JP2023515371A - 置換７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド誘導体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、乾癬、全身性エリテマトーデス、または１型糖尿病を治療するのに有用な、Ｒが（ＩＩ）もしくは（ＩＩＩ）である式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。TIFF2023515371000034.tif7984
Description
本発明は、ＴＹＫ２のシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）に結合し、かつある特定のサイトカインシグナル伝達、特にＩＬ－２３およびＩＦＮαシグナル伝達を阻害する新規化合物と、この化合物を含む薬学的組成物と、ある特定の自己免疫疾患を治療するためにこの化合物を使用する方法と、この化合物の合成に有用な中間体およびプロセスとに関する。
乾癬および糖尿病などの他の自己免疫疾患は、ある特定の炎症性サイトカインのＴＹＫ２シグナル伝達によって媒介されると考えられる（例えば、Ｊ．Ｓ．Ｔｏｋａｒｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２９０（１７），ｐａｇｅｓ １１０６１－１１０７４（２０１５）、およびＬ．Ｍａｒｒｏｑｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｖｏｌ．６４，ｐａｇｅｓ ３８０８－３８１７（２０１５）を参照されたい）。乾癬は、慢性皮膚疾患であり、一般人口の約２％が罹患していると推定される。乾癬の治療選択肢には、例えば、コルチコステロイドなどの局所治療、紫外線Ｂ（ＵＶＢ）光などの光線療法、ならびにメトトレキサートおよびアプレミラストなどの全身療法が挙げられる。残念ながら、そのような薬剤は、効果的な治療を常に提供するとは限らず、種々の有害な副作用を伴う可能性がある。
ＵＳ２０１９／００３１６６４Ａ１は、ＴＹＫ２の阻害を通じて様々な炎症性および自己免疫疾患を治療するのに有用なある特定の置換ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジンを開示する。米国特許第７，５５７，１１０号は、炎症性疾患および自己免疫疾患などのキナーゼ媒介性障害を治療するのに有用なキナーゼ阻害剤としてある特定のピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン誘導体を開示する。
乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および糖尿病などの自己免疫疾患の代替治療に対する必要性が、存在する。特に、ＴＹＫ２ ＪＨ２ドメインに結合する化合物に対する必要性が、存在する。加えて、ＴＹＫ２ ＪＨ２ドメインに結合し、ＩＬ－２３およびＩＦＮαシグナル伝達を阻害する化合物に対する必要性が、存在する。
したがって、一実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物であって、
式中、Ｒが、以下のもの、
である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
特定の実施形態では、化合物は、式Ｉａのもの、
またはその薬学的に許容される塩である。
特定の実施形態では、化合物は、式Ｉｂのもの、
またはその薬学的に許容される塩である。
一実施形態では、Ｒは、以下のもの、
またはその薬学的に許容される塩である。
一実施形態では、Ｒは、以下のもの、
またはその薬学的に許容される塩である。
一実施形態では、化合物は、以下のもの、
またはその薬学的に許容される塩である。
一実施形態では、化合物は、以下のもの、
またはその薬学的に許容される塩である。
一実施形態では、本発明は、乾癬の治療を必要とする患者における乾癬を治療する方法であって、患者に、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法も提供する。一実施形態では、本発明は、ＳＬＥの治療を必要とする患者におけるＳＬＥを治療する方法であって、患者に、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、体軸性脊椎関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、２型糖尿病、および成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）からなる群から選択される疾患の治療を必要とする患者におけるそのような治療を行う方法であって、患者に、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法をさらに提供する。
一実施形態では、本発明は、療法に使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本発明は、乾癬の治療に使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本発明は、ＳＬＥの治療に使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態では、本発明は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬性関節炎、ＲＡ、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、体軸性脊椎関節炎、ＭＳ、１型糖尿病、２型糖尿病、およびＬＡＤＡからなる群から選択される疾患の治療に使用するための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩も提供する。
一実施形態では、本発明は、乾癬を治療するための医薬の製造のための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用も提供する。一実施形態では、本発明は、ＳＬＥを治療するための医薬の製造のための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態では、本発明は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬性関節炎、ＲＡ、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、軸性脊椎関節炎、ＭＳ、１型糖尿病、２型糖尿病、およびＬＡＤＡからなる群から選択される疾患を治療するための医薬の製造のための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用も提供する。
一実施形態では、本発明は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む、薬学的組成物を調製するためのプロセスをさらに提供する。一実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物の合成のための新規中間体およびプロセスも包含する。
本明細書で使用される場合、「治療すること」、「治療」、または「治療する」という用語は、既存の症状または障害の進行または重症度を抑制すること、遅延させること、阻止すること、または改善することを含む。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、哺乳類、特にヒトを指す。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者に単回または複数回投与すると、診断中または治療中の患者に所望の効果を提供する、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の量または投与量を指す。
