JP2023510911A - 卵巣癌を検出するための組成物及び方法 - Google Patents

卵巣癌を検出するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、一態様では、卵巣癌を検出する、例えば、卵巣癌を早期検出するための技術を提供する。別の態様では、本明細書において提供される技術は、卵巣癌を有するか、またはそれに易罹患性であると決定されている対象に投与される処置を選択する、及び／またはモニターする、及び／またはその有効性を評価するために有用である。一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、治療と併せて、例えば、腫瘍量及び腫瘍量の変化を測定することによるコンパニオン診断を開発するために有用である。一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、例えば、治療反応と関連する女性の血液試料においてバイオマーカーを同定することによるコンパニオン診断を開発するために有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれの全体が本明細書に援用される２０２０年１月１７日出願の米国特許仮出願第６２／９６２，７１１号、及び２０２０年７月０７日出願の米国特許仮出願第６３／０４９，０６３号の利益を請求する。
がんの早期検出により、処置が成功する見込みが大幅に増大する。しかしながら、卵巣癌を含む多くのがんに未だに、有効なスクリーニング推奨基準がない。がんスクリーニング検査についての典型的な課題には、限定的な感受性及び特異性が含まれる。高率の擬陽性結果が特に懸念され得、それというのも、それにより、望ましくない副作用を潜在的に有し得る抗がん治療を不必要に投与したくないであろう（または投与されたくないであろう）臨床医及び患者にとって、管理決定が困難になり得るためである。逆に、高率の偽陰性結果は、治療を必要とする患者を見落として、処置の遅延をもたらし、その結果、成功の可能性を低下させるので、スクリーニング検査の目的を満たすことができない。
本開示は特に、有効な卵巣癌スクリーニングを達成するための洞察及び技術を提供する。一部の実施形態では、提供される技術は、早期ステージの卵巣癌を検出するために有効である。一部の実施形態では、提供される技術は、無症候性個体を含むか、またはその個体からなる集団に適用される場合にも、有効である（例えば、十分に高い感受性及び／または低率の擬陽性及び／または偽陰性結果により）。一部の実施形態では、提供される技術は、卵巣癌を発症する遺伝的リスクのない個体（例えば、無症候性個体）を含むか、またはその個体からなる集団に適用される場合に有効である。一部の実施形態では、提供される技術は、症候性個体（例えば、卵巣癌の１つまたは複数の症状に罹患している個体）を含むか、またはその個体からなる集団に適用される場合に有効である。一部の実施形態では、提供される技術は、卵巣癌についてのリスクを有する（例えば、卵巣癌についての遺伝的及び／または生活歴関連リスク因子を有する個体）を含むか、またはその個体からなる集団に適用される場合に有効である。一部の実施形態では、本明細書において提供される開示を読むことで、当業者には明らかであるとおり、提供される技術は、１つまたは複数の組成物（例えば、分子実体または複合体、系、細胞、収集物、組合せ、キットなど）及び／または方法（例えば、製造する、使用する、評価する方法など）であり得るか、またはそれらを含み得る。
一部の実施形態では、本開示は、例えば、卵巣癌の検出及び診断のためのある特定の従来のアプローチを含むある特定の先行技術を用いて、問題の原因を同定する。例えば、本開示は、例えば、無細胞核酸、血清タンパク質（例えば、ＭＵＣ１６ポリペプチドの一部であるＣＡ－１２５）に基づく多くの従来の診断アッセイ、及び／または細胞外小胞のバルク分析は時間がかかり得、経費がかかり得、及び／または信頼できる包括的な診断評価を得るために十分な感受性、及び／または特異性を欠き得ることを認めるものである。一部の実施形態では、本開示は、そのような問題を特に、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、表面タンパク質バイオマーカー、内部タンパク質バイオマーカー、及びＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含む、個々の細胞外小胞における卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーの共局在を検出することにより解決する技術（システム、組成物、及び方法を含む）を提供する。一部の実施形態では、本開示は、そのような問題を特に、個々の細胞外小胞における少なくとも２つまたはそれ以上の標的実体（例えば、標的バイオマーカーシグネチャー）の相互作用及び／または共局在に基づく、本出願人により開発され、及び両方とも２０２０年２月２８日に出願され、「標的実体を検出するシステム、組成物、及び方法」と標題された米国特許出願第１６／８０５，６３７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０５２９に記載された標的実体検出アプローチを使用して、そのような卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーを検出することにより解決する技術（システム、組成物、及び方法を含む）を提供する。
一部の実施形態では、本開示は特に、無症候性個体のスクリーニング、例えば、症候（複数可）の発症前の、またはそうでなければその非存在下での定期的なスクリーニングが、卵巣癌の有効な管理（例えば、処置の成功）には有利で、重要でもあり得るという洞察を提供する。一部の実施形態では、本開示は、一部の実施形態では、無症候性個体（例えば、卵巣癌の遺伝的リスクのない個体）において、早期ステージがんを含む卵巣癌を検出するために実施することができる、卵巣癌スクリーニングシステムを提供する。一部の実施形態では、提供される技術を、無症候性個体（例えば、卵巣癌の遺伝的リスクのない個体）についての定期的なスクリーニングを達成するために実施する。本開示は、例えば、組成物（例えば、試薬、キット、構成成分など）、ならびにそれらを得る方法、及び／または１つまたは複数の個体（例えば、無症候性個体）の定期的な検査を伴うストラテジーを含む、それらを使用する方法を提供する。本開示は、そのようなシステムの有用性を定義し、かつそれらを実施するための組成物及び方法を提供する。
一部の実施形態では、提供される技術は、単回及び／または定期的な（例えば、周期的）評価への、提供される技術の有用な適用を可能にするために適した感受性及び／または特異性（例えば、擬陽性及び／または擬陰性結果の率）で、卵巣癌の１つまたは複数の特徴（例えば、発生、進行、治療に対する応答性、再発など）の検出（例えば、無症候性個体（複数可）及び／または集団（複数可）における、例えば、早期検出）を達成する。一部の実施形態では、提供される技術は、マンモグラム、ＨＰＶ、及び／またはＰａｐスミアスクリーニングなどの女性の周期的理学的検査と併せて有用である。一部の実施形態では、提供される技術は、処置レジメン（複数可）と併せて有用である；一部の実施形態では、提供される技術は、そのような処置レジメン（複数可）の１つまたは複数の特徴（例えば、許容されるパラメーターによる成功率）を改善し得る。
一部の態様では、対象（例えば、無症候性対象）を、卵巣癌を有するか、またはがんに易罹患性であると分類する際に使用するための技術を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象（例えば、無症候性対象）を、卵巣癌を有するか、またはがんに易罹患性であると分類するための方法またはアッセイを提供する。一部の実施形態では、提供される方法またはアッセイは、（ａ）それを必要とする対象からの血液由来試料において、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーを発現する細胞外小胞を検出すること（その際、上記標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、及び小胞内ＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含み、その際、上記表面タンパク質バイオマーカーは、ＡＱＰ５、ＣＤＨ６、ＣＨＯＤＬ、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＴＲ３Ａ、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せから選択され；上記小胞内タンパク質バイオマーカーは、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せから選択され；かつ上記小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカーは、ＣＬＤＮ６、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、及びそれらの組合せから選択される）；（ｂ）上記血液由来試料中の標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞のレベルを示す試料情報を、基準閾値レベルを含む基準情報と比較すること；ならびに（ｃ）上記血液由来試料が上記基準閾値レベルを基準とする分類カットオフと比べて、標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞のレベルの上昇を示す場合に、上記対象を、卵巣癌を有するか、またはがんに易罹患性であると分類することを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法またはアッセイを、もう１つの追加の標的バイオマーカーシグネチャーについて行うこともできる。一部のそのような実施形態では、分類カットオフは、追加の標的バイオマーカーシグネチャーに対応する追加の基準閾値レベル（複数可）を基準とし得る。
一部の実施形態では、本明細書において使用される、及び／または記載される卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーにおいて使用するための細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、腫瘍特異的バイオマーカー及び／または組織特異的バイオマーカー（例えば、卵巣組織特異的バイオマーカー）であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、非特異的マーカーであり得るか、またはそれを含み得、例えば、１つまたは複数の非標的腫瘍中に、及び／または１つまたは複数の非標的組織中に存在する。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーは、ＡＱＰ５、ＣＤＨ６、ＣＨＯＤＬ、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＴＲ３Ａ、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びＳＬＣ３４Ａ２のうちの１種または複数であり得るか、またはそれらを含み得る。
一部の実施形態では、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーは、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド、ＡＱＰ５ポリペプチド、ＭＵＣ１６ポリペプチド、ＣＬＤＮ３ポリペプチド、ＣＬＤＮ６ポリペプチド、ＦＯＬＲ１ポリペプチド、ＡＬＰＬポリペプチド、ＢＳＴ２ポリペプチド、ＣＤ２４ポリペプチド、ＭＳＬＮポリペプチド、ＭＵＣ１ポリペプチド、ＰＴＧＳ１ポリペプチド、ｓＴｎポリペプチドグリコシル化、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチド、及び／またはＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＣＤ２４ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＰＴＧＳ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＭＵＣ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ｓＴｎポリペプチドグリコシル化であり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＡＬＰＬポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＢＳＴ２ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーは、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のもの）と、一部の実施形態では、ＡＱＰ５、ＣＤＨ６、ＣＨＯＤＬ、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＴＲ３Ａ、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及び／またはそれらの任意の組合せであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの追加の標的表面タンパク質バイオマーカーとを含み得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーは、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のもの）と、一部の実施形態では、ＣＬＤＮ６、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、及びそれらの組合せであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカーとを含み得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーは、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のもの）と、一部の実施形態では、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの追加の標的小胞内タンパク質バイオマーカーとを含み得る。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＳＣＬ３４Ａ２ポリペプチド及び／またはＣＬＤＮ６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＳＣＬ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ３とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ３とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＡＱＰ５とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１及びＡＱＰ５とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＳＬＣ３４Ａ２及びＣＬＤＮ３とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ３とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ３とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１及びＡＱＰ５とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ３とを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと；少なくとも２つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ６とを含む。
一部の実施形態では、提供される方法または本明細書に記載のアッセイにおいて使用するための基準閾値レベルを、非卵巣癌対象の集団からの比較可能な試料において観察された標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞のレベルにより決定する。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーに含まれる細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを、抗体ベースの作用因子を使用して検出することができる。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを、抗体ベースの作用因子を含む捕捉アッセイを使用して検出することができる。例えば、一部の実施形態では、細胞外小胞において細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドの存在を検出するための捕捉アッセイは、細胞外小胞を含む血液由来試料を、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する捕捉因子と接触させることを含み得る。一部の実施形態では、そのような捕捉因子は、固体基材に任意選択でコンジュゲートされていてよい細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のもの）を指向する結合部分を含み得る。限定ではないが、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドのための例示的な捕捉因子は、固体基材（例えば、磁気ビーズ）及び細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する結合部分（例えば、抗体因子）であり得るか、またはそれを含み得る。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーに含まれる標的バイオマーカーを、検出される分析物の種類（例えば、表面タンパク質、小胞内タンパク質、小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））で変化し得る当技術分野で公知の適切な方法を使用して検出することができる。例えば、当業者は、本開示を読むことで、一部の実施形態では、表面タンパク質バイオマーカー及び／または小胞内タンパク質バイオマーカーを、抗体ベースの作用因子を使用して検出することができる一方で、一部の実施形態では、小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカーを、核酸ベースの作用因子を使用して、例えば、定量的逆転写ＰＣＲを使用して検出することができることが分かるであろう。
例えば、標的バイオマーカーが表面タンパク質バイオマーカー及び／または小胞内タンパク質マーカーであるか、またはそれを含む一部の実施形態では、例えば、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書において使用及び／または記載されるとおりのもの）を発現する細胞外小胞を捕捉するための捕捉アッセイ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の後に、近接ライゲーションアッセイを含めて、そのような標的バイオマーカーを検出することができる。一部の実施形態では、そのような近接ライゲーションアッセイは、細胞外小胞を含む血液由来試料を、標的バイオマーカーをそれぞれ指向する検出プローブのセットと接触させることを含み得るが、その際、そのセットは、少なくとも２つの別個の検出プローブを含むので、上記細胞外小胞と、上記検出プローブのセットを含む組み合わせが生じ、上記２つの検出プローブはそれぞれ、（ｉ）表面タンパク質バイオマーカー及び／または小胞内タンパク質バイオマーカーを指向する結合部分；ならびに（ｉｉ）上記結合部分にカップリングしていて、二本鎖部分と、上記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハング部分とを含むオリゴヌクレオチドドメインを含む。上記検出プローブのそのような一本鎖オーバーハング部分は、上記検出プローブが同じ細胞外小胞に結合した場合にそれらが相互にハイブリダイズし得ることにおいて特徴づけられる。次いで、上記細胞外小胞及び上記検出プローブのセットを含むそのような組合せを、上記検出プローブのセットが細胞外小胞上のそれらのそれぞれの標的に結合することを可能にする条件下で維持すると、上記検出プローブが同じ細胞外小胞に結合して、二本鎖複合体を形成し得るようになっている。そのような二本鎖複合体は、上記二本鎖複合体を核酸リガーゼと接触させて、ライゲートされたテンプレートを生成すること；及び上記ライゲートされたテンプレートを検出することにより検出することができる。そのようなライゲートされたテンプレートの存在は、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーについて陽性である細胞外小胞の存在を示している。そのような近接ライゲーションアッセイは、他の既存の近接ライゲーションアッセイよりも良好に、例えば高い特異性及び／または感受性で行うことができるが、当業者は、本開示を読むことで、当技術分野で公知の他の形態の近接ライゲーションアッセイを代わりに使用することもできることが分かるであろう。
標的バイオマーカーが小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）マーカーであるか、またはそれを含む一部の実施形態では、そのような標的バイオマーカーを、核酸検出アッセイを含めて検出することができる。一部の実施形態では、例示的な核酸検出アッセイは逆転写ＰＣＲであり得るか、またはそれを含み得る。
標的バイオマーカーが小胞内バイオマーカー（例えば、小胞内タンパク質バイオマーカー及び／または小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカー）であるか、またはそれを含む一部の実施形態では、そのような標的バイオマーカーを、検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のとおりの近接ライゲーションアッセイ）の前に、その後の検出のために小胞内バイオマーカー（複数可）を露出するための試料の処理（例えば、固定化及び／または透過化）を含めて、検出することができる。
本開示は特に、単一の細胞外小胞の分析においてとは異なり、バルク試料（例えば、細胞外小胞のバルク試料）に基づく単一の卵巣癌関連血清タンパク質または複数の卵巣癌関連バイオマーカーの検出は典型的には、その試料を得た対象がおそらく、卵巣癌に罹患しているか、または易罹患性であるかどうかを決定する際に、十分な特異性及び／または感受性を提供しないことを認めるものである。本開示は特に、例えば、検出のための個々の細胞外小胞が、少なくとも１つまたは複数の細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、少なくとも１つまたは複数の標的バイオマーカーとの組合せを含む標的バイオマーカーシグネチャーの存在により特徴づけられることを特異的に必要とすることを含む、そのような問題を解決するシステム、組成物、及び／または方法を含む技術を提供する。特定の実施形態では、本開示は、そのような個々の実体細胞外小胞が、そのような卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーの存在により（例えば、発現により）特徴づけられる一方で、標的バイオマーカーシグネチャーを含まない細胞外小胞が、検出可能なシグナル（例えば、基準レベルを、例えば、少なくとも１０％以上超えるレベルであり、その際、一部の実施形態では、基準レベルは、陰性対照試料、例えば、そのような標的バイオマーカーシグネチャーを含む個々の細胞外小胞が存在しない試料で観察されるレベルであり得る）を生成しないことを必要とする技術を教示する。
したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、対象において、及び／または対象の集団全体で卵巣癌の発生または再発を検出するために有用であり得る。一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、卵巣癌の検出のために選択することができる。一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、例えば、これに限定されないが、高異型度漿液性卵巣癌、類子宮内膜卵巣癌、明細胞卵巣癌、低異型度漿液性卵巣癌、及び／または粘液性卵巣癌を含む卵巣癌の特異的なカテゴリーの検出のために選択することができる。一部の実施形態では、本明細書において提供される技術を、周期的に（例えば、毎年）使用して、早期ステージ卵巣癌または卵巣癌再発についてヒト対象を、またはヒト対象の集団全体でスクリーニングすることができる。
一部の実施形態では、卵巣癌の発生または再発を検出するために、本明細書において提供される技術に適した対象は、無症候性ヒト対象及び／または無症候性集団全体であってよい。そのような無症候性対象は、卵巣癌の家族歴を有する、卵巣癌のリスクを増大させる生活歴を有する、閉経後である、卵巣癌について以前に処置されたことがある、がんの処置後に卵巣癌の再発リスクを有する、卵巣癌の処置後に寛解している、及び／または少なくとも１つの卵巣癌バイオマーカー、例えば、これに限定されないが、ＣＡ－１２５血清タンパク質の存在について以前に、または周期的にスクリーニングされている対象であり得る。一部の実施形態では、そのような無症候性対象は、正常な血清ＣＡ－１２５レベル（例えば、３５Ｕ／ｍＬ未満の血清ＣＡ－１２５レベル）を有すると決定されている対象であり得る。一部の実施形態では、そのような無症候性対象は、正常な血清ＣＡ－１２５レベル以上の血清ＣＡ－１２５レベルを有すると決定されている対象であり得る。別法では、一部の実施形態では、無症候性対象は、卵巣癌について以前に処置されたことがない、卵巣癌について診断されたことがない、及び／または卵巣癌治療を以前に受けたことがない対象であり得る。
一部の実施形態では、対象または対象の集団を、１つまたは複数の特徴、例えば、年齢、人種、遺伝的履歴、個人的履歴及び／または病歴（例えば、喫煙、アルコール、薬物、発がん因子、食事、肥満、糖尿病、身体活動、日光曝露、放射線曝露、会陰部タルク使用、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）、感染因子、例えば、ウイルスへの暴露、及び／または職業上の危険）に基づき選択することができる。
一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、卵巣癌に罹患しているか、または易罹患性である対象について治療を選択するために有用であり得る。一部の実施形態では、卵巣癌治療及び／または補助治療を、本明細書において提供される技術に基づく所見を考慮して選択することができる。
一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、対象（例えば、卵巣癌対象）に投与される治療の有効性をモニター及び／または評価するために有用であり得る。
一部の実施形態では、本開示は、例えば、１つまたは複数の個々の対象のために、及び／または対象の集団全体で患者看護を管理するための技術を提供する。ほんのいくつかの例を提供するために、一部の実施形態では、本開示は、スクリーニング（例えば、一時的に、または偶発的に動機づけられたスクリーニング及び／または非一時的に、または非偶発的に動機づけられたスクリーニング、例えば、年１回、半年に１回、２年に１回、またはいくつかの他の頻度などの周期的スクリーニング）において利用することができる技術を提供する。例えば、一部の実施形態では、一時的に動機づけられたスクリーニングにおいて使用するために提供される技術は、ある特定の年齢よりも高齢（例えば、５０、５５、６０、６５、７０歳超、またはそれ以上に高齢）である１人または複数の個々の対象を、または対象（例えば、無症候性対象）の集団全体でスクリーニングするために有用であり得る。一部の実施形態では、偶発的に動機づけられたスクリーニングにおいて使用するために提供される技術は、本明細書に記載のとおりの卵巣癌についてのスクリーニングを動機づける出来事または事象を経験していてもよい個々の対象をスクリーニングするために有用であり得る。例えば、一部の実施形態では、がんまたはその易罹患性の１つまたは複数の指標の決定に関連する偶発的動機づけは、例えば、それらの家族歴（例えば、近親者、例えば、血縁者が以前に卵巣癌と診断された）、卵巣癌と関連する１つまたは複数の危険因子の同定（例えば、これに限定されないが、喫煙、アルコール、食事、肥満、職業上の危険などを含む、例えば、生活歴リスク因子）及び／または遺伝子検査（例えば、ゲノムシーケンシング）からの先行の偶発所見、及び／または画像診断検査（例えば、超音波、コンピューター断層撮影（ＣＴ）及び／または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン）、卵巣癌に特徴的な１つまたは複数の徴候または症状の発生（例えば、卵巣癌を潜在的に示す生理中の異常な出血など）に基づく出来事であり得るか、またはそれを含み得る。
一部の実施形態では、患者看護を管理するために提供される技術は、処置及び／または支払い（例えば、処置費の償還）の決定及び／または行為を通知し得る。例えば、一部の実施形態では、提供される技術は、個々の対象が卵巣癌の発生または再発の１つまたは複数の指標を有するかどうかの決定を提供し得て、それにより、医師及び／または患者に、そのような所見を考慮して治療を開始する時期を通知する。加えて、または別法では、一部の実施形態では、提供される技術は、例えば、特異的応答性バイオマーカー（例えば、卵巣癌応答性バイオマーカー）の所見に基づき、医師及び／または患者に、処置の選択を通知し得る。一部の実施形態では、提供される技術は、例えば、卵巣癌と関連する１つまたは複数の分子標的のレベルの変化の所見に基づき、個々の対象が現行の処置に応答性であるかどうかの決定を提供し得て、それにより、医師及び／または患者に、そのような所見を考慮して、そのような治療の有効性及び／または治療を維持または変更する決定を通知する。
一部の実施形態では、提供される技術は、例えば、（１）スクリーニング自体（例えば、周期的／定期的なスクリーニングにのみ有効な、または一時的及び／または偶発的に動機づけられたスクリーニングにのみ有効な償還）について；及び／または（２）提供された技術による所見を考慮しての治療の開始、維持、及び／または変更について、健康保険提供者が償還する（または償還しない）かどうかについてに関する判定を通知し得る。例えば、一部の実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に記載のとおりのスクリーニングの結果を受け取ること、及び同じく、スクリーニング及び／または特定の治療レジメンの償還についての要求を受け取ること；（ｂ）適切なスケジュールまたは関連の出来事に対する応答に従って対象で行われた場合に、スクリーニングの償還を承認すること、及び／または受け取ったスクリーニング結果を考慮して適切な処置である場合に、治療レジメンの償還を承認すること；ならびに、任意選択で（ｃ）償還を実施すること、または償還が拒否されるとの通知を提供することに関する方法を提供する。一部の実施形態では、受け取ったスクリーニング結果が、関連治療レジメンについて承認されたバイオマーカーであるバイオマーカーを検出している場合に、治療レジメンは、受け取ったスクリーニング結果を考慮して適切である（例えば、指示情報ラベルにおいて、及び／または承認されているコンパニオン診断により注記されている場合があるとおり）。別法では、または加えて、本開示は、スクリーニング結果、及び／または本明細書に記載のとおりの償還決定の報告及び処理を可能または容易にする報告システム（例えば、適切な電子デバイス（複数可）及び／またはコミュニケーションシステム（複数可）により実行される）を企図する。
本明細書において提供される一部の態様は、提供される技術において使用するためのシステム及びキットに関する。一部の実施形態では、システムまたはキットは、卵巣癌（例えば、本明細書に記載のもの）の腫瘍バイオマーカーシグネチャーのための検出因子を含み得る。一部の実施形態では、そのようなシステムまたはキットは、卵巣癌（例えば、本明細書において使用及び／または記載されるもの）と関連する細胞外小胞中に存在する細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドのための捕捉因子；及び（ｂ）追加の表面タンパク質バイオマーカー（複数可）（例えば、本明細書において使用及び／または記載されるとおりのもの）、小胞内タンパク質バイオマーカー（複数可）（例えば、本明細書において使用及び／または記載されるとおりのもの）、及び／または小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカー（複数可）（例えば、本明細書において使用及び／または記載されるとおりのもの）であり得るか、またはそれを含み得る、卵巣癌（例えば、本明細書において使用及び／または記載されるもの）の標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の標的バイオマーカーを指向する少なくとも１つまたは複数の検出因子を含み得る。
一部の実施形態では、システム及び／またはキットに含まれる捕捉因子は、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のもの）を指向する結合部分を含み得る。一部の実施形態では、そのような結合部分は、固体基材にコンジュゲートしていてよく、これは、一部の実施形態では、固体基材であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、そのような固体基材は、磁気ビーズであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットに含まれる例示的な捕捉因子は、それにコンジュゲートされる細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する固体基材（例えば、磁気ビーズ）及び抗体因子であり得るか、またはそれを含み得る。
標的バイオマーカーが表面タンパク質バイオマーカー及び／または小胞内タンパク質バイオマーカーを含む一部の実施形態では、システム及び／またはキットは、近接ライゲーションアッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）を実行するための検出因子を含み得る。一部の実施形態では、近接ライゲーションアッセイを実行するためのそのような検出因子は、標的バイオマーカーシグネチャーの標的バイオマーカーをそれぞれ指向する検出プローブのセットを含み得、そのセットは、少なくとも２つの検出プローブを含み、その際、上記２つの検出プローブはそれぞれ、（ｉ）標的バイオマーカーを指向するポリペプチド結合部分；及び（ｉｉ）上記結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインを含み、上記オリゴヌクレオチドドメインは、二本鎖部分と、上記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハング部分とを含み、上記検出プローブの一本鎖オーバーハング部分は、上記検出プローブが同じ細胞外小胞に結合した場合に、それらが相互にハイブリダイズし得ることにおいて特徴づけられる。
一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットは、検出プローブの複数（例えば、２、３、４、５つ以上）のセットを含み得、そのそれぞれのセットが、２つまたはそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）の検出プローブを含む。一部の実施形態では、検出プローブの少なくとも１つのセットは、卵巣癌の検出を指向し得る。例えば、一部の実施形態では、提供されるシステム及び／キットは、卵巣癌を検出するための検出プローブの少なくとも１つのセット、及び異なるがん（例えば、膵臓癌）を検出するための検出プローブの少なくとも１つのセットを含み得る。一部の実施形態では、２つまたはそれ以上の検出プローブは、卵巣癌、例えば、高異型度漿液性卵巣癌、類子宮内膜卵巣癌、明細胞卵巣癌、低異型度漿液性卵巣癌、または粘液性卵巣癌の異なるカテゴリーを指向し得る。一部の実施形態では、２つまたはそれ以上のセットは、異なるステージの卵巣癌の検出を指向し得る。一部の実施形態では、２つまたはそれ以上のセットは、同じステージの卵巣癌の検出を指向し得る。
一部の実施形態では、提供されるキット中の検出プローブを、１つの容器内で単一の混合物として提供することができる。一部の実施形態では、検出プローブの複数のセットを、個々の混合物として別々の容器内で提供することができる。一部の実施形態では、それぞれの検出プローブを個々に、別々の容器内で提供する。
標的バイオマーカーが小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカーを含む一部の実施形態では、そのようなシステム及び／またはキットは、核酸検出アッセイを実行するための検出因子を含み得る。一部の実施形態では、そのようなシステム及び／またはキットは、定量的逆転写ＰＣＲを実行するための検出因子を含み得、これは例えば、小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）標的（複数可）を指向するプライマーを含み得る。
一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットは、例えば、試料及び／またはその中の細胞外小胞を処理するための少なくとも１つの化学試薬を含み得る。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットは、例えば、これに限定されないが、固定剤、透過化剤、及び／または遮断剤を含む、試料中の細胞外小胞を処理するための少なくとも１つの化学試薬を含み得る。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットは、核酸リガーゼ及び／または核酸ポリメラーゼを含み得る。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットは、１つまたは複数のプライマー及び／またはプローブを含み得る。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットは、例えば、ＰＣＲ、例えば、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応のために、一対または複数対のプライマーを含み得る。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットは、例えば、一部の実施形態では、ｑＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）の特異性を上昇させるように設計されていてよい加水分解プローブなどの１つまたは複数のプローブを含み得る。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットは、例えば、同期または平行ｑＰＣＲ反応が使用される場合に有用であり得るように（例えば、読み出しを容易にするか、または改善するために）、１つまたは複数の多重プローブを含み得る。
