JP2023511560A - 妊娠中の葉酸受容体自己免疫疾患及び自閉症を減少させるための葉酸受容体タンパク質を除去することによる家畜乳の再定義 - Google Patents

Abstract

神経管欠損妊娠、早産、低妊孕率、及び自閉症スペクトラム障害を含む多数の発達障害の発生率を減少させるために、集団における葉酸受容体自己免疫障害の有病率を減少させるための牛乳の再定義におけるシステム及び方法が本明細書で提供される。

Description

本発明は、葉酸受容体（ＦＲ）を含まない乳の使用に関する。乳中の葉酸受容体の存在は、葉酸感受性異常、例えば、出生時欠損（例えば、神経管欠損、すなわちＮＴＤ）、不妊症、自然流産、男性不妊症、体外受精の失敗、神経障害、神経発達遅延及び精神神経疾患、例えば、脳葉酸欠乏症又は自閉症スペクトラム障害を引き起こす可能性があるヒト葉酸受容体に対する自己抗体の形成を誘導する可能性がある。本発明は、葉酸受容体が抽出によって除去されているか、又は乳腺において葉酸受容体の発現が抑制又は阻害されている操作された動物から生成され、したがって乳への産生及び分泌を防止する乳（人間が消費するための乳を生産するために使用されるウシ、ヤギ、及び他の家畜から）の生成に関する。

本発明は、一般に、葉酸受容体を含まない（ＦＲＦ）乳及び乳製品の製造に関する。非ヒト葉酸受容体を含有する非ヒト乳又は乳製品への曝露は、母親から胎児、及び乳児の脳への葉酸（ｆｏｌａｔｅ）又は葉酸（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ）輸送を遮断することができるヒト葉酸受容体／葉酸結合タンパク質（ＦＲ／ＦＢＰ）に対する自己抗体を不正に誘発する可能性がある（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，２００４、Ｒａｍａｅｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２００５）。

葉酸は、高度に増殖性の胚性細胞によって必要とされる核酸及びアミノ酸の合成のための１炭素代謝に関与するので、正常な胚発生に不可欠である（Ｌｕｃｏｃｋ，Ｍａｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７１：１２１（２０００））。母体栄養は、葉酸摂取をＮＴＤの予防に関連付けており（Ｈｉｂｂａｒｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｅｌｌｓ，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｂｒ．Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ ７１：５２９（１９６４）、Ｈｉｂｂａｒｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｅｌｌｓ，Ｌａｎｃｅｔ ｌ，１２５４（１９６５）、Ｓｍｉｔｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ ５１：９４４（１９７６））、妊娠中の葉酸の補充は現在一般的な慣行である。しかし、ＮＴＤ又は他の出生異常の多くの症例は、臨床的葉酸欠乏症の徴候を示さなかった母親において生じ、研究者は、細胞代謝又は葉酸の取り込みを損なう他の原因を特定することにつながった。多くの遺伝的原因が同定されているが、これらの遺伝子は少数の出生時欠損を占めるにすぎない（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（Ｍａｙｗｏｏｄ），２２６：２４３（２００１））。

以前の特許公報（米国特許第７，８４６，６７２号）において、Ｅｄｗａｒｄ Ｑｕａｄｒｏｓ博士は、葉酸受容体に対する自己抗体による葉酸取り込みの干渉に起因する、不妊症、自然流産、体外受精の失敗又は出生時欠損などの葉酸感受性障害の発見を記載している。更に、彼らは、葉酸受容体に対するこれらの自己抗体を検出するためのアッセイを記載している。

その後の研究により、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の小児の７０％超がＦＲ抗体について陽性であることが明らかになった（Ｆｒｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．１８：３６９－３８１，（２０１３））。これらの抗体は、脳への葉酸輸送を遮断することができる。特に、本発明者らは、これらのＦＲ抗体が牛乳（ウシ）由来のＦＲと強く反応することを示す（Ｒａｍａｅｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２００９）。牛乳（ウシ）は、相当量（１～３ｕｇ／ｍｌ）の葉酸受容体α［ＦＲ］を含有し、これは葉酸輸送に関与する葉酸結合タンパク質［ＦＢＰ］の群に属する。ヒトＦＲとウシＦＲは構造的に類似しているので、分子模倣が交差反応性の原因である可能性が高い。

多くの報告は、ＡＳＤを有する小児が、ＡＳＤの影響を受けていない比較群よりも早期に人工乳で育ったか、又は離乳した可能性が高いことを示している。これは、ウシ又は非ヒト哺乳動物乳を早期に導入すると、ＡＳＤ及び関連する神経障害のリスクを増加させる可能性があることを示唆している。初期発達中に従来の牛乳を摂取することは、自閉症及び他の神経障害に寄与するか又はそれを引き起こすことに関与している。葉酸は胎児及び乳児の発達中に必須の栄養素であるため、これは葉酸代謝の破壊に関連していると考えられる。より多くの食事性葉酸を導入するために、いくつかの「葉酸が強化された」乳製品が導入されているが、それらの利点は証明されていない。

Ｅｄｗａｒｄ Ｑｕａｄｒｏｓ博士により最近発表された研究は、葉酸受容体自己抗体が、自閉症スペクトラム障害と診断された小児、その正常な兄弟姉妹及び親において一般的であるという明確な証拠を提供している（Ｒａｍａｅｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈ．１８：２７０－２７１（２０１３）、Ｆｒｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｓｙｓｃｈ．１８：３６９－３８１，（２０１３））。ＦＲ自己抗体も発現する、ＡＳＤを有する小児における高用量フォリン酸治療を使用する介入戦略は、学習障害及び行動改善に有益であることが証明されている（Ｆｒｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．２３：２４７－２５６，（２０１８））。更なる多施設臨床試験が進行中である。

高用量のフォリン酸は、認知欠損及びＦＲ抗体を有する小児に治療的処置を提供するが、ＦＲに対する自己抗体形成を引き起こす原因を除去しない。ＦＲ抗体陽性の小児では、乳除去食は抗体価を低下させる（Ｒａｍａｅｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２００９）が、この食事は非常に制限的であり、従うことが困難である。

自閉症スペクトラム障害は、コミュニケーション、社会的交流及び行動に影響を及ぼす発達障害である。ＡＳＤの症状は、通常、生後２年以降に明らかになり、以下の、他人とのコミュニケーション及び交流が困難であること、興味が制限され、反復的行動をすること、学校、仕事及び他の生活領域で適切に機能する能力を損なう症状を特徴とする。自閉症は、人々が経験する症状の種類及び重症度に大きなばらつきがあるため、「スペクトラム」である。ＣＤＣは、米国の５９人に１人（約１～２％）がＡＳＤの影響を受けると推定している。中国での発生率は完全に記録されているが、１００人の小児に推定１人が影響を受ける可能性がある（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２０１８；１４（７）：７１７－７２５）。世界のほとんどの地域では、５５人に１人から２００人に１人の間で変化する。

ＡＳＤの原因は知られていないが、ＡＳＤに関連するものとして遺伝的及び環境的要因が示唆されている。

食物アレルギーは、約２００，０００人の小児の研究で４．２５％であったのに対し、ＡＳＤを有する小児では１１．２５％と、より多くみられる。自己免疫状態はまた、小児の間でより頻繁に報告されている。新たな「脆弱な腸」仮説は、腸吸収に障害のある一部の子供が、葉酸受容体に対する自己抗体を産生し、これがＡＳＤの症状をもたらす可能性があることを記載している。葉酸は、胎児及び新生児の神経発達に必須であり、葉酸代謝の破壊が、ＡＳＤ患者において近年には特定されている。

