JP2023511358A - 線維化、肥大または心不全の処置または予防における使用のための骨髄由来増殖因子 - Google Patents

Abstract

本発明は、線維化および肥大の処置または予防における使用のための、タンパク質骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）、または前記タンパク質をコードする核酸に関する。本発明はまた、心不全の処置における使用のための、タンパク質ＭＹＤＧＦ、または前記タンパク質をコードする核酸にも関する。本発明はまた、線維化および肥大の処置における使用のためのかつ心不全の処置における使用のための、前記核酸を含むベクター、前記核酸を発現する宿主細胞、および方法にも関する。

Description

本発明は、線維化および肥大の処置または予防における使用のための、タンパク質骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）または前記タンパク質をコードする核酸に関する。本発明はまた、心不全の処置または予防における使用のための、タンパク質ＭＹＤＧＦまたは前記タンパク質をコードする核酸にも関する。本発明はまた、線維化および肥大の処置における使用のための、ならびに心不全の処置または予防における使用のための、前記核酸を含むベクター、前記核酸を発現する宿主細胞および方法にも関する。

骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）は、因子１（Ｆａｃｔｏｒ１）としても知られる、ヒト染色体１９上のオープンリーディングフレーム１０（Ｃ１９Ｏｒｆ１０）にコードされるタンパク質である。該タンパク質は、２００７年に、いわゆる線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ細胞）のプロテオーム解析において、滑膜中の新規分泌因子として記載された。該タンパク質の分泌と関節の炎症性疾患との間には相関性のあることが、実験的または統計学的な証拠は何もなしに推測されている（Weiler et al., Arthritis Research and Therapy 2007, The identification and characterization of a novel protein, c19orf10, in the synovium）。対応する特許出願では、関節の処置のため、ならびに増殖変化を受けている組織の診断および組織中の変化のモニタリングのための治療剤として、該タンパク質が特許請求されている（米国特許出願公開第２００８／０００４２３２Ａ１号、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌ９ｏｒｆｌ０， ａ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）。別の科学出版物には、肝細胞癌の細胞内で、該タンパク質の発現が亢進していると記載されている（Sunagozaka et al., International Journal of Cancer, 2010, Identification of a secretory protein c19orf10 activated in hepatocellular carcinoma）。組換え産生タンパクによって、培養肝細胞癌細胞に対する増殖亢進効果が明らかとなった。Ｃ１９Ｏｒｆ１０は最初はインターロイキンと考えられていたため、ＩＬ－２５、ＩＬ－２７およびＩＬ－２７Ｗとも称されていることに留意のこと。しかし、「ＩＬ－２５」および「ＩＬ－２７」という用語は当分野において一貫性なく使用されており、種々の異なるタンパク質を名付けるために使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１８５０４９号ではあるタンパク質がＩＬ－２７と称され、免疫応答のモジュレーションにおけるその使用が開示されている。このタンパク質は因子１とは構造的に異なる（配列番号１による因子１のアミノ酸列を、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＮＥＶ９による「ＩＬ－２７」のアミノ酸配列と比較のこと）。同様に、欧州特許出願公開第２１３０５４７Ａ１号ではあるタンパク質がＩＬ－２５と称され、炎症の処置におけるその使用が開示されている。このタンパク質は当分野においてＬ－１７Ｅとも称されており、因子１とは構造的に異なる（配列番号１による因子１のアミノ酸列を、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９Ｈ２９３による「ＩＬ－２５」のアミノ酸配列と比較のこと）。

国際公開第２０１４／１１１４５８号では、非形質転換組織または非形質転換細胞の増殖の亢進およびアポトーシスの阻害における使用のための、特に急性心筋梗塞の処置における使用のための因子１が開示されている。さらに開示されているのは、医学的な使用のための、特に血管新生が疾患の発症または進行の一因となる疾患の処置または予防における使用のための、因子１の阻害剤である。

Ｋｏｒｆ－Ｋｌｉｎｇｅｂｉｅｌら［Nature Medicine, 2015, Vol. 21(2):140-149］は、心筋梗塞後に骨髄細胞によってＣ１９Ｏｒｆ１０が分泌され、そのタンパク質が心筋細胞の生存および血管新生を促進すると報告している。著者らは、骨髄に由来する単球およびマクロファージがこのタンパク質を内因的に産生して心筋梗塞後の心臓を保護かつ修復することを示し、その名前を骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）とすることを提案する。特に、心筋梗塞後の瘢痕サイズおよび収縮機能不全を低減するための組換えＭｙｄｇｆを用いた処置について報告する。

心不全は、持続的な血行力学的負荷、心筋損傷または遺伝子突然変異に応答して発症する恐れのある、予後不良を伴う臨床症候群である。慢性炎症が心不全の発病および進行の一因となり、治療薬の標的として浮上している（Adamo et al. Nat Rev Cardiol. 2020;17:269-285）。心不全と炎症の間の関係は双方向的であり、心臓、免疫系および末梢臓器の間のクロストークが関与する。心筋においては、炎症細胞に由来するサイトカインおよび増殖因子が心臓の実質細胞および間質細胞に作用することにより、収縮機能不全および有害な左心室（ＬＶ）リモデリングを促進する（Bozkurt et al. Circulation. 1998;97:1382-1391; Ismahil et al. Circ Res. 2014;114:266-282; Sager et al. Circ Res. 2016;119:853-864; Hulsmans et al. J Exp Med. 2018;215:423-440; Bajpai et al. Nat Med. 2018;24:1234-1245）。

マウスにおける、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）手術によって課せられた心臓の急性圧負荷は、自然免疫系および適応免疫系が関与する炎症応答を誘起する（Martini et al. Circulation. 2019;140:2089-2107）。圧を加えられたが生存可能な心筋細胞から発するシグナルは、炎症カスケードを誘発する（Suetomi et al. Circulation. 2018;138:2530-2544）。数時間以内に、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの心臓発現レベルが増加し（Baumgarten et al. Circulation. 2002;105:2192-2197; Xia et al. Histochem Cell Biol. 2009;131:471-481）、一週間以内に、最も主要な免疫細胞サブセットが、圧負荷された心臓中でサイズを拡大する、および／または活性化の兆候を示す（Xia 2009; Liao et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;115:E4661-E4669; Patel et al. JACC Basic Transl Sci. 2018;3:230-244）。

線維化とは、修復性プロセスまたは反応性プロセス、例えば反応状態、良性状態または病的状態における、臓器または組織中での過剰な線維性結合組織の形成のことを言う。線維化する間に沈着した結合組織は、基本となる臓器または組織の正常な構造および機能に干渉するまたはそれらを阻害する可能性がある。

肥大とは、その構成細胞の拡大による、臓器または組織の容量の増加のことを言う。

肥大および線維化を処置するための手段および方法が依然として必要である。心不全を処置するための手段および方法も、依然として必要である。

本発明は、第１の態様において、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を提供する。

一実施形態によれば、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、心不全の処置または予防における使用のためのものである。好ましい実施形態によれば、心不全は慢性心不全である。さらなる実施形態によれば、心不全または慢性心不全は、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、または駆出率が軽度低下した心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｗｉｔｈ ｍｉｄ－ｒａｎｇｅ ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＨＦｍｒＥＦ）である。

好ましい実施形態によれば、ＭＹＤＧＦタンパク質は配列番号１を含む。あるいは、ＭＹＤＧＦタンパクは配列番号１の断片もしくは変異体を含み、それはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈し、ここで前記変異体は配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

好ましい実施形態によれば、線維化は心臓、腎臓、肺および／または肝臓の線維化である。一実施形態によれば、線維化は間質性肺疾患、好ましくは進行性線維化性間質性肺疾患、より好ましくは特発性肺線維症である。

好ましい実施形態によれば、肥大は心筋細胞の肥大である。

さらなる態様によれば、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、増殖因子タンパク質ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体をコードする核酸を提供する。

さらなる態様によれば、本発明は、心不全の処置における使用のための、増殖因子タンパク質ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体をコードする核酸を提供する。

一実施形態によれば、前記核酸は、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。

さらなる態様によれば、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、本発明の核酸を含むベクターを提供する。

さらに別の態様によれば、本発明は、心不全の処置における使用のための、本発明の核酸を含むベクターを提供する。

さらなる態様によれば、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、本発明の核酸または本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、前記宿主細胞は前記核酸を発現する。

さらに別の態様によれば、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための医薬組成物であって、本発明のＭＹＤＧＦタンパク質、核酸、ベクターまたは宿主細胞を含み、適した医薬賦形剤を含んでいてもよい、医薬組成物を提供する。

さらに別の態様によれば、本発明は、心臓機能の改善における使用のための医薬組成物であって、本発明のＭＹＤＧＦタンパク質、核酸、ベクターまたは宿主細胞を含み、適した医薬賦形剤を含んでいてもよい、医薬組成物を提供する。

好ましい実施形態によれば、使用のための医薬組成物は、経口、静脈内、皮下、粘膜内、動脈内、筋肉内または冠動脈内の経路によって投与される。投与は、好ましくは、１回以上のボーラス注射および／または点滴による。

さらなる態様によれば、本発明は、線維化の処置方法を提供する。前記方法は、線維化の処置を必要とする患者に治療有効量のＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含む。

一実施形態によれば、ＭＹＤＧＦは配列番号１またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈する配列番号１の断片もしくは変異体を含む。前記変異体は、配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

一実施形態によれば、線維化は心臓、腎臓、肺および／または肝臓の線維化である。

さらに別の実施形態によれば、ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される。

さらなる態様によれば、本発明は、肥大の処置方法を提供する。前記方法は、肥大の処置を必要とする患者に治療有効量のＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含む。

一実施形態によれば、ＭＹＤＧＦは配列番号１またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈する配列番号１の断片もしくは変異体を含む。前記変異体は、配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

好ましい実施形態によれば、肥大は心筋細胞の肥大である。

さらに別の実施形態によれば、ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される。

さらなる態様によれば、本発明は、心不全の処置または予防を必要とする患者に治療有効量の増殖因子ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含む、心不全の処置または予防方法を提供する。好ましい実施形態によれば、心不全は慢性心不全である。さらなる好ましい実施形態によれば、心不全または慢性心不全はＨＦｐＥＦまたはＨＦｒＥＦであり、好ましくはＨＦｐＥＦはステージＣもしくはステージＤのＨＦｐＥＦであるか、またはＨＦｒＥＦはステージＣもしくはステージＤのＨＦｒＥＦである。

一実施形態によれば、ＭＹＤＧＦは配列番号１またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈する配列番号１の断片もしくは変異体を含む。前記変異体は、配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

さらに別の実施形態によれば、ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される。

骨髄由来増殖因子は、特発性肺線維症の患者由来の肺線維芽細胞において、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）によって刺激されるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。ＴＧＦβ１および／またはＭＹＤＧＦの非存在下または存在下で培養した、特発性肺線維症の患者由来の肺線維芽細胞における、ＳＭＡＤ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）およびＳＭＡＤ３（Ｓｅｒ４２３／４２５）のリン酸化（α－チューブリン発現に対して正規化されている）。 骨髄由来増殖因子は、末期の心不全患者由来の左心室線維芽細胞におけるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）によって刺激されるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。ＴＧＦβ１および／またはＭｙｄｇｆの非存在下または存在下で培養した、末期の心不全患者由来の左心室線維芽細胞における、ＳＭＡＤ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）およびＳＭＡＤ３（Ｓｅｒ４２３／４２５）のリン酸化［非リン酸化ＳＭＡＤ２／３の発現に対して正規化されている］。 骨髄由来増殖因子は、末期の心不全患者由来の左心室線維芽細胞におけるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）によって刺激されるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。ＴＧＦβ１および／またはＭＹＤＧＦの非存在下または存在下で培養した、末期の心不全患者由来の左心室線維芽細胞における、ＳＭＡＤ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）およびＳＭＡＤ３（Ｓｅｒ４２３／４２５）のリン酸化（非リン酸化ＳＭＡＤ２／３の発現に対して正規化されている）。 マウス骨髄由来増殖因子は、マウス胚線維芽細胞における、トランスフォーミング増殖因子β１（Ｔｇｆβ１）によって刺激されるＳｍａｄのリン酸化を阻害する。 ＭＹＤＧＦは、圧負荷の間の左心室（ＬＶ）リモデリングを減弱させる。（Ａ）Ｍｙｄｇｆ野生型（ＷＴ）およびノックアウト（ＫＯ）マウスに、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）手術または擬似手術を供した（７日目）。脛骨の長さに対するＬＶの質量比。典型的な、長軸方向の組織切片（７日目、スケールバー、１ｍｍ）および１群あたり６～１５匹のマウスから得た概要データ。同じ遺伝子型の擬似に対して^＊＊＊Ｐ＜０．００１（ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析）；^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃Ｐ＜０．０１（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｂ）ＬＶ心筋細胞の断面積。コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ；スケールバー、５０μｍ）を用いて染色した典型的な組織切片および１群あたり３～７匹のマウスから得た概要データ。同じ遺伝子型の擬似に対して^＊＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１（ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析）；^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃＃Ｐ＜０．００１（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｃ）単離された心室心筋細胞のサイズ。典型的な位相差顕微鏡画像（７日目、スケールバー、１００μｍ）および１群あたり３～８匹のマウスから得た概要データ。同じ遺伝子型の擬似に対して^＊＊＊Ｐ＜０．００１（統計的検定）；^＃Ｐ＜０．０５（統計的検定）。（Ｄ）擬似手術またはＴＡＣ手術の７日後の典型的なＬＶ圧容量ループ。 骨髄に由来するＭＹＤＧＦは、左心室（ＬＶ）リモデリングを減弱させる。（Ａ～Ｅ）Ｍｙｄｇｆ野生型（ＷＴ）またはノックアウト（ＫＯ）マウス由来の骨髄細胞（ＢＭＣ）を、（→）ＫＯまたはＷＴのレシピエントに移植した。骨髄の再構築後に、マウスに横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）手術を施し、１４日間経過観察した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ａ）脛骨の長さに対するＬＶの質量比。１群あたり７～１８匹のマウス。（Ｂ）ＬＶ心筋細胞の断面積。１群あたり４～５匹のマウス。（Ｃ）ＬＶイソレクチンＢ４（ＩＢ４）^＋内皮細胞密度。１群あたり４～６匹のマウス。（Ｄ）心エコー検査によって決定した、ＬＶ拡張末期面積（ＬＶＥＤＡ）およびＬＶ収縮末期面積（ＬＶＥＳＡ）。１群あたり５～１０匹のマウス。ＬＶＥＤＡ：Ｐ＜０．０５、ＷＴ右矢印ＫＯ対ＫＯ右矢印ＫＯ。ＬＶＥＳＡ：Ｐ＜０．０１、ＷＴ右矢印ＫＯ対ＫＯ右矢印ＫＯ（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｅ）面積変化率（ＦＡＣ）。（Ｄ）と同じ動物。円は個々のマウスを表す。水平バーは平均値である。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｆ）レンチウイルス遺伝子導入によって炎症細胞中にＭＹＤＧＦを過剰発現させるための、（Ｇ～Ｎ）において使用された実験戦略（ＨＳＣは造血幹細胞のことを示す）。（Ｇ）レンチウイルスで形質導入したＢＭＣの移植に続いてドキシサイクリンで１週間処置した、または処置しなかった、移植の６週間後のＷＴレシピエントマウス由来のＢＭＣおよび脾細胞中のＭＹＤＧＦおよびアルファ－チューブリンの発現を示す、典型的な免疫ブロット（４つのうちの）。（Ｈ）レンチウイルスで形質導入したＢＭＣの移植に続いてドキシサイクリンで１週間処置した、または処置しなかった、移植の６週間後のＷＴレシピエントマウスにおけるＭＹＤＧＦの血漿レベル。（Ｉ～Ｍ）すべての動物は、ドキシサイクリンで処置した。（Ｉ）レンチウイルスで形質導入したＢＭＣの移植に続いてドキシサイクリンで１週間処置した、または処置しなかった、移植の６週間後のＷＴレシピエントマウス中のＬＶのＭＹＤＧＦおよびＧＡＰＤＨの発現を示す、典型的な免疫ブロット。（Ｊ～Ｌ、およびＮ）同じレンチウイルス擬似に対して^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃＃＃Ｐ＜０．００１（テューキーの事後検定を用いた二元配置分散分析）。（Ｊ）脛骨の長さに対するＬＶの質量比。１群あたり６匹のマウス。（Ｋ）ＬＶ心筋細胞の断面積。１群あたり５匹のマウス。（Ｌ）ＩＢ４^＋内皮細胞密度。１群あたり６～７匹のマウス。（Ｍ）ＬＶＥＤＡおよびＬＶＥＳＡ。１群あたり６～８匹のマウス。ＬＶＥＤＡおよびＬＶＥＳＡ：Ｐ＜０．００１、Ｌｅｎｔｉ．対照ＴＡＣ対Ｌｅｎｔｉ．対照擬似。ＬＶＥＤＡ：Ｐ＜０．０５、ＴＡＣ Ｌｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦ対ＴＡＣ Ｌｅｎｔｉ．対照。ＬＶＥＳＡ：Ｐ＜０．０１、ＴＡＣ Ｌｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦ対ＴＡＣ Ｌｅｎｔｉ．対照。（Ｎ）ＦＡＣ。（Ｍ）と同じ動物。 心筋細胞肥大。新生仔ラットの心室心筋細胞を、エンドセリン１（ＥＴ１、１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ）および／またはＭＹＤＧＦ（別様に述べられない限り、１００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。（Ａ）典型的な免疫蛍光顕微鏡画像。スケールバー、５０ｍｍ。４～６回の実験から得た概要データ。（Ｂ）用量反応曲線。４回の実験から得たデータ。半数阻害濃度（ｈａｌｆ－ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＩＣ５０）を、４パラメータロジスティック回帰により計算した。対照は、無刺激細胞のサイズを示す。（Ｃ）タンパク質含有量。３回の実験から得たデータ。（Ｄ）ＲＴ－ｑＰＣＲにより決定したＭｙｈ７（ベータミオシン重鎖）、Ｎｐｐａ（ナトリウム利尿ペプチドＡ型）およびＧａｐｄｈのｍＲＮＡ発現レベル。７～１３回の実験から得たデータ。無刺激対照に対して^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃＃＃Ｐ＜０．００１（テューキーの事後検定を用いた一元配置分散分析）。 リン酸化プロテオーム解析により、ＰＩＭ１が、ＭＹＤＧＦのシグナル伝達の標的として同定される。（Ａ～Ｄ）エンドセリン１（ＥＴ１、１００ｎｍｏｌ／Ｌ）および／またはＭＹＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で８時間刺激した、新生仔ラットの心室心筋細胞（ＮＲＣＭ）のリン酸化プロテオーム解析。（Ａ）リン酸化プロテオームデータおよびキナーゼ基質相互作用の予備的知識からキナーゼ活性を推論するためのボトムアップアプローチを例示するフローチャート。（Ｂ）リン酸化プロテオームデータセットの主成分解析（１条件あたり４つの生物学的レプリケート）。（Ｃ）リン酸化プロテオームの変化を例示するヒストグラム。赤色のバーは、無刺激対照と比較して、ＥＴ１によって有意に調節されるすべてのリン酸化部位（ｐｈｏｓｐｈｏｓｉｔｅ）を表す（ｎ＝１２０、Ｐ＜０．０５、１を超えるｌｏｇ_２倍率変化）。青色のバーは、ＥＴ１のみで刺激した細胞と比較した、ＥＴ１＋ＭＹＤＧＦで刺激した細胞におけるこれらの部位の調節を示す。（Ｄ）ＥＴ１のみで刺激した細胞と比較した、ＥＴ１＋ＭＹＤＧＦで刺激した細胞におけるキナーゼ活性の、基質に基づく推論。ＥＴ１および／またはＭＹＤＧＦで１６時間刺激したＮＲＣＭにおける、（Ｅ）ＰＩＭ１タンパク質の発現および（Ｆ）キナーゼ活性。６回の実験。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｇ）ＥＴ１、ＭＹＤＧＦおよび／またはＳＭＩ４ａ（１０μｍｏｌ／Ｌ）で２４時間刺激後のＮＲＣＭのサイズ。３回の実験。対照に対して^＊Ｐ＜０．０５、^＃Ｐ＜０．０５（テューキーの事後検定を用いた一元配置分散分析）。（Ｈ）スクランブルした（ＳＣＲ）またはＰＩＭ１の、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡでトランスフェクションし、ＥＴ１および／またはＭＹＤＧＦで２４時間刺激した後のＮＲＣＭのサイズ。典型的な免疫ブロットは、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＰＩＭ１およびベータアクチンの発現を示す。４回の実験。対照に対して^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＃＃Ｐ＜０．０１（テューキーの事後検定を用いた一元配置分散分析）。 ＭＹＤＧＦは、ＰＩＭ１を介してＳＥＲＣＡ２ａの発現を亢進させる。（Ａ）ＭＹＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激した新生仔ラットの心室心筋細胞（ＮＲＣＭ）における、ＰＩＭ１、筋／小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）およびベータアクチンの発現を示す、典型的な免疫ブロットおよび概要データ。４～５回の実験。ベースラインに対して^＊Ｐ＜０．０５（ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析）。（Ｂ）ＭＹＤＧＦおよび／またはＳＭＩ４ａ（１０μｍｏｌ／Ｌ）で１６時間刺激したＮＲＣＭにおける、ＳＥＲＣＡ２ａおよびベータアクチンの発現を示す、典型的な免疫ブロット（３つのうちの）。示している場合、スクランブルした（ＳＣＲ）またはＰＩＭ１の低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡで、細胞を最初にトランスフェクトした。（Ｃ）擬似手術または横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）手術を供したＭｙｄｇｆ野生型（ＷＴ）およびノックアウト（ＫＯ）マウスにおける、左心室（ＬＶ）のＳＥＲＣＡ２ａおよびビンキュリンの発現を示す典型的な免疫ブロットおよび概要データ。１群あたり９匹のマウス。同じ遺伝子型の擬似に対して^＊＊＊Ｐ＜０．００１（ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析）；^＃Ｐ＜０．０５（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｄ）擬似手術またはＴＡＣ手術の７日後にＷＴおよびＫＯマウスから単離された心筋細胞における、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＩＭ１およびアルファ－チューブリンの発現を示す、典型的な免疫ブロットおよび概要データ。１群あたり５～６匹のマウス。同じ遺伝子型の擬似に対して^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃Ｐ＜０．０１（テューキーの事後検定を用いた二元配置分散分析）。（Ｅ）ＷＴまたはＫＯマウス由来の骨髄細胞を、（右矢印）致死的な放射線を浴びせたＫＯまたはＷＴのレシピエント中に移植した。骨髄の再構築後に、マウスにＴＡＣ手術を施し、１４日間経過観察した。ＬＶのＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＩＭ１およびアルファ－チューブリンの発現を示す、典型的な免疫ブロットおよび概要データ。１群あたり８匹のマウス。^＊Ｐ＜０．０５（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｆ）ＴＡＣの７日後の、ＬＶのＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＩＭ１およびベータアクチンの発現を示す、典型的な免疫ブロットおよび概要データ。マウスには、Ｌｅｎｔｉ．対照またはＬｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦで形質導入した骨髄細胞を移植しており、手術の１週間前からドキシサイクリンで処置した。^＊＊＊Ｐ＜０．００１（２つの独立したサンプルのｔ検定）。 ＭＹＤＧＦタンパク質治療。（Ａ）処置レジメン。横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）手術後、マウスに、組換えＭＹＤＧＦ（１０μｇ）の左心室（ＬＶ）内腔へのボーラス注射、それに続く３日間（Ｂ）、７日間（Ｃ）または４２日間（Ｄ－Ｉ）の皮下点滴（１０μｇ／日）を与えた。ＴＡＣ手術した対照マウスを希釈剤のみで処置した（ボーラス注射および点滴）。（Ｂ）ＭＹＤＧＦの血漿レベル。１群あたり５～７匹のマウス。＊＊＊Ｐ＜０．００１（検定）。（Ｃ）ＬＶの筋／小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）およびアルファ－チューブリンの発現を示す、典型的な免疫ブロットおよび概要データ。１群あたり５～７匹のマウス。^＊Ｐ＜０．０５（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｄ）ＴＡＣ（１群あたり１６～２２匹のマウス）の７日後および４２日後または擬似手術（９匹のマウス）の７日後の連続的な心エコー検査によって決定した、ＬＶ拡張末期面積（ＬＶＥＤＡ）およびＬＶ収縮末期面積（ＬＶＥＳＡ）。ＬＶＥＤＡ：Ｐ＜０．０１、２８日の時点での、ＴＡＣ（対照およびＭＹＤＧＦ）対擬似。ＬＶＥＳＡ：Ｐ＜０．０１、７日および２８日の時点での、ＴＡＣ（対照およびＭＹＤＧＦ）対擬似（ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析）。ＬＶＥＤＡ：Ｐ＜０．０１、２８日の時点でのＭＹＤＧＦ対対照；ＬＶＥＳＡ：Ｐ＜０．００１ ２８日の時点でのＭＹＤＧＦ対対照（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｅ）面積変化率（ＦＡＣ）。（Ｃ）と同じ動物。すべてのＴＡＣ群に対して^＊＊＊Ｐ＜０．００１（ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析）；^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃＃＃Ｐ＜０．００１ ＫＯ対ＷＴ（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｆ）２８日の時点での、脛骨の長さに対するＬＶの質量比。１群あたり６～１２匹のマウス。（Ｇ）２８日の時点での、ＬＶ心筋細胞の断面積。１群あたり６匹のマウス。（Ｈ）２８日の時点での、左心室におけるイソレクチンＢ４（ＩＢ４）^＋内皮細胞密度。１群あたり６匹のマウス。（Ｅ～Ｇ）擬似に対して^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１（ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析）；^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃＃Ｐ＜０．００１（２つの独立したサンプルのｔ検定）。（Ｉ）２７匹の対照マウスおよび１７匹のＭＹＤＧＦで処置したマウスにおける、ＴＡＣ後の累積生存率（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）。^＊Ｐ＝０．０５（ログランク検定）。

