JP2023517057A - 細胞内細菌感染症を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば免疫細胞、例えば、マクロファージまたは樹状細胞）内に生息する細菌細胞により引き起こされる細菌感染症などの、細菌感染症の治療のための組成物及び方法を特徴とする。組成物及び方法は、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を、細菌細胞が生息する細胞内区画（エンドソーム、ファゴソーム、リソソーム、またはサイトゾル）に送達することを含む。

Description

細菌性病原体は、感染症の主たる原因である。多くの細菌はヒトの免疫系により上手く検出され、感染が始まる前に、速やかに取り除かれる。しかし、多数の細菌性病原体は、宿主細胞内に生息することにより、宿主の免疫系を回避する。これらの細胞内細菌は、宿主細胞、例えば、免疫細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）などの宿主細胞内で、ならびに、宿主細胞内の正しい細胞内区画（例えば、エンドソーム、ファゴソーム、リソソーム、またはサイトゾル）内に生息して繁殖することにより多様な免疫回避技術を発展させてきた。宿主細胞内で拡大する細菌感染症は多くの場合、細胞内の感染場所への接近容易性が欠落しているために、困難な治療障壁を呈する。特定の抗細菌組成物は感染症を（例えば、インビトロで）治療することができるが、治療を、細菌が生息する正しい細胞内位置に送達することは、困難を伴う努力であることが証明されている。
困難な細胞内細菌感染症のある群は、マイコバクテリアにより引き起こされる。マイコバクテリアは、ミコール酸にて豊富である太い細胞壁で示される、放線菌である。マイコバクテリアは、脂質二分子膜で構成される細胞膜と、ペプチドグリカン層及びアラビノガラクタン層を含む細胞壁と、疎水性ミコール酸層を含有する外膜と、を含有するエンベロープを含有する。多くのマイコバクテリアは、Ｄ－グルカン、Ｄ－アラビノ－Ｄ－マンナン、及びＤ－マンナンなどの多糖類で構成される外側カプセルもまた含有する。この複雑な細胞エンベローブはマイコバクテリアの耐久力に寄与し、特に、貫通して破壊するのが難しい。病原性マイコバクテリアは多くの場合、２つの群：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、及び、非結核マイコバクテリア（ＮＴＭ）に分けられる。結核とは対照的に、ＮＴＭの、人から人への伝染は稀である。それにもかかわらず、ＮＴＭ感染症の数は、特に、肺疾患を有する人の間で増加している健康上の懸念である。
マイコバクテリアにより引き起こされるものなどの、細胞内細菌感染症を標的にして治療する、改善された組成物及び方法が必要とされている。
一態様では、本発明は、対象のプロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）内の、標的細胞内区画への、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質の送達方法を特徴とする。標的細胞内区画は、細菌細胞（例えば、マイコバクテリア細胞）を含むことができる。方法は、対象に、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含有する超分子構造体を含む組成物を投与することを含む。投与ステップに続いて、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質が、標的細胞内区画に送達される。超分子構造体は、標的部分をさらに含むことができる。抗菌溶解タンパク質は、抗菌バクテリオファージタンパク質であるのが好ましい。
別の態様では、本発明は、対象のプロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）内の、標的細胞内区画への、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質の送達方法を特徴とする。標的細胞内区画は、細菌細胞（例えば、マイコバクテリア細胞）を含むことができる。方法は、対象に、標的部分と、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含むカーゴと、を含む超分子構造体を含む組成物を投与することを含む。投与ステップに続いて、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質が、標的細胞内区画に送達される。
別の態様では、本発明は、細菌細胞により引き起こされる、対象における細胞内細菌感染症の治療方法を特徴とする。方法は、超分子構造体と、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含むカーゴと、を含む組成物を投与することを含む。組成物は、細菌感染症を治療するのに十分な量及び期間で、対象に投与することができる。超分子構造体は、標的部分をさらに含むことができる。
別の態様では、本発明は、細菌細胞により引き起こされる、対象における細胞内細菌感染症の治療方法を特徴とする。方法は、標的部分と、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含むカーゴと、を含む超分子構造体を含む組成物を投与することを含む。組成物は、細菌感染症を治療するのに十分な量及び期間で、対象に投与することができる。
別の態様では、本発明は、超分子構造体と、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含むカーゴと、を含む組成物を特徴とする。超分子構造体は、標的部分をさらに含むことができる。
別の態様では、本発明は、標的部分と、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含むカーゴと、を有する超分子構造体を含む組成物を特徴とする。
バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質は、同じ超分子構造体の中に存在することができる。バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質は、異なる超分子構造体の中に存在することができる。
上記態様のいずれかに記載のいくつかの実施形態では、超分子構造体のＺアベレージ平均粒径は、約７５ｎｍ～約７５０ｎｍ（例えば、約２５０ｎｍ～約７５０ｎｍ、または、約７５ｎｍ～約２５０ｎｍ）である。好ましくは、超分子構造体がＬＮＰまたはミセルである場合、Ｚアベレージ平均粒径は約７５ｎｍ～約２５０ｎｍである。好ましくは、超分子構造体が小胞（例えば、リポソーム）である場合、Ｚアベレージ平均粒径は約２５０ｎｍ～約７５０ｎｍである。Ｚアベレージ平均粒径の非限定例としては、例えば、約７５ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば、７５ｎｍ～約８５ｎｍ、例えば、約８０ｎｍ、例えば、約８０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１３０ｎｍ、または、約１１０ｎｍ～約１３０ｎｍ、例えば、約１２０ｎｍ、例えば、約２００ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば、約２５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約２６０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約２６０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約２６５ｎｍ～約２７５ｎｍ、例えば、約２７０ｎｍ、例えば、約３００ｎｍ～約４００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、例えば、約４５０ｎｍ～約５５０ｎｍ、約４７５ｎｍ～約５２５ｎｍ、約４８０ｎｍ～約５２０ｎｍ、約４９０ｎｍ～約５１０ｎｍ、約４９５ｎｍ～約５０５ｎｍ、例えば、約５００ｎｍ、例えば、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、約２００ｎｍ、約２０５ｎｍ、約２１０ｎｍ、約２１５ｎｍ、約２２０ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２３０ｎｍ、約２３５ｎｍ、約２４０ｎｍ、約２４５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２５５ｎｍ、約２６０ｎｍ、約２６５ｎｍ、約２７０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約２８０ｎｍ、約２８５ｎｍ、約２９０ｎｍ、約２９５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３０５ｎｍ、約３１０ｎｍ、約３１５ｎｍ、約３２０ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３３０ｎｍ、約３３５ｎｍ、約３４０ｎｍ、約３４５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３５５ｎｍ、約３６０ｎｍ、約３６５ｎｍ、約３７０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約３８０ｎｍ、約３８５ｎｍ、約３９０ｎｍ、約３９５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４０５ｎｍ、約４１０ｎｍ、約４１５ｎｍ、約４２０ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４３０ｎｍ、約４３５ｎｍ、約４４０ｎｍ、約４４５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４５５ｎｍ、約４６０ｎｍ、約４６５ｎｍ、約４７０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約４８０ｎｍ、約４８５ｎｍ、約４９０ｎｍ、約４９５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５０５ｎｍ、約５１０ｎｍ、約５１５ｎｍ、約５２０ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５３０ｎｍ、約５３５ｎｍ、約５４０ｎｍ、約５４５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５５５ｎｍ、約５６０ｎｍ、約５６５ｎｍ、約５７０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約５８０ｎｍ、約５８５ｎｍ、約５９０ｎｍ、約５９５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６０５ｎｍ、約６１０ｎｍ、約６１５ｎｍ、約６２０ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６３０ｎｍ、約６３５ｎｍ、約６４０ｎｍ、約６４５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約６５５ｎｍ、約６６０ｎｍ、約６６５ｎｍ、約６７０ｎｍ、約６７５ｎｍ、約６８０ｎｍ、約６８５ｎｍ、約６９０ｎｍ、約６９５ｎｍ、約７００ｎｍ、約７０５ｎｍ、約７１０ｎｍ、約７１５ｎｍ、約７２０ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７３０ｎｍ、約７３５ｎｍ、約７４０ｎｍ、約７４５ｎｍ、または約７５０ｎｍが挙げられる。いくつかの実施形態では、超分子構造体のＺアベレージ平均粒径は、約８０ｎｍ、約２７０ｎｍ、または約５００ｎｍである。
上記態様のいずれかに記載のいくつかの実施形態では、細菌細胞は、マイコバクテリウム、サルモネラ、ナイセリア、ブルセラ、エシェリキア、リステリア、フランキセラ、レジオネラ、エルシニア、ブドウ球菌、クロストリジウム、赤痢菌、または連鎖球菌種であるか、バクテリオファージは、これらに感染することができるか、あるいは、抗菌溶解タンパク質は、これらを殺傷することができる。
いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム種は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍ．ｌｅｐｒａｅ，Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ，Ｍ．ａｖｉｕｍ，Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ，Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ，Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、またはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓであり、サルモネラ種は、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉであり、ナイセリア種は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓであり、ブルセラ種は、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、またはＢ．ｃａｎｉｓであり、エシェリキア種は、Ｅ．ｃｏｌｉであり、リステリア種は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓであり、フランキセラ種は、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、またはＦ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａであり、レジオネラ種は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａであり、エルシニア種は、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓまたはＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａであり、ブドウ球菌種は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓであり、クロストリジウム種は、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、またはＣ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉであり、赤痢菌種は、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、またはＳ．ｓｏｎｎｅｉであり、あるいは、連鎖球菌種は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。
いくつかの実施形態では、超分子構造体は、約０．０５～約０．３の多分散指数（ＰＤＩ）を有することができる。いくつかの実施形態では、超分子構造体は、１種以上の脂質、例えば、イオン化可能な脂質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、超分子構造体は、少なくとも１つの標的部分をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、標的部分は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）を標的にする細胞外標的部分である。
いくつかの実施形態では、標的部分は、ホスファチジルセリンを含む。
いくつかの実施形態では、標的部分は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。それ故、抗体または抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ１６３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ２０６、抗ＣＤ１２３抗体、ならびにその抗原結合フラグメントからなる群から選択されることができる。抗体または抗原結合フラグメントは、抗ＤＥＣ２０５、抗ＣＤ３０４、抗ＣＤ３０３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＢＤＣＡ２、及び抗ＣＤ１２３抗体、ならびにその抗原結合フラグメントからなる群から選択されることができる。
いくつかの実施形態では、標的部分は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、標的部分は、マンノースクラスターまたは葉酸塩である。
いくつかの実施形態では、標的部分はＴＬＲ２アゴニストである。例えば、ＴＬＲ２アゴニストは、ＭＡＬＰ－２リポタンパク質、ＭＡＬＰ－４０４リポタンパク質、外側表面リポタンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）、ポリン、ＬｃｒＶ、Ｈｓｐ６０、糖タンパク質ｇＨ／ｇＬ、または糖タンパク質ｇＢからなる群から選択されることができる。
いくつかの実施形態では、超分子構造体は脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、超分子構造体はミセルである。いくつかの実施形態では、超分子構造体はリポソームである。リポソームは、ユニラメラまたはマルチラメラ（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上のラメラ）であることができる。超分子構造体は、約０．０５～約０．３の多分散指数を有することができる。
超分子構造体は、１種以上の脂質（例えば、イオン化可能な脂質）をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、方法は、抗生物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗生物質は、セファロスポリン、カルバペネム、ペニシリン、及びフルオロキノロンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、チアセタゾン、ｓｑ－１０９、ベダキリン、デラマニド、ピラジナミド、及びイソニアジドからなる群から選択される。例えば、抗生物質は、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エタンブトール、リファンピン、またはアミカシンであることができる。
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、細菌細胞（例えば、マイコバクテリア細胞、例えば、ＮＴＭ細胞）に感染することができる、または、抗菌溶解タンパク質は、これを殺傷することができる。バクテリオファージは、マイコバクテリオファージであることができる。抗菌バクテリオファージタンパク質は、抗菌マイコバクテリオファージタンパク質であることができる。バクテリオファージは、溶解タンパク質（例えば、溶解素、アミラーゼ、またはカプセルデポリメラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。抗菌溶解タンパク質は、溶解タンパク質（例えば、溶解素またはカプセルデポリメラーゼ）であることができる。溶解素は例えば、溶解素Ａまたは溶解素Ｂであることができる。カプセルデポリメラーゼは、例えば、ヒドロラーゼ、メタロヒドロラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペプチドグリカンヒドロラーゼ、ポリサッカラーゼ、多糖類リアーゼ、エンドシアリダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、またはアルギネートリアーゼであることができる。アミラーゼは例えば、イソアミラーゼまたはα－アミラーゼであることができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内投与、経口投与、局所投与される、または、吸入により投与される。
別の態様では、本発明は、細菌を標的にするファージの単離方法であって、当該方法が、
ファージ及び洗剤、クロロホルムである極性、水不混和性、中性溶媒、またはこれらの組み合わせを含む不均質な混合物を接触させて、液体及び個体を含む組成物を作製するステップと、
上記液体を上記固体から分離して上清を作製するステップと、
上記上清を濃縮して濃縮上清を作製するステップと、