通常の丈夫な腸を図１Ａに示す。タンパク質及び単糖類は小腸で健全に消化され、栄養素を吸収されるようになる。繊維及び未消化タンパク質は細菌によって消費される。血液は腸の管腔と相互作用せず、免疫細胞と抗原性食物分子との間の相互作用を妨げる。

脆弱な腸を図１Ｂに示す。ＡＳＤを有する小児は、消化能力の低下を示す。腸内層の炎症及び劣化は、タンパク質及び糖の適切な消化を妨げる。炎症は、血液と腸との直接接触をもたらし、腸内の未消化タンパク質を血流に直接通過させ、又はＧＡＬＴ（腸関連リンパ管）及びＭＡＬＴ（粘膜関連リンパ管）に曝露することを可能にする。これにより、免疫組織内の抗原タンパク質への望ましくない曝露が可能になり、免疫応答が引き起こされる。

脆弱な腸は、牛乳中に分泌される葉酸受容体（１～２ｕｇ／ｍｌ）を含む牛乳タンパク質に対する自己抗体をもたらす可能性がある。ＡＳＤを有する小児から単離された抗葉酸受容体抗体は、牛乳中のウシ葉酸受容体と強く交差反応することが示されている。抗体濃度は、小児を乳除去食にすると有意に低下する。乳除去食は、遵守することが難しい。

葉酸は、脳発達中の多くのプロセスに必要とされる。葉酸代謝は図２に示されており、ＡＳＤ患者では異常であることが多い。ＡＳＤを有する小児の７０％は、葉酸受容体を遮断し、細胞における葉酸取り込みを妨げる自己抗体を有する（Ｆｒｙｅ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈ，２０１３）。妊娠中のラット及び離乳期の仔ラットにおいて、葉酸受容体抗体に曝露させると、重度の行動障害を引き起こす（Ｓｅｑｕｉｅｒａ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｌｏｓ ｏｎｅ，２０１６）。

葉酸欠乏症は、葉酸受容体とは無関係に脈絡叢を介して脳に入ることができる葉酸の還元型であるフォリン酸で補正することができる。葉酸欠乏症は、損傷を修復しないが脳葉酸を回復させてＡＳＤの症状を治療することができる高用量のフォリン酸を用いて矯正することができる。葉酸欠乏症は、脳の葉酸を回復させることによって矯正することができ、これは、ＡＳＤ小児において言語及び社会的コミュニケーションの臨床的改善をもたらす。

本発明は、葉酸受容体自己免疫障害の原因を解決し、その病理学的結果を防止するように設計される。

哺乳動物供給源から葉酸受容体を含まない（ＦＲＦ）乳を産生するためのアッセイ及び方法が本明細書で提供される。方法及びシステムは、以下の説明に部分的に記載されており、その説明から部分的に明らかになるか、又は方法、装置、及びシステムの実施によって学ぶことができる。本方法及びシステムの利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成される。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲に記載の方法及びシステムを限定するものではないことを理解されたい。

添付の図面において、同様の要素は、本発明のいくつかの好ましい実施形態の中で同様の参照番号によって識別される。

通常の丈夫な腸を示す模式図である。

脆弱な腸を示す模式図である。

葉酸代謝を示す模式図である。

ウシを生成し、ＡＳＤの発生率を低下させるための、葉酸受容体を含まない（ＦＲＦ）乳についてのシステムを示す模式図である。

ウシの線維芽細胞系におけるノックダウン葉酸受容体の模式図である。

トランスジェニックウシ系をもたらすための核移植の模式図である。

コホート拡大及び乳分析システムを示す模式図である。

試験するライブラリー中のｓｈＲＮＡを列挙する表である。

本発明の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて読まれる、例示的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかである。詳細な説明及び図面は、限定ではなく本発明の単なる例示であり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物によって定義される。

本明細書において、図面を参照して本発明の実施形態を説明するが、同様の符号は全体を通して同様の要素を反映する。本明細書で提示される説明で使用される用語は、単に本発明の特定の具体的な実施形態の詳細な説明と併せて利用されているため、限定的又は制限的な方法で解釈されることを意図しない。更に、本発明の実施形態は、いくつかの新規な特徴を含むことができ、そのうちの１つだけがその望ましい属性を単独で担うものでも、本明細書に記載の本発明を実施するのに不可欠なものでもない。近位及び遠位という用語は、本明細書に記載の器具の構成要素の特定の端部を示すために本明細書に適用される。近位端は、器具が使用されているときに器具の操作者により近い器具の端部を指す。遠位端は、操作者から遠く、患者及び／又はインプラントの手術領域に向かって延びる構成要素の端部を指す。

本発明を説明する文脈における「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語及び同様の指示対象の使用は、本明細書で特に指示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び／又は「含有している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、記載された特徴、整数、ステップ、動作、要素、及び／又は構成要素の存在を指定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、動作、要素、構成要素、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではないことが更に理解されよう。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各別個の値を個別に参照する簡略的な方法として役立つことを意図しているにすぎず、各別個の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。「約」という単語は、数値に付随する場合、記載された数値から１０％以下の偏差を示すと解釈されるべきである。本明細書で提供されるありとあらゆる例、又は例示的な言語（「例えば（ｅ．ｇ．）」又は「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、特に請求されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、特許請求されていない要素を本発明の実施に必須であると示すと解釈されるべきではない。

「一実施形態」、「実施形態」、「例示的な実施形態」、「様々な実施形態」などへの言及は、そのように記載された本発明の実施形態が特定の特徴、構造、又は特性を含むことができるが、全ての実施形態が必ずしも特定の特徴、構造、又は特性を含むとは限らないことを示すことができる。更に、「一実施形態では」又は「例示的な実施形態では」という語句の繰り返しの使用は、同じ実施形態を指す場合もあるが、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。

本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための様式、手段、技術及び手順を指し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者に知られているか、又は当業者によって既知の様式、手段、技術及び手順から容易に開発される様式、手段、技術及び手順を含むが、これらに限定されない。特に明記しない限り、本明細書に記載の任意の方法又は態様が、そのステップが特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、請求項又は説明において、ステップが特定の順序に限定されるべきであることを具体的に述べていない場合、いかなる点においても順序が推測されることは決して意図されていない。これは、ステップ又は動作フローの配置に関する論理の事項、文法的な構成又は句読点から導かれる平易な意味、又は本明細書に記載されている態様の数又は種類を含む、解釈のための任意の可能な明示的でない根拠に当てはまる。

