JP2023517193A - 移植用前処置レジメン - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞、組織または臓器、任意に造血幹細胞／前駆細胞を対象に移植するための前処置レジメンに関する。本発明はまた、対象において造血キメリズムを誘導する方法に関する。本発明はまた、対象の疾患または状態の予防または治療方法であって、その後の療法による対象の利益を向上させるために、造血キメリズムを誘導する方法にも関する。その後の療法は、細胞、組織または臓器の移植であってもよいし、遺伝子改変造血幹細胞／前駆細胞を用いて実施される遺伝子療法であってもよい。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、細胞、組織または臓器、任意に造血幹細胞／前駆細胞（HSPC）を対象に移植するための前処置レジメンに関する。本発明はまた、対象において造血キメリズムを誘導する方法に関する。本発明はまた、対象の疾患または状態の予防または治療のための方法であって、その後の療法による対象の利益を向上させるために、造血キメリズムを誘導する方法に関する。その後の療法は、細胞、組織または臓器の移植であってもよいし、遺伝子改変HSPCを用いて実施される遺伝子療法であってもよい。

発明の背景
組織／臓器移植は、急性および／または慢性の拒絶反応によって傷つけられ、移植片の不全につながる可能性がある。急性および慢性の拒絶反応は、両方とも、典型的には、感染のリスクを増加させ、癌のリスクを増加させ、また、（移植片などの）臓器不全を引き起こし得る免疫抑制剤によって治療される。（移植の免疫寛容を確立することによって）免疫抑制の必要性を減らすことができる技術は、典型的には細胞、組織または臓器の移植の前に骨髄移植（BMT）での造血幹細胞および前駆細胞を同じドナーから移植することによる造血キメリズムの誘導である。誘導キメリズムは、本来ドナーの造血系と同じ免疫学的プロファイルを持つ移植片を攻撃しないキメラ免疫系をもたらし、一方で、無関係な抗原に反応するレシピエントの正常な免疫能を保持するものである。

残念ながら、HSPCの移植に関わる複雑な免疫学は、特に移植前にドナー抗原に対する感作があった場合、問題となることがある。ドナーおよびレシピエントの免疫系の存在により、ヒト型および細胞型の両方の要素を持つ急性および慢性の拒絶反応が起こる可能性がある。旺盛な宿主対移植片反応（HVG）と移植片対宿主病（GVHD）の両方が観察される。しばしば、移植された細胞はレシピエントにおいてうまく生着しない。現在の方法は、移植前と移植後の免疫抑制によってこれらの問題に対処しようとするものである。移植前に行われる工程は、前処置レジメンと呼ばれ、免疫抑制だけではない治療が含まれることがある。例えば、レシピエントの既存の骨髄細胞の一部または全部を除去し、移植細胞の生着スペースを確保するために、放射線が使用されることがある。しかし、生着がうまくいかないことが多い。HSPCの移植には、改善された前処置レジメンが必要である。

発明の要旨
造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）の移植のための前処置レジメンとしては、典型的には、直接的（例えば、プラズマフェレーシスまたはDSAを吸着する不一致血小板輸血の投与による）または間接的に抗体生成を阻害する（例えば、リツキシマブまたはボルテゾミブを用いる）ことのいずれかによる、Tリンパ球除去および／またはドナー特異的抗体（DSA）を低減する治療が挙げられる。しかし、既存の前処置レジメンは有効でないことが多く、生着がうまくいかないことが多い。これは、骨髄由来の細胞におけるMHCの高発現が、残存する機能的DSAに対する感受性を高めるからかもしれない。

本発明者らは、驚くべきことに、対象の血清IgGの酵素不活性化などの前処置レジメンが、（従来用いられてきた抗体除去技術とは対照的に）生着率を著しく向上させるので、対象の造血キメリズムをもたらす可能性がより高いことを示している。

本発明は、対象にHSPCを移植するための前処置レジメンであって、対象の血清IgG分子を不活性化する酵素を、対象に投与することを含む、前処置レジメンを提供する。投与される前記酵素の量は、好ましくは、対象の血清中に存在する全てのまたは実質的に全てのIgG分子を不活性化するのに十分な量である。

該前処置レジメンは、さらに、以下の一つ以上を含んでもよい：
(a）非致死量の照射および／または対象のHSPCを除去する任意の他の薬剤の対象への投与
(b）対象におけるリンパ球の数を減少させるおよび／または活性を下方制御する薬剤の投与であって、前記リンパ球が以下を含む：
i. T細胞；および／または
ii. B細胞（任意に抗体産生細胞を含む）；
(c）免疫系の活性を低下させる任意の他の薬剤またはレジメン、例えば、補体の阻害剤、サイトカインの阻害剤、自然免疫細胞の阻害剤、寛容の誘導剤の投与。

前処置レジメンは、好ましくは少なくとも（a）を含むが、最も好ましくは少なくとも（a）および（b）を含む。

本発明はまた、対象において造血キメリズムを誘導する方法を提供し、この方法は、本発明の前処置レジメンを実施し、その後、対象における造血キメリズムの誘導に十分な量および適した条件下で、対象にHSPCを投与することを含む。HSPCは、自家（対象自身の細胞を使用）または同種（細胞は別のドナーに由来）であってもよい。HSPCは遺伝子改変であってもよく、その場合、自家であることが望ましい。遺伝子改変は任意の遺伝子を発現させるものであってもよいが、典型的にはレシピエントにとって療法上有益な遺伝子であり、その場合、HSPCは遺伝子療法を発現していると称されることがある。HSPCは、好ましくは同種細胞または遺伝子改変された自家細胞である。HSPCは、最も好ましくは同種である。

本発明はまた、対象の疾患または状態の予防または治療のための方法であって、前記疾患または状態に対する療法の対象への利益を向上させるために、本発明の方法に従って、対象に造血キメリズムを誘導する方法を提供する。前記療法は、細胞、組織または臓器の移植であってよく、典型的には、HSPCと同じドナーからの移植である。移植される細胞、組織または臓器は、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸、皮膚、血管／血管組織、顔、腕、気管、眼の一部、膵島、黒質、骨髄または幹細胞などの任意のタイプのものであってよい。移植される細胞は、追加の療法が必要ないように、方法自体で使用されるのと同じHSPCなど、任意のタイプのものであってよい。

すなわち、本発明はまた、細胞、組織または臓器移植の免疫拒絶反応の予防または治療のための方法を提供し、この方法は、本発明の方法に従って対象において造血キメリズムを誘導すること、および対象に対して細胞、組織または臓器移植を適用することを含み、任意に、前記細胞、組織または臓器はHSPCと同じドナーからのものである。細胞、組織または臓器は、典型的には、対象において造血キメリズムが誘導された後に投与される。細胞、組織または臓器の移植は、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸、皮膚、血管／血管組織、顔、腕、気管、眼の一部、膵島、黒質、骨髄または幹細胞など、任意のタイプのものであってよい。移植される細胞は、追加の移植が必要ないように、造血キメリズムを誘導するために使用されるのと同じHSPCなど、任意のタイプのものであってよい。

別の方法で表現すると、本発明は、細胞、組織または臓器移植の免疫拒絶反応を予防または治療するための方法を提供し、以下を含む：
(i)本発明の前処置レジメンを実施すること；
(ii)対象において造血キメリズムを誘導するのに十分な量および適切な条件下で、対象にHSPCを投与すること；および
(iii)HSPCと同じドナーからの細胞、組織または臓器移植を対象に適用すること、任意に、前記移植は工程(ii)におけるHSPCの投与である。

工程（iii）の細胞、組織または臓器が工程（ii）のHSPCである場合、本発明の方法は、HSPCの移植により治療される疾患または状態の治療方法であってもよい。HSPCが遺伝子療法を施すために遺伝子改変されたものである場合、本発明の方法は、前記遺伝子療法が対象とする疾患または状態の予防または治療のためのものであってもよい。

図１.EndoSは、ドナー骨髄細胞のモノクローナルDSA媒介死滅を阻害する。ナイーブNOD（パネルA-B）またはB6.H-2^g7（パネルC-D）に、CFSE標識NOD/CTV標識B6骨髄細胞（BMC；パネルA-B）またはCFSE標識B6.H-2^g7/CTV標識NOD.H-2^bBMC（パネルC-D）の混合物を注入する４時間前に30μg EndoSおよび／または抗H-2K^b mAb（10μgまたは100μg）を静脈内投与した。NOD（パネルA）およびB6.H-2^g7（パネルC）の実験プロトコルを示す。骨髄移植（BMT）後1から3時間で採取した血液（左パネル）、BMT後4時間で採取した宿主脾臓（中央パネル）および骨髄（BM、右パネル）中のNOD細胞に対する色素標識B6（パネルB）、またはB6.H-2^g7細胞に対するNOD.H-2^b（パネルD）の比率を示す。平均値±SEMを示す。データは5回（パネルB）および4回（パネルD）の独立した実験からプールされた。Mann-Whitney U test（中央および右パネル）は、示された比較のために使用された；*p<0.05および**p<0.01。 図２.EndoS－イムリフィダーゼは感作レシピエントのドナーBMCのDSA媒介死滅を減少させる。(A-C）ナイーブNODマウスを、EndoS－イムリフィダーゼ投与の4週間前にFVB脾臓細胞で免疫化した。血清を免疫前、酵素処置前と酵素処置の4時間後に採取した。左の代表的なヒストグラムは、1：25希釈での血清を伴う、DSA-IgG Fc（パネルA）、DSA-IgG₁ Fc（パネルB）、DSA-IgG₃ Fc（パネルC）およびDSA-IgG₃重鎖（パネルD）のものである。滴定血清中のDSAの平均蛍光強度（MFI）を右側に示す。平均±SEMを示す。各血清希釈での酵素処置前後のDSAのMFIの比較には、Ratio paired t-検定を用い、*p<0.05、**p<0.01とした。(D)E-Fに示した実験の概略。ナイーブNODマウスをT細胞除去mAbの注射の4週間前にB6.CD45.1脾臓細胞で免疫化した。T細胞除去の2日後にEndoS－イムリフィダーゼを投与した。酵素処置4時間後に、NODマウスに8000万個のB6.CD45.2骨髄細胞を静脈内注射した。脾臓細胞および骨髄細胞は、MHC-I H-2K^bおよびCD45.2の発現について分析した。(E-F)4つの異なる処置群（左側）とドナー細胞の割合（右側、平均±SEM）の代表点描画を示す。Holm-Sidakの多重比較付きone-way ANOVAを使用して、3つの感作群間の値を比較し、*p<0.05とした。 図３.BMT前のボルテゾミブ／シクロホスファミドは感作されたレシピエントにおける骨髄B細胞を減少させる。(A）B-Eに示す実験の概略。FVB脾臓細胞による免疫の4週間後に、NODマウスにシクロホスファミドとボルテゾミブ（CyBor）を静脈内処置した。CyBor処置の4日後に、2000万FVB BMCを用いた骨髄移植が行われた。解析のためにBMTの5日後に脾臓細胞および骨髄細胞を採取した。血清はCyBor処置前とBMT後5日目に採取した。CyBorまたはビヒクルを与えたマウスの骨髄（パネルB）および脾臓（パネルC）におけるB細胞および形質細胞の細胞数を示す。(D）免疫化前およびBMT後5日、すなわちCyBor処置後9日目に血清を採取した。個々の対照（左側）またはCyBor処置マウス（右側）からの滴定血清中のDSA-IgG FcのMFIを示す。(E）処置前と比較した1：25希釈でのDSAのMFIにおける9日目のパーセンタイル変化を示す。塗りつぶした記号と空の記号は、2つの別々の実験で収集されたデータを表す。 図４.EndoS－イムリフィダーゼは、前感作レシピエントにおける造血キメリズムを可能にする。(A)キメリズム誘導プロトコルの概略；ナイーブB6.H-2^g7またはNODマウスをFVB脾臓細胞でキメリズム誘導の4から6週間前に免疫化した。キメリズム誘導のために、CyBorをBMTの日を基準にして－4日目に与えた。T細胞除去（TCD）抗体を－2、2、6、11および16日目にi.p.投与した。FVB脾臓細胞に感作されたレシピエントには、－6日目にEndoS－イムリフィダーゼをi.v.処置し、0日目にはBMTの4時間前に反復投与で処置した。0日目のBMTの4時間前に6Gyの全身照射を行った。0日目にFVB BMC（80×10⁶）を与えた。（B）末梢血中のリンパ球ゲートにおけるドナー細胞の割合を経時的に示す。(C）ナイーブNODキメラ（n＝4、左側、平均±SEM）およびプライムNODキメラ（n＝2、右側）からの末梢血中のリンパ球ゲートにおけるドナー細胞の異なる系譜の割合を示す。データは6つの独立した実験からプールされた。 図５.平均イムリフィダーゼ濃度対投与からの名目時間(N=15)。データBLQはBLQ/2として平均値に含まれる。SDはバーで示す。 図６.イムリフィダーゼによるrATGのインビトロ切断の経時。カラムは、イムリフィダーゼ後のウェスタンブロット上で目に見える無傷のrATGを伴う対象の数を示す（N=11）。

