JP2023518596A - スプリットインテイン及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、遺伝子治療用の大型遺伝子を再構成するための、操作されたスプリットインテイン、及び分解シグナル（不安定化ドメイン、デグロン）とのそれらの組合せの使用方法に関するものである。

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に含まれ、具体的にはスプリットインテイン及びその使用に関する。
遺伝子治療用のＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）内に封入できない遺伝子は、２つのフラグメントに分割され得ることが知られている。したがって、各フラグメントはスプリットインテインに融合され、それぞれのＡＡＶにおいて送達されなければならない。標的細胞にインテインを感染させると、所望の標的タンパク質を生成することができる（図１を参照されたい）。
それにもかかわらず、このアプローチの重要な制限の１つは、タンパク質中間体（Ｎ－エクステイン－ＩｔｎＮ及びＩｎｔＣ－Ｃ－エクステイン）、及び切り取られたスプリットインテインが蓄積されることである。この課題に対処するため、本願において、本発明者らは、或る特定のインテインを或る特定の分解シグナルと組み合わせることで、かかるタンパク質中間体の蓄積を大幅に減少させ得ることを示した。本発明は、このインテインと分解シグナルとの組合せに着目する。本発明者らはまた、ｉｎ ｖｉｖｏでのスプライシング収率の向上に寄与する特定のインテイン－デグロンの組合せも特定した。
好ましい最初の態様において、本発明は、組成物であって、
ａ．スプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、スプリットインテインＮフラグメントが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ、配列番号３０のＣａｔＮ、及び配列番号３８のＧｐ４１Ｎ、又は配列番号３９のＣｏｎＮ等のそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択される、第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．スプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、スプリットインテインＣフラグメントが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接結合された、配列番号２８のＣｆａＣ、配列番号３１のＣａｔＣ及び配列番号１０４のＧｐ４１Ｃ、又はＣｆａＣｍｕｔ（配列番号２９）若しくはＣｏｎＣ（配列番号１０５）等のそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択される、第２のポリヌクレオチドと、
を含み、
組成物の両方のポリヌクレオチドは、単一の製剤中に共に充填されてもよく、又は異なる製剤中に別々に充填されてもよく、
第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドが、両方のフラグメントが組み合わされた場合、タンパク質のＮ末端フラグメントがタンパク質のＣ末端フラグメントに連結されて、タンパク質全体が生成されるように、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをそれぞれコードし、
再構成されるタンパク質が２５ＫＤａ超であり、
組成物が、更に、
スプリットインテインＮフラグメントが更に、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結され、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、及び／又は、
スプリットインテインＣフラグメントが更に、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結され、デグロンが、インテインＣフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＣフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結される、
ことを特徴とする、組成物。
最初の態様の好ましい実施の形態において、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択される。好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される。より好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される。
最初の態様の別の好ましい実施の形態において、スプリットインテインＮフラグメントは、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結された配列番号２７のＣｆａＮであり、スプリットインテインＣフラグメントは、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結された配列番号２８のＣｆａＣであり、好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択され、より好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択され、更により好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される。
最初の態様の別の好ましい実施の形態において、スプリットインテインＮフラグメントは、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結された配列番号２７のＣｆａＮであり、スプリットインテインＣフラグメントは、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結された配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔであり、好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択され、より好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択され、更により好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される。
最初の態様の別の好ましい実施の形態において、スプリットインテインＮフラグメントは、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結された配列番号３２のＮｐｕＮであり、スプリットインテインＣフラグメントは、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結された配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ又は配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔであり、好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択され、より好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択され、更により好ましくは、スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結したデグロンは、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される。
最初の態様の別の好ましい実施の形態において、組成物は、２つのデグロンを含むことを特徴とし、特に、組成物は、
スプリットインテインＮフラグメントが更に、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結され、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
スプリットインテインＣフラグメントが更に、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結され、デグロンが、インテインＣフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＣフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結される、
ことを特徴とする。
最初の態様又はその好ましい実施の形態のいずれかの好ましい実施の形態において、組成物は、
ａ．ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２８のＣｆａＣ若しくは配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、第２のポリヌクレオチドと、
を含むことを特徴とする。
最初の態様又はその好ましい実施の形態のいずれかの好ましい実施の形態において、組成物は、
ａ．ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２８のＣｆａＣ若しくは配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、第２のポリヌクレオチドと、
を含む。
最初の態様又はその好ましい実施の形態のいずれかの別の好ましい実施の形態において、組成物は、
ａ．ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２８のＣｆａＣ若しくは配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、第２のポリヌクレオチドと、
を含む。
最初の態様又はその好ましい実施の形態のいずれかの別の好ましい実施の形態において、組成物は、
ａ．ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号３８のＧｐ４１Ｎ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号１０４のＧｐ４１Ｃ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、第２のポリヌクレオチドと、
を含む。
最初の態様又はその好ましい実施の形態のいずれかの別の好ましい実施の形態において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドがそれぞれのタンパク質複合体に翻訳され、本発明の方法に従って組み合わされる場合、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントがＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントに連結され、そのようにしてＡＢＣＡ４タンパク質全体が生成されるように、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをそれぞれコードする。
第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドがそれぞれＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをコードする、上記に示した実施の形態に関連して、本発明は以下の代替案を提供する。
第１の代替案：
ａ．第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
ｂ．第２のポリヌクレオチドが、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳｔ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
上記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位、１位～１１３９位、１位～１１７６位、又は１位～１１７８位をコードし、第２のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位、１１４０位～２２７３位、１１７７位～２２７３位、又は１１７９位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１５０位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１３９位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１４０位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７６位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１７７位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７８位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１７９位～２２７３位をコードする。
第２の代替案：
ａ．第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
ｂ．第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
上記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位、１位～１１３９位、１位～１１７６位、又は１位～１１７８位をコードし、第２のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位、１１４０位～２２７３位、１１７７位～２２７３位、又は１１７９位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１５０位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１３９位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１４０位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７６位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１７７位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７８位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１７９位～２２７３位をコードする。
第３の代替案：
ａ．第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
ｂ．第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
上記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位、１位～１１３９位、１位～１１７６位、又は１位～１１７８位をコードし、第２のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位、１１４０位～２２７３位、１１７７位～２２７３位、又は１１７９位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１５０位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１３９位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１４０位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７６位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１７７位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７８位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１７９位～２２７３位をコードする。
第４の代替案：
ａ．第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
ｂ．第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、任意に更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２８のＣｆａＣ、配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
上記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位をコードし、第２のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１５０位～２２７３位をコードする。
第５の代替案：
ａ．第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号３８のＧｐ４１Ｎ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
ｂ．第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号１０４のＧｐ４１Ｃ、又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
上記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１０９５位、又は１位～１１８５位をコードし、第２のポリヌクレオチドがＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１０９６位～２２７３位、又は１１８６位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１０９５位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドは１０９６位～２２７３位をコードし、上記第１のポリヌクレオチドが１位～１１８５位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１８６位～２２７３位をコードする。
最初の態様又はその好ましい実施の形態若しくは代替案のいずれかの更なる好ましい実施の形態において、両方のポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞における上記ポリヌクレオチドの増殖又は挿入を可能にするベクター内に含まれる。好ましくは、上記ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、より好ましくは、ベクターは血清型１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のＡＡＶである。
最初の態様又はその好ましい実施の形態若しくは代替案のいずれかの別の更なる好ましい実施の形態において、本明細書に記載される組成物は、特に表１で特定される疾患のいずれかに対する治療に使用されるものである。
本発明の更なる態様は、細胞内で目的の遺伝子を発現させるｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの方法であって、以下：
（ｉ）細胞を、
先の態様、実施形態又は代替案のいずれかに定義される第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに接触させることと、
なお、好ましくは、両方のポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内に含まれ、上記ポリヌクレオチドの少なくとも一方が、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結されたスプリットインテインフラグメントをコードする；
（ｉｉ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が産生されるように、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを発現させることと、
（ｉｉｉ）スプリットインテインＮフラグメントがスプリットインテインＣフラグメントに結合してインテイン中間体を形成し、インテイン中間体が反応して、目的の第１のポリペプチドのＣ末端を目的の第２のポリペプチドのＮ末端に共有結合するように、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させることと、
を含む、方法に言及する。
インテイン、及びインテインとデグロンを組み合わせて使用して遺伝子治療用大型タンパク質を再構成する戦略の全体図である。上図：（１）目的の遺伝子が、賢明に選択された位置で組換えにより分割され、タンパク質発現時に、タンパク質のＮ末端フラグメントがそのＣ末端にＩｎｔＮを融合して発現され、タンパク質のＣ末端フラグメントがそのＮ末端にＩｎｔＣを融合して発現されるように、結果として生じた５’末端はＩｎｔＮに、３’末端はＩｎｔＣに組換え融合される（２）。各々のコンストラクトは、別々のＡＡＶに封入されている。これらの２つのＡＡＶを患者に投与することで、或る特定の細胞に同時形質導入される（３）。ＡＡＶを介して送達されたＤＮＡは、同時形質導入によりＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳され、タンパク質レベルでインテインがタンパク質トランススプライシング反応を行って所望のスプライシング産物を再構成する（４）。下図：インテインは分解シグナルと組み合わされて出発物質の蓄積を防ぎ、切り取られたインテインを排除する。デグロンは、Ｎ－インテインのＣ末端及び／又はＣ－インテインのＮ末端に融合される。 上図：ＥＧＦＰＮ－ＩｎｔＮ－Ｈ６とＩｎｔＣ－ＥＧＦＰＣ－Ｈ６とのコンストラクト間の反応スキームであり、これにより、Ｈ６タグを持つ全長ＥＧＦＰの形成、及びインテインの切除がもたらされる。下図：Ｎ末端、Ｃ末端のフラグメントでトランスフェクトした細胞、又はＣｆａ若しくはＮｐｕインテインのいずれかを用いて両フラグメントで同時トランスフェクトした細胞の蛍光顕微鏡画像である。 ＥＧＦＰ－インテインポリヌクレオチドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解液のウエスタンブロット分析を示す図である。左図：ＥＧＦＰ－インテインプラスミドでトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット分析。細胞を全長ＥＧＦＰプラスミド、若しくはＥＧＦＰＮ－ＩｎｔＮ、ＩｎｔＣ－ＥＧＦＰＣプラスミドのいずれかでトランスフェクトするか、又はその両方で同時トランスフェクトした。Ｃｆａ又はＮｐｕインテインを含むプラスミドを試験した。右図：Ｎｐｕに対するスプライシング産物の増加倍率の定量。産物の収率を、β－チューブリンをローディング対照として用いて、デンシトメトリーにより決定した。グラフは、細胞を全長ＥＧＦＰプラスミド（ＥＧＦＰ）でトランスフェクトするか、ＥＧＦＰＮ－ＣｆａＮとＣｆａＣ－ＥＧＦＰＣ（Ｃｆａ）、又はＥＧＦＰＮ－ＮｐｕＮとＮｐｕＣ－ＥＧＦＰＣ（Ｎｐｕ）で同時トランスフェクトした場合のいずれかの、Ｎｐｕに対するＥＧＦＰ産物の増加倍率を表す。 トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、フローサイトメトリーで分析した。左図：異なるコンストラクト又はコンストラクトの組合せでトランスフェクトした細胞のフローサイトメトリーデータ。黒色曲線は、ＥＧＦＰのＮ末端フラグメント又はＣ末端フラグメントのいずれかでトランスフェクトした対照に対応する。青色は全長ＥＧＦＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞の４つの複製であり、緑色曲線はＥＧＦＰＮ－ＣｆａＮとＣｆａＣ－ＥＧＦＰＣ（ＥＧＦＰは７１位で分割）で同時トランスフェクトした細胞に対応し、黄色曲線はＥＧＦＰＮ－ＮｐｕＮとＮｐｕＣ－ＥＧＦＰＣ（ＥＧＦＰは７１位で分割）で同時トランスフェクトした細胞に対応する。中央図：各試料セットで得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットであり、Ｃｆａインテインの使用により、全長ＥＧＦＰに対応するシグナルの９０％超を回復できることを示す。右図：各試料における陽性細胞の数を表すプロットであり、トランスフェクションの効率は３セットとも同程度であった。 ＡＢＣＡ４の１１５０位でのスプライシング収率をＣｆａとＮｐｕで比較した図である。細胞をＡＢＣＡ４Ｎ１１５０－ＩｎｔＮとＩｎｔＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１５０で同時トランスフェクトし、溶解してＷＢで分析した。ＡＢＣＡ４Ｎ１１５０は、残基１から残基１１４９までのＡＢＣＡ４のＮ末端フラグメントに相当し、ＡＢＣＡ４Ｃ１１５０は、残基１１５０から残基２２７３までのＡＢＣＡ４のＣ末端のフラグメントに相当する。Ｃｆａ又はＮｐｕのいずれかを持つコンストラクトを試験した。左図は、抗ＡＢＣＡ４ ｍＡｂを用いたブロットを示す。右図は、ウエスタンブロットのデンシトメトリー定量に対応する。 ＡＢＣＡ４の１１４０位でのスプライシング収率をＣｆａとＮｐｕで比較した図である。細胞をＡＢＣＡ４Ｎ１１４０－ＩｎｔＮ及びＩｎｔＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１４０で同時トランスフェクトし、溶解してＷＢで分析した。ＡＢＣＡ４Ｎ１１４０は、残基１から残基１１３９までのＡＢＣＡ４のＮ末端のフラグメントに相当し、ＡＢＣＡ４Ｃ１１４０は、残基１１４０から残基２２７３までのＡＢＣＡ４のＣ末端のフラグメントに相当する。Ｃｆａ又はＮｐｕのいずれかを持つコンストラクトを試験した。左図は抗ＦＬＡＧタグで、中央のパネルは抗ＡＢＣＡ４ ｍＡｂでブロッティングした結果をそれぞれ示す。右図は、ウエスタンブロットのデンシトメトリー定量に対応する。 ＡＢＣＡ４の１１４０位、１１５０位、１１７９位、及び１１８８位でのスプライシング収率の比較を示す図である。細胞を対応するＡＢＣＡ４Ｎ－ＣｆａＮ及びＣｆａＣ（又はＣｆａＣｍｕｔ）－ＡＢＣＡ４Ｃのコンストラクトで同時トランスフェクトし、溶解してＷＢで分析した。