有効量は、既知の技法の使用によって、かつ同様の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、担当診断医によって多数の要因が考慮され、これらの要因には、患者の人種；患者のサイズ、年齢、および全体的な健康状態；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の程度または関与もしくは重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される調製物の生物学的利用能の特性；選択された投与レジメン；付随する薬物の使用；ならびに他の関連する状況が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の化合物は、本化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される薬学的組成物として製剤化される。より好ましくは、そのような組成物は、経口投与用である。そのような薬学的組成物およびそれを調製するためのプロセスは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）。
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩は、本発明の治療方法に特に有用であり、鏡像異性体を含むすべての立体配置およびラセミ体を含むそれらの混合物が本発明の範囲内で企図される。これらの立体配置は本発明の治療方法および化合物の両方に適用可能であることが、理解される。
以下の調製物に記載される特定の中間体は、１つ以上の窒素保護基を含んでもよい。保護基は、特定の反応条件および実施される特定の変換に応じて、当業者によって認識されるように変化し得ることが理解される。保護および脱保護条件は、当業者に周知であり、文献（例えば、”Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００７を参照のこと）に記載されている。
鏡像異性体を含む個々の異性体は、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって、本発明の化合物の合成における任意の好都合な時点において、当業者により分離または分割されてもよい（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．，”Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１、およびＥ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照されたい）。
本発明の化合物の薬学的に許容される塩を、例えば、当該技術分野で周知の標準的な条件下で、ジエチルエーテルなどの好適な溶媒中で、本発明の化合物の適切な遊離塩基の、適切な薬学的に許容される酸の反応によって形成することができる。加えて、そのような薬学的に許容される塩の形成は、窒素保護基の脱保護と同時に起こり得る。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１－２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７－４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９，（１９７７）を参照されたい。
ある特定の略語は以下のように定義される。「ＢＩＮＡＰ」は、（±）－２，２′－ビス（ジフェニルホスフィノ）－１，１′－ビナフタレンを指し、「ＢＯＰ」は、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指し、「ＤＥＭ」はマロン酸ジエチルを指し、「ＤＩＥＡ」は、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを指し、「ＤＭＥＭ」は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍを指し、「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し、「ＤＭＴ」は、ジメルカプトトリアジンを指し、「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し、「ＥｔＯＨ」は、エタノールおよびエチルアルコールを指し、「ＦＢＳ」は、胎仔ウシ血清を指し、「ＨＡＴＵ」は、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＨＥＰＥＳ」は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸を指し、「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを指し、「ＩＦＮα」は、インターフェロンアルファを指し、「ＩＬ－２」は、インターロイキン２を指し、「ＩＬ－２３」は、インターロイキン２３を指し、「ＪＡＫ」は、ヤヌスキナーゼを指し、「ＬｉＨＭＤＳ」は、リチウムヘキサメチルジシラジドを指し、「ＭｅＩ」はヨウ化メチルを指し、「ＭｅＮＨ２」は、メチルアミンを指し、「ＭｅＯＨ」は、メタノールおよびメチルアルコールを指し、「ＭＴＢＥ」は、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを指し、「ＮａＯＥｔ」は、ナトリウムエトキシドを指し、「Ｐｄ（ＯＡｃ）２」は、パラジウム（ＩＩ）アセテートを指し、「ＲＰＭ」は、毎分回転数を指し、「ＲＰＭＩ」は、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指し、「ＴＹＫ２」は、チロシンキナーゼ２を指し、「ＵＶＢ」は、紫外線Ｂを指し、「ＳＴＡＴ」は、転写タンパク質のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子を指す。
本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩は、当業者に既知の様々な手順によって調製されてもよく、そのうちのいくつかが、以下のスキーム、調製物、および実施例に示される。以下のスキームにおける各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することができる。以下のスキームにおいて、すべての置換基は、別途指示のない限り、すでに定義したとおりである。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、以下のスキーム、調製物、および実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
スキーム１
スキーム１、ステップＡにおいて、化合物（２）の形成を、０～２２℃のＤＭＦなどの溶媒中でＤＩＥＡなどの好適な有機塩基およびＨＡＴＵなどの好適なカップリング剤を使用する、化合物（１）とＭｅＮＨ２との間の当該技術分野で周知の条件下でのアミドカップリングとして示す。
ステップＢにおいて、ＭｅＩは、ジメチルスルホニウムヨージド塩を形成するための化合物（２）へ添加され、続いて０～２２℃でのＴＨＦなどの好適な溶媒中でＬｉＨＭＤＳなどの好適な塩基での処理を行って、環化化合物（３）を得る。
ステップＣにおいて、化合物（３）を、約５５℃のアセトニトリルなどの好適な溶媒中で４－メチルベンゼンスルホン酸などの好適な酸を使用して、標準条件下で脱保護し、続いてＭＴＢＥなどの溶媒を添加して、化合物（４）を沈殿させる。
スキーム２
スキーム２、ステップＡは、化合物（５）へのＤＥＭの添加、およびＥｔＯＨなどの溶媒中で約８０℃でＮａＯＥｔまたはカリウムｔ－ブトキシドなどの好適な塩基を使用する化合物（６）へのその後の環化を示す。
ステップＢにおいて、化合物（６）の７－ヒドロキシおよび５－オキソ基を、アセトニトリルなどの好適な溶媒中で約５０～１００℃でＰＯＣｌ３などの好適な塩素源およびピリジンなどの好適な有機塩基を使用して塩素化して、化合物（７）を得ることができる。
ステップＣにおいて、化合物（７）の７－クロロ基上の選択的求核芳香族置換を、周囲温度でＴＨＦなどの好適な溶媒中のＭｅＮＨ２などの適切な求核試薬を使用する当技術分野で周知の条件下で実施して、化合物（８）を得ることができる。
