＲＤ）または高脂肪の食餌（ＨＦＤ）でのＣ５７ＢＬ６オスのマウスにおける、Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡの発現に対し正規化された、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＫｉｓｓ１およびＫｉｓｓ１ｒの相対的ｍＲＮＡ発現を示す。高脂肪給餌は、肝臓においてＫＩＳＳ１およびＫＩＳＳ１Ｒの発現を誘導する。 図１８Ａは、ＫＩＳＳ１Ｒのノックダウンを示す、ＣＴＲＬおよびＬＫＯマウスからのＨＦＤ肝臓における、ＲＴ－ｑＰＣＲによる表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。ＬＫＯマウス肝臓は、対照と比較して、ＫＩＳＳ１Ｒ発現が枯渇される。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、対照との比較。図１８Ｂは、通常食（ＲＤ）でのＣＴＲＬおよびＫＯマウスの体重を示す。ＲＤで維持されたマウスでは、体重に変化がない。図１８Ｃおよび図１８Ｄは、ＣＴＲＬおよびＬＫＯマウスの呼吸商（ＲＥＲ）（図１８Ｃ）および歩行活動（図１８Ｄ）を示すＣＬＡＭＳ分析を示す。＊ｐ＜０．０５；一元配置分散分析の後に、ダネットの事後検定を行った。 図１９Ａは、ＨＦＤでのＬＫＯマウスでの低い代謝を反映する、ＣＬＡＭＳにより評価された熱発生を示す。図１９Ｂは、肝臓疾患マーカーである肝臓酵素アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の血清レベルが、ＨＦＤでのＣＴＲと比較して、ＨＦＤでのＬＫＯマウスで増加されることを示す。 ＣＴＲＬおよびＬＫＯマウスにおける、腓腹筋の重量（図２０Ａ）、前脛骨筋の重量（図２０Ｂ）、精巣上体における白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）の重量（図２０Ｃ）、および鼠径部における白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）の重量（図２０Ｄ）を示す。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、対照との比較。ＨＦＤでのＬＫＯマウスは、ＨＦＤでの対照と比較して、より低い筋肉量およびより多い脂肪組織を有する。 図２１Ａは、Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡの発現に対し正規化された、肝臓試料（ＨＦＤ）における表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。脂肪形成を制御する主要な遺伝子は、ＨＦＤでのＬＫＯマウスからの肝臓で高められる。図２１Ｂは、肝臓試料における表示される蛋白質の発現を示す代表的なウエスタンブロットを与える。脂肪形成を制御する蛋白質は、ＬＫＯ（ＨＦＤ）マウスからの肝臓で高められる。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、対照群との比較。 図２１Ｂでのウエスタンブロットからの示される蛋白質の発現のデンシトメトリー分析を示す：図２２Ａ（ＦＡＳＮ）；図２２Ｂ（ＰＰＡＲγ）；図２２Ｃ（ＣＤ３６）；図２２Ｄ（ｐＡＭＰＫ／総ＡＭＰＫ）。 図２３Ａは、肝トリグリセリド（ＴＧ）合成経路を示す模式図である；太字の分子は、対照（ＣＴＲＬ）の肝臓と比較してＨＦＤでのＬＫＯにおいて上方制御される。図２３Ｂは、Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡの発現に対し正規化された、ＬＫＯ肝臓試料におけるＲＴ－ｑＰＣＲによる表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。トリグリセリド合成を制御する遺伝子は、ＬＫＯ（ＨＦＤ）肝臓において上昇される。 図２１ＢでのウエスタンブロットからのＧＹＫ発現のデンシトメトリー分析を示す。 図２５Ａは、ＨＦＤでのＣＴＲＬマウスおよびＬＫＯマウスにおける、質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により測定された肝臓脂質類を比較するボルケーノプロットである。ＬＫＯ（ＨＦＤ）肝臓において高度に上昇される脂肪分子種を、グラフの上部右側４分の１の部分に示す。図２５Ｂは、Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡの発現に対し正規化された、ＲＤでのＣＴＲＬマウスおよびＬＫＯマウスの肝臓における、ＲＴ－ｑＰＣＲによる表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、対照との比較。 図２６Ａおよび図２６Ｂは、１２時間絶食後のＨＦＤでのＣＴＲＬマウスおよびＬＫＯマウスにおける、空腹時血糖値（図２６Ａ）および耐糖能試験（ＧＴＴ）時の血糖値（図２６Ｂ）を示す。ＨＦＤでのＬＫＯマウスは、やはりＨＦＤでの対照と比較して、悪化した２型糖尿病を有した。図２６Ｃは、ＧＴＴの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。図２６Ｄは、インスリン耐性試験（ＩＴＴ）中の６時間絶食後のＨＦＤでのＣＴＲＬおよびＬＫＯマウスにおける血糖値を示す。図２６Ｅは、ＩＴＴのＡＵＣを示す。Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡの発現に対し正規化された、グルコース代謝を制御する遺伝子（図２６Ｆ）、炎症マーカー（図２６Ｇ）および線維症マーカー（図２６Ｈ）、およびミトコンドリアの酸化ストレスマーカー（図２６Ｉ）を示すＣＴＲＬおよびＬＫＯ（ＨＦＤ）の肝臓試料におけるＲＴ－ｑＰＣＲによる表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現。ＨＦＤでのＬＫＯマウスからの肝臓は、炎症および線維症を制御する遺伝子の上昇されたレベルを示す。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、対照との比較。 ＫＩＳＳ１Ｒの相対的ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。 ＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達による肝ＰＰＡＲ－γの制御を示すウエスタンブロットである。ＬＫＯマウスの肝臓は、ＰＰＡＲ－γの増加された発現を有するが、リン酸化ＰＰＡＲ－γの減少された発現を有する（図２８Ａ）。このリン酸化部位は、ＰＰＡＲ－γ活性を阻害する。対照的に、ＴＡＫ－４４８処置は、ＰＰＡＲ－γの発現を低下させるが、リン酸化ＰＰＡＲ－γを増加させ、ＰＰＡＲ－γ活性が減少されることを示唆する（図２８Ｂ）。 単離された初代肝細胞における内因性キスペプチンの免疫染色（矢印を参照のこと）の共焦点顕微鏡像である。 マウス初代肝細胞における、ＦＦＡ（１５０μＭオレイン酸および１５０μＭパルミチン酸）負荷によるトリグリセリド蓄積に対する、ＴＡＫ－４４８（３ｎＭ）またはキスペプチン１０（１００ｎＭ）の阻害効果を示すグラフである。 ＬＫＯマウス（ＫＩＳＳ１Ｒ欠損）から単離された肝細胞における、ＦＦＡ（１５０μＭオレイン酸および１５０μＭパルミチン酸）負荷によるトリグリセリド蓄積に対する、ＴＡＫ－４４８またはキスペプチン１０の効果の欠如を示すグラフである。＊ｐ＜０．０５；一元配置分散分析後にダネットの事後検定を行った。 デノボ脂質生成およびトリグリセリド合成を制御する遺伝子の発現に対する、ＴＡＫ－４４８処置の阻害効果を示すグラフである。 図３１Ａは、基礎条件下で、８時間のキスペプチン（ＫＰ）またはＴＡＫ処置の際のＣ５７ＢＬ６オスのマウスから単離した初代マウス肝細胞におけるＲＴ－ｑＰＣＲによる表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。（ｎ＝５）＊ｐ＜０．０５；一元配置分散分析後に、ダネットの事後検定を行った。図３１Ｂは、マウス初代肝細胞（ｎ＝４）における、ＡＭＰＫのリン酸化（その活性化が起こる）に対する、キスペプチン処置の効果（それによってその下流の基質ＡＣＣを阻害する）を示す代表的なウエスタンブロットである。図３１Ｃは、Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡの発現に対し正規化された、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＣＴＲＬおよびＬＫＯマウスの初代肝細胞におけるＫｉｓｓ１Ｒ発現を示す（ｎ＝４）。ＫＩＳＳ１Ｒ発現は、ＬＫＯマウス肝臓からの単離した肝細胞で枯渇される。 図３１Ｂのウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を与える。 図３３Ａは、対照およびＬＫＯマウスから単離した初代肝細胞における、表示蛋白質の発現を示す代表的なウエスタンブロットである。図３３Ｂは、ＣＴＲＬおよびＬＫＯマウス（ｎ＝４）から単離した初代肝細胞における、ＲＴ－ｑＰＣＲによる表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を示し、ＫＩＳＳ１Ｒの欠失時の脂肪合成制御遺伝子の増加を示している。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５。 ＣＤ３６（図３４Ａ）、ＦＡＳ（図３４Ｂ）、ＰＰＡＲγ（図３４Ｃ）、およびＭＯＧＡＴ１（図３４Ｄ）についての図３３Ａのウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を与える。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、対照との比較。 遊離脂肪酸（ＦＦＡ：パルミチン酸塩、１００μＭ）負荷マウス初代肝細胞におけるＴＡＫ－４４８処置が酸素消費速度を増加させ、促進された脂肪酸酸化をもたらす（図３５Ａ）ことを示す一連のグラフである。ＴＡＫ－４４８処置はまた、基礎呼吸（図３５Ｂ）およびＡＴＰ生成（図３５Ｃ）も増加させた。 ＦＦＡ（パルミチン酸塩、１００μＭ）負荷ヒト肝細胞におけるＴＡＫ－４４８処置が、処置の後経時的に酸素消費速度を増加させることを示すグラフである。ＴＡＫ－４４８処置はまた、基礎呼吸（図３６Ｂに示す）およびＡＴＰ生成（図３６Ｃ）も増加させた。 ＴＡＫ－４４８処置が、細胞数の減少により観察されるように、ヒト星細胞ＬＸ２細胞の増殖を低下させることを示す棒グラフである（図３７Ａ）。ＴＡＫ－４４８処置は、ＬＸ２細胞において線維症マーカー遺伝子の発現を減少させる（図３７Ｂ）。 核（図３８Ａ）、内因性のＫＩＳＳ１Ｒ（図３８Ｂ）、星細胞（図３８Ｃ）、および重ね合わせ（図３８Ｄ）について示される、ＮＡＦＬＤ患者からのヒト肝臓生検の染色を示す一連の免疫蛍光像である。 患者肝生検における相対的ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ＫＩＳＳ１およびＫＩＳＳ１Ｒの遺伝子発現および蛋白質発現は、健常対照肝臓と比較して、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者の患者肝生検で上昇される。 一連のウエスタンブロットである。 図３９Ｂでのブロットのデンシトメトリー分析を示す。 健常対象と比較して、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者の成人肝臓におけるより高いＫＩＳＳ１Ｒ染色を示す一連の代表的な組織学像である。 ヒト対象における放射免疫測定による血漿キスペプチンレベルを示す棒グラフである；血漿キスペプチンレベルは、健常対象と比較して、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者で有意に上昇され、キスペプチンの増加がＮＡＦＬＤを解消するための補償的な保護機構である可能性を示唆する。 それにより肝臓でのＫＰ／ＫＩＳＳ１Ｒ活性化が脂肪肝の発生とそのＮＡＳＨへの進行を防ぐ、シグナル伝達経路の作業モデルを示す模式図である。強力な類似体ＴＡＫ－４４８によるＫＩＳＳ１Ｒ活性化の増強は、ＡＭＰＫ活性化を引き起こし、それは脂質生成を阻害し脂肪蓄積を軽減する。代わりに、ＴＡＫ－４４８は、ベータ酸化を介して脂肪酸分解を促進して、例えばミトコンドリアにおいてエネルギーを産生させる。ＴＡＫ－４４８はまた、肥満病態の肝臓において、トリグリセリド合成の主要プロモーターであるＰＰＡＲ－γの発現と活性を阻害する。これは、脂肪のより少ない蓄積、肝臓細胞のより少ない傷害（炎症）をもたらし、したがってＮＡＳＨへの進行を阻む。

１：定義
他で特段に定義されない限り、本明細書で用いる技術用語および科学的用語はいずれも、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料に類似または同等の様々な方法および材料を、本発明の実施および試験に利用可能であるが、好適な方法および材料を後述する。しかし、本明細書において用いられ、記載されるそれらの材料および方法はあくまでも例であり、本発明における利用に好適な唯一のものではないことは、当業者であれば理解するであろう。さらに、測定値には本来固有のばらつきがあるので、本明細書中の何らかの特定の温度、重量、容積、時間間隔、ｐＨ、塩分、モル濃度（ｍｏｌａｒｉｔｙまたはｍｏｌａｌｉｔｙ）、範囲、濃度およびその他の測定値、数量表現は、おおよそであり、そうでないと明示的に示されない限り正確なまたは臨界的な数字でないと意図される。

本明細書中の用語「約」は、示される値のプラス／マイナス２０パーセントを意味し、例えば、「約０．１２５」は０．１２５±０．０２５を意味し、また「約１．０」は１．０±０．２を意味する。

本明細書中の用語「ＴＡＫ－４４８」は、キスペプチン－５４の完全に活性であるＣ末端１０アミノ酸（キスペプチン１０）の安定な類似体を指し；これらは、ＫＩＳＳ１遺伝子にコードされる、キスペプチン－１４５のペプチド産物である。キスペプチン－５４は、以前はメタスチンとして知られており、以前はＧＰＲ５４として知られていた、Ｇ蛋白質共役キスペプチン１受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）のリガンドである。