上記濃縮上清を上記細菌によりインキュベートし、上記ファージ、細胞、及びデブリを含む細胞混合物を作製するステップと、
上記ファージを、上記細胞及びデブリから分離して、上記ファージを単離するステップと、を含む、上記方法を提供する。
いくつかの実施形態では、不均質な混合物は、汚れたスラッジである。いくつかの実施形態では、洗剤は、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）、ポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０）、またはノノキシノール９である。いくつかの実施形態では、極性、水不混和性、中性溶媒はクロロホルムである。
定義
本明細書で使用する場合、用語「約」とは、列挙した値の±１０％を意味する。
本明細書で使用する場合、「組み合わせ療法」または「組み合わせて投与される」とは、２つ（またはそれ以上）の異なる剤または治療が、特定の疾患または状態に対して、定義された治療レジメンの一部として対象に投与されることを意味する。治療レジメンでは、対象に対する別個の剤の効果が重なるように、各剤の投与の用量及び周期性を定義する。いくつかの実施形態では、２つ以上の剤の送達は同時または並行であり、本剤は同時製剤化され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の剤は同時製剤化されず、処方されたレジメンの一部として連続的に投与される。いくつかの実施形態では、２つ以上の剤または治療を組み合わせて投与することは、症状、または疾患に関連する他のパラメータの減少が、単独でまたは他の非存在下で送達される１つの剤または治療で観察されるものよりも大きくなるようなものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的よりも大きくなり得る（例えば、相乗的）。各治療剤の連続または実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、局所経路、及び粘膜組織を介した直接吸収を含む、任意の適切な経路によるものであることができるが、これらに限定されない。治療剤は、同じ経路によって、または異なる経路によって投与することができる。例えば、組み合わせの第１の治療剤を静脈内注射によって投与してもよい一方で、その組み合わせの第２の治療剤を経口投与してもよい。
本明細書で使用する場合、本明細書に記載する（例えば、細胞または対象における）治療効果をもたらす、「有効量」、「治療に有効な量」、及び「十分な量」の剤、という用語は、細胞、または、ヒトを含む対象に投与されたときに、前臨床または臨床的結果を含む、有益な、または所望の結果をもたらすのに十分な量を意味し、そのため、そのような「有効量」、またはその同義語は、この用語が使われる文脈において左右される。例えば、障害の治療の文脈において、この用語は、投与を伴わずに得られる応答と比較して、治療応答を実現するのに十分な剤の量である。所与の剤の量は、様々な因子、例えば、所与の剤、薬学製剤、投与経路、マイコバクテリア感染症の重症度、治療されている対象のアイデンティティ（例えば、年齢、性別、及び／または体重）、または、宿主細胞のアイデンティティ（例えば、哺乳類の免疫細胞）などに応じて変化するであろうが、それにもかかわらず、当業者によって日常的に決定することができる。また、本明細書で使用する場合、「治療に有効な量」の剤とは、対照と比較して、細胞または対象において有益な、または所望の結果をもたらす量である。本明細書で定義する場合、治療に有効な量の剤は、当該技術分野において既知の日常的な方法により、当業者により速やかに決定することができる。投薬レジメンを調整して、最適な治療応答を提供してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「抗菌溶解タンパク質」とは、細菌に対して、殺菌及び／または溶菌活性を有するバクテリオファージと関連する、または、これから分泌されるタンパク質を意味する。抗菌溶解タンパク質の非限定例としては、ホーリン、溶解素（例えば、溶解素Ａ及び／または溶解素Ｂ）、アミラーゼ（例えば、イソアミラーゼまたはαアミラーゼ）、ならびに、カプセルデポリメラーゼ（例えば、ヒドロラーゼ、メタロヒドロラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペプチドグリカンヒドロラーゼ、ポリサッカラーゼ、多糖類リアーゼ、エンドシアリダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、またはアルギネートリアーゼ）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「エンドソームエスケープ部分」とは、エンドソームエスケープ部分を欠くことのみにおいて異なる参照分子と比較して、エンドソーム内容物の放出を向上させる、または、内部細胞区画（例えば、エンドソーム、ファゴソーム、もしくはリソソーム）からの分子の脱出を促進する部分を表す。
本明細書で使用する場合、「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」とは、実質的に固体の脂質コアを封入する脂質層を含む小胞であり、脂質コアは、薬学的に活性な分子を含有することができる。ＬＮＰは通常、粒子（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）の凝集を防止する、陽イオン性脂質、非カチオン性脂質、及び脂質を含有する。
本明細書で使用する場合、用語「リポソーム」とは、少なくとも１つの二分子膜、例えば、１つの二分子膜、または複数の二分子膜の中に配置される両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料及び水性インテリアから形成される膜を有する、ユニラメラ及びマルチラメラ（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上のラメラ）を含む。水性部分は、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質、または、他の構成成分との混合物を含有する。親油性材料は、水性エクステリアを水性インテリアと分離し、通常、ファージタンパク質を含まないが、場合によっては、含有する場合がある。リポソームは、「立体的に安定した」リポソームもまた含み、この用語は、本明細書で使用する場合、リポソームに組み込まれる場合に、そのような専用脂質を欠くリポソームと比較して、向上した循環寿命をもたらす、１種以上の専用脂質を含むリポソームを意味する。
「ミセル」は、本明細書では、両親媒性分子（例えば、脂質）が集まって体積、例えば、実質的に球状の体積を確定する、超分子構造体の一種として定義される。両親媒性分子（例えば、脂質）は通常、ミセルのシェルを構成する。このシェルの中には、両親媒性分子の疎水性部分が通常内側を向いており、親水性部分を、周囲の水相と接触させたままにする。逆の配置は、周囲の媒体が疎水性である場合に存在する。ミセルコアは、抗菌溶解タンパク質、または、バクテリオファージとタンパク質の混合物を含有することができる。
本明細書で使用する場合、用語「標的部分」とは、所与の標的細胞集団（例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞））と会合する受容体または他の受容性部分に特異的に結合する、または、これと反応的に会合する、もしくはこれと複合体を形成する部分（例えば、低分子、例えば、炭水化物）を表す。したがって、標的部分を使用して、本明細書に記載する超分子構造体を、例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）に標的させることができる。
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療の目的で、本発明による組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、任意の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）が含まれる。対象は、治療を求めるか必要としている、治療が必要である、治療を受けている、今後治療を受けるか、または特定の疾患または状態について熟練の専門家による治療を受けているヒトまたは動物であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「超分子構造体」とは、非共有結合、例えば、水素結合、ファンデルワールス力、静電相互作用、疎水性効果、及びπ－π相互作用により互いに結合している、分子の複合体を意味する。超分子構造体は、例えば、球状様構造を形成する、分子の大型複合体を含むことができる。超分子構造体としては、例えば、脂質ベースの超分子構造体、例えば、リポソーム及び脂質ナノ粒子（例えば、ミセル）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「標的細胞内区画」とは、エンドソーム、ファゴソーム、リソソーム、またはサイトゾルを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「標的部分」とは、所与の標的細胞集団（例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞））と会合する受容体または他の受容性部分に特異的に結合する、または、これと反応的に会合する、もしくはこれと複合体を形成する部分（例えば、低分子、例えば、炭水化物）を表す。したがって、標的部分を使用して、本明細書に記載する超分子構造体を、例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）に標的させることができる。
「小胞」は、本明細書では、両親媒性分子（例えば、脂質）が集まって体積、例えば、実質的に球状の体積を確定する、超分子構造体の一種として定義される。両親媒性分子（例えば、脂質）は通常、小胞の少なくとも１つのシェルを構成する。このシェルの中では、両親媒性分子が二分子膜内に配置され、両親媒性分子の親水性部分が、二分子膜の平面に対して外側に向いており、両親媒性分子の疎水性部分が、二分子膜内で主に配置されている。逆の配置は、周囲の媒体が疎水性である場合に存在する。
マイコバクテリウム細胞、または、それぞれ、マイコバクテリウムに感染し抗菌溶解タンパク質で治療したマクロファージ、または、治療用ペイロードを含むバクテリオファージを含む、細胞のグローアウト連続希釈（ＧＯＳＤ）における酵素生物（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ）反応のレベルをスクリーニングし、定量する実験設計の概略図である。例えば、挿入図は、マイコバクテリウムに感染し、抗菌溶解タンパク質（ＡＢＩα）または希釈緩衝液（ＤＢ）で治療した、ＥＣＬ５５細胞のＧＯＳＤプレートを示す。 Ａは、溶解素Ａ（Ａ）、溶解素Ｂ（Ｂ）、イソアミラーゼ（Ｉ）、及びαアミラーゼ（α）（ＡＢＩα）の酵素カクテルの、１回（１０μＬ）、２回（２０μＬ）、または３回（３０μＬ）用量での治療に対する、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ細胞の、ＧＯＳＤ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、及び、－８の用量依存性応答を示す一連のグラフである。培養光学密度（ＯＤ５９０）／検出下限における、ＡＢＩα治療の用量依存性効果の定量化である。Ｂは、溶解素Ａ（Ａ）、溶解素Ｂ（Ｂ）、イソアミラーゼ（Ｉ）、及びαアミラーゼ（α）（ＡＢＩα）の酵素カクテルの、１回（１０μＬ）、２回（２０μＬ）、または３回（３０μＬ）用量での治療に対する、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ細胞の、ＧＯＳＤ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、及び、－８の用量依存性応答を示す一連のグラフである。Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ細胞の数における、治療効果の定量化である。 それぞれ、３．２μｇ、１．６μｇ、０．８μｇ、０．４μｇ、０．２μｇ、及び０．１μｇのＡＢＩα／ウェル、またはＡＢＩαなしで治療した後の、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ細胞の数を示すグラフである。 Ａは、１回用量のＡＢＩαにより、または、これなしで治療し、３または６日間培養した、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ細胞のＧＯＳＤ（－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、及び－８）の、ＯＤ５９０／ＬＬｏＤを示すグラフである。Ｂは、１回用量のＡＢＩαにより、または、これなしで治療し、３または６日間培養した、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ細胞のＧＯＳＤ（－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、及び－８）の、ＯＤ５９０／ＬＬｏＤを示すグラフに対応する画像である。 それぞれ、ＡＢＩα及び抗生物質のアミカシン、ビアペネム、セフォキシチン、エタンブトール、モキシフロキサシン、リファンピシン、またはクラリスロマイシンで処理した、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ細胞の増殖の、画分阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）を示す、データの表での集合である。 封入されていない（遊離酵素）、または、封入された抗菌溶解タンパク質（封入酵素）での処理による、感染マクロファージにおけるマイコバクテリア増殖の減衰での異なる影響を評価するための実験設計の概略図である。 それぞれ、封入されていない（遊離）、または、封入された（封入）Ａ、Ｂ、Ｉ、及びα（ＡＢＩα、ＡＢ、Ｉα、Ｂｉα、ｅｎｃＡＢＩα、ｅｎｃＡＢ、ｅｎｃＩα、及びｅｎｃＢｉα）の組み合わせで処理した、感染マクロファージからの抽出後の、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓのＧＯＳＤ（－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、及び－８）のＯＤ５９０／ＬＬｏＤを示すグラフである。 図７に記載する実験における、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ細胞の数の定量化を示す表である。 封入されていない（遊離バクテリオファージ）または封入されたバクテリオファージで処理した、感染マクロファージにおけるマイコバクテリア増殖の弱毒化の異なる効果を評価するための実験設計の概略図である。 それぞれ、封入されていない（ファージ）、または封入された（封入ファージ）赤痢菌ファージＥＰＨ３４で処理した、感染マクロファージからの抽出後の、Ｓ． ｆｌｅｘｎｅｒｉのＧＯＳＤ（－１、－２、－３、－４、－５、及び－６）のＯＤ５９０／ＬＬｏＤを示すグラフである。
バクテリオファージは、細菌内で感染し複製するウイルスである。溶解ファージは宿主細菌に感染し、宿主の機構を利用して、ヴィリオンを複製する。複製後、ファージは宿主細胞を溶解して、ファージ後代を放出して、感染するための新しい細菌宿主を見つける。バクテリオファージは、宿主に感染してこれを殺傷し、宿主の機構を利用して増殖するための、不可欠な機構全てでプログラムされている。したがって、バクテリオファージ及びそのタンパク質成分は、細菌宿主細胞を特異的に標的して感染し、これを破壊する能力によって、魅力的な抗細菌両方を呈する。
宿主細胞内にあるいくつかの病原菌は、標的にするのが困難である。これらの細胞内細菌は、免疫検出から逃れるために、宿主細胞内に生息して増殖する。細胞内細菌を効率的に標的にするために、治療用ペイロードは、細菌を標的にするだけでなく、細菌が生息する正しい細胞内位置を標的にしなければならない。本発明は、細胞内細菌感染症を治療するための抗細菌療法を標的にするための組成物、及びその使用方法を提供することにより、本問題を解決する。一般に、組成物は、宿主細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）、及び、正しい標的細胞内区画（エンドソーム、ファゴソーム、リソソーム、またはサイトゾル）を標的にする超分子構造体（例えば、脂質ベースの超分子構造体、例えば、リポソーム、ミセル、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を特徴とする。一方で、超分子構造体は、バクテリオファージ、及び、細菌細胞に感染してこれを殺傷するようにプライミングされた、少なくとも１つの抗菌溶解タンパク質でプレロードされる。超分子構造体はペイロードを、正しい細胞型及び細胞内区画に向かわせる一方で、バクテリオファージは、その固有の表面認識特性により、細菌を直接標的にする。抗菌溶解タンパク質は細菌に直接結合し、細胞壁の溶解に関与することができる。
超分子複合体にロードされた、バクテリオファージと抗菌溶解タンパク質の組み合わせを、対象に投与することができる。超分子複合体は、細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞）によりエンドサイトーシスを受け、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質は、標的細胞内区画（エンドソーム、ファゴソーム、リソソーム、またはサイトゾル）に送達され、ここに細菌が生息する。ファージは標的細胞内区画内で細菌を認識し、細菌の表面に付着する。１種以上の溶菌酵素をコードするファージゲノムは、宿主機構により転写され翻訳される。さらに、組成物は、追加の溶菌酵素をさらに含む。これらの溶菌酵素は次に、細菌の細胞壁を破壊し、浸透破裂、及び、付近の細菌細胞に感染してこれを殺傷することができる、ファージ後代の放出をもたらす。マイコバクテリオファージにおいては、溶菌酵素は、マイコエンベロープの強靱なバリアにより、溶解素（例えば、溶解素Ａ及び溶解素Ｂ）、アミラーゼ、例えば、イソアミラーゼ及びαアミラーゼ、ならびに、カプセルデポリメラーゼを含む。カプセルデポリメラーゼは、マイコバクテリア細胞の外側カプセルを破壊する酵素である。外側カプセルは通常、多糖類及びタンパク質、加えて、少量の脂質で構成される。カプセル内のカプセル多糖類としては、例えば、Ｄ－グルカン、Ｄ－アラビノ－Ｄ－マンナン、及びＤ－マンナンが挙げられる。カプセルデポリメラーゼは、これら、及び、カプセルにて見出される他の多糖類を含有する多糖類を破壊する酵素である。これらの酵素は、マイコエンベロープの異なる層の切断を担う。例えば、いくつかのマイコバクテリアにおいては、溶解素Ａはペプチドグリカン層を切断し、溶解素Ｂは、アラビノガラクタンとミコール酸外膜とを切断する。いくつかのマイコバクテリオファージは、ホーリンもまたコードし、ホーリンは、膜形成孔をオリゴマー化及び易透化させて、溶解素がその基質に接近して細胞壁を破壊することを可能にする、膜タンパク質である。
バクテリオファージ
バクテリオファージは、ファージ感染の結果、標的細菌を認識して、これを溶解するのに必要な機構を含有する。バクテリオファージは、表面受容体を含有する宿主細胞表面に接近すること、正の巨大分子相互作用により表面に結合すること、ゲノムを標的細胞に注入すること、ウイルスゲノムをＲＮＡ及びタンパク質に発現させること、複製されたゲノムを含む新しいウイルス粒子をアセンブルすること、及び、宿主細胞を溶解させて後代ファージを放出することを含む一続きの機能を発揮する。いくつかの推定では、１０３０個を超えるファージが存在することが示唆され、このことは、治療剤の開発のための溶菌剤の発見をもたらす、幅広い多様性を示している。
マイコバクテリオファージ（ファージ）は、マイコバクテリアに特異的に感染する二本鎖ＤＮＡウイルスであり、溶解感染サイクルの終了時に、最終的に、マイコバクテリア細胞の死に至る。マイコバクテリオファージは、細胞壁のコアとして、共有結合したミコリル－アラビノガラクタン－ペプチドグリカン（ｍＡＧＰ）複合体を含む、非常に疎水性のマイコバクテリア細胞ウェルの特定の層において、特定の種類の結合を標的にして溶解することに向けられる脂肪分解酵素を含む特異的な溶解系を有するように進化してきた。
