JP2023517582A - 眼疾患の処置における使用のためのナノ粒子 - Google Patents

Abstract

本発明は、眼疾患、特に網膜の疾患（「網膜症」）または視神経症、特に緑内障の処置における使用のためのナノ粒子に関する。第一の態様によれば、本発明は、患者における網膜疾患または視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経症成分の１種または数種を有効に予防または処置する方法における使用のためのナノ粒子に関し、抗炎症活性、免疫抑制活性、抗血管新生活性、神経保護活性、遺伝子治療活性および遺伝子発現に対する調節活性のうちの１種または数種を有する薬物を含むコア；コアを取り囲む両親媒性シェルであって、少なくとも１つのリン脂質および必要に応じて少なくとも１つの界面活性剤を含む、両親媒性シェル；網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面上に発現される受容体に結合する標的化リガンドであって、両親媒性シェルに共有結合している、標的化リガンド；を含む。

Description

本発明は、眼疾患、特に網膜の疾患（「網膜症」）および視神経症、特に緑内障の処置における使用のためのナノ粒子に関する。

網膜の疾患または「網膜疾患」または「網膜症」は、患者の網膜に影響を及ぼし、典型的には患者の視覚障害をもたらすか、またはそれに関連する疾患または障害である。網膜疾患には、遺伝的側面、ならびに網膜に供給する血管の損傷、再構築または新たな形成の関与が含まれても含まれなくてもよい。後者の場合、網膜に供給する血管の損傷、再構築または新たな形成を伴うそのような網膜疾患は、「新生血管眼疾患」と呼ばれることもある。

加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）および未熟児網膜症（ＲＯＰ）を含む新生血管眼疾患はすべて、失明の主な原因の１つであり、世界中で成人および小児に等しく影響を及ぼす［ＷＨＯ，Ｖｉｓｉｏｎ ２０２０：Ｔｈｅ Ｒｉｇｈｔ ｔｏ Ｓｉｇｈｔ］。糖尿病を患っている人の数が増加し、人口が高齢化するにつれて、新規症例数の劇的な増加が予想される［Ｂｏｕｒｎｅ，Ｒ．Ｒ．Ａ．ら、Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ，ｔｅｍｐｏｒａｌ ｔｒｅｎｄｓ，ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ ａｎｄ ｄｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｎｅａｒ ｖｉｓｉｏｎ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，５（９），２０１７］。

血管新生の局在は異なるが、これらの疾患は、高レベルの炎症性メディエーターおよび眼の後部における血管の巨大な非局在化を特徴とする同じ病理機構を共有し、網膜の大規模な損傷をもたらし、最終的に視覚障害および失明を引き起こす。脈絡膜および網膜の血管新生の開始および発達の主な原因因子は、主に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞によって発現される血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。次いで、ＶＥＧＦは内皮細胞の増殖および透過性亢進を促進する［Ｏ．Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ Ｖｉｓｕａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８５，２００５］。

病因における重要な因子としてのＶＥＧＦの認識は、全ての新生血管眼疾患の処置のための現在の標準的な治療、硝子体内抗ＶＥＧＦ抗体注射をもたらした。この治療概念は大きな成功を示しているが、継続的な抗ＶＥＧＦ治療に伴う多くの欠点および副作用がある。ＶＥＧＦの豊富な生物学的効果は、効果が望ましくない内皮細胞に限定されず、ミュラー細胞、星状膠細胞、神経節細胞、光受容体およびＲＰＥ細胞などの様々な他の細胞型に影響を及ぼすので、驚くべきことではない。ＶＥＧＦがこれらのすべての細胞型の生存因子であるため、適切なレベルのＶＥＧＦが眼の恒常性および完全性にとって不可欠である［Ｋ．Ｍ．Ｆｏｒｄら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｏｆ ＶＥＧＦ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．，ｉＯＶＳ，５２，２０１１］。

臨床的には、全在ＶＥＧＦレベルの厳密な抑制は、脈絡膜厚の減少で顕在化し、ＲＰＥ細胞および光受容体の局所的な大量細胞死を伴う硝子体網膜線維症および地図状萎縮に寄与する［Ｆａｌａｖａｒｊａｎｉ Ｋ．Ｇ．，Ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｇｅｎｔｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．，Ｅｙｅ，２７，２０１３］。さらに、ＶＥＧＦ中和剤の投与後にＲＰＥ涙液が報告されており、ＶＥＧＦの中和が有害作用を有し得ることを示唆している［Ｂ．Ｙｅｈ，Ｓ．Ｆｅｒｒｕｃｃｉ，Ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｔｅａｒｓ ａｆｔｅｒ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｏｐｔｏｍｅｔｒｙ，８２，２０１１］。さらに、最近の所見は、２年を超えるこれらの処置の有効性に関する疑問を提起している［Ｙ．Ｔａｏら、Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ａｆｔｅｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｕｄａｔｉｖｅ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２６，２０１０］。最近の報告では、２年間の抗ＶＥＧＦ処置後の有意な視力喪失が記載されており、これは原発性病変と関連していないようであり、ＶＥＧＦ中和の「オフターゲット」効果によるＲＰＥおよび光受容体への損傷の可能性を高めた［Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｌｏｓｉｎｇ ｖｉｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ２ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｍｏｎｔｈｌｙ ｄｏｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１８，２０１１］。
緑内障は、失明の最も一般的な原因の一つであり、現在６０００万人を超える人々が罹患している。平均余命の延長および人口の高齢化のために、緑内障の症例の劇的な増加が予想される。臨床的には、緑内障は、視神経の持続的な損傷のために、不可逆的な視力喪失から完全な失明に至る視神経症として顕在化する。病理学的に、緑内障は、視神経乳頭の変化を伴う網膜神経節細胞の変性を特徴とする視神経症である。視神経に併存する網膜神経節細胞とその軸索は疾患の初期にすでに損傷を受けていることが知られており、視神経の各細胞が死滅することで視力喪失をもたらすが、疾患の病因は知られておらず、または理解されていない。損傷に寄与する要因は、とりわけ、眼内圧上昇である。緑内障および眼内圧上昇を有する患者は、そのような眼内圧を低下させ、それによって疾患の進行を遅らせる手段によって処置される。標準的な治療には、房水の流出を促進することによって、または最初にそのような房水の形成を減少させることによって内圧を低下させることを意図した局所適用点眼薬が含まれる。しかしながら、患者のコンプライアンスは、残念ながら、しばしば治療の失敗につながるこのような長期治療では低い。この慢性疾患の頻度および有効な治療法の欠如を考慮すると、疾患の発症および進行に介入し、視神経を保護および再生するのに役立ち得る手段が緊急に必要とされている。本発明による治療システムは、全身適用後に、封入された薬物を特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、内皮細胞および／または視神経細胞に輸送し、網膜疾患または視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分の１種または数種を首尾よく処置することを可能にする。

Ｙ．Ｔａｏら、Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１０）２６ Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２０１１）１１８

第一の態様によれば、本発明は、患者における網膜疾患または視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経症成分の１種または数種を有効に予防または処置する方法における使用のためのナノ粒子であって、
－抗炎症活性、免疫抑制活性、抗血管新生活性、神経保護活性、遺伝子治療活性および遺伝子発現に対する調節活性のうちの１種または数種を有する薬物を含むコア；
－コアを取り囲む両親媒性シェルであって、少なくとも１つのリン脂質および必要に応じて少なくとも１つの界面活性剤を含む、両親媒性シェル；
－網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面上に発現される受容体に結合する標的化リガンドであって、両親媒性シェルに共有結合している、標的化リガンド；
を含む、ナノ粒子に関する。

視神経症が処置または予防されることが意図される一実施形態では、前記視神経症の以下の成分：前記視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、および神経障害性成分のうちの１種または数種が有効に処置または予防される。この実施形態では、好ましくは、血管新生成分は対処されない、すなわち処置または予防されない。

本明細書で使用される「内皮細胞」という用語は、好ましくは、典型的には、眼内皮細胞を指す。

一実施形態では、網膜疾患または視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分の１種または数種を有効に予防または処置することは、以下：
－網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における薬物の細胞内利用可能性の増加；
－眼、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における薬物の延長された滞留時間；
－眼におけるＶＥＧＦシグナル伝達経路との干渉；
－網膜血管新生の抑制または減少
－眼における炎症の抑制または減少；
－眼における免疫応答の抑制または減少；および
－眼における神経変性およびニューロン細胞死の抑制または減少
のうちの１種または数種で顕在化する。

一実施形態では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における前記薬物の細胞内利用可能性が増加すると、内皮細胞、例えば眼の脈絡膜および／または網膜の血管を裏打ちする内皮細胞における前記薬物の細胞内利用可能性もさらに増加し得る。

一実施形態では、前記網膜疾患または前記視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分の前記１種または数種を有効に予防または処置することはまた、遺伝子のサイレンシング、遺伝子の相同発現の増強、減少または抑制、遺伝子の導入、およびその異種発現の１種または数種で顕在化し得、好ましくは、これらの顕在化のいずれかは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞において、および必要に応じて内皮細胞において生じるか；または好ましくは、これらの顕在化のいずれかは、例えば視神経細胞において生じる。

