JP2023518902A - 標的化ポリ（β－アミノエステル） - Google Patents

標的化ポリ（β－アミノエステル） Download PDF

Info

Publication number
JP2023518902A
JP2023518902A JP2022558496A JP2022558496A JP2023518902A JP 2023518902 A JP2023518902 A JP 2023518902A JP 2022558496 A JP2022558496 A JP 2022558496A JP 2022558496 A JP2022558496 A JP 2022558496A JP 2023518902 A JP2023518902 A JP 2023518902A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
pbae
bond
seq
tetrazine
targeted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022558496A
Other languages
English (en)
Inventor
テズゲル，エズギュル
モウレーン，フレデリック
バイヤン，ルノー
ボッシュ，セシール
Original Assignee
イグザカ フランス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by イグザカ フランス filed Critical イグザカ フランス
Publication of JP2023518902A publication Critical patent/JP2023518902A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/593—Polyesters, e.g. PLGA or polylactide-co-glycolide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/68—Polyesters containing atoms other than carbon, hydrogen and oxygen
    • C08G63/685—Polyesters containing atoms other than carbon, hydrogen and oxygen containing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/91—Polymers modified by chemical after-treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

クリックケミストリーを用いて標的部位に結合することで、無毒性の標的化ポリβ－アミノエステル（ＰＢＡＥ）が合成される。クリックケミストリーは、歪んだアルケン環などのジエノフィルとテトラジンなどのジエンを用いて、ＰＢＡＥポリマーやそれを含むナノ粒子表面に標的部位を迅速に結合させるものである。アプタマー、抗体、抗体様タンパク質などの標的部位を、ＰＢＡＥに迅速かつ安全に結合させることができ、遺伝子治療や治療薬の標的送達のために、ナノ粒子の高度な特異的局在化を実現することができる。