配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を含むIdeSの全配列である。それはNCBI参照配列番号WP_010922160.1としても利用できる。
配列番号２は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を欠く、IdeSの成熟配列である。それはGenbank受入番号ADF13949.1としても利用できる。
配列番号３は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を含むIdeSの全配列である。それはNCBI参照配列番号WP_014622780.1としても利用できる。
配列番号４は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を欠く、IdeZの成熟配列である。
配列番号５は、ハイブリッドIdeS/Zの配列である。Ｎ末端は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を欠くIdeZに基づいている。
配列番号６から２５は、本発明の方法に使用するための例示的なプロテアーゼの配列である。
配列番号２６は、IdeSポリペプチドの配列である。追加のＮ末端メチオニンおよびヒスチジンタグを伴う、配列番号２の配列（内部標準のpCART124）を含む。
配列番号２７は、IdeZポリペプチドの配列である。追加のＮ末端メチオニンおよびヒスチジンタグを伴う、配列番号４の配列（内部標準のpCART144）を含む。
配列番号２８は、IdeS/Zポリペプチドの配列である。追加のＮ末端メチオニンおよびヒスチジンタグを伴う、配列番号５の配列（内部標準のpCART145）を含む。
配列番号２９は、配列番号３の６３位～７３位に対応する連続配列PLTPEQFRYNNである。
配列番号３０は、配列番号１の５８位～６５位に対応する連続配列PPANFTQGである。
配列番号３１は、配列番号３の３５位～５４位に対応する連続配列DDYQRNATEAYAKEVPHQITである。
配列番号３２は、配列番号１の３０位～４９位に対応する連続配列DSFSANQEIRYSEVTPYHVTである。
配列番号３３から５５は、上記に設定されたプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５６から６９は、本発明の方法に使用するための例示的なプロテアーゼの配列である。
配列番号７０は、配列番号１の３３６位～３３９位に対応する連続配列NQTNである。
配列番号７１は、配列番号１の３０位～４９位に対応する連続配列DSFSANQEIR YSEVTPYHVTである。
配列番号７２から８６は、本明細書に開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号８７は、配列番号１の３１位～４９位に対応する配列SFSANQEIRY SEVTPYHVTである。
配列番号８８は、IdeZポリペプチドNCBI参照配列番号WP_014622780.1の３６位～５４位に対応する、配列DYQRNATEAY AKEVPHQITである。
配列番号８９は、本発明のポリペプチドのＮ末端に存在し得る配列DDYQRNATEA YAKEVPHQITである。
配列番号９０は、EndoS (S.ピオゲネスのエンドグリコシダーゼ)の成熟配列である。

発明の詳細な説明
一般事項
開示された生成物および方法の異なる用途は、当該技術分野の特定のニーズに合わせて調整され得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の態様を説明するためのみのものであり、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。

更に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容がそうでないと明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリペプチド（a polypeptide）」への言及は、「ポリペプチド（polypeptides）」を含む、などとなる。

「ポリペプチド」は、本明細書においては、その最も広い意味において、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類縁体または他のペプチド模倣体の化合物を指すために用いられる。従って、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列、また並びにより長いポリペプチドおよびタンパク質を含む。本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸」は、ＤまたはＬの光学異性体の両方、並びにアミノ酸類縁体およびペプチド模倣体などの、天然および／若しくは非天然または合成のアミノ酸のいずれかを指す。

用語「患者」および「対象」は交換可能に用いられ、典型的には、ヒトを指す。IgGへの言及は、特に断らない限り、典型的にはヒトIgGを指す。

アミノ酸の同一性は、任意の適切なアルゴリズムを用いて算出され得る。例えば、PILEUPおよびBLASTアルゴリズムは、例えば、Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300;Altschul,S,F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10に記載の通り、（典型的にはそれらの初期設定で）相同性を算出し、または配列を整列する(line up)（均等または対応する配列を同定する等）ために使用され得る。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationによって公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアライメントされた場合に、ある正の値の(positive-valued)閾値スコアＴに一致するか、またはこれを満たすかのいずれかの、クエリ配列(query sequence)中の長さＷの短いワードを同定することにより、最初に、スコアの高い配列ペア(high scoring sequence pair,HSP)を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値(neighbourhood word score threshold)と呼ばれる(Altschul et al、上記)。これらの最初の近傍ワードのヒットは、それらを含有するＨＳＰを発見する検索を開始するためのシードとして機能する。累積アライメントスコア(cumulative alignment score)が増加し得る限り、該ワードヒットが、各配列に沿って両方向に伸長される。ワードヒットの各方向への伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアがその最大達成値(maximum achieved value)から量Ｘだけ低下するとき；１以上の負のスコアの残基アライメント(residue alignment)の累積に起因して累積スコアがゼロ以下になるとき；またはいずれかの配列の端部に到達するとき。BLASTアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度(sensitivity)および速度を決定する。BLASTプログラムは、初期設定として、ワード長(W)11、BLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919参照）アライメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=4、および両鎖の比較を使用する。

BLASTアルゴリズムは、２配列間の類似性(similarity)の統計解析を行う（例、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787参照）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の１基準(measure)は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸の２配列間の一致が偶然に起こる確率の目安を提供する、最小合計確率(smallest sum probability,P(N))である。ある配列が、別の配列と類似であるとみなされるのは、例えば、第１の配列と第２の配列との比較において、最小合計確率が約１未満である場合、好ましくは約0.1未満である場合、より好ましくは約0.01未満である場合、および最も好ましくは約0.001未満である場合である。あるいは、UWGCGパッケージは、同一性を算出するために用いられ得るBESTFITプログラム（例えば、その初期設定で用いられる）を提供する(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12:387-395)。

本明細書で引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、上記のものか下記のものかにかかわらず、参照によりその全体が、本明細書に組み込まれる。

前処置レジメン
本発明は、対象の血清IgG分子を不活性化する酵素を対象に投与することを含む、対象に細胞、組織または臓器を移植するための前処置レジメンを提供する。投与される前記酵素の量は、好ましくは、対象の血清中に存在する全てのまたは実質的に全てのIgG分子を不活性化するのに十分な量である。必要に応じて、2つ以上のIgG不活性化酵素を組み合わせて、同時または順次など任意の順序で投与することができる。

用語「血清IgG分子」または「血清中に存在するIgG分子」は、本発明の方法が実施される前にヒト組織中または循環中に存在する任意のガンマ免疫グロブリン（IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4）分子を指す。かかるIgG分子は、個々のB細胞から内因的に産生されてもよいし、－任意の起源の任意の療法IgG分子など本発明の方法が実施される前に対象に投与された外因性のガンマ免疫グロブリンであってもよい。血清IgGの不活性化は、典型的には、IgG分子のFc受容体相互作用の減少を意味する。用語「Fc受容体」は、細胞上に存在するFcガンマ免疫グロブリン受容体(FcγR)を指す。ヒトにおいて、FcγRは、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32A）、FcγRIIB（CD32B）、FcγRIIC（CD32C）、FcγRIIIA（CD16a）およびFcγRIIIB（CD16b）を含む受容体のファミリーの一つ、一部または全部を指す。本明細書で使用される場合、用語FcγRとしては、FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32A）、FcγRIIB（CD32B）、FcγRIC（CD32C）、FcγRIIIA（CD16a）およびFcγRIIIB（CD16b）の自然発生多型が挙げられる。

本発明の方法で使用される酵素は、血清IgGを不活性化する任意の酵素であってよいが、典型的には、抗原結合ドメインとFc相互作用ドメインが互いに分離するようにIgGを切断するIgGシステインプロテアーゼである。かかる場合、血清中の無傷のIgG分子の量が減少するため、血清IgG分子のFc受容体相互作用が減少する。別の例として、酵素は、IgGのFc相互作用ドメイン上の糖鎖構造、特にAsn-297位（Kabat numbering）におけるN-結合型二アンテナリア糖鎖を切断するIgGエンドグリコシダーゼであってもよい。この糖鎖構造は、Fc受容体との結合や補体の活性化において重要な役割を担っている。したがって、この糖鎖がタンパク質によって全体的または部分的に除去されると、他の無傷のIgG分子によるFc受容体結合または補体活性化の減少につながる。前処置レジメンに使用するのに適した酵素については、以下の項でより詳細に説明する。

酵素は、好ましくは静脈内注入により投与されるが、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内または他の適切な投与経路など任意の適切な経路により投与されてもよい。投与される酵素の量は、0.01mg/kgBWと2mg/kgBWの間、0.05と1.5mg/kgBWの間、0.1mg/kgBWと1mg/kgBWの間、好ましくは0.15mg/kgと0.7mg/kgBWの間、最も好ましくは0.2mg/kgと0.3mg/kgBWの間、特に0.25mg/kgBWであってもよい。酵素は、酵素と結合可能な対象の血清中の抗薬剤抗体（ADA）の量が、臨床医が決定する閾値を超えないことを条件として、同一の対象に複数回投与してもよい。プロテアーゼと結合可能な対象の血清中のADAの量は、薬剤特異的CAP FEIA（ImmunoCAP）試験や滴定（titre）アッセイなど、任意の適切な方法によって決定されてもよい。対象のADAが前記閾値を超える場合、前処置レジメン（condition regimen）は代替酵素の投与を含んでもよい。

前処置レジメンは、さらに、以下の一つ以上を含んでもよい：
(a）非致死量の照射および／または対象のHSPCを除去する任意の薬剤の対象への投与
(b）対象におけるリンパ球の数を減少させるおよび／または活性を下方制御する薬剤の投与であって、前記リンパ球が以下を含む：
i T細胞；および／または
ii B細胞（任意に抗体産生細胞を含む）；
(c）免疫系の活性を制御する（例、低下させる）任意の他の薬剤またはレジメン、例えば、補体の阻害剤、サイトカインの阻害剤、自然免疫細胞の阻害剤、寛容の誘導剤の投与。