一実施形態では、前記患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。

一実施形態では、前記網膜疾患は、網膜ジストロフィー、例えば遺伝性網膜ジストロフィー；ならびに新生血管網膜疾患、例えば未熟児網膜症（ＲＯＰ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ）から選択される。

一実施形態では、前記視神経症は緑内障、特に開放隅角緑内障または閉塞隅角緑内障である。

一実施形態では、
－網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における薬物の細胞内利用可能性の増加は、薬物がナノ粒子内に含まれない遊離薬物として投与された場合に観察される網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における薬物の細胞内利用可能性と比較した、薬物の細胞内利用可能性の増加であり、好ましくは、増加は、２～５倍の範囲の増加である；ならびに／あるいは
－眼、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における薬物の延長された滞留時間は、眼、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における、少なくとも１日～少なくとも５日の範囲である薬物の滞留時間である；ならびに／あるいは
－眼におけるＶＥＧＦシグナル伝達経路との干渉は、ＶＥＧＦ受容体、特にＶＥＧＦ－Ｒ２受容体の発現もしくは活性の阻害であるか、またはＶＥＧＦの発現もしくは活性の阻害である；ならびに／あるいは
－網膜血管新生の減少は、網膜疾患に罹患した未処置の網膜で観察される網膜血管新生の５０％またはそれ未満、好ましくは２０％またはそれ未満、より好ましくは１５％またはそれ未満への網膜血管新生の減少である；ならびに／あるいは
－眼における炎症の減少は、網膜疾患に罹患した未処置の眼で観察される炎症の５０％またはそれ未満、好ましくは２０％またはそれ未満への炎症の減少である；ならびに／あるいは
－眼における免疫応答の減少は、網膜疾患に罹患した未処置の眼で観察される免疫応答の５０％またはそれ未満、好ましくは２０％またはそれ未満への免疫応答の減少である；ならびに／あるいは
－眼における神経変性およびニューロン細胞死の減少は、視神経症に罹患した未処置の眼において観察されるニューロン細胞死のレベルの８０％またはそれを超える％への、好ましくは５０％またはそれを超える％への、より好ましくは３０％またはそれを超える％への、ニューロン細胞死の減少である。

一実施形態では、眼における炎症の前記減少は、典型的には上昇したレベルから正常またはほぼ正常なレベルへの１種または数種の炎症マーカーのレベルの減少で顕在化する。本明細書で使用される「正常な」または「ほぼ正常な」レベルは、眼の炎症に影響されない患者のそのような炎症マーカーのレベルを指す。眼に関連する典型的な炎症マーカーは、ＣＤ６８、Ｔｎｆ－α、Ｃｃｌ－２、ｉＮｏｓ、インターロイキン、例えばＩｌ－６、Ｉｌ－１ｂおよびＥｇｒ－１である。

一実施形態では、眼における免疫応答の前記減少は、以下のマーカー：ＩＢＡ－１およびＧＦＡＰのうちの１またはそれを超えるマーカーのレベルの変化によって測定されるグリア細胞およびミュラー細胞の非活性化で顕在化する。ＧＦＡＰのレベルの変化は、ｑＰＣＲならびにウエスタンブロットおよび／またはＥＬＩＳＡを使用して定量的に測定することができる。網膜ミクログリア細胞およびミュラー細胞の活性化状態は、ＩＢＡ－１およびＧＦＡＰの免疫組織学マーカーを使用して評価することができる。

一実施形態では、眼における神経変性の前記減少は、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、興奮毒性、炎症性変化、鉄蓄積およびタンパク質凝集のうちの１種または数種のレベルの低減に起因する網膜損傷および網膜神経節細胞喪失の低減で顕在化する。

一実施形態では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面上に発現される受容体は、Ｇタンパク質共役受容体、インテグリン、およびスカベンジャー受容体から選択され、好ましくは、インテグリンが、ανβ３－インテグリンおよびανβ５－インテグリンから選択され、より好ましくは、標的化リガンドが、アミノ酸配列ＲＧＤを有するペプチド、シクロ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）のアミノ酸配列を有する環状ペプチドおよびその誘導体から選択されるか、または好ましくは、スカベンジャー受容体がＣＤ３６であり、より好ましくは、標的化リガンドがリン脂質である。

「誘導体」という用語は、ペプチド標的化リガンドの文脈で本明細書で使用される場合、インテグリン、特にανβ３－インテグリンおよび／またはανβ５－インテグリンを認識し、優先的に結合する能力を保持するペプチドを指すことを意味する。

本明細書で使用される「スカベンジャー受容体」という用語は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を含むがこれに限定されない広範囲のリガンドに結合する能力を有する細胞表面受容体を指すことを意味する。特に、そのようなスカベンジャー受容体は、リポタンパク質、リン脂質、コレステロールエステル、プロテオグリカン、炭水化物およびフェリチンから選択される多様な範囲のリガンドに結合する能力を有し得る。本発明の実施形態の文脈におけるスカベンジャー受容体の好ましい例は、ＣＤ３６である。この文脈において、ＣＤ３６の好ましい標的化リガンドはリン脂質である。

本発明の実施形態は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞の表面上に発現される受容体に結合する１つよりも多くの標的化リガンドを含むナノ粒子を包含し、想定することにも留意すべきである。例えば、本発明の実施形態によるナノ粒子は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面上に発現される異なる受容体に結合する２つの異なる標的化リガンドを含み得る。例えば、本発明の実施形態は、２つの異なる標的化リガンドを含み得、そのうちの一方は１つのタイプの受容体に結合し、もう一方は別のタイプの受容体に結合する。一例として、受容体がＧタンパク質共役受容体およびインテグリン、例えばανβ３－インテグリンである場合、一方の標的化リガンドは前記Ｇタンパク質共役受容体に結合し得、他方の標的化リガンドはインテグリンに結合し得る。さらなる一例として、受容体がανβ３－インテグリンおよびανβ５－インテグリンなどの２つの異なるインテグリンである場合、一方の標的化リガンドは前記ανβ３－インテグリンに結合し得、他方の標的化リガンドはανβ５－インテグリンに結合し得る。

本発明の実施形態は、両親媒性シェルの一部を形成するリン脂質が、細胞、例えば網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面上に発現されるスカベンジャー受容体にナノ粒子を向けるための標的化リガンドとして作用し得るナノ粒子を包含し、想定することにも留意すべきである。そのような実施形態では、標的化リガンドとして作用するリン脂質は、前記ナノ粒子上に存在する唯一の標的化リガンドであり得るか、または、細胞、例えば網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面に発現される別の受容体に特異的な別個の（すなわち、さらなる）標的化リガンドに加えて存在する追加の標的化リガンドであり得る。いかなる理論または機構的説明にも拘束されることを望むものではないが、本発明によるナノ粒子の両親媒性シェル中／上のリン脂質の存在は、表面にスカベンジャー受容体を有する細胞に対するナノ粒子の基本的親和性を少なくとも増加させると考えられる。さらに、また再度いかなる理論または機構的説明にも拘束されることを望むものではないが、本発明によるナノ粒子の両親媒性シェル中／上のリン脂質の存在は、両親媒性シェル中／上の追加の（別個の、またはさらなる）標的化リガンドと併せて、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞へのナノ粒子の結合の特異性を増加させるとも考えられる。この文脈における有用なスカベンジャー受容体の一例は、スカベンジャー受容体ＣＤ３６である。ＣＤ３６は、とりわけリン脂質に対する高親和性受容体であり、例えば天然リポタンパク質のシェル内に存在する。一例として、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞はその表面にＣＤ３６を発現し、これを使用して天然リポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を内在化することができる。本発明の実施形態によるナノ粒子は、その両親媒性シェル中にリン脂質を含み、したがって、ＲＰＥ細胞の表面上のこれらの受容体に対処することができる。結果として、ナノ粒子の結合、ＲＰＥ細胞における取り込みおよび濃縮が、それによって促進され得る。

本発明の実施形態は、１つよりも多くの薬物、例えば２つまたは３つまたはさらに多くの薬物を含むナノ粒子を包含し、想定することにも留意すべきである。本明細書で使用される「薬物を含むコア」という用語はまた、そのようなコアが１つよりも多くの薬物を含むこと、すなわち２つまたはそれを超える薬物を含み得るシナリオを含むことも意味する。例えば、そのようなシナリオはまた、そのようなコアが数種の薬物の組み合わせを含むシナリオを包含することも意味する（薬物は、本発明によるナノ粒子によって標的化され、それらの好ましい作用部位に送達されることが意図される）。

一実施形態では、抗炎症活性、免疫抑制活性、抗血管新生活性、神経保護活性、遺伝子治療活性、および遺伝子発現に対する調節活性の１種または数種を有する薬物が、抗炎症薬、免疫抑制薬、抗血管新生薬、神経保護薬、核酸ならびに上記の質のうちの１つより多くを有する薬物から選択される。