本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。

実施形態は、既存の乳又は乳製品から葉酸受容体を除去するように設計されたアッセイである。葉酸受容体を含まない（「ＦＲＦ」）乳は、本発明の一部を形成するＦＲＦ乳から加工された製品を生成するために更に使用することができ、これは、バルク乳（すなわち、２匹以上の動物からの乳）の供給源に由来し、バルク乳、チーズを作るために使用されるバルク乳であって、乳が低温殺菌されているかどうか、滅菌されているかどうか、又は他の方法で処理されているかどうかにかかわらず、チーズを作る前に微生物集団が低減されたバルク乳、粉乳、乳固形分、カゼイン、カゼイナート、及びカゼイン加水分解物、低温殺菌乳、滅菌乳、精密ろ過乳を含む保存乳、ＵＨＴ乳、低脂肪乳、改良又は強化乳、アイスクリーム又は他の冷凍乳製品ベースの菓子、ヨーグルト又はクワルクなどの発酵乳製品、全脂肪チーズ、部分的に脱脂された加工チーズ及び無脂肪の加工チーズを含むチーズ、乳清、乳製品の添加によって強化されたスープなどの食品、潜在的にアレルゲン分子が除去された乳、チョコレート製品などの菓子、リン酸及び／又はクエン酸を添加した製品を含む炭酸乳製品、完全に脱脂した、部分的に脱脂した、又は無脂肪乳を複数の追加のサプリメントと共に含むことができる乳児用製剤、液体又は粉末飲料混合物、並びにバターミルク及びバターミルク粉末が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のこの態様では、任意の乳製品からＦＲを除去するように設計されたアッセイである。この方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、グリコホスファートイノシトール（ＧＰＩ）捕捉カラムアフィニティークロマトグラフィー、葉酸受容体結合抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＦＲ結合抗体に結合したプロテアーゼを使用した葉酸受容体の特異的消化、ＦＲを除去するための乳製品の分画、及び乳中の葉酸受容体に特異的に結合するリガンドを使用したアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。

サイズ排除クロマトグラフィー又は乳タンパク質の分画：ＦＲタンパク質の３８ｋＤａサイズは、３８ｋＤａのＦＲタンパク質を選択的に排除するか又は３８ｋＤａのＦＲタンパク質を含む膜又は複数の膜のいずれかを介した乳の限外濾過を可能にし、したがってＦＲタンパク質の乳を枯渇させることができる。この同じ原理を適用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ１００又はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００などのサイズ排除及びサイズ包含カラムを使用してＦＲの乳を枯渇させることができる。

葉酸受容体結合抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー：ウシ、ヤギ又は他の動物の葉酸受容体のいずれかに対して生成された抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）を、アガロース又はセファロースなどの不活性固体マトリックス上に固定化し、乳と混合して、乳からＦＲ抗原を捕捉し、したがって乳からＦＲ抗原を選択的に除去することができる。ＬＳＢｉｏ製のウシＦＯＬＲ１／葉酸受容体αに対するヤギポリクローナル抗体をカラムクロマトグラフィーにコンジュゲートすることができる。

本明細書で使用される「葉酸受容体」、「ＦＲ」、又は「ＦＯＬＲ１」という用語は、特に明記しない限り、任意の天然のウシ又はヤギＦＯＬＲ１を指す。「ＦＲ」という用語は、「全長」の未処理ＦＲ、並びに細胞内での処理から生じるＦＲの任意の形態を包含する。この用語はまた、ＦＲの天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体、対立遺伝子変異体及びアイソフォームを包含する。本明細書に記載されるＦＲタンパク質は、様々な供給源、例えばヒト組織型から、又は別の供給源から単離することができるか、又は組換え方法若しくは合成方法によって調製することができる。ウシ、ラット、ヤギ及びヒト由来の葉酸受容体のタンパク質配列及びＢｌａｓｔ識別番号を標的とする抗体を以下に示す。

ヒト葉酸受容体α－ホモサピエンス、２５７ａａ、配列番号１

Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤ：ＦＯＬＲ１－２０３ ＥＮＳＴ０００００３９３６７９．５

ラット葉酸受容体α－ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、２５５ａａ、配列番号２

Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤ：Ｆｏｌｒ１－２０２ ＥＮＳＲＮＯＴ００００００７９６７５．１

ヤギ葉酸受容体α－ヤギ（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）、２５１ａａ、配列番号３

Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤ：ＥＮＳＣＨＩＴ００００００３１５５７．１

ウシ葉酸受容体α－ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）、２５１ａａ、配列番号４

Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤ：ＦＯＬＲ１－２０１ ＥＮＳＢＴＡＴ００００００７１４３９．１

ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ

ヒト葉酸受容体－ホモサピエンス、タンパク質配列－２５７ａａ、配列番号５

Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＢ０５８２７

ラットＦｏｌｒ １タンパク質、部分－ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、タンパク質配列－２０３ａａ、配列番号６

ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＡＩ５７８１２

ヤギ葉酸受容体１、部分－ヤギ（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）、タンパク質配列－６３ａａ、配列番号７

ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＧＡ９５９８０

ヤギＦＲのタンパク質配列を標的とする抗体としては、配列番号８：ｍｐｗｋｌｔｐｌｌｌ ｆｌｇｗｍｔｓｖｃｎ ａｒｔｒｔｄｌｌｎｖ ｃｍｄａｋｈｈｋａｅ ｐｇｐｅｄｋｌｈｎｑ ｃｔｐｗｋｋｎａｃｃ ｓａｒｖｓｑｅｌｈｋ ｄｔｓｓｌｙｎｆｔｗ ｄｈｃｇｋｍｅｐａｃ ｑｒｈｆｉｑｄｎｃｌ ｙｅｃｓｐｎｌｇｐｗ ｉｑｅｖｎｑｋｗｒｋ ｅｒｆｌｎｖｐｌｃｋ ｅｄｃｑｓｗｗｅｄｃ ｒｔｓｈｔｃｋｓｎｗ ｈｒｇｗｄｗｔｓｇｓ ｎｋｃｐｎｇｔｔｃｒ ｔｆｅａｙｆｐｔｐａ ａｌｃｅｇｌｗｓｈｓ ｙｋｌｓｎｙｓｒｇｓ ｇｒｃｉｑｍｗｆｄｐ ａｌｇｎｐｎｅｅｖａ ｒｆｙａｓａｌｔａｅ ａｗｐｑｇｉｒｐｌｓ ｌｃｌａｌｍｌｓｌｗ ｌｈｄを標的とする抗体が挙げられる。

「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又はこれらの組み合わせなどの標的を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片など）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２つのインタクトな抗体から生成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ウシ抗体、ヤギ抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び抗体が所望の生物学的活性を示す限りにおいて抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要クラスであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかであってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる公知のサブユニット構造及び三次元構成を有する。抗体は、裸であってもよく、又は毒素、放射性同位元素などの他の分子に結合体化されてもよい。

「ＦＲに結合する抗体」という用語は、抗体がＦＲを標的とする際の濾過剤又は結合剤として有用であるように十分な親和性でＦＲに結合することができる抗体を指す。無関係な非ＦＲタンパク質への抗ＦＲ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定した場合に、ＦＲへの抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＦＲに結合する抗体が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。

「モノクローナル抗体」とは、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均一な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクト及び全長モノクローナル抗体の両方、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。更に、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない任意の数の方法で生成されたそのような抗体を指す。

ＦＲ結合抗体に結合したプロテアーゼを用いた葉酸受容体の特異的消化。トリプシン又はカルボキシペプチダーゼなどのプロテアーゼをＦＲ特異的抗体に結合させ、それを使用してＦＲタンパク質を選択的に消化し、それによってＦＲタンパク質の抗原性を低下させることも可能であり得る。