Description

本技術は、標的化遺伝子治療用として、ほとんどあらゆる標的部位を、ポリベータアミノエステルまたはその他のポリマー骨格に素早く結合する、逆電子需要ディールス－アルダー・クリックケミストリーに関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２７日に出願の米国仮出願第６３／００１，２０９号の優先権を主張し、同出願はその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
遺伝子治療は、幅広い遺伝性または非遺伝性の状態の処置のための、新規の治療的手法を提案している。遺伝子治療領域においては、いくつかのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが探索されている。遺伝子送達システムの最大の課題の１つは、標的特異性を達成することである。現在までに開発されたナノ粒子ベースの遺伝子送達システムの大部分は、受動的な標的化手法を使用しているが、該手法は、かかる系の有効性を高めるのには十分でないことが多い。最近では、細胞／組織特異的な遺伝子／薬剤送達システムの開発のために、ナノ粒子表面上に細胞または組織特異的標的部位をグラフトすることが導入されている。
遺伝子治療分野では、カチオン性合成ポリマー、多糖類およびポリペプチドを含むいくつかのポリマー系がすでに適用されている（Lv, H et al.2006）。ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）は、生分解性およびｐＨ感受性の特性のために、ポリマーベースの遺伝子送達システムにおいては、ここ数十年間、有望な候補として認識されている。異なるジアクリレートモノマーおよびアミンモノマーを使用して、２０００種を超えるＰＢＡＥが合成されている。さらに、ＰＢＡＥナノ粒子送達システムの有効性を高めるために、細胞特異的な標的リガンドが使用されている。細胞標的部位は、ＰＢＡＥ末端基の官能化を介して、ＰＢＡＥに結合されている。例えば、マンノースは、抗原提示細胞を標的とするのに使用されている（Jones, CH et al.2015）。加えて、ＰＢＡＥ骨格を標的部位によって修飾するのに適用されているその他２つの手法は、共重合技法（Fornaguera C et al.2019）、および古典的なＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップリング反応（Zhang J et al.2015）の使用である。あるいは、標的リガンド（ＲＧＤペプチド、マンノースまたは抗体）は、レイヤーバイレイヤー（ｌａｙｅｒ－ｂｙ－ｌａｙｅｒ）コーティング戦略を介して、リガンド結合ポリグルタミン酸を用いて、ＰＢＡＥナノ粒子内に導入されている（Green JJ et al.2007, Zhang F et al.2019, Smith TT et al. 2017）。
ここ数十年間、薬物送達分野において、ナノ粒子表面上に標的リガンドを直交的に導入するために、クリックケミストリーが大きな注目を集めている。クリックケミストリーの概念は、２０００年代初めに、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓによって最初に導入された。「クリックケミストリー」という用語は、モジュール式、立体特異的であり、高収率の速い反応速度を有し、大きな労力を要する技法なしで容易に除去可能な無視できる副生成物、および／または無害な副生成物をもたらす反応を定義するために使用された。加えて、反応条件が単純であることができ、容易に入手可能な試薬を使用する、最終生成物を容易に単離できる反応である（Kolb HC et al.2001）。クリックケミストリー技法としては、銅（Ｃｕ）触媒を用いるアジド－アルキン付加環化（Ｃｕ－ＡＡＣ）、歪み促進型アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）、および逆電子需要ディールス－アルダー（ＩＥＤＤＡ）付加環化（電子が豊富なジエノフィル（例えばノルボルネン、シクロプロペンまたはシクロオクテン化合物）と、電子不足のジエン（例えばテトラジン）との間の環化付加反応）が挙げられる。ノルボルネンテトラジンベースのＩＥＤＤＡクリックケミストリーは、ペプチド（ＵＳ２０１５０００５４８１Ａ１）、抗体（Meyer C et al.2016）および核酸（Schoch J et al 2011）の標識化に適用されている。
遺伝子送達システムの最大の課題の１つは、標的特異性を達成することである。
本技術は、標的化遺伝子治療用として、ほとんどあらゆる標的部位を、ＰＢＡＥまたはその他のポリマー骨格に素早く結合するＩＥＤＤＡクリックケミストリーを提供する。オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）への、アプタマー、抗体または抗体様タンパク質の迅速な結合を進めるために、後続の大規模な精製を必要としない、生体適合性溶液におけるクリックケミストリーを可能にする戦略が提供される。アプタマーの解明が急速に進むにつれて、本技術は、送達を導くアプタマーを利用した、各種の遺伝子（または、その他の）療法用のペイロード送達を提供することができる。
本技術は、以下の特徴一覧にさらに要約され得る。
１．標的化ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）化合物の合成方法であって、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーを用いて、テトラジン官能性標的部位を歪んだアルケン環官能性ＰＢＡＥにカップリングすることを含む、方法。
２．歪んだアルケン環が、ノルボルネン、歪んだアルケンを含む炭素含有環、架橋結合と歪んだアルケンを含む炭素含有環、シクロプロペン、シクロブテンおよびトランス－シクロオクテンからなる群から選択される、特徴１に記載の方法。
３．歪んだアルケン環がノルボルネンである、特徴２に記載の方法。
４．テトラジン官能性標的部位が、１，２，３，５－テトラジンを含む、先行する特徴のいずれかに記載の方法。
５．テトラジン官能性標的部位が式１０による構造を含む、特徴４に記載の方法であって、
Figure 2023518902000002
 式中、Ｌｉ２は、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、
Figure 2023518902000003
 、またはそれらの組み合わせであり、式中、Ａにおける各原子は独立してＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＢから選ばれ、＊における各結合は独立して単結合、共鳴および／または半共鳴芳香族結合、または二重結合であり、
式中、Ｂは、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、またはそれらの組み合わせであり、
式中、Ｒ３は水素または置換基であり、
式中、ｈは３以上であり、および
式中、ＴＭは標的部位である、方法。
６．Ｒ３が結合、－Ｈ、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－ＯＣＨ３、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ３、ＣＨ３－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－ＳＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ３（アセチル、Ａｃ）、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル（ＢＯＣ）、－ＮＨＡｃ、－ＮＨＢＯＣ、
Figure 2023518902000004
 、またはそれらの組み合わせであり、式中、Ａにおける各原子は、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＢから選択され、＊における各結合は、独立して、単結合、共鳴芳香族結合、または二重結合である、特徴５に記載の方法。
７．Ｌｉ２が以下を含む、特徴５または特徴６に記載の方法。
Figure 2023518902000005
８．テトラジン官能性標的部位が式１１による構造を含む、特徴５～７のいずれかに記載の方法；
Figure 2023518902000006
９．標的部位がアプタマー、多特異性アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ抗体、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマー、細胞表面受容体のリガンド、またはこれらの組み合わせを含む、先行する特徴のいずれかに記載の方法。
１０．カップリングが、水溶液中で、約１５℃～約３０℃の範囲の任意の温度で行われる、先行する特徴のいずれかに記載の方法。
１１．約７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％（モル％）を超えるテトラジン官能性標的部位が、約１５分未満で歪んだアルケン環官能性ＰＢＡＥにカップリングする、先行する特徴のいずれかに記載の方法。
１２．以下のステップを含む方法によって官能性ＰＢＡＥを合成することをさらに含む、先行する特徴のいずれかに記載の方法。
アミンとジアクリレートモノマーを重合して、ＰＢＡＥジアクリレート前駆体を得ること、および
ＰＢＡＥジアクリレート骨格の－ＯＨ側鎖に、ノルボルネンカルボン酸を含む歪んだアルケン環をＤＣＣカップリングでグラフトし、ノルボルネン官能性ＰＢＡＥを得ること。
１３．以下をさらに含む、先行する特徴のいずれかに記載の方法；
チオール－マイケル付加反応を用いた、システイン含有オリゴペプチドを用いたノルボルネン官能性ＰＢＡＥを修飾すること。
１４．オリゴペプチドが、Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ（配列番号４）、Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７）、Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ（配列番号１）、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ（配列番号１０）およびＣｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ（配列番号１３）からなる群より選ばれる、特徴１３に記載の方法。
１５．クリックケミストリー反応が、当該テトラジン官能性標的部位と、ナノ粒子の表面にノルボルネン官能性ＰＢＡＥを含むナノ粒子とを反応させることによって行われる、先行する特徴のいずれかに記載の方法。
１６．先行する特徴のいずれかに記載の方法によって得られる標的化ＰＢＡＥ。
１７．特徴１６に記載の標的化ＰＢＡＥを含む、標的化ナノ粒子。
１８．標的化ＰＢＡＥの当該標的部位が、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマー、または腫瘍細胞もしくは免疫細胞に特異的な抗原を結合する細胞表面受容体のためのリガンドである、特徴１７に記載の標的化ナノ粒子。
１９．アプタマーが抗ＣＤ３アプタマーである、特徴１８に記載の標的化ナノ粒子。
２０．標的化ポリ（β－アミノエステル）化合物（ＰＢＡＥ）を合成するためのキットであって、キットは以下のものを含む；
ノルボルネン官能性ＰＢＡＥ、および
特徴１～１５のいずれかに記載の方法を実施するための指示書。
２１．以下をさらに含む、特徴２０に記載のキット、
テトラジン官能性標的部位。
２２．ノルボルネン官能性ＰＢＡＥがナノ粒子で存在する、特徴２０または２１に記載のキット。
２３．以下を含む、標的化ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）であって、
Figure 2023518902000007
 式中、Ｇ１およびＧ３は、各出現時に独立して、－Ｈ、Ｈ３Ｃ－（ＣＨ２）（２－９）－、およびＨＯ－（ＣＨ２）（３－１０）－からなる群より選択され、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、原子ｖまたは原子ｗにＣ＝Ｃ二重結合を有するＣＨ２、
Figure 2023518902000008
Figure 2023518902000009
 、配列番号４、配列番号７、配列番号１、配列番号１０、および配列番号１３からなる群から選択され、
Ｒａは、Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）－ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（１）－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（２）－、および（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－ＣＨ２－からなる群より各出現時に独立して選択され、Ｌｉ１は、結合、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－および－（ＣＨ２）－からなる群より各出現時に独立して選択され、
ａは３～１０の範囲の整数、ｐは１～３の範囲の整数、ｎは１～５００の範囲の整数、ｙは１～５００の範囲の整数、ｍは１～５００の範囲の整数、ｘは５～１００００の範囲の整数であり、
１以上の出現時において、１つ以上のＴは、それぞれ独立して、歪んだアルケン環（ＳＡＲ）：
Figure 2023518902000010
 を含む。
２４．歪んだアルケン環（ＳＡＲ）が、ノルボルネン、歪んだアルケンを含む炭素含有環、架橋結合と歪んだアルケンを含む炭素含有環、シクロプロペン、シクロブテンまたはトランスシクロオクテンを含む、特徴２３に記載のＰＢＡＥ。
２５．Ｒ１および／またはＲ２が、チオエーテル－Ｓ－を含む共有結合を介してポリマー鎖に結合している、特徴２３または２４に記載のＰＢＡＥ。
２６．標的部位（ＴＭ）を含むテトラジン官能性標的部位（ＴＦＭ）をさらに含む、特徴２３～２５のいずれかに記載の標的化ＰＢＡＥ。
２７．テトラジン官能性標的部位（ＴＦＭ）が、以下を含む、特徴２６に記載のＰＢＡＥであって、
Figure 2023518902000011
 式中、Ｌｉ２は、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、
Figure 2023518902000012
 、またはそれらの組み合わせを含み、式中、Ａにおける各原子は独立してＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＢから選ばれ、＊における各結合は独立して単結合、共鳴および／または半共鳴芳香族結合、または二重結合であり、
また、Ｂは、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、またはそれらの組み合わせを含み、
Ｒ３は水素または置換基であり、
ｈは３以上であり、および
ＴＭは標的部位である、ＰＢＡＥ。
２８．Ｒ３が、結合、－Ｈ、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－ＯＣＨ３、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ３、ＣＨ３－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－ＳＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ３（アセチル、Ａｃ）、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル（ＢＯＣ）、－ＮＨＡｃ、－ＮＨＢＯＣ、
Figure 2023518902000013
 、またはそれらの組み合わせを含み、式中、Ａにおける各原子は、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＢから選択され、＊における各結合は、独立して、単結合、共鳴芳香族結合、または二重結合である、特徴２７に記載のＰＢＡＥ。
２９．Ｌｉ２が以下を含む、特徴２７に記載のＰＢＡＥ。
Figure 2023518902000014
３０．テトラジン官能性標的部位（ＴＦＭ）が、以下を含む、特徴２９に記載のＰＢＡＥであって、
Figure 2023518902000015
 式中、Ｒ３は、Ｈまたは置換基であり、Ｂは、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、またはそれらの組み合わせを含み、ｈは３以上であり、
ＴＭは標的部位である、ＰＢＡＥ。
３１．Ｒ３が、結合、－Ｈ、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－ＯＣＨ３、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ３、ＣＨ３－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－ＳＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ３（アセチル、Ａｃ）、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル（ＢＯＣ）、－ＮＨＡｃ、－ＮＨＢＯＣ、
Figure 2023518902000016
 、またはそれらの組み合わせを含み、式中、Ａにおける各原子は、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＢから選択され、＊における各結合は、独立して、単結合、共鳴芳香族結合、または二重結合である、特徴３０に記載のＰＢＡＥ。
３２．以下を含むことを特徴とする標的化ＰＢＡＥであって、
Figure 2023518902000017