一実施形態では、
－抗炎症薬が、糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン、プレドニゾロン；ＣＯＸ阻害剤、例えばセレコキシブ、エトリコキシブ、ロフェコキシブ、ルミラコキシブおよびパレコキシブ；非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、メロキシカム、ジクロフェナク、エトドラク、スリンダクおよびインドメタシン；抗炎症プロドラッグ、例えばスルファサラジン；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡ；可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の活性化剤、例えばシナシグアトから選択され；
－免疫抑制薬が、ＴＮＦ－α阻害剤、例えばエタネルセプトまたはアダリムマブ；シクロスポリン、例えばシクロスポリンＡ；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばエベロリムスまたはシロリムス；カルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムス、イノシンモノホスフェート－デヒドロゲナーゼ阻害剤、例えばミコフェノラート；葉酸アンタゴニスト、例えば、メトトレキサートおよびメトトレキサート類似体；ニトロイミダゾール系免疫抑制剤、例えばアザチオプリン；ジヒドロ－オロト酸－デヒドロゲナーゼ阻害剤、例えばレフルノミドから選択され；
－抗血管新生薬が、抗ＶＥＧＦ薬、特にＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）またはＶＥＧＦの阻害剤、例えばシクロスポリンＡ、アフリベルセプトまたはラニビズマブ；抗真菌薬、例えばアルベンダゾールまたはイトラコナゾール；葉酸アンタゴニスト、例えば、メトトレキサートおよびメトトレキサート類似体；チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブ、ダサチニブ、バタラニブ、アレクチニブ、スニチニブ、ソラフェニブまたはエルロチニブ；抗糖尿病薬、例えばグリメピリドまたはグリベンクラミド；三環系抗うつ薬、例えばアミトリプチリン；スタチン、例えばシンバスタチン、フルバスタチンまたはアトルバスタチン；サルタン、例えばテルミサルタン；クマリンおよびクマリン誘導体；およびＩＧＦ－１受容体阻害剤から選択され；
－神経保護薬が、免疫抑制薬、抗炎症薬および抗酸化薬、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、特にタクロリムス、補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ１０）、ビタミンＥ、シチコリン（シチジン５’－ジホスホコリン）、パルミトイルエタノールアミド、メラトニン、ＳＣ７９（エチル２－アミノ－６－クロロ－４－（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチル）－４Ｈ－クロメン－３－カルボキシレート）、神経成長因子（ＮＧＦ）、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）から選択され；ならびに
－核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、前述のいずれかのオリゴヌクレオチド、特に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される。

本明細書で使用される場合、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、短い干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られることもあり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路において役割を果たす、典型的には２０～２５塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子のクラスを指し、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨げる。ｓｉＲＮＡはまた、ＲＮＡｉ関連経路において、例えば、抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造の形成において作用する。

本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、遺伝子発現の転写および転写後調節において機能する、典型的には２０～５００ヌクレオチド、より典型的には２０～３０ヌクレオチド、場合によっては２１～２５ヌクレオチドの長さの小さな非コードＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｍｉＲＮＡは、真核生物の核ＤＮＡによってコードされ、ｍＲＮＡ分子内の相補的配列との塩基対形成を介して機能し、通常、翻訳抑制または標的分解を介して遺伝子サイレンシングをもたらす。

一実施形態では、前記ナノ粒子は脂質ナノ粒子であり、シェルが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトールモノホスフェート、ホスファチジルイノシトールビスホスフェート、ホスファチジルイノシトールトリホスフェート、セラミドホスホリルコリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルリピドおよび前述のいずれかの混合物から選択されるリン脂質を含み、シェルが、グリセリルリシノレエートまたはレシチンなどの界面活性剤、好ましくはペグ化界面活性剤、より好ましくはグリセロールポリエチレングリコールリシノレエートから選択される界面活性剤をさらに含む。

一実施形態では、前記コアは、
ａ）油性コアであり、薬物が親油性（ｌｉｐｏｈｉｌｉｃ）薬物であり、好ましくはシクロスポリンＡ；可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の活性化剤、例えばシナシグアト；糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン；スタチン；タクロリムス、補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ１０）、ビタミンＥ、シチコリン、パルミトイルエタノールアミド、メラトニンおよびＳＣ７９から選択される；あるいは
ｂ）水性コアであり、薬物が親水性薬物であり、好ましくは抗ＶＥＧＦペプチドおよび抗ＶＥＧＦＲペプチド、例えばアフリベルセプトまたはラニビズマブ；三環系抗うつ薬、例えばアミトリプチリン；および成長因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）から選択される。

一実施形態では、前記コアは、油性または水性相および前記薬物（または前記いくつかの薬物または薬物の組み合わせ）を含み、前記薬物は、油性または水性相に分散しており、薬物が、好ましくは粒子の形態で、例えばナノ粒子の形態で油性または水性相に分散しており、より好ましくは、薬物が親油性薬物または親水性薬物であり、さらにより好ましくは、薬物が、シクロスポリンＡ；可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の活性化剤、例えばシナシグアト；糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン；スタチン；タクロリムス、補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ１０）、ビタミンＥ、シチコリン、パルミトイルエタノールアミド、メラトニン、ＳＣ７９、抗ＶＥＧＦペプチドおよび抗ＶＥＧＦＲペプチド、例えばアフリベルセプトまたはラニビズマブ；三環系抗うつ薬、例えばアミトリプチリン；および成長因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）から選択される。

一実施形態では、前記コアは溶媒および前記薬物を含み、前記薬物は前記溶媒に溶解または分散しており、好ましくは、溶媒が脂質、特にモノ－、ジ－またはトリ－グリセリド（ｔｒｉｇｙｌｃｅｒｉｄｅ）であるかまたはそれを含み、より好ましくは、モノ－、ジ－またはトリ－グリセリドの脂肪酸成分が、６～１８個の炭素原子、さらにより好ましくは８～１８個の炭素原子、さらにより好ましくは８～１６個の炭素原子の範囲の鎖長の脂肪酸を有する。

一実施形態では、前記ナノ粒子、特に前記脂質ナノ粒子は、５ｎｍ～１００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ～８０ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ～６０ｎｍ、さらにより好ましくは３０ｎｍ～６０ｎｍの範囲のサイズ、好ましくは直径を有する。

一実施形態では、前記ナノ粒子、特に前記脂質ナノ粒子は、複数のナノ粒子のサンプルとして患者に投与された場合、インテグリンに結合する標的化リガンドを有しないナノ粒子と比較して、患者の血液、脾臓および眼の少なくとも１つにおいて３倍超、好ましくは４倍超の濃縮を示し、より好ましくは、濃縮は患者の眼において５倍超である。

本明細書で使用される「濃縮」という用語は、標的化リガンドを含まないナノ粒子と比較して、特定の組織または部位における本発明によるナノ粒子の濃度の増加を指す。本明細書で使用される「濃縮」という用語は、「蓄積」と同義に使用されることもある。

「眼における濃縮」という用語は、そのような濃縮が（それぞれの眼の）視神経中もしくは視神経において生じるシナリオも含むことを意味する。

一実施形態では、前記ナノ粒子、特に前記脂質ナノ粒子は、複数のナノ粒子のサンプルとして患者に投与された場合に、患者の眼における濃縮を示し、好ましくは濃縮が、眼の網膜または視神経中もしくは視神経において、より好ましくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞または眼内皮細胞または視神経細胞において、さらにより好ましくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および網膜の微小血管系において生じる。

一実施形態では、網膜疾患または視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分、および神経変性成分のうちの１種または数種を有効に予防または処置する方法において、前記ナノ粒子、特に前記脂質ナノ粒子は、複数のそのようなナノ粒子のサンプルとして患者に投与され、そのような投与は、
ａ）好ましくは静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻投与、肺投与、より好ましくは静脈内投与から選択される、全身投与、または
ｂ）好ましくは眼内投与、網膜下投与、および角膜への投与、より好ましくは硝子体内投与、さらにより好ましくは患者のそれぞれの眼の網膜の近傍における、局所投与
として行われる。

本明細書で使用される「投与」は、薬物を投与する任意の適切な方法を指す。「全身投与」の文脈において、そのような用語は、好ましくは、薬物の注射、摂取、吸入、適用または他の組み込みを指す。好ましい実施形態では、それは注射である。

「局所投与」の文脈において、この用語は、薬物の注射、吸入、適用または他の部位特異的投与を指す。好ましい実施形態では、それは注射または適用である。

さらなる態様では、本発明はまた、網膜疾患、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）および未熟児網膜症から選択される新生血管眼疾患；または視神経症、特に緑内障、特に開放隅角緑内障および閉塞隅角緑内障の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分の１種または数種を有効に予防または処置するための医薬を製造するための、上記および本明細書で定義されるナノ粒子、特に脂質ナノ粒子の使用に関し；ここで、前記網膜疾患または前記視神経症の有効な処置は、上記および本明細書で定義されるように顕在化する。

本発明はまた、網膜疾患、例えば上記で定義されるような新生血管眼疾患、または上記で定義されるような視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分のうちの１つまたは数種の有効な予防または処置の方法であって、上記および本明細書でさらに定義されるようなナノ粒子、特に脂質ナノ粒子をそれを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。

視神経症が処置または予防されることが意図される一実施形態では、前記視神経症の以下の成分：前記視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、および神経障害性成分のうちの１つまたは数種が有効に処置または予防される。この実施形態では、好ましくは、血管新生成分は対処されない。