本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」という用語は、他のタンパク質を分解する能力を有する酵素タンパク質を指す。プロテアーゼは、タンパク質を形成するペプチド又はポリペプチド鎖中のアミノ酸を互いに連結するペプチド結合の加水分解によってタンパク質異化を開始する「タンパク質分解」を行う能力を有する。このタンパク質消化酵素としてのプロテアーゼの活性を「タンパク質分解活性」という。タンパク質分解活性を測定するための多くの公知の手順が存在する（例えば、Ｋａｌｉｓｚ，’’Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，’’Ｉｎ：Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（ｅｄ．），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８８））。例えば、タンパク質分解活性は、市販の基質を加水分解するそれぞれのプロテアーゼの能力を分析する比較アッセイによって確認することができる。プロテアーゼ又はタンパク質分解活性の分析に有用な例示的な基質としては、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ Ｃ－９８０１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃ－９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ Ｅ－１６２５）及びウシケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ９０２１１１）が挙げられるが、これら限定されない。これらの基質を利用する比色アッセイは、当技術分野で公知である（例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，３７６，４５０号）。ｐＮＡアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：３１６－３２０［１９７９］）はまた、勾配溶出中に収集された画分の活性酵素濃度を決定するのにも使用される。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質、スクシニル－アラニン－アラニン－プロリン－フェニルアラニン－ｐ－ニトロアニリド（ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ）を加水分解する際にｐ－ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応による黄色の生成速度は、分光光度計で４１０ｎｍで測定され、活性酵素濃度に比例する。更に、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度測定を使用して、総タンパク質濃度を決定することができる。活性酵素／総タンパク質比により、酵素純度が得られる。

乳中の葉酸受容体に特異的に結合するリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィー。葉酸などのリガンドは、ＦＲに高親和性（Ｋｄ約１００ｐＭ）で結合し、したがって葉酸をアガロース又はセファロースなどの不活性マトリックスに固定化し、アポ受容体を含有する乳と混合することにより、受容体が葉酸に結合することが可能になり、次いで乳から除去することができる。

本明細書で使用される「葉酸」は、葉酸、葉酸類似体、又は別の葉酸受容体結合分子を意味する。使用することができる葉酸の類似体としては、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸、並びにテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、並びにそれらのデアザ及びジデアザ類似体などの葉酸受容体結合プテリジンが挙げられる。「デアザ」及び「ジデアザ」類似体という用語は、天然に存在する葉酸構造において１個又は２個の窒素原子で置換された炭素原子を有する、当技術分野で認識されている類似体を指す。例えば、デアザ類似体としては、１－デアザ、３－デアザ、５－デアザ、８－デアザ、１０－デアザ類似体が挙げられる。ジデアザ類似体としては、例えば、１，５－ジデアザ、５，１０－ジデアザ、８，１０－ジデアザ、５，８－ジデアザ類似体が挙げられる。前述の葉酸類似体は、従来、葉酸受容体に結合するそれらの能力を反映して「葉酸」と呼ばれている。他の葉酸受容体結合類似体としては、アミノプテリン、アメトプテリン（メトトレキサート）、Ｎ１０－メチル葉酸、２－デアミノ－ヒドロキシ葉酸、１－デアザメトプテリン又は３－デアザメトプテリンなどのデアザ類似体、及び３’，５’－ジクロロ－４－アミノ－４－デオキシ－Ｎ１０－メチルプテロイルグルタミン酸（ジクロロメトトレキサート）が挙げられる。

「高親和性」は、約Ｋｄ＝１０^－１０Ｍであってもよい。

ＦＲＦ乳の検証：

１．機能的ＦＲについての３Ｈ葉酸結合アッセイ。

乳試料を放射性葉酸と共に３０分間インキュベートし、続いてデキストランコーティング炭を使用して遊離葉酸からタンパク質結合葉酸を分離する。この方法は、結合した葉酸のピコグラムを検出するのに十分な感度を有し、乳中の機能的葉酸受容体の尺度を提供する。

２．何らかの非機能性ＦＲ抗原が乳中に存在する可能性がある。これは、ＦＲ抗原の検出のための逐次ＥＬＩＳＡベースのアッセイによって測定される。

このアッセイのために、ＥＬＩＳＡプレートのセットをＦＲ抗体でコーティングする。１セットを既知量のＦＲ抗原とインキュベートして、標準曲線を生成する。別のセットを様々な量のＦＲＦ乳と共にインキュベートする。この最初のインキュベーションは、数時間～一晩であってもよい。両方のセットに、３Ｈ葉酸で飽和したＦＲ抗原を添加し、２０分間インキュベートする。アッセイの原理は、最初のインキュベーションにおける抗原の濃度が増加するにつれて、プレート中の抗体への３Ｈ葉酸の結合が少なくなることに基づいている。ＦＲＦ乳中の抗原も同じ原理に従い、抗原の非機能性断片が依然としてＦＲＦ乳中に存在するかどうかを決定することを可能にする。

３．ＦＲ抗原を検出するための乳のウエスタンブロット。

ＦＲＦ乳の検証：

ＦＲを含まない乳の検証は以下の通りである。

１．機能的ＦＲについての３Ｈ葉酸結合アッセイ。

乳試料を放射性葉酸と共に３０分間インキュベートし、続いてデキストランコーティング炭を使用して遊離葉酸からタンパク質結合葉酸を分離する。この方法は、結合した葉酸のピコグラムを検出するのに十分な感度を有し、乳中の機能的葉酸受容体の尺度を提供する。

２．一部の非機能性ＦＲ抗原が乳中に存在してもよい。これは、ＦＲ抗原の検出のための逐次ＥＬＩＳＡベースのアッセイによって測定される。

このアッセイのために、ＥＬＩＳＡプレートのセットをＦＲ抗体でコーティングする。１セットを既知量のＦＲ抗原とインキュベートして、標準曲線を生成する。別のセットを様々な量のＦＲＦ乳と共にインキュベートする。この最初のインキュベーションは、約数時間～約２４時間であってもよい。両方のセットに、３Ｈ葉酸で飽和したＦＲ抗原を添加し、約２０分間インキュベートする。アッセイの原理は、最初のインキュベーションにおける抗原の濃度が増加するにつれて、プレート中の抗体への３Ｈ葉酸の結合が少なくなることに基づいている。ＦＲＦ乳中の抗原も同じ原理に従い、抗原の非機能性断片が依然としてＦＲＦ乳中に存在するかどうかを決定する。

３．ＦＲ抗原を検出するための乳のウエスタンブロット。

ＦＲに対する抗体を用いてウエスタンブロット分析を行う。これらの実験のために、試料を、２０ｍＭ ＤＴＴを含む又は含まない１×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料ローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でインキュベートし、１０分間煮沸し、４～１２％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させる。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ブロットを上記のようにプローブした。Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（商標）染色済みタンパク質ラダー（ＮＯＶＥＸ（登録商標））を使用してゲルを泳動する。ＦＲタンパク質を使用するゲルも、ＦＲに対する標準を確実にするために銀染色によって可視化した。

他の実施形態では、ＦＲのレベルは、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光測定、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は他のＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。

