JP2023520667A

JP2023520667A - 細菌細胞におけるタンパク質合成のための完全直交系

Info

Publication number: JP2023520667A
Application number: JP2022557978A
Authority: JP
Inventors: シー．ジュエットマイケル; エス．マンキンアレクサンダー; アレクサシンニコライ
Original assignee: ノースウェスタンユニバーシティ; ザボードオブトラスティーズオブザユニヴァーシティーオブイリノイ
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2023-05-18
Also published as: US20230117150A1; WO2021195294A3; WO2021195294A2; EP4127183A2; CN115997022A; EP4127183A4

Abstract

開示されるのは、改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドを含む改変リボソーム、改変（ｅｎｇｉｎｎｅｒｅｄ）ポリヌクレオチド及びリボソームを含む改変細胞及び系、並びに改変ポリヌクレオチド、改変リボソーム、改変細胞及び系を作製及び使用する方法である。改変ポリヌクレオチド、改変リボソーム、及び改変細胞は、配列規定ポリマーの調製及び非カノニカルアミノ酸をポリマーに組み込むことができる変異体リボソームの選択に利用することができる。【選択図】図１

Description

連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する陳述
本発明は、アメリカ国立科学財団（ＮａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって与えられたＭＣＢ－１７１６７６６及びＭＣＢ－１６１５８５１の下で政府の援助によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
関連する特許出願への相互参照

本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０２０年３月２４日に出願された米国仮出願第６２／９９３，８６０号に対する優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。

本発明は、改変ポリヌクレオチド（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、改変ポリヌクレオチドを含む改変リボソーム（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｒｉｂｏｓｏｍｅｓ）、改変ポリヌクレオチド及びリボソームを含む改変細胞（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｃｅｌｌｓ）及び系、並びに改変ポリヌクレオチド、改変リボソーム、改変細胞及び系を作製及び使用する方法に関する。改変ポリヌクレオチド、改変リボソーム、及び改変細胞を利用して配列規定（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｆｉｎｅｄ）ポリマーを調製することができる。

リボソームは、タンパク質の合成を担うリボ核タンパク質の機械装置である。すべての生物の界において、リボソームは、２つのサブユニットで構成されており、それぞれは独自のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）スキャフォールドの上に構築されている。サブユニットの、独立しているが協働的な機能、例えば開始時に結合し、伸長の間に回転し、且つタンパク質放出後に解離する能力は、タンパク質合成の確立されたパラダイムである。さらに、リボソームの二部からなる性質は、専用のアセンブリ因子が未成熟リボソームサブユニットを引き離し、それらが翻訳開始しないようにするので、バイオジェネシスに必須であると推定されている［Ｋａｒｂｓｔｅｉｎ２０１３］。サブユニットの自由な交換は、ネイティブの翻訳を妨げることなく新しい機能に向けて進化可能な特殊な直交性遺伝子系の開発を制限する。

リボソームは非常に複雑な機械装置である。この大きな粒子は、ＲＮＡが主要な構造的且つ機能的な構成要素であり、別個であるが相補的な機能を調整する、必ず２つのサブユニットから構成され、小サブユニットはｍＲＮＡを解読し、一方で大サブユニットはペプチド結合の形成を触媒し、且つポリペプチドの出口トンネルを形成する。サブユニットの結合は、翻訳のサイクルを通じて厳密に制御される。まず、リボ核タンパク質が成熟する間に、いくつかのアセンブリ因子が２つのサブユニットの結合を妨げる。その後、翻訳の開始もまた、開始因子、ｍＲＮＡ及びｆＭｅｔ－ｔＲＮＡ^fMetが順次小サブユニットに加わって、前開始複合体が形成された後に、大サブユニットが動員されるように厳密に制御される。伸長の間には、サブユニットが互いに約６度の角度で相対的に少しずつ一方向に移動する（ｒａｔｃｈｅｔ）。翻訳が終了すると、新たに合成されたタンパク質はリボソームから放出され、リボソームのリサイクルと呼ばれる活発なプロセスでサブユニットが解離し、さらなる翻訳ラウンドに備えられる。したがって、なぜリボソームが進化の過程で２つのサブユニットとして維持されてきたかは、翻訳の特定の段階でサブユニットの結合と解離がプログラムされていることが必要であることからおそらく説明されるであろう。リーダー配列をもたない（ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ）ｍＲＮＡにおける開始は、予め結合したサブユニットをもつ７０Ｓリボソームによって行われることが示唆されたが、タンパク質合成の全サイクルが分離不可能なサブユニットをもつリボソームによって達成されうることを示す実験的証拠は存在しない。

タンパク質の生合成を繰り返す間のリボソームサブユニットのランダムな交換は、完全に直交性のリボソームを作るための障害、基礎科学と生物工学双方に重要な意味をもつ課題である完全直交性リボソームの作製にとって障害となっている。これまで、レポーターｍＲＮＡに代替のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）（ＳＤ）配列を置き、且つ１６ＳｒＲＮＡのアンチＳＤ領域に相補的な変化を導入することによって、小リボソームサブユニットの亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を、常在ｍＲＮＡの翻訳から特異的ｍＲＮＡの翻訳へ方向転換することが可能であり［Ｈｕｉ１９８７；Ｒａｃｋｈａｍ２００５］、新しい解読特性をもつ変異体３０Ｓサブユニットの選択を可能にした［Ｗａｎｇ２００７］。しかし、大サブユニットは、ネイティブ小サブユニットと直交性の小サブユニットの間で自由に交換するので、完全直交性リボソームを作り出すことは不可能であり、それにより、ペプチジルトランスフェラーゼ中心（ＰＴＣ）及び新生ペプチド出口トンネルを含む、５０Ｓサブユニットの特殊な新しい特性のための設計が制限されてきた。

サブユニットが互いに連結されたテザー（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）リボソームの設計は、直交翻訳系を作製すること、合成生物学における非天然アミノ酸の取り込みに向けてリボソームを進化させること、及び優性致死変異を分子的に特徴付けることといった新しい道を開く可能性がある。以前、本発明者ら及び他の者（ｗｅａｎｄｏｔｈｅｒｓ）は、テザーリボソーム、並びにテザーリボソームの製法及び使用法を開示した（国際公開第２０１５／１８４２８３号パンフレット「ＴｅｔｈｅｒｅｄＲｉｂｏｓｏｍｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｏｆＭａｋｉｎｇａｎｄＵｓｉｎｇＴｈｅｒｅｏｆ」及びＯｒｅｌｌｅｅｔａｌ．， ”Ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｒｉｂｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈｔｅｔｈｅｒｅｄｓｕｂｕｎｉｔｓ，” Ｎａｔｕｒｅ，６Ａｕｇｕｓｔ２０１５，Ｖｏｌ．５２４，ｐａｇｅ１１９を参照）。ここでは、テザーサブユニットをもつリボソームを組み込む系及び方法に対するさらなる改良を開示する。

本明細書で開示されるのは、改変ポリヌクレオチド、改変リボソーム、並びに改変細胞及び系である。改変ポリヌクレオチド、改変リボソーム、並びに改変細胞及び系は、配列規定ポリマーを調製するための方法に利用することができる。いくつかの実施形態では、改変リボソームは、小サブユニット、大サブユニット、及びポリヌクレオチド配列を含む連結部分を含み、連結部分は、小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止め、且つ改変リボソームは配列規定ポリマーの翻訳を補助することができる。

ある特定の実施形態では、改変リボソームの小サブユニットはｒＲＮＡ及びタンパク質を含み、改変リボソームの大サブユニットはｒＲＮＡ及びタンパク質を含み、且つ連結部分は小サブユニットのｒＲＮＡを大サブユニットのｒＲＮＡと繋ぎ止める。ある特定の実施形態では、大サブユニットは、２３ＳｒＲＮＡの順列置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）バリアントを含む。ある特定の実施形態では、小サブユニットは、１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアントを含む。したがって、ある特定の実施形態では、改変リボソームは、（ａ）１６ＳｒＲＮＡ、その順列置換バリアント、又はそれらの断片、及び（ｂ）２３ＳｒＲＮＡ、その順列置換バリアント、又はそれらの断片の融合物を含む改変ポリヌクレオチドを含む。

本開示の改変リボソームの小サブユニットのｒＲＮＡは、アンチシャイン・ダルガノ（アンチＳＤ）配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、改変リボソームの小サブユニットのｒＲＮＡのアンチＳＤ配列は、改変リボソームを含む改変宿主細胞のネイティブアンチＳＤ配列に対応する、又はそれと同一である。そのような実施形態では、改変リボソームの小サブユニットのｒＲＮＡのアンチＳＤ配列は、改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡのシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列と逆相補性を示す。本開示の改変リボソームのいくつかの実施形態では、本開示の改変リボソームの小サブユニットのｒＲＮＡは、大サブユニット（ｓｕｂｍｉｔ）のｒＲＮＡに、ポリヌクレオチド配列を含む連結部分を介して連結され、その場合、改変リボソームは、繋ぎ止められた大サブユニットと小サブユニットを有する、且つ改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡのＳＤ配列と逆相補性を示す、改変リボソームを含む改変宿主細胞のネイティブアンチＳＤ配列を含むと記載することができる。したがって、繋ぎ止められた大サブユニットと小サブユニットを有する改変リボソームは、改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡを用いて翻訳を補助することができる。

他の実施形態では、改変リボソームの小サブユニットのｒＲＮＡのアンチＳＤ配列は、改変リボソームを含む改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡのアンチＳＤ配列に対して（又は第１の改変リボソームのアンチＳＤ配列に対して）塩基置換を含むように改変される。そのような実施形態では、改変宿主細胞は、改変リボソームの小サブユニットのｒＲＮＡの改変アンチＳＤ配列に対して逆相補性を示し、改変アンチＳＤ配列をもつｒＲＮＡを有する改変リボソームによる改変ｍＲＮＡの翻訳を可能にする改変アンチＳＤ配列を有する改変ｍＲＮＡを含むように設計することができる。

本開示の改変リボソームは、改変宿主細胞で使用するために組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本開示のリボソームの組み合わせは、第１の改変リボソームと第２の改変リボソームを含むことができる。第１の改変リボソームは、ｉ）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びタンパク質を含む小サブユニット、ｉｉ）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びタンパク質を含む大サブユニット、並びにｉｉｉ）連結部分であって、ポリヌクレオチド配列を含み、且つ小サブユニットのｒＲＮＡを大サブユニットのｒＲＮＡと繋ぎ止める連結部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の改変リボソームの小サブユニットのｒＲＮＡは、改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡの翻訳を可能にし、且つ好ましくは、改変ＳＤ配列（すなわち、改変宿主細胞のネイティブリボソームのアンチＳＤ配列に対して１つ又は複数のヌクレオチド置換を有する改変ＳＤ配列）を有するｍＲＮＡの翻訳を許容しない改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡのＳＤ配列に対応するアンチＳＤ配列を含む。第２の改変リボソームは、ｉ）ｒＲＮＡ及びタンパク質を含む小サブユニット、並びにｉｉ）ｒＲＮＡ及びタンパク質を含む大サブユニットを含むことができ、そこでは第２の改変リボソームは、大サブユニットと小サブユニットの間の連結部分を欠く。いくつかの実施形態では、第２の改変リボソームの小サブユニットのｒＲＮＡは、改変宿主細胞のネイティブリボソームのアンチＳＤ配列に対して（且つ／又は第１の改変リボソームのアンチＳＤに対して）１つ又は複数のヌクレオチド置換を有する改変アンチＳＤ配列を含む。改変アンチＳＤ配列は、優先的に、ネイティブ細胞ｍＲＮＡのＳＤ配列と異なる相補的な若しくは同族のＳＤ配列及び／若しくは第１の改変リボソームのアンチＳＤ配列と異なるアンチＳＤ配列を有するｍＲＮＡテンプレートの翻訳を可能にし（すなわち、第２のリボソームによる改変ＳＤ配列を有するｍＲＮＡの翻訳を可能にする第２のリボソームの小サブユニットのｒＲＮＡのアンチＳＤの相補的である改変ＳＤ配列を有するｍＲＮＡの翻訳を可能にし、且つ好ましくは第２の改変リボソームによる改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡの翻訳を許容しない）、且つ／又はその場合（ａｎｄ／ｏｒｗｈｅｒｅ）、第２の改変リボソームは、大サブユニット及び／若しくは小サブユニットに、改変宿主細胞のネイティブリボソームに対して（若しくは第１の改変リボソームに対して）１つ又は複数の機能変換型変異を含み、その機能変換型変異がアンチＳＤ配列に存在しない。

改変リボソームの大サブユニットと小サブユニットが連結部分によって繋ぎ止められたある特定の実施形態では、連結部分は大サブユニットのヘリックスを小サブユニットのヘリックスに共有結合させる。大サブユニットが２３ＳｒＲＮＡ（又は２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント）を含み、且つ小サブユニットが１６ＳｒＲＮＡ（又は１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント）を含むある特定の実施形態では、連結部分は、２３ＳｒＲＮＡ（又は２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント）のヘリックス１０、ヘリックス３８、ヘリックス４２、ヘリックス５４、ヘリックス５８、ヘリックス６３、ヘリックス７８、又はヘリックス１０１を、１６ＳｒＲＮＡ（又は１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント）のヘリックスに共有結合させる。大サブユニットが２３ＳｒＲＮＡ（又は２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント）を含み、且つ小サブユニットが１６ＳｒＲＮＡ（又は１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント）を含むある特定の実施形態では、連結部分は、１６ＳｒＲＮＡ（又は１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント）のヘリックス１１、ヘリックス２６、ヘリックス３３、又はヘリックス４４を、２３ＳｒＲＮＡ（又は２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント）のヘリックスに共有結合させる。

ある特定の実施形態では、大サブユニットは、Ｌ１ポリヌクレオチドドメイン、Ｌ２ポリヌクレオチドドメイン、及びＣポリヌクレオチドドメインを含み、そこにおいて、Ｌ１ドメインの後ろに、５’から３’に、Ｃドメイン及びＬ２ドメインが順に続く。ある特定の実施形態では、５’から３’に、Ｌ１ドメインが後ろに続くＬ２ドメインから本質的になるポリヌクレオチドは、２３ＳｒＲＮＡ（例えば大腸菌の２３ＳｒＲＮＡ）と実質的に同一である。ある特定の実施形態では、５’から３’に、Ｌ１ドメインが後ろに続くＬ２ドメインから本質的になるポリヌクレオチドは、２３ＳｒＲＮＡと少なくとも９５％同一である。ある特定の実施形態では、Ｃドメインは、１～２００個の範囲のヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣドメインはＧＡＧＡポリヌクレオチドを含む。

ある特定の実施形態では、小サブユニットは、Ｓ１ポリヌクレオチドドメイン及びＳ２ポリヌクレオチドドメインを含み、そこにおいて、５’から３’に、Ｓ１ドメインの後ろにＳ２ドメインが順に続く。ある特定の実施形態では、５’から３’に、Ｓ２ドメインが後ろに続くＳ１ドメインから本質的になるポリヌクレオチドは、１６ＳｒＲＮＡ（例えば、大腸菌の１６ＳｒＲＮＡ）と実質的に同一である。ある特定の実施形態では、５’から３’に、Ｓ２ドメインが後ろに続くＳ１ドメインから本質的になるポリヌクレオチドは、１６ＳｒＲＮＡと少なくとも９５％同一である。

ある特定の実施形態では、連結部分は、Ｔ１ポリヌクレオチドドメイン及びＴ２ポリヌクレオチドドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ１ドメインはＳ１ドメイン及びＬ１ドメインに連結し、且つそこにおいて、５’から３’に、Ｓ１ドメインの後にＴ１ドメイン及びＬ１ドメインが順に続く。ある特定の実施形態では、Ｔ１ドメインは、５～２００個のヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ１ドメインは、７～４０個のヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ１ドメインは、ポリアデニンポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ１ドメインは、７～１２個のアデニンヌクレオチドの長さを有するポリアデニンポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ２ドメインはＳ２ドメイン及びＬ２ドメインに連結し、且つそこにおいて、５’から３’に、Ｌ２ドメインの後にＴ２ドメイン及びＳ２ドメインが順に続く。ある特定の実施形態では、Ｔ２ドメインは、５～２００個のヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ２ドメインは、７～２０個のヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ２ドメインは、ポリアデニンポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ２ドメインは、７～１２個のアデニンヌクレオチドの長さを有するポリアデニンポリヌクレオチドを含む。

ある特定の実施形態では、改変リボソームは、５’から３’に、Ｔ１ドメイン、Ｌ１ドメイン、Ｃドメイン、Ｌ２ドメイン、Ｔ２ドメイン、及びＳ２ドメインが順に続くＳ１ドメインを含む。ある特定の実施形態では、改変リボソームは、５’から３’に、Ｔ１ドメイン、Ｌ１ドメイン、Ｃドメイン、Ｌ２ドメイン、Ｔ２ドメイン、及びＳ２ドメインが順に続くＳ１ドメインから本質的になる。

ある特定の実施形態では、本開示の改変リボソームは、野生型宿主細胞と比較して（例えば、野生型大腸菌と比較して）変異を含む。ある特定の実施形態では、変異は機能変換型変異である。ある特定の実施形態では、機能変換型変異は機能獲得型変異である。ある特定の実施形態では、機能獲得型変異は、改変リボソームの大サブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ中心に存在する。ある特定の実施形態では、機能獲得型変異は、改変リボソームの大サブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ中心のＡサイトに存在する。ある特定の実施形態では、機能獲得型変異は、改変リボソームの大サブユニットの出口トンネルに存在する。ある特定の実施形態では、改変リボソームは、改変リボソームの大サブユニット及び／又は小サブユニットに存在する抗生物質耐性変異を含む。

さらに本明細書で開示されるのは、ポリヌクレオチドであって、改変リボソームのｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはベクターである。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、改変リボソームによって発現する（ｔｏｂｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）遺伝子をさらに含む。ある特定の実施形態では、遺伝子はレポーター遺伝子である。ある特定の実施形態では、レポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質遺伝子である。ある特定の実施形態では、改変リボソームは改変アンチＳＤ配列を含み、且つその遺伝子は、改変リボソームのアンチＳＤ配列に対応する相補的な改変ＳＤ配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子はコドンを含み、且つコドンは非天然アミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、改変アンチＳＤ配列を含むリボソームは非テザー（ｕｎｔｅｔｈｅｒｅｄ）リボソームである。

さらに本明細書で開示されるのは、改変リボソームを調製するための方法であって、改変リボソームのｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを、例えば大腸菌などの改変宿主細胞で発現させる方法である。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞で改変リボソームを調製すること、選択マーカーを発現させること、及び改変宿主細胞において選択マーカーを発現させる改変リボソームを選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、選択された改変リボソームは、改変宿主細胞で発現された改変リボソームに対して（及び／又は改変宿主細胞のネイティブリボソームに対して）１つ又は複数の変異を含むことになる。ある特定の実施形態では、選択ステップは、ネガティブな選択ステップ、ポジティブ選択ステップ、及びネガティブとポジティブ両方の選択ステップを含む。

さらに本明細書で開示されるのは改変細胞である。改変細胞は、（ｉ）改変リボソームのｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）改変リボソーム、又は（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む大腸菌細胞などの宿主細胞である。いくつかの実施形態では、改変宿主細胞は、繋ぎ止められた大サブユニットと小サブユニットを有する第１の改変リボソームを含み、その小サブユニットは、改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡのＳＤ配列に対応するアンチＳＤ配列を有するｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、改変宿主細胞は、繋ぎ止められていない大サブユニットと小サブユニットを有する第２の改変リボソームをさらに含み、その小サブユニットは、改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡのＳＤ配列に対して改変されたアンチＳＤ配列を有し、且つ第２のリボソームの小サブユニットのｒＲＮＡの改変アンチＳＤ配列に対応する改変ＳＤ配列を有するｍＲＮＡの翻訳を可能にするｒＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、改変細胞は第１のタンパク質翻訳機構及び第２のタンパク質翻訳機構を含む。第１のタンパク質翻訳機構は第１の改変リボソームを含むことができ、そこにおいて第１の改変リボソームは、第１と第２のサブユニットを繋ぎ止める連結部分を含む。第２の翻訳機構は第２の改変リボソームを含むことができ、そこにおいて第２の改変リボソームは大サブユニットと小サブユニットの間の連結部分を欠く。いくつかの実施形態では、第２の改変リボソームは、ネイティブｍＲＮＡのＳＤ配列に相補的であるネイティブリボソームのアンチＳＤ配列に対して（且つ／若しくは第１の改変リボソームのアンチＳＤ配列に対して）改変アンチＳＤ配列、及び／又は改変細胞のネイティブリボソームに対して（且つ／若しくは第１の改変リボソームに対して）アンチＳＤ配列以外の機能変換型変異を含む。

さらに本明細書で開示されるのは、配列規定ポリマーを調製するための方法であって、（ａ）改変リボソーム又は１つ若しくは複数の改変リボソームを含む改変細胞を用意すること、及び（ｂ）配列規定ポリマーをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートを用意すること、及び１つ又は複数の改変リボソームを使用して配列規定ポリマーを調製することを含み、改変細胞が１つ又は複数の改変リボソームを含み、且つｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートが配列規定ポリマーをコードする方法である。配列規定ポリマーは、インビトロ及び／又はインビボで調製することができる。

ある特定の実施形態では、配列規定ポリマーがインビトロで調製され、且つ本方法は、（ｃ）リボソーム欠失細胞抽出物又は精製された翻訳系を用意すること及びリボソーム欠失細胞抽出物又は精製翻訳系を使用して配列規定ポリマーを調製することをさらに含む。ある特定の実施形態では、リボソーム欠失細胞抽出物は、指数増殖期の中～後期の細胞培養物又は採取時に少なくとも約２．０、２．５、若しくは３．０のＯＤ₆₀₀を有する培養物から調製されたＳ１５０抽出物を含む。

ある特定の実施形態では、配列規定ポリマーがインビボで調製される。配列規定ポリマーは、改変リボソームを含む第１の及び第２の翻訳系を含む改変細胞で調製することができ、そこにおいて、第１の翻訳系は、野生型アンチＳＤ配列（すなわち、改変宿主細胞のネイティブｍＲＮＡのＳＤ配列に相補的である改変宿主細胞のリボソームのネイティブアンチＳＤ配列）を有するテザーリボソームを含み、且つそこにおいて、第２の翻訳系は、（ａ）改変アンチＳＤ配列（例えば、改変宿主細胞のリボソームのネイティブアンチＳＤ配列に対し、若しくは第１の翻訳系のテザーリボソームのアンチＳＤに対し、宿主細胞のネイティブｍＲＮＡのＳＤ配列に相補的でない）、及び／又は（ｂ）アンチＳＤ配列以外での機能変換型変異であって、改変宿主細胞のネイティブリボソームに対して、若しくは第１の翻訳系のテザーリボソームに対して変異を有する非テザーリボソームを含む。ある特定の実施形態では、配列規定ポリマーをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡは改変ＳＤ配列を含み、且つ第２の翻訳系の非テザー、改変リボソームは、第２の翻訳系による翻訳を可能にする（且つ好ましくは第１の翻訳系による翻訳を可能にする）配列規定ポリマーをコードするｍＲＮＡの翻訳を可能にする配列規定ポリマーをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの改変ＳＤ配列に相補的な改変アンチＳＤ配列を含む。

ある特定の実施形態では、配列規定ポリマーはアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸は天然アミノ酸である。ある特定の実施形態では、アミノ酸は非天然又は非カノニカルアミノ酸であり、且つ第２の翻訳系の非テザー、改変リボソームは、ネイティブリボソームに対して（又は第１の翻訳系のテザー、改変リボソームに対して）１つ又は複数の変異を含み、非天然又は非カノニカルアミノ酸の配列規定ポリマーへの組み込みを可能にする。

図１は、ＯＳＹＲＩＳのセットアップ。ａ）ｒＲＮＡ遺伝子の構成並びに解離可能な７０Ｓリボソーム（左）及びＲｉｂｏ－Ｔ（右）の構造。Ｒｉｂｏ－Ｔの小サブユニットと大サブユニットは、円順列置換（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ－ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）２３ＳｒＲＮＡを１６ＳｒＲＮＡのヘリックス４４のループに繋ぐ２本のＲＮＡテザーによって共有結合している^13、16。ｂ）Ｒｉｂｏ－Ｔに基づく最初のオリジナルの直交翻訳系¹³では、野生型の解離可能なリボソームが細胞プロテオームを翻訳し、一方では直交性Ｒｉｂｏ－Ｔ（ｏＲｉｂｏ－Ｔ）が直交性レポーターｍＲＮＡの翻訳に関与する。ｃ）ＯＳＹＲＩＳ細胞（実施例１）では、プロテオームはＲｉｂｏ－Ｔによって合成され、一方で解離可能なリボソームは特殊な直交翻訳系として機能する。繋ぎ止められているというＲｉｂｏ－Ｔの性質は、解離可能なリボソームの両サブユニット（改変ＡＳＤをもつ３０Ｓサブユニット及び５０Ｓサブユニット）を、直交性ｍＲＮＡのみの翻訳に限定する。

図２は、ＯＳＹＲＩＳ細胞における解離可能な直交性リボソームの性能。ａ）解離可能な７０Ｓリボソームのみを含有する野生型大腸菌（野生型）、及びテザーリボソームのみをもつＲｉｂｏ－Ｔ細胞（Ｒｉｂｏ－Ｔ）と比較したＯＳＹＲＩＳ細胞における大ｒＲＮＡ種（ｌａｒｇｅｒＲＮＡｓｐｅｃｉｅｓ）のアガロースゲル電気泳動分析。ｂ）ＯＳＹＲＩＳ細胞内含有リボソームのプライマー伸長解析。上：Ｒｉｂｏ－Ｔ及び解離可能なリボソームは、Ｒｉｂｏ－ＴｒＲＮＡに存在するＡ２０５８Ｇ変異により区別することができる。中：プライマー伸長解析の原理。ｄｄＣＴＰの存在下において、逆転写酵素は２３ＳｒＲＮＡテンプレート（Ａ２０５８をもつ）ではプライマーを４ｎｔ伸長するが、Ｒｉｂｏ－ＴｒＲＮＡテンプレート（Ｇ２０５８をもつ）では３ヌクレオチドしか伸長しない。下：野生型、Ｒｉｂｏ－Ｔ、又はＯＳＹＲＩＳ細胞から抽出されたｒＲＮＡで精製されたプライマー伸長産物のゲル電気泳動分析。ｃ）野生型３０Ｓサブユニット（ｗｔＲｂｓ）又は１６ＳｒＲＮＡの改変ＡＳＤをもつ直交性３０Ｓサブユニット（ｏＲｂｓ）と、解離可能なリボソームをもつＯＳＹＲＩＳ細胞における直交性ＧＦＰレポーターの発現。レポーター遺伝子の転写は、誘導剤であるホモセリンラクトン¹⁹の濃度を変化させることによって誘導される。レポーター遺伝子を欠く細胞の自己蛍光の値は、すべての値から差し引かれた。差し込み図は、標記細胞がスポットされ、且つ増殖した寒天プレートの紫外線写真である。ｄ）ｏ－ｇｆｐレポーターのＯＳＹＲＩＳ細胞における発現（濃い灰色のバー）と、野生型リボソームを発現するｏ－ｐＡＭ５５２又はｐｏＲｉｂｏ－Ｔで形質転換されたＢＬ２１細胞における発現（薄い灰色のバー）の比較（拡張データの図１を参照）。ＢＬ２１細胞にｏ－リボソーム又はｏＲｉｂｏ－Ｔを導入するのに使用した中程度のコピー数のプラスミドは、ｐＢＲ３２２複製起点（３２２）をベースにし、ＯＳＹＲＩＳのｏ－リボソームを発現する低コピー数のプラスミドはｐＳＣ１０１複製起点（１０１）をベースにしている。エラーバーはｎ＝３の反復の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。＊＊＊はスチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０００５を示す。

図３は、ＯＳＹＲＩＳ細胞における解離可能なｏ－リボソームの小サブユニット及び大サブユニットの直交性。ａ）ＯＳＹＲＩＳ細胞における直交性ＧＦＰレポーターの発現のエリスロマイシンに対する感受性（左、濃い灰色のバー）は、その翻訳が主に解離可能なｏ－リボソームによって行われ、Ｅｒｙ^R Ｒｉｂｏ－Ｔによっても、又はＲｉｂｏ－Ｔ／３０Ｓハイブリッドによっても行われないことを示す（右のイラスト（ｃａｒｔｏｏｎ））。それと一致して、Ｅｒｙ^R Ｒｉｂｏ－Ｔによって進められた野生型ｇｆｐ遺伝子の翻訳は抗生物質によって阻害されない（薄い灰色のバー）。エラーバーはｎ＝３の反復の標準偏差を示す。ｂ）上：２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に致死変異Ａ２６０２Ｕが入っているｐｏＲｂｓプラスミドで形質転換されたＯＳＹＲＩＳ細胞は、コロニーを形成することができ、ｏ－リボソームの大サブユニットが細胞プロテオームの翻訳に関与しないことが明らかにされている。非直交翻訳系におけるＡ２６０２Ｕ変異の優性致死性は、ＯＳＹＲＩＳ細胞が、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に改変されていない（野生型）ＡＳＤをもつ同じプラスミド（ｐＲｂｓ）で形質転換されたときにコロニーを欠くことで示されている（図１２ｂ、ｃも参照）。下：ＯＳＹＲＩＳ細胞が、野生型大腸菌細胞では優性致死でありうる２３ＳｒＲＮＡ変異をもつ大リボソームサブユニットを安定して維持することを示すプライマー伸長解析。変異体２３ＳｒＲＮＡ（上矢印）又は非変異Ｒｉｂｏ－ＴｒＲＮＡ（下矢印）の関連変異部位の近位にアニールしたプライマーを伸長することによって生じたｃＤＮＡバンドが示されている。２０５８位のｒＲＮＡ残基周辺のプライマー伸長解析によって、Ｒｉｂｏ－Ｔ（Ｇ２０５８をもつ）と、致死的な２３ＳｒＲＮＡ変異（但し２０５８位は野生型アデニン）をもつ解離可能なリボソームとの共存がさらに確認された（図１２ｄ）。右：解離可能な５０Ｓサブユニットが、発現がＲｉｂｏ－Ｔに依存する細胞プロテオームの翻訳から大きく隔てられていることを裏付ける、これらの実験からの結論を図示するイラスト。

