発明の詳細な説明
本発明は、外因性ミトコンドリアについて富化された細胞が疾患および障害を治療するために有用であるという重大な発見に基づいている。本発明は、ミトコンドリア富化細胞を提供することによって、対象において骨髄での白血球細胞の産生を増加させる方法および組成物を提供する。さらに、本出願は、骨髄細胞型、CD34+細胞の生着、および分化を増加させるための方法を提供する。
本発明の組成物および方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されず、かかる組成物、方法、および条件は変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみに限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈から明らかにそうではない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「その方法(the method)」への言及は、本明細書に記載されるタイプの1つ以上の方法および/またはステップを含み、本開示などを読めば当業者には明白になるであろう。
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたときと同程度に、本明細書において参照により組み込まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、修正および変形が本開示の趣旨および範囲内に包含されることを理解されたい。好ましい方法および材料を、これから説明する。
本発明は、治療的に有意な量の完全に単離されたミトコンドリアの標的指向送達および全身送達のための細胞プラットフォーム、より具体的には幹細胞由来の細胞プラットフォーム、ならびに対象におけるそれらの利用のための方法を提供する。本発明は、外因性ミトコンドリアについて富化された骨髄由来造血幹細胞の静脈内注射が対象の様々な組織に有益に影響を及ぼし得ることを示すいくつかの驚くべき発見に基づいている。言い換えれば、外因性ミトコンドリアについて富化された幹細胞の投与後、様々な器官および組織において機能の改善を達成することができる。
本発明は、例えばWO2016/135723に開示されているように、幹細胞および骨髄細胞は、無傷の外因性ミトコンドリアについて富化されることを受け入れ、ヒト骨髄細胞は、ミトコンドリアについて富化されることを特に受け入れるという発見に部分的に基づいている。いかなる理論または機構に拘束されるものではなく、幹細胞または骨髄細胞と外因性ミトコンドリアとの同時インキュベーションは、幹細胞または骨髄細胞への無傷の機能的ミトコンドリアの移行を促進すると仮定されている。
骨髄由来造血幹細胞を含むがこれに限定されない幹細胞または骨髄細胞の、ミトコンドリアについての富化の程度、および細胞のミトコンドリア機能の改善は、単離された外因性ミトコンドリアまたは部分的に精製されたミトコンドリアの濃度、ならびにインキュベーション条件を含むがこれらに限定されないミトコンドリア富化に使用される条件に依存することも見出されている。
本発明は、ある特定の態様では、ミトコンドリア富化標的細胞の生着、増殖、およびこれらの増強細胞の骨髄へのホーミングを改善するための方法および組成物を提供する。具体的には、外因性ミトコンドリアによって増強された標的細胞は、外因性ミトコンドリアによる増強も外因性ミトコンドリアについての富化もされていない標的細胞を受け取った対象と比較して、または富化または増強前の標的細胞と比較して、対象の骨髄への生着の改善および増強された細胞の方向付けの改善を有する。
本発明は、一態様では、疾患もしくは障害に罹患している対象からまたは健康な対象から得られるかまたは由来する標的細胞を、外因性ミトコンドリアについて富化すること、および「ミトコンドリア富化」標的細胞を対象に移植することによって、対象において、CD45+細胞のレベルを増加させ、CD33+細胞に対するCD3+細胞のレベルを増加させ、骨髄細胞に対するリンパ球細胞の割合を増加させるための方法および組成物を提供する。
本発明は、対象のリンパ系細胞のレベルを増加させるための方法を提供し、本方法は、疾患もしくは障害に罹患しているかもしくはそれを有する対象から、または健康な対象から標的細胞を得ることと、ドナーから外因性ミトコンドリアを得ることと、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件下で標的細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化標的細胞を産生することと、ミトコンドリア富化標的細胞を対象に投与することとを含み、富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い。一態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にするための条件は、106個の標的細胞当たり約0.088~176mUのクエン酸シンターゼ(CS)活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む。
本発明は、加えて、ミトコンドリア富化標的細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、対象におけるリンパ球のレベルを増加させるための医薬組成物であって、ミトコンドリア富化標的細胞が、外因性ミトコンドリアについて富化されている、医薬組成物を提供する。ミトコンドリア富化標的細胞は、疾患もしくは障害に罹患しているかもしくはそれを有する対象から、または健康な対象から標的細胞を得ることと、ドナーから外因性ミトコンドリアを得ることと、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件下で標的細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化標的細胞を産生することとによって産生され、富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い。一態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にするための条件は、106個の標的細胞当たり約0.088~176mUのクエン酸シンターゼ(CS)活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含む。
リンパ系細胞またはリンパ球は、抗原に対する免疫応答を提供する白血球である。リンパ系細胞は、T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む。T細胞およびB細胞は、適応免疫応答の主要な細胞成分である。T細胞は細胞性免疫に関与するが、B細胞は主に体液性免疫に関与する。NK細胞は、先天性免疫系の一部であり、腫瘍およびウイルス感染細胞から宿主を防御する上で主要な役割を果たす。
本明細書で使用される場合、「白血球細胞の増加したレベル」という用語は、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されている対象であって、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されていない対象と比較して、ミトコンドリア富化されていない標的細胞を投与されている対象と比較して、またはミトコンドリア富化標的細胞を投与される前の対象における白血球細胞のレベルと比較して、白血球細胞の数が増加している対象を指す。いくつかの実施形態によれば、CD45+細胞のレベルは、少なくとも1.1倍、1.3倍、1.5倍、2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、または少なくとも5倍増加する。
本明細書で使用される場合、「リンパ系細胞の増加したレベル」という用語は、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されている対象であって、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されていない対象と比較して、ミトコンドリア富化されていない標的細胞を投与されている対象と比較して、またはミトコンドリア富化標的細胞を投与される前の対象におけるリンパ系細胞のレベルと比較して、リンパ系細胞の数が増加している対象を指す。ある特定の態様では、CD3+細胞のレベルは、少なくとも1.1倍、1.3倍、1.5倍、2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、または少なくとも5倍増加する。
本明細書で使用される場合、「骨髄細胞に対するリンパ系細胞の増加した割合」という用語は、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されている対象であって、ミトコンドリア富化標的細胞を投与されていない対象と比較して、ミトコンドリア富化されていない標的細胞を投与されている対象と比較して、またはミトコンドリア富化標的細胞を投与される前の対象における骨髄細胞に対するリンパ系細胞の割合と比較して、骨髄細胞に対するリンパ系細胞の割合において増加を有する対象を指す。ある特定の態様では、増加は、少なくとも1.1倍、1.3倍、1.5倍、2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、または少なくとも5倍である。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、幹細胞、前駆細胞、または骨髄由来幹細胞である。具体的には、標的細胞は、多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、CD34+細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む。本発明の方法では、標的細胞は、外因性ミトコンドリアについての富化の前に、能動的に変更または改変されない(例えば、mtDNAまたはミトコンドリア機能の低下)。より具体的には、標的細胞におけるミトコンドリア機能および/またはミトコンドリアDNAは、外因性ミトコンドリアと接触する前に能動的に変更または改変されない。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、一般に、任意の哺乳動物幹細胞を指す。幹細胞は、他のタイプの細胞に分化することができ、分裂してほぼ同じタイプの幹細胞を産生することができる未分化細胞である。幹細胞は、全能性または多能性のいずれかであり得る。
本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、一般に、ヒトに自然に見出されるすべての幹細胞、およびエクスビボで産生または誘導され、ヒトと適合性のあるすべての幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞は、自家である。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞は、同種異系である。幹細胞のような「前駆細胞」は、特定のタイプの細胞に分化する傾向があるが、すでに幹細胞よりも特異的であり、その「標的」細胞に分化させられる。幹細胞と前駆細胞の最も重要な違いは、幹細胞は無制限に複製することができるのに対し、前駆細胞は限られた回数しか分裂することができないことである。本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、「前駆細胞」および「完全に分化していない幹細胞」をさらに含む。
HSPCは、すべての免疫細胞、自然免疫系および適応免疫系、ならびに骨髄系およびリンパ系の細胞の前駆細胞である。幹細胞としてそれらは長命であり、造血細胞としてそれらは全身を循環し、体内のすべての臓器系に影響を及ぼし、多系統(multi-systemic)疾患に対処するための鍵となる。ミトコンドリア代謝は、造血幹細胞および前駆細胞の持続性および機能、ならびに免疫細胞の機能および炎症バランスに重要である。免疫機能障害は、ミトコンドリア病患者における罹患率および死亡率の主要な原因であり、神経変性後遺症をもたらすことが知られている。免疫系は、エネルギー不足によって影響され、ミトコンドリア病患者は、免疫能力のある集団で一般的に見られない異常な感染症を含む原発性免疫不全を有する患者と同様の症状を示すことがよくある。重要なことに、輸血依存または血球減少症を有さない患者においても、感染中の代謝異常のリスクが高く、これは、免疫細胞ミトコンドリア機能における細胞固有の欠陥に起因する可能性がある。
前臨床的には、免疫細胞ミトコンドリア機能の救済は、貧血、筋肉の衰え、身体活動、心血管機能、および組織老化の低減を含む多系統効果を発揮することができることが最近示された。造血細胞が非造血効果を発揮する推奨される機構には、免疫細胞におけるミトコンドリア機能障害と関連する炎症の減少、または遠位組織におけるアポトーシスを抑制することができる因子の分泌の増大が含まれる。
ある特定の実施形態では、幹細胞は多能性幹細胞(PSC)である。他の実施形態では、PSCは非胚性幹細胞である。いくつかの実施形態に従い、ヒト胚性幹細胞は、本発明の範囲から明示的に除外される。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工PSC(iPSC)である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、骨髄細胞に由来する。特定の実施形態では、幹細胞は、CD34+細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞である。他の実施形態では、幹細胞は、脂肪組織に由来する。さらに他の実施形態では、幹細胞は、血液に由来する。さらなる実施形態では、幹細胞は、臍帯血に由来する。さらなる実施形態では、幹細胞は、口腔粘膜に由来する。特定の実施形態では、疾患に罹患している患者からまたは健康な対象から得られる幹細胞は、骨髄細胞または骨髄由来幹細胞である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞(PSC)」という用語は、無制限に増殖することができ、また体内に複数の細胞型を生じさせることができる細胞を指す。全能性幹細胞は、体内の他のすべての細胞型を生じさせることができる細胞である。胚性幹細胞(ESC)は全能性幹細胞であり、人工多能性幹細胞(iPSC)は多能性幹細胞である。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞(iPSC)」という用語は、ヒト成体体細胞から生成することができる一タイプの多能性幹細胞を指す。本明細書でiPSCを生成することができる体細胞のいくつかの非限定的な例としては、線維芽細胞、内皮細胞、毛細血管血細胞、ケラチノサイト、骨髄細胞 上皮細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞(ESC)」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する一タイプの全能性幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「骨髄細胞」という用語は、一般に、ヒトの骨髄に自然に見出されるすべてのヒト細胞、およびヒトの骨髄に自然に見出されるすべての細胞集団を指す。「骨髄幹細胞」および「骨髄由来幹細胞」という用語は、骨髄に由来する幹細胞集団を指す。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、CD34+細胞、およびそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、自家または同種異系のヒト幹細胞は、多能性幹細胞(PSC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である。さらなる実施形態では、自家または同種異系のヒト幹細胞は、間葉系幹細胞である。
一部の実施形態によれば、ヒト幹細胞は、脂肪組織、口腔粘膜、血液、臍帯血、または骨髄に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、骨髄に由来する。
ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、骨髄造血細胞を含む。本明細書で使用される場合、「骨髄造血細胞」という用語は、骨髄造血、例えば、骨髄およびそれから生じるすべての細胞、すなわち、すべての血液細胞の産生に関与する細胞を指す。
ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、赤血球生成細胞を含む。本明細書で使用される場合、「赤血球生成細胞」という用語は、赤血球生成、例えば、赤血球(red blood cell)(赤血球(erythrocyte))の産生に関与する細胞を指す。
ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、多能性造血幹細胞(HSC)を含む。本明細書で使用される場合、「多能性造血幹細胞」または「造血芽細胞」という用語は、造血のプロセスを通じて他のすべての血液細胞を生じさせる幹細胞を指す。
ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来の幹細胞は、間葉系幹細胞を含む。本明細書で使用される場合、「一般的な骨髄系前駆細胞」という用語は、骨髄系細胞を生成する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「一般的なリンパ球系前駆細胞」という用語は、リンパ球を生成する細胞を指す。
ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、巨核球、赤血球、肥満細胞、筋芽細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、小リンパ球、Tリンパ球、Bリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、間葉系幹細胞を含む。本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」という用語は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、および脂肪細胞を含む、様々な細胞型に分化することができる、多能性間質細胞を指す。
ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、骨髄造血細胞を含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来の幹細胞は、赤血球生成細胞からなる。ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、多能性造血幹細胞(HSC)を含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、骨髄系共通前駆細胞、リンパ系共通前駆細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来幹細胞は、巨核球、赤血球、肥満細胞、筋芽細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、小リンパ球、Tリンパ球、Bリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、骨髄由来の幹細胞は、間葉系幹細胞からなる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、末梢血から得られる複数のヒト骨髄幹細胞を含む。
CD34抗原としても知られる造血前駆細胞抗原CD34は、ヒトではCD34遺伝子によってコードされているタンパク質である。CD34は、細胞表面糖タンパク質の分化クラスターであり、細胞-細胞接着因子として機能する。ある特定の実施形態では、骨髄幹細胞は、骨髄前駆細胞抗原CD34を発現する(CD34+である)。ある特定の実施形態では、骨髄幹細胞は、それらの外膜上に骨髄前駆細胞抗原CD34を提示する。ある特定の実施形態では、CD34+細胞は、臍帯血由来である。
本明細書で使用される場合、「CD34+細胞」という用語は、それらの起源に関係なく、CD34陽性であると特徴付けられる造血幹細胞を指す。ある特定の実施形態では、CD34+細胞は、骨髄から、血液に動員された骨髄細胞から、または臍帯血から得られる。
本明細書で使用される場合、「障害に罹患している対象からまたは障害に罹患していないドナーから得られた幹細胞」という句は、対象から単離された時点で対象/ドナーの幹細胞であった細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「障害に罹患している対象に由来する幹細胞」または「障害に罹患していないドナーに由来する幹細胞」という句は、対象/ドナーの幹細胞ではなく、幹細胞になるように操作された細胞を指す。本明細書で使用される場合、「操作された」という用語は、体細胞を未分化状態に再プログラミングし、人工多能性幹細胞(iPSC)になり、任意選択で、骨髄細胞(Xu Y.et al.,PLoS ONE,2012,Vol.7(4),e3432l)などの所望の系統または集団の細胞になるようにiPSCをさらに再プログラミングする(Chen M.et al.,IOVS,2010,Vol.51(11),5970~5978)ための、当該分野で既知の方法のいずれか1つ(Yu J.et al.,Science,2007,Vol.318(5858),1917~1920)を使用することを指す。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、インビトロで培養され、拡大増殖される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ミトコンドリア富化の前または後に、少なくとも1回の凍結-解凍サイクルを受ける。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、疾患または障害に罹患している対象に直接由来する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ドナーに直接由来する。本明細書で使用される場合、「直接由来する」という用語は、他の細胞に直接由来した幹細胞を指す。ある特定の実施形態では、造血幹細胞(HSC)は、骨髄細胞に由来する。ある特定の実施形態では、造血幹細胞(HSC)は、末梢血に由来する。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、疾患または障害に罹患している対象に間接的に由来する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ドナーに間接的に由来する。本明細書で使用される場合、「間接的に由来する」という用語は、非幹細胞に由来した幹細胞を指す。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)になるように操作された体細胞に由来した。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、全血、血液画分、末梢血、PBMC、血清、血漿、脂肪組織、口腔粘膜、血液、臍帯血、または骨髄から得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、疾患または障害に罹患している対象の骨髄から直接得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ドナーの骨髄細胞から直接得られる。本明細書で使用される場合、「直接得られた」という用語は、例えば、外科手術または注射器による針を介した吸引などの手段によって、骨髄自体から得られた幹細胞を指す。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患している患者の骨髄から間接的に得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ドナーの骨髄から間接的に得られる。本明細書で使用される場合、「間接的に得られた」という用語は、骨髄自体以外の場所から得られた骨髄細胞を指す。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、疾患または障害に罹患している対象の末梢血から得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、健康な人の末梢血から得られる。本明細書で使用される場合、「末梢血」という用語は、血液系中を循環する血液を指す。
本明細書で使用される場合、「自家細胞」または「自家である細胞」という用語は、患者自身の細胞であることを指す。「自家ミトコンドリア」という用語は、患者自身の細胞または母性的に関連する細胞から得られたミトコンドリアを指す。「同種異系細胞」または「同種異系ミトコンドリア」という用語は、異なるドナー個体からのものであることを指す。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「同系」という用語は、拒絶なく個体間の移植を可能にするのに十分な、遺伝的同一性、または遺伝的にほぼ同一なことを指す。ミトコンドリアの文脈における同系という用語は、本明細書では、同じ母体の血統を意味する自家ミトコンドリアという用語と交換可能に使用される。
「疾患」および「障害」という用語は、正常とはみなされないか、または生理学的状態とは異なるいずれかの苦痛を指すことを意味する。疾患および障害は、事実上、身体であるすべての臓器、組織、または機能に影響を与える可能性がある。疾患および状態の非限定的な例としては、がん、筋肉疾患および障害、糖原病および糖原貯蔵障害、血管内皮障害または疾患、脳障害または脳疾患、胎盤障害または胎盤疾患、胸腺障害または胸腺疾患、自己免疫疾患、腎疾患または障害、膵臓障害または膵臓疾患、前立腺障害または前立腺疾患、腎臓障害または腎臓疾患、血液障害または血液疾患、心臓障害または心臓疾患、皮膚障害または皮膚疾患、免疫および炎症性疾患および障害、骨疾患または骨障害、胃腸疾患または胃腸障害、および眼疾患または眼障害が挙げられる。ある特定の態様では、疾患または障害は、加齢関連疾患または障害である。
加齢関連疾患は、細胞老化が進むにつれて頻度が増加することで最も頻繁に見られる疾患である。本質的に、老齢関連疾患は老化から生じる合併症である。すべての成体動物は年を取るが、すべての成体動物が老齢関連疾患を経験するわけではないため、老齢関連疾患は老齢プロセス自体とは区別される。
ミトコンドリアの質および活性の低下は、正常な老齢と関連しており、広範な老齢関連疾患の発症と相関している。ミトコンドリアは、細胞老化、慢性炎症、および幹細胞活性における年齢依存性低下を含む、老化過程の具体的な態様に寄与している。豊富な裏付けとなる証拠は、ミトコンドリアDNA突然変異の蓄積により、ミトコンドリア機能障害が年齢とともに起こることを示している。様々なミトコンドリアDNA点突然変異は、ヒトの脳、心臓、骨格筋、および肝臓組織において、年齢とともに大幅に増加することが示されている。ミトコンドリアDNAの欠失/挿入の頻度の増加は、動物モデルおよびヒトの両方で加齢とともに報告されている。複製サイクルおよびミトコンドリアDNA突然変異の蓄積は、ミトコンドリアが老化のいくつかの重要な態様に影響を与えるかまたは調節するような、幹細胞老化の根底にある保存された機構である可能性があると仮定されている(Sun et al.,Cell,2016,61:654-66、Srivastava,Genes,2017,8:398、Ren et al.,Genes,2017,8:397)。
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア病」という用語および「原発性ミトコンドリア病」という用語は、交換可能に使用され得る。本明細書で使用される場合、「原発性ミトコンドリア病」という用語は、ミトコンドリアDNAの既知のもしくは明白な病原性突然変異によって、または遺伝子産物がミトコンドリアに取り込まれる核DNAの遺伝子の突然変異によって診断されるミトコンドリア病を指す。いくつかの実施形態によれば、原発性ミトコンドリア病は、先天性疾患である。いくつかの実施形態によれば、原発性ミトコンドリア病は、続発性ミトコンドリア機能障害ではない。「続発性ミトコンドリア機能障害」および「後天性ミトコンドリア機能障害」という用語は、本出願を通して交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「疾患または障害に罹患している対象」または「疾患または障害を有して罹患している対象」という用語は、ある特定の状態によって引き起こされる衰弱作用を経験しているヒト対象を指す。この疾患は、がん、加齢関連疾患、腎疾患、膵臓疾患、肝臓疾患、筋肉疾患、脳疾患または原発性ミトコンドリア病、続発性ミトコンドリア機能障害、ならびに他の疾患または障害を指し得る。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ法」という用語は、そのステップが人体外でのみ実行される方法を指す。特に、エクスビボ法は、後に治療される対象に再導入または移植される体外の細胞の操作を含む。
本明細書で使用される場合、「ドナー」という用語は、外因性ミトコンドリアを提供するドナーを指す。いくつかの実施形態では、ドナーは、疾患または障害に罹患していないか、または対象が罹患している障害と同じ障害の疾患に罹患していない。
ミトコンドリアに関して「外因性」、「単離された外因性」という用語は、細胞の外部にある供給源から標的細胞(例えば、幹細胞)に導入されるミトコンドリアを指す。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアは、一般に、標的細胞とは異なるドナー細胞に由来するかまたは単離され得る。例えば、外因性ミトコンドリアは、ドナー細胞で産生または作製され、ドナー細胞から精製、単離または得られ、その後、標的細胞に導入され得る。外因性ミトコンドリアは、ドナーから得られたものとして同種異系、または対象から得られたものとして自家であり得る。単離されたミトコンドリアは、機能的ミトコンドリアを含み得る。ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアが、全ミトコンドリアである。
本明細書で使用される場合、ミトコンドリアに関連する「単離された」および「部分的に精製された」という用語は、他の細胞成分から少なくとも部分的に精製された外因性ミトコンドリアを含む。外因性の単離されたまたは部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の10%~90%である。
本明細書で使用される場合、「機能的ミトコンドリア」という用語は、正常なミトコンドリアDNA(mtDNA)および正常な非病理学的活性レベルを示すパラメーターを示すミトコンドリアを指す。ミトコンドリアの活性は、膜電位、O2消費、ATP産生、およびクエン酸シンターゼ(CS)活性レベルなど、当技術分野で周知の様々な方法で測定することができる。
ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化細胞中の全ミトコンドリア含有量の少なくとも1%を構成する。ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化標的細胞中の全ミトコンドリア含有量の少なくとも10%を構成する。いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化標的細胞中の全ミトコンドリア含有量の少なくとも約3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%または50%を構成する。ある特定の実施形態では、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、細胞タンパク質の総量の10~90%、20~80%、20~70%、40~70%、20~40%、または20~30%である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の20%~80%である。ある特定の実施形態では、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内画分を合わせた重量の20%~80%である。他の実施形態では、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内画分を合わせた重量の80%を超える。
ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアは、ヒト細胞またはヒト組織から得られる。いくつかの実施形態では、ヒト細胞またはヒト組織は、胎盤、培養で増殖された胎盤細胞、および血液細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ヒト体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、培養細胞である。本明細書でiPSCを生成することができる体細胞のいくつかの非限定的な例としては、線維芽細胞、内皮細胞、毛細血管細胞、ケラチノサイト、骨髄細胞、および上皮細胞が挙げられる。