ステップＤにおいて、Ｂｕｃｈｗａｌｄカップリングを、１３０℃で加熱しながら１，４－ジオキサンおよび２－メチル－２－ブタノールなどの適切な溶媒系中で、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体およびＢＩＮＡＰなどの好適な触媒およびリガンド系を酢酸カリウムなどの好適な塩基とともに使用して、置換アミノピリジンとともに化合物（８）で実施して、化合物（９）を形成することができる。
化合物（９）を、還流下でＥｔＯＨおよびＴＨＦなどの好適な溶媒系中で水性ＬｉＯＨなどの好適な塩基で処理して、ステップＥに示すようにエステルの塩基性加水分解を通じて化合物（１０）を得ることができる。
ステップＦは、ＤＭＦなどの溶媒中でＤＩＥＡなどの好適な有機塩基およびＢＯＰなどの好適なカップリング剤を使用して、化合物（１０）と化合物（４）との間の当該技術分野で周知の条件下でのアミドカップリングを示す。
スキーム３
スキーム３、ステップＡは、５０℃で１，４－ジオキサンなどの溶媒中、ＮａＯＨ水溶液などの好適な塩基を用いて化合物（８）を塩基性加水分解して、化合物（１１）を得ることを示す。
ステップＢは、化合物（１２）を得るためのスキーム２、ステップＦに一般的に記載される条件下での化合物（１１）と（４）との間のアミドカップリングを示す。
ステップＣにおいて、Ｂｕｃｈｗａｌｄカップリングを、１３０℃で加熱しながら１，４－ジオキサンなどの適切な溶媒中で、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体およびＢＩＮＡＰなどの好適な触媒およびリガンド系を酢酸カリウムなどの好適な塩基とともに使用して、置換アミノピリジンとともに化合物（１２）で実施して、式Ｉａの化合物を得ることができる。
調製物１
スキーム１、ステップＡ：ＤＭＦ（４Ｌ）中の（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｄ－メチオニン（４００ｇ、１．６ｍｏｌ）、メチルアミン塩酸塩（１６２．４７ｇ、２．４ｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（７００ｍＬ、４．０１ｍｏｌ）の溶液を０℃まで冷却し、ＨＡＴＵ（７３２．１ｇ、１．９２ｍｏｌ）を添加する。反応物を周囲温度まで温める。２時間撹拌した後、溶媒を蒸発させる。次いで、水（１０Ｌ）を添加し、水溶液をＤＣＭ（２×３Ｌ）で抽出する。有機層を、合わせ、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で濃縮する。得られた残留物を、ヘキサン中のＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体として得る（３６８ｇ、８７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２６３（Ｍ＋Ｈ）。
調製物２
スキーム１、ステップＢ：ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［（１Ｒ）－１－（メチルカルバモイル）－３－メチルスルファニル－プロピル］カルバメート（３６８ｇ、１．４０ｍｏｌ）およびＭｅＩ（３．６８Ｌ、５９．１１ｍｏｌ）の混合物を、周囲温度で１８時間撹拌する。次いで、混合物を、真空中で濃縮する。得られた粗製ジメチルスルホニウムヨージド塩（２１０ｇ、０．５２ｍｏｌ）の一部分を、ＴＨＦ（４．７Ｌ）に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却し、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中の１．００Ｍ溶液、１．１６Ｌ、１．１６ｍｏｌ）を滴下する。次いで、反応混合物を周囲温度まで温める。４時間後、水（２．４Ｌ）を添加し、溶媒を濃縮して半分の体積にする。混合物をＤＣＭ（２×３Ｌ）で抽出する。有機物を、合わせ、真空で濃縮する。残留物を、ＤＣＭ中のＭｅＯＨで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体として得る（５０ｇ）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２１５（Ｍ＋Ｈ）。キラルＨＰＬＣ：Ｒｔ（保持時間）＝９．１３分；ＬＣカラム：ＣｈｉｒａｌＰＡｃ ＩＡ ＯＤ ４．６×２５０ｍｍ ５μｍ；アイソクラティック：０．１％ジエチルアミン／ヘキサン／エタノール（８５／１５）；カラム温度：２５℃；流速：１．０ｍＬ／分。
旋光度：［α］Ｄ
２０＝＋５３°（Ｃ＝０．５、ＭｅＯＨ）。
調製物３
スキーム１、ステップＣ：アセトニトリル（５００ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［（３Ｒ）－１－メチル－２－オキソ－ピロリジン－３－イル］カルバメート（４６ｇ、２１４．６９ｍｍｏｌ）および４－メチルベンゼンスルホン酸（７４．５ｇ、４３３ｍｍｏｌ）を５５℃で加熱し、４時間撹拌する。次いで、ＭＴＢＥ（１Ｌ）を添加し、混合物を２２℃まで冷却する。得られた固体を濾過により収集し、追加のＭＴＢＥで洗浄し、真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物を白色の固体として得る（６０ｇ、９５％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ １１５（Ｍ＋Ｈ）。
旋光度：［α］Ｄ
２０＝＋３１．３°（Ｃ＝０．５、ＭｅＯＨ）。
調製物４
スキーム２、ステップＡ：エチル５－アミノ－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボキシレート（１２．５ｇ、８０．６ｍｍｏｌ）、およびＤＥＭ（１８．５ｍＬ、１２１ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（９０ｍＬ）に溶解する。この混合物に、ＮａＯＥｔ（ＥｔＯＨ中２１質量％、４５．１ｍＬ、１２１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を９０℃で２４時間撹拌する。この後、混合物を、周囲温度まで冷却する。次いで、混合物を５Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にし、得られた沈殿物を濾過して、表題化合物を白色の固体として得る（１１．７ｇ、６５．１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２２４（Ｍ＋Ｈ）。
代替調製物４
スキーム２、ステップＡ：ＥｔＯＨ（６．００Ｌ）中のエチル５－アミノ－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボキシレート（４００ｇ、２．５８ｍｏｌ）およびＤＥＭ（５８４ｍＬ、３．８７ｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ－ブトキシド（５７８ｇ、５．１６ｍｏｌ）を、窒素下で２５℃で添加する。溶液を、８０℃で１２時間撹拌し、次いで２２℃まで冷却する。反応混合物を０．１Ｎ ＨＣｌ（２Ｌ）で希釈し、ｐＨを５Ｎ ＨＣｌで３に調整する。混合物を濾過し、フィルターケーキを水（８００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物をオフホワイトの固体として得る（４６０ｇ、８１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２２４（Ｍ＋Ｈ）。
スキーム２、ステップＡ：ＥｔＯＨ（６．００Ｌ）中のエチル５－アミノ－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボキシレート（４００ｇ、２．５８ｍｏｌ）およびＤＥＭ（５８４ｍＬ、３．８７ｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ－ブトキシド（５７８ｇ、５．１６ｍｏｌ）を、窒素下で２５℃で添加する。溶液を、８０℃で１２時間撹拌し、次いで２２℃まで冷却する。反応混合物を０．１Ｎ ＨＣｌ（２Ｌ）で希釈し、ｐＨを５Ｎ ＨＣｌで３に調整する。混合物を濾過し、フィルターケーキを水（８００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物をオフホワイトの固体として得る（４６０ｇ、８１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２２４（Ｍ＋Ｈ）。