 式中、Ｇ１およびＧ３は、各出現時に独立して、－Ｈ、Ｈ３Ｃ－（ＣＨ２）（２－９）－、およびＨＯ－（ＣＨ２）（３－１０）－からなる群より選択され、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、原子ｖまたは原子ｗにＣ＝Ｃ二重結合を有するＣＨ２、
Figure 2023518902000018
 、
Figure 2023518902000019
 、配列番号４、配列番号７、配列番号１、配列番号１０、および配列番号１３からなる群から選択され、
Ｒａは、Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）－ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（１）－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（２）－、および（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－ＣＨ２－からなる群より各出現時に独立して選択され、Ｌｉ１は、結合、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－および－（ＣＨ２）－からなる群より各出現時に独立して選択され、
ａは３～１０の範囲の整数、ｐは１～３の範囲の整数、ｎは１～５００の範囲の整数、ｙは１～５００の範囲の整数、ｍは１～５００の範囲の整数、ｘは５～１００００の範囲の整数であり、
ＴＭは、アプタマー、多特異性アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマー、細胞表面受容体のリガンド、配列番号６、またはそれらの組み合わせを含む標的部位である、ＰＢＡＥ。
ノルボルネン（Ｎｂ）修飾ＰＢＡＥジアクリレートポリマーの構造を示す。「ｎ」は、Ｃ６官能性構成単位の反復単位の数である。「ｙ」は、ノルボルネン官能性反復単位の数を示す。「ｍ－ｙ」は、－ＯＨ末端側鎖を含有する反復単位の数である。「ｘ」は、重合度（ＤＰ）を与える反復単位の総数である。ｍは、ノルボルネン修飾前の、－ＯＨ末端側鎖を含有する反復単位の総数である。 Ｎｂ官能性オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）と、テトラジン（Ｔｚ）官能性標的リガンド（例えば、星によって示されるアプタマーまたは抗体）とのＩＥＤＤＡクリックケミストリー反応のスキームを示す。ポリマー鎖末端の「Ｒ」は、テトラペプチド構造（例えば、ｃｙｓ－ａｒｇ－ａｒｇ－ａｒｇ（ＣＲＲＲ、配列番号４）、ｃｙｓ－ｌｙｓ－ｌｙｓ－ｌｙｓ（ＣＫＫＫ、配列番号７）、ｃｙｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ（ＣＨＨＨ、配列番号１）、ｃｙｓ－ｇｌｕ－ｇｌｕ－ｇｌｕ（ＣＥＥＥ、配列番号１０）、またはｃｙｓ－ａｓｐ－ａｓｐ－ａｓｐ（ＣＤＤＤ、配列番号１３））を示し、これらは後重合反応を経てＮｂ修飾ＰＢＡＥジアクリレートポリマーに付加される。 標的リガンド結合ＯＭ－ＰＢＡＥの一例として、アプタマー結合したＯＭ－ＰＢＡＥ合成の実施形態のフローチャートを示す。 Ｎｂ修飾ＰＢＡＥとＴｚ修飾蛍光体とのＩＥＤＤＡクリックケミストリー付加物のアガロースゲル分析を示す。第１のレーンは、Ｎｂ修飾ＰＢＡＥ、すなわちＮｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）のみを表し、「ＰｏｌｙＥ」とラベルをつける。第２のレーンは、Ｔｚ官能性蛍光体、スルホ－Ｃｙ５を示し、「Ｃｙ５」とラベルをつける。第３のレーンは、ｔ＝０でのクリックケミストリー反応物（Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）およびＴｚ－スルホ－Ｃｙ５）の混合物に、「ＰｏｌｙＥ＋Ｃｙ５、Ｎｂ／Ｔｚ＝５、ｔ＝０」としてマークする。第４のレーンは、Ｎｂ／Ｔｚ比５での、１５分後のＩＥＤＤＡクリックケミストリー付加物であり、「ＰｏｌｙＥ－Ｃｙ５、Ｎｂ／Ｔｚ＝５」としてラベルをつける。第５のレーンは、Ｎｂ／Ｔｚ比１０での、１５分後のクリックケミストリー付加物であり、「ＰｏｌｙＥ－Ｃｙ５、Ｎｂ／Ｔｚ＝１０」としてラベルをつける。 Ｎｂ／Ｔｚ比１０～１５での、Ｎｂ修飾ポリマー（Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ、すなわちＮｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）と、Ｔｚ修飾アプタマーとのＩＥＤＤＡクリックケミストリー付加物の、サイズ排除スピンカラムによる精製後のＵＶ－ｖｉｓ分光法分析を示す。 Ｎｂ／Ｔｚ比１０～１５での、Ｎｂ修飾ポリマー（Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ、すなわちＮｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）と、Ｔｚ修飾アプタマーとのＩＥＤＤＡクリックケミストリー付加物の、サイズ排除スピンカラムによる精製後のアガロースゲル分析を示す。 ポリマーのみ、およびアプタマーのみと比較した、精製後のポリマーアプタマー複合体のＲＰ－ＨＰＬＣ分析を示す。 ヒトＰＢＭＣを、１μＭの濃度の抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ）のみ、Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）ポリマーに共有結合でグラフトした同じ抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ／Ｃ６Ｅ３）のみの存在下、またはこれらと、７ｎＭの濃度の共刺激性モノクローナル抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８ ｍＡｂ）の存在下で、０、２４、４８および７２時間インキュベーションした後、フローサイトメトリーによって測定したヒトＰＢＭＣの細胞生存率を示す棒グラフである。各条件は、２人の異なる血液ドナーからのＰＢＭＣで得られた平均値を示す。比較のために、単独で、または抗ＣＤ３（ＣＤ３ ｍＡｂ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下（それぞれ７ｎＭの濃度）で培養したＰＢＭＣの生存率を示す。 図８Ａおよび図８Ｂは、ヒトリンパ球を、１μＭの濃度の抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ）のみ、Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）ポリマーに共有結合でグラフトした同じ抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ／Ｃ６Ｅ３）のみの存在下、またはこれらと、７ｎＭの濃度の共刺激性モノクローナル抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８ ｍＡｂ）の存在下で、０、２４、４８および７２時間インキュベーションした後、ＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの発現によって測定したヒトリンパ球の活性化を示す棒グラフである。２４時間および４８時間のインキュベーション後、アプタマーの濃度を一定に保つために、培養液に抗ＣＤ２８抗体と混合した新鮮な溶液を添加した。図８Ａは、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球上のＣＤ２５およびＣＤ６９表面マーカーの発現レベルを示す。図８Ｂは、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球上のＣＤ２５およびＣＤ６９表面マーカーの発現レベルを示す。各条件は、２人の異なる血液ドナーからのＰＢＭＣで得られた平均値を示す。比較のために、単独で、または抗ＣＤ３（ＣＤ３ ｍＡｂ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下（それぞれ７ｎＭの濃度）で培養したＰＢＭＣの活性化を示す。 図９Ａ～図９Ｅは、ヒトリンパ球を、１μＭの濃度の抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ）のみ、Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）ポリマーに共有結合でグラフトした同じ抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ／Ｃ６Ｅ３）のみの存在下、またはこれらと、７ｎＭの濃度の共刺激性モノクローナル抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８ ｍＡｂ）の存在下で、０、２４、４８および７２時間インキュベーションした後、サイトカイン分泌によって測定したヒトリンパ球の活性化を示す棒グラフである。２４時間および４８時間のインキュベーション後、アプタマーの濃度を一定に保つために、培養液に抗ＣＤ２８抗体と混合した新鮮な溶液を添加した。ＴＮＦ－ａ（図９Ａ）、ＩＦＮ－ｇ（図９Ｂ）、ＩＬ－５（図９Ｃ）、ＩＬ－４（図９Ｄ）およびＩＬ－２（図９Ｅ）を、培養上澄みでのビーズベースのフローサイトメトリー法によって定量化した。各条件は、２人の異なる血液ドナーからのＰＢＭＣで得られた平均値を示す。比較のために、単独で、または抗ＣＤ３（ＣＤ３ ｍＡｂ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下（それぞれ７ｎＭの濃度）で培養したＰＢＭＣの活性化を示す。 図９Ａ～図９Ｅは、ヒトリンパ球を、１μＭの濃度の抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ）のみ、Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）ポリマーに共有結合でグラフトした同じ抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ／Ｃ６Ｅ３）のみの存在下、またはこれらと、７ｎＭの濃度の共刺激性モノクローナル抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８ ｍＡｂ）の存在下で、０、２４、４８および７２時間インキュベーションした後、サイトカイン分泌によって測定したヒトリンパ球の活性化を示す棒グラフである。２４時間および４８時間のインキュベーション後、アプタマーの濃度を一定に保つために、培養液に抗ＣＤ２８抗体と混合した新鮮な溶液を添加した。ＴＮＦ－ａ（図９Ａ）、ＩＦＮ－ｇ（図９Ｂ）、ＩＬ－５（図９Ｃ）、ＩＬ－４（図９Ｄ）およびＩＬ－２（図９Ｅ）を、培養上澄みでのビーズベースのフローサイトメトリー法によって定量化した。各条件は、２人の異なる血液ドナーからのＰＢＭＣで得られた平均値を示す。比較のために、単独で、または抗ＣＤ３（ＣＤ３ ｍＡｂ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下（それぞれ７ｎＭの濃度）で培養したＰＢＭＣの活性化を示す。 図９Ａ～図９Ｅは、ヒトリンパ球を、１μＭの濃度の抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ）のみ、Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）ポリマーに共有結合でグラフトした同じ抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ／Ｃ６Ｅ３）のみの存在下、またはこれらと、７ｎＭの濃度の共刺激性モノクローナル抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８ ｍＡｂ）の存在下で、０、２４、４８および７２時間インキュベーションした後、サイトカイン分泌によって測定したヒトリンパ球の活性化を示す棒グラフである。２４時間および４８時間のインキュベーション後、アプタマーの濃度を一定に保つために、培養液に抗ＣＤ２８抗体と混合した新鮮な溶液を添加した。ＴＮＦ－ａ（図９Ａ）、ＩＦＮ－ｇ（図９Ｂ）、ＩＬ－５（図９Ｃ）、ＩＬ－４（図９Ｄ）およびＩＬ－２（図９Ｅ）を、培養上澄みでのビーズベースのフローサイトメトリー法によって定量化した。各条件は、２人の異なる血液ドナーからのＰＢＭＣで得られた平均値を示す。比較のために、単独で、または抗ＣＤ３（ＣＤ３ ｍＡｂ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下（それぞれ７ｎＭの濃度）で培養したＰＢＭＣの活性化を示す。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、ヒトリンパ球を、１μＭの濃度の抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ）のみ、Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）ポリマーに共有結合でグラフトした同じ抗ＣＤ３アプタマー（ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ／Ｃ６Ｅ３）のみの存在下、またはこれらと、７ｎＭの濃度の共刺激性モノクローナル抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８ ｍＡｂ）の存在下で、０、２４、４８および７２時間インキュベーションした後、フローサイトメトリーによって測定した、ヒトリンパ球のＣＤ３受容体インターナリゼーションを示す棒グラフである。２４時間および４８時間のインキュベーション後、アプタマーの濃度を一定に保つために、培養液に抗ＣＤ２８抗体と混合した新鮮な溶液を添加した。図１０Ａは、Ｔリンパ球上のＣＤ３表面マーカーの発現レベルを示す。図１０Ｂは、Ｔリンパ球上のＣＤ４およびＣＤ８表面マーカーの発現レベルを示す。各条件は、２人の異なる血液ドナーからのＰＢＭＣで得られた平均値を示す。比較のために、単独で、または抗ＣＤ３（ＣＤ３ ｍＡｂ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下（それぞれ７ｎＭの濃度）で培養したＰＢＭＣの表面上での、これらの受容体の発現を示す。
本技術は、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーを利用して、ＰＢＡＥ骨格上に官能基を導入する。歪んだアルケン、例えばノルボルネンは、テトラジン官能基と極めて急速かつ選択的に反応し、確立されたクリックケミストリープロトコルよりもはるかに速い速度定数を有する、安定な付加物を形成する。さらに、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーを介した、部位特異的で、直交的な様式での標的リガンドの複合化は、水溶液中で、室温、例えば約１５℃～約３０℃の範囲で、ノルボルネンとテトラジン官能基との間の反応を介して実行できる。ＩＥＤＤＡクリックケミストリーの最終的な付加物は、反応中、追加の試薬を使用しないため、さらなる処理または精製なしでそのまま使用できる。
標的リガンド結合ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーは、４段階の合成手順を使用して合成できる。第１の工程は、アミンモノマーとジアクリレートモノマーを重合させ、ＰＢＡＥジアクリレート前駆体を得ることを含む。第２の工程は、ＤＣＣカップリングを介して、ＰＢＡＥジアクリレート骨格上の－ＯＨ側鎖の１つに、ノルボルネンカルボン酸をグラフトすることを伴う。第３の工程は、システイン含有テトラペプチドを使用し、チオール－マイケル付加反応を介したポリマー末端基修飾である。最後の工程は、１つ以上のテトラジン官能性標的リガンド（例えば、アプタマー、多特異性アプタマー、または抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマー）を、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーを介して、ノルボルネン修飾ＯＭ－ＰＢＡＥ上にグラフトすることを含む（図２）。あるいは３段階合成においては、第１の工程は省略でき、ＰＢＡＥジアクリレートが出発物質として提供される。別の代替的実施形態では、工程３のクリックケミストリーは、ノルボルネンまたは別の歪んだアルケンを、ＰＢＡＥジアクリレート骨格上にグラフトする第２の工程の前に実行できる。
上で議論したように、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーの最終的な付加物はそのまま使用でき、図３に示した「精製工程３」（および凍結乾燥、再構成）は、最小化、任意選択とする、または回避し、ＯＭ－ＰＢＡＥへの標的部位の結合のための、すぐに使えるキットを提供することができる。本明細書にて開示した、水溶性の手法を利用することで、有機溶媒の使用を部分的に、または完全に回避できる。例えば、ＯＭ－ＰＢＡＥのＤＭＳＯを含まない合成は、ＷＯ２０２１／０５３４００Ａ２に記載され、同明細書はその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
ＰＢＡＥジアクリレート前駆体の構造の例を、下記の式１に示す。
Figure 2023518902000020
 側鎖Ｇ１、Ｇ２およびＧ３は、それぞれ独立して、Ｈまたは下記の式２に示す構造から選択できるが、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３のうち少なくとも１つは式２による構造を有し、式中、Ｔは水素、歪んだアルケン、歪んだアルケン環、－Ｎ－アジド、アジドまたは－ＯＨであることができ、「ａ」は３、４、５、６、７、８、９または１０であることができる。
Figure 2023518902000021