以下で本発明について詳細に記載する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されるものではなく、これらは変化し得るものと理解されたい。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されたい。別様に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。

定義
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載の通りに定義される。

本発明を実施するためには、別様に指示されない限り、当分野の文献において説明されている化学、生化学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術の従来法が使用される（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照のこと）。さらに、同様に当分野の文献において説明されている臨床心臓病学の従来法も使用される（例えば、Braunwald's Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine, 9^th Edition, P. Libby et al. eds., Saunders Elsevier Philadelphia, 2011を参照のこと）。

文脈上別様に要求されない限り、本明細書およびそれに続く特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」などの変形は、述べられた整数または工程あるいは述べられた整数または工程の群を含むことを暗示しているが、他の任意の整数または工程あるいは整数または工程の群を除外することは暗示していないことが理解されよう。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容上別様に明確に規定されない限り、複数の指示対象を含む。

核酸分子は、ヌクレオチドモノマーから作られる重合体高分子として理解される。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、五炭糖（例えば、これらに限定されないが、リボースまたは２’－デオキシリボース）および１～３個のリン酸基から構成される。典型的には、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチドモノマーの間のホスホジエステル結合によって形成される。言及される本発明の文脈では、核酸分子にはリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。

「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）という用語は、アミノ酸に翻訳され得るヌクレオチドの配列のことを指す。典型的には、そのようなＯＲＦは、開始コドンと、それに続く３ヌクレオチドの倍数の長さを有する領域を通常は含有するが、所与のリーディングフレーム中に終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡ）は含有しない。典型的には、ＯＲＦは、天然に存在するか、または人工的に、すなわち遺伝子工学的な手段によって構築される。ＯＲＦはタンパク質をコードし、それが翻訳されることが可能なアミノ酸がペプチド連結鎖を形成する。

「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意のペプチド結合連結鎖のことを指す。本発明において使用可能なタンパク質（タンパク質誘導体、タンパク質変異体、タンパク質断片、タンパク質セグメント、タンパク質エピトープおよびタンパク質ドメインを含む）は、化学修飾によってさらに修飾することができる。これは、そのような化学的に修飾されたポリペプチドが、天然に存在する２０種のアミノ酸以外の化学基を含むことを意味する。そのような他の化学基の例としては、グリコシル化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドの化学修飾は、親ポリペプチドと比較して有利な特性、例えば、安定性の強化、生物学的半減期の増加または水溶性の増加のうちの１つ以上をもたらし得る。本発明において使用可能な、変異体に適用可能な化学修飾には：ペグ化、非グリコシル化親ポリペプチドのグリコシル化、グルカゴン様ペプチド１アゴニストのような低分子治療薬であって、エキセナチド、アルビグルチド、タスポグルチド、ＤＰＰ４阻害剤、インクレチンおよびリラグルチドを含む低分子治療薬への共有結合、または親ポリペプチド中に存在するグリコシル化パターンの修飾が含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用可能な、変異体に適用可能なそのような化学修飾は、翻訳時に、または翻訳後に起こり得る。

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸ならびにアミノ酸誘導体を包含する。本発明の文脈における疎水性非芳香族アミノ酸は、好ましくは、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性インデックスが０．５よりも大きく、より好ましくは１．０よりも大きく、さらにより好ましくは１．５よりも大きく、かつ芳香族ではない任意のアミノ酸である。好ましくは、本発明の文脈における疎水性非芳香族アミノ酸は、アミノ酸のアラニン（Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性インデックスが１．８）、メチオニン（Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性インデックスが１．９）、イソロイシン（Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性インデックスが４．５）、ロイシン（Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性インデックスが３．８）およびバリン（Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性インデックスが４．２）、または上記で定義されたＫｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性インデックスを有するそれらの誘導体からなる群から選択される。

本明細書において使用される「変異体」という用語は、アミノ酸配列の１つまたは複数が変化することによって、それが由来するポリペプチドまたはその断片と比べて異なるポリペプチドのことを指す。タンパク質の変異体が由来するポリペプチドは、親ポリペプチドとしても知られる。同様に、タンパク質断片の変異体が由来する断片は、親断片として知られる。典型的には、変異体は、人工的に、好ましくは遺伝子工学的手な手段によって構築される。典型的には、親ポリペプチドは、野生型のタンパク質または野生型のタンパク質ドメインである。さらに、本発明において使用可能な変異体は、該変異体が親ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を呈するという条件で、該親ポリペプチドのホモログ、オルソログまたはパラログあるいは人工的に構築された変異体に由来してもよい。アミノ酸配列の変化は、アミノ酸の交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断またはＣ末端切断あるいはこれら変化の任意の組合せであってもよく、それは１つまたは複数の部位において起こってもよい。好ましい実施形態では、本発明において使用可能な変異体は、総数が最大で２３（最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３）個の、アミノ酸配列の変化（すなわち交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断および／またはＣ末端切断）を呈する。アミノ酸交換は保存的、および／または半保存的、および／または非保存的であってもよい。好ましい実施形態では、本発明において使用可能な変異体は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個のアミノ酸交換、好ましくは保存されたアミノ酸変化により、それが由来するタンパク質またはドメインとは異なる。

典型的な置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド誘導体間、塩基性残基を有するアミノ酸間または芳香族残基を有するアミノ酸間でのものである。典型的な半保存的および保存的な置換は以下の通りである：

Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣへの変化は、新たなシステインが遊離のチオールのままである場合に半保存的である。さらに、当業者であれば、立体的に要求される位置にあるグリシンを置換するべきではないことおよびアルファヘリカルまたはベータ－シート構造を有するタンパク質部分にＰを導入するべきではないことは理解しているであろう。

あるいは、または加えて、本明細書で使用される場合の「変異体」は、それが由来する親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドに対するある程度の配列同一性によって特徴付けることができる。より正確に言えば、本発明の文脈におけるタンパク質変異体は、その親ポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性を呈する。好ましくは、問題のポリペプチドと参照ポリペプチドは、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれを超えるアミノ酸の連続するストレッチにわたって、あるいは参照ポリペプチドの全長にわたって、示された配列同一性を呈する。好ましくは、問題のポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドは、６０、９０、１２０、１３５、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００またはそれを超えるヌクレオチドの連続するストレッチにわたって、あるいは参照ポリペプチドの全長にわたって、示された配列同一性を呈する。

「少なくとも８５％の配列同一性」という用語は、本明細書全体にわたって、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列比較に関して使用される。この表現は、好ましくは、それぞれの参照ポリペプチドに対して、またはそれぞれの参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性のことを指す。

タンパク質の断片はアミノ酸の欠失を含み、それはＮ末端切断、Ｃ末端切断または内部の欠失あるいはこれらの任意の組合せであってもよい。Ｎ末端切断、Ｃ末端切断および／または内部の欠失を含むそのような変異体は、本出願の文脈において「断片」と称される。断片は、天然に存在するもの（例えばスプライス変異体）でもよく、または人工的に、好ましくは遺伝子工学的な手段によって構築されてもよい。好ましくは、断片（または欠失変異体）は、親ポリペプチドと比較して、そのＮ末端において、および／またはそのＣ末端において、および／または内部において、好ましくはそのＮ末端において、そのＮ末端およびＣ末端において、またはそのＣ末端において、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３アミノ酸の欠失を有する。

２つの配列を比較する場合であって、配列同一性のパーセンテージを計算するために比較する参照配列が指定されていない場合には、配列同一性は、別様に具体的に示されない場合、比較する２つの配列のうち長い方を参照して計算する。

ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは、配列アライメントによって決定することができる。そのようなアライメントは、当分野において既知のいくつかのアルゴリズムを用いて、好ましくはＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌの数学アルゴリズム［Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877］を用いて、ｈｍｍａｌｉｇｎ（HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/）を用いて、またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム［Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80］もしくはＣＬＵＳＴＡＬＷ２アルゴリズム［Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948.］を用いて実施することができ、それらは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｈｔｍｌまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ上で入手可能である。好ましくは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ上のＣＬＵＳＴＡＬＷ２のアルゴリズムが使用され、ここで使用されるパラメータは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ上で下記のように設定されているデフォルトパラメータである：ｓｌｏｗ ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔオプションの場合、Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｙｐｅ＝Ｓｌｏｗ、ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ、ｇａｐ ｏｐｅｎ＝１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝０，１、およびｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ、ｇａｐ ｏｐｅｎ＝１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝０，２０、ｇａｐ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ＝５、Ｎｏ ｅｎｄ ｇａｐｓ＝ｎｏ、出力オプション：ｆｏｒｍａｔ＝Ａｌｎ ｗ／ｎｕｍｂｅｒｓ、Ｏｒｄｅｒ＝ａｌｉｇｎｅｄ。

配列同一性（配列マッチング）のグレードは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴあるいはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を使用して計算してもよい。類似のアルゴリズムが、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410.のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム中に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ上で入手可能なＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて実施される。使用される好ましいアルゴリズムのパラメータは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ上で下記のように設定されているデフォルトパラメータである：Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝３、ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ＝０、ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ｇａｐ ｃｏｓｔｓ＝Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１、ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ＝ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ、ならびに因子１および因子２のポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るためのデータベースとしてｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｎｒ）を共に用いる。

比較の目的でギャップ付きアライメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用する。配列マッチング解析は、Ｓｈｕｆｆｌｅ－ＬＡＧＡＮ（Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62）のような確立された相同性マッピング技術またはマルコフ確率場によって補完されてもよい。配列同一性のパーセンテージが本出願において言及される場合、これらのパーセンテージは、別様に具体的に指示されない場合は、より長い配列の完全長に対して計算される。

本明細書で使用される場合の「宿主」という用語は、本発明の核酸（例えばプラスミドまたはウイルスの形態における）が入った細胞のことを指す。そのような宿主細胞は、原核細胞（例えば細菌細胞）または真核細胞（例えば真菌細胞、植物細胞もしくは動物細胞）のいずれであってもよい。細胞は形質転換されていても形質転換されていなくてもよい。細胞は、例えば細胞培養液中の単離された細胞であっても、または組織の一部であってもよく、組織はそれ自体が単離されたものであっても、または臓器もしくは個体などのより複雑な有機的構造の一部であってもよい。

「骨髄由来増殖因子」、「ＭＹＤＧＦ」、「因子１」、「ＭＹＤＧＦポリペプチドまたはタンパク質」あるいは「因子１ポリペプチドまたはタンパク質」という用語は交換可能に使用され、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１９１０７．３（ヒトホモログ）において示されるタンパク質ならびにその哺乳動物ホモログ、特にマウスまたはラット由来のホモログのことを指す。ヒトホモログのアミノ酸配列は、ヒト染色体１９上のオープンリーディングフレーム１０（Ｃ１９Ｏｒｆ１０）中にコードされている。好ましくは、ＭＹＤＧＦおよび因子１タンパク質は、配列番号１によるアミノ酸配列を有するヒト因子１のコアセグメントを含むか、から本質的になるかまたはからなるタンパク質のことを指す。