一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットを、個体（例えば、無症候性または症候性対象）のスクリーニング（例えば、定期的なスクリーニング）及び／または他の評価のために使用して、卵巣癌を検出（例えば、早期検出）することができる。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットを、卵巣癌に易罹患性の個体（例えば、既知の遺伝的、環境、または経験上のリスクを有する個体など）のスクリーニング及び／または他の評価のために使用することができる。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットを、以前に処置されたことのある対象において卵巣癌の再発をモニターするために使用することができる。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットを、コンパニオン診断として、卵巣癌に罹患している対象のための治療と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットを、卵巣癌に罹患している対象に投与される治療の有効性をモニターまたは評価するために使用することができる。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットを、卵巣癌に罹患している対象のために治療を選択するために使用することができる。一部の実施形態では、提供されるシステム及び／またはキットを、卵巣癌と関連する１つまたは複数の症状（例えば、非特異的症状）を有する対象のために、治療を決定する、及び／または選択するために使用することができる。
本明細書に記載の方法を実行すること、及び／または本明細書に記載のシステム及び／またはキットを使用することにより形成される複合体も、本開示の範囲内である。例えば、一部の実施形態では、複合体は、（ａ）標的バイオマーカーシグネチャーを発現する細胞外小胞を含み、その際、標的バイオマーカーシグネチャーのうちの少なくとも２つは、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、及び小胞内ＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含み、その際、上記表面タンパク質バイオマーカーは、ＡＱＰ５、ＣＤＨ６、ＣＨＯＤＬ、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＴＲ３Ａ、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せから選択され；上記小胞内タンパク質バイオマーカーは、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せから選択され；上記小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカーは、ＣＬＤＮ６、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、及びそれらの組合せから選択され、その細胞外小胞は、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する結合部分を含む固体基材上に固定化されている。そのような複合体はさらに、上記細胞外小胞に存在する標的バイオマーカーシグネチャーの少なくとも１つの標的バイオマーカーを指向する少なくとも２つの検出プローブを含み、その際、それぞれの検出プローブは、そのような標的バイオマーカーに結合し、かつそれぞれは、（ｉ）標的バイオマーカーを指向する結合ドメイン；及び（ｉｉ）結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインを含み、上記オリゴヌクレオチドドメインは、二本鎖部分と、上記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハング部分とを含み、上記検出プローブの一本鎖オーバーハング部分は相互にハイブリダイズする。
一部の実施形態では、複合体を形成する細胞外小胞中に存在する細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーは、ＡＱＰ５、ＣＤＨ６、ＣＨＯＤＬ、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＴＲ３Ａ、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せのうちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＣＬＤＮ６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＭＵＣ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ｓＴｎポリペプチドグリコシル化であり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＡＬＰＬポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＢＳＴ２ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る。
本開示に包含されるこれらの、及び他の態様を下記において、かつ特許請求の範囲において、より詳細に記載する。
個々の細胞外小胞（ＥＶ）をプロファイルする例示的なワークフローを示す概略図である。この図は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び特異的膜結合タンパク質マーカーを提示するＥＶの免疫親和性捕捉を使用して、血漿からＥＶを精製すること（パネルＡ）；本明細書に記載の一部の実施形態による標的実体検出アッセイを使用して、捕捉されたＥＶ上で共局在している標的マーカー（例えば、小胞内タンパク質または表面タンパク質）を検出すること（パネルＢ）を示している。
本明細書に記載の一部の実施形態による標的実体検出アッセイを示す概略図である。一部の実施形態では、がんの検出に特異的である検出プローブの組合せを使用する標的実体検出アッセイが示されている。一部の実施形態では、標的タンパク質１（例えば、がんマーカー１）のための第１の検出プローブ及び標的タンパク質２（例えば、がんマーカー２）のための第２の検出プローブを含む二重システムを、生物学的実体（例えば、細胞外小胞）を含む試料に添加する。一部の実施形態では、検出プローブはそれぞれ、二本鎖部分と、そのオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含むオリゴヌクレオチドドメインにカップリングしている標的結合部分（例えば、標的タンパク質に対する抗体因子）を含む。第１及び第２の検出プローブの別個の標的結合部分（例えば、それぞれ標的タンパク質１及び標的タンパク質２に対する抗体因子）が同じ生物学的実体（例えば、細胞外小胞）に近接して局在化していて、対応する一本鎖オーバーハングが相互にハイブリダイズし、したがって、それらのオリゴヌクレオチドドメインのライゲーションが生じることが可能になった場合に、検出シグナルが生じる。例えば、対照実体（例えば、健康な対象試料からの生物学的実体）は標的タンパク質１（例えば、がんマーカー１）及び標的タンパク質２（例えば、がんマーカー２）の一方または両方を発現せず、したがって、シグナルの検出は生じ得ない。しかしながら、がん試料（例えば、卵巣癌）からの生物学的実体が標的タンパク質１及び標的タンパク質２を発現し、かつそれらの標的タンパク質が、同じ生物学的実体（例えば、細胞外小胞）において相互に十分に短距離内に存在する場合に、検出シグナルが生じる。
例えば、図１または図２に例示のアッセイを使用して、種々の細胞系由来細胞外小胞試料においてライゲートされた試料のｑＰＣＲ検出からの実験データが示されている。一部の実施形態では、標的実体検出アッセイは、ＳＬＣ３４Ａ２マーカーに基づき細胞外小胞を捕捉するための作用因子（「ＳＬＣ３４Ａ２捕捉」）及び例示的な二重システムを含み、これは例えば、二本鎖部分と、そのオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含む別個のオリゴヌクレオチドドメインにカップリングしているＭＵＣ１６結合部分（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）をそれぞれ含む少なくとも２つの検出プローブ（「ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブ」）を含む。パネルＡは、非卵巣癌細胞系ＥＶ（陰性細胞系）に対して卵巣癌細胞系ＥＶ（陽性細胞系）の検出を比較するｑＰＣＲデータのグラフを示している。パネルＢは、基線として陰性対照細胞系（例えば、非卵巣癌細胞系）を使用して、対応する平均デルタＣｔ値を示している。
卵巣嚢胞腺癌（ＯＣ）患者血漿試料研究に含まれた患者の人口統計を示すグラフのセットである。（パネルＡ）例示的なアッセイにより評価された女性患者コホートでの年齢及びコホートサイズの概要。 卵巣嚢胞腺癌（ＯＣ）患者血漿試料研究に含まれた患者の人口統計を示すグラフのセットである。（パネルＢ）良性腫瘤を伴う患者からの女性血漿試料での年齢及びコホートサイズの概要。
卵巣癌患者（パネルＡ）及び良性腫瘤を有する患者（パネルＢ）からの試料におけるＣＡ－１２５レベルとの患者年齢の相関を示すグラフのセットである。
主な卵巣癌腫サブタイプによる卵巣癌有病率を示すパイチャートである。「その他」は、単一のサブタイプに分類することができない混合型または移行性癌を指す。例えば、本明細書に記載の目的について、また追加の情報のために参照によりその全体が本明細書にそれぞれ援用されるＧｉｌｋｓ ｅｔ ａｌ．、２００８、Ｓｅｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２００３、２００４を参照されたい。
ＳＬＣ３４Ａ２捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとに基づく二重システム（例えば、図１または２に記載のとおりのもの）を含む、卵巣癌を検出するための例示的なアッセイの性能を示すグラフのセットである。パネルＡは、様々な卵巣癌サブタイプからの統合データに関する。 ＳＬＣ３４Ａ２捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとに基づく二重システム（例えば、図１または２に記載のとおりのもの）を含む、卵巣癌を検出するための例示的なアッセイの性能を示すグラフのセットである。パネルＢは、２つの異なるカットオフで、最も一般的な卵巣サブタイプの高異型度漿液性卵巣癌の優れた検出を示している。カットオフ１は、９９．８％の特異性に関し、カットオフ２は、９８％の特異性に関する。注記されている卵巣癌ステージについての対応する感受性は、指定のカットオフで表示されている。
ＳＬＣ３４Ａ２捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとに基づく二重システム（例えば、図１または２に記載のとおりのもの）を含む、類子宮内膜卵巣癌を検出するための例示的なアッセイの性能を示すグラフである。２つの異なるカットオフで、二番目に一般的な卵巣サブタイプの類子宮内膜卵巣癌の優れた検出が示されている。カットオフ１は、９９．８％の特異性に関し、カットオフ２は、９８％の特異性に関する。
ＳＬＣ３４Ａ２捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとに基づく二重システム（例えば、図１に記載のとおりのもの）を含む、低異型度漿液性卵巣癌を検出するための例示的なアッセイの性能を、２つの異なるカットオフで示すグラフである。カットオフ１は、９９．８％の特異性に関し、カットオフ２は、９８％の特異性に関する。
ＳＬＣ３４Ａ２捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとに基づく二重システム（例えば、図１または２に記載のとおりのもの）を含む、明細胞卵巣癌を検出するための例示的なアッセイの性能を、２つの異なるカットオフで示すグラフである。カットオフ１は、９９．８％の特異性に関し、カットオフ２は、９８％の特異性に関する。
ＳＬＣ３４Ａ２捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとに基づく二重システム（例えば、図１または２に記載のとおりのもの）を含む、粘液性卵巣癌を検出するための例示的なアッセイの性能を、２つの異なるカットオフで示すグラフである。カットオフ１は、９９．８％の特異性に関し、カットオフ２は、９８％の特異性に関する。
ＳＬＣ３４Ａ２捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとに基づく二重システム（例えば、図１または２に記載のとおりのもの）を含む、卵巣癌サブタイプを検出するための例示的なアッセイの読み出しが、血清ＣＡ－１２５レベルに対して示されている。パネルＡは、アッセイシグナルと血清ＣＡ－１２５レベルとの間で、相関は観察されないことを示している。カットオフ１は、対数正規分布を健康な対照患者の集団でのＣｔ値（例示的なアッセイにより得られたもの）にフィットさせ、その分布の平均と、すべての健康な患者のＣｔ値のうちの９９．８％が上回るであろう標準偏差２．８７９を用いることにより引いた。 ＳＬＣ３４Ａ２捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとに基づく二重システム（例えば、図１または２に記載のとおりのもの）を含む、卵巣癌サブタイプを検出するための例示的なアッセイの読み出しが、血清ＣＡ－１２５レベルに対して示されている。パネルＢは、パネルＡに示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値 対 パネルＡに示されている血清ＣＡ－１２５値を使用して、卵巣癌を有する患者を良性婦人科腫瘍を有する患者から識別するための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である（患者コホートは図４Ａに記載されている）。良性婦人科腫瘍には、例えば、類子宮内膜嚢胞、濾胞性嚢胞、粘液嚢胞腺腫、成熟奇形腫、平滑筋腫、及び漿液性嚢胞腺腫が含まれる。さらに、高異型度漿液性、低異型度漿液性、粘液性、類子宮内膜、及び明細胞を含む卵巣癌のいくつかのサブタイプを評価した。
ステージＩ及びＩＩ高異型度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）を検出するための例示的なアッセイの性能を、現行の標準治療：血清ＣＡ－１２５及び経腟超音波検査（ＴＶＵＳ）と比較して示すデータのセットである。特異性（パネルＡ及びＤ）、感受性（パネルＢ及びＥ）、及び陽性予測値（パネルＣ及びＦ）を、遺伝的リスク（パネルＡ、Ｂ、及びＣ）、及び平均的リスク（パネルＤ、Ｅ、及びＦ）を有する女性をＨＧＳＯＣについてスクリーニングするために比較した。一部の事例では、遺伝的及び平均的リスクを有する女性での有病率は、それぞれ１％及び０．０５７％である。血清ＣＡ－１２５及びＴＶＵＳの性能パラメーターは、本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用されるＢｕｙｓ ｅｔ ａｌ．、２０１１から得た。
卵巣癌細胞系 対 陰性対照細胞系からのＥＶにおけるＭＩＦ ｍＲＮＡの検出を示すグラフのセットである。（パネルＡ）ＲＴ－ｑＰＣＲを使用してのバルクＥＶにおけるＭＩＦ ｍＲＮＡの検出。 卵巣癌細胞系 対 陰性対照細胞系からのＥＶにおけるＭＩＦ ｍＲＮＡの検出を示すグラフのセットである。（パネルＢ）バルクでのＥＶと比較しての、抗ＥｐＣＡＭ官能化ビーズを使用して捕捉されたＥＶにおけるＭＩＦ ｍＲＮＡの検出。
本明細書に記載の一部の実施形態による標的実体検出アッセイを示す概略図である。この図は、例示的な三重標的実体検出システムを示しており、その際、一部の実施形態では、それぞれ標的タンパク質のための３つまたはそれ以上の検出プローブを、生物学的実体（例えば、細胞外小胞）を含む試料に添加することができる。一部の実施形態では、検出プローブはそれぞれ、二本鎖部分と、そのオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含むオリゴヌクレオチドドメインにカップリングしている標的結合部分（例えば、標的タンパク質に対する抗体因子）を含む。３つまたはそれ以上のすべての検出プローブの対応する一本鎖オーバーハングが相互にハイブリダイズして、線状二本鎖複合体を形成し、かつその二本鎖複合体の少なくとも１本の鎖のライゲーションが生じ、したがって、生じたライゲートされた産物を検出することが可能になった場合に、検出シグナルが生じる。
それらのそれぞれの一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションを介して線状配置で相互に連結された４つの検出プローブを含む二本鎖複合体の非限定的例である。
本明細書に記載の例示的な実施形態の標的実体検出アッセイを示す概略図である。一部の実施形態では、それぞれ別個の標的のための複数の検出プローブを、生物学的実体（例えば、細胞外小胞）を含む試料に添加する。一部の実施形態では、検出プローブはそれぞれ、二本鎖部分と、そのオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含むオリゴヌクレオチドドメインにカップリングしている標的結合部分（例えば、抗体因子）を含む。すべての検出プローブが同じ生物学的実体（例えば、細胞外小胞または分析物）に近接して局在化して、対応する一本鎖オーバーハングがハイブリダイズして、線状二本鎖複合体を形成し、かつ生じた二本鎖複合体の少なくとも１本の鎖のライゲーションが生じ、それにより、ライゲートされた産物を検出することが可能になった場合に、検出シグナルが生じる。
４４２の卵巣癌試料（ステージＩ／ＩＩ及びステージＩＩＩ／ＩＶ）における転写産物発現が、全部で１７，３８２の健康な組織試料と比較して、（パネルＡ）ＳＬＣ３４Ａ２、（パネルＢ）ＭＵＣ１６、（パネルＣ）ＦＯＬＲ１、及び（パネルＤ）ＣＬＤＮ６を含む４つの例示的な表面タンパク質バイオマーカーについて図示されている。 ４４２の卵巣癌試料（ステージＩ／ＩＩ及びステージＩＩＩ／ＩＶ）における転写産物発現が、全部で１７，３８２の健康な組織試料と比較して、（パネルＡ）ＳＬＣ３４Ａ２、（パネルＢ）ＭＵＣ１６、（パネルＣ）ＦＯＬＲ１、及び（パネルＤ）ＣＬＤＮ６を含む４つの例示的な表面タンパク質バイオマーカーについて図示されている。 ４４２の卵巣癌試料（ステージＩ／ＩＩ及びステージＩＩＩ／ＩＶ）における転写産物発現が、全部で１７，３８２の健康な組織試料と比較して、（パネルＡ）ＳＬＣ３４Ａ２、（パネルＢ）ＭＵＣ１６、（パネルＣ）ＦＯＬＲ１、及び（パネルＤ）ＣＬＤＮ６を含む４つの例示的な表面タンパク質バイオマーカーについて図示されている。 ４４２の卵巣癌試料（ステージＩ／ＩＩ及びステージＩＩＩ／ＩＶ）における転写産物発現が、全部で１７，３８２の健康な組織試料と比較して、（パネルＡ）ＳＬＣ３４Ａ２、（パネルＢ）ＭＵＣ１６、（パネルＣ）ＦＯＬＲ１、及び（パネルＤ）ＣＬＤＮ６を含む４つの例示的な表面タンパク質バイオマーカーについて図示されている。
２つの例示的なオルトゴナルなバイオマーカー組合せの性能が図示されている。図１８に注記されている転写産物発現カットオフを（パネルＡ）ＳＬＣ３４Ａ２＋ＭＵＣ１６に適用すると、卵巣癌試料の７１％を健康な組織試料の９９．９％超から識別した。 ２つの例示的なオルトゴナルなバイオマーカー組合せの性能が図示されている。図１８に注記されている転写産物発現カットオフを（パネルＢ）ＦＯＬＲ１＋ＣＬＤＮ６に適用すると、卵巣癌試料の７５％を健康な組織試料の９９．９％超からそれぞれ識別した。 （パネルＣ）がん患者試料を特徴づけるためにパネルＡ及びＢに示されているとおりの両方のバイオマーカー組合せを使用した場合に、カットオフを上回ると同定された卵巣癌患者のパーセント（９１％）を示すベン図である。２つまたはそれ以上のバイオマーカーの組合せを使用することで、卵巣癌検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の感受性が上昇し得ることを示している。
先行バイオマーカー組合せの結果が図示されている。（パネルＡ）プールされた健康な血漿及びプールされた卵巣癌血漿試料における先行バイオマーカー組合せスクリーニング（１１２の組合せがスクリーニングされた）からの結果が図示されている。各データポイントは、固有のバイオマーカー組合せを、パネルＢに示されているレッドデータポイント（ｒｅｄ ｄａｔａ ｐｏｉｎｔ）で表している。（パネルＢ）７つの例示的なバイオマーカー組合せでの、プールされた健康な血漿と、プールされた卵巣癌血漿との間のアッセイシグナルの差。
複数のオルトゴナルなバイオマーカー組合せの使用、及びアッセイ感受性における関連した改善が図示されている。組合せ１（ＳＬＣ３４Ａ２捕捉、ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブ読み出し）及び組合せ２（ＳＬＣ３４Ａ２捕捉、ＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブ読み出し）は個々に、卵巣癌集団を健康な対照及び良性腫瘍コホートから識別することができる。９９．５％の特異性を達成するように、両方のカットオフは設定されている。
対照対象（例えば、健康な女性対象、及び／または良性婦人科腫瘍及び／または例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、子宮内膜症などを含む炎症状態を伴う対象）を卵巣癌患者から識別するための、個々の例示的なバイオマーカー組合せを用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。例示的な個々のバイオマーカー組合せには、下記が含まれる：
Figure 2023510911000001
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６をそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブとのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、（ｉ）（例えば、分布内の健康な対象のうちの９９．８３％を排除するように）健康な対照対象及び炎症状態を伴う対象の平均から離れて標準偏差２．９３または（ｉｉ）健康な対照対象からの最大アッセイシグナルのいずれかのうち、より制限的でないものを選択することにより決定された。一部の実施形態では、良性卵巣腫瘍試料は、健康な対照対象及び／または炎症状態（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、子宮内膜症）を伴う対象よりも、オフターゲットシグナルについて、懸念が少なくなり得る。したがって、一部のそのような実施形態では、良性卵巣腫瘍試料は、カットオフ値を決定するために含まれなくてもよい。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、ＦＯＬＲ１を指向する少なくとも１つの第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＭＵＣ１６を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、ＦＯＬＲ１を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
例示的なバイオマーカー組合せをそれぞれ用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。（パネルＡ）ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＭＵＣ１６を指向する第２の検出プローブのセット；（パネルＢ）ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、ＦＯＬＲ１を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブのセット；ならびに（パネルＣ）ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブのセット。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる例示的なアッセイが、正常な血清ＣＡ－１２５（例えば、３５Ｕ／ｍＬ未満）を有する卵巣癌患者を検出することができ、かつ上昇した血清ＣＡ－１２５を有する多くの非卵巣癌患者（例えば、良性婦人科腫瘍を有する患者）を卵巣癌患者から識別することができることが図示されている。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＭＵＣ１６を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる例示的なアッセイが、正常な血清ＣＡ－１２５（例えば、３５Ｕ／ｍＬ未満）を有する卵巣癌患者を検出することができ、かつ上昇した血清ＣＡ－１２５を有する多くの非卵巣癌患者（例えば、良性婦人科腫瘍を有する患者）を卵巣癌患者から識別することができることが図示されている。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、ＦＯＬＲ１を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる例示的なアッセイが、正常な血清ＣＡ－１２５（例えば、３５Ｕ／ｍＬ未満）を有する卵巣癌患者を検出することができ、かつ上昇した血清ＣＡ－１２５を有する多くの非卵巣癌患者（例えば、良性婦人科腫瘍を有する患者）を卵巣癌患者から識別することができることが図示されている。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＣＬＤＮ３を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＣＬＤＮ６を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、ＦＯＬＲ１を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＣＬＤＮ３を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＬＲＲＴＭ１を指向する捕捉因子と、ＭＵＣ１６を指向する少なくとも第１の検出プローブ及びＭＵＣ１６を指向する第２の検出プローブのセット）を用いる本明細書に記載の例示的なアッセイの性能が図示されている。カットオフ値は、図２３に記載のとおりに決定された。
ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＡ）は、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．９２の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＢ）は、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉プローブ、及びＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．８７の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＣ）は、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．９０の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＤ）は、ＭＵＣ１６捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．９１の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＥ）は、ＭＵＣ１６捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．９１の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＦ）は、ＭＵＣ１６捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＣＬＤＮ３ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．８４の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＧ）は、ＭＵＣ１６捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＣＬＤＮ６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．９０の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＨ）は、ＭＵＣ１６捕捉プローブ、及びＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．９０の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＩ）は、ＭＵＣ１６捕捉プローブ、及びＦＯＬＲ１＋ＣＬＤＮ３ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．６７の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。 ステージＩ～ＩＶ卵巣癌を有する患者を健康な患者から識別するための一連の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が図示されている。それぞれ図２３～２８及び図３３～３６に示されている例示的なアッセイから決定されたＣｔ値を使用して、曲線を生成した。（パネルＪ）は、ＬＲＲＴＭ１捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブを利用した場合の、例示的なＲＯＣ曲線を０．７８の曲線下面積（ＡＵＣ）と共に図示している。
複数のオルトゴナルなバイオマーカーシグネチャー組合せの使用、及びアッセイ感受性における関連した改善が図示されている。組合せ１（ＳＬＣ３４Ａ２捕捉、ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブ）及び組合せ２（ＭＵＣ１６捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブ）は個々に、卵巣癌集団を健康な対照及び良性腫瘍コホートから識別することができる。９９．５％の特異性を達成するように、両方のカットオフは設定されている。
複数のオルトゴナルなバイオマーカーシグネチャー組合せの使用、及びアッセイ感受性における関連した改善が図示されている。組合せ１（ＳＬＣ３４Ａ２捕捉プローブ、及びＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブ）及び組合せ２（ＭＵＣ１６捕捉プローブ、及びＭＵＣ１６＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブ）は個々に、卵巣癌集団を健康な対照及び良性腫瘍コホートから識別することができる。９９．５％の特異性を達成するように、両方のカットオフは設定されている。
ある特定の定義
投与すること：本明細書で使用される場合、「投与すること」または「投与」という用語は典型的には、組成物を対象に投与して、組成物であるか、または組成物に含まれる作用因子を、標的部位または処置される部位に送達することを指す。当業者は、適切な状況で、対象、例えば、ヒトに投与するために利用することができる様々な経路が分かるであろう。例えば、一部の実施形態では、投与は非経口であり得る。一部の実施形態では、投与は経口であり得る。一部の実施形態では、投与は、単回用量のみを含み得る。一部の実施形態では、投与は、固定された数の用量を適用することを含み得る。一部の実施形態では、投与は、断続的（例えば、時間を空けて複数の用量）及び／または周期的（例えば、共通期間を空けて個々の用量）投与である投与を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる連続的投与（例えば、潅流）を含み得る。
増幅：「増幅」及び「増幅する」という用語は、その当初の量及び／またはレベルと比べて、核酸分子の量及び／またはレベルの上昇をもたらすテンプレート依存的プロセスを指す。テンプレート依存的プロセスは一般に、プライマー分子のテンプレート依存的伸長を含むプロセスであり、その際、新たに合成される核酸の鎖の配列は、相補的塩基対合の周知の規則により規定される（例えば、本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用されるＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７）を参照されたい）。
抗体因子：本明細書で使用される場合、「抗体因子」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する作用因子を指す。一部の実施形態では、この用語は、特異的な結合を付与するために十分な免疫グロブリン構造要素を包含するいずれのポリペプチドまたはポリペプチド複合体も包含する。例示的な抗体因子には、これに限定されないが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が含まれる。一部の実施形態では、抗体因子は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的である１つまたは複数の定常領域配列を含み得る。一部の実施形態では、抗体因子は、当技術分野で公知であるとおり、ヒト化されている、霊長類化されている、キメラなどの１つまたは複数の配列要素を含み得る。多くの実施形態で、「抗体因子」という用語は、代替の提示において抗体の構造的及び機能的特徴を利用するために当技術分野で公知であるか、または開発されたコンストラクトまたはフォーマットのうちの１つまたは複数を指すために使用される。例えば、実施形態、本発明に従って利用される抗体因子は、これに限定されないが、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体；二重－または多重特異的抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）；抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのセット；一本鎖Ｆｖ；ポリペプチド－Ｆｃ融合体；シングルドメイン抗体（例えば、サメシングルドメイン抗体、例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片）；ラクダ抗体；マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰ（商標）」）；一本鎖またはタンデム二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；マイクロタンパク質；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（登録商標）、ＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）、ならびにＡｆｆｉｍｅｒ（登録商標）から選択されるフォーマットである。一部の実施形態では、抗体は、天然に産生された場合に有するであろう共有結合修飾（例えば、グリカンの付着）を欠いていてよい。一部の実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療用部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリ－エチレングリコールなど］の付着を含んでよい。多くの実施形態で、抗体因子は、そのアミノ酸配列が当業者により相補性決定領域（ＣＤＲ）と認識される１つまたは複数の構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む；一部の実施形態では、抗体因子は、そのアミノ酸配列が基準抗体において見い出されるものと実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、基準ＣＤＲと実質的に同一であり、その際、これは、配列が同一であるか、または基準ＣＤＲと比較して、１～５つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、基準ＣＤＲと実質的に同一であり、その際、これは、基準ＣＤＲと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を示す。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、基準ＣＤＲと実質的に同一であり、その際、これは、基準ＣＤＲと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を示す。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、基準ＣＤＲと実質的に同一であり、その際、基準ＣＤＲと比較して、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲは、他の点では基準ＣＤＲのものと同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、基準ＣＤＲと実質的に同一であり、その際、基準ＣＤＲと比較して、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１～５個のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲは、他の点では基準ＣＤＲのものと同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、基準ＣＤＲと実質的に同一であり、その際、基準ＣＤＲと比較して、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が置換されているが、含まれるＣＤＲは、他の点では基準ＣＤＲのものと同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、基準ＣＤＲと実質的に同一であり、その際、基準ＣＤＲと比較して、含まれるＣＤＲ内の１～５個のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲは、他の点では基準ＣＤＲと同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体因子は、そのアミノ酸配列が当業者により免疫グロブリン可変ドメインと認識される複数の構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、抗体因子は、免疫グロブリン結合ドメインと相同な、または広く相同な結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。