歪んだアルケン環は、下記の反応１に示すように、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーに利用することができる。
Figure 2023518902000022
Figure 2023518902000023
結合したカルボン酸を含有する歪んだアルケン環を使用して、下記の反応２に図示するように、エステルを形成することができる。歪んだアルケン環は異なる大きさであり得るから、エステルを形成するカルボン酸を含む歪んだアルケン環の反応手法に際して、上記の「ａ」の最小値は立体効果を考慮に入れて決定する。エステルは、歪んだアルケン環（または歪んだアルケン）と、ＰＢＡＥジアクリレート前駆体の１つ以上の側鎖との間に、下記の反応２の例に図示するように、形成することができる。
Figure 2023518902000024
反応２にはエキソ－ノルボルネンが図示されているが、エステル形成には任意の歪んだアルケンが含まれ得る。反応２の利点は、ＰＢＡＥ末端での反応（例えば、エステル形成）を回避するために末端ジアクリレートを利用していることである。ＩＥＤＤＡでは、各種の歪んだアルケンまたは歪んだアルケン環を利用し、また歪んだアルケン環として導入して、続いて使用可能となったクリックケミストリーの後続の反応副生成物を回避することができる。反応２においては、単純な試薬（例えば水溶液）を用いた、後続の高収率でのクリックケミストリーを可能にする高度に歪んだアルケン環が示されている。この反応は、例えば、著しい副生成物を生成することなく、ＰＢＡＥに選択した標的部位を結合するための、すぐに利用可能なキットに使用され得る。反応２に示した歪んだアルケン環は、エキソ－５－ノルボルネンカルボン酸である。
環系上の歪みは、環内にまたは環系において微妙な違いを伴い得る。歪んだアルケン環の立体化学の効果は、エンド－５－ノルボルネンカルボン酸が、１，２，４，５－テトラジンと、エキソ－５－ノルボルネンカルボン酸よりも著しく遅く反応することによって示される。その他の好適な、カルボン酸を含む歪んだアルケン（ＳＡ）の例は、電子豊富なジエノフィル（シクロプロペンまたはシクロオクテン化合物）であり、その異なる縮合環誘導体を有するトランスシクロオクテンおよびメチルシクロプロペンなどが挙げられる。一例では、歪んだアルケンまたは歪んだアルケン環は、ノルボルネンのみを含むことができる。エキソ－５－ノルボルネンカルボン酸および５つの炭素（式２の「ａ」＝５）を用いる例を図１に図示する。歪んだアルケンの結合後、末端ジアクリレートは、例えば式３に示すように末端修飾され得る。
Figure 2023518902000025
式３に示すＲ１基およびＲ２基は、独立してアクリレート（末端Ｈ２を含む）であることができ、または後続のクリックケミストリーと競合しないもしくは妨げない任意の化学構造から選択することができる。式３に示すＲ１基およびＲ２基は、独立して、任意の所望のポリマー、例えば生体分子、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、糖、または多糖類などから選択され得る。好ましくは、Ｒ１およびＲ２はオリゴペプチドから選択され、より好ましくはテトラペプチドから選択される。
オリゴペプチドは、任意のアミノ酸配列を有することができる。この配列は、例えば、Ｎ末端システインと、Ｈ、ＲおよびＫの任意の組み合わせなどの１つ以上の正電荷を帯びたアミノ酸と、最大で２０個のアミノ酸残基を含有することができる。この配列は、例えば、Ｎ末端システインと、ＤおよびＥの任意の組み合わせなどの１つ以上の負電荷を帯びたアミノ酸と、最大で２０個のアミノ酸残基を含有することができる。この配列は、例えば、Ｎ末端システインと、Ｈ、ＲおよびＫなどの１つ以上の正電荷を帯びたアミノ酸とを、任意の順序でＤまたはＥなどの任意の負電荷を帯びたアミノ酸と組み合わせて、最大で２０個のアミノ酸残基を含有することができる。例示的なアミノ酸配列としては、ＣＨ、ＣＨＨ、ＣＨＨＨ（配列番号１）、ＣＨＨＨＨ（配列番号２）、ＣＨＨＨＨＨ（配列番号３）、ＣＲ、ＣＲＲ、ＣＲＲＲ（配列番号４）、ＣＲＲＲＲ（配列番号５）、ＣＲＲＲＲＲ（配列番号６）が挙げられる。ＣＫ、ＣＫＫ、ＣＫＫＫ（配列番号７）、ＣＫＫＫＫ（配列番号８）、ＣＫＫＫＫＫ（配列番号９）、ＣＥ、ＣＥＥ、ＣＥＥＥ（配列番号１０）、ＣＥＥＥＥ（配列番号１１）、ＣＥＥＥＥＥ（配列番号１２）、ＣＤ、ＣＤＤ、ＣＤＤＤ（配列番号１３）、ＣＤＤＤＤ（配列番号１４）、ＣＤＤＤＤＤ（配列番号１５）、ＣＨＲＨ（配列番号１６）、ＣＨＲＲ（配列番号１７）、ＣＨＫＨ（配列番号１８）、ＣＨＫＫ（配列番号１９）、ＣＨＥＨ（配列番号２０）、ＣＨＥＥ（配列番号２１）、ＣＨＤＨ（配列番号２２）、ＣＨＤＤ（配列番号２３）、ＣＲＨＲ（配列番号２４）、ＣＲＨＨ（配列番号２５）、ＣＲＫＲ（配列番号２６）、ＣＲＫＫ（配列番号２７）、ＣＲＥＲ（配列番号２８）、ＣＲＥＥ（配列番号２９）、ＣＲＤＲ（配列番号３０）、ＣＲＤＤ（配列番号３１）、ＣＫＨＫ（配列番号３２）、ＣＫＨＨ（配列番号３３）、ＣＫＲＫ（配列番号３４）、ＣＫＲＲ（配列番号３５）、ＣＤＨＤ（配列番号３６）、ＣＤＨＨ（配列番号３７）、ＣＤＲＤ（配列番号３８）、ＣＤＲＲ（配列番号３９）、ＣＤＫＤ（配列番号４０）、ＣＤＫＫ（配列番号４１）、ＣＥＨＥ（配列番号４２）、ＣＥＨＨ（配列番号４３）、ＣＥＲＥ（配列番号４４）、ＣＥＲＲ（配列番号４５）、ＣＥＤＥ（配列番号４６）およびＣＥＤＤ（配列番号４７）。本技術のオリゴペプチドはまた、細胞膜透過性ペプチド、例えば、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（ＴＡＴ）（配列番号４８）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（配列番号４９）、ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（ＮＬＳ配列）（配列番号５０）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ１０）（配列番号５１）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＲＶ（ｐｅｐ－１）（配列番号５２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（ＭＡＰ）（配列番号５３）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（ＦＨＶ ｃｏａｔ）（配列番号５４）、およびＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（ｐＶＥＣ）（配列番号５５）であることができる。本技術のオリゴペプチドはまた、インテグリン結合ペプチド、例えばＲＧＤまたはその他のインテグリン結合ペプチドであることができる。
オリゴペプチドをＰＢＡＥジアクリレートに付加するには、チオール－マイケル付加反応を利用することができる。一例では、ＣＲＲＲ（配列番号４）を、下記の式４にて図示するように、システインの硫黄を介してチオール－エーテルを形成して結合する。チオール－エーテルは必須ではなく、ペプチドはペプチド結合を介して結合される場合があり、従って配列番号４は式４のように図示される。Ｒ１基およびＲ２基のその他の例を、式５および式６に示す。Ｒ１基およびＲ２基を選択した後の、電子不足のジエンの例としての１，２，４，５－テトラジン、および電子豊富なジエノフィルの、クリックケミストリーのための使用を図２に図示する。
Figure 2023518902000026
Figure 2023518902000027
Figure 2023518902000028
式６の例において、ｐは１９以下であることができ、Ｒａは、各出現時に、Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）－ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（１）－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（２）－、および（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－ＣＨ２－からなる群から選択され得る。
一例では、ナノ粒子を含有する製剤は、正味の負電荷を有する１種以上のＯＭ－ＰＢＡＥと、正味の正電荷を有する１種以上のＯＭ－ＰＢＡＥとを組み合わせることによって形成され得る。ＯＭ－ＰＢＡＥまたはナノ粒子の個別の電荷を変えて、ナノ粒子またはＯＭ－ＰＢＡＥのゼータ電位を調整することができる。
図２に示した３－フェニル－１，２，４，５－テトラアジン（すなわちテトラジン）は、例えば、アプタマー、標的部位、多特異性アプタマーまたは抗体（図２において星で示す）が結合されるときの反応速度に応じた立体障害を考慮に入れるために、フェニルを含有する。３－メチル－６－フェニル－１，２，４，５－テトラジンを使用することができ、または任意のその他の好適な１，２，４，５－テトラジンを実施することができる（例えば、式１０）。図２に示した例によって、クリックケミストリー用の水溶性キットが可能になり得る。
図３においては、「骨格Ｃ６の重合」は、第１級アミンモノマーおよびジアクリレート官能性モノマーを使用して、ＰＢＡＥジアクリレートポリマー（例えば、式１）を合成することによって達成できる。例えば、５－アミノ－１－ペンタノール、１－ヘキシルアミンおよび１，４－ブタンジオールジアクリレートを、第１級アミン基に対するアクリレートのモル比が２．２：１で、約９０℃で約２０時間、混合され得る。精製工程１は、ヘプタンまたはその他の好適な溶媒中での沈殿および任意の洗浄によって達成できる。歪んだアルケン（例えば、反応２）の付加は、「Ｎｂ修飾Ｃ６骨格の合成」として、図３に示す。ＰＢＡＥジアクリレートポリマーは、当該技術分野において既知の任意の化学、例えば－ＯＨまたは側鎖からのアジド（式２）の間の好適な付加反応を用いて、歪んだアルケンに結合され得る。エステル形成は、本明細書においては、使いやすい手法として示される。
－ＯＨの場合、好適な塩基を用いた、ＰＢＡＥの１つ以上の側鎖上の－ＯＨ基と、歪んだアルケンのカルボン酸基との間のエステル化は、カップリング試薬、例えばＤＣＣを用いて、好適な溶媒（例えば、ＴＨＦ）中で利用できる。後続の精製は、例えば、ＤＣＣ添加後に、沈殿、遠心分離および溶媒除去によって達成できる。
Ｒ１基およびＲ２基の付加は、例えばアセトニトリル中にＰＢＡＥジアクリレートポリマーを溶解することによって達成できる。ＤＭＳＯを使用することもできるが、ＤＭＳＯは除去が困難であり、その後の生体不適合性につながり得る。それとは別に、選択したＲ１基およびＲ２基は、ｐＨ約５で、水溶性クエン酸塩緩衝液に溶解され得る。アセトニトリルは、これらの基の溶解後、クエン酸塩に添加できる。クエン酸塩緩衝液が、アセトニトリル中のＰＢＡＥジアクリレートポリマーと混合されるとき、Ｒ１基およびＲ２基は、末端ビニル炭素に結合して末端修飾ポリマーを形成する（式３）。その後に溶媒除去が続く。精製した試料、これはすぐに使用できるクリックケミストリーの第１の試薬として提供され得るものであり、反応１および式３の例に示す。別個の分取反応において、クリックケミストリーの第２の試薬として、１，２，４，５－テトラジンを標的部位に結合する。
図３において、「クリックケミストリーを介したアプタマーＯＭ－ＰＢＡＥ複合体の合成」は、単一のクリックケミストリー工程で達成でき、任意の後続の工程はこの技術によって回避できる。アプタマーまたは抗体は、図２に示すクリックケミストリーの前に１，２，４，５－テトラジンに結合される。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドである。合成の１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ、ＸＮＡ（核酸アナログ）、または特定の二次および三次構造を形成するＲＮＡ分子が例である。例えば、ＤＮＡアプタマーは、末端ホスフェートにアミノ修飾剤を結合することによって、５’末端において官能化され得る。任意の適切な結合化学を使用できる。アミノ修飾剤の例を式７に示す。式中、ｆは、アプタマーの末端ホスフェート（例えば、５’）に関する立体効果を考慮して、約３～約５以上であることができる。
Figure 2023518902000029
アミン結合の後、テトラジン官能基を、テトラジン－ＰＥＧ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）エステルとして、ＮＨＳ／ＥＤＣ（エチル－ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）化学によって結合し、それによって混合極性スペーサーを、アプタマー配列と１，２，４，５－テトラジンの間に導入できる。このとき、立体障害を考慮するべきである。いろいろな鎖長のエステル、例えばペンタまたはヘキサエチレングリコールなど、３～１２のエチレングリコール単位を有するエステルの使用が熟慮される。その他のより短いエステル、例えばテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、メチルテトラジン－スルホ－ＮＨＳエステルおよびメチルテトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステルなども使用可能である。アプタマー次第で、遊離３’ヒドロキシル基が存在する場合、後続の３’修飾を利用してヌクレアーゼ分解への耐性を高めることができる。
異なるクラスの抗体またはそれらのフラグメントを、抗原結合部位から離れたテトラジンに結合することで１，２，４，５－テトラジンで官能化して、活性の低下を防ぐことができる。抗体、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマー、または細胞表面受容体のリガンド（例えば、標的部位）は、同様に反応させることができる。一例では、１，２，４，５－テトラジンは、２－メルカプトエタンスルホネート（メスナ）を用いたチオール－ジスルフィド交換による単鎖可変フラグメントのリリースによって、標的部位に結合させることができる。 Ｎ末端ペプチドにおける開裂反応およびカルボキシ末端におけるメスナとのチオエステルの形成を利用して、チオエステルを第１級アミンおよびリンカーと反応させることができる。式７に示すリン酸エステルは、通常式８に示すように、スルホン酸エステルとして考慮でき、アプタマーは抗体またはその他の部分であり、ｅは約３～５以上である。続いて、テトラジン含有部位は、上述のように、テトラジン－ＰＥＧ－Ｎ－ＮＨＳエステルを介して第１級アミンに結合することができる。
Figure 2023518902000030
組み合わせたアプタマーまたは多特異性アプタマーは、１，２，４，５－テトラジンの結合の前または後に、２か所以上を連結することによって利用できる。例えば、２つ以上の標的に結合するアプタマーを使用することにより、それぞれが異なる標的に対する結合特異性を有し、リンカーがアプタマーを連結する。ＳＥＬＥＸ手法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）またはこの変種を介して開発し、ＰＣＲを介して増幅した任意のアプタマーは、例えば式７に示すように、リン酸エステルを介して結合することができる。アプタマーは、任意の所望の長さを有することができる。アプタマーは、少なくとも約８、最大で約１３０のヌクレオチドを含有してよい。
その他のクリックケミストリー手法、例えばアジド、すなわち式２の「Ｔ」を利用するような手法も使用できるが、ＩＥＤＤＡクリックケミストリー技術は、標的部位が迅速にＯＭ－ＰＢＡＥに結合できるように、クリックケミストリー反応の後のさらなる工程を回避する。
ＩＥＤＤＡクリックケミストリーは、触媒または別の試薬を必要としないため、極めて速い反応速度を有し、水溶性条件において即座に起こる。図４においては、１，２，４，５－テトラジン（Ｔｚ）官能性スルホ－Ｃｙ５色素およびＮｂ官能性ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ））を使用して、反応溶媒としての蒸留水を用いて、２０ｍｇの規模で実施するＩＥＤＤＡクリックケミストリーの反応を、３％アガロースゲル電気泳動を使用して測定する。Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）およびＴｚ官能性スルホ－Ｃｙ５を、Ｎｂ／Ｔｚ比が５：１（右から２番目のレーン）および１０：１（最も右側のレーン）、蒸留水中０．５ｍＭのスルホ－Ｃｙ５濃度で、１００μｌの最終容量で、１５分間反応させる。Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥと、Ｔｚ官能性スルホ－Ｃｙ５との間のクリックケミストリーは、１５分で完了に達する。図４の中央のレーンはｔ＝０を示し、遊離のスルホ－Ｃｙ５バンドが観察されるが、クリックケミストリー付加物の形成に相当するバンドがすでに存在する。左から２番目のレーンは、スルホ－Ｃｙ５（Ｃｙ５）用の対照であり、最も左側のレーンはＮｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥの対照である。
クリックケミストリーによって標的部位を結合した後、歪んだアルケン環（ＳＡＲ）を鎖に組み込む。選択した官能基をＳＡＲに含まれ得るが、得られる標的化ＯＭ－ＰＢＡＥの無毒性または水素結合を損い得る官能基（例えば－ＣＮニトリルまたは帯電した基）は、想定し、回避することができる。免疫応答を引き起こす置換基は避けることができる。
本技術は、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマーおよび細胞表面受容体のリガンドの、ＯＭ－ＰＢＡＥへの迅速な結合を可能にする。１種以上の標的部位およびＯＭ－ＰＢＡＥを含むキットが提供され得る。水溶性の化学を用いることで、最小限の後続の浄化、または後続の浄化を回避してクリックケミストリーを行うことができ、またこの技術を前進させるための送達ツールが提供される。