本明細書中の用語「治療する（処置する）」、および「治療（処置）」などの、その同語源語は、所望の薬理学的効果および／または生理的効果を得ることを指す。したがって、「治療（処置）」は、
（ａ）ある病態または疾病についての素因を有する可能性があるが、未だそれを有すると診断されていない対象において、その病態または疾病またはその症状が発生することを予防すること；
（ｂ）病態または疾病またはその症状を阻止すること（その発生を止めることなど）；
および
（ｃ）病態または疾病またはその症状を軽減、低減または改善すること（例えば、病態または疾病またはその症状の反転または部分的反転を起こすこと）
を含む。

本明細書中の用語「防ぐ」、および「防止」などの、その同語源語は、対象において、ある病態または疾病が発生する可能性を低減すること、ある病態または疾病の重症度を低下させること、およびその病態または疾病を部分的に、または完全に止めることを指す。

本明細書中の用語「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒト患者（ヒト小児患者を含む）を指す。

本明細書中の用語「それを必要とする」は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している、あるいは罹患している疑いのある対象を指す。

本明細書中の用語「治療的有効量」は、治療的効果、好ましくは所望の薬理学的結果および／または生理学的結果を生じる量、用量、または用量レジメンを指す。

用語「投与する」、および「投与」などの、その同語源語は、薬科学の分野において公知の方法および経路にしたがって、対象と化合物を接触させることを指す。

用語「脂肪肝」は、対象の肝臓が５％以上の脂肪を含む病態を指す。「脂肪肝」のカテゴリーに含まれる病態としては、脂肪肝疾患、肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変、黄疸および肝臓癌、または肝臓が５％以上の脂肪を含む任意の病態が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中の用語「ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ」は、非アルコール性脂肪肝疾患および／または非アルコール性脂肪性肝炎を指す。ＮＡＦＬＤは、脂肪症（脂肪肝）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維症および肝硬変（肝臓の過度の瘢痕化）を含む、様々な病態を包含する。

天然または合成のペプチドまたはペプチド類似体に関する用語「保存的変異体」は、そのペプチドに対し約９０％以上の同一である配列（例えば、その配列において１アミノ酸置換、１アミノ酸付加、または１アミノ酸欠失を含む）を指す。この用語はまた、化合物の構造へのメチル基、エチル基、ハロ基、トリフルオロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、メチルアミンなどの付加を含む、アミノ酸側鎖の化学修飾などの、ペプチドの化学的変種も含む。

２：概説
本発明は、血液中に存在する天然ペプチドである、キスペプチン１０の長期持続型合成類似体ＴＡＫ－４４８の投与による、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨなどの代謝障害の治療法を提供する。Ｇ蛋白質共役受容体であるキスペプチン受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）を介するキスペプチンシグナル、ならびにキスペプチンおよびＫＩＳＳ１Ｒの両方は、肝臓により発現される。キスペプチン－５４ペプチドは、健常人に投与され、それは、食物摂取または食欲を変化させずに、インスリン分泌を亢進することが示されている。

３：本発明の実施態様
この報告では、肝臓の脂質生成の主要制御因子としてのＫＩＳＳ１Ｒの新機能の初めての証拠を提供する。ＫＩＳＳ１Ｒは肝臓で発現されるが、肝臓におけるその生物学的機能は未解明のままである。本研究の目的は、ＮＡＦＬＤなどの脂肪肝の発生と進行におけるＫＩＳＳ１Ｒの役割を調べること、ならびにＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨおよび肝臓における脂肪蓄積を含む他の病態の予防および治療での使用のための組成物および方法を提供することであった。肝Ｋｉｓｓ１ｒノックアウト（ＬＫＯ）を用いて、本発明者らは、肝臓のＫｉｓｓ１ｒ欠損が、ＮＡＦＬＤのマウスモデルにおいて肝脂肪症、炎症および線維症を悪化させることを明らかにした。ＨＦＤでのＬＫＯマウスは、体重増加、肝臓トリグリセリド（ＴＧ）レベルの上昇、空腹時血糖とインスリン抵抗性の上昇、および炎症性マーカーおよび線維症マーカーの増加などの、代謝パラメーターの増悪を示した。

これらの表現型は、肝臓のＫＩＳＳ１／ＫＩＳＳ１Ｒ欠失が、ＮＡＦＬＤ表現型の発現および関連する代謝低下の負の制御に重要な役割を果たすことを示唆している。そこで、肝ＫＩＳＳ１ＲがＮＡＦＬＤにおいて保護的役割を果たすという仮説を試験するために、インスリン耐性野生型マウスを、ＫＰ１０と同程度の強力な作用薬活性を有するプロテアーゼ耐性ＫＰ類似体であるＴＡＫ－４４８で処置した。我々は、インスリン耐性野生型マウスにおいて、ＴＡＫ処置が、肝臓の脂質蓄積を抑制し、血清ＴＧ、コレステロールおよび遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を低下させ脂肪量を減少させることを見出した。さらに、ＴＡＫ処置は、食物摂取を変化させることなく体重増加を防ぎ、耐糖能およびインスリン感受性を改善した。重要なことに、ＴＡＫ投与は、炎症および線維症を制御する主要遺伝子を低下させた。まとめると、これらの知見は脂肪肝（脂肪症）およびＮＡＳＨの発症に対するＫＩＳＳ１Ｒの重要な保護的役割を実証する。ヒトのデータは、健常対象と比較して、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者からの肝臓生検におけるＫＩＳＳ１およびＫＩＳＳ１Ｒレベルの有意な増加かつ増加された血漿キスペプチンレベルを示した。これは、肝臓の脂肪蓄積を減少させる保護的な代償機構であるのかもしれない。しかし、ＫＩＳＳ１Ｒの内因性活性化は、ＮＡＦＬＤの発症に対し保護するためには明らかに不充分である。これらの結果は、それらが食餌誘導性ＮＡＦＬＤマウスモデルにおいて見られる結果を反映するので、本発明者らの前臨床的知見の臨床的な妥当性を示す。重要なことに、ＴＡＫ－４４８処置はまた、肝線維症に主要な役割を果たすヒト肝星細胞の増殖を低下させ、線維症の予防におけるＴＡＫ－４４８の保護的役割を示唆する。

本発明者らはまた、それによりＫＩＳＳ１Ｒが脂質生成を制御する、細胞経路を明らかにした（図４０を参照のこと）。本発明者らの知見は、ＫＩＳＳ１Ｒが、ＨＦＤ肝臓においてインビボでＡＭＰＫを活性化し、かつ単離した初代肝細胞において、インビトロでＡＭＰＫを活性化し、脂肪症に対するＫＩＳＳ／ＫＩＳＳ１Ｒの保護的効果の基礎となるデノボ脂質生成（ＤＮＬ）およびＴＧの蓄積の阻害をもたらすことを明らかにする。ＤＮＬ（脂肪への炭水化物の変換）は、ＮＡＦＬＤにおいて上方制御され、ＡＭＰＫの活性化は、ＡＣＣをリン酸化しその活性を低下させることによりＤＮＬを阻害し、脂肪酸利用を促進する。ＴＡＫ－４４８処置は、ベータ酸化とよばれるプロセスを介して遊離脂肪酸分解を増加させた。ＡＭＰＫ活性化はまた、脂質生成のマスター転写制御因子であるＳＲＥＢＰ－１を直接的にリン酸化することにより脂肪合成遺伝子発現の下方制御をもたらる。

ＡＭＰＫ活性化は、ＴＧ合成を低下させ、２種類の可能な機構による抗脂肪症効果をもたらすことが示されている。第１に、ＡＭＰＫ活性化は、肝臓で肝Ｘ受容体ａ（ＬＸＲａ）の活性を阻害する；ＬＸＲａは、脂肪酸合成を促進し高トリグリセリド血症をもたらす、脂質センサーである。第２に、ＡＭＰＫ活性化は、ＰＰＡＲγの転写を阻害する。それによりＫＰがＡＭＰＫを活性化する機序は、現在のところ知られていない。ＡＭＰＫの活性化は、ＡＭＰ：ＡＴＰ比の増加と細胞内Ｃａ２＋の上昇を介するトレオニン１７２（Ｔ１７２）のリン酸化を必要とする（３８）。複数の報告は、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼβ（ＣａＭＫＫβ）の活性化が、哺乳動物細胞におけるＡＭＰＫ活性化に生理的役割を果たしていることを示している。ＫＩＳＳ１Ｒ活性化は細胞内Ｃａ２＋を増加させる（４１）ので、ＫＩＳＳ１ＲがＣａＭＫＫβ経路を介してＡＭＰＫを活性化する可能性が高い。

ＰＰＡＲγの発現は、健常な肝臓では低いが、ＮＡＦＬＤでは有意に上昇し、デノボ脂質代謝を制御することにより肝脂肪症の発症に寄与する。さらに、ＰＰＡＲγは、脂肪酸エステル化の主要酵素Ｇｙｋ１、脂肪取り込み輸送体Ｃｄ３６、およびＴＧ前駆体であるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を形成するためにモノアシルグリセロールをエステル化するＭｏｇａｔ１などの、ＴＧ合成に関与する遺伝子／経路を直接的に上方制御することにおいて重要な役割を果たす。ＰＰＡＲγ依存性ＭＯＧＡＴ１の発現抑制は、肝脂肪症を防ぎ、他方、ＣＤ３６依存性ＦＦＡ取り込みおよびＭＯＧＡＴ媒介性脂肪酸エステル化は、脂肪症を促進する。ＰＰＡＲγおよびＭＯＧＡＴの過剰発現がまた、ＮＡＦＬＤを有するヒトにおいて観察されている。ＴＡＫがＰＰＡＲγ、ＣＤ３６、およびＭＯＧＡＴ１の発現を阻害するという知見は、肝インスリン感受性を負に制御するＤＡＧとの関連が知られているので、臨床的に重要な意味合いを有する。結論として、本発明者らの研究は、肝ＫＰ／ＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達系は、ＡＭＰＫ－ＰＰＡＲγシグナル伝達を含む機序を介して、肝細胞における肝デノボ脂質生成を阻害することを示唆し、ＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達の活性化がＮＡＦＬＤ治療の有望な治療標的であることをさらに示唆する。

具体的には、本明細書に記載の前臨床試験は、確立されたＮＡＦＬＤマウスモデルを利用し、そのモデルでは、雄マウスが、通常食（ＲＤ、４％キロカロリーの脂肪）に比べて高脂肪の、欧米型高脂肪の食餌（ＨＦＤ、６０％キロカロリーの脂肪）を給餌される。このモデルを用いて、本発明者らは、キスペプチン類似体（ＴＡＫ－４４８）の皮下投与が、媒体（リン酸緩衝性生理食塩水、ＰＢＳ）対照で処置されたマウスと比較して、マウスＮＡＦＬＤモデルにおいて脂肪肝の発症を防ぐことを明らかにした（図１Ａ～図１Ｊならびに図３Ａおよび図３Ｃを参照のこと）。具体的には、糖尿病マウスに１か月間投与されたＴＡＫ－４４８（図２Ａおよび図２Ｂ）は、脂肪症（肝臓におけるトリグリセリド蓄積）を防ぎ、かつ肝トリグリセリドおよび血清トリグリセリドの上昇を防ぎ（図１Ｃ）；かつ血中コレステロール（図３Ｂ）、脂肪酸（図１Ｄ）、およびトリグリセリド構成要素であるグリセロール（図３Ｃ）を低下させた。ＴＡＫ－４４８処置は、脂肪肝疾患の臨床バイオマーカーである肝酵素ＡＬＴのレベルを低下させた。図３Ａを参照のこと。ＴＡＫ－４４８処置はまた、末梢における脂肪蓄積およびインスリン抵抗性を防いだ。図１Ｆ～図１Ｊを参照のこと。対象と比較してＴＡＫ処置マウスでは（両方ともＨＦＤを与えた）、食物摂取には変化がなかった（図２Ｃ）。

さらに、肝臓Ｋｉｓｓ１Ｒの欠失を有する（ＬＫＯ）ＨＦＤ給餌マウスでは、体重（図１４）、肝脂肪（図１５）および肝臓トリグリセリド（図１６）におけるより大きな増加が、食物摂取は無変化であるにもかかわらず（図１４Ｄ）、ＨＦＤ給餌同腹仔対照と比較して、観察された。このことは、ＮＡＦＬＤの発症予防における、キスペプチン／Ｋｉｓｓ１Ｒ経路の保護的役割を示唆する。図１４、図１５および図１６を参照のこと。Ｋｉｓｓ１Ｒノックアウト動物はまた、対照と比較して（いずれもＨＦＤを給餌）、不耐糖およびインスリン抵抗性であった。図２６Ｂ～図２６Ｅを参照のこと。肝ＫＩＳＳ１Ｒノックアウトマウスからの肝臓は、対照と比較して（いずれもＨＦＤを給餌）、炎症性サイトカイン（インターロイキン類（ＩＬ）－１α、Ｍｉｐ２、ＩＰ１０；図２６Ｇを参照のこと）およびＮＡＳＨ／線維症に関する生化学マーカー（例えばＴＧＦβ、コラーゲン（図２６Ｈを参照のこと））の有意な増加を示した。