調製物５
スキーム２、ステップＢ：エチル７－ヒドロキシ－５－オキソ－４Ｈ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（１１．７ｇ、５２．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）に懸濁し、窒素で５分パージする。この混合物に、ＰＯＣｌ３（１４．８ｍＬ、１５７ｍｍｏｌ）、続いてピリジン（４．２８ｍＬ、５２．４ｍｍｏｌ）を５０℃で添加し、次いで混合物を１００℃で５時間撹拌する。この後、混合物を、周囲温度まで冷却し、氷／水混合物に注ぐ。この混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で中和し、得られた沈殿物を濾過して、表題化合物を白色固体として得る（１３ｇ、９５．３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６０／２６２［Ｍ＋Ｈ］＋。
代替調製物５
スキーム２、ステップＢ：アセトニトリル（２Ｌ）中のエチル７－ヒドロキシ－５－オキソ－４Ｈ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（４００ｇ、１．７９ｍｏｌ）の懸濁液に、ＰＯＣｌ３（４１６ｍＬ、４．４８ｍｏｌ）およびピリジン（２１７ｍＬ、２．６９ｍｏｌ）を窒素下で、５０℃で滴下する。混合物を、８０℃で１２時間撹拌する。反応混合物を真空で濃縮し、残留物を水（２Ｌ）に注ぐ。反応混合物を濾過し、固体を水（８００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物をオレンジ色の固体として得る（３６０ｇ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６０／２６２［Ｍ＋Ｈ］＋。
スキーム２、ステップＢ：アセトニトリル（２Ｌ）中のエチル７－ヒドロキシ－５－オキソ－４Ｈ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（４００ｇ、１．７９ｍｏｌ）の懸濁液に、ＰＯＣｌ３（４１６ｍＬ、４．４８ｍｏｌ）およびピリジン（２１７ｍＬ、２．６９ｍｏｌ）を窒素下で、５０℃で滴下する。混合物を、８０℃で１２時間撹拌する。反応混合物を真空で濃縮し、残留物を水（２Ｌ）に注ぐ。反応混合物を濾過し、固体を水（８００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物をオレンジ色の固体として得る（３６０ｇ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６０／２６２［Ｍ＋Ｈ］＋。
調製物６
スキーム２、ステップＣ：エチル５，７－ジクロロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（５０．０ｇ、１９２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２５０ｍＬ）に添加し、溶液を１０℃まで冷却する。次いで、ＭｅＮＨ２溶液（ＥｔＯＨ中３３％ｗ／ｗ）（７９ｍＬ、６３４ｍｍｏｌ）を添加し、温度を２０℃未満に保つ。混合物を、撹拌し、２２℃まで温め、４時間撹拌する。次いで水（３００ｍＬ）を添加し、混合物をさらに１時間撹拌する。得られた固体を濾過により収集し、ＴＨＦ／水混合物（２：３）（１００ｍＬ）および水（４００ｍＬ）で洗浄する。次いで、固体を真空（１０ｍｂａｒ／５０℃）下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物を淡褐色の固体（４９．５ｇ、９０％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２５５／２５７［Ｍ＋Ｈ］＋。
調製物７
スキーム３、ステップＡ：１Ｎ ＮａＯＨ（５０ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（５０ｍＬ）中のエチル５－クロロ－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（９．０５ｇ、３５．５ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を５０°Ｃに温める。１６時間後、混合物を周囲温度まで冷却し、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌの添加によって約３に調整する。固体を、収集し、真空下で乾燥させて、表題化合物を淡黄褐色の固体（８．０ｇ、９９％超）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２２７／２２９［Ｍ＋Ｈ］＋。
調製物８
スキーム２、ステップＤ：丸底フラスコに、エチル５－クロロ－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（１．３ｇ、５．１ｍｍｏｌ）、６－エトキシピリジン－２－アミン（８５０ｍｇ、６．２ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（１．１ｇ、１１ｍｍｏｌ）、２－メチルブタン－２－オール（１．４ｍＬ）、および１，４－ジオキサン（１４ｍＬ）を充填する。フラスコに、窒素を５分間流す。ＢＩＮＡＰ（０．２３ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）および塩化アリルパラジウム（ＩＩ）二量体（９２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１３０°Ｃに加熱する。１時間後、混合物を、周囲温度まで冷却し、水（３０ｍＬ）で希釈する。混合物を珪藻土を通して濾過し、濾液をＭｅＯＨ（４００ｍＬ）およびＤＣＭ（１００ｍＬ）に懸濁する。ＳｉｌｉａＭｅｔＳ（登録商標）ＤＭＴ樹脂（ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ Ｒ７９０３０Ｂ）を添加し、混合物を８０°Ｃで４時間加熱する。混合物を、周囲温度まで冷却し、濾過し、周囲温度で真空下で乾燥して、表題化合物（１．７ｇ、９３％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３５７（Ｍ＋Ｈ）。
調製物９
スキーム２、ステップＥ：丸底フラスコに、水（１１ｍＬ）に溶解したエチル５－［（６－エトキシ－２－ピリジル）アミノ］－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（１．７ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（１８ｍＬ）、ＴＨＦ（５ｍＬ）、およびＬｉＯＨ（０．５ｇ、２０ｍｍｏｌ）を充填した。混合物を、窒素下で４時間加熱還流し、次いで周囲温度まで冷却させる。ｐＨを、５Ｎ ＨＣｌの添加によって約４に調整する。３０分間撹拌した後、得られた固体を、濾過し、氷冷水（２０ｍＬ）で洗浄し、真空下、周囲温度で乾燥させて、表題化合物（１．４ｇ、８９％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３２９．０（Ｍ＋Ｈ）。
調製物１０
スキーム３、ステップＢ：ＢＯＰ（７．２ｇ、１６ｍｍｏｌ）を、５－クロロ－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸（２．７５ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）、（３Ｒ）－３－アミノ－１－メチル－ピロリジン－２－オン；ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の４－メチルベンゼンスルホン酸（３．４８ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９ｍＬ、５１．６ｍｍｏｌ）の混合物に添加する。周囲温度で１時間撹拌後、１００ｍＬの氷水を添加し、混合物を２０分間撹拌する。得られた固体を、収集し、追加の水で洗浄し、真空下で乾燥させて、表題化合物をかすかな黄色の固体（２．５４ｇ、６５％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３２３／３２５［Ｍ＋Ｈ］＋。