グラフは、再構成されたＡＢＣＡ４タンパク質のＷＢによるデンシトメトリー定量、及び全長タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクションして得られたＡＢＣＡ４レベルの比較に対応する。 デグロンを含むＰＴＳの反応スキームを示す図である。目的のタンパク質のＮ末端フラグメントは、ＩｎｔＮ、リンカー（この場合はＨｉｓ６タグ）、及びデグロンに融合される。タンパク質のＣ末端はＩｎｔＣに融合され、そのＮ末端はデグロンに連結される。スプライシング反応により、デグロンが融合していない所望の全長タンパク質と、各々が分解シグナルを担持する切断されたインテインとの形成が起こる。 レポータータンパク質ＥＧＦＰの再構成のためのインテインとデグロンとの組合せを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を指定のコンストラクトでトランスフェクトし、溶解して抗Ｈｉｓ６タグｍＡｂを用いたウエスタンブロットで分析した。結果は、ＣｆａＮ又はＣ－インテインと分解シグナルとを組み合わせたコンストラクトの使用が、インテイン（ＣｆａＮ－６Ｈ）と同様に出発物質（ＥＧＦＰ－ＣｆａＮ－６Ｈ）から生じるシグナルを全て消失させたことを示す。 大型タンパク質ＡＢＣＡ４を再構成するためのインテインとデグロンとの組合せを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞をＡＢＣＡ４Ｎ１１５０－ＣｆａＮとＣｆａＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１５０で、デグロンあり及びなしにてトランスフェクトし、溶解して抗ＦＬＡＧタグｍＡｂを用いてウエスタンブロットで分析した。２つの異なる時間点（２４時間及び４８時間）で細胞を採取した。上図：ウエスタンブロット分析。下図：ウエスタンブロットのデンシトメトリー定量。結果は、ＣｆａＮ又はＣ－インテインと分解シグナルとを組み合わせたコンストラクトの使用が、出発物質（ＡＢＣＡ４－ＣｆａＮ及びＣｆａＣ－ＡＢＣＡ４）から生じるシグナルを消失させたことを示す。興味深いことに、結果は、Ｃｆａインテインと分解シグナルとの組合せが、再構成された全長ＡＢＣＡ４の収量の増加をもたらすことも実証する。 インテイン－デグロンの組合せの効果は、プロテオソームによって媒介される。細胞をＡＢＣＡ４Ｎ１１５０－ＣｆａＮとＣｆａＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１５０のコンストラクトでデグロンあり及びなしにて同時トランスフェクトし、２４時間後にプロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下又は不在下で指定の時間（３０分、３時間、６時間及び２４時間）インキュベートした。指定時間後に細胞を溶解し、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂを用いたウエスタンブロットで分析した。プロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２の添加により、フラグメントに対応するバンドの強度が増し、分解が阻害されたことを示唆した。 異なるインテイン、又はインテインとデグロンを組み合わせて用いた再構成収率の比較を示す図である。左図：Ｃｆａ、Ｃｆａ－ＳｏｐＥ、又はＮｐｕを用いた、１１５０位で分割したＡＢＣＡ４のＰＴＳを介する再構成のウエスタンブロット。細胞を、ＡＢＣＡ４Ｎ１１５０－ＣｆａＮとＣｆａＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１５０（Ｃｆａ）、ＡＢＣＡ４Ｎ１１５０－ＣｆａＮ－ＳｏｐＥとＳｏｐＥ－ＣｆａＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１５０（Ｃｆａ－ＳｏｐＥ）、又はＡＢＣＡ４Ｎ１１５０－ＮｐｕＮとＮｐｕＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１５０（Ｎｐｕ）で同時トランスフェクトした。４８時間後、細胞を収集し、溶解してＷＢで分析した。Ｃｆａコンストラクトは二連で、ＣｆａＳｏｐＥとＮｐｕは三連で分析した。右図：インテインとデグロンとの各組合せで得られた産物、及び残留している出発物質のデンシトメトリー定量。結果は、Ｃｆａとデグロン（ＳｏｐＥ）を併用することで、どれくらい産物の再構成が高くなるかを示す。興味深いことに、データは、Ｎｐｕによる再構成が最も低く、しかも未反応の出発物質が最も多く残っていることを示す。 分解シグナルあり及びなしにて、ＣｆａＣｍｕｔを用いた１１４０位でのＡＢＣＡ４の再構成を示す図である。左図：細胞をＡＢＣＡ４Ｎ１１４０－ＣｆａＮとＣｆａＣｍｕｔ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１４０、ＡＢＣＡ４Ｎ１１４０－ＣｆａＮ－ＳｏｐＥとＳｏｐＥ－ＣｆａＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１４０（Ｃｆａ－ＳｏｐＥ）、又は全長のＡＢＣＡ４（ＡＢＣＡ）で同時トランスフェクトした。４８時間後に細胞を収集し、溶解して抗ＦＬＡＧタグｍＡｂを用いてＷＢで分析した。右図：全長ＡＢＣＡ４によるトランスフェクションと比較した、ＡＢＣＡ４再構成のレベルのデンシメトリー定量。 ＤＤ１デグロンを用いた、インテインとデグロンとの組合せによるレポータータンパク質ＥＧＦＰの再構成を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を指定のコンストラクトでトランスフェクトし、溶解して抗Ｈｉｓ６タグｍＡｂを用いたウエスタンブロットで分析した。ＣｆａインテインとＤＤ１デグロンとの組合せにより、不要な出発物質及び切り取られたインテインが排除される。 質量分析を示す図である。細胞をＡＢＣＡ４Ｎ１１５０－ＣｆａＮ－ＳｏｐＥ及びＳｏｐＥ－ＣｆａＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ１１５０でトランスフェクトし、４８時間後に収集し溶解した。細胞溶解物をＳＤＳＰＡＧＥゲルで泳動し、３００ＫＤａ付近のバンドを切り出し、タンパク質分解し（材料及び方法を参照されたい）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。結果を図に要約する。ＭＳＭＳによって同定されたペプチドで、偽陽性率（ＦＤＲ）が１％未満のものを緑色で示す。ＦＤＲ５％未満で同定されたペプチドを黄色で示す。赤色の下線は、分割部位の配列を示す。 オルソゴナルコンセンサスインテインを用いた３ピースライゲーションを示す図である。 オルソゴナルコンセンサスインテインを用いた３ピースライゲーションを示す図である。図１６に示すＮ、Ｍ、及びＣのコンストラクトを、ＨＥＫ２９３にいずれか単独でトランスフェクトするか、対で同時トランスフェクトするか、又は３つのフラグメントを共に同時トランスフェクトした。細胞を溶解しＮ末端、Ｍ末端、Ｃ末端フラグメントのＣ末端に存在する３ＦＴタグに対する抗体（左図）又はＰＯＩＮフラグメントに対する抗体（右図）を用いてウエスタンブロットにより分析した。 Ａ）本発明のスプリットインテインＮフラグメントの発現レベルに対するデグロンの効果の分析を示す図である。デグロンを含むコンストラクト及び含まないコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ウエスタンブロットにより発現レベルを分析した。Ｎ－インテインフラグメントにデグロンを付加すると、発現タンパク質の検出レベルの低下がもたらされる。Ｂ）本発明のスプリットインテインＣフラグメントの発現レベルに対するデグロンの効果の分析を示す図である。デグロンを含むコンストラクト及び含まないコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ウエスタンブロットにより発現レベルを分析した。Ｃ－インテインフラグメントにデグロンを付加すると、発現タンパク質の検出レベルの低下がもたらされる。Ｃ）Ｎ末端若しくはＣ末端フラグメントのいずれかでトランスフェクトした細胞、又は両方のフラグメントで同時トランスフェクトした細胞のウエスタンブロットによる分析を示す図である。デグロンを含まない（デグロンなし）又は代表的なデグロン（ＳｏｐＥ、Ｌ２、及びＬ９）を含むコンストラクトの結果を示す。右側の図は、指定される各々のデグロンにより得られたＰＴＳ産物の量を、デグロンなしで得られたものと比較して定量したものを提供する。幾つかのデグロンは、デグロンなしのコンストラクトよりも高い収率を提供することがわかる。興味深いことに、全てのデグロンが機能し、全てのデグロンで、デグロンなしで得られた産物の少なくとも２５％を再構成することができる。幾つかのデグロンは、デグロンなしで得られたレベルの５０％超の再構成を可能とし、最終的には１００％の（又はそれよりも高い）再構成をもたらすデグロンもある。 異なるデグロンによるＰＴＳ反応を、インテインを検出できるように、異なるタイプのゲルを用いてＷＢで分析した図である。見てわかるように、幾つかのデグロンは他のデグロン（例えばＳｐｏＥ及びＰＥＳＴ）に比べて切り取られたインテインの量を減らし、一方、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ２、Ｍ４又はＤＤ３のようにその他のものは完全にインテインバンドを排除する。 異なるデグロンの組合せを用いる及びデグロンを用いない、分割位置１１５０でのＰＴＳ反応のウエスタンブロットによる分析を示す図である。この場合、Ｎフラグメントのデグロンは固定で（左図Ｌ９及び右図Ｌ２にＮと表示）、Ｃフラグメントには異なるデグロンを使用した（Ｌ２、Ｌ９ Ｍ４、Ｍ２、Ｖ１２、ＤＤ３及びＤＤ１にＣと表示）。 Ｎ末端及びＣ末端インテインＡＢＣＡ４フラグメントにおいてデグロンＬ９を用いる又は用いない部位１１４０及び部位１１ １１７９におけるＰＴＳ反応のＷＢ及び定量を示す図である。 ｇｐ４１インテインを用いたＰＴＳ反応のウエスタンブロットによる分析を示す図である。左図：１１５０位においてＣｆａインテインを用い、及び１１８５位においてｇｐ４１インテインを用いて分割されたＡＢＣＡ４のＰＴＳによる再構成のウエスタンブロット。４８時間後、細胞を収集し、溶解してＷＢで分析した。右図：各インテインにより得られた産物、及び全長タンパク質のデンシトメトリー定量。 ｉｎ ｖｉｖｏ網膜ＥＧＦＰを示す図である：（Ａ）全長ＥＧＦＰをコードするＡＡＶ８、又は本発明のＮ末端フラグメント（Ｎ、ＥＧＦＰＮ－ＣｆａＮ）及びＣ末端フラグメント（Ｃ、ＣｆａＣ－ＥＧＦＰＣ）をコードする２つのＡＡＶを注射したマウスの眼底自発蛍光（ＦＡＦ）。（Ｂ）生理食塩水又は処理網膜の免疫組織化学分析（ＩＨＣ）。結果は、光受容体においてネイティブＥＧＦＰ蛍光を示し、タンパク質スプライシングを介したＥＧＦＰ再構成を示す。全てのコンストラクトはＧＲＫ１プロモーターの制御下にあり、２つの異なる用量のＮ＋Ｃコンストラクトを注入した。ＢＳＳ（バランス滅菌生理食塩水）。
本発明は、遺伝子治療用の大型タンパク質を再構成するための、操作された又は天然由来のスプリットインテイン、及び分解シグナル（不安定化ドメイン、デグロン）とのそれらの組合せの使用方法に関するものである。
本発明に記載の方法により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏで大型タンパク質を再構成することができる。ｉｎ ｖｉｖｏで使用すると、限定されるものではないが、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、筋肉、肝臓、眼球、膵臓、網膜、腎臓、内耳、心臓、肺、血液、脾臓、皮膚を含む任意の所望の組織で所望の大型標的タンパク質を再構成することが可能になる。
本明細書において使用される場合、「インテイン」という用語は、前駆体タンパク質からインテイン配列を切り取って、その近傍配列（Ｎ－エクステイン及びＣ－エクステイン）をペプチド結合でつなぐタンパク質スプライシング反応を触媒することができる天然由来の又は人工的に構築されたポリペプチド配列を意味する。インテインは、典型的には、１５０～５５０アミノ酸の大きさで、ホーミングエンドヌクレアーゼドメインを含むこともある。既知のインテインの一覧はhttp://www.inteins.com及びhttps://inteins.biocenter.helsinki.fi/index.phpで公開されている。
本明細書において使用される場合、「スプリットインテイン」という用語は、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸配列がペプチド結合を介して直接連結されていない任意のインテインであって、Ｎ末端及びＣ末端の配列が、トランススプライシング反応に機能的なインテインに非共有結合で再会合、又は再構成することができる別々のフラグメントとなるようなものを指す。
「ペプチド結合」という用語は、カルボキシ成分と呼ばれる或る分子のカルボキシ部分が、アミノ成分と呼ばれる別の分子のアミノ部分と反応し、分子を放出させる場合に２つの分子間に形成される共有結合性の化学結合－ＣＯ－ＮＨ－を指す。例えば、タンパク質原性Ｌ－アミノ酸は、水分子の放出に付随してペプチド結合を形成することができる。したがって、タンパク質及びペプチドは、アミノ酸残基がペプチド結合でつながった鎖と見なすことができる。ペプチド結合は、「アミド結合」（"amide bond" or "amide linkage"）である。
本明細書においては、「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」という用語は、アミノ酸のポリマーを指すために区別なく使用される。
「アミノ酸」という用語は、天然由来のアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然由来のアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類縁体及びアミノ酸模倣物を指す。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸（立体異性体）の両方を含む。
「天然アミノ酸」又は「天然由来のアミノ酸」という用語は、２０種の天然由来のアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホトレオニンを含むｉｎ ｖｉｖｏで翻訳後修飾されることの多いアミノ酸、並びに限定されるものではないが、２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン及びオルニチンを含む他の珍しいアミノ酸を含む。
本明細書において使用される場合、「非天然アミノ酸」又は「合成アミノ酸」という用語は、「α」（アルファ）位がアミン基で置換された、構造的に天然アミノ酸に関連するカルボン酸、又はその誘導体を指す。改変アミノ酸又は一般的でないアミノ酸の例示的な非限定的な実例としては、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、２，４－ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アリオヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ｐ－ハロフェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－アジドフェニルアラニン、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン等が挙げられる。このグループは、「天然アミノ酸」のＤ－異性体も含む。
本明細書において使用される場合、「スプリットインテインＮフラグメント」又は「Ｎ末端スプリットインテイン」又は「Ｎ末端インテインフラグメント」又は「Ｎ末端インテイン配列」（「ＩｎｔＮ」と略記）という用語は、トランススプライシング反応に機能的なＮ末端アミノ酸配列を含む任意のインテイン配列を指し、すなわち、機能的なスプリットインテインＣフラグメントと会合して、宿主タンパク質から自身を切り離すことができる完全なインテインを形成することができるか、エクステイン若しくは近傍配列のペプチド結合によるライゲーションを触媒することができるか、又はスプリットインテインＣフラグメントと会合すると「Ｎ末端切断」を触媒し、すなわち、エクステインとスプリットインテインＮフラグメントのＮ末端との間のペプチド結合を求核攻撃し、上記ペプチド結合の破壊をもたらす。このように、ＩｎｔＮはトランススプライシングが起こる際にスプライシングされる配列も含む。ＩｎｔＮは、天然由来のインテイン配列のＮ末端部分を改変した配列を含み得る。例えば、ＩｎｔＮは、追加のアミノ酸残基及び／又は突然変異した残基を含むことがトランススプライシングにおいてＩｎｔＮを非機能的にすることがない限り、かかる追加の残基及び／又は突然変異した残基を含むことができる。好ましくは、追加の残基及び／又は突然変異した残基を含めることで、ＩｎｔＮのトランススプライシング活性が改善又は増強される。
本明細書において使用される場合、「デグロン」という用語は、別のポリペプチドに組換え融合された場合、プロテオソーム分解経路又は任意の他の細胞分解機構を介してそのタンパク質分解を促進する天然由来の又は人工的に構築されたポリペプチド配列を意味する。
本明細書において区別なく使用されるように、「スプリットインテインＣフラグメント」、「Ｃ末端スプリットインテイン」、「Ｃ末端インテインフラグメント」及び「Ｃ末端インテイン配列」（「ＩｎｔＣ」と略記）という用語は、トランススプライシング反応に機能的なＣ末端アミノ酸配列を含む任意のインテイン配列を指し、すなわち、会合の際に、機能的なスプリットインテインのＮフラグメントと会合して、宿主タンパク質から自身を切り離すことができる完全なインテインを形成することができるか、エクステイン若しくは近傍配列のペプチド結合によるライゲーションを触媒することができるか、又はスプリットＮ－インテインと会合すると、「Ｃ末端切断」を触媒し、すなわち、エクステインとスプリットインテインＣフラグメントのＣ末端との間のペプチド結合を求核攻撃し、上記ペプチド結合の破壊をもたらす。このように、ＩｎｔＣはトランススプライシングが起こる際にスプライシングされる配列も含む。ＩｎｔＣは、天然由来のインテイン配列のＣ末端部分を改変した配列を含み得る。例えば、ＩｎｔＣは、追加のアミノ酸残基及び／又は突然変異した残基を含むことがトランススプライシングにおいてＩｎｔＣを非機能的にすることがない限り、かかる追加の残基及び／又は突然変異した残基を含むことができる。好ましくは、追加の残基及び／又は突然変異した残基を含めることで、ＩｎｔＣのトランススプライシング活性が改善又は増強される。
本明細書においては、本発明の文脈において、「再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメント」とは、タンパク質のＮ末端フラグメント、より詳細には、２５ＫＤａ超、５０ＫＤａ超又は１００ＫＤａ超のタンパク質のフラグメントを指すことに留意されたい。本明細書において使用される場合、「タンパク質のＮ末端フラグメント」という用語は、したがって、タンパク質のＮ末端（成熟型又は未熟型）を含む長さが可変のフラグメントを指す。特定の実施形態において、Ｎ末端フラグメントは、タンパク質全体の長さの１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満を含むフラグメントである。
本明細書においては、本発明の文脈において、「再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメント」とは、タンパク質のＣ末端フラグメント、より詳細には、２５ＫＤａ超、５０ＫＤａ超又は１００ＫＤａ超のタンパク質のフラグメントを指すことに留意されたい。したがって、本明細書において使用される場合、「タンパク質のＣ末端フラグメント」という用語は、タンパク質のＣ末端を含む長さが可変のフラグメントを指す。特定の実施形態において、Ｃ末端フラグメントは、タンパク質全体の長さの１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満を含むフラグメントである。
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合（又はその合成類縁体上の関連構造変異体）を介して連結した複数のヌクレオチド単位（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの関連構造変異体若しくは合成類縁体）で構成されるポリマーを指す。ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖又は一本鎖のゲノム及びｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成及び遺伝子操作されたポリヌクレオチド、並びにセンス及びアンチセンスポリヌクレオチドの双方（ただし、本発明ではセンス鎖のみが開示されている）を含む。これは、一本鎖及び二本鎖の分子、すなわちＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、及びＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。
スプリットインテインＮフラグメント
本発明は、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントにペプチド結合を介して直接連結されたスプリットインテインＮ末端フラグメントに言及する。コンストラクトはＮ末端からＣ末端までの一般的な構造を持つことになる：
（再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメント）－インテインＮ
再構成されるタンパク質は、その再構成がプラスの治療効果をもたらす可能性のある任意の大きな遺伝子であり得る。本発明で再構成され得るタンパク質の非限定的な例は、ＡＢＣＡ４タンパク質、及び以下の表１に列挙される遺伝子によりコードされるタンパク質である。これらのタンパク質を再構成する目的は、かかる遺伝子を正しいバージョンで提供することによって、それらのコーディング遺伝子内の突然変異に関連する疾患を治療することである。さらに、再構成されるタンパク質は、疾患を治療するためのタンパク質又は酵素である可能性もあるが、必ずしも突然変異したものと置き換わるとは限らない。例えば、再構成されるタンパク質は、遺伝子、塩基又はプライム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムであり得る。
Figure 2023518596000001
Figure 2023518596000002
Figure 2023518596000003
Figure 2023518596000004
Figure 2023518596000005
Figure 2023518596000006
したがって、本発明の第１の態様は、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結されたスプリットインテインＮフラグメントであって、上記に反映されるように、ＩｎｔＮが直接又はリンカーを用いてＮ末端フラグメントのＣ末端に連結されているもの（以下「本発明のスプリットインテインＮフラグメント」と呼ぶ）に言及する。
本発明の第１の態様の好ましい実施形態は、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結されたスプリットインテインＮフラグメント（以下、「本発明のスプリットインテインＮフラグメントデグロン」と呼ぶ）に言及し、デグロンは、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介して、インテインＮフラグメントに連結されており、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結されている。
したがって、本発明のスプリットインテインＮフラグメントデグロンのコンストラクトのＮ末端からＣ末端までの構造は、次の通りとなる：
（再構成されるタンパク質のＮ末端部分）－（インテイン－Ｎフラグメント）－（デグロン）。
ＩｎｔＮとデグロンとの間にリンカーを導入した場合であれば、本発明のスプリットインテインＮフラグメントデグロンのＮ末端からＣ末端までのコンストラクトの構造は、以下の通りとなる：
（再構成されるタンパク質のＮ末端部分）－（インテイン－Ｎフラグメント）－（リンカー）－（デグロン）。
好ましくは、本発明のスプリットインテインＮフラグメント又は本発明のスプリットインテインＮフラグメントデグロンのいずれかのインテインＮは、以下の表２に列挙されるいずれかから選択することができる。
Figure 2023518596000007
ここで、好ましくは、インテインＮは、配列番号２７のＣｆａＮインテイン若しくは配列番号３９のＣｏｎＮ等のその任意の変異体；又は配列番号３０のＣａｔＮインテイン若しくはその任意の変異体；又は配列番号３２のＮｐｕＮインテイン若しくはその任意の変異体；又は配列番号３８のＧｐ４１Ｎインテイン若しくはその任意の変異体である。
本明細書において使用される場合、「変異体」という用語は、特定のポリペプチド配列に実質的に類似しているポリペプチド分子を指す。本発明では、本発明者らは、Ｃｆａ、Ｎｐｕ、Ｃａｔ又はＧｐ４１のインテインのＮ－インテイン又はＣ－インテインの変異体を、それらのポリペプチド配列のいずれかと実質的に類似するポリペプチドと呼び、例えば、Ｃｏｎインテインは、Ｃｆａの変異体として本明細書においては理解される。したがって、変異体は、それが由来するポリペプチドと構造及び生物学的活性において類似している可能性がある。したがって、変異体は、ポリペプチド配列の突然変異体を指す場合もある。「突然変異体」という用語は、それが由来するポリペプチド分子と比較して、配列中の１個以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、又は別様に化学的に修飾されたポリペプチド分子を指す用語である。突然変異体は、それが由来するポリペプチド分子と実質的に同じ特性を保持してもよく、又は特許請求の範囲に記載の配列の生物学的活性を欠くものであってもよい。特定の実施形態において、インテイン変異体は、非触媒Ｃｙｓ残基、すなわちＮ－インテインの第１残基がセリン、又はアラニンに突然変異した突然変異体を含む。
好ましくは、本発明で通常理解される「変異体」という用語は、曖昧さ（promiscuity）が増加した変異体を指し、ここで曖昧さとは、インテインが分割部位にすぐ隣の残基の同一性に依存せずにタンパク質トランススプライシング（ＰＴＳ）反応を行う能力として理解される。より具体的には、インテインの曖昧さとは、分割部位のすぐ隣のアミノ酸、つまり目的のタンパク質にインテインが挿入される部位の同一性に依存せずにＰＴＳ反応を行う能力を指す。以下に、分割部位の模式図を示す：