別の実施形態では、ＦＲＦ乳を産生するウシ及びヤギを操作する方法である。乳腺におけるウシ葉酸受容体の発現を特異的にサイレンシングするためにＲＮＡｉトリガーを導入する遺伝子工学的方法を使用して、これらの遺伝子改変ウシの子孫を搾乳することによってウシＦＲＦ乳製品を得ることができる。この実施形態は、ウシ葉酸受容体を標的とする複数のｓｈＲＮＡを同定すること、複数の乳房特異的ｓｈＲＮＡ発現構築物を生成すること、形質導入法を使用して複数のウシ線維芽細胞に複数の乳房特異的ｓｈＲＮＡ発現構築物を挿入すること、線維芽細胞の体細胞移入を使用してウシを生成すること、及び牛から産生された乳が葉酸受容体を枯渇していることを確認することを含むＲＮＡｉ方法を含む。別の実施形態は、ウシ葉酸受容体を標的とする複数のｓｈＲＮＡを同定すること、複数のｓｈＲＮＡ発現構築物を生成すること、ＣＲＩＳＰＲを使用してウシ線維芽細胞の乳房特異的遺伝子に複数のｓｈＲＮＡ発現構築物を挿入すること、線維芽細胞の体細胞移入を使用してウシを生成すること、及び牛から産生された乳が葉酸受容体を枯渇していることを確認することを含むＲＮＡｉ方法である。別の実施形態は、ウシ葉酸受容体を標的とする複数のｓｈＲＮＡを同定すること、複数のｓｈＲＮＡ発現構築物を生成すること、ウシ胚へのＣＲＩＳＰＲ及び前核注入を使用して複数のｓｈＲＮＡ発現構築物を挿入してトランスジェニックウシを生成すること、及びトランスジェニックウシから産生された乳が葉酸受容体を枯渇していることを確認することを含むＲＮＡｉ方法である。ヒト化方法の別の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲを使用してウシ受容体をノックアウトし、ウシ受容体をヒト葉酸受容体と置き換えること、ウシ線維芽細胞を標的とし、次いで、体細胞核移植又は前核注入を使用して複数のＣＲＩＳＰＲ試薬の複数のウシ胚へ注入すること、及びウシから産生された乳がヒト葉酸受容体を発現し、抗原性ではないことを検証することを含む。

別の実施形態では、葉酸受容体に結合した天然葉酸の除去を補償するために、葉酸の形態（これらには、葉酸、ＤＬフォリン酸、Ｌ－フォリン酸又はメチル葉酸が挙げられる）でＦＲＦ乳を補う方法である。

本技術の別の実施形態では、葉酸受容体を欠く家畜は、胚発生から成体期までの子孫の葉酸代謝及び生存率を維持するための適切な介入を伴う葉酸受容体遺伝子の組換え技術及び／又は選択的不活性化の組み合わせによって生成することができる。

一実施形態では、家畜を遺伝子操作することによって葉酸受容体を含まない乳を生成するシステム１００が図３に示されており、葉酸受容体を標的とするｓｈＲＮＡの生成１１０、ｓｈＲＮＡのヌクレオフェクション１２０、限定希釈培養１３０、陽性単一クローンの同定１４０、及びウシへの核移植の実施１５０を含む。ヒト化ウシは、ヒト母乳を反映するように生産されており、ヒトが摂取するために一般に受け入れられている。ウシが記載されているが、マウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物及びペットなどの他の哺乳動物を使用することができる。インビボで得られた又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫も包含される。

葉酸受容体を標的とするｓｈＲＮＡを、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、及びｍＲＮＡ ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１２０６５３２．１、ＧｅｎＢａｎｋ Ｇｒａｐｈｉｃｓ＞ＮＭ＿００１２０６５３２．１、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ｍＲＮＡ、配列番号９に対してマッピングする。

一実施形態では、ウシ線維芽細胞系２００におけるノックダウン葉酸受容体を図４に示す。最初のステップは、大規模なｓｈＲＮＡライブラリー２１０内のｓｈＲＮＡを同定し、次いで、センサーアッセイ２１０を介してｓｈＲＮＡを検証することであり、これは、葉酸受容体を強力かつ特異的にサイレンシングするｓｈＲＮＡを見つけることである。第３のステップは、ウシ線維芽細胞におけるｓｈＲＮＡノックダウンを確認２３０することである。第４のステップは、ｓｈＲＮＡのコンカテマーベクターをクローニング２４０することである。一実施形態では、構築物は、乳房特異的プロモータ－ｓｈＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ－ｓｈＲＮＡである。最後のステップは、コンカテマーベクター構築物をウシ線維芽細胞に挿入２４０することである。

予測ｓｈＲＮＡ２１０の効力を検証するために、機能的蛍光系レポーターアッセイ２２２を使用することができる。機能的蛍光系レポーターアッセイ２２２に必要な材料としては、ＬＰＥ－ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ標的部位を含むｇＢｌｏｃｋ、ＧＦＰベースのレポーターベクター、ＥＲＣニワトリ細胞株、Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ｅ細胞株、ヘルパープラスミドであるＶＳＶ－Ｇ、Ｇａｇ－Ｐｏｌヘルパープラスミド（Ｅｃｏ又はＡｍｐｈｏヘルパープラスミド）、トランスフェクション試薬、細胞培養試薬（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ、トリプシン）、細胞培養プレート、蛍光活性化細胞分取器（ＦＡＣＳ）チューブが挙げられるが、これらに限定されない。試験するライブラリー中のｓｈＲＮＡのリストを図７に示す。

一実施形態では、ｇＢｌｏｃｋは、約７５０ｂｐ長までの二本鎖ＤＮＡ断片（ＩＤＴを介して利用可能）であり、機能的蛍光系レポーターアッセイ２２２は、各予測ｓｈＲＮＡについて約２１ｂｐのパッセンジャー鎖を決定すること、目的の遺伝子の完全なｍＲＮＡ配列を見出し、重複する領域全体を選択する重複する標的部位について、予測されるｓｈＲＮＡのパッセンジャー鎖をマークすること、以下のモチーフＣＴＣＧＡＧ（Ｘｈｏ１）、ＧＡＡＴＴＣ（ＥｃｏＲ１）、ＡＡＴＡＡＡ及びＡＴＴＡＡＡ（ポリＡシグナル）についてリンカー配列をチェックすること、リンカーの５’末端にＸｈｏ１制限部位を、３’末端にＥｃｏＲ１制限部位を付加し、リンカーの両側に少なくとも６個のランダム塩基を付加して、最終的な「ｇＢｌｏｃｋ」を得ることを含む。

一実施形態では、ｇＢｌｏｃｋクローニングは、約３５ｎｇの消化されたｇＢｌｏｃｋ挿入物（約５００ｂｐ）＋約１５０ｎｇの消化しＣＩＰ処理したベクター（約６４４８ｂｐ）を使用してライゲーションをセットアップすることを含む。一実施形態では、安定なレポーター細胞株の生成は、以下を含む。

０日目：トランスフェクションのために１０ｃｍ培養プレート上に７０％コンフルエンシーでＰｌａｔ－ＧＰ細胞を播種する。

１日目：１０ｕｇの配列が確認されたｇＢｌｏｃｋｓ＋ＶＳＶＧを用いて、以前に播種したＰｌａｔ－ＧＰ細胞のトランスフェクションを行う（これは、安定な細胞株を「エコナイーブ」に保つためであり、その結果、エコトロピックパッケージングを使用して産生されたウイルスに後で感染させて、単一コピーの組み込みを生成することができる）。