タンパク質、変異体または断片がＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するかしないかは、以下の実施例において記載されるいずれか１つの試験によって決定することができる。本発明によれば、本明細書において以下に提示される少なくとも１つの実施例において示される、本発明のＭＹＤＧＦタンパク質を用いて得られた結果と比較して、あるペプチドまたはタンパク質を用いて得られた結果が、指示された対照に対して報告されたＭＹＤＧＦの効果の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％を達成する場合に、そのようなペプチドまたはタンパク質はＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈する。

本明細書で使用される場合、「ＭＹＤＧＦ」および「Ｍｙｄｇｆ」という用語は、共に骨髄由来増殖因子を示し、ここで「ＭＹＤＧＦ」は、骨髄由来増殖因子のヒト変異体を指すために本発明において使用され、「Ｍｙｄｇｆ」は骨髄由来増殖因子のマウス変異体を指すために使用される。

本明細書で使用される場合の「心臓機能の改善」という用語は、例えば、収縮期および／または拡張期の心臓機能の改善を意味し、それは、例えば、心エコー検査、心臓磁気共鳴イメージング、心臓コンピュータ断層撮影または心室血管造影によって評価することができる。例えば、左心室の寸法の増加および心臓の収縮期機能の向上は心臓機能の改善の指標であり、例えば以下の実施例１０において示されるように測定することができる。

「線維化」という用語は、臓器または組織の正常な構成物質としての線維組織の生成ではなく、修復性または反応性プロセスとしての線維組織の形成のことを表現する。それは、例えば、Farlex Partner Medical Dictionary、The American Heritage Medical DictionaryまたはPschyrembel Klinisches Woeterbuch, 261^st ed., 2007において定義されているものと同じ意味を有する。

「肥大」という用語は、その構成細胞の拡大による、臓器または組織容量の異常に激しい増加のことを表現する。過剰増殖とは大きく異なり、肥大は、急速な分裂による細胞の高速の増殖によってではなく既存の細胞の拡大によってもっぱら生じる、組織または臓器の容量の増加を特徴とする。本明細書で使用される場合の「肥大」という用語は、例えば、Farlex Partner Medical Dictionary、The American Heritage Medical DictionaryまたはPschyrembel Klinisches Woeterbuch, 261^st ed., 2007において定義されているものと同じ意味を有する。肥大は、例えば肥大に罹患した細胞または組織の表面積、断面積またはサイズを、肥大に罹患していない対照細胞または対照組織の表面積、断面積またはサイズと比較することによって、あるいは罹患細胞のタンパク質含有量を対照と比較することによって、評価または測定することができる。本発明に従って処置される肥大は、好ましくは病的肥大、例えば、病的なタイプの心肥大を促進することが知られているＥＴ１および／またはＡｎｇＩＩによって引き起こされる肥大である。

「間質性肺疾患」または「ＩＬＤ」という用語は、Lederer et al., New England Journal of Medicine, 2018, Vol. 378(19):1811-1823、またはvan Cleemput, J. et al. Idiopathic Pulmonary Fibrosis for Cardiologists: Differential Diagnosis, Cardiovascular Comorbidities, and Patient Management; Adv Ther. 2019 Feb;36(2):298-317に記載の通りに理解されるべきである。

本明細書で使用される場合の、「心不全の処置および／または予防」という文脈における「心不全」という用語は、2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure ［European Heart Journal, 2016; Vol. 37(27):2129-2200］において定義されているように理解されるべきであり、慢性心不全、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、駆出率が軽度低下した心不全（ＨＦｍｒＥＦ）を含む。本発明の文脈においては、該用語は、ＨＦｐＥＦまたはＨＦｒＥＦ、特に、2017 ACC/AHH/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure［Journal of American College of Cardiology, 2017; Vol. 70(6):776-803］に記載のステージＣもしくはステージＤのＨＦｐＥＦおよびステージＣもしくはステージＤのＨＦｒＥＦのことも指すことが意図されている。実施形態の記載には、本申請全体にわたって使用される用語のさらなる定義および説明が含まれる。これら記載および定義は、別様に述べられない限り、本申請全体に対して有効である。

配列
本発明において使用される配列を以下にリストする。
配列番号１（３１アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠く、ヒト因子１のアミノ酸配列）：
VSEPTTVAFDVRPGGVVHSFSHNVGPGDKYTCMFTYASQGGTNEQWQMSLGTSEDHQHFTCTIWRPQGKSYLYFTQFKAEVRGAEIEYAMAYSKAAFERESDVPLKTEEFEVTKTAVAHRPGAFKAELSKLVIVAKASRTEL
配列番号２（２４アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを欠く、因子１のマウスホモログのアミノ酸配列）：
VSEPTTVPFDVRPGGVVHSFSQDVGPGNKFTCTFTYASQGGTNEQWQMSLGTSEDSQHFTCTIWRPQGKSYLYFTQFKAELRGAEIEYAMAYSKAAFERESDVPLKSEEFEVTKTAVSHRPGAFKAELSKLVIVAKAARSEL
配列番号３［Ｎ末端シグナルペプチド（太字および下線で示す）を含む、ヒト因子１のアミノ酸配列；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９６９Ｈ８］：

配列番号４［Ｎ末端シグナルペプチド（太字および下線で示す）を含む、因子１のマウスホモログのアミノ酸配列；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＣＰＴ４］：

配列番号５は、配列番号３（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５６００５）のＭＹＤＧＦをコードするヒト因子１の核酸配列を示す。
配列番号６は、配列番号４（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８１０６）のＭｙｄｇｆをコードするマウス因子１の核酸配列を示す。

実施形態
以下において、本発明の要素が記載される。これらの要素は特定の実施形態と共に列挙されるが、それらは、さらなる実施形態を作り出すために任意の様式および任意の数で組み合わされ得ると理解されるべきである。多様に記載される実施例および好ましい実施形態によって、明示的に記載される実施形態のみに本発明が限定されると解釈されるべきではない。本記載は、明示的に記載される実施形態と、任意の数の開示されるおよび／または好ましい要素とを組み合わせる実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記載されるすべての要素の任意の並べ替えおよび組合せが、文脈上別様に指示されない限り、本出願の記載によって開示されるとみなされるべきである。

本発明者らは、ＭＹＤＧＦの抗線維化効果および抗肥大効果を初めて示す。発明者らは、マウスモデルにおけるＭＹＤＧＦの投与が、肥大および線維化を阻害することを特に示す。これらの効果は、とりわけ心臓機能の改善のために使用することができる。従って、第１の態様では、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、タンパク質骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を提供する。

第２の態様では、本発明は、心不全の処置または予防における使用のための、タンパク質骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を提供する。好ましい実施形態によれば、心不全は慢性心不全または急性心不全であり、ここで急性心不全は心筋梗塞を含まない。好ましい実施形態によれば、急性心不全は急性圧負荷により誘導された心不全である。さらに提供されるのは、本使用のためのＭＹＤＧＦまたはその断片もしくは変異体であり、ここで心不全または慢性心不全は、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、または駆出率が軽度低下した心不全（ＨＦｍｒＥＦ）である。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、心不全と関連づけられる線維化および／または肥大を減弱させて、および／または心臓機能の改善によって、心不全を処置または予防する。

本発明の特に好ましい実施形態では、タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を含む。好ましくは、タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。

本発明の本態様の好ましい実施形態では、タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を含む。当業者は、親ポリペプチド中のどの位置にどの程度まで変異を導入することができ、どの位置をポリペプチドの機能を保つために維持しなければならないかを、過度の負担なく決定することが可能である。そのような情報は、例えば、当分野において周知のバイオインフォマティクスの方法によって同定、アラインおよび解析が可能なホモログの配列から入手することができる。そのような解析が、国際公開第２０１４／１１１４５８号の実施例７ならびに図６および図７中に例示的に記載されている。変異は、種間、好ましくは哺乳動物間で完全には保存されていないタンパク質の領域中に好ましくは導入される。本発明の特に好ましい実施形態では、ＭＹＤＧＦタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を含むか、から本質的になるかまたはからなる。好ましくは、前記タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

Ｎ末端欠失変異体も包含され、それは、例えば、アミノ酸位置１～２４（配列番号１に基づいて）、すなわちＮ末端保存領域から、１つ以上のアミノ酸を欠いていてもよい。

Ｃ末端欠失変異体も包含され、それは、例えば、アミノ酸位置１１４～１４２（配列番号１に基づいて）から、１つ以上のアミノ酸を欠いていてもよい。

一方、ＭＹＤＧＦタンパク質にアミノ酸を付加することができる。そのような付加には、Ｎ末端における付加、Ｃ末端における付加、アミノ酸配列の内部における付加またはそれらの組合せが含まれる。本発明の第１の態様のタンパク質は、このように、例えば、得られるタンパク質の安定化または精製のために、付加アミノ酸配列をさらに含んでもよい。そのようなアミノ酸の例は、６×Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグまたはＦＬＡＧタグであり、これらは当分野において周知であり、タンパク質の任意の位置、好ましくはＮ末端またはＣ末端において存在させてもよい。特に好ましい付加配列は６×Ｈｉｓ－タグである。好ましくは、前記６×Ｈｉｓ－タグは、ＭＹＤＧＦタンパク質のＣ末端上に存在する。使用する発現システムによって、および上記のタグなどの付加的なアミノ酸が存在する場合にはそれによって、１つ以上の残存アミノ酸が、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端上に残る可能性がある。例えば、Ebenhoch R. et al., Nat Commun. 2019 Nov 26;10(1):5379、およびPolten F. et al., Anal Chem. 2019 Jan 15;91(2):1302~1308において示されているように、本発明によるＭＹＤＧＦタンパク質およびＭｙｄｇｆタンパク質中には、そのようなアーテファクトが存在する可能性があることを強調する。

タンパク質を安定化するために、本発明の第１の態様のＭＹＤＧＦタンパク質内部のプロテアーゼ切断部位に変異を導入することが好ましい場合もある（Segers et al. Circulation 2007, 2011を参照のこと）。当業者は、タンパク質内部の潜在的なタンパク質切断部位をどのように決定するかを知っている。例えば、タンパク質配列を、そのような解析を提供するウェブサイト、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ＿ｃｕｔｔｅｒ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｍａｐ．ｂｕｒｎｈａｍ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｅａｓｅｓのようなウェブサイトにサブミットすることができる。配列番号１によるタンパク質配列を、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ＿ｃｕｔｔｅｒ／にサブミットすると、低切断頻度（ｌｏｗｅｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）［１０未満］を有する以下の切断部位が決定される。

タンパク質の血清半減期を増加させるために、これらの部位を変えて、それぞれに同定されたプロテアーゼの認識／切断配列を取り除いてもよい。

本発明において、ＭＹＤＧＦは、線維化、特に心臓の線維化を阻害または予防することが示された。よって、本発明は、線維化の処置または予防における使用のための、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を提供する。

本発明の文脈における線維化の処置または予防とは、例えば、線維化組織の量を低減すること、あるいは線維化組織の形成を予防することまたはそれを低減することを意味する。低減は、好ましくは、活性薬剤で処置していない対照組織に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の低減である。

いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＭＹＤＧＦは、普遍的な線維化促進増殖因子（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）であるトランスフォーミング増殖因子βを阻害し、それによって線維化を予防および／または処置する。

本発明において、ＭＹＤＧＦは、肥大、特に心筋細胞の肥大を阻害または予防することが示された。よって、本発明は、肥大の処置または予防における使用のための、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を提供する。心筋細胞の肥大が処置または予防される場合、前記心筋細胞は、好ましくは、左心室もしくは右心室の心筋細胞または心房の心筋細胞である。

心臓の組織および／または心筋細胞などの細胞の肥大および線維化の処置および／または予防は、心臓の機能の改善のためにも使用することができる。このように、本発明はまた、心臓の機能の改善における使用のためのＭＹＤＧＦも提供する。本発明の意味の範囲内での心臓機能は、収縮期および／または拡張期の心臓機能に関し、それは、例えば、心エコー検査、心臓磁気共鳴イメージング、心臓コンピュータ断層撮影または心室血管造影によって評価することができる。心臓機能を評価するための好ましい方法は、高分解能２Ｄ経胸壁心エコー検査（例えばLang et al., Eur Heart J Cardiovasc Imaging, 2015;16:233-270において例えば記載されている）であり、例えばマウスでは３０ＭＨｚの線形変換器（Ｖｅｖｏ ３１００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を使用する。そのような実験では、左心室（ＬＶ）拡張末期面積（ＬＶＥＤＡ）および左心室収縮末期面積（ＬＶＥＳＡ）が、長軸ビューから決定される。ＬＶＥＤＡ（ｍｍ^２）は、左心室拡張末期容量の２次元近似であり；ＬＶＥＳＡ（ｍｍ^２）は、左心室収縮末期の容量の２次元近似である。次いで、面積変化率（ＦＡＣ）を、収縮期機能、すなわち心臓のパンピングまたは収縮機能の評価基準として計算する［（ＬＶＥＤＡ－ＬＶＥＳＡ）／ＬＶＥＤＡ］×１００。このように、心臓機能の改善は、本発明によるＭＹＤＧＦを用いた処置の前の同じ心臓の心臓機能と比較して、少なくとも１０％またはそれよりも大きな、例えば１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％よりも大きな、例えば１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％またはそれよりも大きな、例えばＦＡＣを評価することによって測定される収縮期および／または拡張期の心臓機能の改善を意味する。

ＭＹＤＧＦタンパク質は、例えば、得られるタンパク質の安定化または精製のために、付加アミノ酸配列をさらに含んでもよい。例えば、タンパク質を安定化させるために、ＭＹＤＧＦタンパク質内部のプロテアーゼ切断部位に変異を導入することが好ましい。適したタンパク質切断部位は、上記に記載の通りに同定することができる。

ＭＹＤＧＦタンパク質または該タンパク質を含む組成物は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、好ましくはインビボで投与することができる。

線維化または肥大した細胞または組織は、好ましくは、消化器系、内分泌系、排泄系、免疫系、外皮系、筋肉系、神経系、生殖器系、呼吸器系および骨格系あるいはそれらの組合せを含む群から選択される、個体の体の定義された系に属するか、または由来する。あるいは、線維化または肥大した細胞または組織は、好ましくは、皮膚、骨、心臓、軟骨、血管、食道、胃、腸、腺、肝臓、腎臓、肺、脳および脾臓を含む群から選択される、個体の体の定義された器官または臓器に属するか、または由来する。特に好ましい実施形態では、細胞または組織は、心臓に属するか、または由来する。

線維化または肥大した細胞または組織は、損傷を受けたか、または疾患にかかった細胞または組織であり得る。好ましくは、損傷または疾患は、遺伝的な／遺伝性の疾患、あるいは例えば虚血、再かん流傷害、炎症、感染症、外傷、機械的負荷、中毒または手術に起因する後天性の疾患によって引き起こされる。特に好ましい実施形態では、損傷は梗塞、特に心筋梗塞によって引き起こされる。特に好ましい別の実施形態では、損傷は、再かん流傷害によって引き起こされる。

特に好ましい実施形態では、線維化を負った細胞または組織は、心臓、腎臓、肺および肝臓の細胞または組織、最も好ましくは心臓の細胞または組織からなる群から選択される。ＩＰＦ患者由来の細胞に基づく実施例１５～１８において示される結果は、ＩＬＤの観点での線維化に対する適用可能性を大いに示唆する。胚線維芽細胞に基づく実施例２１および２２において示される結果は、腎臓および肝臓などの他組織の線維化に対しても適用可能性を示唆する。

好ましい実施形態では、線維化は間質性肺疾患（ＩＬＤ）である。好ましい一実施形態によれば、ＩＬＤは進行性線維化性間質性肺疾患、より好ましくは特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。このように、一実施形態によれば、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、Lederer et al., New England Journal of Medicine, 2018, Vol. 378(19):1811-1823, およびvan Cleemput, J. et al. Idiopathic Pulmonary Fibrosis for Cardiologists: Differential Diagnosis, Cardiovascular Comorbidities, and Patient Management, Adv Ther. 2019 Feb;36(2):298-317において定義される間質性肺疾患の予防または処置における使用のためのものである。さらなる実施形態によれば、ＩＬＤは、進行性線維化性ＩＬＤ（ＰＦ－ＩＬＤ）であり、特に特発性非特異的間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不可能な特発性間質性肺炎（分類不可能なＩＩＰ）、自己免疫性の特徴を伴う特発性肺炎（ＩＰＡＦ）、慢性の過敏性肺炎（ＣＨＰ）、環境性／職業性線維化性肺疾患、全身性硬化症間質性肺疾患（ＳＳｃ－ＩＬＤ）、またはリウマチ性関節炎間質性肺疾患（ＲＡ－ＩＬＤ）である。

特に好ましい実施形態では、肥大を負った細胞または組織は、心臓の細胞または組織、より好ましくは心筋細胞である。

さらなる態様では、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、本明細書に記載の、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体をコードする核酸を提供する。本発明はまた、心不全の処置または予防における使用のための、本明細書に記載の、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体をコードする核酸も提供する。本発明による使用のための核酸は、好ましくは、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。

核酸配列は、宿主細胞における発現を亢進させようと努力する中で最適化することができる。考慮すべきパラメータには、Ｃ：Ｇの含有率、好ましいコドンおよび阻害型二次構造の回避が含まれる。これらの要素は、特定の宿主において発現が亢進する核酸配列を得るための試みにおいて、様々なやり方で組み合わせることができる（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙらの国際公開第９７／４７３５８号を参照のこと）。特定の宿主において発現が亢進する特定の配列の能力には、いつかの経験的な実験法が関与する。そのような実験法には、有望な核酸配列の発現を測定し、必要に応じてその配列を変えることが必要である。特定のアミノ酸配列と既知の遺伝子コードの縮重を用いて始めると、多くの異なるコード化核酸配列を得ることができる。遺伝子コードの縮重は、三連のヌクレオチドの複数の異なる組合せ、すなわち「コドン」よってほとんどすべてのアミノ酸がコードされていることによって生じる。特定のコドンが特定のアミノ酸に翻訳されることは、当分野において周知である（例えば、Lewin GENES IV, p. 119, Oxford University Press, 1990を参照のこと）。