本発明者らは、驚くべきことに、本明細書で定義されるナノ粒子、特に脂質ナノ粒子が、本明細書で定義される網膜疾患、例えば新生血管眼疾患の炎症性成分、免疫応答成分、および血管新生成分、または本明細書で定義される視神経症の神経変性成分の１つまたは数種の有効な予防または処置に有効に使用するのに適していることを見出した。

本明細書で使用される「網膜疾患または視神経症の炎症性成分」という用語は、典型的には、前記網膜疾患または前記視神経症に関連する炎症を指す。

本明細書で使用される「網膜疾患または視神経症の免疫応答成分」という用語は、典型的には、前記網膜疾患または前記視神経症に関連する免疫応答を指す。

本明細書で使用される「網膜疾患の血管新生成分」という用語は、典型的には、前記網膜疾患に関連する血管新生、例えば前記網膜疾患に関連する新生血管、または既存の血管の増殖を指す。

本明細書で使用される「網膜疾患または視神経症の神経変性成分」という用語は、典型的には、前記視神経症に関連する神経変性事象ならびにニューロン細胞の損傷および死を指す。

本明細書で使用される「処置」という用語は、疾患または障害の１種または数種の症状、好ましくは根底にある病理（複数の病理）の緩和または軽減または治癒を指す。一実施形態では、それは、疾患または障害の病理学的な炎症性、免疫原性、血管新生または神経変性成分の有効な緩和または軽減、および健康な状態の回復を指す。

本明細書で使用される「予防」という用語は、患者において生じる病的状態の回避、または予防がない場合に患者において生じる病的状態の程度の減少を指す。

本明細書で使用される「遊離薬物」という用語は、ナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子によって封入も区画化もされておらず、代わりに溶液もしくは分散物の一部として、または固体として投与される薬物を指すことを意味する。

「未処置の眼」という用語は、眼における炎症または免疫応答の減少の文脈で本明細書で使用される場合、対応する網膜疾患に影響されるが、いかなる薬物または活性医薬成分によっても処置されないか、またはせいぜい適切な対照、例えば生理食塩溶液によってのみ処置される基準点としての眼を指す。

「未処置の網膜」という用語は、網膜血管新生の減少の文脈で本明細書で使用される場合、対応する網膜疾患に影響されるが、いかなる薬物または活性医薬成分によっても処置されないか、またはせいぜい適切な対照、例えば生理食塩溶液によってのみ処置される基準点としての網膜を指す。

本発明者らは、驚くべきことに、薬物を含む脂質ナノ粒子を使用して、そのような網膜疾患、例えば新生血管眼疾患に罹患しているか、またはそのような視神経症に罹患している患者の網膜疾患または視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分の１種または数種を有効に予防または処置することができることを見出した。

新生血管眼疾患などの網膜疾患または視神経症の有効な処置は、以下の基準の１種または数種において本発明に従って顕在化する：
－網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における前記薬物の細胞内利用可能性の増加；
－眼、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における前記薬物の延長された滞留時間；
－眼におけるＶＥＧＦシグナル伝達経路との干渉；
－網膜血管新生の抑制または減少；
－眼における炎症の抑制または減少；
－眼における免疫応答の抑制または減少；および
－眼における神経変性およびニューロン細胞死の抑制または減少。

上述の基準のいずれも、網膜疾患、例えば新生血管眼疾患、または前記視神経症の有効な処置の適応（または顕在化）であり得、したがって、そのような有効な処置はまた、上述の基準のいずれかによって測定および／または決定され得る。

一実施形態では、前記網膜疾患または前記視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分の前記１種または数種を有効に予防または処置することはまた、またはその代わりに、遺伝子のサイレンシング、遺伝子の相同発現の増強、減少または抑制、遺伝子の導入、およびその異種発現の１種または数種で顕在化し得、好ましくは、これらの顕在化のいずれかは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞において、および必要に応じて内皮細胞または網膜神経節細胞において生じる。

本明細書で使用される「抗ＶＥＧＦ薬」という用語は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の産生もしくは作用、および／または血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の産生もしくは作用と相互作用する任意の薬物を指すことを意味する。抗ＶＥＧＦ薬の典型的な例は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を妨害および抑制する親油性薬物としてのシクロスポリンＡである。別の例は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したＶＥＧＦ受容体由来のＶＥＧＦ結合部分を含む融合タンパク質であるアフリベルセプトである。抗ＶＥＧＦ薬の他の例は、それぞれＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲに指向された抗体である。

本発明はまた、本明細書で定義されるナノ粒子、特に脂質ナノ粒子を含む組成物に関し、この組成物は、その後、新生血管眼疾患などの網膜疾患、または緑内障などの視神経症を有効に予防または処置するために使用され得る。典型的には、本明細書で定義される複数のナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子を含むそのような組成物では、そのような脂質ナノ粒子は多分散性であるが、好ましくは狭いサイズ分布を有し、より好ましくは０．０７未満の多分散指数を有する。これにより、規定量の薬物の投与が可能になる。なぜならば、本発明によれば、本明細書で定義される脂質ナノ粒子はまた、典型的には６０％超である定義されたカプセル化効率（ＥＥ）を典型的には有するので、本発明の実施形態によれば、比較的多量のＶＥＧＦ薬をその意図する作用観点を標的とした様式で投与することができる。

本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、その平均寸法、具体的にはサイズ、より具体的には直径がナノメートル範囲にある粒子を指す。典型的には、そのような「ナノ粒子」は、５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満の平均直径を有する。一実施形態では、それらは、５ｎｍ～１００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ～８０ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ～６０ｎｍ、さらにより好ましくは３０ｎｍ～６０ｎｍの範囲のサイズ（具体的には平均直径）を有する。

本明細書で使用される「脂質ナノ粒子」という用語は、１種または数種の脂質を含むナノ粒子を指す。一実施形態では、この用語は、以下を含むナノ粒子を指す：
－コア；
－少なくとも１つのリン脂質および必要に応じて少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記コアを取り囲む両親媒性シェル、好ましくは脂質シェル；
－網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面上に発現される受容体に結合する標的化リガンドであって、前記両親媒性（好ましくは前記脂質）シェルに共有結合している、標的化リガンド。

一実施形態では、本発明による脂質ナノ粒子はリポソームである。別の実施形態では、それらは脂質ナノカプセルである。

本明細書で使用される「脂質ナノ粒子」という用語は、リポソームおよび脂質ナノカプセルも、これらが「ナノ粒子」であるという前述の意味でのサイズを有する限りにおいて含む。脂質ナノカプセルは、本明細書ではＬＮＣと略されることもある。「リポソーム」は、１種または数種の脂質層、多くの場合は脂質二重層を含む小胞であり、そのような脂質（二重）層はシェルとして作用し、コアを取り囲む。多くの場合、それらはシェルの比較的高い流動性を特徴とし、それにより、そのようなリポソームが外側脂質膜に囲まれた細胞などのより大きな粒子または実体と融合してその一部になることを可能にする。

本明細書で使用される「脂質ナノカプセル」は、コアを取り囲む脂質シェルで構成されたナノ粒子であるが、「リポソーム」と比較して、「脂質ナノカプセル」は、より高い安定性および／または剛性を有し、そのような脂質ナノカプセルをより長期間、例えば１ヶ月～数ヶ月間保存することを可能にする。

一実施形態では、本発明による脂質ナノ粒子はＬＤＬ様である。本明細書で使用される「ＬＤＬ様」という用語は、本発明によるナノ粒子が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子と同様の様式で作用する能力を指す。そのようなＬＤＬ粒子は、６０ｎｍ未満、典型的には２０ｎｍ～３０ｎｍの範囲のサイズを有する。それらは、内皮細胞層の開口部または接合部を通って拡散することができ、内皮細胞を透過することができ、ブルッフ膜を通って網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に移動することができる。

本発明によれば、前記脂質ナノ粒子は、複数のナノ粒子のサンプル／組成物として患者に投与される。一実施形態では、前記患者はヒト患者である。一実施形態では、前記患者は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）もしくは未熟児網膜症（ＲＯＰ）に罹患しているヒト患者であるか、または視神経症、特に緑内障に罹患しているヒト患者である。

本発明によれば、脂質ナノ粒子は、患者に投与された場合、前記患者の血液、脾臓および眼の少なくとも１つにおいて濃縮を示す。好ましくは、そのような濃縮は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の表面上に発現される受容体に結合する標的化リガンドを有しない脂質ナノ粒子と比較した場合、３倍超、好ましくは４倍超である。特定の好ましい実施形態では、前記脂質ナノ粒子のそのような濃縮は、前記患者の眼における、５倍を超える濃縮である。一実施形態では、そのような濃縮が前記患者の眼において生じる場合、この濃縮は、好ましくは眼の網膜または視神経中もしくは視神経において、より好ましくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞または眼内皮細胞または視神経細胞において、さらにより好ましくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および前記網膜の微小血管系においてである。