２日目：６ウェルプレートに感染のためのＥＲＣニワトリ細胞を播種する。

３日目：ウイルスを採取し、６ウェルプレート中のＥＲＣに、１ｕｇ／ｍＬのｄｏｘを用いて１：１の感染で感染させる（ｄＴｏｍａｔｏレポーターを高度に発現させる必要があるので、感染が高いほど良好である）。

３日目～５日目：２～３日インキュベートする。

６日目：ＧＦＰ陽性細胞を調べ、１０ｃｍプレート上に拡大する。

６日目～１４日目：３～４日の選択を継続する。細胞を６ウェルから１０ｃｍ培養プレートに拡大し、ｎｅｏ＋ｄｏｘ選択を継続する。この選択プロセスを更に２回繰り返す（細胞の９５％がＧＦＰ陽性になるまで）。

１５日目：１０ｃｍプレートあたり３バイアルのレポーター細胞株を凍結する。

一実施形態では、ＬＰＥ－ｓｈＲＮＡウイルス産生は、以下を含む。

０日目：Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ｅ細胞を１０ｃｍ培養プレートに播種する。トランスフェクトされるｓｈＲＮＡの数に対して７０％のコンフルエントで十分な細胞を有することを計画する。

１日目：１０ｕｇのＬＰＥ－ｓｈＲＮＡ＋Ｇａｇ－Ｐｏｌヘルパープラスミドを使用してトランスフェクションを行う。適切な対照ｓｈＲＮＡが含まれていることを確認する。

２日目：ｓｈＲＮＡ特異的標的部位を有するＥＲＣレポーター細胞株を播種する。

３日目：ウイルスを採取し、２つのウイルス希釈（１：８及び１：１５）で安定なレポーター細胞株に感染させて、単一コピー（５～２０％のｍＫａｔｅ陽性細胞）で感染を達成する。細胞を２日間インキュベートする。

５日目：Ｇｕａｖａ装置を使用して感染率（％ｍＫａｔｅ）を決定する。ｓｈＲＮＡ感染レポーター細胞のインキュベーションを更に４日間継続する。

８日目：ＬＳＲＩＩ装置を使用してＦＡＣＳを実施する（黄緑色レーザーが必要になる）。ＬＰＥ－Ｒｅｎ－７１３対照に対するＧＦＰのノックダウン率を決定する。

一実施形態では、ｄＴｏｍａｔｏ蛍光決定のためのフローサイトメトリーは、以下の、細胞を含有する１０ｃｍプレートに１．５ｍｌのトリプシンを添加することによって細胞をトリプシン処理すること、２分後、細胞を増殖培地に再懸濁すること、細胞を１５ｍｌのファルコンチューブに移し、３０００ｇで５分間回転させること、上清を取り除くこと、細胞を５ｍｌの冷ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄すること、細胞を３０００ｇで５分間回転させること、上清を取り除き、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁して所望の濃度の細胞にすること、ノズル／器具の目詰まりを防止するために４０μｍセルストレーナキャップを通して細胞を流すこと、及び選別するまで細胞を氷上に保つことを含む。

トランスジェニックウシを生成するための核移植

一実施形態では、トランスジェニックウシ系３００を生成するための核移植が図５に示されている。トランスジェニックウシ系３００を生成するための核移植は、乳房特異的プロモータ３１０及び遺伝子編集を使用してノックインを行うことを含む。一実施形態では、ウシ線維芽細胞３２０に乳房特異的プロモータ３１０を使用することができる。一実施形態では、トランスジェニックウシ系を生成するための核移植３３０は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を使用して乳房特異的遺伝子内にノックインすることができる。ウシ３４０を生成するために一実施形態において使用することができる体細胞核移植技術のための方法は、Ｋｗｏｎ ＤＪ，Ｌｅｅ ＹＭ，Ｈｗａｎｇ ＩＳ，Ｐａｒｋ ＣＫ，Ｙａｎｇ ＢＫ，Ｃｈｅｏｎｇ ＨＴ．Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｏｖｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｙｐｅ．Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．２０１０；１１（２）：９３－１０１に開示されている。別の方法は、ＤＮＡが前核に挿入され、ランダムに組み込まれる遺伝子導入であってもよい。乳腺において特異的にクローン３５０における葉酸受容体発現をサイレンシングすることにより、この抗原を乳から低減又は排除することができた。ウシは、高用量のフォリン酸による補充を必要とする可能性がある。

ｓｈＲＮＡ発現を泌乳乳腺に限定するために、インビトロで使用される構成的プロモータを、マウスホエイ酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモータで置き換えることができる。

参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願シリアル番号国際出願ＵＳ２０１６／０５１９９２に記載されている誘導性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＲＮＡｉ方法１００は、同じ生物系（又は生物若しくは動物モデル）において連続的に及び／又は組み合わせて使用される特異的遺伝子編集イベント（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮなどを介して）とＲＮＡ干渉との新規な組み合わせである。

ウシにおける葉酸受容体ノックダウン。

一実施形態では、ウシの葉酸受容体をノックダウンするために、Ｊａｂｅｄ Ａ，Ｗａｇｎｅｒ Ｓ，ＭｃＣｒａｃｋｅｎ Ｊ，Ｗｅｌｌｓ ＤＮ，Ｌａｉｂｌｅ Ｇ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｃａｔｔｌｅ ｄｉｒｅｃｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ β－ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｆｒｅｅ，ｈｉｇｈ－ｃａｓｅｉｎ ｍｉｌｋ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１２；１０９（４２）：１６８１１－６を使用することができる。核移植（ＮＴ）について以前に検証されたドナー細胞株（ウシ胎児線維芽細胞）をｓｈＲＮＡの発現カセットでトランスフェクトした。２つの増殖細胞クローンを核型分類し、正常な染色体数を有する必要があった。２つのトランスジェニック細胞株の導入遺伝子コピー数は、サザンブロット分析から、一方では約３０、他方では２００を超えると決定された。

細胞株３１２／３及びクローン胚のレシピエントへの移植は、妊娠をもたらすはずである。妊娠のうちの１つを終了させて胎児を回収し、再生細胞を誘導して固有の遺伝子を保存し、将来の選択肢を提供することができる。残りの妊娠のうち、生きたウシの子牛を産んだのは１頭であった。

乳を得て、葉酸受容体発現のｍｉＲＮＡ媒介ノックダウンを評価するために、本発明者らはトランスジェニックウシを泌乳にホルモン誘導した。ＳＤＳ－ゲル電気泳動及びクーマシーブルー染色による乳試料の分析により、ｓｈＲＮＡｃａｌｆからの乳試料のいずれも検出可能なレベルの葉酸受容体を含まないことが明らかになった。対照的に、葉酸受容体は、初乳並びに天然及び誘導乳試料を含む全てのＷＴ対照において主要な乳タンパク質として容易に検出可能である。トランスジェニックウシ由来の全ての乳試料が検出可能な葉酸受容体を欠いていたので、ウエスタンブロットによる葉酸受容体レベルのより高感度の分析により、非常に効果的なノックダウンを確認することができる。葉酸受容体レベルを更に定量し、葉酸受容体のノックダウンが乳タンパク質組成に及ぼす可能性がある任意の影響を決定するために、乳試料をＨＰＬＣによって全ての主要な乳タンパク質について定量することができる。クーマシーブルー染色及びウエスタン結果と一致して、ＨＰＬＣ分析は、トランスジェニックウシ乳試料中の葉酸受容体抗原を検出せず、葉酸受容体の包括的なノックダウンが確認された。葉酸受容体抗原が存在しないことは、他の乳タンパク質のレベルに対して強力な代償作用を有することができる。天然及び誘導ＷＴ試料と比較して、全ての他の主要な乳タンパク質は、トランスジェニック子ウシによって産生された乳、特にカゼインにおいて大幅に増加し得る。