工程（a）は、典型的には、対象の骨髄を部分的または完全に根絶する（または切除する）のに十分な線量の放射線を投与することを含む。副作用が典型的にはそれほど重くなく、レシピエントの骨髄もいくらか保持することが望ましいので、部分的な根絶が好ましい。レシピエント骨髄の切除は、骨髄内にドナーHSPCの生着スペースを作るが、対象のリンパ球が除去され、したがって、工程（b）と同様の方法で免疫系の活性も低下させる。このように、前処置レジメンは、好ましくは少なくとも（a）を含むが、最も好ましくは少なくとも（a）および（b）を含む。あるいは、工程（a）において、抗CD117および／または抗CD47の投与など、対象HSPCの除去に照射を伴わないアプローチを用いることが好ましい場合がある。これは、ドナーHSPCの生着のためのスペースを作るが、照射の望ましくない副作用のいくつかを伴わない。HSPCの除去に加えて、対象は任意でドナーCD8－アルファ細胞の注入を受けてもよく、これは感作されたレシピエントにおける安定したキメリズムの頻度を増加させるかもしれない。ドナーT細胞の注入は、宿主T細胞の生存を低下させることにより、ドナーHSPCの生着を促進するかもしれない。

工程（b）は、任意の適切な方法および任意の適切な薬剤を使用して実施することができる。同じ薬剤または薬剤の組み合わせは、２種類以上のリンパ球の数を減らしおよび／または活性を下方制御するのに有効である場合がある。例えば、前感作されたレシピエントへの移植の非ヒト霊長類モデルにおける前臨床研究は、ベラタセプトによる共刺激遮断をボルテゾミブによる形質細胞除去療法と組み合わせることにより、DSAを持続的に抑制し、抗体媒介拒絶のリスクを減少させることができることを示唆している。

T細胞の除去に適した例示的な薬剤は当技術分野で知られており、抗胸腺細胞グロブリン（ATG、ウサギまたはウマATGなど）；または抗CD4、抗CD8、および抗CD90などの抗体のパネル；抗CD52抗体（アレムツズマブなど）；抗CD117抗体；抗CD45抗体；ブスルファン；シクロホスファミド；フルダラビン；トレオスルファン；シクロスポリン；タクロリムス；またはT細胞を標的とする免疫毒素などが挙げられる。

B細胞（任意に形質細胞を含む）の除去に適した例示的な薬剤は当技術分野で知られており、抗CD20抗体（リツキシマブなど）；抗CD19抗体；ボルテゾミブ；フルダラビン；シクロホスファミド；または抗CD20免疫毒素（例えばMT-3724）などのB細胞を標的とする免疫毒素などが挙げられる。

工程（a）および（b）を含む例示的なレジメンが、実施例に示されている。これは、非致死量の放射線の投与に加えて、T細胞を除去させるための抗CD4、抗CD8、および抗CD90などの抗体のパネルの投与、並びにB細胞（抗体産生細胞など）を除去させるためのボルテゾミブおよびシクロホスファミドの投与を含む。

工程（a）および（b）は、典型的には、互いに分離され、必要な場合には、対象の血清IgG分子を不活性化する酵素の投与からも、所望の効果を有するように、投与に適した時間間隔だけ分離されるであろう。例えば、工程（a）および／または（b）が抗体ベースの薬剤を含む場合、これらの工程は、酵素が工程（a）または（b）の抗体ベースの薬剤も不活性化しないように、酵素の投与の後に十分な時間間隔で行われることが好ましいであろう。例示的な時間間隔を、実施例2に図示する。rATG（または他の抗体ベースの療法）の投与は、イムリフィダーゼの投与の4日後と同じくらい早く開始してもよい。あるいは、酵素は、抗体ベースの薬剤が既にその効果を発揮しているような、抗体ベースの薬剤の後に適切な間隔で添加してもよい。

血清IgG分子を不活性化する酵素の投与と、工程（a）および（b）は、対象への細胞、組織または臓器の移植に対して異なる時期に行ってもよい。例えば、酵素の投与、並びに工程（a）および（b）は、細胞、組織または臓器移植の前に全て行ってもよい。あるいは、酵素の投与、並びに工程（a）および（b）は、細胞、組織または臓器移植の後に全て行ってもよい。あるいは、酵素の投与は、細胞、組織または臓器の移植の前に行い、工程（a）および（b）はその後に行ってもよい。あるいは、酵素の投与および（存在する場合）工程（a）は、細胞、組織または臓器移植の前に行い、工程（b）はその後に行ってもよい。典型的な方法は、酵素の投与、次いで細胞、組織または臓器移植（腎臓移植など）の適用、次いで酵素の後に適切な間隔でATGの投与が挙げられ得る。HPSCの移植（例えば骨髄移植）の場合、工程の順序は、典型的には、工程（b）の抗体ベースの薬剤、次いで工程（a）のレシピエントHPSCの除去、次いで対象の血清IgG分子を不活化する酵素、次いで移植の順序であってもよい。

造血キメリズムの誘導方法
本発明は、対象における造血キメリズムを誘導する方法を提供し、該方法は、本発明の前処置レジメンを実施すること、その後、対象において造血キメリズムを誘導するのに十分な量および適切な条件下でHSPCを該対象に投与することを含む。該方法は、代替的に、HSPCの安定的な移植のための方法として説明され得る。HSPCは、自家（患者自身の細胞が使用される）または同系（細胞は遺伝的に同一の双子から得られる）であってもよく、あるいは同種（細胞は別の非同一のドナーから得られる）であってもよい。

レシピエントにおけるHSPCの成功的生着の可能性を低下させる免疫合併症は、同種細胞において最も顕著であり、したがって、本発明の方法はかかる細胞において最も有益である。しかし、自家細胞であっても、レシピエントがこれまで曝露されたことのない産物が発現していれば、免疫合併症は起こり得る。自家細胞が遺伝子療法を発現するように遺伝子改変された場合、該細胞は免疫応答を引き起こすほど十分に変化しているかもしれない。例えば、発現された遺伝子療法産物に対して免疫応答が起こるかもしれない。HSPCが、レシピエントのHLAと一致しない異なるHLA型を発現するように遺伝子改変された場合も同様である。したがって、HSPCは同種細胞であることが好ましく、あるいは遺伝子改変された自家細胞または同系細胞であることが好ましい。HSPCは、最も好ましくは同種細胞である。特に好ましい態様では、HSPCは、レシピエントに移植されるもう一つの臓器または組織のドナーでもあるドナー由来である。すなわち、同一のドナーが、HSPCと別の細胞、臓器または組織の両方を提供する。

HSPCは、成人の骨髄、特に骨盤、大腿骨および胸骨に存在する。また、それらは、臍帯血や、少数ではあるが末梢血にも見出される。HSPCは、当技術分野で確立された任意の適切な技術を用いて、これらの場所から採取してもよい。

例えば、HSPCは、ドナーの骨の中心から大きな針で直接吸引することによって、ヒトの骨髄から採取してもよい。後腸骨稜が通常の採取部位である。この技術は、骨髄採取と呼ばれ、局所麻酔または全身麻酔で行われうる。投与されるHSPCがドナーの骨髄に由来する場合、HSPCの投与は骨髄移植（BMT）と表現されることがある。

HSPCは、乳児の出生直後に臍帯血から採取することができる。臍帯は臍からダブルクランプで締め、クランプの間で処置する。臍帯静脈を無菌状態で穿刺し、血液は抗凝固処理された無菌閉鎖型採取システムに重力によって自由に流れ込み、そこからHSPCが単離される得る。

HSPCは、典型的にはアフェレーシスによって末梢血から採取することができる。しかし、末梢血中のHSPCの数は通常少ないので、まず骨髄からHSPCを動員する必要がある。健康なドナーの場合、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の投与によってこれを達成することができる。ドナーが健康でない場合は、別の方法が必要になるかもしれない。これは、予定のHSPCの移植が自家移植の場合によくあるケースかもしれない。

HSPCは、好ましくは採取後できるだけ早く使用されるが（つまり新鮮）、保存のために凍結保存して本発明の方法において使用するために解凍してもよい。凍結保存は、典型的に、赤血球および血漿の除去による体積減少を含む。採取物中の幹細胞の量は、例えば、試料のフローサイトメトリー分析によって定量化し、CD34（幹細胞のマーカー）に対して陽性である細胞の割合を確定してもよい。

HSPCは、任意の適切な方法によって対象に投与してもよい。好ましい方法は注入であり、典型的には中心ラインを通してである。患者は、感染のリスクを低減するために、注入の前、間、および後に、陽圧下で高効率微粒子空気（HEPA）フィルターを備えた部屋などで、高度に清浄または無菌状態に保たれてもよい。

本方法は、HSPC移植が造血キメリズムを首尾よくもたらしたことを決定するためにモニターしてもよい。これは、特定の時間間隔後、典型的にはHSPCの投与後28日後に対象から採取した血液試料中に存在するドナー由来の造血細胞の割合を決定することによって達成される。例えば、試料中のリンパ球および／または骨髄球の少なくとも5％がドナー由来であることが判明した場合、好ましくは試料中のリンパ球の少なくとも5％がドナー由来であることが判明した場合、造血キメリズムが達成されたと定義することができる。試料中のリンパ球および／または骨髄球の90％以下がドナー由来であることが判明した場合（つまり、少なくとも10％が依然としてレシピエント由来である場合）、好ましくは、試料中のリンパ球の90％以下がドナー由来であることが判明した場合（つまり、リンパ球の少なくとも10％が依然としてレシピエント由来である場合）、キメリズムは混合と表現される。試料中のリンパ球および／または骨髄球の98％以上がドナー由来であることが判明した場合、キメリズムは完全であると表現することができる。混合キメリズムは、レシピエントがより高いレベルの免疫能を有することになるので、本発明の方法にとって典型的に好ましい。しかし、例えば白血病のような癌の治療では、癌の再発を引き起こす可能性のある宿主細胞を排除し、移植されたHSPCと置き換えることが目的なので、状況によってはフルキメリズムが有効な場合もある。

試料中のドナー由来細胞およびレシピエント由来細胞の割合は、実施例に記載されているようなフローサイトメトリー分析など、当技術分野における任意の適切な方法によって決定することができる。リアルタイムPCRも使用してよい。他の方法は、Agrawal et al Bone Marrow Transplantation 2004 (34) p-12に記載されている。

疾患または状態を治療または予防する方法
本発明は、対象の疾患または状態を予防または治療するための方法を提供する。本方法は、前記疾患または状態に対する療法の対象への利益を向上させるために、上記の方法に従って対象において造血キメリズムを誘導し、それによって疾患または状態を治療または予防することを含む。前記療法は、細胞、組織または臓器の移植であってよく、典型的には、HSPCと同じドナーからの移植である。移植される細胞、組織または臓器は、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸、皮膚、血管／血管組織、顔、腕、気管、眼の一部、膵島、黒質、骨髄など、任意の種類のものであってもよい。移植される細胞は、追加の療法を必要としないように、方法自体で使用されるのと同じHSPCなど任意の種類であってもよい。療法は、遺伝子改変HPSCを用いて実行される遺伝子療法であってもよい。