標的部位の結合後、本明細書にて提供されるナノ粒子またはＯＭ－ＰＢＡＥは、送達システム、例えば免疫療法または遺伝子治療における適用のためのシステムとして利用することができる。このようなナノ粒子を含有する組成物または製剤は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫機能障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生中性反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病、代謝性疾患、神経性疾患、眼の疾患の、必要とする対象における予防、処置または改善に用いられる医薬品として機能し得る。別の例では、この技術は、診断での適用、医療用画像化での適用、精製系、および細胞選別または濃縮での適用において利用することができる。
いくつかの実施形態では、本技術により作られた標的化ＰＢＡＥを含有するナノ粒子を使用して、免疫エフェクター細胞をがん細胞にリダイレクトすることが可能となり得る。標的部位は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４またはその他のＴ細胞特異的抗原を発現する免疫エフェクターＴ細胞を、関心対象であるその他の細胞標的、例えばＣＤ１９、上皮細胞接着性分子、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＤＬＬ３、ＥＧＦ－Ｒ、ＭＨＣクラスＩ関連タンパク質ＭＲ１またはメソテリンにリダイレクトできる。いくつかの実施形態では、標的部位は、例えばＣＤ１６Ａ、ＮＫＧ２Ｄまたはその他のＮＫ細胞特異的抗原を介する免疫エフェクターＮＫ細胞を、関心対象であるその他の細胞標的、例えばＣＤ３０、ＣＤ１９、上皮細胞接着性分子、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ３、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＤＬＬ３、ＥＧＦ－Ｒ、ＭＨＣクラスＩ関連タンパク質ＭＲ１またはメソテリンにリダイレクトできる。標的部位は、標的、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ０４、Ｌａｇ－３、ＴＩＭ－３またはＯＸ４０および腫瘍微小環境（ＴＭＥ）調節因子、例えばＣＤ４７またはＶＥＧＦに結合することができ、あるいは１種以上の腫瘍関連抗原、例えばＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ａ３／Ａ６、ＭＡＧＥ Ａ１０、ＡＦＰを標的とすることができる。標的部位は、炎症性疾患または自己免疫疾患、心代謝性疾患、呼吸器疾患、眼の疾患、神経性疾患または感染症に関与する抗原を標的とすることができる。
いくつかの実施形態では、標的部位は、免疫エフェクター細胞を活性化および刺激して、特定の標的化抗原を発現する細胞を殺傷することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、送達システムとして機能することができる（例えば、遺伝子治療での適用）。いくつかの実施形態では、標的化ナノ粒子は、診断用での適用において使用できる。いくつかの実施形態では、標的化ＰＢＡＥは、精製系、例えば細胞選別または濃縮での適用において使用できる。
実施例１：ＩＥＤＤＡクリックケミストリーのための、ノルボルネン修飾ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーおよびテトラジン修飾標的剤の合成および精製
ＰＢＡＥジアクリレートポリマーの合成、精製およびキャラクタリゼーション
付加型の重合を介して、第１級アミンモノマーおよびジアクリレート官能性モノマーを使用して、ポリ（β－アミノエステル）－ジアクリレート（ＰＢＡＥジアクリレート）ポリマーを合成した。５－アミノ－１－ペンタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９５．７％の純度、３．９ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）、１－ヘキシルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９．９の純度、３．８ｇ、３８ｍｍｏｌ）および１，４－ブタンジオールジアクリレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、８９．１％の純度、１８ｇ、８１ｍｍｏｌ）を、第１級アミン基に対するアクリレートのモル比２．２：１で、丸底フラスコ中で混合した。混合物を９０℃で２０時間撹拌した。続いて、反応混合物を室温まで冷却することによって、粗生成物、すなわち薄黄色の粘性の油状物を得た。合成されたＰＢＡＥジアクリレートポリマーを、ヘプタン中の沈殿によって精製した。粗生成物を酢酸エチルに溶解し、これを過剰量のヘプタン（１／１０、ｖ／ｖ）に滴下して添加し、この手順を２回繰り返した。酢酸エチル／ヘプタン（１／１０、ｖ／ｖ）を用いた精製ＰＢＡＥジアクリレートは、８６％の収率を有する５０ｇの規模で得られ、溶離液としてＴＨＦを使用するゲル浸透クロマトグラフィーによって、それぞれ５３００ｇ／ｍｏｌおよび３１００ｇ／ｍｏｌのＭｗおよびＭｎを有すると特徴付けされた。
ノルボルネン（Ｎｂ）修飾ＰＢＡＥジアクリレートの合成、精製およびキャラクタリゼーション
ＰＢＡＥの側鎖上の－ＯＨ基と、Ｎｂのカルボン酸との間のエステル化反応を介して、ＰＢＡＥジアクリレートポリマーをノルボルネン（Ｎｂ）基によって修飾した。精製ＰＢＡＥジアクリレート（１ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、エキソ－ノルボルネンカルボン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９７％の純度、６９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）および４－ジメチルアミノピリジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９８％の純度、６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を反応器に添加し、９ｍｌの無水ＴＨＦ中で１０分間撹拌した。続いて、反応混合物を氷上で０℃まで冷却し、さらに３０分間撹拌した。次に、ＤＣＣ試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９％の純度、１０３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を０℃で反応混合物に添加し、１時間撹拌し、続いて反応混合物を２５℃まで徐々に加熱し、さらに２０時間撹拌した。
反応完了後、副生成物の沈殿物１，３－ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を、遠心分離を介して溶液から取り除いた。ＴＨＦを、減圧下で蒸発させた。得られた５ｇの生成物を２ｍｌの酢酸エチル中に再溶解し、再び遠心分離にかけて残留ＤＣＵ沈殿物を除去した。酢酸エチルを減圧下で除去し、ＰＢＡＥ骨格上へのＮｂのグラフトを確認するために、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＡＰＴおよび２Ｄ ＣＯＳＹ ＮＭＲ技術を使用して、最終生成物をキャラクタリゼーションした。構造はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析により確認した。
Ｎｂ修飾ＰＢＡＥジアクリレートからのＯＭ－ＰＢＡＥの合成、精製およびキャラクタリゼーション
遊離チオール含有テトラペプチド、すなわちＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ（ＣＥＥＥ、配列番号１０）（２．８当量）を用いて、チオール－マイケル付加反応を介して、Ｎｂ修飾ＰＢＡＥジアクリレートポリマー（１当量）を末端封鎖した。ＤＭＳＯを含まない条件下で、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）を使用して、不活性窒素雰囲気下でカップリング反応を実施した。反応後、減圧下、４０℃で、アセトニトリル／クエン酸塩混合物を除去した。さらに、溶離液としてＭｉｌｌｉＱ水を使用して、８０ｍｇ／ｍｌの濃度でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１０充填カラムを介して、粗生成物を精製した。１ｇ規模の回分の精製生成物を凍結乾燥によって回収し、さらなる使用のために－２０℃で保管した。Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）生成物を、１Ｈ－ＮＭＲおよびＧＰＣ（Ｍｎ＝４９００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ＝１１４００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝２．３）を使用してキャラクタリゼーションし、構造を確認し、またＣ１８ ＢＥＨカラムを使用するＨＰＬＣで、残留遊離ペプチドを決定した。構造はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析により確認した。
テトラジン修飾アプタマーの合成、精製およびキャラクタリゼーション
ＤＮＡアプタマーＣＤ３＿ＣＥＬＴＩＣ＿ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ（ＧＧＧＴＴＴＧＧＣＡＴＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣ、配列番号５６）を、ヒトＣＤ３に対してあらかじめ選択している。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ Ｋａｎｅｋａ（Ｌｉｅｇｅ Ｂｅｌｇｉｕｍ）から、標準的な固相ホスホラミダイトケミストリーを介して合成されたＨＰＬＣ－ＲＰ精製１本鎖オリゴとして、１０ｍｇ回分を入手した。その他のアプタマーは、ＣＤ３または別の所望の標的に特定の結合親和性を有する配列番号５６で置き換えることができる。続いて、アプタマーの５’末端を、末端ホスフェートに付加したＣ６アミノ修飾剤を介して、第１級アミンで官能化した。テトラジンの後続の結合を容易にするために５’アミノ修飾剤を使用し、修飾剤の長さは立体効果を踏まえて考慮した。アプタマー配列とテトラジンフラッグの間に１６原子の混合極性スペーサーを導入しつつ、テトラジン官能基を、テトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステルとして、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ化学を介して付加した。ヌクレアーゼ分解への抵抗性を高める戦略として、３’－３’デオキシチミジン修飾を付加した。修飾アプタマーの分子量、純度および完全性を、ＨＰＬＣ－ＭＳによって検証した。抗ＣＤ３アプタマーの親和性および特異性を、ＣＤ３陽性およびＣＤ３陰性細胞上で評価した。この抗ＣＤ３アプタマーは、共刺激性抗ＣＤ２８抗体と組み合わせても、サイトカイン分泌または表面マーカーの発現を活性化せず、抗ＣＤ３モノクローナル抗体とは異なっていた（データは図示せず）。
実施例２：ＩＥＤＤＡクリックケミストリーを介したノルボルネン修飾ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーの官能化
Ｎｂ－ＯＭ－ＰＢＡＥおよびテトラジン（Ｔｚ）官能性スルホ－Ｃｙ５を使用したクリックケミストリー
１，２，４，５－テトラジン（Ｔｚ）官能性スルホ－Ｃｙ５色素（ＳｕｌｆｏＣｙ５－テトラジン、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）およびＮｂ官能性ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ、Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）を使用して、２０ｍｇの規模でＩＥＤＤＡクリックケミストリーを実施した。反応溶媒として蒸留水を用いた。（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥおよびＴｚ官能性スルホ－Ｃｙ５を、５：１および１０：１のＮｂ／Ｔｚ比、０．５ｍＭのスルホ－Ｃｙ５濃度、１００μＬの最終容量で、蒸留水中で１５分間反応させた。Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥとＴｚ官能性スルホ－Ｃｙ５との間のクリックケミストリーは１５分で完了に達し、これは３％アガロースゲル電気泳動によって確認した（図４）。３％アガロースゲルを１ｘＴＢＥ緩衝液中で調製し、電気泳動を１００Ｖで２５分間実行した。Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ、スルホ－Ｃｙ５－テトラジン、およびｔ＝０でＮｂ／Ｔｚ比５のＮｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥとスルホ－Ｃｙ５－テトラジンとの混合物もまた、対照群として３％アガロースゲルにロードした（図４）。ｔ＝０でＮｂ／Ｔｚ比５のＮｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥとスルホ－Ｃｙ５－テトラジンとの混合物の場合に、遊離スルホ－Ｃｙ５バンドを観察する可能性があった。しかし同時に、クリックケミストリー付加物の形成に相当するバンドがすでに存在した。概して、これらの結果は、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーが、触媒または別の試薬を必要としないため、極めて速い反応速度を有し、水溶性条件において即座に起こることを示している。
Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥおよびＴｚ官能性ＣＤ３標的アプタマーを使用したクリックケミストリー
２００μＭのアプタマーおよび５ｍＭのＮｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）の原液を、全ての反応において使用した。第１セットの反応は、５０μＬの反応容量で行った。その後に、精製試験のために１００μＬの反応容量を使用し、さらなるキャラクタリゼーションのために、反応容量を２ｍＬまで増加させた。Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥの全体的な溶解度を改善するために、反応媒体中に異なる量のＤＭＳＯが含まれた。
従って、反応でさらに使用するために、５０％のＤＭＳＯ中、５ｍＭのＮｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥ溶液を調製した。従って、蒸留水中、２％、４％、１０％および１５％の最終ＤＭＳＯ濃度で、２、４、１０および１５の比のＮｂ／Ｔｚを試験した。アガロースゲル分析により、Ｎｂ／Ｔｚ比を高めると、遊離の、非結合アプタマー分子に相当するバンドの強度が低下することが示された。さらに、クリックケミストリー反応生成物のＵＶ信号もまた、遊離ポリマーおよびアプタマー種と比較して違いを示した。
反応混合物を、６ｋＤａのＭＷＣＯを有するＢｉｏＳｐｉｎ６サイズ排除カラムを使用してさらに精製し、反応後のＤＭＳＯおよび遊離ポリマーを除去した。ＢｉｏＳｐｉｎ６カラムは、ＳＣＣ緩衝液中であった。それゆえに、緩衝液交換ステップを適用した。最初に、保管緩衝液を１０００ｘｇで２分間溶出した。次に、５００μＬのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水を適用し、１０００ｘｇで１分間遠心分離にかけた。この第２工程を４回繰り返した。次に、４０または５０μＬの試料をロードし、１０００ｘｇで４分間遠心分離にかけ、５０または６０μＬを回収した。試料を２回精製した。１０および１５のＮｂ／Ｔｚ比を試験した。反応媒体に添加され得る、相当するＤＭＳＯ濃度が限定されていたため、Ｎｂ／Ｔｚ比は１５に限定された。ＩＥＤＤＡクリックケミストリー効率は、Ｎｂ／Ｔｚ比を高めることによって向上した。ＵＶ－ｖｉｓスペクトルによって、約２６０ｎｍで相当するアプタマーのピーク強度が低下することが示された（図５Ａ）。加えて、アガロースゲル上で検出された遊離アプタマーの量は、Ｎｂ／Ｔｚ比１０と比較して、Ｎｂ／Ｔｚ比１５で著しく低下した（図５Ｂ）。
さらに、クリックケミストリー反応を、Ｎｂ／Ｔｚ比１５で、１．５ｍｇのアプタマーを含む２ｍＬの規模で実施し、サイズ排除カラムによって精製し、凍結乾燥によって最終生成物を回収し、さらなる使用のために－２０℃で保管した。ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラムを使用）を用いて、遊離アプタマーおよび遊離ポリマーをアプタマーポリマー複合体と比較することで、最終生成物をキャラクタリゼーションした（図６）。
実施例３：ＩＥＤＤＡクリックケミストリーを介して、ノルボルネン修飾ＯＭ－ＰＢＡＥポリマー上に共有結合でグラフトした抗ＣＤ３標的剤の生物的性質および無毒性の維持
ＩＥＤＤＡクリックケミストリーによって標的剤をカップリングしたＯＭ－ＰＢＡＥポリマーの生物学的機能性を、Ｎｂ－ＣＥＥＥ－ＰＢＡＥポリマー（Ｎｂ－配列番号１０－ＰＢＡＥ）上にグラフトしたテトラジン修飾抗ＣＤ３アプタマー、すなわちＣＤ３＿ＣＥＬＴＩＣ＿ｃｏｒｅ４０ＨＥＧｔ（配列番号６）を用いて、ヒト末梢白血球（ＰＢＭＣ）上でインビトロ評価した。このアプタマーは、ヒトＴリンパ球の表面上のＣＤ３受容体に特異的に結合するため選択した。治療用の抗ＣＤ３モノクローナル抗体とは対照的に、このアプタマーは、標的に結合したときでも、共刺激性抗ＣＤ２８抗体と組み合わせても、サイトカイン分泌または表面マーカー発現を活性化しない（データは図示せず）。
