JP2023519744A - ミトコンドリア増強療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、骨髄での白血球細胞の産生を増加させる方法および組成物を提供する。具体的には、本発明は、ミトコンドリア富化細胞を提供することによって、対象におけるＣＤ４５＋細胞のレベルを増加させるための方法および組成物を提供する。さらに、本出願は、骨髄細胞型、ＣＤ３４＋細胞の生着、および分化を増加させるための方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２５日に出願された米国特許出願第６３／１１８，５６９号、および２０２０年３月３１日に出願された米国特許出願第６３／００３，１７４号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、両方の全容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、概して、ミトコンドリアについて富化された細胞に関し、より具体的には、幹細胞の生着、増殖、ホーミングまたは生存を増加させ、ならびに幹細胞分化パターンを改変するための方法および組成物に関する。

背景情報
ミトコンドリアは、ほとんどの真核細胞に見られる、直径０．５～１．０ｐｍの範囲の膜結合細胞小器官である。ミトコンドリアは、ほぼすべての真核生物に見出され、細胞型に応じて数および位置が異なる。ミトコンドリアは、独自のＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）と、ＲＮＡおよびタンパク質を合成するための独自の機構とを含有する。ｍｔＤＮＡは３７個の遺伝子しか含有せず、哺乳類の体内の遺伝子産物のほとんどは核ＤＮＡによってコードされている。

ミトコンドリアは、ピルビン酸酸化、クレブス回路、ならびにアミノ酸、脂肪酸、およびステロイドの代謝などの、真核細胞内の多数の重要な課題を実行する。しかしながら、ミトコンドリアの主な機能は、電子伝達鎖および酸化的リン酸化系（「呼吸鎖」）によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）としてのエネルギーの生成である。ミトコンドリアが関与する追加のプロセスには、熱産生、カルシウムイオンの貯蔵、カルシウムシグナリング、プログラム細胞死（アポトーシス）、および細胞増殖が含まれる。

細胞内のＡＴＰ濃度は、典型的には１～１０ｍＭであり、ＡＴＰは、エネルギー源として単糖および複合糖（炭水化物）または脂質を使用した酸化還元反応によって産生され得る。ＡＴＰへと合成される複雑な燃料は、まず、より小さく、より単純な分子に分解する必要がある。複雑な炭水化物は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖に加水分解される。脂肪（トリグリセリド）は代謝されて脂肪酸およびグリセロールをもたらす。

グルコースを二酸化炭素に酸化する全体的なプロセスは細胞呼吸として知られており、グルコースの単一分子から約３０個のＡＴＰの分子を産生することができる。ＡＴＰは、いくつかの異なる細胞プロセスによって産生される。真核生物においてエネルギーを生成するために使用される３つの主要な経路は、解糖およびクエン酸回路／酸化的リン酸化（両方とも細胞呼吸の構成要素）およびベータ酸化である。

非光合成の真核生物によるこのＡＴＰ産生の大部分はミトコンドリアで起こり、典型的な細胞の総体積のほぼ２５％を占める場合がある。様々なミトコンドリア障害は、ミトコンドリアＤＮＡの欠損遺伝子に起因することが既知である。

白血球は、感染症および外来侵入物の両方から身体を保護することに関与する免疫系の細胞である。白血球は、その物理的および機能的特徴によって区別することができる異なるタイプの細胞を含む。

骨髄は、新たな血液細胞産生または造血の主要な部位である。白血球を含むあらゆるタイプの造血細胞が骨髄で作られる。骨髄不全は、様々な疾患（例えば、ファンコニ貧血）における主要な病理学的特徴である。造血幹細胞（ＨＳＣ）移植療法は、幹細胞障害（例えば、ムコ多糖貯蔵ハーラー病）に罹患している患者の不全のまたは欠損している血液細胞系統などの１つ以上の血液細胞型を、集合または再集合させるように、治療を必要とする対象に投与することができる。しかしながら、ＨＳＣは顕著な治療的可能性を有するが、臨床におけるそれらの使用を妨げている制限は、宿主における造血幹細胞移植の生着を確保することと関連する困難性であった。

患者自身の免疫系は、多くの場合、外因性（自家、同種異系、または同系）移植細胞を攻撃し、移植された造血幹細胞の拒絶反応を媒介する。拒絶反応を回避するために、患者は、造血幹細胞移植の前に免疫系破壊剤、例えば、化学療法剤または放射線で治療される。残念ながら、患者における造血幹細胞移植のトレランスを誘導する努力は、しばしば重篤な合併症をもたらす。したがって、造血幹細胞移植を改善するための新しい組成物および方法の必要性が存在する。

白血球は、骨髄芽球およびリンパ芽球の２つの主要なカテゴリーに分類することができる。リンパ球は、白血球のサブタイプであり、ナチュラルキラー細胞（細胞媒介性細胞傷害性先天性免疫で機能する）、Ｔ細胞（細胞媒介性細胞傷害性適応免疫の場合）、およびＢ細胞（体液性抗体駆動性適応免疫の場合）を含む。骨髄球は、顆粒球系の若い細胞であり、骨髄で正常に発生する。骨髄球は、好中球、好酸球、および好塩基球に成熟し、これらのすべてが免疫系において重要な役割を果たす。骨髄におけるリンパ球および骨髄細胞の産生を変化させることで、特定の免疫系応答を誘導する能力をもたらすことができる。低リンパ球数に関連することが知られている多数の疾患および障害がある。加えて、加齢に伴う免疫機能の低下と循環リンパ球の頻度の変化が報告された。

これまで、白血球含有量を増加させ、不全免疫系の機能を改善し、様々な疾患および障害を治療するための、新規で安全な方法の必要性が依然として存在する。

本発明は、ミトコンドリアについて富化された細胞が疾患および障害の治療に有用であるという重大な発見に基づいている。本発明は、骨髄での白血球細胞の産生を増加させる方法および組成物を提供する。具体的には、本発明は、ミトコンドリア富化細胞を提供することによって、対象におけるＣＤ４５＋細胞のレベルを増加させるための方法および組成物を提供する。さらに、本出願は、骨髄細胞型、ＣＤ３４＋細胞の生着、および造血幹細胞の分化を増加させるための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、対象における白血球細胞のレベルを増加させる方法であって、疾患もしくは障害を有する対象からまたはドナーから標的細胞を得ることと、外因性ミトコンドリアを得ることと、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件下で標的細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化標的細胞を産生することと、ミトコンドリア富化標的細胞を対象に投与することとを含み、ここで、ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量が、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高く、それによって対象における白血球細胞のレベルを増加させる、方法を提供する。

本発明はまた、骨髄での骨髄細胞に対するリンパ系細胞の割合を増加させる方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ３３＋細胞のレベルを改変するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、ＣＤ３３＋細胞のレベルに対するＣＤ３＋細胞のレベルを増加させることも提供する。いくつかの実施形態では、本発明はまた、ＣＤ１９＋のレベルを増加させることも提供する。

一実施形態では、本発明は、対象における白血球細胞のレベルを増加させる方法であって、疾患もしくは障害を有する対象または健康なドナーから標的細胞を得ることと、外因性ミトコンドリアを得ることと、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件下で標的細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化標的細胞を産生することと、ミトコンドリア富化標的細胞を対象に投与することとを含み、ここで、ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量が、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高く、それによって対象において骨髄細胞からリンパ球細胞へのシフトを引き起こす、方法を提供する。

一態様では、標的細胞は、多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。ある特定の態様では、標的細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。追加の態様では、標的細胞は、全血、血液画分、末梢血、ＰＢＭＣ、血清、血漿、脂肪組織、胎盤、口腔粘膜、血液、臍帯血、または骨髄から得られる。追加の態様では、標的細胞は、ドナーからのものである。さらなる態様では、標的細胞および／または外因性ミトコンドリアは、自家である。

ある特定の態様では、対象は、疾患または障害を有する。いくつかの態様では、疾患または障害は、加齢関連障害、がん、筋肉疾患および障害、糖原病および糖原貯蔵障害、血管内皮障害もしくは疾患、脳障害もしくは脳疾患、胎盤障害もしくは胎盤疾患、胸腺障害もしくは胸腺疾患、自己免疫疾患、腎疾患もしくは腎障害、原発性ミトコンドリア病、膵臓障害もしくは膵臓疾患、前立腺障害もしくは前立腺疾患、腎臓障害もしくは腎臓疾患、血液障害もしくは血液疾患、心臓疾患もしくは心臓障害、皮膚障害もしくは皮膚疾患、免疫および炎症性疾患および障害、骨疾患もしくは骨障害、胃腸疾患もしくは胃腸障害、眼疾患もしくは眼障害、または感染症である。

さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、単離された凍結－解凍ヒトミトコンドリアである。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、ヒト細胞またはヒト組織に由来する。いくつかの実施形態では、ヒト細胞またはヒト組織は、胎盤、培養で増殖された胎盤細胞、および血液細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ヒト体細胞である。ある特定の態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件は、標的細胞を、外因性ミトコンドリアとともに、１６～３７℃の範囲の温度で０．５～３０時間の範囲の時間、インキュベートすることを含む。追加の態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件は、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む。一態様では、外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも１％を構成する。

一態様では、ミトコンドリア富化標的細胞の外因性ミトコンドリア含有量は、ＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択される少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、クエン酸シンターゼの活性レベル、酸素（Ｏ_２）消費率、アデノシン三リン酸産生率、ミトコンドリアＤＮＡ含有量、ヘテロプラスミーのレベル、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアッセイによって決定される。

追加の態様では、ミトコンドリア富化標的細胞の投与は、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、および筋肉内投与によるものである。さらなる態様では、少なくとも５×１０^５～５×１０^９個のミトコンドリア富化標的細胞が対象に投与される。ある特定の態様では、薬学的に許容される担体は、対象に投与する前に、ミトコンドリア富化標的細胞に添加される。別の態様では、ミトコンドリア富化標的細胞はＣＤ４５を発現する。

ある特定の態様では、ミトコンドリア富化標的細胞は、ミトコンドリア富化前の標的細胞と比較して、ＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択される少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の増加した含有量、増加した酸素（Ｏ_２）消費率、増加したクエン酸シンターゼ活性レベル、増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、より低いヘテロプラスミーレベル、またはそれらの任意の組み合わせを有する。

別の実施形態では、本発明は、ミトコンドリア富化標的細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、対象におけるリンパ系細胞のレベルを増加させるための医薬組成物であって、ミトコンドリア富化標的細胞が、外因性ミトコンドリアについて富化されている、医薬組成物を提供する。

一態様では、ミトコンドリア富化標的細胞は、疾患もしくは衰弱性障害に罹患している対象または健康なドナーから標的細胞を得ることと、ドナーから外因性ミトコンドリアを得ることと、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件下で標的細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化標的細胞を産生することとを含む方法によって産生され、ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い。

ある特定の態様では、標的細胞は、多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。具体的な態様では、標的細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。追加の態様では、標的細胞は、全血、血液画分、末梢血、ＰＢＭＣ、血清、血漿、脂肪組織、口腔粘膜、血液、臍帯血、または骨髄から得られる。ある特定の態様では、標的細胞は、対象に対して同種異系、自家、または同系である。いくつかの態様では、単離されたミトコンドリアは、自家である。

一態様では、外因性ミトコンドリアは、単離されたまたは部分的に精製された凍結－解凍ヒト機能的ミトコンドリアである。

追加の態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件は、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む。別の態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件は、標的細胞を、外因性ミトコンドリアとともに、１６～３７℃の範囲の温度で０．５～３０時間の範囲の時間、インキュベートすることを含む。追加の態様では、ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、ＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択される少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、クエン酸シンターゼの活性レベル、酸素（Ｏ_２）消費率、アデノシン三リン酸産生率、ミトコンドリアＤＮＡ含有量、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアッセイによって決定される。

さらなる態様では、ミトコンドリア富化標的細胞は、ミトコンドリア富化前の標的細胞と比較して、ＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択される少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の増加した含有量、増加した酸素（Ｏ_２）消費率、増加したクエン酸シンターゼ活性レベル、増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、より低いヘテロプラスミーレベル、またはそれらの任意の組み合わせを有する。

一態様では、対象は、疾患または障害を有する。追加の態様では、疾患または障害は、加齢関連障害、がん、筋肉疾患および障害、糖原病および糖原貯蔵障害、血管内皮障害もしくは疾患、脳障害もしくは脳疾患、胎盤障害もしくは胎盤疾患、胸腺障害もしくは胸腺疾患、自己免疫疾患、腎疾患もしくは腎障害、原発性ミトコンドリア病、膵臓障害もしくは膵臓疾患、前立腺障害もしくは前立腺疾患、腎臓障害もしくは腎臓疾患、血液障害もしくは血液疾患、心臓疾患もしくは心臓障害、皮膚障害もしくは皮膚疾患、免疫および炎症性疾患および障害、骨疾患もしくは骨障害、胃腸疾患もしくは胃腸障害、眼疾患もしくは眼障害、または感染症である。

一態様では、医薬組成物は、患者に投与される。ある特定の態様では、医薬組成物は、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、および筋肉内により対象に投与される。追加の態様では、少なくとも５×１０^５～５×１０^９個のミトコンドリア富化標的細胞が投与される。

一実施形態では、本発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、対象にＨＳＣを投与することとを含む、対象における１つのリンパ球欠乏症関連疾患または複数のリンパ球欠乏関連疾患の衰弱作用を軽減するための方法を提供する。ある特定の態様では、ＨＳＣは、自家または同種異系幹細胞である。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。様々な態様では、ＨＳＣは、対象に投与する前に洗浄される。

骨髄または造血幹細胞移植の前に、対象は、基礎疾患を排除するおよび／または新規細胞の拒絶を防止するためのコンディショニングプロセスを経てもよい。

追加の実施形態では、本発明は、対象における造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を改善するための方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、対象にＨＳＣを投与することとを含む、方法を提供する。ある特定の態様では、ＨＳＣは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。一態様では、ＨＳＣは、インビトロで拡大増殖される。追加の態様では、ＨＳＣは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。さらなる態様では、ＨＳＣは、インビトロでの拡大増殖の前または後に、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。ある特定の態様では、ＨＳＣは、外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前または後に、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。追加の態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件は、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含み得る。

様々な態様では、ＨＳＣは、対象に投与する前に洗浄される。

さらなる実施形態では、本発明は、ミトコンドリア富化標的細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、対象における遺伝子療法のための細胞の生着を高めるための医薬組成物であって、ミトコンドリア富化標的細胞が、外因性ミトコンドリアについて富化されている、医薬組成物を提供する。一態様では、標的細胞は、外因性ミトコンドリアについての富化前、富化中、または富化後に遺伝子改変されている。

一実施形態では、本発明は、対象における免疫不全または免疫関連疾患を治療するための方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、ＨＳＣを対象に投与することとによる、方法を提供する。ある特定の態様では、ＨＳＣは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。一態様では、ＨＳＣは、インビトロで拡大増殖される。追加の態様では、ＨＳＣは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。さらなる態様では、ＨＳＣは、インビトロでの拡大増殖の前または後に、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。ある特定の態様では、ＨＳＣは、外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前または後に、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。追加の態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件は、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含み得る。

一実施形態では、本発明は、疾患または障害を治療する方法であって、外因性ミトコンドリアが細胞に入るのを可能にする条件下で細胞を外因性ミトコンドリアと接触させることによってミトコンドリア富化細胞を産生することと、目的の遺伝子を有するウイルスベクターをミトコンドリア富化細胞に形質導入することと、ミトコンドリア富化形質導入細胞を対象に投与することとによる、方法を提供する。一実施形態では、本発明は、疾患または障害を治療する方法であって、目的の遺伝子を含むウイルスベクターを細胞に形質導入することと、形質導入細胞を、外因性ミトコンドリアに、外因性ミトコンドリアが細胞に入るのを可能にする条件下で接触させることによって、ミトコンドリア富化細胞を産生することと、ミトコンドリア富化形質導入細胞を対象に投与することとによる、方法を提供する。一態様では、細胞は、幹細胞である。ある特定の態様では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または免疫不全細胞である。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。追加の態様では、ミトコンドリア富化形質導入細胞の投与は、非増強細胞と比較して、Ｂ細胞の数を増加させる。ある特定の態様では、Ｂ細胞は、プレＢ細胞またはプロＢ細胞である。さらなる態様では、ミトコンドリア富化形質導入細胞の投与は、非増強細胞と比較して、ＩｇＭ陽性細胞の数を増加させる。一実施形態では、ミトコンドリア富化は、形質導入細胞の数を増加させる。