本明細書に記載するバクテリオファージは、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）に生息する細胞内細菌などの細胞内細菌に感染する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、マイコバクテリウム、サルモネラ、ナイセリア、ブルセラ、エシェリキア、リステリア、フランキセラ、レジオネラ、エルシニア、ブドウ球菌、クロストリジウム、赤痢菌、または連鎖球菌種に感染することが可能である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、マイコバクテリウムに感染可能なマイコバクテリオファージである。マイコバクテリウム種の例としては、限定されるものではないが、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍ．ｌｅｐｒａｅ，Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ，Ｍ．ａｖｉｕｍ，Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ，Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ，Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、またはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓが挙げられる。マイコバクテリオファージは、前述のマイコバクテリア種のいずれかに感染することができる。いくつかの実施形態では、マイコバクテリオファージは、複数の前述のマイコバクテリアに感染することができる。
バクテリオファージは、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉに感染することができる。バクテリオファージは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに感染することができる。バクテリオファージは、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、またはＢ．ｃａｎｉｓに感染することができる。バクテリオファージは、Ｅ．ｃｏｌｉに感染することができる。バクテリオファージは、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに感染することができる。バクテリオファージは、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、またはＦ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａに感染することができる。バクテリオファージは、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに感染することができる。バクテリオファージは、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓまたはＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａに感染することができる。バクテリオファージは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに感染することができる。バクテリオファージは、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、またはＣ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉに感染することができる。バクテリオファージは、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、またはＳ．ｓｏｎｎｅｉに感染することができる。バクテリオファージは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに感染することができる。
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、自然に存在するバクテリオファージである。他の実施形態では、バクテリオファージは組み換えバクテリオファージである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、例えば、２つ以上の細菌種または株により引き起こされる細菌感染症を治療するための、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれ以上の）異なるバクテリオファージを含む。
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、例えば、溶菌酵素（例えば、溶解素（例えば、溶解素Ａ及び／または溶解素Ｂ）、ホーリン、またはカプセルデポリメラーゼ）をコードする核酸を含むバクテリオファージである。溶菌酵素の非限定例を表１に示す。
Figure 2023517057000002
細菌を標的にしたバクテリオファージは、ファージを含む不均質な混合物を、洗剤（例えば、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）、ポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０）、もしくはノノキシノール９）、極性、水不混和性、中性溶媒、またはこれらの組み合わせと接触させて、液体及び固体を含む組成物を作製することと、上記液体を上記固体から分離して上清を作製することと、上記上清を濃縮して濃縮上清を作製することと、上記濃縮上清を上記細菌によりインキュベートし、上記ファージ、細胞、及びデブリを含む細胞混合物を作製することと、上記ファージを上記細胞及びデブリから分離して、上記ファージを単離することと、により、源、例えば、不均質な混合物（例えば、汚れたスラッジ）から単離することができる。有利には、本方法は、汚れた、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスにて発見可能な他のウイルス性病原体を破壊しながら、生存しているバクテリオファージの単離を可能にする。
いくつかの実施形態では、洗剤（例えば、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）、ポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０）、またはノノキシノール９）は、約０．００７％～約０．１％ｗ／ｖの濃度（例えば、約０．００８％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．００９％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．００１％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．０１０％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．０２０％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．０３０％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．０４０％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．０５０％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．０６０％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．０７０％～約０．１％ｗ／ｖ、約０．０８０％～約０．１％ｗ／ｖ、または約０．０９０％～約０．１％ｗ／ｖ）で存在する。いくつかの実施形態では、極性、水不混和性、中性溶媒はクロロホルムである。
抗菌溶解タンパク質
抗菌溶解タンパク質、例えば、溶解バクテリオファージタンパク質を、バクテリオファージと共に超分子構造体にロードして、超分子複合体を形成することができ、これを細胞、試料、または対象に投与することができる。超分子複合体は哺乳類免疫細胞、例えばマクロファージまたは樹状細胞によりエンドサイトーシスを受け、抗菌溶解タンパク質は、１つ以上の標的細胞内区画（エンドソーム、ファゴソーム、リソソーム、またはサイトゾル）に送達され、ここで細菌が生息する。いくつかの実施形態では、抗菌溶解タンパク質は、細菌表面に付着する。抗菌溶解タンパク質は、特定の結合を切断することで、細菌の細胞エンベロープの構成成分を孔粒（ｐｏｒａｔｅ）及び／または破壊し、浸透破壊及び細菌の死をもたらす。マイコバクテリオファージタンパク質は、溶解素、例えば溶解素Ａ及び溶解素Ｂ、アミラーゼ、例えばイソアミラーゼ及びαアミラーゼ、ならびに、カプセルデポリメラーゼを含む。溶解素及びカプセルデポリメラーゼは、それぞれ、細胞エンベロープのマイコバクテリアｍＡＧＰ複合体含有細胞壁及び外側細胞カプセルにおける、異なる結合の切断を担う。マイコバクテリオファージタンパク質は、ホーリンもまた含み、これは、マイコバクテリア細胞膜をオリゴマー化及び孔粒して、非孔形成溶解素がその基質に接近し、細胞壁を溶解することができるようにする、膜結合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、抗菌溶解タンパク質は例えば、溶解バクテリオファージタンパク質、例えば、マイコバクテリオファージタンパク質である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージタンパク質は、細胞を殺傷することができるか、または、マイコバクテリウム、サルモネラ、ナイセリア、ブルセラ、エシェリキア、リステリア、フランキセラ、レジオネラ、エルシニア、ブドウ球菌、クロストリジウム、赤痢菌、もしくは連鎖球菌からなる群から選択される細胞に感染するファージに由来する。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム種は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍ．ｌｅｐｒａｅ，Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ，Ｍ．ａｖｉｕｍ，Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ，Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ，Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、及びＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓからなる群から選択される種であり、サルモネラ種は、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉであり、ナイセリア種は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓであり、ブルセラ種は、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、またはＢ．ｃａｎｉｓであり、エシェリキア種は、Ｅ．ｃｏｌｉであり、リステリア種は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓであり、フランキセラ種は、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、またはＦ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａであり、レジオネラ種は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａであり、エルシニア種は、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓまたはＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａであり、ブドウ球菌種は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓであり、クロストリジウム種は、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、またはＣ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉであり、赤痢菌種は、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、またはＳ．ｓｏｎｎｅｉであり、あるいは、連鎖球菌種は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。いくつかの実施形態では、マイコバクテリオファージタンパク質は、溶解素、アミラーゼ、またはカプセルデポリメラーゼ、例えばカプスラーゼ（ｃａｐｓｕｌａｓｅ）である。いくつかの実施形態では、溶解素は溶解素Ａまたは溶解素Ｂである。いくつかの実施形態では、アミラーゼはイソアミラーゼ及びαアミラーゼである。カプセルデポリメラーゼは、マイコバクテリア細胞の外側細胞カプセル、例えば、ムコイドカプセルを破壊する酵素である。外側カプセルは通常、多糖類及びタンパク質、加えて、少量の脂質で構成される。いくつかの実施形態では、カプセルデポリメラーゼは、ヒドロラーゼ、メタロヒドロラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペプチドグリカンヒドロラーゼ、ポリサッカラーゼ、多糖類リアーゼ、エンドシアリダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、またはアルギネートリアーゼである。外側カプセル内のカプセル多糖類としては、例えば、Ｄ－グルカン、Ｄ－アラビノ－Ｄ－マンナン、及びＤ－マンナンが挙げられる。さらに、カプセルデポリメラーゼは、これらの、及び他のカプセル多糖類を破壊する酵素である。
いくつかの実施形態では、抗菌溶解タンパク質は自然に存在するタンパク質である。他の実施形態では、抗菌溶解タンパク質は組み換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、例えば、２種以上の細菌の種または株を殺傷する、２種以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれ以上の）異なるタンパク質を含む。
抗菌溶解タンパク質の非限定例は上記表１に示される。
細胞内細菌
細胞内細菌は宿主細胞内に生息し、ここで繁殖して、感染を引き起こす。細胞内細菌は、プロフェッショナル抗原細胞などの免疫細胞の中に生息することができる。プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）としては、マクロファージ、Ｂ細胞、及び樹状細胞が挙げられる。ＡＰＣは、その表面上で、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体化した抗原を処理し、その表面上にこれを提示する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を使用してこれらの抗原提示複合体を認識し、これは、効果的な適応免疫応答に重要なプロセスである。特定の細菌は、免疫細胞内に隠れることで、この免疫応答を回避する。
本明細書に記載する組成物及び方法を使用して、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）に生息する細胞内細菌などの、あらゆる細胞内細菌を治療することができる。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、マイコバクテリウム、サルモネラ、ナイセリア、ブルセラ、エシェリキア、リステリア、フランキセラ、レジオネラ、エルシニア、ブドウ球菌、クロストリジウム、赤痢菌、または連鎖球菌種である。マイコバクテリウム種の例としては、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍ．ｌｅｐｒａｅ，Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ，Ｍ．ａｖｉｕｍ，Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ，Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ，Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、またはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓが挙げられる。特定の実施形態では、マイコバクテリウムはＮＴＭである。いくつかの実施形態では、ＮＴＭはＭ．ａｖｉｕｍまたはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓである。いくつかの実施形態では、感染症は、Ｍ．ａｖｉｕｍまたはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓなどの、ＮＴＭの組み合わせにより引き起こされる。
他の細胞内細菌は、当該技術分野において既知である。サルモネラ種は、例えば、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉであることができる。ナイセリア種は、例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＥ．ｃｏｌｉであることができる。ブルセラ種は、例えば、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、またはＢ．ｃａｎｉｓであることができる。エシェリキア種は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであることができる。リステリア属種は、例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓであることができる。フランキセラ属種は、例えば、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、またはＦ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａであることができる。レジオネラ属種は、例えば、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａであることができる。エルシニア種は、例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓまたはＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａであることができる。ブドウ球菌種は、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓであることができる。クロストリジウム種は、例えば、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、またはＣ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉであることができる。赤痢菌種は、例えば、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、またはＳ．ｓｏｎｎｅｉであることができる。連鎖球菌種は、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであることができる。
超分子構造体
超分子構造体を使用して、バクテリオファージと、送達用の抗菌溶解タンパク質と、を含む抗細菌剤を製剤化することができる。超分子構造体は、非共有結合、例えば、水素結合、ファンデルワールス力、静電相互作用、疎水性効果、及びπ－π相互作用により互いに結合している、分子（例えば、脂質）の画定された複合体を含む。超分子構造体は、球体、棒、またはシート様構造を形成する、分子の大型複合体を含むことができる。超分子構造体としては、例えば、ミセル、リポソーム、及びＬＮＰなどの、脂質ベースの超分子構造体が挙げられる。超分子構造体は、所定のサイズを有することができる。構造体のサイズは、構造内に詰め込まれた構成成分（例えば、ファージのサイズ）に応じて変化することができる。