調製物１１
ＴＹＫ２－ＪＨ２トレーサー結合アッセイ用のトレーサーの調製
（２Ｅ）－２－［（２Ｅ、４Ｅ）－５－［３－［６－［４－［４－［［５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－６－（メチルカルバモイル）－１，２，４－トリアジン－３－イル］アミノ］ピラゾール－１－イル］－１－ピペリジル］－６－オキソ－ヘキシル］－３－メチル－５－スルホナト－１－（３－スルホナトプロピル）インドール－１－イウム－２－イル］ペンタ－２，４－ジエニリデン］－３，３－ジメチル－１－（３－スルホナトプロピル）インドリン－５－スルホネート；トリエチルアンモニウム
２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリン（５．９５ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２０ｍＬ）中のエチル５－クロロ－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレート（６．８ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を周囲温度で撹拌する。９０分後、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌する。得られた固体を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄する。固体を、ＤＣＭと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配する。有機層を、飽和塩化ナトリウム水溶液でさらに洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、エチル５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレートをかすかな黄色の固体（１０．１２ｇ、８２％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４０２．２（Ｍ＋Ｈ）。
ＴＹＫ２－ＪＨ２トレーサー結合アッセイ用のトレーサーの調製
（２Ｅ）－２－［（２Ｅ、４Ｅ）－５－［３－［６－［４－［４－［［５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－６－（メチルカルバモイル）－１，２，４－トリアジン－３－イル］アミノ］ピラゾール－１－イル］－１－ピペリジル］－６－オキソ－ヘキシル］－３－メチル－５－スルホナト－１－（３－スルホナトプロピル）インドール－１－イウム－２－イル］ペンタ－２，４－ジエニリデン］－３，３－ジメチル－１－（３－スルホナトプロピル）インドリン－５－スルホネート；トリエチルアンモニウム
２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリン（５．９５ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２０ｍＬ）中のエチル５－クロロ－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレート（６．８ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を周囲温度で撹拌する。９０分後、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌する。得られた固体を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄する。固体を、ＤＣＭと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配する。有機層を、飽和塩化ナトリウム水溶液でさらに洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、エチル５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレートをかすかな黄色の固体（１０．１２ｇ、８２％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４０２．２（Ｍ＋Ｈ）。
エチル５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレート（１０．１２ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ中（７５ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）の２Ｍ ＭｅＮＨ２中で、周囲温度で４時間撹拌する。ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌する。得られた固体を収集し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－Ｎ－メチル－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキサミドを淡黄色の固体として得る（８．０３ｇ、７８％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３８７．０（Ｍ＋Ｈ）。
ｍ－クロロペルオキシ安息香酸（７０３ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１２．５ｍＬ）中の５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－Ｎ－メチル－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキサミド（５００ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）の懸濁液に０℃で添加し、周囲温度まで温める。３０分後、ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－アミノピラゾール－１－イル）ピペリジン－１－カルボキシレート（５２０ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で撹拌する。２４時間後、混合物を、ＤＣＭと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配する。有機層を、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られた固体をジエチルエーテルで数回粉砕し、真空下で乾燥させて、ｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－６－（メチルカルバモイル）－１，２，４－トリアジン－３－イル］アミノ］ピラゾール－１－イル］ピペリジン－１－カルボキシレートを８６％純粋な黄色の固体として得る（７２０ｍｇ、８１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ６０５．２（Ｍ＋Ｈ）。