別の方法で表現すると、本発明はまた、細胞、組織または臓器移植の免疫拒絶反応の予防または治療のための方法を提供し、該方法は、本発明の方法に従って対象に造血キメリズムを誘導すること、および対象に細胞、組織または臓器移植を適用することを含み、任意に、前記細胞、組織または臓器はHSPCと同じドナーからのものである。細胞、組織または臓器は、典型的には、対象において造血キメリズムが誘導された後に投与されるが、その前に投与されてもよい。例えば、死亡したドナーから臓器を採取した場合、臓器移植を先に行い、その後、同じ死亡したドナーまたはそれに近いドナーから採取したHSPCを用いて造血キメリズムを誘導することが好ましいかもしれない。細胞、組織または臓器の移植は、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸、皮膚、血管／血管組織、顔、腕、気管、眼の一部、膵島、黒質、骨髄など、任意の種類のものであってもよい。移植される細胞は、追加の移植を必要としないように、造血キメリズムを誘導するために使用されるのと同じHSPCなど任意の種類であってよい。

移植される細胞、組織または臓器は、レシピエントとは異なる種に由来するものであってもよく、すなわち異種移植であってもよい。ヒトのレシピエントへの異種移植に適した種としては、ブタや非ヒト霊長類が挙げられうる。かかる場合、HSPCは移植に対する寛容を補助するために遺伝子改変されていてもよい。異種移植である細胞、組織または臓器もまた、遺伝子改変されていてもよい。

治療される対象は、好ましくは、感作されるかまたは高感作され得る。「感作された」とは、対象がヒト主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ））とも呼ばれる）に対する抗体を発現していることを意味する。抗ＨＬＡ抗体は、同種感作Ｂ細胞に由来し、通常、輸血、以前の移植または妊娠により、以前から感作された患者に存在する。感作された患者において造血キメリズムを達成することにより、T細胞およびB細胞に特異的寛容が生じることを通して、DSAなどのドナー特異的免疫応答が減少し、同種感作をリバースさせるかもしれない。

移植レシピエントの候補が感作されているか否かは、任意の適切な方法によって決定され得る。レシピエントが感作されているか否かを判定するために、例えば、パネル反応性抗体（ＰＲＡ）試験が用いられ得る。ＰＲＡスコア>30%は、典型的には、患者が「高い免疫学的リスク」または「感作性」であることを意味すると解される。あるいは、移植ドナー候補の血液の試料と、意図されたレシピエントの試料と混合する交差適合試験が行なわれ得る。交差適合陽性は、レシピエントがドナー試料に反応する抗体を有することを意味し、レシピエントが感作され、移植が行われるべきでないことを示す。交差適合試験は、典型的には、移植直前の最終チェックとして行われる。

細胞、組織または臓器移植の免疫拒絶反応を予防または治療するための方法は、以下を含む：
(i) 本発明の前処置レジメンを実施すること；
(ii)対象において造血キメリズムを誘導するのに十分な量および適切な条件下で、対象にHSPCを投与すること。

該方法は、任意で(iii)対象に典型的にはHSPCと同じドナーに由来する細胞、組織または臓器移植を適用することも含んでもよい。工程(ii)で投与されたHSPC自体が移植であってもよく、その場合、追加の工程(iii)は必要ない。該方法は、細胞、組織または臓器の移植によって治療される疾患または状態の治療方法と考え得る。例えば、HSPCがそれ自体移植である場合、該方法は、HSPC移植によって治療される任意の疾患または状態の予防または治療のための方法であってもよい。

HSPC移植によって典型的に治療される疾患または状態には、後天性のものと先天性のものがあり得る。HSPC移植によって治療され得る後天性の疾患または状態としては、以下が挙げられる：
－血液系悪性腫瘍、例えば、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML））；リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）および骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫（Kahler病））、
－固形腫瘍がん、例えば、神経芽細胞腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、ユーイング肉腫、絨毛癌、
－血液系疾患、例えば、食細胞系疾患（例えば、骨髄異形成症）；貧血（例えば、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH；重症形成不全）、再生不良性貧血、後天性純赤血球形成不全）；骨髄増殖性疾患（例えば、真性多血症、本態性血小板症、骨髄線維症）、
－代謝性障害、例えば、アミロイドーシス（例えば、アミロイド軽鎖（AL）アミロイドーシス）、
－環境起因性疾患、例えば、放射線障害、
－ウイルス性疾患、例えば、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、
－自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症。

HSPC移植で治療されうる先天性疾患または状態としては以下が挙げられる：
－ライソゾーム貯蔵障害、例えば、リピドーシス（Lipidoses）－脂質貯蔵障害－（例えば、神経セロイドリポフスチン症、乳児神経セロイドリポフスチン症（INCL、サンタヴオリ病）、ヤンスキー－ビエルショウスキー病（乳児神経セロイドリポフスチン症の後期））；スフィンゴ糖脂質症（例えば、ニーマン－ピック病、ゴーシェ病）；白質ジストロフィー（例えば、アドレナリン白質ジストロフィー、メタクロマチック白質ジストロフィー、クラッベ病（グロボイド細胞白質ジストロフィー））；ムコ多糖症（例えば、ハーラー症候群（MPS I H、α-L-イドロニダーゼ欠損）、シャイー症候群（MPS I S）、ハーラー－シャイー症候群（MPS I H-S）、ハンター症候群（MPS II、イズロニダーゼサルフェート欠損）、サンフィリッポ症候群（MPS III）、モーキオ症候群（MPS IV）、マローテックス－ラミー症候群（MPS VI）、スライ症候群（MPS VII））； 糖蛋白症（例えば、ムコリピドーシスII（I細胞病）、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、アルファ－マンノシドーシス）；またはその他（例えば、ウォルマン病（酸性リパーゼ欠損症）、
－免疫不全症、例えば、T細胞欠損症（例えば、運動失調症－毛細血管拡張症、ディジョージ症候群）；T細胞およびB細胞の複合欠損症（例えば、重症複合免疫不全症（SCID）、すべてのタイプ）；ウィスコット－アルドリッチ症候群；食細胞障害（例えば、コストマン症候群、シュワックマン－ダイヤモンド症候群）；免疫制御異常疾患（例えば、グリセリ症候群、タイプII）；自然免疫不全（例えば、NF－カッパ－B必須モジュレーター（NEMO）欠損症）
－血液疾患、例えばヘモグロビン異常症（例えば鎌状赤血球症、β－重症型サラセミア（クーリー貧血））；貧血症（例えば再生不良性貧血、ダイヤモンド－ブラックファン貧血、ファンコニ貧血）；細胞減少症（例えば無巨核球性血小板減少症）；および血球貪食症候群（例えば血球貪食性リンパ組織球症（HLH））。

HSPCが遺伝子療法を適用するために遺伝子改変される場合、本発明の方法は、前記遺伝子療法が対象とする疾患または状態の予防または治療のためのものであってもよい。

本発明はまた、疾患または状態の予防または治療のための方法において使用するための、対象における血清IgG分子を不活性化する酵素を提供し、ここで、該方法は上記の通りである。

本発明はまた、医薬の製造における、対象中の血清IgG分子を不活性化する酵素の使用であって、該医薬が、上記のような方法における疾患または状態の予防または治療のためのものである、使用も提供する。

酵素
IgGシステインプロテアーゼ
本発明で使用するためのIgGシステインプロテアーゼは、IgGに特異的である。好ましい態様では、本発明の方法において使用するためのプロテアーゼは、IdeS（Immunoglobulin G-degrading enzyme of S. Pyogenes（S.ピオゲネスの免疫グロブリンＧ分解酵素））であり、別名イムリフィダーゼとして知られている。IdeSは、ヒトの病原体であるS.ピオゲネス（S. pyogenes）が産生する細胞外システインプロテアーゼである。IdeSはもともと血清型M1のA群ストレプトコッカス菌（Streptococcus strain）から分離されたが、現在では試験したすべてのA群ストレプトコッカス菌でideS遺伝子が同定されている。IdeSは非常に高い基質特異性を持っており、その唯一の基質はIgGと同定された。IdeSは、ヒトIgGのすべてのサブクラスの重鎖の下部ヒンジ領域において、単一のタンパク質分解切断を触媒する。また、IdeSは、様々な動物のIgGのいくつかのサブクラスの重鎖の同等の切断を触媒する。IdeSは、2段階の機構でIgGをFcおよびF(ab’)₂フラグメントに効率的に切断する。第一段階では、IgGの1本（第一）重鎖が切断され、Fc分子が非共有結合した1本の切断型IgG（scIgG）分子が生成される。scIgG分子は実質的に中間生成物であり、元のIgG分子の残りの（第二）重鎖を保持している。機構の第二段階では、この第二重鎖がIdeSによって切断され、F(ab’)₂フラグメントとホモダイマーFcフラグメントが放出される。これらは、生理的条件下で一般に観察される生成物である。還元条件下では、F(ab’)₂フラグメントは2つのFabフラグメントに解離し、ホモダイマーFcはその構成単量体に解離するかもしれない。IdeSは、ヒトにおいて特にIgGの切断に有効であることが示されている。IdeSの投与後数分で血漿中のIgGプール全体が切断され、血漿中に新たに合成されたIgGが出現するまで1週間を超えて血中のIgG濃度が低いままである。これは、血漿プール（すなわち血清IgG分子）だけでなく、細胞外IgGプール全体がIdeSによって切断されることを示している（Winstedt et al; PloS One 2015; 10(7): e0132011）。

配列番号１は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を含むIdeSの全配列である。また、NCBI参照配列番号WP_010922160.1としても利用できる。配列番号２は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を欠く、IdeSの成熟配列である。また、Genbank受入番号ADF13949.1としても利用できる。

代替の態様では、本発明の方法において使用するためのプロテアーゼは、馬に主に見られる細菌であるストレプトコッカス equi ssp. ズーエピデミクス（Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus）によって産生されるIgGシステインプロテアーゼである、IdeZである。配列番号３は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を含むIdeZの全配列である。また、これは、NCB参照配列番号WP_014622780.1としても利用できる。配列番号４は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を欠く、IdeZの成熟配列である。

代替の態様において、本発明の方法において使用するためのプロテアーゼは、配列番号５の配列のようなハイブリッドIdeS/Zである。Ｎ末端は、Ｎ末端メチオニンおよびシグナル配列を欠くIdeZに基づく。

好ましい態様では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号２、４または５を含むまたはそれからなってもよい。本発明で使用するためのプロテアーゼは、標準的な細菌発現系における発現およびそこからの単離を助けるために、Ｎ末端に追加のメチオニン（M）残基および／またはＣ末端にタグを含んでいてもよい。適切なタグとしては、ポリペプチドのＣ末端に直接結合してもよいし、3、4または5個のグリシン残基などの任意の適切なリンカー配列によって間接的に結合してもよい、ヒスチジンタグが挙げられる。ヒスチジンタグは、典型的には6個のヒスチジン残基からなるが、これより長く、典型的には最大7、8、9、10または20個のアミノ酸、あるいは短く、例えば5、4、3、2または1個のアミノ酸であり得る。