キスペプチンはまた、脳に作用し、中心生殖系を制御する。キスペプチンの長期投与は、性ステロイドホルモン合成の抑制をもたらす。これは、前立腺癌を有する男性においてテストステロンレベルを下げるために用いられている（２つの第１相臨床試験）、持続作用性ＴＡＫ－４４８により模倣される。さらに、異なる名称（ＭＶＴ－６０２）でＴＡＫ－４４８は、女性の不妊を治療するためにＭＹＯＶＡＮＴにより試験されており、現在第１相および第２相臨床試験である。

ＴＡＫ－４４８は、キスペプチン５４の完全に活性なＣ末端１０アミノ酸（キスペプチン１０）のオリゴペプチド類似体である。それは、数分以内に急速に分解されるキスペプチン類とは対照的に、血液中で４時間の半減期を有する。ＴＡＫ－４４８は、強力なキスペプチン１受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ、またはＧＰＲ５４）作用薬である。ＫＩＳＳ１Ｒは、キスペプチンを結合するＧ蛋白質共役受容体である。キスペプチンは、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）抑制遺伝子ＫＩＳＳ１によりコードされ、様々な内分泌組織および生殖腺組織で発現される。キスペプチンおよびＫＩＳＳ１Ｒは、思春期の発現と視床下部－下垂体－性腺軸の制御におけるそれらの関与のため、哺乳動物の生殖に重要な役割を担っている。それは、前立腺癌、低テストステロン、前立腺腫瘍、および低ゴナドトロピン性性機能低下症の治療を試験する治験に用いられている。ＴＡＫ－４４８の構造は、以下である：

目的の配列に関しては、下の表１を参照のこと。

本発明の実施態様にしたがって治療され得る対象としては、研究室動物、ペット動物、家畜、動物園の動物などの哺乳動物（ヒトを含む）が挙げられる。好ましい対象は、ヒトおよび齧歯類である。本発明に好適な対象は好ましくは、肝臓における脂肪蓄積または脂肪肝を含む任意の疾病または病態を含む疾病を含む、ＴＡＫ－４４８の投与により改善され、治療されまたは予防され得る疾病を、有することが疑われる、有すると診断されている、または発症するリスクを有する、ヒトである。

ＴＡＫ－４４８は、脂肪蓄積または脂肪肝を含む疾病または病態において、疾患の進行を予防、遅延、緩徐、逆行、または疾患の進行を止めるために投与されてよい。そのような病態としては、（１）ＮＡＦＬＤ、（２）ＮＡＳＨ、（３）脂肪肝疾患、（４）肝炎、（５）肝線維症、（６）肝硬変、（７）黄疸、（８）肝臓癌、または（９）対象の肝臓が５％以上の脂肪を含む任意の病態、が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中の用語「ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ」は、非アルコール性脂肪肝疾患および／または非アルコール性脂肪性肝炎を指す。ＮＡＦＬＤは、脂肪症（脂肪肝）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維症および肝硬変（肝臓の過度の瘢痕化）を含む、様々な病態を包含する。

本明細書に記載される本発明における使用のための化合物としては、ＴＡＫ－４４８またはその保存的変異体、およびキスペプチン１０またはその保存的変異体が挙げられるが、これらに限定されない。保存的変異体は、約９０％以上の配列同一性、または上記のような化学的に修飾されたペプチドである。例えば、キスペプチン１０の保存的変異体は、キスペプチン１０の欠失、置換、および付加、ならびに例えば、下記の表２～表６に例示されるものなどの、化学的変種を含む。ＴＡＫ－４４８の保存的変異体は、ＴＡＫ－４４８の欠失、置換、および付加、ならびに例えば、下記の表２～表６に例示されるものなどの、化学的変種を含む。

本発明の化合物はまた、塩基、および薬学的に許容可能な水和物、溶媒和、酸または塩を含み、不定形または任意の結晶形態で、あるいは油またはワックスとして存在し得る。任意の薬学的に許容可能な塩を、状況に応じて、利用できる。

一般に、これらの塩は薬学的および生物学的に許容可能な無機酸または有機酸および塩基または金属に由来する。そのような塩の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アンモニウム塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、重炭酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、炭酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マグネシウム塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩（メシラート）、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、カリウム塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ナトリウム塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩（トシラート）およびウンデカン酸塩。

化合物はまた、治療剤の任意または全ての立体化学的形態（すなわち、各不斉中心についてＲ配位および／またはＳ配位）を含む。したがって、治療剤の単一光学異性体、ラセミ混合物、およびジアステレオマー類は、本発明の範囲に含まれる。また、治療剤の立体異性体および位置異性体も本発明の範囲に含まれる。いくつかの実施態様の治療剤はまた、１種類以上の同位体標識原子の存在に関してのみ異なる化合物を含むことが意図される。例えば、１種類以上の原子が、例えば、重水素、トリチウム、^１３Ｃ、^１４Ｃ（またはリン、カルシウム、ヨウ素、塩素、臭素、または同位体標識に好都合である他の任意の元素などの本技術分野で通常用いられるような任意の同位体標識）で置換されている治療剤は、本発明の範囲内である。

ＴＡＫ－４４８などの化合物、および本発明の実施態様にしたがう他の化合物は、当該技術分野で公知の好適な任意の経路または方法により対象に投与されてよい。好適な投与経路としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：経口投与、静脈内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与または腹腔内注射、坐薬またはかん腸剤による直腸内投与または腟内投与、経粘膜投与、経皮投与、頬側投与、鼻投与、吸入投与、舌下投与、局所投与、または標的組織内または標的組織上への直接的局所投与、または治療有効量の薬剤または組成物を標的細胞または標的組織に送達する任意の経路または方法による投与。投与が経口である場合、好ましい用量形態は、遅延放出またはペプチドまたはペプチド類似体化合物が分解する前に化合物が吸収されることを可能にする他の製剤である。好ましくは、本発明の実施態様の方法は、皮下投与または静脈内投与を含む。投与は、輸液または点滴により行われてよく、かつ埋め込み、埋め込みポンプ、または外部ポンプ、または当該技術分野で公知の任意のデバイスにより投与されてよい。

好ましい方法の実施態様において、本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容され得る担体および、本明細書に記載の本発明の化合物を１種類以上含む、および併用療法のために、同じまた別の種類の脂肪肝軽減薬などの、付加的薬剤と共に本明細書に記載の本発明の化合物の１種類以上を含む、１種類以上の薬剤を含む医薬品組成物として製剤化され投与される。

ＴＡＫ－４８８などの本発明の化合物と同時にまたは逐次的に、併用療法において用いるための化合物の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＣＣ阻害剤、ＡＭＰＫ、ＡＫＲ－００１、アラムコール（ａｒａｍｃｈｏｌ）、ＡＳＣ４０、ＡＺＤ７６８７、ＢＩ－１４６７３３５、ＢＩ０８９－１００、ＢＭＳ－９８６０３６、カナグリフロジン（ｃａｎａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、セニクリビロック（ｃｅｎｉｃｒｉｖｉｒｏｃ）、シロフェキソール（ｃｉｌｏｆｅｘｏｒ）、ダパグリフロジン（ｄａｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ＤＧＡＴＥＤＰ－３０５、エラフィブラノール（ｅｌａｆｉｂｒａｎｏｒ）、エロビキシバット（ｅｌｏｂｉｘｉｂａｔ）、エンパグリフロジン（ｅｍｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、エムリカサン（ｅｍｒｉｃａｓａｎ）、エキセナチド、ＥＹＰ００１ａ、ＦＡＬＣＯＮ１（ＰＥＧ－ＦＧＦ２１（ＦＡＳＮ阻害剤）、フェノフィブラート、フィルソコスタット（ｆｉｒｓｏｃｏｓｔａｔ）（ＦＸＲ作用薬）、ＧＲ－ＭＤ－０２、ＩＯＮＩＳ－ＤＧＡＴ２ｒ_ｘ、イプラグリフロジン（ｉｐｒａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、リコグリフロジン（ｌｉｃｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）、ルセオグリフロジン（ｌｕｓｅｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ＥＹ３２０２３２８、ＭＥＴ４０９、ＭＧＬ－３１９６、ＭＫ－４０７４、ＭＳＤＣ－０６０２Ｋ、ＭＴ－３９９５、ＮＧＭ２８２、ニドゥフェキソル（ｎｉｄｕｆｅｘｏｒ）、ＯＡＴ－１２５１、オベチコール酸、ＯＣＡ、ＯＷＥ８３３、ＰＦ－０５２２１３０４、ＰＦ－０６８３５９１９、ＰＦ－０６８６５５７１、ＰＦ－０６８８２９６１、ピオグリタゾン、ＰＸ－１０２、ＰＸＥ７７０、ＰＸＳ－５１５３Ａ、セラデルパー（ｓｅｌａｄｅｌｐａｒ）、セロンセルチブ（ｓｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ）、セマグルチド（ｓｉｍａｇｌｕｔｉｄｅ）、シムツズマブ、ＴＥＲＮ－１０１、ＴＥＲＮ－２０１、トロピフェクサー（ｔｒｏｉｆｅｘｏｒ）、ＴＴＰ２７３、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ＶＫ２８０９、およびボリキシバット（ｖｏｌｉｘｉｂａｔ）。さらに、ＴＡＫ－４４８、キスペプチン、およびそれらの変異体などの化合物を投与することによる治療は、食事および運動の変更および減量を含む一次治療により実施できる。

薬学的に許容され得る担体は、毒性でなく、かつそれが共に製剤化される治療剤の薬理学的活性を消失させず有意に低下させない、任意の利便的な化合物または化合物群を指す。そのような薬学的に許容され得る担体または媒体は、当該技術分野で考察されるものなどの、当該技術分野で公知の薬学的に許容される標準的な任意の固体状担体、液状担体、またはガス状担体を含む。好適な担体は、医薬品組成物について意図される投与経路に応じて異なる。

本発明と共に利用することが意図される担体および媒体の非包括的リストは、以下である：充填剤、希釈剤、アジュバント、ｐＨ調整剤、緩衝液、防腐剤、結合剤および崩壊剤、溶媒、脂質類、リポソーム、乳剤、懸濁液、および容器（例えば、アンプル、ボトル、予め充填された注射筒など）。

液状担体は、溶液、懸濁液、乳剤、油、ゲルなどの形態であってよく、例えば、水溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝性生理食塩水、リンゲルなど）、水中油型または油中水型乳剤、リポソームなどを含む。ガス状担体としては、例えば空気、酸素、フッ化炭素、分散剤などが挙げられる。固体状担体としては、例えば、でんぷん（例えば、トウモロコシでんぷん、ジャガイモでんぷん、米デンプンなど）、セルロース（例えば、微小結晶セルロースなど）、糖類（例えば、乳糖、スクロース、グルコースなど）、クレー（ｃｌａｙ）、ミネラル類（例えば、タルクなど）、ガム、香味料、防腐剤、着色剤、矯味剤、甘味料、脂質類、油類、溶媒、生理食塩水、乳化剤、懸濁化剤、湿潤剤、分散剤、結合剤、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、塩、ｐＨ調整剤（例えば、酸または塩基）、緩衝液などが挙げられる。

注射に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性である）または分散液、懸濁液または乳剤、および注射可能な滅菌溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末または顆粒を含む。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ（登録商標）、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）または（例えば、リン酸）緩衝液性食塩水（ＰＢＳ）を含む。いずれの場合にも、組成物は、滅菌されるべきであり、かつ容易に注射できる程度に流動的であるべきである。それは、製造条件下および保存条件下で安定である必要があり、かつ細菌および真菌などの微生物の混入する作用に対し保存されなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物を含む、溶媒または分散媒体であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には選択される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持できる。微生物の作用の阻止は、各種抗菌物質および抗真菌物質、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。場合によっては、等張化剤（例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、または塩化ナトリウム）が、組成物に含まれる。注射可能組成物の持続吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物に含有させることにより達成できる。

徐放性組成物および持続性放出組成物もまた、本発明の実施態様と共に、または本発明の実施態様において用いることが意図される。したがって、好適な担体は、活性成分の遅延放出、徐放または持続性放出を達成するために、公知の成分の任意のものを含み得る。

投与の経路は、利便性、治療する対象の健康および病態、ならびに治療する部位、および病態のステージにしたがって、当業者により決定される。したがって、医薬品組成物が取り得る形態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：錠剤、カプセル、カプレット、トローチ剤、糖衣錠、丸薬、顆粒、経口用溶液、希釈用粉末、吸入用粉末、蒸気、ガス、注射用または点滴用の滅菌溶液またはその他の液体、経皮パッチ、頬パッチ、挿入剤または埋め込み剤、直腸坐剤、膣坐剤、クリーム、ローション、油類、軟膏、局所被覆剤（例えば、創傷被覆剤および包帯）、懸濁液、乳剤、脂質小胞など。