ミトコンドリアに関して「自家」という用語は、細胞と同じ供給源から標的細胞(例えば、幹細胞)に導入されるミトコンドリアを指す。例えば、いくつかの実施形態では、自家ミトコンドリアは、標的細胞の供給源である対象に由来するかまたは単離される。例えば、自家ミトコンドリアは、対象の細胞から精製/単離/取得され、その後、対象の標的細胞に導入され得る。
ミトコンドリアに関して「内因性」という用語は、細胞によって作製/発現/産生されており、外部供給源から細胞に導入されないミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態では、内因性ミトコンドリアは、細胞のゲノムによってコードされているタンパク質および/または他の分子を含有する。いくつかの実施形態では、「内因性ミトコンドリア」という用語は、「宿主ミトコンドリア」という用語と等しい。
本発明の原理に従えば、外因性ヒトミトコンドリアが、ヒト幹細胞であり得る標的細胞に導入され、こうしてこれらの細胞を、外因性ミトコンドリアについて富化する。かかる富化は標的細胞のミトコンドリア含有量を変化させることを理解するべきであり、ナイーブヒト幹細胞は、実質的に、宿主/自家ミトコンドリアの1つの集団を有するが、外因性ミトコンドリアについて富化された標的細胞は、宿主/内因性ミトコンドリアの第1の集団と、導入されたミトコンドリアの別の集団(すなわち、外因性ミトコンドリア)の2つのミトコンドリアの集団を実質的に有する。よって、「濃縮された」という用語は、外因性ミトコンドリアを受け取った/組み込んだ後の細胞の状態に関する。ミトコンドリアの2つの集団間の数および/または比率を決定することは、2つの集団がいくつかの態様、例えばミトコンドリアDNAにおいて異なり得るため、簡単である。したがって、「外来性ヒトミトコンドリアについて富化されたヒト幹細胞」という句は、「内因性ミトコンドリアと外因性単離ミトコンドリアとを含むヒト幹細胞」という句と等しい。例えば、全ミトコンドリアの少なくとも1%の外因性単離ミトコンドリアを含むヒト幹細胞は、宿主内因性ミトコンドリアと外因性単離ミトコンドリアを99:1の比率で含むとみなされる。例えば、「全ミトコンドリアの3%」は、富化後、元の(内因性)ミトコンドリア含有量が全ミトコンドリアの97%であり、導入された(外因性)ミトコンドリアが全ミトコンドリアの3%であることを意味し、これは(3/97=)3.1%の富化に相当する。別の例として、「全ミトコンドリアの33%」は、富化後、元の(内因性)ミトコンドリア含有量が全ミトコンドリアの67%であり、導入された(外因性)ミトコンドリアが全ミトコンドリアの33%であることを意味し、これは(33/67=)49.2%の富化に相当する。
いくつかの実施形態では、内因性ミトコンドリアの外因性ミトコンドリアからの特定/区別は、後者が標的細胞に導入された後、例えば、限定されないが、mtDNA配列の差異、例えば、内因性ミトコンドリアと外因性ミトコンドリアとの間の異なるハプロタイプを特定すること、外因性ミトコンドリアの供給源組織に由来する特定のミトコンドリアタンパク質、例えば、胎盤からのチトクロームp450コレステロール側鎖切断(P450SCC)、褐色脂肪組織からのUCP1などを特定すること、またはそれらの任意の組み合わせを含む、様々な手段によって実行され得る。
ヘテロプラスミーとは、細胞または個体内に1タイプを超えるミトコンドリアDNAが存在することである。ヘテロプラスミーレベルは、変異mtDNA分子 対 野生型/機能的mtDNA分子の比率であり、ミトコンドリア病の重症度を考慮するのに重要な要素である。低レベルのヘテロプラスミー(十分な量のミトコンドリアが機能している)は、健康な表現型と関連しているが、高レベルのヘテロプラスミー(十分な量のミトコンドリアが機能していない)は病状と関連している。ある特定の実施形態では、富化された幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、対象またはドナーから得られた、または由来する幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも1%、3%、5%、15%、20%、25%、または30%低い。
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア富化標的細胞」という用語は、外因性ミトコンドリアが挿入された標的細胞を指す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、CD45、CD3、CD33、CD14、CD19、CD11、CD15、CD16等を発現する細胞に分化する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、CD45、CD3、CD33、CD14、またはCD19を発現する。CD45は、赤血球および形質細胞を除く造血系統のすべての細胞に存在する受容体結合タンパク質チロシンホスファターゼである。CD3は免疫応答効率のマーカーである。具体的には、CD3は前胸腺細胞で発現される。細胞上のCD45およびCD3の発現は、フローサイトメトリーを含む当技術分野で既知の任意の手段によって決定することができる。いくつかの実施形態によれば、CD45、CD3、CD33、CD14、および/またはCD19発現は、ミトコンドリア富化細胞を対象に投与した後に生じる。
本明細書で使用する場合、「接触させる」という用語は、ミトコンドリアと細胞を十分に近接させて、ミトコンドリアが細胞に入るのを促進することを指す。ミトコンドリアを標的細胞に導入または挿入するという用語は、接触させるという用語と交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「単離されたミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件」という句は、一般に、時間、温度、培養培地、およびミトコンドリアと幹細胞との間の近接性などのパラメーターを指す。例えば、ヒト細胞およびヒト細胞株は、日常的に、37℃および5%CO2雰囲気で、組織培養インキュベーターなどにおいて、液体培地中でインキュベートされ、無菌環境で保持される。本明細書に開示および例示される代替の実施形態によれば、細胞は、ヒト血清アルブミンを補給した生理食塩水中で室温でインキュベートすることができる。
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、約16~約37℃の範囲の温度で、約0.5~30時間の範囲の時間、単離されたミトコンドリアとともにインキュベートされる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、単離されたミトコンドリアとともに、約1~30時間または約5~25時間の範囲の時間、インキュベートされる。特定の実施形態では、インキュベーションは、20~30時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、少なくとも1、3、5、8、10、13、15、18、20、21、22、23または24時間である。他の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも5、10、15、20、または30時間までである。特定の実施形態では、インキュベーションは24時間である。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、標的細胞中のミトコンドリア含有量が、それらの初期ミトコンドリア含有量と比較して平均して約1%~45%増加するまでである。
いくつかの実施形態では、インキュベーションは、室温(16℃~30℃)である。他の実施形態では、インキュベーションは37℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、5%CO2雰囲気中である。他の実施形態では、インキュベーションは、空気中に見られるレベルを超える追加のCO2を含まない。
またさらなる実施形態では、インキュベーションは、ヒト血清アルブミン(HSA)を補給した培養培地で実行される。追加の実施形態では、インキュベーションは、HSAを補給した生理食塩水中で実行される。ある特定の例示的な実施形態によれば、単離された外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に入り、それにより、当該ヒト幹細胞を、当該ヒト外因性ミトコンドリアについて富化することを可能にする条件は、4.5%ヒト血清アルブミンを補給した生理食塩水中での室温でのインキュベーションを含む。
ある特定の実施形態では、単離されたミトコンドリアは、ミトコンドリアが得られた後、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60分、標的細胞とともにインキュベートされる。追加の実施形態では、単離されたミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアが得られた後、約0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間、標的細胞とともにインキュベートされる。一態様では、ミトコンドリアは、ドナーから得られる。別の態様では、外因性ミトコンドリアは、標的細胞に対して自家または同種異系である。
ある特定の実施形態では、インキュベーションは、37℃で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも6時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも12時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、12~24時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、0.88ミリユニットのCSを有するかまたは示す外因性ミトコンドリアの量につき1×105~1×107個の標的細胞の割合で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、0.88ミリユニットのCSを有するかまたは示す外因性ミトコンドリアの量につき1×106個のナイーブ幹細胞の割合で実行される。ある特定の実施形態では、条件は、CS活性によって決定されるように、ナイーブ幹細胞のミトコンドリア含有量を少なくとも約1%、3%、5%、または10%増加させるのに十分である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
本明細書で使用される場合、「富化」という用語は、哺乳動物細胞の、ミトコンドリア含有量、例えば、無傷のミトコンドリアの数、またはミトコンドリアの機能を増加させるように設計された任意の作用を指す。特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアについて富化された幹細胞は、富化前の同じ幹細胞と比較して、機能の向上を示すことになる。
クエン酸シンターゼ(CS)は、ミトコンドリアマトリックスに局在するが、核DNAによってコードされている。クエン酸シンターゼは、クレブス回路の第1のステップに関与し、無傷のミトコンドリアの存在に対する定量的酵素マーカーとして一般的に使用される(Larsen S.et al.,J.Physiol.,2012,Vol.590(14),pages 3349-3360、Cook G.A.et al.,Biochim.Biophys.Acta.,1983,Vol.763(4),356~367ページ)。
ミトコンドリアの用量は、本明細書で説明するように、外因性ミトコンドリアの量の他の定量化可能な尺度であるCS活性のユニットまたはmtDNAコピー数で表すことができる。「CS活性のユニット」は、1mLの反応体積で1分間に1マイクロモルの基質の変換を可能にする量として定義される。
いくつかの実施形態では、幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化は、百万個の細胞当たり少なくとも0.044~176ミリユニット(mU)のクエン酸シンターゼ(CS)活性、百万個の細胞当たり少なくとも0.088~176mUのCS活性、百万個の細胞当たり少なくとも0.2~150mUのCS活性、百万個の細胞当たり少なくとも0.4~100mUのCS活性、百万個の細胞当たり少なくとも0.6~80mUのCS活性、百万個の細胞当たり少なくとも0.7~50mUのCS活性、百万個の細胞当たり少なくとも0.8~20mUのCS活性、百万個の細胞当たり少なくとも0.88~17.6mUのCS活性、または百万個の細胞当たり少なくとも0.44~17.6ミリユニットのCS活性のミトコンドリアの用量を標的細胞に導入することを含む。
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア含有量」という用語は、1つの細胞内のミトコンドリアの量、または複数の細胞内のミトコンドリアの平均量を指す。本明細書で使用される場合、「増加したミトコンドリア含有量」という用語は、ミトコンドリア富化前の標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高いミトコンドリア含有量を指す。
ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアについて富化されたヒト幹細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い。様々な実施形態によれば、ミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、標的細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも3%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%以上高い。
ある特定の実施形態では、標的細胞は新鮮なまま使用される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ミトコンドリアについての富化の前または後に凍結および解凍される。
ある特定の実施形態では、標的細胞またはミトコンドリア富化標的細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの含有量を決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、幹細胞または富化幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの活性レベルを決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、幹細胞または富化幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの含有量と相関する。ある特定の実施形態では、幹細胞または富化幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの活性レベルと相関する。CS活性は、市販のキット、例えば、CS活性キットCS0720(Sigma)を使用することによって測定することができる。
ミトコンドリアDNA含有量は、核遺伝子に対して正規化された、ミトコンドリア富化の前後のミトコンドリア遺伝子の定量的PCRを実行することによって測定され得る。
特定の状況では、ミトコンドリア富化前の同じ細胞は、CSおよびATP活性を測定し、富化レベルを決定するための対照として機能する。
ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出可能に高い」という用語は、正常値と増加した値との間の統計的に有意な増加を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出可能に高い」という用語は、非病理学的増加、すなわち、実質的に高い値と関連する病理学的症状が目に見えないレベルを指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「増加した」という用語は、健康な対象または複数の健康な対象の対応する細胞もしくは対応するミトコンドリア、またはミトコンドリア富化前の標的細胞に見られる対応する値よりも1.05倍、1.1倍、1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍以上高い値を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