図１Ａ～Ｃは、ＮＳＧＳマウスへのミトコンドリア富化ＣＤ３４＋細胞および非富化ＣＤ３４＋細胞の移植から２か月後の骨髄の生着に対するミトコンドリア富化の効果の解析を示す。図１Ａ．骨髄におけるヒトミトコンドリアコピー数。図１Ｂ．骨髄におけるヒト細胞の相対数。図１Ｃ．骨髄における細胞当たりの相対的なヒトミトコンドリアコピー。 図２Ａ～Ｃは、ＮＳＧＳマウスへのミトコンドリア富化ＣＤ３４＋細胞および非富化ＣＤ３４＋細胞の移植から２か月後の末梢血中のミトコンドリアおよび細胞含有量に対するミトコンドリア富化の効果の解析を示す。図２Ａ．末梢血におけるヒトミトコンドリアコピー数。図２Ｂ．末梢血におけるヒト細胞の相対数。図２Ｃ．末梢血における細胞当たりの相対的なヒトミトコンドリアコピー。 図３Ａ～Ｂは、ＮＳＧＳマウスへのミトコンドリア富化ＣＤ３４＋細胞の移植から６か月後の骨髄の分析を示す。図３Ａ：ヒトＣＤ４５＋細胞およびマウスＣＤ４５＋細胞の合計からのヒトＣＤ４５＋細胞のパーセント、ならびにヒトＣＤ４５＋細胞からのＣＤ３＋細胞およびＣＤ３３＋細胞の相対パーセントのフローサイトメトリー分析。図３Ｂ：外因性ヒトミトコンドリアコピー数を示す棒グラフ。 ミトコンドリア富化ＣＤ３４＋細胞および非富化ＣＤ３４＋細胞をＮＳＧＳマウスに移植してから６か月後の骨髄のフローサイトメトリー解析を示す。 図５Ａ～Ｂは、末梢血を用いたＣＤ４５＋細胞サブセットの頻度を示す。図５Ａ：ミトコンドリア増強療法（ＭＡＴ）後の特定の時点における骨髄および末梢血細胞のフローサイトメトリー分析。 図５Ａ～Ｂは、末梢血を用いたＣＤ４５＋細胞サブセットの頻度を示す。図５Ｂ：ＭＡＴ後の特定の時点での末梢血を用いたＣＤ４５＋細胞サブセットの頻度。 レシピエント細胞に移された外因性ミトコンドリアの相対レベルを示す。 ＣＤ３^＋（Ｔ細胞）、ＣＤ１９^＋（Ｂ細胞）、ＣＤ１１ｂ^＋（骨髄細胞）発現を示す。４．５か月の時点で、骨髄系集団を、単球（Ｌｙ６Ｃ^高Ｌｙ６Ｇ^－）および好中球（Ｌｙ６Ｃ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋）サブセットにさらに特徴付けた。 単球および好中球が外因性ミトコンドリアを取り込むことを示す。 増強されかつＢＴＫ遺伝子を形質導入した免疫不全細胞のＢ細胞発達を試験するための実験的スキームを示す。 ＮＴＸ１０１またはＮＴＸ１０９を形質導入した増強細胞および非増強細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞、および野生型（ＷＴ）細胞についての１３日目の細胞の絶対数を示す。 図１１Ａ～Ｂは、ＨＳＰＣ集団のパーセンテージおよび絶対数を示す。図１１Ａ．ＮＴＸ１０１またはＮＴＸ１０９を形質導入した増強細胞および非増強形質導入細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞、ならびに野生型細胞のうちの、ＨＳＰＣ集団のパーセントのフローサイトメトリー分析。 図１１Ａ～Ｂは、ＨＳＰＣ集団のパーセンテージおよび絶対数を示す。図１１Ｂ．ＮＴＸ１０１およびＮＴＸ１０９増強および非増強細胞、非形質導入増強および非増強細胞、ならびに野生型細胞のうちの、ＨＳＰＣ集団の絶対数。 増強後１３日目の、ＮＴＸ１０１またはＮＴＸ１０９を形質導入した増強および非増強細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞、および野生型細胞のうちの、プロＢおよびプレＢ細胞集団のパーセントのフローサイトメトリー分析を示す。 図１３Ａ～Ｂは、増強１３日後の、プロＢ／プレＢ細胞集団比およびプロＢおよびプレＢ集団絶対細胞数を示す。図１３Ａ．増強１３日後の、ＮＴＸ１０１またはＮＴＸ１０９を形質導入した増強および非増強細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞、および野生型細胞におけるプロＢ／プレＢ細胞集団比である。図１３Ｂ．増強１３日後の、ＮＴＸ１０１およびＮＴＸ１０９を形質導入した増強および非増強細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞、および野生型細胞におけるプロＢおよび前Ｂ細胞集団の絶対細胞数である。 増強１７日後の、ＮＴＸ１０１またはＮＴＸ１０９を形質導入した増強および非増強細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞、および野生型細胞のうちの、Ｂ細胞のパーセンテージおよび絶対数のフローサイトメトリー解析を示す。 増強１７日後の、ＮＴＸ１０１またはＮＴＸ１０９を形質導入した増強および非増強細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞、および野生型細胞のうちの、ＩｇＭ陽性Ｂ細胞集団のフローサイトメトリー解析を示す。 増強１３日後の、ＮＴＸ１０１またはＮＴＸ１０９を形質導入した増強および非増強細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞、および野生型細胞のうちの、ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー解析を示す。 増強１７日後の、ＮＴＸ１０１またはＮＴＸ１０９を形質導入した増強および非増強細胞、増強非形質導入細胞、非増強非形質導入細胞のうちの、ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー解析を示す。 レンチベクター（Ｘｉｄ^ｐＴＣ９）を形質導入した増強細胞および非増強細胞の導入遺伝子発現を示す。 対照細胞、非増強形質導入細胞、および増強形質導入細胞における遺伝子発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。

発明の詳細な説明
本発明は、外因性ミトコンドリアについて富化された細胞が疾患および障害を治療するために有用であるという重大な発見に基づいている。本発明は、ミトコンドリア富化細胞を提供することによって、対象において骨髄での白血球細胞の産生を増加させる方法および組成物を提供する。さらに、本出願は、骨髄細胞型、ＣＤ３４＋細胞の生着、および分化を増加させるための方法を提供する。

本発明の組成物および方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されず、かかる組成物、方法、および条件は変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみに限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明らかにそうではない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「その方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書に記載されるタイプの１つ以上の方法および／またはステップを含み、本開示などを読めば当業者には明白になるであろう。

本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたときと同程度に、本明細書において参照により組み込まれる。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、修正および変形が本開示の趣旨および範囲内に包含されることを理解されたい。好ましい方法および材料を、これから説明する。

本発明は、治療的に有意な量の完全に単離されたミトコンドリアの標的指向送達および全身送達のための細胞プラットフォーム、より具体的には幹細胞由来の細胞プラットフォーム、ならびに対象におけるそれらの利用のための方法を提供する。本発明は、外因性ミトコンドリアについて富化された骨髄由来造血幹細胞の静脈内注射が対象の様々な組織に有益に影響を及ぼし得ることを示すいくつかの驚くべき発見に基づいている。言い換えれば、外因性ミトコンドリアについて富化された幹細胞の投与後、様々な器官および組織において機能の改善を達成することができる。

本発明は、例えばＷＯ２０１６／１３５７２３に開示されているように、幹細胞および骨髄細胞は、無傷の外因性ミトコンドリアについて富化されることを受け入れ、ヒト骨髄細胞は、ミトコンドリアについて富化されることを特に受け入れるという発見に部分的に基づいている。いかなる理論または機構に拘束されるものではなく、幹細胞または骨髄細胞と外因性ミトコンドリアとの同時インキュベーションは、幹細胞または骨髄細胞への無傷の機能的ミトコンドリアの移行を促進すると仮定されている。

骨髄由来造血幹細胞を含むがこれに限定されない幹細胞または骨髄細胞の、ミトコンドリアについての富化の程度、および細胞のミトコンドリア機能の改善は、単離された外因性ミトコンドリアまたは部分的に精製されたミトコンドリアの濃度、ならびにインキュベーション条件を含むがこれらに限定されないミトコンドリア富化に使用される条件に依存することも見出されている。

本発明は、ある特定の態様では、ミトコンドリア富化標的細胞の生着、増殖、およびこれらの増強細胞の骨髄へのホーミングを改善するための方法および組成物を提供する。具体的には、外因性ミトコンドリアによって増強された標的細胞は、外因性ミトコンドリアによる増強も外因性ミトコンドリアについての富化もされていない標的細胞を受け取った対象と比較して、または富化または増強前の標的細胞と比較して、対象の骨髄への生着の改善および増強された細胞の方向付けの改善を有する。

本発明は、一態様では、疾患もしくは障害に罹患している対象からまたは健康な対象から得られるかまたは由来する標的細胞を、外因性ミトコンドリアについて富化すること、および「ミトコンドリア富化」標的細胞を対象に移植することによって、対象において、ＣＤ４５＋細胞のレベルを増加させ、ＣＤ３３＋細胞に対するＣＤ３＋細胞のレベルを増加させ、骨髄細胞に対するリンパ球細胞の割合を増加させるための方法および組成物を提供する。

本発明は、対象のリンパ系細胞のレベルを増加させるための方法を提供し、本方法は、疾患もしくは障害に罹患しているかもしくはそれを有する対象から、または健康な対象から標的細胞を得ることと、ドナーから外因性ミトコンドリアを得ることと、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件下で標的細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化標的細胞を産生することと、ミトコンドリア富化標的細胞を対象に投与することとを含み、富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い。一態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にするための条件は、１０^６個の標的細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む。

本発明は、加えて、ミトコンドリア富化標的細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、対象におけるリンパ球のレベルを増加させるための医薬組成物であって、ミトコンドリア富化標的細胞が、外因性ミトコンドリアについて富化されている、医薬組成物を提供する。ミトコンドリア富化標的細胞は、疾患もしくは障害に罹患しているかもしくはそれを有する対象から、または健康な対象から標的細胞を得ることと、ドナーから外因性ミトコンドリアを得ることと、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件下で標的細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化標的細胞を産生することとによって産生され、富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い。一態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にするための条件は、１０^６個の標的細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む。

リンパ系細胞またはリンパ球は、抗原に対する免疫応答を提供する白血球である。リンパ系細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。Ｔ細胞およびＢ細胞は、適応免疫応答の主要な細胞成分である。Ｔ細胞は細胞性免疫に関与するが、Ｂ細胞は主に体液性免疫に関与する。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の一部であり、腫瘍およびウイルス感染細胞から宿主を防御する上で主要な役割を果たす。

本明細書で使用される場合、「白血球細胞の増加したレベル」という用語は、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されている対象であって、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されていない対象と比較して、ミトコンドリア富化されていない標的細胞を投与されている対象と比較して、またはミトコンドリア富化標的細胞を投与される前の対象における白血球細胞のレベルと比較して、白血球細胞の数が増加している対象を指す。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ４５＋細胞のレベルは、少なくとも１．１倍、１．３倍、１．５倍、２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、または少なくとも５倍増加する。

本明細書で使用される場合、「リンパ系細胞の増加したレベル」という用語は、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されている対象であって、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されていない対象と比較して、ミトコンドリア富化されていない標的細胞を投与されている対象と比較して、またはミトコンドリア富化標的細胞を投与される前の対象におけるリンパ系細胞のレベルと比較して、リンパ系細胞の数が増加している対象を指す。ある特定の態様では、ＣＤ３＋細胞のレベルは、少なくとも１．１倍、１．３倍、１．５倍、２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、または少なくとも５倍増加する。

本明細書で使用される場合、「骨髄細胞に対するリンパ系細胞の増加した割合」という用語は、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されている対象であって、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されていない対象と比較して、ミトコンドリア富化されていない標的細胞を投与されている対象と比較して、またはミトコンドリア富化標的細胞を投与される前の対象における骨髄細胞に対するリンパ系細胞の割合と比較して、骨髄細胞に対するリンパ系細胞の割合において増加を有する対象を指す。ある特定の態様では、増加は、少なくとも１．１倍、１．３倍、１．５倍、２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、または少なくとも５倍である。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、幹細胞、前駆細胞、または骨髄由来幹細胞である。具体的には、標的細胞は、多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む。本発明の方法では、標的細胞は、外因性ミトコンドリアについての富化の前に、能動的に変更または改変されない（例えば、ｍｔＤＮＡまたはミトコンドリア機能の低下）。より具体的には、標的細胞におけるミトコンドリア機能および／またはミトコンドリアＤＮＡは、外因性ミトコンドリアと接触する前に能動的に変更または改変されない。

本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、一般に、任意の哺乳動物幹細胞を指す。幹細胞は、他のタイプの細胞に分化することができ、分裂してほぼ同じタイプの幹細胞を産生することができる未分化細胞である。幹細胞は、全能性または多能性のいずれかであり得る。

本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、一般に、ヒトに自然に見出されるすべての幹細胞、およびエクスビボで産生または誘導され、ヒトと適合性のあるすべての幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞は、自家である。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞は、同種異系である。幹細胞のような「前駆細胞」は、特定のタイプの細胞に分化する傾向があるが、すでに幹細胞よりも特異的であり、その「標的」細胞に分化させられる。幹細胞と前駆細胞の最も重要な違いは、幹細胞は無制限に複製することができるのに対し、前駆細胞は限られた回数しか分裂することができないことである。本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、「前駆細胞」および「完全に分化していない幹細胞」をさらに含む。

ＨＳＰＣは、すべての免疫細胞、自然免疫系および適応免疫系、ならびに骨髄系およびリンパ系の細胞の前駆細胞である。幹細胞としてそれらは長命であり、造血細胞としてそれらは全身を循環し、体内のすべての臓器系に影響を及ぼし、多系統（ｍｕｌｔｉ－ｓｙｓｔｅｍｉｃ）疾患に対処するための鍵となる。ミトコンドリア代謝は、造血幹細胞および前駆細胞の持続性および機能、ならびに免疫細胞の機能および炎症バランスに重要である。免疫機能障害は、ミトコンドリア病患者における罹患率および死亡率の主要な原因であり、神経変性後遺症をもたらすことが知られている。免疫系は、エネルギー不足によって影響され、ミトコンドリア病患者は、免疫能力のある集団で一般的に見られない異常な感染症を含む原発性免疫不全を有する患者と同様の症状を示すことがよくある。重要なことに、輸血依存または血球減少症を有さない患者においても、感染中の代謝異常のリスクが高く、これは、免疫細胞ミトコンドリア機能における細胞固有の欠陥に起因する可能性がある。

前臨床的には、免疫細胞ミトコンドリア機能の救済は、貧血、筋肉の衰え、身体活動、心血管機能、および組織老化の低減を含む多系統効果を発揮することができることが最近示された。造血細胞が非造血効果を発揮する推奨される機構には、免疫細胞におけるミトコンドリア機能障害と関連する炎症の減少、または遠位組織におけるアポトーシスを抑制することができる因子の分泌の増大が含まれる。

ある特定の実施形態では、幹細胞は多能性幹細胞（ＰＳＣ）である。他の実施形態では、ＰＳＣは非胚性幹細胞である。いくつかの実施形態に従い、ヒト胚性幹細胞は、本発明の範囲から明示的に除外される。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、骨髄細胞に由来する。特定の実施形態では、幹細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞である。他の実施形態では、幹細胞は、脂肪組織に由来する。さらに他の実施形態では、幹細胞は、血液に由来する。さらなる実施形態では、幹細胞は、臍帯血に由来する。さらなる実施形態では、幹細胞は、口腔粘膜に由来する。特定の実施形態では、疾患に罹患している患者からまたは健康な対象から得られる幹細胞は、骨髄細胞または骨髄由来幹細胞である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、無制限に増殖することができ、また体内に複数の細胞型を生じさせることができる細胞を指す。全能性幹細胞は、体内の他のすべての細胞型を生じさせることができる細胞である。胚性幹細胞（ＥＳＣ）は全能性幹細胞であり、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は多能性幹細胞である。

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、ヒト成体体細胞から生成することができる一タイプの多能性幹細胞を指す。本明細書でｉＰＳＣを生成することができる体細胞のいくつかの非限定的な例としては、線維芽細胞、内皮細胞、毛細血管血細胞、ケラチノサイト、骨髄細胞 上皮細胞が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する一タイプの全能性幹細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「骨髄細胞」という用語は、一般に、ヒトの骨髄に自然に見出されるすべてのヒト細胞、およびヒトの骨髄に自然に見出されるすべての細胞集団を指す。「骨髄幹細胞」および「骨髄由来幹細胞」という用語は、骨髄に由来する幹細胞集団を指す。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、およびそれらの任意の組み合わせである。

いくつかの実施形態では、自家または同種異系のヒト幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。さらなる実施形態では、自家または同種異系のヒト幹細胞は、間葉系幹細胞である。

一部の実施形態によれば、ヒト幹細胞は、脂肪組織、口腔粘膜、血液、臍帯血、または骨髄に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、骨髄に由来する。

ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、骨髄造血細胞を含む。本明細書で使用される場合、「骨髄造血細胞」という用語は、骨髄造血、例えば、骨髄およびそれから生じるすべての細胞、すなわち、すべての血液細胞の産生に関与する細胞を指す。

ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、赤血球生成細胞を含む。本明細書で使用される場合、「赤血球生成細胞」という用語は、赤血球生成、例えば、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））の産生に関与する細胞を指す。

ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。本明細書で使用される場合、「多能性造血幹細胞」または「造血芽細胞」という用語は、造血のプロセスを通じて他のすべての血液細胞を生じさせる幹細胞を指す。

ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来の幹細胞は、間葉系幹細胞を含む。本明細書で使用される場合、「一般的な骨髄系前駆細胞」という用語は、骨髄系細胞を生成する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「一般的なリンパ球系前駆細胞」という用語は、リンパ球を生成する細胞を指す。

ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、巨核球、赤血球、肥満細胞、筋芽細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、間葉系幹細胞を含む。本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」という用語は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、および脂肪細胞を含む、様々な細胞型に分化することができる、多能性間質細胞を指す。

ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、骨髄造血細胞を含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来の幹細胞は、赤血球生成細胞からなる。ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、巨核球、赤血球、肥満細胞、筋芽細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来の幹細胞は、間葉系幹細胞からなる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、末梢血から得られる複数のヒト骨髄幹細胞を含む。

ＣＤ３４抗原としても知られる造血前駆細胞抗原ＣＤ３４は、ヒトではＣＤ３４遺伝子によってコードされているタンパク質である。ＣＤ３４は、細胞表面糖タンパク質の分化クラスターであり、細胞－細胞接着因子として機能する。ある特定の実施形態では、骨髄幹細胞は、骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４を発現する（ＣＤ３４＋である）。ある特定の実施形態では、骨髄幹細胞は、それらの外膜上に骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４を提示する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、臍帯血由来である。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、それらの起源に関係なく、ＣＤ３４陽性であると特徴付けられる造血幹細胞を指す。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、骨髄から、血液に動員された骨髄細胞から、または臍帯血から得られる。

本明細書で使用される場合、「障害に罹患している対象からまたは障害に罹患していないドナーから得られた幹細胞」という句は、対象から単離された時点で対象／ドナーの幹細胞であった細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「障害に罹患している対象に由来する幹細胞」または「障害に罹患していないドナーに由来する幹細胞」という句は、対象／ドナーの幹細胞ではなく、幹細胞になるように操作された細胞を指す。本明細書で使用される場合、「操作された」という用語は、体細胞を未分化状態に再プログラミングし、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）になり、任意選択で、骨髄細胞（Ｘｕ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１２，Ｖｏｌ．７（４），ｅ３４３２ｌ）などの所望の系統または集団の細胞になるようにｉＰＳＣをさらに再プログラミングする（Ｃｈｅｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＩＯＶＳ，２０１０，Ｖｏｌ．５１（１１），５９７０～５９７８）ための、当該分野で既知の方法のいずれか１つ（Ｙｕ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，Ｖｏｌ．３１８（５８５８），１９１７～１９２０）を使用することを指す。

いくつかの実施形態では、幹細胞は、インビトロで培養され、拡大増殖される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ミトコンドリア富化の前または後に、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受ける。

ある特定の実施形態では、幹細胞は、疾患または障害に罹患している対象に直接由来する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ドナーに直接由来する。本明細書で使用される場合、「直接由来する」という用語は、他の細胞に直接由来した幹細胞を指す。ある特定の実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄細胞に由来する。ある特定の実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、末梢血に由来する。

ある特定の実施形態では、幹細胞は、疾患または障害に罹患している対象に間接的に由来する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ドナーに間接的に由来する。本明細書で使用される場合、「間接的に由来する」という用語は、非幹細胞に由来した幹細胞を指す。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）になるように操作された体細胞に由来した。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、全血、血液画分、末梢血、ＰＢＭＣ、血清、血漿、脂肪組織、口腔粘膜、血液、臍帯血、または骨髄から得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、疾患または障害に罹患している対象の骨髄から直接得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ドナーの骨髄細胞から直接得られる。本明細書で使用される場合、「直接得られた」という用語は、例えば、外科手術または注射器による針を介した吸引などの手段によって、骨髄自体から得られた幹細胞を指す。

ある特定の実施形態では、幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患している患者の骨髄から間接的に得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ドナーの骨髄から間接的に得られる。本明細書で使用される場合、「間接的に得られた」という用語は、骨髄自体以外の場所から得られた骨髄細胞を指す。

ある特定の実施形態では、幹細胞は、疾患または障害に罹患している対象の末梢血から得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、健康な人の末梢血から得られる。本明細書で使用される場合、「末梢血」という用語は、血液系中を循環する血液を指す。

本明細書で使用される場合、「自家細胞」または「自家である細胞」という用語は、患者自身の細胞であることを指す。「自家ミトコンドリア」という用語は、患者自身の細胞または母性的に関連する細胞から得られたミトコンドリアを指す。「同種異系細胞」または「同種異系ミトコンドリア」という用語は、異なるドナー個体からのものであることを指す。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「同系」という用語は、拒絶なく個体間の移植を可能にするのに十分な、遺伝的同一性、または遺伝的にほぼ同一なことを指す。ミトコンドリアの文脈における同系という用語は、本明細書では、同じ母体の血統を意味する自家ミトコンドリアという用語と交換可能に使用される。

「疾患」および「障害」という用語は、正常とはみなされないか、または生理学的状態とは異なるいずれかの苦痛を指すことを意味する。疾患および障害は、事実上、身体であるすべての臓器、組織、または機能に影響を与える可能性がある。疾患および状態の非限定的な例としては、がん、筋肉疾患および障害、糖原病および糖原貯蔵障害、血管内皮障害または疾患、脳障害または脳疾患、胎盤障害または胎盤疾患、胸腺障害または胸腺疾患、自己免疫疾患、腎疾患または障害、膵臓障害または膵臓疾患、前立腺障害または前立腺疾患、腎臓障害または腎臓疾患、血液障害または血液疾患、心臓障害または心臓疾患、皮膚障害または皮膚疾患、免疫および炎症性疾患および障害、骨疾患または骨障害、胃腸疾患または胃腸障害、および眼疾患または眼障害が挙げられる。ある特定の態様では、疾患または障害は、加齢関連疾患または障害である。

加齢関連疾患は、細胞老化が進むにつれて頻度が増加することで最も頻繁に見られる疾患である。本質的に、老齢関連疾患は老化から生じる合併症である。すべての成体動物は年を取るが、すべての成体動物が老齢関連疾患を経験するわけではないため、老齢関連疾患は老齢プロセス自体とは区別される。

ミトコンドリアの質および活性の低下は、正常な老齢と関連しており、広範な老齢関連疾患の発症と相関している。ミトコンドリアは、細胞老化、慢性炎症、および幹細胞活性における年齢依存性低下を含む、老化過程の具体的な態様に寄与している。豊富な裏付けとなる証拠は、ミトコンドリアＤＮＡ突然変異の蓄積により、ミトコンドリア機能障害が年齢とともに起こることを示している。様々なミトコンドリアＤＮＡ点突然変異は、ヒトの脳、心臓、骨格筋、および肝臓組織において、年齢とともに大幅に増加することが示されている。ミトコンドリアＤＮＡの欠失／挿入の頻度の増加は、動物モデルおよびヒトの両方で加齢とともに報告されている。複製サイクルおよびミトコンドリアＤＮＡ突然変異の蓄積は、ミトコンドリアが老化のいくつかの重要な態様に影響を与えるかまたは調節するような、幹細胞老化の根底にある保存された機構である可能性があると仮定されている（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１６，６１：６５４－６６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｇｅｎｅｓ，２０１７，８：３９８、Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ，２０１７，８：３９７）。

本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア病」という用語および「原発性ミトコンドリア病」という用語は、交換可能に使用され得る。本明細書で使用される場合、「原発性ミトコンドリア病」という用語は、ミトコンドリアＤＮＡの既知のもしくは明白な病原性突然変異によって、または遺伝子産物がミトコンドリアに取り込まれる核ＤＮＡの遺伝子の突然変異によって診断されるミトコンドリア病を指す。いくつかの実施形態によれば、原発性ミトコンドリア病は、先天性疾患である。いくつかの実施形態によれば、原発性ミトコンドリア病は、続発性ミトコンドリア機能障害ではない。「続発性ミトコンドリア機能障害」および「後天性ミトコンドリア機能障害」という用語は、本出願を通して交換可能に使用される。

本明細書で使用される場合、「疾患または障害に罹患している対象」または「疾患または障害を有して罹患している対象」という用語は、ある特定の状態によって引き起こされる衰弱作用を経験しているヒト対象を指す。この疾患は、がん、加齢関連疾患、腎疾患、膵臓疾患、肝臓疾患、筋肉疾患、脳疾患または原発性ミトコンドリア病、続発性ミトコンドリア機能障害、ならびに他の疾患または障害を指し得る。

本明細書で使用される場合、「エクスビボ法」という用語は、そのステップが人体外でのみ実行される方法を指す。特に、エクスビボ法は、後に治療される対象に再導入または移植される体外の細胞の操作を含む。

本明細書で使用される場合、「ドナー」という用語は、外因性ミトコンドリアを提供するドナーを指す。いくつかの実施形態では、ドナーは、疾患または障害に罹患していないか、または対象が罹患している障害と同じ障害の疾患に罹患していない。

ミトコンドリアに関して「外因性」、「単離された外因性」という用語は、細胞の外部にある供給源から標的細胞（例えば、幹細胞）に導入されるミトコンドリアを指す。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアは、一般に、標的細胞とは異なるドナー細胞に由来するかまたは単離され得る。例えば、外因性ミトコンドリアは、ドナー細胞で産生または作製され、ドナー細胞から精製、単離または得られ、その後、標的細胞に導入され得る。外因性ミトコンドリアは、ドナーから得られたものとして同種異系、または対象から得られたものとして自家であり得る。単離されたミトコンドリアは、機能的ミトコンドリアを含み得る。ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアが、全ミトコンドリアである。

本明細書で使用される場合、ミトコンドリアに関連する「単離された」および「部分的に精製された」という用語は、他の細胞成分から少なくとも部分的に精製された外因性ミトコンドリアを含む。外因性の単離されたまたは部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の１０％～９０％である。

本明細書で使用される場合、「機能的ミトコンドリア」という用語は、正常なミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）および正常な非病理学的活性レベルを示すパラメーターを示すミトコンドリアを指す。ミトコンドリアの活性は、膜電位、Ｏ_２消費、ＡＴＰ産生、およびクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性レベルなど、当技術分野で周知の様々な方法で測定することができる。

ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化細胞中の全ミトコンドリア含有量の少なくとも１％を構成する。ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化標的細胞中の全ミトコンドリア含有量の少なくとも１０％を構成する。いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化標的細胞中の全ミトコンドリア含有量の少なくとも約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％または５０％を構成する。ある特定の実施形態では、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、細胞タンパク質の総量の１０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、４０～７０％、２０～４０％、または２０～３０％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の２０％～８０％である。ある特定の実施形態では、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内画分を合わせた重量の２０％～８０％である。他の実施形態では、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内画分を合わせた重量の８０％を超える。

ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアは、ヒト細胞またはヒト組織から得られる。いくつかの実施形態では、ヒト細胞またはヒト組織は、胎盤、培養で増殖された胎盤細胞、および血液細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ヒト体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、培養細胞である。本明細書でｉＰＳＣを生成することができる体細胞のいくつかの非限定的な例としては、線維芽細胞、内皮細胞、毛細血管細胞、ケラチノサイト、骨髄細胞、および上皮細胞が挙げられる。

ミトコンドリアに関して「自家」という用語は、細胞と同じ供給源から標的細胞（例えば、幹細胞）に導入されるミトコンドリアを指す。例えば、いくつかの実施形態では、自家ミトコンドリアは、標的細胞の供給源である対象に由来するかまたは単離される。例えば、自家ミトコンドリアは、対象の細胞から精製／単離／取得され、その後、対象の標的細胞に導入され得る。

ミトコンドリアに関して「内因性」という用語は、細胞によって作製／発現／産生されており、外部供給源から細胞に導入されないミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態では、内因性ミトコンドリアは、細胞のゲノムによってコードされているタンパク質および／または他の分子を含有する。いくつかの実施形態では、「内因性ミトコンドリア」という用語は、「宿主ミトコンドリア」という用語と等しい。

本発明の原理に従えば、外因性ヒトミトコンドリアが、ヒト幹細胞であり得る標的細胞に導入され、こうしてこれらの細胞を、外因性ミトコンドリアについて富化する。かかる富化は標的細胞のミトコンドリア含有量を変化させることを理解するべきであり、ナイーブヒト幹細胞は、実質的に、宿主／自家ミトコンドリアの１つの集団を有するが、外因性ミトコンドリアについて富化された標的細胞は、宿主／内因性ミトコンドリアの第１の集団と、導入されたミトコンドリアの別の集団（すなわち、外因性ミトコンドリア）の２つのミトコンドリアの集団を実質的に有する。よって、「濃縮された」という用語は、外因性ミトコンドリアを受け取った／組み込んだ後の細胞の状態に関する。ミトコンドリアの２つの集団間の数および／または比率を決定することは、２つの集団がいくつかの態様、例えばミトコンドリアＤＮＡにおいて異なり得るため、簡単である。したがって、「外来性ヒトミトコンドリアについて富化されたヒト幹細胞」という句は、「内因性ミトコンドリアと外因性単離ミトコンドリアとを含むヒト幹細胞」という句と等しい。例えば、全ミトコンドリアの少なくとも１％の外因性単離ミトコンドリアを含むヒト幹細胞は、宿主内因性ミトコンドリアと外因性単離ミトコンドリアを９９：１の比率で含むとみなされる。例えば、「全ミトコンドリアの３％」は、富化後、元の（内因性）ミトコンドリア含有量が全ミトコンドリアの９７％であり、導入された（外因性）ミトコンドリアが全ミトコンドリアの３％であることを意味し、これは（３／９７＝）３．１％の富化に相当する。別の例として、「全ミトコンドリアの３３％」は、富化後、元の（内因性）ミトコンドリア含有量が全ミトコンドリアの６７％であり、導入された（外因性）ミトコンドリアが全ミトコンドリアの３３％であることを意味し、これは（３３／６７＝）４９．２％の富化に相当する。

いくつかの実施形態では、内因性ミトコンドリアの外因性ミトコンドリアからの特定／区別は、後者が標的細胞に導入された後、例えば、限定されないが、ｍｔＤＮＡ配列の差異、例えば、内因性ミトコンドリアと外因性ミトコンドリアとの間の異なるハプロタイプを特定すること、外因性ミトコンドリアの供給源組織に由来する特定のミトコンドリアタンパク質、例えば、胎盤からのチトクロームｐ４５０コレステロール側鎖切断（Ｐ４５０ＳＣＣ）、褐色脂肪組織からのＵＣＰ１などを特定すること、またはそれらの任意の組み合わせを含む、様々な手段によって実行され得る。

ヘテロプラスミーとは、細胞または個体内に１タイプを超えるミトコンドリアＤＮＡが存在することである。ヘテロプラスミーレベルは、変異ｍｔＤＮＡ分子 対 野生型／機能的ｍｔＤＮＡ分子の比率であり、ミトコンドリア病の重症度を考慮するのに重要な要素である。低レベルのヘテロプラスミー（十分な量のミトコンドリアが機能している）は、健康な表現型と関連しているが、高レベルのヘテロプラスミー（十分な量のミトコンドリアが機能していない）は病状と関連している。ある特定の実施形態では、富化された幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、対象またはドナーから得られた、または由来する幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも１％、３％、５％、１５％、２０％、２５％、または３０％低い。

本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア富化標的細胞」という用語は、外因性ミトコンドリアが挿入された標的細胞を指す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１１、ＣＤ１５、ＣＤ１６等を発現する細胞に分化する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１４、またはＣＤ１９を発現する。ＣＤ４５は、赤血球および形質細胞を除く造血系統のすべての細胞に存在する受容体結合タンパク質チロシンホスファターゼである。ＣＤ３は免疫応答効率のマーカーである。具体的には、ＣＤ３は前胸腺細胞で発現される。細胞上のＣＤ４５およびＣＤ３の発現は、フローサイトメトリーを含む当技術分野で既知の任意の手段によって決定することができる。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１４、および／またはＣＤ１９発現は、ミトコンドリア富化細胞を対象に投与した後に生じる。

本明細書で使用する場合、「接触させる」という用語は、ミトコンドリアと細胞を十分に近接させて、ミトコンドリアが細胞に入るのを促進することを指す。ミトコンドリアを標的細胞に導入または挿入するという用語は、接触させるという用語と交換可能に使用される。

本明細書で使用される場合、「単離されたミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件」という句は、一般に、時間、温度、培養培地、およびミトコンドリアと幹細胞との間の近接性などのパラメーターを指す。例えば、ヒト細胞およびヒト細胞株は、日常的に、３７℃および５％ＣＯ_２雰囲気で、組織培養インキュベーターなどにおいて、液体培地中でインキュベートされ、無菌環境で保持される。本明細書に開示および例示される代替の実施形態によれば、細胞は、ヒト血清アルブミンを補給した生理食塩水中で室温でインキュベートすることができる。

ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、約１６～約３７℃の範囲の温度で、約０．５～３０時間の範囲の時間、単離されたミトコンドリアとともにインキュベートされる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、単離されたミトコンドリアとともに、約１～３０時間または約５～２５時間の範囲の時間、インキュベートされる。特定の実施形態では、インキュベーションは、２０～３０時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、少なくとも１、３、５、８、１０、１３、１５、１８、２０、２１、２２、２３または２４時間である。他の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも５、１０、１５、２０、または３０時間までである。特定の実施形態では、インキュベーションは２４時間である。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、標的細胞中のミトコンドリア含有量が、それらの初期ミトコンドリア含有量と比較して平均して約１％～４５％増加するまでである。