網膜疾患、例えば新生血管眼疾患、または視神経症、例えば緑内障の予防または処置のために、本発明による前記ナノ粒子、好ましくは前記脂質ナノ粒子は、複数のこのようなナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含むサンプル／組成物の一部として患者に投与される。一実施形態では、投与は全身投与、好ましくは静脈内注射である。別の実施形態では、投与は局所投与であり、好ましくは眼内投与、網膜下投与、および角膜への投与、より好ましくは硝子体内投与、さらにより好ましくは前記患者のそれぞれの眼の網膜の近傍におけるものである。

使用される略語：
ＬＮＣ＝脂質ナノカプセル
ＲＧＤ－ＬＮＣ＝ＲＧＤ標的化リガンドを有する脂質ナノカプセル。
ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣ＝ＲＧＤ標的化リガンドを有しておりシクロスポリンＡを含む脂質ナノカプセル
ＣｓＡ＝シクロスポリンＡ
遊離ＣｓＡ＝ＤＰＢＳ中に溶解したシクロスポリンＡ
ＤＰＢＳ＝ダルベッコリン酸緩衝食塩水
ＲＰＥ＝網膜色素上皮
ＲＰＥ細胞＝網膜色素上皮細胞
ＭＣＴ＝中鎖トリグリセリド

ここで、図面を参照して本発明をさらに説明する。

図１は、ＬＮＣおよびＲＧＤ－ＬＮＣのサイズおよびサイズ分布を示す。ＬＮＣおよびＲＧＤ－ＬＮＣのサイズ（バー）およびサイズ分布（多分散性、黒四角）を、動的光散乱を用いて２５℃で１０％ ＤＰＢＳにおいて測定した。

図２は、全身投与および１時間の循環時間後の非改変ＬＮＣおよびＲＧＤ－ＬＮＣの体内分布を示す。組織中のナノ粒子濃度を、蛍光を決定することによって分析した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表す。統計学的有意性のレベルは、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）として示される。結果は、臓器のグラム当たりの初期用量（ＩＤ）のパーセンテージによって示される。１００μｌの２０ｍｇ／ｍｌ ＬＮＣまたはＲＧＤ－ＬＮＣのいずれかの全身投与後の１時間の循環時間後の臓器のグラム当たりの初期用量のパーセンテージ。

図３は、全身投与および１時間の循環時間後のＬＮＣと比較したＲＧＤ－ＬＮＣのバイオアベイラビリティを示す。組織中のナノ粒子濃度を、蛍光を決定することによって分析した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表す。統計学的有意性のレベルは、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）として示される。結果は、眼当たりの初期用量のパーセンテージによって示される。より具体的には、図３は、１００μｌの２０ｍｇ／ｍｌ ＬＮＣまたはＲＧＤ－ＬＮＣのいずれかの全身投与後の１時間の循環時間後の眼当たりの初期用量（ＩＤ）のパーセンテージを示す。

図４は、フラットマウントされた網膜の顕微鏡分析を示す。蛍光画像は、ＬＮＣと比較したＲＧＤ－ＬＮＣの毛細血管関連のナノ粒子蓄積を示す。ＲＧＤ－ＬＮＣ処置網膜のＺスタック写真は、３つすべての網膜血管層を通る毛細血管関連の蛍光を示す（下部神経叢、中間神経叢、および上部神経叢）。より具体的には、図４は、フラットマウントされた網膜の顕微鏡分析を示す。 上：網膜全体の蛍光画像は、ＲＧＤ－ＬＮＣのナノ粒子蓄積の顕著な増加を示し、明確な毛細血管の関連がある。スケールバー：５００μｍ。 下：マークされた領域のｚスタック写真では、ＲＧＤ－ＬＮＣ蛍光は、３つすべての網膜血管層を通して明確に見ることができる。スケールバー：５０μｍ。

図５は、ＲＧＤ－ＬＮＣおよびＬＮＣの適用（白色）ならびに１時間の循環時間後のマウス後眼の凍結切片の蛍光画像を示し、核はＤＡＰＩで染色され（青色）、Ｆ－アクチンはファロイジン－ＴＲＩＴＣで染色された（オレンジ色）。網膜血管および脈絡膜血管、特にＲＰＥ細胞における過剰なＲＧＤ－ＬＮＣ蓄積が明らかである。より具体的には、図５は、ＲＧＤ－ＬＮＣおよびＬＮＣの適用（白色）ならびに１時間の循環時間後のマウス後眼の凍結切片の蛍光画像を示し、核はＤＡＰＩで染色され（青色）、Ｆ－アクチンは、組織におけるより良好な配向のためにファロイジン－ＴＲＩＴＣで染色された（オレンジ色）。網膜血管および脈絡膜血管、特にＲＰＥ細胞におけるＲＧＤ－ＬＮＣ蓄積が明らかである。

図６は、ＣｓＡ負荷ＲＧＤ－ＬＮＣの適用後および未処置マウスにおけるマウス後眼の凍結切片の蛍光画像を示す。上のパネルは健康なマウス（酸素正常状態）を示し、下のパネルは網膜症（ＲＯＰ）を有するマウスを示す。両方の群をＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣによってＰ１２で処置したか、または処置しなかった。染色は、ＤＡＰＩまたは抗ＶＥＧＦ－Ｒ２抗体を用いて行った。健康なマウスの場合に見られ得るように、処置群間の差は観察されなかった。ＲＯＰを有するマウスの場合、ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣを使用した処置は、ＶＥＧＦ－Ｒ２発現を健康な動物に匹敵する値まで減少させた。

図７は、ＲＧＤ－ＬＮＣ、ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣまたは遊離ＣｓＡのいずれかによりＰ１２において処置した、健康なマウス（酸素正常状態）または網膜症（ＲＯＰ）を有するマウスのＰ１７における網膜のホールマウントの蛍光画像を示す。健康なマウスの場合、処置群間に差はないことが明らかである。ＲＯＰを有するマウスでは、血管新生に対するＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣの多大なポジティブな効果を可視化することができるが、対照と比較してＲＧＤ－ＬＮＣ処置マウスおよびＣｓＡ処置マウスの網膜にほとんど差はない。より具体的には、図７は、ＲＧＤ－ＬＮＣ、ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣまたは遊離ＣｓＡのいずれかによりＰ１２において処置した、健康なマウス（酸素正常状態）または網膜症（ＲＯＰ）を有するマウスのＰ１７における網膜のホールマウントの蛍光画像を示す。健康なマウスの場合、処置群間に差はないことが明らかである。ＲＯＰを有するマウスでは、血管新生に対するＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣの多大なポジティブな効果を可視化することができるが、対照と比較してＲＧＤ－ＬＮＣ処置マウスおよびＣｓＡ処置マウスの網膜にほとんど差はない。ＦＩＴＣ－デキストランで染色した血管。スケールバー：５００μｍ。

図８は、血管新生のパーセンテージの定量化を示す。ＲＧＤ－ＬＮＣ、ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣまたは遊離ＣｓＡのいずれかによりＰ１２において処置した、健康なマウス（酸素正常状態）または網膜症（ＲＯＰ）を有するマウスのＰ１７における網膜のホールマウントの分析。健康なマウスの場合、処置群間に差はないことが明らかである。ＲＯＰを有するマウスでは、血管新生に対するＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣの多大なポジティブな効果を可視化することができるが、遊離ＣｓＡの効果はなく、ＲＧＤ－ＬＮＣの効果はわずかである。より具体的には、図８は、血管新生のパーセンテージの定量化を示す。ＲＧＤ－ＬＮＣ、ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣまたは遊離ＣｓＡのいずれかによりＰ１２において処置した、健康なマウス（酸素正常状態）または網膜症（ＲＯＰ）を有するマウスのＰ１７における網膜のホールマウントの分析。健康なマウスの場合、処置群間に差はないことが明らかである。ＲＯＰを有するマウスでは、血管新生に対するＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣの多大なポジティブな効果を可視化することができるが、遊離ＣｓＡの効果はなく、ＲＧＤ－ＬＮＣの効果はわずかである。

図９は、総ＣｓＡ量（ｎｇ）の定量化を示す。ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣまたは遊離ＣｓＡのいずれかによりＰ１２において処置した網膜症（ＲＯＰ）を有するマウスのＰ１７におけるＵＨＰＬＣ－ＭＳによる眼の分析。ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣで処置したマウスの眼のみにおける相当量のＣｓＡの存在が明らかであり、ＲＧＤ－ＬＮＣ輸送によるＣｓＡの利用可能性の増加を示している。より具体的には、図９は、眼の総ＣｓＡ量（ｎｇ）の定量化を示す。ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣまたは遊離ＣｓＡのいずれかによりＰ１２において処置した網膜症（ＲＯＰ）を有するマウスのＰ１７におけるＵＨＰＬＣ－ＭＳによる眼の分析。ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣで処置したマウスの眼のみにおける相当量のＣｓＡの存在が明らかであり、ＲＧＤ－ＬＮＣ輸送によるＣｓＡの利用可能性の増加を示している。

図１０は、未処置マウスまたはＲＧＤ－ＬＮＣの適用（白色）および１時間の循環時間後の後眼の凍結切片の蛍光画像を示す。核をＤＡＰＩで染色した（青色）。視神経、特に視神経乳頭および視神経に直接隣接するＲＰＥの領域におけるＲＧＤ－ＬＮＣの蓄積が明らかである。