図４は、ＯＳＹＲＩＳ細胞におけるＰＴＣ変異体ライブラリーからの機能獲得型変異の選択。ａ）ｇｆｐの末端にＴｎａＣをコードする配列を付加することは、高濃度のＬ－トリプトファンで翻訳が起こる際にＴｎａＣが終結を阻害する作用²⁸に起因して、レポーター発現を減少させると予想される。ＴｎａＣにおけるＷ１２Ｒ変異の存在は、終結の問題を部分的に緩和する²⁸ことが知られており、且つより高いレベルのレポーター発現につながるはずである。ｂ）ＯＳＹＲＩＳ細胞におけるＧＦＰ－ＴｎａＣ融合体の発現は、Ｌ－トリプトファン類似体である１－メチルトリプトファン（１ｍ－Ｔｒｐ）の存在下で９４％抑制され、一方ではＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）変異体の発現は４８％しか減少しない。エラーバーはｎ＝３の反復の標準偏差を示す。＊＊はスチューデントのｔ検定によるｐ＜０．００５を示す。ｃ）５０Ｓリボソームサブユニットを横切りにしたもの（ｃｒｏｓｓ－ｃｕｔ）に示された、ＰＴＣ変異体ライブラリーに変異が存在する２３ＳｒＲＮＡヌクレオチド（矢印）の位置。Ｐサイト及びＡサイトのｔＲＮＡが示されている。ｄ）変異がＰＴＣライブラリーを含む２３ＳｒＲＮＡ残基。左及び中央：ＰＴＣライブラリーでは、ＰＴＣ活性部位の半径１０Å（内殻）内のすべての２３ＳｒＲＮＡ残基及び、半径２５Å（第２の殻（ｓｅｃｏｎｄｓｈｅｌｌ））内の残基の大部分が変異していた。Ｐサイト及びＡサイトのｔＲＮＡのアミノアシル化されたアクセプター末端がそれぞれピンクと緑で示されている。右：２３ＳｒＲＮＡドメインＶ中央ループの二次構造において示された変異ヌクレオチドの位置。関連する２３ＳｒＲＮＡヘアピンが示されている。ｅ）ＯＳＹＲＩＳ細胞で直交性ＧＦＰ－ＴｎａＣレポーターを発現するＰＴＣライブラリー変異体の翻訳活性とて停滞バイパススコア（ｓｔａｌｌｉｎｇｂｙｐａｓｓｓｃｏｒｅ）。高い翻訳の効率（野生型対照の＞６０％）を維持しつつ、ＴｎａＣペプチドの効率的な終結を示す変異体（バイパススコアの増加）に対応するドットは、四角く囲まれ、且つより濃い。点線は、直交性リボソームを欠くＲｉｂｏ－Ｔ細胞における直交性ＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）変異体の発現のバックグラウンドレベルを示す。黒い点（矢印）は、野生型２３ＳｒＲＮＡを含有するｏ－リボソームによるレポーターの翻訳を示す。ｆ）ＯＳＹＲＩＳ細胞で同定された特定の機能獲得型変異をもつ単離リボソームを無細胞翻訳系で試験する。インビトロ試験では、致死変異（Ｕ２５００Ｇ、Ａ２０６０Ｃ、Ａ２４５０Ｕ）をもつリボソームの５０ＳサブユニットをＯＳＹＲＩＳ細胞から単離し、且つ野生型３０Ｓサブユニットと結合させた。ＳＱ１７１細胞から非致死的変異をもつリボソームを単離した。ＴｎａＣの不充分な放出に起因するｔｎａＣ遺伝子の終止コドンにおける翻訳アレスト（ａｒｒｅｓｔ）の程度を評価するために、トウプリンティングアッセイ（図１６ｃ）が用いられた。エラーバーは３つの独立した実験からの標準偏差を表す。野生型の値との差の統計的有意性は、スチューデントのｔ検定により決定して、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．００５）、又は＊＊＊（ｐ＜０．０００５）で示される。ｇ）ＴｎａＣ停滞リボソームの構造³⁰における、変異が機能獲得をもたらす（パネルＥの濃い点）２３ＳｒＲＮＡ残基（青）の、ＴｎａＣ－ｔＲＮＡ（緑）及びＲＦ２（オレンジ）に対する配置。

図５は、ＯＳＹＲＩの重要なプラスミド。ａ）ｐＲｉｂｏ－Ｔｔプラスミドのマップ。１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡハイブリッド及び５ＳｒＲＮＡをコードするｐＲｉｂｏ－Ｔ遺伝子は、ラムダＰ_Lプロモーターの制御下で発現する。１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡハイブリッドでは、ヘリックス１０１のループで開いた円順列置換２３ＳｒＲＮＡは、オリジナルのＲｉｂｏ－Ｔバージョンに対して配列がＲｉｂｏ－Ｔｖ．２．０で再設計された２つのＲＮＡテザーによって１６ＳｒＲＮＡのヘリックス４４のループに挿入されている^3、4。２３ＳｒＲＮＡセグメントは、Ｒｉｂｏ－Ｔにエリスロマイシン耐性を与えるＡ２０５８Ｇ変異をもつ。染色体ｒＲＮＡオペロンの欠失に起因して宿主細胞で見られない¹⁰ｔＲＮＡ遺伝子のクラスターはＰ_tacプロモーターの制御下にある。そのプラスミドは、ｐＢＲ３２２複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子をもつ。ｂ）ｐＡＭ５５２⁴由来のｐｏＲＢＳプラスミドは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子においてＡＳＤ配列ＧＵＧＧＵＵが改変された大腸菌ｒｒｎＢオペロンをもつ³。このプラスミドはｐＳＣ１０１複製起点及びカナマイシン耐性遺伝子をもつ。対照プラスミドｐＲｂｓ（図示せず）は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に野生型ＡＳＤを含有することを除いてｐｏＲｂｓと同一である。ｃ）レポータープラスミドｐｏＧＦＰは、スーパーフォルダー（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ）緑色蛍光タンパク質（ｓｆ－ｇｆｐ）の遺伝子（ｐｏＧＦＰ）又は同一遺伝子とさらに赤色蛍光タンパク質の遺伝子（ｐｏＲＦＰ／ｏＧＦＰ）のいずれかをもつ。レポーターのコード配列の前に、パネルｂに示されるｐｏＲＢＳプラスミドにコードされた１６ＳｒＲＮＡのＡＳＤ配列に相補的である改変（直交性）ＳＤ配列、ＡＡＣＣＡＣ³がある。ｐｏＧＦＰの直交性ｇｆｐ遺伝子の転写は、Ｎ－（β－ケトカプロイル）－Ｌ－ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）のＬｕｘＲリプレッサーへの結合によって調節される誘導性Ｐ_Luxプロモーターによって制御される。２つのｌｕｘＲ遺伝子のコピーがプラスミドに存在する。ＴｐｏＧＦＰプラスミドはｐＡ１５複製起点及びＳｐｃ耐性遺伝子を有する。ｄ）レポータープラスミドｐｏＲＦＰ／ｏＧＦＰは、それぞれＰ_lpp5及びＰ_T5プロモーターの制御下にある緑色（ｓｆＧＦＰ）及び赤色（ＲＦＰ）蛍光タンパク質の遺伝子をもつ。どちらの遺伝子の前にも直交性ＳＤ配列ＡＡＣＣＡＣがある。このプラスミドはｐＡ１５複製起点及びＳｐｃ耐性遺伝子を有する。ｅ）ｐｏＬｕｃプラスミドはｐｏＧＦＰプラスミド（パネルｃ）に類似しているが、ｓｆ－ｇｆｐ遺伝子が、ホタルルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子に置き換えられている。ｌｕｃ遺伝子の前に直交性ＳＤ配列ＡＡＣＣＡＣがある。この図に示されているプラスミドの完全なアノテーション付き配列は、付録（Ａｐｐｅｎｄｉｘ）Ｉで見ることができる。

図６は、大腸菌細胞におけるＯＳＹＲＩＳのアセンブリ。ａ、ＯＳＹＲＩＳ細胞のプラスミド組成。細胞プロテオームを翻訳するＲｉｂｏ－ＴはｐＲｉｂｏ－Ｔｔプラスミドから発現される。ｐｏＧＦＰ（又はｐｏＲＦＰ／ｏＧＦＰ）プラスミドの直交性レポーター遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、ｒＲＮＡがｐｏＲｂｓプラスミドにコードされているｏ－リボソームによって翻訳される。ｂ、ＯＳＹＲＩＳ細胞の構築のための一連のステップ。アセンブリステップＩＩＩの後、細胞のゲノムを完全に配列決定した（パネルｃを参照）。次の２つのステップでは、続いて細胞をレポータープラスミド（図示の例ではｐｏＧＦＰ）で形質転換し、且つその後にｐｏＲｂｓで（又は図４に記載のＰＴＣ変異体ライブラリーのプラスミドによって）形質転換した。各ステップで生じた細胞の抗生物質耐性を示す。ｃ、ＯＳＹＲＩＳ細胞のゲノム。出発のＳＱ１７１ＦＧ株は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５細胞に由来する²⁶。５つの自然変異（矢印）がＯＳＹＲＩＳ細胞のアセンブリ及び増殖の間に得られ、且つ変異の正確な位置及び影響を受けた遺伝子の機能を図２０の表に載せた。円の外側の数字はゲノムのヌクレオチド番号を示す。ｄ、ＯＳＹＲＩＳのアセンブリの異なるステップ（パネルｂに示す）における細胞内含有プラスミドのゲル電気泳動分析。プラスミド調製物をＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素の混合物で消化した。参照のために個々のプラスミドの制限酵素消化を示す。

図７ｏＲｂｓはＯＳＹＲＩＳ細胞において安定して発現している。ａ、一晩培養したものを希釈した後、ＯＳＹＲＩＳ細胞に維持されたトータルＲＮＡのアガロースゲル－電気泳動分析。ｐｏＧＦＰプラスミドをもつＯＳＹＲＩＳ細胞の２つの独立したコロニー（Ａ及びＢ）を一晩培養し、且つ５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン及び１５μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＬＢ培地で２本のチューブにそれぞれ１：５０に希釈した。表記の時間間隔後にトータルＲＮＡを単離した。各培養の２つの技術的反復を独立して処理し、且つゲルの別々のレーンに流した。ｂ、ＯＳＹＲＩＳ細胞におけるＲｉｂｏ－Ｔ（Ａ２０５８Ｇ変異をもつ）に対するｏＲｂｓ（野生型Ａ２０５８を有する）の発現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の経時的なプライマー伸長解析。プライマー伸長解析の原理はシークエンシングゲルの上に図示されている。ＯＳＹＲＩＳ細胞から調製したトータルＲＮＡ（パネルａを参照）をプライマー伸長のテンプレートとして使用した。野生型大腸菌細胞（「Ａ２０５８」）及びＲｉｂｏ－Ｔのみを発現する細胞（「Ａ２０５８Ｇ」）から調製したＲＮＡ試料を対照として使用した。「Ｐｒ」と印を付けられたレーンは［³²Ｐ］で標識されたＤＮＡプライマーが入っている。ｃ、Ｒｉｂｏ－Ｔ及びｏＲｂｓ特異的バンドの相対強度の定量を用いて、２つのリボソーム種の相対的な発現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を評価した。

図８は、ＯＳＹＲＩＳ細胞における直交性レポーターの効率的な翻訳。ａ、ｏ－リボソーム（実線）又は野生型リボソーム（破線）を含有するＯＳＹＲＩＳ細胞の増殖曲線（上）及びその中での直交性ＧＦＰレポーターの発現（右）。ｂ、ｏ－リボソーム（実線）又は野生型リボソーム（破線）を発現するＯＳＹＲＩＳ細胞における増殖曲線（左）及び直交性ＧＦＰ（中央）とＲＦＰレポーター（右）の発現。各実験において最も高い蛍光の読み取り値相対蛍光単位）を１００％とした。ｃ、ｏ－リボソーム（濃い灰色のバー）又は野生型リボソーム（薄い灰色のバー）のいずれかを含むＯＳＹＲＩＳ細胞における直交性ルシフェラーゼレポーターの発現。最も高い蛍光の読み取り値（相対蛍光単位、ＲＬＵ）を１００％とした。エラーバーはｎ＝３の反復の標準偏差を示し、＊＊＊はｐ＜０．０００５を示し、ｎ．ｓ．はスチューデントのｔ検定による統計的有意性がないことを示す。

図９は、ＯＳＹＲＩＳ細胞及び大腸菌ＢＬ２１における直交性ｇｆｐレポーターの発現。９６ウェルプレート－で培養したＯＳＹＲＩＳ細胞及びＢＬ２１細胞の（ａ）増殖曲線、（ｂ）ＧＦＰ蛍光、及び（ｃ）細胞密度で正規化したＧＦＰ蛍光。両タイプの細胞とも、野生型リボソーム（破線）又はｏ－リボソーム（実線）のいずれかを発現する。なお、正規化した直交性ＧＦＰ蛍光（又は１つの細胞当たりのｏＧＦＰ蛍光）は、ＢＬ２１細胞よりもＯＳＹＲＩＳ細胞で高いことに留意されたい。データは独立した３つの生物学的反復の結果を表し、エラーバーは標準偏差を示す。（ｂ）では、最も高い蛍光の読み取り値（相対蛍光単位）（ＢＬ２１細胞の場合）を１００％とした。（ｃ）では、正規化した蛍光の読み取り値の最も高いもの（Ａ₆₀₀に対する相対蛍光単位）（ＯＳＹＲＩＳ細胞の場合）を１００％とした。

図１０は、ｏＲｂｓは、直交性ルシフェラーゼレポーターの発現においてｏＲｉｂｏ－Ｔより優れる。解離可能なｏＲｂｓ又はｏＲｉｂｏ－Ｔによって進められるＢＬ２１又はＯＳＹＲＩＳ細胞におけるｏ－ｌｕｃの発現。レポータープラスミドｐｏＬｕｃをもつＢＬ２１細胞を、それぞれｏＲｂｓ又はｏＲｉｂｏ－Ｔを発現させる中程度のコピー数（ｐＢＲ３２２ｏｒｉ）プラスミドｏ－ｐＡＭ５５２又はｐｏＲｉｂｏ－Ｔで形質転換した。ＯＳＹＲＩＳ細胞は、低コピー数プラスミドｐｏＲｂｓからのｏＲｂｓを発現する。対照細胞は野生型ＡＳＤを含むｒＲＮＡをもつこと以外同じのプラスミドで形質転換した。相対的なレポーターの発現は実験手順に記載のように記録した。エラーバーはｎ＝３の反復の標準偏差を示す。＊＊＊はｐ＜０．０００５を示し、且つｎ．ｓ．はスチューデントのｔ検定による統計的有意性がないことを示す。

図１１は、ＯＳＹＲＩＳ細胞のエリスロマイシン（Ｅｒｙ）に対する耐性は、直交性の解離可能なリボソームの機能的分離を示す。ａ、野生型（上２つの細胞及び下の細胞の左側）又は直交性（下の細胞の右側）リボソームを発現するＯＳＹＲＩＳ細胞のリボソーム組成。テザーリボソームにはＡ２０５８Ｇ変異をもち、Ｅｒｙに対する耐性を付与するが、解離可能なリボソームはＥｒｙに感受性である。ｂ：表記の濃度のＥｒｙの存在下において９６ウェルプレートで２４時間増殖させた後に野生型又は直交性リボソームを発現するＯＳＹＲＩＳ細胞培養物の光学密度。Ｅｒｙ^R Ｒｉｂｏ－Ｔとともに野生型の解離可能なＥｒｙ^Sリボソームを発現させることにより、細胞はエリスロマイシンに対して感受性になり（Ｒｉｂｏ－Ｔ＝＋ｗｔＲｂｓ、各Ｘ軸の点で３番目のバー）、遊離５０Ｓサブユニットが翻訳に関与している場合（この場合ではその野生型３０Ｓサブユニットとの相互作用に起因して）、タンパク質合成及び細胞増殖が阻害されることが示されている。それに対して、ｏＲｂｓを発現する細胞はＥｒｙ^Rのままであり、ＯＳＹＲＩＳ細胞内の直交性の解離可能なリボソームの５０Ｓサブユニットは機能的に分離されており、細胞プロテオームの翻訳に関与しないことが示されている。図１１ｂの場合、各Ｘ軸データ値の最初のバーはＲｉｂｏ－Ｔのみ、２番目のバーはＲｉｂｏ－Ｔ＋野生型Ｒｂｓ、３番目のバーはＲｉｂｏ－Ｔ＋ｏＲｂｓである。

図１２は、直交性リボソームの５０ＳサブユニットのｒＲＮＡに致死変異を発現するＯＳＹＲＩＳ細胞の生存性は、２つの直交翻訳系の機能分離（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｏｌａｔｉｏｎ）を示す。ａ、ＰＴＣ活性部位（ＰＤＢ１ＶＹ４）²²における２３ＳｒＲＮＡヌクレオチドＧ２５５３、Ａ２６０２、Ａ２４５１（オレンジ色）の位置。これらのヌクレオチドの変異は野生型大腸菌細胞において優性致死である²⁷。ＡサイトｔＲＮＡは緑色であり、且つＰサイトｔＲＮＡは青色である。ｂ、ＯＳＹＲＩＳ細胞の形質転換は、致死変異をもつ変異体２３ＳｒＲＮＡが直交性１６ＳｒＲＮＡ（ｐｏＲｂｓ）と共発現させたときは、生存コロニーを生じるが、野生型１６ＳｒＲＮＡ（ｐＲｂｓ）と共発現させたときは生じない。ｃ、ｐＲｂｓ及びｐｏＲｂｓプラスミドからのｒＲＮＡｓオペロンの発現が抑制されているＰＯＰ２１３６株²の形質転換はコロニーを生じない。ｄ、（上）Ａ２０５８Ｇ変異をもつＲｉｂｏ－Ｔ、及び５０Ｓサブユニットが致死変異をもつ解離可能な直交性リボソーム（右）を発現するＯＳＹＲＩＳ細胞のリボソーム組成。（下）Ｒｉｂｏ－Ｔ（Ａ２０５８Ｇ変異をもつ）といっしょに、致死変異をもつ（Ａ２０５８Ｇ変異をもたない）５０ＳサブユニットのＯＳＹＲＩＳ細胞において安定した維持を示す、ヌクレオチド２０５８に近位のｒＲＮＡ領域のプライマー伸長解析。レーン１～３：野生型２３ＳｒＲＮＡ（レーン１）、Ａ２０５８Ｇ変異をもつ２３ＳｒＲＮＡ（レーン２）又はＲｉｂｏ－Ｔのみを発現するＯＳＹＲＩＳ細胞から抽出されたＲＮＡ（レーン３）の調製での対照プライマー伸長。レーン４、ｐＲｂｓで形質転換され、且つ野生型の解離可能なリボソームを発現するＯＳＹＲＩＳ細胞由来のｒＲＮＡ。レーン５～８、２３ＳｒＲＮＡに変異の無い（レーン４）又は２３ＳｒＲＮＡに表記の致死変異をもつ直交性リボソームを発現する細胞に由来するｒＲＮＡ。ゲルのレーンの下の数字は、２３ＳｒＲＮＡを表すｃＤＮＡバンド（下の２本の矢印）の強度と、２３ＳｒＲＮＡ及びＲｉｂｏ－Ｔ特異的バンド（それぞれ下の２本の矢印と上の矢印）の強度の合計の比として推定した２３ＳｒＲＮＡの含有率（％）を示す。３つの独立した生物学的反復の代表的なゲルを示す。

図１３は、レポータータンパク質のインビトロ翻訳のＴｎａＣによって媒介される阻害。ＧＦＰ－ＴｎａＣ又はＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）レポーターの翻訳を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ無細胞系において低濃度（５０μＭ）又は高濃度（５ｍＭ）のＬ－トリプトファンの存在下で行った。ＴｎａＣ変異Ｗ１２Ｒは、Ｌ－トリプトファン濃度が高い場合に、終止コドンでのＴｎａＣによって媒介されるタンパク質放出の阻害を弱めることが知られている²⁸。データは３つの独立した実験の結果を表し、誤差バーは実験誤差を示す。ＤＮＡテンプレートの配列は付録Ｉで見ることができる。各実験において最も高い蛍光の読み取り値（相対蛍光単位）を１００％とした。

図１４は、ＯＳＹＲＩＳ細胞におけるＰＴＣライブラリー変異体の翻訳活性。個々の変異体の翻訳活性を、変異体ｏ－リボソームをもつＯＳＹＲＩＳ細胞におけるｏ－ＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）レポーター（部分的な停滞緩和を示す）（図４ａ～ｂを参照）の発現を、野生型２３ＳｒＲＮＡをもつｏ－リボソームをもつＯＳＹＲＩＳ細胞における同じレポーターの発現（１００％）と比較することによって推定した。それぞれの野生型２３ＳｒＲＮＡ残基が示され、且つ評価した変異体の同一性を示す。高い翻訳活性は、レポーターの発現が６０％以上であった場合として定義した。高いバイパススコアと高い翻訳活性を兼ね備えた機能獲得型変異体は、より濃いバーで示されている（図４ｅ及び図１３を参照）。データは２つの独立した生物学的複製の結果を表し、エラーバーは実験誤差を示す。数値データは図１７で見ることができる。野生型２３ＳｒＲＮＡをもつｏ－リボソームを含有するＯＳＹＲＩＳ細胞の正規化蛍光読み取り（Ａ₆₀₀での相対蛍光単位）を１００％とした。

図１５は、個々のＰＴＣ変異体の終結停滞バイパススコア（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｔａｌｌｉｎｇｂｙｐａｓｓｓｃｏｒｅ）。ＴｎａＣ停滞バイパススコアは、ＧＦＰ－ＴｎａＣを発現するＯＳＹＲＩＳ細胞におけるＧＦＰ蛍光（細胞密度で正規化）の、ＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）レポーターをもつ細胞における蛍光に対する比として算出した。野生型２３ＳｒＲＮＡをもつｏ－リボソームをもつ細胞のバイパススコアは０．１７である。閾値高バイパススコア（≧０．３、赤の破線）は、ｔｎａＣ終止コドンでの翻訳アレストを減少させることが報告されているＵ２６０９Ｃ変異²⁹、³⁰によってもたらされるスコアとした。それぞれの野生型２３ＳｒＲＮＡ残基を示し、且つ評価した変異体の同一性を示す。高いバイパススコアと高い翻訳活性を兼ね備えた機能獲得型変異体（図４ｅ及び図１４を参照）を青色で示した。データは２つの独立した生物学的反復の結果を表し、エラーバーは実験誤差を示す。各変異体の値を野生型リボソームと比較したスチューデントのｔ検定により、ｎ．ｓ．は統計的有意差なしを示し、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．００５を示し、＊＊はｐ＜０．０００５を示す。数値データは図１７で見ることができる。

図１６は、無細胞翻訳系における機能獲得型変異体の試験。ａ、ＯＳＹＲＩＳ細胞からのリボソーム材料のサブユニット解離条件下でのショ糖勾配分画。解離した野生型リボソームから調製した３０Ｓ及び５０Ｓサブユニット（矢印）をマーカーとして使用した。灰色の網掛けは、無細胞翻訳実験で集め、且つ使用した５０Ｓサブユニット画分を示す。ｂ、ｒＲＮＡのアガロースゲル電気泳動による５０Ｓ材料（Ａに記載のように単離）の純度の分析。野生型の１６Ｓ及び２３Ｓ並びに精製Ｒｉｂｏ－ＴｒＲＮＡを移動マーカーとして使用した。ｃ、インビトロトウプリンティング実験の原理（上）と結果（下）。ｔｎａＣテンプレートを、単離された変異体５０Ｓサブユニット及び野生型３０Ｓサブユニットからアセンブリしたリボソームで翻訳させた。各変異体について、３つの異なる条件下で翻訳反応を行った。（Ｉ）ＡサイトのｔｎａＣＰｒｏ２４コドンをもつリボソームを停滞させるプロリルｔＲＮＡ合成酵素の阻害剤Ｌ－ＰＳＡ²¹の存在下。対応するトウプリンティングバンド（白い（ｏｐｅｎ）アローヘッドで示される）の強度は、変異体リボソームの翻訳活性を反映する。（Ｈ）ｒＲＮＡ変異が停滞を緩和しない場合、終止コドンでの（緑のアローヘッドで示される）翻訳アレストにつながる高濃度のＬ－トリプトファン（５ｍＭ）の存在下。（Ｌ）低濃度のＬ－トリプトファン（５μＭ）で終止コドンでの停滞が検出されなかった場合、又は限定的な停滞が検出された場合。終結停滞効率（図４ｆ）を、Ｈ試料の終止コドントウプリントのバンドの、Ｉ試料のＰｒｏ２４コドンのバンドに対する強度の比として計算した。

図１７は、実施例１に記載のＰＴＣライブラリー変異体の翻訳活性及び終結停滞バイパススコアを示す表を提供する。

図１８は、実施例１で使用された大腸菌株の遺伝子型を示す表を提供する。

図１９は、実施例１で使用されたプライマーを示す表を提供する。

図２０は、実施例１で使用されたＯＳＹＲＩＳ細胞の遺伝子型を示す表を提供する。

図２１は、実施例１のプライマー伸長解析に使用されたプライマー及びヌクレオチドの組み合わせを示す表を提供する。

図２２は、Ａ）大サブユニットｒＲＮＡ及び小サブユニットｒＲＮＡの二次構造。Ｂ）大サブユニットｒＲＮＡ及び小サブユニットｒＲＮＡをコードする遺伝子。

図２３は、Ａ）大サブユニット、小サブユニット、及び連結部分を有するテザーリボソーム。Ｂ）図２３Ａのテザーリボソームをコードする遺伝子。

図２４は、リボソームｒＲＮＡのＰｅｒ変異。

図２５は、Ａ）ｒＲＮＡをコードする遺伝子を有するプラスミド。Ｂ）テザーリボソームのｒＲＮＡをコードする遺伝子を有するプラスミド。

タンパク質合成を成功裡に行うことができる、繋ぎ止められ、且つしたがって分離不能なサブユニットリボソーム（「Ｒｉｂｏ－Ｔ」）が開示される。Ｒｉｂｏ－Ｔは、小サブユニット、大サブユニット、及び小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める連結部分を含むリボソームを遺伝子操作すること（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって調製することができる。改変リボソームは、小サブユニットｒＲＮＡ配列、大サブユニットｒＲＮＡ配列、並びに小サブユニットｒＲＮＡ配列及び大サブユニットｒＲＮＡ配列を共有結合して単一体（ｓｉｎｇｌｅｅｎｔｉｔｙ）にすることができるＲＮＡリンカーを含むハイブリッドｒＲＮＡを含むことができる。改変リボソームは、改変リボソームのｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって調製することができる。改変リボソームはまた、変異のポジティブ又はネガティブな選択によって進化させることができる。際だったことに、Ｒｉｂｏ－Ｔはインビトロで機能的であるだけでなく、野生型（「ｗｔ」）リボソームの非存在下でさえも、細胞増殖を補助することもできる。結果として、Ｒｉｂｏ－Ｔには様々な用途がある。例えば、Ｒｉｂｏ－Ｔは、天然由来のタンパク質又は非天然由来のアミノ酸ポリマーなどの配列規定ポリマーを調製すること、インビトロ又はインビボで完全直交リボソーム－ｍＲＮＡ系を作り出すこと、リボソームの理解されていない機能を調べること、及び新しい機能をもつリボソームを設計することに使用することができる。

テザーリボソーム

テザーリボソーム並びにテザーリボソームを作製及び使用する方法を開示する米国特許出願公開第２０１７／００７３３８１号明細書が参照され、且つその内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。改変リボソームは、小サブユニット、大サブユニット、及び連結部分を含み、連結部分は小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める。改変リボソームは配列規定ポリマーの翻訳を補助することができる。

天然由来のリボソームとは対照的に、改変リボソームは、分離不能な大サブユニット及び小サブユニットを有する。図２２は、分離可能である小サブユニット及び大サブユニットを有する野生型リボソームの一部を示す。図２２Ａは、機能的なリボソームの一部分を一緒になって形成する大サブユニットｒＲＮＡ１０１及び小サブユニットｒＲＮＡ１０２の二次構造を示す。図２２Ｂは、大サブユニットｒＲＮＡ２０２をコードするオペロン及び小サブユニットｒＲＮＡ２０１をコードするオペロンを含むｒＲＮＡ遺伝子２００を示す。野生型ｒＲＮＡでは、一次転写物から大サブユニット及び小サブユニットのｒＲＮＡが切り出され、且つプロセスされて個々のサブユニットを成熟させる。

改変テザーリボソームの一実施形態を図２３に示す。図２３Ａは、改変リボソーム３００のｒＲＮＡの一部分の二次構造を示す。改変リボソームは、大サブユニット３０１、小サブユニット３０２、及び小サブユニット３０２を大サブユニット３０１と繋ぎ止める連結部分３０３を含む。この例では、連結部分３０３は、小サブユニット３０２のｒＲＮＡを大サブユニット３０１のｒＲＮＡと繋ぎ止める。改変リボソームは、ネイティブ大サブユニットｒＲＮＡの末端を閉じるコネクター３０４を含むことができる。図２３Ｂは、ｒＲＮＡ遺伝子４００、及び改変リボソーム３００にコードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇｔｏ）オペロンの一例を示す。