いくつかの実施形態では、特定の粒径を使用して、構造体を、適切な標的細胞内区画に向ける特定のエンドサイトーシス経路に誘導する。超分子構造体はエンドサイトーシスを受け、例えば、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介して、または、カベオリン依存性エンドサイトーシスを介して、標的細胞内区画に送達されることができる。構造体の粒径、例えば、Ｚアベレージ平均粒径は、例えば、約７５ｎｍ～約７５０ｎｍ（例えば、約２５０ｎｍ～約７５０ｎｍ、または、約７５ｎｍ～約２５０ｎｍ）で変化することができる。好ましくは、超分子構造体がＬＮＰまたはミセルである場合、Ｚアベレージ平均粒径は約７５ｎｍ～約２５０ｎｍである。好ましくは、超分子構造体が小胞（例えば、リポソーム）である場合、Ｚアベレージ平均粒径は約２５０ｎｍ～約７５０ｎｍである。Ｚアベレージ平均粒径の非限定例としては、例えば、約７５ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば、７５ｎｍ～約８５ｎｍ、例えば、約８０ｎｍ、例えば、約８０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１３０ｎｍ、または、約１１０ｎｍ～約１３０ｎｍ、例えば、約１２０ｎｍ、例えば、約２００ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば、約２５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約２６０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約２６０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約２６５ｎｍ～約２７５ｎｍ、例えば、約２７０ｎｍ、例えば、約３００ｎｍ～約４００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、例えば、約４５０ｎｍ～約５５０ｎｍ、約４７５ｎｍ～約５２５ｎｍ、約４８０ｎｍ～約５２０ｎｍ、約４９０ｎｍ～約５１０ｎｍ、約４９５ｎｍ～約５０５ｎｍ、例えば、約５００ｎｍ、例えば、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、約２００ｎｍ、約２０５ｎｍ、約２１０ｎｍ、約２１５ｎｍ、約２２０ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２３０ｎｍ、約２３５ｎｍ、約２４０ｎｍ、約２４５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２５５ｎｍ、約２６０ｎｍ、約２６５ｎｍ、約２７０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約２８０ｎｍ、約２８５ｎｍ、約２９０ｎｍ、約２９５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３０５ｎｍ、約３１０ｎｍ、約３１５ｎｍ、約３２０ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３３０ｎｍ、約３３５ｎｍ、約３４０ｎｍ、約３４５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３５５ｎｍ、約３６０ｎｍ、約３６５ｎｍ、約３７０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約３８０ｎｍ、約３８５ｎｍ、約３９０ｎｍ、約３９５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４０５ｎｍ、約４１０ｎｍ、約４１５ｎｍ、約４２０ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４３０ｎｍ、約４３５ｎｍ、約４４０ｎｍ、約４４５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４５５ｎｍ、約４６０ｎｍ、約４６５ｎｍ、約４７０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約４８０ｎｍ、約４８５ｎｍ、約４９０ｎｍ、約４９５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５０５ｎｍ、約５１０ｎｍ、約５１５ｎｍ、約５２０ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５３０ｎｍ、約５３５ｎｍ、約５４０ｎｍ、約５４５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５５５ｎｍ、約５６０ｎｍ、約５６５ｎｍ、約５７０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約５８０ｎｍ、約５８５ｎｍ、約５９０ｎｍ、約５９５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６０５ｎｍ、約６１０ｎｍ、約６１５ｎｍ、約６２０ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６３０ｎｍ、約６３５ｎｍ、約６４０ｎｍ、約６４５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約６５５ｎｍ、約６６０ｎｍ、約６６５ｎｍ、約６７０ｎｍ、約６７５ｎｍ、約６８０ｎｍ、約６８５ｎｍ、約６９０ｎｍ、約６９５ｎｍ、約７００ｎｍ、約７０５ｎｍ、約７１０ｎｍ、約７１５ｎｍ、約７２０ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７３０ｎｍ、約７３５ｎｍ、約７４０ｎｍ、約７４５ｎｍ、または約７５０ｎｍが挙げられる。特定の実施形態では、超分子構造体は、約７５ｎｍ～約２５０ｎｍ（例えば、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、または約１５０ｎｍ）のＺアベレージ平均粒径を含有する。
平均粒径は、ゼータ電位、動的光散乱法（ＤＬＳ）、電気泳動光散乱（ＥＬＳ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、分子量、電気泳動移動度、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、フィールドフローフラクショネーション、または、当該技術分野において既知の他の方法により測定することができる。特定の実施形態では、平均粒径は、により測定される。特定の実施形態では、超分子構造体は、約７５ｎｍ～約２５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含有する。特定の実施形態では、超分子構造体は、約２５０ｎｍ～約７５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含有する。特定の実施形態では、超分子構造体は、約５００ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含有する。特定の実施形態では、超分子構造体は、約２７０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含有する。特定の実施形態では、超分子構造体は、約８０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含有する。超分子構造体のまとまり（例えば、リポソーム、ＬＮＰ、またはミセル）は、まとまりの中である範囲のＺアベレージ平均粒径を有し得ることを、当業者は理解するであろう。したがって、まとまりは多分散系であることができる。まとまりは、０．３以下（例えば、０．０５～０．３）の多分散指数を有し得る。多分散指数は、ＤＬＳを使用して測定することができる（例えば、ＩＳＯ ２２４１２：２０１７を参照されたい）。
超分子構造体は、超分子構造体１個当たり、所定数のファージ、または平均数のファージでロードすることができる。例えば、超分子構造体は、約１個のファージ～約２０個のファージ（例えば、１～１５、１～１０、１～１５、１～３、２～１０、２～５、２～４、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のファージ）を含有することができる。構造体１個当たりのファージの数は、ファージのサイズ、及び構造体のサイズに左右され得る。
超分子構造体は、超分子構造体１個当たり、所定数の抗菌溶解タンパク質、または、平均数の抗菌溶解タンパク質でロードすることができる。例えば、超分子構造体は、約１個～約１０６個のタンパク質（例えば、約１～約１０５、約１～約１０４、約１～約１０３、約１～約１０２、約１～約１０、約１０～約１０６、約１０～約１０５、１０～約１０４、約１０～約１０３、約１０～約１０２、約１０３～約１０６、約１０３～約１０５、約１０３～約１０４個）を含有することができる。構造体１個当たりのタンパク質の数は、タンパク質のサイズ、及び構造体のサイズに左右され得る。
超分子構造体は、エンドソームエスケープ部分を含むことができる。エンドソームエスケープ部分を含む超分子構造体を、超分子構造体に含まれるカーゴ（例えば、治療剤）の改善されたサイトゾル送達のために提供することができる。エンドソームエスケープ部分は、当該技術分野において既知である。エンドソームエスケープ部分はイオン化可能な脂質であるのが好ましい。イオン化可能な脂質は典型的である。イオン化可能な脂質は、超分子構造体－層形成脂質としても役割を果たすことができる。イオン化可能な脂質の非限定例としては、例えば、ＷＯ２０１９／０６７８７５；ＷＯ２０１８／１９１７５０；及びＵＳ９，９９９，６７１に記載されているものが挙げられる。他の例示的なエンドソームエスケープ部分としては、膜融合性脂質（例えば、ジオレオイルホスファチジル－エタノールアミン（ドープ））；ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー；ポリ（β－アミノエステル）；ポリアルギニン（例えば、オクタアルギニン）及びポリリシン（例えば、オクタリシン）などのポリペプチド；プロトンスポンジ、ウイルスキャプシド、及び、本明細書に記載するペプチド形質導入ドメインが挙げられる。例えば、膜融合性ペプチドは、インフルエンザＡウイルスのＭ２タンパク質；インフルエンザウイルスヘマグルチニンのペプチド類似体；インフルエンザＣウイルスのＨＥＦタンパク質；フィロウイルスの膜貫通糖タンパク質；狂犬病ウイルスの膜貫通糖タンパク質；水疱性口内炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質（Ｇ）；センダイウイルスの融合タンパク質；セムリキフォレストウイルスの膜貫通糖タンパク質；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質；麻疹ウイルスの融合タンパク質；ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質；ビスナウイルスの融合タンパク質；マウス白血病ウイルスの融合タンパク質；ＨＴＬウイルスの融合タンパク質；及び、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の融合タンパク質に由来することができる。エンドソームエスケープを容易にするために使用可能な他の部分は、Ｄｏｍｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２３（８）：１１８３－１１８９，２０１０に記載されている。本明細書で開示する超分子構造体に含める、または、これにコンジュゲートするのに好適な部分を含む、エンドソームエスケープ部分の具体例は、例えば、ＷＯ２０１５／１８８１９７に示されており、これらのエンドソームエスケープ部分の開示は、本明細書で参照により組み込まれる。
リポソーム
リポソームは、ファージ及びファージタンパク質を作用部位に移動させる、及び送達するのに有用である。リポソーム膜は構造的に、生物学的膜に類似しているため、リポソームを組織に適用する際、リポソーム二分子膜は、細胞膜の二分子膜と融合する。リポソーム及び細胞進行が合わさると、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含む内部水性内容物は、細胞及び抗菌溶解タンパク質が細胞内に送達され、ここで、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質は、哺乳類免疫細胞の中に生息する細菌細胞（例えば、マイコバクテリア細胞、例えば、ＮＴＭ細胞）を標的にして溶解することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を、特定の哺乳類免疫細胞、及び／または、感染の間に、通常細菌（例えば、マイコバクテリア）を有する特定の細胞内区画（エンドソーム、ファゴソーム、リソソーム、もしくはサイトゾル）に向けさせるために、特異的に標的にされる。リポソームの組成物は通常、普通は、コレステロールなどのステロイドと組み合わさった、リン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質もまた、使用することができる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び、二価カチオンの存在に左右される。
好ましくは、本明細書に記載するリポソームは、リン脂質を、より好ましくは、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルセリンを含む。ホスファチジルセリンは、脂肪酸エステル部分で置換された２個のヒドロキシル基、及び、セリン側鎖に共有結合したホスホジエステル部分で置換された１個のヒドロキシル基を有するグリセロール分子である。ホスファチジルセリンの典型的な構造は、ＲＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＲ）－ＣＨ２－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）－ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ２、またはその塩［式中、各Ｒは独立して脂肪酸アシルである。］である。加えて、または代替的に、本明細書に記載するリポソームは、例えば、リゾリン脂質、例えば、リゾホスファチジルセリンを含むことができる。リゾホスファチジルセリンは、その２つの脂肪酸エステル部分のうちの１つを欠いているホスファチジルセリンである。リゾホスファチジルセリンの典型的な構造は、ＲＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＲ）－ＣＨ２－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）－ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ２、またはその塩［式中、片方のＲは脂肪酸アシルであり、他のＲはＨである。］である。したがって、特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載するリポソームは、ＲＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＲ）－ＣＨ２－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）－ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ２、またはその塩［式中、各ＲはＨまたは脂肪酸アシルであり、但し、少なくとも１つのＲは脂肪酸アシルである。］を含む。
主要な種類のリポソーム組成物の１つとしては、自然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。中性リポソーム組成物は例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。陽イオン性脂質の非限定例としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイル－３－（２Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）もしくはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニエテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イエエチルアザネジエジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはこれらの混合物が挙げられる。陽イオン性脂質は例えば、粒子内に存在する全脂質の約２０モル％～約５０モル％、または約４０モル％を占めることができる。
非カチオン性リポソームは、原形質膜とはさほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによりインビボで取り入れられ、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質をマクロファージに送達することができる。アニオン性リポソーム組成物は通常、ジミリストイルホスファチジルグリセロ－ルから形成されるが、アニオン膜融合性リポソームは主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。イオン化可能な／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ－ＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩、ＤＯＰＳ）、またはこれらの混合物を含むがこれらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であることができる。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、例えば、粒子内に存在する全脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％～約５８モル％であることができる。いくつかの実施形態では、イオン化可能な／非カチオン性脂質は、上述した脂質の組み合わせ、例えば、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、Ｃｈｏｌ、及びＤＯＰＥを含む脂質の組み合わせであることができる。
リポソーム粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、限定されるものではないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質であることができる。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、または、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であることができる。粒子の凝集を防止する複合脂質は、例えば、粒子内に存在する全脂質の、０モル％～約２０モル％、または約２モル％であることができる。いくつかの実施形態では、リポソーム組成物は、コレステロールを、例えば、粒子内に存在する全脂質の約１０モル％～約６０モル％、または約５０モル％でさらに含む。
別の種類のリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣ、及び卵ＰＣなどの、ホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質及び／またはホスファチジルコリン及び／またはコレステロールの混合物から形成される。リポソームを細胞に、インビトロ及びインビボで導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号；同第５，１７１，６７８号；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４；Ｆｅｉｇｎｅｒ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０；Ｎａｂｅｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７；Ｎａｂｅｌ，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９；Ｇｅｒｓｈｏｎ，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３；及びＳｔｒａｕｓｓ，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７が挙げられる。
リポソームの標的化はまた、例えば、器官特異性、細胞特異性、及び細胞器官特異性に基づいて可能であり、当該技術分野において既知である。リポソームが標的にするデリバリーシステムの場合、リポソーム二分子膜と安定して会合しながら、リガンドの標的化を維持するために、脂質基を、リポソームの脂質二分子膜に組み込むことができる。脂質鎖を標的のリガンドに結合させるために、様々な連結基を使用することができる。さらなる方法は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許出願公開第２００６００５８２５５号に記載されており、その連結基は、参照により本明細書に組み込まれる。