－３－２－１ ＋１＋２＋３
Ｘ－Ｘ－Ｘ－インテインＮ インテインＣ－Ｘ－Ｘ－Ｘ
典型的には、インテインはその位置において或る特定のアミノ酸を強く選好する。例えば、Ｃａｔインテイン（配列番号３０）は、＋１位にＣｙｓ、－１位にＧｌｕを選好する（Stevens, A. J., Sekar, G., Gramespacher, J. A., Cowburn, D., & Muir, T. W. (2018)). An Atypical Mechanism of Split Intein Molecular Recognition and Folding. Journal of the American Chemical Society, 140(37), 11791-11799. http://doi.org/10.1021/jacs.8b07334）。より曖昧な変異体は、かかる好ましい残基がない場合でも、タンパク質トランススプライシング反応を良好な収率で行うことができるものとなる。
特定の実施形態において、インテイン変異体は、インテインの触媒残基及び第２シェルの促進剤残基（second shell accelerator residues）が維持され、非触媒残基又は第２シェル外の残基のみが突然変異している突然変異体を含む。第２シェルの促進剤残基は、インテインの活性部位に隣接する残基であり、インテインのスプライシング活性を調整するのに重要な役割を担う。例えば、Ｃｆａインテイン、及びＤｎａＥファミリーのインテインの触媒残基及び促進剤残基はよく知られており、当該技術分野で説明されている（Stevens, A. J., Brown, Z. Z., Shah, N. H., Sekar, G., Cowburn, D., & Muir, T. W. (2016). Journal of the American Chemical Society. http://doi.org/10.1021/jacs.5b13528）。同様に、ＤｎａＥ、ＧｙｒＡ、ＧｙｒＢ、ＤｎａＢ、ＴｅｒＬ、ｇｐ４１、ＩＭＰＤＨを含む他の複数のインテインファミリーの触媒残基が研究され特徴づけられている（Shah, N. H., & Muir, T. W. (2014). Inteins: Nature's Gift to Protein Chemists. Chemical Science (Royal Society of Chemistry :2010), 5(1), 446-461. http://doi.org/10.1039/C3SC52951G）。第２シェルの促進剤残基を同定する方法論も記載されており（Stevens et al. 2016 Journal of the American Chemical Society. http://doi.org/10.1021/jacs.5b13528）、本発明で使用するのに適した特性を有するインテイン変異体（Ｎ－インテイン及びＣ－インテインの両方）を作製するために使用することができる。
特定の実施形態において、インテイン変異体は、インテインの触媒残基が維持されている突然変異体を含み、変異体は、速いスプライシング速度（半減期５分未満）、カオトロピック剤存在下又は高温での高い活性を含む、ＣｆａＮ、ＮｐｕＮ、ＣａｔＮ、又はｇｐ４１Ｎインテインの主要機能的特徴を保持する。より詳細な実施形態において、ＣｆａＮ、ＣａｔＮ、ＮｐｕＮ又はｇｐ４１Ｎインテインの変異体は、これらの配列のいずれかの機能的に等価な変異体である。
本明細書において使用される場合、「機能的に等価な変異体」という用語は、機能が実質的に維持又は改善される場合であれば、修飾、挿入及び／又は欠失、又は１個以上のアミノ酸によって配列から得られる全てのそれらのタンパク質を意味すると理解され、特にスプリットインテインのＮフラグメントの機能的に等価な変異体の場合は、その活性を維持することを指す。本明細書において使用される場合、「活性」という用語は、スプリットインテインＣフラグメントに結合することにより、スプリットインテインＮフラグメントがタンパク質トランススプライシング反応を行う能力を指す。
ＣｆａＮ、ＮｐｕＮ、ＣａｔＮ、又はｇｐ４１Ｎインテインの機能的に等価な変異体の例を以下に示す。
ＣｆａＮの機能的に等価な変異体は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる。
Ｃｙｓ２８及び／又はＣｙｓ５９がＳｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｌａに突然変異している、ＣｆａＮ配列（配列番号２７）。
Ｍｅｔ１のＮ末端に追加のアミノ酸、例えば、リンカー、デグロン、検出用タグ等が含まれる、ＣｆａＮ配列（配列番号２７）。
その残基のいずれかが、維持されなければならない以下の残基：Ｃｙｓ１、Ｌｙｓ７０、Ｈｉｓ７２、Ｍｅｔ７５、Ｍｅｔ８１を除いて、同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異している、ＣｆａＮ配列（配列番号２７）。
その残基のいずれかが、維持されなければならない以下の残基：Ｃｙｓ１、Ａｓｐ５、Ｐｈｅ１５、Ｇｌｕ２４、Ｔｈｒ３２、Ｌｙｓ３５、Ｐｈｅ３８、Ｖａｌ３９、Ｉｌｅ４４、Ａｓｎ４９、Ｉｌｅ６５、Ｔｈｒ６９、Ｌｙｓ７０、Ｈｉｓ７２、Ｍｅｔ７５、Ｔｈｒ７７、Ｍｅｔ８１、Ｇｌｙ９１、Ｌｙｓ９５、Ｇｌｎ９６、Ｇｌｙ９９を除いて、同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異している、ＣｆａＮ配列（配列番号２７）。
以下の残基：Ｃｙｓ１、Ｌｙｓ７０、Ｈｉｓ７２、Ｍｅｔ７５、Ｍｅｔ８１が維持され、以下：Ａｓｐ５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ２４Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ３８Ａｓｎ、Ｖａｌ３９Ｉｌｅ、Ｉｌｅ４４Ｖａｌ、Ａｓｎ４９Ａｓｐ、Ｉｌｅ６５Ｌｅｕ、Ｔｈｒ７７Ｖａｌ、Ｇｌｙ９１Ｇｌｕ、Ｌｙｓ９５Ｍｅｔ、Ｇｌｎ９６Ａｒｇ、Ｇｌｙ９９Ａｓｎの突然変異のいずれか又はそれらの組合せが導入されている、ＣｆａＮ配列（配列番号２７）。
以下の残基：Ｃｙｓ１、Ｌｙｓ７０、Ｈｉｓ７２、Ｍｅｔ７５、Ｍｅｔ８１が維持され、以下の突然変異Ａｓｐ５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ２４Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ３８Ａｓｎ、Ｖａｌ３９Ｉｌｅ、Ｉｌｅ４４Ｖａｌ、Ａｓｎ４９Ａｓｐ、Ｉｌｅ６５Ｌｅｕ、Ｔｈｒ７７Ｖａｌ、Ｇｌｙ９１Ｇｌｕ、Ｌｙｓ９５Ｍｅｔ、Ｇｌｎ９６Ａｒｇ、Ｇｌｙ９９Ａｓｎのうち１個～６個（１及び６は範囲に含まれる）が導入されている、ＣｆａＮ配列（配列番号２７）。
以下の残基：Ｃｙｓ１、Ａｓｐ５、Ｇｌｕ２４、Ｐｈｅ３８、Ｖａｌ３９、Ｉｌｅ４４、Ｌｙｓ７０、Ｈｉｓ７２、Ｍｅｔ７５、Ｍｅｔ８１、Ｇｌｙ９１、Ｌｙｓ９５、Ｇｌｎ９６、Ｇｌｙ９９が維持され、以下の突然変異Ｐｈｅ１５Ａｌａ、Ｔｈｒ３２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ３５Ｇｌｕ、Ａｓｎ４９Ａｓｐ、Ｉｌｅ６５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ７７Ｇｌｕのいずれか又は突然変異の組合せが導入されているＣｆａＮ配列（配列番号２７）。
ＮｐｕＮの機能的に等価な変異体は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる。
Ｃｙｓ２８及び／又はＣｙｓ５９がＳｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｌａに突然変異している、ＮｐｕＮ配列（配列番号３２）。
ＮｐｕＮの任意の残基が、維持されなければならない以下の残基：Ｃｙｓ１、Ｔｈｒ６９、Ｌｙｓ７０、Ｈｉｓ７２、Ｍｅｔ７５、Ｍｅｔ８１を除いて、同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異され得るＮｐｕＮ配列（配列番号３２）。
ＮｐｕＮの任意の残基をＣｆａＮの配列中の対応するアミノ酸に突然変異させることができるＮｐｕＮ配列（配列番号３２）。
Ｇｐ４１Ｎの機能的に等価な変異体は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる。
Ｃｙｓ５９及び／又はＣｙｓ８３がＳｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｌａに突然変異しているＧｐ４１Ｎ配列（配列番号３８）。
Ｇｐ４１Ｎの任意の残基が、維持されなければならない以下の残基：Ｃｙｓ１、Ｈｉｓ６３を除いて、同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異させることができ、残基６０はＳｅｒ又はＴｈｒである、Ｇｐ４１Ｎ配列（配列番号３８）。
ＣａｔＮの機能的に等価な変異体は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる。
ＣａｔＮの任意の残基を、維持しなければならないＣｙｓ１残基を除いて、同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異させることができるＣａｔＮ配列（配列番号３０）。
特定の実施形態において、インテインＮは、配列全体にわたって、それぞれ配列番号２７、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列番号２７、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３８のアミノ酸配列の変異体を含むか、又はそれからなる。特定の実施形態において、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３８のインテインＮの変異体は、配列全体にわたって、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３８とそれぞれ少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
２つ以上のアミノ酸又はヌクレオチド配列と関連して「同一性」、「同一」、「同一性パーセント」又は「配列同一性」という用語は、配列同一性の一部として任意の保存的アミノ酸置換を考慮せず、最大の対応のために比較及び整列（必要に応じてギャップを導入）した場合に、同じであるか、又は同じアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズム、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸配列のアラインメントを得るために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野で知られている。配列アラインメントアルゴリズムのかかる非限定的な一例は、Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-7において改変されるKarlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-8に記載されるアルゴリズムであり、Ｎ ＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴのプログラム（Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-402)に組み込まれている。或る特定の実施形態において、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-402に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴ－２、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２（Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-80）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Genentech、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ）又はＭｅｇａｌｉｇｎ（DNASTAR）は配列を整列させるために使用することができる追加の公的に利用できるソフトウェアプログラムである。或る特定の代替実施形態において、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-53 (1970))のアルゴリズムを組み込んだＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５の長さ重みを使用する）。或いは、或る特定の実施形態において、アミノ酸配列間の同一性パーセントは、Myers and Miller (CABIOS, 4:1 1-7 (1989))のアルゴリズムを用いて決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用し、残基表を備えるＰＡＭ１２０、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。特定のアラインメントソフトウェアによる最大アラインメントのための適切なパラメータは、当業者によって決定され得る。或る特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。或る特定の実施形態において、第１のアミノ酸配列の第２のアミノ酸配列に対する同一性パーセント「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、ここでＹは、第１の配列及び第２の配列のアラインメントにおいて（目視又は特定の配列アラインメントプログラムによって整列された）同一の一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、Ｚは第２の配列における残基の総数である。第２の配列が第１の配列より長い場合、両方の配列の全体を考慮したグローバルアラインメントが使用されるため、それぞれの配列の全ての文字とヌルがアラインメントされる必要がある。この場合、上記と同じ式を用いることができるが、第１の配列と第２の配列が重なる領域の長さをＺ値として用い、上記領域は第１配列の長さと実質的に同じ長さを有するものとする。
非限定的な例として、任意の特定のポリペプチドが参照配列に対して或る特定のパーセンテージの配列同一性（例えば、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、及び或る幾つかの実施形態において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一）を有するかどうかは、特定の実施形態において、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 5371 1）を使用して決定することが可能である。ＢｅｓｔｆｉｔはSmith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-9 (1981)の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最適なセグメントを見つける。Ｂｅｓｔｆｉｔ又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に対して９５％同一であるかどうかを判断する場合、同一性のパーセンテージは参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、参照配列中のヌクレオチドの総数の最大５％の相同性のギャップが許容されるようにパラメータが設定される。
スプリットインテインＮフラグメントとデグロンとの間の「リンカー」という用語は、インテインＮフラグメントのＣ末端とデグロン配列のＮ末端とをつなぐアミノ酸配列を指す。リンカーは、好ましくは、１個～１００個のアミノ酸、又は個１～５個、又は１個～１０個、又は１個～５０個、又は１個～２５個のアミノ酸のポリペプチドであり得る。リンカーは、Ｇｌｙリッチペプチド、又はＧｌｙ－Ｓｅｒリッチペプチドであってもよい。Ｇｌｙ－Ｓｅｒリッチペプチドの例としては、配列ＧＧＳ、又はこのリンカーのポリマーで一般式（ＧＧＳ）ｎ（ｎは１～１０であり得る）を持つものが挙げられる。リンカーの一般的な式は、（（Ｇ）ｎＳ）ｙであり、ｎは１～５、ｙは１～１０である。さらに、エピトープタグをリンカーとして使用することができ、例えば、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６、配列：ＧＨＨＨＨＨＨＧ（配列番号８４）タグ、又はトリプルフラッグタグ（３ＦＴ、配列：ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１０３））である。
別の特定の実施形態において、ペプチド結合を介してスプリットインテインＮフラグメントに直接連結されたデグロンは、以下の表３に列挙されているもののいずれかから選択される。
Figure 2023518596000008
デグロンの他の非限定的な例としては、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）、ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）、ＦＲＢ（ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合タンパク質）及びＰＤＥ５（ホスホジエステラーゼ５型）に関連するポリペプチドが挙げられる。また、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）経路の分解シグナルも挙げられる。
更に別の好ましい実施形態において、デグロンは７５アミノ酸未満のポリペプチドであり、本発明のインテインＮフラグメントに融合すると、その分解を誘導する。
更に別の好ましい実施形態において、デグロンは、本発明のスプリットインテインＮ末端又はＣ末端フラグメントと融合した場合、上記フラグメントの発現レベルの１０％超、又は２０％超、又は３０％超、又は５０％超、又は７５％超、又は９０％超の低下をもたらすポリペプチドである。重要なことは、本発明のフラグメントにデグロンを組み込んでも、本発明のスプリットインテインＮ末端とＣ末端とのフラグメントデグロン間のタンパク質トランススプライシングから得られる再構成タンパク質の収率に大きな影響を与えないということである。この好ましい実施形態の目的のため、発現レベルは、図１８に記載されるように測定され、すなわち、デグロンを有するフラグメントの発現レベルは、図１８に記載されるものに類似する条件下で、デグロンを有しないフラグメントの発現レベルと比較され、前者は後者より少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも９０％低くなることを要する。
更に別の好ましい実施形態において、本発明のスプリットインテインＮフラグメントデグロンのＮ－インテイン及びデグロンの好ましい組合せは、以下からなる群より選択される：
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせたＣｆａＮ又は機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、若しくはＤＤ４のデグロンのいずれかと組み合わせたＣｆａＮ又は機能的に等価なその変異体、又は、
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６若しくはＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせたＧｐ４１Ｎ又は機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、若しくはＤＤ４のデグロンのいずれかと組み合わせたＧｐ４１Ｎ又は機能的に等価なその変異体。
図１８Ａでは、幾つかの代表的なデグロンが、スプリットＮ－インテインフラグメント、特にＣｆａＮインテインに融合したときの効果を示す。デグロン（ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２）を添加すると、デグロンが融合したＮ－インテイン含有タンパク質融合体の検出可能な発現レベルが著しく減少する。興味深いことに、実施例、並びに図１８、図２０及び図２１に記載されているように、幾つかの好ましいデグロン（ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、又はＶ１２）が含まれていても、スプライシング産物形成の収率に悪影響を及ぼさない。デグロンの添加によって達成されるように、タンパク質トランススプライシング反応の出発物質量が減少すると、タンパク質のスプライシング収量が減少することが予想されることから、この結果は技術水準からは予測されていなかった。
更に別の好ましい実施形態において、スプリットインテインＮフラグメント及びデグロンの好ましい組合せは、ＣｆａＮインテインと以下のデグロンＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７との組合せからなる群より選択される。
このように、本発明者らは、ＣｆａＮインテインを上記のいずれかのデグロン、特に以下：ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７と組み合わせた場合、Ｎ末端インテインフラグメントの発現レベルの低下が検出された（図９、図１８Ａ）ことを観察した。重要なのは、これがタンパク質トランススプライシング反応の収率に影響を与えないことである（図９、図１８Ｃ、図２０又は図２１）。典型的には、タンパク質トランススプライシング反応に関与する２つのインテインフラグメントのうち一方の収率、発現、又は安定性が低下すると、形成されるスプライシング産物の量が全体的に減少するため、この結果は従来技術からすると予想外のものであった。
本発明者らは、この効果が、ＡＢＣＡ４等の膜タンパク質（図１８、図２０、及び図２１）だけでなく、ＥＧＦＰ等の細胞質可溶性タンパク質でも観察されており、その効果の普遍性を示している。図９では、ＥＧＦＰＮ－ＣｆａＮにデグロンを添加すると、そのタンパク質に対応するバンドが完全に消失することが観察され得る。しかしながら、ＣｆａＣ－ＥＧＦＰＣフラグメント（デグロンあり、又はなし）を添加すると、デグロンを使用しなかった場合と同じ収率で全長ＥＧＦＰ産物が形成される。この例は、デグロンを１つ、或いは２つ（各フラグメントに１つ）追加しても、標的タンパク質の収率に悪影響を与えないことを示している。
スプリットインテインのＮフラグメントを含む複合体
別の態様において、本発明は、以下の複合体（複数の場合もある）のいずれか、すなわち本発明のスプリットインテインＮフラグメント又は本発明のスプリットインテインＮフラグメントデグロン（以下、本発明の第１の複合体（複数の場合もある）と呼ぶ）に関し、これらの複合体の各々は、以下：
（ｉ）再構成される目的のタンパク質のＮ末端フラグメントと、
（ｉｉ）上記の項で規定されるように、スプリットインテインＮフラグメント、又はペプチド結合を介して、任意にリンカーにより、デグロンに直接連結したスプリットインテインＮフラグメント（本発明のスプリットインテインＮフラグメントデグロン）と、
を含み、
複合体（複数の場合もある）は、任意に、（ｉ）と（ｉｉ）との間にリンカーを含み、
目的のタンパク質のＮ末端フラグメントが、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端フラグメントに連結されているか、又は、
複合体（複数の場合もある）がリンカーを含む場合、目的のタンパク質のＮ末端フラグメントはアミド結合によってリンカーに結合され、及び／又はリンカーはアミド結合によってスプリットインテインＮフラグメントのＮ末端に結合されている。
上記の複合体のいずれかにおいて有用な目的のタンパク質の非限定的な実例としては、上記の表１に示されるものである。目的の更なるタンパク質を、抗体、Ｆｃドメイン、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメント、ナノボディ、二重特異性抗体、タンパク質、好ましくは、２５ＫＤａ、５０ＫＤａ、１００ＫＤａより大きい任意のタンパク質から選択することができる。
既に示したように、任意に、目的のタンパク質とスプリットインテインＮフラグメントはリンカーによりつながれてもよいことから、リンカーは目的のタンパク質とＮ－インテインとの間に位置することになる。リンカーの性質は、目的のタンパク質の性質に依存する。特定の実施形態において、リンカーは、ペプチドである。特定の実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００又はそれ以上のアミノ酸残基の長さを有するペプチドであり、具体的には、１～３アミノ酸残基であり得る。好ましくは、ペプチド結合により、リンカーのＮ末端は目的のタンパク質のＣ末端に連結され、リンカーのＣ末端はＮ－インテインのＮ末端に連結される。
別の特定の実施形態において、複合体は、目的のタンパク質のＮ末端フラグメントとスプリットインテインＮフラグメントとの間にリンカーを含まない。この特定の実施形態において、目的のタンパク質は、アミド結合によってスプリットインテインＮフラグメントのＮ末端に連結される。
別の特定の実施形態において、複合体がリンカーを含む場合、複合体は融合タンパク質である。「融合タンパク質」という用語は当該技術分野でよく知られており、天然及び／又は人工の異なる起源からの２つ以上の配列を含む、人工的に設計された単一のポリペプチド鎖を指す。融合タンパク質は、定義上、それ自体が自然界に見られることはない。
スプリットインテインＣフラグメント
別の態様において、本発明は、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結されたスプリットインテインＣフラグメント（以下、「本発明のスプリットインテインＣフラグメント」と呼ぶ）に関する。
より好ましくは、本発明は、ペプチド結合を介して、デグロンに直接連結されたスプリットインテインＣフラグメント（以下、「本発明のスプリットインテインＣフラグメントデグロン」と呼ぶ）に言及し、デグロンは、インテインＣフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介して、インテインＣフラグメントに連結されており、スプリットインテインＣフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントのＮ末端に直接連結されている。
したがって、本発明のスプリットインテインＣフラグメントデグロンのコンストラクトのＮ末端からＣ末端までの構造は、次の通りとなる：