本発明による使用のための核酸は、タンパク質の発現を制御するために配置された転写制御エレメントまたは発現制御配列をさらに含んでもよい。制御エレメントを伴うそのような核酸は、しばしば発現システムと称される。本明細書で使用される場合の「発現システム」という用語は、１種以上の目的の遺伝子産物を産生するように設計されたシステムのことを指す。典型的には、そのようなシステムは、「人工的」に、すなわち目的の遺伝子産物をインビボ、インビトロまたはエクスビボで産生するのに使用可能な遺伝子工学的な手段によって設計される。「発現システム」という用語は、さらに、ポリヌクレオチドの転写、ｍＲＮＡスプライシング、ポリペプチドへの翻訳、ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳時および翻訳後修飾ならびに１つ以上の細胞内区画へのタンパク質の標的化、細胞からの分泌および同じまたは別の細胞内へのタンパク質の取り込みを含む目的の遺伝子産物の発現も包含する。この一般的な記載は、真核生物の細胞、組織または生物体における使用のための発現システムのことを指す。原核生物系のための発現システムは異なる可能性があり、原核細胞用の発現システムがどのように構築されるかは当分野において周知である。

遺伝子発現カセット内に存在する調節エレメントには：（ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写的に連結したプロモーター、（ｂ）ヌクレオチド配列に機能的に連結した５’リボソーム結合部位、（ｃ）ヌクレオチド配列の３’末端につないだターミネーター、および（ｄ）ヌクレオチド配列に機能的に連結した３’ポリアデニル化シグナルが一般的には含まれる。遺伝子発現またはポリペプチドのプロセシングの亢進または調節に有用なさらなる調節エレメントも存在してもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される、下流の領域の転写を媒介する遺伝子エレメントである。好ましいプロモーターは、転写のレベルの増加をもたらす強力なプロモーターである。強力なプロモーターの例は、前初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）、およびイントロンＡを含むＣＭＶ（Chapman et al, Nucl. Acids Res. 19:3979-3986, 1991）である。プロモーターのさらなる例としては、天然に存在するプロモーター、例えばＥＦ１アルファプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびＳＶ４０初期／後期プロモーターおよび［ベータ］アクチンプロモーター；ならびに人工のプロモーター、例えば合成の筋肉特異的プロモーターおよびキメラの筋肉特異的／ＣＭＶプロモーター（Li et al., Nat. Biotechnol. 17:241-245, 1999 , Hagstrom et al., Blood 95:2536-2542, 2000）が挙げられる。

リボソーム結合部位は、開始コドンに位置するか、またはその近くに位置する。好ましいリボソーム結合部位の例としては、ＣＣＡＣＣＡＵＧＧ、ＣＣＧＣＣＡＵＧＧおよびＡＣＣＡＵＧＧが挙げられ、ここでＡＵＧは開始コドンである（Kozak, Cell 44:283-292, 1986）。ポリアデニル化シグナルは、転写されたＲＮＡの切断およびポリ（Ａ）テールのＲＮＡへの付加に関わっている。高等真核生物におけるポリアデニル化シグナルでは、ポリアデニル化付加部位から１１～３０ヌクレオチドのところにＡＡＵＡＡＡ配列を含有する。ＡＡＵＡＡＡ配列は、ＲＮＡ切断のシグナル伝達に関与する（Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY, 1990）。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡのプロセシング、核外への輸送、翻訳および安定性にとって重要である。

遺伝子発現カセットの一部として使用することができるポリアデニル化シグナルには、最小ウサギ［ベータ］グロビンポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ）（Xu et al., Gene 272:149-156, 2001, Post et al.、米国特許第５，１２２，４５８号）が含まれる。

遺伝子発現またはポリペプチドのプロセシングの亢進または調節に有用な、存在してもよいさらなる調節エレメントの例としては、エンハンサー、リーダー配列およびオペレーターが挙げられる。エンハンサー領域は、転写を増加させる。エンハンサー領域の例としては、ＣＭＶエンハンサーおよびＳＶ４０エンハンサーが挙げられる（Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7:13-30, 1995、Xu, et al., Gene 272:149-156, 2001）。エンハンサー領域は、プロモーターと関連づけることができる。

本発明によるＭＹＤＧＦタンパク質またはその変異体の発現は、調節することができる。そのような調節は、遺伝子発現の多くの段階において達成することができる。可能な調節段階は、例えば、これらに限定されないが、転写の開始、プロモータークリアランス、転写の伸長、スプライシング、核外への輸送、ｍＲＮＡの安定性、翻訳の開始、翻訳効率、翻訳の伸長およびタンパク質フォールディングである。細胞内のＭＹＤＧＦポリペプチドの濃度に影響を及ぼす他の調節段階は、タンパク質の半減期に影響を与える。そのような調節段階は、例えば、タンパク質の変性の調節である。本発明のタンパク質には分泌タンパク質が含まれるため、タンパク質を宿主細胞の分泌経路に導くことができる。分泌効率は、発現およびタンパク質の安定性を参照する調節段階と共に、細胞外でのそれぞれのタンパク質の濃度を調節する。細胞外とは、例えば、これらに限定されないが、培養培地、組織、細胞内基質もしくは空間、または血液もしくはリンパ液などの体液のことを指し得る。

上で述べた調節段階の制御は、例えば、細胞タイプもしくは組織タイプに依存しないか、または細胞タイプもしくは組織タイプに特異的であり得る。本発明の特に好ましい実施形態では、調節段階の制御は、細胞タイプもしくは組織タイプに特異的である。そのような細胞タイプもしくは組織タイプに特異的な調節は、好ましくは、核酸の転写を参照する調節段階によって達成される。この転写調節は、細胞タイプもしくは組織タイプに特異的なプロモーター配列の使用によって達成することができる。この細胞タイプもしくは組織タイプに特異的な調節からの結果は、様々なグレードの特異性を有し得る。これは、個別のポリペプチドの発現が、他の細胞もしくは組織タイプに比べて個別の細胞もしくは組織において亢進されること、または該発現が個別の細胞もしくは組織タイプに限定されることを意味する。細胞もしくは組織タイプに特異的なプロモーター配列は、当分野において周知であり、幅広い細胞もしくは組織タイプに対して入手可能である。

発現は、必ずしも細胞タイプもしくは組織タイプに特異的ではないが、生理的状態に依存することがある。そのような状態は、例えば炎症または創傷である。そのような生理的状態に特異的な発現も、上記で述べたすべての調節段階における調節によって達成することができる。生理的状態に特異的な発現のための調節の好ましいやり方は転写調節である。この目的のために、創傷または炎症に特異的なプロモーターを使用することができる。それぞれのプロモーターは、例えば、天然に存在する配列であり、それらは、例えば、免疫反応および／または創傷組織の再生の間に特異的に発現する遺伝子に由来し得る。別の可能性は人工プロモーター配列の使用であり、人工プロモーター配列は、例えば、２つ以上の天然に存在する配列の組合せによって構築される。

調節は、細胞タイプもしくは組織タイプに特異的かつ生理的状態に特異的であることができる。特に、発現は心臓に特異的な発現であることができる。好ましくは、発現は心臓に特異的および／または創傷に特異的である。

本発明によるＭＹＤＧＦタンパク質またはその変異体の発現の調節のための別の可能性は、遺伝子発現の条件付き調節（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）である。条件付き調節を達成するために、オペレーター配列を使用することができる。例えば、Ｔｅｔオペレーター配列を、遺伝子発現を抑制するために使用することができる。Ｔｅｔオペレーターと共にＴｅｔレプレッサーを用いた遺伝子発現の条件付き調節は、当分野において周知であり、多くの個別のシステムが、幅広い原核および真核生物用に確立されている。当業者は、どのように適したシステムを選び、それを個別の用途の特殊なニーズに適合させるかを知っている。

特に好ましい実施形態では、本発明による核酸の使用は、個体、好ましくは線維化または肥大を患っている個体に対する適用を含む。

さらなる態様によれば、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、あるいは心不全の処置における使用のための、本明細書に記載の、核酸または発現システムを含むベクターを提供する。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、細胞に導入され得る、あるいはその中に含まれるタンパク質および／または核酸を細胞に導入し得る、タンパク質またはポリヌクレオチドあるいはその混合物のことを指す。本発明の文脈においては、導入されるポリヌクレオチドによってコードされる目的の遺伝子が、ベクターまたは複数のベクターの導入と同時に、宿主細胞内で発現されることが好ましい。適したベクターの例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、繊維状ファージベクター、ウイルスベクター、ウイルス様粒子および細菌胞子が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の好ましい実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。適したウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ｐｏｘウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の特に好ましい実施形態では、ベクターはアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

治療的投与に適したベクターを使用して、本発明による１種以上のＭＹＤＧＦタンパク質またはその変異体をコードする核酸を、宿主の細胞、組織または個体に導入することができる。適したベクターは、好ましくは、許容されない副作用を引き起こすことなく、核酸を標的細胞にデリバリーすることができる。

特に好ましい実施形態では、本発明によるベクターの使用は、それを必要とする個体に対する適用を含む。

上記のＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体をコードする核酸を含むベクターは、好ましくは、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、あるいは心不全の処置における使用のためのものである。

さらなる態様によれば、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、あるいは心不全の処置における使用のための、本明細書に記載のベクターを含み、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体をコードする核酸を発現する宿主細胞を提供する。

さらなる態様によれば、本発明は、線維化または肥大の処置または予防における使用のための、あるいは心不全の処置における使用のための医薬組成物であって、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を含み、適した医薬賦形剤を含んでいてもよい、医薬組成物を提供する。

「適した医薬賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、薬理学的に不活性な物質、例えば、これらに限定されないが、治療活性成分を投与するのに共に用いる、希釈剤、賦形剤、界面活性物質、安定剤、生理緩衝溶液、または媒体のことを指す。「医薬賦形剤」は「医薬担体」とも呼ばれ、液体または固体であってもよい。液体担体には滅菌された溶液、例えば、水中の生理食塩水溶液ならびに石油、動植物または合成が起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含むがこれらに限定されない油、が含まれるがこれらに限定されない。生理食塩水溶液ならびに含水ブドウ糖およびグリセロールの溶液も、特に注射液に対する液体担体として使用することができる。生理食塩水溶液は、医薬組成物が静脈内投与される場合に好ましい担体である。適した医薬担体の例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。本発明の好ましい実施形態では、担体は適した医薬賦形剤である。適した医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜（ｃｈａｌｋ）、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。そのような適した医薬賦形剤は、好ましくは薬学的に許容される。

「薬学的に許容される」は、動物、より具体的にはヒトにおける使用に対し、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されているか、あるいは米国の薬局方または他の一般的に認知されている薬局方にリストされていることを意味する。

「組成物」という用語には、カプセルを形成する１つの担体としての封入材料を含む活性化合物の剤形であって、その中で活性構成成分が他の担体の有無にかかわらず１つの担体によって取り囲まれ、それゆえその１つの担体が活性化合物と結合する活性化合物の剤形が含まれることが意図されている。

「活性成分」という用語は、医薬組成物または剤形中の、生物学的に活性な物質、すなわち薬学的価値をもたらす物質のことを指す。本発明の文脈においては、活性成分はＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体である。医薬組成物は、互いに協力または独立して作用してもよい１種以上の活性成分を含んでもよい。活性成分は、中性または塩形態として製剤化することができる。塩形態は、好ましくは薬学的に許容される塩である。

「薬学的に許容される塩」という用語は、例えば、これに限定されないが、本明細書に記載の、その断片もしくは変異体を含む本発明のＭＹＤＧＦポリペプチドの塩のことを指す。適した薬学的に許容される塩には、例えば、本発明のポリペプチドの溶液を、薬学的に許容される酸、例えば塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸の溶液と混合することにより形成することができる酸付加塩が含まれる。さらに、ペプチドが酸性部分を担持する場合、適したその薬学的に許容される塩には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムまたはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムまたはマグネシウム塩）；および適した有機配位子（例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対アニオンを使用して形成されるアンモニウム、四級アンモニウムおよびアミンのカチオン）を用いて形成される塩が含まれてもよい。薬学的に許容される塩の実例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、カンシル酸塩（ｃａｍｓｙｌａｔｅ）、炭酸塩、塩化物、クエン酸、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩（ｅｓｔｏｌａｔｅ）、エシル酸塩（ｅｓｙｌａｔｅ）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（ｇｌｙｃｏｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎａｔｅ）、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩（ｉｓｏｔｈｉｏｎａｔｅ）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、粘液酸（ｍｕｃａｔｅ）、２－ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ－メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロ酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない［例えばS. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, pp. 1-19 (1977)を参照のこと］。

一実施形態によれば、活性成分を、有効量において、細胞、組織または個体に投与する。「有効量」とは、意図された目的を達成するのに十分な活性成分の量のことである。活性成分は治療剤であってもよい。所与の活性成分の有効量は、パラメータ、例えば成分の性質、投与経路、活性成分を与える個体のサイズおよび種ならびに投与の目的によって変わることになる。個々のケースにおける有効量は、当分野において確立された方法に従って、当業者が経験的に決定してもよい。本発明の文脈において使用される場合、「投与すること」には、個体へのインビボ投与ならびに細胞または組織へのインビトロまたはエクスビボでの直接投与が含まれる。

本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は、疾患または障害の処置に対してカスタマイズされる。本明細書で使用される場合、疾患または障害の、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、以下の１つ以上を達成することを意味する：（ａ）障害の重症度を低減すること；（ｂ）処置されている障害に特徴的な症状の発現を制限または予防すること；（ｃ）処置されている障害に特徴的な症状の悪化を阻害すること；（ｄ）以前に障害を有したことのある患者において障害の再発を制限または予防すること；（ｅ）以前に障害の症状を示した患者において症状の再発を制限または予防すること；（ｆ）疾患または障害の発生後の死亡率の低下；（ｇ）治癒すること；および（ｈ）疾患の発病予防。「改善すること」という用語も、「処置すること」という用語に包含される。本明細書で使用される場合、疾患または障害の、「予防する」、「予防すること」または「予防」は、そのような疾患または障害が患者において生じることを予防することを意味する。

本発明の特に好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物を用いた処置は、そのような処置を必要とする個体の処置を含む。

本発明によって企図される医薬組成物は、当業者に周知の種々のやり方において製剤化されてもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、液体の形態、例えば溶液、エマルションまたは懸濁液の形態であってもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物は、非経口投与用に，好ましくは静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、肺内投与、腹腔内投与、冠動脈内投与、心臓内投与または粘膜を介した投与用に、好ましくは静脈内投与、皮下投与または腹腔内投与用に製剤化される。経口投与または経肛門投与用の製剤もまた可能である。好ましくは、本発明の医薬組成物は滅菌水溶液の形態にあり、それは他の物質、例えば血液と等張の溶液を作製するのに十分な塩またはグルコースを含有していてもよい。水溶液は、必要であれば、適切に緩衝させるべきである（好ましくは３～９のｐＨに、より好ましくは５～７のｐＨに）。医薬組成物は、好ましくは単位投薬形態である。そのような形態では、医薬組成物は適切な量の活性構成成分を含有する単位用量に細分される。単位投薬形態はパッケージ化された製剤であってもよく、該パッケージは、バイアルまたはアンプルなどの、個別の量の医薬組成物を含有する。

医薬組成物は、好ましくは、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経皮、肺内、腹腔内の、冠動脈内または心臓内経路によって投与され、ここでは当分野において既知の他の投与経路も含まれる。

医薬組成物を個体に対する処置として使用する場合には、医薬組成物の使用は、それぞれの疾患または状態に対する標準的処置と置きかえることができるか、あるいは標準的処置に加えて投与することができる。医薬組成物を追加的に使用するケースでは、医薬組成物を標準的治療の前に、標準的治療と同時に、または標準的治療の後で投与することができる。

医薬組成物は１回以上投与することがさらに好ましい。これは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０回を含む。医薬品の投与のための期間は制限されない。好ましくは、投与は１、２、３、４、５、６、７または８週間を超えない。

医薬組成物の単回用量が、それだけで投与量の総量を構成してもよく、あるいはそれぞれの投与期間に、１回以上のボーラス注射および／または点滴としての投与が含まれてもよい。

さらなる態様によれば、本発明は、線維化の処置を必要とする患者に治療有効量のＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含む、線維化の処置方法を提供する。前記方法では、ＭＹＤＧＦは、好ましくは、配列番号１、または配列番号１のＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈する、その断片もしくは変異体を含む。この点において、断片もしくは変異体は、配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の方法の好ましい実施形態では、線維化は、心臓、腎臓、肺および／または肝臓の線維化である。好ましい実施形態によれば、線維化は間質性肺疾患、より好ましくは進行性線維化性間質性肺疾患、最も好ましくは特発性肺線維症である。

本発明の本方法の好ましい実施形態によれば、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される。

さらなる態様によれば、本発明は肥大の処置方法を提供し、前記方法は、肥大の処置を必要とする患者に治療有効量のＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含む。前記方法では、ＭＹＤＧＦは、好ましくは、配列番号１、または配列番号１のＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を含む。この点において、断片または変異体は、配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の方法の好ましい実施形態によれば、肥大は心筋細胞の肥大である。

本発明の方法の好ましい実施形態によれば、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される。

本発明の本方法の好ましい実施形態によれば、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される。

さらなる態様によれば、本発明は、心不全の処置または予防を必要とする患者に治療有効量の増殖因子ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含み、好ましくは心不全が慢性心不全である、心不全の処置または予防方法を提供する。好ましい実施形態によれば、心不全の処置方法において、心不全または慢性心不全はＨＦｐＥＦまたはＨＦｒＥＦであり、好ましくはＨＦｐＥＦはステージＣもしくはステージＤのＨＦｐＥＦであるか、またはＨＦｒＥＦはステージＣもしくはステージＤのＨＦｒＥＦである。この点において、断片または変異体は、配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の本方法の好ましい実施形態によれば、ＭＹＤＧＦタンパク質またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体は、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される。

実施例は、本発明をさらに例示し、より良い理解の助けとなるように考案されている。それらは決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されてはならない。

実施例において使用される材料と方法
別様に述べられない限り、以下の材料および方法を実施例において使用した。

エンドセリン１（ＥＴ１）およびアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）はｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、マウスインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社からから購入し、ＳＭＩ４ａはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社から購入した（カタログ番号［＃］Ｓ８００５）。抗体は、Ａｂｃａｍ社［筋／小胞体Ｃａ２^＋ＡＴＰアーゼ２ａ［ＳＥＲＣＡ２ａ］、ポリクローナル、＃ａｂ９１０３２；アルファ－チューブリン、クローンＥＰＲ１３４７８（Ｂ）］、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ベータアクチン、クローン１３Ｅ５；ビンキュリン、クローンＥ１Ｅ９Ｖ）、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈ社（マウスＭＹＤＧＦ、ポリクローナル、特注品）（Korf-Klingebiel、2015）およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社（ＰＩＭ１、クローンＧ．３６０．１）から購入した。