当業者は、抗体因子を、当技術分野で公知の方法ならびに市販のサービス及びキットを使用して作製することができる。例えば、モノクローナル抗体を調製する方法は、当技術分野で周知であり、それには、ハイブリドーマ技術及びファージディスプレイ技術が含まれる。本開示で使用するために適したさらなる抗体が、例えば、次の刊行物に記載されている：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３０，２０１３）；Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｓ．Ｇａｒｙ Ｃ．Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗ Ｒ．Ｋａｓｅｒ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（Ｊｕｌｙ ２９，２０１３）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｐａｔｒｉｃｋ Ｃｈａｍｅｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ａｕｇｕｓｔ ２１，２０１２）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｅｄｓ．Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｏｓｓｉｐｏｗ ａｎｄ Ｎｉｃｏｌａｓ Ｆｉｓｃｈｅｒ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ １２，２０１４）；及びＨｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｔｅｉｎｉｔｚ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３０，２０１３））。
抗体は、標準的な技術により、例えば、適切なポリペプチドもしくはその部分（複数可）での免疫化により、またはファージディスプレイライブラリを使用することにより生成することができる。ポリクローナル抗体が望ましい場合には、選択された宿主動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリなど）を、任意選択で別のポリペプチドにハプテン化された所望のエピトープ（複数可）を有する免疫原性ポリペプチドで免疫化する。ホスト種に応じて、様々なアジュバントを使用して、免疫応答を増大させることができる。そのようなアジュバントには、これに限定されないが、フロイントアジュバント、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、及び表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールが含まれる。免疫化動物からの血清を収集し、公知の手順に従って処理する。所望のエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、上記ポリクローナル抗体を、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは当技術分野で公知の任意の他の方法により精製することができる。ポリクローナル抗血清を生成または処理する技術は、当技術分野で周知である。
およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つまたは複数の値に適用される場合、定められた基準値と同様である値を指す。一般に、その文脈を熟知している当業者は、その文脈において「約」または「およそ」に包含される関連分散度が分かるであろう。例えば、一部の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、関連値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内にある値の範囲を包含し得る。
アプタマー：本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は典型的には、特異的標的分子（例えば、エピトープ）に結合する核酸分子またはペプチド分子を指す。一部の実施形態では、核酸アプタマーは、ヌクレオチド配列により記載され得、かつ典型的には、約１５～６０ヌクレオチド長である。核酸アプタマーは、一本鎖及び／または二本鎖構造であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、核酸アプタマーは、ＤＮＡであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、核酸アプタマーは、ＲＮＡであり得るか、またはそれを含み得る。いずれの理論にも束縛されることは望まないが、アプタマー中のヌクレオチドの鎖が分子を複合体三次元形状に折り畳む分子内相互作用を形成し、かつこの三次元形状が、アプタマーがその標的分子の表面に緊密に結合することを可能にすることが企図されている。一部の実施形態では、ペプチドアプタマーは、タンパク質スキャフォールドにより提示される可変配列の１つまたは複数のペプチドループを有すると記載され得る。ペプチドアプタマーは、コンビナトリアルライブラリから単離することができ、かつ多くの場合に続いて、指向変異または可変領域変異誘発及び選択のラウンドにより改善することができる。すべての可能なヌクレオチド及び／またはペプチド配列のユニバース内に存在する分子形状の非常な多様性を考慮すると、アプタマーを、タンパク質及び小分子を含む幅広い分子標的について得ることができる。高い特異性に加えて、アプタマーは典型的には、それらの標的について非常に高い親和性（例えば、タンパク質またはポリペプチドについて、ピコモルから低いナノモルまでの範囲の親和性）を有する。アプタマーは典型的には合成分子であるので、アプタマーは、それらの機能を特定の用途のために最適化し得る様々な修飾に適している。
と関連する：この用語が本明細書において使用される場合、一方の存在、レベル及び／または形態が、他方のそれらと相関しているならば、その２つの事象または実体は相互に「関連」している。例えば、特定の生物学的現象（例えば、特異的バイオマーカーの発現）は、その存在が卵巣癌の発生及び／または易罹患性（例えば、関連集団全体）と相関しているならば、卵巣癌（例えば、卵巣癌の特異的な種類及び／または卵巣癌のステージ）と関連していると判断される。
生物学的実体：適切な状況では、当業者には文脈から明らかであるように、「生物学的実体」という用語を、一部の実施形態では、細胞または生体、例えば、動物またはヒトであり得るか、もしくはそれを含み得る、または一部の実施形態では、生物学的組織または流体であり得るか、もしくはそれを含み得る、例えば、一部の実施形態では、対象に由来するか、またはそこから得られる生物学的試料中に存在する実体もしくは構成成分を指すために利用することができる。一部の実施形態では、生物学的実体は、細胞もしくは微生物、またはその画分、抽出物、または構成成分（例えば、細胞内構成成分及び／または細胞もしくは微生物により分泌される分子を含む）であるか、またはそれを含む。例えば、一部の実施形態では、生物学的実体は、細胞であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、生物学的実体は、細胞外小胞であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、生物学的実体は、生物学的分析物（例えば、代謝産物、炭水化物、タンパク質またはポリペプチド、酵素、脂質、細胞器官、サイトカイン、受容体、リガンド、及びそれらの任意の組合せ）であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、試料中に存在する生物学的実体は、天然の状態にある（例えば、タンパク質またはポリペプチドが、天然に存在する高次構造で維持されている）。一部の実施形態では、生物学的実体を、例えば、試料から単離すること、または天然に存在する生物学的実体から得ることにより処理する。例えば、生物学的実体を、本明細書において提供される技術を利用して検出するためにより望ましいものであるように、１つまたは複数の化学剤で処理することができる。例にすぎないが、生物学的実体は、固定剤（例えば、これに限定されないが、メタノール及び／またはホルムアルデヒド）と接触すると、細胞または細胞外小胞中に存在するタンパク質及び／またはペプチドの架橋の形成をもたらす細胞または細胞外小胞であり得る。一部の実施形態では、生物学的実体は、単離された、または純粋な形態である（例えば、血液、血清、または血漿試料などの体液試料から単離される）。一部の実施形態では、生物学的実体は、複合マトリックス（例えば、血液、血清、または血漿試料などの、例えば、体液試料）中に存在し得る。
バイオマーカー：「バイオマーカー」という用語は典型的には、その存在、レベル、程度、種類、及び／または形態が特定の生物学的事象または目的の状態と相関し、したがって、その事象または状態の「マーカー」であると判断される実体、事象、または特徴を指す。いくつかの例を示すと、一部の実施形態では、バイオマーカーは、特定の病態、または特定の疾患、障害もしくは状態が発生し得る、起こり得る、もしくは再発し得る可能性についてのマーカーであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーは、特定の疾患もしくは治療成績、またはその可能性についてのマーカーであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーは、特定の組織（例えば、これに限定されないが、脳、乳房、結腸、卵巣及び／または女性生殖系と関連する他の組織、膵臓、前立腺及び／または男性生殖系と関連する他の組織、肝臓、肺、及び皮膚）についてのマーカーであり得るか、またはそれを含み得る。特定の組織についてのそのようなマーカーは、一部の実施形態では、健康な組織に特異的であり得るか、罹患組織に特異的であり得るか、または一部の実施形態では、正常で健康な組織及び罹患組織（例えば、腫瘍）に存在し得て；当業者は、本開示を読むことで、そのような種類のバイオマーカーそれぞれについての適切な状況が分かるであろう。一部の実施形態では、バイオマーカーは、がん特異的マーカー（例えば、特定のがんに特異的であるマーカー）であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーは、非特異的がんマーカー（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上のがんに存在するマーカー）であり得るか、またはそれを含み得る。非特異的がんマーカーは、一部の実施形態では、がんについての一般的なマーカー（例えば、組織種にかかわらず、がんに典型的に存在するマーカー）、または一部の実施形態では、特異的な組織のがんについてのマーカー（例えば、これに限定されないが、脳、乳房、結腸、卵巣及び／または女性生殖系と関連する他の組織、膵臓、前立腺及び／または男性生殖系と関連する他の組織、肝臓、肺、及び皮膚）であり得るか、またはそれを含み得る。したがって、一部の実施形態では、バイオマーカーは予測的であり；一部の実施形態では、バイオマーカーは予後的であり；一部の実施形態では、バイオマーカーは、関連生物学的事象または目的の状況について診断的である。バイオマーカーは、任意の化学的群の実体であり得るか、またはそれを含み得、かつ実体の組合せであり得るか、またはそれを含み得る。例えば、一部の実施形態では、バイオマーカーは、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、小分子、無機因子（例えば、金属またはイオン）、またはそれらの組合せであり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーは、特定の分子、複合体、または構造の一部分であるか、またはそれを含み；例えば、一部の実施形態では、バイオマーカーは、エピトープであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーは、卵巣癌と関連する細胞外小胞の表面マーカー（例えば、表面タンパク質マーカー）である。一部の実施形態では、バイオマーカーは、小胞内（例えば、細胞外小胞内に存在するタンパク質またはＲＮＡマーカー）である。一部の実施形態では、バイオマーカーは、遺伝的または後成的シグネチャーであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子発現シグネチャーであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、本開示に従って使用するために適した「バイオマーカー」は、標的マーカーに存在する分子実体（例えば、エピトープ）の存在、レベル、及び／または形態を指し得る。例えば、一部の実施形態では、分子実体として２つまたはそれ以上の「バイオマーカー」（例えば、エピトープ）が、同じ標的マーカー（例えば、マーカータンパク質、例えば、細胞外小胞中に存在する表面タンパク質）上に存在し得る。
血液由来試料：「血液由来試料」という用語は、本明細書で使用される場合、それを必要とする対象の血液試料（すなわち、全血試料）に由来する試料を指す。血液由来試料の例には、これに限定されないが、血漿（例えば、新鮮凍結血漿を含む）、血清、血液画分、血漿画分、血清画分、赤血球（ＲＢＣ）を含む血液画分、血小板、白血球など、及びその画分を含む細胞溶解産物（例えば、細胞、例えば、赤血球、白血球などを細胞溶解産物を得るために収集及び溶解させることができる）が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法、システム、及び／またはキットで使用される血液由来試料は血漿試料である。
がん：「がん」という用語は本明細書では、目的の組織の細胞が相対に異常な、無制御の、及び／または自律的成長を示し、したがってそれらが、細胞増殖の制御の有意な喪失により特徴づけられる異常な成長表現型を示す疾患または状態を一般に指すために使用される。一部の実施形態では、がんは、前がん性（例えば、良性）、悪性、転移前、転移性、及び／または非転移性である細胞を含み得る。本開示は、卵巣癌を検出するための技術を提供する。
分類カットオフ：本明細書で使用される場合、「分類カットオフ」という用語は、例えば、集団の２つまたはそれ以上のサブセット（例えば、正常な健康対象及び炎症状態を有する対象 対 肺癌対象）の中で、１つまたは複数の境界線を定義することにより、疾患または状態（例えば、肺癌）についての対象のリスクを予測するために使用されるレベル、値、もしくはスコア、または値のセット、または指標を指す。一部の実施形態では、分類カットオフは、任意選択で、他の適切な変項、例えば、対象の年齢、生活歴関連危険因子、遺伝的要因、身体的及び／または医学的状態と組み合わせて、本明細書に記載の標的バイオマーカーシグネチャーについての少なくとも１つの基準閾値レベル（例えば、基準カットオフ）を基準として決定することができる。分類が単一の標的バイオマーカーシグネチャー（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）に基づく一部の実施形態では、分類カットオフは、単一の標的バイオマーカーシグネチャーについて事前決定された基準閾値（例えば、カットオフ）と同じであり得る。分類が２つまたはそれ以上の標的バイオマーカーシグネチャーに基づく一部の実施形態では、分類カットオフは、対応する標的バイオマーカーシグネチャーについてそれぞれ個々に事前決定された２つまたはそれ以上の基準閾値（例えば、カットオフ）を基準とし、任意選択で、１つまたは複数の適切な変項、例えば、対象の年齢、生活歴関連危険因子、遺伝的因子、身体的及び／または医学的状態を組み込んでよい。一部の実施形態では、分類カットオフは、任意選択で、他の適切な変項、例えば、対象の年齢、生活歴関連危険因子、遺伝的要因、身体的及び／または医学的状態と組み合わせて、本明細書に記載の標的バイオマーカーシグネチャーについての少なくとも１つの基準閾値レベル（例えば、基準カットオフ）を基準とするコンピューターアルゴリズム媒介分析により決定することができる。
近接：「近接」という用語は、本明細書で使用される場合、検出プローブ間の相互作用（例えば、それぞれのオリゴヌクレオチドドメインを介して）がおそらく起こると予測されるほど十分に近い２つの検出プローブ（例えば、一対における２つの検出プローブ）間の距離を指す。例えば、一部の実施形態では、規定の条件下で（例えば、検出プローブが細胞外小胞においてそれぞれの標的に結合している場合に）相互に十分に近接している場合に、ある期間にわたって２つの検出プローブが相互に相互作用する確率（例えば、それぞれのオリゴヌクレオチドドメインを介して）は、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上を含めて、少なくとも５０％またはそれ以上である。一部の実施形態では、相互に十分に近接している場合の２つの検出プローブ間の距離は、およそ０．１～１０００ｎｍ、または０．５～５００ｎｍ、または１～２５０ｎｍの範囲であり得る。一部の実施形態では、相互に十分に近接している場合の２つの検出プローブ間の距離は、およそ０．１～１０ｎｍまたはおよそ０．５～５ｎｍであり得る。一部の実施形態では、相互に十分に近接している場合の２つの検出プローブ間の距離は、例えば、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、５ｎｍ未満、１ｎｍ未満、またはそれ以下を含めて、１００ｎｍ未満またはそれ以下であり得る。一部の実施形態では、相互に十分に近接している場合の２つの検出プローブ間の距離は、およそ４０～１０００ｎｍまたは４０ｎｍ～５００ｎｍの範囲であり得る。
比較可能な：本明細書で使用される場合、「比較可能な」という用語は、相互に同一でなくてもよいが、それらの間の比較を可能にするために十分に類似していて、当業者が、観察される相違または類似性に基づき結論を合理的に導き出せると認めるであろう２つまたはそれ以上の作用因子、実体、状況、条件のセットなどを指す。一部の実施形態では、条件、状況、個体、または集団の比較可能なセットは、複数の実質的に同一な特徴及び様々な特徴のうちの１つまたは小数により特徴づけられる。当業者は、文脈において、任意の所与の状況で２つまたはそれ以上のそのような作用因子、実体、状況、条件のセットなどが比較可能と判断されるためには、どの程度の同一性が必要とされるかを理解するであろう。例えば、当業者は、状況、個体、または集団の種々のセットの下で得られた結果、またはそれを用いて観察された現象の相違が、変化させた特徴における変化に起因するか、またはそれを示すとの合理的な結論を保証するために十分な数及び種類の実質的に同一の特徴により特徴づけられた場合に、状況、個体、または集団のセットは相互に比較可能であることが分かるであろう。
相補的：本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、塩基対合規則により関連付けられるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに対する言及において使用される。例えば、配列「Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｔ」は、配列「Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ａ」に相補的である。相補性は、部分的または全体であり得る。したがって、任意の程度の部分的相補性が、「相補的」という用語の範囲内に含まれることが意図されているが、ただし、その部分的相補性がオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを許容することを条件とする。１つまたは複数の核酸塩基が塩基対合規則に従ってマッチしない場合が、部分的相補性である。いずれもすべての核酸塩基が塩基対合規則下で他方の塩基とマッチする場合が、核酸間の全体または完全相補性である。
検出すること：「検出すること」という用語は、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーを発現する細胞外小胞またはそのような細胞外小胞を示す測定の任意の形態の存在または非存在を決定する適切な手段を含むように本明細書において広く使用される。したがって、「検出すること」は、任意の方法で標的バイオマーカーシグネチャーの部分に対応する目的の実体（例えば、表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、または小胞内ＲＮＡバイオマーカー）の存在または非存在、レベル、量、及び／または位置を決定すること、測定すること、評価すること、またはアッセイすることを含み得る。一部の実施形態では、「検出すること」は、目的の実体（例えば、表面タンパク質バイオマーカー及び／または小胞内タンパク質バイオマーカーを示すライゲートされたテンプレート、または小胞内ｍＲＮＡを示すＰＣＲ増幅産物）を示す測定の形態を決定すること、測定すること、評価すること、または定量化することを含み得る。半定量的を含めて、定量的及び定性的決定、測定または評価が含まれる。例えば、目的の実体（例えば、表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、または小胞内ＲＮＡバイオマーカー）またはそれを示す測定の形態が対照基準、または絶対と比べて検出されている場合、そのような決定、測定または評価は相対的であり得る。したがって、目的の実体（例えば、表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、または小胞内ＲＮＡバイオマーカー）またはそれを示す測定の形態を定量化する文脈において使用される場合、「定量化すること」という用語は、絶対的または相対的定量化を指し得る。絶対的定量化は、目的の実体の検出されたレベル（例えば、表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、または小胞内ＲＮＡバイオマーカー）またはそれを示す測定の形態を、既知の対照標準に相関させること（例えば、標準曲線の生成を介して）により達成することができる。別法では、相対的定量化は、２つまたはそれ以上の異なる目的の実体（例えば、異なる表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、または小胞内ＲＮＡバイオマーカー）の間で検出されたレベルまたは量を比較して、目的の２つまたはそれ以上の異なる実体のそれぞれの、すなわち、相互に対する相対的定量化を得ることにより達成することができる。
検出ラベル：「検出ラベル」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能な任意の元素、分子、官能基、化合物、断片または部分を指す。一部の実施形態では、検出ラベルを、単独で提供または利用する。一部の実施形態では、検出ラベルを、別の作用因子と会合させて（例えば、結合させて）提供及び／または利用する。検出ラベルの例には、これに限定されないが：様々なリガンド、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、６４Ｃｕ、１８７Ｒｅ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、８９Ｚｒなど）、蛍光色素、化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）、生物発光剤、スペクトル解析可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金など）ナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素、比色ラベル（例えば、色素、コロイド金など）、ビオチン、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ハプテン、及び抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質が含まれる。
検出プローブ：「検出プローブ」という用語は典型的には、特異的標的の検出及び／または定量化を指向するプローブを指す。一部の実施形態では、検出プローブは、特異的標的のレベルを表す指標を提供する定量化プローブである。本開示では、検出プローブは、オリゴヌクレオチドドメインに直接的または間接的にカップリングしている標的結合実体を含む組成物を指し、その際、上記標的結合実体は、それぞれの標的（例えば、分子標的）に特異的に結合し、かつオリゴヌクレオチドドメインの少なくとも一部分が、別個の標的のための別の検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインの一部分とのハイブリダイゼーションを可能にするように設計されている。多くの実施形態で、本開示により使用するために適したオリゴヌクレオチドドメインは、二本鎖部分と、少なくとも１つの一本鎖オーバーハングとを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、二本鎖部分と、二本鎖部分の各末端の一本鎖オーバーハングとを含み得る。
二本鎖：本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドドメインの文脈における「二本鎖」という用語は、当業者により、一対のオリゴヌクレオチドが、水素結合したらせん配置で、典型的には例えば、ＤＮＡなどの核酸と関連して存在していることと理解される。二本鎖オリゴヌクレオチドの１００％相補的形態に加えて、「二本鎖」という用語は、本明細書で使用される場合、ミスマッチ（例えば、部分的相補性）及び／またはバルジ、ループ、またはヘアピンとしての構造的特徴を含む形態を指すことも意図されている。
二本鎖複合体：本明細書で使用される場合、「二本鎖複合体」という用語は典型的には、検出プローブの相補的一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションを介して線状配置で相互に連結またはカップリングしている、標的（同じ標的でも、または別個の標的でもよい）をそれぞれ指向する少なくとも２つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上を含む）の検出プローブ（例えば、本明細書において提供及び／または利用されるとおりのもの）を含む複合体を指す。一部の実施形態では、そのような二本鎖複合体は、細胞外小胞を含んでよく、その際、検出プローブのそれぞれの標的結合部分は、細胞外小胞に同時に結合している。
エピトープ：本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン（例えば、抗体または受容体）結合構成成分またはアプタマーにより特異的に認識される任意の部分を含む。一部の実施形態では、エピトープは、抗原上の複数の化学原子または基からなる。一部の実施形態では、その抗原が関連三次元構造を採用する場合、そのような化学原子または基は表面暴露される。一部の実施形態では、そのような化学原子または基は、上記抗原がそのような構造を採用する場合に、空間的に物理的に相互に近い。一部の実施形態では、上記抗原が代替の構造を採用している（例えば、線状化されている）場合、基である少なくとも一部のそのような化学原子は、物理的に相互に分離されている。
細胞外小胞：本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」という用語は典型的には、例えば、細胞により分泌される、細胞の外側の小胞を指す。分泌される小胞の例には、これに限定されないが、エクソソーム、微小小胞体、マイクロ粒子、エクトソーム、オンコソーム、及びアポトーシス小体が含まれる。理論に束縛されることは望まないが、エクソソームは、多胞性エンドソーム（ＭＶＥ）の境界膜の内向き出芽（ｉｎｗａｒｄ ｂｕｄｄｉｎｇ）により形成され得る細胞内由来のナノメートルサイズの小胞体（例えば、４０ｎｍ～１２０ｎｍ）である一方で、微小小胞体は典型的には細胞表面から出芽し、かつそれらのサイズは、５０ｎｍ～１０００ｎｍで変動し得る。一部の実施形態では、細胞外小胞は、エクソソーム及び／または微小小胞体であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、細胞外小胞を含む試料は、アポトーシス小体を実質的に非含有である。一部の実施形態では、細胞外小胞を含む試料は、１つまたは複数の組織（例えば、癌性組織及び／または非癌性または健康な組織）から放出されるか、または由来する細胞外小胞を含み得る。一部の実施形態では、試料中の細胞外小胞は、卵巣癌腫瘍から放出され得るか、または由来し得て；一部の実施形態では、試料中の細胞外小胞は、非卵巣癌の腫瘍から放出されるか、または由来する。一部の実施形態では、細胞外小胞は、健康な組織から放出されるか、または由来する。一部の実施形態では、細胞外小胞は、良性婦人科腫瘍から放出されるか、または由来する。一部の実施形態では、細胞外小胞は、卵巣癌と関連する症状（例えば、非特異的症状）を有する対象の組織から放出されるか、または由来する。
細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド：本明細書で使用される場合、そのような用語は、細胞外小胞の膜に存在するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、そのようなポリペプチドは、腫瘍特異的であり得る。一部の実施形態では、そのようなポリペプチドは、組織特異的（例えば、卵巣組織特異的）であり得る。一部の実施形態では、そのようなポリペプチドは、非特異的であり得、例えば、これは、１つまたは複数の非標的腫瘍に、及び／または１つまたは複数の非標的組織に存在する。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズすること」、「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイゼーション」、「アニールすること」、または「アニールする」という用語は、ハイブリダイズ複合体を形成する塩基対合を介して核酸の１本の鎖が相補鎖と一緒になる任意のプロセスを使用して相補的核酸の対合に言及する際に互換的に使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（例えば、核酸間の会合の強度）は、例えば、核酸間の相補性の程度、関係する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔ）、及び核酸内のＧ：Ｃ比を含む様々な因子により影響を受ける。
小胞内タンパク質バイオマーカー：本明細書で使用される場合、「小胞内タンパク質バイオマーカー」という用語は、生物学的実体（例えば、細胞または細胞外小胞）内に存在するポリペプチドの状態（例えば、存在、レベル、及び／または活性）を示すマーカーを指す。多くの実施形態で、小胞内タンパク質バイオマーカーは、細胞外小胞と会合しているか、またはその中に存在する。
小胞内ＲＮＡバイオマーカー：本明細書で使用される場合、「小胞内ＲＮＡバイオマーカー」という用語は、生物学的実体（例えば、細胞または細胞外小胞）内に存在するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の状態（例えば、存在及び／またはレベル）を示すマーカーを指す。多くの実施形態で、小胞内ＲＮＡバイオマーカーは、細胞外小胞と会合しているか、またはその中に存在する。
リガーゼ：本明細書で使用される場合、「リガーゼ」または「核酸リガーゼ」という用語は、核酸をライゲートする際に使用するための酵素を指す。一部の実施形態では、リガーゼは、ポリヌクレオチドの３’末端をポリヌクレオチドの５’末端にライゲートする際に使用するための酵素である。一部の実施形態では、リガーゼは、付着末端ライゲーションを行うために使用するための酵素である。一部の実施形態では、リガーゼは、平滑末端ライゲーションを行うために使用するための酵素である。一部の実施形態では、リガーゼは、ＤＮＡリガーゼであるか、またはそれを含む。
生活歴関連危険因子：本明細書で使用される場合、「生活歴危険因子」という用語は、生活においてそのような活動、経験、病歴、及び／または曝露をそれらの個体の生活において有さない個体と比べて、例えば、ある状態、例えば、卵巣癌についての個体のリスクを直接的または間接的に増大させ得る生活における個体の活動、経験、病歴、及び／または曝露を指す。一部の実施形態では、生活歴関連危険因子の非限定的例には、喫煙、アルコール、薬物、発癌因子、食事、肥満、糖尿病、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、子宮内膜症、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、未経産／不妊、経口避妊薬使用の履歴がないこと／短期履歴、身体活動、日光曝露、放射線曝露、会陰部タルク使用、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）、感染因子、例えば、ウイルスへの暴露、及び／または職業上の危険が含まれる（Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．、２０１７；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。当業者は、がん（例えば、卵巣癌）罹患性に寄与する生活歴関連危険因子の上のリストは、網羅的ではなく、常に進化していることが分かる。
ライゲーション：本明細書で使用される場合、「ライゲートする」、「ライゲートすること」または「ライゲーション」という用語は、２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを結合するために当技術分野で公知の方法または組成物を指す。ライゲーションは、付着末端ライゲーションまたは平滑末端ライゲーションであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、提供される技術に含まれるライゲーションは、付着末端ライゲーションであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、ライゲーションは、ポリヌクレオチドの３’末端をポリヌクレオチドの５’末端に結合させることを指す。一部の実施形態では、ライゲーションをリガーゼの使用により促進する。
非がん対象：本明細書で使用される場合、「非がん対象」という用語は一般に、非良性卵巣癌を有さない女性対象を指す。例えば、一部の実施形態では、非がん対象は、健康な女性対象である（例えば、健康な成人女性対象）。一部の実施形態では、非がん対象は、５５歳未満の健康な女性対象（例えば、健康な成人女性対象）である。一部の実施形態では、非がん対象は、５５歳またはそれ以上の年齢の健康な女性対象（例えば、健康な成人女性対象）である。一部の実施形態では、非がん対象は、非卵巣関連の健康上の疾患、障害、または状態を有する女性対象（例えば、成人女性対象）である。一部の実施形態では、非がん対象は、良性卵巣腫瘍（例えば、卵管内及び／または卵巣上で観察される良性腫瘤）を有する女性対象（例えば、成人女性対象）である。
核酸／オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、少なくとも１０のヌクレオチドまたはそれ以上からなるポリマーを指す。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖核酸であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、二本鎖核酸であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖及び二本鎖部分の両方を含む。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のホスホジエステル結合を含む骨格を含む。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル及び非ホスホジエステル結合の両方を含む骨格を含む。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のホスホロチオアートまたは５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合及び／または１つまたは複数のペプチド結合を、例えば、「ペプチド核酸」においてのように含む骨格を含み得る。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数、またはすべての天然残基（例えば、アデニン、シトシン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、グアニン、チミン、ウラシル）を含む。一部の実施形態では、核酸は、１つもしくは複数、またはすべての非天然残基を含む。一部の実施形態では、非天然残基は、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、６－Ｏ－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレートされた塩基、及びそれらの組合せ）を含む。一部の実施形態では、非天然残基は、天然残基においてのものと比較して、１つまたは複数の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはポリペプチドなどの機能性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のイントロンを含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸を、天然源からの単離、酵素的合成（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの、例えば、相補的テンプレートに基づく重合、組換え細胞もしくはシステムにおける再現、または化学合成により調製することができる。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、または２０，０００またはそれ以上の残基またはヌクレオチド長である。
ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、その当技術分野において承認されている意味を指す。いくつかのヌクレオチドが、例えば、オリゴヌクレオチドのサイズの表示として使用される場合、ある特定数のヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドの一本鎖上のヌクレオチドの数を指す。
患者：本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患または障害または状態に罹患しているか、そのリスクを有する任意の生体を指す。典型的な患者には、動物（例えば、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒト）が含まれる。一部の実施形態では、患者はヒトである。一部の実施形態では、患者は、１つまたは複数の疾患または障害または状態に罹患しているか、または易罹患性である。一部の実施形態では、患者は、疾患または障害または状態の１つまたは複数の症状を表示する。一部の実施形態では、患者は、１つまたは複数の疾患または障害または状態を有すると診断されている。一部の実施形態では、提供される技術に適した疾患または障害または状態は、がん、または１つもしくは複数の腫瘍の存在であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、患者は、疾患、障害、または状態を診断する、及び／または処置するためのある特定の治療を投与されているか、または投与されたことがある。
ポリペプチド：「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的には、少なくとも３つのアミノ酸またはそれ以上からなるポリマーの、その当技術分野において承認されている意味を有する。当業者は、「ポリペプチド」という用語は、本明細書において列挙されている完全な配列を有するポリペプチドだけが包含されるのではなく、そのような完全なポリペプチドの機能的に活性な、または特徴的な断片、部分またはドメイン（例えば、少なくとも１つの活性を保持している断片、部分、またはドメイン）を表すポリペプチドも包含されるほど十分に一般的であると意図されていることが分かるであろう。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはその両方を含んでよく、及び／または当技術分野で公知の様々なアミノ酸修飾または類似体のいずれも含んでよい。有用な修飾には、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが含まれる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組合せを含み得る（例えば、ペプチド模倣物質であり得るか、またはそれを含み得る）。