大サブユニット

大サブユニット３０１は、アミノ酸を結合してポリペプチド鎖を形成することができるサブユニットを含む。大サブユニット３０１は、第１の大サブユニットドメイン（「Ｌ１ポリヌクレオチドドメイン」又は「Ｌ１ドメイン」）、第２の大サブユニットドメイン（「Ｌ２ポリヌクレオチドドメイン」又は「Ｌ２ドメイン」）、及びコネクタードメイン（「Ｃポリヌクレオチドドメイン」又は「Ｃドメイン」）３０４を含むことができ、５’から３’に、Ｌ１ドメインの後ろに、Ｃドメイン及びＬ２ドメインが順に続く。

図２３Ｂは、改変リボソーム３００をコードするｒＲＮＡ遺伝子４００の例を示し、且つ改変リボソームを理解するための代替表現を提供する。コードするポリヌクレオチド４００は、改変リボソーム３００の様々なドメインをコードする異なる配列（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を含むことができる。図２３Ｂに示されるように、大サブユニットｒＲＮＡ３０１をコードするポリヌクレオチドは、Ｌ１ドメイン４０２をコードするポリヌクレオチド、Ｃドメイン４０６をコードするポリヌクレオチド、及びＬ２ドメイン４０３をコードするポリヌクレオチドを含む。

大サブユニットｒＲＮＡ３０１は順列置換バリアントであることができる。ある特定の実施形態では、順列置換バリアントは、分離可能な大サブユニットｒＲＮＡの円順列置換バリアントである。分離可能な大サブユニットは任意の機能的な大サブユニットであることができる。ある特定の実施形態では、分離可能な大サブユニットは２３ＳｒＲＮＡであることができる。ある特定の実施形態では、分離可能な大サブユニットは野生型大サブユニットｒＲＮＡである。具体的な実施形態では、分離可能な大サブユニットは野生型２３ＳｒＲＮＡである。

大サブユニット３０１が大サブユニットｒＲＮＡの順列置換バリアントである場合、５’から３’に、Ｌ１ドメインが後ろに続くＬ２ドメインから本質的になるポリヌクレオチド、大サブユニットｒＲＮＡに実質的に同一であることができる。ある特定の実施形態では、５’から３’に、Ｌ１ドメインが後ろに続くＬ２ドメインから本質的になるポリヌクレオチドは、大サブユニットｒＲＮＡと少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一である。

大サブユニット３０１が分離可能な大サブユニットｒＲＮＡの順列置換バリアントである、ある特定の実施形態では、大サブユニット３０１は、分離可能な大サブユニットｒＲＮＡのネイティブ５’及び３’末端を繋ぐＣドメイン３０４をさらに含むことができる。Ｃドメインは、１～２００ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施形態では、Ｃドメイン３０４は、１～１５０ヌクレオチド、１～１００ヌクレオチド、１～９０ヌクレオチド、１～８０ヌクレオチド、１～７０ヌクレオチド、１～６０ヌクレオチド、１～５０ヌクレオチド、１～４０ヌクレオチド、１～３０ヌクレオチド、１～２０ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、１～９ヌクレオチド、１～８ヌクレオチド、１～７ヌクレオチド、１～６ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、又は１～２ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣドメインはＧＡＧＡポリヌクレオチドを含む。

小サブユニット

小サブユニット３０２はｍＲＮＡに結合することができる。小サブユニット３０２は、第１の小サブユニットドメイン（「Ｓ１ポリヌクレオチドドメイン」又は「Ｓ１ドメイン」）及び第２の小サブユニットドメイン（「Ｓ２ポリヌクレオチドドメイン」又は「Ｓ２ドメイン」）を含み、５’から３’に、Ｓ１ドメインの後ろにＳ２ドメインが順に続く。再び図２３Ｂを参照して、小サブユニットｒＲＮＡ３０２をコードするポリヌクレオチドは、Ｓ１ドメイン４０１をコードするポリヌクレオチド及びＳ２ドメイン４０４をコードするポリヌクレオチドを含む。

小サブユニットｒＲＮＡ３０２は、分離可能な小サブユニットｒＲＮＡの順列置換バリアントであることができる。ある特定の実施形態では、順列置換バリアントは、分離可能な小サブユニットｒＲＮＡの円順列置換バリアントである。分離可能な小サブユニットは小サブユニットであることができる。ある特定の実施形態では、分離可能な小サブユニットは１６ＳｒＲＮＡであることができる。ある特定の実施形態では、分離可能な小サブユニットは野生型小サブユニットｒＲＮＡである。具体的な実施形態では、分離可能な小サブユニットは野生型２３ＳｒＲＮＡである。

小サブユニット３０２が小サブユニットｒＲＮＡの順列置換バリアントである場合、５’から３’に、Ｓ２ドメインが後ろに続くＳ１ドメインから本質的になるポリヌクレオチドは、小サブユニットｒＲＮＡに実質的に同一であることができる。ある特定の実施形態では、５’から３’に、Ｓ２ドメインが後ろに続くＳ１ドメインから本質的になるポリヌクレオチドは、小サブユニットｒＲＮＡと少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一である。

小サブユニットはさらに改変アンチシャイン・ダルガノ配列（ｍｏｄｉｆｉｅｄ－ａｎｔｉ－Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。改変アンチシャイン・ダルガノ配列は、内在性細胞ｍＲＮＡとは異なる相補的なシャイン・ダルガノ配列を有するテンプレートの翻訳を可能にする。

連結部分

再び図２３Ｂを参照して、連結部分３０３は、小サブユニット３０２を大サブユニット３０１と繋ぎ止める。ある特定の実施形態では、その連結部分は、大サブユニット３０１のヘリックスを小サブユニット３０２のヘリックスに共有結合させる。

連結部分はまた、第１のテザー（ｔｅｔｈｅｒ）ドメイン（「Ｔ１ポリヌクレオチドドメイン」又は「Ｔ１ドメイン」）及び第２のテザードメイン（「Ｔ２ポリヌクレオチドドメイン」又は「Ｔ２ドメイン」）を含むことができる。再び図２３Ｂを参照して、連結部分３０３をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ１ドメイン４０５をコードするポリヌクレオチド及びＴ２ドメイン４０７をコードするポリヌクレオチドを含む。

Ｔ１ドメインは、そのＳ１ドメイン及びＬ１ドメインを連結し、５’から３’に、Ｓ１ドメインの後ろに、Ｔ１ドメイン及びＬ１ドメインが順に続く。Ｔ１ドメインは、５～２００ヌクレオチド、５～１５０ヌクレオチド、５～１００ヌクレオチド、５～９０ヌクレオチド、５～８０ヌクレオチド、５～７０ヌクレオチド、５～６０ヌクレオチド、５～５０ヌクレオチド、５～４０ヌクレオチド、５～３０ヌクレオチド、又は５～２０ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチド、例えば、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、又は２０ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施形態では、Ｔ１はポリアデニンを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ１はポリウリジンを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ１は非構造化（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）ポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ１は、Ｔ２ドメインと塩基対を形成するヌクレオチドを含む。

Ｔ２ドメインは、そのＬ２ドメイン及びＳ２ドメインを連結し、５’から３’に、Ｌ２ドメインの後ろに、Ｔ２ドメイン及びＳ２ドメインが順に続く。Ｔ２ドメインは、５～２００ヌクレオチド、５～１５０ヌクレオチド、５～１００ヌクレオチド、５～９０ヌクレオチド、５～８０ヌクレオチド、５～７０ヌクレオチド、５～６０ヌクレオチド、５～５０ヌクレオチド、５～４０ヌクレオチド、５～３０ヌクレオチド、又は５～２０ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチド、例えば、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、又は２０ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施形態では、Ｔ１はポリアデニンを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ２はポリウリジンを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ２は非構造化ポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ２は、Ｔ１ドメインと塩基対を形成するヌクレオチドを含む。

Ｔ１ドメイン及びＴ２ドメインを有する実施形態では、Ｔ１ドメイン及びＴ２ドメインは、同じ数のポリヌクレオチドを有することができる。他の実施形態では、Ｔ１ドメイン及びＴ２ドメインは、異なる数のポリヌクレオチドを有することができる。

ある特定の実施形態では、改変リボソームは、５’から３’に、Ｔ１ドメイン、Ｌ１ドメイン、Ｃドメイン、Ｌ２ドメイン、Ｔ２ドメイン、及びＳ２ドメインが順に後ろに続くＳ１ドメインを含むことができる。具体的な実施形態では、改変リボソームは、５’から３’に、Ｔ１ドメイン、Ｌ１ドメイン、Ｃドメイン、Ｌ２ドメイン、Ｔ２ドメイン、及びＳ２ドメインが順に後ろに続くＳ１ドメインから本質的になることができる。

変異

ある特定の実施形態では、改変リボソームは１つ又は複数の変異を含みうる。具体的な実施形態では、変異は機能変換型変異である。機能変換型変異は、機能獲得型変異であっても、又は機能喪失型変異であってもよい。機能獲得型変異は、新しい機能を付与するいずれの変異であってもよい。機能喪失型変異は、親がもっていた機能の喪失をもたらすいずれの変異であってもよい。

ある特定の実施形態では、機能変換型変異はリボソームのペプチジルトランスフェラーゼ中心にあることができる。具体的な実施形態では、機能変換型変異は、ペプチジルトランスフェラーゼ中心のＡサイトにあることができる。他の実施形態では、機能変換型変異は、改変リボソームの出口トンネルにあることができる。

ある特定の実施形態では、機能変換型変異は抗生物質耐性変異であることができる。抗生物質耐性変異は、大サブユニット又は小サブユニットのいずれにあってもよい。ある特定の実施形態では、抗生物質耐性変異は、改変リボソームに、アミノグリコシド、テトラサイクリン、パクタマイシン、ストレプトマイシン、エデイン、又は小リボソームサブユニットを標的とする他の任意の抗生物質に対する耐性を付与することができる。ある特定の実施形態では、抗生物質耐性変異は、改変リボソームに、マクロライド、クロラムフェニコール、リンコサミド、オキサゾリジノン、プレウロムチリン、ストレプトグラミン、又は大リボソームサブユニットを標的とする他の任意の抗生物質に対する耐性を付与することができる。

テザーリボソームの設計

大サブユニットと小サブユニットを繋ぎ止めるキメラ構築物の成功には、ｉ）機能的なリボソームアセンブリのために、リボソームのタンパク質やバイオジェネシス因子と適切に相互作用し、ｉｉ）リボヌクレアーゼの分解を避け、且つｉｉｉ）サブユニットのシス会合を確実にするのに充分に短いが、翻訳開始、伸長、ペプチド放出に要するサブユニットの動きを最小限に抑えるのに充分に長いリンカーを有しなければならない。上記で概説した設計上の制約を考慮すると、大サブユニット及び小サブユニットのネイティブ末端は不適当である。例えば、ネイティブ原核生物リボソームでは、例えば、１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡの５’及び３’末端は離れすぎていて（＞１７０Å）、ヌクレアーゼ耐性ＲＮＡリンカーで繋ぐことができない。結果として、機能する改変リボソームを実現させるなら、代替の設計が必要とされる。

テザーリボソームを設計するための１つの方法は、大サブユニットを順列置換して新しい５’末端と３’末端を作り出すことである。ある特定の実施形態では、大サブユニットのネイティブ末端は互いに近位であるので、円順列置換（ｃｉｒｃｕｌａｒｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＣＰ）法が採用される。円順列置換は次のスキームで示すことができる。

したがって、ポリヌクレオチドの円順列置換変異では、ポリヌクレオチドの配列は各順列置換において維持されるが、各ヌクレオチドは個々の順列置換の末端にある。順列置換変異は、ポリヌクレオチドの二次構造を維持しつつ、ポリヌクレオチドの末端を異なる位置に置き換えるために利用される。

ＣＰ法は、Ｐｏｌａｃｅｋと同僚ら（ｃｏｗｏｒｋｅｒｓ）によってインビトロで最初に開発され［Ｅｒｌａｃｈｅｒ２００５］、そしてその後のパイロット研究により、３つの２３ＳｒＲＮＡ円順列置換バリアントがインビボで機能的サブユニットにアセンブリできることが示された［Ｋｉｔａｈａｒａ２００９］。そのアプローチを図２４に示す。図２４において、ネイティブ大サブユニットリボソーム５１０は、５’から３’に、第１の大サブユニットドメイン（Ｌ１ドメイン）が後ろに続く第２の大サブユニットドメイン（Ｌ２ドメイン）５１３を含む。大サブユニットリボソーム５１０（図２２Ａに示される大サブユニットｒＲＮＡ１０１を簡略に表したもの）のネイティブ末端は、コネクタードメイン（Ｃドメイン）５１１を通してつながれ、且つ５１２で新しい末端が作製される。この方法で作製された円順列置換サブユニットは、第１の大サブユニットドメイン（Ｌ１ドメイン）、それに続いて５’から３’に、コネクタードメイン（Ｃドメイン）及び第２の大サブユニットドメイン（Ｌ２ドメイン）を順に含む。図２４はまた、小サブユニット５０１並びにＬ１ドメイン５０２、それに続いて５’から３’に、Ｃドメイン５０６及びＬ２ドメイン５０３を順に含む新しい円順列置換大サブユニットをコードする遺伝子５００の一部を図示する。

上で概説したアプローチを続けると、図２３Ａ、Ｂに示されるように、小サブユニットの新しい末端は、連結部分によって大サブユニットの新しい末端と結合できるように作製される必要がある。

上で概説したアプローチを使用して、新しい末端をもつ円順列置換変異体のコレクションを生成することができる。新しい末端は、ネイティブサブユニットのどの位置にでも作製することができる。いくつかの順列置換変異体の新しい末端の結果は生存可能でないこともあるが、本明細書に開示の方法は、円順列置換変異体のコレクションを生成及び試験することができる。

いくつかの実施形態では、小サブユニット又は大サブユニットの新しい末端の位置は、サブユニットの二次構造、他のサブユニットへの近さ、リボソームの生存能、又はそれらのいずれかの組み合わせに基づいて選択することができる。

大サブユニット及び小サブユニットのいずれか又は両方の二次構造を用いて、新しい末端の位置を決定することができる。ある特定の実施形態では、新しい末端は、ネイティブサブユニットのヘリックスに作製される。いくつかの具体的な実施形態では、新しい末端は、ネイティブサブユニットのヘアピンに作製される。

他のサブユニットへの近さを用いて、大サブユニット若しくは小サブユニットのいずれか又は両方に新しい末端の位置を選択することができる。ある特定の実施形態では、新しい末端は、ネイティブサブユニットのサブユニット溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ）側に位置する。いくつかの他の実施形態では、新しい末端はサブユニット界面リム（ｉｎｔｅｒｆａｃｅｒｉｍ）の近くに位置する。ある特定の具体的な実施形態では、新しい末端は、サブユニット溶媒側に、且つサブユニット界面リムの近くに位置する。

リボソームの生存能を利用して、大サブユニット若しくは小サブユニットのいずれか又は両方に新しい末端の位置を選択することができる。例えば、集団内で高度に保存されていない大サブユニット若しくは小サブユニットのいずれか又は両方にあるポリヌクレオチド配列又は二次構造を利用して、新しい末端の位置を選択することができる。

改変リボソームが２３Ｓ構築物である、ある特定の実施形態では、連結部分は、２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアントのヘリックス１０、ヘリックス３８、ヘリックス４２、ヘリックス５４、ヘリックス５８、ヘリックス６３、ヘリックス７８、又はヘリックス１０１を共有結合させることができる。改変リボソームが１６ＳｒＲＮＡ構築物であるある特定の実施形態では、連結部分は、１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアントのヘリックス１１、ヘリックス２６、ヘリックス３３、又はヘリックス４４を共有結合させることができる。改変リボソームが１６Ｓ構築物である、ある特定の他の実施形態では、連結部分は、１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアントのＥ－サイトの近くに共有結合することができる。改変リボソームが１６Ｓ－２３Ｓ構築物である具体的な実施形態では、連結部分は、順列置換バリアント１６ＳｒＲＮＡのヘリックス４４を順列置換バリアント２３ＳｒＲＮＡのヘリックス１０１と共有結合させる、連結部分は、順列置換バリアント１６ＳｒＲＮＡのヘリックス２６を順列置換バリアント２３ＳｒＲＮＡのヘリックス１０と共有結合させる、連結部分は、順列置換バリアント１６ＳｒＲＮＡのヘリックス３３を順列置換バリアント２３ＳｒＲＮＡのヘリックス３８と共有結合させる、連結部分は、順列置換バリアント１６ＳｒＲＮＡのヘリックス１１を順列置換バリアント２３ＳｒＲＮＡのヘリックス５８と共有結合させる、連結部分は、順列置換バリアント１６ＳｒＲＮＡのヘリックス４４を順列置換バリアント２３ＳｒＲＮＡのヘリックス５８と共有結合させる、連結部分は、順列置換バリアント１６ＳｒＲＮＡのヘリックス２６を順列置換バリアント２３ＳｒＲＮＡのヘリックス５４と共有結合させる、連結部分は、順列置換バリアント１６ＳｒＲＮＡのヘリックス１１を順列置換バリアント２３ＳｒＲＮＡのヘリックス６３と共有結合させる、又は連結部分は、順列置換バリアント１６ＳｒＲＮＡのヘリックス４４を順列置換バリアント２３ＳｒＲＮＡのヘリックス６３と共有結合させる。

上で説明したように、連結部分は、分解を防ぎ、且つサブユニットのシス結合を確実にするために充分に短く、一方で翻訳開始、伸長、及びペプチド放出に要するサブユニットの動きを最小限に抑えるのに充分に長くなければならない。結果として、連結部分は、大サブユニットと短い（ｓｈｏｒｔ）サブユニットの新しい末端の間で数十オングストロームにわたっていなければならない。

テザーリボソームをコードするポリヌクレオチド

さらに、テザーリボソームをコードするポリヌクレオチドも開示される。テザーリボソームをコードするポリヌクレオチドは、発現してテザーリボソームのｒＲＮＡを生成できる任意のポリヌクレオチドでありうる。図２３Ｂは、テザーリボソームのｒＲＮＡを調製するためのポリヌクレオチドを示す。ポリヌクレオチド４００は、５’から３’に、Ｔ１リンカー４０５のｒＲＮＡをコードする配列、Ｌ１ドメイン４０２のｒＲＮＡをコードする配列、Ｃドメイン４０６のｒＲＮＡをコードする配列、Ｌ２ドメイン４０３のｒＲＮＡをコードする配列、Ｔ２リンカー４０７のｒＲＮＡをコードする配列、及びＳ２ドメイン４０４のｒＲＮＡをコードする配列が順に続くＳ１ドメイン４０１のｒＲＮＡをコードする配列を含む。

テザーリボソームをコードするポリヌクレオチドは、リボソームの他のｒＲＮＡサブユニット又はリボソームタンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことができる。例えば、順列置換１６ＳｒＲＮＡに繋ぎ止められた順列置換２３ＳｒＲＮＡを含む改変リボソームをコードするポリヌクレオチドは、５ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子をさらに含むことができる。

ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、外来の遺伝子材料を宿主細胞に導入できるベクターである。ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、又は人工染色体であることができる。

図２５Ａ、Ｂは、分離可能なサブユニットを有する原核生物リボソームをコードするプラスミド（図２５Ａ）及びテザーリボソームをコードするポリヌクレオチド（図２５Ｂ）の例を示す。図２５Ａにおいて、プラスミド６００は、プロモーター６１２、より小さい長方形で示されるプロセシングステムの発現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含む１６Ｓサブユニットをコードする遺伝子６０１、ｔＲＮＡ遺伝子６１３、より小さい長方形で示されるプロセシングステムの発現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含む２３Ｓサブユニットをコードする遺伝子６０２、５Ｓサブユニットをコードする遺伝子６１１、抗生物質耐性をコードする遺伝子６１４、及び複製起点遺伝子６１５を含む。いくつかの実施形態では、１６Ｓサブユニット６０１は改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含む。改変アンチシャイン・ダルガノ配列は、小サブユニットドメイン、すなわち、Ｓ１又はＳ２のいずれかに位置することができる。

任選選択で、分離可能なサブユニットを有する原核生物リボソームをコードするプラスミドは、１つ又は複数の追加の遺伝子を含む。追加の遺伝子（単数又は複数）は、非テザーリボソームの小サブユニットの改変アンチシャイン・ダルガノ配列に相補的である改変シャイン・ダルガノ配列を含むことができる。

分離可能なサブユニットを有するリボソームをコードするプラスミドとは対照的に、テザーリボソーム７００をコードするプラスミドは、大サブユニット、小サブユニット、及び大サブユニットを小サブユニットと繋ぐ連結部分７０１～７０７をコードするキメラ遺伝子を有する。プラスミドはテザーリボソーム７２０の発現のための遺伝子を含む。任意選択で、プラスミドは１つ又は複数の追加の遺伝子７４０をさらに含むことができる。

テザーサブユニットをコードする遺伝子は、５’から３’に、Ｔ１リンカーのｒＲＮＡをコードする配列７０５、Ｌ１ドメインのｒＲＮＡをコードする配列７０２、ＣドメインのｒＲＮＡをコードする配列７０６、Ｌ２ドメインのｒＲＮＡをコードする配列７０３、Ｔ２リンカーのｒＲＮＡをコードする配列７０７、及びＳ２ドメインのｒＲＮＡをコードする配列７０４が順に続くＳ１ドメインのｒＲＮＡをコードする配列７０１を含む。小さな長方形で示されるキメラ遺伝子に隣接する小サブユニットのプロセシング配列は、小サブユニット末端の適切な成熟のために保持できるが、大サブユニット７１６のプロセシング配列は、ハイブリッドから大サブユニットが切断されるのを防ぐために、プラスミドの別の場所に動かす、又は完全に取り除くことができる。

ある特定の実施形態では、テザーサブユニットをコードするプラスミドは、５Ｓサブユニットをコードする遺伝子７１１、抗生物質耐性をコードする遺伝子７１４、及び複製起点遺伝子７１５をさらに含む。

任意選択で、テザーサブユニットをコードするプラスミドは、改変アンチシャイン・ダルガノ配列７０８（丸）を含むことができる。改変アンチＳＤ配列は、Ｓ２ドメインをコードする配列内に位置するように図２５Ｂでは示されているが、改変アンチシャイン・ダルガノ配列は、小サブユニットドメインのいずれか、すなわちＳ１又はＳ２に位置することがある。いくつかの実施形態では、テザーサブユニットを含むプラスミドは野生型アンチシャイン・ダルガノ配列を含む。

任意選択で、テザーサブユニットをコードするプラスミドは１つ又は複数の追加の遺伝子７４０を含む。追加の遺伝子は、テザーリボソームの改変アンチシャイン・ダルガノ配列に相補的である改変シャイン・ダルガノ配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、その追加の遺伝子はレポーター遺伝子であることができる。具体的な実施形態では、レポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、追加の遺伝子は野生型アンチシャイン・ダルガノ配列を含む。

ポリヌクレオチドの調製

さらに、ポリヌクレオチドを調製する方法も本明細書で開示される。その方法は、順列置換サブユニットｒＲＮＡ構築物をコードするプラスミドを調製すること、生存可能な順列置換サブユニットｒＲＮＡ構築物を特定すること、及び大サブユニット、小サブユニット、及び小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める連結部分を含む改変リボソームをコードするポリヌクレオチドを調製することを含む。

順列置換サブユニットｒＲＮＡ構築物をコードするプラスミドの調製は、サブユニットのネイティブ末端を繋ぎ、且つ新しい末端を調製する円順列置換法によって達成することができる（図２４）。プラスミドの調製は、テンプレートの調製、プラスミドバックボーンの調製、及びアセンブリのステップから含むことができる。テンプレート調製ステップは、プラスミド消化及びライゲーションによって達成することができる。例として、ＣＰ２３Ｓテンプレートは、ｐＣＰ２３Ｓ－ＥａｇＩプラスミドからＥａｇＩ消化及びライゲーションによって調製することができる。各ＣＰ２３Ｓバリアントは、テンプレートとして環状化した（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ）２３ＳｒＲＮＡ遺伝子及び目的プラスミドバックボーンと重複する配列を加えたユニークなプライマー対を使用したＰＣＲによって生成される。プラスミドバックボーンの調製ステップは、ステムサイトをプロセスするサブユニットでバックボーンを直鎖にする制限酵素によるプラスミドの消化によって達成することができる。例として、プラスミドバックボーンは、２３Ｓプロセッシングステムサイトでバックボーンを直鎖にするＡｆｌＩＩ制限酵素でｐＡＭ５５２－２３Ｓ－ＡｆｌＩＩを消化することによって調製される。アセンブリステップでは、テンプレートがプラスミドバックボーンに組み込まれ、順列置換サブユニットｒＲＮＡをコードするプラスミドが調製される。アセンブリステップは、ギブソン・アセンブリによって達成することができる。

順列置換サブユニットｒＲＮＡの生存可能構築物を特定するために、順列置換サブユニットｒＲＮＡをコードするプラスミドを宿主細胞株に導入し、且つスクリーニング機構を用いて形質転換体が同定される。宿主細胞は、プラスミド及び野生型ｒＲＮＡオペロンをコードするプラスミドを含み、且つ抗生物質とともに寒天プレート上にスポットすることができる。選択機構は、抗生物質に耐性のある形質転換体を同定することを含む。例として、プラスミドを、野生型ｒＲＮＡオペロンをもつｐＣＳａｃＢプラスミドを有するΔ７ｒｒｎＳＱ１７１株に形質転換し、且つアンピシリン、エリスロマイシン及びスクロースに耐性のある形質転換体が選択される。野生型ｒＲＮＡオペロンが順列置換サブユニットｒＲＮＡをコードするプラスミドに完全に置換されていることを確認するために、３プライマー診断（ｔｈｒｅｅ－ｐｒｉｍｅｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）ＰＣＲチェックを全プラスミド抽出物に対して行うことができる。

大サブユニット、小サブユニット、及び小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める連結部分を含む改変リボソームをコードするポリヌクレオチドを調製することは、順列置換サブユニットｒＲＮＡ構築物と連結部分を他のサブユニットに一体化させる（ｇｒａｆｔｉｎｇ）を含む。ある特定の実施形態では、調製ステップはまた、大サブユニット、小サブユニット、及び小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める連結部分を含む改変リボソームをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを調製することを含むことができる。他の実施形態では、調製ステップはまた、大サブユニット、小サブユニット、及び小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める連結部分を含む改変リボソームをコードするポリヌクレオチド並びに追加の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを調製することを含むことができる。

テザーリボソームの調製

さらに開示されるのは、テザーリボソームを調製するための方法である。テザーリボソームは、改変リボソームをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって調製することができる。ある特定の実施形態では、テザーリボソームの調製は、改変リボソームをコードするポリヌクレオチドを調製することをさらに含む。他の実施形態では、テザーリボソームの調製は、細胞を、改変リボソームをコードするポリヌクレオチドで形質転換することをさらに含む。いくつかの具体的な実施形態では、テザーリボソームの調製は、ポリヌクレオチドを用意すること及び細胞をポリヌクレオチドで形質転換することをさらに含む。

テザーリボソームの進化

さらに開示されるのは、テザーリボソームを進化させるための方法である。テザーリボソーム進化のための方法は、改変リボソームをコードするポリヌクレオチドを発現させること及び変異体を選択することを含む。選択ステップは、ネガティブ選択ステップ、ポジティブ選択ステップ、又はネガティブとポジティブ両方の選択ステップを含みうる。選択された変異体は、機能変換型変異を有するテザーリボソームを含みうる。機能変換型変異は、機能獲得型変異であってもよく、又は機能喪失型変異であってもよい。

テザーリボソームの有用性及び用途

テザーリボソームのいくつかの使用及び用途を以下に記載する。

人工細胞

人工細胞が開示される。人工細胞は、改変リボソームをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、改変リボソームは、小サブユニット、大サブユニット、及び連結部分を含み、連結部分は、小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める。改変リボソームをコードするポリヌクレオチドを含む人工細胞は、ポリヌクレオチドを発現して改変リボソームを調製することができうる。他の実施形態では、人工細胞は改変リボソームを含む。いくつかの具体的な実施形態では、人工細胞は、改変リボソームをコードするポリヌクレオチド及び改変リボソームを含む。

人工細胞は１つ又は複数の翻訳機構を含むことができる。第１の実施形態では、人工細胞は改変リボソームを含む１つの翻訳機構を有し、改変リボソームは、小サブユニット、大サブユニット、及び連結部分を含み、連結部分は、小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める。

別の実施形態では、人工細胞は２つの翻訳機構を含むことができる。第１の翻訳機構はリボソームを含むことができ、そのリボソームは大サブユニットと小サブユニットの間の連結部分を欠く。第２の翻訳機構は改変リボソームを含み、改変リボソームは、小サブユニット、大サブユニット、及び連結部分を含み、連結部分は、小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める。いくつかの実施形態では、第１の翻訳機構又は第２の翻訳機構は直交翻訳機構である。いくつかの実施形態では、第１の翻訳機構及び第２の翻訳機構は直交翻訳機構である。直交翻訳機構は、リボソームのアンチシャイン・ダルガノ配列を改変して、内在性細胞ｍＲＮＡと異なる相補的なシャイン・ダルガノ配列を有するテンプレートの翻訳を可能にすることによって調製することができる。

別の実施形態では、タンパク質翻訳のための第１の機構及び第２の機構を含む細胞が開示される。第１の機構は、野生型アンチシャイン・ダルガノ配列をもつテザーリボソームを含み、ｍＲＮＡは、天然遺伝コード（すなわち、細胞に内在するトリプレットコード）に従ってリボソームによって翻訳される。第２の機構は、異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅ）の発現を可能にするように機能する非テザーリボソームに由来する人工的な機構を含む。いくつかの実施形態では、第２の機構は、改変アンチシャイン・ダルガノ配列を有するリボソームを含む。