さらなる好ましい態様では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号６から２５のいずれか一つの配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなり得る。これらの配列は、プロテアーゼ活性の増加および／または免疫原性の減少を伴うIdeSおよびIdeZポリペプチドを表す。配列番号６から２５の各々は、任意に、Ｎ末端に追加のメチオニンおよび／またはＣ末端にヒスチジンタグを含んでもよい。ヒスチジンタグは、好ましくは、6個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、3xグリシン残基または5xグリシン残基のリンカーによってＣ末端に連結される。

さらなる好ましい態様では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号５６から６９のいずれか一つの配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなり得る。これらの配列は、プロテアーゼ活性の増加および／または免疫原性の減少を伴うIdeSポリペプチドを表す。配列番号５６から６９の各々は、任意に、Ｎ末端に追加のメチオニンおよび／またはＣ末端にヒスチジンタグを含んでもよい。ヒスチジンタグは、好ましくは、6個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、3xグリシンまたは5xグリシン残基のリンカーによってＣ末端に連結される。

さらなる好ましい態様では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、最大3個（例えば1、2または3個）のアミノ酸置換を伴ってもよい配列番号６から２５のいずれか一つの配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなり得る。配列番号６から２５の各々およびその変異体は、任意に、Ｎ末端に追加のメチオニンおよび／またはＣ末端にヒスチジンタグを含んでもよい。

さらなる好ましい態様では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、最大3個（例えば1、2または3個）のアミノ酸置換を伴ってもよい配列番号５６から６９のいずれか一つの配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなり得る。配列番号５６から６９の各々およびその変異体は、任意に、Ｎ末端に追加のメチオニンおよび／またはＣ末端にヒスチジンタグを含んでもよい。

本発明のポリペプチドは、典型的には、長さが、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００または３１０個のアミノ酸である。本発明のポリペプチドは、典型的には、長さが４００、３５０、３４０、３３０、３２０または３１５個以下のアミノ酸である。上に列挙した下限のいずれかが、上に列挙した上限のいずれかと組み合わされて、本発明のポリペプチドの長さについての範囲が提供され得ることが理解されるであろう。例えば、ポリペプチドは、長さが１００から４００個のアミノ酸、または長さが２５０から３５０個のアミノ酸であり得る。ポリペプチドは、好ましくは、長さが２９０から３２０個のアミノ酸、最も好ましくは、長さが３００から３１５個のアミノ酸である。

本発明のプロテアーゼの一次構造（アミノ酸配列）は、IdeS、IdeZまたはIdeS/Zの一次構造に、具体的にはそれぞれ配列番号２、４または５のアミノ酸配列に基づく。本発明のプロテアーゼの配列は、配列番号２、４または５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、配列番号２、４または５のアミノ酸配列の変異体を含み得る。変異体配列は、配列番号２、４または５の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。変異体は、WO2016/128558またはWO2016/128559で同定された一つ以上の特定の改変を含むことを除いて、配列番号２、４または５の配列と同一であり得る。配列番号２、４または５の配列に対する同一性は、配列番号２、４または５に示される配列の少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個またはそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、またはより好ましくは配列番号４または５の全長にわたって測定され得る。

本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号２、４または５の配列に対してアミノ酸の付加、欠失または置換などの改変がなされる、配列番号２、４または５のアミノ酸配列の変異体を含む、IdeS、IdeZまたはIdeS/Zポリペプチドであり得る。かかる改変は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖の嵩の、他のアミノ酸で置換する。導入されるアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸に類似の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有し得る。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族のアミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的なアミノ酸の変更は当該技術分野で周知である。

IgGシステインプロテアーゼ活性は、例えば、IgGを含む試料と共にポリペプチドをインキュベートし、IgG切断産物の存在を判定することによって、任意の適切な方法によって評価されてもよい。適切な方法は、WO2016／128559号公報に記載されている。適切なアッセイとしては、WO2016／128559に記載されているような、ELISAベースのアッセイが挙げられる。かかるアッセイでは、アッセイプレートのウェルは、典型的には、ウシ血清アルブミン（BSA）などの抗体標的で被覆される。次に、試験されるポリペプチドの試料がウェルに加えられ、次いで、本実施例ではBSAに特異的な抗体である標的特異的抗体の試料が加えられる。ポリペプチドおよび抗体は、IgGシステインプロテアーゼ活性に適した条件下で相互作用させる。適当な時間経過後、アッセイプレートを洗浄し、標的特異的抗体と特異的に結合する検出抗体を、標的特異的抗体への結合に適した条件下で添加する。検出抗体は、各ウェル中で標的に結合している、任意の無傷な標的特異的抗体に結合する。洗浄後、あるウェルに存在する検出抗体の量は、そのウェルに結合した標的特異的抗体の量に比例する。検出抗体は、直接または間接的に標識や他のレポーター系（酵素など）と結合させることができ、各ウェルに残存する検出抗体の量を測定することができる。ウェルに含まれる試験ポリペプチドの効力が高いほど、無傷の標的特異的抗体は少なくなり、したがって検出抗体も少なくなる。典型的には、所定のアッセイプレート上の少なくとも一つのウェルには、試験されるポリペプチドの代わりにIdeSが含まれ、試験ポリペプチドの効力をIdeSの効力に直接比較することができるようにする。また、IdeZやIdeS/Zも比較のために含まれることがある。

他のアッセイは、試験ポリペプチドによるIgGの切断から生じるIgGのフラグメントを直接可視化および／または定量化することによって、試験ポリペプチドの効力を決定し得る。このタイプのアッセイは、WO2016／128559にも記載されている。かかるアッセイは、典型的には、IgGの試料を、滴定系において異なる濃度の試験ポリペプチド（または対照としてIdeS、IdeZおよびIdeS／Zの一つ以上）と共にインキュベートする。その後各濃度でのインキュベーションから生じた生成物は、ゲル電気泳動、例えばSDS-PAGEを用いて分離される。その後全IgGおよびIgGの切断から生じるフラグメントは、サイズによって識別され、適切な色素による染色の強度によって定量化される。切断フラグメントの量が多いほど、所定の濃度における試験ポリペプチドの効力は大きくなる。本発明のポリペプチドは、典型的には、IdeZおよび／またはIdeSよりも低い濃度（滴定系のより低いポイント）で検出可能な量の切断フラグメントを生成するであろう。この種のアッセイはまた、各切断事象から生じる異なるフラグメントの量も決定され得るので、IgG分子の第1重鎖または第2重鎖を切断するのにより有効な試験ポリペプチドの同定を可能にし得る。本発明のポリペプチドは、特にIgGがIgG2アイソタイプである場合、IgG分子の第１鎖を第２鎖よりも切断するのに有効であり得る。本発明のポリペプチドは、IgG2よりもIgG1の切断により有効であり得る。

IgGエンドグリコシダーゼ
酵素は、好ましくはIgGのFc領域中のAsn-297（Kabat numbering）での糖鎖部分を切断する、IgGエンドグリコシダーゼ活性を有していてもよい。このようなタンパク質の例として、EndoS (Endoglycosidase of S. pyogenes（S.ピオゲネスのエンドグリコシダーゼ）)が挙げられる。EndoSは、正常にグリコシル化されたIgGのアスパラギン結合糖鎖のβ-1,4-ジ-N-アセチルキトビオースのコアを加水分解する。 EndoSの成熟配列は、配列番号90として提供される。薬剤は、配列番号90のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるタンパク質であってもよいし、ストレプトコッカス equi（Streptococcus equi）またはストレプトコッカス ズーエピデミクス（Streptococcus zooepidemicus）、またはコリネバクテリウム シュードツベルクローシス（Corynebacterium pseudotuberculosis）、エンテロコッカス フェカーリス（Enterococcus faecalis）またはエリザベトキンギア メニンゴセプティカ（Elizabethkingia meningoseptica）などの代替細菌からのその相同体であってもよい。薬剤は、CP40、EndoE、またはEndoF₂であってもよい。

あるいは、薬剤は、配列番号 90と少なくとも80％、85％、90％または95％の同一性を有し、IgGエンドグリコシダーゼ活性を有する任意のアミノ酸配列を含む、またはそれからなるEndoSタンパク質の変異体であってよい。変異体がIgGエンドグリコシダーゼ活性を有する場合は、EndoSタンパク質の変異体は、配列番号90のアミノ酸配列に対して、最大1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90個、またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失が行われたアミノ酸配列を含む、またはそれからなってもよい。前記アミノ酸置換は、好ましくは保存的である。保存的置換は、前項で定義した通りである。

あるいは、薬剤は、配列番号90のフラグメントを含む、またはそれからなり、IgGエノドグリコシダーゼ（enodglycosidase）活性を有するタンパク質であってよく、好ましくは、前記フラグメントは、長さが400から950個、500から950個、600から950個、700から950個または800から950個のアミノ酸である。好ましいフラグメントは、配列番号90のアミノ酸1から409からなり、連鎖球菌システインプロテイナーゼSpeBによる切断によって生成されたEndoSの酵素活性α－ドメインに相当する。フラグメントは、配列番号90のアミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基の欠失によって作製されてもよい。最大1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500または550個の残基が欠失されてもよく、またはそれ以上が欠失されてもよい。欠失された残基は、他の残基と連続していてもよい。

配列番号90の任意のフラグメントまたは変異体としては、好ましくは配列番号90の残基191から199、すなわち配列番号90のLeu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、Asp-195、Val-196、Asp-197、Val-198、およびGlu-199が挙げられる。これらのアミノ酸は、グルタミン酸で終わる完全なキチナーゼファミリー18の活性部位を構成している。キチナーゼの活性部位のグルタミン酸は、酵素活性に必須である。最も好ましくは、したがって、配列番号90の変異体は、配列番号90のGlu-199を含む。ただし変異体が配列番号90のGlu-199を含む場合は、配列番号90の変異体は、一つ以上の保存的置換を有する配列番号90の残基191から199を含んでもよい。

ポリペプチドの製造
本発明の方法で使用される酵素はポリペプチドであり、いかなる適切な手段によって製造されてもよい。例えば、ポリペプチドは、Fmoc固相化学、Boc固相化学、または溶液相ペプチド合成など、当技術分野で知られている標準的な技術を用いて直接合成されてもよい。あるいは、ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードする核酸分子またはベクターで細胞、典型的には細菌細胞を形質転換することにより製造されてもよい。細菌宿主細胞における発現による酵素ポリペプチドの製造は、WO2016／128558およびWO2016／128559に記載され、例示されている。

ポリペプチドを含む組成物および製剤
本発明はまた、本発明の方法において使用するための、酵素を含む組成物を提供する。例えば、本発明は、一つ以上のポリペプチドと、少なくとも一つの医薬上許容される担体または希釈剤とを含む組成物を提供する。担体は、組成物の他の成分と適合し、組成物が投与される対象に対して有害でないという意味で、「許容される」でなければならない。典型的には、担体および最終組成物は、無菌でパイロジェンフリーである。

適切な組成物の製剤は、標準的な医薬製剤化学および方法論を用いて実施することができ、これらはすべて当業者が容易に利用可能である。例えば、酵素は、一つ以上の医薬上許容される賦形剤またはビヒクルと組み合わせることができる。湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化物質、還元剤などの補助物質が賦形剤またはビヒクル中に存在してもよい。適切な還元剤としては、システイン、チオグリセロール、チオレドキシン、グルタチオンなどが挙げられる。賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般に、組成物を受け取る個体に免疫反応を誘発しない医薬であり、それらは過度の毒性なしに投与され得る。医薬上許容される賦形剤には、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、チオグリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。医薬上許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩などもそこに含まれ得る。医薬上許容される賦形剤、ビヒクルおよび補助物質に関する完全な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)で入手可能である。