予防する、または予防：本明細書で使用される場合、「予防する」」または「予防」は、疾患、障害、及び／または状態の発生と関連して使用される場合、その疾患、障害及び／または状態が発生するリスクを低下させること、及び／または疾患、障害または状態の１つまたは複数の特徴または症状の開始を遅延させることを指す。予防は、疾患、障害または状態の開始が事前に規定された期間にわたって遅延されている場合に、完全と判断され得る。
プライマー：本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に（例えば、ヌクレオチド及び誘導剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在下に、かつ適切な温度及びｐＨに）置いた場合に、合成開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは好ましくは、増幅の最大効率のために一本鎖である。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成をプライムするために十分に長くあるべきである。プライマーの正確な長さは、多くの因子、例えば、温度に依存し得る。
基準：本明細書で使用される場合、「基準」は、それに対して比較が行われる標準または対照を記述するものである。例えば、一部の実施形態では、目的の作用因子、動物、個体、集団、試料、配列または値を、基準または対照作用因子、動物、個体、集団、試料、配列または値と比較する。一部の実施形態では、基準または対照を、目的の試験または決定と実質的に同時に試験及び／または決定する。一部の実施形態では、基準または対照は、任意選択で有形媒体中で実施される履歴基準または対照である。一部の実施形態では、標的の基準レベルの文脈における基準または対照は、正常で健康な対象または正常で健康な対象の集団における標的のレベルを指す。一部の実施形態では、標的の基準レベルの文脈における基準または対照は、処置前の対象における標的のレベルを指す。当業者には理解されるであろうとおり、典型的には、基準または対照は、比較可能な条件または状況下で、評価中のものに対して決定または特徴付けられる。当業者は、特定の可能な基準または対照に対して信頼性を正当化し、及び／またはそれに対して比較するために十分な類似性が存在する場合が分かるであろう。
リスク：文脈から理解されるであろうとおり、疾患、障害、及び／または状態の「リスク」は、特定の個体が疾患、障害、及び／または状態を発生させる可能性を指す。一部の実施形態では、リスクは、パーセンテージとして表される。一部の実施形態では、リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０から最高１００％までである。一部の実施形態では、リスクは、基準試料または基準試料の群と関連するリスクに対するリスクとして表される。一部の実施形態では、基準試料または基準試料の群は、疾患、障害、状態及び／または事象の既知のリスクを有する。一部の実施形態では、基準試料または基準試料の群は、特定の個体に比較可能な個体からのものである。一部の実施形態では、相対リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
試料：本明細書で使用される場合、「試料」という用語は典型的には、目的の供給源から得られたか、またはそれに由来する物質の一定部分を指す。一部の実施形態では、試料は、目的の生物源（例えば、組織または生体または細胞培養物）から得られるか、またはそれに由来する。一部の実施形態では、目的の供給源は、細胞または生体、例えば、動物またはヒトであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、目的の供給源は、生物学的組織または流体であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、生物学的組織または流体は、羊水、房水、腹水、胆汁、骨髄、血液、母乳、脳脊髄液、耳垢、乳糜、チャイム（ｃｈｉｍｅ）、射出精液、内リンパ、浸出液、糞便、胃酸、胃液、リンパ、粘液、囲心腔液、外リンパ、腹腔液、胸膜液、膿、カタル性分泌物、唾液、皮脂、精液、血清、恥垢、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、硝子体液、嘔吐物、及び／またはそれらの組合せまたは構成成分（複数可）であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、生体液は、細胞内流体、細胞外液、小胞内流体（血漿）、間質液、リンパ液、及び／または細胞透過液であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、生物学的組織または試料は、例えば、吸引液、生検（例えば、微細針または組織生検）、スワブ（例えば、口腔、経鼻、皮膚、または膣スワブ）、擦過、外科手術、洗浄または潅注（例えば、気管支肺胞、管、鼻、眼、口腔、子宮、膣、または他の洗浄または潅注）により得ることができる。一部の実施形態では、生物学的試料は、リキッドバイオプシーであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、生物学的試料は、個体から得られた細胞であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、試料は、任意の適切な手段により目的の供給源から直接的に得られた「一次試料」である。一部の実施形態では、文脈から明白であろうとおり、「試料」という用語は、一次試料を（例えば、その１つまたは複数の構成成分を除去することにより、及び／またはそれに１つまたは複数の薬剤を添加することにより）処理することにより得られる調製物を指す。例えば、試料は、目的の生物学的実体を他の非標的実体から分離するために半透膜または抗体ベースの方法などの親和性ベースの方法を使用することにより処理された調製物である。そのような「処理済み試料」は、例えば、一部の実施形態では、細胞外小胞を含み得る一方で、一部の実施形態では、試料から抽出された核酸及び／またはタンパク質などを含み得る。一部の実施形態では、処理済み試料を、一次試料を１つまたは複数の技術、例えば、核酸の増幅または逆転写、ある特定の構成成分などの単離及び／または精製に掛けることにより得ることができる。
選択的または特異的：「選択的」または「特異的」という用語は、活性を有する作用因子に関して本明細書で使用される場合、上記作用因子が潜在的な標的実体、状態、または細胞を識別することを意味すると当業者には理解される。例えば、一部の実施形態では、作用因子が１つまたは複数の競合する代替の標的の存在下で、その標的と優先的に結合するならば、その作用因子は、その標的に「特異的に」結合すると記載される。多くの実施形態で、特異的相互作用は、標的実体（例えば、エピトープ、クレフト、結合部位）の特定の構造的特徴の存在に依存する。特異性は絶対的である必要はないことは理解されるべきである。一部の実施形態では、特異性を、１つまたは複数の他の潜在的な標的実体（例えば、競合因子）についての標的結合部分の特異性と比べて評価することができる。一部の実施形態では、特異性を、基準特異的結合部分の特異性と比べて評価する。一部の実施形態では、特異性を、基準非特異的結合部分の特異性と比べて評価する。一部の実施形態では、標的結合部分は、その標的実体に結合する条件下で、競合代替標的に検出可能に結合しない。一部の実施形態では、標的結合部分は、競合代替標的（複数可）と比較して高いオンレート、低いオフレート、上昇した親和性、減少した解離、及び／または上昇した安定性で、その標的実体に結合する。
小分子：本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、低分子量有機及び／または無機化合物を意味する。一般に、「小分子」は、サイズが約５キロダルトン（ｋＤ）未満である分子である。一部の実施形態では、小分子は、約４ｋＤ、３ｋＤ、約２ｋＤ、または約１ｋＤ未満である。一部の実施形態では、小分子は、約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、または約１００Ｄ未満である。一部の実施形態では、小分子は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。一部の実施形態では、小分子は、ポリマーではない。一部の実施形態では、小分子は、ポリマー部分を含まない。一部の実施形態では、小分子は、タンパク質またはポリペプチドではない（例えば、オリゴペプチドまたはペプチドではない）。一部の実施形態では、小分子は、ポリヌクレオチドではない（例えば、オリゴヌクレオチドではない）。一部の実施形態では、小分子は、多糖ではない。一部の実施形態では、小分子は、多糖を含まない（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質などではない）。一部の実施形態では、小分子は、脂質ではない。一部の実施形態では、小分子は、生物学的に活性である。一部の実施形態では、適切な小分子は、化合物の大きなライブラリのスクリーニング（Ｂｅｃｋ－ Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ ＆ Ｗｅｂｅｒ（２００１） Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｓｕｓｓｅｘ）；核磁気共鳴による構造活性相関（Ｓｈｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６） ”Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳＡＲ ｂｙ ＮＭＲ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１５３１－１５３４）；コードされた自己集合化学ライブラリ（Ｍｅｌｋｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００４） ”Ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５６８－５７４）；ＤＮＡ－テンプレート化学（Ｇａｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４） ”ＤＮＡ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１６０１－１６０５）；動的コンビナトリアル化学（Ｒａｍｓｔｒｏｍ ＆ Ｌｅｈｎ（２００２） ”Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１：２６－３６）；テザリング（Ａｒｋｉｎ ＆ Ｗｅｌｌｓ（２００４） ”Ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｄｒｅａｍ．” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３：３０１－３１７）；及びスピードスクリーニング（Ｍｕｃｋｅｎｓｃｈｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００４） ”ＳｐｅｅｄＳｃｒｅｅｎ：ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ－ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｏｒｐｈａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄｓ．” Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２４：２４１－２４９）などの方法により同定することができる。一部の実施形態では、小分子は、標的についてナノモル範囲の解離定数を有し得る。
特異的結合：本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、結合が起こり得る環境において、可能な結合パートナーを識別する能力を指す。他の潜在的な標的が存在する場合に、ある特定の標的と相互作用する標的結合部分は、それが相互作用する標的に「特異的に結合する」と記載され得る。一部の実施形態では、特異的結合を、標的結合部分とそのパートナーとの間の会合を検出すること、またはその程度を決定することにより評価し；一部の実施形態では、特異的結合を、標的結合部分－パートナーの複合体の解離を検出すること、またはその程度を決定することにより評価し；一部の実施形態では、特異的結合を、そのパートナーと及び別の実体との間の代替の相互作用と競合する標的結合部分の能力を検出すること、またはそれを決定することにより評価する。一部の実施形態では、特異的結合を、そのような検出または決定を一連の濃度にわたって実行することにより評価する。
がんのステージ：本明細書で使用される場合、「がんのステージ」という用語は、がん（例えば、卵巣癌）の進行レベルの定性または定量的評価を指す。一部の実施形態では、がんのステージを決定するために使用される基準には、これに限定されないが、がんが身体に位置するかどうか、腫瘍サイズ、がんがリンパ節に展開しているかどうか、がんが１つまたは複数の異なる身体部位に拡散しているかどうかなどのうちの１つまたは複数が含まれ得る。一部の実施形態では、がんを、ＡＪＣＣ病期分類システムを使用して段階付けることができる。ＡＪＣＣ病期分類システムは、がん患者における疾患進行の程度を記載するためにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒにより開発された分類システムであり、これは一部では、ＴＮＭスコアリングシステム：腫瘍サイズ、罹患しているリンパ節、転移を利用する。一部の実施形態では、がんを、ＴＮＭスコアリングシステムを一部では含む分類システムを使用して段階付けることができ、これによると、Ｔは、通常原発腫瘍と呼ばれる主要な腫瘍のサイズ及び規模を指し；Ｎは、がんを有する近接リンパ節の数を指し；かつＭは、がんが転移しているかどうかを指す。一部の実施形態では、がんは、ステージ０（異常な細胞が存在するが、近接組織に拡散しておらず、上皮内癌、またはＣＩＳとも呼ばれ；ＣＩＳはがんではないが、がんになり得る）、ステージＩ～ＩＩＩ（がんが存在し；数字が大きいほど、腫瘍は大きく、かつ近接組織に広く展開している）、またはステージＩＶ（がんが身体の遠位部位に拡散している）と称され得る。一部の実施形態では、がんを、ｉｎ ｓｉｔｕ（異常な細胞は存在するが、近接組織に展開していない）；局在化（がんが、出発した場所に限定されており、拡散している徴候がない）；局所的（がんが近接リンパ節、組織、または器官に拡散している）：遠位（がんが身体の遠位部分に拡散している）；及び不明（ステージを理解するための情報が十分にない）からなる群から選択されるステージに指定することができる。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療目的でそこから試料を得る生体を指す。典型的な対象には、動物（例えば、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、家庭内ペットなど）及びヒトが含まれる。一部の実施形態では、対象は、ヒト女性対象、例えば、ヒト成人女性対象である。一部の実施形態では、対象は、卵巣癌に罹患している。一部の実施形態では、対象は、卵巣癌に易罹患性である。一部の実施形態では、対象は、卵巣癌の１つまたは複数の症状または特徴を提示する。一部の実施形態では、対象は、卵巣癌の１つまたは複数の非特異的症状を提示する。一部の実施形態では、対象は、卵巣癌のいずれの症候または特徴も提示しない。一部の実施形態では、対象は、卵巣癌に対する易罹患性に特徴的な１つもしくは複数の特徴または卵巣癌のリスクを有するものである。一部の実施形態では、対象は、患者である。一部の実施形態では、対象は、診断及び／または治療が投与される、及び／または投与されたことがある個体である。一部の実施形態では、対象は、付属器腫瘤を有すると決定された女性対象（例えば、成人女性対象）である。一部の実施形態では、対象は、無症候性対象である。そのような症候性対象は、平均的集団リスクを有するか、または遺伝的リスクを有する女性対象（例えば、成人女性対象）であり得る。例えば、そのような無症候性対象は、がんの家族歴を有する、がんについて以前に処置されたことがある、がん処置後にがんの再発についてリスクを有する、がん処置後に寛解している、及び／または少なくとも１つのがんバイオマーカーの存在について以前に、または周期的にスクリーニングされている対象であり得る。別法では、一部の実施形態では、無症候性対象は、がんについて以前にスクリーニングされたことがない、がんについて診断されたことがない、及び／またはがん治療を以前に受けたことがない対象であり得る。一部の実施形態では、提供される技術に適した対象は、１つまたは複数の特徴、例えば、年齢、人種、遺伝的履歴、病歴、個人的履歴（例えば、喫煙、アルコール、薬物、発がん因子、食事、肥満、身体活動、日光曝露、放射線曝露、感染因子、例えば、ウイルスへの暴露、及び／または職業上の危険）に基づき選択された個体である。
～に罹患している：疾患、障害、及び／または状態「に罹患している」個体は、疾患、障害、及び／または状態の１つまたは複数の症状を有すると診断されている、及び／または提示する。
表面ポリペプチドまたは表面タンパク質：本明細書において互換的に使用されるとおり、「表面ポリペプチド」、「表面タンパク質」、及び「膜結合ポリペプチド」という用語は、生物学的実体（例えば、細胞、細胞外小胞など）の膜の表面中に、及び／またはその上に存在する１つまたは複数のドメインまたは領域を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。一部の実施形態では、表面タンパク質は、生物学的実体（例えば、細胞、細胞外小胞など）の形質膜を貫通する、及び／またはそれと会合している１つまたは複数のドメインまたは領域を含み得る。一部の実施形態では、表面タンパク質は、生物学的実体（例えば、細胞、細胞外小胞など）の形質膜を貫通する、及び／またはそれと会合していて、また、細胞内及び／または小胞内空間に突出している１つまたは複数のドメインまたは領域を含み得る。一部の実施形態では、表面タンパク質は、例えば、１つまたは複数の非ペプチド結合を介して生物学的実体（例えば、細胞、細胞外小胞など）の形質膜と会合している１つまたは複数のドメインまたは領域を含み得る。一部の実施形態では、表面タンパク質は、生物学的実体（例えば、細胞、細胞外小胞など）の形質膜の両側に係留されている１つまたは複数のドメインまたは領域を含み得る。一部の実施形態では、表面タンパク質は、細胞外小胞と会合しているか、またはその中に存在する。一部の実施形態では、表面ポリペプチドまたは膜結合ポリペプチドは、卵巣癌関連細胞外小胞（例えば、卵巣癌に罹患しているか、またはそれらに易罹患性である対象の血液または血液由来試料から得られたか、または由来する細胞外小胞）と会合しているか、またはその中に存在し得る。当業者には理解されるであろうとおり、細胞外小胞上／その中の表面ポリペプチドまたは表面タンパク質の少なくとも一部分の存在の検出は、対象からの生物学的試料（例えば、血液または血液由来試料）からの卵巣癌関連細胞外小胞の分離及び／または単離を容易にし得る。一部の実施形態では、表面ポリペプチドまたは表面タンパク質の存在の検出は、そのような表面ポリペプチドまたは表面タンパク質の小胞内部分（例えば、小胞内エピトープ）の検出であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、表面ポリペプチドまたは表面タンパク質の存在の検出は、そのような表面ポリペプチドまたは表面タンパク質の膜貫通部分の検出であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、表面ポリペプチドまたは表面タンパク質の存在の検出は、そのような表面ポリペプチドまたは表面タンパク質の小胞外部分の検出であり得るか、またはそれを含み得る。
表面タンパク質バイオマーカー：本明細書で使用される場合、「表面タンパク質バイオマーカー」という用語は、生物学的実体（例えば、細胞または細胞外小胞）の表面タンパク質（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の状態（例えば、存在、レベル、及び／または活性）を示すマーカーを指す。一部の実施形態では、表面タンパク質は、生物学的実体（例えば、細胞または細胞外小胞）の膜の表面中に、またはその上に位置する１つまたは複数のドメインまたは領域を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。一部の実施形態では、表面タンパク質バイオマーカーは、上記膜の内側（小胞内）または外側（小胞外）の上に存在するエピトープであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、表面タンパク質バイオマーカーは、細胞外小胞と会合しているか、またはその中に存在する。
～に易罹患性な（である）：疾患、障害、及び／または状態「に易罹患性である」個体は、疾患、障害、及び／または状態を発生させるリスクが、一般人が発生させるよりも高い個体である。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に易罹患性である個体は、疾患、障害、及び／または状態を有すると診断されたことがなくてもよい。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に易罹患性である個体は、疾患、障害、及び／または状態の症状を示し得る。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に易罹患性である個体は、疾患、障害、及び／または状態の症状を示さないことがある。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に易罹患性である個体は、疾患、障害、及び／または状態を発生させるであろう。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に易罹患性である個体は、疾患、障害、及び／または状態を発生させないであろう。
標的結合部分：一般に、「標的結合部分」及び「結合部分」という用語は、目的の標的（例えば、目的の分子標的、例えば、バイオマーカーまたはエピトープ）に結合する任意の実体または部分を指すために本明細書で互換的に使用される。多くの実施形態で、目的の標的結合部分は、その標的（例えば、標的バイオマーカー）と特異的に結合して、特定の相互作用の状況において、その標的を他の潜在的な結合パートナーから識別するものである。一般に、標的結合部分は、任意の化学群（例えば、ポリマー、非ポリマー、小分子、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸など）の実体または部分であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、標的結合部分は、単一の化学的実体である。一部の実施形態では、標的結合部分は、関連条件下で非共有結合相互作用により相互に会合している２つまたはそれ以上の別個の化学的実体の複合体である。例えば、当業者は、一部の実施形態では、標的結合部分は、一般的結合部分のパートナーに結合する「一般的」結合部分（例えば、ビオチン／アビジン／ストレプトアビジン及び／またはクラス特異的抗体の部分）及び「特異的」結合部分（例えば、特定の分子標的との抗体またはアプタマー）を含み得ることが分かるであろう。一部の実施形態では、そのようなアプローチは、種々の特異的結合部分と一般的結合部分パートナーとの結合を介して、複数の標的結合部分のモジュラーアセンブリを可能にし得る。
標的バイオマーカーシグネチャー：「標的バイオマーカーシグネチャー」という用語は、本明細書で使用される場合、（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、またはそれ以上を含む、例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）のバイオマーカーの組合せを指し、この組み合わせは、特定の生物学的事象または目的の状態と相関していて、当業者は、これがその事象または状態の「シグネチャー」であると適切に判断され得ることが分かるであろう。いくつかの例を示すにすぎないが、一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、特定の疾患または病態と、及び／または特定の疾患、障害または状態が発生し得る、起こり得る、または再発し得る可能性と相関し得る。一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、特定の疾患または治療成績、またはその可能性と相関し得る。一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、特異的がん及び／またはそのステージと相関し得る。一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、卵巣癌及び／またはそのステージ及び／またはサブタイプと相関し得る。一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、一緒に卵巣癌またはそのサブタイプ及び／または疾患ステージについて特異的である（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、またはそれ以上を含む、例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）のバイオマーカーの組合せを含むが、そのような組合せの中の１つまたは複数のバイオマーカーは、卵巣癌に特異的でない標的（例えば、表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、及び／または小胞内ＲＮＡ）を指向してもよい。例えば、一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、卵巣癌またはそのステージ及び／またはサブタイプ（すなわち、卵巣癌特異的標的）に特異的な少なくとも１つのバイオマーカーを含み得、かつ必ずしも、またはまったく卵巣癌に特異的ではないバイオマーカー（例えば、一部または全部の生物学的実体、例えば、細胞、細胞外小胞などにおいても見い出されるもので、がん性ではなく、関連がんのものではなく、及び／または目的の特定のステージ及び／またはサブタイプのものではない）をさらに含み得る。すなわち、当業者であれば本明細書を読むことで分かるであろうとおり、標的バイオマーカーシグネチャーにおいて利用されるバイオマーカーの組合せが一緒に、目的の関連標的生物学的実体（例えば、目的の卵巣癌細胞または卵巣癌細胞により分泌される細胞外小胞）に特異的である（すなわち、検出のための関連標的生物学的実体（例えば、目的の卵巣癌細胞または卵巣癌細胞により分泌される細胞外小胞）を、検出の目的ではない他の生物学的実体から十分に識別する）複数のバイオマーカーであるか、またはそれを含む限り、そのようなバイオマーカーの組合せは、本開示のある特定の実施形態によると有用な標的バイオマーカーシグネチャーである。
治療薬：本明細書において互換的に使用されるとおり、「治療薬」または「治療」という語句は、対象または患者に投与された場合に、治療効果を有する、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘導する作用因子または介入を指す。一部の実施形態では、治療薬または治療は、疾患、障害、及び／または状態の１つまたは複数の症状または特徴を緩和する、寛解する、軽減する、阻害する、予防する、その開始を遅延させる、その重症度を低下させる、及び／またはその発生率を低下させるために使用することができる任意の物質である。一部の実施形態では、治療薬または治療は、疾患、障害、及び／または状態の１つまたは複数の症状または特徴を緩和する、軽減する、阻害する、提示する、その開始を遅延させる、その重症度を低下させる、及び／またはその発生率を低下させるために実行することができる医学的介入（例えば、外科手術、放射線、光線療法）である。
閾値レベル（例えば、カットオフ）：本明細書で使用される場合、「閾値レベル」という用語は、測定の結果、例えば、アッセイにおいて得られた測定結果についての情報を得る、及び／または分類するための基準として使用されるレベルを指す。例えば、一部の実施形態では、閾値レベル（例えば、カットオフ）は、集団の２つのサブセット（例えば、正常及び／または非卵巣癌 対 卵巣癌）の間の境界線を定義する、アッセイにおいて測定された値を意味する。したがって、閾値レベル以上である値は、集団の一方のサブセットを定義し、かつ閾値レベル未満である値は、集団の他方のサブセットを定義する。閾値レベルは、１つまたは複数の対照試料に基づき、または対照試料の集団全体で決定することができる。閾値レベルは、目的の測定を実施する前に、それと同時に、またはその後に決定することができる。一部の実施形態では、閾値レベルは、ある範囲の値であってよい。
処置する：本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、疾患、障害、及び／または状態の１つまたは複数の症状または特徴を部分的に、または完全に緩和する、寛解する、軽減する、阻害する、予防する、その開始を遅延させる、その重症度を低下させる、及び／またはその発生率を低下させるために使用される任意の方法を指す。処置を、疾患、障害、及び／または状態の徴候を示していない対象に投与することができる。一部の実施形態では、処置を、例えば、疾患、障害、及び／または状態と関連する病態を発生させるリスクを低下させる目的で、疾患、障害、及び／または状態の初期徴候のみを示している対象に投与することができる。一部の実施形態では、処置を、疾患、障害、及び／または状態の後期ステージにある対象に投与することができる。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション）のために、標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術を、製造者仕様書に従って、または当技術分野で一般に達成されるとおり、または本明細書に記載のとおりに実行することができる。上述の技術及び手順を一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、かつ本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的で、より具体的な参照文献に記載されているとおりに実行することができる。例えば、本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
卵巣癌は、２０１８年の米国において、推定１４，０７０例の死亡の原因であった（Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。これらの死亡例の大部分は、診断の遅れに帰すことができ；卵巣癌は、その最早期ステージで発見されれば、９３％の推定５年生存率を有するが、それに対して、その最後期ステージで発見されれば２６％を有する（Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。高異型度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）の検出は、ＨＧＳＯＣが全卵巣癌死亡例の７０％～８０％を占めていることを考慮すると、特に重要である一方で、他のサブタイプは、よりゆっくりと成長し、現行の技術を使用すると、過剰診断されやすい（Ｔｅｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０１７；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。残念なことに、すべてのがんのうちで５番目に多い女性の死因であるにも関わらず（Ｈｏｗｌａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１９；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）、平均的リスクの女性に推奨される卵巣癌スクリーニング検査は存在しない。遺伝的リスクを有し、及び／または卵巣癌の１つまたは複数の症状（例えば、腹腔内体液（腹水）、一般胃腸機能不全、便秘、腸閉塞、悪心、嘔吐、下痢、胃腸逆流、腹囲増大、尿症状、腹部鼓張、腹部及び／または骨盤疼痛、倦怠、及び／または息切れ）を経験しているかもしれない多くの女性は現在、血清ＣＡ－１２５及び／または経腟超音波検査（ＴＶＵＳ）によりスクリーニングされるが、これらの検査は、スクリーニングについて最適以下であり、それというのも、それらは、ステージＩ及びＩＩ疾患について低い感受性（約２０％）及び不十分な特異性を有するためである。例えば、前立腺、肺、結腸直腸及び卵巣癌スクリーニング無作為化試験は、血清ＣＡ－１２５を見出し、ＴＶＵＳは、不必要な外科手術の回数を増加させ、平均的リスクの女性について、死亡率のメリットを提供しない（Ｂｕｙｓ ｅｔ ａｌ．、２０１１；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。この不十分な性能にも関わらず、血清ＣＡ－１２５及びＴＶＵＳは現在、卵巣癌を潜在的に示し得る非特異的骨盤疼痛を有する閉経後女性を選別するための一般的なスクリーニングツールである。
本開示は特に、例えば、卵巣癌を発見及び診断するためのいくつかの従来のアプローチを含む、いくつかの先行技術の問題の原因を同定する。例えば、本開示は、例えば、細胞非含有核酸、血清タンパク質（例えば、ＣＡ－１２５）、及び／または細胞外小胞のバルク分析に基づく多くの従来の診断アッセイは時間がかかり得る、経費がかかり得る、及び／または信頼可能で包括的な診断評価を得るために十分な感受性及び／または特異性を有し得ないと認識している。一部の実施形態では、本開示は、特にバイオインフォマティクス分析に基づき卵巣癌について高い感受性及び特異性を示すと予測されるバイオマーカー組合せを同定することにより、そのような問題を解決する技術（システム、組成物、及び方法を含む）を提供する。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、卵巣癌と関連する細胞外小胞に存在する表面タンパク質バイオマーカー、内部タンパク質バイオマーカー、及びＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含む、個々の細胞外小胞における卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャー（例えば、バイオインフォマティクス分析により同定されるもの）の共局在を検出することにより、そのような問題を解決する技術（システム、組成物、及び方法を含む）を提供する。一部の実施形態では、本開示は、特に個々の細胞外小胞における標的バイオマーカーシグネチャーの相互作用及び／または共局在に基づく、本出願人により開発され、かつ両方とも２０２０年２月２８日に出願され、「標的実体を検出するシステム、組成物、及び方法」と標題された米国特許出願第１６／８０５，６３７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０５２９に記載された標的実体検出アプローチを使用して、卵巣癌のそのような標的バイオマーカーシグネチャーを検出することにより、そのような問題を解決する技術（システム、組成物、及び方法を含む）を提供する。上述の開示のそれぞれの内容は、それらの全体で参照により本明細書に援用される。
本開示は特に、有効な卵巣癌スクリーニングを達成するための、例えば、卵巣癌を早期検出するための洞察及び技術を提供する。一部の実施形態では、本開示は、卵巣癌と関連する１つ複数の症状を経験しているかもしれない女性において卵巣癌を早期検出するための技術を提供する。一部の実施形態では、本開示は、卵巣癌について遺伝的リスクを有する女性において卵巣癌を早期検出するための技術を提供する。一部の実施形態では、本開示は、遺伝的リスクを有してよく、及び／または卵巣癌と関連する１つまたは複数の症状を経験しているかもしれない閉経後女性において卵巣癌を早期検出するための技術を提供する。一部の実施形態では、本開示は、早期ステージ高異型度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）について遺伝的または平均的リスクを有する女性をスクリーニングするための技術を提供する。ＨＧＳＯＣは、卵巣癌の最も一般的及び致命的サブタイプであり、その際、症例の８４％が進行ステージで検出される（Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１８、本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、提供される技術は、早期ステージ卵巣癌の検出のために有効である。一部の実施形態では、提供される技術は、無症候性または症候性個体を含むか、またはそれからなる集団に適用された場合にも（例えば、十分に高い感受性、及び／または低い確率の擬陽性及び／または擬陰性結果により）、有効である。一部の実施形態では、提供される技術は、卵巣癌の発生において遺伝的リスクを有さない個体（例えば、無症候性または症候性個体）を含むか、またはそれからなる集団に適用された場合に、有効である。一部の実施形態では、提供される技術は、卵巣癌の発生において遺伝的リスクを有する個体（例えば、無症候性または症候性個体）を含むか、またはそれからなる集団に適用された場合に、有効である。一部の実施形態では、提供される技術は、卵巣癌に易罹患性である個体（例えば、既知の遺伝的、環境的、または経験的リスクを有する個体など）を含むか、またはそれからなる集団に適用された場合に、有効である。一部の実施形態では、本明細書において提供される開示を読むことで当業者には明白であろうとおり、提供される技術は、１つまたは複数の組成物（例えば、分子複合体、システム、収集、組合せ、キットなど）及び／または方法（例えば、製造、使用、評価方法など）であり得るか、またはそれを含み得る。
一部の実施形態では、提供される技術は、提供される技術の単回及び／または定期的な（例えば、周期的）評価への有用な適用を可能にする適切な感受性及び／または特異性（例えば、擬陽性及び／または擬陰性結果の割合）で、卵巣癌の１つまたは複数の特徴（例えば、発生、進行、治療に対する応答性、再発など）の検出（例えば、無症候性個体（複数可）及び／または集団（複数可）における、例えば、早期検出）を達成する。一部の実施形態では、提供される技術は、マンモグラム、ＨＰＶ、及び／またはＰａｐスミアスクリーニングなどの女性の周期的理学的検査と併せて有用である。一部の実施形態では、提供される技術は、ＣＡ－１２５測定（例えば、ＣＡ－１２５血清レベル測定）及び／またはＴＶＵＳなどの１つまたは複数のスクリーニング方法（例えば、卵巣癌についての）と併せて有用である。一部の実施形態では、提供される技術は、処置レジメン（複数可）と併せて有用である；一部の実施形態では、提供される技術は、そのような処置レジメン（複数可）の１つまたは複数の特徴（例えば、許容されるパラメーターによる成功率）を改善し得る。