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、または、分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清または血液中よりも細胞内で、高いレベルまたは活性にて、より効果がある、または見出される。そのような分解性剤の例としては、例えば、還元により、酸化還元性の切断可能な連結基を分解可能な、細胞に存在する、メルカプタンなどの酸化性もしくは還元性酵素、または還元性剤；エステラーゼ；酸性環境を作り出すことができるエンドソームまたは剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般酸として作用することにより、切断可能な酸連結基を加水分解または分解することができる酵素；ペプチダーゼ（基質特異性であることができる）；及び、ホスファターゼを含む、特定の基質に対して選択性である、または、基質特異性を有しない、酸化還元剤が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能な連結基は、ｐＨの影響を受けやすい可能性がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、細胞内の平均ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の、より酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０で、より一層酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨにて切断される切断可能な連結基を有することにより、陽イオン性脂質をリガンドから細胞内へ、または、細胞の所望の区画に放出する。
リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な連結基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的とされる細胞により左右される可能性がある。一般に、候補となる切断可能な連結基の適合性は、分解性剤（または条件）が、候補となる連結基を切断する能力を試験することにより評価することができる。候補となる切断可能な連結基が、血液中で、または、他の非標的組織と接触したときに、切断に抵抗する能力を試験することもまた、望ましいであろう。したがって、第１の条件と第２の条件とでの、切断に対する相対的な感受性を測定することができ、ここで、第１の条件は、標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件は、他の組織または生物学的流体、例えば、血液または血清での切断を示すように選択される。評価は無細胞系、細胞、細胞培養液、器官もしくは組織培養液、または動物全体で実施することができる。初期の評価は、無細胞または培養液条件で行い、動物全体でのさらなる評価により確認するのが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補となるリンカーは、血液または血清（もしくは、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内で（または、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件にて）、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または約１００倍速く切断される。
脂質ナノ粒子
本発明の抗細菌剤は、脂質製剤、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に完全に封入することができる。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の循環寿命の延長を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に隔てられている部位）にて蓄積するため、全身投与に極めて有用である。ＬＮＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、これは、国際公開第２０００／００３６８３号で説明されている、封入された縮合剤－核酸複合体を含む。本発明の粒子は通常、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、本発明の核酸－脂質粒子中に存在する場合、核酸は、ヌクレアーゼによる分解に対して、水溶液中では耐性を有する。核酸－脂質粒子、及び、その調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号、及び、国際公開第９６／４０９６４号に開示されている。
一実施形態では、脂質：薬剤の比（質量／質量比）（例えば、脂質：オリゴヌクレオチドの比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または、約６：１～約９：１の範囲である。上記列挙した範囲の中間となる範囲もまた、本発明の一部であると想到される。
カチオン性脂質の非限定例としては、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＡＣ、ＤＬｉｎ－ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ、１ＤＬｉｎ－ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡもしくはその類似体、ＡＬＮ１００、ＭＣ３、Ｔｅｃｈ Ｇ１、またはこれらの混合物が挙げられる。陽イオン性脂質は例えば、粒子内に存在する全脂質の約２０モル％～約５０モル％、または約４０モル％を占めることができる。
イオン化可能な／非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＤＯＰＥ－ｍａｌ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、ＳＯＰＥ、コレステロール、またはこれらの混合物を含むがこれらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であることができる。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、例えば、粒子内に存在する全脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％～約６０モル％であることができる。
粒子の凝集を抑制するコンジュゲート脂質は、例えば、限定されるものではないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質であることができる。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であることができる。粒子の凝集を防止する複合脂質は、例えば、粒子内に存在する全脂質の、０モル％～約２０モル％、または約２モル％であることができる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、コレステロールを、例えば、粒子内に存在する全脂質の約１０モル％～約６０モル％、または約５０モル％でさらに含む。
ミセル
ミセルは、分子の疎水性部分が全て内側を向いており、親水性部分を、周囲の水相と接触させたままにするように、両親媒性分子が球状構造に配置されている、特定の種類の分子アセンブリである。ミセルは、脂質から作製されることができる。ミセル相は、二分子膜相の単一尾脂質の挙動を閉じ込めることにより引き起こされる。脂質先端基の水和により、分子上で作用する先端基に対して領域を収容しながら、二分子膜の内側の体積全てを満たす難しさが、ミセルの形成をもたらす。この種のミセルは、順相ミセル（水中油型ミセル）として知られている。逆ミセルは、中央に先端基が存在し、尾が外に伸びている（油中水型ミセル）。
ミセルはほぼ球状の形状である。楕円体、円柱、及び二層などの形状を含む他の層もまた可能である。ミセルの形状及びサイズは、その界面活性剤分子の分子幾何学と、界面活性剤濃度、温度、ｐＨ、及びイオン強度などの溶液の条件との関数である。ミセルの形成プロセスはミセル化として知られており、その多形性により、多くの脂質の相挙動の一部を形成する。
標的部分
本明細書に記載する超分子構造体は、例えば、標的部分を含むことができる。標的部分を使用して、超分子構造体を特定の細胞型（例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞））に向けることができる。特定の脂質（例えば、ホスファチジルセリン）は、超分子構造体相形成脂質及び標的部分の両方として、超分子構造体（例えば、小胞）において使用することができる。標的部分は、例えば、抗体または抗原結合フラグメントまたは操作されたその誘導体（例えば、Ｆｃａｂまたは融合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ））であり得る。標的部分は例えば、ポリペプチドであることができる。あるいは、標的部分は、例えば、低分子（例えば、マンノースもしくは葉酸塩）、または、低分子のクラスター（例えば、マンノースのクラスター）であることができる。標的部分は、超分子構造体と共有的に、または非共有的に会合することができる。
低分子
標的部分は、標的細胞の表面上で発現する受容体を複合体化可能な低分子であることができる。本明細書に記載する超分子構造体中で標的部分として使用可能な低分子の非限定例は、ホスファチジルセリン、葉酸リゾホスファチジルセリン、マンノース、及びマンノースクラスターである。
標的部分はホスファチジルセリンまたはリゾホスファチジルセリンであるのが好ましい。より好ましくは、標的部分はホスファチジルセリンである。ホスファチジルセリン及び／またはリゾホスファチジルセリンは、超分子構造体の残りに非共有的に結合した、超分子構造体相形成脂質として存在することができる。
葉酸塩は、標的部分として使用することができる。本明細書に記載する超分子構造体では、葉酸塩は以下の構造を取ることができる：
Figure 2023517057000003
マンノースまたはマンノースクラスターを使用して、本明細書に記載する超分子構造体を、樹状細胞及びマクロファージに向けることができる。マンノースクラスターは、当該技術分野において既知である。
葉酸塩、マンノース、及びマンノースクラスターは、超分子構造体に共有結合することができる。葉酸塩、マンノース、及びマンノースクラスターを結合させるコンジュゲーション技術は、例えば、ＵＳ２０１４／００４５９１９、ＵＳ９，７２５，４７９、ＵＳ８，７５８，８１０、ＵＳ８，４５０，４６７、ＵＳ６，５２５，０３１、ＵＳ６，３３５，４３４、及びＵＳ５，７５９，５７２に記載されているように、当該技術分野において既知である。
抗原結合部分
本明細書に記載する超分子構造体中の抗原結合部分は、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）２もしくはＦａｂ）、または、その組み換え誘導体（例えば、Ｆｃａｂもしくは融合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ））であることができる。ヒトまたはキメラ（例えば、ヒト化）抗体は、本明細書に記載する超分子構造体内で抗体として使用することができる。
抗原結合部分は、抗原結合部分により認識される表面抗原を有するＡＰＣを標的にする。樹状細胞は、抗ＤＥＣ２０５、抗ＣＤ３０４、抗ＣＤ３０３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＢＤＣＡ２、もしくは抗ＣＤ１２３抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくはその組み換え誘導体により標的にされることができる。マクロファージは、抗ＣＤ１６３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ２０６、もしくは抗ＣＤ１２３、または、その抗原結合フラグメントもしくは組み換え誘導体により標的にされることができる。
抗ＣＤ３８抗体の非限定例は、ダラツムマブ、ＳＡＲ６５０９８４、ＭＯＲ２０２、または、ＷＯ２０１２／０９２６１６に開示されている、抗体Ａｂ７９、Ａｂ１９、Ａｂ４３、Ａｂ７２、及びＡｂ１１０のいずれか１つであり、これらの抗体の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。抗ＣＤ７９ｂ抗体の非限定例は、ＷＯ２０１４／０１１５２１に開示されているｈｕＭＡ７９ｂ ｖ２８である。抗ＣＤ２２抗体の非限定例は、ＵＳ２０１４／０１２７１９７に開示されている１０Ｆ４である。抗ＣＤ２０抗体の非限定例は、リツキシマブである。抗ＤＥＣ２０５抗体の非限定例は、ＵＳ２０１０／００９８７０４に示され、その抗体は、参照により本明細書に組み込まれている。抗ＣＤ４０抗体の非限定例は、ルカツムマブ及びダセツズマブである。抗ＣＤ３０４抗体の非限定例は、ベセンクマブである。
抗原結合部分を結合するためのコンジュゲーション技術は、例えば、Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２５：５１－６８，２０００；ＵＳ２００２／００２５３１３；ＵＳ６，３７９，６９９；及びＵＳ５，０５９，４２１に記載されているように、当該技術分野において既知である。
ポリペプチド
標的部分は、細胞に対する親和性を有する（例えば、細胞型、例えば、樹状細胞に対する親和性を有する）ポリペプチドであることができる。ポリペプチドの非限定例は、ＲＧＤペプチド、狂犬病ウイルス、糖タンパク質（ＲＶＧ）、及びＤＣ３ペプチドである。あるいは、ポリペプチドは、ＴＬＲ２アゴニスト、例えば、ＭＡＬＰ－２リポタンパク質、ＭＡＬＰ－４０４リポタンパク質、ＯｓｐＡ、ポリン、ＬｃｒＶ、Ｈｓｐ６０、糖タンパク質ｇＨ／ｇＬ、または糖タンパク質ｇＢであってよい。
ペプチドを結合するためのコンジュゲーション技術は、例えば、Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２５：５１－６８，２０００；ＵＳ２００２／００２５３１３；ＵＳ６，３７９，６９９；及びＵＳ５，０５９，４２１に記載されているように、当該技術分野において既知である。
ＰＡＭＰ
標的部分はＰＡＭＰであることができる。ＰＡＭＰは、当該技術分野において既知であり、例えば、ＣｐＧ ＯＤＮである。ＣｐＧ ＯＤＮは一般に、３つのクラス：クラスＡ、クラスＢ、及びクラスＣに分けられる。クラスＡのＣｐＧ ＯＤＮは通常、３’及び５’末端に、チオリン酸骨格を有するポリＧテール、及び、リン酸骨格を含む中心回文配列を含有する。クラスＡのＣｐＧ ＯＤＮは通常、中心回文配列の中にＣｐＧを含有する。クラスＢのＣｐＧ ＯＤＮは通常、完全にチオリン酸化した骨格を含み、クラスＢのＣｐＧ ＯＤＮの５’末端における配列は多くの場合、ＴＬＲ９活性化に対して重要である。クラスＣのＣｐＧ ＯＤＮは、完全にチオリン酸化した骨格を含み、３’末端配列はデュプレックスの形成が可能である。ＰＡＭＰは、当該技術分野において既知の技術及び方法を使用して、超分子構造体に共有結合させることができる。
治療方法
本明細書に記載する抗細菌剤（例えば、バクテリオファージと抗菌溶解タンパク質の組み合わせ）は、疾患または状態、例えば細菌感染症（例えば、細胞内細菌症、例えば、マイコバクテリア感染症、例えば、ＮＴＭ感染症）を治療するためにヒト対象に投与するための医薬組成物に製剤化するのが好ましい。細菌感染症は、別の場合においては健常な対象で生じ得る。あるいは、細菌感染症は、別の併存疾患または疾患を有する対象において生じ得る。例えば、免疫系が弱った対象は、細菌感染症により罹りやすい可能性がある。
ＮＴＭにより引き起こされるマイコバクテリア感染症は、通常は環境に存在する細菌である。これらの細菌を吸引することにより、健常な患者、及び、免疫系が損なわれた患者の両方において疾患が引き起こされ得る。ＮＴＭ疾患は最も多くの場合、成人において肺に影響を及ぼすが、任意の体の部位にも影響を与え得る。何名かの対象では、ＮＴＭ感染症に罹り、疾患が進行するリスクが高い。気管支拡張症（気道の拡大）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、α－１アンチトリプシン欠損症などの、既存の肺疾患を有する人、または、結核などの以前に感染症に罹った人は、肺ＮＴＭ疾患のリスクが増加している。ＨＩＶ感染症（ＣＤ４＜５０）、または、免疫関連遺伝病（例えば、インターフェロン－γ欠損症もしくは受容体欠損症、インターロイキン－１２欠損症）が進行した対象では、播種性（例えば、体内の広範囲にわたる）ＮＴＭ感染症の一部として、肺疾患が進行し得る。治療される対象は、例えば、細菌感染症に加えて、前述の適応症のいずれかを有し得る。
本明細書に記載する方法組成物及び方法を使用して、感染症のレベルを低下させることができる。例えば、方法は、参照と比較して、感染症のレベル（例えば、細菌の数、または感染のサイズ）を低下させることができる。例えば、感染症は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％低下することができる。
医薬組成物
本明細書に記載する抗菌剤は、インビボでの投与に好適な生物学的に適合性のある形態にて、ヒト対象に投与するための医薬組成物に製剤化されるのが好ましい。
当業者により理解されるように、本明細書に記載する組成物は、選択された投与経路に応じて、様々な形態で対象に投与することができる。本明細書に記載する組成物は、例えば、組成物（例えば、超分子構造体、例えば、リポソーム、ミセル、またはＬＮＰ）を標的細胞に到達させる任意の経路により、投与されることができる。組成物は、例えば、経口、非経口、髄腔内、脳室内、実質内、頬、舌下、経鼻、直腸、貼付、ポンプ、または経皮投与により投与されることができ、医薬組成物は適宜製剤化される。非経口投与としては、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経鼻、肺内、髄腔内、脳室内、実質内、直腸及び局所の投与方法が挙げられる。一実施形態では、空気非経口投与により投与される組成物は、選択された期間にわたる連続点滴によるものであってよい。いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載する組成物は吸入により投与される。
２種以上の抗菌剤の投与は、同一経路による、または異なる経路によるものであってよく、連続して、またはほぼ同時に生じてよい。例えば、組み合わせの第１の抗菌剤を静脈内注射によって投与してもよい一方で、その組み合わせの第２の治療剤を経口投与してもよい。
本明細書に記載する特定の組成物を、例えば、吸入により投与することができる。吸入は経口吸入、または経鼻吸入であってよい。本明細書に記載する吸入可能な組成物は、液体剤形、または乾燥粉末剤形として提供することができる。乾燥粉末組成物は、例えば、そのままで、または、ビヒクル（例えば、生理食塩水（例えば、等張食塩水）、リン酸塩緩衝生理食塩水、または水）で再構成した後で、吸入により投与することができる。
吸入可能な乾燥粉末剤形は、乾燥により（例えば、凍結乾燥、スプレードライ、スプレー凍結乾燥、または超臨界流体技術により）、本明細書に記載する液体組成物から調製することができる。本明細書に記載する、吸入可能な乾燥粉末剤形は、担体（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールなど）、凍結保護剤（例えば、トレハロース、マンニトールなど）、及び／または、接着防止剤（例えば、グリシン、Ｌ－ロイシン、セリンなど）を含むことができる。本明細書に記載する、吸入可能な乾燥粉末剤形は、乾燥粉末吸入器を使用して投与することができる。乾燥粉末吸入器は当該技術分野において既知であり、噴射剤を含んでも、含まなくてもよい。乾燥粉末吸入器の非限定例は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４：２３－３３，２００４に見出すことができ、その開示全体が本発明において参照により組み込まれている。