コホート拡大及び乳分析

一般的に言えば、コホート拡大及び乳分析システム４００を図６に示す。

ウシコホートのサイズを増加させるためのインビボ受精を使用することができる。乳の分析組成試験は、農場近くの実験室で行われる。

動物福祉評価：中国農業大学で生成された全てのトランスジェニック動物は、健康で活発な生活を送っている。トランスジェニック動物と非トランスジェニック動物との間の物理的差異は観察されるべきではないが、いくつかの異常が存在し得る（尾部なし）。

ＦＲＦウシは乳腺でのみＲＮＡを発現し、体内に蓄積しない。ＲＮＡ動物の生体系及び健康に影響を及ぼすべきではない。動物の系からの分泌を試験する。

以前に生成されたウシからのトランスジェニック乳は、若いウシの健康及び耐病性にプラスの効果をもたらした。

実験設計：

これらの例の目的は、市販の牛乳から出発して、葉酸受容体α（ＦＲα）を欠く乳を製造することである。この目的のために、タンパク質精製技術を使用して、牛乳の基本組成を変更することなく、またいかなる外来化学物質又は物質も最終生成物に添加することなく、牛乳からＦＲαタンパク質を選択的に除去する。精漿アプローチは、乳からＦＲαを選択的に除去するためにアフィニティークロマトグラフィーの原理を使用する。

この例は、１）牛乳からＦＲを精製すること、２）ニュージーランド白ウサギを免疫することにより、乳ＦＲαに対するポリクローナル抗血清を生成すること、３）アフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＲαに対する特異的抗体を精製すること、４）不活性固体マトリックスに共有結合したＦＲα抗体を含有するアフィニティーマトリックスを調製すること、５）ＦＲα抗体アフィニティーマトリックスを使用して、Ａ２乳からＦＲαを捕捉し、それによって生成物にＦＲαタンパク質を含ませないようにすることによって達成される。

例１．牛乳からのＦＲαの精製

共有結合的に固定化された葉酸を有するアフィニティーマトリックスの調製。

最初に、５～１０個の炭素リンカー／スペーサーアームが葉酸の末端グルタミン酸残基に結合され、その後、このスペーサーアームの末端が活性化セファロース４Ｂビーズに結合される。マトリックスを広範囲に洗浄し、リガンドの漏出について試験し、次いで、ＦＲαを乳から捕捉及び精製するために使用する。最終的に免疫目的に使用することができる純粋な均質な生成物を得るために、約２～４回の精製が必要な場合がある。精製されたＦＲαをＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析によって試験して、タンパク質の純度を監視する。

約１０～２０ｍｇのタンパク質が、１０匹のウサギの免疫のために必要とされる。

例２：ニュージーランド白ウサギを免疫することによる、乳ＦＲαに対するポリクローナル抗血清の産生。

ウサギの免疫及び抗血清産生は、商業施設で行うことができる。抗血清の全ての試験及びＦＲα特異的ＩｇＧの精製を以下に示す。

４匹のウサギを精製ＦＲα抗原で免疫した。３回のブースター免疫後に試験出血を行った。抗血清による３Ｈ葉酸結合ＦＲ抗原の直接免疫沈降によって、抗体力価を決定する。

生乳（低温殺菌されていない）は、１ｍｌ当たり平均で約５～１０ｕｇのＦＲαを含有する。抗血清の各ｍｌは、以前に決定されたように、乳から約１０ｕｇのＦＲ抗原に定量的に結合して除去することができる。抗体力価に基づいて、約１ｍｌの抗血清は、１ｍｌの乳中のＦＲαタンパク質の全てを除去することができる。更なる除去が必要な場合、１ｍｌの乳あたり１ｍｌより多い又は少ない抗血清を使用することができる。

概念実証は、これらの予備実験で得られる。このために、ウサギ抗血清からの約１００～約２００ｍｇの総ＩｇＧがプロテインＡマトリックスに結合する。このプロテインＡ－ＩｇＧウサギ抗血清マトリックスを約１０ｍｌの牛乳とインキュベートし、様々な時点で乳を試験して、乳中のＦＲを全て除去するのに必要な最小時間を決定する。

この例は、ＦＲフリーミルクを含まない乳を得るための戦略が成功するかどうかを示す。

例３：アフィニティークロマトグラフィーによるＦＲαに対する特異的抗体の精製

この例では、ＦＲαに対する抗体を精製するために、約５００～約１０００ｍｇの純粋なＦＲαが必要である。

例４：不活性固体マトリックスに共有結合したＦＲα抗体を含有するアフィニティーマトリックスの調製

ＦＲα抗体は、５～１０個の炭素リンカーを介して活性化セファロースマトリックスに共有結合する。

例５：ＦＲα抗体親和性マトリックスを使用して生乳からＦＲαを捕捉し、それによって生成物ＦＲαを含まないようにする

ＦＲαが枯渇する乳はマトリックスを通過し、これにより乳中のＦＲが捕捉される。第１の通過でＦＲの全てが乳から除去されない場合、マトリックスを通る第２の通過又は第３の通過が必要である可能性がある。目標は、最終的な乳製品中のＦＲαの検出不能なレベルである。

抗体産生

モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に記載されているものなどのハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用して、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を上記のように免疫して、免疫抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して適切な骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマ細胞を形成し、次いで未融合リンパ球及び骨髄腫細胞から選択することができる。次いで、免疫沈降、免疫ブロット又はインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＭＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定されるような、選択された抗原に対して特異的に指向するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を用いたインビトロ培養、又は動物における腹水腫瘍としてインビボのいずれかで増殖させることができる。次いで、モノクローナル抗体を、上記のポリクローナル抗体について記載したように、培地又は腹水から精製することができる。

或いは、モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている組換えＤＮＡ法を使用して産生することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲなどによって成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離され、それらの配列は従来の手順を使用して決定される。次いで、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、適切な発現ベクターにクローニングし、これを、免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体が宿主細胞によって産生される。また、所望の種の組換えモノクローナル抗体又はその断片は、記載の所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７）。

モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術を使用していくつかの異なる方法で更に修飾して、代替抗体を産生することができる。いくつかの実施形態では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインは、１）例えば、キメラ抗体を産生するための抗体のそれらの領域に、又は２）融合抗体を産生するための非免疫グロブリンポリペプチドに置換することができる。いくつかの実施形態では、定常領域を切断又は除去して、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成する。可変領域の部位特異的又は高密度変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。

本発明はまた、任意の動物ＦＲを特異的に認識する二重特異性抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識し、結合することができる抗体である。異なるエピトープは、例えば、両方の抗体が葉酸受容体１並びに例えば、１）白血球上のエフェクター分子、例えばＴ細胞受容体（例えば、ＣＤ３）若しくはＦｃ受容体（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２又はＣＤ１６）又は２）以下に詳細に記載されるような細胞傷害剤を特異的に認識して結合することができるように、同じ分子内（例えば、同じ葉酸受容体１）又は異なる分子上のいずれかであってもよい。