（デグロン）－（インテイン－Ｃフラグメント）－（再構成されるタンパク質のＣ末端部分）。
デグロンとインテインＣとの間にリンカーが含まれる場合、本発明のスプリットインテインＣフラグメントデグロンのコンストラクトのＮ末端からＣ末端までの構造は、以下の通りとなる：
（デグロン）－（リンカー）－（インテイン－Ｃフラグメント）－（再構成されるタンパク質のＣ末端部分）。
好ましくは、本発明のスプリットインテインＣフラグメント又は本発明のスプリットインテインＣフラグメントデグロンのいずれかのインテインＣは、以下の表４に列挙されるいずれかから選択される。
Figure 2023518596000009
ここで、好ましくは、インテインＣは、配列番号２８のＣｆａＣインテイン又はＣｆａＣｍｕｔ（配列番号２９）若しくはＣｏｎＣ（配列番号１０５）等のその任意の変異体；又は配列番号３１のＣａｔＣインテイン若しくはその任意の変異体、又はＮｐｕＣインテイン（配列番号３３）若しくはＮｐｕＣｍｕｔ（配列番号３６）等のその任意の変異体、又は配列番号１０４のＧＰ４１Ｃインテイン若しくはその任意の変異体；又は上で定義した曖昧さが増加した任意の変異体である。
変異体という用語は、スプリットインテインのＮフラグメントについて定義されている通りである。インテインＣの変異体としては、Ｎ末端のメチオニン残基を含まない配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号１０４及び配列番号１０５が挙げられる。
特定の実施形態において、曖昧さが増加したＣｆａＣ、ＮｐｕＣ、又はＣｏｎＣの変異体は、Stevens et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017に記載されているように、２１位、２２位及び２３位にアミノ酸Ｇｌｙ、Ｇｌｕ及びＰｒｏを含む。
特定の実施形態において、ＣｆａＣ、ＮｐｕＣ、ＣａｔＣ又はｇｐ４１ｃインテインの機能的に等価な変異体の例は、以下のように示される：
ＣｆａＣの機能的に等価な変異体は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる：
Ｍｅｔ１が除去されたＣｆａＣ（配列番号２８）配列。
Ｎ末端Ｍｅｔ１に追加のアミノ酸、例えば、リンカー、デグロン、検出用タグ等が含まれるＣｆａＣ（配列番号２８）配列。
ＣｆａＣの任意の残基が、維持されるべき以下の残基：Ａｓｐ１７、Ｈｉｓ２４、Ａｓｎ３６を除いて同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異しているＣｆａＣ（配列番号２８）配列。
ＣｆａＣの任意の残基が、維持されるべき以下の残基：Ａｓｐ１７、Ａｓｐ２３、Ｈｉｓ２４、Ｓｅｒ３５、Ａｓｎ３６を除いて同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異しているＣｆａＣ（配列番号２８）配列。
ＣｆａＣの任意の残基が、維持されるべき以下の残基：Ａｓｐ１７、Ａｓｐ２３、Ｈｉｓ２４、Ｓｅｒ３５、Ａｓｎ３６を除いて同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異しているＣｆａＣ（配列番号２８）配列。
以下の残基：Ａｓｐ１７、Ａｓｐ２３、Ｈｉｓ２４、Ｓｅｒ３５、Ａｓｎ３６が維持され、以下のアミノ酸Ｖａｌ２、Ｉｌｅ５、Ｓｅｒ６、Ｓｅｒ９、Ｌｙｓ２２、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２、Ｖａｌ３３のいずれかが突然変異している、ＣｆａＣ（配列番号２８）配列。
以下の残基：Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｕ、及びＡｓｐ２３Ｐｒｏが突然変異しているＣｆａＣ（配列番号２８）配列。この変異体は、ＣｆａＣｍｕｔインテイン（配列番号２９）に相当する。
指定の位置にあるべき以下の残基：Ａｓｐ１７、Ｇｌｙ２１、Ｇｌｕ２２、Ｐｒｏ２３、Ｈｉｓ２４、Ａｓｎ３６を除いて、任意の残基が同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異しているＣｆａＣ（配列番号２８）配列。
以下の残基：Ａｓｐ１７、Ｇｌｙ２１、Ｇｌｕ２２、Ｐｒｏ２３、Ｈｉｓ２４、Ｓｅｒ３５、Ａｓｎ３６が指定の位置にあるべきであり、以下のアミノ酸Ｖａｌ２、Ｉｌｅ５、Ｓｅｒ９、Ｌｅｕ２７、Ｌｅｕ３２、Ｖａｌ３３のいずれかが突然変異している、ＣｆａＣ（配列番号２８）配列。
以下の突然変異Ｖａｌ２Ｉｌｅ、Ｉｌｅ５Ａｌａ、Ｓｅｒ６Ｔｈｒ、Ｓｅｒ９Ｔｙｒ、Ｔｈｒ１２Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２７Ａｌａ、Ｌｅｕ３２Ｐｈｅ、Ｖａｌ３３Ｉｌｅのうち１個～５個（１及び５は範囲に含まれる）が導入されているＣｆａＣ（配列番号２８）又はＣｆａＣｍｕｔ（配列番号２９）配列。
ＮｐｕＣの機能的に等価な変異体は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる：
Ｍｅｔ１が除去されたＮｐｕＣ（配列番号３３）配列。
Ｍｅｔ１のＮ末端に追加のアミノ酸、例えば、リンカー、デグロン、検出用タグ等が含まれるＮｐｕＣ（配列番号３３）配列。
ＮｐｕＣの任意の残基が、維持されるべき以下の残基：Ａｓｐ１７、Ｈｉｓ２４、Ａｓｎ３６を除いて同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異し得るＮｐｕＣ（配列番号３３）配列。
ＮｐｕＣの任意の残基が、維持する必要がある以下の残基：Ａｓｐ１７、Ｈｉｓ２４、Ｓｅｒ３５、Ａｓｎ３６を除いて同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異し得るＮｐｕＣ（配列番号３３）配列。
以下の残基：Ａｓｐ１７、Ｈｉｓ２４、Ｓｅｒ３５、Ａｓｎ３６が維持され、以下のアミノ酸Ｖａｌ２、Ｉｌｅ５、Ｓｅｒ９、Ｌｙｓ２２、Ｌｅｕ３２、Ｖａｌ３３のいずれかが突然変異している、ＮｐｕＣ（配列番号３３）配列。
以下の残基：Ａｓｐ１７、Ｈｉｓ２４、Ｓｅｒ３５、Ａｓｎ３６が維持され、以下の突然変異Ｉｌｅ２Ｖａｌ、Ａｌａ５Ｉｌｅ、Ｔｙｒ９Ｓｅｒ、Ａｌａ２７Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３２Ｌｅｕ、Ｉｌｅ３３Ｖａｌのいずれかが組み込まれている、ＮｐｕＣ（配列番号３３）配列。
Ｎｐｕの曖昧さを高めるために、以下の残基Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ、Ａｒｇ２２Ｇｌｕ、Ａｓｐ２３Ｐｒｏに突然変異している、ＮｐｕＣ（配列番号３３）配列。
Ｇｐ４１Ｃの機能的に等価な変異体は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる：
Ｍｅｔ１が除去されたＧｐ４１Ｃ（配列番号１０４）配列。
Ｍｅｔ１のＮ末端に追加のアミノ酸、例えば、リンカー、デグロン、検出用タグ等が含まれるＧｐ４１Ｃ（配列番号１０４）配列。
Ｇｐ４１Ｃの任意の残基が、維持する必要がある以下の残基：Ｈｉｓ２６、Ｈｉｓ３６、Ａｓｎ３７を除いて同様の物理化学的特性を有する残基に突然変異し得る、Ｇｐ４１Ｃ（配列番号１０４）の配列。
特定の実施形態において、インテインＣは、配列全体にわたって、それぞれ配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、又は配列番号１０４と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、又は配列番号１０４のアミノ酸配列の変異体を含むか、又はそれからなる。特定の実施形態において、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、又は配列番号１０４のインテインＣの変異体は、配列全体にわたって、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、又は配列番号１０４とそれぞれ少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
別の特定の実施形態において、ペプチド結合を介してスプリットインテインＣフラグメントに直接連結されたデグロンは、表３に列挙されているもののいずれかから選択される。この項で有用な、目的のタンパク質の非限定的な実例は、上記の表１に示されるものである。
更に別の好ましい実施形態において、本発明のスプリットインテインＣフラグメントデグロンのＣ－インテインとデグロンとの好ましい組合せは、以下からなる群より選択される：
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせた、ＣｆａＣ又はＣｆａＣｍｕｔ等のその任意の機能的に等価な変異体。好ましくは以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６若しくはＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせた、ＣｆａＣ又はＣｆａＣｍｕｔ等のその任意の機能的に等価な変異体、又は、
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６若しくはＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせた、Ｇｐ４１Ｃ又はその任意の機能的に等価な変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、若しくはＤＤ４のデグロンのいずれかとの組み合わせたＧｐ４１Ｃ又は機能的に等価なその変異体。
図１８ＢではＣ末端コンストラクトにデグロンを融合させる効果を観察することができる。Ｎ末端のデグロンで観察されたようにＣ末端のコンストラクトにデグロンを融合させると、コンストラクトの発現レベルが低下するが、好ましい組合せを使用した場合には、スプライシング収率への影響は観察されない。ＣｆａＣと特に相性が良いのは、以下のデグロンである：ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７。Ｎ末端フラグメントで観察されたように、本発明のＣ末端フラグメントにデグロンを組み込むと、その発現が低下した（ＷＢで検出）が、また興味深いことに、ＰＴＳ収率、すなわち目的の産物の形成には悪影響が観察されなかった。この結果は、本明細書において示したＥＧＦＰとＡＢＣＡ４の例を含む、幾つかのタンパク質で観察されている。
スプリットインテインＣフラグメントを含む複合体
別の態様において、本発明は、以下のいずれかの複合体（複数の場合もある）、すなわち本発明のスプリットインテインＣフラグメント又は本発明のスプリットインテインＣフラグメントデグロン（以下、本発明の第２の複合体（複数の場合もある）と呼ぶ）に関し、これらの複合体の各々は、以下：
（ｉ）目的のタンパク質のＣ末端フラグメントと、、
（ｉｉ）上記の項で規定されたように、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、デグロンに直接連結された、スプリットインテインＣフラグメント又はスプリットインテインＣフラグメント（本発明のスプリットインテインＣフラグメントデグロン）と、
を含み、
複合体（複数の場合もある）は、任意に、（ｉ）と（ｉｉ）との間にリンカーを含み、
目的のタンパク質のＣ末端フラグメントが、アミド結合によってスプリットインテインＣフラグメントのＣ末端に連結されているか、又は、
複合体（複数の場合もある）がリンカーを含む場合、目的のタンパク質のＣ末端フラグメントはアミド結合によってリンカーに結合され、及び／又はリンカーはアミド結合によってスプリットインテインＣフラグメントのＣ末端に結合される。
本発明で有用な、目的のタンパク質の非限定的な実例は、上記の表１に列挙されるものである。目的のタンパク質の更なる例を、抗体、Ｆｃドメイン、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメント、ナノボディ、二重特異性抗体、タンパク質、好ましくは、２５ＫＤａ、５０ＫＤａ、１００ＫＤａより大きい任意のタンパク質から選択することができる。
「目的のタンパク質」及び「リンカー」という用語は、本発明の第１の複合体に関連して既に定義されている。本発明の第１の複合体の目的のタンパク質とリンカーとの全ての特定の実施形態は、本発明の第２の複合体にも完全に適用される。
特定の実施形態において、複合体は、目的の化合物とスプリットインテインＣフラグメントとの間にリンカーを含まない。この特定の実施形態において、目的の化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣフラグメントのＣ末端に連結される。
特定の実施形態において、複合体は、目的の化合物とスプリットインテインＣフラグメントとの間にリンカーを含む。この特定の実施形態において、目的の化合物は、目的の化合物及びリンカーの化学的性質に応じて、任意の適切な手段によってリンカーに結合され得る。この特定の実施形態において、リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣフラグメントのＣ末端に結合している。別の特定の実施形態において、目的の化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、この場合、リンカーは任意の適切な手段によってスプリットインテインＣフラグメントのＣ末端に結合され得る。別の特定の実施形態において、目的の化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、リンカーはアミド結合によってスプリットインテインＣフラグメントのＣ末端に結合される。
特定の実施形態において、複合体がリンカーを含む場合、リンカーはペプチドリンカーである。この特定の実施形態において、複合体は、融合タンパク質である。
本発明の複合体を含む組成物
別の態様において、本発明は、本発明の第１の複合体（複数の場合もある）及び／又は第２の複合体（複数の場合もある）を含む組成物（以下、本発明の第１の組成物と呼ぶ）に言及する。
「組成物」という用語は、特定の成分を含む産物だけでなく、特定の成分を特定の量で組み合わせた結果、直接的又は間接的に生じる産物も包含することが意図されている。組成物の成分は、単一の製剤中に一緒に充填されてもよく、又は異なる製剤中に別々に充填されてもよい。したがって、実施形態において、本発明の第１の複合体は、単一の製剤において本発明の第２の複合体と共に充填される。別の実施形態において、本発明の第１の複合体と、本発明の第２の複合体とは、別々に充填される。
特に好ましい実施形態において、第１の複合体及び第２の複合体は、両方の複合体が本発明の方法に従って組み合わされる場合、タンパク質のＮ末端フラグメントがタンパク質のＣ末端フラグメントに連結されてタンパク質全体を生成するように、それぞれ同じタンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントを含む。
本発明のポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
別の態様において、本発明は、本発明の第１の複合体（複数の場合もある）又は第２の複合体（複数の場合もある）をコードするポリヌクレオチドに関する。
好ましくは、好ましい実施形態において、本発明は、２つのポリヌクレオチドに言及し、これらのポリヌクレオチドのうちの一方は、本発明の第１の複合体（複数の場合もある）をコードし（以下、本発明の第１のポリヌクレオチド）、他方は、本発明の第２の複合体（複数の場合もある）をコードし（以下、本発明の第２のポリヌクレオチド）、本発明の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、両ポリヌクレオチドがそれぞれのタンパク質複合体に翻訳される、及び／又は本発明の方法に従って組み合わされた場合、タンパク質のＮ末端フラグメントはタンパク質のＣ末端フラグメントに連結され、そのようにして、再構成されるタンパク質全体が生成されるように、それぞれ同じタンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをコードする。本発明の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、それぞれ好ましくは同じインテインのスプリットインテインをコードすること、すなわち、Ｎ－インテインとＣ－インテインが同族対であることに留意するのが重要である（Shah et al. Journal of the American Chemical Society 2012 https://doi.org/10.1021/ja303226xを参照されたい）。同族インテイン対の例としては、ＣｆａＮ／ＣｆａＣ（又はＣｆａＣｍｕｔを含むそれらの変異体のいずれか）、ＮｐｕＮ／ＮｐｕＣ（又はそれらの変異体のいずれか）、ＣａｔＮ／ＣａｔＣ（又はそれらの変異体のいずれか）、Ｇｐ４１Ｎ／Ｇｐ４１Ｃ（又はそれらの変異体のいずれか）が挙げられる。しかしながら、両方のポリヌクレオチドが同一のインテインに関わるスプリットインテインをコードしているかどうかという事実とは無関係に、タンパク質に翻訳されると、スプリットインテインそれぞれのＮ末端とＣ末端の配列は、トランススプライシング反応に機能的なインテインに非共有結合的に再集合することができる、すなわち再構成することができる別々のフラグメントにならなくてはならない。
好ましい実施形態において、本発明は、上記で言及した２つのポリヌクレオチドに言及し、これらのポリヌクレオチドのうちの一方は、本発明のスプリットインテインＮフラグメントデグロンをコードし（以下、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチドと呼ぶ）、他方は本発明のスプリットインテインＣフラグメントデグロンをコードし（以下、本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチドと呼ぶ）、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドがそれぞれのタンパク質複合体に翻訳され、本発明の方法に従って組み合わされた場合、タンパク質のＮ末端フラグメントがタンパク質のＣ末端フラグメントに連結され、そのようにしてタンパク質全体が生成されるように、それぞれ同一のタンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをコードする。先の実施形態と同様に、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、それぞれ好ましくは同一のインテインのスプリットインテインをコードすることに留意することが重要である。いずれにせよ、そして上記に反映されるように、本明細書において使用される場合、各ポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるとＮ末端配列及びＣ末端配列が、トランススプライシング反応に機能的なインテインに非共有結合的に再集合することができるか、又は再構成することができる別々のフラグメントとなるように、スプリットインテインをコードしなければならない。
更に別の好ましい実施形態において、本発明は、オルソゴナルスプリットインテイン対を用いた３ピースライゲーション戦略について言及する。この方法論には、３つのポリヌクレオチドがあり、第１のポリヌクレオチドは、ＰＯＩＮ－ＣｆａＮ（ＰＯＩＮは、「目的のタンパク質」のＮフラグメントとして理解される）をコードし、第２のポリヌクレオチドは、ＣｆａＣ－ＰＯＩＭ－ＣａｔＮ（この場合、ＰＯＩＭは、目的のタンパク質の中間フラグメントである）をコードし、第３のポリヌクレオチドは、ＣａｔＣ－ＰＯＩＣ（ＰＯＩＣは、目的のタンパク質のＣフラグメントとして理解される）をコードする。或いは、Ｃｆａインテイン及びＣａｔインテインの位置を入れ替えて、以下のような構造：ＰＯＩＮ－ＣａｔＮ、ＣａｔＣ－ＰＯＩＭ－ＣｆａＮ、及びＣｆａＣ－ＰＯＩＣを持つコンストラクトを生成することもできる。ＣｆａＮは、ＣｆａＮインテインフラグメント配列番号２７、及びその変異体のいずれかである。ＣａｔＮは、ＣａｔＮインテインフラグメント配列番号３０、及びその変異体のいずれかである。ＣｆａＣは、ＣｆａＣインテインフラグメント配列番号２８、及び配列番号２９を含むその変異体のいずれかである。ＣａｔＣは、ＣａｔＣインテインフラグメント配列番号３１、及びその変異体のいずれかである。
本明細書においては、２つのポリヌクレオチドに言及するそれらの実施形態について、第１のポリヌクレオチド（又は具体的には本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド）は、本発明の任意のスプリットインテインＮフラグメント又は本発明の任意のスプリットインテインＮデグロンフラグメントであり得ることが留意される。特に、本発明の第１のポリヌクレオチド（又は具体的には、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド）は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６及び配列番号７８。より好ましくは、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチドは、以下のインテインとデグロンとの具体的な組合せのいずれかをコードする：
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせた、ＣｆａＮ又はＣｏｎＮ等の機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、若しくはＤＤ４のデグロンのいずれかと組み合わせた、ＣｆａＮ又はＣｏｎＮ等の機能的に等価なその変異体、又は、
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６若しくはＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせたＧｐ４１Ｎ又は機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２若しくはＤＤ４のデグロンのいずれかと組み合わせたＧｐ４１Ｎ又は機能的に等価なその変異体。
本明細書においては、２つのポリヌクレオチドに言及するそれらの実施形態について、第２のポリヌクレオチド（又は具体的には本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチド）は、本発明の任意のスプリットインテインＣフラグメント又は本発明の任意のスプリットインテインＣデグロンフラグメントであり得ることが更に留意される。特に、本発明の第２のポリヌクレオチド（又は具体的には、本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチド）は、以下からなる一覧のいずれかから選択することができる：配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７及び配列番号７９。より好ましくは、本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチドは、以下のインテインとデグロンとの具体的な組合せのいずれかをコードする：
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴｔ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせた、ＣｆａＣ又はＣｆａＣｍｕｔ若しくはＣｏｎＣ等の機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６若しくはＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせた、ＣｆａＣ又はＣｆａＣｍｕｔ等の機能的に等価なその変異体、又は、
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６若しくはＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせたＧｐ４１Ｃ又は機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２若しくはＤＤ４のデグロンのいずれかと組み合わせたＧｐ４１Ｃ又は機能的に等価なその変異体。
好ましい実施形態において、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドがそれぞれのタンパク質複合体に翻訳され、本発明の方法に従って組み合わされる場合、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントがＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントに連結されてＡＢＣＡ４タンパク質全体が生成されるように、それぞれＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをコードする。より好ましくは、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位、１位～１１３９位、１位～１１７８位、又は１位～１１８７位と、以下のインテイン及びデグロンの特定の組合せのいずれかとをコードし：
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせたＣｆａＮ又はＣｏｎＮ等の機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、又はＤＤ４のいずれかのデグロンと組み合わせた、ＣｆａＮ又はＣｏｎＮ等の機能的に等価なその変異体；
本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位、１１４０位～２２７３位、１１７９位～２２７３位、又は１１８８位～２２７３位と、以下のインテイン及びデグロンの特定の組合せのいずれかとをコードする：
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳｔ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせたＣｆａＣ、又はＣｆａＣｍｕｔ若しくはＣｏｎＣ等の機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７のデグロンのいずれかと組み合わせたＣｆａＣ又はＣｆａＣｍｕｔ等の機能的に等価なその変異体。
本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントはＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントと連結されなくてはならず、そのようにしてＡＢＣＡ４タンパク質全体が生成されることから、本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位をコードすることに留意することが重要である。他の位置についても同様である。