本明細書で使用される場合、「増加したミトコンドリアDNA含有量」という用語は、ミトコンドリア富化前の、標的細胞中のミトコンドリアDNA含有量よりも、検出可能に高いミトコンドリアDNAの含有量を指す。ミトコンドリア含有量は、SDHAまたはCOX1の含有量を測定することにより決定され得る。本明細書および特許請求の範囲の文脈において、「正常なミトコンドリアDNA」は、ミトコンドリア病と関連することが既知である突然変異または欠失を持たない/有さないミトコンドリアDNAを指す。本明細書で使用される場合、「正常な酸素(O2)消費率」という用語は、健康な個体からの細胞の平均O2消費を指す。本明細書で使用される場合、「クエン酸シンターゼの正常な活性レベル」という用語は、健康な個体からの細胞におけるクエン酸シンターゼの平均活性レベルを指す。本明細書で使用される場合、「正常なアデノシン三リン酸(ATP)産生率」という用語は、健康な個体からの細胞における平均ATP産生率を指す。
幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化の程度は、酸素(O2)消費率、クエン酸シンターゼの含有量または活性レベル、アデノシン三リン酸(ATP)産生率を含むがこれらに限定されない機能的および/または酵素的アッセイによって決定され得る。代替では、幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化は、ドナーのミトコンドリアDNAの検出によって確認することができる。いくつかの実施形態によれば、幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化の程度は、ヘテロプラスミーの変化のレベルによって、および/または細胞当たりのmtDNAのコピー数によって決定され得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
TMRM(テトラメチルローダミンメチルエステル)または関連するTMRE(テトラメチルローダミンエチルエステル)は、ミトコンドリア膜電位の変化を特定することにより、生細胞のミトコンドリア機能を評価するために一般的に使用される細胞透過性蛍光発生色素である。いくつかの実施形態によれば、富化のレベルは、TMREまたはTMRMで染色することによって決定することができる。
いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア膜の無傷性は、当技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。非限定的な例では、ミトコンドリア膜の無傷性は、テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)またはテトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE)蛍光プローブを使用して測定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。顕微鏡下で観察され、TMRMまたはTMRE染色を示すミトコンドリアには、無傷ミトコンドリア外膜を有する。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア膜」という用語は、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア外膜、およびその両方からなる群から選択されるミトコンドリア膜を指す。
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、細胞中の全ミトコンドリアDNAの少なくとも統計的に代表的な部分を配列決定し、宿主/内因性ミトコンドリアDNAおよび外因性ミトコンドリアDNAの相対レベルを決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中のミトコンドリアの富化のレベルは、一ヌクレオチド多型(SNP)分析によって決定される。ある特定の実施形態では、最大のミトコンドリア集団および/もしくは最大のミトコンドリアDNA集団は、宿主/内因性ミトコンドリア集団および/もしくは宿主/内因性ミトコンドリアDNA集団であり、かつ/または2番目に大きいミトコンドリア集団および/もしくは2番目に大きいミトコンドリアDNA集団は、外因性ミトコンドリア集団および/もしくは外因性ミトコンドリアDNA集団である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態によれば、幹細胞の、外因性ミトコンドリアについての富化は、当技術分野で認識されている従来のアッセイによって決定することができる。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト標的細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、(i)宿主/内因性ミトコンドリアDNAおよび外因性ミトコンドリアDNAのレベル、(ii)クエン酸シンターゼ(CS)、チトクロームCオキシダーゼ(COX1)、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラビンタンパク質サブユニットA(SDHA)、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるミトコンドリアタンパク質のレベル、(iii)CS活性レベル、または(iv)(i)、(ii)、および(iii)の任意の組み合わせによって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中のミトコンドリアの富化のレベルは、(i)同種異系ミトコンドリアの場合、宿主ミトコンドリアDNAおよび外因性ミトコンドリアDNAのレベル、(ii)クエン酸シンターゼ活性のレベル、(iii)コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラボタンパク質サブユニットA(SDHA)もしくはチトクロームCオキシダーゼ(COX1)のレベル、(iv)酸素(O2)消費率、(v)アデノシン三リン酸(ATP)産生率、または(vi)それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つによって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。これらの様々なパラメーターを測定するための方法は、当技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、幹細胞の、外因性ヒトミトコンドリアについての富化は、ヒト幹細胞を当該単離した外因性ヒト外因性ミトコンドリアとインキュベートした後に、ミトコンドリア富化標的細胞を洗浄することを含む。このステップは、細胞片またはミトコンドリア膜の残遺物および幹細胞に入らなかったミトコンドリアを実質的に欠いている、ミトコンドリア富化標的細胞を提供する。いくつかの実施形態では、洗浄は、ヒト標的細胞と当該単離された外因性ヒトミトコンドリアとのインキュベーション後に、ミトコンドリア富化標的細胞を遠心分離することを含む。いくつかの実施形態によれば、本方法は、遊離ミトコンドリア、すなわち、幹細胞に入らなかったミトコンドリアまたは他の細胞片から分離されているミトコンドリア富化ヒト幹細胞を産生し、本医薬組成物は、遊離ミトコンドリアから分離されているミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含有する。いくつかの実施形態によれば、検出可能な量の遊離ミトコンドリアを含まないミトコンドリア富化ヒト幹細胞を、本方法は産生し、本医薬組成物はそれを含有する。
ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーションおよび/または接触の前に、またはインキュベーションおよび/または接触中に、標的細胞および単離された外因性ミトコンドリアを濃縮することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーションまたは接触の前、インキュベーションまたは接触中、またはインキュベーションまたは接触の後に、標的細胞および単離された外因性ミトコンドリアの遠心分離をさらに含む。いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、標的細胞と単離されたミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に一回の遠心分離ステップを含む。
ある特定の実施形態では、遠心速度は約7,000gまたは8,000gである。さらなる実施形態によれば、遠心分離は、300g~8000g、500g~8000g、1000g~8000g、300g~5000g、2000g~4000g、2500g~8500g、3000g~8000g、4000g~8000g、5,000~10,000g、7000g~8000g、または2500g超の速度である。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約2分~30分、3分~25分、5分~20分、または8分~15分の範囲の時間にわたって実行される。
いくつかの実施形態では、遠心分離は、約2~6℃、4~37℃、4~10℃、または16~30℃の範囲の温度で行われる。特定の実施形態では、遠心分離は4℃で実行される。いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、標的細胞と単離された外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に一回の遠心分離、続いて30℃未満の温度での細胞の静置を含む。いくつかの実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアがヒト標的細胞に入るのを可能にする条件は、標的細胞と、単離されたミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に一回の遠心分離、続いて16~28℃の範囲の温度での細胞の静置を含む。
いくつかの実施形態では、対象の体重1キログラム当たり少なくとも104~2×108個、5×105~1.5×107個、または5×105~4×107個のミトコンドリア富化標的細胞の濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化幹細胞を生成し、および/または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化幹細胞を含有する。いくつかの実施形態では、患者の体重1キログラム当たり少なくとも106~107個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞の濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化標的細胞を生成し、および/または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化標的細胞を含有する。他の実施形態では、患者の体重1キログラム当たり少なくとも105または少なくとも106個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞の濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化標的細胞を生成し、および/または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化標的細胞を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも5×105~最大5×109個のミトコンドリア富化標的細胞の合計濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化幹細胞を生成し、および/または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化幹細胞を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも106~最大109個のミトコンドリア富化標的細胞の合計濃度で、本方法は、ミトコンドリア富化標的細胞を生成し、および/または本医薬組成物は、ミトコンドリア富化標的細胞を含有する。他の実施形態では、合計少なくとも2×106~最大5×108個のミトコンドリア富化標的細胞を、本方法は生成し、および/または本医薬組成物はそれを含む。
ある特定の実施形態では、標的細胞は、新鮮である。ある特定の実施形態では、第2の組成物は、凍結され、次いでインキュベーションの前に解凍される。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは、新鮮である。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは、凍結され、次いでインキュベーションの前に解凍される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、新鮮である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、凍結され、次いで投与の前に解凍される。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は凍結されない。さらなる実施形態では、単離された富化標的細胞は、凍結され、次いで保存され、使用前に解凍される。さらなる実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、凍結および保存せずに使用される。またさらなる実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、凍結、保存、および解凍後に使用される。生存能力を維持するために細胞調製物を凍結および解凍するのに好適な方法は、当技術分野で周知である。
本明細書で使用される場合、「凍結-解凍サイクル」という用語は、単離された外因性ミトコンドリアを0℃未満の温度に凍結し、ミトコンドリアを0℃未満の温度で所定の期間維持し、単離されたミトコンドリアを室温または体温または単離されたミトコンドリアによる標的細胞の処置を可能にする0℃を超える任意の温度に解凍することを指す。本明細書で使用される場合、「室温」という用語は、典型的には、18℃~25℃の温度を指す。本明細書で使用される場合、「体温」という用語は、35.5℃~37.5℃、好ましくは37℃の温度を指す。
別の実施形態では、凍結-解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、-20℃以下、-4℃以下、または-70℃以下の温度で凍結された。別の実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、段階的である。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、瞬間凍結による。本明細書で使用される場合、「瞬間凍結」という用語は、ミトコンドリアを低温貯蔵温度に供することによって急速に凍結することを指す。
別の実施形態では、凍結-解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも30分間凍結された。別の実施形態によれば、凍結-解凍サイクルは、単離された外因性ミトコンドリアを解凍前に少なくとも30、60、90、120、180、210分間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結-解凍サイクルを受けた単離された外因性ミトコンドリアは、解凍前に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、48、72、96、または120時間凍結された。別の実施形態では、凍結-解凍サイクルを受けた単離された外因性ミトコンドリアは、解凍前に少なくとも4、5、6、7、30、60、120、365日間凍結された。別の実施形態によれば、凍結-解凍サイクルは、単離された外因性ミトコンドリアを解凍前に少なくとも1、2、3週間凍結することを含む。別の実施形態によれば、凍結-解凍サイクルは、単離された外因性ミトコンドリアを解凍前に少なくとも1、2、3、4、5、6か月間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結-解凍サイクル後の単離された外因性ミトコンドリアの酸素消費量は、凍結-解凍サイクル前の外因性ミトコンドリアの酸素消費量と等しいかまたはそれよりも高い。
ある特定の実施形態によれば、解凍は、室温である。別の実施形態では、解凍は、体温である。別の実施形態によれば、解凍は、本発明の方法によるミトコンドリアの投与を可能にする温度である。別の実施形態によれば、解凍は、段階的に実行される。