治療レジメンとしては、単回投与または、１週間、２週間、数週間、１か月、２か月、数か月、１年またはより長くを含み、対象の残りの生涯にわたる投与を含む、２日以上続く一連の投与が挙げられる。レジメンは、例えば、複数回投与／日、１回投与／日または１回投与／週、または１時間、数時間、丸１日またそれより長い期間継続する長時間点滴投与を含み得る。

好適な投与形態は、患者、治療する病状、および治療病態の重症度に応じて、治療医により決定されてよい。そのような投与形態は、所望の結果を生じる任意の量、投与の形態、または投与レジメンを含む。投与毎の投与量は、医師により決定される任意の量を含み、治療対象の体重、対象の状態と健康、投与経路、治療または予防する病態などに依存する。。

一般に、大部分の対象にとっては、約０．０１ｎｍｏｌ／時間～約１０ｎｍｏｌ／時間の範囲の用量が、好適であり、好ましくは約０．１ｎｍｏｌ／時間～約５ｎｍｏｌ／時間が、有用であり、約１時間～約７２時間、または約２４時間～約４８時間にわたり、または複数日、複数週間、またはそれを超える期間にわたり与えられることが意図される。この用量は、毎週、毎日、または複数回／日、あるいは連続点滴、経皮製剤、またはデポー製剤として投与されてよい。

さらに、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０２５ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇの、またはそれより多い単回注射用量が、投与されてよい。あるいは、約０．００２μｍｏｌ／ｋｇ、約０．００４μｍｏｌ／ｋｇ、約０．００８μｍｏｌ／ｋｇ、約０．０１μｍｏｌ／ｋｇ、約０．０２５μｍｏｌ／ｋｇ、約０．５μｍｏｌ／ｋｇ、約０．７５μｍｏｌ／ｋｇ、約１μｍｏｌ／ｋｇ、約２μｍｏｌ／ｋｇ、約５μｍｏｌ／ｋｇ、約８μｍｏｌ／ｋｇ、約１０μｍｏｌ／ｋｇの、またはそれより多い単回注射用量が、投与されてよい。

４：結果のまとめ
ＨＦＤ（欧米型の高脂肪食餌、６０％キロカロリーの脂肪）を給餌した肝キスペプチン受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）ノックアウトマウスは、食物摂取には変化がないにもかかわらず、ＨＦＤでの同腹仔対照と比較した場合、体重、肝脂肪症におけるより大きな増加、上昇された肝臓トリグリセリド、並びに血中トリグリセリドおよびＡＬＴ（脂肪肝の臨床マーカー）のより高いレベルを有した。これは、ＮＡＦＬＤおよび他の脂肪肝病態の病因におけるキスペプチン／Ｋｉｓｓ１Ｒ経路の病理学的役割を示唆する。

肝Ｋｉｓｓ１Ｒノックアウトマウスはまた、対照と比較して（いずれもＨＦＤを給餌）、不耐糖であり、インスリン抵抗性であった。肝ＫＩＳＳ１Ｒノックアウトマウスからの肝臓は、対照と比較して（いずれもＨＦＤを給餌）、ＮＡＳＨ／線維症の生化学マーカー（例えば、ＴＧＦβ、コラーゲン）、および炎症性サイトカイン（インターロイキン類（ＩＬ）－１α、Ｍｉｐ２、ＩＰ１０）において有意な増加を示した。

ＴＡＫ－４４８の皮下投与は、媒体（ＰＢＳ）対照で処置されたマウスと比較して、ＮＡＦＬＤ（脂肪肝または脂肪症）の発症およびそのＮＡＳＨへの進行に対し高脂肪給餌マウスを保護した。

高脂肪給餌マウスへの１か月間のＴＡＫ－４４８の投与は、肝臓トリグリセリドの蓄積、および血液中のトリグリセリド類、遊離脂肪酸およびグリセロール（トリグリセリド構成要素）の上昇を抑えた。これらの変化は、ＮＡＦＬＤを発症したＨＦＤでの媒体処置対照と比較して、食物摂取における変化なしに起こった。

ＴＡＫ－４４８処置はまた、末梢における脂肪蓄積およびインスリン抵抗性を防ぎ、かつ炎症および線維症（ＮＡＳＨの特徴）を制御する主要遺伝子の発現を低下させることによりＮＡＳＨの発症を防いだ。

５：実施例
本発明は、記載の特定プロセス、組成物、または方法論のみに限定されるものではなく、これらは変わり得る。本明細書に記載され用いられる専門用語は、特定形態または実施態様を説明する目的においてのみ使用され、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明は付属の特許請求の範囲によってのみ規定される。本明細書に記載する方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施態様の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、デバイス、および材料をここで説明する。本明細書中で言及される公開物はいずれも、その全体が参照として本明細書に組み入れられる；本明細書中のいかなる箇所も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。

実施例１：方法と材料
Ａ：動物
動物実験は、ラトガース大学にて施設内動物実験倫理委員会により規定された指針により承認された。Ｋｉｓｓ１ｒ Ａｌｂ－Ｃｒｅノックアウトマウスを、オスのＡｌｂ－Ｃｒｅ＋／－とメスのＫｉｓｓ１ｒ ｒｆ／ｆ１を掛け合わせることにより作成した。Ａｌｂ－Ｃｒｅマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標）から購入した。Ｋｉｓｓ１ｒ ｆ１／ｆ１マウスを、公知の方法にしたがって作成した。Ｆ１の作成は、Ｋｉｓｓ１ ＡｌｂＣｒｅ＋／－またはＫｉｓｓ１ｒ ｆ１／＋、ＡｌｂＣｒｅ－／－であった。Ｋｉｓｓ１ｒ ｆ１／＋、ＡｌｂＣｒｅ＋／－をＫｉｓｓ１ｒ ｆ１／ｆ１に戻し交配して、Ｋｉｓｓ１ｒ ｆ１／ｆ１、ＡｌｂＣｒｅ＋／－（肝臓ノックアウト：ＬＫＯ）およびＫｉｓｓ１ｒ ｆ１／ｆ１（同腹仔対照）を作成した。マウスを、１２時間の明暗サイクルで維持された無菌障壁施設にて飼育した。

４週齢オスのＬＫＯおよび対照マウスに、高脂肪食餌（ＨＦＤ：６０％キロカロリーの脂肪、０．２７９６％コレステロール、炭水化物由来の２０％カロリー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ（登録商標）カタログ番号Ｄ１２４９２、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）または通常の対照固形餌（ＲＤ）を給餌した。マウスを、群飼育し、餌および水を不断で与えた。所定の食餌を開始してから５か月後に、耐糖能試験を実施し、続いて１週間後にインスリン耐性試験を行った。全体重を、所定の食餌を開始してから２０週間にわたり、毎週測定し、その後動物を安楽死させた。

Ｂ：ＫＰ類似体ＴＡＫ－４４８の投与
オスのＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（４週齢）を、６週間、ＨＦＤまたはＲＤで維持した後、空腹時血糖値を、測定した。ＴＡＫ－４４８またはＰＢＳ（媒体対照）を含むＡｚｌｅｔ（登録商標）小型浸透圧ポンプモデル２００４（０．３ｎｍｏｌ／時間）を、公知の方法にしたがいマウスの脇腹に皮下で挿入した。動物を、特段に明記されない限り４週間処置しＲＤまたはＨＦＤで維持した（全体で１０週間）。

Ｃ：代謝試験
血糖値測定を、血糖値測定器（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｎｔｏｕｒ（登録商標））を用いて外側尾静脈の部位の小さな切り傷から行った。耐糖能試験では、マウスを１２時間の絶食させ、その後Ｄ－グルコース（１ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。インスリン耐性試験では、マウスを６時間絶食させ、その後インスリン（０．５Ｕ／ｋｇ；Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ（登録商標））を腹腔内注射した。

Ｄ：代謝ケージ評価法
マウスを、明暗制御と給餌を備えた８チャンバー臨床実験動物モニターシステム（ＣＬＡＭＳ）で個別に飼育した。二酸化炭素排出、酸素吸収、呼吸商（ＲＥＲ）、歩行運動、および食餌量を、４日間にわたり測定した。
Ｅ：インスリン、グリセロール、トリグリセリド類、ＡＬＴ、ＦＦＡ、およびコレステロールの測定

血清インスリンレベルを、超高感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ（登録商標））を用いて測定した。血清グリセロールレベルを、グリセロール測定キット（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を用いて測定した。肝トリグリセリド類を、トリグリセリド定量キット（ＭＢＬ（登録商標）、国際カタログ番号ＪＭ－Ｋ６２２－５００）を用いて測定した。遊離脂肪酸を、遊離脂肪酸定量キット（Ｓｉｇｍａ（登録商標）、ＭＡＫ０４４－１ＫＴ）を用いて測定した。ＡＬＴレベルを、製造元の指示にしたがいＬｉｑｕｉｄ ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）試薬セットを用いて測定した；コレステロールレベルを、製造元の指示にしたがいコレステロールセットを用いて測定した。

Ｆ：免疫ブロットアッセイ
免疫アッセイを、公知の方法にしたがって実施した。マウスの肝臓組織または初代肝細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液中でホモジナイズし４℃で遠心分離した；溶解物中の蛋白質発現を、ウエスタンブロットにより分析した。蛋白質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分離し、以下の抗体を用いて調べた：
Ａｂｅａｍ（登録商標）（ウサギ抗ＫＩＳＳ１Ｒ １：１０００；ウサギ抗ＭＯＧＡＴ１、１：１０００）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）（ウサギ抗ｐＡＭＰＫ、ウサギ抗ＡＭＰＫ、ウサギ抗ｐＡＣＣ、ウサギ抗ＦＡＳＮ、ウサギ抗ＰＰＡＲ－γ、ウサギ抗ＣＤ３６、およびウサギ抗ＧＹＫ；いずれも１：１０００）、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標）（ウサギ抗ＫＩＳＳ１、１：７５０）。マウス抗βアクチン（１：５０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））または抗ビンキュリン （１：１０００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））を、添加量対照として用いた。蛋白質を次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ウサギ２次抗体（１：２５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））またはマウス２次抗体（１：２５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））と１時間インキュベートした。ブロットを、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（登録商標）タッチイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を用いる化学発光により可視化した。蛋白質レベルを、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウエア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））を用いて定量した。

Ｇ：定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ法を用いて細胞から抽出した。逆転写を、ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））を用い製造元の指示にしたがい行った。遺伝子発現を、下の表７に示すプライマーを用いて以前に記載されたように、ＳＹＢＲグリーン・リアルタイムｑＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を用いて決定した。以下のプライマーを、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）（検証済みＰＣＲＰｒｉｍｅ（登録商標）プライマー）から購入した：
Ｓｒｅｂｐ１、Ａｑｐ３、Ａｑｐ９、Ｇｐａｔ２、Ａｇｐａｔ２、Ｄｇａｔ１、Ｄｇａｔ２、Ｍｏｇａｔ１、Ｓｌｃ２ａ２、Ｄｇｋｇ、Ｄｇｋｈ、Ｌｇｐａｔ１、Ｓｏｄ１、Ｓｏｄ２、Ｇｓｓ、Ｕｃｐ２、およびＧｐａｍ。Ｉｌ－１３を、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）（ＱＴ０００９９５５４）から購入した。Ｓｒｅｂｆ１、Ａｑｐ３、Ａｑｐ９、Ｇｐａｔ２、Ａｇｐａｔ２、Ｄｇａｔ１、Ｄｇａｔ２、Ｍｏｇａｔ１、Ｓｌｃ２ａ２、Ｌｇｐａｔ１、Ｓｏｄ１、Ｓｏｄ２、Ｇｓｓ、Ｕｃｐ２、およびＧｐａｍのプライマーは、既製品であり、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）から購入した。

Ｈ：組織学的分析
肝臓組織を、マウスを安楽死させた後に１０％中性ホルマリンで直ぐに固定した。組織を、ラトガース大学で病理実験サービス部門により組織学用に処理した。肝臓を、５μｍ厚の切片に切り出し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。切片を、組織病理学的変化について光学顕微鏡法で調べた。

Ｉ：液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）による代謝分析。
ＬＣ－ＭＳによる血清および肝臓の代謝分析を、公知の方法にしたがって実施した。細胞代謝産物のＬＣ－ＭＳ分析を、親水性相互作用クロマトグラフィーを備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））で実施した。データを、各標識同位元素（質量精度窓：５ｐｐｍ）につきＭＡＶＥＮソフトウエアを用いて取得した。標識同位体の天然存在率および不純物を、ＲでコードされたＡｃｃｕＣｏｒパッケージを用いて補正した。