例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、そのうちの少なくとも１つは本発明のポリペプチドに由来する。或いは、免疫グロブリン分子の抗抗原アームは、特定の抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中させるために、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）又はＩｇＧのＦｃ受容体などの白血球上のトリガー分子に結合するアームと組み合わせることができる。二重特異性抗体を使用して、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を誘導することもできる。これらの抗体は、抗原結合アームと、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ又はＴＥＴＡなどの細胞傷害剤又は放射性核種キレート剤に結合するアームとを有する。二重特異性抗体を産生するための技術は、当技術分野において一般的である（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７－５３９、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：１２０、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５－３６５９、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７－２２５、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８、及び米国特許第５，７３１，１６８号）。３つ以上の結合価を有する抗体も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。したがって、一定の実施形態では、ＦＲに対する抗体は多重特異性である。

例

前述の例は、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法がどのようにして生成及び評価されるかの完全な開示及び説明を当業者に提供するように記載されており、本発明の純粋に例示的なものであることを意図しており、本発明者らが本発明と見なす範囲を限定することを意図していない。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、同様又は類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。

数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされてきたが、いくらかの誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃又は周囲温度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。

参考文献

本明細書で言及される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示したのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を様々な実施形態に関連して説明してきたが、本発明は更なる変更が可能であることが理解されよう。本出願は、一般に本発明の原理に従って、本発明が関係する技術分野内の既知の慣習的な実施の範囲内で、本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、又は適合を網羅することを意図している。

Claims (16)

1. 葉酸受容体を含まない（ＦＲＦ）乳を製造する方法であって、サイズ排除クロマトグラフィー、グリコホスファートイノシトール（ＧＰＩ）捕捉カラムアフィニティークロマトグラフィー、葉酸受容体結合抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＦＲ結合抗体に結合したプロテアーゼを使用した葉酸受容体の特異的消化、ＦＲを除去するための乳製品の分画、又は乳中の葉酸受容体に特異的に結合するリガンドを使用したアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される方法を使用して、乳製品から葉酸受容体を除去することを含む、方法。
2. 前記サイズ排除クロマトグラフィーが、少なくとも３８ｋＤａの膜を使用して葉酸受容体を乳から濾過することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記葉酸受容体結合抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィーが、葉酸受容体に対する抗体を産生することと、固体マトリックスにおいて葉酸受容体に対する前記抗体を固定することと、乳溶液を前記固体マトリックス及び葉酸受容体に対する抗体と混合し、前記乳溶液から葉酸受容体抗原を選択的に除去することと、を含む、請求項２に記載の方法。
4. ＦＲ結合抗体に結合したプロテアーゼを使用した葉酸受容体の前記特異的消化が、プロテアーゼを葉酸受容体抗体に結合させることと、乳溶液中の葉酸受容体を選択的に消化することと、を含む、請求項３に記載の方法。
5. 乳中の葉酸受容体に特異的に結合するリガンドを使用した前記アフィニティークロマトグラフィーが、乳溶液中で葉酸受容体に高親和性で結合するために葉酸を使用することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 自閉症の割合を減少させるための葉酸受容体を含まない乳のためのシステムであって、哺乳動物において葉酸受容体を標的とするｓｈＲＮＡを生成することと、前記ｓｈＲＮＡのヌクレオフェクションを行うことと、陽性単一クローンを同定することと、葉酸受容体抗原を欠く乳を産生する哺乳動物に核移植を行うことと、を含む、システム。
7. ウシの線維芽細胞における葉酸受容体のノックダウン方法であって、ｓｈＲＮＡライブラリー中のｓｈＲＮＡを同定し、前記ｓｈＲＮＡをセンサーアッセイで検証して、葉酸受容体を強力かつ特異的にサイレンシングするｓｈＲＮＡを見出すことと、線維芽細胞における前記ｓｈＲＮＡノックダウンを確認することと、ｓｈＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのコンカテマーを含有するベクターをクローニングすることと、前記ベクターを線維芽細胞に挿入することと、を含む、方法。
8. 前記ベクターが、乳房特異的プロモータ－ｓｈＲＮＡ又は乳房特異的プロモータ－ｓｈＲＮＡ－ｓｈＲＮＡ－ｓｈＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
9. 前記ｓｈＲＮＡベクターが、乳房特異的遺伝子に特異的に挿入される、請求項７に記載の方法。
10. 前記センサーアッセイが、複数のＬＰＥ－ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ標的部位を含有するｇＢｌｏｃｋ、ＧＦＰ系レポーターベクター、ＥＲＣニワトリ細胞株、Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ｅ細胞株、ＶＳＶ－Ｇ、Ｇａｇ－Ｐｏｌヘルパープラスミド（Ｅｃｏ又はＡｍｐｈｏヘルパープラスミド）の群から選択される複数のヘルパープラスミド、複数のトランスフェクション試薬、複数の細胞培養試薬（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ、トリプシン）、複数の細胞培養プレート、複数の蛍光活性化細胞分取器（ＦＡＣＳ）チューブを含む機能的蛍光系レポーターアッセイである、請求項８に記載の方法。
11. 前記ｓｈＲＮＡライブラリーが、図７に示されるｓｈＲＮＡから選択される、請求項９に記載の方法。
12. 核移植によってトランスジェニック哺乳動物を生成することと、乳房特異的プロモータ及び遺伝子編集を使用して、葉酸受容体を強力かつ特異的にサイレンシングするｓｈＲＮＡをノックインすることと、を更に含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記乳房特異的プロモータが、ウシ線維芽細胞において使用される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記核移植が、乳房特異的遺伝子内にノックインするためにＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を使用する、請求項１２記載の方法。
15. 乳腺における葉酸受容体発現をサイレンシングし、乳中の葉酸受容体抗原を減少させることを更に含む、請求項１３に記載の方法。
16. 乳製品であって、バルク乳、チーズを作るために使用されるバルク乳であって、前記乳が低温殺菌されているかどうか、滅菌されているかどうか、又は他の方法で処理されているかどうかにかかわらず、チーズを作る前に微生物集団が低減されたバルク乳、粉乳、乳固形分、カゼイン、カゼイナート、及びカゼイン加水分解物、低温殺菌乳、滅菌乳、精密ろ過乳を含む保存乳、ＵＨＴ乳、低脂肪乳、改良又は強化乳、アイスクリーム又は他の冷凍乳製品ベースの菓子、ヨーグルト又はクワルクなどの発酵乳製品、全脂肪チーズ、部分的に脱脂された加工チーズ及び無脂肪の加工チーズを含むチーズ、乳清、乳製品の添加によって強化されたスープなどの食品、潜在的にアレルゲン分子が除去された乳、チョコレート製品などの菓子、リン酸及び／又はクエン酸を添加した製品を含む炭酸乳製品、完全に脱脂した、部分的に脱脂した、又は無脂肪乳を複数の追加のサプリメントと共に含むことができる乳児用製剤、液体又は粉末飲料混合物、並びにバターミルク及びバターミルク粉末からなる群から選択される製品を作るために使用される葉酸を含まない乳製品を含む、乳製品。

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