ある特定の実施形態では、上記の方法は、疾患もしくは障害に罹患している対象にまたはドナーに、末梢血への骨髄細胞の動員を誘導する薬剤を投与する先行ステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、骨髄細胞/骨髄で産生された幹細胞の、末梢血への動員を誘導する薬剤は、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、1,1’-[1,4-フェニレンビス(メチレン)]ビス[1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン](Plerixafor、CAS番号155148-31-5)、CXCR4阻害剤、それらの塩、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、上記の方法は、疾患もしくは障害に罹患している対象のおよび/またはドナーの末梢血から幹細胞を単離することをさらに含む。本明細書で使用される場合、「末梢血から単離する」という用語は、血液の他の成分からの幹細胞の単離を指す。
アフェレーシス中、対象またはドナーの血液は、1つの特定の成分を分離し、残りを循環に戻す装置を通過する。したがって、それは体外で実行される医療手順である。ある特定の実施形態では、単離はアフェレーシスによって実行される。
ある特定の実施形態では、幹細胞であり得る標的細胞は、疾患もしくは障害に罹患している対象からまたはドナーから得られ、標的細胞は、(i)正常な酸素(O2)消費率、(ii)正常なクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル、(iii)正常なアデノシン三リン酸(ATP)産生率、または(iv)(i)、(ii)、および(iii)の任意の組み合わせを有する。
ある特定の実施形態では、幹細胞であり得る標的細胞は、疾患もしくは障害に罹患している対象からまたはドナーから得られ、標的細胞は、疾患もしくは障害に罹患していない対象と比較して、(i)減少した酸素(O2)消費率、(ii)減少したクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル、(iii)減少したアデノシン三リン酸(ATP)産生率、または(iv)(i)、(ii)、および(iii)の任意の組み合わせを有する。
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、標的細胞と比較して、(i)増加した酸素(O2)消費率、(ii)増加したクエン酸シンターゼ含有量もしくは活性レベル、(iii)増加したアデノシン三リン酸(ATP)産生率、(iv)増加したミトコンドリアDNA含有量、(v)より低いヘテロプラスミーレベル、または(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、および(v)の任意の組み合わせを有する。
本明細書で使用される場合、「増加した酸素(O2)消費率」という用語は、ミトコンドリア富化前の酸素(O2)消費率よりも検出可能に高い酸素(O2)消費率を指す。
本明細書で使用される場合、「増加したクエン酸シンターゼ含有量または活性レベル」という用語は、ミトコンドリア富化前のクエン酸シンターゼの含有量値または活性レベルよりも検出可能に高いクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを指す。
本明細書で使用される場合、「増加したアデノシン三リン酸(ATP)産生率」という用語は、ミトコンドリア富化前のアデノシン三リン酸(ATP)産生率よりも検出可能に高いアデノシン三リン酸(ATP)産生率を指す。
いくつかの態様によれば、本発明は、治療を必要とするヒト対象において、疾患もしくは障害またはそれらの症状を治療する方法を提供し、方法は、複数のミトコンドリア富化標的細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
「治療」という用語は、本明細書では、「治療方法」という用語と互換的に使用され、1)診断された病理状態もしくは障害の治癒、緩徐化、症状の軽減、および/または進行の停止、ならびに2)ならびに予防(prophylactic)/予防(preventative)措置の両方を指す。治療を必要とする個体には、既に特定の医学的障害を有する個体、ならびに最終的にその障害を獲得し得る個体(すなわち、予防措置を必要とする個体)が含まれ得る。
「治療有効量」、「有効用量」、「治療有効用量」、「有効量」などの用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医によって求められている組織、システム、動物、またはヒトの生物学的もしくは医学的な応答を誘発する対象化合物の量を指す。一般に、応答は、患者の症状の改善または所望の生物学的転帰のいずれかである。有効量は、本明細書に記載されるように決定することができる。
「の投与」および/または「投与すること」という用語は、治療を必要とする対象に治療有効量の医薬組成物を提供することを意味すると理解されるべきである。投与経路は、経腸、局所、または非経口であり得る。そのため、投与経路は、静脈内、腹腔内、動脈内、および筋肉内が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口で投与される」という語句は、腸内および局所投与以外の投与様式を意味する。医薬組成物は、投与方法に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、坐剤、パッチ剤、点鼻剤、注射剤、植込み型徐放性製剤、脂質複合体などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明はさらに、別の態様では、上記のように複数のミトコンドリア富化標的細胞を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、上記の医薬組成物は、障害を有するヒト対象のある特定の症状を治療する方法で使用するためのものである。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、活性成分、および任意選択で薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む製剤を指す。「活性成分(active ingredient)」という用語は、「有効成分(effective ingredient)」を同義的に指すことができ、投与時に求められる効果を誘発することができる任意の薬剤を指すことを意味する。活性成分の例には、化合物、薬物、治療剤、小分子などが含まれるが、これらに限定されない。
「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、または賦形剤が、製剤の他の成分と適合する必要があり、そのレシピエントにも、製剤の活性成分の活性にも有害ではないことを意味する。薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤は、当技術分野において、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.Ed.(1980)において周知である。薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度ではレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類;ナトリウムなどの塩形成対イオン; 金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体);ならびに/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含み得る。担体の例には、リポソーム、ナノ粒子、軟膏、ミセル、マイクロスフェア、マイクロパーティクル、クリーム、エマルション、およびゲルが含まれるが、これらに限定されない。賦形剤の例には、ステアリン酸マグネシウムなどの付着防止剤、糖類およびそれらの誘導体(スクロース、乳糖、デンプン、セルロース、糖アルコールなど)などの結合剤、ゼラチンなどのタンパク質および合成ポリマー、タルクおよびシリカなどの滑沢剤、ならびに抗酸化剤、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、パルミチン酸レチニル、セレン、システイン、メチオニン、クエン酸、硫酸ナトリウム、およびパラベンなどの防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。希釈剤の例には、水、アルコール、生理食塩水、グリコール、鉱油、およびジメチルスルホキシド(DMSO)が含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、症状は、歩行能力障害、運動技能障害、言語技能障害、記憶障害、体重減少、悪液質、低血中アルカリホスファターゼレベル、低血中マグネシウムレベル、高血中クレアチニンレベル、低血中重炭酸塩レベル、低血中塩基過剰レベル、高尿中グルコース/クレアチニン比、高尿中塩化物/クレアチニン比、高尿中ナトリウム/クレアチニン比、高血中乳酸レベル、高尿中マグネシウム/クレアチニン比、高尿中カリウム/クレアチニン比、高尿中カルシウム/クレアチニン比、糖尿、マグネシウム尿、高血中尿素レベル、低C-ペプチドレベル、高HbA1Cレベル、副甲状腺機能低下症、眼瞼下垂、聴力損失、心伝導障害、低ATP含有量、およびリンパ球における酸素消費量、双極性障害、強迫性障害、うつ病性障害、ならびにパーソナリティ障害を含む気分障害からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。症状を「高い」および「低い」と定義することは、それぞれ「正常より検出可能に高い」および「正常より検出可能に低い」に対応し、正常レベルは、ミトコンドリア病に罹患していない複数の対象における対応するレベルであることを理解されたい。
ある特定の実施形態では、富化幹細胞は、特定の組織または器官に投与される。ある特定の実施形態では、富化幹細胞は、少なくとも104個のミトコンドリア富化標的細胞を有する。
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、非経口投与によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与、静脈内投与または静脈内注入によって投与される。ある特定の実施形態では、富化幹細胞は、少なくとも105個のミトコンドリア富化標的細胞を有する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化標的細胞は、少なくとも約104個、少なくとも104~少なくとも108個、少なくとも106~少なくとも108個、少なくとも105~少なくとも2×107個、少なくとも106~少なくとも5×106個、または少なくとも105個のミトコンドリア富化標的細胞を有する。
ある特定の実施形態では、幹細胞であり得るミトコンドリア富化標的細胞は、(i)ミトコンドリア富化前の標的細胞におけるミトコンドリアDNA含有量と比較して、増加したミトコンドリアDNA含有量、(ii)ミトコンドリア富化前の標的細胞における酸素(O2)消費率と比較して、増加した酸素(O2)消費率、(iii)ミトコンドリア富化前の標的細胞におけるクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベルと比較して、増加したクエン酸シンターゼ含有量もしくは活性レベル、(iv)ミトコンドリア富化前の標的細胞におけるアデノシン三リン酸(ATP)産生率と比較して、増加したアデノシン三リン酸(ATP)産生率、または(v)より低いヘテロプラスミーレベル、(i)、(ii)、(iii)、(iv)、および(v)の任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを有する。
ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、細胞タンパク質の総量の10%~80%、20~70%、40~70%、20~40%、または20~30%である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の20%~80%である。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内画分の合わせた重量の20%~80%である。他の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内画分の合わせた重量の80%を超える。
いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、標的細胞を、標的細胞を拡大増殖させることができる増殖培地中で当該幹細胞を培養することによって拡大増殖させることをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、ミトコンドリア富化標的細胞を、標的細胞を拡大増殖させることができる培養または増殖培地中で当該細胞を培養することによって拡大増殖させることをさらに含む。本出願を通して使用される場合、「培養または増殖培地」という用語は、細胞培養培地、細胞成長培地、細胞に栄養を提供する緩衝液などの流体培地である。
ある特定の実施形態では、標的細胞は、障害に罹患している対象に対して同種異系である。「対象に対して同種異系」という用語は、患者の細胞に対してHLA適合であるか、または少なくとも部分的にHLA適合である幹細胞またはミトコンドリアを指す。ある特定の実施形態によれば、ドナーは、特定のミトコンドリアDNAハプログループの特定により対象に適合される。ある特定の実施形態では、対象は、幹細胞および/またはミトコンドリアの供給源である。
本明細書で使用される場合、「HLA適合」という用語は、対象および標的細胞のドナーが、少なくとも対象がドナーの標的細胞に対する急性免疫応答を発症しない程度まで可能な限り厳密にHLA適合であるようにという所望を指す。かかる免疫応答の予防および/または治療は、免疫抑制剤の急性的または慢性的使用により達成されても、それによらずに達成されてもよい。ある特定の実施形態では、ドナーからの幹細胞は、患者が幹細胞を拒絶しない程度まで患者に対してHLA適合である。
ある特定の実施形態では、患者は、幹細胞移植片の免疫拒絶を防ぐために免疫抑制療法によってさらに治療される。
本明細書で使用される場合、「ハプログループ」という用語は、母系で共通の祖先を共有する人々の遺伝的集団群を指す。ミトコンドリアハプログループは、シーケンシングによって決定される。
ある特定の実施形態では、ミトコンドリアは、同一のハプログループからである。他の実施形態では、ミトコンドリアは、異なるハプログループからである。
ある特定の実施形態では、上記の方法は、医薬組成物の投与の前に、対象に移植前コンディショニング剤を投与する先行ステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、「移植前コンディショニング剤」という用語は、ヒト対象の骨髄内の骨髄細胞を殺傷することができる任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、移植前コンディショニング剤はブスルファンである。
ある特定の実施形態によれば、単離されたミトコンドリアは、対象の障害に従って、特定のミトコンドリアハプログループから選択されるドナーから単離される。
リンパ球欠乏症は、対象が異常に低レベルのリンパ球にある状態である。対象は、Tリンパ球減少症、Bリンパ球減少症、またはNKリンパ球減少症に罹患している可能性がある。リンパ球欠乏症は、コルチコステロイドの使用;ウイルス、微生物および真菌感染症;栄養不良、過度の身体運動、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、サルコイドーシス、および多発性硬化症と関連している。
リンパ球欠乏症関連疾患または障害は、対象が異常に低レベルのリンパ球を有する任意の疾患または障害である。リンパ球欠乏症関連疾患または障害の例としては、ウイルス、微生物および真菌感染症;全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、サルコイドーシス、および多発性硬化症が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、造血幹細胞(HSC)を、単離された外因性ミトコンドリアとともに、単離された外因性ミトコンドリアがHSCに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、対象に(a)からのHSCを投与することとを含む、対象における1つのリンパ球欠乏症関連疾患または複数のリンパ球欠乏症関連疾患の衰弱作用を軽減するための方法を提供する。ある特定の態様では、HSCは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも1回の凍結-解凍サイクルを受けている。様々な態様では、HSCは、対象に投与する前に洗浄される。