Ｊ：初代マウス肝細胞試験
マウス由来の初代肝細胞を、公知の方法にしたがって単離した。マウス（野生型、Ｃ５７ＢＬ６）またはＬＫＯおよび同腹仔対照を、ケタミン／キシラジン混合物（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ（登録商標））を用いて麻酔した。肝臓に肝門脈経由でカニューレを挿入し、まずＥＧＴＡを含むクレブスリンゲル溶液で３７℃１０分間の灌流を行った。第１の洗浄の後に、ＣａＣｌ２およびＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））を含む第２のクレブスリンゲル溶液を、肝臓が完全に灌流されるまで用いた。肝細胞を、ガーゼメッシュにより濾過し、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ（登録商標））、２００ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））、５ｍＭのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））を含むウイリアム培地Ｅ（Ｓｉｇｍａ（登録商標））に再懸濁した。細胞を、コラーゲンでコーティングした６穴プレート（Ｓｉｇｍａ（登録商標））に３ｘ１０^５の密度で播種した。肝細胞を、回復のために一晩静置し、次いで実験前に３時間、血清飢餓状態にした。遊離脂肪酸（ＦＦＡ）負荷のために、１５０μＭオレイン酸および１５０μＭパルミチン酸を、２％ＢＳＡ（０．３ｍＭ）と共役させた。細胞に、単離後ＦＦＡを負荷し、血清飢餓前に細胞を一晩回復させてから、ＫＰ－１０またはＴＡＫで処理した。

Ｋ：ヒト肝細胞ＨｅｐａＲＧ細胞
ヒト肝ＨｅｐａＲＧ細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）から購入した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、５マイクログラム／ｍＬのインスリン（ヒューマリンＲ）、５０およびマイクロモルのヒドロコルチゾンヘミコハク酸を含むウイリアム培地Ｅ中で、コンフルエントへと増殖させた。コンフルエント細胞を、２週間２％ＤＭＳＯを含む増殖培地を補充することにより、分化させて、肝細胞様前駆細胞および肝前駆細胞の両方を含むコンフルエント分化培養物を取得し、その後細胞を、継代し実験に用いた。

Ｌ：トリグリセリド合成
遊離脂肪酸（１５０μＭオレイン酸および１５０μＭパルミチン酸）を、２％ＢＳＡ（０．３ｍＭ）と共役させた。細胞に、単離後ＦＦＡを負荷し、細胞を血清飢餓前に一晩回復させてから、ＫＰ－１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））またはＴＡＫ－４４８（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標））で処理した。ＴＧを、トリグリセリド定量キット（ＭＢＬ（登録商標）、国際カタログ番号ＪＭ－Ｋ６２２－５００）を用いて測定した。

Ｍ：免疫蛍光
免疫蛍光試験のために、細胞を、ホルマリンで固定し、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘで透過性処理し、記載されるように染色した。細胞を、ＫＩＳＳ１抗体（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、１：２５０）とインキュベートし、次いでヤギ抗ウサギ－ＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）；１：４００）とインキュベートした。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）；１：１００００）で染色した。画像を、Ｚｅｉｓｓ（登録商標）ＬＳＭ７００レーザー走査顕微鏡を用いて取得した。

Ｎ：患者の血液収集と血漿キスペプチン測定
試験は、ラトガース大学で施設内倫理委員会により承認され、治験参加者全員（男性）は書面による同意を提出した。グルコース代謝または脂質代謝に影響を与え得る慢性病態（活動性悪性腫瘍、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール依存症、慢性膵臓炎、活性ウイルス／細菌感染、重度の心不全または呼吸器不全を含む）を有する個体を除外した。健常対象および脂肪肝（ＮＡＦＬＤ、Ｎ＝１６）またはＮＡＳＨ（Ｎ＝８）を有する患者における、血漿ＫＰ免疫反応性を、決定した。ＮＡＦＬＤ診断は、肝臓疾患の他の原因が存在しない場合のＡＳＴおよびＡＬＴレベルの上昇ならびに超音波エコーで肝脂肪症の存在に基づいた。ＮＡＳＨ診断は、大滴性脂肪化脂肪症、小葉および門脈の炎症ならびに線維症を検出する組織学的分析に基づいた。簡単に説明すれば、血液（５ｍＬ）を、ロバートウッドジョンソン医科大学（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）にて専門分科クリニックからの参加対象から、ＢＤバキュテイナＫ２ ＥＤＴＡ採血管（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に採取した。血液を、１２１０ｘｇで１０分間遠心分離し、血漿を、保存のために直ぐに凍結した。血漿ＫＰ免疫反応性を、市販のキスペプチンＥＬＩＳＡを用いて測定した。

Ｏ：免疫組織化学
マウスの肝臓を、ラトガース大学で病理実験サービス部門により組織学用に処理した。オイルレッドＯ染色を、中性脂肪を検出するために、凍結肝臓組織のクリオスタット切片で行った。健常ヒト肝臓のパラフィン切片を、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）社（ＭＤ、米国）から購入した。ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ患者からのパラフィン切片を、診断が病理医により確認された後にロバートウッドジョンソン医科大学病院病理検査室で寄託されていた肝臓組織から取得した。脱パラフィンおよび加熱により誘導される抗原回復後に、スライドを、ウサギポリクローナル抗ＧＰＲ５４（Ａｂｅａｍ（登録商標）、ａｂｌ３７４８３；１：１０００）とインキュベートし、次いで、ＩｍｍＰＲＥＳＳ（登録商標）ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧ（ペルオキシダーゼ）ポリマー検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標））を用いた。

Ｐ：酸素消費速度（ＯＣＲ）
ＯＣＲを、単離初代マウス肝細胞およびヒト肝ＨｅｐａＲＧ細胞ならびにＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）の細胞外フラックスアナライザー（ＸＦｅ２４）を用い製造元のプロトコルにしたがって測定した。簡単に説明すると、細胞を、５００μＬのウイリアム培地Ｅ（１０％ＦＢＳ、２００ｎＭデキサメタゾン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および２ｍＭグルタミン）中でＸＦ２４プレートに２ｘ１０^４細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で、１００μＭ ＢＳＡ－ＰＡＬまたはＢＳＡ＋／－ＴＡＫ－４４８（３ｎＭ）と一晩プレインキュベートした。細胞を、アッセイの前に、１時間、血清飢餓状態にした。基礎ＯＣＲ測定を、０．５ｍＭグルコースおよび０．５ｍＭ Ｌ－カルニチンを含むＳｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）ＸＦ培地中で行い、ＴＡＫ－４４８（３ｎＭ）またはＰＢＳで処理した。結果を、Ｗａｖｅソフトウエアを用いて分析した（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

Ｑ：統計分析
２群間の統計的有意性を、対応のない両側スチューデントｔ検定で評価した。複数群間の比較のために、一元配置分散分析の後に、ダネットの多重比較検定を用いた。Ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であるとみなす。グラフを、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍバージョン８．３．１（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて作成した。

実施例２：初期試験；キスペプチン類似体（ＴＡＫ－４４８）投与はＮＡＦＬＤの高脂肪食餌誘導性前臨床マウスモデルにおいてＮＡＦＬＤ（脂肪肝およびそのＮＡＳＨへの進行）を防ぎかつインスリン抵抗性の発現を予防する
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高脂肪食餌（ＨＦＤ）、あるいは対照に通常食（ＲＤ）を１２週間与えた（４～５匹／群）。ＴＡＫ－４４８（ＴＡＫ）または媒体（Ｖｅｈすなわち、ＰＢＳ対照）を、皮下埋め込みＡＬＺＥＴ小型浸透圧ポンプを用いて４週間投与した。結果については、図１を参照のこと。脂肪症が、対照肝臓において、ヘマトキシリン－エオシン染色したマウス肝臓により（脂質蓄積、白い小型液滴、矢じり）、脂質のオイルレッドＯ染色により（灰色の点）示される（図１Ａ）。これは、ＴＡＫ－４４８処置群（図１Ａ）において防止された。図１Ｂ～図１Ｇは、それぞれ、終点肝臓トリグリセリド（ＴＧ）、終点血中ＴＧ、血中遊離脂肪酸、血中グリセロール、体重、精巣上体白色脂肪組織への脂肪蓄積、および鼠径部白色脂肪組織への脂肪蓄積を示し、ＴＡＫ－４４８投与により、それらはすべて減少する。ＴＡＫ－４４８処置は、それぞれ、耐糖能試験（ＧＴＴ）またはインスリン耐性試験（ＩＴＴ）により測定されるように、空腹時血糖（肝臓による糖新生の測定）の上昇を防ぎ、かつ不耐糖およびインスリン抵抗性を防いだ。図１Ｈ～図１Ｊ（黒丸）とそれに対する対照（白抜きの丸）を参照のこと。＊、ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析およびダネットの事後検定。ＴＡＫ－４４８は、（１）ＮＡＦＬＤ患者（ＩＩ型糖尿病を有する／有しない）および（２）ＮＡＳＨ患者における疾患の進行を遅延させる、または防止するために投与され得る。

実施例３：ＴＡＫ－４４８処置は、ＮＡＦＬＤのマウスモデルにおいて食物摂取を変化させない
ＮＡＦＬＤの発症に対する、ＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達増強の効果を決定するために、野生型Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス（４週齢）に６週間ＲＤまたはＨＦＤのいずれかを給餌した。ＨＦＤでの野生型マウスは、体重が増加し（図２Ａ）、インスリン抵抗性を発現し、ＴＡＫ－４４８投与前に空腹時血糖値の上昇をもたらした（糖尿病；図２Ｂ）。マウス（同じような体重の同腹仔）に次いで、媒体（ＰＢＳ）またはＫＰ類似体（ＴＡＫ、０．３ｎｍｏｌ／時間）を点滴し、さらに４週間ＲＤ／ＨＦＤで維持した。予想通り、ＨＦＤ対照（ＶＥＨ）マウスは、ＲＤ（ＶＥＨ）対照マウス（図１Ｅ）に比較して、有意に高い体重を有した。しかし、ＨＦＤマウスの間で、ＴＡＫ処置マウスは、ＶＥＨ（媒体）対照よりも有意に低い体重かつ媒体群対照（図１Ｅ）に比較して低い空腹時血糖値を有した；これらの変化は、食物摂取の変化なしに起こった（図２Ｃ）。これらの表現型に合致して、ＨＦＤ給餌ＴＡＫ処置マウスは、ＨＦＤ対照に比較して、耐糖性（図１Ｉ）かつインスリン感受性（図１Ｊ）であった。

実施例４：キスペプチン類似体（ＴＡＫ－４４８）処置は、ＮＡＦＬＤの高脂肪食餌（ＨＦＤ）誘導性前臨床マウスモデルにおいて、肝酵素（ＡＬＴ）および血液循環トリグリセリドおよび遊離脂肪酸のレベルを低下させ、かつ白色脂肪組織量を減少させる。
肝臓のトリグリセリド蓄積およびグルコース恒常性に対するその顕著な効果に加えて、高脂肪給餌マウスにおけるＴＡＫ－４４８処置はまた、脂肪肝疾患の臨床マーカーであるＡＬＴの上昇（図３Ａを参照のこと）を防ぎ、かつ血中のコレステロール（図３Ｂを参照のこと）およびグリセロール（図３Ｃを参照のこと）を低下させた。ＣＬＡＭＳ分析は、処置マウスと未処置マウスの間で、エネルギー産生または呼吸商（ＲＥＲ）に差がないことをさらに明らかにした（図４Ａおよび図４Ｂ）。

機構的には、ＨＦＤ条件下でのＴＡＫ処置は、ＴＧ合成および脂肪合成の主要制御因子（ＰＰＡＲγ、ＣＤ３６およびＭＯＧＡＴ１など）の肝発現を有意に低下させた（図５Ａ；図５Ｂ；図６Ａ；図６Ｂ；図６Ｃ）。さらに、ＴＡＫ処置は、肝臓においてＡＭＰＫのリン酸化を誘導し（図７；図８Ａ）；それは、活性化時にＰＰＡＲγの転写を阻害する。ＡＭＰＫ活性化はまた、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ （ＧＰＡＴ）活性の急性阻害により、およびＳＲＥＢＰ１の転写を負に制御することにより、脂質合成を阻害する。Ｇｐａｍ（ＧＰＡＴをコードする）の発現は、ＴＡＫ処置肝臓で有意に減少され（図５Ａ）、これは、ＧＰＡＴ活性の低下をもたらし得る。Ｓｒｅｂｆ１の低下は有意ではなかったが、その下流標的Ｆａｓｎにおいて有意な低下があった（図５Ｂ；図８Ｂ）。ＴＡＫ処置は、脂質生成の重要な制御因子であるＬｆａｂｐ１およびＧｙｋ１の発現を低下させた（図５Ａ）。

最後に、ＴＡＫ処置肝臓は、炎症性遺伝子（Ｉｐ１０、Ｍｃｐ１；図９Ａ）のより低いレベル、線維症マーカー（Ｃｏｌａ２、Ａｃｔａ２；図９Ｂ）および酸化ストレスマーカー（Ｕｃｐ２、Ｇｓｓ；図９Ｂ）の低下されたレベルを有した。全体的に、これらのデータは、インビボＴＡＫ処置が、ＡＭＰＫ活性化を介して脂質合成を下方制御することにより脂肪症を防ぎ、これがＮＡＦＬＤの発症を軽減させることをが示唆する。