かかる組成物は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製、包装または販売されてもよい。注射用組成物は、防腐剤を含むアンプルまたはマルチドーズ容器などの単位投与形態で調製、包装または販売されてもよい。組成物には、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、および埋め込み可能な徐放性または生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。かかる組成物は、懸濁剤、安定化剤または分散剤など、一つ以上の追加成分をさらに含んでもよいが、これらに限定されない。非経口投与用組成物の一態様においては、有効成分は、適切なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェンフリーの水）で再構成するために、乾燥形態（例えば、粉末または顆粒）で提供され、後に再構成された組成物が非経口投与される。組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液または溶液の形態で調製、包装または販売されてもよい。この懸濁液または溶液は、公知技術に従って製剤化することができ、有効成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤または懸濁剤などの追加の成分を含んでいてもよい。かかる無菌注射製剤は、例えば、水または1，3-ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を使用して調製してもよい。他の許容される希釈剤および溶媒としては、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液および合成モノまたはジグリセリドなどの固定油などが挙げられるが、これらに限定されない。

他の有用で非経口投与可能な（parentally-administrable）組成物としては、有効成分を微結晶形態で、リポソーム製剤で、または生分解性ポリマー系の成分として含んでいるものが挙げられる。徐放または埋め込みのための組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩などの医薬上許容されるポリマー材料または疎水性材料を含んでもよい。組成物は、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨膜内または他の適切な投与経路などの任意の適切な経路による投与に適するかもしれない。好ましい組成物は、静脈内注入による投与に適している。

キット
本発明はまた、本明細書に記載された方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、上述したように、酵素または酵素を含む組成物を含んでもよい。キットは、酵素または組成物を対象に投与するための手段を含んでもよい。キットは、本明細書に記載されるような任意の方法における様々な構成要素の使用説明書を含んでもよい。

実施例
特に断りのない限り、使用した方法は標準的な生化学および分子生物学の技術である。適切な方法論の教科書の例としては、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons, Inc.が挙げられる。

実施例１
イントロダクション
イムリフィダーゼはすべてのヒトIgGサブクラスを切断するが、マウスIgG2cおよびIgG3のみを切断し、マウスIgG1およびIgG2bを切断しない。興味深いことに、EndoSはマウスIgG1およびIgG2bの補体およびFcγRを介した機能を低下させることが示されている。しかし、EndoS処理したマウスIgG2aおよびIgG2cは、FcγRを介して細胞溶解活性を維持するが、IgG2cは条件によって結合親和性をいくらか失うことも示されている。そこで、以下の実験で使用する動物モデルの目的から、マウス対象において血清IgGに対する効果が最も大きくなるように、イムリフィダーゼとEndoSを組み合わせて使用している。イムリフィダーゼまたはEndoS（または同等の特異性／活性を有する他のプロテアーゼまたはエンドグリコシダーゼ）単独で、ヒト対象において同等の効果を達成するのに十分であることが期待される。

以下の実験は、照射および寛容誘導に抵抗性である感作NODレシピエントのストリンジェントなモデルを使用する。この実験では、イムリフィダーゼとEndoSの両方を併用するアプローチが、これらのマウスに混合造血キメリズムを生成しうることを実証している。

材料と方法
動物
成体NOD/ShiLtJ（H-2^g7；NODと称する）、FVB/NJ（H-2^q；FVBと称する）、C57BL/6J（H-2^b；B6.CD45.2と称する）、B6.SJL-Ptprc a Pepcb./Boy（H-2^b，B6.CD45.1 と称する）、B6.NOD-（D17Mit21-D17Mit10）（H-2^g7；B6.H-2^g7と称する）、NOD.B10Sn-H2^b/J（H-2^b ; NOD.H-2^b と称する）マウスはジャクソン研究所（Bar Harbor, ME, USA）から購入し、アルバータ大学の特定の病原体のない施設で繁殖させ、飼育した。動物の世話と取り扱いはすべて、Canadian Council on Animal Careのガイドラインに従って行われた。キメリズム誘導に用いたNODマウスはすべて8から10週齢の雌であった。

インビボ実験用試薬
イムリフィダーゼとEndoSはHansa Biopharma AB (ルンド、スウェーデン)から提供され、許可を得て使用した。抗CD4（クローンGk1.5、ラットIgG_2b）、抗CD90（クローンYTS154、ラットIgG_2b）、抗CD8α（クローンYTS169.4、ラットIgG_2b）および抗MHC-I H-2K^b（クローンB8.24.3、マウスIgG_2b）mAbは社内で生成したものを用いた。YTS 169.4 抗マウスCD8α mAb産生細胞は、Prof. H WaldmannとDr. SP Cobbold(Department of Pathology, University of Cambridge)により開発され、Cambridge Enterprise Limited（Hauser Forum, 3 Charles Babbage Road, Cambridge CB3 0GT）経由で入手した。シクロホスファミド（29875）およびボルテゾミブ（A2614）は、それぞれSigma（MO、USA）およびApexBio（TX、USA）より購入した。

インビボEndoS媒介モノクローナルDSA阻害アッセイ
NODまたはB6.H-2^g7マウスに、前処置として、ビヒクル、抗MHC-I H-2K^b（10μg）単独、またはEndoS（30μg）と抗MHC-I H-2K^b（10μgまたは100μg）の混合物をi.v.投与した。EndoSと抗H-2Kbは注射直前に混合した。この前処置から4時間後に、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）標識NODとセルトレース紫色素（CTV）標識B6骨髄細胞（BMC）の1：1混合物の500万個の細胞を前処置したNODマウスにi.v.注射した。同様に、CFSE標識B6.H-2^g7とCTV標識NOD.H-2^b BMCの1：1混合物を、前処置したB6.H-2^g7マウスに注射した。細胞投与後1、2および3時間目に採血し、フローサイトメトリーで解析した。一つの後肢から脾臓細胞およびBMCを各マウスから採取し、BMC注入後4時間で解析した。

血清DSA検出アッセイ
NODマウスにFVB脾臓細胞20×10⁶個をi.p.投与して感作させた。感作前、感作4から6週間後、およびイムリフィダーゼとEndoS処置4時間後に血清を採取した。FVB脾臓細胞（2×10⁵個）をFcR遮断（抗マウスCD16／CD32ラットIgG2_b抗体、クローン2.4G2、BE0307、Bio X cell）で5分間処理し、その後100μL中で滴定量の血清と30分間インキュベーションした。細胞を2回洗浄し、100μL中で蛍光色素結合二次抗体と30分間インキュベートした。以下の二次抗体を使用した：ウサギ抗マウスIgG Fc抗体からのFITC結合F（ab’）₂フラグメント（1：200、315-096-046、Jackson ImmunoResearch）、APC結合ヤギ抗マウスIgG₁ Fc抗体（1：100、115-135-205、Jackson ImmunoResearch）およびFITC結合ヤギ抗マウスIgG₃Fc抗体（1：100、115-095-209、Jackson ImmunoResearch）。細胞は2回洗浄し、フローサイトメトリーで解析した。細胞の洗浄と再構成には、2% FBS入りHBSSを使用した。

BMTプロトコルとキメリズムの定義
感作されたレシピエントにおけるドナーBMCの短期生存を決定するため、B6.CD45.1脾臓細胞に感作したNODマウスにBMTの2日前にT細胞除去（抗CD4 0.25mg、抗CD8 0.25mg、抗CD90 0.3mg、i.p.)、BMT（80×10⁶個の B6.CD45.2 BMC、i.v.注射）の4時間前にEndoSとイムリフィダーゼをi.v.注射した。脾臓細胞およびBMCはBMC注射後4時間目に解析した。

長期キメリズム誘導のために、FVB脾臓細胞に感作されたNODマウスをBMTの日に関して－6日目にイムリフィダーゼおよびEndoSをi.v.で処置した。シクロホスファミド（150mg/kg、i.p.またはi.v.）とボルテゾミブ（1mg/kg、i.v.）を－4日目に投与した。T細胞除去抗体を－2、2、6、11、および16日目にi.p.投与した。0日目のBMTの4時間前にイムリフィダーゼとEndoSを反復投与し、6Gyの全身照射（TBI、Gammacell 1000 Elite）を行った。0日目にFVB骨髄細胞（80×10⁶個）を側尾静脈から静脈内(i.v.)投与した。BMT前のシクロホスファミドとボルテゾミブの感作されたレシピエントへの効果を測定する実験では、ドナー骨髄細胞へのDSAの吸着可能性を制限するために、低用量（20×10⁶個）の骨髄細胞が与えられた。末梢血は、指定された時点でフローサイトメトリー解析のために採取された。長期キメリズムについては、BMT後28日目にリンパ球ゲート中のMHC-I⁺細胞の少なくとも5％がドナー由来である場合に、レシピエントをキメラとみなした。

抗体とフローサイトメトリー
マウスH-2K^d (SF1-1.1.1)、H-2K^q (KH114)、H-2K^b (AF6-88.5)、CD45.2 (104)、CD19 (6D5)、CD138 (281-2)、B220 (RA3-6B2)、TCRβ (H57-597)、CD4 (RM4-5またはRM4-4)、CD8β (H35-17.2)、CD11b (M1/70)、CD11c (N418)、CD49b (DX5)、CD122 (TM-β1)に対する蛍光色素標識抗体をBD Pharmingen (CA, USA), BioLegend (CA, USA)またはThermo Fisher Scientific (CA, USA)より購入した。データ取得にはLSR II（Becton Dickson, CA, USA）フローサイトメーターを使用し、データ解析はFlowJo（Treestar software, OR, USA）を用いて行った。

統計解析
Mann-Whitney U 検定、Ratio paired t-検定、Holm-Sidak の多重比較検定付きone-way ANOVAおよびFisherの正確検定が適宜示されたとおりに使用された。すべての統計解析は、Prism (GraphPad Software, CA, USA)を用いて行われた。

結果
EndoSはドナーBMCのモノクローナルDSA媒介死滅を阻害する
抗体媒介ドナーBMCの死滅の阻害に対するEndoSの効果を評価するため、DSAの受動的移植実験を行った。すべてのDSAのうち、抗ドナーMHC抗体またはHLA抗体は、臨床で最も重要である。そこで、ナイーブNODマウスにMHC-I K^b発現細胞を標的とするマウスIgG_2b抗体を注射し、EndoSで処置するか未処置のまま、その後B6マウスから骨髄移植を行った。

図1A-Bに示すように、10μgの抗K^bmAbを単回投与したNODレシピエントにおいて、BMT後1時間の血中NOD細胞に対するB6の比率は、酵素処置をしなかったマウスと比較して、EndoSで処置したマウスで有意に増加した。この2群間の血中NODに対するB6の比率の差は、BMT後2時間および3時間においても安定していた。同様に、100μgの抗K^b mAbとEndoSを与えたマウスは、100μgの抗K^b mAb単独での処置と比較して、1時間および2時間後に血液中のNODに対するB6の比率を増加させた。しかし、この比率の増加は3時間まで続かず、残存するmAbエフェクター機能が時間経過とともに蓄積していることが示唆された。BMT後4時間で、EndoSと10μg抗K^b mAbで処置したマウスでは、10μg抗K^b mAbのみを受けたマウスと比較して、BMおよび脾臓の両方でNOD細胞に対するB6の比率の有意な増加も観察された。