本明細書に記載する、吸入可能な液体剤形（例えば、エアゾール製剤）は、超分子構造体を含有する液体組成物の調製で有用な技術及び方法を使用して調製することができる。吸入可能な液体剤形は通常、生理学的に許容できる水性または非水溶媒中に、本明細書に記載する超分子構造体の懸濁液を含み、通常、封止した容器内に滅菌形態で、単回または複数回用量で存在し、これは、噴霧装置により使用するためのカートリッジまたはレフィルの形態を取ることができる。あるいは、封止した容器は、一体型分配装置、例えば、単回投与経鼻吸入器、または、使用後に廃棄される目的の、絞り弁で適合したエアロゾル分配器であることができる。剤形がエアロゾル分配器を含有する場合、剤形は噴射剤を含有し、これは、圧縮ガス、例えば、圧縮空気、または、有機噴射剤、例えばヒドロフルオロアルカンであることができる。吸入可能な液体剤形は、ネブライザーを使用して投与することができる。バルクの液体を小滴に、圧搾空気により変換するプロセスは、霧化と呼ばれる。気体ネブライザーの操作には、液体霧化のための駆動力として、噴射剤が必要である。様々な種類のネブライザーＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃａｒｅ，４５：６０９－６２２，２０００に記載されており、その開示全体が本発明において参照により組み込まれている。あるいは、本明細書に記載する、吸入可能な液体剤形は、定量吸入器を使用して投与することができる。定量吸入器は当該技術分野において既知であり、通常、キャニスター、アクチュエーター、及び絞り弁を含む。
本発明に記載する組成物は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与され得るか、またはハードシェルもしくはソフトシェルのゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に圧縮され得るか、または食事の食品に直接組み込まれ得る。経口治療投与の場合、本明細書に記載する組成物は、賦形剤と共に組み込まれ、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、及びウエハーの形態で使用され得る。本明細書に記載する組成物もまた、非経口投与することができる。本明細書に記載する組成物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ、及びアルコールを含むまたは含まないそれらの混合物、及び油中で調製され得る。これらの製剤は、通常の保存条件及び使用条件下で、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有してもよい。好適な製剤を選択及び調製するための従来の手順及び成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１２，２２ｎｄ ｅｄ．）、及び、２０１８年に発行されたＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ４１ ＮＦ ３６）に記載されている。注射用途に適切な医薬形態には、滅菌水溶液または滅菌分散液、及び注入可能な滅菌溶液または滅菌分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、この形態は滅菌されていなければならず、これがシリンジにより容易に投与され得る程度に流体でなければならない。頬または舌下投与に好適な組成物としては、錠剤、ロゼンジ、及びトローチが挙げられ、ここで、活性成分は、糖、アカシア、トラガカント、ゼラチン、及びグリセリンなどの担体と共に製剤化される。直腸投与のための組成物は便利なことに、カカオバターなどの従来の座薬基剤を含有する座薬の形態で存在する。
本明細書に記載する組成物は、本明細書に記載するように、動物、例えば、ヒトに、単独で、または薬学的に許容される担体と組み合わせて投与され得、その割合は、組成物の溶解性及び化学的性質、選択された投与経路、及び標準的な医薬慣行によって決定される。
本明細書に記載する組成物（例えば、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含む組成物）の用量は、ファージの薬力学的特性、投与様式、治療対象の年齢、健康状態、及び体重、症状の性質及び程度、治療頻度、及び同時治療の種類（存在する場合）、ならびに、治療される動物における組成物のクリアランス率などの多くの因子に応じて左右される可能性がある。本明細書に記載する組成物は、臨床応答に応じて、必要に応じて調節され得る好適な投薬量で最初に投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含む組成物）の用量は、予防に、または治療に有効な量である。さらに、用量は全て、連続して与えることができる、または、所与の時間枠当たりで、与えられる用量に分けることができると理解されている。組成物は、例えば、毎時間、毎日、毎週、毎月、または毎年投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、連続して、または全身投与される。
組み合わせ療法
本明細書に記載する医薬組成物は、組み合わせ療法の一部として投与することができる。組み合わせ療法とは、２つ（またはそれ以上）の異なる剤または治療が、特定の疾患または状態に対して、定義された治療レジメンの一部として対象に投与されることを意味する。治療レジメンでは、対象に対する別個の剤の効果が重なるように、各剤の投与の用量及び周期性を定義する。いくつかの実施形態では、２つ以上の剤の送達は同時または並行であり、本剤は同時製剤化され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の剤は同時製剤化されず、処方されたレジメンの一部として連続的に投与される。各治療剤の連続または実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び粘膜組織を介した直接吸収を含む、任意の適切な経路によるものであることができるが、これらに限定されない。治療剤は、同じ経路によって、または異なる経路によって投与することができる。例えば、組み合わせの第１の治療剤は静脈内注射またはエアゾール化により投与することができる一方で、組み合わせの第２の治療剤は、例えば経口投与、または吸入により投与することができる。
本明細書に記載する組み合わせの実施形態のいずれかにおいて、第１の治療剤及び第２の治療剤は、同時にまたはいずれかの順序で順次投与することができる。第２の治療剤の前後の、最大１５分、最大３０分、最大１時間、最大２時間、最大３時間、最大４時間、最大５時間、最大６時間、最大７時間、最大８時間、最大９時間、最大１０時間、最大１１時間、最大１２時間、最大１３時間、最大１４時間、最大１６時間、最大１７時間、最大１８時間、最大１９時間、最大２０時間、最大２１時間、最大２２時間、最大２３時間、最大２４時間、または１～７、１～１４、１～２１、もしくは１～３０日間で、第１の治療剤は直ちに投与することができる。
本明細書に記載する医薬組成物は、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含む超分子構造体と共に投与される、追加の抗細菌剤をさらに含むことができる。組成物は、１種以上のバクテリオファージを含む第１の超分子構造体、及び、１種以上の抗菌溶解タンパク質を含む第２の超分子構造体を含むことができる。
本明細書に記載する組成物及び方法は、例えば、細菌感染症（例えば、ＮＴＭ感染症）により悪化し得る、根底にある肺状態の治療をさらに含むことができる。好適な肺療法としては、気道クリアランス、ネブライザー、呼吸用マスク、及び吸入器（例えば、ステロイド類吸入器）が挙げられるが、これらに限定されない。
抗生物質
追加の抗菌剤は、抗生物質であることができる。好適な抗生物質としては、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラシリン、アズロシリン、テモシリン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファロリジン、セファゾリン、セファマンドール、セフロキシム、セファレキシン、セフプロジル、セファクロル、ロラカルベフ、セフォキシチン、セフメタゾール、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフィキシム、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフピロム、セフェピム、クロルヘキシジン、ＢＡＬ５７８８、ＢＡＬ９１４１、イミペネム、エルタペネム、メロペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタム、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ピューロマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、スペクチノマイシン、シソマイシン、ジベカシン、イセパマイシン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、テリスロマイシン、ＡＢＴ－７７３、リンコマイシン、クリンダマイシン、バンコマイシン、オリタバンシン、ダルババンシン、テイコプラニン、キヌプリスチン及びダルホプリスチン、スルファニルアミド、ｐ－アミノ安息香酸、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファメトキサゾール、スルファタリジン、リネゾリド、ナリジクス酸、オキソリン酸、ノルフロキサシン、ペフロキサシン、エノキサシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、テマフロキサチン、ロメフロキサシン、フレロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン、ゲミフロキサシン、シタフロキサシン、メトロニダゾール、ダプトマイシン、ガレノキサシン、ラモプラニン、ファロペネム、ポリミキシン、チゲサイクリン、ＡＺＤ２５６３、トリメトプリム、エタンブトール、及びリファンピンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複数の抗生物質は、本明細書に記載する組成物と共に投与される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、セファロスポリン、カルバペネム、ペニシリン、及びフルオロキノロンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、チアセタゾン、ｓｑ－１０９、ベダキリン、デラマニド、ピラジナミド、及びイソニアジドからなる群から選択される。
有利なことに、いくつかの実施形態では、同時投与される治療剤との相乗作用により、他の治療剤を伴わずに投与した場合、抗生物質の、治療量以下の用量での投与が可能となり得る。
抗生物質は、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含有する超分子構造体により製剤化することができる。抗生物質は、個別の医薬組成物として投与することができる。抗生物質は、ファージを有する超分子構造体を含有する医薬組成物とは異なる時間で投与することができる。いくつかの好ましい実施形態では、追加の抗生物質はアミカシンである。アミカシンは、例えば、吸入のために製剤化されるリポソームアミカシンであってよい。
以下の実施例は、本発明を例示することを意図する。実施例は、本発明を如何様にも限定することを意図しない。
以下の実施例は、本明細書に記載する組成物及び方法をどのように使用し、製造し、評価し得るかについての説明を当業者に提供するために提示し、純粋に本開示を例示することを意図するものであり、発明者らが自身の開示と見なすものの範囲を限定することを意図しない。
実施例１：材料及び方法
クローニング
Ｉ．溶解素Ａのクローニング
バクテリオファージＨａｌｏ ＬｙｓＡ（ｇｐ １０（寄託番号ＮＣ＿００１９００））のオープンリーディングフレームを、終止コドンを用いずに、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより合成し、ｐｅｔ２１ａプラスミドのＮｄｅＩ～ＸｈｏＩ部位に入れた。
ＩＩ．溶解素Ｂのクローニング
ｂＤ２９ ＬｙｓＢ（ｇｐ１２寄託番号ＮＣ＿００１９００）のオープンリーディングフレームを、アダプターを備えたＧｅｎｓｃｒｉｐｔにより合成して、Ｔ７タグの下流のｐｅｔ２１プラスミドの位置５２３７にて、Ｇｉｂｓｏｎベースの相同性クローニングによりクローンした。
タンパク質の調製
Ｉ．発現
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂｌ２１（ｄｅ３）細胞に、治療用ペイロードを含むｐＥＴ２１ａプラスミドを形質導入し、トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）培地で培養した。培養物は全て、３７℃でおよそ３．５時間、または、０．４の光学密度（ＯＤ）６００に達するまで、増殖させた。増殖した培養物を氷上で３０分間インキュベートした後、４０ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を発現のために低温で一晩インキュベートした。インキュベーターから取り出した後、培養物を、スイングバケットローターの中で、２０分間、４０００毎分回転数（ＲＰＭ）で遠心分離にかけて、上清から細胞を分離した。
治療用タンパク質を精製するために、細菌タンパク質抽出試薬（Ｂ－ＰＥＲ）、ベンゾナセム、及びリゾチームを含有する溶液で、溶解を行った。高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ランニング緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８）、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１０％グリシン（ｇｌｙｃ）で構成された。溶出緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、７００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８）、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１０％グリセロールで構成された。５ｍＬのＣｙｔｉｖａ ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ５を、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒｔと共に使用し、溶出画分の透析を、１０ｋＤａの透析バッグを用いて、一晩４℃で行った。透析緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２０％グリセロールで構成された。
ＩＩ．ペイロードのリポソーム封入
Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ Ｉｇｎｉｔｅ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてリポソームをアセンブルするために、１ｍｇ／ｍＬの全脂質濃度の、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩；ＤＯＰＳ）：コレステロール（Ｃｈｏｌ）：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を、１：０．３：０．４：１の比率で、有機溶媒及び水性緩衝液（１Ｍのトリス、ｐＨ７．４）と組み合わせた。
ペイロードのリポソームへの付加を媒介するために、２～４ｍｇ／ｍＬのタンパク質ペイロードを水性緩衝液に添加し、続いて、１×１０８～１×１０１０ｐｆｕ／ｍＬのファージを水性緩衝液に添加した。これは、１５ｍＬ／分の全流速、及び１：１の流速比、かつ、１ｍＬの全体積で生じた。２工程透析によりリポソームを精製するために、１０ｋＤａのｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒによる３０分間の透析を、１００ｍＭまたは１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、５％グリセロールの中で、室温で行った。試料のサイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）装置で分析し、封入された試料のサイズ及び多分散度を測定した。０．５～１．５マイクロメートルのサイズを作り出す試料を、細胞でのアッセイのために選択した。
したがって、ＡＢＩα（溶解素Ａ、溶解素Ｂ、イソアミラーゼ、及びαアミラーゼ）、ならびにＢＩα（溶解素Ｂ、イソアミラーゼ、及びαアミラーゼ）を調製した。
ＡＢＩαの投与による、非結核マイコバクテリアの殺傷
０日目に、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９ブロス＋ＴＷＥＥＮ（約１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）にて、ＭｃＦａｒｌａｎｄスタンダードにより、細胞の対数増殖を０．５に調整し、調整した懸濁液を、７Ｈ９ブロス＋ＴＷＥＥＮで１：５の比率で希釈することにより、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ細菌細胞の懸濁液を調製した。アッセイ用の培地溶液は、３０ｍＬのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９、ＡＤＣ、及びＴＷＥＥＮ；３．３ｍＬの１２Ｘ ＰＭ添加剤（Ｂｉｏｌｏｇ，Ｉｎｃ）、３．３ｍＬのＩＦ－０１ａ流体（Ｂｉｏｌｏｇ，Ｉｎｃ）、及び４００μＬの１００Ｘ 色素Ｇ（Ｂｉｏｌｏｇ，Ｉｎｃ）を含んだ。９０μＬの調製した培地溶液を、９６ウェルプレートのウェルにピペット処理し、５μＬの調製した細胞懸濁液を添加し、１０μＬの酵素を添加して、それぞれ、３．２μｇの終濃度にすることにより、アッセイプレートを調製した。対照は、透析緩衝液と共に、またはこれなしで、細胞のみを含んだ。予備ステップの後、プレートを蓋で締め、パラフィルムを巻き付けることで、アッセイプレートをインキュベートした。次に、プレートを３７℃の静止インキュベーターに配置した。
１日目に、１０μＬの酵素カクテルを、用量２ｘ及び３ｘとして示されるウェルに添加することにより、投与アッセイプレートを調製した。２日目に、１０μＬのＡＢＩα（溶解素Ａ、溶解素Ｂ、イソアミラーゼ、及びαアミラーゼ）、またはＢＩα（溶解素Ｂ、イソアミラーゼ、及びαアミラーゼ）カクテルを、用量３ｘとして示されるウェルに添加した。３日目に、５０ｍＬのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９、ＡＤＣ、及びＴＷＥＥＮ、ならびに、５００μＬの１００Ｘの色素Ｇで、連続希釈用の色素培地を調製した。９０μＬの培地を、９６ウェルプレートのウェルにアリコートし、アッセイプレートをインキュベーターから取り除き、１０μＬの反応物を、９６ウェルプレートの上列にピペット処理し、１０μＬをピペット処理する（例えば、ウェルをピペット処理し、次の列に希釈する前に混合する）ことにより、列Ａ～Ｈで、１０倍連続希釈を行うことにより、増殖した連続希釈物（ＧＯＳＤ、例えば、－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、及び－８）を調製した。次に、プレートを蓋で覆い、パラフィルムを巻き付けて、３７℃、ＣＯ２インキュベーターに配置して、７２時間静置した。インキュベーション後、培養液の光学密度（ＯＤ５９０）を読み取った。実験のデータはヒストグラムとして表され、Ｙ軸は、検出下限（ＬＬｏＤ）で除した、培養物の光学密度（ＯＤ５９０）５９０（ＯＤ５９０／ＬＬｏＤ）を示す。ＬＬｏＤを、バックグラウンド測定用の細胞対照なしで計算し、１を上回る値は全て、当該希釈において、増殖に対して有意とする。
低増殖マイコバクテリアＭ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの殺傷
５ｍＬの１２Ｘ ＰＭ添加剤溶液（Ｂｉｏｌｏｇ，Ｉｎｃ）、４５ｍＬのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９（ＡＤＣサプリメントを含む）、及び、５００ｕＬの１００Ｘ色素Ｇ（Ｂｉｏｌｏｇ，Ｉｎｃ）を用いて、培地溶液を調製した。Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの処理を、以下のとおりに行った：９０μＬの調製培地溶液を、９６ウェルプレートの列Ａに添加した。Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの増殖株の細胞密度を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄスタンダード（約１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）に調整して、１０μＬの細胞を９６ウェルプレートに添加し、１×１０５ｃｆｕ／ウェルの入力細胞濃度を目標にした。対照として、いくつかのウェルはそのままとし、及び／または、１０ｕＬの透析緩衝液（ＤＢ）を添加した。１０μＬのＡＢＩαカクテルを、３．２μｇ／ウェルの終濃度にし、プレートを３７℃で３日間インキュベートした。前述のように、ＯＤ５９０を読み取り、プレートをインキュベーターに戻して配置した。６日目に、プレートを３７℃でインキュベートし、ＯＤ５９０を定量した。最終ステップにおいて、ＧＯＳＤ反応を細胞のみ、細胞＋ＤＢ、及び細胞＋ＡＢＩαで実施した。そうするために、９０μＬの培地溶液を、新しい９６ウェルプレートに添加し、続いて、１０μＬの反応液を上列に添加して、列Ａから列Ｈまで、１０倍連続希釈を行った。プレートを３７℃で６日間インキュベートし、ＯＤ５９０を読み取った。