さらに、本発明を限定するためではなく、例示するために与えられる実施例を参照する。

実施例１
脂質ナノ粒子の製造
脂質ナノ粒子は、それらの生体適合性の性質、有機溶媒を使用しない調製の単純さ、および様々な溶解度特性を有する広範囲の薬物をカプセル化する能力のために、送達システムとして選択された。さらに、ＲＰＥ細胞は、コレステロール、トリグリセリド、脂肪酸およびリン脂質などの脂質の供給に依存する。これには、古典的な脂質輸送体であるＬＤＬおよびＶＬＤＬナノ粒子が脈絡膜の内皮細胞層を貫通し、ブルッフ膜を横切って移動して、脂質を血液からＲＰＥ細胞に輸送できることが必要である。本発明者らは、レシチン（Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ７５－３）とペグ化界面活性剤（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ １５）との混合物によって囲まれた、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）で構成される油性コアからなるＬＮＣが、ＨＤＬおよびＬＤＬを模倣するのに理想的であると仮定した。それらは、それらの生物学的対応物と同様のリン脂質の厚い外層を有する。それらの調製は以下の通りであった：

８８７．５ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ１５、３０ｍｇのＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ７５－３、４１５ｍｇのＭＣＴ、１２ｍｇのＮａＣｌおよび６５５．８ｍｇの水を、９０℃と６０℃の間で３サイクルの漸進的な加熱および冷却に供した。改変および精製後の粒子を定量化するために、蛍光色素（ＤｉＩ、ＤｉＯまたはＤｉＤ １．５％（ｗ／ｗ））を初期混合物に添加した。最後のサイクルの間、転相温度（phase inversion）で５ｍｌの水で希釈することによって不可逆的ショックが誘導され、安定なＬＮＣの形成をもたらした。その後、室温で５分間追加の磁気撹拌を加えた。最終分散物を滅菌用の０．２２μｍ再生セルロース（ＲＣ）膜に通して濾過し、室温で暗所で保存した。

薬物負荷ＬＮＣを調製するために、３５．３ｍｇのＣｓＡをＭＣＴに溶解し、粒子を上記のように調製した。

調製は、良好な単分散性を有する脂質ナノ粒子形成をもたらし、約５０ｎｍの直径を有するナノ粒子の形成をもたらす、エマルジョンの転相温度現象に基づく［Ｈｅｕｒｔａｕｌｔ Ｂ．ら、Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｈａｓｅ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９，２００２］。次のステップとして、ＬＮＣに標的化リガンドをグラフトした。まず、シクロ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）（ＲＧＤ）ペプチドを、ペプチドの環状構造上に存在するチオール基とマレイミドとの間の共役化学を用いて両親媒性ＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００－マレイミドにカップリングさせた。次に、ＤＳＰＥコンジュゲートとＬＮＣとの混合物を単純に加熱して、ミセルからＬＮＣへのＤＳＰＥ－ＰＥＧ分子の移動を促進することによって、コンジュゲートをポスト－インサーション法によってＬＮＣのシェルに挿入した。改変ＬＮＣを、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｇ２ ＭＷＣＯ ３００ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）を使用して一晩ＤＰＢＳに対して透析し、続いて、さらなる精製のためにＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４ ＭＷＣＯ １００ｋＤａ遠心分離フィルタ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を使用して２回（１５分、４０００ｇ）遠心分離した。

その目的のために、最初に、ペプチドの環状構造上に存在するチオール基とマレイミドとの間の共役化学を用いて、リガンド分子を両親媒性ＤＳＰＥ－ＰＥＧ ２０００－マレイミドにカップリングさせた。次に、コンジュゲートまたはＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ ２０００を、ポスト－インサーション法［Ｐｅｒｒｉｅｒ Ｔ．ら、Ｐｏｓｔ－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＮＣｓ）：Ｆｒｏｍ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｔｏ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，３９６，２０１０］によってＬＮＣのシェルに挿入した。

リガンドとして、非常に強力でαｖβ３インテグリン特異的な小さな環状ペプチドであるシクロ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）（ＲＧＤ）を使用した。

実施例２
脂質ナノ粒子の標的化投与
本発明者らによって選択された標的化概念は、以下のようにインビボで証明された：１００μｌの２０ｍｇ／ｍｌ ＬＮＣまたはＲＧＤ－ＬＮＣのいずれかを健康なマウスに全身注射し、１時間循環させた。その後、マウスを屠殺し、内容物の血液、臓器および眼を採取した。血液、臓器および眼を溶解緩衝液中でホモジナイズし、その後、すべてのサンプルを遠心分離し、上清中のナノ粒子濃度を蛍光によって測定した。実際のナノ粒子含有量は、規定のナノ粒子量でホモジネートをスパイクすることによって各臓器に対して個々に作成した検量線を使用して定量化した。

本発明者らは、ＲＧＤ－ＬＮＣが血液中を十分に循環することができ、さらに、改変されていないＬＮＣとは対照的に、拡張された血液循環を示したことを見出した（図２）。さらに、ＲＧＤで改変されたＬＮＣは、改変されていないＬＮＣとは対照的に、眼に効率的に蓄積することができ（図３）、バイオアベイラビリティが１０倍向上することが明らかである。

眼におけるナノ粒子局在化のより深い洞察のために、網膜フラットマウントの蛍光顕微鏡写真を撮影した（図４）。その目的のために、１００μｌの２０ｍｇ／ｍｌ ＬＮＣまたはＲＧＤ－ＬＮＣのいずれかを健康なマウスに全身注射し、１時間循環させた。その後、マウスを屠殺し、眼を回収し、４％ ＰＦＡに１時間入れた。次いで、網膜を単離し、網膜フラットマウントを調製した。その後、蛍光顕微鏡を使用して蛍光標識ＬＮＣを検出した。網膜微小血管系に結合するＲＧＤ－ＬＮＣは明確であったが、改変されてＬＮＣは網膜においてほとんど見られなかった。網膜血管系をより詳細に見ることによって、ＲＧＤ－ＬＮＣは、網膜のｚスタック全体を通る蛍光によって示される網膜のすべての異なる神経叢内に蓄積することができるだけでなく、より小さい血管およびより大きい血管にも結合する（図４）。

図５は、ＲＧＤ－ＬＮＣおよびＬＮＣの適用（白色）ならびに１時間の循環時間後のマウス後眼の詳細な画像を示し、核はＤＡＰＩで染色され（青色）、Ｆ－アクチンは、組織におけるより良好な配向のためにファロイジン－ＴＲＩＴＣで染色された（オレンジ色）。拡大された部分（ローザ・スクエア（ｒｏｓａ ｓｑｕａｒｅ））をより詳細に見ることによって、網膜血管におけるＲＧＤ－ＬＮＣの蓄積、ならびにＲＰＥおよび脈絡膜血管におけるさらなる蓄積を見ることができる。特に、改変されていないＬＮＣと比較される。これらの所見は、ＲＧＤで改変されたＬＮＣが効率的に後眼を標的化することができることを明確に確認する。さらに、ＲＧＤ－ＬＮＣは、病理学的症状発現の部位ならびに病理機構の中心的な支柱を標的とすることによって二重の作用（double-play）を可能にする。

それを最大限に利用するために、異なる位置で様々な効果を有する活性化合物をナノ粒子に負荷した。その目的のために、免疫抑制剤として周知であり複数の細胞内部位でＶＥＧＦシグナル伝達経路を妨害する薬物シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）を選択した［Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ．，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，１９９１］。ＣｓＡは、細胞内ＶＥＧＦシグナル伝達経路を抑制することができ、内皮細胞の発芽および増殖を緩和する。さらに、ＣｓＡは、網膜におけるＶＥＧＦの主な供給源であるＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦ産生のＴＧＦβ関連の増加を打ち消す［Ｒａｆｉｅｅ，Ｐ．ら、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ＶＥＧＦ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．，Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｕｎ．Ｓｉｇｎ．，２，２００４］。さらに、ＣｓＡは抗炎症能を有し、インターロイキン－１βレベルを低下させる。それに加え、ＣｓＡは、糖尿病の動物モデルにおいて血液網膜関門の損傷を回復させる［Ａ．Ｃａｒｍｏら、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ－Ａ ｏｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｒｅｔｉｎａｌ ｂａｒｒｉｅｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，９，２０００］。ＣｓＡが移植患者による経口投与後の糖尿病性網膜症の進行を有意に示すが中程度に緩和したという事実は、高い治療可能性を実証するが、眼血管系における利用可能性は不十分である［Ｖ．Ｃ．Ｃｈｏｗら、Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ａｆｔｅｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｋｉｄｎｅｙ－ｐａｎｃｒｅａｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１３，１９９９］。

ＣｓＡは親油性が高いため、初期エマルジョンの油相に直接溶解し、標準プロトコルに従って粒子を調製した（実施例１参照）。６７％の値および３４．１ｍｇ／ｇ ＬＮＣの薬物ペイロードで高いカプセル化効率が達成された。