NODマウスは、補体依存性細胞傷害に必須で、MHC遺伝子との遺伝的な関連していない溶血性補体C5を欠いていることは注目に値する。従って、NODマウスにおけるDSAの効果は補体充足宿主と比較して低下しているかもしれない。そこで、補体充足宿主におけるDSAに対するEndoSの役割も検討した。NOD MHCコンジェニックB6.H-2^g7マウスをレシピエントとして使用した。EndoSは、NOD宿主と比較して、B6.H-2^g7マウスにおいてレシピエント細胞に対するドナーの比率を同程度に向上させた（図1C-D）。

つまり、EndoSは、レシピエントが補体不足であるかどうかにかかわらず、抗MHC抗体存在下でドナー細胞の生存を改善し、少なくともこのモデル系では、除去の他の機構、例えば、FcgR媒介）に対する効果が示唆された。

EndoSは前感作レシピエントにおけるドナーBMCの生存を改善する
次に、ドナー抗原に対する抗体レパートリーが多様化している同種感作（allo-sensitized）レシピエントにおいて、EndoSがドナーBMCの生存を改善させうるかどうかを検討した。これを検証するために、EndoSはイムリフィダーゼと組み合わせて使用された。イムリフィダーゼはマウスIgG_2cとIgG₃を切断するが、マウスIgG₁とIgG_2bを切断することができない。そこで、イムリフィダーゼで切断されないマウスIgGアイソタイプのエフェクター機能を減弱させるために、EndoSを共投与させた。図2Aに示すように、FVB脾臓細胞で感作したNODマウスでは、イムリフィダーゼとEndoSの併用により、DSA-IgGが有意に減少した。ドナー細胞のIgG標的化の減少は、EndoSではなくイムリフィダーゼによるものと思われる。なぜなら、脱グリコシル化によりFc特異的検出抗体は依然として結合することができるからである。マウスIgGアイソタイプに対する感度の違いは、DSA-IgG₁（図2B）のレベルに変化が見られなかったのに対し、イムリフィダーゼによって切断されるサブクラスであるDSA-IgG₃（図2C）が約80%減少したことからも示されている。イムリフィダーゼによるIgG₃の分解は、無傷のIgGの中程度の減少しかもたらさないが、EndoSはイムリフィダーゼ抵抗性IgG分子の脱グリコシル化を通じて、DSA-IgGエフェクター機能の減少にさらに寄与できるかもしれない。両酵素の組み合わせにより、ポリクローナルDSAで感作されたレシピエントにおけるドナー細胞の生存を解析することができた。DSAに加えて、プライムドナー抗原特異的細胞傷害性T細胞が、ドナーBMCの迅速な死滅に寄与している可能性がある。そこで、先天性B6.CD45.1脾臓細胞で感作されたCD45.1 NODレシピエントは、感作T細胞を介した急性細胞傷害作用を避けるため、イムリフィダーゼとEndoS処置の2日前にT細胞除去を行った（図2D）。T細胞除去性mAbを投与した2日後には、95％を超える末梢血中のT細胞がレシピエントで除去されていた（データは示していない）。ここで、CD45.1/2系は、生存ドナーBMCの同定を補助するために使用されたが、そのMHC染色は、DSAによって妨害される可能性がある。図2E-Fに示すように、B6.CD45.2ドナー細胞は、ビヒクル対照（BM 0.22%および脾臓0.27%）またはイムリフィダーゼのみ（BM 0.15%および脾臓0.46%）与えた場合、感作NODマウスでBMT後4時間でほぼ完全に排除された。一方、EndoSとイムリフィダーゼで処置した感作NODマウスのBMCの0.5％近くと脾臓細胞の約1.5％はB6.CD45.2ドナー由来だった。したがって、BMTの4時間前にイムリフィダーゼとEndoSを投与すると、ビヒクルまたはイムリフィダーゼ単独で処置した感作レシピエントと比較して、同種感作レシピエントのドナーBMCの有意の割合が救済された(図2F)。興味深いことに、イムリフィダーゼとEndoSで処置したレシピエントの残存ドナー細胞の大部分は、低いMHC-I K^b染色を示し、ドナーのMHCエピトープが、脱グリコシル化DSAまたはDSAのF(ab’)₂のどちらかによって遮断されたことを示唆している（図2E）。あるいは、生き残ったドナー細胞は、MHCクラスIの発現が少ない細胞であった可能性もある。

総合すると、これらのデータは、イムリフィダーゼとEndoSの組み合わせが、同種感作レシピエントにおけるドナーBMCの生存を改善することを示した。言い換えれば、実質的にすべての血清IgGを不活性化することで、同種感作レシピエントにおけるドナーBMSの生存が改善された。

BMT前のボルテゾミブとシクロホスファミドの処置はBM中のB細胞を減少させた
BMTのためのイムリフィダーゼおよび/またはEndoSに加えて、DSA産生細胞も減少させる方法は、BMT後のドナー細胞の継続的な生存とさらなる発達のための低DSA環境の長いウィンドウを提供するかもしれない。BMT後に既存の形質細胞および形質細胞に分化しうるB細胞を減少させる試みとして、感作マウスにおいてBMT前に、抗体産生細胞を除去させるためにボルテゾミブを、B細胞を減少させるためにシクロホスファミドを採用した（図3A）。ボルテゾミブとシクロホスファミドの組み合わせ（CyBor）は、非移植適格多発性骨髄腫患者や同種BMT後の移植片対宿主病（GVHD）予防に用いられているが、DSA減感作の目的で用いられることは稀である。

BMT後5日目の時点で、BMのBMCの細胞性は群の間で差がなかった。興味深いことに、CyBorで前処置したマウス群では、脾臓細胞の全体数が増加した。しかし、ビヒクル群と比較して、BMのCD19⁺ B細胞、CD19^-CD138⁺B220⁺形質芽細胞、およびCD19^-CD138⁺B220^-形質細胞は、CyBorで処置したマウスで有意に減少した（図3B）。BMのB細胞の減少とは対照的に、脾臓のCD19⁺B細胞の減少は、CyBor処置群では調べた時間では有意でなかった。さらに、CyBor処置マウスの脾臓では、CD19^-CD138⁺B220⁺形質芽細胞およびCD19^-CD138⁺B220^-形質細胞の有意な増加があった（図3C）。

次に、BMC注射により刺激されたDSA形成の増加を、CyBor処置が阻止するかどうかを検討した。図3Dに示すように、対照群では5匹中2匹、CyBor処置群では5匹中2匹でDSAレベルが大幅に増加し、CyBorはDSAレベルを減少させることができないことが示唆された。しかし、BMT後5日（CyBor処置後9日）のDSAレベルのパーセンタイル変化を比較すると、CyBor処置マウスではDSAの増加が少ない傾向にあり、BMT前のCyBor処置がBMC注射により刺激されたDSAの増加を阻害する可能性が示唆された（図3E）。

要約すると、これらのデータは、BMにおいてはCyBorのBM細胞数減少効果は顕著であり、CyBorはBMC注射により生じるDSAの増加を抑制する可能性があることを示した。

イムリフィダーゼ、EndoS、T細胞除去およびCyBorの組み合わせにより、前感作レシピエントにおいて生着が達成可能である
上記のデータから、非致死量の照射と大用量のBMCと一緒にイムリフィダーゼとEndoSにT細胞除去抗体とCyBorによる骨髄形質細胞除去を組み合わせれば、前感作レシピエントへのドナー細胞の生着が可能になると仮定された。かかるプロトコルがNODマウスだけでなく、NODとMHCが一致するがキメリズム誘導に抵抗性のないB6.H-2^g7マウスでもキメリズムを誘導するかどうか検討した。レシピエントマウスは、キメリズム誘導の4週間前にFVB細胞で感作された。ナイーブおよびプライムレシピエントには、方法の項および図4Aに示したように、同じ前処置プロトコルを与えた。

予想通り、すべてのナイーブマウスはBMT後4週目にFVB細胞と一緒にほぼ完全にキメラ化したが、イムリフィダーゼおよびEndoSで処置しなかったプライムマウスではドナー細胞は拒絶された。図4Bに示すように、酵素を受けなかった感作NODマウスでは、BMT後2日目でもドナー細胞は検出されなかった。一方、酵素処置を施した感作NODレシピエント7匹のうち5匹では、BMT後4日目または9日目にドナー細胞が5％を超えた。さらに、酵素処置を受けた4匹の感作NODマウスでは、キメリズムレベルはBMT後16日目に50パーセントを超えるまで着実に増加した。結局、8匹のNODおよびB6.H-2^g7前感作マウスのうち5匹がBMT後4週目にドナー細胞とキメラ化し、2匹のプライムNODマウスは末梢に複数の系統のドナー細胞を持つ安定な混合キメラとなった（表1および図4C）。どのキメラでもGVHDの兆候は観察されなかった。シクロホスファミドまたはボルテゾミブのいずれかを除去してこのプロトコルを簡略化する試みにおいて、感作されたレシピエントにキメリズムを誘導するための現在のプロトコルの成功には、それらの両方が不可欠であると思われた（表1）。

要約すると、イムリフィダーゼとEndoSの組み合わせ（つまり、実質的にすべての血清IgGの不活性化）は、CyBorおよび標準的な前処置剤と組み合わせた場合、前感作レシピエントマウスにおけるドナーBMC生着を可能にするということである。

考察
DSAは、感作されたレシピエントにおける同種BMTの大きな障害である。これまでの研究で、イムリフィダーゼはDSAの除去/減少に使用でき、EndoSはIgGを介した細胞傷害を抑制できることが様々なモデルで示されているが、骨髄由来細胞上のMHCの高い発現が、残存する機能的DSAに対する感受性を高くさせる可能性があるHSPC移植/骨髄移植の関連でどちらの酵素も使用されていない。

感作されたレシピエントに対する腎移植の最近の臨床試験のこれまでの結果を今回の実験と合わせて考えると、イムリフィダーゼは、ヒト患者がHSPC移植／骨髄移植を受けるための前処置に実際に使用できることを示している。また、今回の研究は、EndoSがこの関連で使用できることも示している。EndoS単独で、インビボでのDSAの存在下でドナー細胞の生存を改善させることが判明した。Maria AllhornとMattias Collinが報告したように、EndoS処置IgGは補体の固定能力を低下させることを考慮すると、EndoSがB6.H-2^g7とNODで同程度にドナー細胞の生存を改善したという我々の知見は、FcgRなどの追加のメカニズムがこのBMT-モデルにおけるDSAの病原性の主要な媒介者であることを示唆した。低用量または高用量のモノクローナルDSAとEndoSを投与したNODマウスとB6.H-2^g7マウスの違いは、非MHC遺伝子が個体によってEndoSの有効性に影響を与える可能性を示している。このNODとB6.H-2^g7の違いは、NODとB6バックグラウンドのマウスでIgG_2bと様々なFc受容体の結合能力が異なることに起因している可能性がある。FcRの多型も同様に重要かもしれない。また、この結果は、EndoSの効果は低力価のDSAに対してより強力であることを示唆する。