ジオキサン（２．５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）中の４Ｎ ＨＣｌを、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－６－（メチルカルバモイル）－１，２，４－トリアジン－３－イル］アミノ］ピラゾール－１－イル］ピペリジン－１－カルボキシレート（７２０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加し、周囲温度で撹拌する。７２時間後、混合物を蒸発させる。得られた物質をＤＣＭ（１００ｍＬ）と水（２０ｍＬ）とに分配する。水層のｐＨを、１Ｎ ＮａＯＨを添加して８超に調整し、３：１のクロロホルム／イソプロパノールで抽出する。有機層を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られた固体をジエチルエーテルで粉砕し、次いで真空下で乾燥させて、５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－Ｎ－メチル－３－［［１－（４－ピペリジル）ピラゾール－４－イル］アミノ］－１，２，４－トリアジン－６－カルボキサミドを８６％純粋な黄色の固体として得る（５８５ｍｇ、９７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５０５．０（Ｍ＋Ｈ）。
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の（２Ｅ）－２－［（２Ｅ、４Ｅ）－５－［３－［６－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ－６－オキソ－ヘキシル］－３－メチル－５－スルホナト－１－（３－スルホナトプロピル）インドール－１－イウム－２－イル］ペンタ－２，４－ジエニリデン］－３，３－ジメチル－１－（３－スルホナトプロピル）インドリン－５－スルホンナートトリエチルアンモニウム（１０ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－Ｎ－メチル－３－［［１－（４－ピペリジル）ピラゾール－４－イル］アミノ］－１，２，４－トリアジン－６－カルボキサミド（４．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．００２ｍＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応バイアルを、光から保護するためにアルミホイルで包み、周囲温度で一晩撹拌した。得られた残留物を、水中の０～２０％のアセトニトリルで溶出する分取ＨＰＬＣ（Ｋｉｎｅｔｉｘ ＥＶＯ Ｃ１８ ３０ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）によって精製して、表題化合物を明るい青色の固体（８．５ｍｇ、６５％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ６７３．４（Ｍ＋Ｈ）。
実施例１
スキーム２、ステップＦ：５－［（６－エトキシ－２－ピリジル）アミノ］－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸（１．４ｇ、４．３ｍｍｏｌ）、（３Ｒ）－３－アミノ－１－メチル－ピロリジン－２－オン；ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の４－メチルベンゼンスルホン酸（１．２ｇ、４．１ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＩＥＡ（３ｍｌ、１７ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（２．５ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を添加した。周囲温度で１８時間撹拌後、反応混合物を、３：１のＤＣＭおよびＭｅＯＨと２Ｎ ＮａＯＨ水溶液とに分配する。水層を、３：１のＤＣＭおよびＭｅＯＨで２回抽出する。有機層を、合わせ、５Ｎ ＮａＯＨ水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を逆相クロマトグラフィーを介して精製して、表題化合物（０．９４ｇ、５２％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４２５．２（Ｍ＋Ｈ）。
実施例２
スキーム３、ステップＣ：２０ｍＬバイアルに、５－クロロ－７－（メチルアミノ）－Ｎ－［（３Ｒ）－１－メチル－２－オキソ－ピロリジン－３－イル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド（１ｇ、３．１ｍｍｏｌ）、４，６－ジメチルピリジン－２－アミン（６６０ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）、および酢酸カリウム（７７０ｍｇ、７．８ｍｍｏｌ）を充填した。バイアルを、排気し、窒素で３回充填し戻す（ｂａｃｋ－ｆｉｌｌ）。１，４－ジオキサン（１１ｍＬ）、（Ｒ）－ＢＩＮＡＰ（１６０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）および塩化アリルパラジウム（ＩＩ）二量体（６６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、バイアルに、窒素を流し、１３０°Ｃに加熱する。約３０分後、混合物を、周囲温度まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）および水（５０ｍＬ）の混合物に注ぐ。約１０分間激しく撹拌した後、混合物を濾過する。固体を、ＥｔＯＡｃおよび水で連続的に洗浄し、次いで真空下で乾燥させて、粗ベージュ色の固体を得る。固体を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）、ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）、およびＭｅＯＨ（５ｍＬ）の混合物に懸濁する。１ｇのＳｉｌｉａＭｅｔＳ（登録商標）ＤＭＴ樹脂（ＳｉｌｉＣｙｃｌｅ Ｒ７９０３０Ｂ）を添加し、混合物を８０℃に設定した加熱ブロック内で一晩撹拌する。樹脂を、濾過し、追加のＤＭＦおよびＤＭＳＯで洗浄する。濾液を高真空下で濃縮して、表題化合物をオフホワイトの固体（７２５ｍｇ、５７％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４０９［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＴＹＫ２－ＪＨ２トレーサー結合アッセイ
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを有するヒトＪＡＫ（細胞質チロシンキナーゼのＪａｎｕｓファミリー）ファミリーチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿００３３２２）のシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）を、バキュロウイルス中で発現させ、ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と好適なＴＹＫ２ ＪＨ２バインダーとのコンジュゲートである調製物１１で調製した化合物を、本明細書では「トレーサー」と呼ぶ。実施例１および実施例２の化合物の３倍、１０点段階希釈を１００％ＤＭＳＯ、５０ｎＬ／ウェルで調製し、音響液体処理を使用して、Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ－３８４Ｆホワイトプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００８２８０）に移す。阻害率を決定するために使用した対照ウェルには、１００％ＤＭＳＯ（５０ｎＬ）と、トレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）（最小、低ＦＲＥＴ）または希釈ＴＹＫ２－ＪＨ２酵素（最終濃度０．２００ｎＭ）およびトレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）（最大、高ＦＲＥＴ）のいずれかのアッセイバッファーが含まれていた。