実施例３
未熟児網膜症のマウスモデル
インビトロおよびインビボで標的化戦略を確認した後、未熟児網膜症（ＲＯＰ）のマウスモデルを使用することによって、新生血管眼疾患の処置のための治療概念を証明した。この疾患モデルは、未熟児網膜症および糖尿病性網膜症の標準モデルであると考えられ、網膜のホールマウントを介した血管新生の直接評価が最も意味のある結果である［Ｃｏｎｎｏｒ Ｋ．Ｍ．，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ：ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｖｅｓｓｅｌ ｌｏｓｓ，ｖｅｓｓｅｌ ｒｅｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，４，２００９］。

７日齢の仔マウス（生後７日目＝Ｐ７）を密閉インキュベーター内で高酸素条件（７５±２％酸素）に５日間曝露した。５日後、Ｐ１２（生後１２日目＝Ｐ１２）マウスを室内空気に戻した。最大の網膜血管新生は、室内空気に戻した５日後にＰ１７（生後１７日目＝Ｐ１７）において生じることが知られている。その目的のために、マウスを２０μｌのＤＰＢＳ（対照と呼ばれる）、２０ｍｇ／ｍｌ ＲＧＤ－ＬＮＣ、２０ｍｇ／ｍｌ ＣｓＡ負荷ＲＧＤ－ＬＮＣまたは０．６８ｍｇ／ｍｌ遊離ＣｓＡのいずれかによってＰ１２において処置した。Ｐ１２における単回処置の後、マウスをＰ１７において麻酔し、血管染色のために２ｍｌのＦＩＴＣデキストラン（緑色）で灌流した。その後、眼を回収し、網膜フラットマウントを調製した。それらのホールマウントを、蛍光顕微鏡を使用して全体として画像化した。さらに、全網膜領域および新生血管領域を測定することができ、パーセンテージ比として定量化することができる。

図６は、ＣｓＡ負荷ＲＧＤ－ＬＮＣがＶＥＧＦ－Ｒ２発現を正常値まで減少させる能力を実証するが、健康なマウスではＶＥＧＦ－Ｒ２レベルは変化しない。より具体的には、図６は、ＤＡＰＩおよび抗ＶＥＧＦ－Ｒ２抗体で染色した凍結切片を示す。ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣを用いた処置は、ＶＥＧＦ－Ｒ２発現を健康（「正常」）レベルまで減少させた。内皮およびＲＰＥ細胞特異的な抗ＶＥＧＦ治療により、ＶＥＧＦシグナル伝達経路が妨害され、ＶＥＧＦ－Ｒ２発現が抑制されるのではなく正常化されることを示している。

最後に、網膜血管新生に対する効果を調べた。図７は、網膜症を有するマウスの場合の、ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣ処置マウスと対照マウスとの間の検出可能な差を伴う、Ｐ１７における可視化された網膜血管新生を示す。マウスを酸素正常状態下に維持し、網膜血管新生を検出することができない場合、ナノ粒子投与後に網膜血管にネガティブな影響は見られなかった。ＣｓＡ ＲＧＤ－ＬＮＣの予防的投与は網膜血管系に害を及ぼさない可能性があることを示している。さらに、対照マウスとＲＧＤ－ＬＮＣ処置マウスまたはＣｓＡ処置マウスとの間に大きな違いは見られない。血管新生の範囲は、網膜領域全体に関連する血管新生のパーセンテージとして定量化することができ、それによって主観的評価を定量化することができる。図８は、適用された処置とは無関係に、健康なマウスの血管新生の量に差がないことを明らかにする。網膜症を有するマウスの場合、薬物非含有ＲＧＤ－ＬＮＣはわずかであるが有意な効果を示すが、薬物負荷ＲＧＤ－ＬＮＣはＰ１２における１回の処置後の血管新生に多大な効果を及ぼすようであり、遊離ＣｓＡは全く効果がないようである。これは、本発明によるリガンドがグラフトされた送達システムが満足のいく結果を達成するために必要であることを明らかにする。

リガンドがグラフトされた送達システムが薬物の有効性にとって必須であるという仮定を証明するために、Ｐ１２において処置された網膜症を有するマウスのＰ１７におけるＣｓＡの量をＵＨＰＬＣ－ＭＳによって測定した。その目的のために、処置マウスをＰ１７において麻酔し、眼を回収し、水晶体を含む眼の前部を廃棄した。次いで、後眼部をメタノールに入れ、ホモジナイズし、遠心分離し、濾過し、ＵＨＰＬＣ－ＭＳを用いて分析した。ＣｓＡがスパイクされた未処置マウスの眼から調製した検量線を用いてサンプルを定量化した。図９は、送達システムが使用される場合にのみ、ＣｓＡが依然として存在することが明らかであり、眼におけるＣｓＡの延長された滞留時間および薬物の利用可能性の増加を示している。

未熟児網膜症の病理機構を理想的に模倣するこのモデルでは、ＣｓＡ負荷ＲＧＤ－ＬＮＣは、血管新生を直接阻害することができるため、病因全体、特に網膜の血管新生に対して多大な効果を示す。

実施例４
脂質ナノ粒子の標的化投与
実施例２で調製した脂質ナノ粒子を、実施例２に記載したように健康なマウスに静脈内投与し、１時間循環させた。その後、マウスを屠殺し、眼を回収し、固定し、凍結保護した。その後、矢状凍結切片を調製し、ＤＡＰＩで染色して蛍光顕微鏡画像を撮影した。画像は図１０に示されており、視神経細胞および視神経に隣接するＲＰＥ領域におけるＲＧＤ－ＬＮＣの蓄積を実証し、したがってそのようなナノ粒子によって視神経細胞を有効に標的化する可能性を実証し、それによって視神経症、特に緑内障の有効な処置（単なる対症的な処置とは対照的に）を可能にする。本発明の実施形態によれば、ナノ粒子には、抗炎症薬、免疫抑制薬、および／または神経保護薬が負荷されてもよく、次いで、ナノ粒子の標的化により、視神経または視神経に直接近接するＲＰＥの領域に蓄積されるようになり得る。

前述の実施例は、本発明によるナノ粒子が、α_ｖβ_３－インテグリンリガンド（ＲＧＤ）などの適切なリガンドおよびシクロスポリンＡなどの薬物とナノ粒子との新規な組み合わせを利用することを示す。この組み合わせは、全ての網膜疾患および視神経症、特に新生血管眼疾患および緑内障のための全身的な細胞特異的治療を可能にし、これは、あらゆる点で現在の治療状況の改善を意味する。

Claims (15)