配列規定ポリマーの調製

さらに、配列規定ポリマーを調製するための方法も提供される。ある特定の実施形態では、配列規定ポリマーを調製する方法は、改変リボソームを用意すること、及び配列規定ポリマーをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートを用意することを含む。いくつかの実施形態では、改変リボソームは、小サブユニット、大サブユニット、及び連結部分を含み、且つ連結部分は、小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止め、且つそこにおいて、改変リボソームは改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含む。いくつかの実施形態では、改変リボソームは、小サブユニット、大サブユニットを含み、連結部分がなく、且つ改変シャイン・ダルガノ配列を含む。本方法の１つの態様では、ステップのいずれか１つは、配列規定ポリマーのｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの外因性ＤＮＡテンプレートを加えることを含む。

本発明の方法の１つの態様では、配列規定ポリマーは天然バイオポリマーである。本発明の方法の別の態様では、配列規定ポリマーは非天然バイオポリマーである。ある特定の実施形態では、配列規定ポリマーはアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸は天然アミノ酸でありうる。本明細書で使用される場合、天然アミノ酸は、普遍遺伝コードのコドンによって直接コードされたタンパク質原性のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸であることができる。本明細書で使用される場合、非天然アミノ酸とは、非タンパク質原性のアミノ酸のことである。非天然アミノ酸の例としては、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐβ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｓｅｒｉｎｅ）、ホスホノチロシン（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；メチオニンアミノ酸の非天然類似体；ロイシンアミノ酸の非天然類似体；イソロイシンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、若しくはアミノ置換アミノ酸、又はそれらの組み合わせ；光活性化可能架橋剤付きアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージドアミノ酸及び／又は光異性化可能アミノ酸；ビオチン又はビオチン－アナログ含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能又は光切断可能アミノ酸；側鎖が伸長したアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素連結型糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α－ヒドロキシ含有酸；アミノチオアシッド；α，αジ置換アミノ酸；β－アミノ酸；γ－アミノ酸、プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、並びにフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、配列規定ポリマーはポリペプチド又はタンパク質である。

本発明の１つの態様では、テザーサブユニットの配置は、２３Ｓと１６ＳｒＲＮＡの間の連結部分を含む。この態様の１つの観点では、連結部分は、２３ＳｒＲＮＡのヘリックス１０１を１６ＳｒＲＮＡのヘリックス４４に共有結合させる。この態様の別の観点では、連結部分は、５ヌクレオチド～２００ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む。連結されたリボソームは、内在性細胞ｍＲＮＡとは異なる相補的なＳＤ配列を有する翻訳テンプレートのインビトロ翻訳を可能にするように改変アンチシャイン・ダルガノ配列を有する改変１６ＳｒＲＮＡをさらに含むことができる。このように、配列規定バイオポリマーを高効率で生成するｍＲＮＡのインビトロでの選択的翻訳が可能である。

本発明の１つの態様では、改変リボソームは繋ぎ止められておらず、且つ内在性細胞ｍＲＮＡとは異なる相補的なＳＤ配列を有する翻訳テンプレートのインビトロ又はインビボ翻訳を可能にするように改変アンチシャイン・ダルガノ（ＳＤ）１６Ｓ配列を含む。このように、配列規定バイオポリマーを高効率で生成するｍＲＮＡの選択的翻訳が可能である。

本発明の１つの態様では、ｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートは改変シャイン・ダルガノ配列をコードする。ある特定の実施形態では、改変リボソームは、ｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートによってコードされるシャイン・ダルガノ配列に相補的なアンチシャイン・ダルガノ配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートは、改変された細胞（例えば、２つの異なるタンパク質翻訳機構を含む細胞）、そのような細胞からの抽出物、又はそのような細胞からの精製された翻訳系に供給される。

配列規定ポリマーはインビトロで調製することができる。いくつかの実施形態では、配列規定ポリマーをインビトロで調製する方法は、リボソーム欠失細胞抽出物又は精製された翻訳系を用意することさらに含む。ある特定の実施形態では、リボソーム欠失細胞抽出物は、指数増殖期の中～後期の細胞培養物又は採取時に～３．０のＯ．Ｄ．６００を有する培養物から調製されるＳ１５０抽出物を含む。本発明の１つの態様では、リボソーム欠失抽出物は、スペルミン、スペルミジン及びプトレシンなどの１つ又は複数のポリアミン、又はそれらの組み合わせで調製される。本発明の１つの態様では、リボソーム欠失抽出物は約５０ｍＭ～約３００ｍＭの塩の濃度で調製される。

リボソーム欠失細胞抽出物の調製及びそれらを配列規定ポリマーのインビトロでの翻訳を補助するために使用する方法が、ＭｉｃｈａｅｌＪｅｗｅｔｔｅｔａｌ．による２０１４年４月２４日に出願された”ＩＭＰＲＯＶＥＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＭＡＫＩＮＧＲＩＢＯＳＯＭＥＳ”と題する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／３５３７６号明細書に開示され、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。

本方法の１つの態様では、ｍＲＮＡは、リボソーム欠失細胞抽出物に存在する内在性細胞ｍＲＮＡとは異なる改変シャイン・ダルガノ配列をコードする。この態様の１つの観点では、改変リボソームは、改変シャイン・ダルガノ配列に相補的な改変アンチシャイン・ダルガノ配列を有する改変１６ＳｒＲＮＡを含み、ｍＲＮＡのインビトロでの翻訳を可能にしてインビトロで配列規定バイオポリマーを調製する。

１つの態様では、本方法は、流加回分操作又は連続操作向けに構成される。本方法の別の態様では、操作中に少なくとも１つの基質が補充される。

本方法の１つの態様では、少なくとも１つのステップはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。本方法の１つの態様では、少なくとも１つの高分子クラウディング剤がステップの１つに含まれる。本方法の１つの態様では、少なくとも１つの還元剤（例えば、ジチオトレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩など）が、ステップの１つに含まれる。

配列規定ポリマーはインビボで調製することができる。配列規定ポリマーをインビボで調製する方法は、上記に開示の人工細胞で行うことができる。人工細胞は、改変リボソームを含む翻訳機構を有することができ、そこにおいて改変リボソームは、小サブユニット、大サブユニット、及び連結部分を含み、且つ連結部分は、小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止める。ある特定の実施形態では、人工細胞は１つの翻訳機構を有する。他の実施形態では、細胞は２つの翻訳機構を有する。いくつかの実施形態では、細胞は２つのタンパク質翻訳機構を有し、第１のタンパク質翻訳機構はリボソームを含み、そこにおいてリボソームは、大サブユニット及び小サブユニットの間の連結部分を欠き、且つ第２のタンパク質翻訳機構はリボソームを含み、そこにおいてリボソームは、大サブユニットと小サブユニットを連結する連結部分を含む。いくつかの実施形態では、第１の翻訳系のリボソームは改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含み、且つ第２の翻訳系のリボソームは野生型（改変されていない（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ））アンチシャイン・ダルガノ配列を含む。

用語

別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で定義及び使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により援用される文書における定義、及び／又は定義された用語の通常の意味より優先されることが理解されるべきである。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明らかに反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

範囲は個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３つのメンバーからなる群とは、１つ、２つ、３つのメンバーを有する群を意味する。

また、明らかに反対の指示がない限り、２つ以上（ｍｏｒｅｔｈａｎｏｎｅ）のステップ又は行為を含む本明細書でクレームされるいずれの方法においても、方法のステップ又は行為の順序は、方法のステップ又は行為が記載の順序に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。

「ｍａｙ」という法助動詞は、複数の記載された実施形態又はその中に含まれる特徴のうち、１つ又は複数の選択肢（ｏｐｔｉｏｎｓ）又は選択（ｃｈｏｉｃｅｓ）の好ましい使用又は選択を意味する。特定の実施形態又はその中に含まれる特徴に関する選択肢又は選択が開示されていない場合、「ｍａｙ」という法助動詞は、記載の実施形態若しくはその中に含まれる特徴の態様（ａｓｐｅｃｔ）をどのように作製若しくは使用するかに関する積極的行動（ａｆｆｉｒｍａｔｉｖｅａｃｔ）、又は記載の実施形態若しくはその中に含まれる特徴に関する特定の技能（ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｋｉｌｌ）を使用する最終決定（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅｄｅｃｉｓｉｏｎ）を意味する。この後者の文脈では、「ｍａｙ」という法助動詞は、「ｃａｎ」という助動詞と同じ意味及び言葉の含み（ｃｏｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を有する。

特許請求の範囲でも、上記明細書でも、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「もっている（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「もつ（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ）」及び同種のもののすべての移行句は、オープンエンド（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）である、すなわち、含むが限定されないことを意味するものと理解される。米国特許庁の特許審査手続マニュアル（ｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔＯｆｆｉｃｅＭａｎｕａｌｏｆＰａｔｅｎｔＥｘａｍｉｎｉｎｇＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）第２１１１．０３条に規定されているように、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」という経過句のみが、それぞれクローズド（ｃｌｏｓｅｄ）又はセミクローズド（ｓｅｍｉ－ｃｌｏｓｅｄ）の移行句であるものとする。

本明細書で使用される「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有）、及びプリン又はピリミジン塩基のＮグリコシドである他の任意のタイプのポリヌクレオチドを意味する。「核酸」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語の間には、意図された長さの区別はなく、これらの用語は互いに交換可能に使用されることになる。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語は、二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ並びに二本鎖及び一本鎖のＲＮＡを包含する。本発明で使用する場合、オリゴヌクレオチドはまた、塩基、糖又はリン酸骨格が改変された類似体、及び非プリン又は非ピリミジンヌクレオチド類似体も含みうる。

ポリヌクレオチドの「断片」は、参照配列と配列が同一であるが、参照配列よりも長さが短いポリヌクレオチド配列の一部分である。断片は、参照配列の全長から少なくとも１つのヌクレオチドを除いたものまでを含みうる。例えば、断片は、参照ポリヌクレオチドの５～１０００個の連続したヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、断片は、参照ポリヌクレオチドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、又は５００個の連続したヌクレオチドを含みうる。断片は、分子のある特定の領域から優先的に選択することができる。なお、「少なくとも１つの断片」という用語は、全長のポリヌクレオチドを包含する。参照ポリヌクレオチド配列の「バリアント」、「変異体」又は「誘導体」は、参照ポリヌクレオチド配列の断片を含むことがある。

ポリヌクレオチド配列に関しては、同一性パーセントは、例えば、特定の配列番号で定義されるように、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定されることもあれば、又はより短い長さわたって、例えばより大きな定義された配列から取られた断片にわたって、例えば少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、若しくは少なくとも２００個の連続したヌクレオチドの断片の長さにわたって測定されることもある。そのような長さはくまで例示に過ぎず、本明細書において表、図、又は配列表に示される配列によってサポートされる任意の断片の長さを使用して同一性のパーセント割合が測定でされうる長さを記述できることが理解される。

ポリヌクレオチド配列に関して、「バリアント」、「変異体」又は「誘導体」は、米国国立生物工学情報センターのウェブサイトで利用可能なｂｌａｓｔｎと「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール（ＴａｔｉａｎａＡ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，ＴｈｏｍａｓＬ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）， ”Ｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ－ａｎｅｗｔｏｏｌｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ．１７４：２４７－２５０を参照）を使用して、１つの核酸配列のある特定の長さにわたって、特定の核酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列として定義されうる。そのような核酸の対は、ある特定の定義された長さにわたって、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％以上の配列同一性を示すことができる。

「組換え核酸」は天然には存在しない配列である、又は２つ以上の通常は別々の配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作られる配列を有する。この人工的な組み合わせは、多くの場合化学合成によって、又はより一般的には核酸の単離セグメントの人工的に操作によって、例えば当該技術分野で公知の遺伝子工学技術よって達成される。組換え体という用語は、一部の核酸の付加、置換又は欠失のみによって改変された核酸を含む。しばしば、組換え核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結された核酸配列を含むことがある。そのような組換え核酸は、例えば、細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部でありうる。

本明細書に開示の核酸は、「実質的に単離又は精製された」ものであることができる。「実質的に単離又は精製された」という用語は、その自然環境から取り出され、且つそれが天然に結合する他の構成成分が少なくとも６０％ない、好ましくは少なくとも７５％ない、より好ましくは少なくとも９０％ない、さらにより好ましくは少なくとも９５％ない核酸を意味する。

オリゴヌクレオチドは、Ｎａｒａｎｇｅｔａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０－９９のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９－１５１のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅｅｔａｌ．，１９８１，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２２：１８５９－１８６２のジエチルホスホラミダイト法、及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体担体（ｓｏｌｉｄｓｕｐｐｏｒｔ）法などの方法による直接化学合成を含む任意の好適な方法によって調製することができる。各文献は参照により本明細書に援用される。オリゴヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドのコンジュゲートの合成方法の総説は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１（３）：１６５－１８７に示され、この文献は参照により本明細書に援用される。

本明細書で使用される「プライマー」という用語は、好適な条件下でＤＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。そのような条件としては、４つの異なるヌクレオシド三リン酸及び伸長剤（例えばＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下において適切な緩衝液と好適な温度で、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導するもので挙げられる。

好ましくは、プライマーは一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用目的によるが、典型的には、約６～約２２５個のヌクレオチドの範囲であり、１５～３５個のヌクレオチド、１８～７５個のヌクレオチド、２５～１５０個のヌクレオチドなど中間の範囲を含む。短いプライマー分子は一般に、テンプレートと充分に安定したハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレート核酸の配列を正確に反映する必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするのに充分な相補性がなければならない。所与の標的配列の増幅に適したプライマーの設計は、当該技術分野で周知であり、且つ本明細書で引用された文献に記載されている。

プライマーは、プライマーの検出又は固定化を可能にする追加の特徴を組み込むことができるが、ＤＮＡ合成の開始点として作用するというプライマーの基本的な性質は変わらない。例えば、プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしないが、増幅産物のクローニング若しくは検出を容易にする、又はＲＮＡの転写（例えばプロモーターを含めることによって）若しくはタンパク質の翻訳（例えば、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）などの５’－ＵＴＲ若しくはポリ（Ａ）ｎ配列（ｎは約２０から約２００までの範囲である）などの３’－ＵＴＲ要素を含めることによって）ＲＮＡの転写を可能にする追加の核酸配列を５’末端に含有することができる。プライマーの、テンプレートと充分に相補的でハイブリダイズする領域を、本明細書ではハイブリダイジング領域と呼ぶ。

「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ及び他のトランス作用性転写因子を導いて、シス作用性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡテンプレートからＲＮＡ転写を開始するシス作用性ＤＮＡ配列を意味する。

本明細書で使用される「標的」、「標的配列」、「標的領域」、及び「標的核酸」という用語は同義であり、増幅、配列決定、又は検出される核酸の領域又は配列を意味する。

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、２本の一本鎖核酸が相補的な塩基対形成により二重鎖構造を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖の間でも、又はミスマッチの小さな領域が入った「実質的に相補的な」核酸鎖の間でも起こりうる。完全に相補的な核酸鎖のハイブリダイゼーションが強く好まれる条件は、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「配列特異的なハイブリダイゼーション条件」と呼ばれる。実質的に相補的な配列の安定した二重鎖は、より低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でも達成することができ、許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の好適な調整によって制御することができる。核酸技術の当業者は、当技術分野によって提供される指針に従って、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対組成、イオン強度、並びにミスマッチ塩基対の発生率を含む数多くの変数を考慮して、経験的に二重鎖安定性を決めることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ－ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（３／４）：２２７－２５９、及びＯｗｃｚａｒｚｙｅｔａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：５３３６－５３５３を参照。これらの文献は参照により本明細書に援用される）。

「増幅反応」という用語は、酵素反応を含む、テンプレート核酸配列のコピー数の増加をもたらす、又はテンプレート核酸の転写をもたらす化学反応を意味する。増幅反応としては、逆転写、リアルタイムＰＣＲを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照）、並びにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙｅｔａｌ．、米国特許第５，４９４，８１０号明細書を参照）が挙げられる。好ましい（Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）「増幅反応条件」又は「増幅条件」は、典型的には、２ステップ又は３ステップのいずれかのサイクルを含む。２ステップサイクルは、高温の変性ステップ、それに続くハイブリダイゼーション／伸長（又はライゲーション）ステップを有する。３ステップサイクルは、変性ステップ、それに続くハイブリダイゼーションステップ、それに続く伸長ステップを含む。

本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を意味する。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。既知のＤＮＡポリメラーゼは、としては、例えば、ピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。「ＲＮＡポリメラーゼ」はリボヌクレオチドの重合を触媒する。前述のＤＮＡポリメラーゼの例は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしても知られる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼもＤＮＡポリメラーゼの範囲に入る。レトロウイルスにコードされるウイルスポリメラーゼを含む逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの一例である。ＲＮＡポリメラーゼ（「ＲＮＡＰ」）の既知の例としては、例えば、特Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。前述のＲＮＡポリメラーゼの例は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしても知られる。上記酵素のいずれかのポリメラーゼ活性は、当該技術分野で周知の手段により測定することができる。

本明細書で使用される場合、「配列規定ポリマー」という用語は、特定の一次配列を有するポリマーを意味する。配列規定ポリマーは、遺伝子が特定の一次配列を持つポリマーをコードしている場合には、遺伝的にコードされた（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ－ｅｎｃｏｄｅｄ）規定ポリマーと同等でありうる。

本明細書で使用される場合、プライマーは、充分にストリンジェントな条件下で増幅反応に使用されたとき、プライマーが主に標的核酸にハイブリダイズする場合に、標的配列に対して「特異的」である。典型的には、プライマー－標的配列二重鎖の安定性が、プライマー及び試料中の他の配列の間に形成される二重鎖の安定性よりも大きい場合、プライマーは標的配列に特異的である。当業者であれば、塩の条件、並びにプライマーの塩基組成及びミスマッチの位置などの様々な要因が、プライマーの特異性に影響を与えることなり、且つプライマーの特異性は、多くの場合、日常的に実験的に確認することが必要であることを認識するであろう。プライマーが標的配列とのみ安定した二重鎖を形成できるハイブリダイゼーション条件を選択することができる。したがって、好適にストリンジェントな増幅条件下で標的特異的プライマーを使用することにより、標的プライマー結合部位を含有するそれらの標的配列の選択的増幅が可能となる。

本明細書で使用される場合、「発現テンプレート」は、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳できる少なくとも１つのＲＮＡを転写するための基質となる核酸を意味する。発現テンプレートは、ＤＮＡ又はＲＮＡから構成される核酸を含む。発現テンプレート用の核酸に使用するためのＤＮＡに好適な供給源としては、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡに変換できるＲＮＡが挙げられる。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、特に、組織試料、生検、スワブ、喀痰、血液試料、糞便試料、尿試料、掻爬検体（ｓｃｒａｐｉｎｇ）など、いずれの生物源に由来してもよい。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、宿主細胞でも、又はウイルス由来でもあることができ、且つ現存する生物及び絶滅した生物を含むあらゆる種に由来することができる。本明細書で使用される場合、「発現テンプレート」及び「転写テンプレート」は同じ意味を有し、互いに交換可能に使用される。

本明細書で使用される場合、「繋ぎ止められた」、「結合した（ｃｏｎｊｏｉｎｅｄ）」、「連結された」、「つながれた」、「結合された（ｃｏｕｐｌｅｄ）」及び「共有結合した」は、修飾語句（ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）として同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、「テザーリボソーム」及び「Ｒｉｂｏ－Ｔ」は互いに交換可能に使用されることになる。

本明細書で使用される場合、「改変リボソーム」という用語は、改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）リボソームを意味する。好ましい（Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）改変としては、１つ又は複数のサブユニットを繋ぎ止めること、サブユニットを改変すること（ａｌｔｅｒｉｎｇｏｒｓｕｂｕｎｉｔｓ）、及び１つ又は複数のｒＲＮＡ配列を変化させることが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい（Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）、非限定的な改変としては、１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、アンチシャイン・ダルガノ配列、ペプチジルトランスフェラーゼ中心、新生出口トンネル（ｎａｓｃｅｎｔｅｘｉｔｔｕｎｎｅｌ）、リボソームのコーディング中心、伸長因子との相互作用部位、ｔＲＮＡ結合部位、シャペロン結合部位、新生鎖修飾酵素結合部位、ＧＴＰアーゼ中心、抗生物質耐性配列の導入などの改変の１つ又は複数が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「野生型」、「ネイティブの」又は「内在性」という用語は、所与の生物に典型的に見出される物質又は状態を意味する。

本明細書で使用される場合、「変異体」、「外因性の」、「直交性の」及び「非ノンネイティブの」という用語は、所与の生物に典型的に見出されない物質又は状態を意味する。

ここで使用される場合、「ＣＰ」は、円順列置換サブユニットを意味する。本明細書で使用される場合、ＣＰの後に「２３Ｓ」が続くとき、それは円順列置換２３ＳｒＲＮＡを意味する。本明細書で使用される場合、ＣＰの後に数字が続くとき、文脈によって、二次構造における新しい５’末端の位置を指すこともあり（例えばＣＰ１０１は、新しい５’末端が２３ＳｒＲＮＡのヘリックス１０１にあることを意味し）、又は新しい５’ヌクレオチドの位置を指すこともある（例えばＣＰ２８６１は、新しい５’ヌクレオチドが２３ｒＲＮＡのヌクレオチド２８６１であることを意味する）。

本明細書で使用される場合、「翻訳テンプレート」は、ポリペプチド又はタンパク質を合成するためにリボソームによって使用されうる、発現テンプレートからの転写のＲＮＡ産物を意味する。

本明細書で使用される場合、「リボソーム結合部位」又は「ＲＢＳ」は、タンパク質翻訳の開始の間にリボソームを動員する役割を担う、ｍＲＮＡ転写物の開始コドンの上流にあるヌクレオチドの配列である。ＲＢＳはシャイン・ダルガノ配列を含みうる。シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列は、原核生物のメッセンジャーＲＮＡのリボソーム結合部位であり、一般に開始コドンＡＵＧの約８塩基上流に位置する。ＳＤ配列は、リボソームを開始コドンと整列させることによって、リボソームをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にリクルートしてタンパク質合成を開始するのを助ける。６塩基のコンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧであり、且つ大腸菌ではＡＧＧＡＧＧＵである。

その他

本明細書に記載の方法はすべて、本明細書に特に示されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書で提供されるすべての例又は好ましい（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）文言（例えば「など（ｓｕｃｈａｓ）」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図しており、別段の主張がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書のいかなる文言も、クレームされていない要素が発明の実施に不可欠であることを示すものとして解釈されるべきではない。

本発明の好ましい態様を、本発明を実施するための本発明の発明者らに公知の最良の態様を含めて、本明細書に記載する。それらの好ましい態様の変形は、前述の説明を読めば、当業者には明らかになるであろう。本発明の発明者らは、当業者がそのような変形を適宜採用することを予想しており、本発明の発明者らは、本明細書に具体的に記載した以外の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に記載の主題の、適用法によって許されるすべての変更及び均等物を含む。さらに、本明細書で特に指示されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、上記要素のすべての考えられる変形でのそれら要素のいずれの組み合わせも本発明によって包含される。

例示的な実施形態
以下の実施形態は例示であり、且つクレームされた主題の範囲を限定するように解釈されるべきである。

実施形態１．改変リボソームであって、小サブユニット、大サブユニット、及び連結部分を含み、ａ．連結部分が小サブユニットを大サブユニットと繋ぎ止め、且つｂ．そこにおいて配列規定ポリマーの翻訳を補助することができる改変リボソーム。

実施形態２．小サブユニットがｒＲＮＡ及びタンパク質を含み、大サブユニットがｒＲＮＡ及びタンパク質を含み、且つ前記連結部分が小サブユニットのｒＲＮＡを大サブユニットのｒＲＮＡと繋ぎ止める実施形態１の改変リボソーム。

実施形態３．大サブユニットが、２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント（例えば、２３ｒＲＮＡの円順列置換バリアント）を含む実施形態１又は２の改変リボソーム。

実施形態４．小サブユニットが、１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント（例えば、２３ｒＲＮＡの円順列置換バリアント）を含む実施形態１～３の改変リボソーム。

実施形態５．小サブユニットが、内在性細胞ｍＲＮＡと異なる相補的なシャイン・ダルガノ配列を有するテンプレートの翻訳を可能にする改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含む（例えば、そこにおいて小サブユニットの改変アンチシャイン・ダルガノ配列が内在性細胞ｍＲＮＡと異なるシャイン・ダルガノ配列に相補的である）実施形態１～４のいずれかの改変リボソーム。

実施形態６．連結部分が、大サブユニットのヘリックスを小サブユニットのヘリックスに共有結合させる実施形態１～５のいずれかの改変リボソーム。

実施形態７．連結部分が、２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアントヘリックス１０、ヘリックス３８、ヘリックス４２、ヘリックス５４、ヘリックス５８、ヘリックス６３、ヘリックス７８、又はヘリックス１０１を共有結合させる実施形態３～６のいずれかの改変リボソーム。

実施形態８．連結部分が、１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアントのヘリックス１１、ヘリックス２６、ヘリックス３３、又はヘリックス４４を共有結合させる実施形態４～７のいずれかの改変リボソーム。

実施形態９．大サブユニットが、Ｌ１ポリヌクレオチドドメイン（例えば、２３ＳｒＲＮＡの断片）、Ｌ２ポリヌクレオチドドメイン（例えば、２３ＳｒＲＮＡの断片）、及びＣポリヌクレオチドドメインを含む、又はそれらから本質的になり、そこにおいて、Ｌ１ドメインの後ろに、５’から３’に、Ｃドメイン及びＬ２ドメインが順に続く実施形態１～８のいずれかの改変リボソーム。

実施形態１０．５’から３’に、Ｌ１ドメインが続くＬ２ドメインを含む、又はそれから本質的になるポリヌクレオチドが、２３ＳｒＲＮＡ又は２３ＳｒＲＮＡの断片に実質的に同一である実施形態９の改変リボソーム。

実施形態１１．５’から３’に、Ｌ１ドメインが続くＬ２ドメインを含む、又はそれから本質的になるポリヌクレオチドが、２３ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡの断片に少なくとも９５％同一である（又は２３ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡの断片に少なくとも９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である）実施形態９又は１０の改変リボソーム。

実施形態１２．Ｃドメインが、１～２００ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む実施形態９～１１のいずれかの改変リボソーム。

実施形態１３．ＣドメインがＧＡＧＡポリヌクレオチドを含む実施形態９～１２のいずれかの改変リボソーム。

実施形態１４．小サブユニットが、Ｓ１ポリヌクレオチドドメイン（例えば、１６ＳｒＲＮＡの断片）及びＳ２ポリヌクレオチドドメイン（例えば、１６ＳｒＲＮＡの断片）を含み、又はそれらから本質的になり、Ｓ１ドメインの後ろに、５’から３’に、Ｓ２ドメインが順に続く実施形態１～１３のいずれかの改変リボソーム。

実施形態１５．５’から３’に、Ｓ２ドメインが続くＳ１ドメインを含む、又はそれから本質的になるポリヌクレオチドが、１６ＳｒＲＮＡ（又は１６ＳｒＲＮＡの断片）に実質的に同一である実施形態１４の改変リボソーム。

実施形態１６．５’から３’に、Ｓ２ドメインが続くＳ１ドメインを含む、又はそれから本質的になるポリヌクレオチドが、１６ＳｒＲＮＡに少なくとも９５％同一である（又は２３ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡの断片に少なくとも９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である）実施形態１４又は１５の改変リボソーム。

実施形態１７．連結部分が、Ｔ１ポリヌクレオチドドメイン及びＴ２ポリヌクレオチドドメインを含む実施形態１～１６のいずれかの改変リボソーム。

実施形態１８．Ｔ１ドメインがＳ１ドメイン及びＬ１ドメインを連結し、且つそこにおいて、Ｓ１ドメインの後ろに、５’から３’に、Ｔ１ドメイン及びＬ１ドメインが順に続く実施形態１７の改変リボソーム。

実施形態１９．Ｔ１ドメインが、５～２００ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む実施形態１７又は１８の改変リボソーム。

実施形態２０．Ｔ１ドメイが、７～２０ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む実施形態１９の改変リボソーム。

実施形態２１．Ｔ１ドメインがポリアデニンポリヌクレオチドを含む実施形態１７～２０のいずれかの改変リボソーム。

実施形態２２．Ｔ１ドメインが、７～１２アデニンヌクレオチドの長さを有するポリアデニンポリヌクレオチドを含む実施形態１７～２０のいずれかの改変リボソーム。

実施形態２３．Ｔ２ドメインがＳ２ドメイン及びＬ２ドメインを連結し、且つそこにおいて、Ｌ２ドメインの後ろに、５’から３’に、Ｔ２ドメイン及びＳ２ドメインが順に続く実施形態１７～２２のいずれかの改変リボソーム。

実施形態２４．Ｔ２ドメインが、５～２００ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む実施形態１７～２４のいずれかの改変リボソーム。

実施形態２５．Ｔ２ドメインは、７～２０ヌクレオチドの範囲の長さを有するポリヌクレオチドを含む実施形態１７、２３、又は２４の改変リボソーム。

実施形態２６．Ｔ２ドメインがポリアデニンポリヌクレオチドを含む実施形態１７～２５のいずれかの改変リボソーム。

実施形態２７．Ｔ２ドメインが、７～１２アデニンヌクレオチドの長さを有するポリアデニンポリヌクレオチドを含む実施形態１７～２６のいずれかの改変リボソーム。

実施形態２８．リボソームが、５’から３’に、Ｔ１ドメイン、Ｌ１ドメイン、Ｃドメイン、Ｌ２ドメイン、Ｔ２ドメイン、及びＳ２ドメインが順に続くＳ１ドメインを含む実施形態１７～２７のいずれかの改変リボソーム。