上記の好ましい組合せを用いるとＮ末端及びＣ末端の出発フラグメントのレベルを著しく低下させながら、これらの例ではＡＢＣＡ４という標的タンパク質の効率的な再構成を得ることができることが確認できる。一方のコンストラクトに少なくとも１つのデグロンが含まれている場合、又は両方に含まれている場合、Ｎ末端及び／又はＣ末端フラグメントの分解が促進されるため、発現が低減する。技術水準に基づけば、かかる出発物質のレベルの低下は、スプライス産物の低下をもたらすと予想される。それにもかかわらず、本発明者らは逆の挙動を観察し、全長スプライシング産物の収率は影響を受けず、場合によっては向上することさえある。さらに、本発明者らは、本明細書に記載の方法を用いてタンパク質を再構成することで、本発明者らは、ＡＴＰアーゼ活性アッセイを使用して決定した場合に、機能的なタンパク質を生成できることを観察した。本発明者らはまた、マウスの網膜においてｉｎ ｖｉｖｏで標的タンパク質を効率的に再構成することを確認した。
別の好ましい実施形態において、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１０９５位、又は１位～１１８５位と、以下のインテイン及びデグロンの特定の組合せのいずれかとをコードし：
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７のいずれかのデグロンと組み合わせたＧｐ４１Ｎ又は機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２、又はＤＤ４のいずれかのデグロンと組み合わせた、Ｇｐ４１Ｎ又は機能的に等価なその変異体；
本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１０９６位～２２７３位、又は１１８６位～２２７３位と、以下のインテイン及びデグロンの特定の組合せのいずれかとをコードする：
以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７のいずれかのデグロンと組み合わせたＧｐ４１Ｃ又は機能的に等価なその変異体。好ましくは、以下：ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４、Ｖ１２又はＤＤ４のいずれかのデグロンと組み合わせたＧｐ４１Ｃ又は機能的に等価なその変異体。
先の事例と同様に、本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチドが１位～１０９５位をコードする場合、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントはＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントと連結されなくてはならず、そのようにしてＡＢＣＡ４タンパク質全体が生成されることから、本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１０９６位～２２７３位をコードすることに留意することが重要である。他の位置についても同様である。
上記配列をコードするヌクレオチド配列の更に好ましい組合せ（それぞれ本発明の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド又は本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド）は、以下の対のいずれかから選択される：１と２；３と４；５と６；６６と６７：６８と６９：７０と７１：７２と７３；７４と７５；７６と７７；及び７８と７９。
「本発明の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド」という用語は、とりわけ「本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド」を包含し、したがって、本発明者らは、以下では、本発明の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを、既にポリヌクレオチドの上記代替物の全てを包含する用語としてのみ言及することに留意されたい。
好ましくは、本発明は、本発明の第１のポリヌクレオチド及び／又は第２のポリヌクレオチド、或いは本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド及び／又は第２のポリヌクレオチドを含む、及び／又は、オルソゴナルスプリットインテイン対を使用する３ピースライゲーションシステムのＰＯＩ－インテインフラグメントのそれぞれを別々に若しくは合同で含む、組成物、以下、本発明の第２の組成物に言及する。「組成物」という用語は、この特定の文脈では、指定された成分を含む産物を包含することを意図する。組成物の成分は、単一の製剤中に共に充填されてもよく、又は異なる製剤中に別々に充填されてもよい。したがって、実施形態において、本発明の第１のポリヌクレオチドは、単一の製剤において本発明の第２のポリヌクレオチドと共に充填される。別の実施形態において、本発明の第１のポリヌクレオチド及び本発明の第２のポリヌクレオチドは、別々に充填される。より好ましくは、本発明の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、本発明の方法に従って両複合体を組み合わせると、タンパク質のＮ末端フラグメントがタンパク質のＣ末端フラグメントに連結され、再構成されるタンパク質全体が生成されるように、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをそれぞれコードする。
本発明の上記ポリヌクレオチドは全て、それ自体として単離されるか、又は適切な宿主細胞における上記ポリヌクレオチドの送達及び／又は伝播を可能にするベクターの一部を形成していることが見出され得る。したがって、別の態様において、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターに関するものである。
上記ポリヌクレオチドの挿入に適したベクターは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ及びその誘導体、ｍｐｌ８、ｍｐｌ９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４、ファージ等の原核生物における発現ベクターに由来するベクター、並びにｐＳＡ３及びｐＡＴ２８等の「シャトル」ベクター；２ミクロンプラスミド、統合プラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドのタイプのベクター等の酵母における発現ベクター；ｐＡＣシリーズ及びｐＶＬシリーズのベクター等の昆虫細胞における発現ベクター；ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズ等の植物における発現ベクター；並びに任意の市販のバキュロウイルス系を用いた昆虫細胞のトランスフェクションに適したバキュロウイルスを含む真核細胞における発現ベクターである。真核細胞用のベクターとしては、好ましくは、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルスに関連するウイルス、例えばレトロウイルス、特にレンチウイルス）、並びに非ウイルスベクター（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ（Ambion）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＭＣＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬ及びＰＫＳＶ－１０、ｐＢＰＶ－１、ｐＭＬ２ｄ及びｐＴＤＴｌ等）が挙げられる。好ましくは、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。好ましくは、ベクターは血清型１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のＡＡＶである。二量体、又は自己相補型ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）も上記ポリヌクレオチドの挿入に使用することができる。
したがって、本発明は、好ましくは、遺伝子治療用ベクターとしてのＡＡＶの開発に向けられたものである。好ましくは、これらのベクターは、ベクターのＤＮＡからｒｅｐ及びｃａｐを除去することにより、統合能力をなくしたものである。遺伝子の転写を駆動するプロモーターと共に所望の遺伝子（ポリヌクレオチド）は、一本鎖のベクターＤＮＡが宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体によって二本鎖ＤＮＡに変換された後、核内でコンカテマー形成を助ける逆末端反復配列（ＩＴＲ）の間に挿入される。ＡＡＶを用いた遺伝子治療用ベクターは、宿主細胞の核内でエピソームコンカテマーを形成する。非分裂細胞では、これらのコンカテマーは宿主細胞の寿命が尽きるまでそのまま残る。分裂する細胞では、エピソームのＤＮＡは宿主細胞のＤＮＡと共に複製されないため、細胞分裂によってＡＡＶのＤＮＡは失われる。ＡＡＶのＤＮＡの宿主ゲノムへのランダムな組み込みは検出可能であるが、非常に低い頻度で発生する。
所望の遺伝子（ポリヌクレオチド）は、コンストラクトが発現される予定の宿主細胞で機能する調節エレメントと組み合わされ得る。当業者であれば、適切な宿主細胞、例えば哺乳動物又はヒトの宿主細胞で使用するための調節エレメントを選択することができる。調節エレメントとしては、例えば、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、シグナルペプチド、及びポリアデニル化エレメントが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドを、プロモーター配列に作動可能に連結することができる。発明の主題において使用が企図されるプロモーターとしては、限定されるものではないが、ネイティブ遺伝子プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＫＦ８５３６０３．１、ｂｐ１４９～７３５）、キメラＣＭＶ／チキンベータ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）、及びＣＢＡの切断型（ｓｍＣＢＡ）プロモーター（米国特許第８２９８８１８号、及びLight-Driven Cone Arrestin Translocation in Cones of Postnatal Guanylate Cyclase- 1 Knockout Mouse Retina Treated with AAVGC 1）、ロドプシンプロモーター（ＮＧ００９１１５、ｂｐ４２０５～５０１０）、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーター（ＮＧ＿０２９７１８．１、ｂｐ４７７７～５０１１）、卵黄様黄斑変性症２（ＶＭＤ２）プロモーター（ＮＧ００９０３３．１、ｂｐ４８７０～５４７０）、ＰＲ特異的ヒトＧタンパク質共役型受容体キナーゼ１（ｈＧＲＫｌ；ＡＹ３２７５８０．１ ｂｐ１７９３～２０８７又はｂｐ１７９３～１９９１）（Haire et al. 2006；米国特許第８，２９８，８１８号）、近位マウスロドプシンプロモーター（ＭＯＰＳ）が挙げられる。しかしながら、当該技術分野で知られている任意の適切なプロモーターを使用することができる。具体的な実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター又はｈＧＲＫｌプロモーターである。一実施形態において、プロモーターは、１つの組織又は一群の組織において選択的な活性を示すが、他の組織では活性が低いか又は活性がない組織特異的なプロモーターである。一実施形態において、プロモーターは、光受容体特異的プロモーターである。更なる実施形態において、プロモーターは、錐体細胞特異的及び／又は桿体細胞特異的プロモーターである。
好ましいプロモーターは、ＣＭＶ、ＧＲＫ１、ＣＢＡ、及びＩＲＢＰプロモーターである。更に好ましいプロモーターは、様々なプロモーターからの調節エレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターである（例えば、ＣＭＶプロモーターからのエンハンサー、ＣＢＡプロモーター及びＳｖ４０キメライントロンを組み合わせたキメラＣＢＡプロモーター、本明細書においてはＣＢＡハイブリッドプロモーターと呼ぶ）。
また、ＡＡＶの免疫原性は非常に低く、中和抗体の生成にとどまるようであり、明確に区別される細胞傷害性反応は誘導されない。この特徴は、静止細胞に感染する能力と共に、ヒトの遺伝子治療のためのベクターとしてアデノウイルスよりも優位に立つものである。
ＡＡＶゲノム、トランスクリプトーム、及びプロテオーム：ＡＡＶのゲノムは、ポジティブセンス又はネガティブセンスの一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）でできており、その長さは約４．７キロベースである。ゲノムはＤＮＡ鎖の両端にある逆末端反復配列（ＩＴＲ）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐとを含む。前者は、ＡＡＶのライフサイクルに必要なＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子で構成され、後者はカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のヌクレオチド配列を重複して含み、これらは相互作用して正２０面体対称のカプシドを形成する。
逆末端反復（ＩＴＲ）配列は、それぞれ１４５塩基を含む。ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要であることが示され、その対称性からそう名づけられた。また、これらの配列の別の特性は、ヘアピンを形成する能力であり、これはプライマーに依存しない第２のＤＮＡ鎖の合成を可能にする、いわゆるセルフプライミングに寄与する。また、ＩＴＲはＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノム（ヒトでは１９番染色体）への組み込みとそこからのレスキューの両方に必要であり、更に完全に組み立てられたデオキシリボヌクレアーゼ耐性ＡＡＶ粒子の生成と組み合わせたＡＡＶ ＤＮＡの効率的なカプセル化に必要であることが示された。
遺伝子治療に関しては、治療用遺伝子の隣にｃｉｓで必要な配列はＩＴＲだけであるようであり、構造遺伝子（ｃａｐ）及びパッケージング遺伝子（ｒｅｐ）をｔｒａｎｓで導入することができる。この前提のもと、レポーター遺伝子又は治療用遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを効率的に製造する方法が数多く確立された。しかしながら、効果的な複製及びカプセル化にｃｉｓで必要な要素は、ＩＴＲだけではないことも発表された。幾つかの研究グループは、ｒｅｐ遺伝子のコード配列内にｃｉｓ作動性Ｒｅｐ依存型エレメント（ＣＡＲＥ：cis-acting Rep-dependent element）と呼ばれる配列を同定した。ＣＡＲＥはｃｉｓで存在すると、複製とカプセル化を増強することが示された。
２００６年までに、既に１１種類のＡＡＶ血清型が報告されている。全ての既知の血清型は、複数の多様な組織型の細胞に感染することができる。組織特異性はカプシドの血清型によって決定され、ＡＡＶベクターのシュードタイピングによってその向性範囲を変えることは、治療への利用において重要であると思われる。本発明では、ＡＶＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のＩＴＲが好ましい。
血清型２（ＡＡＶ２）は、これまで最も多く検討されてきた。ＡＡＶ２は、骨格筋、神経細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞に対して自然向性を示す。
また、ベクターは、接触させた後にベクターを取り込んだ細胞を識別することができるレポーター又はマーカー遺伝子を含んでもよい。
本発明の関連で有用なレポーター遺伝子としては、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ＧＦＰ等が挙げられる。本発明との関連で有用なマーカー遺伝子としては、例えば、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するネオマイシン耐性遺伝子；ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；オルニチン脱炭酸酵素阻害剤（２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン（ＤＦＭＯ））に対する耐性を付与するＯＤＣ遺伝子；メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子；ピューロマイシンに対する耐性を付与するピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；ゼオシンに対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子；９－ベータ－Ｄ－キシロフラノースアデニンに対する耐性を付与するアデノシンデアミナーゼ遺伝子；Ｎ－（ホスホノアセチル）－Ｌ－アスパラギン酸の存在下で細胞の増殖を可能にする、シトシンデアミナーゼ遺伝子；アミノプテリンの存在下で細胞の増殖を可能にする、チミジンキナーゼ；キサンチンの存在下とグアニンの不在下で細胞を増殖させることを可能にする、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；トリプトファンの代わりにインドールの存在下で細胞が増殖することを可能にする大腸菌（E. coli）のｔｒｐＢ遺伝子；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチジノールを使用することを可能にする、大腸菌のｈｉｓＤ遺伝子が挙げられる。選択遺伝子は、真核細胞における上記遺伝子の発現に適したプロモーター（例えば、ＣＭＶ又はＳＶ４０プロモーター）、最適化された翻訳開始部位（例えば、いわゆるＫｏｚａｋの規則に従う部位又はＩＲＥＳ）、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位又はホスホグリセリン酸キナーゼ部位等のポリアデニル化部位、例えば、ベータグロブリン遺伝子イントロン等のイントロンを更に含むことができるプラスミドに組み入れられる。或いは、レポーター遺伝子及びマーカー遺伝子の組合せを同一ベクターで同時に使用することも可能である。
一方、当業者に知られているように、ベクターの選択は、その後に導入される宿主細胞に依存する。例としては、上記ポリヌクレオチドが導入されたベクターは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰＩ由来人工染色体（ＰＡＣ）でもあり得る。ＹＡＣ、ＢＡＣ、及びＰＡＣの特性は、当業者に知られている。上記のタイプのベクターに関する詳細な情報は、例えば、Giraldo及びMontoliu (Giraldo, P. & Montoliu L., 2001 Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals, Transgenic Research 10(2):83-110)によって提供される。本発明のベクターは、当業者に知られている従来法により得ることができる（Sambrook J. et al., 2000 "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Vol 1-3）。
本発明のポリヌクレオチドは、裸のＤＮＡプラスミドとしてｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞に導入することができるが、トランスフェクション、エレクトロポレーション（例えば経皮的エレクトロポレーション）、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクター輸送体の使用等、当該技術分野でよく知られている方法によって、ベクターを使用しても導入することができる。また、裸のＤＮＡを製剤化し、哺乳動物の筋肉組織に投与する方法も知られている。Feigner P, et al.、米国特許第５，５８０，８５９号及び米国特許第５，５８９，４６６号を参照されたい。また、カチオン性オリゴペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド、又はカチオン性ポリマー等、ｉｎ ｖｉｖｏにおける核酸のトランスフェクションを促進する他の分子も有用である。Bazile D, et al.、国際公開第１９９５０２１９３１号及びByk G, et al.、国際公開第１９９６０２５５０８号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するのに使用することができる方法としてもう一つよく知られているのが、粒子線照射（別名、バイオリスティック形質転換）である。バイオリスティック形質変換は、一般的に幾つかの方法のいずれかで行われる。一般的な方法としては、不活性又は生物学的に活性な粒子を細胞に向けて推進する方法がある。Sanford J, et al.、米国特許第４，９４５，０５０号、米国特許第５，０３６，００６号、及び米国特許第５，１００，７９２号を参照されたい。
或いは、リポフェクションによりベクターをｉｎ ｖｉｖｏ導入することも可能である。カチオン性脂質を用いることで、負に帯電した核酸の封入を促進し、また負に帯電した細胞膜との融合を促進することができる。Feigner P、Ringold G、Science 1989; 337:387-388を参照されたい。核酸の転写に特に有用な脂質化合物及び組成物が記載されている。Feigner P, et al.、米国特許第５，４５９，１２７号、Behr J, et al.、国際公開第１９９５０１８８６３号、及びByk G、国際公開第１９９６０１７８２３号を参照されたい。
最後に、そして特に好ましくは、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、偽型ＡＡＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターを含むがこれに限らないウイルス送達系によってｉｎ ｖｉｖｏに導入することが可能である。偽型ＡＡＶベクターとは、或るＡＡＶ血清型のゲノムを第２のＡＡＶ血清型のカプシドに含むものであり、例えば、ＡＡＶ２／８ベクターはＡＡＶ８カプシドとＡＡＶ２ゲノムを含む（Auricchio et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10(26):3075-81）。かかるベクターはキメラベクターとしても知られる。他の送達システムの例としては、ｅｘ ｖｉｖｏ送達システムがあり、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ＤＮＡバイオリスティックス、脂質媒介トランスフェクション、コンパクト化ＤＮＡ媒介トランスフェクション等のＤＮＡトランスフェクション法が挙げられる。
ＡＡＶベクターの構築は、当業者に知られている手順及び技術に従って実施することができる。アデノ随伴ウイルスベクターの構築及び治療における使用の理論及び実践は、幾つかの科学出版物及び特許公報に示されている（以下の参考文献は、参照することで本明細書の一部をなす：Flotte TR. Adeno-associated virus-based gene therapy for inherited disorders. Pediatr Res. 2005 Dec; 58(6):1143-7; Goncalves MA. Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector, Virol J. 2005 May 6;2:43; Surace EM, Auricchio A. Adeno-associated viral vectors for retinal gene transfer. Prog Retin Eye Res. 2003 Nov; 22(6):705-19; Mandel RJ, Manfredsson FP, Foust KD, Rising A, Reimsnider S, Nash K, Burger C. Recombinant adeno-associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurological disorders. Mol Ther. 2006 Mar; 13(3):463-83）。
ＡＡＶベクターを含む医薬組成物の好適な投与形態としては、注射用溶液又は懸濁液、アイローション及び眼科用軟膏が挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞に関する。この細胞は、当業者に知られた従来の方法によって得ることができる（例えば、前掲のSambrook et al.,を参照されたい）。