組換えＭＹＤＧＦ。動物由来フリーの、化学的に定義された、タンパク質フリーのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７発現培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で培養したＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞内で、Ｃ末端８×Ｈｉｓタグを有する組換えマウスＭＹＤＧＦを作製した（Karste et al. Methods Mol Biol. 2017;1586:313-324）。トランスフェクション効率は、ＧＦＰをコードする対照プラスミドをコトランスフェクトすることにより評価した。細胞培養液の上清（６Ｌ）を遠心分離により回収し、５ｋＤａのＰｅｌｌｉｃｏｎ２フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用したＰｒｏｆｌｕｘ Ｍ１２クロスフロー限外ろ過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）内で、３００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ／ＮａＣｌ）に対して透析ろ過することにより、１５倍に濃縮した。濃縮物を、０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｂｒａｎ３００カプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を使用してろ過し、アジ化ナトリウム（０．０５％）を加えた。ＭＹＤＧＦを、ＡＥＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ Ｍシステム（Ｃｙｔｉｖａ社）および５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用することにより捕捉した。ＵＶシグナルがベースラインに達するまで、カラムをＰＢＳ／ＮａＣｌで洗浄した。イミダゾール（３０ｍｍｏｌ／Ｌ）で溶出した、組換えタンパク質を含有するフラクションをプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（５，０００ＭＷＣＯ）限外ろ過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を使用して濃縮した。ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、タンパク質をさらに精製した。ＭＹＤＧＦを単一のピークにおいて溶出し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（５，０００ＭＷＣＯ）限外ろ過ユニットを使用して、２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。タンパク質濃度を、分子吸光係数（１ｍｇ／ｍｌ＝Ａｂｓ_{２８０ｎｍ} ０．９５）により計算した。組換えタンパク質（総収量５．９５ｍｇ／Ｌ）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ社）を使用するトリプシンのフィンガープリント法によって特徴付けた。タンパク質サンプルを液体窒素中で瞬間凍結し、マイナス８０℃で保管した。

Ｍｙｄｇｆ欠損マウス。Ｍｙｄｇｆの遺伝子欠失を伴うマウス（Ｍｙｄｇｆ ｔｍ１Ｋｃｗ、マウスゲノムインフォマティクスＩＤ：５６８８４７２）が以前に記載されている。該動物（ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統に１０世代戻し交配し、ヘテロ接合性交配によりそのバックグラウンドを維持した。すべての実験において同腹子を使用した。野生型および標的化された対立遺伝子を、ゲノムＰＣＲによって検出した（Korf-Klingebiel, 2015）。

マウスの手術および機能評価。すべての外科手技は、ドイツのハノーバーの当局［ニーダーザクセン州消費者保護および食品安全局（Ｎｉｅｄｅｒｓａｅｃｈｓｉｓｃｈｅｓ Ｌａｎｄｅｓａｍｔ ｆｕｅｒ Ｖｅｒｂｒａｕｃｈｅｒｓｃｈｕｔｚ ｕｎｄ Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌｓｉｃｈｅｒｈｅｉｔ）］によって承認された。マウスを、ハノーバー医科大学の中央動物施設（ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｉｍａｌ ｆａｃｉｌｉｔｙ）内の個別換気ケージ内で、１２時間の明暗サイクルにおいて飼育した。餌と水は自由に与えた。横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）手術（Rockman et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88:8277-8281）を、８～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおいて実施した。０．０２ｍｇ／ｋｇのアトロピン（Ｂ．Ｂｒａｕｎ社）および２００ｍｇ／ｋｇのメタミゾール（Ｚｅｎｔｉｖａ社）で、該動物の皮下に前処置した。３～４％のイソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ社）を用いて、誘導室内で麻酔を誘導した。経口挿管後、マウスに機械的に人工呼吸させ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、ミニベント Ｔｙｐｅ ８４５）、１．５～２％のイソフルランを用いて麻酔を維持した。手術の間、温度コントローラー（Ｆｏｅｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）に接続した加熱パッドの上にマウスを置いて、直腸内温度を３７℃に保った。左前外側の開胸を、手術用顕微鏡下で実施した。胸腺と脂肪組織を大動脈弓から分離させた後、６－０絹縫合糸を腕頭動脈と左頸動脈の間に置き、２６ゲージ鈍針に対して結紮した。結び目を結んだ後、該針を取り出した。傷を閉じた後、マウスを人工呼吸器から切り離し、３２℃のインキュベーター内で回復させた。擬似手術した対照マウスにおいては、大動脈の周りの結紮糸を結ばなかった。マウスに３週間の水泳訓練プロトコールを供して生理的肥大を誘導した（Heineke, Methods Mol Biol. 2013;963:279-301）。

フェイスマスクを介して１～２％のイソフルランで鎮静させたマウスにおいて、２Ｄ経胸壁心エコー検査を、２０～４６ＭＨｚの線形変換器（ＭＸ４００、Ｖｅｖｏ ３１００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社）を用いて実施した。大動脈狭窄部位全体にかかる圧勾配および右総頸動脈と左総頸動脈の最大血流速度（Ｖｍａｘ）比を、ドップラー超音波検査により、ＴＡＣ手術または擬似手術後直ちに決定した。ＬＶ拡張末期面積（ＬＶＥＤＡ）およびＬＶ収縮末期面積（ＬＶＥＳＡ）を、傍胸骨の長軸ビューから記録した。面積変化率（％）を、［（ＬＶＥＤＡ－ＬＶＥＳＡ）／ＬＶＥＤＡ］×１００として計算した。

ＬＶの圧容量測定のために、マウスに、２ｍｇ／ｋｇのブトルファノール（Ｚｏｅｔｉｓ社）を皮下注射した。４％のイソフルランを用いて麻酔を誘導した。経口挿管後、マウスに０．８ｍｇ／ｋｇのパンクロニウム（Ａｃｔａｖｉｓ社）を腹腔内注射し、２％のイソフルランを用いて麻酔を維持した。１．４Ｆの微圧計を先端につけたコンダクタンスカテーテル（ＳＰＲ－８３９、Ｍｉｌｌａｒ社の機器）を、右頸動脈を介して左心室に挿入した。定常状態の圧容量ループを１ｋＨｚの速度においてサンプリングし、ＬａｂＣｈａｒｔ ７ Ｐｒｏソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いてを解析した。

骨髄移植。７～９週齢のＭｙｄｇｆ ＷＴまたはＫＯのドナーマウスの大腿骨および脛骨から、骨髄細胞（ＢＭＣ）をフラッシュさせた。赤血球を、ＮＨ_４Ｃｌ溶解によって除去した。７～９週齢のＭｙｄｇｆ ＷＴまたはＫＯのレシピエントマウスに致死的な放射線（９．５Ｇｙ）を浴びせ、１０^６個のＢＭＣ（１０６ ＢＭＣｓ）を尾静脈を介して移植した。移植後、マウスをシプロフロキサシン（Ｂａｙｅｒ社）で３週間処置した（飲み水中に１００ｍｇ／Ｌ）。ＴＡＣ手術を、移植の７～８数週間後に実施した。対照実験において本プロトコールを適用し、ＣＤ４５．２レシピエントマウスに致死的な放射線を浴びせ、コンジェニックＣＤ４５．１ドナーマウス（Ｂ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃａ Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ；ジャクソン研究所）から得たＢＭＣを移植した。ＣＤ４５．１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、クローンＡ２０）（希釈度、１：１６）およびＣＤ４５．２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、クローン１０４）（１：１５０）の抗体を使用したフローサイトメトリーによって示されるように、８週間後には、９５％を超える血中白血球がＣＤ４５．１ｈｉｇｈであった。

レンチウイルス遺伝子導入。以前に記載されているように（Lachmann et al. Gene Ther. 2013;20:298-307）、ｔｅｔＯ／ＣＭＶプロモーター制御下の完全長マウスＭＹＤＧＦをコードするレンチウイルスおよび空の対照ウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で生成した。骨髄に由来する炎症細胞における条件的付きＭＹＤＧＦ過剰発現を可能にするために、普遍的に活性なＲｏｓａ２６プロモーターの制御下で逆テトラサイクリン制御型トランスアクチベーター（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）（ｒｔＴＡ－Ｍ２）タンパク質を発現する７～９週齢のＲ２６－Ｍ２ｒｔＴＡマウスから、造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離した。この目的のために、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のＬｉｎｅａｇｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、系列陰性（ｌｉｎ^－）骨髄細胞を磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）により単離した。以前に記載されているように（Lachmann 2013; Kustikova et al. Exp Hematol. 2014;42:505-515 e507）、サイトカイン（ｋｉｔリガンド、インターロイキン３、インターロイキン１１、Ｆｌｔ３リガンド）を補った血清フリーＳｔｅｍＳｐａｎ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で細胞を拡大培養し、次いで、レトロネクチン（タカラバイオ社）で覆ったプレート内で、レンチウイルスベクター粒子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清で形質導入した。ＷＴレシピエントマウスに致死的な放射線（９．５Ｇｙ）を浴びせ、Ｌｅｎｔｉ．対照またはＬｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦで形質導入した１×１０^６個のＨＳＣを、尾静脈を介して移植した。移植後、マウスをシプロフロキサシンで３週間処置した。擬似手術またはＴＡＣ手術を、移植の７週間後に実施した。レンチウイルスで形質導入したＨＳＣに由来する炎症細胞においてＭＹＤＧＦ発現を誘発するために、マウスをドキシサイクリン（飲み水中に２ｍｇ／ｍｌ）で、手術の１週間前から処置した。

ＭＹＤＧＦタンパク質治療。アルゼット浸透圧ミニポンプ（モデル２００４、０．２５μＬ／ｈの注入速度で２８日間、６μＬあたり１０μｇのＭＹＤＧＦまたは希釈剤のみを充填した）を、ＴＡＣ手術後直ちに皮下肩甲骨間のポケットに置いた。その後単回の腹腔内ボーラス注射を授けた（１０μｇのＭＹＤＧＦまたは希釈剤のみ）。

アデノウイルス。ＳＥＲＣＡ２Ａまたは赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄをコードするアデノウイルスを、ＡｄＥａｓｙアデノウイルスベクターシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて生成した。ＴＡＣ手術の５日前に、マウスにアデノウイルスを注射した（尾静脈を介して１×１０^１０プラーク形成単位）。ＴＡＣ後直ちに、マウスに２回目のアデノウイルスの注射を与えた。

ＭＹＤＧＦ標的化液体クロマトグラフィー／多重反応モニタリング質量分析。マウスおよび患者から得たＥＤＴＡ血漿サンプル中のＭＹＤＧＦ濃度を、標的化液体クロマトグラフィー／多重反応モニタリング質量分析（ＬＣ／ＭＲＭ－ＭＳ）（Polten et al. Anal Chem. 2019;91:1302-1308）により決定した。

蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）およびフローサイトメトリー。炎症細胞を、酵素消化およびＦＡＣＳにより、左心室からから単離した（Hulsmans 2018;Korf-Klingebiel et al. Circ Res. 2019;125:787-801）。左心室を、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ社）、２．４ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ（Ｇｉｂｃｏ社）および１００Ｕ／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するＰＢＳ中で、３７℃で３０分間消化した。細胞懸濁液をろ過し（４０μｍのセルストレーナー、Ｆａｌｃｏｎ社）、洗浄し、４％のＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、および精製されたマウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ｍｏｕｓｅ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ、クローン２．４Ｇ２）（１：５５）を含むＰＢＳ中で、４℃で５分間インキュベートした。次いで、細胞を、以下の抗体と共に４℃で２０分間インキュベートした：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０－ＰＥ（クローンＲＡ３－６Ｂ２）（１：５００）、ＣＤ９０．２／Ｔｈｙ－１．２－ＰＥ（クローン５３－２．１）（１：２５００）、ＮＫ－１．１－ＰＥ（クローンＰＫ１３６）（１：５００）、ＣＤ４９ｂ／ＤＸ５－ＰＥ（クローンＤＸ５）（１：５００）、Ｌｙ６Ｇ－ＰＥ（クローン１Ａ８）（１：５００）およびＣＤ１１ｂ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（クローンＭ１／７０）（１：５０）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のＬｙ６Ｃ－ＡＰＣ（クローン１Ｇ７．Ｇ１０）（１：８）；ならびにＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社のＣＤ４５－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５７０（クローン３０－Ｆ１１）（１：３３）、Ｆ４／８０－ＦＩＴＣ（クローンＢＭ８）（１：３３）、ＣＤ３－ＰＥ／Ｃｙ７（クローン１７Ａ２）（１：３３）およびＣＤ１９－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（クローン６Ｄ５）（１：３３）。洗浄後、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩｕ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）上で、細胞を分取した。単球は、ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ（ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ９０．２／Ｔｈｙ－１．２、ＮＫ１．１、ＣＤ４９ｂ／ＤＸ５、Ｌｙ６Ｇ）ｌｏｗ Ｆ４／８０ｌｏｗ Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈとして；マクロファージは、ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ（ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ９０．２／Ｔｈｙ－１．２、ＮＫ１．１、ＣＤ４９ｂ／ＤＸ５、Ｌｙ６Ｇ）ｌｏｗ Ｆ４／８０ｈｉｇｈまたはｌｏｗ Ｌｙ６Ｃｌｏｗとして；好中球は、ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ（ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ９０．２／Ｔｈｙ－１．２、ＮＫ１．１、ＣＤ４９ｂ／ＤＸ５、Ｌｙ６Ｇ）ｈｉｇｈとして；Ｔ細胞は、ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＣＤ１１ｂｌｏｗ（ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ９０．２／Ｔｈｙ－１．２、ＮＫ１．１、ＣＤ４９ｂ／ＤＸ５、Ｌｙ６Ｇ）ｈｉｇｈ ＣＤ３ｈｉｇｈ ＣＤ１９ｌｏｗとして；およびＢ細胞は、ＣＤ４５ｈｉｇｈ ＣＤ１１ｂｌｏｗ（ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ９０．２／Ｔｈｙ－１．２、ＮＫ１．１、ＣＤ４９ｂ／ＤＸ５、Ｌｙ６Ｇ）ｈｉｇｈ ＣＤ３ｌｏｗ ＣＤ１９ｈｉｇｈとして同定された。フローサイトメトリーの場合は、炎症細胞を、標識された上記の抗体と共にインキュベートした。次いで、細胞をＴｒｕＣＯＵＮＴチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加え、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）上でカウントし、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６ソフトウェアを用いて解析した。

ＭＡＣＳによる内皮細胞および線維芽細胞の単離。ＬＶの心筋を、コラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）およびデオキシリボヌクレアーゼＩ（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて酵素的に消化した。細胞懸濁液をろ過し（３０μｍのセルストレーナー、Ｆａｌｃｏｎ社）、洗浄し、ＣＤ４５マイクロビーズと共にインキュベートし、ＬＤカラムに添加した。ＣＤ４５ｌｏｗ細胞のフロースルーフラクションを洗浄し、ＣＤ１４６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄと共にインキュベートし、ＬＤカラムに添加した。内皮細胞（ＣＤ４５ｌｏｗ ＣＤ１４６ｈｉｇｈ）をカラムから溶出し、ＲＮＡの単離用に使用した（ＲＮｅａｓｙキット、Ｑｉａｇｅｎ社）。ＣＤ４５ｌｏｗ ＣＤ１４６ｌｏｗ細胞のフロースルーフラクションを洗浄し、Ｆｅｅｄｅｒ Ｒｅｍｏｖａｌ ＭｉｃｒｏＢｅａｄと共にインキュベートし、ＬＳカラムに添加した。線維芽細胞をカラムから溶出し、ＲＮＡの単離用に使用した（すべての試薬および設備はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社から得た）。

組織の収集および解析。ＴＡＣ手術または擬似手術後の異なる時点でマウスを屠殺し、左心室を取り出した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して単離した。ＲＩＰＡバッファー中でタンパク質ライセートを調製した。心室中部（Ｍｉｄｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）のスライスをＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ）中に包埋し、液体窒素中で瞬間凍結し、マイナス８０℃で保管した。６μｍの凍結切片を調製した。切片をローダミンがコンジュゲートしたコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で染色して、心筋細胞の境界を強調させた。２００～４００個の筋細胞の外周をなぞり、デジタル化して平均断面積を計算した。切片をフルオレセインがコンジュゲートしたＧＳＬ ＩイソレクチンＢ４（ＩＢ４、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で染色して、毛細血管を可視化した。画像を蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１）によって取得した。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社のポリクローナル抗体（１：１００）およびＦＩＴＣ標識ポリクローナル二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ａ２４５３２）（１：２００）で染色後に、共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳスキャンヘッドを搭載したＬｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ）により、６μｍの凍結切片中のＭＹＤＧＦを可視化した。切片を、ＣＤ１１ｂ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、クローンＭ１／７０）（１：２００）およびＣｙ３標識ポリクローナル二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、＃７１２－１６５－１５３）（１：２００）で共染色した。パイロット実験では、すべての二次抗体が低いバックグラウンドシグナルを与えることを見出した。切片をシリウスレッド（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で染色して、間質コラーゲン容量分率を光学顕微鏡を使用して定量化した。

心筋細胞の単離および培養。成体マウスの心室心筋細胞（ＡＭＣＭ）を、Ａｌｌｉａｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｉｎｇ－ｇａｔｅｗａｙ．ｏｒｇ／ｄａｔａ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｇｉ？ｃａｔ＝０）から得たプロトコールを使用して、酵素消化により単離した。５％のＦＣＳおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌの２，３－ブタンジオンモノオキシム（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を補った１９９培地（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で、ＡＭＣＭをラミニンで覆った６ウェルプレート上に蒔き、細胞の長さと幅を、位相差顕微鏡およびデジタル画像解析装置（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｚｅｉｓｓ社）により決定した。新生仔ラットの心室心筋細胞（ＮＲＣＭ）を、１～３日齢のスプラーグドーリーラットから、パーコール密度勾配遠心分離により単離した（Shubeita et al. A paracrine mechanism for myocardial cell hypertrophy. J Biol Chem. 1990;265:20555-20562）。ＮＲＣＭを、５％のウマ血清、２．５％のＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質を補ったＤＭＥＭ（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、４部）と１９９培地（１部）中で、ゼラチンで覆った培養皿上に蒔いて一晩置いた。次いで、細胞をグルタミンと抗生物質のみを補ったＤＭＥＭと１９９培地に切り替え、種々の薬剤で２４時間刺激した。ＮＲＣＭ表面積をＰｌａｎｉｍｅｔｒｙ法により決定し、タンパク質含有量をブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により決定した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬およびｓｉＲＮＡ（ＰＩＭ１：＃４３９０７７１、ＩＤ：ｓ１２８２０５；スクランブルしたもの：＃４３９０８４３、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）を使用して、ＮＲＣＭをｓｉＲＮＡ［５０ｐｍｏｌ／１０^６細胞（５０ｐｍｏｌ／１０６ｃｅｌｌｓ）］でトランスフェクトした。