ＡＣＣのリン酸化は、その活性を低下させ、それによりデノボ脂質生成を阻害する（図３１Ｂ；図３２Ｂを参照のこと）。ＲＤ給餌の肝臓ＫＩＳＳ１Ｒノックアウト（ＬＫＯ）マウスから単離した肝細胞は、ＣＤ３６、ＦＡＳ、ＰＰＡＲγ、およびＭＯＧＡＴ１のレベル上昇を示した（図３３Ａ、図３３Ｂ；図３４Ａ～図３４Ｄを参照のこと）。まとめると、これらのデータに基づき、ＫＩＳＳ１Ｒの活性化は、ＡＭＰＫを活性化することにより肝脂肪量を負に制御し、これは次いで、ＰＰＡＲγ（トリグリセリド合成の主要制御因子）およびその下流のシグナル伝達経路を阻害することに加えて、デノボ脂質生成を阻害することが、示唆される（図４０を参照のこと）。

図４０は、それによりＫＩＳＳ１Ｒ活性化がＮＡＳＨへの進行を阻害するシグナル伝達経路を示す最新の作業モデルである（破線矢印を参照のこと）。キスペプチン（ＫＰ）類似体（ＴＡＫ－４４８）によるＫＩＳＳ１Ｒの活性化は、マスターエネルギーセンサー（ＡＭＰＫ）を活性化し、それをリン酸化する。活性化されたＡＭＰＫは次いで、その下流標的酵ＡＣＣをリン酸化することによって、脂質生成（脂肪形成）を阻害し、その阻害をもたらし、それにより脂質生成を阻害する。これはまた、ミトコンドリアで脂肪酸のベータ酸化を促進する主要酵素であるＣＰＴ１の活性化をもたらし、脂肪分解をもたらす。さらに、ＡＭＰＫの活性化は、ＴＧ合成経路において多くの酵素を発現制御する転写因子ＰＰＡＲ－γの活性と発現を低下させることにより、トリグリセリド（ＴＧ）合成を阻害する。全体的に、これは、肝臓における脂肪蓄積減少をもたらし、したがってＮＡＦＬＤおよびそのＮＡＳＨおよび線維症への進行を阻害する。

実施例５：ＴＡＫ－４４８投与は、肝臓のトリグリセリド合成およびデノボ脂質生成に関する主要制御因子の発現を阻害した
図１０は、ｑＰＣＲ分析による表示される遺伝子（トリグリセリド合成および脂肪形成（脂質生成）の制御因子）の発現に関するデータを表している。＊ｐ＜０．０５、対照との比較；対応のないスチューデントｔ検定。これらのデータは、ＴＡＫ－４４８処置が肝臓のトリグリセリド（ＴＧ）合成およびデノボ脂質生成の主要制御因子の発現を低下させることを示す。各遺伝子について、発現における有意な減少があり（どの遺伝子であるのか、それらが何に関与するのか）、そのためＴＡＫ－４４８処置は、患者の肝臓脂肪を減らすために用いられ得る。

実施例６：ＴＡＫ－４４８投与は、肝臓の炎症の主要制御因子の発現を阻害した
炎症の制御における表示される主要遺伝子（マクロファージ炎症性蛋白質（Ｍｉｐ２）、ケモカイン、インターフェロンγ誘導性蛋白質１０（Ｉｐ１０）、インターロイキン１アルファ（Ｉｌ１ａ）、炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α（Ｔｎｆａ）、単球化学誘引蛋白質（Ｍｃｐ１）、およびインターロイキン１α（Ｉｌ１ａ）および１β（Ｉｌ１ｂ））の発現を、ｑＰＣＲ分析により調べ、結果を図１１に示す。＊ｐ＜０．０５、対照との比較；対応のないスチューデントｔ検定。この結果は、ＴＡＫ－４４８処置が肝臓の炎症のこれらの主要制御因子の発現を低下させることを示す。

実施例７：ＴＡＫ－４４８投与は、肝線維症の主要制御因子の発現を阻害した
ｑＰＣＲ分析による線維症を制御する表示される遺伝子（コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ２）、平滑筋アクチン（Ａｃｔａ２）および形質転換増殖因子β（ＴＧＦｂ））の発現を、図１２に示す。＊ｐ＜０．０５、対照との比較；対応のないスチューデントｔ検定。結果は、このキスペプチン類似体が肝線維症の主要制御因子の発現を低下させることを示す。

実施例８：ＴＡＫ－４４８投与は、脂肪のミトコンドリアでのおよびペルオキシソームでのベータ酸化を制御する遺伝子の発現を増加させた
ＴＡＫ－４４８処置は、ミトコンドリアの脂肪酸輸送の律速酵素であるＣｐｔ１ａおよびＣｐｔ２の発現を増加させ、かつ脂肪酸のペルオキシソーム内β酸化の律速段階を制御するアシル補酵素Ａ酸化酵素（ＡＯＸ）の発現もまた増加させた。＊ｐ＜０．０５、対照との比較；対応のないスチューデントｔ検定。図１３を参照のこと；これは、ｑＰＣＲ分析による表示される遺伝子の発現を示す。まとめると、ＴＡＫ－４４８（キスペプチン類似体）処置は、脂肪のミトコンドリアでのおよびペルオキシソームでのベータ酸化を制御する肝臓遺伝子の発現を増加させ、これは、脂肪の分解の増加をもたらす。

実施例９：Ｋｉｓｓ１ｒの肝ノックアウト（ＫＯ）は、ＮＡＦＬＤのマウスモデルにおいて、体重増加、肝脂肪症および脂質蓄積を促進する
肝Ｋｉｓｓ１ｒ ＫＯ（ＬＫＯ）を、Ｋｉｓｓ１ｒ ｆ１／ｆ１マウスをＡｌｂ－Ｃｒｅマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ（登録商標））と交配することにより作成した。同腹仔対照（Ｋｉｓｓ１ｒ ｆ１／ｆ１）およびＫｉｓｓ１ｒ ＫＯマウス（３週齢、１０匹／群）に、２０週間にわたり通常食（ＲＤ）または高脂肪食（ＨＦＤ）を給餌した。ＬＫＯマウスは、食物摂取に変化がなかったにもかかわらず（図１４）、有意な体重増加を有した（図１４Ａ～図１４Ｃ）。ヘマトキシリン－エオジン染色したマウス肝臓は、対照と比較して（すべてＨＦＤを給餌）、ＬＫＯ肝臓で脂肪症の著しい増加を示した（図１５Ａ）。対照的に、脂肪症は、ＲＤを給餌した動物の肝臓では認められなかった（図１５Ｂを参照のこと；健康な肝臓を示す）。四角で囲んだ領域の拡大像を、下に示す（図１５Ｂ）。図１６は、やはりＨＦＤでの対照（ＣＴＲＬ）と比較して、ＬＫＯ（ＨＦＤ）マウスでの肝臓トリグリセリドの上昇を示す。＊、ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析およびダネットの事後検定。

実施例１０：ＮＡＦＬＤの制御における肝ＫＩＳＳ１Ｒの役割を決定するための、肝Ｋｉｓｓ１Ｒノックアウトの作成
Ａ：肝ＫＩＳＳ１Ｒ欠損は、肥満のインスリン抵抗性マウスにおいて肝脂肪症を増悪させる
肝ＫＩＳＳ１／ＫＩＳＳ１ＲがＮＡＦＬＤの発症に関与するか否かを調べるために、肝臓のＫｉｓｓ１／Ｋｉｓｓ１ｒの発現を、ＮＡＦＬＤの食餌誘導性マウスモデルで評価した。４週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに８週間高脂肪食（ＨＦＤ）を給餌した後、Ｋｉｓｓ１およびＫｉｓｓ１ｒのｍＲＮＡレベルは、肝臓において有意に増加した。図１７を参照のこと；それは、８週間にわたる通常食（ＲＤ）または高脂肪食（ＨＦＤ）でのＣ５７ＢＬ６オスのマウスにおける、Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡ発現に正規化されたＲＴ－ｑＰＣＲによるＫｉｓｓ１およびＫｉｓｓ１ｒの相対的ｍＲＮＡ発現を示す。このように、高脂肪食餌（ＨＦＤ）は、キスペプチン（ＫＩＳＳ１）の発現およびキスペプチン受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）の遺伝子発現を誘導する。

次に、肝脂質代謝の制御におけるＫＩＳＳ１Ｒの役割を調べるために、Ｋｉｓｓ１ｒの肝臓特異的ノックアウト（ＬＫＯ）を作成した。ＬＫＯマウスの分析は、Ｋｉｓｓ１ではなく、Ｋｉｓｓ１ｒの発現が有意に低下されたことを示した。図１８Ａを参照のこと。ＬＫＯマウスおよびその同腹仔対照に次いで、対照通常食（ＲＤ）またはＨＦＤを給餌した。ＲＤを給餌したＬＫＯおよび対照マウスは、体重における差異を示さなかった（図１８Ｂ）。ＲＥＲ（呼吸交換率）および歩行活動における差は、群間で認められなかった（図１８Ｃおよび図１８Ｄを参照のこと）。

興味深いことに、高脂肪給餌のＬＫＯマウスは、対照と比較して、より低い熱発生（低代謝を表す）を示した（図１９Ａ；ＣＬＡＭＳで評価された熱発生）。血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）（脂肪肝疾患の臨床マーカー）のレベルは、ＲＤと比較して両方のＨＦＤ群で上昇しており、ＨＦＤ誘導性肝細胞傷害を示唆する（図１９Ｂ）。

ＬＫＯマウスはまた、筋肉量の減少（図２０Ａ（腓腹筋）および図２０Ｂ（前脛骨筋））を示し、ＨＦＤを給餌した対照と比較して精巣上体の白色脂肪組織には変化が認められなかったが、鼠径部における白色脂肪組織の増加を示した（図２０Ｃおよび図２０Ｄを参照のこと）。ＬＫＯ ＨＦＤマウスにおける肝臓ＴＧの増加は、肝ＫＩＳＳ１Ｒが脂肪症に対し肝臓において保護的機能を果たすことを示唆する。

Ｂ：肝ＫＩＳＳ１Ｒ欠損は、脂質生成および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）取り込みを制御する遺伝子を上方制御する
ＬＫＯマウスにおける肝脂質蓄積の機序を解明するために、脂肪酸取り込みの肝制御因子（脂肪酸トランスロカーゼ、分化クラスター（Ｃｄ３６）、肝脂肪酸結合蛋白質、（Ｌｆａｂｐ１））、および脂質生成の肝制御因子（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ；Ｐｐａｒｇによってコードされる）、ステロール制御性要素結合蛋白質１（ＳＲＥＢＰ１；Ｓｒｅｂｆ１によってコードされる）およびその下流の標的脂肪酸合成（ＦＡＳ；Ｆａｓｎによってコードされる））のレベルを測定した。ＨＦＤ条件下では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１（ＡＣＣ１；デノボ脂肪酸合成の最初の過程を触媒する）をコードするＡｃａｃａ（増加したが有意ではなかった）を除き、脂肪形成を制御する主要な遺伝子（図２１Ａ；Ｒｐｌ１３ａ ｍＲＮＡの発現に対し正規化された、肝臓試料（ＨＦＤ）における表示される遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現）に有意な増加があった。ＰＰＡＲ－γおよびその下流遺伝子標的ＣＤ３６の蛋白質レベル、ならびにＦＡＳのレベルもまた、対照と比較してＨＦＤ給餌ＬＫＯ肝臓において有意に高かった（図２１Ａ；図２２Ａ、図２２Ｂ、および図２２Ｃ）。平均値±平均値の標準誤差を示す；対応のないスチューデントｔ検定；＊ｐ＜０．０５、対照群との比較。

さらに、ＬＫＯ肝臓は、ＡＭＰＫのリン酸化の抑制を示した（図２１Ｂ；図２２Ｄ）；ＡＭＰＫは、活性化されると、Ｓｒｅｂｆ１およびその下流の遺伝子標的であるＡｃａｃａおよびＦａｓｎを負に制御することによりデノボ脂質生成を阻害する、蛋白質キナーゼである。

実施例１１：肝Ｋｉｓｓ１Ｒノックアウトは、トリグリセリド合成を制御する遺伝子の増加された発現および増加された肝臓脂肪値を示す
トリグリセリド（ＴＧ）合成は、グリセロール３－リン酸（Ｇ３Ｐ）を必要とし、それは、２種類の方法：（ａ）グリセロールのグリセロールキナーゼ（ＧＹＫ）依存性リン酸化および（ｂ）ジヒドロキシアセトンリン酸のグリセロール３－リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ１）依存性還元、により形成され得る。図２３Ａを参照のこと；肝トリグリセリド（ＴＧ）合成経路を模式的に示す；太字の分子は、ＨＦＤ給餌ＬＫＯおよび対照（ＣＴＲＬ）の肝臓において上方制御される。ＨＦＤ給餌ＬＫＯマウスからの肝臓の分析は、肝臓のＧｙｋ１のｍＲＮＡおよび蛋白質の発現レベルの有意な増加を明らかにした（図２３Ｂ、図２１Ｂ、および図２４）。ＨＦＤでの肝Ｋｉｓｓ１ｒノックアウト（ＬＫＯ）マウスは、トリグリセリド合成を制御する遺伝子の上昇されたレベルを示した（図２３Ｂを参照のこと）。