本明細書において使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明によるポリヌクレオチドやベクター等の本発明の核酸が導入され、本発明のスプリットインテインＮフラグメント又は該スプリットインテインＮフラグメントを含む融合タンパク質を発現することができる細胞を指す。本明細書においては、「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は区別なく使用される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫又は潜在的な子孫を指すことが理解されるべきである。突然変異又は環境の影響により、後代に或る特定の変化が生じることがあるため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書において使用する用語の範囲に含まれるものとする。この用語には、異種ＤＮＡの導入により改変することができる培養可能な細胞も含まれる。好ましくは、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドが安定に発現し、翻訳後修飾され、適切な細胞内区画に局在し、適切な転写機構に関与させることができるものである。適切な宿主細胞の選択は、検出シグナルの選択にも影響される。例えば、レポーターコンストラクトは、上記のように、転写調節タンパク質に応答して遺伝子転写の活性化又は阻害に際して選択可能又はスクリーニング可能な形質を提供することができ、最適な選択又はスクリーニングを達成するために、宿主細胞の表現型が考慮される。本発明の宿主細胞としては、原核細胞及び真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性生物又はグラム陽性生物が挙げられ、例えば、大腸菌又はバチルス菌が挙げられる。好ましくは、ポリヌクレオチドを含む転写制御配列又は本発明のベクターの増殖のために、原核細胞が使用されることが理解される。形質転換に適した原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、及びシュードモナス属、ストレプトミセス属、及びスタフィロコックス属内の様々な他の種が挙げられる。真核細胞としては、限定されるものではないが、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）、哺乳動物細胞、及び寄生生物（例えば、トリパノソーマ）の細胞が挙げられる。本明細書において使用される場合、酵母は、厳密な分類学的意味での酵母、すなわち単細胞生物だけでなく、糸状菌の酵母様多細胞菌類も含む。例示的な種としては、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyverei lactis）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、及びウスチラゴ・メイディス（Ustilaqo maydis）が挙げられ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が好ましい。本発明の実施に用いることができる他の酵母は、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、及びハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）である。哺乳動物宿主細胞培養系としては、ＣＯＳ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、胚性幹細胞等の確立した細胞株が挙げられ、ＢＨＫ細胞、ＨｅＫ細胞又はＨｅＬａ細胞が好ましい。組換え遺伝子の発現には、真核細胞を用いることが好ましい。
好ましい実施形態において、本発明の第２の組成物は、治療における使用のため、より詳細には、組成物中にコードされる遺伝子の種類に応じて表１で特定される疾患のいずれかにおける使用のためのものである（疾患と遺伝子との相関は表１に明確に示されており、したがって、正しい組合せを特定することは、当業者にとって明らかである）。
細胞内で目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現させる方法
別の態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで、細胞内で目的の遺伝子を発現させる方法（以下、目的の遺伝子の第１の発現方法）に関し、本方法は、
（ｉ）細胞を、
（ａ）本発明の第１のポリヌクレオチド、又は本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチド、及び、
（ｂ）本発明の第２のポリヌクレオチド、又は本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチドに接触させることと、
（ｉｉ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が産生されるように、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを発現させることと、
（ｉｉｉ）スプリットインテインＮフラグメントがスプリットインテインＣフラグメントに結合してインテイン中間体を形成し、インテイン中間体が反応して、目的の第１のポリペプチドのＣ末端を目的の第２のポリペプチドのＮ末端に共有結合するように、第１のタンパク質と第２のタンパク質を接触させることと、
を含む。
特定の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デグロンをコードする第１のポリヌクレオチドであり、第２のポリヌクレオチドは、デグロンをコードする第２のポリヌクレオチドであり、好ましくは、目的のタンパク質が２５ＫＤａ超、５０ＫＤａ超、又は１００ＫＤａ超であり、目的の第１のポリペプチドのＣ末端と目的の第２のポリペプチドのＮ末端とを共有結合させると、タンパク質全体が得られる。
本発明の第１のポリヌクレオチド及び／又は第２のポリヌクレオチドのいずれかと細胞との接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで、目的のポリヌクレオチドを細胞内に導入できるようにするための任意の適切な手段、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、リポフェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクター輸送体の使用により行うことができる。好ましくは、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
好ましい実施形態において、本発明は、細胞内で目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現させる方法（以下、目的の遺伝子の第１の発現方法）に関し、本方法は、
（ｉ）細胞を、
（ａ）本発明の第１のポリヌクレオチド、又は本発明のデグロンをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ、及び
（ｂ）本発明の第２のポリヌクレオチド、又は本発明のデグロンをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶに接触させる又は形質導入することと、
（ｉｉ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が産生されるように、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを発現させることと、
（ｉｉｉ）スプリットインテインＮフラグメントがスプリットインテインＣフラグメントに結合してインテイン中間体を形成し、インテイン中間体が反応して、目的の第１のポリペプチドのＣ末端を目的の第２のポリペプチドのＮ末端に共有結合するように、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを接触させることと、
を含み、
好ましくは、第１のポリヌクレオチドは、デグロンをコードする第１のポリヌクレオチドであり、第２のポリヌクレオチドは、デグロンをコードする第２のポリヌクレオチドであり、より好ましくは、目的のタンパク質が２５ＫＤａ超、５０ＫＤａ超、又は１００ＫＤａ超であり、目的の第１のポリペプチドのＣ末端と目的の第２のポリペプチドのＮ末端とを共有結合させると、タンパク質全体が得られる。
この意味で、また実施例に示すように、デグロンの存在は、出発物質（すなわち、本発明のスプリットインテインＮ末端及び／又はＣ末端フラグメントデグロン）の高速分解を引き起こす。選択されたデグロンは、タンパク質スプライシングに適合した分解速度を有し、定常状態では、デグロンがない場合に観察されるものに比べて、出発物質の量が減少している。しかしながら、スプライシング産物のレベルは、デグロンがない場合に観察されるものに比べて、維持されるか、又は増加する。
本発明の目的遺伝子を発現させる方法では、細胞を第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに同時に接触させるか、又は第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドに任意の順序で順次接触させることが企図され、すなわち、細胞を最初に第１のポリヌクレオチドに、次に第２のポリヌクレオチドに接触させてもよく、最初に第２のポリヌクレオチドに、次に第１のポリヌクレオチドに接触させてもよい。上記ポリヌクレオチドをコードするベクターについても、同様とする。
これらの方法には、あらかじめ宿主細胞として定義された任意の細胞を使用することができる。
本発明を以下の実施例によって説明するが、これらは単に例示であって、本発明の範囲を限定するものではないと見なされる。
以下の表では、本発明者らは、本書で既に列挙されている配列を追加して形成される配列を表す命名法を確立する。かかる配列は、以下の表において、それらを構成するＮ末端からＣ末端までの、配列番号で識別される配列の一覧で表される。例えば、配列番号１０６のアミノ酸１～１１４９が配列番号２７（ＣｆａＮ）に直接連結され、それが配列番号１０３（３ＦＴ）に直接連結されている配列については、用いられる命名法は次の通りである：配列番号１０６（１～１１４９）－配列番号２７－配列番号１０３。この具体例はＮ末端から、配列番号１０６のアミノ酸１～１１４９で始まり、その直後に、ペプチド結合を介して直接連結された配列番号２７に対応するポリペプチドが続き、その直後に、同じくペプチド結合を介して連結された配列番号１０３に対応するポリペプチドが続く配列と解釈されるべきである。そのため、配列は、Ｎ末端からＣ末端まで、次のような構造を有し得る：
［配列番号１０６（１～１１４９の残基）］－［配列番号２７］－［配列番号１０３］
ここで、括弧「［ ］」内の配列はその配列内の全てのアミノ酸を表し、「－」は括弧内の２つの配列をつなぐペプチド結合を表す。或る特定の配列のｘからｙまでの残基とは、ｘ位からｙ位まで（ｘ位とｙ位の両方を含む）の全てのアミノ酸残基を意味する。例えば、配列番号１０６（１～１１４９の残基）は、配列番号１０６の残基１から残基１１４９まで（残基１と残基１１４９の両方を含む）を含む配列を意味する。
Figure 2023518596000010
Figure 2023518596000011
Figure 2023518596000012
Figure 2023518596000013
材料及び方法
材料：
オリゴヌクレオチドをEurofins genomicsから購入した。合成遺伝子をGENEWIZから購入した。クローニング用のＰｆｕ Ｕｌｔｒａ融合ポリメラーゼ及び全ての制限酵素をThermofisher Scientificから購入した。クローニングに使用したハイコンピテンシー細胞を、ＸＬ１０－Ｇｏｌｄケミカルコンピテント大腸菌から作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をATCCから購入した。ＤＮＡ精製キットをQiagenから購入した。全てのプラスミドはMacrogenにより配列決定された。Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、及び全ての緩衝塩をThermofisher Scientificから購入した。クマシーブリリアントブルー、ＭＧ－１３２プロテオソーム阻害剤、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ヨードアセトアミド、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＤＴＴ、ギ酸、ウシ胎児血清、及び大豆由来アソレクチンをSigma-Aldrichから購入した。アセトニトリル（ＡＣＮ）をCarlo-Erbaから購入した。ＥＤＴＡフリー完全プロテアーゼ阻害剤をRocheから購入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬、ＤＭＥＭ高グルコースＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント、ＲＰＭＩ１６４０培地ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント、ＲＩＰＡ溶解及び抽出バッファー、ＢＣＡタンパク質アッセイキット、ＭＥＳ－ＳＤＳランニングバッファー、前染色タンパク質ラダー、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｓ－ｔｒｉｓゲル及びＴｒｉｓ－酢酸ゲル）をThermofisher Scientificから購入した。一次抗６×Ｈｉｓタグマウスモノクローナル抗体、抗ｆｌａｇタグマウスモノクローナル抗体、抗ＡＢＣＡ４ウサギポリクローナル抗体、及び抗チューブリンウサギポリクローナル抗体をInvitrogenから購入した。二次抗体のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度交差吸着抗体ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ｐｌｕｓ ６８０及びヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体ｄｙｌｉｇｈｔ ８００ ４×ＰＥＧをInvitrogenから購入した。ドデシルマルトシド（Ｄ３１０）及びコレステリルヘミスクシネート（ＣＨ２１０）の溶液をAnatraceから購入した。トリプシンをPromegaから購入した。
機器：
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Thermo Scientific）質量分析計に接続したｎｏ Ａｃｑｕｉｔｙ液体クロマトグラファー（Waters）にて実施した。ゲル及びウエスタンブロットをＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒで撮像した。細胞溶解をＳＦＸ５５０ Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒを用いて実施した。ＦＡＣＳ測定をＧａｌｌｉｏｓ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒで行った。
組換えＤＮＡのクローニング
コンストラクトＡＢＣＡ４－１１５０－ＣｆａＮ（配列番号１）及びＡＢＣＡ４－１１５０－ＣｆａＣ（配列番号２）を調製するための合成遺伝子を購入し、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩの制限酵素を用いてｐＥＧＦＰ－Ｎ１発現ベクターに導入した。ＮｐｕＮ及びＮｐｕＣの合成遺伝子を購入し、制限酵素フリーのクローニングによりＡＢＣＡ４－１１５０－ＣｆａＮ及びＡＢＣＡ４－１１５０－ＣｆａＣに導入し、コンストラクトＡＢＣＡ４－１１５０－ＮｐｕＮ（配列番号８）及びＡＢＣＡ４－１１５０－ＮｐｕＣ（配列番号９）を得た。
コンストラクトＡＢＣＡ４－３ＦＴ（配列番号７）、ＡＢＣＡ４－１１４０－ＣｆａＮ（配列番号３）、ＡＢＣＡ４－１１４０－ＣｆａＣｍｕｔ（配列番号４）、ＡＢＣＡ４－１１８８－ＣｆａＮ（配列番号５）、ＡＢＣＡ４－１１８８－ＣｆａＣｍｕｔ（配列番号６）、ＡＢＣＡ４－１１７９－ＣｆａＮ（配列番号９３）及びＡＢＣＡ４－１１７９－ＣｆａＣｍｕｔ（配列番号９４）を制限酵素フリーのクローニングにより作製した。ＣｆａＣｍｕｔにおける突然変異を、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＦポリメラーゼを用いたインバースＰＣＲを使用して導入した。ＡＢＣＡ４－１１４０－ＮｐｕＮ（配列番号１０）、ＡＢＣＡ４－１１４０－ＮｐｕＣ（配列番号１１）、ＡＢＣＡ４－１１８８－ＮｐｕＮ（配列番号１２）及びＡＢＣＡ４－１１８８－ＮｐｕＣ（配列番号１３）を制限酵素フリーのクローニングによって調製した。
コンストラクトＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＮ（配列番号１４）、ＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＣ（配列番号１５）、ＥＧＦＰ（配列番号１６）、ＥＧＦＰ－７１－ＮｐｕＮ（配列番号１７）及びＥＧＦＰ－７１－ＮｐｕＣ（配列番号１８）を制限酵素フリーのクローニングで調製した。
ＳｏｐＥ用の合成遺伝子を購入し、制限酵素フリーのクローニングによりＡＢＣＡ４－１１５０－ＣｆａＮ、ＡＢＣＡ４－１１５０－ＣｆａＣ、ＡＢＣＡ４－１１４０－ＣｆａＮ、ＡＢＣＡ４－１１４０－ＣｆａＣ、ＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＮ及びＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＣに導入し、コンストラクトＡＢＣＡ４－１１５０－ＣｆａＮ－ＳｏｐＥ（配列番号１９）、ＡＢＣＡ４－１１５０－ＣｆａＣ－ＳｏｐＥ（配列番号２０）、ＡＢＣＡ４－１１４０－ＣｆａＮ－ＳｏｐＥ（配列番号２１）、ＡＢＣＡ４－１１４０－ＣｆａＣ－ＳｏｐＥ（配列番号２２）、ＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＮ－ＳｏｐＥ（配列番号２３）及びＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＣ－ＳｏｐＥ（配列番号２４）を得た。オーバーラップ伸長ＰＣＲによりＤＤ１用の遺伝子を調製し、制限酵素フリーのクローニングによりＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＮ及びＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＣに導入し、コンストラクトＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＮ－ＤＤ１（配列番号２５）及びＥＧＦＰ－７１－ＣｆａＣ－ＤＤ１（配列番号２６）を得た。全ての組換えプラスミドの同一性は配列決定により確認され、対応するタンパク質の配列を表１に報告する。デグロンを含むコンストラクトを、スプリットタンパク質遺伝子、スプリットインテイン、及びデグロンを含む異なる要素を発現プラスミドにクローニングすることで同様に作製した。
ＡＡＶの産生
ＣｆａＮインテインを有するＥＧＦＰフラグメント又はＡＢＣＡ４フラグメントをコードする本発明のＮフラグメントをコードするＡＡＶを、標準的なトリプルトランスフェクション戦略を用いて製造した。野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するｒＡＡＶ８ベクターを、プラスミドｐＡＡＶ－Ｒｅｐ２－Ｃａｐ８、ｐＨｅｌｐｅｒ及びＡＡＶ－導入遺伝子プラスミドのＨＥＫ２９３細胞へのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介同時トランスフェクションにより製造した。
細胞及び培地を、トランスフェクションの４８時間後に採取した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎを用いる処理の後、細胞からウイルスを放出し、ＰＥＧ沈殿により培養培地からＡＡＶ粒子を得た。粗溶解物の精製及び空カプシドの除去を、Zolotukhinらの方法に従ってイオジキサノール勾配により行った［Zolotukhin S, Byrne BJ, Mason E, Zolotukhin I, Potter M, Chestnut K, Summerford C, Samulski,RJ, Mucyczka N. (1999) Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther; 6(6):973-85.］。
精製したバッチを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ １００．０００ ＭＷＣＯ（Sartorius、カタログ番号ＶＳ０６４１）を用いて、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）で決定した場合に最終濃度１×１０１３ｖｇ／ｍｌまで濃縮し、製剤化した。使用した製剤用バッファーは、ＢＳＳ（Alcon）＋Ｐｌｕｒｏｎｉｃを特徴とする。
濃縮後、ウイルスバッチをＡｃｒｏｄｉｓｃ（商標）シリンジフィルター（Acrodisc PP、ＰＥＳ、０．２μＭ １ｃｍ２）を用いて濾過し、－８０℃で保存した。ＩＴＲ特異的ＰＣＲプライマーを用いたｑＰＣＲにより、１ミリリットルあたりのゲノムコピー数に関してウイルス力価を決定した。さらに、ＡＡＶ８ ＥＬＩＳＡ（Progen）を用いて、製造者の指示に従ってカプシド力価を得た。最終産物中に存在する１×１０１０ｖｇに相当するタンパク質を、タンパク質の可視化のためにＰｉｅｒｃｅ銀染色キット（カタログ番号２４６１２）を使用して１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した。ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質、及びＶＰ３タンパク質は１：１：１０の正しい化学量論で検出可能であり、ＡＡＶ調製物の純度が９５％超であることを示す。
ＨＥＫ２９３細胞におけるインテインプラスミドのトランスフェクション：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭにて、３７℃の６％ＣＯ２雰囲気で維持した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び各プラスミド１．２５μｇを用い、６ウェルプレートフォーマットで、約８０％コンフルエントな状態で細胞を同時トランスフェクトした。全長遺伝子をコードするプラスミドを用いた実験では、２つのインテインプラスミドを用いた場合にトランスフェクトされたＤＮＡが同じ量になるように、スクランブルプラスミドを完全長プラスミドと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を採取し、ＥＧＦＰをウエスタンブロットにより分析した。
ＨＥＫ２９３細胞におけるデグロン－インテインプラスミドのトランスフェクション：
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び各プラスミド１．２５μｇを用い、６ウェルプレートフォーマットで、約８０％コンフルエントな状態で細胞を同時トランスフェクトした。インテイン－デグロンプラスミドでトランスフェクトした細胞をトランスフェクションの４８時間後に採取し、ウエスタンブロットで分析した。タイムコース実験では、トランスフェクションの２４時間及び４８時間後に細胞を採取し、ウエスタンブロットで分析した。
プロテオソーム阻害剤実験を、ＭＧ－１３２阻害剤を用いて実施した。細胞を同時トランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にＤＭＳＯ又はＭＧ－１３２（ＤＭＳＯに溶解）を最終濃度５０□Ｍとなるように添加した。３０分後、３時間後、６時間後、及び２４時間後に細胞を採取し、ウエスタンブロットで分析した。
ウエスタンブロット分析：
ＥＧＦＰをトランスフェクトした細胞（ＨＥＫ２９３細胞及びＷＥＲＩ－ＲＢ１細胞）を、プロテアーゼ阻害剤及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルを添加したＲＩＰＡバッファーに溶解した。溶解後、試料をＢＣＡタンパク質アッセイキットで定量した。総タンパク質が１０μｇの試料を１×Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファーにおいて９５℃で１０分間変性させた。溶解物を１２％Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより１６５Ｖで４０分間分離した。イムノブロッティングに使用した抗体は、ＥＧＦＰを検出するための抗６×Ｈｉｓタグ及びローディング対照としての抗β－チューブリンであった。ウエスタンブロットにより検出されたＥＧＦＰバンドの定量を、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒを使用して実施した。
ＡＢＣＡ４をトランスフェクトした細胞（ＨＥＫ２９３）を、プロテアーゼ阻害剤及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルを添加したＰＢＳ（１：１）中のドデシルマルトシド（Ｄ３１０）及びコレステリルヘミスクシネート（ＣＨ２１０）溶液に溶解した。溶解後、ＡＢＣＡ４試料をＢＣＡタンパク質アッセイキットで定量した。総タンパク質が２５μｇの試料を、２．５ｍｇ／ｍｌのアソレクチンを含む１×Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファーにおいて３７℃で１５分間変性させた。溶解物を３％～８％Ｔｒｉｓ－酢酸ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより１５０Ｖで１．５時間分離した。イムノブロッティングに使用した抗体は、ＡＢＣＡ４タンパク質を検出するための抗ｆｌａｇタグ又は抗ＡＢＣＡ４のいずれか、及びローディング対照としての抗β－チューブリンであった。ウエスタンブロットにより検出されたＡＢＣＡ４バンドの定量を、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒを使用して実施した。
蛍光活性化セルソーティング測定：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を各ＥＧＦＰ－インテインプラスミド２μｇで同時トランスフェクトし、陰性対照としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養したが、トランスフェクションは行わなかった。全長遺伝子をコードするプラスミドを用いた実験では、２つのインテインプラスミドを用いた場合にトランスフェクトされたＤＮＡが同じ量になるように、スクランブルプラスミドを完全長プラスミドと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞をフローサイトメトリーにより分析した。トランスフェクションした細胞とトランスフェクションしていない細胞とをそれぞれＦＡＣＳ分析バッファー（ＰＢＳ、２％ＦＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。ＥＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターで、Ｋａｌｕｚａフローサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて、異なるトランスフェクトした細胞とトランスフェクトしていない細胞とを比較することによって評定した。Ｄａｐｉ染色を使用して、死細胞の数を検出した。
質量分析による分析：