Ｍ．ＡｂｓｃｅｓｓｕｓでのＡＢＩαカクテルのＭＩＣ測定
Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓの管を、Ｍｃｆａｒｌａｎｄスタンダード０．５まで希釈し、１×１０５ｃｅｌｌまで希釈して、プレートマップに従いウェルに添加した。次に、１０μＬのＡＢＩαカクテル（３．２μｇ）を各ウェルに添加した。未処理の対照では、等体積のＤＢを添加した。次に、ビアペネムをウェルに、２倍希釈系列で添加した。ウェルは全て、１ｘ色素培地により、適切な体積及び緩衝液条件にした。具体的には、５０ｍＬのファルコンチューブで、３０ｍＬのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９、ＡＤＣ、及びＴＷＥＥＮ；３．３ｍＬの１２Ｘ ＰＭ添加剤、３．３ｍＬのＩＦ－０１ａ流体、及び４００ｕＬの１００Ｘ色素Ｇ、を添加した。
プレートを、蓋を閉め、パラフィルムを側面に巻き付けて、２４時間、３７℃でインキュベートした。全連続希釈の前に、静置プレートを少なくとも１０分間振盪させ、ピペットを上下に動かしてアグリゲートを分解した。複製ＧＯＳＤ実験を９６時間、３７℃で、Ｏｍｎｉｌｏｇ Ｂｉｏｌｏｇ，ｉｎｃ．にて実施した。これらの実験では、希釈は１×１０－６で実施した。
マイコバクテリアのマクロファージへの取り込み
１日目には、マクロファージを以下のとおりに調製した：Ｔ－７５フラスコ内の、マクロファージのコンフルエント培養液を、培地からデカントし、新鮮なＣ－ＤＭＥＭ（１０ｍＬ）を補充した。細胞を、およそ８×１０６ｃｅｌｌのコンフルエンシーで、細胞スクレーパーを用いてフラスコの底からこすり、Ｃ－ＤＭＥＭの中で、１×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度まで希釈した。１００μＬの希釈細胞を、（１×１０４ｃｅｌｌ／ウェルの播種密度のための）９６ウェル組織培養プレートのウェルに添加し、プレートを、５％ ＣＯ２の中で、３７℃で一晩インキュベートした。
２日目に、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓのマクロファージへの取り込みを、以下のとおりに行った：Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ株の増殖培養液を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄスタンダードに調整して、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９にて１：５に希釈し、９６ウェルの組織培養プレートを取り出し、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回、ウェルを希釈した。１００μＬの新鮮な、予熱したＣ－ＤＭＥＭ、５μＬの１×１０５個のＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ細胞を、ウェルに添加した。次に、プレートを５％ ＣＯ２の中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。次に、２５０μｇ／ｍＬのアミカシンを含む１００μＬのＣ－ＤＭＥＭを添加し、プレートを１時間インキュベートした。細胞を１００μＬのＰＢＳで３回洗浄し、５０μｇ／ｍＬのアミカシンを含む８５μＬのＣ－ＤＭＥＭを補充した。酵素で処理するために、１５μＬの調製酵素カクテルを、組織培養プレートの指定のウェルに添加した。３．２μｇの、ＡＢＩαカクテルの各構成成分（例えば、溶解素Ａのみ、溶解素Ｂのみ、イソアミラーゼのみ、及びαアミラーゼのみ）で、遊離酵素処理を行った。同様の量の封入ＡＢＩαを、平均５０％のペイロード封入にて添加した。プレートを、５％ ＣＯ２の中で３７℃で、７２時間インキュベートした。
５日目に、以下のとおりのマクロファージ抽出を行った：インキュベーション後、培地を取り除いて細胞をＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬの０．５％ＳＤＳを添加し、ピペットを上下に動かして混合した。プレートを３７℃で１０分間インキュベートし、インキュベーターから取り出した。ウェルを上下にピペット処理して混合し、培地を新しい９６ウェルプレートに移した。プレートを、Ｂｉｏｔｅｋ振盪インキュベーターに添加して、細胞の凝集を解き、ＣＦＵ定量のために、全ての反応ウェルに対してＧＯＳＤを行った。
赤痢菌ファージハントプロトコル及びファージ調製
赤痢菌ファージハントプロトコル及びファージ調製を、以下のとおりに行った。Ｄｅｅｒ ｌｓｌａｎｄ排水処理施設から、５００ｍＬの活性汚泥試料を収集した。受領の際に、試料をＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００で処理し、０．１％の終濃度にした。ボトルを５回反転して、５分間静置した。サンプルを、５０ｍＬのファルコンチューブにアリコートして、１０分間４０００ｘｇで遠心分離にかけた。上清をきれいなボトルに収集して、もう一度ＴＲＩＴＯＮ Ｘ １００で処理し、０．１％の終濃度にした。貯蔵のために、４０％のグリセロールを上清に添加し、２０％の終濃度にした。上清を、５０ｍＬのファルコンチューブにて、４０ｍＬの体積にアリコートし、使用するまで－８０℃の冷凍庫で保存した。
２０％グリセロール中で、－８０で保管した、４０ｍＬのＴＲＩＴＯＮ処理した、汚れた上清を解凍した。２５０ｍＬのフラスコに、５０ｍＬのＴＳＢ、及び、１ｍＭの塩化マグネシウム、及び、５００μＬの、一晩のフレクスナー赤痢菌株（ＡＴＣＣ２９９０３）を添加した。汚れた上清をＩｎｎｏｖａｐｒｅｐ中空繊維ピペットで濃縮した。次に、ＴＳＢ及び細胞を含有するフラスコを、１ポンプの溶出流体（０．０７５％のＴＷＥＥＮ ２０＋２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０））で溶出した。３７℃で一晩振盪しながら、フラスコをインキュベートした。インキュベーション後、細胞を１０分間４０００ｘｇで遠心分離にかけた。上清を０．２μｍのフィルターで濾過した。プラークアッセイを行うために、１００μＬの細胞を、１００μＬの濃縮液、及び濃縮液の連続希釈液に添加し、３ｍＬの０．５％ ＴＳＢトップアガーと混合して、ＴＳＡプレートに配置した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。その後、プラークを、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む５ｍＬのＴＳＢで２４時間増殖させた。細胞及びデブリを１０分間、４０００Ｘｇでピペット処理し、上清を以前と同じように、Ｉｎｎｏｖａｐｒｅｐで精製し、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．１％ゼラチンを含有する、１．５ｍＬのファージ緩衝液に入れた。
赤痢菌ファージによる細胞内赤痢菌の殺傷
赤痢菌ファージによる細胞内赤痢菌の殺傷を、以下のとおりに行った。１日目に、マクロファージの調製を、Ｔ－７５フラスコ内でのマクロファージのコンフルエント培養により始め、これを培地からデカントし、新鮮なＣ－ＤＭＥＭ（１０ｍＬ）を補充した。細胞を、細胞スクレーパーを用いてフラスコの底からこすり（約８×１０６ｃｅｌｌのコンフルエンシー）、Ｃ－ＤＭＥＭの中で、１×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度まで希釈した。１００μＬの希釈細胞を、（１×１０４ｃｅｌｌ／ウェルの播種密度のための）９６ウェル組織培養プレートのウェルに添加し、プレートを、５％ ＣＯ２の中で、３７℃で一晩インキュベートした。ＡＢＩα及び赤痢菌実験用のリポソームを作製するために、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＳ、ＤＯＰＥ、及びＣｈｏｌを含む全てのリポソームに、標準的な脂質の作製物を使用した。この作製物は、１：１の流速比、及び１５ｍＬ／分の流速で生じた。使用した脂質溶媒は、ＥｔＯＨ、及び、水性緩衝液（１Ｍのトリス、ｐＨ８）を含んだ。リポソームは全て、１０ｋＤａのメンブレンにて、１時間透析した。具体的には、３０分の透析は、１００ｍＭのトリス（ｐＨ８、５％グリセロール）で生じ、３０分の透析は、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８、５％グリセロール）で生じた。タンパク質の濃度の測定を行った後で、試料を採取して細胞を添加し、これを５０％ ＩＰＡ・５０％ ＰＢＳに１：１で希釈し、Ｎａｎｏｄｒｏｐで２８０ｎｍにて吸光度を読み取った。
２日目に、フレクスナー赤痢菌の増殖培養物を使用し、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄスタンダードに培養物を調整して濁度計で確認し、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９に１：５で希釈して９６ウェル組織培養プレートに取り出し、ウェルを１００μＬのＰＢＳで３回洗浄することにより、細菌のマクロファージへの取り込みを行った。１００μＬの新鮮な、予熱したＣ－ＤＭＥＭ、及び５μの調製培養物をウェルに添加した。プレートを、５％ ＣＯ２の中で３時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を１００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。２５０μｇ／ｍＬのアミカシンを含む１００μＬのＣ－ＤＭＥＭを添加し、１時間インキュベートした。その後、細胞を１００μＬのＰＢＳで洗浄し、５０ｕｇ／ｍＬのアミカシンを含む８５μＬのＣ－ＤＭＥＭを補充した。対照にはアミカシンを添加せずにそのままとした。未封入（例えば、遊離）または封入ペイロードで後処理をするために、１０μＬの調製ペイロードを、組織培養プレートの指定のウェルに添加した。
実施例２：抗菌溶解タンパク質の送達は、マイコバクテリウム細胞の有効な殺傷を媒介する
本実施例は、マイコバクテリウム細胞の複製の減衰を可能な、用量依存性酵素カクテルの立証について記載する。
材料及び方法
材料及び方法及び細胞株は、実施例１に記載している。
結果
未処理対照と比較して、ならびに、光学密度（ＯＤ；図２Ａ）及び細胞計数（図２Ｂ）により評価されるように、単回または複数回投与の、溶解素Ａ（Ａ）、溶解素Ｂ（Ｂ）、イソアミラーゼ（Ｉ）、及びαアミラーゼ（α）（ＡＢＩα）の酵素カクテルで処理したときに、マイコバクテリウムアブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）は、用量に依存して殺傷されたことが、一連の増殖連続希釈（ＧＯＳＤ）（図１）における、細菌細胞の増殖のスクリーニングにより明らかとなった。異なる用量のＡＢＩα処理が、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓの繁殖不能を引き起こすかいなかを同定するために、用量依存性実験を行った。図３は、用量依存性実験を示し、ここで、３．２μｇのＡＢＩαでの処理が、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓを消滅させたことが観察された。同様の実験を、低増殖性のマイコバクテリウム種であるＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅで行い、細胞増殖を数日にわたり監視した（図４Ｂ）とき、ＡＢＩα処理が、細胞増殖の減衰の持続をもたらしたことが明らかとなった（図４Ａ）。同様の研究において、ＡＢＩαカクテルは効果的に、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｇｏｏｄｉｉ、Ｍ．ｍａｓｉｌｉｅｎｓｅ、Ｍ．ｂｏｌｅｔｔｉ、Ｍ．ｃｈｉｍｅｒａ、及びＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの細胞増殖を減衰したことが明らかとなった（データは図示せず）。合わせると、これらの結果は、インビトロでの死／増殖アッセイにおいて、ＡＢＩαによるマイコバクテリアの用量依存性の滅菌を実証している。
実施例３：抗菌溶解タンパク質及び抗生物質の送達は、マイコバクテリウム細胞の相乗的殺傷を媒介する
本実施例は、マイコバクテリウム産生の減衰における、ＡＢＩα酵素カクテルと抗生物質の組み合わせの相乗効果について記載する。
材料及び方法
材料及び方法及び細胞株は、実施例１に記載している。
結果
図５は、それぞれ、ＡＢＩα、及び、抗生物質のアミカシン、ビアペネム、セフォキシチン、エタンブトール、モキシフロキサシン、リファンピシン、またはクラリスロマイシンでの処理後の、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓの細胞増殖アッセイの表での定量である。定量のための画分阻害濃度（ＦＩＣ）指数を使用することで、アミカシン、ビアペネム、セフォキシチン、またはモキシフロキサシンと組み合わせたＡＢＩαが、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ増殖の減衰において相乗効果を引き起こしたことが明らかとなった。合わせると、これらの結果は、様々な化学抗生物質と組み合わせたＡＢＩαの酵素カクテルは、マイコバクテリウム細胞の死において相乗効果を引き起こすことを実証している。
実施例４：封入抗菌溶解タンパク質の送達は、感染したマクロファージにおける、マイコバクテリウムの非常に有効な殺傷を媒介する
本実施例は、感染したマクロファージ内での、細胞内局在化マイコバクテリウムの複製の減衰における、封入酵素カクテルの有効性の向上について記載する。
材料及び方法
材料及び方法及び細胞株は、実施例１に記載している。
結果
酵素（溶解素Ａ（Ａ）、溶解素Ｂ（Ｂ）、イソアミラーゼ（Ｉ）、またはαアミラーゼ（α））の最も有効な組み合わせを同定し、それらの封入により、マイコバクテリウム複製の減衰の有効性が向上するか否かを同定するために（図６）、未封入ＡＢＩα、ＡＢ、Ｉα、もしくはＢＩα、または、封入ＡＢＩα、ＡＢＩα、Ｉα、もしくはＢＩα（それぞれ、ｅｎｃＡＢＩα、ｅｎｃＡＢ、ｅｎｃＩα、及びｅｎｃＢＩα；図７）で処理した感染マクロファージから抽出した後の、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓの光学密度を測定した。未封入ＡＢＩα、及び、他の全ての部分的カクテルと比較して、封入ＡＢＩαカクテルは、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓの殺傷の向上を示したことが観察された（図８）。合わせると、これらの結果は、単回投与の封入ＡＢＩαカクテルは、未封入ＡＢＩαの９０％殺傷と比較して、細胞内Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓの９９％を殺傷したことを実証している。
実施例５：封入バクテリオファージの送達は、感染したマクロファージにおける、マイコバクテリウムの非常に有効な殺傷を媒介する
本実施例は、感染マクロファージ内での、細胞内局在化フレクスナー赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の複製の減衰における、封入赤痢菌バクテリオファージの有効性について記載する。
材料及び方法
材料及び方法及び細胞株は、実施例１に記載している。
結果
赤痢菌バクテリオファージを使用して、感染マクロファージにおけるフレクスナー赤痢菌の複製を減衰することができるか否かを同定するために、マクロファージをフレクスナー赤痢菌、及び、治療用ペイロード（ＥＰＨ３４）をコードする未封入または封入赤痢菌ファージで処理する実験を行った（図９）。４８時間のインキュベーション期間後に、細胞を抽出し、ＧＯＳＤを一晩定量した。封入赤痢菌ファージＥＰＨ３４（ｅｎｃＰｈａｇｅ）は、マクロファージからの抽出後に増殖を示さなかったが、未封入ファージＥＰＨ３４は、－１希釈にて増殖を示したことが観察された（図１０）。合わせると、これらの結果は、光学密度の１０倍低下により示されるように、ｅｎｃＰｈａｇｅは、感染マクロファージにおいて、最も有効なフレクスナー赤痢菌の減少をもたらしたことを実証した。
他の実施形態
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが具体的に個別に参照により組み込まれることが示されていると同程度に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本出願の用語が、参照により本明細書に組み込まれている文書とは異なって定義されていることが見つかった場合、本明細書で提供する定義が、その用語の定義としての役割を果たす。
本発明はその特定の実施形態と共に記載されているが、本発明は、さらなる修正が可能であり、かつ、本出願が、一般に、本発明の原理に従った、本発明のあらゆる変化、使用、または適応をカバーし、本発明が関係する当該技術で知られるようになる、または、習慣的に実践される、本開示からの逸脱を含むことが意図され、上記で説明した本質的な特徴に適用可能であり、特許請求の範囲に従うことが理解されよう。

Claims (78)

  1. 対象のプロフェッショナル抗原提示細胞内に細菌細胞を含む標的細胞内区画に、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を送達する方法であって、前記方法が、前記対象に、前記バクテリオファージ及び前記抗菌溶解タンパク質を含む超分子構造体を含む組成物を投与することを含み、前記超分子構造体が、約７５ｎｍ～約７５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含み、前記投与ステップの後、前記バクテリオファージ及び前記抗菌溶解タンパク質が前記標的細胞内区画に送達される、前記方法。
  2. 前記プロフェッショナル抗原提示細胞がマクロファージまたは樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 細菌細胞により引き起こされる細胞内細菌症の治療方法であって、前記方法が、前記対象に、前記細菌感染症を治療するのに十分な量及び期間、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含む超分子構造体を含む組成物を投与することを含み、前記超分子構造体が約７５ｎｍ～約７５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含む、前記方法。
  4. 前記超分子構造体が、約２５０ｎｍ～約７５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記超分子構造体が、約７５ｎｍ～約２５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記超分子構造体が、標的部分をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 対象のプロフェッショナル抗原提示細胞内に細菌細胞を含む標的細胞内区画に、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を送達する方法であって、前記方法が、標的部分と、前記バクテリオファージ及び前記抗菌溶解タンパク質を含むカーゴと、を含む超分子構造体を含む組成物を、前記対象に投与することを含み、前記投与ステップの後、前記バクテリオファージ及び前記抗菌溶解タンパク質が前記標的細胞内区画に送達される、前記方法。
  8. 前記プロフェッショナル抗原提示細胞がマクロファージまたは樹状細胞である、請求項６に記載の方法。