実施形態２９．リボソームが、５’から３’に、Ｔ１ドメイン、Ｌ１ドメイン、Ｃドメイン、Ｌ２ドメイン、Ｔ２ドメイン、及びＳ２ドメインが順に続くＳ１ドメインから本質的になるポリヌクレオチドを含む実施形態１７～２８のいずれかの改変リボソーム。

実施形態３０．改変リボソームが変異を含む実施形態１～２９のいずれかの改変リボソーム。

実施形態３１．変異が機能変換型変異である実施形態３０の改変リボソーム。

実施形態３２．機能変換型変異がペプチジルトランスフェラーゼ中心にある実施形態３１の改変リボソーム。

実施形態３３．機能変換型変異がペプチジルトランスフェラーゼ中心のＡサイトである実施形態３１の改変リボソーム。

実施形態３４．機能変換型変異が、改変リボソームの出口トンネル、トランスロコンとの相互作用部位、又は翻訳を容易にする補助タンパク質との相互作用部位の１つ又は複数にある実施形態３１の改変リボソーム。

実施形態３５．改変リボソームが抗生物質耐性変異を有する実施形態１～３５のいずれかの改変リボソーム。

実施形態３６．ポリヌクレオチドであって、実施形態１～３５のいずれかの改変リボソームのｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。

実施形態３７．ポリヌクレオチドがベクターである実施形態３６のポリヌクレオチド。

実施形態３８．ポリヌクレオチドが、改変リボソームによって発現する遺伝子をさらに含む実施形態３６又は３７のポリヌクレオチド。

実施形態３９．遺伝子がレポーター遺伝子である実施形態３８のポリヌクレオチド。

実施形態４０．レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質遺伝子である実施形態３９のポリヌクレオチド。

実施形態４１．改変リボソームが改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含み、且つ遺伝子が改変リボソームに相補的なシャイン・ダルガノ配列を含む実施形態３６～４０のいずれかのポリヌクレオチド。

実施形態４２．遺伝子がコドンを含み、かつコドンが非天然アミノ酸をコードする実施形態３６～４１のいずれかのポリヌクレオチド。

実施形態４３．改変リボソームを調製する方法であって、実施形態３６～４２のいずれかのポリヌクレオチドを発現させることを含む方法。

実施形態４４．変異体を選択することをさらに含む実施形態４３の方法。

実施形態４５．選択ステップがネガティブ選択ステップ、ポジティブ選択ステップ、又はネガティブとポジティブ両方の選択ステップを含む実施形態４４の方法。

実施形態４６．改変細胞であって、（ｉ）実施形態３６～４２のいずれかのポリヌクレオチド、（ｉｉ）実施形態１～３５のいずれか改変リボソーム、又は（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む改変細胞。

実施形態４７．改変細胞であって、第１のタンパク質翻訳機構及び第２のタンパク質翻訳機構を含み、ａ．そこにおいて、第１のタンパク質翻訳機構はリボソームを含み、そこにおいてリボソームが大サブユニットと小サブユニットの間の連結部分を欠、且つｂ．そこにおいて第２のタンパク質翻訳機構は実施形態１～３５のいずれかの改変リボソームを含む改変細胞。

実施形態４８．配列規定ポリマーを調製する方法であって、（ａ）実施形態１～３５のいずれかの改変リボソームを用意すること、及び（ｂ）配列規定ポリマーをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートを用意すること含む方法。

実施形態４９．配列規定ポリマーがインビトロで調製される実施形態４８の方法。

実施形態５０．リボソーム欠失細胞抽出物又は精製翻訳系を用意することをさらに含む実施形態４９の方法。

実施形態５１．リボソーム欠失細胞抽出物が、指数増殖期の中～後期の細胞培養物又は採取時にＯ．Ｄ．６００～３．０を有する培養物を調製するＳ１５０抽出物を含む実施形態５０の方法。

実施形態５２．配列規定ポリマーがインビボで調製される実施形態４８の方法。

実施形態５３．配列規定ポリマーが実施形態４６又は４７のいずれかの細胞で調製される実施形態４８又は５２の方法。

実施形態５４．ｍＲＮＡ又はＤＮＡが改変シャイン・ダルガノ配列をコードし、且つ改変リボソームが、改変シャイン・ダルガノ配列に相補的なアンチシャイン・ダルガノ配列を含む実施形態４８～５３のいずれかの方法。

実施形態５５．配列規定ポリマーがアミノ酸を含む実施形態４８～５４のいずれかの方法。

実施形態５６．アミノ酸が天然アミノ酸である実施形態５５の方法。

実施形態５７．アミノ酸が非天然アミノ酸である実施形態５５の方法。

実施形態５８．第１のタンパク質翻訳機構のリボソームは改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含み、且つ第２のタンパク質翻訳系のリボソームが、改変されていない（例えば、野生型）アンチシャイン・ダルガノ配列を含む実施形態４７の改変細胞。

実施形態５９．改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含む非テザーリボソームをさらに含む実施形態４８～５３のいずれか１つの方法。

実施形態６０．ｍＲＮＡ又はＤＮＡが改変シャイン・ダルガノ配列をコードし、且つ非テザー（ｕｎｔｅｔｈｅｒｅｄ）リボソームが、改変シャイン・ダルガノ配列に相補的なアンチシャイン・ダルガノ配列を含む実施形態５９の方法。

実施形態６１．配列規定ポリマーが天然又は非天然アミノ酸を含む実施形態６０の方法。

実施形態６２．２つ以上のタンパク質翻訳機構を含む改変細胞であって、そこにおいて、（ａ）第１の機構が、ｍＲＮＡが天然遺伝コードに従って、テザー、又はステープルリボソームによって翻訳される天然翻訳機構であり、（ｂ）第２の機構が、宿主の代謝負荷を調節する、又は直交性コドンを含む直交性ｍＲＮＡがこの直交性リボソームによって翻訳される解離可能なリボソームに由来する人工的な機構である改変細胞。

実施形態６３．２つ以上のタンパク質翻訳機構を含む改変細胞であって、そこにおいて、（ａ）第１の機構が、細胞の生存（ｌｉｆｅ）を持続させるｍＲＮＡがテザー、又はステープルリボソームによって翻訳される天然翻訳機構であり、（ｂ）第２の機構が、直交機能（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ）を実行する解離可能なリボソームに由来する人工的な機構である改変細胞。

実施形態６４．２つ以上のタンパク質翻訳機構を含む改変細胞であって、直交性の解離可能なリボソームが、タンパク質発現の状況において、直交性テザーリボソームより優れる改変細胞。

実施形態６５．ｏ－３０Ｓだけでなく、遊離５０Ｓサブユニットも操作されて、新しい機能を実現する改変細胞。

実施形態６６．ｏ－３０Ｓだけでなく、遊離５０Ｓサブユニットも操作されて、細胞プロテオームの発現を妨害することなく新しい機能を実現する改変細胞。

実施形態６７．ｏ－３０Ｓだけでなく、遊離５０Ｓサブユニットも操作されて機能獲得型のリボソーム変異を実現する改変細胞。

実施形態６８．ｏ－３０Ｓだけでなく、遊離５０Ｓサブユニットも操作されて機能獲得型のリボソーム変異を実現する改変細胞であって、そこにおいて、それらの変異が問題のあるポリマー配列の翻訳を特異的に克服する改版細胞。

実施形態６９．第１のタンパク質翻訳機構及び第２のタンパク質翻訳機構を含む改変細胞であって、第１のタンパク質翻訳機構が第１の改変リボソームを含み、第１の改変リボソームが、ｉ）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びタンパク質を含む小サブユニット、ｉｉ）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びタンパク質を含む大サブユニット、並びにｉｉｉ）連結部分を含み、連結部分がポリヌクレオチド配列含み、且つ小サブユニットのｒＲＮＡを大サブユニットのｒＲＮＡと繋ぎ止め、第２のタンパク質翻訳機構が第２の改変リボソームを含み、第２の改変リボソームが、ｉ）ｒＲＮＡ及びタンパク質を含む小サブユニット、ｉｉ）ｒＲＮＡ及びタンパク質を含む大サブユニットを含み、且つｉｉｉ）そこにおいて、第２の改変リボソームが大サブユニットと小サブユニットの間の連結部分を欠き、且つそこにおいて、第２の改変リボソームの小サブユニットが改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含んで、内在性細胞ｍＲＮＡと異なる相補的な且つ／若しくは同族のシャイン・ダルガノ配列を有するテンプレートの翻訳を可能にし、且つ／又は第２の改変リボソームが１つ又は複数の機能変換型変異を含み、機能変換型変異がアンチシャイン・ダルガノ配列にない改変細胞。

実施形態７０．第１及び第２のタンパク質翻訳機構が配列規定ポリマーの翻訳を補助することができる実施形態６９の改変細胞。

実施形態７１．第１のタンパク質翻訳機構が、ネイティブの内在性ＲＮＡの翻訳を補助することができる実施形態６９～７０のいずれか１つの改変細胞。

実施形態７２．第２のタンパク質翻訳機構が、非ネイティブの外因性ＲＮＡの翻訳を補助することができる実施形態６９～７１のいずれか１つの改変細胞。

実施形態７３．第２の改変リボソームの小サブユニットが、３’－ＧＧＵＧＵＵ－５’、３’－ＵＧＧＵＧＵ－５’、３’－ＧＧＵＧＵＣ－５’、３’－ＧＵＵＵＡＧ－５’、３’－ＵＧＧＡＡＵ－５’、３’－ＧＧＡＵＣＵ－５’、３’－ＵＧＧＡＵＣ－５’、３’－ＵＧＧＵＡＡ－５’、及び３’－ＵＧＧＡＵＣ－５’からなる群より選択される改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含む実施形態６９～７２のいずれか１つの改変細胞。

実施形態７４．第２の改変リボソームが、１つ又は複数の：ａ）ペプチジルトランスフェラーゼ中心（ＰＴＣ）、ｂ）新生ペプチド出口トンネル（ＮＰＥＴ）、ｃ）伸長因子との相互作用部位、ｄ）ｔＲＮＡ結合部位、ｅ）シャペロン結合部位、ｆ）新生鎖修飾酵素結合部位、ｇ）ＧＴＰアーゼ中心において、機能変換型変異を含む実施形態６９～７４のいずれか１つの改変細胞。

実施形態７５．第２の改変リボソームの大サブユニットが、１つ又は複数の次の２３ＳｒＲＮＡの残基：Ｇ２０６１、Ｃ２４５２、Ｕ２５８５、Ｇ２２５１、Ｇ２２５２、Ａ２０５７、Ａ２０５８、Ｃ２６１１、Ａ２０６２、Ａ２５０３、Ｕ２６０９、Ｇ２４５４、及びＧ２４５５において機能変換型変異を含む実施形態６９～７４のいずれか１つの改変細胞。

実施形態７６．第１、第２、又は第１と第２両方の改変リボソームが、抗生物質耐性変異を含む実施形態６９～７５のいずれか１つの改変細胞。

実施形態７７．第１の改変リボソームの大サブユニットが、２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント若しくは変異体を含み、且つ／又は小サブユニットが、１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント若しくは変異体を含む実施形態６９～７６のいずれか１つの改変細胞。

実施形態７８．連結部分が、ヘリックス１０、ヘリックス３８、ヘリックス４２、ヘリックス５４、ヘリックス５８、ヘリックス６３、ヘリックス７８、ヘリックス１０１からなる群より選択される大サブユニットのヘリックスを、ヘリックス１１、ヘリックス２６、ヘリックス３３、及びヘリックス４４からなる群より選択される小サブユニットのヘリックスに共有結合させる実施形態６９～７７のいずれか１つの改変細胞。

実施形態７９．配列規定アミノ酸ポリマーを調製する方法であって、（ａ）１つ又は複数の：（ｉ）実施形態６９～７８のいずれか１つの細胞、（ｉｉ）実施形態６９～７８のいずれか１つの細胞に由来する細胞抽出物、（ｉｉｉ）実施形態６９～７８のいずれか１つの細胞に由来する精製翻訳系を用意すること、（ｂ）配列規定ポリマーをコードするｍＲＮＡを細胞又は細胞抽出物に提供することを含む方法。

実施形態８０．配列規定アミノ酸ポリマーがインビボで調製される実施形態７９の方法。

実施形態８１．配列規定アミノ酸ポリマーがインビトロで調製される実施形態７９の方法。

実施形態８２．配列規定アミノ酸ポリマーが１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む実施形態７９～８１のいずれか１つの方法。

以下の実施例は例示的なものであり、クレームされた主題を限定するように解釈すべきではない。

実施例１．細菌細胞におけるタンパク質合成のための完全直交系の開発及び試験

Ａ．抄録

リボソームは、タンパク質原性アミノ酸から遺伝的にコードされたポリペプチドを合成する。リボソーム工学（Ｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）は、タンパク質合成装置の触媒能を拡大し、その起源、進化、及び機能を解明するための強力な方法となってきている。改変リボソームの性質が通常のタンパク質合成に対して有害である可能性があるので、遺伝子工学によって改変された（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）リボソームは、細胞タンパク質を合成する翻訳機構から機能的に分離している必要がある。この問題に対する最初の解決策は、所望のタンパク質を翻訳する一方で、細胞プロテオームの翻訳からは外れうるテザーサブユニットをもつ改変リボソームであるＲｉｂｏ－Ｔによって提供されている。ここで本発明者らは、２つの直交翻訳系をもつ改変細胞の概念的に異なる設計を提供する。それにより、細胞タンパク質がＲｉｂｏ－Ｔによって翻訳され、一方でネイティブリボソームは、両サブユニットが特定の種類のｍＲＮＡの翻訳に関与する分離したタンパク質合成機械装置として作動する。本発明者らは、特殊化リボソームの両サブユニットが、Ｒｉｂｏ－Ｔからの自律性を保ち、細胞プロテオームの翻訳から外れ、且つしたがって新しい機能に向けて組換え操作できうることを示す。本発明者らは、ペプチジルトランスフェラーゼ中心のすべてのｒＲＮＡヌクレオチドにおいて変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）をもつ変異体の包括的なコレクションを作り、且つリボソームがアレストペプチドによる翻訳終結の遮断を克服できる機能獲得型変異を単離することによって、この系の有用性を示す。

Ｂ．序論

リボソームは、タンパク質合成の際に、独特で（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）、複雑で、且つ高度に協調した機能を発揮する。リボソームは小サブユニットと大サブユニットの２つから構成され、細菌ではそれぞれ３０Ｓと５０Ｓである（図１ａ）。３０Ｓサブユニットは、ｍＲＮＡの開始コドン近くのシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ）とその１６ＳｒＲＮＡの３’末端のアンチシャイン・ダルガルノ配列（ＡＳＤ）との間の相補性を用いて翻訳の開始を進める¹。３０Ｓサブユニットは、タンパク質合成の伸長段階ではコドン－アンチコドン相互作用を維持することによって解読機能を発揮し、一方で終結では放出因子による終止コドンの認識を促す。５０Ｓサブユニットは、ペプチジルトランスフェラーゼ中心（ＰＴＣ）の場所を提供し（ｈｏｓｔｓ）、ここでアミノ酸のポリペプチドへの重合が行われ、終結段階ではペプチドの遊離が触媒される。伸びているアミノ酸鎖は、ＰＴＣから新生ペプチド出口トンネル（ＮＰＥＴ）に進み、リボソームから外に出ていく^2、3。

リボソームは、天然の基質（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、タンパク質原性アミノ酸）を用いて作動し、遺伝的にコードされたタンパク質を合成できるように進化してきた。それでもなお、分子工学によってその合成能が拡張されて、代替的な遺伝コードの使用、より多様なアミノ酸の重合を可能にする、又はさらに非タンパク質性ポリマーのプログラム可能な合成を実行する可能性がある⁴。リボソーム工学はまた、タンパク質合成装置の起源、進化、機能の解明に利用できる可能性がある。しかし、このような試みはすべて、リボソームの本体ある性質を変える必要があり⁵、必然的に細胞タンパク質を合成するリボソームの能力を低下させる、又は消滅さえさせる^6、7。この問題に対する興味深い解決策は、無細胞翻訳系によって提供されうるが⁸、効率と拡張性の問題から、現在、それらの適用には限界がある。

リボソーム工学が苦慮している状態（ｐｒｅｄｉｃａｍｅｎｔ）は、細胞内に、細胞プロテオームの生成に関与せず、且つ１つ又は数種の特定のｍＲＮＡのみの翻訳専用に特化した直交タンパク質合成装置を作り出すことによって克服することができる⁹。１６ＳｒＲＮＡのＡＳＤを変異させ、且つ相補的なＳＤ配列をｍＲＮＡに導入することによって、小サブユニットの一部を同族ｍＲＮＡ^10、11のみの翻訳に導くことが可能となり、それはリボソームの解読能を拡張するために活用されてきた戦略である¹²。しかし、このセットアップの直交性は小サブユニットのみに限定される。その理由は、複数回の翻訳における大リボソームサブユニットと小リボソームサブユニットの結合の確率的な性質に起因して、野生型（ｗｔ）と直交性３０Ｓサブユニットの両方が５０Ｓサブユニットの同じプールを共有するからである。直交性５０Ｓサブユニットを創ることができないことから、触媒能が変更又は拡張された翻訳装置を設計するための最も重要な部位であるＰＴＣ及びＮＰＥＴを改造する取り組みは限られてきた。最初の完全直交翻訳系を組換え操作することが、テザーサブユニットをもつリボソームＲｉｂｏ－Ｔ¹³の出現により可能になった。Ｒｉｂｏ－Ｔ及びそれ以降の類似した設計^14-16では、円順列置換２３ＳｒＲＮＡが１６ＳｒＲＮＡに埋め込まれ、サブユニットが２つのＲＮＡリンカーで繋ぎ止められたリボソームが得られる（図１ａ）。改変ＡＳＤをもつた直交性Ｒｉｂｏ－Ｔ（ｏＲｉｂｏ－Ｔ）では、Ｒｉｂｏ－Ｔの小サブユニットと大サブユニットが分離できないので、両サブユニットが専ら同族のｍＲＮＡを翻訳することに関与し、且つｏＲｉｂｏ－Ｔはしたがって細胞タンパク質を翻訳する野生型リボソームとは独立して機能する（図１ｂ）。ｏＲｉｂｏ－Ｔを活用して（Ｗｉｔｈｔｈｅｈｅｌｐｏｆ）、野生型リボソームにとって問題のあるアミノ酸配列の重合を容易にする特定のＰＴＣ変異を選択することができた^13、15。しかし、完全な直交性を達成する一方で、Ｒｉｂｏ－Ｔの通常とは異なる（ｕｎｕｓｕａｌ）デザインはその機能を制限する。Ｒｉｂｏ－Ｔは、解離可能なリボソームの半分の速度でしかタンパク質を翻訳しない¹³。また、野生型リボソームと比較して、開始コドンからの離れるのが遅い¹⁷。さらに、「野生型」リボソームのバイオジェネシスでさえ、かなり遅く、且つ効率が悪く¹⁷、且つリボソームの機能中心がさらなる変更を受けた場合、アセンブリに関する問題はさらに悪化する可能性がある⁷。本発明者らは、詳しく特徴付けをしていないものの、「ステープル（ｓｔａｐｌｅｄ）」リボソームでも同様の課題を予想する。まとめると、これらの要因はすべて、Ｒｉｂｏ－Ｔ、又はいずれかのテザーリボソームを、さらなる工学的な取り組みに直接使用することを難しくしている。

Ｃ．細菌細胞におけるタンパク質合成に向けた「反転（ｆｌｉｐｐｅｄ）」直交系の開発と試験

機能的に独立した２つの翻訳機構をもつ細胞を設計するオリジナルのｏＲｉｂｏ－Ｔベースの方法の欠点を克服するために、今般本発明者らは、特殊なｍＲＮＡのみの翻訳に特化した、解離可能であり、さらには完全に分離したリボソームを利用するインビボでの系の概念的に新しい設計を作り出した。Ｒｉｂｏ－Ｔと及び解離可能なリボソームの役割を「反転（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）」させることで、本発明者らは、プロテオームの翻訳がＲｉｂｏ－Ｔによって行われ、一方で解離可能な直交性３０Ｓ（ｏ－３０Ｓ）サブユニット及び野生型５０Ｓサブユニットから構成されるリボソームは完全直交翻訳機械装置として機能する細菌細胞を設計した（図１ｃ）。本発明者らが、ＯＳＹＲＩＳ（分離サブユニットをもつリボソームに基づいた直交翻訳系（ＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎＳＹｓｔｅｍｂａｓｅｄｏｎＲｉｂｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈＩｓｏｌａｔｅｄＳｕｂｕｎｉｔｓ））と名付けた、結果として得られたセットアップでは、Ｒｉｂｏ－Ｔが繋ぎ止められているという性質により、解離可能なリボソームのｏ－３０Ｓ又は５０Ｓのいずれとも結合することができないので、完全な直交性が達成される。したがって、ＯＳＹＲＩＳ細胞では、物理的に連結していないｏ－３０Ｓと５０Ｓのリボソームサブユニットは、連結していないにもかかわらず、互いに相互作用し、且つ完全直交性リボソーム（ｏ－リボソーム）として機能することを強いられる。結果として、ｏ－３０Ｓだけでなく、遊離５０Ｓサブユニットもまた、細胞プロテオーム（図１ｃ）の発現を妨害することなく新しい機能を実現するように設計することができる。

系の構成要素（図５）は、染色体ｒｒｎ対立遺伝子¹⁸（図６）を欠く大腸菌株でアセンブリされた。得られたＯＳＹＲＩＳ細胞では、最適化されたｐＲｉｂｏ－Ｔｔプラスミドから、改良された１６Ｓ－２３Ｓテザー（ｔｅｔｈｅｒｓ）¹⁶をもつＲｉｂｏ－ＴｒＲＮＡが発現する。別のプラスミドｐｏＲｂｓは解離可能なｏ－リボソームのｒＲＮＡ遺伝子をもち、その１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は改変ＡＳＤをもつ（図５）。これら２つのプラスミドで形質転換された細胞では、ｏ－リボソームは全リボソーム集団の～１５％を占める（図２ａ、ｂ及び図７）。ｏ－リボソームＡＳＤのレポーター遺伝子と同族のＳＤをもつ特化したレポーター遺伝子（ｇｆｐ、ｒｆｐ又はｌｕｃ）が、第３のプラスミド（ｐｏＧＦＰ、ｐｏＲＦＰ／ｏＧＦＰ又はｐｏＬｕｃ）に導入される（本発明者らは、これらの直交性レポーターをｏ－レポーターと呼ぶことになる）（図５）。

ＯＳＹＲＩＳ細胞におけるｏ－レポーターの発現はｏ－リボソームに依存し、その非存在下において、ｏ－ｍＲＮＡによってコードされるレポータータンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼ）は低レベルで産生され、一方では解離可能なｏ－リボソームの存在はｏ－レポーターの発現を大きく刺激する（図２ｃ、ｄ及び図８）。したがって、以前の研究^11、16において細胞ｍＲＮＡの翻訳から外れていることが確認されているｏ－３０Ｓサブユニットは、ＯＳＹＲＩＳのｏ－ｍＲＮＡの翻訳を効率的に進める。注目すべきことに、解離可能なｏ－リボソームは、同等のベクターで同じ宿主（大腸菌、ＢＬ２１）に導入したとき、ｏ－レポーター（ｒｅｐｒｏｔｅｒ）の発現においてｏ－Ｒｉｂｏ－Ｔより優れていた
さらに、ｏ－リボソームが低コピー数プラスミドから発現するＯＳＹＲＩＳ細胞におけるｏ－ＧＦＰレポーターの相対的な発現は、高コピー数プラスミドからｏ－Ｒｉｂｏ－Ｔを発現する細胞（図２ｄ、図８、濃い（ｄａｒｋ）バー）と比較して高い。

ＯＳＹＲＩＳ細胞の解離可能なｏ－リボソームの小サブユニットのみ、又は小サブユニットと大サブユニットの両方が、Ｒｉｂｏ－Ｔから機能的に分離されたままであるかどうかを調べるために、本発明者らは、抗生物質エリスロマイシン（Ｅｒｙ）に対する耐性を付与する、Ｒｉｂｏ－Ｔに存在するＡ２０５８Ｇ変異¹³を利用した。もし、Ｅｒｙ感受性である遊離５０Ｓサブユニットが、プロテオームを翻訳する際に何らかの形でＲｉｂｏ－Ｔの小サブユニットと協力しうるなら、Ｅｒｙはタンパク質合成全体を阻害し、且つ細胞増殖を妨害するであろう。しかし、ＯＳＹＲＩＳ細胞は、試験した最高濃度の抗生物質（１ｍｇ／ｍｌ）でも増殖を続け、解離可能な５０Ｓサブユニット及びＲｉｂｏ－Ｔの機能上の自律性を示している（図１１、各グループの２番目のバーのセット）。対照的に、ｏ－ＧＦＰレポーターの発現は培地中のＥｒｙ濃度の増加とともに徐々に減少した（図３ａ）。この結果は、ｏ－レポーターの翻訳が、ｏ－３０Ｓ／Ｒｉｂｏ－Ｔハイブリッドとは対照的に、解離可能なｏ－３０Ｓと５０Ｓサブユニットから構成されるリボソームによって主に進められることを示している（図３ａ）。したがって、ｏ－３０Ｓサブユニットも５０ＳサブユニットもＲｉｂｏ－Ｔと相互作用せず、且つ両サブユニットは、それらの間に物理的な連結がないにもかかわらず、互いに機能的に専用の状態のまま（ｒｅｍａｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｄｅｄｉｃａｔｅｄ）である。

ＯＳＹＲＩＳ細胞の解離可能５０Ｓサブユニットの直交性に関するより厳密な証明は、野生型大腸菌細胞において優性致死的であることが知られているその２３ＳｒＲＮＡに変異を導入することによって得られた^20、21。それらの変異のうちの２つ、Ａ２４５１Ｃ及びＡ２６０２Ｕは、ＰＴＣ活性部位の重要なヌクレオチドを変化させ、一方で変異Ｇ２５５３Ｃは、ペプチド結合形成のためのＡサイトアミノアシル－ｔＲＮＡの適切な配置に必要な必須のｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ相互作用を妨げる^22、23（図１２ａ）。もし、変異体の解離可能な５０Ｓサブユニットが主にｏ－３０Ｓサブユニットと相互作用するならば、ｏ－リボソームは通常の翻訳から排除されるので、ＯＳＹＲＩＳ細胞の生存は損なわれないはずである。逆に、遊離５０ＳサブユニットがＲｉｂｏ－Ｔと結合し、且つプロテオームの翻訳に関与するならば、優性致死的な２３ＳｒＲＮＡ変異はＯＳＹＲＩＳ細胞の増殖を妨げる、又は著しく損なうことになる。ｏ－３０Ｓを欠く細胞で変異体５０Ｓサブユニットを発現させる試み（野生型１６ＳｒＲＮＡとともに変異体２３ＳｒＲＮＡをコードするｐＲｂｓプラスミドでＲｉｂｏ－Ｔ細胞を形質転換することによる）では、形質転換体は得られず、２３ＳｒＲＮＡ変異の優性致死性が確認された（図３ｂ及び図１２ｂ、ｃ）。対照的に、ＯＳＹＲＩＳ細胞において直交性１６ＳｒＲＮＡをもつプラスミドに変異体２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を導入すると、多くの形質転換体が出現した（図３ｂ及び図１２ｂ、ｃ）。形質転換細胞の培養物から単離されたｒＲＮＡの分析はから、変異体２３ＳｒＲＮＡを含有する遊離５０Ｓサブユニットのかなり高い発現レベルが明らかなった（図３ｂ、図１２ｄ）。これらの結果は全体として、解離可能な大リボソームサブユニットがＲｉｂｏ－Ｔから機能的に分離されたままであることを明らかに示す。これらの結果は、解離可能な大リボソームサブユニットがＲｉｂｏ－Ｔから機能的に分離されたままであることを明らかに示す。

まとめると、ｏ－レポーターの発現及び優性致死変異に対する耐性の結果は、ＯＳＹＲＩＳ細胞では、解離可能なｏ－リボソームはｏ－ｍＲＮＡを翻訳するが、プロテオームの翻訳には大きく寄与しないことを示す。したがって、ＯＳＹＲＩＳ細胞の解離可能なｏ－リボソームの両サブユニットは、生体分子工学（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）に適している。

ＯＳＹＲＩＳ細胞の解離可能なリボソームの直交性を確立したので、本発明者らは、リボソームが通常では困難なタスク（ｐｒｏｂｌｅｍａｔｉｃｔａｓｋ）を実行できるようにすると思われる、大サブユニットのｒＲＮＡの変異を選択する系の可能性を試験するために原理証明実験を行った。具体的には、本発明者らは、終止困難なタンパク質を効率的に放出できるリボソームの設計を目指した。一般的に、完全に合成されたポリペプチドの放出は、クラス１の放出因子の補助を受けたＰＴＣによって触媒される非常に微妙な（ｎｕａｎｃｅｄ）反応である^24、25。大部分のタンパク質は終止コドンで効率的に放出されるが、他のものの終結はより問題になりうる^26、27。大腸菌での非効率的な終結の極端な例は、調節蛋白質ＴｎａＣをコードするｍＲＮＡの終止コドンでのプログラムされた翻訳アレストで示される^28-30。高濃度のトリプトファンにおいて、完全に翻訳されたＴｎａＣの放出が阻害され、且つ結果として生じるｔｎａＣ終止コドンでのリボソームの停滞は、ｔｎａオペロンの下流遺伝子の発現の活性化をもたらす³¹。ｔｎａＣ終止コドンでの終結アレスト（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｒｒｅｓｔ）は、新生ＴｎａＣと、ＮＰＥＴ及びＰＴＣの、ｒＲＮＡヌクレオチドとの好ましくない相互作用によって媒介される^30、31。ＴｎａＣによって媒介される終結アレストは、非効率的なタンパク質放出のパラダイムを表し、且つ、例えば非カノニカルアミノ酸をもつ生物工学的に改変されたポリペプチドの発現を抑制しうる問題の１つを示している。