一部の実施形態では、本開示は特に、症候（複数可）の発生前、またはそうでなければその非存在下での無症候性個体のスクリーニング、例えば、定期的なスクリーニングが有利であり得、卵巣癌の有効な管理（例えば、処置の成功）にも重要であり得るという洞察を提供する。一部の実施形態では、本開示は、例えば、一部の実施形態では、無症候性個体（例えば、卵巣癌の遺伝的リスクを有さない）において早期ステージがんを含む卵巣癌を検出するために実施することができる卵巣癌スクリーニングシステムを提供する。一部の実施形態では、提供される技術を、無症候性個体（例えば、卵巣癌の遺伝的リスク（複数可）を有するか、または有さない）の定期的なスクリーニングを達成するために実施する。一部の実施形態では、提供される技術を、症候性個体（例えば、卵巣癌の遺伝的リスク（複数可）を有するか、または有さない）の定期的なスクリーニングを達成するために実施する。本開示は、例えば、組成物（例えば、試薬、キット、構成成分など）、ならびにそれらを提供する、及び／または使用する方法を提供し、その際、１つまたは複数の個体（例えば、無症候性個体）の定期的な検査を含むストラテジーを含む。本開示は、そのようなシステムの有用性を定義し、かつそれらを実施するための組成物及び方法を提供する。
Ｉ．卵巣癌検出
今日、平均的リスクの無症候性女性についてＦＤＡ認可されている、いずれの種類の卵巣癌スクリーニング検査も存在しないが、米国において、卵巣癌を発症する平均生涯リスクは１．３％であり、女性７８人に１人に等しい。米国における全卵巣癌有病率は、５５～７４歳の女性１０，０００人あたり５．７人であった（Ｂｕｙｓ ｅｔ ａｌ．、２０１１；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。２０１８年には米国において、およそ２２，２４０件の新たな症例が卵巣癌と診断され、１４，０７０件の卵巣癌死があった（Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。特に、年齢及び閉経状態が卵巣癌についての危険因子と同定されており、当初表出の平均年齢は、およそ６８歳である。
上皮性卵巣癌サブタイプが全卵巣癌の９０％を占めている。上皮癌は、漿液性（５２％）、類子宮内膜（１０％）、粘液性（６％）、または明細胞（６％）と分類されている（Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。多くの漿液性癌が、その時点で５年生存率がそれぞれ４２％及び２６％であるステージＩＩＩ（５１％）またはステージＩＶ（２９％）で診断され、早期ステージスクリーニング検査の必要を示している。生殖細胞及び性索間質腫瘍が非上皮癌の大部分を構成しているが、全卵巣癌のうちのそれぞれ３％及び２％を占めるにすぎない。卵巣癌は、すべての民族の女性に影響を及ぼす。
卵巣癌のさらに強力な危険因子は、乳癌または卵巣癌の家族歴である。侵襲性上皮性卵巣癌を発症するリスクが、卵巣癌の履歴を有する第一度近親者がいる女性では、およそ５０％、及び乳癌を有する第一度近親者がいる女性では１０％上昇する。上皮性卵巣癌症例、特に高異型度漿液性癌のおよそ１８％は、リスクの上昇をもたらす遺伝性変異によると推定される。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の変異は、その疾患の家族歴を有する女性では、卵巣癌症例のうちのだいたい４０％を占める。ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異を有する女性では、８０歳までに卵巣癌を発症するリスクはそれぞれ、４４％及び１７％である。例えば、Ｍａｔｕｌｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、２０１６（本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）に記載されているとおり、上皮性卵巣癌での、まれな中程度浸透度遺伝子変異は、ＰＡＬＢ２、ＢＡＲＤ１、ＢＲＩＰ１、ＲＡＤ５１Ｃ、及びＲＡＤ５１Ｄなどのファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路に関係する遺伝子を含む。リンチ症候群を有する家族は、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子（例えば、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２）における生殖細胞系変異により特徴づけられる。リンチ症候群を有する女性は、一般の集団における０．７％と比較して、７０歳までに卵巣癌（通常は非漿液性上皮性腫瘍）を発症するおよそ８％のリスクを有する（Ｔｏｒｒｅ、ｅｔ ａｌ．、２０１８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。ＣＨＥＫ２、ＭＲＥ１１Ａ、ＲＡＤ５０、ＡＴＭ、及びＴＰ５３などのＤＮＡ修復に関係する他の遺伝子における遺伝性変異も、卵巣癌を発症するリスクを上昇させ得る。ゲノムワイド関連解析により示唆されているとおり、追加の一般的な低浸透度対立遺伝子も、上皮性卵巣癌罹患性と関連し得る。そのような遺伝子及び遺伝子座には、ＷＮＴ４、ＲＳＰＯ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＨＯＸＤ３、ＨＡＧＬＲ、ＴＩＰＡＲＰ、ＳＹＮＰＯ２、ＴＥＲＴ、ＧＰＸ６、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＬＩＮＣ００８２４、ＣＯＬ１５Ａ１、ＳＭＣ２－ＡＳ１、ＭＬＬＴ１０、ＩＮＣＥＮＰ、ＲＣＣＤ１、ＡＴＡＤ５、ＨＮＦ１Ｂ、ＰＬＥＫＨＭ１、ＳＫＡＰ１、ＡＮＫＬＥ１、ＧＡＴＡＤ２Ａ、Ｃｙｔｏｂａｎｄｓ及びＳＮＰｓ ２ｑ１３ ｒｓ７５２５９０、４ｑ３２．３ ｒｓ４６９１１３９、９ｐ２２ ｒｓ３８１４１１３、９ｑ３４．２ ｒｓ６３５６３４、１０ｐ１１．２１ ｒｓ１１９２６９１、及び／または１９ｑ１３．２ ｒｓ６８８１８７が含まれる（Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．、２０１７；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。
遺伝的リスクを有すると同定されている比較的若い女性の人数は、年を追うごとに増加すると予測されている。膵臓癌についてのＮＣＣＮガイドラインは２０１９年１２月に更新されて、すべての患者をＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＡＬＢ２、ＳＴＫ１１及びＴＰ５３における生殖細胞系変異について検査する推奨を含むこととなった。この遺伝子リストが、卵巣癌についての遺伝的リスクをもたらす遺伝子と重複することを考慮すると、おそらく、膵臓患者のより多くの娘が、膵臓及び卵巣癌の両方についての彼女ら自身の遺伝的リスクに気づき、彼女らは一般的なリスクカテゴリーから遺伝的リスクカテゴリーへと移ることになるであろう。加えて、乳癌患者における最近の費用有効性研究により、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２及びＰＡＬＢ２における生殖細胞系変異について、米国及び英国のすべての乳癌患者をスクリーニングすることが、費用的に有効であると結論付けられた（Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．、２０１９；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。乳癌を有するすべての女性について生殖細胞系遺伝子検査を実施ガイドラインに導入することで、その娘も乳癌及び卵巣癌についての遺伝的リスクを有する追加のリスク変異キャリアが同定される。現在、女性（例えば、遺伝的リスクを有さない）の卵巣癌に推奨されるスクリーニング検査は存在しない。特に、ある特定の実施形態では、本開示は、卵巣癌リスク評価を得るために利用することができる卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の開発が必要とされているという洞察を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のアッセイ及び／または技術は、基準閾値（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）に関するスコアを提供し得る。ある特定の実施形態では、そのようなスコアは、卵巣癌リスクスコアであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、そのようなスコアは、全体評価を得るために、例えば、これに限定されないが、ＣＡ－１２５測定（例えば、ＣＡ－１２５血清レベル測定及び／またはＴＶＵＳ）及び／または卵巣癌関連危険因子（複数可）などの他の卵巣癌スクリーニング評価（複数可）と併せて使用することができる。
早期検出についての経腟超音波検査（ＴＶＵＳ）及び腫瘍マーカーＣＡ－１２５の固定カットポイント（≧３５Ｕ／ｍＬ）の使用を評価するものであったＰｒｏｓｔａｔｅ，Ｌｕｎｇ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ，ａｎｄ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｒｉａｌ（ＰＬＣＯ）において、１９年間のフォローアップ後に、卵巣癌死亡率の低下は観察されなかった。ＵＫ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ ＳｃｒｅｅｎｉｎｇはＴＶＵＳを、ＣＡ－１２５レベルの変化を組み込んだリスクアルゴリズムと組み合わせて評価し、１５年後に、平均的リスクの女性において死亡率の低下を見出した。矛盾しているが、Ｕ．Ｓ． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ（ＵＳＰＳＴＦ）は、一般集団では卵巣癌についてスクリーニングしないように推奨し続けており、毎年のスクリーニングが卵巣癌死亡率を低下させず、重大な危害、主に、卵巣癌を有さない女性における外科的介入につながり得るという十分な証拠が存在すると結論付けている。
特に、ある特定の実施形態では、本開示は、卵巣癌について遺伝的リスクを有する女性及び／または卵巣癌と関連する１つまたは複数の症状を経験しているかもしれない女性をスクリーニングするための卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発が必要とされているという洞察を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、例えば、他のスクリーニング方法、例えば、ＴＶＵＳの前に、症候性または無症候性女性をスクリーニングするための卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発が必要とされているという洞察を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、他のスクリーニング方法、例えば、ＴＶＵＳの前に、無症候性女性をスクリーニングするための卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発が必要とされているという洞察を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、卵巣癌について平均的リスクを有する女性をスクリーニングするための卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発が必要とされているという洞察を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、卵巣癌の生活歴関連リスクを有する女性をスクリーニングするための卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発が必要とされているという洞察を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、閉経後である女性、例えば、卵巣癌と関連する１つまたは複数の症状を経験しているかもしれない閉経後の女性をスクリーニングするための卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発が必要とされているという洞察を提供する。すべてのがんのうちで５番目に多い女性の死因であるにも関わらず（Ｈｏｗｌａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１９；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）、現在、平均的リスクの女性に推奨される卵巣癌スクリーニングツールは存在せず、遺伝的リスクを有する女性及び／または卵巣癌の症状を経験しているかもしれない女性におけるステージ１及びＩＩ疾患のための現行の標準治療スクリーニングアッセイ（例えば、ＴＶＵＳ及び血清マーカーＣＡ－１２５レベル）は、低い感受性（約２０％）及び低い特異性を示す（ＮＣＣＮ，２０１９；Ｂｕｙｓ ｅｔ ａｌ．、２０１１；本明細書に記載の目的について参照により本明細書にそれぞれ援用される）。感受性及び特異性のこれらの低率が、効率的でタイムリーな診断に対する障壁となっている。平均的リスクの女性における卵巣癌の発生を考慮すると、不十分な検査特異性（例えば、＜９９．５％）は、真陽性の数を一桁よりも多く上回る偽陽性結果をもたらす。これは、医療制度、及び擬陽性結果とスクリーニングされた女性に、かなりの負担を掛け、追加の検査、不必要な外科手術、及び感情的／身体的苦痛につながる（Ｂｕｙｓ ｅｔ ａｌ．、２０１１；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。
一部の実施形態では、本開示は、特に有用な卵巣癌スクリーニング検査は、ステージＩ及びＩＩ卵巣癌（すなわち、予後が最も有利であるとき）について（１）擬陽性の数を最小化する超高特異性（＞９８％）、及び（２）高い感受性（＞４０％）により特徴づけられ得るという洞察を提供する。例えば、一部の実施形態では、特に有用な卵巣癌スクリーニング検査は、例えば、ステージＩ及びＩＩ卵巣癌について＞９８％の特異性及び＞５０％の感受性により特徴づけられ得る。一部の実施形態では、特に有用な卵巣癌スクリーニング検査は、例えば、ステージＩ及びＩＩ卵巣癌について＞９８％の特異性及び＞６０％の感受性により特徴づけられ得る。一部の実施形態では、特に有用な卵巣癌スクリーニング検査は、例えば、ステージＩ及びＩＩ卵巣癌について＞９８％の特異性及び＞７０％の感受性により特徴づけられ得る。一部の実施形態では、特に有用な卵巣癌スクリーニング検査は、例えば、ステージＩ及びＩＩ卵巣癌について＞９９．５％の特異性及び＞６５％の感受性により特徴づけられ得る。一部の実施形態では、特に有用な卵巣癌スクリーニング検査は、例えば、ステージＩ及びＩＩ卵巣癌について＞９９．５％の特異性及び＞６０％の感受性により特徴づけられ得る。
一部の実施形態では、本開示は、バイオマーカー組合せの１つよりも多いセット（例えば、本明細書に記載のとおりの少なくとも２つのオルトゴナルなバイオマーカー組合せ）を含む卵巣癌スクリーニング検査は、バイオマーカー組合せの１セットにより達成される感受性と比較して、そのようなアッセイの感受性を上昇させ得るという洞察を提供する。例えば、一部の実施形態では、少なくとも２つのオルトゴナルなバイオマーカー組合せを含む卵巣癌スクリーニング検査は、少なくとも９８％の特異性及び少なくとも５０％の感受性を達成し得る。一部の実施形態では、少なくとも２つのオルトゴナルなバイオマーカー組合せを含む卵巣癌スクリーニング検査は、少なくとも９８％の特異性及び少なくとも６０％の感受性を達成し得る。
一部の実施形態では、本開示は、特に有用な卵巣癌スクリーニング検査は、経済的に正当な経費で許容される陽性予測値（ＰＰＶ）により特徴づけられ得るという洞察を提供する。ＰＰＶは、患者が陽性検査の後に疾患を有する可能性であり、感受性、特異性、及び／または疾患有病率により影響を受ける。卵巣癌についてスクリーニングするために必要とされる最低ＰＰＶについての臨床医コンセンサスの１つは１０％である（Ｎｏｓｓｏｖ ｅｔ ａｌ．、２００８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。１０％のＰＰＶでは、真陽性１つごとに９つの擬陽性が存在するであろう。これらの擬陽性は、医療制度、及び擬陽性結果とスクリーニングされた女性の両方に、かなりの負担を掛けるが、それというのも、それらが、追加の検査、不必要な外科手術、ならびに感情的及び身体的苦痛につながるためである（Ｂｕｙｓ ｅｔ ａｌ．、２０１１；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、本明細書に記載のアッセイは、卵巣癌について遺伝的リスクを有する女性では少なくとも９８％の特異性カットオフで、または卵巣癌と関連する１つまたは複数の症状を経験している女性では少なくとも９９．５％の特異性カットオフで、例えば、１５％超、２０％超、または２５％またはそれ以上を含む、１０％またはそれ以上に高いＰＰＶを達成する早期卵巣癌検出のために特に有用である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のアッセイは、例えば、３％超、４％超、５％超、６％超、７％超、８％超、９％超、１０％超、１５％超、２０％超、または２５％超もしくはそれ以上を含む、２％超またはそれ以上のＰＰＶを達成する早期卵巣癌検出のために有用であり得る。一部のそのような実施形態では、本明細書に記載のアッセイは、少なくとも９５％またはそれ以上に高い特異性カットオフ（例えば、卵巣癌について遺伝的リスクを有する女性で少なくとも９８％の特異性カットオフ、または卵巣癌と関連する１つまたは複数の症状を経験している女性で少なくとも９９．５％の特異性カットオフで）を達成し得る。
いくつかの異なるバイオマーカークラスが、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、バルクタンパク質、及び細胞外小胞（ＥＶ）を含む卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイのために研究されている。ＥＶは、ｃｔＤＮＡ及びＣＴＣと比べて、早期ステージがんについての感受性の改善を示唆する血流におけるそれらの豊富さ及び安定性により、特に有望である。さらに、ＥＶは、同じ細胞に由来するカーゴ（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、代謝産物）を含有し、バルクタンパク質の測定を上回る優れた特異性をもたらす。診断有用性ＥＶが研究されているが、この研究の大部分は、バルクＥＶ測定または低スループット単一ＥＶ分析に関している。
ＩＩ． 卵巣癌の検出のために提供されるバイオマーカー及び／または標的バイオマーカーシグネチャー
本開示は特に、卵巣癌についての様々な標的バイオマーカーまたはそれらの組合せ（例えば、標的バイオマーカーシグネチャー）を提供する。卵巣癌について高い感受性及び特異性を示すと予測されるそのような標的バイオマーカーシグネチャーは、多方向バイオインフォマティクス分析及び生物学的アプローチにより発見されたが、これは例えば、一部の実施形態では、機械学習及び／または計算モデリングを介した、例えば、一部の実施形態では、シーケンシングデータ、発現データ、質量分析法、組織診、翻訳後修飾データ、及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ実験データのうちの１つまたは複数を含むデータの多用なセットの計算分析を含む。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、卵巣癌と関連する細胞外小胞中に存在する表面ポリペプチド）と、表面タンパク質バイオマーカー（複数可）、小胞内タンパク質バイオマーカー（複数可）、及び小胞内ＲＮＡバイオマーカー（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の標的バイオマーカーとを含み、したがって、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）と、そのような標的バイオマーカー（複数可）との組合せは、（ａ）擬陽性の数を最小化するために高い特異性（例えば、９９％超、または９９．５％超など、９８％超またはそれ以上）、及び（ｂ）予後が最も有利であるときであるステージＩ及びＩＩ卵巣癌について高い感受性（例えば、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超）をもたらす卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーを表すようになっている。一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、卵巣癌と関連する細胞外小胞に存在する表面ポリペプチド）と、表面タンパク質バイオマーカー（複数可）、小胞内タンパク質バイオマーカー（複数可）、及び小胞内ＲＮＡバイオマーカー（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含み、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）と、そのような標的バイオマーカー（複数可）との組み合わせが、少なくとも１５％またはそれ以上、少なくとも２０％またはそれ以上、少なくとも２５％またはそれ以上、及び／または少なくとも３０％またはそれ以上の陽性予測値（ＰＰＶ）を提供する卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーを表すようになっている。一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、卵巣癌と関連する細胞外小胞に存在する表面ポリペプチド）と、表面タンパク質バイオマーカー（複数可）、小胞内タンパク質バイオマーカー（複数可）と、小胞内ＲＮＡバイオマーカー（複数可）からなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含み、そのような細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）と、そのような標的バイオマーカー（複数可）の組合せが、例えば、３％超、５％超、７％超、１０％超、１５％超またはそれ以上、２０％超またはそれ以上、２５％超またはそれ以上、及び／または３０％超またはそれ以上を含む、２％超またはそれ以上の陽性予測値（ＰＰＶ）をもたらす卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーを表すようになっている。
一部の実施形態では、本開示は、ある特定の実施形態では、種々の卵巣リスクレベルを有する女性での感受度及び特異度は、主治医及び／または利害医療組合が記載するガイドラインのリスク許容性に応じて変動し得ることを認めている。ある特定の実施形態では、卵巣癌の遺伝的リスクを有する女性は、９９．５％の特異度と７０％の感受性で、または９８％の特異度と８０％の感受性で最も良好に応対され得る。ある特定の実施形態では、閉経後非症候性女性は、９９．５％の特異度と７０％の感受性、または９８％の特異度と８０％の感受性で最も良好に対応され得る。ある特定の実施形態では、閉経後症候性女性は、９９．５％の特異度と７０％の感受性、または９８％の特異度と８０％の感受性で最も良好に対応され得る。ある特定の実施形態では、生活歴リスクを有する女性は、９９．５％の特異度と７０％の感受性、または９８％の特異度と８０％の感受性で最も良好に対応され得る。一部の実施形態では、症候性女性において卵巣癌を検出するための本明細書に記載の技術及び／またはアッセイは、無症候性女性において卵巣癌を検出するための本明細書に記載の技術及び／またはアッセイよりも低い感受性及び／または特異性要求を有してもよい。一部の実施形態では、症候性女性において卵巣癌を検出するための本明細書に記載のアッセイは、例えば、９９％未満の感受性、９５％未満、９０％未満、または８５％未満の特異度を含む、９９．５％未満の特異性である設定特異度を有してもよい。一部の実施形態では、症候性女性において卵巣癌を検出するための本明細書に記載のアッセイは、例えば、７０％未満、または６０％未満の感受度を含む、８０％未満の感受性である設定感受度を有してもよい。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーに含まれる細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）は、アクアポリン－５（ＡＱＰ５）ポリペプチド、カドヘリン－６（ＣＤＨ６）ポリペプチド、コンドロレクチン（ＣＨＯＤＬ）ポリペプチド、クローディン－３（ＣＬＤＮ３）ポリペプチド、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）ポリペプチド、クローディン－１６（ＣＬＤＮ１６）ポリペプチド、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）ポリペプチド、５－ヒドロキシトリプタミン受容体３Ａ（ＨＴＲ３Ａ）ポリペプチド、ＬＥＭドメイン含有１（ＬＥＭＤ１）ポリペプチド、ロイシンリッチリピート膜貫通神経タンパク質１（ＬＲＲＴＭ１）ポリペプチド、ムチン－１６（ＭＵＣ１６）ポリペプチド、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＳＬＣ３４Ａ２）ポリペプチド、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）ポリペプチド、骨髄ストローマ細胞抗原２（ＢＳＴ２）ポリペプチド、小細胞肺癌クラスター４抗原（ＣＤ２４）ポリペプチド、メソテリン（ＭＳＬＮ）ポリペプチド、ムチン－１（ＭＵＣ１）ポリペプチド、プロスタグランジン－エンドペルオキシドシンターゼ１（ＰＴＧＳ１）ポリペプチド、ＳＴ１４膜貫通セリンプロテアーゼマトリプターゼ（ＳＴ１４）ポリペプチド、がん関連シアリル－Ｔｈｏｍｐｓｅｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ（Ｔｎ）（ｓＴｎ）ポリペプチドグリコシル化、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＡＣＳＴＤ２）ポリペプチド、基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ）ポリペプチド、ＣＤ７４抗原（ＣＤ７４）ポリペプチド、リンパ球抗原６ファミリーメンバーＥ（ＬＹ６Ｅ）ポリペプチド、溶質輸送体ファミリー２メンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）ポリペプチド、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）ポリペプチド、ディスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ１（ＤＤＲ１）ポリペプチド、エフリンＢ１（ＥＦＮＢ１）ポリペプチド、ノッチ受容体３（ＮＯＴＣＨ３）ポリペプチド、プレキシンＢ１（ＰＬＸＮＢ１）ポリペプチド、セリンぺプチダーゼ阻害因子クニッツタイプ２（ＳＰＩＮＴ２）ポリペプチド、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１２Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）ポリペプチド、またはそれらの組合せであるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーに含まれる標的バイオマーカーは、アクアポリン－５（ＡＱＰ５）ポリペプチド、カドヘリン－６（ＣＤＨ６）ポリペプチド、コンドロレクチン（ＣＨＯＤＬ）ポリペプチド、クローディン－３（ＣＬＤＮ３）ポリペプチド、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）ポリペプチド、クローディン－１６（ＣＬＤＮ１６）ポリペプチド、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）ポリペプチド、５－ヒドロキシトリプタミン受容体３Ａ（ＨＴＲ３Ａ）ポリペプチド、ＬＥＭドメイン含有１（ＬＥＭＤ１）ポリペプチド、ロイシンリッチリピート膜貫通神経タンパク質１（ＬＲＲＴＭ１）ポリペプチド、ムチン－１６（ＭＵＣ１６）ポリペプチド、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＳＬＣ３４Ａ２）ポリペプチド、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）ポリペプチド、骨髄ストローマ細胞抗原２（ＢＳＴ２）ポリペプチド、小細胞肺癌クラスター４抗原（ＣＤ２４）ポリペプチド、メソテリン（ＭＳＬＮ）ポリペプチド、ムチン－１（ＭＵＣ１）ポリペプチド、プロスタグランジン－エンドペルオキシドシンターゼ１（ＰＴＧＳ１）ポリペプチド、ＳＴ１４膜貫通セリンプロテアーゼマトリプターゼ（ＳＴ１４）ポリペプチド、がん関連シアリル－Ｔｎ（ｓＴｎ）ポリペプチドグリコシル化、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＡＣＳＴＤ２）ポリペプチド、基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ）ポリペプチド、ＣＤ７４抗原（ＣＤ７４）ポリペプチド、リンパ球抗原６ファミリーメンバーＥ（ＬＹ６Ｅ）ポリペプチド、溶質輸送体ファミリー２メンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）ポリペプチド、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）ポリペプチド、ディスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ１（ＤＤＲ１）ポリペプチド、エフリンＢ１（ＥＦＮＢ１）ポリペプチド、ノッチ受容体３（ＮＯＴＣＨ３）ポリペプチド、プレキシンＢ１（ＰＬＸＮＢ１）ポリペプチド、セリンぺプチダーゼ阻害因子クニッツタイプ２（ＳＰＩＮＴ２）ポリペプチド、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１２Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）ポリペプチド、またはそれらの組合せからなる群から選択される表面タンパク質バイオマーカーであるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーに含まれる細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）は、アクアポリン－５（ＡＱＰ５）ポリペプチド、カドヘリン－６（ＣＤＨ６）ポリペプチド、コンドロレクチン（ＣＨＯＤＬ）ポリペプチド、クローディン－３（ＣＬＤＮ３）ポリペプチド、クローディン－６（ＣＬＤＮ６）ポリペプチド、クローディン－１６（ＣＬＤＮ１６）ポリペプチド、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）ポリペプチド、５－ヒドロキシトリプタミン受容体３Ａ（ＨＴＲ３Ａ）ポリペプチド、ＬＥＭドメイン含有１（ＬＥＭＤ１）ポリペプチド、ロイシンリッチリピート膜貫通神経タンパク質１（ＬＲＲＴＭ１）ポリペプチド、ムチン－１６（ＭＵＣ１６）ポリペプチド、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＳＬＣ３４Ａ２）ポリペプチド、またはそれらの組合せであるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、表１に記載のとおりの組合せの標的を含み得て、その際、標的を捕捉プローブ及び／または検出プローブで使用することができる。一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、表１に記載のとおりの捕捉プローブの標的と、検出プローブ（例えば、検出プローブ１及び／または検出プローブ２）の少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上を含む）の標的とを含み得る。例に過ぎないが、一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、ＡＬＰＬ（表１に記載の捕捉プローブの標的）、ｓＴｎ（表１に記載の検出プローブ１または２の標的）及びＦＯＬＲ１（表１に記載の検出プローブ１または２の標的）を含み得る。一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーは、表１に記載のとおりの捕捉及び検出プローブの組合せの標的を含み得る。
Figure 2023510911000002
Figure 2023510911000003
Figure 2023510911000004
Figure 2023510911000005
Figure 2023510911000006
Figure 2023510911000007
一部の実施形態では、（例えば、より高い感受性、特異性及び／またはＰＰＶで）卵巣癌検出に特に有用であり得る表１に表示のとおりのある特定のバイオマーカー組合せを、基準としての進行ステージ（例えば、後期ステージ、例えば、ステージＩＩＩ及び／またはＩＶ）卵巣癌試料プール及び健康な対照試料プールを使用するスクリーニングの当初ラウンドに掛けることができる。一部の実施形態では、選択された組合せを、早期ステージ卵巣癌試料プール（例えば、任意選択で、低または高ＣＡ－１２５含有率により識別されたステージＩ及び／またはＩＩ）、良性婦人科腫瘍血漿試料プール（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）、非卵巣癌試料プール（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）、及び／またはそれらの任意の組合せを使用してさらに試験することができる。一部の実施形態では、バイオマーカー組合せ性能は、健康な試料プールと卵巣癌試料プールとの間の（例えば、Ｃｔベースでの）アッセイシグナルの差を計算することにより決定することができる。
一部の実施形態では、卵巣癌検出のためのある特定のバイオマーカー組合せは、アッセイ間変動性よりも高いデルタＣｔで選択することができる。例えば、一部の実施形態では、２．０（４倍差に対応）または１．０（２倍差に対応）よりも高いデルタＣｔを有するバイオマーカー組合せが、特に有効な診断有用性をもたらす（例えば、アッセイ間変動性よりも高いシグナルをもたらす）と判断される。例えば、本明細書に記載のある特定の組合せの例示的な分析を提供する実施例７を参照されたい。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーに含まれる標的バイオマーカーは、細胞内レチノイン酸結合タンパク質２（ＣＲＡＢＰ２）ポリペプチド、カリクレイン－７（ＫＬＫ７）ポリペプチド、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチド、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）ポリペプチド、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（Ｓ１００Ａ１）ポリペプチド、及びそれらの組合せからなる群から選択される小胞内タンパク質バイオマーカーであるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーに含まれる標的バイオマーカーは、ＣＬＤＮ６ ＲＮＡ、ＣＲＡＢＰ２ ＲＮＡ、ＫＬＫ７ ＲＮＡ、ＭＩＦ ＲＮＡ、ＰＲＡＭＥ ＲＮＡ、Ｓ１００Ａ１ ＲＮＡ、及びそれらの組合せからなる群から選択される小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカーであるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のもの）と、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の表面タンパク質バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）を含む。一部のそのような実施形態では、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカーは、同じである。例えば、一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドである少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、ＭＵＣ１６ポリペプチドである少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカーとを含む。一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドである少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、ＦＯＬＲ１ポリペプチドである少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカーを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカー（複数可）とは別個である。例えば、一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、ＣＬＤＮ３ポリペプチド、ＣＬＤＮ６ポリペプチド、及び／またはＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカーを含む。一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、ＣＬＤＮ３ポリペプチド、ＣＬＤＮ６ポリペプチド、及び／またはＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカーとを含む。一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、ＭＵＣ１６ポリペプチド、及び／またはＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカーとを含む。一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、ＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のもの）と、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の小胞内タンパク質バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）とを含む。一部のそのような実施形態では、上記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）と、上記小胞内タンパク質バイオマーカー（複数可）とは、同じ遺伝子によりコードされ得る一方で、前者は、細胞外小胞の膜で発現され、かつ後者は、細胞外小胞内で発現される。一部のそのような実施形態では、上記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）と、上記小胞内タンパク質バイオマーカー（複数可）とは、異なる遺伝子によりコードされ得る。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のもの）と、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）とを含む。一部のそのような実施形態では、上記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）と、上記小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカー（複数可）とは、同じ遺伝子によりコードされ得る。