いくつかの実施形態では、インキュベーションは、室温（１６℃～３０℃）である。他の実施形態では、インキュベーションは３７℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、５％ＣＯ_２雰囲気中である。他の実施形態では、インキュベーションは、空気中に見られるレベルを超える追加のＣＯ_２を含まない。

またさらなる実施形態では、インキュベーションは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補給した培養培地で実行される。追加の実施形態では、インキュベーションは、ＨＳＡを補給した生理食塩水中で実行される。ある特定の例示的な実施形態によれば、単離された外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に入り、それにより、当該ヒト幹細胞を、当該ヒト外因性ミトコンドリアについて富化することを可能にする条件は、４．５％ヒト血清アルブミンを補給した生理食塩水中での室温でのインキュベーションを含む。

ある特定の実施形態では、単離されたミトコンドリアは、ミトコンドリアが得られた後、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０分、標的細胞とともにインキュベートされる。追加の実施形態では、単離されたミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアが得られた後、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間、標的細胞とともにインキュベートされる。一態様では、ミトコンドリアは、ドナーから得られる。別の態様では、外因性ミトコンドリアは、標的細胞に対して自家または同種異系である。

ある特定の実施形態では、インキュベーションは、３７℃で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも６時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも１２時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、１２～２４時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、０．８８ミリユニットのＣＳを有するかまたは示す外因性ミトコンドリアの量につき１×１０^５～１×１０^７個の標的細胞の割合で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、０．８８ミリユニットのＣＳを有するかまたは示す外因性ミトコンドリアの量につき１×１０^６個のナイーブ幹細胞の割合で実行される。ある特定の実施形態では、条件は、ＣＳ活性によって決定されるように、ナイーブ幹細胞のミトコンドリア含有量を少なくとも約１％、３％、５％、または１０％増加させるのに十分である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

本明細書で使用される場合、「富化」という用語は、哺乳動物細胞の、ミトコンドリア含有量、例えば、無傷のミトコンドリアの数、またはミトコンドリアの機能を増加させるように設計された任意の作用を指す。特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアについて富化された幹細胞は、富化前の同じ幹細胞と比較して、機能の向上を示すことになる。

クエン酸シンターゼ（ＣＳ）は、ミトコンドリアマトリックスに局在するが、核ＤＮＡによってコードされている。クエン酸シンターゼは、クレブス回路の第１のステップに関与し、無傷のミトコンドリアの存在に対する定量的酵素マーカーとして一般的に使用される（Ｌａｒｓｅｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０１２，Ｖｏｌ．５９０（１４），ｐａｇｅｓ ３３４９－３３６０、Ｃｏｏｋ Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９８３，Ｖｏｌ．７６３（４），３５６～３６７ページ）。

ミトコンドリアの用量は、本明細書で説明するように、外因性ミトコンドリアの量の他の定量化可能な尺度であるＣＳ活性のユニットまたはｍｔＤＮＡコピー数で表すことができる。「ＣＳ活性のユニット」は、１ｍＬの反応体積で１分間に１マイクロモルの基質の変換を可能にする量として定義される。

いくつかの実施形態では、幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化は、百万個の細胞当たり少なくとも０．０４４～１７６ミリユニット（ｍＵ）のクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性、百万個の細胞当たり少なくとも０．０８８～１７６ｍＵのＣＳ活性、百万個の細胞当たり少なくとも０．２～１５０ｍＵのＣＳ活性、百万個の細胞当たり少なくとも０．４～１００ｍＵのＣＳ活性、百万個の細胞当たり少なくとも０．６～８０ｍＵのＣＳ活性、百万個の細胞当たり少なくとも０．７～５０ｍＵのＣＳ活性、百万個の細胞当たり少なくとも０．８～２０ｍＵのＣＳ活性、百万個の細胞当たり少なくとも０．８８～１７．６ｍＵのＣＳ活性、または百万個の細胞当たり少なくとも０．４４～１７．６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を標的細胞に導入することを含む。

本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア含有量」という用語は、１つの細胞内のミトコンドリアの量、または複数の細胞内のミトコンドリアの平均量を指す。本明細書で使用される場合、「増加したミトコンドリア含有量」という用語は、ミトコンドリア富化前の標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高いミトコンドリア含有量を指す。

ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアについて富化されたヒト幹細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い。様々な実施形態によれば、ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％以上高い。

ある特定の実施形態では、標的細胞は新鮮なまま使用される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ミトコンドリアについての富化の前または後に凍結および解凍される。

ある特定の実施形態では、標的細胞またはミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの含有量を決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、幹細胞または富化幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの活性レベルを決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、幹細胞または富化幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの含有量と相関する。ある特定の実施形態では、幹細胞または富化幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの活性レベルと相関する。ＣＳ活性は、市販のキット、例えば、ＣＳ活性キットＣＳ０７２０（Ｓｉｇｍａ）を使用することによって測定することができる。

ミトコンドリアＤＮＡ含有量は、核遺伝子に対して正規化された、ミトコンドリア富化の前後のミトコンドリア遺伝子の定量的ＰＣＲを実行することによって測定され得る。

特定の状況では、ミトコンドリア富化前の同じ細胞は、ＣＳおよびＡＴＰ活性を測定し、富化レベルを決定するための対照として機能する。

ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出可能に高い」という用語は、正常値と増加した値との間の統計的に有意な増加を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出可能に高い」という用語は、非病理学的増加、すなわち、実質的に高い値と関連する病理学的症状が目に見えないレベルを指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「増加した」という用語は、健康な対象または複数の健康な対象の対応する細胞もしくは対応するミトコンドリア、またはミトコンドリア富化前の標的細胞に見られる対応する値よりも１．０５倍、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍以上高い値を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

本明細書で使用される場合、「増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量」という用語は、ミトコンドリア富化前の、標的細胞中のミトコンドリアＤＮＡ含有量よりも、検出可能に高いミトコンドリアＤＮＡの含有量を指す。ミトコンドリア含有量は、ＳＤＨＡまたはＣＯＸ１の含有量を測定することにより決定され得る。本明細書および特許請求の範囲の文脈において、「正常なミトコンドリアＤＮＡ」は、ミトコンドリア病と関連することが既知である突然変異または欠失を持たない／有さないミトコンドリアＤＮＡを指す。本明細書で使用される場合、「正常な酸素（Ｏ_２）消費率」という用語は、健康な個体からの細胞の平均Ｏ_２消費を指す。本明細書で使用される場合、「クエン酸シンターゼの正常な活性レベル」という用語は、健康な個体からの細胞におけるクエン酸シンターゼの平均活性レベルを指す。本明細書で使用される場合、「正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率」という用語は、健康な個体からの細胞における平均ＡＴＰ産生率を指す。

幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化の程度は、酸素（Ｏ_２）消費率、クエン酸シンターゼの含有量または活性レベル、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率を含むがこれらに限定されない機能的および／または酵素的アッセイによって決定され得る。代替では、幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化は、ドナーのミトコンドリアＤＮＡの検出によって確認することができる。いくつかの実施形態によれば、幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化の程度は、ヘテロプラスミーの変化のレベルによって、および／または細胞当たりのｍｔＤＮＡのコピー数によって決定され得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル）または関連するＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）は、ミトコンドリア膜電位の変化を特定することにより、生細胞のミトコンドリア機能を評価するために一般的に使用される細胞透過性蛍光発生色素である。いくつかの実施形態によれば、富化のレベルは、ＴＭＲＥまたはＴＭＲＭで染色することによって決定することができる。

いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア膜の無傷性は、当技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。非限定的な例では、ミトコンドリア膜の無傷性は、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）蛍光プローブを使用して測定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。顕微鏡下で観察され、ＴＭＲＭまたはＴＭＲＥ染色を示すミトコンドリアには、無傷ミトコンドリア外膜を有する。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア膜」という用語は、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア外膜、およびその両方からなる群から選択されるミトコンドリア膜を指す。

ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、細胞中の全ミトコンドリアＤＮＡの少なくとも統計的に代表的な部分を配列決定し、宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡの相対レベルを決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中のミトコンドリアの富化のレベルは、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析によって決定される。ある特定の実施形態では、最大のミトコンドリア集団および／もしくは最大のミトコンドリアＤＮＡ集団は、宿主／内因性ミトコンドリア集団および／もしくは宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡ集団であり、かつ／または２番目に大きいミトコンドリア集団および／もしくは２番目に大きいミトコンドリアＤＮＡ集団は、外因性ミトコンドリア集団および／もしくは外因性ミトコンドリアＤＮＡ集団である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

ある特定の実施形態によれば、幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化は、当技術分野で認識されている従来のアッセイによって決定することができる。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト標的細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、（ｉ）宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡのレベル、（ｉｉ）クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、チトクロームＣオキシダーゼ（ＣＯＸ１）、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラビンタンパク質サブユニットＡ（ＳＤＨＡ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるミトコンドリアタンパク質のレベル、（ｉｉｉ）ＣＳ活性レベル、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせによって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中のミトコンドリアの富化のレベルは、（ｉ）同種異系ミトコンドリアの場合、宿主ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡのレベル、（ｉｉ）クエン酸シンターゼ活性のレベル、（ｉｉｉ）コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラボタンパク質サブユニットＡ（ＳＤＨＡ）もしくはチトクロームＣオキシダーゼ（ＣＯＸ１）のレベル、（ｉｖ）酸素（Ｏ_２）消費率、（ｖ）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つによって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。これらの様々なパラメーターを測定するための方法は、当技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、幹細胞の、外因性ヒトミトコンドリアについての富化は、ヒト幹細胞を当該単離した外因性ヒト外因性ミトコンドリアとインキュベートした後に、ミトコンドリア富化標的細胞を洗浄することを含む。このステップは、細胞片またはミトコンドリア膜の残遺物および幹細胞に入らなかったミトコンドリアを実質的に欠いている、ミトコンドリア富化標的細胞を提供する。いくつかの実施形態では、洗浄は、ヒト標的細胞と当該単離された外因性ヒトミトコンドリアとのインキュベーション後に、ミトコンドリア富化標的細胞を遠心分離することを含む。いくつかの実施形態によれば、本方法は、遊離ミトコンドリア、すなわち、幹細胞に入らなかったミトコンドリアまたは他の細胞片から分離されているミトコンドリア富化ヒト幹細胞を産生し、本医薬組成物は、遊離ミトコンドリアから分離されているミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含有する。いくつかの実施形態によれば、検出可能な量の遊離ミトコンドリアを含まないミトコンドリア富化ヒト幹細胞を、本方法は産生し、本医薬組成物はそれを含有する。

ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーションおよび／または接触の前に、またはインキュベーションおよび／または接触中に、標的細胞および単離された外因性ミトコンドリアを濃縮することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーションまたは接触の前、インキュベーションまたは接触中、またはインキュベーションまたは接触の後に、標的細胞および単離された外因性ミトコンドリアの遠心分離をさらに含む。いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、標的細胞と単離されたミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に一回の遠心分離ステップを含む。

ある特定の実施形態では、遠心速度は約７，０００ｇまたは８，０００ｇである。さらなる実施形態によれば、遠心分離は、３００ｇ～８０００ｇ、５００ｇ～８０００ｇ、１０００ｇ～８０００ｇ、３００ｇ～５０００ｇ、２０００ｇ～４０００ｇ、２５００ｇ～８５００ｇ、３０００ｇ～８０００ｇ、４０００ｇ～８０００ｇ、５，０００～１０，０００ｇ、７０００ｇ～８０００ｇ、または２５００ｇ超の速度である。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約２分～３０分、３分～２５分、５分～２０分、または８分～１５分の範囲の時間にわたって実行される。

いくつかの実施形態では、遠心分離は、約２～６℃、４～３７℃、４～１０℃、または１６～３０℃の範囲の温度で行われる。特定の実施形態では、遠心分離は４℃で実行される。いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、標的細胞と単離された外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に一回の遠心分離、続いて３０℃未満の温度での細胞の静置を含む。いくつかの実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアがヒト標的細胞に入るのを可能にする条件は、標的細胞と、単離されたミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に一回の遠心分離、続いて１６～２８℃の範囲の温度での細胞の静置を含む。

いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラム当たり少なくとも１０^４～２×１０^８個、５×１０^５～１．５×１０^７個、または５×１０^５～４×１０^７個のミトコンドリア富化標的細胞の濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化幹細胞を生成し、および／または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化幹細胞を含有する。いくつかの実施形態では、患者の体重１キログラム当たり少なくとも１０^６～１０^７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞の濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化標的細胞を生成し、および／または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化標的細胞を含有する。他の実施形態では、患者の体重１キログラム当たり少なくとも１０^５または少なくとも１０^６個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞の濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化標的細胞を生成し、および／または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化標的細胞を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも５×１０^５～最大５×１０^９個のミトコンドリア富化標的細胞の合計濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化幹細胞を生成し、および／または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化幹細胞を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１０^６～最大１０^９個のミトコンドリア富化標的細胞の合計濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化標的細胞を生成し、および／または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化標的細胞を含有する。他の実施形態では、合計少なくとも２×１０^６～最大５×１０^８個のミトコンドリア富化標的細胞を、本方法は生成し、および／または本医薬組成物はそれを含む。

ある特定の実施形態では、標的細胞は、新鮮である。ある特定の実施形態では、第２の組成物は、凍結され、次いでインキュベーションの前に解凍される。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは、新鮮である。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは、凍結され、次いでインキュベーションの前に解凍される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、新鮮である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、凍結され、次いで投与の前に解凍される。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は凍結されない。さらなる実施形態では、単離された富化標的細胞は、凍結され、次いで保存され、使用前に解凍される。さらなる実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、凍結および保存せずに使用される。またさらなる実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、凍結、保存、および解凍後に使用される。生存能力を維持するために細胞調製物を凍結および解凍するのに好適な方法は、当技術分野で周知である。

本明細書で使用される場合、「凍結－解凍サイクル」という用語は、単離された外因性ミトコンドリアを０℃未満の温度に凍結し、ミトコンドリアを０℃未満の温度で所定の期間維持し、単離されたミトコンドリアを室温または体温または単離されたミトコンドリアによる標的細胞の処置を可能にする０℃を超える任意の温度に解凍することを指す。本明細書で使用される場合、「室温」という用語は、典型的には、１８℃～２５℃の温度を指す。本明細書で使用される場合、「体温」という用語は、３５．５℃～３７．５℃、好ましくは３７℃の温度を指す。

別の実施形態では、凍結－解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、－２０℃以下、－４℃以下、または－７０℃以下の温度で凍結された。別の実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、段階的である。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、瞬間凍結による。本明細書で使用される場合、「瞬間凍結」という用語は、ミトコンドリアを低温貯蔵温度に供することによって急速に凍結することを指す。

別の実施形態では、凍結－解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも３０分間凍結された。別の実施形態によれば、凍結－解凍サイクルは、単離された外因性ミトコンドリアを解凍前に少なくとも３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０分間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結－解凍サイクルを受けた単離された外因性ミトコンドリアは、解凍前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、４８、７２、９６、または１２０時間凍結された。別の実施形態では、凍結－解凍サイクルを受けた単離された外因性ミトコンドリアは、解凍前に少なくとも４、５、６、７、３０、６０、１２０、３６５日間凍結された。別の実施形態によれば、凍結－解凍サイクルは、単離された外因性ミトコンドリアを解凍前に少なくとも１、２、３週間凍結することを含む。別の実施形態によれば、凍結－解凍サイクルは、単離された外因性ミトコンドリアを解凍前に少なくとも１、２、３、４、５、６か月間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結－解凍サイクル後の単離された外因性ミトコンドリアの酸素消費量は、凍結－解凍サイクル前の外因性ミトコンドリアの酸素消費量と等しいかまたはそれよりも高い。

ある特定の実施形態によれば、解凍は、室温である。別の実施形態では、解凍は、体温である。別の実施形態によれば、解凍は、本発明の方法によるミトコンドリアの投与を可能にする温度である。別の実施形態によれば、解凍は、段階的に実行される。

ある特定の実施形態では、上記の方法は、疾患もしくは障害に罹患している対象にまたはドナーに、末梢血への骨髄細胞の動員を誘導する薬剤を投与する先行ステップをさらに含む。

ある特定の実施形態では、骨髄細胞／骨髄で産生された幹細胞の、末梢血への動員を誘導する薬剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、１，１’－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］ビス［１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン］（Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ、ＣＡＳ番号１５５１４８－３１－５）、ＣＸＣＲ４阻害剤、それらの塩、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、上記の方法は、疾患もしくは障害に罹患している対象のおよび／またはドナーの末梢血から幹細胞を単離することをさらに含む。本明細書で使用される場合、「末梢血から単離する」という用語は、血液の他の成分からの幹細胞の単離を指す。

アフェレーシス中、対象またはドナーの血液は、１つの特定の成分を分離し、残りを循環に戻す装置を通過する。したがって、それは体外で実行される医療手順である。ある特定の実施形態では、単離はアフェレーシスによって実行される。