ＩＥＤＤＡクリックケミストリーの、ヒトＰＢＭＣ生存率への効果の評価
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２人の健康なドナー（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｒｈｏｎｅｓ－Ａｌｐｅｓ）から入手したバフィーコートから単離した。血液をＤＰＢＳで希釈した後、ＰＢＭＣをＦＩＣＯＬＬ密度勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、再懸濁して目的の細胞密度を得て、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃、５％ＣＯ２で補充した、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ヒトＰＢＭＣを、９６ウエルプレートに、ウエル当たり２ｘ１０５の細胞密度で、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地において播種した。続いて、１μｇ／ｍＬ（各々７ｎＭ）の濃度の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＭの抗ＣＤ３ ｃｏｒｅ４０ＨＥＧのみ、もしくは１μＭの抗ＣＤ３ ｃｏｒｅ４０ＨＥＧ＋１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（７ｎＭ）、または１μＭの抗ＣＤ３アプタマー／ＰＢＡＥのみ、もしくは１μＭの抗ＣＤ３アプタマー／ＰＢＡＥ＋１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（７ｎＭ）の存在下で、細胞を最大で７２時間インキュベートした。０、２４、４８および７２時間培養した後、細胞をハーベストし、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ固定可能な生死判定キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって、製造業者の指示書に従って染色した。フローサイトメトリー（ＡｔｔｕｎｅＮＸＴ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）で、ＲＬ３チャネルでの蛍光性の細胞数を測定することによって生細胞を分析した。
図７に示すように、２人の異なるドナーからのヒトＰＢＭＣを最大で７２時間培養したときの生存率は、全ての試験した条件で類似していた。プロファイルは、アプタマーが過剰の濃度（１μＭ）で存在するときに、遊離形態でまたはＣＥＥＥポリマーに結合した形態で比較可能だった。抗ＣＤ２８共刺激性抗体は、ＣＤ３結合剤と組み合わせるとＴリンパ球の活性化および増殖を誘発することが知られており、この抗ＣＤ２８共刺激性抗体を付加しても、細胞の生存率にいかなる影響も及ぼさなかった。従って、これらの結果は、ノルボルネンによるＣＥＥＥポリマーの官能化、およびＣＤ３標的剤を共有結合するのに使用されるＩＥＤＤＡクリックケミストリー反応は、ヒト細胞の生存率を変え得るいかなる細胞毒性生成物も生成しないことを示唆している。
ＩＥＤＤＡクリックケミストリーによってＯＭ－ＰＢＡＥにカップリングした抗ＣＤ３標的剤によるＴリンパ球の活性化
ヒトＰＢＭＣを、上述したように、２人の健康なドナーから得られたバフィーコートから単離した。ヒトＰＢＭＣを、９６ウエルプレートに、ウエル当たり２ｘ１０５の細胞密度で、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地において播種した。続いて、陽性対照として１μｇ／ｍＬ（各々７ｎＭ）の濃度の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＭの抗ＣＤ３ ｃｏｒｅ４０ＨＥＧのみ、もしくは１μＭの抗ＣＤ３ ｃｏｒｅ４０ＨＥＧ＋１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（７ｎＭ）、または１μＭの抗ＣＤ３アプタマー／ＰＢＡＥのみ、もしくは１μＭの抗ＣＤ３アプタマー／ＰＢＡＥ＋１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（７ｎＭ）の存在下で、細胞を最大で７２時間インキュベートした。細胞を２４時間および４８時間インキュベーションし、その後、アプタマー濃度を一定に保ち、血清中での分解を補完するために、細胞に新鮮なモノマー溶液またはポリマー結合したアプタマー溶液を添加した。あるいは、細胞を、試薬を含まないＲＰＭＩ培地で培養した（陰性対照）。
０、２４、４８および７２時間培養した後、試料を３２０ｇで５分間遠心分離にかけ、上澄みを回収し、製造業者の指示書に従った、Ｍｏｕｓｅ Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた分析まで、－８０℃で保管した。試料を、フローサイトメトリー（ＡｔｔｕｎｅＮＸＴ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）によって、ＹＬ－１チャネルで分析し、分泌されたインターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－ａ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ－ｇ）の血漿中濃度を、ＡｔｔｕｎｅＮＸＴソフトウエア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて定量化した。得られた結果を図９Ａ～図９Ｅに示す。
培養上澄みの回収後、細胞をハーベストし、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した特異的抗体パネルによって、製造業者の指示書に従って細胞の染色後、一般的なパネル（ＣＤ４５－ＢＶ５１０、ＣＤ３ｅ－ＡＦ７００、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ８ａ－ＢＶ６０５）、ならびに活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９－ＰＥ－ＤａｚｚｌｅおよびＣＤ２５－ＰＥ）によってＴリンパ球の表現型および活性化マーカーの発現を分析した。蛍光陽性細胞を、フローサイトメトリー（ＡｔｔｕｎｅＮＸＴ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）によって、ＢＬ３（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５色素）、ＹＬ１（ＰＥ色素）、ＹＬ２（ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ色素）、ＲＬ２（ＡＦ７００色素）、ＶＬ２（ＢＶ５１０色素）およびＶＬ３（ＢＶ－６０５色素）チャネルでカウントした。細胞表現型を、ＣＤ４５＋のうち、生存可能かつ次の単一細胞：Ｔリンパ球（ＣＤ３ｅｈｉｇｈ）、ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ＣＤ４ｈｉｇｈ）およびＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＤ８ｈｉｇｈ）で定義し、一方で活性化Ｔ細胞を３種の亜集団（ＣＤ２５ｈｉｇｈ－ＣＤ６９ｌｏｗ、ＣＤ２５ｌｏｗ－ＣＤ６９ｈｉｇｈまたはＣＤ２５ｈｉｇｈ－ＣＤ６９ｈｉｇｈ）として特定した。得られた結果を図８Ａ～図８Ｂに示す。
抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で処理した細胞は、測定した全てのサイトカインの分泌増加、時間依存的分泌、ならびにＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの表面発現の上方制御を示した。モノマー形態の抗ＣＤ３アプタマー、またはＩＥＤＤＡクリックケミストリーによってポリマーにグラフトした抗ＣＤ３アプタマーは、共刺激性抗ＣＤ２８抗体と組み合わせても、表面マーカー発現のサイトカイン分泌を活性化しなかった。血清中での分解を補完するために、新鮮な溶液を繰り返し添加することによってアプタマー濃度を一定に保っても、より持続的な活性化プロファイルという結果にならなかった。従って、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーによるノルボルネン修飾ＣＥＥＥポリマーへのＣＤ３結合剤の共有結合性カップリング、およびその結果の多量体化は、ヒトＴリンパ球での活性が欠如していることに影響を与えない。
ＩＥＤＤＡクリックケミストリーによってＯＭ－ＰＢＡＥにカップリングした抗ＣＤ３標的剤による、Ｔリンパ球における受容体インターナリゼーションの評価
ヒトＰＢＭＣを、上述したように、２人の健康なドナーから得られたバフィーコートから単離した。ヒトＰＢＭＣを、９６ウエルプレートに、ウエル当たり２ｘ１０５の細胞密度で、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地において播種した。続いて、陽性対照として１μｇ／ｍＬ（各々７ｎＭ）の濃度の、共刺激性と共にある抗ＣＤ３ ＯＫＴ－３抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＭの抗ＣＤ３ ｃｏｒｅ４０ＨＥＧのみ、もしくは１μＭの抗ＣＤ３ ｃｏｒｅ４０ＨＥＧのみ＋１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（７ｎＭ）、または１μＭの抗ＣＤ３アプタマー／ＰＢＡＥのみ、もしくは１μＭの抗ＣＤ３アプタマー／ＰＢＡＥ＋１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（７ｎＭ）の存在下で、細胞を最大で７２時間インキュベートした。細胞を２４時間および４８時間インキュベーションし、その後、アプタマー濃度を一定に保ち、血清中での分解を補完するために、細胞に新鮮なモノマー溶液またはポリマー結合したアプタマー溶液を添加した。あるいは、細胞jiを、試薬を含まないＲＰＭＩ培地で培養した（陰性対照）。
０、２４、４８および７２時間培養した後、細胞をハーベストし、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８表面マーカーに対して向けた特異的抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）によって、製造業者の指示書に従って染色した。ＣＤ３受容体は、ＯＫＴ３によって認識されたエピトープと同じエピトープに結合しないため、抗体クローンＳＫ７を使用した。ＣＤ４５－ＢＶ５１０、ＣＤ３ｅ－ＡＦ７００、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５およびＣＤ８ａ－ＢＶ６０５試薬を使用し、フローサイトメトリー（ＡｔｔｕｎｅＮＸＴ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）によって、ＢＬ３（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５色素）、ＲＬ２（ＡＦ７００色素）、ＶＬ２（ＢＶ５１０色素）およびＶＬ３（ＢＶ－６０５色素）チャネルで、蛍光陽性細胞をカウントした。細胞表現型を、ＣＤ４５＋のうち、生存可能かつ次の単一細胞：Ｔリンパ球（ＣＤ３ｅｈｉｇｈ）、ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ＣＤ４ｈｉｇｈ）およびＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＤ８ｈｉｇｈ）で定義した。得られた結果を図１０Ａ～図１０Ｂに示す。
抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で処理した細胞は、ＣＤ３陽性リンパ球の数の有意な低減（８０％を上回る）を示したが、その他のＣＤ４およびＣＤ８特異的受容体の発現レベルには変化がなかった。２４時間インキュベーション後にすでに観察された、この他と異なる発現プロファイルは、ＯＫＴ－３抗体の、認識したエピトープへの結合に際し、ＣＤ３受容体をインターナライズする能力、すなわちこの治療的抗体の免疫抑制活性を担う特性を反映している。モノマー形態の抗ＣＤ３アプタマー、またはＩＥＤＤＡクリックケミストリーによってポリマーにグラフトした抗ＣＤ３アプタマーは、共刺激性抗ＣＤ２８抗体と組み合わせても、そのようなＣＤ３インターナリゼーションを誘発しなかった。血清中での分解を補完するために、新鮮な溶液を繰り返し添加することによってアプタマー濃度を一定に保っても、より持続的な活性化プロファイルという結果にならなかった。この最後の官能性アッセイによって、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーによるノルボルネン修飾ＣＥＥＥポリマーへのＣＤ３結合剤の共有結合性カップリング、およびその結果の多量体化は、ヒトＴリンパ球での活性を欠いていることに影響を与えないことが確認される。
概して、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーを介して、生物活性部位を有し、ポリマーの特性の変化または細胞毒性の誘発を起こさずに、ノルボルネン修飾ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを官能化した。
本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、記載された値の±１０％、５％、１％または０．５％以内の範囲を意味する。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない物質または工程の包含を許容する。本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の、特に組成物の構成成分の記載における、または装置の要素の記載におけるいかなる詳述も、代替的な表現である、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に交換され得る。
参考文献
Fornaguera C, Guerra-Rebollo M, Lazaro MA, Cascante A, Rubio N et al. In Vivo Retargeting of Poly(beta aminoester) (OM-PBAE) Nanoparticles is Influenced by Protein Corona. Adv. Healthc. Mater. 2019, 1900849.
Jones CH, Chen M, Ravikrishnan A, Reddinger R, Zhang G et al. Mannosylated poly(beta-amino esters) for targeted antigen presenting cell immune modulation. Biomaterials 2015, 37: 333-44.
Green JJ, Chiu E, Leshchiner ES, Shi J, Langer R et al. Electrostatic Ligand Coatings of Nanoparticles Enable Ligand-Specific Gene Delivery to Human Primary Cells. Nano Letters 2007, 7: 874-9.
Kolb HC, Finn MG, Sharpless KB. Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40: 2004-21.
Lv H, Zhang S, Wang B, Cui S, Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release. 2006, 114:100-9.
Meyer C, Liebscher S, Bordusa F. Selective Coupling of Click Anchors to Proteins via Trypsiligase. Bioconjugate Chem. 2016, 27: 47-53.
Schoch J, Ameta S, Jaschke A. Inverse electron-demand Diels-Alder reactions for the selective and efficient labeling of RNA. Chem. Commun., 2011,47:12536-12537.
Smith TT, Stephan SB, Moffett HF, McKnight LE, Ji W et al. In situ programming of leukaemia-specific T cells using synthetic DNA nanocarriers. Nat. Biotechnol. 2017, 12: 813-20.
Zhang F, Parayath NN, Ene CI, Stephan SB, Koehne AL et al. Genetic programming of macrophages to perform anti-tumor functions using targeted mRNA nanocarriers. Nat. Commun. 2019, 10:3974.
Zhang J, Chen R, Fang X, Chen F, Wang Y et al. Nucleolin targeting AS1411 aptamer modified pH-sensitive micelles for enhanced delivery and antitumor efficacy of paclitaxel. Nano Research 2015, 8: 201-18.