骨髄または造血幹細胞移植の前に、対象は、基礎疾患を排除し、新しい細胞の拒絶を防止するためのコンディショニングプロセスを経てもよい。コンディショニングレジメンは、化学療法剤および/または全身照射の投与を含む。
本明細書で使用される場合、「コンディショニングされた対象(conditioned subject)」という用語は、骨髄またはHSC移植を受けることになり、化学療法剤および/または全身照射の投与を伴うコンディショニング治療を受けた対象を指す。
本明細書で使用される場合、「コンディショニングされていない対象」(non-condition subject)という用語は、骨髄またはHSC移植を受けることになり、化学療法剤および/または全身照射の投与を伴うコンディショニング治療を受けていない対象を指す。
追加の態様では、本発明は、対象における造血幹細胞(HSC)移植を改善するための方法であって、造血幹細胞(HSC)を、単離された外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがHSCに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、このHSCを対象に投与することとを含む、方法を提供する。ある特定の態様では、HSCは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも1回の凍結-解凍サイクルを受けている。様々な態様では、HSCは、対象に投与する前に洗浄される。
一実施形態では、本発明は、疾患または障害を治療する方法であって、外因性ミトコンドリアが細胞に入るのを可能にする条件下で細胞を外因性ミトコンドリアに接触させることによってミトコンドリア富化細胞を産生することと、目的の遺伝子を有するウイルスベクターをミトコンドリア富化細胞に形質導入することと、ミトコンドリア富化形質導入細胞を対象に投与することとによる、方法を提供する。一実施形態では、本発明は、疾患または障害を治療する方法であって、目的の遺伝子を有するウイルスベクターを細胞に形質導入することと、形質導入細胞を、外因性ミトコンドリアに、外因性ミトコンドリアが細胞に入るのを可能にする条件下で接触させることによって、ミトコンドリア富化細胞を産生することと、ミトコンドリア富化形質導入細胞を対象に投与することとによる、方法を提供する。一態様では、細胞は、幹細胞である。ある特定の態様では、細胞は、造血幹細胞(HSC)または免疫不全細胞である。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターまたはレンチウイルスベクターである。追加の態様では、ミトコンドリア富化形質導入細胞の投与は、非増強細胞と比較して、B細胞の数を増加させる。ある特定の態様では、B細胞は、プレB細胞またはプロB細胞である。さらなる態様では、ミトコンドリア富化形質導入細胞の投与は、非増強細胞と比較して、IgM陽性細胞の数を増加させる。一実施形態では、ミトコンドリア富化は、形質導入細胞の数を増加させる。
遺伝子療法技術は、遺伝子改変自家造血幹細胞(HSC)の移植に基づく。遺伝子療法は、疾患を治療または予防するために遺伝子を使用する。最も一般的な形態の遺伝子療法は、異常な遺伝子を置き換えるために正常な遺伝子を挿入することを含む。他のアプローチとしては、異常遺伝子を正常なものと交換すること、異常遺伝子を修復すること、および遺伝子がオンまたはオフにされる程度を変更することが挙げられる。幹細胞遺伝子療法は、比較的少数の幹細胞の遺伝子改変に基づいている。これらは自己再生を経ることによって体内に長期間存続し、遺伝的に「修正された」子孫を大量に生み出す。HSCは、遺伝子改変が分化するにつれてすべての血液細胞系統に渡されるため、遺伝子療法に特に魅力的な標的である。
HSCおよびその子孫の効率的な長期的な遺伝子改変には、HSC機能に影響を与えることなく、ゲノムへの修正DNAの安定的な組込みを可能にする技術が必要である。したがって、y-レトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスなどの組込み組換えウイルスシステムの使用が、この分野を支配している(Chang,A.H.et al.(2007)Mol.Ther.15:445-456)。治療効果は、アデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全症(ADA-SCID、Aiuti,A.et al.(2009)N.Engl.J.Med.360:447-458)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID-X1、Hacein-Bey-Abina,S.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363: 355-364)およびウィスコット・アルドリッチ症候群(WAS、Boztug,K.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363:1918-1927)のy-レトロウイルスベースの臨床試験ですでに達成されている。加えて、レンチウイルスは、X連鎖副腎白質ジストロフィーの治療において(ALD;Cartier,N.et al.(2009)Science326:818-823)、ならびに異染性白質ジストロフィー(MLD;Biffi,A.et al.(2013)Science341:1233158)、およびWAS(Aiuti,A.et al.(2013)Science 341:1233151)のために、送達ビヒクルとして用いられている。
ベクターは、発現カセットおよび/または導入遺伝子を細胞のゲノムに組み込むベクターの能力を指す、組込みベクターまたは非組込みベクターであり得る。組込みベクターまたは非組込みベクターのいずれかを使用して、調節要素に作動可能に連結された遺伝子を含有する発現カセットを送達することができる。ベクターの例としては、(a)線状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドを含む核酸ベクター等の非ウイルスベクター、ヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、および細菌人工染色体(BACまたはPAC)等の人工染色体、エピソームベクター、トランスポゾン(例えば、PiggyBac)、ならびに(b)レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびAAVベクター等のウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは、特定の標的細胞または組織に対する高い感染性および/またはトロピシズムを含む、核酸の送達に関していくつかの利点を有する。場合によっては、ウイルスは、本明細書に記載のように、遺伝子に作動可能に連結された1つ以上の調節要素を含む核酸分子または発現カセットを送達するために使用される。
発現ベクターは、目的のポリヌクレオチドの転写を制御するための調節要素を含むことができる。調節要素の非限定的な例としては、プロモーター、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列(例えば、配列内リボソーム進入セグメント、IRES)、エンハンサー、またはイントロンが挙げられる。かかる要素は、転写、mRNAの安定性、翻訳効率等に影響を与えることによって発現を増加させる場合があるが、必要ではない場合もある。かかる要素は、細胞における核酸の最適な発現を得るために、所望に応じて核酸構築物に含めることができる。ベクターには、他の要素も含めることもできる。例えば、ベクターは、コードされたポリペプチドが特定の細胞位置に向けられるように、シグナルペプチドをコードする核酸(例えば、タンパク質を細胞によって分泌させるシグナル分泌配列)、または選択可能なマーカーをコードする核酸を含むことができる。選択可能なマーカーの非限定的な例には、ピューロマイシン、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(neo、G418、APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ(TK)、およびキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)が含まれる。かかるマーカーは、培養物中の安定した形質転換体を選択するのに有用である。調節配列は、一般に、哺乳類、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来し得る。通常は複製起点により付与される宿主における複製能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子。当業者は、かかるベクターに含まれる好適な調節領域を選択することができる。
ベクターは、ゲノムに組み込まれるベクター、または宿主細胞の染色体DNAに組み込まれ得る「組込み型ベクター」であることができ、またはエピソームベクター、例えば、染色体外複製が可能な核酸であり得る。それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書では、「発現ベクター」と称される。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、およびウシパピローマウイルスベクターが挙げられる(ウイルスおよび非ウイルスベクターの概説に関するKay et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12744-12746(1997)を参照されたい)。ウイルスベクターは、改変されて、ウイルス本来のトロピズムおよび病原性が変更または除去されている。ウイルスのゲノムはまた、その感染性を高め、目的のポリペプチドをコードする核酸のパッケージングに適合させるように改変することもできる。
「AAV」という用語は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその派生物を指すように使用され得る。この用語は、別段必要とされる場合以外、すべての血清型、亜型、ならびに天然型および組換え型の両方の形態をカバーする。略語「rAAV」は、組換えAAVベクター(または「rAAVベクター」)とも称される、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。「AAV」という用語は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rhlO、およびそれらのハイブリッド、鳥類AAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、およびヒツジAAVを含む。
遺伝子療法における「レンチウイルスベクター」の使用は、レンチウイルスを使用して生物において遺伝子を挿入、改変、または欠失させることができる方法を指す。レンチウイルスは、宿主細胞のゲノムにDNAを挿入することによって感染するウイルスのファミリーである。かかるウイルスの多くは、遺伝子療法におけるウイルスを使用した研究の基礎となってきたが、レンチウイルスは、非分裂細胞に感染する能力が独特であり、したがって、より広い範囲の潜在的応用を有する。レンチウイルスは、内因性(ERV)となり、それらのゲノムを宿主生殖細胞系ゲノムに組み込むことができ、その結果、ウイルスが宿主の子孫によって継承される。遺伝子療法に有効であるためには、宿主細胞遺伝子の挿入、変更、および/または除去が行われなければならない。これを行うために、科学者らはレンチウイルス感染の機構を使用して、遺伝子療法の所望の結果を達成する。遺伝子療法に使用することができる非限定的な例またはレンチウイルスとしては、ウシ免疫不全ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス1、ヒト免疫不全ウイルス2、ジェンブラナ病ウイルス、ピューマレンチウイルス、サル免疫不全ウイルスまたはビスナ・マエディウイルスに由来するものが挙げられる。
レトロウイルスおよびレンチウイルスベースベクターの使用に加えて、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)などの他のウイルスに由来するベクターも、造血幹細胞および前駆細胞の改変に利用され得る。
当業者に既知のように、遺伝子改変は、部位特異的エンドヌクレアーゼを用いてDNA内の二本鎖切断(DSB)を誘導することによって、標的遺伝子編集によって達成され得る(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR))。
別の実施形態では、遺伝子療法は、遺伝子発現を増大させるために使用することができる。いくつかの実施形態によれば、増強形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、増加した増殖を提供する。いくつかの実施形態によれば、増強形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、分化が増加する。別の態様では、ミトコンドリアによって増強された形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して増加した遺伝子発現を有する。いくつかの実施形態によれば、増強形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、導入遺伝子を発現する細胞の数が増加している。
さらなる実施形態では、本発明は、対象における造血幹細胞(HSC)移植を改善するための方法であって、造血幹細胞(HSC)を、単離された外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがHSCに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、HSCを対象に投与することとを含む、方法を提供する。一態様では、HSCは、遺伝子改変されている。追加の態様では、対象は、原発性免疫不全症(例えば、ウィスコット・アルドリッチ症候群、白血球粘着不全症、X連鎖高IgM症候群、X連鎖リンパ増殖性疾患、X連鎖無ガンマグロブリン血症、X連鎖重症複合免疫不全、慢性肉芽腫性疾患)、ヘモグロビン異常症(例えば、鎌状赤血球症、ベータサラセミア)、貯蔵および代謝障害(例えば、ゴーシェ病および他の脂質代謝異常、ムコ多糖症(I-VII)、X連鎖副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、大理石骨病)、先天性血球減少症および幹細胞欠損症(例えば、ファンコニ貧血、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、コストマン症候群)から選択される疾患または障害を有する。さらなる態様では、リソソーム蓄積症は、ゴーシェ病I型である。ある特定の態様では、HSCは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも1回の凍結-解凍サイクルを受けている。様々な態様では、HSCは、対象に投与する前に洗浄される。
一実施形態では、本発明は、対象における免疫不全または免疫関連疾患を治療するための方法であって、造血幹細胞(HSC)を、外因性ミトコンドリアとともに、外因性ミトコンドリアがHSCに入るのを可能にする条件下でインキュベートすることと、HSCを対象に投与することとによる、方法を提供する。ある特定の態様では、HSCは、自家または同種異系幹細胞である。追加の態様では、外因性ミトコンドリアは、ドナーから単離される。さらなる態様では、外因性ミトコンドリアは、少なくとも1回の凍結-解凍サイクルを受けている。一態様では、HSCは、インビトロで拡大増殖される。追加の態様では、HSCは、少なくとも1回の凍結-解凍サイクルを受けている。さらなる態様では、HSCは、インビトロでの拡大増殖の前または後に、少なくとも1回の凍結-解凍サイクルを受けている。ある特定の態様では、HSCは、外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前または後に、少なくとも1回の凍結-解凍サイクルを受けている。追加の態様では、外因性ミトコンドリアが標的細胞に入るのを可能にする条件は、106個の細胞当たり約0.088~176mUのクエン酸シンターゼ(CS)活性の割合で、標的細胞を外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることを含み得る。