ある特定の実施形態では、幹細胞であり得る標的細胞は、疾患もしくは障害に罹患している対象からまたはドナーから得られ、標的細胞は、（ｉ）正常な酸素（Ｏ_２）消費率、（ｉｉ）正常なクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル、（ｉｉｉ）正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを有する。

ある特定の実施形態では、幹細胞であり得る標的細胞は、疾患もしくは障害に罹患している対象からまたはドナーから得られ、標的細胞は、疾患もしくは障害に罹患していない対象と比較して、（ｉ）減少した酸素（Ｏ_２）消費率、（ｉｉ）減少したクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル、（ｉｉｉ）減少したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを有する。

ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、標的細胞と比較して、（ｉ）増加した酸素（Ｏ_２）消費率、（ｉｉ）増加したクエン酸シンターゼ含有量もしくは活性レベル、（ｉｉｉ）増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、（ｉｖ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、（ｖ）より低いヘテロプラスミーレベル、または（ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）の任意の組み合わせを有する。

本明細書で使用される場合、「増加した酸素（Ｏ_２）消費率」という用語は、ミトコンドリア富化前の酸素（Ｏ_２）消費率よりも検出可能に高い酸素（Ｏ_２）消費率を指す。

本明細書で使用される場合、「増加したクエン酸シンターゼ含有量または活性レベル」という用語は、ミトコンドリア富化前のクエン酸シンターゼの含有量値または活性レベルよりも検出可能に高いクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを指す。

本明細書で使用される場合、「増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率」という用語は、ミトコンドリア富化前のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率よりも検出可能に高いアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率を指す。

いくつかの態様によれば、本発明は、治療を必要とするヒト対象において、疾患もしくは障害またはそれらの症状を治療する方法を提供し、方法は、複数のミトコンドリア富化標的細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。

「治療」という用語は、本明細書では、「治療方法」という用語と互換的に使用され、１）診断された病理状態もしくは障害の治癒、緩徐化、症状の軽減、および／または進行の停止、ならびに２）ならびに予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指す。治療を必要とする個体には、既に特定の医学的障害を有する個体、ならびに最終的にその障害を獲得し得る個体（すなわち、予防措置を必要とする個体）が含まれ得る。

「治療有効量」、「有効用量」、「治療有効用量」、「有効量」などの用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医によって求められている組織、システム、動物、またはヒトの生物学的もしくは医学的な応答を誘発する対象化合物の量を指す。一般に、応答は、患者の症状の改善または所望の生物学的転帰のいずれかである。有効量は、本明細書に記載されるように決定することができる。

「の投与」および／または「投与すること」という用語は、治療を必要とする対象に治療有効量の医薬組成物を提供することを意味すると理解されるべきである。投与経路は、経腸、局所、または非経口であり得る。そのため、投与経路は、静脈内、腹腔内、動脈内、および筋肉内が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口で投与される」という語句は、腸内および局所投与以外の投与様式を意味する。医薬組成物は、投与方法に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、坐剤、パッチ剤、点鼻剤、注射剤、植込み型徐放性製剤、脂質複合体などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はさらに、別の態様では、上記のように複数のミトコンドリア富化標的細胞を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、上記の医薬組成物は、障害を有するヒト対象のある特定の症状を治療する方法で使用するためのものである。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、活性成分、および任意選択で薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む製剤を指す。「活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は、「有効成分（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」を同義的に指すことができ、投与時に求められる効果を誘発することができる任意の薬剤を指すことを意味する。活性成分の例には、化合物、薬物、治療剤、小分子などが含まれるが、これらに限定されない。

「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、または賦形剤が、製剤の他の成分と適合する必要があり、そのレシピエントにも、製剤の活性成分の活性にも有害ではないことを意味する。薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤は、当技術分野において、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）において周知である。薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度ではレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン； 金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。担体の例には、リポソーム、ナノ粒子、軟膏、ミセル、マイクロスフェア、マイクロパーティクル、クリーム、エマルション、およびゲルが含まれるが、これらに限定されない。賦形剤の例には、ステアリン酸マグネシウムなどの付着防止剤、糖類およびそれらの誘導体（スクロース、乳糖、デンプン、セルロース、糖アルコールなど）などの結合剤、ゼラチンなどのタンパク質および合成ポリマー、タルクおよびシリカなどの滑沢剤、ならびに抗酸化剤、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、パルミチン酸レチニル、セレン、システイン、メチオニン、クエン酸、硫酸ナトリウム、およびパラベンなどの防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。希釈剤の例には、水、アルコール、生理食塩水、グリコール、鉱油、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、症状は、歩行能力障害、運動技能障害、言語技能障害、記憶障害、体重減少、悪液質、低血中アルカリホスファターゼレベル、低血中マグネシウムレベル、高血中クレアチニンレベル、低血中重炭酸塩レベル、低血中塩基過剰レベル、高尿中グルコース／クレアチニン比、高尿中塩化物／クレアチニン比、高尿中ナトリウム／クレアチニン比、高血中乳酸レベル、高尿中マグネシウム／クレアチニン比、高尿中カリウム／クレアチニン比、高尿中カルシウム／クレアチニン比、糖尿、マグネシウム尿、高血中尿素レベル、低Ｃ－ペプチドレベル、高ＨｂＡ１Ｃレベル、副甲状腺機能低下症、眼瞼下垂、聴力損失、心伝導障害、低ＡＴＰ含有量、およびリンパ球における酸素消費量、双極性障害、強迫性障害、うつ病性障害、ならびにパーソナリティ障害を含む気分障害からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。症状を「高い」および「低い」と定義することは、それぞれ「正常より検出可能に高い」および「正常より検出可能に低い」に対応し、正常レベルは、ミトコンドリア病に罹患していない複数の対象における対応するレベルであることを理解されたい。

ある特定の実施形態では、富化幹細胞は、特定の組織または器官に投与される。ある特定の実施形態では、富化幹細胞は、少なくとも１０^４個のミトコンドリア富化標的細胞を有する。

ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、非経口投与によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与、静脈内投与または静脈内注入によって投与される。ある特定の実施形態では、富化幹細胞は、少なくとも１０^５個のミトコンドリア富化標的細胞を有する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、少なくとも約１０^４個、少なくとも１０^４～少なくとも１０^８個、少なくとも１０^６～少なくとも１０^８個、少なくとも１０^５～少なくとも２×１０^７個、少なくとも１０^６～少なくとも５×１０^６個、または少なくとも１０^５個のミトコンドリア富化標的細胞を有する。

ある特定の実施形態では、幹細胞であり得るミトコンドリア富化標的細胞は、（ｉ）ミトコンドリア富化前の標的細胞におけるミトコンドリアＤＮＡ含有量と比較して、増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、（ｉｉ）ミトコンドリア富化前の標的細胞における酸素（Ｏ_２）消費率と比較して、増加した酸素（Ｏ_２）消費率、（ｉｉｉ）ミトコンドリア富化前の標的細胞におけるクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベルと比較して、増加したクエン酸シンターゼ含有量もしくは活性レベル、（ｉｖ）ミトコンドリア富化前の標的細胞におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率と比較して、増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｖ）より低いヘテロプラスミーレベル、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）の任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを有する。

ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、細胞タンパク質の総量の１０％～８０％、２０～７０％、４０～７０％、２０～４０％、または２０～３０％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の２０％～８０％である。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内画分の合わせた重量の２０％～８０％である。他の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内画分の合わせた重量の８０％を超える。

いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、標的細胞を、標的細胞を拡大増殖させることができる増殖培地中で当該幹細胞を培養することによって拡大増殖させることをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、ミトコンドリア富化標的細胞を、標的細胞を拡大増殖させることができる培養または増殖培地中で当該細胞を培養することによって拡大増殖させることをさらに含む。本出願を通して使用される場合、「培養または増殖培地」という用語は、細胞培養培地、細胞成長培地、細胞に栄養を提供する緩衝液などの流体培地である。

ある特定の実施形態では、標的細胞は、障害に罹患している対象に対して同種異系である。「対象に対して同種異系」という用語は、患者の細胞に対してＨＬＡ適合であるか、または少なくとも部分的にＨＬＡ適合である幹細胞またはミトコンドリアを指す。ある特定の実施形態によれば、ドナーは、特定のミトコンドリアＤＮＡハプログループの特定により対象に適合される。ある特定の実施形態では、対象は、幹細胞および／またはミトコンドリアの供給源である。

本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ適合」という用語は、対象および標的細胞のドナーが、少なくとも対象がドナーの標的細胞に対する急性免疫応答を発症しない程度まで可能な限り厳密にＨＬＡ適合であるようにという所望を指す。かかる免疫応答の予防および／または治療は、免疫抑制剤の急性的または慢性的使用により達成されても、それによらずに達成されてもよい。ある特定の実施形態では、ドナーからの幹細胞は、患者が幹細胞を拒絶しない程度まで患者に対してＨＬＡ適合である。

ある特定の実施形態では、患者は、幹細胞移植片の免疫拒絶を防ぐために免疫抑制療法によってさらに治療される。

本明細書で使用される場合、「ハプログループ」という用語は、母系で共通の祖先を共有する人々の遺伝的集団群を指す。ミトコンドリアハプログループは、シーケンシングによって決定される。

ある特定の実施形態では、ミトコンドリアは、同一のハプログループからである。他の実施形態では、ミトコンドリアは、異なるハプログループからである。

ある特定の実施形態では、上記の方法は、医薬組成物の投与の前に、対象に移植前コンディショニング剤を投与する先行ステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、「移植前コンディショニング剤」という用語は、ヒト対象の骨髄内の骨髄細胞を殺傷することができる任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、移植前コンディショニング剤はブスルファンである。

ある特定の実施形態によれば、単離されたミトコンドリアは、対象の障害に従って、特定のミトコンドリアハプログループから選択されるドナーから単離される。

リンパ球欠乏症は、対象が異常に低レベルのリンパ球にある状態である。対象は、Ｔリンパ球減少症、Ｂリンパ球減少症、またはＮＫリンパ球減少症に罹患している可能性がある。リンパ球欠乏症は、コルチコステロイドの使用；ウイルス、微生物および真菌感染症；栄養不良、過度の身体運動、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、サルコイドーシス、および多発性硬化症と関連している。

リンパ球欠乏症関連疾患または障害は、対象が異常に低レベルのリンパ球を有する任意の疾患または障害である。リンパ球欠乏症関連疾患または障害の例としては、ウイルス、微生物および真菌感染症；全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、サルコイドーシス、および多発性硬化症が挙げられる。

一実施形態では、本発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を、単離された外因性ミトコンドリアとともに、単離された外因性ミトコンドリアがＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、対象に（ａ）からのＨＳＣを投与することとを含む、対象における１つのリンパ球欠乏症関連疾患または複数のリンパ球欠乏症関連疾患の衰弱作用を軽減するための方法を提供する。ある特定の態様では、ＨＳＣは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。様々な態様では、ＨＳＣは、対象に投与する前に洗浄される。

骨髄または造血幹細胞移植の前に、対象は、基礎疾患を排除し、新しい細胞の拒絶を防止するためのコンディショニングプロセスを経てもよい。コンディショニングレジメンは、化学療法剤および／または全身照射の投与を含む。

本明細書で使用される場合、「コンディショニングされた対象（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、骨髄またはＨＳＣ移植を受けることになり、化学療法剤および／または全身照射の投与を伴うコンディショニング治療を受けた対象を指す。

本明細書で使用される場合、「コンディショニングされていない対象」（ｎｏｎ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｓｕｂｊｅｃｔ）という用語は、骨髄またはＨＳＣ移植を受けることになり、化学療法剤および／または全身照射の投与を伴うコンディショニング治療を受けていない対象を指す。

追加の態様では、本発明は、対象における造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を改善するための方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を、単離された外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、このＨＳＣを対象に投与することとを含む、方法を提供する。ある特定の態様では、ＨＳＣは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。様々な態様では、ＨＳＣは、対象に投与する前に洗浄される。

一実施形態では、本発明は、疾患または障害を治療する方法であって、外因性ミトコンドリアが細胞に入るのを可能にする条件下で細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化細胞を産生することと、目的の遺伝子を有するウイルスベクターをミトコンドリア富化細胞に形質導入することと、ミトコンドリア富化形質導入細胞を対象に投与することとによる、方法を提供する。一実施形態では、本発明は、疾患または障害を治療する方法であって、目的の遺伝子を有するウイルスベクターを細胞に形質導入することと、形質導入細胞を、外因性ミトコンドリアに、外因性ミトコンドリアが細胞に入るのを可能にする条件下で接触させることによって、ミトコンドリア富化細胞を産生することと、ミトコンドリア富化形質導入細胞を対象に投与することとによる、方法を提供する。一態様では、細胞は、幹細胞である。ある特定の態様では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または免疫不全細胞である。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。追加の態様では、ミトコンドリア富化形質導入細胞の投与は、非増強細胞と比較して、Ｂ細胞の数を増加させる。ある特定の態様では、Ｂ細胞は、プレＢ細胞またはプロＢ細胞である。さらなる態様では、ミトコンドリア富化形質導入細胞の投与は、非増強細胞と比較して、ＩｇＭ陽性細胞の数を増加させる。一実施形態では、ミトコンドリア富化は、形質導入細胞の数を増加させる。

遺伝子療法技術は、遺伝子改変自家造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植に基づく。遺伝子療法は、疾患を治療または予防するために遺伝子を使用する。最も一般的な形態の遺伝子療法は、異常な遺伝子を置き換えるために正常な遺伝子を挿入することを含む。他のアプローチとしては、異常遺伝子を正常なものと交換すること、異常遺伝子を修復すること、および遺伝子がオンまたはオフにされる程度を変更することが挙げられる。幹細胞遺伝子療法は、比較的少数の幹細胞の遺伝子改変に基づいている。これらは自己再生を経ることによって体内に長期間存続し、遺伝的に「修正された」子孫を大量に生み出す。ＨＳＣは、遺伝子改変が分化するにつれてすべての血液細胞系統に渡されるため、遺伝子療法に特に魅力的な標的である。

ＨＳＣおよびその子孫の効率的な長期的な遺伝子改変には、ＨＳＣ機能に影響を与えることなく、ゲノムへの修正ＤＮＡの安定的な組込みを可能にする技術が必要である。したがって、ｙ－レトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスなどの組込み組換えウイルスシステムの使用が、この分野を支配している（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４４５－４５６）。治療効果は、アデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、Ａｉｕｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０：４４７－４５８）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ－Ｘ１、Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３： ３５５－３６４）およびウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ、Ｂｏｚｔｕｇ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：１９１８－１９２７）のｙ－レトロウイルスベースの臨床試験ですでに達成されている。加えて、レンチウイルスは、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィーの治療において（ＡＬＤ；Ｃａｒｔｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：８１８－８２３）、ならびに異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ；Ｂｉｆｆｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４１：１２３３１５８）、およびＷＡＳ（Ａｉｕｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：１２３３１５１）のために、送達ビヒクルとして用いられている。

ベクターは、発現カセットおよび／または導入遺伝子を細胞のゲノムに組み込むベクターの能力を指す、組込みベクターまたは非組込みベクターであり得る。組込みベクターまたは非組込みベクターのいずれかを使用して、調節要素に作動可能に連結された遺伝子を含有する発現カセットを送達することができる。ベクターの例としては、（ａ）線状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドを含む核酸ベクター等の非ウイルスベクター、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、および細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）等の人工染色体、エピソームベクター、トランスポゾン（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）、ならびに（ｂ）レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびＡＡＶベクター等のウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは、特定の標的細胞または組織に対する高い感染性および／またはトロピシズムを含む、核酸の送達に関していくつかの利点を有する。場合によっては、ウイルスは、本明細書に記載のように、遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の調節要素を含む核酸分子または発現カセットを送達するために使用される。

発現ベクターは、目的のポリヌクレオチドの転写を制御するための調節要素を含むことができる。調節要素の非限定的な例としては、プロモーター、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、配列内リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、またはイントロンが挙げられる。かかる要素は、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率等に影響を与えることによって発現を増加させる場合があるが、必要ではない場合もある。かかる要素は、細胞における核酸の最適な発現を得るために、所望に応じて核酸構築物に含めることができる。ベクターには、他の要素も含めることもできる。例えば、ベクターは、コードされたポリペプチドが特定の細胞位置に向けられるように、シグナルペプチドをコードする核酸（例えば、タンパク質を細胞によって分泌させるシグナル分泌配列）、または選択可能なマーカーをコードする核酸を含むことができる。選択可能なマーカーの非限定的な例には、ピューロマイシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。かかるマーカーは、培養物中の安定した形質転換体を選択するのに有用である。調節配列は、一般に、哺乳類、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来し得る。通常は複製起点により付与される宿主における複製能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子。当業者は、かかるベクターに含まれる好適な調節領域を選択することができる。

ベクターは、ゲノムに組み込まれるベクター、または宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ得る「組込み型ベクター」であることができ、またはエピソームベクター、例えば、染色体外複製が可能な核酸であり得る。それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書では、「発現ベクター」と称される。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、およびウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（ウイルスおよび非ウイルスベクターの概説に関するＫａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２７４４－１２７４６（１９９７）を参照されたい）。ウイルスベクターは、改変されて、ウイルス本来のトロピズムおよび病原性が変更または除去されている。ウイルスのゲノムはまた、その感染性を高め、目的のポリペプチドをコードする核酸のパッケージングに適合させるように改変することもできる。