一部のそのような実施形態では、上記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（複数可）と、上記小胞内ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）バイオマーカー（複数可）とは、異なる遺伝子によりコードされ得る。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、表３～５に記載のとおりの組合せの標的であり得るか、またはそれを含み得る。ある特定の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、後期ステージ卵巣癌試料を対照試料から（例えば、健康な試料と比較して、良性婦人科腫瘍試料と比較して、及び／または他のがん試料と比較して；例えば、表３～５を参照されたい）識別するものである。ある特定の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、早期ステージ卵巣癌試料（例えば、低い及び／または高い血清ＣＡ－１２５を有する）を対照試料から（例えば、健康な試料と比較して、良性婦人科腫瘍試料と比較して、及び／または他のがん試料と比較して；例えば、表３～５を参照されたい）識別するものである。一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの検出を指向するアッセイは、表３～５に記載のとおりの捕捉及び検出プローブの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＳＬＣ３４Ａ２ ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド（標的表面タンパク質バイオマーカーとして）とを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド（標的表面タンパク質バイオマーカーとして）とを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド（標的表面タンパク質バイオマーカーとして）とを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＣＬＤＮ６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＡＱＰ５ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びＡＱＰ５ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びＣＬＤＮ６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド及びＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びＡＱＰ５ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＣＬＤＮ６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＬＲＲＴＭ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＣＬＤＮ３ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＣＬＤＮ３ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド及びＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＣＬＤＮ３ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＣＬＤＮ３ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＣＬＤＮ３ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＣＬＤＮ３ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＣＬＤＮ３ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＣＬＤＮ６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＣＬＤＮ６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＡＬＰＬポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＢＳＴ２ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＦＯＬＲ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＳＬＣ２Ａ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＰＴＧＳ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともｓＴｎグリコシル化ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともｓＴｎグリコシル化ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも１つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤ ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＭＵＣ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＴＡＣＳＴＤポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともｓＴｎグリコシル化ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＭＵＣ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともｓＴｎグリコシル化ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともｓＴｎグリコシル化ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともｓＴｎグリコシル化ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともｓＴｎグリコシル化ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともｓＴｎグリコシル化ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＳＬＮポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＭＵＣ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＭＳＬＮポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＭＳＬＮポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーは、少なくともＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド（細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドとして）と、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであり得るか、またはそれらを含み得る少なくとも２つの標的表面タンパク質バイオマーカーとを含む。
一部の実施形態では、提供されるバイオマーカーのいずれか１つを、野生型形態のタンパク質及び／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）発現レベルにより検出及び／または測定することができる。
一部の実施形態では、提供されるバイオマーカーのいずれか１つを、変異型形態のタンパク質及び／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）発現レベルにより検出及び／または測定することができる。したがって、一部の実施形態では、提供されるバイオマーカー（例えば、タンパク質及び／またはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡなど）の変異体特異的検出も含まれ得る。
本明細書において注記されるとおり、一部の実施形態では、バイオマーカーは、１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、プロ型、短縮化形態、修飾形態、例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化形態など）の特定の形態であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような形態の検出は、その形態で存在する複数の（及び、一部の実施形態では、実質的にすべての）ポリペプチド（例えば、特定の修飾、例えば、特定のグリコシル化、例えば、シアリル－Ｔｎ（ｓＴｎ）グリコシル化などを含むもの、例えば、ＧａｌＮＡｃ α－Ｏ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒに結合したシアル酸α－２，６を含有する短縮化Ｏ－グリカン）を検出する。
したがって、一部の実施形態では、表面タンパク質バイオマーカーは、グリコシル化部分（例えば、ｓＴｎ部分）であり得るか、またはそれを含み得る。Ｔｈｏｍｐｓｅｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ（Ｔｎ）抗原は、広範囲の腫瘍と関連すると考えられているＯ－結合グリカンである。Ｔｎは、主要なＯ－結合グリコシル化経路の第１のステップとしてＳｅｒまたはＴｈｒに付加される単一のアルファ結合ＧａｌＮＡｃである。一部の実施形態では、表面タンパク質バイオマーカーは、腫瘍関連翻訳後修飾であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、そのような翻訳後修飾は、当初ＧａｌＮＡｃ（例えば、Ｔｎ）において異常に短縮化されたグリカンを含むムチンなどの腫瘍特異的グリコシル化パターン、またはそれらの組合せであってよいか、またはそれを含み得る。
一部の実施形態では、バイオマーカーは、ポリペプチドの短縮化形態であるか、またはそれを含む。例えば、一部の実施形態では、ＭＵＣ１６バイオマーカーは、ＭＵＣ１６タンパク質の短縮化形態である。
ＩＩＩ． 卵巣癌について提供されるマーカー及び／または標的バイオマーカーシグネチャーを検出する例示的な方法
一般に、本開示は、それを必要とする対象からの細胞外小胞を含む血液由来試料において標的バイオマーカーシグネチャーを分析し、及び／または評定する技術を提供する；一部の実施形態では、診断または治療の決定を、そのような分析及び／または評定に基づき行う。
一部の実施形態では、標的バイオマーカーシグネチャーを検出する方法は、タンパク質としての標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるマーカーを検出するための方法を含む。１つまたは複数の提供されるマーカーを検出する例示的なタンパク質ベースの方法には、これに限定されないが、近接ライゲーションアッセイ、質量分析法（ＭＳ）及び免疫沈降などのイムノアッセイ；ウェスタンブロット；ＥＬＩＳＡ；免疫組織化学；免疫細胞化学；フローサイトメトリー；ならびに免疫ＰＣＲが含まれる。一部の実施形態では、イムノアッセイは、化学発光イムノアッセイであり得る。一部の実施形態では、イムノアッセイは、ハイスループット及び／または自動イムノアッセイプラットフォームであり得る。
一部の実施形態では、試料においてタンパク質としての１つまたは複数の提供されるマーカーを検出する方法は、試料を、目的の提供されるマーカーを指向する１つまたは複数の抗体因子と接触させることを含む。一部の実施形態では、そのような方法はまた、試料を、１つまたは複数の検出ラベルと接触させることも含む。一部の実施形態では、抗体因子を１つまたは複数の検出ラベルで標識する。
一部の実施形態では、目的のバイオマーカーと、目的のバイオマーカーのための抗体因子との間の結合の検出は、１つまたは複数の検出因子での吸光値または発光値を決定することを含む。例えば、吸光値または発光値は、細胞外小胞により発現される目的のバイオマーカーの量及び／または濃度を示す（例えば、吸光度が高いほど、細胞外小胞により発現される目的のバイオマーカーのレベルが高いことを示す）。一部の実施形態では、検出因子での吸光値または発光値は、閾値を超える。一部の実施形態では、検出因子での吸光値または発光値は、閾値よりも少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも３．５倍またはそれ以上高い。一部の実施形態では、閾値を、対照または基準群の集団（例えば、非がん対象）全体で決定する。
一部の実施形態では、１つまたは複数の提供されるマーカーを検出する方法は、核酸としての１つまたは複数の提供されるマーカーを検出するための方法を含む。１つまたは複数の提供されるマーカーを検出する例示的な核酸ベースの方法は、これに限定されないが、核酸増幅方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、転写－媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を実行することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の提供されるマーカーを検出する核酸ベースの方法は、１つまたは複数の核酸プローブと、目的のバイオマーカーをコードする１つまたは複数のヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを検出することを含む。一部の実施形態では、上記核酸プローブは、目的のバイオマーカーをコードする１つまたは複数のヌクレオチドのうちの１つの少なくとも一部分に対してそれぞれ相補的である。一部の実施形態では、目的のバイオマーカーをコードするヌクレオチドには、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）が含まれる。一部の実施形態では、目的のバイオマーカーをコードするヌクレオチドには、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）が含まれる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の提供されるマーカーを検出する方法は、近接－ライゲーション－免疫定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｌｉｑ－ＰＣＲ）を含み得る。ｐｌｉｑ－ＰＣＲは、ＥＶをプロファイルするための他の技術を上回るある特定の利点を有し得る。例えば、ｐｌｉｑ－ＰＣＲは、他の標準的なイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡよりも３桁高い感受性を有し得る（Ｄａｒｍａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、２０１０；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、ｐｌｉｑ－ＰＣＲ反応を、痕跡レベルの腫瘍由来ＥＶ、例えば、１ｍＬあたり１０００までのＥＶを検出することを可能にする極めて低いＬＯＤを有するように設計することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の提供されるマーカーを検出するための方法は、例えば、それぞれ約１０３及び約１０４ＥＶのＬＯＤが報告されている（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．、２０１８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）、Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｏｓｏｍｅ（ｎＰＬＥＸ）Ｓｅｎｓｏｒ（Ｉｍ ｅｔ ａｌ．、２０１４；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ－Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ（ｉＭＥＸ）Ｓｅｎｓｏｒ（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１６；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）を含む、ＥＶを検出するための他の技術を含み得る。
一部の実施形態では、細胞外小胞において１つまたは複数の提供されるバイオマーカーを検出する方法は、バルクＥＶ試料分析に基づき得る。
一部の実施形態では、細胞外小胞において１つまたは複数の提供されるバイオマーカーを検出する方法は、個々のＥＶをプロファイルすること（例えば、単一ＥＶプロファイリングアッセイ）に基づき得、これは、下記の「個々の細胞外小胞（ＥＶ）をプロファイルするための例示的な方法」と標題したセクションにおいてさらに論述する。
一部の実施形態では、試料中の細胞外小胞を、本開示に従って１つまたは複数の提供されるバイオマーカーを検出する前に、固体基材上に捕捉または固定化することができる。一部の実施形態では、細胞外小胞を、例えば、吸着を含む非特異的相互作用により固体基材表面上に捕捉することができる。一部の実施形態では、細胞外小胞を、固体基材表面上に選択的に捕捉することができる。例えば、一部の実施形態では、固体基材表面を、細胞外小胞（例えば、卵巣癌と関連する、例えば、細胞外小胞を特異的に標的とする抗体因子）に特異的に結合する作用因子でコーティングすることができる。一部の実施形態では、固体基材表面を、親和性結合対の膜でコーティングすることができ、かつ捕捉される目的の実体（例えば、細胞外小胞）を、上記親和性結合対の相補的メンバーにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、例示的な親和性結合対には、例えば、これに限定されないが、ビオチン及びアビジン様分子、例えば、ストレプトアビジンが包含される。当業者に理解されるとおり、固体基材表面への目的の実体の捕捉を促進するために、他の適切な親和性結合対を使用することもできる。一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載の目的について参照により本明細書に両方とも援用され、かつ未希釈ヒト血液または血漿試料から細胞外小胞を単離するための交流動電マイクロアレイチップデバイスの使用を両方とも記載しているＩｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ．、１１：６６４１－６６５１（２０１７）及びＬｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ．、１２：３３１１－３３２０（２０１８）に記載されているとおり、目的の実体を電流の適用により固体基材表面上に捕捉することができる。
固体基材を、細胞外小胞を捕捉するために適していて、かつ下流での取り扱い、処理、及び／または検出に干渉しない形態で得ることができる。例えば、一部の実施形態では、固体基材は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、固体基材は、表面であり得るか、またはそれを含み得る。例えば、一部の実施形態では、そのような表面は、アッセイチャンバーの捕捉表面（例えば、管、ウェル、マイクロウェル、プレート、フィルター、膜、マトリックスなどを含む）であり得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、試料において得られたバイオマーカーを検出する前に、細胞外小胞を固体基材上に捕捉すること、または固定化することを含む。
一部の実施形態では、細胞外小胞を固体基材表面上に捕捉する前に、試料を例えば、望ましくない実体、例えば、細胞破片または細胞を除去するために処理することができる。例えば、一部の実施形態では、そのような試料を、例えば、細胞破片、細胞、及び／または他の微粒子を除去するために、遠心分離に掛けることができる。加えて、または別法では、一部の実施形態では、そのような試料を、サイズ排除ベースの精製または濾過に掛けることができる。様々なサイズ排除ベースの精製または濾過が当技術分野で公知であり、当業者は、場合によっては試料を、特異的な分子量または粒径カットオフに基づきスピンカラム精製に掛けることができることが分かるであろう。当業者はまた、精製目的での適切な分子量または粒径カットオフを、例えば、細胞外小胞のサイズに基づき選択することができることが分かるであろう。例えば、一部の実施形態では、ある特定のサイズ（例えば、３０ｎｍ超及び１０００ｎｍ以下、または７０ｎｍ超及び２００ｎｍ以下）である細胞外小胞の画分を単離するために、サイズ排除分離方法を、細胞外小胞を含む試料に適用することができる。典型的には、細胞外小胞は、直径３０ｎｍから数マイクロメートルの範囲であり得る。例えば、種々の細胞外小胞（ＥＶ）サブタイプでのサイズ：ミグラソーム（０．５～３μｍ）、微小小胞体（０．１～１μｍ）、オンコソーム（１～１０μｍ）、エキソマー（＜５０ｎｍ）、小エクソソーム（６０～８０ｎｍ）、及び大エクソソーム（９０～１２０ｎｍ）の情報を提供している、本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用されるＣｈｕｏ ｅｔ ａｌ．、“Ｉｍａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２５：９１（２０１８）を参照されたい。一部の実施形態では、約３０ｎｍ～１０００ｎｍのサイズ範囲を有するナノ粒子を、検出アッセイのために、例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のサイズ排除分離方法により単離することができる。一部の実施形態では、特異的ＥＶサブタイプ（複数可）を、検出アッセイのために、例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のサイズ排除分離方法により単離することができる。
一部の実施形態では、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるバイオマーカーを検出する前に、試料中の細胞外小胞を処理することができる。例えば、検出される細胞外小胞中の標的（例えば、標的バイオマーカー）を安定化するために、及び／または検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）への標的（例えば、小胞内タンパク質及び／またはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の曝露を促進するために、及び／または非特異的結合を減少させるために、種々の試料処理及び／または調製を行うことができる。そのような試料処理及び／または調製の例は当技術分野で公知であり、かつ、それには、これに限定されないが、分子標的の架橋（例えば、固定）、生物学的実体（例えば、細胞または細胞外小胞）の透過化、及び／または非特異的結合部位の遮断が含まれる。
一態様では、本開示は、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーが、一部の実施形態では、細胞外小胞を含む血液由来試料であってよいそれを必要とする対象からの生物学的試料中に存在するか、または存在しないかを検出するための方法を提供する。一部の実施形態では、そのような方法は、（ａ）対象からの生物学的試料、例えば、血液由来試料（例えば、血漿試料）において、卵巣癌の標的バイオマーカーシグネチャーを発現する目的の生物学的実体（例えば、細胞外小胞を含む）を検出すること；及び（ｂ）生物学的試料（例えば、血液由来試料）における目的の標的バイオマーカーシグネチャー発現生物学的実体（例えば、細胞外小胞）のレベルを示す試料情報を、基準閾値レベルを含む基準情報と比較することを含む。一部の実施形態では、基準閾値レベルは、基準対象、例えば、非がん対象の集団からの比較可能な試料における、そのような標的バイオマーカーシグネチャーを発現する目的の生物学的実体（例えば、細胞外小胞）のレベルに対応する。一部の実施形態では、例示的な非がん対象には、健康な女性対象（例えば、５５歳未満または５５歳超などの、例えば、指定の年齢範囲の健康な女性対象）、非卵巣関連の健康上の疾患、障害、または状態を有する女性対象（例えば、肺癌、結腸直腸癌などの非卵巣癌を有する女性対象、または炎症性腸疾患または障害の症状を有する女性対象を含む）、良性卵巣腫瘍（例えば、卵管内及び／または卵巣上で観察される良性腫瘤）を有する女性対象、及びそれらの組合せが含まれる。
一部の実施形態では、試料を、本明細書に記載のアッセイにおいて利用する前に、ある特定の特徴について事前スクリーニングする。一部の実施形態では、ある特定の事前スクリーニング基準を満たす試料が、事前スクリーニング基準を満たさなかった試料よりも、診断適用に適している。例えば、一部の実施形態では、例えば、正常、溶血（赤色）、黄疸（黄色）、及び／または脂肪（混濁）の試料である既知の標準を使用して、試料を外観について視覚的に検査する。一部の実施形態では、次いで、試料を、既知の標準的なスケール（例えば、１、２、３、４、５）でレーティングすることができ、結果を記録する。一部の実施形態では、試料を溶血（例えば、ヘム）について視覚的に検査し、１～５のスケールでレーティングするが、その際、外観検査は、既知の濃度と相関し、例えば、１は、およそ０ｍｇ／ｄＬを示し、２は、およそ５０ｍｇ／ｄＬを示し、３は、およそ１５０ｍｇ／ｄＬを示し、４は、およそ２５０ｍｇ／ｄＬを示し、５は、およそ５２５ｍｇ／ｄＬを示す。一部の実施形態では、試料を、黄疸レベル（例えば、ビリルビン）について視覚的に検査し、１～５のスケールでレーティングするが、その際、外観検査は、既知の濃度と相関し、例えば、１は、およそ０ｍｇ／ｄＬを示し、２は、およそ１．７ｍｇ／ｄＬを示し、３は、およそ６．６ｍｇ／ｄＬを示し、４は、およそ１６ｍｇ／ｄＬを示し、５は、およそ３０ｍｇ／ｄＬを示す。一部の実施形態では、試料を、混濁度（例えば脂質）について視覚的に検査し、１～５のスケールでレーティングするが、その際、外観検査は、既知の濃度と相関し、例えば、１は、およそ０ｍｇ／ｄＬを示し、２は、およそ１２５ｍｇ／ｄＬを示し、３は、およそ２５０ｍｇ／ｄＬを示し、４は、およそ５００ｍｇ／ｄＬを示し、５は、およそ１０００ｍｇ／ｄＬを示す。
一部の実施形態では、１つまたは複数の測定基準で、ある特定のレベル未満、例えば、４のスコア以下のスコアリングの試料を、本明細書に記載のとおりのアッセイにおいて利用することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の測定基準で、ある特定のレベル未満、例えば、３のスコア以下のスコアリングの試料を、本明細書に記載のとおりのアッセイにおいて利用することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の測定基準で、ある特定のレベル未満、例えば、２のスコア以下のスコアリングの試料を、本明細書に記載のとおりのアッセイにおいて利用することができる。一部の実施形態では、３つすべての測定基準（例えば、溶血、黄疸、及び脂質）で、ある特定のレベル未満、例えば、２のスコア以下のスコアリングの試料を、本明細書に記載のとおりのアッセイにおいて利用することができる。一部の実施形態では、溶血、ビリルビン、及び／または高脂血症などの事前スクリーニング基準での低い外観検査スコア（例えば、２のスコア以下）が、本明細書に記載のとおりのアッセイにおいて生成される診断特性（例えば、Ｃｔ値）について、明かな作用を有さないこともある（例えば、それと相関しないこともある）。
一部の実施形態では、試料が、基準閾値レベル（例えば、本明細書に記載のもの）と比べて上昇したレベルの標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞を示す場合に、その試料を、標的バイオマーカーシグネチャー（例えば、本明細書に記載のもの）を発現する細胞外小胞を有すると決定する。一部の実施形態では、そのレベルが、基準閾値レベルと比較して、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上を含めて、少なくとも３０％またはそれ以上高ければ、試料を標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞について陽性であると決定する。一部の実施形態では、そのレベルが、基準閾値レベルと比較して、例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも７５０倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２５００倍、少なくとも５０００倍、またはそれ以上を含めて、少なくとも２倍またはそれ以上高ければ、試料を、標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞について陽性であると決定する。
一部の実施形態では、２項分類システムを、試料が標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞について陽性であるかどうかを決定するために使用することができる。例えば、一部の実施形態では、そのレベルが基準閾値レベル、例えば、カットオフ値であるか、またはそれを超えているならば、試料を標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞について陽性であると決定する。一部の実施形態では、卵巣癌検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）の所望の感受性及び／または特異性が達成され得るように、そのような基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）を、対照対象から得られた平均値から離れたある特定の数の標準偏差を選択することにより決定することができる。一部の実施形態では、卵巣癌検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）の所望の感受性及び／または特異性が達成され得るように、そのような基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、対照対象から得られた最大アッセイシグナルから離れたある特定の数の標準偏差を選択することにより決定することができる。一部の実施形態では、卵巣癌検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）の所望の感受性及び／または特異性が達成され得るように、そのような基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、（ｉ）対照対象から得られた平均値から離れたある特定の数の標準偏差、または（ｉｉ）対照対象から得られた最大アッセイシグナルから離れたある特定の数の標準偏差のいずれかの制限的でない方を選択することにより決定することができる。一部の実施形態では、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）を決定するための対照対象には、これに限定されないが、健康な対象、炎症状態を有する対象（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、子宮内膜症など）、良性婦人科腫瘍を有する対象、及びそれらの組合せが含まれ得る。一部の実施形態では、健康な対象及び炎症状態を有する対象（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、子宮内膜症など）が、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）の決定に含まれる。一部の実施形態では、良性婦人科腫瘍を有する対象は、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）の決定に含まれない。一部の実施形態では、卵巣癌検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）の所望の特異性（例えば、一部の実施形態では、少なくとも９９．８％の特異性など、少なくとも９５％またはそれより高い特異性［例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれより高い特異性を含む］）が達成され得るように、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、（ｉ）対照対象から得られた平均値、または（ｉｉ）対照対象から得られた最大アッセイシグナルから離れた少なくとも１．５またはそれ以上の標準偏差（ＳＤ）（例えば、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３、少なくとも３．１、少なくとも３．２、少なくとも３．３、少なくとも３．４、少なくとも３．５、少なくとも３．６またはそれ以上のＳＤを含む）を選択することにより決定することができる。一部の実施形態では、卵巣癌検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）の所望の特異性（例えば、少なくとも９９％、またはそれより高い特異性）が達成され得るように、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、（ｉ）対照対象から得られた平均値、または（ｉｉ）対照対象から得られた最大アッセイシグナルから離れた少なくとも２．９のＳＤ（例えば、少なくとも２．９３のＳＤ）を選択することにより決定することができる。一部の実施形態では、卵巣癌検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）の所望の特異性（例えば、少なくとも９９％、またはそれより高い特異性）が達成され得るように、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、（ｉ）対照対象から得られた平均値、または（ｉｉ）対照対象から得られた最大アッセイシグナルのより制限的でない方から離れた少なくとも２．９のＳＤ（例えば、少なくとも２．９３のＳＤ）を選択することにより決定することができる。一部の実施形態では、目的の特異性及び／または感受性（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）が達成され得るように、そのような基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、正常な健康組織 対 卵巣癌試料における標的バイオマーカーの発現レベル（例えば、転写産物レベル）に基づき決定することができる。一部の実施形態では、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、例えば、卵巣癌ステージ及び／またはサブタイプ及び／または患者の特徴、例えば、患者の年齢、閉経状態、卵巣癌についてのリスク因子（例えば、遺伝的リスク 対 平均的リスク、生活歴関連危険因子）、症候性／無症候性状態、及びそれらの組合せに依存して変動し得る。
一部の実施形態では、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、健康な女性対象（例えば、規定の年齢範囲の女性対象）、及び任意選択で、炎症状態（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、子宮内膜症など）を有する女性対象全体での対数正規分布ならびに目的の特異性（例えば、一部の実施形態では、少なくとも９５％またはそれより高い特異性［例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれより高い特異性を含む］、例えば、少なくとも９９．８％の特異性）を達成するために必要な標準偏差（ＳＤ）（例えば、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３、少なくとも３．１、少なくとも３．２、少なくとも３．３、少なくとも３．４、少なくとも３．５、少なくとも３．６またはそれより高いＳＤ）の数の選択に基づき、例えば、卵巣癌またはそのサブタイプの有病率に基づき決定することができる。本開示は特に、対象が卵巣癌を有するか、またはそれに易罹患性であるかどうかを決定するための技術も提供する。例えば、一部の実施形態では、それを必要とする対象からの血液由来試料が基準閾値レベル、例えば、カットオフ値（例えば、本開示に従って決定されたとおりのもの）であるか、またはそれを超える標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞のレベルを示した場合に、上記対象を、卵巣癌を有するか、またはそれに易罹患性であると分類する。一部のそのような実施形態では、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）を、健康な女性対象（例えば、規定の年齢範囲の女性対象）、及び任意選択で、炎症状態（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、子宮内膜症など）を有する女性対象全体での対数正規分布及び目的の特異性（例えば、少なくとも９５％またはそれより高い特異性［例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれより高い特異性を含む］、例えば、一部の実施形態では、少なくとも９９．８％の特異性）を達成するために必要な標準偏差（ＳＤ）（例えば、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３、少なくとも３．１、少なくとも３．２、少なくとも３．３、少なくとも３．４、少なくとも３．５、少なくとも３．６またはそれより高いＳＤ）の数の選択に基づき、例えば、卵巣癌またはそのサブタイプの有病率に基づき決定することができる。一部のそのような実施形態では、目的の特異性及び／または感受性（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）が達成され得るように、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）を、正常な健康組織 対 卵巣癌試料における標的バイオマーカーシグネチャーの個々の標的バイオマーカー（複数可）の発現レベル（例えば、転写産物レベル）に基づき決定することができる。一部の実施形態では、基準閾値レベル（例えば、カットオフ値）は、例えば、卵巣癌ステージ及び／またはサブタイプ及び／または患者の特徴、例えば、患者の年齢、閉経状態、卵巣癌についてのリスク因子（例えば、遺伝的リスク 対 平均的リスク、生活歴関連危険因子）、症候性／無症候性状態、及びそれらの組合せに依存して変動し得る。