Claims (32)

  1. 標的のポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）化合物の合成方法であって、ＩＥＤＤＡクリックケミストリーを用いて、テトラジン官能性標的部位を歪んだアルケン環官能性ＰＢＡＥにカップリングすることを含む、方法。
  2. 前記歪んだアルケン環が、ノルボルネン、歪んだアルケンを含む炭素含有環、架橋結合と歪んだアルケンを含む炭素含有環、シクロプロペン、シクロブテンおよびトランス－シクロオクテンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記歪んだアルケン環がノルボルネンである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記テトラジン官能性標的部位が、１，２，３，５－テトラジンを含む、前記先行する請求項のいずれかに記載の方法。
  5. 前記テトラジン官能性標的化部位が式１０による構造を含む、請求項４に記載の方法。
    Figure 2023518902000031
     式中、Ｌｉ２は、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、
    Figure 2023518902000032
     、またはそれらの組み合わせであり、式中、Ａにおける各原子は独立してＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＢから選ばれ、＊における各結合は独立して単結合、共鳴および／または半共鳴芳香族結合、または二重結合であり、
    式中、Ｂは、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、またはそれらの組み合わせであり、
    式中、Ｒ３は水素または置換基であり、
    式中、ｈは３以上であり、および
    式中、ＴＭは標的部位である、方法。
  6. Ｒ３が結合、－Ｈ、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ３、ＣＨ３－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－ＳＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ３（アセチル、Ａｃ）、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ｔｅｒｔブチル（ＢＯＣ）、－ＮＨＡｃ、－ＮＨＢＯＣ、
    Figure 2023518902000033
     、またはそれらの組合せであり、式中、Ａにおける各原子は、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＢから選択され、＊における各結合は、独立して、単結合、共鳴芳香族結合、または二重結合である、請求項５に記載の方法。
  7. Ｌｉ２が以下を含む、請求項５または請求項６に記載の方法。
    Figure 2023518902000034
  8. 前記テトラジン官能性標的部位が式１１による構造を含む、請求項５～７のいずれかに記載の方法；
    Figure 2023518902000035
  9. 前記標的部位がアプタマー、多特異性アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ抗体、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマー、細胞表面受容体のリガンド、またはこれらの組み合わせからなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  10. 前記カップリングが、水溶液中で、約１５℃～約３０℃の範囲の任意の温度で行われる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
  11. 約７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％（モル％）を超えるテトラジン官能性標的部位が、約１５分未満で歪んだアルケン環官能化ＰＢＡＥにカップリングする、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  12. 以下のステップを含む方法によって官能性ＰＢＡＥを合成することをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
    アミンとジアクリレートモノマーを重合して、ＰＢＡＥジアクリレート前駆体を得ること、および
    ＰＢＡＥジアクリレート骨格の－ＯＨ側鎖に、ノルボルネンカルボン酸を含む歪んだアルケン環をＤＣＣカップリングでグラフトし、ノルボルネン官能性ＰＢＡＥを得ること。
  13. 以下をさらに含む、前記先行する請求項のいずれかに記載の方法；
    チオール－マイケル付加反応を用いた、システイン含有オリゴペプチドを用いたノルボルネン官能性ＰＢＡＥを修飾すること。
  14. 前記オリゴペプチドが、Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ（配列番号４）、Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７）、Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ（配列番号１）、Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ（配列番号１０）およびＣｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ（配列番号１３）からなる群より選ばれる請求項１３に記載の方法。
  15. 前記クリックケミストリー反応が、前記テトラジン官能性標的部位と、ナノ粒子の表面にノルボルネン官能性ＰＢＡＥを含むナノ粒子とを反応させることによって行われる、前記先行する請求項のいずれかに記載の方法。
  16. 前記先行する請求項のいずれかに記載の方法によって得られる標的化ＰＢＡＥ。
  17. 請求項１６に記載の標的化ＰＢＡＥを含む、標的化ナノ粒子。
  18. 前記標的化ＰＢＡＥの標的部位が、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマー、または腫瘍細胞もしくは免疫細胞に特異的な抗原を結合する細胞表面受容体のためのリガンドである、請求項１７に記載の標的化ナノ粒子。
  19. 前記アプタマーが抗ＣＤ３アプタマーである、請求項１８に記載の標的化ナノ粒子。
  20. 標的化ポリ（β－アミノエステル）化合物（ＰＢＡＥ）を合成するためのキットであって、キットは以下のものを含む；
    ノルボルネン官能性ＰＢＡＥ、および
    請求項１～１５のいずれかに記載の方法を実施するための指示書。
  21. 以下をさらに含む、請求項２０に記載のキット、
    テトラジン官能性標的部位。
  22. 前記ノルボルネン官能性ＰＢＡＥがナノ粒子で存在する、請求項２０または２１に記載のキット。
  23. 以下を含む、標的化ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）であって、
    Figure 2023518902000036
     式中、Ｇ１およびＧ３は、各出現時に独立して、－Ｈ、Ｈ３Ｃ－（ＣＨ２）（２－９）－、およびＨＯ－（ＣＨ２）（３－１０）－からなる群より選択され、
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、原子ｖまたは原子ｗにＣ＝Ｃ二重結合を有するＣＨ２、
    Figure 2023518902000037
     、
    Figure 2023518902000038
     、配列番号４、配列番号７、配列番号１、配列番号１０、および配列番号１３からなる群から選択され、
    Ｒａは、Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）－ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（１）－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（２）－、および（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－ＣＨ２－からなる群より各出現時に独立して選択され、Ｌｉ１は、結合、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－および－（ＣＨ２）－からなる群より各出現時に独立して選択され、
    ａは３～１０の範囲の整数、ｐは１～３の範囲の整数、ｎは１～５００の範囲の整数、ｙは１～５００の範囲の整数、ｍは１～５００の範囲の整数、ｘは５～１００００の範囲の整数であり、
    １以上の出現時において、１つ以上のＴは、それぞれ独立して、歪んだアルケン環（ＳＡＲ）：
    Figure 2023518902000039
     を含む。
  24. 前記歪んだアルケン環（ＳＡＲ）が、ノルボルネン、歪んだアルケンを含む炭素含有環、架橋結合と歪んだアルケンを含む炭素含有環、シクロプロペン、シクロブテンおよびトランスシクロオクテンからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. Ｒ１および／またはＲ２が、チオエーテル－Ｓ－からなる共有結合を介してポリマー鎖に結合している、請求項２３または２４に記載のＰＢＡＥ。
  26. 標的部位（ＴＭ）を含むテトラジン官能性標的部位（ＴＦＭ）をさらに含む、請求項２３～２５のいずれかに記載の標的化ＰＢＡＥ。
  27. 前記テトラジン官能性標的部位（ＴＦＭ）が、以下を含む、請求項２６に記載のＰＢＡＥ。
    Figure 2023518902000040
     式中、Ｌｉ２は、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、
    Figure 2023518902000041
     、またはそれらの組み合わせを含み、式中、Ａにおける各原子は独立してＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＢから選ばれ、＊における各結合は独立して単結合、共鳴および／または半共鳴芳香族結合、または二重結合であり、
    また、Ｂは、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、またはそれらの組み合わせを含み、
    Ｒ３は水素または置換基であり、
    ｈは３以上であり、および
    ＴＭは標的部位である、ＰＢＡＥ。
  28. Ｒ３が、結合、－Ｈ、ー（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－ＯＣＨ３、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ３、ＣＨ３－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－ＳＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ３（アセチル、Ａｃ）、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ｔｅｒｔブチル（ＢＯＣ）、－ＮＨＡｃ、－ＮＨＢＯＣ、
    Figure 2023518902000042
     、またはそれらの組合せであり、式中、Ａにおける各原子は、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＢから選択され、＊における各結合は、独立して、単結合、共鳴芳香族結合、または二重結合である、請求項２７に記載の方法。
  29. Ｌｉ２が以下を含む、請求項５または請求項２７に記載の方法。
    Figure 2023518902000043
  30. 前記テトラジン官能性標的部位（ＴＦＭ）が、以下を含む、請求項２９に記載のＰＢＡＥ。
    Figure 2023518902000044
     式中、Ｒ３は、Ｈまたは置換基であり、Ｂは、結合、－（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、またはそれらの組み合わせを含み、ｈは３以上であり、
    ＴＭは標的部位である、ＰＢＡＥ。
  31. Ｒ３が、結合、－Ｈ、ー（ＣＨ２）－、－Ｏ－、－ＯＣＨ３、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｎ－、－Ｎ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ３、ＣＨ３－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－、－ＳＯ２ＣＨ３－、－ＳＣＨ３－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ３（アセチル、Ａｃ）、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ｔｅｒｔブチル（ＢＯＣ）、－ＮＨＡｃ、－ＮＨＢＯＣ、
    Figure 2023518902000045
     、またはそれらの組合せであり、式中、Ａにおける各原子は、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＢから選択され、＊における各結合は、独立して、単結合、共鳴芳香族結合、または二重結合である、請求項３０に記載の方法。
  32. 以下を含むことを特徴とする標的のＰＢＡＥ；
    Figure 2023518902000046
     式中、Ｇ１およびＧ３は、各出現時に独立して、－Ｈ、Ｈ３Ｃ－（ＣＨ２）（２－９）－、およびＨＯ－（ＣＨ２）（３－１０）－からなる群より選択され、
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、原子ｖまたは原子ｗにＣ＝Ｃ二重結合を有するＣＨ２、
    Figure 2023518902000047
     、
    Figure 2023518902000048
     、配列番号４、配列番号７、配列番号１、配列番号１０、および配列番号１３からなる群から選択され、
    Ｒａは、Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）－ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（１）－、ＣＯＯ（ＣＨ２）（２）－、および（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－ＣＨ２－からなる群より各出現時に独立して選択され、Ｌｉ１は、結合、－Ｏ－、－Ｏ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－および－（ＣＨ２）－からなる群より各出現時に独立して選択され、
    ａは３～１０の範囲の整数、ｐは１～３の範囲の整数、ｎは１～５００の範囲の整数、ｙは１～５００の範囲の整数、ｍは１～５００の範囲の整数、ｘは５～１００００の範囲の整数であり、
    ＴＭは、アプタマー、多特異性アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、抗体様タンパク質骨格、オリゴペプチド、スピーゲルマー、細胞表面受容体のリガンド、配列番号６、またはそれらの組み合わせからなる標的化部分である。
JP2022558496A 2020-03-27 2021-03-29 標的化ポリ（β－アミノエステル） Pending JP2023518902A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063001209P 2020-03-27 2020-03-27
US63/001,209 2020-03-27
PCT/IB2021/000181 WO2021191686A1 (en) 2020-03-27 2021-03-29 Targeted poly(beta-amino ester)s