定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）。ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡを細胞および組織から単離した後、ｃＤＮＡに逆転写し（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）；ｍＲＮＡ濃度をＴａｑＭａｎアッセイまたはＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎアッセイを用いて決定した（アニーリング、６０℃で１分間；伸長、７２℃で１分間）（すべての試薬はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から得た）。標準曲線（ＴａｑＭａｎ）または相対定量（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ）を使用してデータを解析した。

プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクスのための試料調製。刺激後に、ＮＲＣＭ（１レプリケートあたり２×１０^６個の細胞）を、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し；２４ｍｍｏｌ／Ｌ トリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、１％ デスオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ社）およびＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ社）を含有する４００μＬの氷冷ＲＩＰＡバッファーで可溶化し；－８０℃で一晩凍結した。解凍後、サンプルをＩＫＡ Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘを用いて氷上で分散させ、１４，０００ｇで４℃で５分間遠心分離した。上清を新しい反応チューブに移し、タンパク質濃度をＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて測定した。プロテオミクスの場合は、以前に記載されているように（Polten et al. Anal Chem. 2019;91:1302-1308）、５０μｇのタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびゲル内トリプシン消化を使用してプロセシングした。具体的には、各ゲルのレーンを６つの部分に切り分けて別々に消化し、６つのペプチドサンプルを生成した。リン酸化プロテオミクスの場合は、改変されたフィルター支援サンプル調製（ｆｉｌｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）プロトコールを使用した（Nel et al. J Proteome Res. 2015;14:1637-1642）。簡潔に言えば、３００μｇのタンパク質を、２００μＬの尿素バッファー（８ｍｏｌ／Ｌ 尿素、０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ９．５］）と合わせて、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心式フィルター（Ｍｅｒｃｋ社）にロードした。フィルター膜を２００μＬの尿素バッファーで２回洗浄し、１００μＬの、５０ｍｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミドの尿素バッファー溶液を加えることにより、暗所で２０分間、遊離のシステインをカルバミドメチル化した。その後、フィルター膜を１００μＬの尿素バッファーで２回洗浄し、１００μＬの４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ_４ＨＣＯ_３で２回洗浄した。７μｇの質量分析グレードのトリプシン（Ｓｅｒｖａ社）を含有する１２０μＬの４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ_４ＨＣＯ_３中で、トリプシン消化を実施した。３７℃で一晩消化した後、ペプチドを４０μＬの４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ_４ＨＣＯ_３で２回溶出した。フロースルーを合わせ、１２μＬの１０％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることによって酸性化し、次いで真空遠心分離によって乾燥させた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＰｉｅｒｃｅ Ｆｅ－ＮＴＡリン酸化ペプチド濃縮キットおよびＰｉｅｒｃｅ ＴｉＯ_２リン酸化ペプチド濃縮キットを使用し、メーカーのプロトコールに従って、リン酸化ペプチドを濃縮した。簡潔に言えば、Ｆｅ－ＮＴＡカラムを平衡化した後、乾燥させた消化ペプチドを２００μＬの結合バッファー中に溶解し、カラムに添加し、室温で３０分間インキュベートした。遠心分離した後、フロースルーを収集した。１００μＬの洗浄バッファーＡを用いた２回の洗浄工程および２００μＬの洗浄バッファーＢを用いた２回の洗浄工程後に、フロースルーおよび洗浄フラクションを合わせ、真空遠心分離によって乾燥し、ＴｉＯ_２リン酸化ペプチド濃縮用スピンチップにロードした。洗浄後、スピンチップに結合したリン酸化ペプチドを溶出し、真空遠心分離によって乾燥させた。Ｆｅ－ＮＴＡカラムに結合したリン酸化ペプチドを、１００μＬの溶出バッファーで２回溶出した。溶出フラクションを合わせ、真空遠心分離により乾燥させた。Ｆｅ－ＮＴＡおよびＴｉＯ_２ベースの濃縮工程から得られたリン酸化ペプチド溶出液を、Ｐｉｅｒｃｅグラファイトスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用して脱塩した。

液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）およびデータ処理。１レプリケートあたり６つのペプチドサンプルおよび２つのリン酸化ペプチドサンプルを、以前に記載されているように（Junemann et al. Front Microbiol. 2018;9:3083）、それぞれ３０μＬの高速液体クロマトグラフィーローディングバッファー（２％ アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ）中で元に戻し、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に接続したＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して別々に分析した。統合されているＡｎｄｒｏｍｅｄａペプチド検索エンジンをラットのＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（Tyanova et al. Nat Protoc. 2016;11:2301-2319; UniProt Consortium. UniProt:a worldwide hub of protein knowledge. Nucleic Acids Res. 2019;47:D506-D515）に対して適用するＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（バージョン１．６．１．０）を用いて、生成されたスペクトルを解析した。プロピオンアミド化（Ｃ）（プロテオーム解析）またはカルバミドメチル化（Ｃ）（リン酸化プロテオーム解析）を固定修飾として設定し；リン酸化（Ｓ／Ｔ／Ｙ）、酸化（Ｍ）、脱アミド（Ｎ／Ｑ）およびＮ末端アセチル化を可変修飾として設定した。６アミノ酸を超えるペプチド長および最大で２つまでのトリプシン切断ミスを許可した。ペプチドおよびタンパク質レベルの両方に対して偽発見率（ＦＤＲ）の閾値を０．０１に設定し、ｍａｔｃｈ－ｂｅｔｗｅｅｎ－ｒｕｎｓアルゴリズムを適用した。潜在的な夾雑物およびリバースデータベースヒット（ｒｅｖｅｒｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｈｉｔ）を除外した。０．３のｗｉｄｔｈおよび１．８のｄｏｗｎ ｓｈｉｆｔを適用するＰｅｒｓｅｕｓソフトウェア（バージョン１．６．１．３）を使用して、レプリケートごとに別々に、ｌｏｇ_２変換されたすべての測定強度の正規分布に基づいて欠損値を補完した（Tyanova et al. Nat Methods. 2016;13:731-740）。リン酸化プロテオーム解析の場合は、局在確率（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）が０．７５よりも大きなリン酸化部位のみを考慮した。少なくとも１つの実験条件から得た４つのレプリケートすべてで検出できないリン酸化部位を除いた。リン酸化部位の強度を、対応するタンパク質の存在量に対して正規化した。主成分解析は、Ｐｅｒｓｅｕｓによって計算したＡＮＯＶＡのＰ値が０．０５未満のすべてのリン酸化部位に基づいた。主成分空間内のクラスターを、レプリケートの値の直線回帰に基づいて定めた。中央値が調整されたリン酸化部位の強度、ならびに行および列のツリーに対してユークリッド距離測定基準を使用するＲのＣｏｍｐｌｅｘＨｅａｔｍａｐパッケージを用いて、教師なし階層的クラスタリングを実施した（Gu et al. Bioinformatics. 2016;32:2847-2849）。対比較の場合は、リン酸化強度の差を、対応するタンパク質の存在量の差に対して正規化した。少なくとも１条件でのプロテオームにおいて欠損している定量値、または有意に調節されていないタンパク質［両側独立ｔ検定（２－ｓｉｄｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ）のＰ値＞０．０５］は、タンパク質の存在量比が１であるとみなした。Ｐｅｒｓｅｕｓ、およびＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓデータベース（Hornbeck et al. Nucleic Acids Res. 2015;43:D512-520; Hogrebe et al. Nat Commun. 2018;9:1045）から得たリン酸化部位のアノテーションを使用して、キナーゼモチーフ濃縮線形解析（Ｌｉｎｅａｒ ｋｉｎａｓｅ ｍｏｔｉｆ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。キナーゼと基質の関係を、測定されたリン酸化部位の周囲の配列認識モチーフに基づいて予想した。有意に調節されているリン酸化部位のキナーゼ基質モチーフを、フィッシャーの正確確率検定を用いて明確に濃縮した。有意に調節されているキナーゼ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ＜０．０２）の場合は、すべての潜在的な標的を抽出し［キナーゼ－基質認識モチーフ陽性、局在確率＞０．７５、両側独立ｔ検定（２－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ）Ｐ値＜０．０５］、算術平均調節を決定した（Ｈｏｇｒｅｂｅ ２０１８）。

ＰＩＭキナーゼ活性アッセイ。Ｐｉｍキナーゼ活性を、Ｐｉｍ ｋｉｎａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍおよびＡＤＰ－Ｇｌｏ ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｖ４０３２）を用いて測定した。

細胞内Ｃａ^２＋濃度の測定。５％のＦＣＳおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌの２，３－ブタンジオンモノオキシムを補った１９９培地中で、ＡＭＣＭを、ラミニンで覆ったカバーガラス上に蒔いた。３時間後、細胞を１９９培地に切り替え、１．５μｍｏｌ／Ｌのｆｕｒａ－２，ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ｆ１２２１）を３７℃で２０分間ロードし、１５分間２回洗浄し、特注のかん流チャンバーに移した。ＮａＣｌ １１７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ ５．７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ １．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ_２ １．２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４ ０．６６ｍｍｏｌ／Ｌ、グルコース １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウム ５ｍｍｏｌ／Ｌ、クレアチン １０ｍｍｏｌ／ＬおよびＨｅｐｅｓ ２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）を含有する等張電解質溶液を用いた一定の再循環下で、ＭｙｏＰａｃｅｒ ＥＰ刺激装置（ＩｏｎＯｐｔｉｘ社）を用いて細胞を電気的に刺激した（Mutig et al. Mol Immunol. 2013;56:720-728）。刺激（１Ｈｚ、１５Ｖ、４ｍｓのインパルス持続期間）に反応する、明確に定義された横紋を有する静止状態の棒状の心筋細胞をランダムに選択した。以前に記載されているように（Mutig 2013; Dobson et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008;295:H2364-2372）、二重励起蛍光光電子増倍管システム（ＩｏｎＯｐｔｉｘ社）を使用して、３４０ｎｍと３８０ｎｍの交互波長による励起後に５１０ｎｍで放出される蛍光を測定することにより、単一細胞のＣａ^２＋トランジェントを記録した。ｆｕｒａ－２，ＡＭをロードしていない１０個の細胞の群から、平均バックグラウンド蛍光を別々に記録し、３４０ｎｍ／３８０ｎｍ蛍光比（Ｒ）を計算する前に減算した。１細胞あたり２０個のカルシウムトランジェントのデータを平均した。Ｆｕｒａ－２，ＡＭ比の大きさ、ｆｕｒａ－２，ＡＭ比の増加の最大速度、およびｆｕｒａ－２，ＡＭ比の減衰の時定数（τ）を、ＩｏｎＷｉｚａｒｄ ６．５を使用して解析した。

単細胞のサルコメアの収縮および弛緩の解析。５％のＦＣＳおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌの２，３－ブタンジオンモノオキシムを補った１９９培地中で、ＡＭＣＭを、ラミニンで覆ったカバーガラス上に蒔いた。３時間後、細胞を１９９培地に切り替え、特注のかん流チャンバーに移し、上記のように電気的に刺激した。細胞ごとに、１５～２０サルコメアを含む目的の長方形の領域を定義し、倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１）に接続した可変速度ＣＣＤビデオカメラ（ＭｙｏＣａｍ－Ｓ、ＩｏｎＯｐｔｉｘ社）を用いて、サルコメア長の変化を記録した。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）アルゴリズムを、電気的にペースを整えた収縮の間のサルコメア長の変化を記録するために使用した。１細胞あたり２０～３０個の単収縮のデータを平均した。収縮の大きさ、最大短縮速度および最大弛緩速度を、ＩｏｎＷｉｚａｒｄ ６．５ソフトウェア（ＩｏｎＯｐｔｉｃｓ社）を用いて解析した。

ヒト血漿サンプル。重度の高勾配大動脈弁狭窄症（ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｉｅｎｔ ａｏｒｔｉｃ ｓｔｅｎｏｓｉｓ）（弁面積０．６５±０．０５ｃｍ^２、平均圧勾配５１±３ｍｍＨｇ）の心エコーエビデンスを有し、待機的な経カテーテル的大動脈弁植え込み術（ＴＡＶＩ）をハノーバー医科大学で受ける予定であった１１患者（７６～８６歳の年齢範囲、３男性および８女性）から、ＥＤＴＡ処理した血漿サンプルを得た。冠動脈疾患（５０％超の任意の管腔径狭窄）、活動性の炎症または悪性疾患、３０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ^２未満の推定糸球体ろ過率、または心代償不全の兆候を有する患者は除外した。第２の血漿サンプルを、ＴＡＶＩの３ヶ月後の定期フォローアップ検査の間に採取した。さらに、ハイデルベルク大学において募集した１３人の明らかな健常人（７５～８４歳、３男性および１０女性）から、ＥＤＴＡ血漿サンプルを得た（Giannitsis et al. Clin Biochem. 2020;78:18-24）。血漿サンプルを、－８０℃で保管した。すべての参加者が書面によるインフォームドコンセントを提供し、現地の倫理委員会が本研究を承認した。

統計学的解析。マウス同腹子を、異なる実験群にランダムに割り振った。目視での精査に基づけば、データは正規分布しており、異なる群における分散は類似していた。標本サイズが小さいため、我々は分散の正規性または同一性について統計検定を適用しなかった。別様に述べられない限り、データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として提示する。２つの独立したサンプルのｔ検定を、２つの群を比較するために使用した。２つを超える群の間の比較については、独立変数が１つの場合には一元配置分散分析を、独立変数が２つの場合には２元配置分散分析を使用した。ダネットの事後検定を、単一対照群を用いた多重比較に対して使用した。テューキーの事後検定を、多重比較の調整のために使用した。０．０５未満の両側Ｐ値が、統計学的な有意性を示すと考えた。Ｋ．Ｃ．Ｗ．は研究の全データに完全にアクセスすることができたのであって、データの完全性およびデータ解析に対して責任を負う。
［実施例１］

国際公開第２０１４／１１１４５８号において詳述されているように、ＭＹＤＧＦタンパク質（ヒト因子１；Ｃ１９ｏｒｆ１０）を同定した。ヒト因子１をコードする核酸配列が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５６００５（配列番号６）の下に入手可能である。Ｎ末端シグナルペプチドを含むヒト因子１のアミノ酸配列を、配列番号３において詳述する。実施例では、Ebenhoch R. et al., Crystal structure and receptor-interacting residues of MYDGF - a protein mediating ischemic tissue repair［Nat Commun. 2019 Nov 26;10(1):5379およびPolten et al. Plasma Concentrations of Myeloid-Derived Growth Factor in Healthy Individuals and Patients with Acute Myocardial Infarction as Assessed by Multiple Reaction Monitoring-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2019 Jan 15;91(2):1302-1308］において詳述されているように、シグナルペプチドを含まないヒトＭＹＤＧＦを使用し、発現した。

実施例において使用した、ヒトＭＹＤＧＦに対するマウスホモログ：
発現された、ハツカネズミＤＮＡセグメント、Ｃｈｒ１７、ウェイン州立大学１０４（Ｄ１７Ｗｓｕ１０４ｅ）。マウス因子１をコードする核酸配列が、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０８０８３７．２（配列番号７）の下に入手可能である。Ｎ末端シグナルペプチドを含むマウス因子１のアミノ酸配列を、配列番号４において詳述する。Ｎ末端シグナルペプチドは関連する生物学的機能を有さないため、本発明では、配列番号２によるＮ末端ペプチドを含まないマウスＭｙｄｇｆを使用した。この目的のために、マウスＭｙｄｇｆのｃＤＮＡ配列（内因性Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端６×Ｈｉｓタグを含有する）を、ｐＦｌｐＢｔＭ－ＩＩプラスミドベクター中にクローニングし、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞内で発現した（Meyer S, et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 2013;8:e68674）。シグナルペプチドを欠くマウスＭｙｄｇｆを、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、馴化細胞上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）から精製した。組換えＭｙｄｇｆの精製のために、６×Ｈｉｓタグをタンパク質に付加した。

ヒトＭＹＤＧＦ（配列番号１）とマウスＭｙｄｇｆ（配列番号２）の間で配列比較すると、両アミノ酸配列の間には９２％の配列同一性があることが明らかになる。
［実施例２］

マウスおよびヒト骨髄由来増殖因子は、エンドセリン１（ＥＴ１）で刺激した新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）の肥大（エンドポイント、細胞面積）を、用量依存的に阻害する。ＮＲＶＭを、１００ｎｍｏｌ／ＬのＥＴ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、ここおよび以下で使用した）および／または組換えマウス骨髄由来増殖因子もしくは組換えヒト骨髄由来増殖因子それぞれ（Ｍｙｄｇｆ；ＨＥＫ２９３細胞内で作製し、ここおよび以下で使用した／ＭＹＤＧＦ；Ebenhoch R. et al., Crystal structure and receptor-interacting residues of MYDGF - a protein mediating ischemic tissue repair. Nat Commun. 2019 Nov 26;10(1):5379およびPolten F. et al. Plasma Concentrations of Myeloid-Derived Growth Factor in Healthy Individuals and Patients with Acute Myocardial Infarction as Assessed by Multiple Reaction Monitoring-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2019 Jan 15;91(2):1302-1308に記載の通りにＨＥＫ２９３細胞内で作製し、ここおよび以下で使用した）で２４時間刺激した。ＥＴ１はペプチドホルモンであり、インビトロおよびインビボの、心筋細胞肥大のプロトタイプのインデューサーである（Heineke J & Molkentin JD. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol 2006;7:589-600において概説されている）。心筋細胞肥大を、Ｐｌａｎｉｍｅｔｒｙ法により判定した（エンドポイント、細胞面積）。結果を、以下の表２に示す。

［実施例３］

マウスおよびヒト骨髄由来増殖因子は、エンドセリン１（ＥＴ１）で刺激した新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）の肥大（エンドポイント、タンパク質含有量）を阻害する。ＮＲＶＭを、１００ｎｍｏｌ／ＬのＥＴ１および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子もしくは組換えヒト骨髄由来増殖因子それぞれ（すなわち、ＭｙｄｇｆもしくはＭＹＤＧＦそれぞれ）で２４時間刺激した。結果を、以下の表３に示す。