「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその派生物を指すように使用され得る。この用語は、別段必要とされる場合以外、すべての血清型、亜型、ならびに天然型および組換え型の両方の形態をカバーする。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈｌＯ、およびそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む。

遺伝子療法における「レンチウイルスベクター」の使用は、レンチウイルスを使用して生物において遺伝子を挿入、改変、または欠失させることができる方法を指す。レンチウイルスは、宿主細胞のゲノムにＤＮＡを挿入することによって感染するウイルスのファミリーである。かかるウイルスの多くは、遺伝子療法におけるウイルスを使用した研究の基礎となってきたが、レンチウイルスは、非分裂細胞に感染する能力が独特であり、したがって、より広い範囲の潜在的応用を有する。レンチウイルスは、内因性（ＥＲＶ）となり、それらのゲノムを宿主生殖細胞系ゲノムに組み込むことができ、その結果、ウイルスが宿主の子孫によって継承される。遺伝子療法に有効であるためには、宿主細胞遺伝子の挿入、変更、および／または除去が行われなければならない。これを行うために、科学者らはレンチウイルス感染の機構を使用して、遺伝子療法の所望の結果を達成する。遺伝子療法に使用することができる非限定的な例またはレンチウイルスとしては、ウシ免疫不全ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒト免疫不全ウイルス２、ジェンブラナ病ウイルス、ピューマレンチウイルス、サル免疫不全ウイルスまたはビスナ・マエディウイルスに由来するものが挙げられる。

レトロウイルスおよびレンチウイルスベースベクターの使用に加えて、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの他のウイルスに由来するベクターも、造血幹細胞および前駆細胞の改変に利用され得る。

当業者に既知のように、遺伝子改変は、部位特異的エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡ内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによって、標的遺伝子編集によって達成され得る（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ））。

別の実施形態では、遺伝子療法は、遺伝子発現を増大させるために使用することができる。いくつかの実施形態によれば、増強形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、増加した増殖を提供する。いくつかの実施形態によれば、増強形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、分化が増加する。別の態様では、ミトコンドリアによって増強された形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して増加した遺伝子発現を有する。いくつかの実施形態によれば、増強形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、導入遺伝子を発現する細胞の数が増加している。

さらなる実施形態では、本発明は、対象における造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を改善するための方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を、単離された外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、ＨＳＣを対象に投与することとを含む、方法を提供する。一態様では、ＨＳＣは、遺伝子改変されている。追加の態様では、対象は、原発性免疫不全症（例えば、ウィスコット・アルドリッチ症候群、白血球粘着不全症、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、慢性肉芽腫性疾患）、ヘモグロビン異常症（例えば、鎌状赤血球症、ベータサラセミア）、貯蔵および代謝障害（例えば、ゴーシェ病および他の脂質代謝異常、ムコ多糖症（Ｉ－ＶＩＩ）、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、大理石骨病）、先天性血球減少症および幹細胞欠損症（例えば、ファンコニ貧血、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、コストマン症候群）から選択される疾患または障害を有する。さらなる態様では、リソソーム蓄積症は、ゴーシェ病Ｉ型である。ある特定の態様では、ＨＳＣは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。様々な態様では、ＨＳＣは、対象に投与する前に洗浄される。

一実施形態では、本発明は、対象における免疫不全または免疫関連疾患を治療するための方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を、外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、ＨＳＣを対象に投与することとによる、方法を提供する。ある特定の態様では、ＨＳＣは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。一態様では、ＨＳＣは、インビトロで拡大増殖される。追加の態様では、ＨＳＣは、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。さらなる態様では、ＨＳＣは、インビトロでの拡大増殖の前または後に、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。ある特定の態様では、ＨＳＣは、外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前または後に、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている。追加の態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件は、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含み得る。

本明細書で使用される場合、「治療」および「治療すること」という用語は、１）診断された病的状態もしくは障害の治癒、緩徐化、症状の軽減、および／または進行の停止する治療的処置および手段、ならびに２）ならびに予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指す。治療を必要とする個体には、既に特定の医学的障害を有する個体、ならびに最終的にその障害を獲得し得る個体（すなわち、予防措置を必要とする個体）が含まれ得る。

免疫関連疾患は、免疫系に影響を与える疾患である。かかる疾患および障害は、自己免疫疾患および免疫不全疾患および障害を含む。自己免疫疾患は、免疫系が正常な体組織を攻撃する抗体を産生させる疾患である。自己免疫疾患の例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スプルー皮膚炎、慢性疲労性免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎（Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ－Ｆｉｂｒｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、グレーブス病、ギランバレー（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒ）、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、 サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、 潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑症、ウェゲナー肉芽腫症および重症筋無力症が含まれる。

免疫不全疾患および障害は、身体に侵入または攻撃する外来または異常な細胞（細菌、ウイルス、真菌、およびがん細胞など）から身体を防御する免疫系の能力を損なう。結果として、異常な細菌感染症、ウイルス感染症、もしくは真菌感染症、またはリンパ腫もしくは他のがんが発症する可能性がある。免疫不全障害には原発性および続発性の２つのタイプが存在する。原発性免疫不全障害は通常、出生時に存在し、通常遺伝性である遺伝性障害である。これらは通常、乳児期または幼児期に顕著になる。しかしながら、いくつかの原発性免疫不全障害（分類不能型免疫不全症など）は、成人になるまで認識されない。一般的な原発性免疫不全障害の例としては、ウィスコット・アルドリッチ症候群、重症複合免疫不全疾患（ＳＣＩＤ）、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症（Ａｔａｘｉａ－ｔｅｌａｎｇｅｃｔａｓｉａ）、慢性肉芽腫性疾患、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、補体欠損症および選択的ＩｇＡ欠損症が挙げられる。

続発性免疫不全障害は、一般に、晩年に発症し、しばしば、特定の薬物の使用、または糖尿病もしくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症などの別の障害に起因する。これらは、原発性免疫不全障害よりも一般的である。一般的な続発性免疫不全障害の例としては、ＨＩＶ、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられる。

以下の実施例は、本発明のより完全な理解を提供するために提示される。本発明の原理を例示するために記載された特定の技術、条件、材料、割合、および報告されたデータは、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１
マウスモデルへの富化幹細胞の移植
ミトコンドリアを、健康なヒトドナーの血液から単離した。ミトコンドリアを－８０℃で凍結させた。ＣＤ３４＋細胞は、ピアソン症候群を有する対象の凍結および解凍された臍帯血細胞（ＵＢＣ）から単離された。この対象は、ｍｔＤＮＡの８，４７０～１３，４４７位置にある４，９７７ヌクレオチドの欠失と診断された。ミトコンドリアを解凍した後、対象のＣＤ３４＋細胞を１×１０^６個の細胞当たり０．８８ｍＵのヒトミトコンドリアとともに２２時間インキュベートした。その後、培地を除去し、細胞を洗浄し、４．５％ＨＳＡに再懸濁した。配列解析を使用して、細胞中のヒトミトコンドリアの存在を特定することによって、増強を検証した。その後、増強された細胞を３週齢のＮＳＧＳマウスにＩ．Ｖ．注射した（マウス当たり５０Ｋ細胞）。

３群のマウスを試験した。ＭＡＴ群：ヒト増強ＣＤ３４＋細胞、５０Ｋ細胞／１５０μｌを移植したＮＳＧＳマウス。対照群：ヒトＣＤ３４＋細胞、５０Ｋ細胞／１５０ｕｌを移植したＮＳＧＳマウス。ナイーブ群：ナイーブマウス。

移植の２か月後：
ＭＡＴ群から３匹、対照群から３匹のマウスを屠殺した。末梢血（ＰＢ）を採取し、大腿骨および脛骨から骨髄（ＢＭ）細胞を単離した。ヒト内因性および外因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）のコピー数を決定するために、ＤＮＡをＢＭおよびＰＢから単離し、ｄＰＣＲを使用して解析した。

造血細胞の亜集団に対するＣＤ３４＋細胞の分化を決定するために、末梢血およびＢＭ試料をフローサイトメトリーで解析した。ＣＤ４５抗原が、末梢血中のリンパ球、単球、顆粒球、好酸球、および好塩基球を含むすべてのヒト白血球に存在するため、最初にヒトＣＤ４５＋細胞の％を決定した。その後、ＣＤ４５＋細胞をさらに、ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋（骨髄系統）、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋（Ｂ細胞）、ＣＤ４５＋ＣＤ１４＋（単球）の亜集団に分けた。

さらに、フローサイトメトリー解析を使用して、ｍＣＤ４５細胞対ｈＣＤ４５細胞の％を決定した。

結果ＢＭ：処置の２か月後の、ＭＡＴ群と対照群との間のＢＭの結果を図１に示す。

結果ＰＢ：ＰＢ ｄＰＣＲ：対照群とＭＡＴ群との間の、ＰＢ中のヒトミトコンドリアコピー数、ヒト細胞数およびｍｔＤＮＡコピーの結果を図２に示す。末梢血において、細胞当たりの総（外因性＋内因性）ｍｔＤＮＡコピーの有意な増加が観察された。

移植の６か月後：
各群のマウスおよびナイーブマウスを屠殺した。内因性および外因性ヒトｍｔＤＮＡのレベルを測定するため、ＤＮＡをＢＭおよび末梢血から単離し、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）を使用して解析した。

結果ＢＭ：ＢＭ ｄＰＣＲは、対照群（非増強ヒト細胞を含むマウス）、ＭＡＴ群（ミトコンドリア増強ヒト細胞を移植したマウス）、ＮＴＣ（「テンプレートなし」）、ナイーブ群（処置なし）のＤＮＡ １ｎｇ当たりの外因性ミトコンドリアコピー数を示した。使用されるＳＮＰアッセイは、内因性ヒトｍｔＤＮＡと外因性ヒトｍｔＤＮＡの２つの対立遺伝子（ｍｔＤＮＡの１０８３１位のＧ／Ａ）を区別する単一のヌクレオチド変異に基づくため、特定の対立遺伝子に対する選択性は完全ではなく、したがって、対照群において偽陽性結果も明らかになった。それにもかかわらず、ＭＡＴマウスに由来するＢＭ細胞は、ＤＮＡ １ｎｇ当たりの外因性ミトコンドリアコピー数が有意に多く、これは、ＭＡＴ細胞の生着の増加およびおそらく細胞増殖の増加を示した。（図３、右の棒グラフ）。

ＢＭフローサイトメトリーの結果：移植の６か月後、ＭＡＴマウスに由来するＢＭ細胞は、対照マウスに由来するＢＭ細胞と比較して、有意に高いレベルのＣＤ４５＋ヒト細胞を含んでいた。ＭＡＴマウスにおけるＣＤ４５＋細胞の増加は、生着の増加、ホーミングの改善、細胞増殖の増加、細胞生存率の増加、または細胞アポトーシスの減少を示す。ヒトＣＤ４５＋細胞は、これらの亜集団への分化についてさらに解析された。ＣＤ４５＋細胞亜集団には、ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ１４＋細胞（マクロファージ）、ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）、ＣＤ３３＋細胞（骨髄系細胞）が含まれた。

ＭＡＴマウスは、対照と比較して異なる細胞分化パターンを有した。ＭＡＴマウスは、フローサイトメトリー分析に見られるように、より高い％のＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）およびより低い％のＣＤ３３＋細胞を有し、対照マウスは、より高い％のＣＤ３３＋細胞およびより低い％のＣＤ３＋細胞を有した。ＭＡＴマウスはまた、対照マウスと比較して高いＣＤ１９＋細胞％を有した。これらの結果は、骨髄系細胞からリンパ系細胞への移行を示している（図４および表３）。

実施例２
対象のリンパ球欠乏症の処置／リンパ球集団の増加
１つのリンパ球欠乏症関連疾患または複数のリンパ球欠乏症関連疾患に罹患している対象におけるリンパ球欠乏の衰弱作用を軽減するための方法のステップは、（１）自家または同種異系造血幹細胞を得ること、（２）ドナーの細胞からミトコンドリアを単離すること（外因性ミトコンドリアの単離は、このプロセスの前に実行することができ、ミトコンドリアを－８０℃（少なくとも）で凍結させて保存し、使用前に解凍する）、（３）ＨＳＣを、単離された外因性ミトコンドリアとともにインキュベーションすること、（４）骨髄細胞を洗浄すること、および（５）ミトコンドリアについて富化されたＨＳＣを対象に注入することである。全期間を通して、患者血球数および生化学的血液マーカーの変化を評価する。

実施例３
骨髄移植を改善するためのミトコンドリア増強療法
生着を改善し、したがって、コンディショニングされた患者またはコンディショニングされていない患者の細胞移植を改善するために、細胞は患者への移植前にミトコンドリア増強を受ける。造血幹細胞移植を必要とする対象における造血幹細胞移植を改善する方法は、（１）対象またはドナーから造血幹細胞（ＨＳＣ）を得ることと、（２）ドナーの細胞からミトコンドリアを単離することと（ミトコンドリアの単離は、このプロセスの前に実行することができ、ミトコンドリアを－８０℃（少なくとも）で凍結させて保存し、使用前に解凍する）、（３）ＨＳＣを、単離された外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることと、（４）骨髄細胞を洗浄することと、（５）ミトコンドリアについて富化されたＨＳＣを対象に投与することとを含む。ＨＳＣは、自家または同種異系造血幹細胞であり得る。

実施例４
遺伝子療法を改善するためのミトコンドリア増強療法
ＨＳＣおよびその子孫の効率的な長期的な遺伝子改変には、ＨＳＣ機能に影響を与えることなく、ゲノムへの修正ＤＮＡの安定的な組込みを可能にする技術が必要である。したがって、ｙ－レトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスなどの組込み組換えウイルスシステムの使用が、この分野を支配している（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４４５－４５６）。治療効果は、アデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、Ａｉｕｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０：４４７－４５８）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ－Ｘ１、Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：３５５－３６４）およびウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ、Ｂｏｚｔｕｇ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：１９１８－１９２７）のｙ－レトロウイルスベースの臨床試験ですでに達成されている。加えて、レンチウイルスは、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィーの処置における（ＡＬＤ；Ｃａｒｔｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：８１８－８２３）、ならびに異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ；Ｂｉｆｆｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４１：１２３３１５８）、およびＷＡＳ（Ａｉｕｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：１２３３１５１）ための送達ビヒクルとして用いられている。

クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ））／ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的とされたＤＮＡ配列に相補的なスペーサー配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、Ｃａｓ９酵素など）をゲノム標的に誘導する、迅速なゲノム操作のための強力なツールである。結合すると、Ｃａｓ９は、二本鎖ＤＮＡ切断を作製する。ＤＮＡ修復機構、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）を利用して、遺伝子挿入および欠失を導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および哺乳動物細胞などの様々な種で実施されている。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の他の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４が含まれる。

ＣＲＩＳＰＲシステムの要素（例えば、直接反復、相同組換え編集テンプレート、ガイド配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、標的配列、プライミング部位、調節要素、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、当業者に周知である。すなわち、標的配列を与えられた場合、当業者は、特定の標的配列に特異的な機能的ＣＲＩＳＰＲ要素を設計することができる。本明細書に記載される方法は、特定のＣＲＩＳＰＲ要素の使用に限定されない。

レトロウイルスおよびレンチウイルスベースベクターの使用に加えて、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの他のウイルスに由来するベクターも、造血幹細胞および前駆細胞の改変に利用され得る。

遺伝子療法（例えば、ゴーシェ病Ｉ型原発性免疫不全などのライソソーム蓄積障害）で使用されることが意図される細胞の生着を高めるために、細胞は、単離された外因性ミトコンドリアによって増強を受ける。細胞は、遺伝子療法のためのＨＳＣを遺伝子改変する前、改変中、または改変後に増強を受け得る。対象における細胞の生着を高める方法は、（１）対象またはドナーから造血幹細胞（ＨＳＣ）を得ることと、（２）ドナーの細胞からミトコンドリアを単離することと（ミトコンドリアの単離は、このプロセスの前に実行することができ、ミトコンドリアを－８０℃（少なくとも）で凍結させて保存し、使用前に解凍する）、（３）ＨＳＣを、単離された外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることと、（４）骨髄細胞を洗浄することと、（５）ミトコンドリアについて富化されたＨＳＣを対象に投与することとを含む。ＨＳＣは、自家または同種異系造血幹細胞であり得る。

実施例５
ミトコンドリア増強後のミトコンドリア機能障害マウスモデルにおける外因性ミトコンドリアの継続的移行
疾患を有する動物モデルにおいて、生体内分布を評価するために、および増強されたＨＳＰＣまたはその子孫が、ミトコンドリアをインビボで他の細胞に移行させることができるかどうかを評価するために、遺伝子標識された細胞を、ミトコンドリア機能不全のマウスモデル（ＰｏｌＧマウス）に注入した。