グリセロールは、主にＡＱＰ３およびＡＱＰ９などのアクアグリセロポリン類（ＡＱＰ）を介して肝臓に入る（図２３Ａを参照のこと）。Ａｑｐ９のｍＲＮＡレベルは、ＬＫＯ ＨＦＤマウス肝臓において有意に上方制御されるが、Ａｑｐ３のレベルは変化しない（図２３Ｂ）。ＴＧ合成の律速段階を触媒するＧＰＡＴ１（Ｇｐａｍによってコードされる）、ＤＡＧをアセチル化してＴＧを生成するジアシルグリセロール（ＤＡＧ）アシルトランスフェラーゼ ２（Ｄｇａｔ２）、およびモノアシルグリセロールをＴＧの直接的前駆体ジアシルグリセロールに変換する（図２３Ｂを参照のこと）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（Ｍｏｇａｔ１）を含む、ＴＧ合成を制御する多くの酵素もまた、ＬＫＯ ＨＦＤ肝臓で上方制御された（図２３Ａを参照のこと；ＨＦＤでのＬＫＯマウスは、トリグリセリド合成を制御する遺伝子の上昇レベルを示すことを示している）。まとめると、これは、ＬＫＯマウスが、ＴＧ合成を制御する遺伝子の上昇したレベルを示したことを示す。

ＨＦＤ条件下のＬＫＯマウスにおいて観察される表現型の差に寄与する代謝的差異を明らかにする目的で、ＬＫＯおよび対照の肝臓の総合的な非標的代謝分析を実施した。これは、ＴＧ、ＤＡＧ、およびホスファチジルコリンを含む各種の脂質類が、ＨＦＤ給餌ＬＫＯ肝臓で有意に上方制御されることを明らかにした（図２５Ａを参照のこと；質量分光法による、ＨＦＤ給餌ＬＫＯマウスにおける、肝臓脂質代謝産物の増加を示すボルケーノプロットである）。同様の知見が、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨに罹患している患者においても得られている。ＬＫＯマウスは、他の変化も示した。これらは、高レベルのセラミド類、ホスファチジルグリセロールおよびカルジオリピン含んだ。ミトコンドリアのリン脂質であるホスファチジルグリセロールは、肝脂肪症を含む複数の代謝性疾患に関与するが、セラミド合成阻害は、肝臓の脂肪症および線維症を軽減することが報告されている。カルジオリピンは、ミトコンドリアの最適機能に必須のリン脂質であり、その変化は複数の組織において、インスリン抵抗性およびＮＡＦＬＤを含むミトコンドリア機能不全の原因となる。

データは、肝ＫＩＳＳ１Ｒの欠損がおそらくはＰＰＡＲγおよびその下流の遺伝子標的の上方制御を介してＨＦＤ給餌下の肝細胞に脂質蓄積の増加をもたらすことを明らかにしたので、これがＲＤ給餌ＬＫＯマウスの肝臓においても起こるかどうかを求めた。興味深いことに、ＲＤで維持されたＬＫＯマウスは、脂肪症発症もＴＧ蓄積も起こさなかった。しかし、Ｐｐａｒｇは、Ｍｏｇａｔ１、Ｃｄ３６、またはＳｒｅｂｆ１の有意な変化なしに有意に上方制御された（図２５Ｂを参照のこと）。このことは、それによりＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達が肝における脂質生成を制御する潜在的機構が、ＰＰＡＲγ制御を介することを示唆する。

実施例１２：肝Ｋｉｓｓ１ｒ ＫＯマウスは不耐糖でありインスリン抵抗性である
インスリン抵抗性はＮＡＦＬＤの発症に重要な役割を担うので、代謝試験を、血糖値に対する肝ＫＩＳＳ１Ｒ欠損の効果を調べるために実施した。結果は、ＨＦＤ対照と比較して、ＨＦＤ給餌ＬＫＯマウスは、糖新生の上昇を示唆する有意に高い空腹時血糖値を有したことを示した（図２６Ａを参照のこと）。それらはまた、不耐糖（図２６Ｂおよび図２６Ｃ）かつインスリン抵抗性であった（図２６Ｄおよび図２６Ｅ）。

さらに、ＬＫＯ ＨＦＤ肝臓において、Ｇ６ｐｃ（糖新生の最終過程でグルコース－６－リン酸をグルコースに変換する）、Ｐｃｋ１（オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸塩に変換する）、およびＳｌｃ２ａ２によってコードされる肝グルコーストランスポーターＧＬＵＴ２などの、糖新生を制御する主要な肝遺伝子の発現が増加した（図２６Ｆ）。

ＮＡＦＬＤは、ＮＡＳＨ（肝臓において炎症、線維症および酸化ストレスの増加に関連する病態）に進行し得る。本発明者らは、ＬＫＯマウスにおいて、２０週間のＨＦＤ後に、サイトカインマクロファージ炎症性蛋白質２（Ｍｉｐ２）、インターロイキン１イソ型であるＩＬ１αおよびＩＬ１β（Ｉｌ１ａおよびＩｌ１ｂによってコードされる）およびケモカインであるインターフェロンγ誘導性蛋白質１０（Ｉｐ１０）および単球誘引蛋白質（Ｍｃｐ１）などのＮＡＦＬＤに関連する炎症を制御する各種遺伝子の上方制御があったことを観察した。図２６Ｇを参照のこと。

ＬＫＯマウスはまた、線維症の初期段階で上方制御される、ＮＡＳＨに関与する遺伝子の上昇を示した。これらの遺伝子は、コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ２）および形質転換増殖因子β（Ｔｇｆｂ１）を含んだ。平滑筋アクチン（Ａｃｔａ２）およびメタロプロテイナーゼ１（Ｔｉｍｐ１）組織阻害因子の増加も観察されたが、これは有意なレベルに達しなかった（図２６Ｈを参照のこと）。さらに、酸化ストレスマーカー（Ｓｏｄ１、Ｓｏｄ２、Ｇｓｓ）の増加も認められた（図２６Ｉを参照のこと）。まとめると、これらの知見は、肝ＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達の欠損は肝臓に有害効果をもたらし、ＮＡＦＬＤ表現型を促進することを示唆する。

実施例１３：ＫＩＳＳ１Ｒノックアウト（ＬＫＯ）は肝臓において選択的である
肝臓で選択的な、ＫＩＳＳ１Ｒノックダウンの特異性を示す、各種臓器におけるＨＦＤ給餌ＣＴＲＬおよびＬＫＯマウスでの、ＲＴ－ｑＰＣＲによる遺伝子の発現（図２７に示される）。＊ｐ＜０．０５、対照との比較；対応のないスチューデントｔ検定。

実施例１４：肝ＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達は、肝臓におけるＰＰＡＲ－γの発現と活性を負に制御する
転写因子ＰＰＡＲ－γは、ＮＡＦＬＤ患者および実験的マウスモデルの脂肪肝において誘導される脂質生成の主要制御因子である。図２８は、ＨＦＤでのＣＴＲＬおよびＬＫＯ マウスの肝臓における上昇されたＰＰＡＲ－γの発現にもかかわらず、阻害的部位（セリン１１２）でのＰＰＡＲ－γの低下されたリン酸化を示す代表的なウエスタンブロットである。図２８Ａを参照のこと。対照的に、図２８Ｂは、ＴＡＫ－４４８の投与が、マウス肝臓でのＰＰＡＲ－γ発現を低下させ、セリン１１２におけるそのリン酸化を誘導し、媒体（ＰＢＳ）処置対照と比較してＰＰＡＲ－γの標的遺伝子であるＭＯＧＡＴ１、ＣＤ３６およびＦＡＳの発現低下を引き起こしたことを示す。図５Ｂを参照のこと。

実施例１５：単離された初代マウス肝細胞：ＴＡＫ－４４８処置は、デノボ脂質生成およびトリグリセリド合成の主要制御因子の発現を阻害することによりトリグリセリド蓄積を直接阻害する
データはＫＩＳＳ１Ｒシグナル伝達が脂肪症をインビボ阻害することを明らかにしたので、肝臓の脂質生成へのＴＡＫ－４４８の直接的効果を、初代マウス肝細胞を用いて調べた。図２９Ａは、初代肝細胞における内因性キスペプチン（ＫＩＳＳ１蛋白質、矢印を参照のこと）免疫染色の代表的な共焦点顕微鏡像を示す。スケールバーは５０μＭである。肝細胞を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）担体に共役させた遊離脂肪酸（ＦＦＡ：１５０μＭパルミチン酸塩および１５０μＭオレイン酸塩）の混合物の存在下または非存在下で培養した。対照マウスから単離したＦＦＡを負荷した肝細胞のＫＰ－１０（１００ｎＭ）またはＴＡＫ－４４８（３ｎＭ）処置は、ＴＧ蓄積を減少させた（図２９Ｂを参照のこと）。しかし、図２９Ｃは、ＴＡＫ－４４８およびＫＰ－１０が、肝ＫＩＳＳ１Ｒノックアウト（ＬＫＯ）マウスから単離した肝細胞ではトリグリセリド蓄積を抑制できなかったことを示す。ＴＡＫ－４４８処置（８時間）はまた、オスのＣ５７ＢＬ６マウスから単離され、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）担体に共役した遊離脂肪酸（ＦＦＡ：１５０μＭパルミチン酸塩および１５０μＭオレイン酸塩）の混合物の存在下または非存在下で培養された初代マウス肝細胞において、デノボ脂質生成およびトリグリセリド（ＴＧ）合成を制御する遺伝子の発現を低下させた（図３０）。８時間のキスペプチン（ＫＰ）処置またはＴＡＫ処置は、デノボ脂肪合成遺伝子の基礎発現を低下させ（図３１Ａ）、かつＡＭＰＫおよびその下流標的ＡＣＣのリン酸化を刺激した（図３１Ｂ）；このことは、ＴＡＫ－４４８処置が単離初代肝細胞においてＡＭＰＫを活性化し、それにより脂肪合成を阻害したことを示している。図３１Ｃは、ＫＩＳＳ１Ｒの発現が、ＬＫＯマウスから単離した初代肝細胞において枯渇されることを示す。図３２も参照のこと；これは、マウス初代肝細胞（ｎ＝４）におけるＡＭＰＫおよびその下流の基質ＡＣＣのリン酸化に対するキスペプチン処置の効果を示す図３１Ｂの代表的なウエスタンブロットのデンシトメトリー分析である。

実施例１６：単離初代マウス肝細胞：ＫＩＳＳ１Ｒノックアウトマウスから単離した肝細胞における、デノボ脂質生成およびトリグリセリド合成の主要制御因子の発現増加
ＫＩＳＳ１Ｒノックアウトマウスから単離した肝細胞は、ＣＤ３６、ＦＡＳ、ＰＰＡＲγ、およびＭＯＧＡＴ１などの、脂肪形成を制御する蛋白質のレベルの上昇を示した（図３３Ａ、図３４Ａ～図３４Ｄを参照のこと；図３３Ａのブロットのデンシトメトリー分析を示すも）。ＫＩＳＳ１Ｒノックアウトマウスから単離した肝細胞はまた、脂肪形成を制御する遺伝子のレベル上昇を示した（図３３Ｂ）。

実施例１７：単離初代マウス肝細胞：ＴＡＫ－４４８処置は、ミトコンドリアにおける遊離脂肪酸のベータ酸化を増加させる
図３５は、ＴＡＫ－４４８（３ｎＭ）またはＣＰＴ１阻害剤であるエトモキシル（ＥＴＯ）の存在下または非存在下において、１００μＭパルミチン酸塩（ＰＡ）またはＢＳＡ媒体対照で処置した肝細胞での酸素消費速度（ＯＣＲ）を示す；ＣＰＴ１は、ミトコンドリアのベータ酸化の主要制御因子である。２．５μＭオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏ）、３μＭカルボニルシアニド－４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）（ミトコンドリアの酸化的リン酸化の脱共役剤）、ならびに２．５μＭロテノンおよび２．５μＭアンチマイシンＡ（Ｒ＋Ａ）（複合体Ｉ阻害剤および複合体ＩＩＩ阻害剤）の逐次処置後のＳｅａｈｏｒｓｅ分析器を用いた代表的なＯＣＲトレースを、図３５Ａに示す。この図は、ＴＡＫ－４４８がミトコンドリアの脂肪酸酸化を増加させる（ＦＡＯ）ことを示している。図３５Ｂは、ＴＡＫ－４４８が基礎呼吸を増加させることを示し；図３５Ｃは、ＴＡＫ－４４８がＡＴＰ産生を増加させることを示している。平均値±平均値の標準誤差を示す。対応のないスチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５、対照との比較；一元配置分散分析後にダネットの事後検定を行った。結果は、ＴＡＫ－４４８（キスペプチン類似体）処置が、単離初代マウス肝細胞において、ミトコンドリアにおける遊離脂肪酸のベータ酸化を直接的に増加させる、すなわち、それらの分解を促進することを示している。