1. 患者における網膜疾患または視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分の１種または数種を有効に予防または処置する方法における使用のためのナノ粒子であって、
   －抗炎症活性、免疫抑制活性、抗血管新生活性、神経保護活性、遺伝子治療活性および遺伝子発現に対する調節活性のうちの１種または数種を有する薬物を含むコア；
   －前記コアを取り囲む両親媒性シェルであって、少なくとも１つのリン脂質および必要に応じて少なくとも１つの界面活性剤を含む、両親媒性シェル；
   －網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面上に発現される受容体に結合する標的化リガンドであって、前記両親媒性シェルに共有結合している、標的化リガンド；
   を含む、ナノ粒子。
2. 前記網膜疾患または前記視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分および神経変性成分の前記１種または数種を有効に予防または処置することが、以下：
   －網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における前記薬物の細胞内利用可能性の増加；
   －眼、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における前記薬物の延長された滞留時間；
   －眼におけるＶＥＧＦシグナル伝達経路との干渉；
   －網膜血管新生の抑制または減少
   －眼における炎症の抑制または減少；
   －眼における免疫応答の抑制または減少；および
   －眼における神経変性およびニューロン細胞死の抑制または減少
   のうちの１種または数種で顕在化する、請求項１に記載の使用のためのナノ粒子。
3. 前記網膜疾患が、網膜ジストロフィー、例えば遺伝性網膜ジストロフィー；ならびに新生血管網膜疾患、例えば未熟児網膜症（ＲＯＰ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ）；から選択され、前記視神経症が、緑内障、特に開放隅角緑内障または閉塞隅角緑内障である、請求項１～２のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子。
4. －網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における前記薬物の細胞内利用可能性の前記増加は、前記薬物がナノ粒子内に含まれない遊離薬物として投与された場合に観察される網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における前記薬物の細胞内利用可能性と比較した、前記薬物の細胞内利用可能性の増加であり、好ましくは、前記増加は、２～５倍の範囲の増加である；ならびに／あるいは
   －眼、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における前記薬物の前記延長された滞留時間は、眼、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視神経細胞および／または眼内皮細胞における、少なくとも１日～少なくとも５日の範囲である前記薬物の滞留時間である；ならびに／あるいは
   －眼におけるＶＥＧＦシグナル伝達経路との前記干渉は、ＶＥＧＦ受容体、特にＶＥＧＦ－Ｒ２受容体の発現もしくは活性の阻害であるか、またはＶＥＧＦの発現もしくは活性の阻害である；ならびに／あるいは
   －網膜血管新生の前記減少は、前記網膜疾患に罹患した未処置の網膜で観察される網膜血管新生の５０％またはそれ未満、好ましくは２０％またはそれ未満、より好ましくは１５％またはそれ未満への網膜血管新生の減少である；ならびに／あるいは
   －眼における炎症の前記減少は、前記網膜疾患に罹患した未処置の眼で観察される炎症の５０％またはそれ未満、好ましくは２０％またはそれ未満への炎症の減少である；ならびに／あるいは
   －眼における免疫応答の前記減少は、前記網膜疾患に罹患した未処置の眼で観察される免疫応答の５０％またはそれ未満、好ましくは２０％またはそれ未満への免疫応答の減少である；ならびに／あるいは
   －眼における神経変性およびニューロン細胞死の前記減少は、前記視神経症に罹患した未処置の眼において観察されるニューロン細胞死のレベルの８０％またはそれを超える％への、好ましくは５０％またはそれを超える％への、より好ましくは３０％またはそれを超える％への、ニューロン細胞死の減少である、
   請求項２～３のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子。
5. 網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または内皮細胞および／または視神経細胞の表面上に発現される前記受容体が、Ｇタンパク質共役受容体、インテグリン、およびスカベンジャー受容体から選択され、好ましくは、前記インテグリンが、ανβ３－インテグリンおよびανβ５－インテグリンから選択され、より好ましくは、前記標的化リガンドが、アミノ酸配列ＲＧＤを有するペプチド、シクロ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）のアミノ酸配列を有する環状ペプチドおよびその誘導体から選択されるか、または好ましくは、前記スカベンジャー受容体がＣＤ３６であり、より好ましくは、前記標的化リガンドがリン脂質である、請求項１～４のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子。
6. 抗炎症活性、免疫抑制活性、抗血管新生活性、神経保護活性、遺伝子治療活性、および遺伝子発現に対する調節活性の１種または数種を有する前記薬物が、抗炎症薬、免疫抑制薬、抗血管新生薬、神経保護薬、および核酸から選択される、請求項１～５のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子。
7. －前記抗炎症薬が、糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン、プレドニゾロン；ＣＯＸ阻害剤、例えばセレコキシブ、エトリコキシブ、ロフェコキシブ、ルミラコキシブおよびパレコキシブ；非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、メロキシカム、ジクロフェナク、エトドラク、スリンダクおよびインドメタシン；抗炎症プロドラッグ、例えばスルファサラジン；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡ；可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の活性化剤、例えばシナシグアトから選択され；
   －前記免疫抑制薬が、ＴＮＦ－α阻害剤、例えばエタネルセプトまたはアダリムマブ；シクロスポリン、例えばシクロスポリンＡ；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばエベロリムスまたはシロリムス；カルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムス、イノシンモノホスフェート－デヒドロゲナーゼ阻害剤、例えばミコフェノラート；葉酸アンタゴニスト、例えば、メトトレキサートおよびメトトレキサート類似体；ニトロイミダゾール系免疫抑制剤、例えばアザチオプリン；ジヒドロ－オロト酸－デヒドロゲナーゼ阻害剤、例えばレフルノミドから選択され；
   －前記抗血管新生薬が、抗ＶＥＧＦ薬、特にＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）またはＶＥＧＦの阻害剤、例えばシクロスポリンＡ、アフリベルセプトまたはラニビズマブ；抗真菌薬、例えばアルベンダゾールまたはイトラコナゾール；葉酸アンタゴニスト、例えば、メトトレキサートおよびメトトレキサート類似体；チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブ、ダサチニブ、バタラニブ、アレクチニブ、スニチニブ、ソラフェニブまたはエルロチニブ；抗糖尿病薬、例えばグリメピリドまたはグリベンクラミド；三環系抗うつ薬、例えばアミトリプチリン；スタチン、例えばシンバスタチン、フルバスタチンまたはアトルバスタチン；サルタン、例えばテルミサルタン；クマリンおよびクマリン誘導体；およびＩＧＦ－１受容体阻害剤から選択され；
   －前記神経保護薬が、免疫抑制薬、抗炎症薬および抗酸化薬、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、特にタクロリムス、補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ１０）、ビタミンＥ、シチコリン（シチジン５’－ジホスホコリン）、パルミトイルエタノールアミド、メラトニン、ＳＣ７９（エチル２－アミノ－６－クロロ－４－（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチル）－４Ｈ－クロメン－３－カルボキシレート）、神経成長因子（ＮＧＦ）、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）から選択され；ならびに
   －前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、前述のいずれかのオリゴヌクレオチド、特に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される、
   請求項６に記載の使用のためのナノ粒子。
8. 前記ナノ粒子が脂質ナノ粒子であり、前記シェルが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトールモノホスフェート、ホスファチジルイノシトールビスホスフェート、ホスファチジルイノシトールトリホスフェート、セラミドホスホリルコリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルリピドおよび前述のいずれかの混合物から選択されるリン脂質を含み、前記シェルが、グリセリルリシノレエートまたはレシチンなどの界面活性剤、好ましくはペグ化界面活性剤、より好ましくはグリセロールポリエチレングリコールリシノレエートから選択される界面活性剤をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子。
9. 前記コアが、
   ａ）油性コアであり、前記薬物が親油性（ｌｉｐｏｈｉｌｉｃ）薬物であり、好ましくはシクロスポリンＡ；可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の活性化剤、例えばシナシグアト；糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン；スタチン；タクロリムス、補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ１０）、ビタミンＥ、シチコリン、パルミトイルエタノールアミド、メラトニンおよびＳＣ７９から選択される；あるいは
   ｂ）水性コアであり、前記薬物が親水性薬物であり、好ましくは抗ＶＥＧＦペプチドおよび抗ＶＥＧＦＲペプチド、例えばアフリベルセプトまたはラニビズマブ；三環系抗うつ薬、例えばアミトリプチリン；および成長因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）から選択される、
   先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子、特に、請求項８に記載の使用のための脂質ナノ粒子。
10. 前記コアが、油性または水性相および前記薬物を含み、前記薬物が、前記油性または水性相に分散しており、前記薬物が、好ましくは粒子の形態で、例えばナノ粒子の形態で前記油性または水性相に分散しており、より好ましくは、前記薬物が親油性薬物または親水性薬物であり、さらにより好ましくは、前記薬物が、シクロスポリンＡ；可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の活性化剤、例えばシナシグアト；糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン；スタチン；タクロリムス、補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ１０）、ビタミンＥ、シチコリン、パルミトイルエタノールアミド、メラトニン、ＳＣ７９、抗ＶＥＧＦペプチドおよび抗ＶＥＧＦＲペプチド、例えばアフリベルセプトまたはラニビズマブ；三環系抗うつ薬、例えばアミトリプチリン；および成長因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子、特に、請求項８～９に記載の使用のための脂質ナノ粒子。
11. 前記コアが溶媒および前記薬物を含み、前記薬物が前記溶媒に溶解または分散しており、好ましくは、前記溶媒が脂質、特にモノ－、ジ－またはトリ－グリセリド（ｔｒｉｇｙｌｃｅｒｉｄｅ）であるかまたはそれを含み、より好ましくは、前記モノ－、ジ－またはトリ－グリセリドの脂肪酸成分が、６～１８個の炭素原子、さらにより好ましくは８～１８個の炭素原子、さらにより好ましくは８～１６個の炭素原子の範囲の鎖長の脂肪酸を有する、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子、特に、請求項８～１０に記載の使用のための脂質ナノ粒子。
12. 前記ナノ粒子、特に前記脂質ナノ粒子が、５ｎｍ～１００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ～８０ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ～６０ｎｍ、さらにより好ましくは３０ｎｍ～６０ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１～１１のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子、特に請求項８～１１のいずれかに記載の使用のための脂質ナノ粒子。
13. 前記ナノ粒子が、複数のナノ粒子のサンプルとして患者に投与された場合、インテグリンに結合する標的化リガンドを有しないナノ粒子と比較して、前記患者の血液、脾臓および眼の少なくとも１つにおいて３倍超、好ましくは４倍超の濃縮を示し、より好ましくは、前記濃縮は前記患者の眼において５倍超である、請求項１～１２のいずれかに記載の使用のためのナノ粒子、特に請求項８～１２のいずれかに記載の使用のための脂質ナノ粒子。
14. 前記ナノ粒子が、複数のナノ粒子のサンプルとして患者に投与された場合に、前記患者の眼における濃縮を示し、好ましくは前記濃縮が、前記眼の網膜または視神経中もしくは視神経において、より好ましくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞または眼内皮細胞または視神経細胞において、さらにより好ましくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および前記網膜の微小血管系において生じる、請求項１３に記載の使用のためのナノ粒子、特に請求項１３に記載の使用のための脂質ナノ粒子。
15. 前記網膜疾患または前記視神経症の炎症性成分、免疫応答成分、血管新生成分、および神経変性成分のうちの１種または数種を有効に予防または処置する前記方法において、前記ナノ粒子は、複数のそのようなナノ粒子のサンプルとして患者に投与され、そのような投与は、
    ａ）好ましくは静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻投与、肺投与、より好ましくは静脈内投与から選択される、全身投与、または
    ｂ）好ましくは眼内投与、網膜下投与、および角膜への投与、より好ましくは硝子体内投与、さらにより好ましくは前記患者のそれぞれの眼の網膜の近傍における、局所投与
    として行われる、
    先行する請求項のいずれかに記載の使用のための脂質ナノ粒子、特に、請求項８～１４に記載の使用のための脂質ナノ粒子。

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