ミトコンドリア増強骨髄細胞、またはそれらが保有するミトコンドリアが静脈内注入後にどこに戻るかを追跡するのに役立つ新しいマウスインビボシステムを使用した。すべての細胞核を赤色蛍光（ｄＴｏｍａｔｏ）で標識し、すべてのミトコンドリアを緑色蛍光（タンパク質Ｃｏｘ８－Ｄｅｎｄｒａ）で標識し、ここでは「赤緑色」細胞と呼ばれる、ＲＯＳＡ^{ｎＴ－ｎＧ}／ＰｈＡＭ^切除マウスモデルを使用した。増強は、ＲＯＳＡ^{ｎＴ－ｎＧ}／ＰｈＡＭ^切除マウスから単離された「緑色」ミトコンドリアで行った。

ＨＳＰＣおよび外因性ミトコンドリアの分布または持続性は、生物ストレスによって影響され得るため、ＰｏｌｇＤ^２５７Ａ変異がミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼの校正機能を損ない、ｍｔＤＮＡ変異の蓄積および欠失をもたらす、Ｐｏｌｇマウスモデルを使用した。ＰｏｌＧマウスモデルを、増強された赤緑色ＨＳＰＣで処置して、ミトコンドリア増強細胞およびそのミトコンドリアのインビボ生体内分布を評価した。

ＲＯＳＡｎＴ^－ｎＧ／ＰｈＡＭ^切除マウスに由来する赤色標識核（ｄＴｏｍａｔｏ）および緑色標識ミトコンドリア（Ｄｅｎｄｒａ）を遍在的に発現する系統陰性細胞（Ｌｉｎ^－）を、ＲＯＳＡｎＴ^－ｎＧ／ＰｈＡＭ^切除マウスの肝臓細胞から単離されたＤｅｎｄｒａミトコンドリアによって増強し、投与時２５～２８週齢（雄）および３０～３５週齢（雌）のＰｏｌｇマウスに注射した。

増強レベルを、ＭＡＴ後の細胞におけるｍｔ－ＤＮＡにコードされたチトクロームｃオキシダーゼ１（ＣＯＸ－１）のタンパク質レベルで測定した。ＣＯＸ－１値は、ヤヌスグリーンによって評価されるように、非処置細胞および細胞数に対して正規化された。

レシピエントＰｏｌＧマウスでは、３つの細胞型が識別できる可能性がある：１）注入細胞またはその子孫に由来する赤緑色細胞、２）ＰｏｌＧレシピエントに由来する非蛍光細胞、および３）レシピエントＰｏｌＧ細胞へのミトコンドリア移行の証拠を提供する緑色のみの細胞。

注射の１２時間、１週間、および４．５か月後に、血液を採取し、ＢＭを抽出し、ＰＢおよびＢＭの両方をフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡によって解析した。

注入されたＨＳＰＣから末梢血中の内因性細胞への外因性ミトコンドリアの長期持続性および継続的移行が実証された。図５Ａ～Ｂは、ＰＢ内のＣＤ４５^＋細胞サブセットの頻度を示す。ｄＴｏｍａｔｏ^＋Ｄｅｎｄｒａ^＋の割合は、注射後１２時間で０．００１５％から４．５ｍで０．３７％に経時的に増加した。同様に、ミトコンドリア移行が生じたｄＴｏｍａｔｏ^－Ｄｅｎｄｒａ^＋細胞の割合は、０．００１５％から７．３％に増加した。ミトコンドリアＣｏｘ８－Ｄｅｎｄｒａ２タンパク質は、ＲＯＳＡ^{ｎＴ－ｎＧ}／ＰｈＡＭ^切除核ゲノムによってのみコードされ、したがって、Ｐｏｌｇレシピエント細胞に一過性に渡されるので、末梢血中のｄＴｏｍａｔｏ^－Ｄｅｎｄｒａ^＋細胞の一貫した存在は、注入された細胞またはその子孫に由来する外因性ミトコンドリアの継続的な移行の証拠である。

レシピエント細胞に移行した外因性ミトコンドリアの相対レベルを決定するために、末梢血細胞をＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ－ｒｅｄで染色した。赤緑色細胞に対するミトコンドリアを受容した細胞（緑色細胞）における、外因性ミトコンドリア対全ミトコンドリアの比率の変化倍率を測定した。

外因性ミトコンドリアは、１か月で全細胞ミトコンドリア含有量の８．４％、４．５か月で６．１％であることが実証された。（図６）。

緑色のミトコンドリアを含む細胞は、ＭＡＴの４．５か月後にマウス腎臓でも見出された。

緑色のミトコンドリアがレシピエントＰｏｌＧ細胞内に存在していたため、このデータは、外因性ミトコンドリアの持続性および継続的移行が存在することを示唆する。重要なことに、Ｃｏｘ８－Ｄｅｎｄｒａタンパク質の半減期によって制限されるため、これは外因性ミトコンドリア含有量の下限である。

実施例６
ミトコンドリアは、様々な造血細胞型に移行する
フローサイトメトリーを使用して、造血細胞型を試験して、どの細胞型が細胞内ミトコンドリア移行のレシピエントであるかを決定した。ＰＢにおける主要な免疫細胞サブセットの分布は、１ｍおよび４．５ｍの時点で、総ＣＤ４５^＋およびＣＤ４５^＋ｄＴｏｍａｔｏ－Ｄｅｎｄｒａ^＋集団の両方において、評価された（図７）。

４．５ｍの時点で、外因性ミトコンドリアを取り込む骨髄系集団がさらに特徴付けられ、単球（Ｌｙ６Ｃ^高Ｌｙ６Ｇ^－）および好中球（Ｌｙ６Ｃ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋）の両方がミトコンドリアを取り込むことが実証された（図８）。

骨髄系細胞集団は、優先的に外因性ミトコンドリアを取り込んだが、多数の細胞型（Ｔ細胞およびＢ細胞を含む）が、すべてミトコンドリアを取り込むことが実証された。

データは、注入されたＨＳＰＣに由来する外因性ミトコンドリアが、末梢血中に存在する様々な造血細胞型に継続的に移行することを実証している。さらに、遠隔組織に外因性ミトコンドリアを保有する細胞の証拠は、外因性ミトコンドリアが免疫細胞だけでなく、非造血組織にも存在することを示唆している。

要約すると、注入されたＨＳＰＣからのミトコンドリアは、ＭＡＴ処置後少なくとも４．５か月にわたって末梢血中および遠位組織中の追加の造血細胞に移行することができることが実証された。

実施例７
ミトコンドリア増強後の細胞機能の評価
ＰｏｌＧマウスの末梢血中のＣＤ１１ｂ^＋骨髄系細胞は、ｄＴｏｍａｔｏ^＋Ｄｅｎｄｒａ^＋細胞から外因性ミトコンドリアを取り込むことが観察されている。したがって、外因性ミトコンドリアを含むＣＤ１１ｂ^＋骨髄系細胞の活性レベルをさらに評価する。

ｄＴｏｍａｔｏ^＋Ｄｅｎｄｒａ^＋系統陰性細胞を、室温で２１時間ＲＯＳＡ^{ｎＴ－ｎＧ}／ＰｈＡＭ^切除マウスの肝臓から単離したＤｅｎｄｒａ２^＋ミトコンドリアによって増強し、ＰｏｌＧマウスにＩＶ注射した。

末梢血（ＰＢ）を、非処置ＰｏｌＧマウスおよび処置の１週間、１か月、３か月、および４．５か月後の処置マウスから抽出する。抽出されたＰＢは、ＦＡＣＳによって骨髄系細胞について選別される。非処置またはビヒクル対照処置マウスから抽出した骨髄系細胞を、以下のアッセイにおいて対照として使用する。

処置マウスおよび対照マウスの骨髄系細胞の活性の違いを評価するために、細胞に対してＲＮＡｓｅｑを行い、骨髄系細胞のトランスクリプトームの変化を評価する。同様に、ＲＮＡＳｅｑは、細胞表面マーカーによって、または単一の細胞ＲＮＡＳｅｑによって選別された特定の骨髄系細胞亜集団（好中球、好酸球、単球など）に対して行われる。加えて、骨髄系細胞または骨髄系細胞亜集団活性レベルは、サイトカイン発現；ＡＴＰレベル、ＣＳ活性、ミトコンドリア膜電位を含む代謝活性およびミトコンドリア活性；または単球からマクロファージへの分化、食作用アッセイ、誘導物質への応答、およびネトーシス（ＮＥＴｏｓｉｓ）アッセイなどの細胞特異的な機能活性評価を含むがこれらに限定されない細胞ベースのアッセイにおいて評価される。

骨髄系細胞亜集団に対する増強の効果は、ナイーブおよびミトコンドリア増強マウスまたはヒトＰＢＭＣから単離された骨髄系細胞を使用して、上記のアッセイでさらに評価することができる。

ミトコンドリアを受容した骨髄前駆体細胞は、増殖、分化および／または活性が増加し、全血骨髄系細胞および骨髄系亜集団の出現の増加をもたらすことが予想される。加えて、血液骨髄系細胞が、ミトコンドリア増強後のミトコンドリア取り込みによってプライミングされ、より堅牢な機能をもたらす（例えば、病原体またはマクロファージ食作用に応答した好中球ネトーシス）。

実施例８
免疫不全細胞および遺伝子療法に対する増強の効果
Ｂ細胞の発達進行は、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）の集合、発現、およびシグナル伝達につながる一連の事象によって導かれる。重（Ｈ）鎖免疫グロブリン遺伝子および軽（Ｌ）鎖免疫グロブリン遺伝子は、プロＢおよびプレＢ段階（それぞれ）で再編成され、完全な表面ＩｇＭは、未熟段階で発現される。さらなる発達進行および成熟は、ナイーブＢ細胞の免疫能のあるコレクションを提供する。ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子は、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達経路の重要な構成要素であり、Ｂ細胞の発達、生存、および活性化に重要な役割を果たす。ＢＴＫの発現はＢ細胞に限定されず、ＢＴＫは、マクロファージおよび好中球を含む骨髄系統の細胞でも発現される。Ｘ連鎖欠損（Ｘｉｄ）マウスは、ＢＴＫ遺伝子に自然突然変異を有する。Ｂ細胞の発達が損なわれたＸｉｄマウスは、ヒトＸ連鎖免疫不全疾患のモデルとして使用される。例えば、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子の変異に起因する遺伝子疾患であるＸ結合型アガマグロブリン血症（ＸＬＡ）。これらの変異は、Ｂリンパ球の成熟の不全、血清免疫グロブリンレベルの低下、特異的抗体産生の不全、ならびに他の免疫シグナルの交代をもたらす。

これらの実験は、免疫不全細胞および遺伝子療法に対する増強の効果を決定する。これは、増強されかつＢＴＫ遺伝子を形質導入した免疫不全細胞のＢ細胞発達を試験することによって行われた。

Ｌｉｎ－細胞はＸｉｄマウスの骨髄から単離された。細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス胎盤（１×１０^６個の細胞当たり４．４ｍＵのＣＳ活性）に由来するミトコンドリアとともにまたはなしで２１時間インキュベートした。インキュベーション後、増強細胞および非増強細胞の、同数の細胞に、非形質導入またはＮＴＸ１０９もしくはＮＴＸ１０１レンチウイルス構築物のいずれかを形質導入した。各構築物は、ＢＴＫプロモーター－ＢＴＫ導入遺伝子－Ａ２－ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を含むカセットを含んでいた。表５は、試験した群を示す。

形質導入の２２時間後、細胞を洗浄し、回収のためにプレーティングした。２～１３日目に、ＩＬ７の存在下で細胞を増殖させるなど、Ｂ細胞増殖と分化を誘導する条件下で細胞を増殖させた。１３日目に、細胞を、ＬＰＳ／ＣｐＧで誘導して、Ｂ細胞を成熟させ、細胞がＢ２２０およびＩｇＭを発現する細胞に分化することを可能にした。１３日目および１７日目に、フローサイトメトリーを使用して細胞を解析し、絶対細胞数およびＢ細胞亜集団を決定した。実験スキームを図９に示す。

１３日目に、それぞれの非増強ＮＴＸ１０１細胞および非増強ＮＴＸ１０９細胞と比較して、増強ＮＴＸ１０１細胞および増強ＮＴＸ１０９細胞において、それぞれ、絶対細胞数の１１．４倍および５倍の増加が観察された。加えて、増強ＮＴＸ１０９細胞の細胞数は、ＷＴ細胞数に相当した（図１０）。非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して、増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞では、絶対細胞数の６．９倍の増加が観察された（図１０）。

後のＨＳＰＣ集団を１３日目に決定した（図１１Ａ～Ｂ）。増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞は、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して、ＨＳＰＣ集団のパーセンテージが４７％低下した。非増強ＮＴＸ１０１細胞は、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して、ＨＳＰＣ集団パーセンテージの１１％低下を示した。一方、増強ＮＴＸ１０１細胞は、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して、ＨＳＰＣ集団パーセンテージの３１％低下を示した。さらに、増強ＮＴＸ１０１細胞は、非増強ＮＴＸ１０１細胞と比較して、ＨＳＰＣ集団パーセンテージの２２％低下を示した。非増強ＮＴＸ１０９細胞は、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して、ＨＳＰＣ集団パーセンテージの２２％低下を示した。一方、増強ＮＴＸ１０９集団では、非増強非形質導入Ｌｉｎ－集団と比較して、ＨＳＰＣ集団パーセンテージの３７％低下が観察された。加えて、増強ＮＴＸ１０９細胞では、非増強ＮＴＸ１０９細胞と比較して、ＨＳＰＣ集団パーセンテージの１９％低下が観察された。加えて、表５に記載の増強群は、それらのそれぞれの非増強群と比較して、有意に多くのＨＳＰＣを含んでいた（図１１Ｂ）。

Ｂ細胞集団（プレＢ細胞およびプロＢ細胞）を、増強の１３日後に決定した。増強後に、より高いプレＢ細胞集団パーセンテージが観察された。増強ＮＴＸ１０１細胞では、非増強ＮＴＸ１０１細胞と比較して、プレＢ細胞のパーセンテージの１．７６倍の増加が観察された。増強ＮＴＸ１０９細胞では、非増強ＮＴＸ１０９細胞と比較して、プレＢ細胞のパーセンテージの１．７３倍の増加が観察された。増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞では、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して、プレＢ細胞のパーセンテージの１．１４倍の増加が観察された（図１２）。

増強後の細胞１３の免疫表現型検査（図１３Ａ～Ｂ）を実行した。増強ＮＴＸ１０１細胞におけるプロ／プレＢ細胞比は２．５４であったが、非増強ＮＴＸ１０１細胞におけるプロ／プレＢ細胞比は６．６であった。したがって、増強ＮＴＸ１０１細胞では、非増強ＮＴＸ１０１細胞と比較して、プロＢ／プレＢ細胞比が６２％低下した。非増強ＮＴＸ１０９細胞と比較して、増強ＮＴＸ１０９細胞におけるプロＢ／プレＢ細胞比の５３％低下が、観察された（それぞれ、プロＢ／プレＢ細胞比：４．７対９．９）。増強ＮＴＸ１０９細胞のプロＢ／プレＢ細胞比は、ＷＴ細胞に見られる比と同様であった。増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞のプロＢ／プレＢ細胞比では、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して有意な変化は観察されなかった（比率：２．１２対２．１７）。加えて、表５に記載の増強群は、それぞれの非増強群と比較して、有意に多くのプレＢ細胞およびプロＢ細胞を含んでいた（図１３Ｂ）。

増強１７日後に細胞数およびＢ細胞集団を決定した（図１４）。増強から１７日後、増強非形質導入細胞は、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して、細胞数の１８倍の増加を示した（それぞれ、３，９８０細胞対７２，５００細胞）。加えて、１７日後、増強非形質導入細胞は、ＷＴと比較して１．９倍多くの細胞を含んでいた（それぞれ、７２，５００対３７，０００細胞）。増強非形質導入細胞のＢ細胞集団パーセンテージは、非増強非形質導入細胞のＢ細胞集団よりも７．４倍高く、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞の細胞集団の５．２％と比較して、細胞集団の３８．８８％を構成していた。増強および形質導入された細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、３５倍および１６倍多くの細胞を示した（ＮＴＸ１０１は１，２５９個の細胞を含む一方、増強ＮＴＸ１０１は４５，０００個を含み、ＮＴＸ１０９は３，９３２個の細胞を含む一方、増強ＮＴＸ１０９は６５，５００個の細胞を含んでいた）。増強ＮＴＸ１０１Ｌｉｎ－細胞のＢ細胞集団パーセンテージは、非増強ＮＴＸ１０１細胞と比較して、３．３倍の増加が観察された（６６．９％対２８．４％）。増強ＮＴＸ１０９細胞の細胞集団のＢ細胞集団パーセンテージは、非増強ＮＴＸ１０９細胞と比較して、１．２６倍の増加が観察された（５３．８％対４２．６％）。