一部の実施形態では、それを必要とする対象からの血液由来試料が、基準閾値レベルと比較して、上昇したレベルの標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞を示す場合に、上記対象を、卵巣癌を有するか、またはそれに易罹患性であると分類する。一部の実施形態では、それを必要とする対象の血液由来試料が、基準閾値レベルと比較して、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上を含めて、少なくとも３０％またはそれより高い標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞のレベルを示す場合に、そのような対象を、卵巣癌を有するか、またはそれに易罹患性であると分類する。一部の実施形態では、それを必要とする対象の血液由来試料が、基準閾値レベルと比較して、例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも７５０倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上を含めて、少なくとも２倍またはそれより高い標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞のレベルを示す場合に、そのような対象を、卵巣癌を有するか、またはそれに易罹患性であると分類する。それを必要とする対象からの血液由来試料が基準閾値レベルと比較可能なレベル（例えば、１０～２０％内）を示す場合に、上記対象を、卵巣癌をおそらく有さないか、またはそれに易罹患性ではないと分類する。一部のそのような実施形態では、基準閾値レベルは、基準対象、例えば、非がん対象の集団からの比較可能な試料における標的バイオマーカーシグネチャーを発現する細胞外小胞のレベルに対応する。一部の実施形態では、例示的な非がん対象には、健康な女性対象（例えば、５５歳未満５５歳超などの、例えば、指定の年齢範囲の健康な女性対象）、非卵巣癌関連の健康上の疾患、障害、または状態を有する対象（例えば、肺癌、結腸直腸癌などの非卵巣癌を有する女性対象、または炎症性腸疾患もしくは障害の症状を有する女性対象を含む）、良性卵巣腫瘍（例えば、卵管内及び／または卵巣上で観察される良性腫瘤）を有する女性対象、及びそれらの組合せが含まれる。
ＩＶ．個々の細胞外小胞（ＥＶ）をプロファイルするための例示的な方法
一部の実施形態では、個々の細胞外小胞をプロファイルするためのアッセイ（例えば、単一のＥＶプロファイリングアッセイ）を、卵巣癌についての１つまたは複数の標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるバイオマーカーを検出するために使用することができる。例えば、一部の実施形態では、そのようなアッセイは、（ｉ）卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるマーカーを標的とすることによる捕捉アッセイと、（ｉｉ）卵巣癌についてのそのような標的バイオマーカーシグネチャーの少なくとも１つまたは複数の追加の提供されるマーカーについての検出アッセイとを含み得、その際、そのような捕捉アッセイを、そのような検出アッセイの前に実行する。
一部の実施形態では、捕捉アッセイを、それを必要とする対象の血液または血液由来試料（例えば、血漿試料）から腫瘍関連細胞外小胞（例えば、卵巣腫瘍関連細胞外小胞）を選択的に捕捉するために実行する。一部の実施形態では、捕捉アッセイを、ある特定のサイズ範囲、及び／またはある特定の特徴（複数可）の細胞外小胞、例えば、卵巣癌と関連する細胞外小胞を選択的に捕捉するために実行する。一部のそのような実施形態では、捕捉アッセイの前に、血液または血液由来試料を事前処理して、例えば、これに限定されないが、可溶性タンパク質及び干渉実体、例えば、細胞破片などを含む、非細胞外小胞を除去することができる。例えば、一部の実施形態では、細胞外小胞を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、対象の血液または血液由来試料から精製する。一部のそのような実施形態では、一部の実施形態では可溶性タンパク質及び他の干渉因子、例えば、細胞破片などの少なくとも９０％またはそれ以上（例えば、少なくとも９３％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上を含む）を除去することができるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を血液または血液由来試料から直接的に精製することができる。
一部の実施形態では、捕捉アッセイは、血液または血液由来試料を、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの少なくとも１つまたは複数の提供されるバイオマーカーに結合する標的捕捉部分を含む少なくとも１つの捕捉因子と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、捕捉アッセイを多重化してよく、これは、血液または血液由来試料を、捕捉因子のセットと接触させるステップを含み、その際、各捕捉因子は、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの別個の提供されるバイオマーカーに結合する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、標的捕捉部分は、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）を指向する。
一部の実施形態では、そのような標的捕捉部分を固体基材に固定化することができる。したがって、一部の実施形態では、捕捉アッセイにおいて使用される捕捉因子は、それにコンジュゲートした少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の標的捕捉部分を含む固体基材であるか、またはそれを含み、その際、各標的捕捉部分は、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチド（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）を指向する。固体基材を、細胞外小胞を捕捉するために適しており、かつ下流での取り扱い、処理、及び／または検出に干渉しない形態で得ることができる。例えば、一部の実施形態では、固体基材は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、固体基材は、表面であり得るか、またはそれを含み得る。例えば、一部の実施形態では、そのような表面は、アッセイチャンバーの捕捉表面（例えば、管、ウェル、マイクロウェル、プレート、フィルター、膜、マトリックスなどを含む）であり得る。一部の実施形態では、捕捉因子は、それにコンジュゲートした標的捕捉部分を含む磁気ビーズであるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、検出アッセイを、捕捉アッセイ（例えば、上記のとおりのもの）により捕捉される細胞外小胞において卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるバイオマーカー（例えば、捕捉アッセイにおいて標的化されるものとは異なるもの）を検出するために実行する。一部の実施形態では、検出アッセイは、免疫ＰＣＲを含み得る。一部の実施形態では、免疫ＰＣＲは、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの単一の提供されるバイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）を標的とする少なくとも１つのプローブを含み得る。一部の実施形態では、免疫ＰＣＲは、標的バイオマーカーシグネチャーの同じバイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）の異なるエピトープを指向する複数の（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれ以上）のプローブを含み得る。一部の実施形態では、免疫ＰＣＲは、本明細書に記載の異なる提供されるバイオマーカーをそれぞれ指向する複数（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれ以上）のプローブを含み得る。
一部の実施形態では、検出アッセイは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を含み得る。一部の実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲは、本明細書に記載の単一の提供されるバイオマーカーを標的とする少なくとも１つのプライマー／プローブセットを含み得る。一部の実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲは、複数（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれ以上）のプライマー／プローブセットを含み得、その際、各セットはそれぞれ、本明細書に記載の異なる提供されるバイオマーカーを指向する。
一部の実施形態では、例えば、細胞外小胞（例えば、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを発現する捕捉細胞外小胞）内での卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるバイオマーカーの共局在を決定するために、検出アッセイは、近接－ライゲーション－免疫定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｌｉｑ－ＰＣＲ）を含み得る。
一部の実施形態では、検出アッセイは、一部では、個々の細胞外小胞における標的バイオマーカーシグネチャーの相互作用及び／または共局在に基づく、本出願人により開発され、両方とも２０２０年２月２８日に出願され、「標的実体検出のためのシステム、組成物、及び方法」と標題された米国特許出願第１６／８０５，６３７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０５２９（両方ともそれらの全体が参照により本明細書に援用される「６３７出願」及び「５２９出願」）に記載されている標的実体検出システム（例えば、「提供される標的実体検出システム」と標題されたセクションに記載のとおりのもの）を使用する。例えば、そのような標的実体検出システム（「６３７出願」及び「５２９出願」に記載されており、ならびに「提供される標的実体検出システム及びそれを含む方法」と標題されたセクションにもさらに下記されているとおりのもの）は、試料（例えば、生物学的、環境的、または他の試料）において、一部の実施形態では、少なくとも１つまたはそれ以上の（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上の）標的（例えば、分子標的）を含む目的の実体（例えば、目的の生物学的または化学的実体、例えば、細胞外小胞または分析物）を、単一の実体レベルで検出することができる。当業者は、本開示を読むことで、提供される標的実体検出システムが、例えば、卵巣癌の検出のためを含めて、広範囲の様々な適用及び／または目的のために有用であることを認めるであろう。例えば、一部の実施形態では、提供される標的実体検出システムは、医学的用途及び／または目的に有用であり得る。一部の実施形態では、提供される標的実体検出システムは、疾患または状態（例えば、卵巣癌）について個体（例えば、一部の実施形態では、無症候性個体であってよいか、または一部の実施形態では、卵巣癌と関連する１つまたは複数の症状を経験している個体であってよいか、または一部の実施形態では、卵巣癌についてリスクを有する個体、例えば、卵巣癌についての遺伝的リスク及び／または生活歴関連危険因子を有する個体、または閉経後個体であってよい個体）をスクリーニングする（例えば、定期的にスクリーニングする）ために有用であり得る。一部の実施形態では、提供される標的実体検出システムは、異なる種類のがんについて（例えば、そのうちの１つが卵巣癌であり得る複数の異なるがんについて）個体（例えば、一部の実施形態では、無症候性個体であってよいか、または一部の実施形態では、卵巣癌と関連する１つまたは複数の症状を経験している個体であってよいか、または一部の実施形態では、卵巣癌についてリスクを有する個体、例えば、卵巣癌についての遺伝的リスク及び／または生活歴関連危険因子を有する個体、または閉経後個体であってよい個体）をスクリーニングする（例えば、定期的にスクリーニングする）ために有用であり得る。一部の実施形態では、提供される標的実体検出システムは、無症候性個体を含むか、またはその個体からなる集団に適用される場合にも、有効である（例えば、十分に高い感受性及び／または低率の擬陽性及び／または偽陰性結果により）。一部の実施形態では、提供される標的実体検出システムは、コンパニオン診断として、疾患処置（例えば、卵巣癌の処置）と併せて有用であり得る。
一部の実施形態では、細胞外小胞において、例えば、捕捉アッセイ（例えば、上記のとおりのもの）により捕捉されるものにおいて、卵巣癌についての１つまたは複数の標的バイオマーカーシグネチャー（例えば、捕捉アッセイにおいて標的化されるものとは異なるもの）の複数のバイオマーカー（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）を検出するために、複数（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）の検出アッセイを実行することができる。例えば、一部の実施形態では、複数の検出アッセイは、（ｉ）提供される標的実体検出システムまたは「６３７出願」及び「５２９出願」に記載のシステムと；（ｉｉ）免疫ＰＣＲとを含み得る。一部の実施形態では、複数の検出アッセイは、（ｉ）提供される標的実体検出システムまたは「６３７出願」及び「５２９出願」に記載のシステムと；（ｉｉ）ＲＴ－ＰＣＲとを含み得る。
Ｖ．提供される標的実体検出システム及びそれを含む方法
一部の実施形態では、卵巣癌についての１つまたは複数の標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるバイオマーカーのための検出アッセイにおいて有用であり得る標的実体検出システムは、それぞれ特異的標的（例えば、標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）のための複数の検出プローブを含む。一部の実施形態では、そのようなシステムは、それぞれ特異的標的（例えば、標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）のための少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、またはそれ以上の検出プローブを含み得る。一部の実施形態では、そのようなシステムは、それぞれ特異的標的（例えば、標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）のための２～５０の検出プローブを含み得る。一部の実施形態では、そのようなシステムは、それぞれ特異的標的（例えば、標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）のための２～３０の検出プローブを含み得る。一部の実施形態では、そのようなシステムは、それぞれ特異的標的（例えば、標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）のための２～２５の検出プローブを含み得る。一部の実施形態では、そのようなシステムは、それぞれ特異的標的（例えば、標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）のための５～３０の検出プローブを含み得る。一部の実施形態では、そのようなシステムは、それぞれ特異的標的（例えば、標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）のための５～２５の検出プローブを含み得る。一部の実施形態では、セット中のそのような検出プローブのうちの少なくとも２つは、標的バイオマーカーシグネチャーの同じバイオマーカーを指向し得る。一部の実施形態では、セット中のそのような検出プローブのうちの少なくとも２つは、標的バイオマーカーシグネチャーの同じバイオマーカーの同じエピトープを指向し得る。一部の実施形態では、セット中のそのような検出プローブのうちの少なくとも２つは、標的バイオマーカーシグネチャーの同じバイオマーカーの異なるエピトープを指向し得る。
一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システムにおいて使用するために適した検出プローブを、単一の疾患または状態、例えば、卵巣癌を検出するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システムにおいて使用するために適した検出プローブは、例えば、そのうちの１つが卵巣癌である少なくとも２つまたはそれ以上の疾患または状態の検出を可能にし得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システムにおいて使用するために適した検出プローブは、例えば、これに限定されないが、高異型度漿液性卵巣癌、類子宮内膜卵巣癌、明細胞卵巣癌、低異型度漿液性卵巣癌、及び／または粘液性卵巣癌を含む、ある特定のサブタイプの卵巣癌の検出を可能にし得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システムにおいて使用するために適した検出プローブは、例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及び／またはステージＩＶを含む、ある特定のステージの卵巣癌の検出を可能にし得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システムにおいて使用するために適した検出プローブは、複数（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上）のセットの検出プローブを含み得、その際、それぞれのセットは、異なる疾患または異なる種類の疾患もしくは状態の検出を指向する。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システムにおいて使用するために適した検出プローブは、複数（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上）のセットの検出プローブを含み得、その際、一部の実施形態では、それぞれのセットは、そのうちの１つが卵巣癌である異なる種類のがんの検出を指向するか、または一部の実施形態では、それぞれのセットは、様々なサブタイプ及び／またはステージの卵巣癌の検出を指向する。
検出プローブ
一部の実施形態では、本明細書において提供及び／または利用される検出プローブは、標的結合部分と、その標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインとを含む。一部の実施形態では、標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインは、二本鎖部分と、オリゴヌクレオチドドメインの少なくとも一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含み得る。一部の実施形態では、標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインは、二本鎖部分と、オリゴヌクレオチドドメインの各末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含み得る。一部の実施形態では、検出プローブは、近接－ライゲーション－免疫定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｌｉｑ－ＰＣＲ）に適し得て、ｐｌｉｑ－ＰＣＲ検出プローブと称され得る。
Ａ．標的結合部分
オリゴヌクレオチドドメインにカップリングしている標的結合部分は、標的（例えば、標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー；当業者は、標的バイオマーカーが特定の形態または部分／構成成分である場合、標的結合部分はその形態または部分／構成成分に特異的に結合することは分かるであろう）に特異的に結合する実体または作用因子である。一部の実施形態では、標的結合部分は、標的（例えば、分子標的）について少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、またはそれ未満の結合親和性（例えば、解離定数により測定されるとおりのもの）を有し得る。当業者は、場合によっては、結合親和性（例えば、解離定数により測定されるとおりのもの）が、２つの分子間の非共有結合分子間相互作用、例えば、水素結合、静電相互作用、疎水性及びファンデルワールス力により影響を受け得ることが分かるであろう。別法では、または加えて、リガンドと、その標的分子との間の結合親和性は、他の分子の存在により影響を受け得る。当業者は、例えば、これに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ゲル－シフトアッセイ、プルダウンアッセイ、平衡透析法、分析用超遠心分離、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法、グレーティング結合干渉法、及び分光学的アッセイを含む、本開示に従って結合親和性及び／または解離定数を測定するための様々な技術を熟知しているであろう。
一部の実施形態では、標的結合部分は、任意の化学群の作用因子、例えば、炭水化物、核酸、脂質、金属、ポリペプチド、小分子など、及び／またはそれらの組合せであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、標的結合部分は、抗体因子及び／またはアプタマーであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、標的結合部分は、抗体因子、例えば、標的またはそのエピトープに特異的に結合する抗体因子、例えば、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカーまたはそのエピトープであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、提供されるバイオマーカーのための標的結合部分は、市場で入手可能であり得る。一部の実施形態では、提供されるバイオマーカーのための標的結合部分は、本明細書に記載のとおりのアッセイにおいて使用する目的のために設計及び作製することができる。一部の実施形態では、標的結合部分は、アプタマー、例えば、標的またはそのエピトープ、例えば、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカーまたはそのエピトープに特異的に結合するアプタマーであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、標的結合部分は、標的またはそのエピトープ、例えば、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカーまたはそのエピトープに特異的に結合するアフィマー分子であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのようなアフィマー分子は、対応する抗体の特異性及び親和性と同様の特異性及び親和性で、標的またはそのエピトープ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）に結合するペプチドまたはポリペプチドであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、標的は、卵巣癌と関連する標的であり得るか、またはそれを含み得る。例えば、一部のそのような実施形態では、がん関連標的は、１つよりも多いがん（すなわち、少なくとも２つまたはそれ以上のがん）と関連する標的であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、がん関連標的は、典型的にはがんと関連する標的であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、がん関連標的は、特異的組織のがん、例えば、卵巣癌と関連する標的であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、がん関連標的は、特定のがん、例えば、特定の卵巣癌に特異的である標的であり得るか、またはそれを含み得る。
一部の実施形態では、標的結合部分は、生物学的実体（例えば、これに限定されないが、細胞及び／または細胞外小胞を含む）に存在する標的を認識し、それに特異的に結合する。例えば、一部の実施形態では、標的結合部分は、腫瘍関連抗原またはそのエピトープを認識し、それに特異的に結合し得る。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、例えば、皮膚癌、脳癌（を含む、例えば、神経膠芽腫）、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、及び皮膚癌などのがんと関連する抗原であり得るか、またはそれらを含み得る。一部の実施形態では、標的結合部分は、卵巣癌（例えば、高異型度漿液性卵巣癌、類子宮内膜卵巣癌、明細胞卵巣癌、低異型度漿液性卵巣癌、または粘液性卵巣癌）と関連する腫瘍抗原を認識し得る。一部の実施形態では、標的結合部分は、高異型度漿液性卵巣癌と関連する腫瘍抗原を認識し得る。
一部の実施形態では、標的結合部分は、細胞内標的、例えば、提供される小胞内タンパク質またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に特異的に結合し得る。一部の実施形態では、標的結合部分は、細胞外小胞上／内に存在する表面標的、例えば、卵巣癌関連細胞外小胞上に存在する膜結合ポリペプチドに特異的に結合し得る。
一部の実施形態では、標的結合部分は、特異的状態または疾患（例えば、がん）のためのバイオマーカーを指向し、そのバイオマーカーは、例えば、そのようなバイオマーカー（例えば、予測バイオマーカー）を同定するために、患者生検及び／または患者データの集団またはライブラリ（例えば、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、またはそれ以上）を分析することにより決定されるか、または決定されている。
一部の実施形態では、関連バイオマーカーは、例えば、データ解析を介して同定及び／または特徴付けられたものであり得る。一部の実施形態では、疾患または状態（例えば、がん）に高度に特異的であるバイオマーカー（例えば、予測マーカー）を同定するために、例えば、多様なセットのデータ（例えば、一部の実施形態では、バルクＲＮＡシーケンシング、単一細胞ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）シーケンシング、質量分析法、組織診、翻訳後修飾データ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ実験データのうちの１つまたは複数を含む）を、機械学習及び／または計算モデルを介して解析することができる。
一部の実施形態では、標的結合部分は、組織特異的標的、例えば、特異的組織、例えば、脳、乳房、結腸、卵巣及び／または女性生殖系と関連する他の組織、膵臓、前立腺及び／または男性生殖系と関連する他の組織、肝臓、肺、及び皮膚などと関連する標的を指向する。一部の実施形態では、そのような組織特異的標的は、正常な健康な組織及び／または罹患組織、例えば腫瘍と関連し得る。一部の実施形態では、標的結合部分は、対象の正常で健康な状態と特異的に関連する標的を指向する。
一部の実施形態では、複数の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）において利用される個々の標的結合実体は、異なる標的を指向する。一部の実施形態では、そのような異なる標的は、異なるマーカータンパク質またはポリペプチドであってよい。一部の実施形態では、そのような異なる標的は、同じマーカータンパク質またはポリペプチドの異なるエピトープであり得る。一部の実施形態では、複数の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）において利用される２つまたはそれ以上の個々の標的結合実体は、同じ標的を指向し得る。
一部の実施形態では、卵巣癌を検出するために複数の検出プローブにおいて利用される個々の標的結合実体は、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャー（例えば、上の「卵巣癌を検出するために提供されるバイオマーカー及び／または標的バイオマーカーシグネチャー」と標題されたセクションに記載されているとおりのもの）の異なる標的バイオマーカーを指向し得る。例えば、一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、それぞれＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１を指向するそれらの標的結合実体を有し得る。一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、それぞれＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ６を指向するそれらの標的結合実体を有し得る。一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、それぞれＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ３を指向するそれらの標的結合実体を有し得る。一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、それぞれＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ６を指向するそれらの標的結合実体を有し得る。一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、それぞれＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ３を指向するそれらの標的結合実体を有し得る。一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、それぞれＳＬＣ３４Ａ２及びＣＬＤＮ３を指向するそれらの標的結合実体を有し得る。一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、それぞれＳＬＣ３４Ａ２及びＣＬＤＮ３を指向するそれらの標的結合実体を有し得る。
一部の実施形態では、卵巣癌を検出するために複数の検出プローブにおいて利用される個々の標的結合部分は、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの同じ標的バイオマーカーを指向し得る（例えば、上の「卵巣癌を検出するために提供されるバイオマーカー及び／または標的バイオマーカーシグネチャー」と標題されたセクションに記載されているとおりのもの）。一部の実施形態では、そのような標的結合実体は、卵巣癌のためのそのような標的バイオマーカーシグネチャーの同じ標的バイオマーカーの同じか、または異なるエピトープを指向し得る。例えば、一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、それぞれＭＵＣ１６を（例えば、そのインタクトな膜貫通タンパク質形態において、及び／または同じエピトープで、または異なるエピトープで）指向するそれらの標的結合実体を有し得る。一部の実施形態では、複数のうちの少なくとも２つの検出プローブは、ＦＯＬＲ１ペプチドを（例えば、同じエピトープで、または異なるエピトープで）それぞれ指向するそれらの標的結合実体を有し得る。
Ｂ．オリゴヌクレオチドドメイン
一部の実施形態では、本開示により使用するためのオリゴヌクレオチドドメイン（例えば、標的結合部分にカップリングしていてよい）は、二本鎖部分と、オリゴヌクレオチドドメインの一方または両方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含み得る。オリゴヌクレオチドドメインが各末端から伸長している一本鎖オーバーハングを含む一部の実施形態では、一本鎖オーバーハングは、二本鎖部分の異なる鎖から伸長している。オリゴヌクレオチドドメインがそのオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングを含む一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの他方の末端は、平滑末端であり得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、ワトソン－クリックタイプまたは類似の塩基対合相互作用、及びそれらの任意の組合せに参加し得るリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド残基を含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、ＤＮＡであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、少なくとも部分的に、例えば、検出される目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）の物理的特徴、及び／または検出される目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）における分子標的の選択及び局在により決定される長さを有し得る。一部の実施形態では、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブが目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）に結合した場合に、第１の一本鎖オーバーハング及び第２の一本鎖オーバーハングが、一本鎖オーバーハング間の相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）を可能にするために十分に近接しているような長さを有するように、検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインを構成する。例えば、目的の実体（例えば、生物学的実体）が細胞外小胞（例えば、エクソソーム）である場合、検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインはそれぞれ独立に、それらのそれぞれの一本鎖オーバーハングが、対応する検出プローブが同じ細胞外小胞に結合した場合に相互にアニールする、または相互作用するほど十分に近接するような長さを有し得る。例えば、一部の実施形態では、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を検出する際に使用するための検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインはそれぞれ独立に、約２０ｎｍ～約２００ｎｍ、約４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４０ｎｍ～約３００ｎｍ、または約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）を検出する際に使用するための検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインはそれぞれ独立に、約２０ｎｍ～約２００ｎｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、セット内の検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインの長さをそれぞれ独立に変化させて、目的の同じ実体に同時に結合した場合にそれらが相互を見い出す確率を上昇させる、及び／または最大化することができる。
したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される技術において使用するためのオリゴヌクレオチドドメインは、約２０～約１０００ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、約３０～約１０００ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、約３０～約５００ヌクレオチド、約３０～約２５０ヌクレオチド、約３０～約２００ヌクレオチド、約３０～約１５０ヌクレオチド、約４０～約１５０ヌクレオチド、約４０～約１２５ヌクレオチド、約４０～約１００ヌクレオチド、約４０～６０ヌクレオチド、約５０～約９０ヌクレオチド、約５０～約８０ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、例えば、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００ヌクレオチドまたはそれ以上を含めて、少なくとも２０またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、例えば、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下のヌクレオチド、２０以下のヌクレオチドまたはそれ未満を含めて、１０００ヌクレオチド以下またはそれ未満の長さを有し得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、約２０ｎｍ～約５００ｎｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、約２０ｎｍ～約４００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、または約４０ｎｍ～約６０ｎｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、例えば、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約４００ｎｍまたはそれ以上を含めて、少なくとも約２０ｎｍまたはそれ以上の長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインは、例えば、９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下またはそれ未満を含めて、１０００ｎｍ以下またはそれ未満の長さを有し得る。