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを有するヒトＪＡＫ（細胞質チロシンキナーゼのＪａｎｕｓファミリー）ファミリーチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿００３３２２）のシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）を、バキュロウイルス中で発現させ、ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と好適なＴＹＫ２ ＪＨ２バインダーとのコンジュゲートである調製物１１で調製した化合物を、本明細書では「トレーサー」と呼ぶ。実施例１および実施例２の化合物の３倍、１０点段階希釈を１００％ＤＭＳＯ、５０ｎＬ／ウェルで調製し、音響液体処理を使用して、Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ－３８４Ｆホワイトプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００８２８０）に移す。阻害率を決定するために使用した対照ウェルには、１００％ＤＭＳＯ（５０ｎＬ）と、トレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）（最小、低ＦＲＥＴ）または希釈ＴＹＫ２－ＪＨ２酵素（最終濃度０．２００ｎＭ）およびトレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）（最大、高ＦＲＥＴ）のいずれかのアッセイバッファーが含まれていた。
アッセイバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四酢酸、０．０１％のＢｒｉｊ－３５およびＭｉｌｌｉ－Ｑ）水中の５．０μＬのＨｉｓタグ付きＴＹＫ２－ＪＨ２（０．４０２ｎＭ）およびＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ Ｅｕ－抗ＨＩＳ抗体（４．０２ｎＭ、ＬｉｆｅＴｅｃｈ、ＰＶ５５９７）を５０ｎＬの希釈化合物を含むＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ－３８４プレートおよび対照ウェルに添加する。アッセイ緩衝液中の５．０μＬのトレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）を、プレートに添加し、周囲温度で３０分間平衡化させる。３０分後、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎで、励起（３４０ｎｍ）、トレーサー発光（６６５ｎｍ）、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ Ｅｕ－抗Ｈｉｓ抗体発光（６１５ｎｍ）の設定で計数する。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ Ｅｕ－抗Ｈｉｓ抗体発光（６１５ｎｍ）に対するトレーサー発光（６６５ｎｍ）の比率を決定する。各阻害剤濃度での阻害パーセント比を、最大および最小の対照ウェルを使用して計算し、ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）の４パラメータ非線形ロジスティック方程式に適合させて、実施例１の化合物について０．２５４ｎＭ未満（ｎ＝１）、かつ実施例２の化合物について０．２５４ｎＭ未満（ｎ＝１）のＩＣ５０を得る。この結果は、実施例１および実施例２の化合物がインビトロでＴＹＫ２－ＪＨ２シュードキナーゼドメインに結合することを実証する。
ＴＦ１細胞におけるｐＳＴＡＴ１を通じたＩＦＮαシグナル伝達の阻害
ＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＬ－２００３）を、１０％透析ＦＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン、および２ｎｇ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を補充したＲＰＭＩ １６４０（ＧＩＢＣＯ）で培養する。ＴＦ１細胞（ウェルあたり１００Ｋ）を、無血清ＤＭＥＭ中、９６ウェルのポリ－Ｄ－リジン被覆プレートに播種し、３７℃で、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートする。実施例１を、ＤＭＳＯで段階希釈し、細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮα２で３７°Ｃで２０分間刺激する。培地を除去した後、細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃７８４４１）を含有するバッファー中、周囲温度で３０分間溶解する。ｐ－Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）の量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）アッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬＳＵ－ＰＳＴ１－Ａ５０Ｋ）を使用して、ベンダーの推奨プロトコルに従って６１５ｎｍでの発光として定量化する。各阻害剤濃度のパーセント阻害を、計算し、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）を使用して４パラメータ非線形ロジスティック方程式に適合させて、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を有するＧｅｏＭｅｔｒｉｃ平均として表された、実施例１の化合物について０．０３８μＭ（±０．００４μＭ、ｎ＝２）かつ実施例２の化合物について０．０８４μＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０を得る。この結果は、実施例１および実施例２の化合物が、ＴＦ１細胞におけるｐＳＴＡＴ１を通じたＩＦＮαシグナル伝達の阻害剤であることを実証する。
ＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＬ－２００３）を、１０％透析ＦＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン、および２ｎｇ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を補充したＲＰＭＩ １６４０（ＧＩＢＣＯ）で培養する。ＴＦ１細胞（ウェルあたり１００Ｋ）を、無血清ＤＭＥＭ中、９６ウェルのポリ－Ｄ－リジン被覆プレートに播種し、３７℃で、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートする。実施例１を、ＤＭＳＯで段階希釈し、細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮα２で３７°Ｃで２０分間刺激する。培地を除去した後、細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃７８４４１）を含有するバッファー中、周囲温度で３０分間溶解する。ｐ－Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）の量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）アッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬＳＵ－ＰＳＴ１－Ａ５０Ｋ）を使用して、ベンダーの推奨プロトコルに従って６１５ｎｍでの発光として定量化する。各阻害剤濃度のパーセント阻害を、計算し、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）を使用して４パラメータ非線形ロジスティック方程式に適合させて、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を有するＧｅｏＭｅｔｒｉｃ平均として表された、実施例１の化合物について０．０３８μＭ（±０．００４μＭ、ｎ＝２）かつ実施例２の化合物について０．０８４μＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０を得る。この結果は、実施例１および実施例２の化合物が、ＴＦ１細胞におけるｐＳＴＡＴ１を通じたＩＦＮαシグナル伝達の阻害剤であることを実証する。