  9. 細菌細胞により引き起こされる細胞内細菌症の治療方法であって、前記方法が、標的部分と、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含むカーゴと、を含む超分子構造体を含む組成物を、前記細菌感染症を治療するのに十分な量及び期間で、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  10. 前記超分子構造体が、約約２５０ｎｍ～約７５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記超分子構造体が、約７５ｎｍ～約２５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記細菌細胞が、マイコバクテリウム、サルモネラ、ナイセリア、ブルセラ、エシェリキア、リステリア、フランキセラ、レジオネラ、エルシニア、ブドウ球菌、クロストリジウム、赤痢菌、または連鎖球菌種である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. （ａ）前記マイコバクテリウム種が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍ．ｌｅｐｒａｅ，Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ，Ｍ．ａｖｉｕｍ，Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ，Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ，Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、またはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓであり、
    （ｂ）前記サルモネラ種が、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉであり、
    （ｃ）前記ナイセリア種が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓであり、
    （ｄ）前記ブルセラ種が、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、またはＢ．ｃａｎｉｓであり、
    （ｅ）前記エシェリキア種が、Ｅ．ｃｏｌｉであり、
    （ｆ）前記リステリア種が、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓであり、
    （ｇ）前記フランキセラ種が、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、またはＦ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａであり、
    （ｈ）前記レジオネラ種が、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａであり、
    （ｉ）前記エルシニア種が、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓまたはＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａであり、
    （ｊ）前記ブドウ球菌種が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓであり、
    （ｋ）前記クロストリジウム種が、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、またはＣ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉであり、
    （ｌ）前記赤痢菌種が、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、またはＳ．ｓｏｎｎｅｉであり、あるいは
    （ｍ）前記連鎖球菌種が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記バクテリオファージが、カプセルデポリメラーゼ、アミラーゼ、もしくは溶解素をコードするポリヌクレオチドを含むか、または、前記抗菌溶解タンパク質が、カプセルデポリメラーゼ、アミラーゼ、もしくは溶解素である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記カプセルデポリメラーゼが、ヒドロラーゼ、メタロヒドロラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペプチドグリカンヒドロラーゼ、ポリサッカラーゼ、多糖類リアーゼ、エンドシアリダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、またはアルギネートリアーゼである、請求項１４に記載の方法。
  16. （ａ）前記溶解素が溶解素Ａもしくは溶解素Ｂであり、及び／または
    （ｂ）前記アミラーゼがイソアミラーゼ及びαアミラーゼである、
    請求項１４に記載の方法。
  17. 前記標的部分が、プロフェッショナル抗原提示細胞を標的にする細胞外標的部分である、請求項６～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記プロフェッショナル抗原提示細胞がマクロファージまたは樹状細胞である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記標的部分がホスファチジルセリンを含む、請求項６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記標的部分が抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗ＣＤ１６３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ２０６、抗ＣＤ１２３抗体、及びその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗ＤＥＣ２０５、抗ＣＤ３０４、抗ＣＤ３０３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＢＤＣＡ２、及び抗ＣＤ１２３抗体、ならびにその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記標的部分が病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む、請求項６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記標的部分がマンノースクラスターまたは葉酸塩である、請求項６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記標的部分がＴＬＲ２アゴニストである、請求項６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ＴＬＲ２アゴニストが、ＭＡＬＰ－２リポタンパク質、ＭＡＬＰ－４０４リポタンパク質、外側表面リポタンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）、ポリン、ＬｃｒＶ、Ｈｓｐ６０、糖タンパク質ｇＨ／ｇＬ、または糖タンパク質ｇＢからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記超分子構造体が脂質ナノ粒子である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記超分子構造体がミセルである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記超分子構造体がリポソームである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記リポソームがユニラメラである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記リポソームがマルチラメラである、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記超分子構造体が、約０．０５～約０．３の多分散指数を含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記超分子構造体が１種以上の脂質を含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記１種以上の脂質のうちの少なくとも１つがイオン化可能な脂質である、請求項３３に記載の方法。
  35. 抗生物質を投与することをさらに含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記抗生物質が、セファロスポリン、カルバペネム、ペニシリン、及びフルオロキノロンからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記抗生物質が、チアセタゾン、ｓｑ－１０９、ベダキリン、デラマニド、ピラジナミド、及びイソニアジドからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記抗生物質が、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エタンブトール、リファンピン、及びアミカシンからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  39. 前記バクテリオファージが、前記細菌細胞に感染可能であるか、または、前記抗菌溶解タンパク質が、前記細菌細胞を殺傷可能である、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記バクテリオファージがマイコバクテリオファージであるか、または、前記抗菌溶解タンパク質が抗菌マイコバクテリオファージタンパク質である、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記組成物が、静脈内投与、経口投与、局所投与される、または、吸入により投与される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含む超分子構造体を含む組成物であって、前記超分子構造体が、約７５ｎｍ～約７５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含む、前記組成物。
  43. 標的部分をさらに含む、請求項４２に記載の組成物。
  44. 標的部分と、バクテリオファージ及び抗菌溶解タンパク質を含むカーゴと、を含む超分子構造体を含む組成物。
  45. 前記超分子構造体が、約２５０ｎｍ～約７５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の組成物。
  46. 前記超分子構造体が、約７５ｎｍ～約２５０ｎｍのＺアベレージ平均粒径を含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の組成物。
  47. 前記バクテリオファージが、カプセルデポリメラーゼ、アミラーゼ、もしくは溶解素をコードするポリヌクレオチドを含むか、または、前記バクテリオファージタンパク質が、カプセルデポリメラーゼ、アミラーゼ、もしくは溶解素である、請求項４２～４６のいずれか１項に記載の組成物。
  48. 前記カプセルデポリメラーゼが、ヒドロラーゼ、メタロヒドロラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ペプチドグリカンヒドロラーゼ、ポリサッカラーゼ、多糖類リアーゼ、エンドシアリダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、またはアルギネートリアーゼである、請求項４７に記載の組成物。
  49. （ａ）前記溶解素が溶解素Ａもしくは溶解素Ｂであり、及び／または
    （ｂ）前記アミラーゼがイソアミラーゼ及びαアミラーゼである、
    請求項４７に記載の組成物。
  50. 前記標的部分が、プロフェッショナル抗原提示細胞を標的にする細胞外標的部分である、請求項４３～４９のいずれか１項に記載の組成物。
  51. 前記プロフェッショナル抗原提示細胞がマクロファージまたは樹状細胞である、請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記標的部分がホスファチジルセリンを含む、請求項４３～５１のいずれか１項に記載の組成物。
  53. 前記標的部分が抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項４３～５１のいずれか１項に記載の組成物。
  54. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗ＣＤ１６３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ２０６、抗ＣＤ１２３抗体、及びその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗ＤＥＣ２０５、抗ＣＤ３０４、抗ＣＤ３０３、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＢＤＣＡ２、及び抗ＣＤ１２３抗体、ならびにその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項５３に記載の組成物。
  56. 前記標的部分がＰＡＭＰを含む、請求項４３～５１のいずれか１項に記載の組成物。
  57. 前記標的部分がマンノースクラスターまたは葉酸塩である、請求項４３～５１のいずれか１項に記載の組成物。
  58. 前記標的部分がＴＬＲ２アゴニストである、請求項４３～５１のいずれか１項に記載の組成物。
  59. 前記ＴＬＲ２アゴニストが、ＭＡＬＰ－２リポタンパク質、ＭＡＬＰ－４０４リポタンパク質、ＯｓｐＡ、ポリン、ＬｃｒＶ、Ｈｓｐ６０、糖タンパク質ｇＨ／ｇＬ、または糖タンパク質ｇＢからなる群から選択される、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記超分子構造体が脂質ナノ粒子である、請求項４２～５９のいずれか１項に記載の組成物。
  61. 前記超分子構造体がミセルである、請求項４２～５９のいずれか１項に記載の組成物。
  62. 前記超分子構造体がリポソームである、請求項４２～５９のいずれか１項に記載の組成物。
  63. 前記リポソームがユニラメラである、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記リポソームがマルチラメラである、請求項６２に記載の組成物。
  65. 前記超分子構造体が、約０．０５～約０．３の多分散指数を含む、請求項４２～６４のいずれか１項に記載の組成物。
  66. 前記超分子構造体が１種以上の脂質を含む、請求項４２～６５のいずれか１項に記載の組成物。
  67. 前記１種以上の脂質のうちの少なくとも１つがイオン化可能な脂質である、請求項６６に記載の組成物。
  68. 抗生物質をさらに含む、請求項４２～６７のいずれか１項に記載の組成物。
  69. 前記抗生物質が、セファロスポリン、カルバペネム、ペニシリン、及びフルオロキノロンからなる群から選択される、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記抗生物質が、チアセタゾン、ｓｑ－１０９、ベダキリン、デラマニド、ピラジナミド、及びイソニアジドからなる群から選択される、請求項６８に記載の組成物。
  71. 前記抗生物質が、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エタンブトール、リファンピン、及びアミカシンからなる群から選択される、請求項６８に記載の組成物。
  72. 前記バクテリオファージが、マイコバクテリウム、サルモネラ、ナイセリア、ブルセラ、エシェリキア、リステリア、フランキセラ、レジオネラ、エルシニア、ブドウ球菌、クロストリジウム、赤痢菌、または連鎖球菌種であるか、あるいは、前記抗菌溶解タンパク質が、これらを殺傷することができる、請求項４２～７１のいずれか１項に記載の組成物。
  73. （ａ）前記マイコバクテリウム種が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍ．ｌｅｐｒａｅ，Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ，Ｍ．ａｖｉｕｍ，Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ，Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ，Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、またはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓであり、
    （ｂ）前記サルモネラ種が、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＳ．ｂｏｎｇｏｒｉであり、
    （ｃ）前記ナイセリア種が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓであり、
    （ｄ）前記ブルセラ種が、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、またはＢ．ｃａｎｉｓであり、
    （ｅ）前記エシェリキア種が、Ｅ．ｃｏｌｉであり、
    （ｆ）前記リステリア種が、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓであり、
    （ｇ）前記フランキセラ種が、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、またはＦ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａであり、
    （ｈ）前記レジオネラ種が、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａであり、
    （ｉ）前記エルシニア種が、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓまたはＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａであり、
    （ｊ）前記ブドウ球菌種が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓであり、
    （ｋ）前記クロストリジウム種が、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、またはＣ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉであり、
    （ｌ）前記赤痢菌種が、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、またはＳ．ｓｏｎｎｅｉであり、あるいは
    （ｍ）前記連鎖球菌種が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、
    請求項７２に記載の方法。
  74. 前記バクテリオファージがマイコバクテリオファージであるか、または、前記抗菌溶解タンパク質が抗菌マイコバクテリオファージタンパク質である、請求項４２～７３のいずれか１項に記載の組成物。
  75. 細菌を標的にするファージの単離方法であって、前記方法が、
    前記ファージを含む不均質な混合物を、洗剤、極性、水不混和性、中性溶媒、またはこれらの組み合わせと接触させて、液体及び固体を含む組成物を作製することと、
    前記液体を前記固体から分離して上清を作製することと、
    前記上清を濃縮して濃縮上清を作製することと、
    前記濃縮上清を前記細菌によりインキュベートし、前記ファージ、細胞、及びデブリを含む細胞混合物を作製することと、
    前記ファージを、前記細胞及びデブリから分離して、前記ファージを単離することと、
    を含む、前記方法。
  76. 前記不均質な混合物が汚れたスラッジである、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記洗剤が、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリソルベート、またはノノキシノール９である、請求項７５または７６に記載の方法。
  78. 前記極性、水不混和性、中性溶媒がクロロホルムである、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の方法。
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