イムリフィダーゼとEndoSの組み合わせにより、T細胞除去、CyBorおよび亜致死照射で前処置した感作マウスにおいて、ドナーBMCの生存が改善され、ドナーキメリズムが可能になることが判明した。試験したプロトコルでは、末梢のT細胞除去の効果はEndoSによって影響を受けなかった。このことは、タイミングを適切に設計すれば、血清IgGの酵素除去は、IVIGのような抗体ベースの製品やリツキシマブのようなB細胞除去抗体と一緒に使用できることを示唆する。つまり、酵素は、それぞれの投与タイミングを慎重に選択すれば、IgGベースの生物製剤のエフェクター機能に悪影響を与えることなく、DSAを不活性化するために使用することができる。

シクロホスファミドとボルテゾミブの使用に関しては、両者ともB細胞や形質細胞を標的とする以外の免疫調節作用がある。例えば、シクロホスファミドは、メモリーT細胞を減少させることにより、感作されたレシピエントのキメリズム誘導を促進することができる。ボルテゾミブに関しては、ボルテゾミブ処置後に脾臓B細胞が代償的に増加し、その結果、体液性代償が生じるという発表データと知見は一致する。しかし、今回の研究で、BMT後の脾臓B細胞の増加がDSAのリバウンドを伴うかどうかはまだ不明である。さらに重要なことには、このプロトコルで採用したT細胞除去が、ナイーブおよびメモリーB細胞の両方の回復と成熟、およびデノボDSAの生成を潜在的に阻害するかもしれない。

最後に、本研究で得られた知見は、いくつかの限界に照らして検討されなければならない。イムリフィダーゼはヒトIgGサブクラスのすべてを切断するが、マウスIgGの2つのサブクラスのみを切断し、IgMは影響を受けない。IgM DSAレベルはIgGと比較して低いが、観察されたキメリズムレベルを低下させた可能性がある。臨床では、IgM DSAはプラズマフェレーシスによって除去することが可能である。マウスのDSAに対して最大の効果を達成するためには、EndoSとイムリフィダーゼを組み合わせることが必要であった。イムリフィダーゼはインビトロで膜結合型BCRの切断によりメモリーB細胞の活性化を一時的に抑制することが示されており、これがキメリズムの成功に寄与しているかもしれない。しかし、イムリフィダーゼはマウスIgG_2cとIgG₃しか切断しないので、このモデルではマウスIgGに対するイムリフィダーゼの効果は完全ではなかった（図2A）。イムリフィダーゼを減感剤のみとするプロトコルは、イムリフィダーゼがすべての細胞外IgGを完全に除去／不活化し、IgG DSAプールを完全に不活化するヒトにおいて、より効率的である。したがって、これらの知見は、臨床の場におけるこれらの酵素の可能性を過小評価するかもしれない。

第二の限界は、キメリズム誘導プロトコルの毒性に関する。しかし、今回の研究は、IgG Fcの調節が感作されたレシピエントのBMTに戦略的に有用であり得ることを示す原理研究の証明である。さらに、EndoSまたはイムリフィダーゼは、他の脱感作法と組み合わせて使用することもできる。現在のところ、酵素を介したDSAの遮断が抗体のリバウンドを防ぐかどうかは知られていない。おそらく、DSAの機能を遮断しながら一定レベルのDSAを維持すること、すなわちIgG Fcの脱グリコシル化は、DSAの完全除去よりもリバウンドを誘発する可能性が少ないかもしれない。これらの実験では、宿主の抗酵素抗体産生の結果としての活性低下を避けるために、酵素反復注射に短い時間枠（注射間隔6日）を採用した。ヒトの場合、イムリフィダーゼのより高い有効性により、酵素を別々に投与することができ（例えば、イムリフィダーゼの後にEndoS）、抗酵素抗体と一緒に生じ得るどんな懸念も緩和されるかもしれない。

最後に、イムリフィダーゼとEndoSの組み合わせ（すなわち、実質的にすべての血清IgGの酵素的不活性化）は、他の脱感作戦略と組み合わせて、同種感作レシピエントマウスのドナーキメリズムの誘導に用いることができると結論付けることができる。

実施例２ イムリフィダーゼと抗体ベース療法の最適な間隔
背景
イムリフィダーゼ（EUでは腎移植の減感作に条件付きで認可）は、ヒトおよびウサギのIgGのすべてのサブクラスをF(ab’)₂フラグメントと二量体Fcフラグメントに切断するシステインプロテアーゼである。ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（rATG）は、腎移植における導入が承認された除去性抗体療法である（循環Tリンパ球を大幅に減少させる効果がある）。rATGなどの抗体ベース療法は、イムリフィダーゼと一緒に与えると不活性化されるかもしれない。本研究の目的は、残存するイムリフィダーゼの切断活性の大部分を回避しつつ、rATG治療を開始する最も早い時期を検討することであった。

方法
0.25mg/kgのイムリフィダーゼ（EudraCT番号：2019-002770-31）で処置した健常対象（n=11）の血清を用いて、rATGの切断パターンを検討した。血清試料は、臨床的に適切な固定濃度の50μg/mL rATG（1.5 mg/kgの投与後に一般的に観察される）と一緒に、37℃で2時間インキュベートした。血清試料をイムリフィダーゼ前からイムリフィダーゼ後14日を通して採取し、SDS-PAGEおよびヤギ抗ウサギIgG、F(ab’)₂特異的抗体を用いて展開したウェスタンブロットを用いて解析し、rATGの切断を評価した。イムリフィダーゼ濃度は、MSD技術に基づく検証済みのエレクトロルミネセンスイムノアッセイを使用して解析した。

結果
対象のイムリフィダーゼ血清濃度は急速に低下し、96時間での平均濃度は0.5μg/mLであったが、個人差は大きく、＜0.1-1.8 μg/mLであった（図5）。この時点で、イムリフィダーゼ活性レベルは11人中8人の対象において、十分に低下しrATGの完全切断を回避していた（図6）。

結論
rATGは、一部の患者では最初のrATG投与の一部が切断される可能性を考慮し、イムリフィダー後4日という早い時期に開始してもよい。しかし、rATGの投与量は多く、数日間投与を繰り返すため、療法開始時のこの切断がrATG治療の有効性に全体として悪影響を及ぼすことはないと予想される。

実施例３－混合キメリズムプロトコルの特異性向上と毒性軽減
特異性を高め、アプローチの潜在的な毒性を低減し、臨床的平行移動（translation）のより高い可能性を達成することを目的として、実施例1で示す混合キメリズムプロトコルに段階的な変更を導入し得る。特に：
(i）感作されたレシピエントにおける安定したキメリズムの頻度を増加させるために、ドナーCD8－アルファ細胞の注入を投与し得る。ドナーT細胞の注入は、宿主T細胞の生存を低下させることにより、BMTの生着を促進する可能性がある。
(ii）酵素（IdeSおよび／またはEndoS）によるDSAの除去、T細胞やNK細胞の最大限の除去とともに、抗CD117/抗CD47を投与し得る。これにより、前感作レシピエントに対する初めての無照射、非骨髄破壊的キメリズムプロトコルが可能になり得る。抗CD117/抗CD47抗体は、宿主のHSCを除去するのに役立つ。

Claims (13)

1. 対象の血清IgG分子を不活性化する酵素を対象に投与することを含む、細胞、組織または臓器を対象に移植するための前処置レジメンであって、任意に、移植が造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）である、前処置レジメン。
2. 投与される前記酵素の量が、対象の血清中に存在する全てのまたは実質的に全てのIgG分子を不活性化するのに十分である、請求項１の前処置レジメン。
3. 酵素が、IgGシステインプロテアーゼまたはIgGエンドグリコシダーゼである、先行する請求項のいずれかの前処置レジメン。
4. (i）IgGシステインプロテアーゼが、ストレプトコッカス ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）などのストレプトコッカス菌由来であり、任意に、前記酵素がIdeS、IdeZもしくはMAC2ポリペプチド、あるいは
   (ii)IgGエンドグリコシダーゼが、ストレプトコッカス ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス equi（Streptococcus equi）もしくはストレプトコッカス ズーエピデミクス（Streptococcus zooepidemicus）などのストレプトコッカス菌由来、またはコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Corynebacterium pseudotuberculosis）、エンテロコッカス フェカーリス（Enterococcus faecalis）もしくはエリザベトキンギア メニンゴセプティカ（Elizabethkingia meningoseptica）由来であり、任意に前記酵素がEndoS、CP40、EndoEもしくはEndoF2ポリペプチドである、
   請求項３に記載の前処置レジメン。
5. －前記IgGシステインプロテアーゼが、配列番号2、4もしくは5と少なくとも80％同一、例えば少なくとも85％、90％、95％もしくは99％同一である配列を有するポリペプチドであるか、または、前記IgGシステインプロテアーゼが、配列番号6から25および55から69のいずれか一つの配列を含むまたはそれからなり、任意に前記配列がN末端に追加のメチオニンおよび／またはC末端にヒスチジンタグを含む；あるいは
   －前記IgGエンドグリコシダーゼが、配列番号90と少なくとも80％同一、例えば少なくとも85％、90％、95％または99％同一である配列を有するポリペプチドであり、任意に、前記配列がN末端に追加のメチオニンおよび／またはC末端にヒスチジンタグを含む、
   請求項４に記載の前処置レジメン。
6. 酵素が、イムリフィダーゼおよび／またはEndoSである、先行する請求項のいずれか１項の前処置レジメン。
7. 以下のうちの一つ以上を含む、先行する請求項のいずれか１項の前処置レジメン：
   (a)非致死量の照射および／または対象のHSPCを除去する任意の他の薬剤の対象への投与、
   (b）対象におけるリンパ球の数を減少させるおよび／または活性を下方制御する薬剤の投与であって、前記リンパ球が以下を含む：
   i. T細胞；および／または
   ii．B細胞（任意に抗体産生細胞を含む）、
   (c）免疫系の活性を低下させる任意の他の薬剤またはレジメン、例えば補体の阻害剤、サイトカインの阻害剤、自然免疫細胞の阻害剤、寛容の誘導剤の投与。
8. 少なくとも（a）および（b）を含む、請求項７の前処置レジメンであって、任意で
   －（a）さらにドナーCD8－アルファ細胞の注入投与を含む；ならびに／または
   －（a）抗CD117抗体および／または抗CD47抗体の投与を含む；ならびに／または
   －（b）抗CD4、抗CD8および抗CD90抗体、ボルテゾミブ、およびシクロホスファミドの投与、ならびに／またはrATGの投与を含む、前処置レジメン。
9. 先行する請求項のいずれか１項の前処置レジメンを実施すること、その後、対象に造血キメリズムの誘導に十分な量および適した条件下で、造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）を対象に投与することを含む、対象において造血キメリズムを誘導する方法。
10. HSPCが、同種、同系または自家であり、任意に遺伝子改変されている、請求項９に記載の方法。
11. 請求項９または１０の方法を実施すること、およびHSPCと同じドナーからの細胞、組織または臓器移植を対象に適用することを含む、細胞、組織または臓器移植の免疫拒絶反応の予防または治療方法。
12. 移植が、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、小腸、皮膚、血管／血管組織、顔、腕、気管、眼の一部、膵島、黒質、骨髄または幹細胞であり、任意に、追加の移植が必要ないように請求項９または１０の方法で使用したHSPCを含む、請求項１１の方法。
13. 細胞、組織または臓器移植の免疫拒絶反応の予防または治療のための方法に用いる血清IgG分子を不活性化する酵素であって、該方法が請求項１１または１２の方法を含む酵素。

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