増強のＩｇＭ陽性Ｂ細胞への効果を増強の１７日後に決定した（図１５）。形質導入細胞は、増強後の細胞集団において、ＩｇＭ陽性パーセンテージの増加を示さなかった。ＩｇＭ陽性Ｂ細胞は、非増強ＮＴＸ１０１のＩｇＭ陽性細胞の１９．７％と比較して、増強ＮＴＸ１０１集団の１３．７％を構成していた。ＮＸＴ１０９では、非増強ＮＴＸ１０９集団の細胞の２５．６１％と比較して、増強ＮＴＸ１０９細胞の細胞集団の１７．１１％がＩｇＭ陽性細胞であった。しかしながら、増強非形質導入細胞は、非増強非形質導入Ｌｉｎ－細胞と比較して、ＩｇＭ陽性Ｂ細胞集団のパーセントにおいて５．８倍の増加を示した（それぞれ、１３．０５％対２．２４％）。増強細胞におけるＩｇＭ陽性細胞集団の割合は、ＷＴ対照マウス（ＣＢＡ）由来のＬｉｎ－細胞におけるＩｇＭ陽性Ｂ細胞の割合よりも２．５倍高かった（それぞれ１３．０５％対５．２０％）。増強形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、細胞集団のＩｇＭ陽性Ｂ細胞の相対的な部分（すなわち、細胞のパーセンテージ）が低い一方で、増強を受けた細胞では、全細胞の絶対数、したがって、ＩｇＭ陽性Ｂ細胞の絶対数は、有意により高かった。

遺伝子発現は、増強の１３日後に決定された（図１６）。Ｂ細胞分化の過程中に各細胞群から同一の細胞数を抽出し、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ発現について解析した。ＧＦＰによって反映されるように、増強ＮＴＸ１０９細胞では、非増強ＮＴＸ１０９細胞と比較して、ＢＴＫを発現する細胞のパーセンテージの２．６２倍の増加が観察され（図１６）、増強ＮＴＸ１０９の形質導入の増加が示された。増強ＮＴＸ１０１細胞では、非増強ＮＴＸ１０１細胞と比較して、ＧＦＰ発現の増加は観察されなかった。

遺伝子発現は、増強の１３日後に決定された（図１７）。増強ＮＴＸ１０９細胞では、非増強ＮＴＸ１０９細胞と比較して、ＢＴＫ発現の４．２倍の増加が観察された（それぞれ、１４．５２％対３．４３％）。

増強Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞（形質導入および非形質導入）は、非増強細胞と比較して、またはＷＴ細胞と比較して、細胞の絶対数によって測定される細胞増殖の増加を示した。増強Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞（形質導入および非形質導入）は、集団のＨＳＰＣのパーセントの減少を示した。増強Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞（形質導入および非形質導入）は、非増強細胞と比較して、集団のＢ細胞パーセンテージの増加および絶対細胞数の増加を示し、これはＢ細胞分化の増大を示した。ＩｇＭ陽性細胞のパーセンテージは、非増強非形質導入細胞と比較して、増強非形質導入細胞においてより高かった。全細胞の絶対数、したがって、ＩｇＭ陽性Ｂ細胞の絶対数は、増強を受けたすべての細胞群で、非増強群と比較して有意により高かった。ＮＴＸ１０９ベクターを形質導入した増強細胞は、非増強ＮＴＸ１０９細胞と比較して、ＢＴＫ発現細胞％の増加を示し、Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞におけるＢＴＫ発現の回復における増強の有益な効果を示唆した。

実施例９
遺伝子療法に対する増強の効果
レンチベクター（Ｘｉｄ^ｐＴＣ９）を形質導入した増強もしくは非増強Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞、またはＷＴ Ｌｉｎ^－細胞（Ｘｉｄ^{ＣＢＡ／Ｃａ}）を、致死的に照射されたＸｉｄマウスに移植する効果について、評価した。

ＰＧＫ構成プロモーターの下で、ＧＦＰ導入遺伝子を含むｐＴＣ９レンチベクターを形質導入した増強（ＭＮＶ）または非増強（ＮＴ）Ｘｉｄ Ｌｉｎ－細胞をＸｉｄマウスに移植した。非形質導入ＸｉｄおよびＷＴ Ｌｉｎ－細胞と比較した相対ベクターコピー数（ＶＣＮ）およびＧＦＰのタンパク質発現を測定することにより、細胞産物における導入遺伝子の発現レベルを評価するために、形質導入細胞の並行インビトロ特徴付けを実行した。

相対的ＶＣＮは、試験したすべての条件において、同等のゲノム組込み事象を実証した。導入遺伝子発現（ＧＦＰ陽性細胞の割合）は、すべての形質導入された細胞（増強細胞および対照細胞の両方）において明らかであった（図１８）。

形質導入されたＸｉｄ Ｌｉｎ－細胞をｘｉｄマウスに移植した６週間後に血液を採取し、フローサイトメトリーを使用して、導入遺伝子発現を評価した（ＮＴ ＰｔＣ９についてはＮ＝５マウス、ＭＮＶ ＰｔＣ９についてはＮ＝４マウス）。

ＧＦＰを発現する細胞のパーセントに関して動物間で変動があったが、増強は、ＧＦＰを発現する細胞の最小、最大、および平均パーセントを上昇させた（図１９）。表６は、試験した各トランスジェニックおよびＷＴ動物におけるＧＦＰを発現する細胞のパーセントを示す。

本発明は、上記の実施例を参照して説明されているが、変更および変形は、本発明の趣旨および範囲内に包含されることが理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (62)

1. 対象における白血球細胞のレベルを増加させる方法であって、
   ａ）対象から標的細胞を得る工程と、
   ｂ）ドナー細胞から外因性ミトコンドリアを得る工程と、
   ｃ）前記外因性ミトコンドリアが前記標的細胞に入るのを可能にする条件下で、前記標的細胞を前記外因性ミトコンドリアに接触させることによって、ミトコンドリア富化標的細胞を産生する工程と、
   ｄ）前記ミトコンドリア富化標的細胞を前記対象に投与する工程と
   を含み、
   ここで、前記ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量が、前記標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高く、
   それによって対象における白血球細胞のレベルを増加させる、方法。
2. 前記標的細胞が、多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記標的細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記標的細胞が、全血、血液画分、末梢血、ＰＢＭＣ、血清、血漿、脂肪組織、胎盤、口腔粘膜、血液、臍帯血、または骨髄から得られる、請求項１に記載の方法。
5. 前記対象が、疾患または障害を有する、請求項１に記載の方法。
6. 前記疾患または障害が、加齢関連障害、がん、筋肉疾患および障害、糖原病および糖原貯蔵障害、血管内皮障害または疾患、脳障害または脳疾患、胎盤障害または胎盤疾患、胸腺障害または胸腺疾患、自己免疫疾患、腎疾患または腎障害、原発性ミトコンドリア病、膵臓障害または膵臓疾患、前立腺障害または前立腺疾患、腎臓障害または腎臓疾患、血液障害または血液疾患、心臓疾患または心臓障害、皮膚障害または皮膚疾患、免疫および炎症性疾患および障害、骨疾患または骨障害、胃腸疾患または胃腸障害、眼疾患または眼障害、ならびに感染症からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記外因性ミトコンドリアが、単離されたまたは部分的に精製された凍結－解凍ヒトミトコンドリアである、請求項１に記載の方法。
8. 前記外因性ミトコンドリアが、前記ミトコンドリア富化標的細胞中の全ミトコンドリア含有量の少なくとも１％を構成する、請求項１に記載の方法。
9. 前記外因性ミトコンドリアが、胎盤、培養で増殖された胎盤細胞、血液細胞、および幹細胞からなる群から選択されるヒト細胞または組織に由来する、請求項１に記載の方法。
10. 前記ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量が、ＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択される少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、クエン酸シンターゼの活性レベル、酸素（Ｏ_２）消費率、アデノシン三リン酸産生率、ミトコンドリアＤＮＡ含有量、ヘテロプラスミーのレベル、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアッセイによって決定される、請求項１に記載の方法。
11. 前記ミトコンドリア富化標的細胞の前記投与が、静脈内、腹腔内、動脈内、または筋肉内投与による、請求項１に記載の方法。
12. 少なくとも５×１０^５～５×１０^９個のミトコンドリア富化標的細胞が、前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
13. 前記ミトコンドリア富化標的細胞が、ミトコンドリア富化前の標的細胞と比較して、
    ａ）ＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択される少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の、増加した含有量、
    ｂ）増加した酸素（Ｏ_２）消費率、
    ｃ）増加したクエン酸シンターゼ活性レベル、
    ｄ）増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、
    ｅ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、
    ｆ）より低いヘテロプラスミーレベル、または
    ｇ）それらの任意の組み合わせ
    を有する、請求項１に記載の方法。
14. 前記対象への投与の前に、前記ミトコンドリア富化標的細胞に、薬学的に許容される担体を添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記外因性ミトコンドリアが前記標的細胞に入るのを可能にする前記条件が、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で前記標的細胞を前記外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
16. ミトコンドリア富化標的細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、対象におけるリンパ系細胞のレベルを増加させるための医薬組成物であって、前記ミトコンドリア富化標的細胞が、外因性ミトコンドリアについて富化されている、医薬組成物。
17. 前記ミトコンドリア富化標的細胞が、
    ａ）疾患もしくは障害に罹患している対象から、またはドナーから、標的細胞を得る工程と、
    ｂ）ドナーから外因性ミトコンドリアを得る工程と、
    ｃ）前記外因性ミトコンドリアが前記標的細胞に入るのを可能にする条件下で、前記標的細胞を前記外因性ミトコンドリアに接触させることによって、ミトコンドリア富化標的細胞を産生する工程と
    を含む方法によって産生され、
    前記ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量が、前記標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い、
    請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 前記標的細胞が、多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 前記標的細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 前記標的細胞が、全血、血液画分、末梢血、ＰＢＭＣ、胎盤、血漿、脂肪組織、口腔粘膜、血液、臍帯血、または骨髄から得られる、請求項１７に記載の医薬組成物。
21. 前記外因性ミトコンドリアが、単離されたまたは部分的に精製された凍結－解凍ヒトミトコンドリアである、請求項１７に記載の医薬組成物。
22. 前記標的細胞が、自家である、請求項１７に記載の医薬組成物。
23. 前記外因性ミトコンドリアが、自家である、請求項１７に記載の医薬組成物。
24. 前記ミトコンドリア富化標的細胞の前記ミトコンドリア含有量が、ＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択される少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、クエン酸シンターゼの活性レベル、酸素（Ｏ_２）消費率、アデノシン三リン酸産生率、ミトコンドリアＤＮＡ含有量、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアッセイによって決定される、請求項１７に記載の医薬組成物。
25. 前記ミトコンドリア富化標的細胞が、ミトコンドリア富化前の標的細胞と比較して、
    ａ）ＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択される少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の、増加した含有量、
    ｂ）増加した酸素（Ｏ_２）消費率、
    ｃ）増加したクエン酸シンターゼ活性レベル、
    ｄ）増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、
    ｅ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、もしくは
    ｆ）より低いヘテロプラスミーレベル、または
    ｇ）それらの任意の組み合わせ
    を有する、請求項１７に記載の医薬組成物。
26. 前記対象が、疾患または障害を有する、請求項１６に記載の医薬組成物。
27. 前記疾患または障害が、加齢関連障害、がん、筋肉疾患および障害、糖原病および糖原貯蔵障害、血管内皮障害または疾患、脳障害または脳疾患、胎盤障害または胎盤疾患、胸腺障害または胸腺疾患、自己免疫疾患、腎疾患または腎障害、原発性ミトコンドリア病、膵臓障害または膵臓疾患、前立腺障害または前立腺疾患、腎臓障害または腎臓疾患、血液障害または血液疾患、心臓疾患または心臓障害、皮膚障害または皮膚疾患、免疫および炎症性疾患および障害、骨疾患または骨障害、胃腸疾患または胃腸障害、眼疾患または眼障害、ならびに感染症からなる群から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
28. 前記対象に投与される、請求項１７に記載の医薬組成物。
29. 少なくとも５×１０^５～５×１０^９個のミトコンドリア富化標的細胞が、前記対象に投与される、請求項２８に記載の医薬組成物。
30. 前記外因性ミトコンドリアが前記標的細胞に入るのを可能にする前記条件が、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で前記標的細胞を前記外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
31. 対象における１つのリンパ球欠乏関連疾患または複数のリンパ球欠乏関連疾患の衰弱作用を軽減するための方法であって、
    （ａ）造血幹細胞（ＨＳＣ）を外因性ミトコンドリアとともに、前記外因性ミトコンドリアが前記ＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートする工程と、
    （ｂ）（ａ）からの前記ＨＳＣを前記対象に投与する工程と
    を含む、方法。
32. 前記ＨＳＣが、自家または同種異系幹細胞である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記外因性ミトコンドリアが、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている、請求項３０に記載の方法。
34. 前記外因性ミトコンドリアが前記ＨＳＣに入るのを可能にする前記条件が、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合を含む、請求項３０に記載の方法。
35. 対象における造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を改善するための方法であって、
    （ａ）造血幹細胞（ＨＳＣ）を外因性ミトコンドリアとともに、前記外因性ミトコンドリアが前記ＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートする工程と、
    （ｂ）（ａ）からの前記ＨＳＣを前記対象に投与する工程と
    を含む、方法。
36. 前記ＨＳＣが、自家または同種異系幹細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記外因性ミトコンドリアが、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている、請求項３５に記載の方法。
38. 前記ＨＳＣが、インビトロで拡大増殖された、請求項３５に記載の方法。
39. 前記ＨＳＣが、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている、請求項３５に記載の方法。
40. 前記ＨＳＣが、インビトロでの拡大増殖の前または後に、少なくとも１回の凍結解凍サイクルを受けている、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ＨＳＣが、前記外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前または後に、少なくとも１回の凍結解凍サイクルを受けている、請求項３９に記載の方法。
42. 単離されたミトコンドリアが前記ＨＳＣに入るのを可能にする前記条件が、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で前記標的細胞を前記外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む、請求項３５に記載の方法。
43. ミトコンドリア富化標的細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、対象における遺伝子療法のための細胞の生着を高める医薬組成物であって、前記ミトコンドリア富化標的細胞が、外因性ミトコンドリアについて富化されている、医薬組成物。
44. 前記標的細胞が、前記外因性ミトコンドリアについての富化前、富化中、または富化後に、遺伝子改変されている、請求項４３に記載の医薬組成物。
45. 対象における免疫不全または免疫関連疾患を治療するための方法であって、
    （ａ）造血幹細胞（ＨＳＣ）を外因性ミトコンドリアとともに、前記外因性ミトコンドリアが前記ＨＳＣに入るのを可能にする条件下でインキュベートする工程と、
    （ｂ）（ａ）からの前記ＨＳＣを前記対象に投与する工程と
    を含む、方法。
46. 前記ＨＳＣが、自家または同種異系幹細胞である、請求項４５に記載の方法。
47. 前記外因性ミトコンドリアが、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている、請求項４５に記載の方法。
48. 前記ＨＳＣが、インビトロで拡大増殖された、請求項４５に記載の方法。
49. 前記ＨＳＣが、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルを受けている、請求項４５に記載の方法。
50. 前記ＨＳＣが、インビトロでの拡大増殖の前または後に、少なくとも１回の凍結解凍サイクルを受けている、請求項４９に記載の方法。
51. 前記ＨＳＣが、前記外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前または後に、少なくとも１回の凍結解凍サイクルを受けている、請求項４９に記載の方法。
52. 単離されたミトコンドリアが前記ＨＳＣに入るのを可能にする前記条件が、１０^６個の細胞当たり約０．０８８～１７６ｍＵのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の割合で前記標的細胞を前記外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む、請求項４５に記載の方法。
53. 疾患または障害を治療する方法であって、
    ａ）細胞を、外因性ミトコンドリアに、前記外因性ミトコンドリアが前記細胞に入るのを可能にする条件下で接触させることによって、ミトコンドリア富化細胞を産生する工程と、
    ｂ）目的の遺伝子を含むウイルスベクターを前記ミトコンドリア富化細胞に形質導入する工程と、
    ｃ）前記ミトコンドリア富化形質導入細胞を対象に投与する工程と
    を含み、それによって前記疾患または障害を治療する、方法。
54. 疾患または障害を治療する方法であって、
    ａ）目的の遺伝子を含むウイルスベクターを細胞に形質導入する工程と、
    ｂ）前記形質導入細胞を、外因性ミトコンドリアに、前記外因性ミトコンドリアが前記細胞に入るのを可能にする条件下で接触させることによって、ミトコンドリア富化形質導入細胞を産生する工程と、
    ｃ）前記ミトコンドリア富化形質導入細胞を対象に投与する工程と
    を含み、それによって前記疾患または障害を治療する、方法。
55. 前記細胞が、幹細胞である、請求項５３または５４に記載の方法。
56. 前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項５５に記載の方法。
57. 前記細胞が、免疫不全細胞である、請求項５３または５４に記載の方法。
58. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項５３または５４に記載の方法。
59. 前記ミトコンドリア富化形質導入細胞の前記投与が、非増強細胞と比較して、Ｂ細胞の数を増加させる、請求項５３または５４に記載の方法。
60. 前記Ｂ細胞が、プレＢ細胞またはプロＢ細胞である、請求項５９に記載の方法。
61. 前記ミトコンドリア富化形質導入細胞の前記投与が、非増強細胞と比較して、ＩｇＭ陽性細胞の数を増加させる、請求項５３または５４に記載の方法。
62. ミトコンドリア富化が、形質導入細胞の数を増加させる、請求項５３に記載の方法。

Images