ゲルバンドを炭酸水素アンモニウム（５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）及びアセトニトリル（ＡＣＮ）で洗浄した。２０ｍＭ ＤＴＴで６０℃、６０分間試料を還元した後、５５ｍＭ ヨードアセトアミドで２５℃、３０分間暗所下でアルキル化した。その後、トリプシン（配列等級改変トリプシン）で３７℃にて２時間及び一晩、二重に消化した。最後に、得られたペプチド混合物を、５０％ＡＣＮ中の５％ギ酸（ＦＡ）及び１００％ＡＣＮでゲルマトリクスから抽出し、ＳｐｅｅｄＶａｃ真空システムで乾燥させた。得られたペプチド混合物を、製造業者のプロトコルに従ってＣ１８チップ（PolyLC Inc.）でクリーンアップした。最後に、クリーンアップしたペプチド溶液を乾燥させた。トリプシン消化混合物を１％ＦＡ溶液に再懸濁し、各試料について、クロマトグラフィー分離のためにアリコートを注入した。ペプチドをＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８捕捉カラム（５μｍ １８０μｍ×２０ｍｍ；Waters）に捕捉し、Ｃ１８逆相キャピラリーカラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｍ－クラス ペプチドＢＥＨカラム；１３０Å、１．７μｍ、７５μｍ×２５０ｍｍ、Waters）を用いて分離した。ペプチドの溶出に用いた勾配は、流量２５０ｎＬ／分で、１％→４０％Ｂを２５分、続いて４０％→６０％を５分（Ａ：０．１％ＦＡ；Ｂ：１００％ＡＣＮ、０．１％ＦＡ）であった。溶出したペプチドをエミッターニードル（ＰｉｃｏＴｉｐ（商標）、New Objective）で、印加電圧２０００Ｖのエレクトロスプレーイオン化に供した。ペプチドの質量（ｍ／ｚ３００～１７００）を、データ依存モードで分析し、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて４００ｍ／ｚで分解能６００００ＦＷＨＭにてフルスキャンＭＳを取得した。各ＭＳスキャンから１５番目に多いペプチド（最小強度５００カウント）を選択し、次いでヘリウムをコリジョンガスとするＣＩＤ（３８％正規化衝突エネルギー）を用いてリニアイオントラップでフラグメント化した。データベース検索を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用し、Ｓｅｑｕｅｓｔ ＨＴ検索エンジンで行った。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験
実験を４週齢の野生型動物、１２９Ｓｖ系統で行った。マウスに試験試料を網膜下注射した。
５ｍｌのハミルトン注射器に３３Ｇの注射針を使用し、瞳孔散大後に網膜下注入を行った。注射後４週間のＥＧＦＰ発現眼底評価を、デジタルイメージングシステムに接続されたＣａｎｏｎ ＵＶＩ網膜カメラを用いて行った。Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓイメージングシステム（Heidelberg Engineering Inc.）を用いたＳＤ－ＯＣＴ（Optical Coherence Tomography）により、網膜構造及び外顆粒層（ＯＮＬ）の定量を評価した。撮像後、動物を安楽死させ、免疫組織化学及びウエスタンブロットによる更なる分析のため眼球摘出を行った。さらに、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの内耳にベクターを注入する実験も行った。
結果及び考察
最近、コンセンサスデザインに基づいて、幾つかの新しいインテインが設計され（Stevens et al., 2016; Stevens, Sekar, Gramespacher, Cowburn, & Muir, 2018）、天然由来のインテインよりも優れた特性を持つことが示された。Ｃｆａと呼ばれるこれらのインテインの１つは、ＤｎａＥインテインのアラインメントからコンセンサスデザインによって生成され、Ｎｐｕ等のＤｎａＥファミリーの最も優れたインテインの幾つかよりも優れた特性を有することが示された。Ｃｆａは、より速い速度、高い発現レベル、高温及び高濃度の変性剤等の極限条件に対する高い耐性を持つことが報告されている。興味深いことに、相同性の程度が９０％以上のＣｆａ変異体も同様の特性を示す。同じコンセンサスデザイン戦略をＴｅｒＬ－ＡｃｅＬインテインファミリーにも適用した結果、Ｃａｔと呼ばれるコンセンサス配列が得られ、これもＴｅｒＬ－ＡｃｅＬファミリーの残りのメンバーに比べて改善された特性を示した。
コンセンサスインテインが遺伝子治療用途のタンパク質トランススプライシングによるタンパク質の再構成に有益であることを示すため、直接比較を行った。精製したプラスミドで細胞をトランスフェクションすることにより比較を行った。
最初の実験を、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰを使用して行った。簡潔に言えば、ＥＧＦＰを７１位で分割し、Ｎ末端フラグメント（残基１～７０、ＥＧＦＰＮ）をＮ－インテインに、Ｃ末端フラグメント（残基７１～２３９、ＥＧＦＰＣ）をＣ－インテインに組換えにより融合させた。Ｃｆａコンセンサス配列とＮｐｕとの再構成効率を比較するため、以下の４つのコンストラクトを生成した：ＥＧＦＰＮ－ＣｆａＮ、ＥＧＦＰＮ－ＮｐｕＮ、ＣｆａＣ－ＥＧＦＰＣ、及びＮｐｕＣ－ＥＧＦＰＣ。培養ＨＥＫ２９３細胞を、Ｎ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをコードするプラスミドで等モル量にて同時トランスフェクトし、スプライシング効率を蛍光顕微鏡検査、フローサイトメトリー分析及びウェスタンブロッティングでモニターした。
本発明者らの結果（図２、図３及び図４を参照されたい）は、コンセンサスＣｆａインテインはＮｐｕインテインと比較してＥＧＦＰ再構成の２．５倍の増加を提供し、コンセンサスデザインによって得られたインテインは同時トランスフェクトの際により収量の多い標的タンパク質を提供することを示す。Ｃｆａがｉｎ ｖｉｔｒｏでＮｐｕよりも速い速度で分裂すること、そのＮ末端フラグメントを個別に細胞に形質転換又はトランスフェクトするとより良好に発現することは知られていたが、その結果、両方のフラグメントを同じ細胞に同時トランスフェクトした場合に利点があるかどうかは示されていなかったということは重要な点であった。これらの実験を通して、本発明者らは、ＩｎｔＮとＩｎｔＣの両フラグメントが同じ細胞内で発現される場合、Ｎｐｕ等の既知の超高速スプリットインテインに比べＣｆａを使用することで、標的タンパク質の再構成収率に明らかな利益を提供することを実証した。また、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達のため、ＥＧＦＰのＮフラグメントとＣフラグメント、及びＮ－インテインとＣ－インテインをコードする遺伝子を組換えＡＡＶに組み込んだ。結果は、Ｃｆａインテイン媒介タンパク質スプライシングにより、網膜及び内耳を含む幾つかの器官でＥＧＦＰが再構成されることを実証した（図２３）。
このＣｆａコンセンサス配列のポジティブな特徴が他のタンパク質でも観察されることを確認するため、本発明者らは、ＡＢＣＡ４タンパク質を用いて実験を繰り返した。ＡＢＣＡ４は、シュタルガルト病で突然変異している大型タンパク質であり、その再構成が疾患の治療に実行可能な戦略として提案されている。現在、ＡＡＶ遺伝子治療に基づく幾つかのアプローチが、ＡＢＣＡ４タンパク質を再構築するため探索されている。ＡＢＡＣＡ４はサイズが大きいため、単一のＡＡＶに封入することができず、そのため、ＡＢＣＡ４を２つのフラグメントに分けて送達し、標的細胞内で再構成することができる様々な戦略が提案されている。Ｃｆａ等の操作されたコンセンサス配列がＮｐｕ等の天然由来のインテインよりも利益をもたらすことを確認するため、本発明者らは、ＡＢＣＡ４を１１５０位で分割し、Ｎ－インテインとＣ－インテインをそれぞれタンパク質のＮ末端フラグメントとＣ末端のフラグメントにクローニングした。
ＡＢＣＡ４Ｎ（１～１１４９）－ＩｎｔＮ及びＩｎｔＣ－ＡＢＣＡ４Ｃ（１１５０～２２７３）とＣｆａ又はＮｐｕのインテインとを発現プラスミドにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。細胞を溶解し、タンパク質の再構成収率をウエスタンブロットにより決定した。対照となる全長ＡＢＣＡ４も同時トランスフェクトした。
ＥＧＦＰで観察されたように、本発明者らは、ＣｆａではＮｐｕよりも高い再構成収率を観察した（図５を参照されたい）。
また、ＣｆａＣフラグメントに特定の突然変異を含むＣｆａＣｍｕｔ（Stevens et al., 2017）と呼ばれるＣｆａの変異体が最近報告され、Ｃｆａの利点に付加価値を与えている。特にＣｆａＣｍｕｔ変異体は、Ｃ－エクステインの＋２位に本来のＰｈｅ残基がなくても、タンパク質フラグメントを効率的にスプライスできることが示されている。上記で定義した＋２位とは、ＩｎｔＣの最後のアミノ酸から相対的に＋２された位置を意味する。ＡＢＣＡ４が１１５０位で分割されると、Ｃエクステイン＋２位にＰｈｅが残り、これはＣｆａと同様にＮｐｕに最適な残基である。
ＡＢＣＡ４は１１５０位で分割することにより再構成できるにもかかわらず、これは治療目的としては最適な位置ではないかもしれない。ＡＢＣＡ４を１１５０とは異なる部位で分割して再構成する能力を試験するため、本発明者らは、インテインに対して＋２位のＰｈｅを与える位置に限定されないように、ＣｆａＣｍｕｔを使用した。
ＡＢＣＡ４タンパク質を、分割部位の＋２位にＰｈｅを含まない部位で分割したＡＢＣＡ４コンストラクトを幾つかクローニングした。＋２部位のＳｅｒに相当する１１４０位と、＋２部位のＰｒｏに相当する１１８８位の２つの追加の部位を試験した。コンストラクトを上記に示すようにクローニングし、試験した。具体的には、ＡＢＣＡ４（１～１１３９）－ＩｎｔＮ、ＩｎｔＣ－ＡＢＣＡ４（１１４０～２２７３）のコンストラクトを用いて、１１４０位でのＡＢＣＡ４のスプライシングを評価した。また、ＡＢＣＡ４（１～１１８７）－ＩｎｔＮ及びＩｎｔＣ－ＡＢＣＡ４（１１８８～２２７３）ではＡＢＣＡ４の１１８８位での分割を評価した。ＡＢＣＡ４のトポロジー構造に基づいて、折り畳まれたドメインの存在を考慮しながら、部位を選択した。ＡＢＣＡ４の細胞内側のよく折り畳まれたドメインの外側にある部位を選択した。異なる部位を試験したところ、いずれもＣｆａ及びＣｆａの変異体はＮｐｕよりも高い再構成収率を提供し、分割部位によって効率も異なることが観察された（図５、図６、及び図７）。本発明者らはまた、このアプローチにより、１１７９位と１１７７位でのＡＢＣＡ４の分割を再構成できることも実証した。１１４０及び１１８８について上記で定義したものと類似のコンストラクトをクローニングし、１１７９位と１１７７位でのスプライシングの効率を試験するために使用し、１１７９位での結果を図２１に示す。
本発明者らはまた、ｇｐ４１等の他の効率的なインテインを使用して、分割されたフラグメントからＡＢＣＡ４を再構成できることも実証した。１１８５位と１０９５位で分割したＡＢＣＡ４コンストラクトを設計し、Ｎ末端とＣ末端のインテインに対応する融合体をクローニングして、上記のようにスプライシング活性を分析した。分割位置１０９６とｇｐ４１インテインでのＰＴＳ反応のウエスタンブロットによる分析を図２２に示す。
以下の表７は、タンパク質を異なる部位（１１７７、１１７９、１０９６、及び１１８５）で分割したときに得られるＡＢＣＡ４フラグメントの配列、及び対応するＡＢＣＡ４－インテインＮ又はインテインＣ－ＡＢＣＡ４融合体の配列を示す。
遺伝子治療におけるスプリットインテインの使用には、再構成収率以外に、未反応の出発物質及び／又はインテインの存在という大きな制約がある。望ましくない出発物質の蓄積を防ぎ、切り取られたインテインフラグメントを排除するために、本発明者らは図８に示す一般的な構造を持つコンストラクトにデグロンを追加した。
本発明者らは、ＡＢＣＡ４に対する遺伝子治療アプローチを開発するためにインテインと組み合わせて使用することができる幾つかのデグロンを特定し、これは、他の大型遺伝子上の突然変異によって引き起こされる疾患にも転用可能であり、またそれらの疾患を治療するためのタンパク質の再構成、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの再構成に転用可能である。
デグロン－インテインの適切な組合せを特定するために、選択されたデグロンを含むＥＧＦＰ－Ｉｎｔコンストラクトをクローニングした。デグロンをＮ－インテインのＣ末端、及びＣ－インテインのＮ末端でクローニングした。検出目的のため、２つのエレメントの間にリンカーとしてＨｉｓ６タグを含めた。原理証明として、ＳｏｐＥ不安定化ドメイン（１～１００）、及びペプチド配列ＤＤ１からなるデグロン（表３を参照されたい）を使用した。
結果は、デグロンを含めることで、あらゆる検出可能な量の出発物質及びインテインが実際に除去されることを示す（図９、図１４を参照されたい）。重要なことは、予想外に、両方のデグロンを同時に含むことで、タンパク質スプライシング反応の収率を落とすことなく、あらゆる未反応の出発物質を除去できることが実証された。
興味深いことに、デグロン戦略を大型の遺伝子ＡＢＣＡ４に適用したところ、本発明者らは、同様の結果を観察したが、スプライシングされたＡＢＣＡ４産物のレベルも上昇し、コンセンサスインテインとデグロンとの予想外の相乗効果を示す（図１０を参照されたい）。
これらの結果に対するプロテオソームの阻害剤の効果も検討した（図１１）。本発明者らは、プロテオソーム阻害剤がデグロンの効果を減少させることを示し、したがってＳｏｐＥの分解がプロテオソームによって媒介されることを確認した。興味深いことに、本発明者らは、インテインとデグロンを組み合わせることで、本発明者らが出発物質の存在を排除できただけでなく、ＡＢＣＡ４の再構成レベルを維持し、更には高めることが可能であったことを確認した（図１０）。
本発明者らはまた、コンセンサスインテインのＣｆａとデグロンを組み合わせた場合の効果を調べる実験を行い、デグロンがない場合又は他のインテインを用いた場合との比較を行った。興味深いことに、本発明者らは、デグロンと共にＣｆａを使用すると、出発物質のレベルが非常に著しく低下し、産物の量も増加することを観察した（図１２）。本発明者らはまた、この効果がＡＢＣＡ４の１１４０位（図１３及び図２１）及び１１７９位（図２１）でも観察されたことを確認した。重要なことに、本発明者らは、或る特徴を共有する幾つかの異なるデグロンとＣｆａ（及びＣｆａｍｕｔ）インテインを組み合わせることで観察される効果が維持されることを示した（実施例３を参照されたい）。
ＡＢＣＡ４で得られた結果に基づいて、このアプローチを適用できる他の疾患、遺伝子、及びタンパク質として、表１に示されるものが挙げられる。
実施例２．オルソゴナルスプリットインテイン対を用いた３ピースライゲーション戦略
材料及び方法：
ＨＥＫ２９３細胞における３ピースプラスミドのトランスフェクション：
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び各プラスミド１．２５μｇを用い、６ウェルプレートフォーマットで、約８０％コンフルエントな状態で細胞を同時トランスフェクトした。３ピースプラスミドでトランスフェクトした細胞をトランスフェクションの４８時間後に採取し、ウエスタンブロットで分析した。対照として、細胞を２つのプラスミド（ＰＯＩＮ－ＣｆａＮ＋ＣｆａＣ－ＰＯＩＭ－ＣａｔＮ、ＣｆａＣ－ＰＯＩＭ－ＣａｔＮ＋ＣａｔＣ－ＰＯＩＣ、及びＰＯＩＮ－ＣｆａＮ＋ＣａｔＣ－ＰＯＩＣ）で同時トランスフェクトした。
ウエスタンブロット分析：
３ピーストランスフェクションを行った細胞（ＨＥＫ２９３）を、プロテアーゼ阻害剤及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルを添加したＲＩＰＡバッファーに溶解した。溶解後、試料をＢＣＡタンパク質アッセイキットで定量した。総タンパク質が１０μｇの試料を１×Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファーにおいて９５℃で１０分間変性させた。溶解物を１２％Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより１６５Ｖで４０分間分離した。イムノブロッティングに使用した抗体は、ＰＯＩを検出するための抗ｆｌａｇタグ、及びローディング対照としての抗β－チューブリンであった。
結果
本発明者らは、超高速コンセンサスインテインとデグロンとを組み合わせることは、出発物質及び切り取られたインテインのレベルを減らしながら、大型タンパク質を再構成する実行可能な戦略であることを示した。この戦略は、本明細書において開示されるような適切な送達ベクターと組み合わせれば、遺伝子治療において、遺伝子置換戦略で大型タンパク質を再構成し、またｉｎ ｖｉｖｏで治療薬を生成するために使用できる可能性がある。しかしながら、更に大型のタンパク質の場合、この戦略では不十分であるかもしれない。例えば、コーディング領域が７ｋｂ～８ｋｂより大きいタンパク質の場合、そのコーディング遺伝子を２つのフラグメントに分割しても、ＡＡＶベクターに封入できるフラグメントを得るには十分ではない。かかるタンパク質の場合、コーディング遺伝子を３つのピースに分割する必要がある可能性がある。インテインを使って３つの別々のフラグメントからタンパク質を組み立てるには、オルソゴナルインテイン対が必要である。最大限の再構成収率を達成するためには、高効率でオルソゴナルなインテインが必要である。本発明者らは、ＣｆａインテインをＣａｔインテインと組み合わせて使用することにした。これら２つのインテインはコンセンサスデザインによって得られたものであり、高い発現収率、耐熱性、カオトロピック剤への耐性、及び速いスプライシング速度を含む幾つかの共通する特徴を共有する。本発明者らは、図１６に説明する構造に従って、一連のコンストラクト：ＰＯＩＮ－ＣｆａＮ、ＣｆａＣ－ＰＯＩＭ－ＣａｔＮ、及びＣａｔＣ－ＰＯＩＣを設計した。代替的には、Ｃｆａインテイン及びＣａｔインテインの位置を入れ替えて、以下のような構造：ＰＯＩＮ－ＣａｔＮ、ＣａｔＣ－ＰＯＩＭ－ＣｆａＮ、及びＣｆａＣ－ＰＯＩＣを持つコンストラクトを生成することもできる。
本発明者らが、それらのオルソゴナリティを試験したところ、両インテインは確かにオルソゴナルであり、互いに反応しないこと、すなわちＣｆａ又はＣａｔインテインのＮフラグメントは、それぞれの同族対にのみ反応することを実証した。３つのフラグメントを等モル量で同時トランスフェクトした場合、検出された主な産物は、３つのフラグメントが全長の所望の産物に組み立てることによって生じるものであった。重要なことは、本発明者らは、未反応の物質を低レベルで検出したにすぎず、また本発明者らは、中間産物（すなわち、２つのフラグメントのみの反応から生じる産物）も検出しなかった。この結果は、オルソゴナルなコンセンサスインテインの高活性対を使用することが、３つの個別フラグメントから大型のタンパク質を組み立てるのに適した戦略であることを示す。
実施例３．
本発明を実施するために、幾つかのデグロンを試験した。ＡＡＶ遺伝子治療への適用のためには、得られる導入遺伝子のサイズを最小にするために７５アミノ酸より小さいデグロンが望ましいことから、デグロンをそのサイズに基づいて文献から選択した。幾つかの例では、既知のＮ末端又はＣ末端のデグロンを組み合わせて設計した。
デグロンをＮフラグメントのＣ末端とＣフラグメントのＮ末端にクローニングし、いずれも可溶性細胞質タンパク質の代表例として全長ＥＧＦＰタンパク質の再構成を意図したフラグメントであった。図９に結果の概要を見ることができ、１個又は２個のデグロン（各ＥＧＦＰフラグメントに１個ずつ）を含めると、スプライシング収率に悪影響を与えずに望ましくない出発物質フラグメントを排除できることがわかる。異なるデグロンでも同様の結果が得られ（図１４）、アプローチの汎用性が示された。
デグロンをＮフラグメントのＣ末端とＣフラグメントのＮ末端にクローニングし、いずれも、代表例として１１４０、１１５０、及び１１７９を含む異なる分割位置で全長のＡＢＣＡ４タンパク質を再構成することを意図したフラグメントであった。以下の表６に、サイズ、配列、それらの起源、及びまたユビキチン化と最終的な分解に関与するリガーゼを含めて、試験した全てのデグロンを示す。
Figure 2023518596000014
デグロンが出発物質及び切り取られたインテインの分解を誘導できるかどうかを確認し、また、タンパク質トランススプライシング反応の収率、すなわち全長のＡＢＣＡ４タンパク質を再構成する能力への影響を確認するためにデグロンを試験した。細胞を、上記に示した異なるデグロンを含むＮ末端及びＣ末端コンストラクトで同時トランスフェクトした。細胞を溶解し、ウエスタンブロットで分析し、デグロンあり及びなしにて、ＰＴＳ産物の存在を検出した。図１８では、ＮフラグメントとＣフラグメントで同じデグロンを使用した結果を示す。左図のゲル（図１８Ｃ）は、各反応のＰＴＳ産物（ＡＢＣＡ４）、及び出発物質（ＡＢＣＡＮ－ＩｎｔＮ－ＤＤ及びＤＤ－ＩｎｔＣ－ＡＢＣＡＣ）を示す。ＰＴＳはデグロン未使用時の結果に対応し、他のレーンのラベルはそれぞれの場合でどのデグロンを使用したかを示す。右図（図１８Ｃ）は、それぞれの場合のＰＴＳ産物の量の定量を提供する。意外にも幾つかのデグロンはデグロンなしのコンストラクトよりも高い収率を示すことがわかる。興味深いことに、全てのデグロンが機能し、全てのデグロンで、デグロンなしで得られた産物の少なくとも２５％を再構成することができる。デグロンによっては、デグロンなしで得られたレベルの５０％超を再構成できるものもあり、最終的には１００％（又はそれ以上）の再構成をもたらすデグロンもある。特に、１００％（又はそれ以上）の再構成が得られるデグロンとしては、以下のものが挙げられた：ＤＤ１、Ｖ１２、Ｍ４、Ｌ２、Ｌ９、ＤＤ３、及びＳｏｐＥ１００。
また、切り取られたインテインに対するデグロンの効果も調べた（図１９）。異なるデグロンによるＰＴＳ反応を、高率アクリルアミドゲルを用いたＷＢ（ウエスタンブロット）により分析してインテインを検出した。見てわかるように、幾つかのデグロンは他のもの（例えばＳｐｏＥやＰＥＳＴ）に比べて切り取られたインテインの量を減らし、他のものはＬ２（配列番号５２）、Ｌ９（配列番号５４）、Ｍ２（配列番号４７）、Ｍ４（配列番号３５）又はＤＤ３（配列番号４５）のようにインテインバンドを完全に排除する。
さらに、本発明者らは、Ｎ末端又はＣ末端の位置に異なるデグロンを使用した場合の効果を調べる実験も行った。例として、図２０に、本発明者らは、Ｎフラグメントにデグロンを固定し、Ｃフラグメントのデグロンを変化させたウエスタンブロット分析を示す。図２０に示す結果は、好ましいデグロンを幾つか組み合わせることで、所望のスプライシング産物の収率を低下させることなく、出発物質の更なる削減を達成し、結果を更に改善することができることを示す。これらの組合せは、或る特定の適用、特に全ての出発物質を完全に排除することが重要な場合に有用であると考えられる。
得られた結果に基づいて、本発明者らは、デグロンを３つのカテゴリーに分類することができた：
デグロンがない場合に得られた収率の少なくとも２５％で標的タンパク質の再構成を可能にするデグロン。
デグロンがない場合に得られた収率の約５０％超で標的タンパク質の再構成を可能にするデグロン。
デグロンがない場合と同等以上の収率で標的タンパク質の再構成を可能にするデグロン。
ＣｆａＮとＣｆａＣ又はＣｆａＣｍｕｔインテインとの組合せを使用する場合、ＡＢＣＡ４中の幾つかの部位が、本明細書で述べた発明の使用に適していることが示された。具体的には、１１４０位、１１５０位、１１７７位、１１７９位、及び１１８８位を含む、ヌクレオチド結合ドメイン１（ＮＢＤ１）のＣ末端と第７膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）との間の部位である。ＡＢＣＡ４再構成の収率は１１４０位、１１５０位、及び１１７９位で最も高く、１１８８位は非常に低い効率で機能したが、それでも非コンセンサスＮｐｕインテインを用いて得られたものよりも高いレベルのＡＢＣＡ４再構成をもたらした。
ＣｆａＮ及びＣｆａＣｍｕｔインテインの組合せは、曖昧さの増加を提供する。実際、本発明者らは、ＡＢＣＡ４等の膜貫通型タンパク質では、この曖昧さの増加が観察され、異なるスプライシング部位でＣｆａＮ－ＣｆａＣ突然変異対を用いると高い再構成収率が得られることを今回初めて明らかにした。さらに、かかるスプライシング反応は、これらのインテイン（ＣｆａＮ及びＣｆａＣｍｕｔインテイン）を用いた場合、それぞれの出発物質の１０％未満しか観察されない（図１２に記載したように推定）ことから非常に有効であることが示され、このことは、出発物質のかなりの部分が反応せずに残っており、かかる膜タンパク質ではタンパク質－トランススプライシングは本質的に困難であることが示唆された、以前に報告されたＮｐｕインテインとＡＢＣＡ４とを用いた結果（Auricchio et al. 2019）からは予想できなかった。
本明細書で報告された結果に基づき、本発明者らは、コンセンサスインテインＣｆａＮ及びＣｆａＣの突然変異対を使用する場合、以下の特徴を有する任意の部位が効率的に機能すると結論づける：（１）酵素ドメイン又は膜貫通ドメイン外にある部位、（２）分割部位＋１位（前述）等がＣｙｓ又はＳｅｒ等の求核性残基に対応するはずであり、＋２位はＰｒｏを除く任意の部位となる部位。
Figure 2023518596000015
項目
１．組成物であって、
ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリヌクレオチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリヌクレオチドをコードする第２のポリヌクレオチドとを含み、
組成物の両方の成分が、単一の製剤中に共に充填されてもよく、又は異なる製剤中に別々に充填されてもよく、
第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、両方のフラグメントが組み合わされた場合、タンパク質のＮ末端フラグメントがタンパク質のＣ末端フラグメントに連結されて、タンパク質全体を生成するように、それぞれ、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをコードし、
各ポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されると、Ｎ末端及びＣ末端の配列が、トランススプライシング反応に機能的なインテインへと非共有結合で再会合又は再構成することができる別々のフラグメントとなるように、スプリットインテインをコードしなければならず、
再構成されるタンパク質が２５ＫＤａ超である、組成物。