実施例１８：ヒト肝細胞：ＴＡＫ－４４８処置は、ミトコンドリアにおける遊離脂肪酸のベータ酸化を増加させる
図３６Ａは、それぞれ、１μＭオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏ）、１μＭ ＦＣＣＰ、ならびに０．５μＭロテノンおよび０．５μＭアンチマイシンＡ（Ｒ＋Ａ）による逐次処置後の、ヒト肝ＨｅｐａＲＧ細胞での酸素消費速度（ＯＣＲ）のＳｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）分析器によるトレースを示す。細胞を、ＴＡＫ－４４８（３ｎＭ）の存在下または非存在において、１００μＭパルミチン酸塩（ＰＡ）またはＢＳＡで処置した。ＴＡＫ－４４８処置は、ヒト肝細胞における脂肪分解を増加させる。図３６Ｂは、ＴＡＫ－４４８が基礎呼吸を増加させることを示し；図３６Ｃは、ＴＡＫ－４４８がヒト肝細胞におけるＡＴＰ産生を増加させることを示す。平均値±平均値の標準誤差を示す。対応のないスチューデントｔ検定、または一元配置分散分析後のダネットの事後検定；＊ｐ＜０．０５、対照に対する比較。すなわち、これらの結果は、ＴＡＫ－４４８（キスペプチン類似体）処置が、ヒト肝細胞におけるミトコンドリアでの遊離脂肪酸β酸化を増加させることを示している。

実施例１９：ヒト肝星細胞ＬＸ－２細胞：ＴＡＫ－４４８処置は、増殖を阻害し、線維症のマーカーを低下させる
２０万個のＬＸ－２細胞を、各ウェルに播種し、ＴＡＫ－４４８（３ｎＭ）または媒体（ＰＢＳ）で４８時間処置し、その後、血球計数器を用いて計数した。図３７Ａの結果を参照のこと。細胞を、ＴＡＫ－４４８（３ｎＭ）で４８時間処置した。次いで、線維症マーカー（平滑筋アクチン：ＡＣＴＡ、およびコラーゲン：ＣＯＬ１Ａ１）の遺伝子発現変化を、ＲＴ－ｑＰＣＲにより調べた。対応のないスチューデントｔ－検定、＊ｐ＜０．０５；Ｎ＝３。図３７Ｂの結果を参照のこと。これらの結果は、ＴＡＫ－４４８がヒト肝星細胞ＬＸ－２細胞の増殖および線維症遺伝子発現を阻害することを示している。

実施例２０：ヒトＮＡＳＨ生検切片：内因性キスペプチン受容体は肝星細胞に局在する
ヒトＮＡＳＨ生検切片において、内因性キスペプチン受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）および星細胞マーカー（デスミン）の局在を調べた。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）を用いて染色した。左側に見られる免疫細胞の浸潤は、ＫＩＳＳ１Ｒ染色に関して陰性である（図３８Ａを参照のこと；矢印）。ＫＩＳＳ１Ｒがデスミン（肝星細胞の分子マーカー）と共局在を示す領域は、明るい白色に見える（重ね合わせ、図３８Ｄ、矢印）。

実施例２１：ＫＩＳＳ１およびキスペプチン受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）の発現、および血漿キスペプチンのレベルは、ヒトＮＡＦＬＤにおいて増加される
図３９Ａは、患者肝生検におけるＴＢＰに対し正規化された、ＲＴ－ｑＰＣＲによるヒトＫＩＳＳ１およびＫＩＳＳ１Ｒの相対的ｍＲＮＡ発現を示す。ＫＩＳＳ１およびＫＩＳＳ１Ｒ遺伝子発現は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者において上昇される。図３９Ｂは、代表的なウエスタンブロットを示す。平均値±平均値の標準誤差を示す、対応のないスチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５、対照に対する比較。図３９Ｃおよび図３９Ｄは、図３９Ｂからのウエスタンブロットのデンシトメトリー分析である。図３９Ｅは、ウサギポリクローナル抗ヒトＫＩＳＳ１Ｒを用いた、成人肝臓における内因性ヒトＫＩＳＳ１Ｒの発現の免疫染色像からの代表的な結果を示す；スケールバー：８０μｍ。ＫＩＳＳ１Ｒ蛋白質発現は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者からの患者肝生検において上昇される。図３９Ｆは、ヒト対象における放射免疫測定により測定された血漿キスペプチン（ＫＰ）レベル（ｐｍｏｌ／Ｌ；平均値±標準偏差）を示す。キスペプチン（ＫＩＳＳ１）蛋白質発現は、ＮＡＦＬＤ患者の肝臓で上昇される。下の表８は、図３９Ａ、Ｂでの男性対象の臨床的特徴を示す。統計分析を、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定を用いて行った。エラーバー：ＳＤ。血漿キスペプチンは、健常対象の血漿キスペプチンレベルと比較して、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ患者で上昇される。

実施例２２：ＮＡＦＬＤにおけるＴＡＫ－４４８の保護効果の作用機序
これらの知見は、ＴＡＫ－４４８により増強されたＫＩＳＳ１Ｒの活性化は、ＡＭＰＫを活性化することにより肝の脂質含有量を負に制御し、それは次いで、ＰＰＡＲｇおよび、トリグリセリド合成を制御するその下流のシグナル伝達経路を阻害することに加えて、脂質生成を阻害し脂肪酸酸化を増加させることを示唆する（図４０を参照のこと）。これは、脂肪肝（脂肪症）の発生、ならびにそのＮＡＳＨおよび線維症への進行を防ぐ。まとめると、本明細書に提示されるデータは、ＴＡＫ－４４８が、ＡＭＰＫを活性化することおよびミトコンドリアでの脂肪分解（すなわち、脂肪酸酸化）を増加させることにより、脂肪肝の発生ならびにそのＮＡＳＨへの進行を防ぐ、強力なキスペプチン類似体であることを示している。

下に示す参考文献および本明細書中で言及する参考文献は、いずれもその全体が参照として本明細書に組み入れられる。

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１９． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．， １０（１０）： １５４８－１５５６， ２０１１．
２０． Ｐｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌ．， ４６（４）：１０８１－１０９０， ２００７．
２１． Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｈｅｐａｔｏｌ．， ７（４）：７６３－７８１， ２０１９．
２２． Ａｂｄｅｌｍａｌｅｋ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｈｅｐａｔｏ．， １３（ １２）：６８５－６８６， ２０１６．
２３． Ｄｉｅｈｌ ａｎｄ Ｄａｙ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３７７（２１）：２０６３－２０７２， ２０１７．
２４． Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ， ３８４（９９４５）：７６６－７８１， ２０１４．
２５． Ｉｚｚｉ－Ｅｎｇｂｅａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ． Ｍｅｔａｂ．， ２０（１２）：２８００－２８１０， ２０１８．
２６． ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ９９（８）：Ｅ１４４５－Ｅ１４５３， ２０１４．
２７． Ａｓａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５６（２１）：８２９８－８３０７， ２０１３．
２８． Ｐａｒａｄｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｏｘｉｄ． Ｒｅｄｏｘ． Ｓｉｇｎａｌ． ２０（１２）： １９２５－１９５３， ２０１４．
２９． Ｐａｒａｄｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， ２０（３９）： １４２０５－１４２１８， ２０１４．
３０． Ｐｅｔｒｏｓｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １７６７（１０）：１２６０－１２６７， ２００７．
３１． Ｔａｒａｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ．， ９（１）， ２０１９．
３２． Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ２４（７）：９０８－９２２， ２０１８．
３３． Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ５：１００９６， ２０１５．
３４． Ｈａｕｋｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ．， ４４（６）： １１６７－１１７４， ２００６．
３５． Ｍｉｒｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， ２４（５）：４５８－４７１， ２０１８．
３６． Ｓｙｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．， １３（４）：５６５－５８０， ２００９．
３７． Ｒａｋｈｓｈａｎｄｅｈｒｏｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＰＡＲ Ｒｅｓ． ２０１０；２０１０．
３８． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．， ２９１（５）：Ｅ１０７４－１０８２， ２００６．
３９． Ｃａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １５５（８）：３０６５－３０７８， ２０１４．
４０． Ｓｏｚｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ． Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３０１（４）：Ｇ７３９－Ｇ７４７， ２０１１．
４１． Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｍｅｔａｂ．， １３（４）：３７６－３８８， ２０１１．
４２． Ｎａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．， ３１６（４）：Ｅ５７８－Ｅ５８９， ２０１９．
４３． Ｍｕｎｄａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １７５（２）：３３１－３３８， １９９８．
４４． Ｍｉｌｌａｒ ａｎｄ Ｂａｂｗａｈ， Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １０１（３）： １９３－２１０， ２０１５．
４５． Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， １４６（３）：７２６－７３５， ２０１４．
４６． Ｈｗａｈｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌ．， ４９（６）：１９１３－１９２５， ２０１９．
４７． Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．， ３１１（４）：Ｅ７３０－Ｅ７４０， ２０１６．
４８． Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．， ２３（１２）：２００５－２０１２， ２０１１．
４９． Ｗｉｌｌｏｗｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ４７４（１７）：３０５９－３０７３， ２０１７．
５０． Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ．， ６２（４）：５６５－５７８， ２０１０．
５１． Ｂｅｄｏｕｃｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ．， ３５（１）： １７－２３， ２００１．
５２． Ｍｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １４１（１１）：４０２１－４０３１， ２０００．
５３． Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １１１（３６）： １３１６３－１３１６８， ２０１４．
５４． Ｍａｚｚｕｃｏｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ５６（１０）：２４６７－２４７５， ２００７．
５５． Ｌａｓａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｒｅｐ．， ２２（３）：７６０－７７３， ２０１８．
５６． Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １９（４）：４５３－４６１， ２００５．
５７． Ｔｏｎｔｏｎｏｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ９３（２）：２４１－２５２， １９９８．
５８． Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １０９（３４）： １３６５６－１３６６１， ２０１２．
５９． Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ６：２９３５２， ２０１６．
６０． Ｗｏｌｆ Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ２３２（１）： １０７－１２１， ２０１７．
６１． Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ５３（５）：９９０－９９９， ２０１２．
６２． Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ４６０（３）：７１５－７２０， ２０１５．
６３． Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ８７（２）：５０７－５２０， ２００７．
６４． Ｎｏｖａｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ２８（２）：２２５－２３８， ２０１４．
６５． Ｚａｊａｃ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ６（６）：ｅ２１５９９， ２０１１．
６６． Ｃｖｅｔｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １５４（６）： １９９９－２０１４， ２０１３．
６７． Ｄｒａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．， １１（２）： １０６， ２０２０．
６８． Ｂｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ７：４６５２５， ２０１７．
６９． Ｋａｌｅｍｂａｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２９４（４８）： １８０１７－１８０２８， ２０１９．
７０． Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ２９８：Ｅ２９６－Ｅ３０３， ２００９．
７１． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２９（４）：６５４－６５８， ２０１９．
７２． Ｄｅｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐ． ６：２６９０８， ２０１６

Claims (6)

1. ＴＡＫ－４４８およびその任意の塩；ＴＡＫ－４４８の保存的変異体およびその任意の塩；キスペプチン１０およびその任意の塩；ならびにキスペプチン１０の保存的変異体およびその任意の塩から選択される化合物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の肝臓において脂肪を減らす方法。
2. 対象が、脂肪肝を患う、請求項１の方法。
3. 対象が、アルコール依存症、肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＬＦＤ）、または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される病態に罹患している、請求項２の方法。
4. 対象が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＬＦＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している、請求項１の方法。
5. 
   ＡＫＲ－００１、アラムコール（ａｒａｍｃｈｏｌ）、ＡＳＣ４０、ＡＺＤ７６８７、ＢＩ０８９－１００、ＢＭＳ－９８６０３６、カナグリフロジン（ｃａｎａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、セニクリビロック（ｃｅｎｉｃｒｉｖｉｒｏｃ）、シロフェキソール（ｃｉｌｏｆｅｘｏｒ）、ダパグリフロジン（ｄａｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ＥＤＰ－３０５、エラフィブラノール（ｅｌａｆｉｂｒａｎｏｒ）、エムリカサン（ｅｍｒｉｃａｓａｎ）、ＥＹＰ００１ａ、フェノフィブラート、フィルソコスタット（ｆｉｒｓｏｃｏｓｔａｔ）、ＧＲ－ＭＤ－０２、ＩＯＮＩＳ－ＤＧＡＴ２ｒ_ｘ、イプラグリフロジン（ｉｐｒａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、リコグリフロジン（ｌｉｃｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ルセオグリフロジン（ｌｕｓｅｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ＬＹ３２０２３２８、ＭＥＴ４０９、メトホルミン、ＭＧＬ－３１９６、ＭＫ－４０７４、ＭＳＤＣ－０６０２Ｋ、ＭＴ－３９９５、ＮＧＭ２８２、ニドゥフェキソル（ｎｉｄｕｆｅｘｏｒ）、ＰＦ－０５２２１３０４、ＰＦ－０６８３５９１９、ＰＦ－０６８６５５７１、ＰＦ－０６８８２９６１、ＰＸ－１０２、ＰＸＬ７７０、ＰＸＳ－５１５３Ａ、セロンセルチブ（ｓｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ）、シムツズマブ、セマグルチド（ｓｉｍａｇｌｕｔｉｄｅ）、ＴＥＲＮ－１０１、ＴＥＲＮ－２０１、トロピフェクサー（ｔｒｏｉｆｅｘｏｒ）、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびＶＫ２８０９から選択される第２の化合物の治療的量を投与することをさらに含む、請求項１の方法。
6. 投与が、皮下、静脈内、または経口である、請求項１の方法。

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