［実施例４］

マウス骨髄由来増殖因子は、エンドセリン１（ＥＴ１）で刺激した成体ラット心室筋細胞（ＡＲＶＭ）の肥大（エンドポイント、細胞サイズ）を阻害する。ＡＲＶＭを、１００ｎｍｏｌ／ＬのＥＴ１および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（すなわちＭｙｄｇｆ）で２４時間刺激した。心筋細胞肥大を、形態計測（細胞の長さおよび細胞の幅）ならびにＰｌａｎｉｍｅｔｒｙ法（細胞面積）によって判定した。結果を、以下の表４に示す。

［実施例５］

マウス骨髄由来増殖因子は、エンドセリン１（ＥＴ１）で刺激した新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）における筋／小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ２ａ）タンパク質の発現を増加させる。ＮＲＶＭを１００ｎｍｏｌ／ＬのＥＴ１および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（すなわちＭｙｄｇｆ）で２４時間刺激した。次いで、Ｓｅｒｃａ２ａおよびビンキュリンタンパク質の発現レベルを免疫ブロットにより判定した。Ｓｅｒｃａ２ａは、心筋細胞におけるカルシウムホメオスタシスの不可欠なレギュレーターである。心不全の実験モデルおよびヒトの心不全では、心筋細胞におけるＳｅｒｃａ２ａ（ヒトではＳＥＲＣＡ２ａ）の発現が減少しており、それゆえ機能衰退および心不全が促進される。ＳＥＲＣＡ２ａは、従って、心不全における処置標的として提案されている（Kawase Y & Hajjar RJ. The cardiac sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase: a potent target for cardiovascular diseases. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2008;5:554-65において概説されている）。結果を、以下の表５に示す。

［実施例６］

筋／小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ２ａ）のダウンレギュレーションは、エンドセリン１（ＥＴ１）で刺激した新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）におけるマウス骨髄由来増殖因子の抗肥大効果を消失させる。ＮＲＶＭを、Ｓｅｒｃａ２ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入、カタログ番号４３９０７７１、ＩＤ：ｓ１３２０３７）を標的化する低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号４３９０８４３）でトランスフェクトした。その後、ＮＲＶＭを１００ｎｍｏｌ／ＬのＥＴ１および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（すなわち）で２４時間刺激した。心筋細胞肥大を、Ｐｌａｎｉｍｅｔｒｙ法により判定した（エンドポイント、細胞面積）。結果を、以下の表６に示す。

［実施例７］

マウス骨髄由来増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子β１（Ｔｇｆβ１）で刺激した、新生仔ラット心室から単離された線維芽細胞（ＮＲＶＦ）において、抗線維化効果を促進する（エンドポイント、コラーゲン１Ａ１および結合組織増殖因子［Ｔｇｆβ１］のｍＲＮＡ発現）。ＮＲＶＦを、組換えマウスＴｇｆβ１（２ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、ここおよび以下で使用した）および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）で２４時間刺激した。ＴＧＦβ１は、臓器線維化の重要なインデューサーである（Border WA & Noble NA. Transforming growth factor beta in tissue fibrosis. N Engl J Med 1994;331:1286-92において概説されている）。結果を、以下の表７に示す。

［実施例８］

マウス骨髄由来増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子β１（Ｔｇｆβ１）で刺激した、新生仔ラット心室から単離された線維芽細胞（ＮＲＶＦ）において、抗線維化効果を促進する（エンドポイント、α平滑筋アクチン［ＳＭＡ］のプロモーター活性）。ＮＲＶＦを、ヒトαＳＭＡプロモーター断片（－２５９／＋５１塩基対）の制御下にホタルルシフェラーゼをコードするレポータープラスミドでトランスフェクトし、次いで組換えマウスＴｇｆβ１（２ｎｇ／ｍＬ）および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）で２４時間刺激した。結果を、以下の表８に示す。

［実施例９］

ヒト骨髄由来増殖因子は、新生仔ラット心室から単離された線維芽細胞（ＮＲＶＦ）において、トランスフォーミング増殖因子β１（Ｔｇｆβ１）によって誘導される遺伝子発現変化を部分的に減弱させる。ＮＲＶＦを、組換えマウスＴｇｆβ１（２ｎｇ／ｍＬ）および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）と共に、４時間インキュベートした。ポリＡ ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに変換し、ライブラリー調製を行った後、次世代シーケンシングを使用して遺伝子発現のプロファイリングを行った。リードをラットの参照ゲノムに対してアラインし、各遺伝子にマッピングされたリードの数を数え、異なる処理条件全体にわたる差次的遺伝子（表９中に示す）を、０．１の補正ｐ値カットオフ、１．５の倍率変化カットオフを適用するＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｉｍｍａパッケージを用いてコンピュータで計算した。Ｔｇｆβ１でダウンレギュレートされた２６遺伝子がＭＹＤＧＦによってアップレギュレートされ、Ｔｇｆβ１で誘導された３０遺伝子がＭＹＤＧＦによってダウンレギュレートされた。

［実施例１０］

マウス骨髄由来増殖因子のタンパク質療法は、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）を供したマウスにおいて、抗肥大および抗線維化効果を促進する。Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ野生型マウスにＴＡＣ手術を施した（最初に、Rockman HA et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo mouse model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:8277-81において記載された）。ＴＡＣは心臓の左心室を長期にわたって圧負荷に晒し、左心室（ＬＶ）肥大および間質線維化をもたらす（Houser SR et al. Animal models of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circ Res 2012;111:131-50において概説されている）。対照マウスに擬似手術（大動脈狭窄を行わない開胸術）を施した。ＴＡＣ後直ちに、マウスに、１０μｇの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の腹腔内ボーラス注射を与えた。その後、マウスを、７日間のＭｙｄｇｆの皮下点滴（浸透圧ミニポンプを介して１０μｇ／日）で処置した。さらに別のＴＡＣマウスに、媒体のみ（０．９％ ＮａＣｌ）を注射および点滴した。４２日後、ＬＶ肥大を重量測定によって判定し（エンドポイント、市販の基準バランスを使用するＬＶ質量／体重）；ＬＶ間質線維化をシリウスレッド染色によって定量化した。結果を、以下の表１０に示す。

［実施例１１］

マウス骨髄由来増殖因子のタンパク質療法は、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）を供したマウスにおける心臓機能を改善する。Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ野生型マウスにＴＡＣ手術を施した。対照マウスに擬似手術（大動脈狭窄を行わない開胸術）を施した。ＴＡＣ後直ちに、マウスに、１０μｇの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の腹腔内ボーラス注射を与えた。その後、マウスを、７日間のＭｙｄｇｆの皮下点滴（浸透圧ミニポンプを介して１０μｇ／日）で処置した。さらに別のＴＡＣマウスに、媒体のみ（０．９％ ＮａＣｌ）を注射および点滴した。４２日後、３０ＭＨｚの線形変換器（Ｖｅｖｏ ３１００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社）を使用して、マウスに高分解能２次元経胸壁心エコー検査を受けさせた。左心室（ＬＶ）拡張末期面積（ＬＶＥＤＡ）および左心室収縮末期面積（ＬＶＥＳＡ）を、長軸ビューから決定した。面積変化率（ＦＡＣ）を、収縮期機能の評価基準として計算した［（ＬＶＥＤＡ－ＬＶＥＳＡ）／ＬＶＥＤＡ］×１００。結果を、以下の表１１に示す。

［実施例１２］

マウス骨髄由来増殖因子のタンパク質療法は、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）を供したマウスから単離した左心室心筋細胞における、筋／小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ２ａ）タンパク質の発現を増加させる。Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ野生型マウスにＴＡＣ手術を施した。対照マウスに擬似手術（大動脈狭窄を行わない開胸術）を施した。ＴＡＣ後直ちに、マウスに、１０μｇの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の腹腔内ボーラス注射を与えた。その後、マウスを、７日間のＭｙｄｇｆの皮下点滴（浸透圧ミニポンプを介して１０μｇ／日）で処置した。さらに別のＴＡＣマウスに、媒体のみ（０．９％ ＮａＣｌ）を注射および点滴した。７日後に、単離された左心室心筋細胞における、Ｓｅｒｃａ２ａおよびβ－アクチンタンパク質の発現レベルを、免疫ブロットにより測定した。結果を、以下の表１２に示す。

［実施例１３］

マウス骨髄由来増殖因子のタンパク質療法は、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）を供したマウスにおける、左心室心筋細胞の肥大を低減する。Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ野生型マウスにＴＡＣ手術を施した。対照マウスに擬似手術（大動脈狭窄を行わない開胸術）を施した。ＴＡＣ後直ちに、マウスに、１０μｇの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の腹腔内ボーラス注射を与えた。その後、マウスを、７日間のＭｙｄｇｆの皮下点滴（浸透圧ミニポンプを介して１０μｇ／日）で処置した。さらに別のＴＡＣマウスに、媒体のみ（０．９％ ＮａＣｌ）を注射および点滴した。４２日後、左心室心筋細胞の断面積を、コムギ胚芽凝集素で染色した組織切片において決定した。結果を、以下の表１３に示す。

［実施例１４］

マウス骨髄由来増殖因子の遺伝子療法は、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）を供したマウスにおける心臓機能を改善し、抗肥大および抗線維化効果を促進する。Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ野生型マウスに致死的な放射線を浴びせ、マウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）をコードするレンチウイルスまたは緑色蛍光タンパク質をコードするレンチウイルス（ＧＦＰ対照）で形質導入した骨髄幹細胞を移植した。このレンチウイルスのシステムは、以前に記載されている（Magnusson M et al. HOXA10 is a critical regulator for hematopoietic stem cells and erythroid/megakaryocyte development. Blood 2007;109:3687-96）。移植の６週間後、マウスにＴＡＣ手術を施した。対照マウスに擬似手術（大動脈狭窄を行わない開胸術）を施した。４２日後、３０ＭＨｚの線形変換器（Ｖｅｖｏ ３１００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社）を使用して、マウスに高分解能２次元経胸壁心エコー検査を受けさせた。左心室（ＬＶ）拡張末期面積（ＬＶＥＤＡ）および左心室収縮末期面積（ＬＶＥＳＡ）を、長軸ビューから決定した。面積変化率（ＦＡＣ）を、収縮期機能の評価基準として計算した［（ＬＶＥＤＡ－ＬＶＥＳＡ）／ＬＶＥＤＡ］×１００。左心室肥大の評価基準としての左心室拡張末期の後壁の厚みを短軸ビューから決定した。ＬＶ間質線維化を、シリウスレッド染色によって定量化した。結果を、以下の表１４に示す。

［実施例１５］

ヒト骨髄由来増殖因子は、特発性肺線維症の患者由来の肺線維芽細胞において、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）によって刺激されるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。特発性肺線維症の２患者由来の肺線維芽細胞を、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ；ＨＥＫ２９３細胞内で作製し、ここおよび以下で使用した）の非存在下または存在下で、１５、３０または６０分間、２ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＧＦβ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、ここおよび以下で使用した）で刺激した。ＳＭＡＤのリン酸化（活性化）を、免疫ブロットによって判定した。ＳＭＡＤシグナル伝達経路は、ＴＧＦβ１の線維化促進効果の不可欠なメディエーターである（Walton KL et al. Targeting TGFβ mediated SMAD signaling for the prevention of fibrosis. Front Pharmacol 2017;8:461において概説されている）。結果を、以下の表１５に示す。

［実施例１６］

ヒト骨髄由来増殖因子は、特発性肺線維症の患者由来の肺線維芽細胞の遊走を阻害する。特発性肺線維症の２患者由来の肺線維芽細胞を、コンフルエンシーに達するまで増殖させた。単層を２００μＬのピペットの先端でスクラッチし、洗浄し、２ｎｇ／ｍＬのヒトトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）の非存在下または存在下で１６時間培養した。刺激前（０時間）および刺激後（１６時間）に、デジタル位相差画像をキャプチャーした。回復率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）（％）を、［（０時間における無細胞面積（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ａｒｅａ）－１６時間における無細胞面積）／０時間における無細胞面積］×１００として計算した。結果を、以下の表１６に示す。

［実施例１７］

マウス骨髄由来増殖因子は、特発性肺線維症の患者由来の肺線維芽細胞の遊走を阻害する。特発性肺線維症の２患者由来の肺線維芽細胞を、コンフルエンシーに達するまで増殖させた。単層を２００μＬのピペットの先端でスクラッチし、洗浄し、２ｎｇ／ｍＬのヒトトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の非存在下または存在下で１６時間培養した。刺激前（０時間）および刺激後（１６時間）に、デジタル位相差画像をキャプチャーした。回復率（％）を、［（０時間における無細胞面積－１６時間における無細胞面積）／０時間における無細胞面積］×１００として計算した。結果を、以下の表１７に示す。

［実施例１８］

ヒト骨髄由来増殖因子は、特発性肺線維症の患者由来の肺線維芽細胞において、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）によって刺激されるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。特発性肺線維症の患者由来の肺線維芽細胞を、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）の非存在下または存在下で、５、１５、３０または６０分間、２ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＧＦβ１で刺激した。ＳＭＡＤのリン酸化（活性化）を、免疫ブロットによって判定した。ＡＬＫ５／ＴＧＦβＩ型受容体の低分子阻害剤ＳＢ４３１５４２（１０μｍｏｌ／Ｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、ここおよび以下で使用した）を陽性対照として使用した。結果を図１に示す。
［実施例１９］

マウス骨髄由来増殖因子は、末期の心不全患者由来の左心室線維芽細胞において、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）によって刺激されるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。末期の心不全患者由来の左心室肺線維芽細胞を、１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の非存在下または存在下で、３０分間、２ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＧＦβ１で刺激した。ＳＭＡＤのリン酸化（活性化）を、免疫ブロットによって判定した。ＡＬＫ５／ＴＧＦβＩ型受容体の低分子阻害剤ＳＢ４３１５４２（１０μｍｏｌ／Ｌ）を陽性対照として使用した。結果を図２に示す。
［実施例２０］

ヒト骨髄由来増殖因子は、末期の心不全患者由来の左心室線維芽細胞において、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）によって刺激されるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。末期の心不全患者由来の左心室肺線維芽細胞を、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）の非存在下または存在下で、３０分間、２ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＧＦβ１で刺激した。ＳＭＡＤのリン酸化（活性化）を、免疫ブロットによって判定した。ＡＬＫ５／ＴＧＦβＩ型受容体の低分子阻害剤ＳＢ４３１５４２（１０μｍｏｌ／Ｌ）を陽性対照として使用した。結果を図３に示す。
［実施例２１］

マウス骨髄由来増殖因子は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の遊走を阻害する。ＭＥＦを、コンフルエンシーに達するまで増殖させた。単層を２００μＬのピペットの先端でスクラッチし、洗浄し、２ｎｇ／ｍＬのマウストランスフォーミング増殖因子β１（Ｔｇｆβ１）および／または１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の非存在下または存在下で１６時間培養した。刺激前（０時間）および刺激後（１６時間）に、デジタル位相差画像をキャプチャーした。回復率（％）を、［（０時間における無細胞面積－１６時間における無細胞面積）／０時間における無細胞面積］×１００として計算した。結果を、以下の表２１に示す。

［実施例２２］

マウス骨髄由来増殖因子は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）における、トランスフォーミング増殖因子β１（Ｔｇｆβ１）によって刺激されるＳｍａｄのリン酸化を阻害する。ＭＥＦを、１００ｎｇ／ｍＬの組換えマウス骨髄由来増殖因子（Ｍｙｄｇｆ）の非存在下または存在下で、３０分間、２ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＴｇｆβ１で刺激した。Ｓｍａｄのリン酸化（活性化）を、免疫ブロットによって判定した。結果を図４に示す。
［実施例２３］

炎症細胞に由来するＭＹＤＧＦは、圧負荷の間の心臓のリモデリングを減弱させる。圧負荷の間のＭＹＤＧＦの機能を探索するために、Ｍｙｄｇｆ ＫＯマウスおよびそのＷＴ同腹子にＴＡＣ手術を供した。Ｍｙｄｇｆ ＫＯマウスは正常に繁殖および発達し、ベースラインにおいて明白な心血管表現型を示さない（Korf-Klingebiel 2015）。大動脈狭窄の部位全体にかかる圧勾配および左総頸動脈と右総頸動脈の最大血流速度比は、ＷＴおよびＫＯマウスにおいて類似していた。大動脈狭窄の過酷さは同等であるにもかかわらず、ＫＯマウスはＷＴマウスよりも目立ったＬＶ肥大を発症し（図５Ａ）、心筋細胞サイズがより大きく増加していることが、ＴＡＣの７日後および４２日後の組織学的および単細胞検査（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）により明らかであった（図５Ｂおよび５Ｃ）。ＷＴマウスと比較して、ＫＯマウスでは、７日目においてＭｙｈ６（アルファミオシン重鎖）のｍＲＮＡ発現がより強く衰退し、７日目および４２日目においてＭｙｈ７（ベータミオシン重鎖）のｍＲＮＡがより大きく増加し、４２日目においてＮｐｐａ（ナトリウム利尿ペプチドＡ型）のｍＲＮＡがより高まり、両時点においてＮｐｐｂ（ナトリウム利尿ペプチドＢ型）のｍＲＮＡが同様に上昇することが示された。

ＬＶ圧－容量測定により、ＫＯマウスは、ＷＴ対照よりも、ＴＡＣ後に目立った収縮期および拡張期機能不全を発症することが示された（図５Ｄ；表２２）。

加えて、骨髄キメラマウスを生成し、圧負荷の間のＬＶ肥大および心臓機能のモジュレーションにおける炎症細胞に由来するＭＹＤＧＦの重要性に特に取り組んだ。ＷＴ骨髄細胞（ＢＭＣ）をＫＯマウスに移植すると、ＴＡＣチャレンジ後のＬＶ肥大（図６Ａ）および心筋細胞肥大（図６Ｂ）が阻害され、心筋の毛細血管化が亢進し（図６Ｃ）、ＬＶ膨張（図６Ｄ）および収縮期機能不全（図６Ｅ）が減弱した。逆に、ＫＯ ＢＭＣをＷＴマウスに移植すると、肥大が増し、毛細血管密度が低下し、ＬＶリモデリングおよび収縮期機能不全が悪化した（図６Ａから図６Ｅ）。レンチウイルス遺伝子導入を使用して、ＷＴマウスにおいて、誘導性の炎症細胞特異的なＭＹＤＧＦの過剰発現を可能にした（図６Ｆ）。

Ｌｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦで形質導入したＢＭＣを移植したマウスでは、ドキシサイクリンを飲み水に加えることにより、ＢＭＣ（ドキシサイクリンを加えないＬｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦに対し５．８±２．２倍）および脾細胞（ドキシサイクリンを加えないＬｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦに対し、９．１±２．７倍）において、ＭＹＤＧＦタンパク質の発現が亢進した（図６Ｇ）。ＴＡＣ手術後、ドキシサイクリンで処置したＬｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦマウスは、ドキシサイクリンで処置したＬｅｎｔｉ．対照マウスよりも、ＭＹＤＧＦの血漿濃度が高く（図６Ｈ）、ＬＶ ＭＹＤＧＦの発現レベルが大きかった（図６Ｉ）。ドキシサイクリンで処置したＬｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦマウスは、ドキシサイクリンで処置したＬｅｎｔｉ．対照マウスよりも軽度のＬＶ肥大をＴＡＣ手術後に発症し（図６Ｊ）、心筋細胞は小さく（図６Ｋ）、毛細血管密度はやや高く（Ｐ＝０．１１、図６Ｌ）、ＬＶ膨張は少なく（図６Ｍ）、収縮期機能は保たれていた（図６Ｎ）。従って、炎症細胞に由来するＭＹＤＧＦは、長期にわたる圧負荷の間の非適応性肥大およびリモデリングを制限するのに必要かつ十分であると結論付けられる。
［実施例２４］

リン酸化プロテオーム解析により、ＰＩＭ１が心筋細胞におけるＭＹＤＧＦのシグナル伝達の標的として同定される。インビトロの肥大モデルを確立して、ＭＹＤＧＦが心筋細胞を直接標的化するかどうか評価した。２４時間のＥＴ１刺激により、新生仔ラット心室心筋細胞（ＮＲＣＭ）のサイズ（図７Ｂ）、タンパク含有量（図７Ｃ）、ならびにＭｙｈ７およびＮｐｐａのｍＲＮＡ遺伝子発現（図７Ｄ）が増加した。組換えＭＹＤＧＦ単独ではこれらのエンドポイントに影響を与えなかったが、ＭＹＤＧＦを用いた共処置では、ＥＴ１に対する肥大応答が完全に妨げられ；ＭＹＤＧＦの抗肥大効果は濃度依存的であり、半数阻害濃度の７．６ｎｇ／ｍＬで飽和可能であった（図７Ｂ）。ＭＹＤＧＦは、ＡｎｇＩＩによって誘導される肥大を同様に阻害したが、ＩＧＦ１に応答する肥大は減弱しなかった（図７Ａ）。ＥＴ１とＡｎｇＩＩが病的なタイプの心肥大を促進するのとは対照的に、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）は新生仔ラット心筋細胞において、ＭＹＤＧＦによって減弱されない生理的なタイプの心肥大を促進する。

ＭＹＤＧＦによって活性化されるシグナル伝達中間体を同定するために、リン酸化プロテオーム解析とそれに続くコンピュータによる基質ベースのキナーゼ活性推論（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ）を実施した（図８Ａ）（Hogrebe et al. Nat Commun. 2018;9:1045; Strasser et al. Integr Biol. 2019;11:301-314）。ＭＹＤＧＦの非存在下または存在下でＮＲＣＭをＥＴ１で刺激した８時間後に、ハイコンテントＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを収集した。対応するタンパク質存在量の差に対してスケーリングした場合に、１，１１０個の異なるタンパク質中に分布する２，３０８個の定量化されたリン酸化部位のうちの４２３個が、４実験条件にわたって差次的にリン酸化された。

教師なし階層的クラスタリングおよび主成分解析（図８Ｂ）により、各条件由来の生物学的レプリケートは共にクラスター形成することが示され、よってワークフローの再現性が確認された。主成分空間において４条件はよく分離しており、それらが別個のリン酸化プロテオームシグネチャーと関連づけられることを示した。類似性の測定基準としてユークリッド距離を使用し、我々は、ＥＴ１とＭＹＤＧＦで共処置したＮＲＣＭが、ＥＴ１と無刺激対照の間に位置付けられる中間表現型を示すことを観察した（図８Ｂ）。実際に、ＭＹＤＧＦは、ＥＴ１によって誘導されるリン酸化プロテオームの変化の多くを逆にした：すなわち、ＥＴ１で処理した細胞内でより強くリン酸化されたリン酸化部位（無刺激対照と比較して）は、ＥＴ１とＭＹＤＧＦで共刺激した細胞内ではあまり強くリン酸化されない傾向にあり（ＥＴ１単独と比較して）、逆もまた同様である（図８Ｃ）。キナーゼ－基質相互作用の予備的知識（Hornbeck et al. Nucleic Acids Res. 2015;43:D512-520）をリン酸化プロテオームデータセットに適用して、ＥＴ１で処理した細胞において、ＭＹＤＧＦによって誘導されるキナーゼ活性の変化を推論した。差次的に調節されるリン酸化部位と、それらのそれぞれのキナーゼ基質モチーフの濃縮に基づけば、ＭＹＤＧＦは複数のタンパク質キナーゼの活性を変えることが予想され、それにはセリン／スレオニンキナーゼＰＩＭ１の強力な活性化が含まれた（図８Ｄ）。

ＰＩＭ１ならびにそのアイソフォーム、ＰＩＭ２およびＰＩＭ３は、類似の基質嗜好性を有するが、異なる組織発現プロファイルを有し（Selten et al. Cell. 1986;46:603-611; Qian et al. J Biol Chem. 2005;280:6130-6137; Nawijn et al. Nat Rev Cancer. 2011;11:23-34）、ＰＩＭ１は心臓における主たるアイソフォームである（Muraski et al. Nat Med. 2007;13:1467-1475）。ＰＩＭキナーゼは恒常的に活性であり、タンパク質発現のレベルにおいて調節される（Nawijn 2011）。先行研究では、ＰＩＭ１の過剰発現により、ＥＴ１によって誘導される肥大からＮＲＣＭが保護され（Muraski 2007）、それにより、ＰＩＭ１が、心筋細胞においてＭＹＤＧＦの効果を媒介する潜在的な候補として浮上した。我々のリン酸化プロテオームデータを実証して、無刺激およびＥＴ１で刺激したＮＲＣＭにおいて、ＭＹＤＧＦはＰＩＭ１の発現（図８Ｅ）およびキナーゼ活性（図８Ｆ）を増加させた。ＭＹＤＧＦの抗肥大効果は、低分子ＰＩＭキナーゼ阻害剤のＳＭＩ４ａ（Beharry et al. Mol Cancer Ther. 2009;8:1473-1483; Xia et al. J Med Chem. 2009;52:74-86）（図８Ｇ）およびｓｉＲＮＡが媒介するＰＩＭ１のダウンレギュレーション（図８Ｈ）によって抑えられ、ＭＹＤＧＦが実際にＰＩＭ１を介してシグナル伝達することが示された。
［実施例２５］

ＭＹＤＧＦは、ＰＩＭ１を介して、心筋細胞におけるＳＥＲＣＡ２ａの発現を亢進させる。心筋細胞の収縮および弛緩に遅れをもたらすＣａ^２＋サイクリングにおける異常は、肥大しかつ不全の心臓においてよく見られる（Houser et al. J Mol Cell Cardiol. 2000;32:1595-1607）。筋／小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）の発現および／または活性の低下は、筋／小胞体へのＣａ^２＋隔離の減退につながり、心不全におけるＣａ^２＋の調節不良の一因となり得る（Luo et al. Circ Res. 2013;113:690-708）。ＰＩＭ１がＳＥＲＣＡ２ａ発現を刺激することが以前に報告されているため（Muraski et al. Nat Med. 2007;13:1467-1475）、ＳＥＲＣＡ２ａの存在量がＭＹＤＧＦによって制御されるかどうかについて探索した。実際に、ＭＹＤＧＦで刺激したＮＲＣＭにおけるＰＩＭ１の発現の増加は、Ｓｅｒｃａ２ａタンパク質の発現の増加と同時に進行した（図９Ａ）。ＰＩＭ１の阻害またはｓｉＲＮＡが媒介するＰＩＭ１のダウンレギュレーションにより、Ｓｅｒｃａ２ａの上昇は妨げられ、ＭＹＤＧＦはＰＩＭ１を介してＳＥＲＣＡ２ａの発現を制御することが示された（図９Ｂ）。

インビボでは、擬似手術したＷＴとＭｙｄｇｆ ＫＯマウスにおいて、ＬＶ心筋のＳＥＲＣＡ２ａタンパク質レベルは同等であった（図９Ｃ）。ＴＡＣ手術後、ＷＴマウスにおけるＳＥＲＣＡ２ａの発現は、７日目ではまだ保たれていた（－１７％、Ｐ＝０．１４）が、４２日目では減っていた。両時点において、ＫＯマウスにおけるＳＥＲＣＡ２ａの発現は、ＷＴマウスにおけるものよりも有意に低かった（図９Ｃ）。擬似手術したＷＴおよびＫＯマウスの、単離されたＬＶ心筋細胞におけるＰＩＭ１およびＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質発現レベルは類似していた（図９Ｄ）。心筋細胞におけるＴＡＣ後のＰＩＭ１の発現はＷＴマウスにおいて増加したが、ＫＯマウスにおいては増加しなかった。ＫＯマウスがＴＡＣ後にＰＩＭ１をアップレギュレートできないことが、心筋細胞におけるＳＥＲＣＡ２ａの存在量の大幅な低下と関連づけられた（図９Ｄ）。

圧負荷された心臓において、炎症細胞に由来するＭＹＤＧＦがＰＩＭ１およびＳＥＲＣＡ２ａの発現を調節するかどうかを特に明確にするために、Ｍｙｄｇｆの骨髄キメラトランスジェックマウスおよび骨髄条件付きトランスジェックマウスにＴＡＣ手術を供した。ＴＡＣ後のＬＶのＰＩＭ１およびＳＥＲＣＡ２ａの存在量は、ＷＴ ＢＭＣをＭｙｄｇｆ ＫＯマウス中に移植することにより高まった一方、ＫＯ ＢＭＣをＷＴマウス中に移植することにより減った（図９Ｅ）。さらに、ドキシサイクリンで処置したＬｅｎｔｉ．ＭＹＤＧＦマウスのＬＶのＰＩＭ１およびＳＥＲＣＡ２ａの発現レベルは、ドキシサイクリンで処置したＬｅｎｔｉ．対照マウスよりも高かった（図９Ｆ）。炎症細胞に由来するＭＹＤＧＦは、圧負荷された左心室におけるＰＩＭ１およびＳＥＲＣＡ２ａの発現を亢進させるのに必要かつ十分であると結論付けられる。
［実施例２６］

圧負荷の間のＭＹＤＧＦの治療可能性を探索した。ＴＡＣ手術後、タンパク質のデリバリー（１０μｇ／日）を確実に継続させるために皮下に埋め込んだ浸透圧ミニポンプを使用して、マウスを組換えＭＹＤＧＦで２８日間処置した（図１０Ａ）。ＴＡＣの３日後、ＭＹＤＧＦで処置したマウスのＭＹＤＧＦ血漿濃度は、希釈剤のみで処置した対照マウスよりも高かった（図１０Ｂ）。ＴＡＣの７日後、ＭＹＤＧＦで処置したマウスでは、単離された心室心筋細胞におけるＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現がより豊富であり（図１０Ｃ）、２８日間の間にこれらの動物が発症したＬＶ膨張（図１０Ｄ）および収縮期機能不全（図１０Ｅ）は、あまり目立たないものであった。抗リモデリング効果は、肥大応答の減弱（図１０Ｆ）とそれに伴うより小さな心筋細胞（図１０Ｇ）、ＬＶ心筋における毛細血管密度の増加（図１０Ｈ）および顕著な生存利益（図１０Ｉ）と関連づけられた。

特に実施例２３、２４、２５および２６により、マウスにおける、圧負荷によって誘導される心不全からのＭＹＤＧＦによる保護が示される。ＴＡＣ手術によって急性圧負荷を実行すると、単球およびマクロファージが主要なＭＹＤＧＦ産生細胞タイプとして新たに現れ、左心室におけるＭＹＤＧＦ存在量の迅速な増加を誘発した。循環ＣＣＲ２^ｈｉｇｈ単球の動員および分化ならびに心臓の常在性マクロファージの増殖が、圧負荷の間のマクロファージプールの著しい増大につながった。

ＴＡＣチャレンジ後、Ｍｙｄｇｆ ＫＯマウスは、野生型マウスよりも大きな心筋細胞を伴う重度のＬＶ肥大を発症した。ＫＯマウスにおけるより大きな肥大は、Ｃａ^２＋サイクリングおよびサルコメア機能の減退、より顕著な胎児性遺伝子の活性化、毛細血管密度の低下、間質線維化の亢進、ならびにＬＶ膨張および収縮期と拡張期の機能不全によって特徴付けられたが、すべては圧負荷に対する非適応性応答の顕著な特徴である。

運動訓練は、心臓における骨髄系細胞の増大を惹起しなかった。よって、訓練したマウスおよび訓練しなかったマウスから得た左心室におけるＭＹＤＧＦの発現は比較的低く、訓練したＭｙｄｇｆ ＫＯマウスは、それらの野生型同腹子と同じように生理的肥大を発症した。

心筋細胞に働きかけて、ＭＹＤＧＦは、細胞の肥大を減らし、かつＳＥＲＣＡ２ａ発現を亢進させることより、Ｃａ^２＋サイクリングおよびサルコメアの機能を改善した。リン酸化プロテオミクスにより、恒常的に活性なセリン／スレオニンキナーゼＰＩＭ１が、ＭＹＤＧＦの下流の１つの潜在的な標的として特定された。実際に、ＰＩＭ１を阻害またはダウンレギュレートすることにより、培養心筋細胞におけるＭＹＤＧＦの抗肥大効果およびＳＥＲＣＡ２ａ誘導効果が消失した。

組換えＭＹＤＧＦの処置により、持続性の後負荷ストレスの間の、ＬＶの形状、収縮期機能および生存に対する有益な効果が媒介されることが示された。

Claims (28)

1. 線維化または肥大の処置または予防における使用のための、骨髄由来増殖因子（ＭＹＤＧＦ）またはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体。
2. 好ましくは慢性心不全である心不全の処置または予防における使用のための、ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体。
3. 前記心不全または慢性心不全が、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、または駆出率が軽度低下した心不全（ＨＦｍｒＥＦ）である、請求項２に記載の使用のためのＭＹＤＧＦまたはその断片もしくは変異体。
4. （ｉ）配列番号１；または
   （ｉｉ）ＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈する、配列番号１の断片もしくは変異体
   を含み、前記変異体が配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１、２または３に記載の使用のためのＭＹＤＧＦ。
5. 前記線維化が、心臓および／または肺の線維化であり、好ましくは前記線維化が、間質性肺疾患、好ましくは進行性線維化性間質性肺疾患、より好ましくは特発性肺線維症である、請求項１または４のいずれか一項に記載の使用のための増殖因子ＭＹＤＧＦ。
6. 前記肥大が心筋細胞の肥大である、請求項１または４に記載の使用のための増殖因子ＭＹＤＧＦ。
7. 線維化または肥大の処置または予防における使用のための、増殖因子ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体をコードする核酸。
8. 心不全の処置または予防における使用のための、増殖因子ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体をコードする核酸。
9. 配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項７または８に記載の使用のための核酸。
10. 線維化または肥大の処置または予防における使用のための、請求項７または８に記載の核酸を含むベクター。
11. 心不全の処置または予防における使用のための、請求項８または９に記載の核酸を含むベクター。
12. 線維化または肥大の処置または予防における使用のための、請求項７に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターを含みかつ前記核酸を発現する宿主細胞。
13. 心不全の処置または予防における使用のための、請求項８に記載の核酸または請求項１１に記載のベクターを含みかつ前記核酸を発現する宿主細胞。
14. 線維化または肥大の処置または予防における使用のための医薬組成物であって、請求項１、４～６のいずれか一項に記載のＭＹＤＧＦ、請求項６または８に記載の核酸、請求項９に記載のベクター、または請求項１１に記載の宿主細胞を含み、適した医薬賦形剤を含んでいてもよい、医薬組成物。
15. 心不全の処置または予防における使用のための医薬組成物であって、請求項２～６のいずれか一項に記載のＭＹＤＧＦ、請求項８または９に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞を含み、適した医薬賦形剤を含んでいてもよい、医薬組成物。
16. 経口、静脈内、皮下、粘膜内、動脈内、筋肉内または冠動脈内の経路によって投与される、請求項１４または１５に記載の使用のための医薬組成物。
17. 前記投与が１回以上のボーラス注射および／または点滴による、請求項１６に記載の使用のための医薬組成物。
18. 線維化の処置を必要とする患者に治療有効量のＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含む、線維化の処置方法。
19. 前記ＭＹＤＧＦが、
    （ｉ）配列番号１；または
    （ｉｉ）配列番号１のＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体
    を含み、前記変異体が配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記線維化が心臓および／または肺の線維化であり、好ましくは、前記線維化が間質性肺疾患、好ましくは進行性線維化性間質性肺疾患、より好ましくは特発性肺線維症である、請求項１８に記載の方法。
21. 前記ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体が、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される、請求項１８に記載の方法。
22. 肥大の処置を必要とする患者に治療有効量のＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含む、肥大の処置方法。
23. 前記ＭＹＤＧＦが、
    （ｉ）配列番号１；または
    （ｉｉ）配列番号１のＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体
    を含み、前記断片もしくは変異体が配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記肥大が心筋細胞の肥大である、請求項２２に記載の方法。
25. 前記ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体が、１回以上のボーラス注射および／または点滴によって、好ましくは薬学的に許容される担体中において投与される、請求項２２に記載の方法。
26. 心不全の処置または予防を必要とする患者に治療有効量の増殖因子ＭＹＤＧＦまたはＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体を投与することを含み、好ましくは前記心不全が慢性心不全である、心不全の処置または予防方法。
27. 前記心不全または慢性心不全がＨＦｐＥＦまたはＨＦｒＥＦであり、好ましくは前記ＨＦｐＥＦがステージＣもしくはステージＤのＨＦｐＥＦであるか、または前記ＨＦｒＥＦがステージＣもしくはステージＤのＨＦｒＥＦである、請求項２６に記載の心不全の処置方法。
28. 前記ＭＹＤＧＦが、
    （ｉ）配列番号１；または
    （ｉｉ）配列番号１のＭＹＤＧＦの生物学的機能を呈するその断片もしくは変異体
    を含み、前記断片もしくは変異体が配列番号１に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６または２７に記載の方法。

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