２．第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結されたスプリットインテインＮフラグメントをコードし、デグロンが、インテインＮフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＣ末端を介してインテインＮフラグメントに連結され、スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結されたスプリットインテインＣフラグメントをコードし、デグロンが、インテインＣフラグメントとデグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、インテインのＮ末端を介してインテインＣフラグメントに連結され、スプリットインテインＣフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結される、項２に記載の組成物。
３．第１のポリヌクレオチドが配列番号２７のＣｆａＮインテイン又はその変異体のいずれかをコードし、第２のポリヌクレオチドが配列番号２８のＣｆａＣインテイン又はその変異体のいずれかをコードし、変異体が、ＣｆａＣｍｕｔ（配列番号２９）等のこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列番号２７又は配列番号２８のスプリットインテインＮフラグメント又はＣフラグメントとして理解される、項１又は２に記載の組成物。
４．デグロンが配列番号４０～配列番号５９、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３７からなる群より選択される、項２又は項３に記載の組成物。
５．スプリットインテインが請求項３で定義された通りであり、デグロンが配列番号４２、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５４及び配列番号３４からなる群より選択される、項２に記載の組成物。
６．両方のポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞における上記ポリヌクレオチドの伝播を可能にするベクター内に含まれる、項１～項５のいずれかに記載の組成物。
７．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項６に記載の組成物。
８．ベクターが血清型１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のＡＡＶである、項７に記載の組成物。
９．タンパク質全体をコードする遺伝子が、表１に収載されるタンパク質のいずれかからなる群より選択される、項１～項８のいずれかに記載の組成物。
１０．治療に使用される、項１～項９のいずれかに記載の組成物。
１１．細胞内で目的の遺伝子を発現させる方法であって、
（ｉ）細胞を、
（ａ）項１に規定される第１のポリヌクレオチド、及び、
（ｂ）項１に規定される第２のポリヌクレオチドと接触させることと、
（ｉｉ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が産生されるように、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを発現させることと、
（ｉｉｉ）スプリットインテインＮフラグメントがスプリットインテインＣフラグメントに結合してインテイン中間体を形成し、インテイン中間体が反応して、目的の第１のポリペプチドのＣ末端を目的の第２のポリペプチドのＮ末端に共有結合するように、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させることと、
を含む、方法。
１２．細胞内で目的の遺伝子を発現させる方法であって、
（ｉ）細胞を、
（ａ）項２に規定される第１のポリヌクレオチド、及び、
（ｂ）項２に規定される第２のポリヌクレオチドと接触させることと、
（ｉｉ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が産生されるように、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを発現させることと、
（ｉｉｉ）スプリットインテインＮフラグメントがスプリットインテインＣフラグメントに結合してインテイン中間体を形成し、インテイン中間体が反応して、目的の第１のポリペプチドのＣ末端を目的の第２のポリペプチドのＮ末端に共有結合するように、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを接触させることと、
を含む、方法。
１３．第１のポリヌクレオチドが配列番号２７のＣｆａＮインテイン又はその変異体のいずれかをコードし、第２のポリヌクレオチドが配列番号２８のＣｆａＣインテイン又はその変異体のいずれかをコードし、変異体が、ＣｆａＣｍｕｔ（配列番号２９）等のこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列番号２７又は配列番号２８のスプリットインテインＮフラグメント又はＣフラグメントとして理解される、項１１又は１２に記載の組成物。
１４．スプリットインテインが請求項３で定義された通りであり、デグロンが配列番号４２、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５４及び配列番号３４からなる群より選択される、項１１又は１２に記載の方法。
１５．両方のポリヌクレオチドがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内に含まれる、項１１～１４のいずれかに記載の方法。

Claims (30)

  1. 組成物であって、
    ａ．スプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記スプリットインテインＮフラグメントが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ、配列番号３０のＣａｔＮ、及び配列番号３８のＧｐ４１Ｎ、又は配列番号３９のＣｏｎＮ等のそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択される、第１のポリヌクレオチドと、
    ｂ．スプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記スプリットインテインＣフラグメントが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成される前記タンパク質のＣ末端フラグメントに直接結合された、配列番号２８のＣｆａＣ、配列番号３１のＣａｔＣ及び配列番号１０４のＧｐ４１Ｃ、又はＣｆａＣｍｕｔ（配列番号２９）若しくはＣｏｎＣ（配列番号１０５）等のそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択される、第２のポリヌクレオチドと、
    を含み、
    前記組成物の両方のポリヌクレオチドは、単一の製剤中に共に充填されてもよく、又は異なる製剤中に別々に充填されてもよく、
    前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、両方のフラグメントが組み合わされた場合、前記タンパク質のＮ末端フラグメントが前記タンパク質のＣ末端フラグメントに連結されて、前記タンパク質全体が生成されるように、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをそれぞれコードし、
    再構成される前記タンパク質が２５ＫＤａ超であり、
    前記組成物が、更に、
    前記スプリットインテインＮフラグメントが更に、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結され、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、及び／又は、
    前記スプリットインテインＣフラグメントが更に、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結され、前記デグロンが、前記インテインＣフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＣフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結される、
    ことを特徴とする、組成物。
  2. 前記スプリットインテインＮフラグメントが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結された配列番号２７のＣｆａＮであり、前記スプリットインテインＣフラグメントが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成される前記タンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結された配列番号２８のＣｆａＣである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記スプリットインテインＮフラグメントが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結された配列番号２７のＣｆａＮであり、前記スプリットインテインＣフラグメントが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成される前記タンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結された配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔである、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
  8. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
  9. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
  10. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
  11. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
  12. 前記スプリットインテインＮフラグメント及び／又はスプリットインテインＣフラグメントに直接連結した前記デグロンが、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
  13. 前記組成物が、
    前記スプリットインテインＮフラグメントが更に、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結され、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    前記スプリットインテインＣフラグメントが更に、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結され、前記デグロンが、前記インテインＣフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＣフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結される、
    ことを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. ａ．前記第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    ｂ．前記第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２８のＣｆａＣ若しくは配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、請求項１３に記載の組成物。
  15. ａ．前記第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    ｂ．前記第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２８のＣｆａＣ若しくは配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、請求項１３に記載の組成物。
  16. ａ．前記第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    ｂ．前記第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２８のＣｆａＣ若しくは配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、請求項１３に記載の組成物。
  17. ａ．前記第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号３８のＧｐ４１Ｎ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    ｂ．前記第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６又はＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号１０４のＧｐ４１Ｃ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結される、請求項１３に記載の組成物。
  18. 前記第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドが、両方のポリヌクレオチドがそれぞれのタンパク質複合体に翻訳され、本発明の方法に従って組み合わされる場合、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントがＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントに連結され、そのようにしてＡＢＣＡ４タンパク質全体が生成されるように、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントをそれぞれコードする、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. ａ．前記第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳＴ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    ｂ．前記第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＣＬ１、Ｄｅｇ１、ＰＥＳｔ、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、Ｍ１、Ｍ２、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ－１－７８、ＳｏｐＥ－１５－７８、ＳｏｐＥ－１５－５０、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｖ１２、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６及びＤＤ７からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    前記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位、１位～１１３９位、１位～１１７６位、又は１位～１１７８位をコードし、前記第２のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位、１１４０位～２２７３位、１１７７位～２２７３位、又は１１７９位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１５０位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１３９位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１４０位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７６位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１７７位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７８位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１７９位～２２７３位をコードする、請求項１８に記載の組成物。
  20. ａ．前記第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    ｂ．前記第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    前記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位、１位～１１３９位、１位～１１７６位、又は１位～１１７８位をコードし、前記第２のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位、１１４０位～２２７３位、１１７７位～２２７３位、又は１１７９位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１５０位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１３９位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１４０位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７６位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１７７位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７８位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１７９位～２２７３位をコードする、請求項１８に記載の組成物。
  21. ａ．前記第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    ｂ．前記第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンにペプチド結合を介して直接連結された、配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ又は配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    前記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位、１位～１１３９位、１位～１１７６位、又は１位～１１７８位をコードし、前記第２のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位、１１４０位～２２７３位、１１７７位～２２７３位、又は１１７９位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１５０位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１３９位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１４０位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７６位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１７７位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１７８位をコードする場合、第２のポリヌクレオチドが１１７９位～２２７３位をコードする、請求項１８に記載の組成物。
  22. ａ．前記第１のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２７のＣｆａＮ又はその任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＮフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＣ末端を介して前記インテインＮフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＮ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    ｂ．前記第２のポリヌクレオチドが、ペプチド結合を介して、任意にペプチドリンカーにより、再構成されるタンパク質のＣ末端フラグメントに直接連結され、更にペプチド結合を介して、ＤＤ１、ＤＤ３、ＰＥＳＴ、ＳｏｐＥ、Ｌ２、Ｌ９、Ｍ４又はＶ１２からなる群より選択されたデグロンに直接連結された、配列番号２８のＣｆａＣ、配列番号２９のＣｆａＣｍｕｔ若しくは配列番号３６のＮｐｕＣｍｕｔ、又はそれらの任意の機能的に等価な変異体からなる群より選択されたスプリットインテインＣフラグメントを含むポリペプチドをコードし、前記デグロンが、前記インテインＮフラグメントと前記デグロンとの間にリンカーを伴って又は伴わずに、前記インテインのＮ末端を介して前記インテインＣフラグメントに連結され、前記スプリットインテインＮフラグメントのＣ末端が、ペプチド結合を介して、再構成される前記タンパク質のＮ末端フラグメントに直接連結され、
    前記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１１４９位をコードし、前記第２のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１１５０位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１４９位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１５０位～２２７３位をコードする、請求項１８に記載の組成物。
  23. 前記第１のポリヌクレオチドが、請求項１７のａに規定される通りであり、前記第１のポリヌクレオチドが、ＡＢＣＡ４タンパク質のＮ末端フラグメントの１位～１０９５位、又は１位～１１８５位をコードし、前記第２のポリヌクレオチドが請求項１７のｂに規定される通りであり、前記第２のポリヌクレオチドがＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端フラグメントの１０９６位～２２７３位、又は１１８６位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１０９５位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１０９６位～２２７３位をコードし、前記第１のポリヌクレオチドが１位～１１８５位をコードする場合、前記第２のポリヌクレオチドが１１８６位～２２７３位をコードする、請求項１８に記載の組成物。
  24. 両方のポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの伝播又は挿入を可能にするベクター内に含まれる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記ベクターが血清型１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のＡＡＶである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 治療に使用される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 細胞内で目的の遺伝子を発現させる方法であって、
    （ｉ）前記細胞を、
    請求項１～１２のいずれか一項に規定される第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドと接触させることと、
    なお、前記ポリヌクレオチドの少なくとも一方が、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結されたスプリットインテインフラグメントをコードする；
    （ｉｉ）前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質が産生されるように、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドを発現させることと、
    （ｉｉｉ）前記スプリットインテインＮフラグメントが前記スプリットインテインＣフラグメントに結合してインテイン中間体を形成し、前記インテイン中間体が反応して、目的の前記第１のポリペプチドのＣ末端を目的の前記第２のポリペプチドのＮ末端に共有結合するように、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質とを接触させることと、
    を含む、方法。
  29. 細胞内で目的の遺伝子を発現させる方法であって、
    （ｉ）前記細胞と請求項１３～２３のいずれか一項に規定される第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを細胞とを接触させることと、
    なお、前記ポリヌクレオチドの両方が、ペプチド結合を介してデグロンに直接連結されたスプリットインテインフラグメントをコードする；
    （ｉｉ）前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質が産生されるように、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドを発現させることと、
    （ｉｉｉ）前記スプリットインテインＮフラグメントが前記スプリットインテインＣフラグメントに結合してインテイン中間体を形成し、前記インテイン中間体が反応して、目的の前記第１のポリペプチドのＣ末端を目的の前記第２のポリペプチドのＮ末端に共有結合するように、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質とを接触させることと、
    を含む、方法。
  30. 両方のポリヌクレオチドがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内に含まれる、請求項２８又は２９に記載の方法。
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