ＴｎａＣの非効率的な終結を緩和しうる変異を特定するために、本発明者らはＴｎａＣをコードする配列をｇｆｐ遺伝子の末端に付加したレポーターを構築した（図４ａ）。予想通り、ＧＦＰ－ＴｎａＣキメラのインビボ及びインビトロでの発現は高濃度のトリプトファンにおいて阻害された（図４ｂ、図１３）。終結アレストを緩和することが知られているＷ１２Ｒ変異²⁸を、ＴｎａＣをコードするセグメントに導入すると、トリプトファンの存在下でレポーター発現が有意に刺激された（図４ｂ、図１３）。

次いで、本発明者らは、以下の変更を含んだｐｏＲｂｓプラスミドの１２０個の単一塩基２３ＳｒＲＮＡ変異体の包括的なライブラリー（図５、図１７の表）を作成した。ｉ）ペプチジル転移反応に関与する受容体アミノ酸の攻撃アミン（ａｔｔａｃｋｉｎｇａｍｉｎｅ）の半径１０Å以内に位置するＰＴＣ活性部位の９つのｒＲＮＡ残基のすべて、ｉｉ）第２の殻のヌクレオチドの４１個（ＰＴＣから半径２５Å以内のもの）、ｉｉｉ）Ｐ－サイトｔＲＮＡ及びＡ－サイトｔＲＮＡの受容体末端の位置調整に関与する、２３ＳｒＲＮＡのＰ－ループ及びＡ－ループの６残基（図４ｃ、ｄ）。注目すべきことに、ＯＳＹＲＩＳ細胞がもつライブラリーに含まれた個々の変異の大部分は、野生型大腸菌細胞において有害又は致死的である^20、21ことが報告されており、且つしたがってＯＳＹＲＩＳ細胞の解離可能なリボソームの直交性のみ基づいて容易に試験することができた。

本発明者らは、停滞バイアス（ｓｔａｌｌｉｎｇｂｙｐａｓｓ）（ＳＢ）スコアを推定することによって個々の変異体がＧＦＰ－ＴｎａＣポリペプチドを成功裏に終止させる能力を特徴付けた。ＳＢスコアは、効率的に終止するＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）バリアント²⁸と比較した、終止しにくいＧＦＰ－ＴｎａＣレポーターの相対的な発現を反映する。さらに、ＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）コンストラクトの発現レベルを用いて、変異体リボソームの通常の翻訳活性に対するＰＴＣ変異の影響を評価した。際だったことに、ＰＴＣｒＲＮＡ残基に変化をもつ数多くの変異体は、野生型５０ＳサブユニットをもつＯＳＹＲＩＳ細胞よりも有意に高いバイパススコアを示した（図４ｅ並びに図１４及び１５）。これらのうち、１９個の変異体は高い翻訳活性（＞６０％の野生型）と、野生型コントロールに対して有意に増加したＳＢスコア（＞０．３対野生型コントロールの０．１７）（図４ｅ、図１７の表）を兼ね備えた。特定された変異には、ＰＴＣ活性サイト（Ｇ２０６１、Ｃ２４５２、Ｕ２５８５）、Ｐループ（Ｇ２２５１、Ｇ２２５２）及び２番目のＰＴＣ殻に位置する２３ＳｒＲＮＡ残基にあり、ＮＰＥＴ入口における残基（Ａ２０５７、Ａ２０５８、Ｃ２６１１、Ａ２０６２、Ａ２５０３、Ｕ２６０９）並びにＰＴＣのＣ２４５２上のＡ２４５３スタックを介した２つに残基（Ｇ２４５４及びＧ２４５５）が含まれた（図４ｇ）。このリスト内の非致死的変異のうちの２つ（Ｕ２６０９ＣとＡ２０５８Ｕ）は以前に報告されている^29、31。それらの変異は、新たに単離された変異体はＴｎａＣを介した終結アレストに関与するＰＴＣ残基を実際に明らかにし、特定された変異がＴｎａＣ終止コドンでのリボソームの停滞を克服するのに役立つことを確認する内部対照として機能した。

ＯＳＹＲＩＳ細胞が提供するユニークな機会は、解離可能な３０Ｓ又は５０Ｓサブユニットはショ糖勾配遠心法によってＲｉｂｏ－Ｔから分離できる¹³ので、たとえ致死的な突然変異をもっても個々のリボソームサブユニットを分離できる可能性である（図１６ａ、ｂ）。本発明者らは、この系の特徴を利用して、バイパススコア＞０．３７を示した致死変異Ｕ２５００Ｇ、Ａ２０６０Ｃ、Ａ２４５０Ｕをもつ大リボソームサブユニットを調製し、それらを野生型（非直交性）３０Ｓサブユニットと再結合させ、そしてその変異がｔｎａＣＯＲＦ（図１６ｃ）の終止コドンでのリボソーム停滞を緩和するかどうかを無細胞翻訳系で調べた。本発明者らはさらに、ＳＢスコアが０．３５～０．５５の数個の非致死的変異体（Ａ２５０３Ｇ、Ａ２０６２Ｇ、Ｃ２６１１Ｇ、Ｃ２６１１Ｕ）も試験した。インビボでのデータと一致して、試験した変異体リボソームはすべて、無細胞翻訳（図４ｇ及び図１６）中の野生型リボソームと比較して、ｔｎａＣ終止コドンでの停滞の減少を示し、ＴｎａＣペプチドの翻訳をより効率的に終了させる能力が明らかになった。特定された終結アレスト－放出変異の位置は、ペプチジル－ｔＲＮＡの配置の変化、又は変異体リボソームのＰＴＣにおけるＰサイト基質及び／若しくは放出因子のあまり厳密でない（less strict）位置調整のいずれかがＴｎａＣ放出を促進することを示唆している。ほぼ間違いなく、ＴｎａＣによって媒介される終結アレストを軽減する変異は、以前のｏＲｉｂｏ－Ｔベースの方法^13、15を使用して単離できる可能性がある。しかし、ＯＳＹＲＩＳの解離可能なｏ－リボソーム（図２ｄ）と比較して、ｏＲｉｂｏ－Ｔによってもたらされるレポーターの発現レベルの低下は、我々のスクリーンにおいて課された（ｉｍｐｏｓｅｄｉｎｏｕｒｓｃｒｅｅｎ）最小効率閾値を上回る変異体数を制限すると思われるので、ＯＳＹＲＩＳで特定された変異のいくつかは見逃される可能性が高いであろう。

本発明者らの原理証明実験は、Ｏ－リボソームの解離可能なサブユニットに互いに相互作用することを強いながら細胞増殖を保つＲｉｂｏ－Ｔの能力に基づくＯＳＹＲＩＳ設計が、完全直交細胞翻訳系を作り出す実行可能な概念的に新しい方法を提示することを示した。Ｒｉｂｏ－Ｔは細胞内プロテオーム全体を翻訳するのに充分に活性である^13、17ため、ＯＳＹＲＩＳの設計が可能であった。しかし、Ｒｉｂｏ－Ｔによって進められる翻訳は遅く、Ｒｉｂｏ－Ｔアセンブリは非効率的であり、これはＯＳＹＲＩＳ細胞の遅い増殖速度（ＢＬ２１株の倍化時間τ～４５分と比較して、９６ウェルプレートにおいてτ～３００分）に寄与する要因の１つである可能性が高い（図９ａ）。したがって、Ｒｉｂｏ－Ｔの機能とアセンブリの最適化により、ＯＳＹＲＩＳ細胞の増殖速度が向上し、且つ直交系の汎用性がさらに拡大する可能性がある。３つのプラスミドのセットアップ（図５）は、ＯＳＹＲＩＳを高度にモジュール化し、且つそれにより、様々な用途に容易に調整できるようにする。原理的には、Ｒｉｂｏ－ＴｒＲＮＡ遺伝子を染色体に導入し、且つ直交ｒＲＮＡ遺伝子及び同じプラスミド上のレポーター遺伝子を組み合わせることによって、ＯＳＹＲＩＳはさらにシンプルなものになりうる。プラスミドの数を減らすことは、さらにＯＳＹＲＩＳ細胞の増殖を促進しうる。プラスミドのコピー数又はプロモーター強度のいずれかを調節することによってＯＳＹＲＩＳ細胞のｏ－リボソームの割合を増加させることは、系の性能を向上させ、且つ特定のニーズに合わせてその系を調整する別の方法でありうる。したがって、本発明者らの実験では、ｏ－リボソームは単一のレポーター遺伝子のみの発現に関与していた一方で、ｏ－リボソームの割合が適切にバランスされていれば、改変されたＳＤを具える数個の遺伝子が同時に翻訳される可能性があり、例えば、マルチサブユニットタンパク質複合体の直交発現の可能性が開かれた。

ＯＳＹＲＩＳの明らかに考えられる用途は、リボソームが識別するポリペプチド（バックボンド（ｂａｃｋｂｏｎｄ）改変Ｄ－アミノ酸又はβ－アミノ酸³²など）に非カノニカルアミノ酸を組み込むことができるリボソームの設計である。リボソームの合成能力を拡張するには、特殊なアミノアシル化系から遺伝子工学によって改変された遺伝コードまで多くの要素が必要とされるが、ＯＳＹＲＩＳ細胞で働く完全直交性の解離可能なリボソームは、この目標の達成を加速させうる。重要なことに、ＯＳＹＲＩＳにより、翻訳装置の起源を解明するためのリボソームレトロエンジニアリング（ｒｅｔｒｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）の採用から、非タンパク質性のポリマーのプログラム可能な合成のための新しい触媒機能の進化まで、他の多くの試みが可能になる。

参考文献
１Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．＆Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．Ｔｈｅ３’－ｔｅｒｍｉｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ１６ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｔｏｎｏｎｓｅｎｓｅｔｒｉｐｌｅｔｓａｎｄｒｉｂｏｓｏｍｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７１，１３４２－１３４６（１９７４）．
２Ｊｅｎｎｉ，Ｓ．＆Ｂａｎ，Ｎ．Ｔｈｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｖｏｙａｇｅｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍａｌｔｕｎｎｅｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３，２１２－２１９（２００３）．
３Ｒｏｄｎｉｎａ，Ｍ．Ｖ．ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎＰｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０，ｐｉｉ：ａ０３２６６４（２０１８）．
４ＤｅｓＳｏｙｅ，Ｂ．Ｊ．，Ｐａｔｅｌ，Ｊ．Ｒ．，Ｉｓａａｃｓ，Ｆ．Ｊ．＆Ｊｅｗｅｔｔ，Ｍ．Ｃ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｐｐａｒａｔｕｓｆｏｒｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２８，８３－９０（２０１５）．
５Ｄａｖｉｓ，Ｌ．＆Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．Ｄｅｓｉｇｎｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｃｏｄｅｅｘｐａｎｓｉｏｎｉｎｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３，１６８－１８２（２０１２）．
６Ｄｅｄｋｏｖａ，Ｌ．Ｍ．，Ｆａｈｍｉ，Ｎ．Ｅ．，Ｇｏｌｏｖｉｎｅ，Ｓ．Ｙ．＆Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＭｏｄｉｆｉｅｄＲｉｂｏｓｏｍｅｓｆｏｒＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｄ－ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓｉｎｔｏＰｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４５，１５５４１－１５５５１（２００６）．
７Ｗａｒｄ，Ｆ．Ｒ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｚ．Ｌ．，Ａｄ，Ｏ．，Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ａ．＆Ｃａｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｄ．Ｄｅｆｅｃｔｓｉｎｔｈｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｒｉｂｏｓｏｍｅｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｂｅｔａ－ａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５８，４４９４－４５０４（２０１９）．
８Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ａ．Ｄ．，Ｋａｒｉｍ，Ａ．Ｓ．＆Ｊｅｗｅｔｔ，Ｍ．Ｃ．Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａｎｅｘｐａｎｄｅｄｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｏｆａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０１９－０１８６－３（２０１９）．
９Ａｒｒａｎｚ－Ｇｉｂｅｒｔ，Ｐ．，Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｕｒｅｎ，Ｋ．＆Ｉｓａａｃｓ，Ｆ．Ｊ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙｉｎｇｅｎｅｔｉｃｃｏｄｅｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｌｉｆｅ９，５８（２０１９）．
１０Ｈｕｉ，Ａ．＆ｄｅＢｏｅｒ，Ｈ．Ａ．Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄｒｉｂｏｓｏｍｅｓｙｓｔｅｍ：ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡｓｐｅｃｉｅｓｂｙａｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｅｄｒｉｂｏｓｏｍｅｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，４７６２－４７６６（１９８７）．
１１Ｒａｃｋｈａｍ，Ｏ．＆Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ＡｎｅｔｗｏｒｋｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｘｍＲＮＡｐａｉｒｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１，１５９－１６６（２００５）．
１２Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｈ．，Ｐｅａｋ－Ｃｈｅｗ，Ｓ．Ｙ．＆Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．Ｅｖｏｌｖｅｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｓｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｔｉｃｃｏｄｅｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，７７０－７７７（２００７）．
１３Ｏｒｅｌｌｅ，Ｃ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｒｉｂｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈｔｅｔｈｅｒｅｄｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ５２４，１１９－１２４（２０１５）．
１４Ｆｒｉｅｄ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｃｈｍｉｅｄ，Ｗ．Ｈ．，Ｕｔｔａｍａｐｉｎａｎｔ，Ｃ．＆Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ＲｉｂｏｓｏｍｅｓｕｂｕｎｉｔｓｔａｐｌｉｎｇｆｏｒｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄｉｔ．５４，１２７９１－１２７９４（２０１５）．
１５Ｓｃｈｍｉｅｄ，Ｗ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｓｕｂｕｎｉｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｅｎａｂｌｅｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｎｅｗｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ５６４，４４４－４４８（２０１８）．
１６Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ｅｔａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｒｉｂｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈｔｅｔｈｅｒｅｄｓｕｂｕｎｉｔｓｆｏｒｅｘｐａｎｄｉｎｇｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，３９２０（２０１９）．
１７Ａｌｅｋｓａｓｈｉｎ，Ｎ．Ａ．ｅｔａｌ．Ａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙｏｆｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅｗｉｔｈｔｅｔｈｅｒｅｄｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，９３０（２０１９）．
１８Ｑｕａｎ，Ｓ．，Ｓｋｏｖｇａａｒｄ，Ｏ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｕｕｒｍａｎ，Ｅ．Ｔ．＆Ｓｑｕｉｒｅｓ，Ｃ．Ｌ．ＭａｒｋｅｒｌｅｓｓＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｒｒｎｄｅｌｅｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ．Ｇ３５，２５５５－２５５７（２０１５）．
１９Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｍｏｄｕｌａｒａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｌａｒｇｅｒｉｂｏｓｏｍａｌｓｕｂｕｎｉｔ．Ｃｅｌｌ１６７，１６１０－１６２２（２０１６）．
２０Ｓａｔｏ，Ｎ．Ｓ．，Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ａｇｍｏｎ，Ｉ．，Ｙｏｎａｔｈ，Ａ．＆Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎｒｅｖｅａｌｅｄｅｓｓｅｎｔｉａｌｂａｓｅｓｉｎｔｈｅｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｃｅｎｔｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３，１５３８６－１５３９１（２００６）．
２１Ｃｏｃｈｅｌｌａ，Ｌ．＆Ｇｒｅｅｎ，Ｒ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｒＲＮＡｂｙｕｓｉｎｇａｎｉｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１，３７８６－３７９１（２００４）．
２２Ｎｉｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．，Ｂａｎ，Ｎ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｐ．Ｂ．＆Ｓｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｏｆｒｉｂｏｓｏｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｐｅｐｔｉｄｅｂｏｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９，９２０－９３０（２０００）．
２３Ｐｏｌｉｋａｎｏｖ，Ｙ．Ｓ．，Ｓｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．＆Ｉｎｎｉｓ，Ｃ．Ａ．Ａｐｒｏｔｏｎｗｉｒｅｔｏｃｏｕｐｌｅａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎａｎｄｐｅｐｔｉｄｅ－ｂｏｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１，７８７－７９３（２０１４）．
２４Ｋｏｒｏｓｔｅｌｅｖ，Ａ．Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｓｐｅｃｔｓｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅ．ＲＮＡ１７，１４０９－１４２１（２０１１）．
２５Ｔａｔｅ，Ｗ．Ｐ．，Ｃｒｉｄｇｅ，Ａ．Ｇ．＆Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｍ． ’Ｓｔｏｐ’ ｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｓｍｏｄｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｅｘｑｕｉｓｉｔｅｓｕｂｔｌｅｔｙｂｙａｎｅｘｔｅｎｄｅｄＲＮＡｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．４６，１６１５－１６２５（２０１８）．
２６Ｌｉ，Ｇ．Ｗ．，Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，Ｄ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｃ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇａｂｓｏｌｕｔｅｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒａｔｅｓｒｅｖｅａｌｓｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇａｌｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｃｅｌｌ１５７，６２４－６３５（２０１４）．
２７Ｂａｇｇｅｔｔ，Ｎ．Ｅ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．＆Ｇｒｏｓｓ，Ｃ．Ａ．ＧｌｏｂａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ．ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ．１３，ｅ１００６６７６（２０１７）．
２８Ｇｏｎｇ，Ｆ．＆Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍｅｂｙｎａｓｃｅｎｔｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７，１８６４－１８６７（２００２）．
２９Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．Ｋ．ｅｔａｌ．ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＴｎａＣｎａｓｃｅｎｔｐｅｐｔｉｄｅｗｉｔｈｒＲＮＡｉｎｔｈｅｅｘｉｔｔｕｎｎｅｌｅｎａｂｌｅｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅｔｏｒｅｓｐｏｎｄｔｏｆｒｅｅｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４２，１２４５－１２５６（２０１４）．
３０Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｌ．，Ｂｅｒｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ，Ｏ．＆Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｒ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇａｓａｎＬ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓｅｎｓｏｒ．ＣｅｌｌＲｅｐ．９，４６９－４７５（２０１４）．
３１Ｃｒｕｚ－Ｖｅｒａ，Ｌ．Ｒ．，Ｒａｊａｇｏｐａｌ，Ｓ．，Ｓｑｕｉｒｅｓ，Ｃ．＆Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．Ｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｔＲＮＡｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｎａｏｐｅｒｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１９，３３３－３４３（２００５）．
３２Ｌｅｅ，Ｊ．ｅｔａｌ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇｔｈｅｌｉｍｉｔｓｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｔｉｃｃｏｄｅｗｉｔｈｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，５０９７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－１２９１６－ｗ（２０１９）．

Ｄ．材料と方法

１．ＯＳＹＲＩＳ細胞のアセンブリ

ａ．プラスミド構築

ＯＳＹＲＩＳセットアップの作成及び最適化に使用したプラスミドを図５に示す。重要なプラスミドのヌクレオチド配列と特徴はソースデータファイル（Ｓｏｕｒｃｅｄａｔａｆｉｌｅ）に示されている。

プラスミドはすべて、ギブソン・アセンブリ¹を用いて構築し、プラスミドバックボーンはインバースＰＣＲ又は制限ヌクレアーゼ消化で調製し、且つクローン化したインサートはそれぞれのテンプレートからＰＣＲ増幅する、又はインテグレーテッドディーエヌエーテクノロジーズ社（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって化学的に合成された。Ｑ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）を使用してＰＣＲ反応を行い、且つＰＣＲ産物をＤＮＡＣｌｅａｎａｎｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。ｒＲＮＡをコードするプラスミドのギブソン・アセンブリ反応物を大腸菌ＰＯＰ２１３６細胞（菌種はすべて図１８の表に掲載）にエレクトロポレーションし、且つ形質転換体は、適切な抗生物質を補充したＬＢプレート上で回収した。プレートを３０℃でインキュベートし、ラムダＰ_Lプロモーターによって制御されるｒＲＮＡ遺伝子の発現を防いだ²。その他のプラスミドをすべて、必要に応じて１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋａｎ）又は５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（Ｓｐｃ）を補充したＬＢ培地で培養した大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、且つ増やした。プラスミドをＨｉｇｈＰｕｒｅＰｌａｓｍｉｄＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ロッシュ）を使用して単離し、ＰＣＲ及びキャピラリーシークエンスで確認し、且つＯＳＹＲＩＳ細胞の改変に使用した。以下のセクションに、主要なプラスミドの構築について概説する。

ｉ）ｐＲｉｂｏ－Ｔｔプラスミド

エリスロマイシン耐性変異Ａ２０５８ＧをもつｐＲｉｂｏ－Ｔｖ２．０プラスミド³のバックボーンをＳｇｓＩ制限酵素で直鎖にし、且つ精製した。その転写がＰ_tacプロモーター及びＴ１ターミネーターによって制御される一群の欠損ｔＲＮＡ遺伝子（ｔＲＮＡ^Glu、ｔＲＮＡ^Ala、ｔＲＮＡ^Ile、ｔＲＮＡ^Trp及びｔＲＮＡ^Aspをコードする）を、ｇＢｌｏｃｋ（インテグレーテッドディーエヌエーテクノロジー（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））として合成し、且つプライマーＮＡ１及びＮＡ２を用いてＰＣＲ増幅した（プライマーはすべて、図１９の表に掲載）。ＰＣＲ反応を、Ｑ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）を用いて製造元のプロトコールに従って以下の条件で触媒した。９８℃、３０秒、それに続く３０サイクル（９８℃、１０秒；６４℃、３０秒；７２℃、２０秒）、それに続く７２℃、２分間の最終インキュベーション。精製したＰＣＲ産物（２０ｎｇ）を、ＳｇｓＩで直鎖にしたｐＲｉｂｏ－Ｔｖ．２．０バックボーン（８０ｎｇ）と、ギブソン・アセンブリ反応（１．７％ＰＥＧ－８００、３．１ｍＭＤＴＴ、０．３１ｍＭ β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、６２．５μＭ各ｄＮＴＰ、３．１ｍＭＭｇＣｌ₂、３１．３ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．００４Ｕ／μｌＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、４Ｕ／μｌＴａｑＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）、０．０２５Ｕ／μｌＰｈｕｓｉｏｎＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）中で混ぜた。５０℃で１時間インキュベートした後、３μｌの反応混合物をエレクトロコンピテントＰＯＰ２１３６大腸菌細胞に形質転換させた。細胞をＬＢ／Ａｍｐ寒天培地プレートにプレーティングした。形質転換体の個々のコロニーをひろい、ＬＢ／Ａｍｐ培地で培養し、且つプラスミドを単離した。ｔＲＮＡクラスターの存在は、プライマーＮＡ３及びＮＡ４を用いたＰＣＲ増幅並びに配列決定で確認した。

ｉｉ）ｐｏＲＢＳプラスミド

ラムダＰ_Lプロモーター及びＴ１／Ｔ２ターミネーターの転写制御下にある直交性及び野生型ｒＲＮＡオペロンを、プライマーＮＡ５及びＮＡ６を使用してｐＯ２及びｐＡＭ５５２プラスミド⁴からそれぞれＰＣＲ増幅した。プラスミドｐＫＤ１３⁵からプライマーＮＡ７及びＮＡ８を使用してＫａｎ^R遺伝子を増幅した。ｐＣＳａｃＢプラスミド⁶からプライマーＮＡ９及びＮＡ１０を使用してｐＳＣ１０１の複製起点を増幅した。ＰＣＲ反応をＤｐｎＩで処理して親プラスミドのバックグラウンドを減少させた。ＰＣＲ産物を精製し、電気泳動で確認し、且つギブソン・アセンブリ反応に（各４０ｎｇ）混ぜた。５０℃で１時間インキュベートした後、３μｌの反応混合物をエレクトロコンピテントＰＯＰ２１３６大腸菌細胞に形質転換させた。細胞をＬＢ／Ｋａｎ寒天プレートにプレーティングした。３７℃で２４時間インキュベートした後、個々のコロニーをひろい、ＬＢ／Ｋａｎ培地で培養し、且つプラスミドを分離し、且つ制限消化及び配列決定で確かめた。

ｉｉｉ）ｐｏＧＦＰプラスミド

５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びＴ１／Ｔ２ターミネーターをもつｏ－ＧＦＰ遺伝子を、ｐｌｐｐ５－ｏＧＦＰプラスミド⁴からプライマーＮＡ１１及びＮＡ１２を使用してＰＣＲ増幅した。ＬｕｘＲリプレッサー及びＰ_Luxプロモーター⁷を、プライマーＮＡ１３及びＮＡ１４を使用してｐＪＤＯ７５プラスミド⁸からＰＣＲ増幅した。Ｓｐｃ^Rマーカー（ａａｄＡ）を、プライマーＮＡ１５及びＮＡ１６を使用してｐｔＲＮＡ６７プラスミド⁶からＰＣＲ増幅した。ｐ１５Ａの複製起点を、プライマーＮＡ１７及びＮＡ１８を使用してｐｔＲＮＡ６７プラスミドからＰＣＲ増幅された。プラスミドテンプレートを含むＰＣＲ反応物をＤｐｎＩで処理した。精製したＰＣＲ産物（各４０ｎｇ）をギブソン・アセンブリ反応に混ぜた。５０℃で１時間インキュベートした後、３μｌの反応混合物をエレクトロコンピテントＪＭ１０９大腸菌細胞（プロメガ）に形質転換させた。細胞をＬＢ／Ｓｐｃ寒天プレートにプレーティングした。３７℃で２４時間インキュベートした後、個々のコロニーをひろい、ＬＢ／Ｓｐｃ培地で培養し、且つプラスミドを分離した。ｌｕｘＲ遺伝子挿入の存在を、プライマーＮＡ１９及びＮＡ２０を使用してＰＣＲで確認した。得られたプラスミドの制限酵素による消化により、そのサイズが予想されたものより～１ｋｂ大きいことが示された。それに続く制限酵素による解析及び配列決定により、ｌｕｘＲ遺伝子が複製を経ていたことが示された（図５ｃ）。この複製はｏ－ｇｆｐレポーターの発現に影響を与えないと予想される。

ｉｖ）ｐｏＲＦＰ／ｏＧＦＰプラスミド

Ｓｐｃ^Rマーカー（ａａｄＡ）及びｐ１５Ａ複製起点は、ｐｔＲＮＡ６７プラスミド⁶からで増幅した。ＰＣＲ反応物をＤｐｎＩで処理した。ｐｌｐｐ５－ｏＧＦＰプラスミド⁴からＰ_lpp5プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びＴ１／Ｔ２ターミネーターをもつｏ－ＧＦＰ遺伝子をＰＣＲ増幅した。精製したＰＣＲ産物（～４０ｎｇずつ）をギブソン・アセンブリ反応に混ぜた。５０℃で１時間インキュベートした後、３μｌの反応混合物をエレクトロコンピテントＪＭ１０９大腸菌細胞（プロメガ）に形質転換させた。細胞をＬＢ／Ｓｐｃ寒天プレートにプレーティングした。３７℃で２４時間インキュベートした後、個々のコロニーをひろい、ＬＢ／Ｓｐｃ培地で培養し、且つプラスミドを単離した。得られたプラスミドｐｌｐｐ５－ｏＧＦＰ－ｐＡ１５－Ｓｐｅｃの構造を、制限消化及び配列決定で確かめた。プラスミドｐＲＹＧ⁹から、Ｐ_T5プロモーター及びＴ０転写ターミネーターを含むｒｆｐ遺伝子をＰＣＲ増幅した。直交性ＳＤ配列をＰＣＲによって導入し、且つ得られたｏ－ｒｆｐコンストラクトをｐｌｐｐ５－ｏＧＦＰ－ｐＡ１５－ＳｐｃプラスミドのユニークＳｐｈＩサイトに挿入した。

ｖ）ｐｏＬｕｃプラスミド

ｐｏＧＦＰをベースにして、直交性ルシフェラーゼ遺伝子をもつプラスミドｐｏＬｕｃを構築した（図５ｃ）。ホタルルシフェラーゼをコードする１６５３ｂｐの遺伝子ｌｕｃを、ｐＢＥＳＴｌｕｃプラスミド（プロメガ）からプライマーＮＡ２１及びＮＡ２２を使用してＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物及びｐｏＧＦＰプラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩで切り、且つライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換させ、ｌｕｃ遺伝子陽性クローンをコロニーＰＣＲによって特定し、クローン化したｌｕｃ遺伝子の完全性を配列決定で確かめた。

ｖｉ）ｐｏＧＦＰ－ＴｎａＣプラスミド

レポーターｐｏＧＦＰ－ＴｎａＣプラスミド（野生型又はＷ１２Ｒ変異体）を構築するために、ｐｏＧＦＰプラスミド中のｇｆｐ－コーディング配列をキメラ野生型又は変異体ＧＦＰ－ＴｎａＣタンパク質をコードする配列で置き換えた。直交性リボソーム結合部位及びＧＦＰ－ＴｎａＣ又はＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）コーディング配列を含有するＤＮＡインサートを、プライマーＮＡ２３及びＮＡ２４を使用して、インビトロ翻訳（後述）に使用されるテンプレートを使用してＰＣＲによって作製した。精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩで切ったｐｏＧＦＰプラスミドに、挿入物をギブソン・アセンブリで導入した。形質転換後、個々のコロニー中の正しい挿入物の存在を、プライマーＮＡ２５及びＮＡ２６を使用したコロニーＰＣＲ並びに、プラスミドの対応するセグメントの配列決定によって確認した。