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023518902A true JP2023518902A (ja) 2023-05-08

Family

ID=75787138

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022558496A Pending JP2023518902A (ja) 2020-03-27 2021-03-29 標的化ポリ（β－アミノエステル）

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP4126059A1 (ja)
JP (1) JP2023518902A (ja)
KR (1) KR20220161391A (ja)
CN (1) CN115884792A (ja)
AU (1) AU2021243745A1 (ja)
BR (1) BR112022019445A2 (ja)
CA (1) CA3174282A1 (ja)
MX (1) MX2022011969A (ja)
WO (1) WO2021191686A1 (ja)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201201100D0 (en) 2012-01-20 2012-03-07 Medical Res Council Polypeptides and methods
MX2022003407A (es) 2019-09-21 2022-07-04 Ixaka France Síntesis sin dmso de poli(beta-aminoéster)es modificados con oligopéptidos y su uso en sistemas de suministro de nanopartículas.

Also Published As

Publication number Publication date
CA3174282A1 (en) 2021-09-30
WO2021191686A1 (en) 2021-09-30
BR112022019445A2 (pt) 2022-12-13
CN115884792A (zh) 2023-03-31
KR20220161391A (ko) 2022-12-06
EP4126059A1 (en) 2023-02-08
AU2021243745A1 (en) 2022-11-10
MX2022011969A (es) 2023-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7054948B2 (ja) プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子
JP6994456B2 (ja) 抗メソテリン完全ヒト抗体およびメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞
CN109055380B (zh) 一种通用型car-t细胞的制备方法
Heller et al. Combining reactive triblock copolymers with functional cross-linkers: A versatile pathway to disulfide stabilized-polyplex libraries and their application as pDNA vaccines
WO2020047176A1 (en) Anti-cd3 antibody folate bioconjugates and their uses
JP2021523209A (ja) 脂質ビヒクルを使用する抗原提示細胞へのペプチドディスプレイ
Lane et al. Well-defined single polymer nanoparticles for the antibody-targeted delivery of chemotherapeutic agents
Tappertzhofen et al. Bioreducible Poly‐l‐Lysine–Poly [HPMA] Block Copolymers Obtained by RAFT‐Polymerization as Efficient Polyplex‐Transfection Reagents
CA3148792A1 (en) Aptamer-based multispecific therapeutic agents
WO2022105826A1 (zh) 靶向nkg2a的抗体及其用途
JP2023518902A (ja) 標的化ポリ（β－アミノエステル）
JP2022549290A (ja) オリゴペプチド修飾ポリ（β－アミノエステル）のＤＭＳＯを含まない合成およびナノ粒子送達システムにおけるそれらの使用
CN114641316A (zh) 用于递送活性剂的生物相容性聚合物药物载体
WO2022250811A9 (en) Nanoparticles for antigen-specific cell programming and uses thereof
CN114085376A (zh) 一种多肽及其制备方法、双特异性抗体及其应用
US20210292760A1 (en) Aptamer-Based CAR T-Cell Switch
EP3930762A1 (en) Method of producing a bioactive surface
CN112955554A (zh) 基于适体的car t细胞开关
JPWO2021092436A5 (ja)
WO2023207390A1 (zh) 一种ciita基因被敲除的工程化免疫细胞及其用途
Soldevilla et al. Aptamers as a Promising Therapeutic Tool for Cancer Immunotherapy
Olden Development of Biomaterials for Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Therapy
TW202132336A (zh) 抗cd3抗體葉酸生物共軛物及其用途
JP2024512783A (ja) 核酸の自己組織化媒介ａｄｃ薬の構築方法および適用
CN117625543A (zh) 工程化Th9细胞及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240313