ＩＬ２３ ｐＳＴＡＴ３ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ
内因性ＩＬ２３受容体を発現するＩＬ２依存性Ｋｉｔ２２５細胞（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）に、ホタルルシフェラーゼに連結されたＬｅｎｔｉ ＳＴＡＴ３ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＬＳ－６０２８Ｌ）を安定的に形質導入させる。これらの細胞を使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡテクノロジー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＬＳＵ－ＴＳＴ３－Ａ５０Ｋ）を使用するＩＬ２の存在下のＩＬ２３による誘導に続くＳＴＡＴ３リン酸化によって引き起こされた遺伝子発現を定量化することによって、ＴＹＫ２活性を監視する。細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １００８２）、１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）、２００ｎｇ／ｍＬ ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ９６２０）、および新鮮な１０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＩＬ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０２－ＩＬ－５０）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ２２４００）で培養する。
内因性ＩＬ２３受容体を発現するＩＬ２依存性Ｋｉｔ２２５細胞（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）に、ホタルルシフェラーゼに連結されたＬｅｎｔｉ ＳＴＡＴ３ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＬＳ－６０２８Ｌ）を安定的に形質導入させる。これらの細胞を使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡテクノロジー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＬＳＵ－ＴＳＴ３－Ａ５０Ｋ）を使用するＩＬ２の存在下のＩＬ２３による誘導に続くＳＴＡＴ３リン酸化によって引き起こされた遺伝子発現を定量化することによって、ＴＹＫ２活性を監視する。細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １００８２）、１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）、２００ｎｇ／ｍＬ ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ９６２０）、および新鮮な１０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＩＬ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０２－ＩＬ－５０）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ２２４００）で培養する。
アッセイ調製のために、細胞をＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｄ５７９６）中のＢｉｏｃｏａｔブラックポリ－ｄ－リジン被覆透明底３８４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ－Ｃｏａｔ ３５－４６４０）内に３００，０００細胞／ウェルで分注し、３７℃で一晩インキュベートさせる。ＤＭＳＯに可溶化された化合物を、１：３で段階希釈し、１０点濃度応答曲線を作成する（最終ＤＭＳＯ＝０．１％）。細胞を、実施例１とともに３７℃で１時間プレインキュベートし、次いでＩＬ２３（最終２５ｎｇ／ｍＬ）で３０分間刺激する。２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、細胞ペレットを、１：１溶解バッファー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ＆Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １８６１２８１）の混合物で３０分間溶解する。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ反応を、ベンダーが推奨するプロトコルに従って実施し、ルシフェラーゼレベルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定する。相対的ＩＣ５０を、４パラメータ非線形ロジスティック方程式（ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３．０．５）を使用して計算して、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を有するＧｅｏＭｅｔｒｉｃ平均として表された、実施例１の化合物について０．０２９μＭ（±０．００７μＭ、ｎ＝２）かつ実施例２の化合物について０．０６０μＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０を得る。この結果は、実施例１および実施例２の化合物が、細胞ベースのアッセイにおいてＩＬ－２３シグナル伝達の阻害剤であることを実証する。
Claims (19)
- 以下の式：
式中、Ｒが、
- 以下の式：
- Ｒが、
- Ｒが、
- 前記化合物が、
- 以下のもの：
- 前記化合物が、
- 以下のもの：
- 患者における乾癬を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法。
- 患者における全身性エリテマトーデスを治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法。
- 患者における１型糖尿病を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法。
- 療法に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- 乾癬の治療に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- 全身性エリテマトーデスの治療に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- １型糖尿病の治療に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- 乾癬を治療するための医薬の製造のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の、使用。
- 全身性エリテマトーデスを治療するための医薬の製造のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の、使用。
- １型糖尿病を治療するための医薬の製造のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の、使用。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに含む、薬学的組成物。
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