ｂ．改変Ｒｉｂｏ－Ｔ発現細胞

染色体ｒＲＮＡアレル¹⁰を欠き、且つＲｉｂｏ－Ｔ⁴を発現時に増殖を促す変異をｙｂｅＸ及びｒｐｓＡ遺伝子にもつＳＱ１７１ＦＧ細胞（図１８の表）を宿主として使用した（図６）。将来、５－フルオロウラシルネガティブ選択を使用するかも知れないので、遺伝子ｕｐｐを組換え操作（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって不活性化した。

レシピエント細胞は最初、次の２つのプラスミドをもっていた：ｒｒｎＢオペロン、カウンター選択性ｓａｃＢマーカー、及びＫａｎ^R遺伝子を含有するｐＣＳａｃＢプラスミド、並びに染色体ｒＲＮＡオペロンの欠失中に除去された欠損ｔＲＮＡ遺伝子をもつｐｔＲＮＡ６７プラスミド⁶。細胞をエレクトロコンピテントにし、且つ次に５０μｌの細胞懸濁液を、ＰＯＰ２１３６細胞から単離した、Ｒｉｂｏ－ＴｒＲＮＡ遺伝子をもち、且つｔＲＮＡ遺伝子を欠くｐＲｉｂｏ－Ｔｔプラスミド５０ｎｇで形質転換した（図５）。形質転換細胞は、１ｍｌのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＳＯ₄、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭグルコース）で希釈し、且つ３７℃で６時間振盪しながらインキュベートした。培養物の１５０μｌアリコートを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５ μｇ／ｍｌスペクチノマイシン及び０．２５％スクロースを補充した新鮮なＳＯＣ培地で２ｍｌに希釈し、且つ３７℃で１２時間絶えず振盪しながら培養した。細胞をスピンダウンし（１分、５０００ｇ）、且つ５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、５％スクロース、及び１ｍｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｒｙ）を含有するＬＢ／寒天プレートに播いた。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。ｐＣＳａｃＢプラスミドが存在しないことを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む又は含まない、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＬＢ／寒天プレート上にコロニーをレプリカプレーティングすることによって試験した形質転換体のカナマイシンに対する感受性によって確かめた。次いで、形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンと２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＬＢ培地で培養し、プラスミドを単離し、制限酵素による解析で確かめた。さらに、野生型ｒＲＮＡが存在しないことを、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（キアゲン）を使用したトータルＲＮＡの単離及びアガロースゲル電気泳動によって確認した。

ｃ．ｐｔＲＮＡ６７プラスミドの除去

次いで、得られた形質転換体のｐｔＲＮＡ６７プラスミドを除去した。そのために、細胞を、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを補充したＬＢ培地で～１００世代にわたって継代した。細胞希釈液をプレーティングした後、個々のクローンにｐｔＲＮＡ６７プラスミドが存在しないことを、Ｓｐｃに対する感受性及び全プラスミド調製物の制限消化において目で見える量のｐｔＲＮＡ６７プラスミドのバンドがないことによって確かめた。

ｄ．Ｒｉｂｏ－Ｔ発現細胞中のｒｅｃＡ遺伝子の不活性化

ｐｏＲｂｓを改変細胞に導入しようとする当初の試みは、ｐｏＲｂｓとｐＲｉｂｏ－Ｔｔプラスミドの間の組換えから生じる異常なプラスミドの出現を頻繁にもたらした。そこで、その問題を回避するために、ｐＲｉｂｏ－Ｔｔプラスミドを有する細胞においてｒｅｃＡ遺伝子を不活性化した（なお、ｒｅｃＡ遺伝子を不活性化してからｐｔＲＮＡ６７プラスミドを除去することは、Ｓｐｃ非存在下で細胞を長期間継代した後のプラスミド消失を防いだ）。

Ｐ１ファージ形質導入によってＯＳＹＲＩＳ細胞のｒｅｃＡ遺伝子を不活性化するために、まず、ｐＫＤ３プラスミド⁵からクロラムフェニコール（Ｃｈｌ）耐性カセットを使用した従来の組換え手順によってドナー株ＢＷ２５１１３ｒｅｃＡ：：ｃａｔを調製した。プライマーＮＡ２７及びＮＡ２８を使用して、そのカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を、Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドｐＤＫ４６をもつＢＷ２５１１３株に形質転換させた。ｒｅｃＡ：：ｃａｔ株を選択及び検証し、且つｐＫＤ４６プラスミドを除去した後、得られた株をファージ形質導入用のドナーとして使用した。５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ／寒天プレートに形質導入体を播く前の回復培養が１時間ではなく６時間であったこと以外は標準的なプロトコール¹¹に従ってＰ１ファージ形質導入を行った。改変株の遺伝子型を図２０の表に示す。

ｅ．ｐｏＲｂｓプラスミドの導入

次いで、ＳＱ１７１ＦＧ ΔｒｅｃＡ／ｐＲｉｂｏ－Ｔｔ株を、エレクトロポレーション及びＡｍｐ^R／Ｋａｎ^R／Ｃｈｌ^R細胞の選択によって、ｐｏＲｂｓ（又は必要に応じてｐＲｂｓ）プラスミドで形質転換した。標準的な形質転換プロトコールとの唯一の違いは、抗生物質を欠くＳＯＣ培地での形質転換体の回収を６時間前に延長し、且つ５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ／寒天プレート上で形質転換体を選択したことであった。形質転換体を、全プラスミドの制限酵素による解析及びアガロースゲル電気泳動によるｒＲＮＡの分析で確かめた。

ｆ．レポータープラスミドの導入

レポータープラスミド（ｐｏＧＦＰ、ｐｏＲＦＰ／ｏＧＦＰ、ｐｏＬｕｃ、ｐｏＧＦＰ－ＴｎａＣ）を、本質的には前項で記載の通り、エレクトロポレーションでＳＱ１７１ＦＧ ΔｒｅｃＡ／ｐＲｉｂｏ－Ｔｔ／ｐｏＲｂｓ細胞への導入及びＡｍｐ^r／Ｋａｎ^r／Ｃｈｌ^r／Ｓｐｃ^r細胞の選択によって導入した。

ｇ．ＯＳＹＲＩＳ細胞のゲノム配列の検証

ＯＳＹＲＩＳ細胞構築の間、最初の宿主細胞は何度も継代され、且つ複数のステップでシングルコロニー精製を経て、自然変異の蓄積につながる可能性がある。そこで、完全にアセンブリされたＯＳＹＲＩＳ細胞の全ゲノムの配列を決定した。得られた配列の解析により、いくつかの遺伝子に変異があることが示された（図２０の表）。これらの変異の一部（例えば、遺伝子ｐｔｓＩ又はａｃｋＡ）は、いくつかの条件下で細胞の増殖に悪い影響を及ぼす可能性があり、且つゲノム工学（ｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって将来、修正される可能性がある。

ｈ．直交性ｇｆｐ遺伝子のインビボ発現のモニタリング

ｐｏＲｂｓ又はｐＲｂｓのいずれかのプラスミド（それぞれ直交性又は非直交性のリボソームを発現させる）及びｐｏＧＦＰレポータープラスミドを有するＯＳＹＲＩＳ細胞を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシン及び１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地で３７℃にて絶えず振盪して振って一晩培養した。同じ抗生物質を補充し、且つさらにレポーター遺伝子転写の誘導物質であるＮ－（β－ケトカプロイル）－Ｌ－ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）（サンタクルーズバイオテクノロジー）を１ｎｇ／ｍｌ含有する新鮮なＬＢ培地に、培養物を１：４０（体積／体積）で希釈した。培養物（１２０μｌ）を９６ウェル平底ポリスチレン組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに入れ、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００Ｐｒｏ）に置き、且つ３７℃で絶えず直線（３ｍｍ）的に振盪しながらインキュベートした。細胞培養密度（Ａ₆₀₀）とＧＦＰ蛍光（励起波長４８５ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ、ゲイン調整機能適用時の最適ゲイン３０％ＲＦＵ）を２４～４８時間の間にわたってモニタリングした。レポーターを欠く細胞の自発蛍光を、すべての記録値から差し引いた。

エリスロマイシン感受性試験の場合、一晩培養したものを、ＨＳＬのみ（最終濃度：０～１６ｎｇ／ｍｌ）又は１ｎｇ／ｍｌのＨＳＬ及び様々な濃度のエリスロマイシン（最終濃度：０～１ｍｇ／ｍｌ）にいずれかを補充した新鮮なＬＢ培地に１：４０で希釈した。細胞増殖及びＧＦＰ発現のモニタリングは、前述のパラグラフに記載の通りである。

ＯＳＹＲＩＳ細胞がｐｏＲＦＰ／ｐｏＧＦＰレポーターをもつ場合、励起波長５５０ｎｍ、及び発光波長６７５ｎｍ、ゲイン調整機能適用時の最適ゲイン３０％ＲＦＵを用いてＲＦＰの発現をモニタリングした。

２．直交性ルシフェラーゼ遺伝子のインビボ発現

ｐｏＬｕｃプラスミドをもつＯＳＹＲＩＳ細胞を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシン及び１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地で２４時間培養し、且つその後に同じ抗生物質及び１ｎｇ／ｍｌのＨＳＬを含有する新鮮な培地に１：４０で希釈した。６時間後、Ａ₆₀₀が０．２の各培養物をスピンダウン（５分、５０００ｇ、４℃）し、細胞ペレットを瞬間凍結させた。ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（プロメガ）を使用して製造元のプロトコールに従って測定した。具体的には、細胞ペレットを２０℃の水浴で解凍し、２５μｌの１０％（体積／体積）の二塩基性リン酸バッファー（１ＭＫ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ７．８、２０ｍＭＥＤＴＡ）を補充したＬＢに再懸濁した。２０μｌの細胞懸濁液を、６０μｌの新鮮に調製した溶解ミックス（ｌｙｓｉｓｍｉｘ）（２５ｍＭリン酸トリスｐＨ７．８、２ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭ１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、１０％グリセロール、１％トリトンＸ－１００、１．２５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、２．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）と混ぜ、且つ室温で１０分間溶解した。次いで、細胞溶解物の１０μｌアリコートを９６ウェルブ黒色／透明（ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ）底アッセイプレート（コーニング）のウェルに入れ、５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（プロメガ）を加え、且つ直ちにＴＥＣＡＮマイクロプレートリーダーで蛍光の読み取りを得た。

３．ｏＲｉｂｏ－Ｔ又はｏＲｂｓによって進められるレポーター発現の比較

大腸菌ＢＬ２１株をｐｏＧＦＰ又はｐｏＬｕｃプラスミドのいずれかで形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌのＳｐｃを補充したＬＢ／寒天プレートで選択し、個々のコロニーから増殖させ、且つその後にエレクトロコンピテントにした。次いで、レポーター含有細胞を、ｐｏＲｉｂｏ－Ｔ（ｏＲｉｂｏ－ＴｒＲＮＡを発現するｐＢＲ３２２ｏｒｉベース、Ａｍｐ^Rプラスミド）³、又はｏ－ｐＡＭ５５２プラスミド（ｏＲｂｓｒＲＮＡを発現するｐＢＲ３２２ｏｒｉベース、Ａｍｐ^R プラスミド）³で形質転換した。

ｏ－ｇｆｐ又はｏ－ｌｕｃレポーターの発現は上記のように測定した。

４．含有される変異体ｒＲＮＡの分析

直交性リボソームの２３ＳｒＲＮＡにおける改変された変異の有無をプライマー伸長法で分析した。そのために、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（キアゲン）を使用してＯＳＹＲＩＳ細胞からトータルＲＮＡを単離した。各変異の分析用のプライマー並びにｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰの組み合わせを図２１の表に示す。各アッセイでは、９０℃で１分間インキュベートし、且つその後に１５分間かけて４２℃まで冷やすことによって適切な５’［³²Ｐ］－標識プライマー（０．５ｐｍｏｌ）を１×ハイブリダイゼーションバッファー（５０ｍＭＫ－ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１００ｍＭＫＣｌ）中で１μｇのトータルＲＮＡにアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーは、０．２５ｍＭの適切なｄｄＮＴＰ及び０．２ｍＭのそれぞれの残りのｄＮＴＰ（図２１の表）の存在下で、２ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（ロッシュ）を用いて４２℃で２０分間伸長した（最終反応量８μｌ）。１２０μｌのストップバッファー（ｓｔｏｐｂｕｆｆｅｒ）（８４ｍＭＮａＯＡｃ、０．８ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、７０％ＥｔＯＨ）を加え、－８０℃で１５分間冷却し、且つ１５０００ｇ（４℃）で１時間遠心分離して核酸をペレット化することによって反応を停止した。上清を除去し、ペレットを乾燥させ、ホルムアミドローディング色素に溶かした。ｃＤＮＡ生成物を１２％変性ポリアクリルアミドゲル中で分解し、且つホスフォイメージングで可視化した。トウプリントバンドの強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア¹²を使用して測定した。バックグラウンドを差し引いた。

５．無細胞翻訳系におけるＧＦＰ－ＴｎａＣ（野生型）又はＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）タンパク質の発現

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のリボソーム結合部位及びＧＦＰ－ＴｎａＣ又はＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）コード配列（付録Ｉを参照）を含有するＤＮＡテンプレートをクロスオーバーＰＣＲで作製した。最初に、Ｔ７プロモーター及びｇｆｐコード配列を、ｐＹ７１－Ｔ７－ＧＦＰプラスミド¹³から、Ｔ７プロモーターフォワードプライマーＮＡ２９（図１９の表）及び野生型ｔｎａＣに相補的なＮＡ３０又はｔｎａＣ遺伝子のＷ１２Ｒ変異体に相補的なＮＡ３１のいずれかを使用してＰＣＲ増幅した。独立して、プラスミドｐＧＦ２５００－ｔｎａＣ－ｗｔ又はｐＧＦ２５００－ｔｎａＣ－ｍｕｔ¹⁴から、野生型についてはフォワードプライマーＮＡ３２、又はＷ１２Ｒ変異体についてはＮＡ３３、及び共通のリバースプライマーＮＡ３４を使用して、３’非翻訳領域をもつ野生型又は変異体ｔｎａＣ遺伝子の３’セグメントをＰＣＲ増幅した。

次いで、野生型又は変異体ｇｆｐ－ｔｎａＣコンストラクトのいずれかに対応する２つのＰＣＲ産物を、４００ｐｇ／μｌ（最終濃度）で合わせ、且つＴ７及びＴｎａＣ（ｒｅｖ）プライマーを使用して再増幅した。

ｇｆｐ－ｔｎａＣテンプレートのインビトロ翻訳を、精製成分から構成される、Δリボソーム、ΔｔＲＮＡ、Δアミノ酸無細胞翻訳系ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（ニュー・イングランド・バイオラボ）で、少し改変をくわえて、¹⁵に記載のように行った。反応に、１９種のアミノ酸混合物（最終濃度：各アミノ酸０．３ｍＭ）及び最終濃度５０μＭのＬ－トリプトファン（低トリプトファン条件での反応）又は５ｍＭＴｒｐ（高トリプトファン条件での反応）を補充した。ＰＣＲで作製したＤＮＡテンプレートを５ｎｇ／μｌの最終濃度まで加えた。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００Ｐｒｏ）内の黒壁及び透明底をもつ３８４ウェルプレート（ファルコン）で、総量５μｌで３７℃にて３時間反応を行った。ＧＦＰ蛍光（励起波長４８５ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ、ゲイン調整機能適用時の最適ゲイン３０％ＲＦＵ）を経時的にモニタリングした。

６．ＰＴＣ変異体ライブラリーの調製

ｐＴ７ｒｒｎＢライブラリー¹⁶からｐｏＲｂｓプラスミドの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に個々の変異を移すことによって、ＰＴＣ変異体ライブラリーを作製した。

プラスミドバックボーンを調製するために、ｐｏＲｂｓプラスミドをＳｇｓＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉ制限酵素で消化し、１５４６ｎｔの断片を２３ＳｒＲＮＡ遺伝子から切り出した。反応生成物をアガロースゲル電気泳動で分離し、且つＺｙｍｏｃｌｅａｎＧｅｌＤＮＡＲｅｃｏｖｅｒｙＫｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及びＤＮＡＣｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＫｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を順に使用して、７４８３ｂｐのバックボーン断片をゲルから精製した。

ＰＴＣ変異をもつ１６０６ｂｐのインサートを生成するために、Ｑ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）によって触媒され、且つプライマーＮＡ３５及びＮＡ３６を用いるＰＣＲ反応用のテンプレートとして、ｐＴ７ｒｒｎＢプラスミドライブラリーの個々のプラスミドを使用した。ＰＣＲ産物をＤＮＡＣｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＫｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してクリーンアップした。

プラスミドバックボーン（３５ｎｇ）及びＤＮＡインサート（６０ｎｇ）を総量５μｌのギブソン・アセンブリ反応物に混ぜ、且つ５０℃で１時間インキュベートした。

個々のギブソン・アセンブリ反応物を用いて、化学的にコンピテントなＰＯＰ２１３６細胞を形質転換した。ハイスループット形質転換は、低蒸発透明蓋付き平底組織培養９６ウェルプレート（ファルコン）を用いて行った。プレートの各ウェルに、２０μｌのコンピテント細胞を、２μｌの個々のギブソン・アセンブリ反応物と混ぜた。プレートを、氷上で３０分間、４２℃で５０秒間、再び氷上で１５分間インキュベートした。各ウェルに１００μｌのＳＯＣ培地を加え、且つ振盪器上で細胞を３０℃で２時間回復させた。プレートを、スイングバケットローターで６０００ｇ、６分間回転し、且つ（８０μｌの上清を除去することによって、培養液の量を４０μｌに減らした。次いで、残りの細胞懸濁液のそれぞれ６μｌを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＬＢ／寒天長方形ＯｍｎｉＴｒａｙＳｉｎｇｌｅ－Ｗｅｌｌプレート（ヌンク）にマルチチャンネルピペッターを使用してスポットプレッティングした（ｓｐｏｔ－ｐｌａｔｅｄ）。プレートを３０℃で２０時間インキュベートした。

個々のコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した新鮮なＬＢ培地に接種し、３０℃で１２時間培養した。プラスミドを単離し、且つＰＣＲ増幅した２３ＳｒＲＮＡセグメントに所望の変異が存在すること、及びオフターゲットの変異がないことをキャピラリーシーケンシングで確認した。

次いで、個々のＰＴＣ変異体ライブラリープラスミドを、上記ハイスループット形質転換アプローチを以下の改変とともに用いてＳＱ１７１ＦＧ／ｐＲｉｂｏ－Ｔｔ／ｐｏＧＦＰ－ＴｎａＣ細胞に形質転換することによってＯＳＹＲＩＳ細胞に導入した。ｉ）２０ｎｇの精製した個々のプラスミドを形質転換に使用した。ｉｉ）形質転換体を３７℃のＳＯＣ培地で６時間回復させ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、及び１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ／寒天プレートにパッチした（ｐａｔｃｈｅｄ）。ｉｉｉ）プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。ｉｖ）形質転換体の個々のコロニーから培養した培養物から９６ウェルプレートにグリセロールストックを作製した。

７．ＰＴＣライブラリースクリーニング

ＰＴＣライブラリー変異体をもつＯＳＹＲＩＳ細胞の個々のコロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、及び１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地が１２０μｌ入った９６ウェルプレートのウェルに接種し、３７℃で２４時間、絶えず振盪しながら培養した。同じ抗生物質、０．３５ｍｇ／ｍｌ１－メチル－トリプトファン（シグマ）及び０．０１６ｎｇ／ｍｌのＨＳＬを補充した新鮮なＬＢ培地１２０μｌに、培養物を１：４０（体積／体積）で希釈した。プレートをＴＥＣＡＮＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００Ｐｒｏプレートリーダーに置き、３７℃で絶えず直線的に（ｌｉｎｅａｒ）（３ｍｍ）振盪しながらインキュベートした。培養物の光学密度（Ａ₆₀₀）及びｏＧＦＰ蛍光を上記のようにモニタリングした。

ＧＦＰ－ＴｎａＣ（Ｗ１２Ｒ）変異体コンストラクトをもつＯＳＹＲＩＳ細胞のＧＦＰ発現の効率を、野生型ＧＦＰ－ＴｎａＣコンストラクトをもつＯＳＹＲＩＳ細胞の発現効率を比較することによって、終結アレストバイパススコアを算出した。停滞バイパス（ＳＢ）スコア値は、４８時間の時点で得られた読み取り値に基づいて次式を用いて算出した。

ここで、ＲＦＵは相対蛍光単位である。

平均ＳＢスコア値は、独立した２つの実験で得られたデータを用いて算出した。

８．ＯＳＹＲＩＳ細胞に由来する５０Ｓリボソームサブユニットの単離

Ｏｈａｓｈｉら¹⁷によって報告されたプロトコールに従ってＯＳＹＲＩＳ細胞からリボソームを単離した。具体的には、２３ＳｒＲＮＡに変異Ｕ２５００Ｇ、Ａ２０６０Ｃ又はＡ２４５０Ｕをもつリボソームを発現するＯＳＹＲＩＳ細胞を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、及び１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地で３７℃にて一晩培養した。培養物を、同じ抗生物質を補充した１Ｌの新鮮なＬＢ培地に、最終Ａ₆₀₀＝０．００３に希釈し、且つ光学密度がＡ₆₀₀＝０．３５に達するまで激しく振盪して約１５時間培養した。細胞を５０００ｇ（４℃）での１５分間遠心分離によって集め、且つ細胞ペレットを液体窒素中で瞬間凍結させ、且つ－８０℃で保存した。凍結細胞ペレットを２０ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．６、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、７ｍＭ β－メルカプトエタノール）に再懸濁し、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ－Ｃ３ホモジナイザー（ＡＶＥＳＴＩＮＩｎｃ．）で１５０００ｐｓｉにて５分間溶解し、且つその後に溶解物を、２００００ｇ（４℃）の３０分間遠心分離で清澄化し、且つ新しい遠心チューブに移した。硫酸アンモニウムを１．５Ｍの最終濃度まで加え、且つチューブを２００００ｇ（４℃）で１時間遠心分離した。リボソーム（Ｒｉｂｏ－Ｔ＋解離可能なリボソーム）含有上清を０．２２－μｍ φ３０ｍｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブレンフィルター（ＣＥＬＬＴＲＥＡＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）を通して濾過した。リボソーム材料を、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒＵＰＣ１０（ＧＥヘルスケア）上で２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、７ｍＭ β－メルカプトエタノール、１．５Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で平衡化した５ｍｌＨｉＴｒａｐＢｕｔｙｌＦＦカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いた疎水クロマトグラフィーで精製した。材料を載せた後、カラムを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、７ｍＭ β－メルカプトエタノール、１．２Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で洗い、且つその後に２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、７ｍＭ β－メルカプトエタノール、０．７５Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を含有するバッファーでリボソームを溶出させた。リボソームが入った溶出画分を一緒にまとめ、３５ｍｌ容遠心チューブにバッファー２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、３０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、７ｍＭ β－メルカプトエタノール中に調製した１６ｍｌの３０％ショ糖クッションに載せた。タイプ７０Ｔｉローター（ベックマン）で３６０００ｒｐｍ、４℃で１８時間遠心分離することによって、リボソームをペレット化した。リボソームペレットを解離／保存バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨｐＨ７．６、３０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、７ｍＭ β－メルカプトエタノール）に再懸濁し、且つアリコートを瞬間冷凍し、且つ－８０℃で保存した。

個々の５０Ｓリボソームサブユニットを単離するために、ＳＷ４１ローター（ベックマン）用の遠心チューブに、バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、１００ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、２ｍＭ β－メルカプトエタノール）中に調製した１０～４０％ショ糖勾配にリボソーム調製物を載せた。その勾配を２７０００ｒｐｍ、４℃で１６時間遠心分離し、且つＡ₂₅₄モニタリングしながらグラジエントフラクショネーター（ＢｉｏＣｏｍｐ）で分画した。大リボソームサブユニットに対応する画分をプールし、セルローストリアセテート膜の付いたＶｉｖａｓｐｉｎ２ｍｌ濃縮器（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＳｔｅｄｉｍＢｉｏｔｅｃｈＧｍｂＨ）で濃縮し、且つリボソーム保存バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨｐＨ７．６、３０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、７ｍＭ β－メルカプトエタノール）に集めた。アリコートを瞬間凍結させ、且つ－８０℃で保存した。

９．非致死的２３ＳｒＲＮＡ変異をもつリボソームの単離

２３ＳｒＲＮＡに非致死的変異（Ａ２５０３Ｇ、Ａ２０６２Ｇ、Ｃ２６１１Ｇ、及びＣ２６１１Ｕ）を有するリボソームを、対応する変異をもつｐＡＭ５５２プラスミド⁴を有するＳＱ１７１細胞から単離した。変異体リボソームの純粋な集団を発現する対応する株を以前に記載¹⁸のように調製した。ショ糖クッション遠心分離後にリボソームペレットをリボソーム保存バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨｐＨ７．６、３０ｍＭＫＣｌ、６ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、７ｍＭ β－メルカプトエタノール）に再懸濁した以外は、上記のようにリボソームを単離した。アリコートを瞬間凍結し、－８０℃で保存した。

１０．トウプリンティング分析

プライマー伸長阻害（トウプリンティング）分析¹⁹を以前に記載²⁰のように行った。必要な場合、プロリル－ｔＲＮＡ合成酵素阻害剤である５’－Ｏ－［Ｎ－（Ｌ－プロリル）－スルファモイル］アデノシン（Ｌ－ＰＳＡ）²¹を、５０μＭの最終濃度で反応に加えた。プライマー伸長産物をシークエンシングゲルで分離し、且つホスフォイメージングを行った後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア¹²を使用してトウプリントバンドの強度を決定した。停止コドンのトウプリントバンドの強度（ＳＢ）（図１６ｃの矢じり）を、Ｌ－ＰＳＡ含有試料の先行コドンでのトウプリントバンド（図１６ｃの開いた白い矢じり）の強度（ＰＢ）と比較することによって、ｔｎａＣ停止コドンでのＴｎａＣによって誘導される翻訳アレストの効率を、次式を用いて算出した。

ここで、ＳＢ_BG及びＰＢ_BGは対応するバンドのバックグラウンドである。

１１．構造解析と図の作成

Ａサイトアミノ酸の攻撃α‐アミノ基に対する２３ＳｒＲＮＡヌクレオチドの距離を計算するために、攻撃前状態にあるＰサイト及びＡサイトｔＲＮＡをもつサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リボソームの結晶構造（ＰＤＢ１ＶＹ４）²²を、部分的に回転した空の（ｐａｒｔｉａｌｌｙｒｏｔａｔｅｄｖａｃａｎｔ）大腸菌リボソーム高解像度構造（ＰＤＢ４ＹＢＢ）²³と全長２３ＳｒＲＮＡに基づいてアラインメントした。距離測定と描画はＰｙＭＯＬ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒａｐｈｉｃｓＳｙｓｔｅｍ、バージョン２．０Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ．）で行った。図４ｇは、ＰサイトのＴｎａＣ－ｔＲＮＡで停滞した大腸菌リボソームの低温電子顕微鏡構造（ＰＤＢ４ＵＹ８）²⁴と、ＲＦ２と複合体形成したＴ．サーモフィルスリボソームの結晶構造（ＰＤＢ４Ｖ６７）²⁵をアラインメントして作成した。

１２．統計解析

統計値は適宜図の凡例で見ることができる。値の平均は算術平均とした。独立した生物学的複製の数（ｎ）に応じて、偏差の範囲は標準偏差（ｎ≧３）又は実験誤差（ｎ＝２）のいずれかを表す。マイクロソフトエクセル３６５ソフトウェアを使用して、すべて統計値を計算し、すべてのグラフをプロットした。ウィンドウズ（登録商標）向けグラフパッドプリズムバージョン８．００（グラフパッドソフトウェア、米国カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、スチューデントのｔ検定を行った。

材料と方法に関する参考文献

１Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔａｌ．ＥｎｚｙｍａｔｉｃａｓｓｅｍｂｌｙｏｆＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓｕｐｔｏｓｅｖｅｒａｌｈｕｎｄｒｅｄｋｉｌｏｂａｓｅｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ６，３４３－３４５（２００９）．

２Ｋｕｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｊａｇｅｒ，Ｅ．Ｊ．＆ｖａｎｄｅｒＺｅｉｊｓｔ，Ｂ．Ａ．ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｌｉｎｋｅｒｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＸ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１７，８００７（１９８９）．

３Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ｅｔａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｒｉｂｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈｔｅｔｈｅｒｅｄｓｕｂｕｎｉｔｓｆｏｒｅｘｐａｎｄｉｎｇｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ１０，３９２０（２０１９）．

４Ｏｒｅｌｌｅ，Ｃ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｒｉｂｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈｔｅｔｈｅｒｅｄｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ５２４，１１９－１２４（２０１５）．

５Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．＆Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．Ｏｎｅ－ｓｔｅｐｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｇｅｎｅｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ－１２ｕｓｉｎｇＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７，６６４０－６６４５（２０００）．

６Ｚａｐｏｒｏｊｅｔｓ，Ｄ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｓ．＆Ｓｑｕｉｒｅｓ，Ｃ．Ｌ．ＰｒｏｄｕｃｔｓｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｆｒｏｍｒｅａｒｒａｎｇｅｄｒｒｎｇｅｎｅｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｃａｎａｓｓｅｍｂｌｅｔｏｆｏｒｍｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１８５，６９２１－６９２７（２００３）．

７Ｃａｎｔｏｎ，Ｂ．，Ｌａｂｎｏ，Ａ．＆Ｅｎｄｙ，Ｄ．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔａｎｄｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒｔｓａｎｄｄｅｖｉｃｅｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２６，７８７－７９３（２００８）．

８Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｍｏｄｕｌａｒａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｌａｒｇｅｒｉｂｏｓｏｍａｌｓｕｂｕｎｉｔ．Ｃｅｌｌ１６７，１６１０－１６２２（２０１６）．

９Ｍｏｎｋ，Ｊ．Ｗ．ｅｔａｌ．ＲａｐｉｄａｎｄｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｎｏｎｓｔａｎｄａｒｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．ＡＣＳＳｙｎｔｈＢｉｏｌ６，４５－５４（２０１７）．

１０Ｑｕａｎ，Ｓ．，Ｓｋｏｖｇａａｒｄ，Ｏ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｕｕｒｍａｎ，Ｅ．Ｔ．＆Ｓｑｕｉｒｅｓ，Ｃ．Ｌ．ＭａｒｋｅｒｌｅｓｓＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｒｒｎｄｅｌｅｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ．Ｇ３５，２５５５－２５５７（２０１５）．

１１Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｌ．Ｃ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｎ．＆Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ．Ｅ．ｃｏｌｉｇｅｎｏｍｅｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｂｙＰ１ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＭｏｌＢｉｏｌ／ｅｄｉｔｅｄｂｙＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌ．．．［ｅｔａｌ．］Ｃｈａｐｔｅｒ１，Ｕｎｉｔ１１７（２００７）．

１２Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．＆Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｋ．Ｗ．ＮＩＨＩｍａｇｅｔｏＩｍａｇｅＪ：２５ｙｅａｒｓｏｆｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ９，６７１－６７５（２０１２）．

１３Ｂｕｎｄｙ，Ｂ．Ｃ．＆Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｐ－ｐｒｏｐａｒｇｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｉｎａｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒｄｉｒｅｃｔｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｃｌｉｃｋｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ２１，２５５－２６３（２０１０）．

１４Ｇｏｎｇ，Ｆ．＆Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．ＲｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｔｎａｏｐｅｒｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏｉｎａｎＳ－３０ｓｙｓｔｅｍ．ＴｒｙｐｔｏｐｈａｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｓｃｌｅａｖａｇｅｏｆＴｎａＣｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｔＲＮＡ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７６，１９７４－１９８３（２００１）．

１５Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．Ｋ．ｅｔａｌ．ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＴｎａＣｎａｓｃｅｎｔｐｅｐｔｉｄｅｗｉｔｈｒＲＮＡｉｎｔｈｅｅｘｉｔｔｕｎｎｅｌｅｎａｂｌｅｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅｔｏｒｅｓｐｏｎｄｔｏｆｒｅｅｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４２，１２４５－１２５６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ９２３（２０１４）．

１６ｄ’Ａｑｕｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ａｚｉｍ，Ｔ．，Ａｌｅｋｓａｓｈｉｎ，Ｎ．Ａ．，Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｒｙ，Ａ．Ｈ．，Ｊｅｗｅｔｔ，Ｍ．Ｃ．Ｍｕｔａｔｉｎｇｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｅｐｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｃｅｎｔｅｒｉｎｖｉｔｒｏ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，ｉｎｐｒｅｓｓ（２０２０）．

１７Ｏｈａｓｈｉ，Ｈ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．，Ｙｉｎｇ，Ｂ．Ｗ．＆Ｕｅｄａ，Ｔ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｒｉｂｏｓｏｍｅｄｉｓｐｌａｙｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｐｕｒｉｆｉｅｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ３５２，２７０－２７６（２００７）．

１８Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌａｓｌｏｐ，Ｎ．，Ｔｈｕｍ，Ｃ．＆Ｍａｎｋｉｎ，Ａ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｄｒｕｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｉｂｏｓｏｍｅｓｔａｌｌｉｎｇ．ＭｏｌＣｅｌｌ３０，１９０－２０２（２００８）．

１９Ｈａｒｔｚ，Ｄ．，ＭｃＰｈｅｅｔｅｒｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｔｒａｕｔ，Ｒ．＆Ｇｏｌｄ，Ｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１６４，４１９－４２５（１９８８）．

２０Ｏｒｅｌｌｅ，Ｃ．ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｏｆａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｂｙｐｒｉｍｅｒｅｘｔｅｎｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４１，ｅ１４４（２０１３）．

２１Ｈｅａｃｏｃｋ，Ｄ．，Ｆｏｒｓｙｔｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｈｉｂａ，Ｋ．＆ＭｕｓｉｅｒＦｏｒｓｙｔｈ，Ｋ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｌｙｌａｄｅｎｙｌａｔｅａｎａｌｏｇｓ．ＢｉｏｏｒｇＣｈｅｍ２４，２７３－２８９（１９９６）．

２２Ｐｏｌｉｋａｎｏｖ，Ｙ．Ｓ．，Ｓｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．＆Ｉｎｎｉｓ，Ｃ．Ａ．Ａｐｒｏｔｏｎｗｉｒｅｔｏｃｏｕｐｌｅａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎａｎｄｐｅｐｔｉｄｅ－ｂｏｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ２１，７８７－７９３（２０１４）．

２３Ｎｏｅｓｋｅ，Ｊ．ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｒｉｂｏｓｏｍｅ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ２２，３３６－３４１（２０１５）．

２４Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｌ．，Ｂｅｒｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ，Ｏ．＆Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｒ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇａｓａｎＬ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓｅｎｓｏｒ．ＣｅｌｌＲｅｐ９，４６９－４７５（２０１４）．

２５Ｋｏｒｏｓｔｅｌｅｖ，Ａ．ｅｔａｌ．ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｒｅｌｅａｓｅｆａｃｔｏｒＲＦ２．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０５，１９６８４－１９６８９（２００８）．

２６Ｋｅｓｅｌｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔａｌ．ＴｈｅＥｃｏＣｙｃｄａｔａｂａｓｅ：ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｇｎｅｗｋｎｏｗｌｅｄｇｅａｂｏｕｔＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ－１２．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４５，Ｄ５４３－Ｄ５５０（２０１７）．

２７Ｓａｔｏ，Ｎ．Ｓ．，Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ａｇｍｏｎ，Ｉ．，Ｙｏｎａｔｈ，Ａ．＆Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎｒｅｖｅａｌｅｄｅｓｓｅｎｔｉａｌｂａｓｅｓｉｎｔｈｅｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｃｅｎｔｅｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０３，１５３８６－１５３９１（２００６）．

２８Ｇｏｎｇ，Ｆ．＆Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍｅｂｙｎａｓｃｅｎｔｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７，１８６４－１８６７（２００２）．

２９Ｃｒｕｚ－Ｖｅｒａ，Ｌ．Ｒ．，Ｒａｊａｇｏｐａｌ，Ｓ．，Ｓｑｕｉｒｅｓ，Ｃ．＆Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．Ｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｔＲＮＡｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｎａｏｐｅｒｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｏｌＣｅｌｌ１９，３３３－３４３（２００５）．

３０Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌａｓｌｏｐ，Ｎ．，Ｒａｍｕ，Ｈ．，Ｋｌｅｐａｃｋｉ，Ｄ．，Ｋａｎｎａｎ，Ｋ．，Ｍａｎｋｉｎ，Ａ．Ｓ．ＴｈｅｋｅｙｒｏｌｅｏｆａｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｍｏｄｉｆｉｅｄｒＲＮＡｒｅｓｉｄｕｅｉｎｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｔｈｅｎａｓｃｅｎｔｐｅｐｔｉｄｅ．ＥＭＢＯＪ．２９，３１０８－３１１７（２０１０）

３１Ｙａｎｉｓｃｈ－Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．＆Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ＩｍｐｒｏｖｅｄＭ１３ｐｈａｇｅｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｈｏｓｔｓｔｒａｉｎｓ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＭ１３ｍｐ１８ａｎｄｐＵＣ１９ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ３３，１０３－１１９（１９８５）．

３３Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔａｌ．ＥｎｚｙｍａｔｉｃａｓｓｅｍｂｌｙｏｆＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅｓｕｐｔｏｓｅｖｅｒａｌｈｕｎｄｒｅｄｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６，３４３－３４５（２００９）．

３４Ｋｕｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｊａｇｅｒ，Ｅ．Ｊ．＆ｖａｎｄｅｒＺｅｉｊｓｔ，Ｂ．Ａ．ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｌｉｎｋｅｒｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＸ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７，８００７（１９８９）．

３５Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．＆Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．Ｏｎｅ－ｓｔｅｐｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｇｅｎｅｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ－１２ｕｓｉｎｇＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，６６４０－６６４５（２０００）．

３６Ｚａｐｏｒｏｊｅｔｓ，Ｄ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｓ．＆Ｓｑｕｉｒｅｓ，Ｃ．Ｌ．ＰｒｏｄｕｃｔｓｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｆｒｏｍｒｅａｒｒａｎｇｅｄｒｒｎｇｅｎｅｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｃａｎａｓｓｅｍｂｌｅｔｏｆｏｒｍｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５，６９２１－６９２７（２００３）．

３７Ｃａｎｔｏｎ，Ｂ．，Ｌａｂｎｏ，Ａ．＆Ｅｎｄｙ，Ｄ．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔａｎｄｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒｔｓａｎｄｄｅｖｉｃｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，７８７－７９３（２００８）．

３８Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｍｏｄｕｌａｒａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｌａｒｇｅｒｉｂｏｓｏｍａｌｓｕｂｕｎｉｔ．Ｃｅｌｌ１６７，１６１０－１６２２（２０１６）

３９Ｍｏｎｋ，Ｊ．Ｗ．ｅｔａｌ．ＲａｐｉｄａｎｄｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｎｏｎｓｔａｎｄａｒｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．ＡＣＳＳｙｎｔｈ．Ｂｉｏ．ｌ６，４５－５４（２０１７）．

４０Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｌ．Ｃ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｎ．＆Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ．Ｅ．ｃｏｌｉｇｅｎｏｍｅｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｂｙＰ１ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．／ｅｄｉｔｅｄｂｙＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌ．．．［ｅｔａｌ．］Ｃｈａｐｔｅｒ１，Ｕｎｉｔ１１７（２００７）．

４１Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．＆Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｋ．Ｗ．ＮＩＨＩｍａｇｅｔｏＩｍａｇｅＪ：２５ｙｅａｒｓｏｆｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ９，６７１－６７５（２０１２）．

４２Ｂｕｎｄｙ，Ｂ．Ｃ．＆Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｐ－ｐｒｏｐａｒｇｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｉｎａｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒｄｉｒｅｃｔｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｃｌｉｃｋｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２１，２５５－２６３（２０１０）．

４３Ｇｏｎｇ，Ｆ．＆Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．ＲｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｔｎａｏｐｅｒｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏｉｎａｎＳ－３０ｓｙｓｔｅｍ．ＴｒｙｐｔｏｐｈａｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｓｃｌｅａｖａｇｅｏｆＴｎａＣｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｔＲＮＡ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１９７４－１９８３（２００１）．

４４ｄ’Ａｑｕｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ａｚｉｍ，Ｔ．，Ａｌｅｋｓａｓｈｉｎ，Ｎ．Ａ．，Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｒｙ，Ａ．Ｈ．，Ｊｅｗｅｔｔ，Ｍ．Ｃ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｍａｐｐｉｎｇｏｆｔｈｅ７０Ｓｒｉｂｏｓｏｍｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４８，２７７７－２７８９（２０２０）．

４５Ｏｈａｓｈｉ，Ｈ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．，Ｙｉｎｇ，Ｂ．Ｗ．＆Ｕｅｄａ，Ｔ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｒｉｂｏｓｏｍｅｄｉｓｐｌａｙｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｐｕｒｉｆｉｅｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５２，２７０－２７６（２００７）．

４６Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌａｓｌｏｐ，Ｎ．，Ｔｈｕｍ，Ｃ．＆Ｍａｎｋｉｎ，Ａ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｄｒｕｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｉｂｏｓｏｍｅｓｔａｌｌｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ３０，１９０－２０２（２００８）．

４７Ｈａｒｔｚ，Ｄ．，ＭｃＰｈｅｅｔｅｒｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｔｒａｕｔ，Ｒ．＆Ｇｏｌｄ，Ｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１６４，４１９－４２５（１９８８）．

４８Ｏｒｅｌｌｅ，Ｃ．ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｏｆａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｂｙｐｒｉｍｅｒｅｘｔｅｎｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４１，ｅ１４４（２０１３）．

４９Ｈｅａｃｏｃｋ，Ｄ．，Ｆｏｒｓｙｔｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｈｉｂａ，Ｋ．＆ＭｕｓｉｅｒＦｏｒｓｙｔｈ，Ｋ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｌｙｌａｄｅｎｙｌａｔｅａｎａｌｏｇｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２４，２７３－２８９（１９９６）．

５０Ｎｏｅｓｋｅ，Ｊ．ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２，３３６－３４１（２０１５）．

５１Ｋｏｒｏｓｔｅｌｅｖ，Ａ．ｅｔａｌ．ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｒｅｌｅａｓｅｆａｃｔｏｒＲＦ２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５，１９６８４－１９６８９（２００８）．

追加参考文献

Ｒａｃｋｈａｍ，Ｏ．；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｒｅｌａｔｉｎｇｔｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｍＲＮＡｐａｉｒｓ．ＵＳ１１／９８２，８７７：ＦｉｌｉｎｇｄａｔｅＮｏｖ６，２００７．

Ｃｈｉｎ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｋ．；Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｈ．，ＯｒｔｈｏｇｏｎａｌＱ－Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．ＵＳ１３／５１７，３７２：ＦｉｌｉｎｇｄａｔｅＤｅｃ２０，２０１０．

Ｃｈｉｎ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｋ．；Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｈ．，Ｅｖｏｌｖｅｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．ＵＳ１２／５１６，２３０：ＦｉｌｉｎｇｄａｔｅＮｏｖ２８，２００７．

Ｅ．実施例１の「反転（ｆｌｉｐｐｅｄ）」直交翻訳系の用途及び利点

１．用途

例として、限定するものではないが、ここで開示されている組成物又は方法の用途としては以下が挙げられるが、それらに限定されない。リボソームの進化／工学（例えば、より効率的な非カノニカルアミノ酸の取り込みに向けて）；非カノニカルアミノ酸の取り込みのための拡張された遺伝コード；抗生物質耐性機構の詳細なインビボ研究を可能にし、抗生物質の開発プロセスを可能にすること；バイオ医薬品の製造；細胞内の直交回路；合成生物学；ネイティブ（若しくは野生型）リボソームによって合成されるペプチド又はその翻訳後修飾された誘導体が得ることができない新しい機能性を組み込むことによって人工ペプチドを作製すること；医薬化学を変革しうる新規プロテアーゼ耐性ペプチドを作製すること；細胞内で改変リボソームの進化を可能にする。

２．利点

例として、限定するものではないが、本明細書に開示の組成物及び方法の利点としては以下が挙げられるが、それらに限定されない。

Ｒｉｂｏ－Ｔの通常とは異なる（ｕｎｕｓｕａｌ）デザインは、その直交翻訳系（ｏＲｉｂｏＴ）としての機能を制限する。具体的には、Ｒｉｂｏ－Ｔは解離可能なリボソームの半分の速度でしかタンパク質を翻訳しない。野生型リボソームと比較して、開始コドンからのから離れるのが遅い。さらに、「野生型」Ｒｉｂｏ－Ｔでさえもバイオジェネシスはかなり遅く、且つ非効率的であり、且つもしリボソームの機能中心がさらなる改変に供されると、アセンブリに関する問題がさらに悪化する可能性がある。

２つの機能的に独立した翻訳装置を用いて細胞を改変するオリジナルのｏＲｉｂｏ－Ｔに基づいた方法の欠点を克服するために、今般、本発明者らは、解離可能であり、さらには完全に分離した、特殊なｍＲＮＡのみの翻訳に特化したリボソームを利用するインビボの系の概念的に新しいデザインを作り出した。Ｒｉｂｏ‐Ｔ及び離可能なリボソームの役割を「反転」させることによって、プロテオームの翻訳がＲｉｂｏ‐Ｔによって行われ、解離可能な直交性３０Ｓ（ｏ‐３０Ｓ）サブユニット及び野生型５０Ｓサブユニットから構成されるリボソームが完全直交翻訳機械装置として機能する細菌細胞を作製した。ＯＳＹＲＩＳ(サブユニットが分離したリボソームをベースとする直交翻訳系（ＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎＳＹｓｔｅｍｂａｓｅｄｏｎＲｉｂｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈＩｓｏｌａｔｅｄＳｕｂｕｎｉｔｓ））と命名した、結果として得られたこのセットアップでは、Ｒｉｂｏ－Ｔが繋ぎ止められているという特性が、解離可能なリボソームのｏ－３０Ｓ又は５０Ｓとの結合を不可能にするので完全な直交性が達成される。したがって、ＯＳＹＲＩＳ細胞において、物理的に連結していないｏ‐３０Ｓ及び５０Ｓリボソームサブユニットは、それにもかかわらず互いに相互作用し、且つ完全直交性リボソーム（ｏ‐リボソーム）として機能することを強いられる。結果として、ｏ‐３０Ｓだけでなく遊離５０Ｓサブユニットも、細胞プロテオームの発現を妨害することなく新しい機能性を達成するように改変することができる。

ＯＳＹＲＩＳ細胞を並べて比較したとき、２つの直交性レポーター（ｏ－ｇｆｐ及び新らたに改変されたｏ－ｌｕｃ）の発現は、同じ宿主（大腸菌ＢＬ２１）において、解離可能な直交性リボソーム（ｏＲｂｓ）又は直交性テザーリボソーム（ｏＲｉｂｏ－Ｔ）のいずれかによって進められる。注目すべきは、ｏＲｉｂｏ－Ｔが高コピー数ベクターから発現され、一方でｏＲｂｓが低コピー数プラスミドから転写されたにもかかわらず、ｏＲｂｓはｏＲｉｂｏ－Ｔより優れたことである。この結果から、直交性ｍＲＮＡの翻訳においてｏＲｉｂｏ－Ｔを上回るｏＲｂｓによって提供される利点が明らかに示され、且つＯＳＹＲＩＳ設計がｏＲｉｂｏ－Ｔに基づく設計よりも優れているという概念が強化される。

リボソーム工学はバイオテクノロジー、化学、及び材料科学の分野に大変興味深いが、これまでの方法では、触媒活性部位及びタンパク質排出トンネルを含むリボソームの大サブユニットを進化させることはできなかった。テザーリボソームの開発はこれらの制限を取り除き、リボソーム工学の可能性を広げる。リボソームは、タンパク質の機能を拡張するために非天然アミノ酸を組み込むように、又は非タンパク質ポリマーの生産のために新しい化学を成し遂げるように改変することができる。

本発明は、ｍＲＮＡの解読、ポリペプチド合成の触媒作用、及びタンパク質排泄がすべて、新しい基質及び機能に対して最適化できる史上初の直交リボソーム－ｍＲＮＡ系を詳述する。先行技術との重要な違いは、小（解読）リボソームサブユニットだけでなく、大（触媒）リボソームサブユニットも、単一の、組み合わされ、且つ分割不可能な直交遺伝子合成機械装置として機能することである。

さらに、テザーリボソームは細胞を生存させ、自由に解離可能なリボソームが設計に用いられるという点でユニークである。

この発明は、この種では初めてのものであることを本発明者らは強調する。本発明者らは、ここで報告されたイノベーションが、より大規模なリボソームの構築及び工学的な取り組みに刺激を与えて、改変生物系の限界を押し広げるのに役だち、現在隣接可能性を超えている研究分野において新しい商業的な機会をもたらすと予想する。

前述の記載において、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示の発明に対して様々な置換及び変更を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書に例示的に記載された発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又は複数の要素、制限又は複数の制限の存在下で、好適に実行することができる。採用されている用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定の用語として使用されず、且つそのような用語及び表現の使用において、提示及び説明された特徴のいずれの均等物又はその一部も排除する意図はないが、発明の範囲内で様々な変更が可能であると認識される。したがって、本発明は、特定の実施形態及び任意選択の特徴によって例示されているが、本明細書に開示さの概念の変更及び／又は変形は、当業者に頼ることができ、且つそのような変更及び変形は、本発明の範囲内にあると考えられることを理解すべきである。

本明細書において、多数の特許及び非特許参考文献の引用がなされている。引用参考文献はその全体が参照により本明細書に援用される。本明細書における用語の定義と引用参考文献における用語の定義との間に矛盾がある場合、その用語は本明細書における定義に基づいて解釈されるべきである。

Claims

第１のタンパク質翻訳機構及び第２のタンパク質翻訳機構を含む改変細胞であって、
ａ）前記第１のタンパク質翻訳機構が、第１の改変リボソームを含み、第１の改変リボソームが、
ｉ）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びタンパク質を含む小サブユニット、
ｉｉ）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びタンパク質を大サブユニット、並びに
ｉｉｉ）連結部分
を含み、
そこにおいて、前記連結部分がポリヌクレオチド配列を含み、且つ前記小サブユニット前記ｒＲＮＡを前記大サブユニットの前記ｒＲＮＡと繋ぎ止め、
ｂ）前記第２のタンパク質翻訳機構が、第２の改変リボソームを含み、第２の改変リボソームが、
ｉ）ｒＲＮＡ及びタンパク質を含む小サブユニット、並びに
ｉｉ）ｒＲＮＡ及びタンパク質を含む大サブユニット
を含み、
そこにおいて、前記第２の改変リボソームが、前記大サブユニット及び前記小サブユニットの間の連結部分を欠き、且つ
そこにおいて、前記第２の改変リボソームの前記小サブユニットが、改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含んで、前記細胞の内在性細胞ｍＲＮＡと異なる相補的で且つ／又は同族のシャイン・ダルガノ配列を有するテンプレートの翻訳を可能にし、且つ／又は
改変細胞。
前記第１及び前記第２のタンパク質翻訳機構が、配列規定ポリマーの翻訳を補助することができる、請求項１に記載の改変細胞。
前記第１のタンパク質翻訳機構が、ネイティブ内在性ＲＮＡの翻訳を補助することができる、請求項１に記載の改変細胞。
前記第２のタンパク質翻訳機構が、非ネイティブ外因性ＲＮＡの翻訳を補助することができる、請求項１に記載の改変細胞。
前記第２の改変リボソームが１つ又は複数の機能変換型変異を含み、そこにおいて、前記機能変換型変異が前記アンチシャイン・ダルガノ配列でない、請求項１に記載の改変細胞。
前記第２の改変リボソームの前記小サブユニットが、３’－ＧＧＵＧＵＵ－５’、３’－ＵＧＧＵＧＵ－５’、３’－ＧＧＵＧＵＣ－５’、３’－ＧＵＵＵＡＧ－５’、３’－ＵＧＧＡＡＵ－５’、３’－ＧＧＡＵＣＵ－５’、３’－ＵＧＧＡＵＣ－５’、３’－ＵＧＧＵＡＡ－５’、及び３’－ＵＧＧＡＵＣ－５’からなる群より選択される改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記第２の改変リボソームが、
ａ）ペプチジルトランスフェラーゼ中心（ＰＴＣ）、
ｂ）新生ペプチド出口トンネル（ＮＰＥＴ）、
ｃ）伸長因子との相互作用部位、
ｄ）ｔＲＮＡ結合部位、
ｅ）シャペロン結合部位、
ｆ）新生鎖修飾酵素結合部位、
ｇ）ＧＴＰアーゼ中心
のうちの１つ又は複数に機能変換型変異を含む
請求項１に記載の改変細胞。
前記第２の改変リボソームの前記大サブユニットが、２３ＳｒＲＮＡの次の残基：Ｇ２０６１、Ｃ２４５２、Ｕ２５８５、Ｇ２２５１、Ｇ２２５２、Ａ２０５７、Ａ２０５８、Ｃ２６１１、Ａ２０６２、Ａ２５０３、Ｕ２６０９、Ｇ２４５４、及びＧ２４５５のうちの１つ又は複数に機能変換型変異を含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記第１、前記第２、又は前記第１と前記第２の両方の改変リボソームが、抗生物質耐性変異を含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記第１の改変リボソームの前記大サブユニットが、２３ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント若しくは変異体を含む、且つ／又は前記小サブユニットが、１６ＳｒＲＮＡの順列置換バリアント若しくは変異体を含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記連結部分が、ヘリックス１０、ヘリックス３８、ヘリックス４２、ヘリックス５４、ヘリックス５８、ヘリックス６３、ヘリックス７８、ヘリックス１０１からなる群より選択される前記大サブユニットのヘリックスを、ヘリックス１１、ヘリックス２６、ヘリックス３３、及びヘリックス４４からなる群より選択される前記小サブユニットのヘリックスに共有結合させる、請求項１に記載の改変細胞。
配列規定ポリマーを調製する方法であって、
（ａ）１つ又は複数の
（ｉ）請求項１に記載の前記細胞、
（ｉｉ）請求項１のいずれか１つに記載の前記細胞に由来する無細胞抽出物、
（ｉｉｉ）請求項１に記載の前記細胞に由来する精製された翻訳系
を用意すること、
ｂ）前記配列規定ポリマーをコードするｍＲＮＡを、前記細胞又は前記無細胞抽出物に提供すること、及び
ｃ）前記ｍＲＮＡを前記細胞又は無細胞抽出物中で翻訳させて、前記配列規定ポリマーを得ること
を含む、方法。
前記配列規定ポリマーがインビボで調製される、請求項１２に記載の方法。
前記配列規定ポリマーがインビトロで調製される、請求項１２に記載の方法。
前記無細胞抽出物が、指数増殖期の中～後期の細胞培養物又は採取時に少なくとも約２．０、２．５、若しくは３．０のＯＤ₆₀₀を有する培養物から調製されたＳ１５０抽出物を含む、請求項１２に記載の方法。
前記配列規定ポリマーをコードする前記ｍＲＮＡが、改変シャイン・ダルガノ配列を含み、且つ前記第２の翻訳系の前記改変リボソームが、前記ｍＲＮＡの前記改変シャイン・ダルガノ配列に相補的なアンチシャイン・ダルガノ配列を含む、請求項１２に記載の方法。
前記配列規定ポリマーがアミノ酸ポリマーを含む、請求項１２に記載の方法。
前記アミノ酸ポリマーがカノニカルアミノ酸を含む、請求項１７に記載の方法。
アミノ酸ポリマーが１つ又は複数の非カノニカルアミノ酸を含む、請求項１７に記載の方法。
前記配列規定ポリマーが非アミノ酸をベースとするポリマーを含む、請求項１２に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、前記ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを用意し、且つ前記ＤＮＡを前記細胞又は前記無細胞抽出物中で転写させ前記ｍＲＮＡを得ることによって用意される、請求項１２に記載の方法。
前記改変細胞が改変されて、前記ＤＮＡを転写するＴ７ＲＮＡ転写酵素などの外因性ＲＮＡ転写酵素を発現して前記ｍＲＮＡをもたらす、請求項２１に記載の方法。
請求項１に記載の前記改変細胞のａ）前記第１のタンパク質翻訳機構の前記改変リボソームの前記ｒＲＮＡをコードする、且つ／又はｂ）前記第２のタンパク質翻訳機構の前記改変リボソームの前記ｒＲＮＡをコードする、１つ又は複数のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドがベクターである、請求項２３に記載にポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記改変リボソームによって発現する遺伝子をさらに含む、請求項２３に記載にポリヌクレオチド。
前記遺伝子がレポーター遺伝子又は選択マーカーである、請求項２５に記載にポリヌクレオチド。
前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質遺伝子である、請求項２６に記載にポリヌクレオチド。
前記選択マーカーが抗生物質に対して耐性である、請求項２６に記載にポリヌクレオチド。
前記第２の翻訳系の前記改変リボソームの前記ｒＲＮＡが改変アンチシャイン・ダルガノ配列を含み、且つ前記ｍＲＮＡが、前記第２の翻訳系の前記改変リボソームに相補的なシャイン・ダルガノ配列を含む、請求項２３に記載にポリヌクレオチド。
前記ｍＲＮＡがコドンを含み、前記コドンが非天然アミノ酸をコードする、請求項２３に記載にポリヌクレオチド。
ａ）前記第１の翻訳系の前記改変リボソームの前記ｒＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドを含む、且つａ）前記第２の翻訳系の前記改変リボソームの前記ｒＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のポリヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
前記第１のポリヌクレオチド及び／又は第２のヌクレオチドが１つ又は複数のベクター上に存在する、請求項３１に記載にポリヌクレオチド。
請求項２３に記載の前記ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させることを含み、任意選択で、前記宿主細胞が請求項１に記載の改変細胞を含む、改変リボソームを調製する方法。
前記宿主細胞を選択に供すること及び変異体リボソームを含む宿主細胞を選択することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
前記変異体が、
ａ）ペプチジルトランスフェラーゼ中心（ＰＴＣ）、
ｂ）新生ペプチド出口トンネル（ＮＰＥＴ）、
ｃ）伸長因子との相互作用部位、
ｄ）ｔＲＮＡ結合部位、
ｅ）シャペロン結合部位、
ｆ）新生鎖修飾酵素結合部位、
ｇ）ＧＴＰアーゼ中心、
ｈ）トランスロコンとの相互作用部位、及び
ｉ）翻訳を促進する補助タンパク質との相互作用部位
のうちの１つ又は複数に変異を含む、請求項３４に記載の方法。
前記選択ステップが、ネガティブ選択ステップ、ポジティブ選択ステップ、又はネガティブとポジティブの両方の選択ステップを含む、請求項３５に記載の方法。