本明細書で使用される場合、「治療」および「治療すること」という用語は、1)診断された病的状態もしくは障害の治癒、緩徐化、症状の軽減、および/または進行の停止する治療的処置および手段、ならびに2)ならびに予防(prophylactic)/予防(preventative)措置の両方を指す。治療を必要とする個体には、既に特定の医学的障害を有する個体、ならびに最終的にその障害を獲得し得る個体(すなわち、予防措置を必要とする個体)が含まれ得る。
免疫関連疾患は、免疫系に影響を与える疾患である。かかる疾患および障害は、自己免疫疾患および免疫不全疾患および障害を含む。自己免疫疾患は、免疫系が正常な体組織を攻撃する抗体を産生させる疾患である。自己免疫疾患の例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スプルー皮膚炎、慢性疲労性免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症-線維筋炎(Fibromyalgia-Fibromyositis)、グレーブス病、ギランバレー(Guillain-Barr)、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、突発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、 サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、 潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑症、ウェゲナー肉芽腫症および重症筋無力症が含まれる。
免疫不全疾患および障害は、身体に侵入または攻撃する外来または異常な細胞(細菌、ウイルス、真菌、およびがん細胞など)から身体を防御する免疫系の能力を損なう。結果として、異常な細菌感染症、ウイルス感染症、もしくは真菌感染症、またはリンパ腫もしくは他のがんが発症する可能性がある。免疫不全障害には原発性および続発性の2つのタイプが存在する。原発性免疫不全障害は通常、出生時に存在し、通常遺伝性である遺伝性障害である。これらは通常、乳児期または幼児期に顕著になる。しかしながら、いくつかの原発性免疫不全障害(分類不能型免疫不全症など)は、成人になるまで認識されない。一般的な原発性免疫不全障害の例としては、ウィスコット・アルドリッチ症候群、重症複合免疫不全疾患(SCID)、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症(Ataxia-telangectasia)、慢性肉芽腫性疾患、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、補体欠損症および選択的IgA欠損症が挙げられる。
続発性免疫不全障害は、一般に、晩年に発症し、しばしば、特定の薬物の使用、または糖尿病もしくはヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症などの別の障害に起因する。これらは、原発性免疫不全障害よりも一般的である。一般的な続発性免疫不全障害の例としては、HIV、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられる。
以下の実施例は、本発明のより完全な理解を提供するために提示される。本発明の原理を例示するために記載された特定の技術、条件、材料、割合、および報告されたデータは、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1
マウスモデルへの富化幹細胞の移植
ミトコンドリアを、健康なヒトドナーの血液から単離した。ミトコンドリアを-80℃で凍結させた。CD34+細胞は、ピアソン症候群を有する対象の凍結および解凍された臍帯血細胞(UBC)から単離された。この対象は、mtDNAの8,470~13,447位置にある4,977ヌクレオチドの欠失と診断された。ミトコンドリアを解凍した後、対象のCD34+細胞を1×106個の細胞当たり0.88mUのヒトミトコンドリアとともに22時間インキュベートした。その後、培地を除去し、細胞を洗浄し、4.5%HSAに再懸濁した。配列解析を使用して、細胞中のヒトミトコンドリアの存在を特定することによって、増強を検証した。その後、増強された細胞を3週齢のNSGSマウスにI.V.注射した(マウス当たり50K細胞)。
3群のマウスを試験した。MAT群:ヒト増強CD34+細胞、50K細胞/150μlを移植したNSGSマウス。対照群:ヒトCD34+細胞、50K細胞/150ulを移植したNSGSマウス。ナイーブ群:ナイーブマウス。
移植の2か月後:
MAT群から3匹、対照群から3匹のマウスを屠殺した。末梢血(PB)を採取し、大腿骨および脛骨から骨髄(BM)細胞を単離した。ヒト内因性および外因性ミトコンドリアDNA(mtDNA)のコピー数を決定するために、DNAをBMおよびPBから単離し、dPCRを使用して解析した。
造血細胞の亜集団に対するCD34+細胞の分化を決定するために、末梢血およびBM試料をフローサイトメトリーで解析した。CD45抗原が、末梢血中のリンパ球、単球、顆粒球、好酸球、および好塩基球を含むすべてのヒト白血球に存在するため、最初にヒトCD45+細胞の%を決定した。その後、CD45+細胞をさらに、CD45+CD33+(骨髄系統)、CD45+CD3+(T細胞)、CD45+CD19+(B細胞)、CD45+CD14+(単球)の亜集団に分けた。
さらに、フローサイトメトリー解析を使用して、mCD45細胞対hCD45細胞の%を決定した。
結果BM:処置の2か月後の、MAT群と対照群との間のBMの結果を図1に示す。
結果PB:PB dPCR:対照群とMAT群との間の、PB中のヒトミトコンドリアコピー数、ヒト細胞数およびmtDNAコピーの結果を図2に示す。末梢血において、細胞当たりの総(外因性+内因性)mtDNAコピーの有意な増加が観察された。
移植の6か月後:
各群のマウスおよびナイーブマウスを屠殺した。内因性および外因性ヒトmtDNAのレベルを測定するため、DNAをBMおよび末梢血から単離し、デジタルPCR(dPCR)を使用して解析した。
結果BM:BM dPCRは、対照群(非増強ヒト細胞を含むマウス)、MAT群(ミトコンドリア増強ヒト細胞を移植したマウス)、NTC(「テンプレートなし」)、ナイーブ群(処置なし)のDNA 1ng当たりの外因性ミトコンドリアコピー数を示した。使用されるSNPアッセイは、内因性ヒトmtDNAと外因性ヒトmtDNAの2つの対立遺伝子(mtDNAの10831位のG/A)を区別する単一のヌクレオチド変異に基づくため、特定の対立遺伝子に対する選択性は完全ではなく、したがって、対照群において偽陽性結果も明らかになった。それにもかかわらず、MATマウスに由来するBM細胞は、DNA 1ng当たりの外因性ミトコンドリアコピー数が有意に多く、これは、MAT細胞の生着の増加およびおそらく細胞増殖の増加を示した。(図3、右の棒グラフ)。
BMフローサイトメトリーの結果:移植の6か月後、MATマウスに由来するBM細胞は、対照マウスに由来するBM細胞と比較して、有意に高いレベルのCD45+ヒト細胞を含んでいた。MATマウスにおけるCD45+細胞の増加は、生着の増加、ホーミングの改善、細胞増殖の増加、細胞生存率の増加、または細胞アポトーシスの減少を示す。ヒトCD45+細胞は、これらの亜集団への分化についてさらに解析された。CD45+細胞亜集団には、CD3+細胞(T細胞)、CD14+細胞(マクロファージ)、CD19+細胞(B細胞)、CD33+細胞(骨髄系細胞)が含まれた。
MATマウスは、対照と比較して異なる細胞分化パターンを有した。MATマウスは、フローサイトメトリー分析に見られるように、より高い%のCD3+細胞(T細胞)およびより低い%のCD33+細胞を有し、対照マウスは、より高い%のCD33+細胞およびより低い%のCD3+細胞を有した。MATマウスはまた、対照マウスと比較して高いCD19+細胞%を有した。これらの結果は、骨髄系細胞からリンパ系細胞への移行を示している(図4および表3)。
実施例2
対象のリンパ球欠乏症の処置/リンパ球集団の増加
1つのリンパ球欠乏症関連疾患または複数のリンパ球欠乏症関連疾患に罹患している対象におけるリンパ球欠乏の衰弱作用を軽減するための方法のステップは、(1)自家または同種異系造血幹細胞を得ること、(2)ドナーの細胞からミトコンドリアを単離すること(外因性ミトコンドリアの単離は、このプロセスの前に実行することができ、ミトコンドリアを-80℃(少なくとも)で凍結させて保存し、使用前に解凍する)、(3)HSCを、単離された外因性ミトコンドリアとともにインキュベーションすること、(4)骨髄細胞を洗浄すること、および(5)ミトコンドリアについて富化されたHSCを対象に注入することである。全期間を通して、患者血球数および生化学的血液マーカーの変化を評価する。
実施例3
骨髄移植を改善するためのミトコンドリア増強療法
生着を改善し、したがって、コンディショニングされた患者またはコンディショニングされていない患者の細胞移植を改善するために、細胞は患者への移植前にミトコンドリア増強を受ける。造血幹細胞移植を必要とする対象における造血幹細胞移植を改善する方法は、(1)対象またはドナーから造血幹細胞(HSC)を得ることと、(2)ドナーの細胞からミトコンドリアを単離することと(ミトコンドリアの単離は、このプロセスの前に実行することができ、ミトコンドリアを-80℃(少なくとも)で凍結させて保存し、使用前に解凍する)、(3)HSCを、単離された外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることと、(4)骨髄細胞を洗浄することと、(5)ミトコンドリアについて富化されたHSCを対象に投与することとを含む。HSCは、自家または同種異系造血幹細胞であり得る。
実施例4
遺伝子療法を改善するためのミトコンドリア増強療法
HSCおよびその子孫の効率的な長期的な遺伝子改変には、HSC機能に影響を与えることなく、ゲノムへの修正DNAの安定的な組込みを可能にする技術が必要である。したがって、y-レトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスなどの組込み組換えウイルスシステムの使用が、この分野を支配している(Chang,A.H.et al.(2007)Mol.Ther.15:445-456)。治療効果は、アデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全症(ADA-SCID、Aiuti,A.et al.(2009)N.Engl.J.Med.360:447-458)、X連鎖重症複合免疫不全(SCID-X1、Hacein-Bey-Abina,S.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363:355-364)およびウィスコット・アルドリッチ症候群(WAS、Boztug,K.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363:1918-1927)のy-レトロウイルスベースの臨床試験ですでに達成されている。加えて、レンチウイルスは、X連鎖副腎白質ジストロフィーの処置における(ALD;Cartier,N.et al.(2009)Science326:818-823)、ならびに異染性白質ジストロフィー(MLD;Biffi,A.et al.(2013)Science341:1233158)、およびWAS(Aiuti,A.et al.(2013)Science 341:1233151)ための送達ビヒクルとして用いられている。
クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR))/CRISPR関連(CRISPR/Cas)システム、CRISPR/Casシステムは、標的とされたDNA配列に相補的なスペーサー配列を含む単一ガイドRNA(sgRNA)が、DNAエンドヌクレアーゼ酵素(例えば、Cas9酵素など)をゲノム標的に誘導する、迅速なゲノム操作のための強力なツールである。結合すると、Cas9は、二本鎖DNA切断を作製する。DNA修復機構、非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え(HR)を利用して、遺伝子挿入および欠失を導入することができる。CRISPR/Cas9は、大腸菌(Escherichia coli)、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、および哺乳動物細胞などの様々な種で実施されている。DNAエンドヌクレアーゼ酵素の他の例には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1およびCsx12としても知られる)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3およびCsf4が含まれる。
CRISPRシステムの要素(例えば、直接反復、相同組換え編集テンプレート、ガイド配列、tracrRNA配列、標的配列、プライミング部位、調節要素、およびRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ)は、当業者に周知である。すなわち、標的配列を与えられた場合、当業者は、特定の標的配列に特異的な機能的CRISPR要素を設計することができる。本明細書に記載される方法は、特定のCRISPR要素の使用に限定されない。
レトロウイルスおよびレンチウイルスベースベクターの使用に加えて、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)などの他のウイルスに由来するベクターも、造血幹細胞および前駆細胞の改変に利用され得る。
遺伝子療法(例えば、ゴーシェ病I型原発性免疫不全などのライソソーム蓄積障害)で使用されることが意図される細胞の生着を高めるために、細胞は、単離された外因性ミトコンドリアによって増強を受ける。細胞は、遺伝子療法のためのHSCを遺伝子改変する前、改変中、または改変後に増強を受け得る。対象における細胞の生着を高める方法は、(1)対象またはドナーから造血幹細胞(HSC)を得ることと、(2)ドナーの細胞からミトコンドリアを単離することと(ミトコンドリアの単離は、このプロセスの前に実行することができ、ミトコンドリアを-80℃(少なくとも)で凍結させて保存し、使用前に解凍する)、(3)HSCを、単離された外因性ミトコンドリアとともにインキュベートすることと、(4)骨髄細胞を洗浄することと、(5)ミトコンドリアについて富化されたHSCを対象に投与することとを含む。HSCは、自家または同種異系造血幹細胞であり得る。
実施例5
ミトコンドリア増強後のミトコンドリア機能障害マウスモデルにおける外因性ミトコンドリアの継続的移行
疾患を有する動物モデルにおいて、生体内分布を評価するために、および増強されたHSPCまたはその子孫が、ミトコンドリアをインビボで他の細胞に移行させることができるかどうかを評価するために、遺伝子標識された細胞を、ミトコンドリア機能不全のマウスモデル(PolGマウス)に注入した。
ミトコンドリア増強骨髄細胞、またはそれらが保有するミトコンドリアが静脈内注入後にどこに戻るかを追跡するのに役立つ新しいマウスインビボシステムを使用した。すべての細胞核を赤色蛍光(dTomato)で標識し、すべてのミトコンドリアを緑色蛍光(タンパク質Cox8-Dendra)で標識し、ここでは「赤緑色」細胞と呼ばれる、ROSAnT-nG/PhAM切除マウスモデルを使用した。増強は、ROSAnT-nG/PhAM切除マウスから単離された「緑色」ミトコンドリアで行った。
HSPCおよび外因性ミトコンドリアの分布または持続性は、生物ストレスによって影響され得るため、PolgD257A変異がミトコンドリアDNAポリメラーゼの校正機能を損ない、mtDNA変異の蓄積および欠失をもたらす、Polgマウスモデルを使用した。PolGマウスモデルを、増強された赤緑色HSPCで処置して、ミトコンドリア増強細胞およびそのミトコンドリアのインビボ生体内分布を評価した。
ROSAnT-nG/PhAM切除マウスに由来する赤色標識核(dTomato)および緑色標識ミトコンドリア(Dendra)を遍在的に発現する系統陰性細胞(Lin-)を、ROSAnT-nG/PhAM切除マウスの肝臓細胞から単離されたDendraミトコンドリアによって増強し、投与時25~28週齢(雄)および30~35週齢(雌)のPolgマウスに注射した。
増強レベルを、MAT後の細胞におけるmt-DNAにコードされたチトクロームcオキシダーゼ1(COX-1)のタンパク質レベルで測定した。COX-1値は、ヤヌスグリーンによって評価されるように、非処置細胞および細胞数に対して正規化された。
レシピエントPolGマウスでは、3つの細胞型が識別できる可能性がある:1)注入細胞またはその子孫に由来する赤緑色細胞、2)PolGレシピエントに由来する非蛍光細胞、および3)レシピエントPolG細胞へのミトコンドリア移行の証拠を提供する緑色のみの細胞。
注射の12時間、1週間、および4.5か月後に、血液を採取し、BMを抽出し、PBおよびBMの両方をフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡によって解析した。
注入されたHSPCから末梢血中の内因性細胞への外因性ミトコンドリアの長期持続性および継続的移行が実証された。図5A~Bは、PB内のCD45+細胞サブセットの頻度を示す。dTomato+Dendra+の割合は、注射後12時間で0.0015%から4.5mで0.37%に経時的に増加した。同様に、ミトコンドリア移行が生じたdTomato-Dendra+細胞の割合は、0.0015%から7.3%に増加した。ミトコンドリアCox8-Dendra2タンパク質は、ROSAnT-nG/PhAM切除核ゲノムによってのみコードされ、したがって、Polgレシピエント細胞に一過性に渡されるので、末梢血中のdTomato-Dendra+細胞の一貫した存在は、注入された細胞またはその子孫に由来する外因性ミトコンドリアの継続的な移行の証拠である。
レシピエント細胞に移行した外因性ミトコンドリアの相対レベルを決定するために、末梢血細胞をMito Tracker Deep-redで染色した。赤緑色細胞に対するミトコンドリアを受容した細胞(緑色細胞)における、外因性ミトコンドリア対全ミトコンドリアの比率の変化倍率を測定した。
外因性ミトコンドリアは、1か月で全細胞ミトコンドリア含有量の8.4%、4.5か月で6.1%であることが実証された。(図6)。
緑色のミトコンドリアを含む細胞は、MATの4.5か月後にマウス腎臓でも見出された。
緑色のミトコンドリアがレシピエントPolG細胞内に存在していたため、このデータは、外因性ミトコンドリアの持続性および継続的移行が存在することを示唆する。重要なことに、Cox8-Dendraタンパク質の半減期によって制限されるため、これは外因性ミトコンドリア含有量の下限である。
実施例6
ミトコンドリアは、様々な造血細胞型に移行する
フローサイトメトリーを使用して、造血細胞型を試験して、どの細胞型が細胞内ミトコンドリア移行のレシピエントであるかを決定した。PBにおける主要な免疫細胞サブセットの分布は、1mおよび4.5mの時点で、総CD45+およびCD45+dTomato-Dendra+集団の両方において、評価された(図7)。
4.5mの時点で、外因性ミトコンドリアを取り込む骨髄系集団がさらに特徴付けられ、単球(Ly6C高Ly6G-)および好中球(Ly6C+Ly6G+)の両方がミトコンドリアを取り込むことが実証された(図8)。
骨髄系細胞集団は、優先的に外因性ミトコンドリアを取り込んだが、多数の細胞型(T細胞およびB細胞を含む)が、すべてミトコンドリアを取り込むことが実証された。
データは、注入されたHSPCに由来する外因性ミトコンドリアが、末梢血中に存在する様々な造血細胞型に継続的に移行することを実証している。さらに、遠隔組織に外因性ミトコンドリアを保有する細胞の証拠は、外因性ミトコンドリアが免疫細胞だけでなく、非造血組織にも存在することを示唆している。
要約すると、注入されたHSPCからのミトコンドリアは、MAT処置後少なくとも4.5か月にわたって末梢血中および遠位組織中の追加の造血細胞に移行することができることが実証された。
実施例7
ミトコンドリア増強後の細胞機能の評価
PolGマウスの末梢血中のCD11b+骨髄系細胞は、dTomato+Dendra+細胞から外因性ミトコンドリアを取り込むことが観察されている。したがって、外因性ミトコンドリアを含むCD11b+骨髄系細胞の活性レベルをさらに評価する。
dTomato+Dendra+系統陰性細胞を、室温で21時間ROSAnT-nG/PhAM切除マウスの肝臓から単離したDendra2+ミトコンドリアによって増強し、PolGマウスにIV注射した。
末梢血(PB)を、非処置PolGマウスおよび処置の1週間、1か月、3か月、および4.5か月後の処置マウスから抽出する。抽出されたPBは、FACSによって骨髄系細胞について選別される。非処置またはビヒクル対照処置マウスから抽出した骨髄系細胞を、以下のアッセイにおいて対照として使用する。
処置マウスおよび対照マウスの骨髄系細胞の活性の違いを評価するために、細胞に対してRNAseqを行い、骨髄系細胞のトランスクリプトームの変化を評価する。同様に、RNASeqは、細胞表面マーカーによって、または単一の細胞RNASeqによって選別された特定の骨髄系細胞亜集団(好中球、好酸球、単球など)に対して行われる。加えて、骨髄系細胞または骨髄系細胞亜集団活性レベルは、サイトカイン発現;ATPレベル、CS活性、ミトコンドリア膜電位を含む代謝活性およびミトコンドリア活性;または単球からマクロファージへの分化、食作用アッセイ、誘導物質への応答、およびネトーシス(NETosis)アッセイなどの細胞特異的な機能活性評価を含むがこれらに限定されない細胞ベースのアッセイにおいて評価される。
骨髄系細胞亜集団に対する増強の効果は、ナイーブおよびミトコンドリア増強マウスまたはヒトPBMCから単離された骨髄系細胞を使用して、上記のアッセイでさらに評価することができる。
ミトコンドリアを受容した骨髄前駆体細胞は、増殖、分化および/または活性が増加し、全血骨髄系細胞および骨髄系亜集団の出現の増加をもたらすことが予想される。加えて、血液骨髄系細胞が、ミトコンドリア増強後のミトコンドリア取り込みによってプライミングされ、より堅牢な機能をもたらす(例えば、病原体またはマクロファージ食作用に応答した好中球ネトーシス)。
実施例8
免疫不全細胞および遺伝子療法に対する増強の効果
B細胞の発達進行は、B細胞抗原受容体(BCR)の集合、発現、およびシグナル伝達につながる一連の事象によって導かれる。重(H)鎖免疫グロブリン遺伝子および軽(L)鎖免疫グロブリン遺伝子は、プロBおよびプレB段階(それぞれ)で再編成され、完全な表面IgMは、未熟段階で発現される。さらなる発達進行および成熟は、ナイーブB細胞の免疫能のあるコレクションを提供する。ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)遺伝子は、B細胞抗原受容体(BCR)シグナル伝達経路の重要な構成要素であり、B細胞の発達、生存、および活性化に重要な役割を果たす。BTKの発現はB細胞に限定されず、BTKは、マクロファージおよび好中球を含む骨髄系統の細胞でも発現される。X連鎖欠損(Xid)マウスは、BTK遺伝子に自然突然変異を有する。B細胞の発達が損なわれたXidマウスは、ヒトX連鎖免疫不全疾患のモデルとして使用される。例えば、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)遺伝子の変異に起因する遺伝子疾患であるX結合型アガマグロブリン血症(XLA)。これらの変異は、Bリンパ球の成熟の不全、血清免疫グロブリンレベルの低下、特異的抗体産生の不全、ならびに他の免疫シグナルの交代をもたらす。
これらの実験は、免疫不全細胞および遺伝子療法に対する増強の効果を決定する。これは、増強されかつBTK遺伝子を形質導入した免疫不全細胞のB細胞発達を試験することによって行われた。
Lin-細胞はXidマウスの骨髄から単離された。細胞は、C57BL/6Jマウス胎盤(1×106個の細胞当たり4.4mUのCS活性)に由来するミトコンドリアとともにまたはなしで21時間インキュベートした。インキュベーション後、増強細胞および非増強細胞の、同数の細胞に、非形質導入またはNTX109もしくはNTX101レンチウイルス構築物のいずれかを形質導入した。各構築物は、BTKプロモーター-BTK導入遺伝子-A2-GFP(緑色蛍光タンパク質)を含むカセットを含んでいた。表5は、試験した群を示す。
形質導入の22時間後、細胞を洗浄し、回収のためにプレーティングした。2~13日目に、IL7の存在下で細胞を増殖させるなど、B細胞増殖と分化を誘導する条件下で細胞を増殖させた。13日目に、細胞を、LPS/CpGで誘導して、B細胞を成熟させ、細胞がB220およびIgMを発現する細胞に分化することを可能にした。13日目および17日目に、フローサイトメトリーを使用して細胞を解析し、絶対細胞数およびB細胞亜集団を決定した。実験スキームを図9に示す。
13日目に、それぞれの非増強NTX101細胞および非増強NTX109細胞と比較して、増強NTX101細胞および増強NTX109細胞において、それぞれ、絶対細胞数の11.4倍および5倍の増加が観察された。加えて、増強NTX109細胞の細胞数は、WT細胞数に相当した(図10)。非増強非形質導入Lin-細胞と比較して、増強非形質導入Lin-細胞では、絶対細胞数の6.9倍の増加が観察された(図10)。
後のHSPC集団を13日目に決定した(図11A~B)。増強非形質導入Lin-細胞は、非増強非形質導入Lin-細胞と比較して、HSPC集団のパーセンテージが47%低下した。非増強NTX101細胞は、非増強非形質導入Lin-細胞と比較して、HSPC集団パーセンテージの11%低下を示した。一方、増強NTX101細胞は、非増強非形質導入Lin-細胞と比較して、HSPC集団パーセンテージの31%低下を示した。さらに、増強NTX101細胞は、非増強NTX101細胞と比較して、HSPC集団パーセンテージの22%低下を示した。非増強NTX109細胞は、非増強非形質導入Lin-細胞と比較して、HSPC集団パーセンテージの22%低下を示した。一方、増強NTX109集団では、非増強非形質導入Lin-集団と比較して、HSPC集団パーセンテージの37%低下が観察された。加えて、増強NTX109細胞では、非増強NTX109細胞と比較して、HSPC集団パーセンテージの19%低下が観察された。加えて、表5に記載の増強群は、それらのそれぞれの非増強群と比較して、有意に多くのHSPCを含んでいた(図11B)。
B細胞集団(プレB細胞およびプロB細胞)を、増強の13日後に決定した。増強後に、より高いプレB細胞集団パーセンテージが観察された。増強NTX101細胞では、非増強NTX101細胞と比較して、プレB細胞のパーセンテージの1.76倍の増加が観察された。増強NTX109細胞では、非増強NTX109細胞と比較して、プレB細胞のパーセンテージの1.73倍の増加が観察された。増強非形質導入Lin-細胞では、非増強非形質導入Lin-細胞と比較して、プレB細胞のパーセンテージの1.14倍の増加が観察された(図12)。
増強後の細胞13の免疫表現型検査(図13A~B)を実行した。増強NTX101細胞におけるプロ/プレB細胞比は2.54であったが、非増強NTX101細胞におけるプロ/プレB細胞比は6.6であった。したがって、増強NTX101細胞では、非増強NTX101細胞と比較して、プロB/プレB細胞比が62%低下した。非増強NTX109細胞と比較して、増強NTX109細胞におけるプロB/プレB細胞比の53%低下が、観察された(それぞれ、プロB/プレB細胞比:4.7対9.9)。増強NTX109細胞のプロB/プレB細胞比は、WT細胞に見られる比と同様であった。増強非形質導入Lin-細胞のプロB/プレB細胞比では、非増強非形質導入Lin-細胞と比較して有意な変化は観察されなかった(比率:2.12対2.17)。加えて、表5に記載の増強群は、それぞれの非増強群と比較して、有意に多くのプレB細胞およびプロB細胞を含んでいた(図13B)。
増強17日後に細胞数およびB細胞集団を決定した(図14)。増強から17日後、増強非形質導入細胞は、非増強非形質導入Lin-細胞と比較して、細胞数の18倍の増加を示した(それぞれ、3,980細胞対72,500細胞)。加えて、17日後、増強非形質導入細胞は、WTと比較して1.9倍多くの細胞を含んでいた(それぞれ、72,500対37,000細胞)。増強非形質導入細胞のB細胞集団パーセンテージは、非増強非形質導入細胞のB細胞集団よりも7.4倍高く、非増強非形質導入Lin-細胞の細胞集団の5.2%と比較して、細胞集団の38.88%を構成していた。増強および形質導入された細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、35倍および16倍多くの細胞を示した(NTX101は1,259個の細胞を含む一方、増強NTX101は45,000個を含み、NTX109は3,932個の細胞を含む一方、増強NTX109は65,500個の細胞を含んでいた)。増強NTX101Lin-細胞のB細胞集団パーセンテージは、非増強NTX101細胞と比較して、3.3倍の増加が観察された(66.9%対28.4%)。増強NTX109細胞の細胞集団のB細胞集団パーセンテージは、非増強NTX109細胞と比較して、1.26倍の増加が観察された(53.8%対42.6%)。
増強のIgM陽性B細胞への効果を増強の17日後に決定した(図15)。形質導入細胞は、増強後の細胞集団において、IgM陽性パーセンテージの増加を示さなかった。IgM陽性B細胞は、非増強NTX101のIgM陽性細胞の19.7%と比較して、増強NTX101集団の13.7%を構成していた。NXT109では、非増強NTX109集団の細胞の25.61%と比較して、増強NTX109細胞の細胞集団の17.11%がIgM陽性細胞であった。しかしながら、増強非形質導入細胞は、非増強非形質導入Lin-細胞と比較して、IgM陽性B細胞集団のパーセントにおいて5.8倍の増加を示した(それぞれ、13.05%対2.24%)。増強細胞におけるIgM陽性細胞集団の割合は、WT対照マウス(CBA)由来のLin-細胞におけるIgM陽性B細胞の割合よりも2.5倍高かった(それぞれ13.05%対5.20%)。増強形質導入細胞は、非増強形質導入細胞と比較して、細胞集団のIgM陽性B細胞の相対的な部分(すなわち、細胞のパーセンテージ)が低い一方で、増強を受けた細胞では、全細胞の絶対数、したがって、IgM陽性B細胞の絶対数は、有意により高かった。
遺伝子発現は、増強の13日後に決定された(図16)。B細胞分化の過程中に各細胞群から同一の細胞数を抽出し、フローサイトメトリーを使用してGFP発現について解析した。GFPによって反映されるように、増強NTX109細胞では、非増強NTX109細胞と比較して、BTKを発現する細胞のパーセンテージの2.62倍の増加が観察され(図16)、増強NTX109の形質導入の増加が示された。増強NTX101細胞では、非増強NTX101細胞と比較して、GFP発現の増加は観察されなかった。
遺伝子発現は、増強の13日後に決定された(図17)。増強NTX109細胞では、非増強NTX109細胞と比較して、BTK発現の4.2倍の増加が観察された(それぞれ、14.52%対3.43%)。
増強Xid Lin-細胞(形質導入および非形質導入)は、非増強細胞と比較して、またはWT細胞と比較して、細胞の絶対数によって測定される細胞増殖の増加を示した。増強Xid Lin-細胞(形質導入および非形質導入)は、集団のHSPCのパーセントの減少を示した。増強Xid Lin-細胞(形質導入および非形質導入)は、非増強細胞と比較して、集団のB細胞パーセンテージの増加および絶対細胞数の増加を示し、これはB細胞分化の増大を示した。IgM陽性細胞のパーセンテージは、非増強非形質導入細胞と比較して、増強非形質導入細胞においてより高かった。全細胞の絶対数、したがって、IgM陽性B細胞の絶対数は、増強を受けたすべての細胞群で、非増強群と比較して有意により高かった。NTX109ベクターを形質導入した増強細胞は、非増強NTX109細胞と比較して、BTK発現細胞%の増加を示し、Xid Lin-細胞におけるBTK発現の回復における増強の有益な効果を示唆した。
実施例9
遺伝子療法に対する増強の効果
レンチベクター(XidpTC9)を形質導入した増強もしくは非増強Xid Lin-細胞、またはWT Lin-細胞(XidCBA/Ca)を、致死的に照射されたXidマウスに移植する効果について、評価した。
PGK構成プロモーターの下で、GFP導入遺伝子を含むpTC9レンチベクターを形質導入した増強(MNV)または非増強(NT)Xid Lin-細胞をXidマウスに移植した。非形質導入XidおよびWT Lin-細胞と比較した相対ベクターコピー数(VCN)およびGFPのタンパク質発現を測定することにより、細胞産物における導入遺伝子の発現レベルを評価するために、形質導入細胞の並行インビトロ特徴付けを実行した。
相対的VCNは、試験したすべての条件において、同等のゲノム組込み事象を実証した。導入遺伝子発現(GFP陽性細胞の割合)は、すべての形質導入された細胞(増強細胞および対照細胞の両方)において明らかであった(図18)。
形質導入されたXid Lin-細胞をxidマウスに移植した6週間後に血液を採取し、フローサイトメトリーを使用して、導入遺伝子発現を評価した(NT PtC9についてはN=5マウス、MNV PtC9についてはN=4マウス)。
GFPを発現する細胞のパーセントに関して動物間で変動があったが、増強は、GFPを発現する細胞の最小、最大、および平均パーセントを上昇させた(図19)。表6は、試験した各トランスジェニックおよびWT動物におけるGFPを発現する細胞のパーセントを示す。
本発明は、上記の実施例を参照して説明されているが、変更および変形は、本発明の趣旨および範囲内に包含されることが理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。