本明細書において提供される技術において使用するためのオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、約３０～約１０００ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、約３０～約５００ヌクレオチド、約３０～約２５０ヌクレオチド、約３０～約２００ヌクレオチド、約３０～約１５０ヌクレオチド、約４０～約１５０ヌクレオチド、約４０～約１２５ヌクレオチド、約４０～約１００ヌクレオチド、約５０～約９０ヌクレオチド、約５０～約８０ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、例えば、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを含めて、少なくとも３０またはそれ以上のヌクレオチドを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、例えば、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下のヌクレオチドまたはそれ未満を含めて、１０００ヌクレオチド以下またはそれ未満の長さを有し得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、約２０ｎｍ～約５００ｎｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、約２０ｎｍ～約４００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、または約４０ｎｍ～約６０ｎｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、例えば、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約４００ｎｍまたはそれ以上を含めて、少なくとも約２０ｎｍまたはそれ以上の長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、例えば、９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下またはそれ未満を含めて、１０００ｎｍ以下またはそれ未満の長さを有し得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、検出プローブが、それぞれの相補的一本鎖オーバーハング（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）のハイブリダイゼーションを介して相互に連結した場合に、それぞれのオリゴヌクレオチドドメインの合計長さ（もしあるならば、標的結合部分をオリゴヌクレオチドドメインに結合させるリンカーを含む）が、それぞれの標的結合実体が目的の実体（例えば、細胞外小胞）のすべての特徴的な長さ（例えば、直径）を実質的にカバーすることを可能にするほど十分に長いことにおいて特徴づけられる。例えば、細胞外小胞が目的の実体である一部の実施形態では、検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインの合計長さ（もしあるならば、標的結合部分をオリゴヌクレオチドドメインに結合させるリンカーを含む）は、検出プローブが相互に十分に連結している場合、およそ５０～２００ｎｍであり得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、プライマーのための結合部位を含み得る。一部の実施形態では、プライマーのためのそのような結合部位は、ミスプライミングまたはプライマー二量体の可能性を低下させる、または最小化するように設計されているヌクレオチド配列を含み得る。そのような特徴は、一部の実施形態では、検出限界を低下させて、本明細書において提供されるシステムの感受性を上昇させることができる。一部の実施形態では、プライマーのための結合部位は、別のプライマー結合部位と類似のアニーリング温度を有するように設計されているヌクレオチド配列を含み得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、対象（例えば、ヒト対象）のゲノム及び／または遺伝子転写産物（例えば、ゲノムＤＮＡ及び／またはＲＮＡ、例えば遺伝子のｍＲＮＡ）と典型的に関連する核酸配列（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ配列）とのオーバーラップを減少させる、または最小化するように設計されているヌクレオチド配列を含み得る。そのような特徴は、一部の実施形態では、検出中に試料中に（例えば、混入物として）存在し得る対象の何らかのゲノムＤＮＡ及び／またはｍＲＮＡ転写産物の干渉を減少させる、または最小化することができる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、自己二量体、ホモ二量体、またはヘテロ二量体の形成を減少させる、または最小化するように設計されているヌクレオチド配列を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書において提供される技術において使用するためのオリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、約２～約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、約２～約１５ヌクレオチド、約２～約１０ヌクレオチド、約３～約２０ヌクレオチド、約３～約１５ヌクレオチド、約３～約１０ヌクレオチドの長さを有し得る。一部の実施形態では、一本鎖オーバーハングは、少なくとも１～５ヌクレオチド長を有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０ヌクレオチド、またはそれ以上を含めて、少なくとも２またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、例えば、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下のヌクレオチドまたはそれ未満を含めて、２０ヌクレオチド以下またはそれ未満の長さを有し得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、約１ｎｍ～約１０ｎｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、約１ｎｍ～約５ｎｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、例えば、少なくとも約１ｎｍ、少なくとも約１．５ｎｍ、少なくとも約２ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍまたはそれ以上を含めて、少なくとも約０．５ｎｍまたはそれ以上の長さを有し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、例えば、９ｎｍ以下、８ｎｍ以下、７ｎｍ以下、６ｎｍ以下、５ｎｍ以下、４ｎｍ以下、３ｎｍ以下、２ｎｍ以下、１ｎｍ以下またはそれ未満を含めて、１０ｎｍ以下またはそれ未満の長さを有し得る。
オリゴヌクレオチドドメインの一本鎖オーバーハングは、第２の検出プローブの一本鎖オーバーハングの少なくとも一部分と相補的であるヌクレオチド配列を含み、相補的一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションを介して、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブを含む二本鎖複合体が形成され得るように設計されている。一部の実施形態では、相補的一本鎖オーバーハングのヌクレオチド配列は、適切な核酸リガーゼの存在下での最適なライゲーション効率のために選択される。一部の実施形態では、一本鎖オーバーハングは、目的の特異的な核酸リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４またはＴ７リガーゼ）による効率的なライゲーションのために優先的に選択されるヌクレオチド配列を有する。例えば、そのような一本鎖オーバーハングは、例えば、本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用されるＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、“Ｅｎｚｙｍｅ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｓｅｗｉｎｇ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ” Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１７７２２（２０１５）に記載されているとおり、ＧＡＧＴのヌクレオチド配列を有し得る。
２つの検出プローブが、それぞれの相補的一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションを介して一緒にカップリングしている場合、ハイブリダイズした一本鎖オーバーハングを含むそれらのそれぞれのオリゴヌクレオチドドメインは、一部の実施形態では、目的の実体（例えば、生物学的実体）の特徴的な長さ（例えば、直径）の約９０％～１１０％または約９５％～１０５％の合計長さを有し得る。例えば、生物学的実体がエクソソームである一部の実施形態では、上記合計長さは、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７５ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約８０ｎｍ～約１２０ｎｍであり得る。
Ｃ．標的結合部分とオリゴヌクレオチドドメインとの間のカップリング
オリゴヌクレオチドドメイン及び標的結合部分を、共有結合により、及び／または非共有結合会合（例えば、タンパク質間相互作用、例えば、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用及び／またはイオン相互作用など）により、検出プローブにおいて一緒にカップリングさせることができる。一部の実施形態では、本開示に従って使用するために適した検出プローブは、標的結合部分及びオリゴヌクレオチドドメインを含むコンジュゲート分子であり、その際、それらの２つの構成成分は典型的には、例えば、直接的に結合により、または間接的に１つもしくは複数のリンカーにより相互に共有結合性にカップリングしている。一部の実施形態では、標的結合部分は、共有結合（例えば、直接的に結合により、または間接的に１つもしくは複数のリンカーにより）、及び／または非共有結合性会合（例えば、タンパク質間相互作用、例えば、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用及び／またはイオン相互作用など）により、オリゴヌクレオチドドメインの２本の鎖のうちの一方にカップリングしている。
リンカーを用いる場合、一部の実施形態では、選択されたリンカーを介してオリゴヌクレオチドドメインの１本または両方の鎖への標的結合部分の共有結合が得られるように、リンカーを選択する。一部の実施形態では、標的結合部分とオリゴヌクレオチドドメインの１本または両方の鎖とで生じる共有結合が、その標的についての標的結合部分の所望の結合親和性を維持するように、リンカーを選択する。一部の実施形態では、その標的についての標的結合部分の結合特異性を増強するように、リンカーを選択する。目的のリンカー及び／またはコンジュゲーション方法は、標的結合部分、例えば、そのサイズ及び／または電荷に依存して広く変化し得る。一部の実施形態では、リンカーは、生物学的に不活性である。
標的結合部分をオリゴヌクレオチドにカップリングするための様々なリンカー及び／または方法が、当業者に公知であり、本開示に従って使用することができる。一部の実施形態では、リンカーは、スペーサー基をいずれの末端にも、標的結合部分に共有結合し得る反応性官能基と共に含み得る。リンカーにおいて使用することができるスペーサー基の例には、これに限定されないが、脂肪族及び不飽和炭化水素鎖（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、またはそれ以上の長さを含む）、酸素などのヘテロ原子を含有するスペーサー（例えば、エーテル、例えば、ポリエチレングリコール）または窒素（ポリアミン）、ペプチド、炭水化物、ヘテロ原子を含有してよい環式または非環式システムが含まれる。共有結合を促進する反応性官能基の非限定的例には、求核性官能基（例えば、アミン、アルコール、チオール、及び／またはヒドラジド）、求電子性官能基（例えば、アルデヒド、エステル、ビニルケトン、エポキシド、イソシアナート、及び／またはマレイミド）、付加環化反応、ジスルフィド結合の形成、または金属への結合が可能な官能基が含まれる。一部の実施形態では、例示的な反応性官能基は、これに限定されないが、第一級及び第二級アミン、ヒドロキサム酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）－ＮＨＳエステル、アジド－ＮＨＳエステル、アジド酢酸ＮＨＳエステル、プロパルギル－ＮＨＳエステル、トランス－シクロオクテン－ＮＨＳエステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルボナート、オキシカルボニルイミダゾール、ニトロフェニルエステル、トリフルオロエチルエステル、グリシジルエーテル、ビニルスルホン、マレイミド、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ－［４－（ｐ－アジドサリチルアミノ）ブチル］－３’－［２’－ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス－スルホスクシンイミジルスベラート、ジメチルアジピミダート、ジスクシンイミジルタルトラート、Ｎ－マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾアート、Ｎ－スクシンイミジル［４－アジドフェニル］－１，３’－ジチオプロピオナート、Ｎ－スクシンイミジル［４－ヨードアセチル］アミノベンゾアート、グルタルアルデヒド、及びスクシンイミジル４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシラート、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）、ならびにその任意の組合せ。
一部の実施形態では、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル化学を使用して、標的結合部分（例えば、標的結合抗体因子）をオリゴヌクレオチドドメインの一方または両方の鎖にカップリングまたはコンジュゲートする。ＮＨＳエステルは遊離の第一級アミンと反応して、安定な共有結合をもたらす。一部の実施形態では、第一級アミノ基は、スペーサー基、例えば、これに限定されないが、脂肪族及び不飽和炭化水素鎖（例えば、Ｃ６またはＣ１２スペーサー基）と共に、末端に位置し得る。
一部の実施形態では、例えば、コンジュゲートされた標的結合部分（例えば、コンジュゲートされた標的結合抗体因子）の結合特異性を増強するために、当技術分野で公知の部位特異的コンジュゲーション方法を使用して、標的結合部分（例えば、標的結合抗体因子）をオリゴヌクレオチドドメインの一方または両方の鎖にカップリングまたはコンジュゲートすることができる。部位特異的コンジュゲーション方法の例には、これに限定されないが、ジスルフィド結合、Ｃ末端、炭水化物残基またはグリカン、及び／または非天然アミノ酸ラベリングを介してのカップリングまたはコンジュゲーションが含まれる。標的結合部分が抗体因子またはペプチドアプタマーであるか、またはそれを含む一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、標的結合部分に存在する少なくとも１個またはそれ以上の遊離アミン基を介して、標的結合部分にカップリングまたはコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、標的結合部分に存在する少なくとも１個またはそれ以上の反応性チオール基を介して、抗体因子またはペプチドアプタマーであるか、またはそれを含む標的結合部分にカップリングまたはコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、標的結合部分に存在する少なくとも１個またはそれ以上の炭水化物残基を介して、抗体因子またはペプチドアプタマーであるか、またはそれを含む標的結合部分にカップリングまたはコンジュゲートすることができる。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上）を、標的結合部分（例えば、標的結合抗体因子）にカップリングまたはコンジュゲートすることができる。
例示的な二重標的実体検出システム
一部の実施形態では、本開示により提供されるとおりの（及び、例えば、卵巣癌と関連する細胞外小胞を、例えば、単一実体レベルで検出するために有用な）標的実体検出システムは、提供される標的バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）のための第１の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）の第１の集団、及び提供される標的バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）のための第２の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）の第２の集団を含み得る。一部の実施形態では、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブは、同じ提供される標的バイオマーカーを指向する。一部の実施形態では、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブは、異なる提供される標的バイオマーカーを指向する。
図２は、目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を、単一の実体レベルで検出するための例示的な二重標的実体検出システムを図示しており、これは、（ｉ）その発現レベルが、同じ標的（例えば、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）の２つの分子が近接して見い出されるほど十分に高い、少なくとも１つの標的（例えば、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）、または（ｉｉ）少なくとも２つまたはそれ以上の別個の標的（例えば、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）を含む。第１の検出プローブは、第１の標的結合部分（例えば、標的１、例えば標的がんマーカー１を指向）と、第１の標的結合部分にカップリングしている第１のオリゴヌクレオチドドメインとを含み、その際、第１のオリゴヌクレオチドドメインは、第１の二本鎖部分と、第１のオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している第１の一本鎖オーバーハングとを含む。図２に示されているとおり、第１のオリゴヌクレオチドドメインは、長鎖（鎖３）及び短鎖（鎖１）のハイブリダイゼーションから生じ得て、それにより、二本鎖部分と、一方の末端の一本鎖オーバーハングとを形成している。一部の実施形態では、第１の標的結合部分（例えば、標的がんマーカー１を指向）を、第１のオリゴヌクレオチドドメインの鎖（例えば、鎖１）の５’末端または３’末端にカップリングする（例えば、共有結合性にカップリングする）。一部の実施形態では、第１の標的結合部分にカップリングしている鎖の５’末端または３’末端をリンカー（例えば、スペーサー基を含むか、または含まない本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）で修飾することができる。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン（例えば、鎖３）の別の鎖の５’末端は、遊離リン酸基を有する。
図２に図示されている実施形態では、第２の検出プローブは、第２の標的結合部分（例えば、標的がんマーカー２を指向）と、第２の標的結合部分にカップリングした第２のオリゴヌクレオチドドメインとを含み、その際、第２のオリゴヌクレオチドドメインは、第２の二本鎖部分と、第２のオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している第２の一本鎖オーバーハングとを含む。図２に示されているとおり、第２のオリゴヌクレオチドドメインは、長鎖（鎖４）及び短鎖（鎖２）のハイブリダイゼーションから生じ得て、それにより、二本鎖部分及び一方の末端の一本鎖オーバーハングを形成している。一部の実施形態では、第２の標的結合部分（例えば、標的がんマーカー２を指向）を、第２のオリゴヌクレオチドドメインの鎖（例えば、鎖２）の５’末端にカップリングする（例えば、共有結合性にカップリングする）。一部の実施形態では、第２の標的結合部分にカップリングしている鎖の５’末端は、リンカー（例えば、スペーサー基を含むか、または含まない本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）で修飾されてよい。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドドメインの別の鎖（例えば、鎖４）の５’末端は、遊離リン酸基を有する。
第１の一本鎖オーバーハング及び第２の一本鎖オーバーハングの少なくとも一部分は、相互に相補的であって、それらが、十分に近接している場合に、例えば、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブが同じ目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）に同時に結合した場合に、ハイブリダイズして、二本鎖複合体を形成し得るようになっている。一部の実施形態では、第１の一本鎖オーバーハング及び第２の一本鎖オーバーハングは同じ長さを有して、それらがハイブリダイズして二本鎖複合体を形成した場合に、それらのそれぞれのオリゴヌクレオチドドメイン間にギャップ（ライゲートするためのニックを除いて）が存在せず、それぞれ個々の標的結合部分が、二本鎖複合体の反対側の末端に位置するようになっている。例えば、一部の実施形態では、ライゲーションが生じる前に、二本鎖複合体は形成しており、その際、上記二本鎖複合体は、それらのそれぞれの一本鎖オーバーハング（例えば、４ヌクレオチド長を有する）の直接的なハイブリダイゼーションを介して相互にカップリングしている第１の検出プローブ及び第２の検出プローブを含み、それぞれ個々の標的結合部分（例えば、それぞれ標的がんマーカー１及び標的がんマーカー２を指向）は、二本鎖複合体の反対側の末端に存在する。そのような実施形態では、二本鎖複合体の両方の鎖（それぞれのオリゴヌクレオチドドメイン間にニックを含む）は、例えば、増幅及び検出のためにライゲート可能である。一部の実施形態では、二本鎖複合体は（例えば、ライゲーションが起こる前に）、目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を含み得、その際、第１の標的結合部分（例えば、標的がんマーカー１を指向する）及び第２の標的結合部分（例えば、標的がんマーカー２を指向する）が目的の実体に同時に結合する。
卵巣癌を検出するための二重標的実体検出システムの一部の実施形態では、第１の検出プローブの第１の標的結合部分は、第１の標的表面タンパク質バイオマーカー（例えば、「卵巣癌を検出するために提供されるバイオマーカー及び／または標的バイオマーカーシグネチャー」と標題されたセクションにおいて提供されているもの）を指向し得る一方で、第２の検出プローブの第２の標的結合部分は、第２の標的表面タンパク質バイオマーカー（例えば、「卵巣癌を検出するために提供されるバイオマーカー及び／または標的バイオマーカーシグネチャー」と標題されたセクションにおいて提供されているもの）を指向し得る。一部の実施形態では、第１の検出プローブの第１の標的結合部分は、第１の標的小胞内タンパク質バイオマーカー（例えば、「卵巣癌を検出するために提供されるバイオマーカー及び／または標的バイオマーカーシグネチャー」と標題されたセクションにおいて提供されているもの）を指向し得る一方で、第２の検出プローブの第２の標的結合部分は、第２の標的小胞内タンパク質バイオマーカー（例えば、「卵巣癌を検出するために提供されるバイオマーカー及び／または標的バイオマーカーシグネチャー」と標題されたセクションにおいて提供されているもの）を指向し得る。一部の実施形態では、第１の標的結合部分及び第２の標的結合部分は、同じ標的表面タンパク質バイオマーカーまたは同じ標的小胞内タンパク質バイオマーカーの同じ、または異なるエピトープを指向し得る。一部の実施形態では、第１の標的結合部分及び第２の標的結合部分は、異なる標的表面タンパク質バイオマーカーまたは異なる標的小胞内タンパク質バイオマーカーを指向し得る。
卵巣癌を検出するための二重標的実体検出システムの一部の実施形態では、第１の検出プローブは、第１のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＭＵＣ１６（例えば、インタクトな膜貫通タンパク質形態で）を指向する第１の標的結合部分を含む一方で；第２の検出プローブは、第２のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＭＵＣ１６（例えば、インタクトな膜貫通タンパク質形態で）を指向する第２の標的結合部分を含む。一部のそのような実施形態では、第１の標的結合部分及び第２の標的結合部分は、ＭＵＣ１６（例えば、インタクトな膜貫通タンパク質形態で）の同じか、または異なるエピトープ（複数可）を指向し得る。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、同じであってよい。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、異なってよい。
卵巣癌を検出するための二重標的実体検出システムの一部の実施形態では、第１の検出プローブは、第１のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する第１の標的結合部分を含む一方で；第２の検出プローブは、第２のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する第２の標的結合部分を含む。一部のそのような実施形態では、第１の標的結合部分及び第２の標的結合部分は、ＦＯＬＲ１ポリペプチドの同じか、または異なるエピトープ（複数可）を指向し得る。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、同じであってよい。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、異なってよい。
卵巣癌を検出するための二重標的実体検出システムの一部の実施形態では、第１の検出プローブは、第１のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＭＵＣ１６ポリペプチドを指向する第１の標的結合部分を含む一方で；第２の検出プローブは、第２のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する第２の標的結合部分を含む。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、同じであってよい。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、異なってよい。
卵巣癌を検出するための二重標的実体検出システムの一部の実施形態では、第１の検出プローブは、第１のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＣＬＤＮ６ポリペプチドを指向する第１の標的結合部分を含む一方で；第２の検出プローブは、第２のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＭＵＣ１６ポリペプチドまたはＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する第２の標的結合部分を含む。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、同じであってよい。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、異なってよい。
卵巣癌を検出するための二重標的実体検出システムの一部の実施形態では、第１の検出プローブは、第１のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＣＬＤＮ３ポリペプチドを指向する第１の標的結合部分を含む一方で；第２の検出プローブは、第２のオリゴヌクレオチドドメインにコンジュゲートしているＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドを指向する第２の標的結合部分を含む。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、同じであってよい。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン及び第２のオリゴヌクレオチドドメインの二本鎖部分は、異なってよい。
一部の実施形態では、卵巣癌を検出するための二重標的実体検出システムは、検出プローブの少なくとも２つの別個のセットを含み得る。例えば、一部の実施形態では、各セットは、１つまたは複数の標的バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）を含む別個の標的バイオマーカーシグネチャーを指向し得る。例えば、一部の実施形態では、図２１に示されているとおり、二本鎖標的実体検出システムは、検出プローブの少なくとも２つのセットを含み得て、その際、第１のセットは、ＭＵＣ１６ポリペプチドをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含み、第２のセットは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含む。一部の実施形態では、例えば、図３８に示されているとおり、二本鎖標的実体検出システムは、検出プローブの少なくとも２つのセットを含み得て、その際、第１のセットは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する少なくとも２つの検出プローブを（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドを指向する捕捉プローブと共に）含み、第２のセットは、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを（例えば、少なくともＭＵＣ１６ポリペプチドを指向する捕捉プローブと共に）含む。一部の実施形態では、図３９に示されているとおり、二本鎖標的実体検出システムは、検出プローブの少なくとも２つのセットを含み得て、その際、第１のセットは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドを指向する捕捉プローブと共に）含み、第２のセットは、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを（例えば、ＭＵＣ１６ポリペプチドを指向する捕捉プローブと共に）含む。一部の実施形態では、各セットは、卵巣癌についての標的バイオマーカーの別個の組合せを指向し得る。例えば、一部の実施形態では、二本鎖標的実体検出システムは、検出プローブの少なくとも２つのセットを含み得て、その際、第１のセットは、別個のバイオマーカーをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含み、第２のセットは、別個のバイオマーカーをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含む。
一部の実施形態では、卵巣癌を検出するための二重標的実体検出システムは、検出プローブの少なくとも３つの別個のセットを含み得る。例えば、一部の実施形態では、各セットは、１つまたは複数の標的バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）を含む別個の標的バイオマーカーシグネチャーを指向し得る。一部のそのような実施形態では、少なくとも１つのセットは、単一の標的バイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）を指向し得る。一部のそのような実施形態では、少なくとも１つのセットは、少なくとも２つの別個の標的バイオマーカーの組合せ（例えば、本明細書に記載の少なくとも２つの標的バイオマーカーの組合せ）を指向し得る。例えば、実施例１０に記載のとおり、二本鎖標的実体検出システムは、検出プローブの少なくとも３つのセットを含み得て、その際、第１のセットは、ＭＵＣ１６ポリペプチドをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含み；第２のセットは、ＦＯＬＲ１ポリペプチドをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含み；第３のセットは少なくとも、ＭＵＣ１６ポリペプチドを指向する第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する第２の検出プローブを含む。
一部の実施形態では、検出プローブの少なくとも２つの別個のセットを含む二本鎖標的実体検出システムは、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する捕捉因子を含む捕捉アッセイも含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のとおりの捕捉プローブまたは検出プローブを含む任意の組合せのバイオマーカープローブ（例えば、バイオマーカーシグネチャー）を、本明細書に記載のとおりの捕捉プローブまたは検出プローブを含む任意の他のセットのバイオマーカープローブ（例えば、バイオマーカーシグネチャー）と組み合わせて利用することができる。
例示的な三重または多重（ｎ≧３）標的実体検出システム
一部の実施形態では、本開示により提供されるような（及び例えば、卵巣癌と関連する細胞外小胞を、例えば、単一の実体レベルで検出するために有用な）標的実体検出システムは、別個の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）のｎ集団を含み得、ここで、ｎ≧３である。例えば、ｎ＝３である場合の一部の実施形態では、標的実体検出システムは、第１の標的のための第１の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）、第２の標的のための第２の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）の集団、及び第３の標的のための第３の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）の集団を含み得る。
図１５は、３つの別個の分子標的を含む目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を、単一の実体レベルで検出するための例示的な三重標的実体検出システムを図示している。第１の検出プローブは、第１の標的結合部分（例えば、抗がんマーカー１抗体因子）と、第１の標的結合部分にカップリングしている第１のオリゴヌクレオチドドメインとを含み、その際、第１のオリゴヌクレオチドドメインは、第１の二本鎖部分と、第１のオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している第１の一本鎖オーバーハングとを含む。図１５に示されているとおり、第１のオリゴヌクレオチドドメインは、長鎖（鎖８）及び短鎖（鎖１）のハイブリダイゼーションから生じ得、それにより、二本鎖部分と、一方の末端の一本鎖オーバーハングとを形成している。一部の実施形態では、第１の標的結合部分（例えば、抗がんマーカー１抗体因子）は、第１のオリゴヌクレオチドドメインの鎖（例えば、鎖１）の５’末端にカップリングしている（例えば、共有結合性カップリングしている）。一部の実施形態では、第１の標的結合部分にカップリングしている鎖の５’末端を、リンカー（例えば、スペーサー基を含む、または含まない本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）で修飾することができる。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドドメイン（例えば、鎖８）の別の鎖の５’末端は、遊離リン酸基を有する。
図１５に図示されている実施形態では、第２の検出プローブは、第２の標的結合部分（例えば、抗がんマーカー３抗体因子）と、第２の標的結合部分にカップリングしている第２のオリゴヌクレオチドドメインとを含み、その際、第２のオリゴヌクレオチドドメインは、第２の二本鎖部分と、第２のオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している第２の一本鎖オーバーハングとを含む。図１５に示されているとおり、第２のオリゴヌクレオチドドメインは、長鎖（鎖４）及び短鎖（鎖２）のハイブリダイゼーションから生じ得、それにより、二本鎖部分と、一方の末端の一本鎖オーバーハングとを形成している。一部の実施形態では、第２の標的結合部分（例えば、抗がんマーカー３抗体因子）は、第２のオリゴヌクレオチドドメイン（例えば、鎖２）の鎖の５’末端にカップリングしている（例えば、共有結合性カップリングしている）。一部の実施形態では、第２の標的結合部分にカップリングしている鎖の５’末端を、リンカー（例えば、スペーサー基を含む、または含まない本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）で修飾することができる。一部の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドドメインの別の鎖（例えば、鎖４）の５’末端は、遊離リン酸基を有さない。
第３の検出プローブは、第３の標的結合部分（例えば、抗がんマーカー２抗体因子）と、第３の標的結合部分にカップリングしている第３のオリゴヌクレオチドドメインとを含み、その際、第３のオリゴヌクレオチドドメインは、第３の二本鎖部分と、第３のオリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含む。例えば、一本鎖オーバーハングは、第３のオリゴヌクレオチドドメインの鎖の一方の末端から伸長している一方で、別の一本鎖オーバーハングは、第３のオリゴヌクレオチドドメインの異なる鎖の反対側の末端から伸長している。図１５に示されているとおり、第３のオリゴヌクレオチドドメインは、２本の鎖（例えば、鎖９及び１０）の部分のハイブリダイゼーションから生じ得、それにより、二本鎖部分と、一方の末端の一本鎖オーバーハングとを形成している。例えば、一本鎖オーバーハング（３Ａ）は、第３の検出プローブの鎖９の５’末端に形成され、その際、鎖９の５’末端は遊離リン酸基を有する。加えて、一本鎖オーバーハング（３Ｂ）が、同じ第３の検出プローブの鎖１０の５’末端に形成されており、第３の標的結合部分（例えば、抗標的２抗体因子）も、鎖１０の５’末端にカップリングしている（例えば、共有結合性カップリングしている）。一部の実施形態では、第３の標的結合部分にカップリングしている鎖（例えば、鎖１０）の５’末端を、リンカー（例えば、スペーサー基を含む、または含まない本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）で修飾することができる。
３つすべての検出プローブが十分に近接している場合、例えば、３つすべての検出プローブが同じ目的の実体（例えば、生物学的実体）に同時に結合する場合、（ｉ）第３の検出プローブの一本鎖オーバーハング（例えば、３Ａ）の少なくとも一部分は、第２の検出プローブの一本鎖オーバーハングの対応する相補的部分にハイブリダイズし、かつ（ｉｉ）第３の検出プローブの別の一本鎖オーバーハング（例えば、３Ｂ）の少なくとも一部分は、第１の検出プローブの一本鎖オーバーハングの対応する相補的部分にハイブリダイズする。結果として、線状配置で相互にカップリングしている３つすべての検出プローブを含む二本鎖複合体が、対応する一本鎖オーバーハングの直接的なハイブリダイゼーションにより形成される。例えば、図１５を参照されたい。
提供される技術において少なくとも３つまたはそれ以上（ｎ＞３）の検出プローブの使用を含む一部の実施形態では、検出プローブの一本鎖オーバーハングがそれぞれ個々のパートナー（複数可）にアニールして二本鎖複合体を形成する場合、少なくとも（ｎ－２）の標的結合部分が、二本鎖複合体の内部部分（複数可）に存在する。そのような実施形態では、内部標的結合部分は二本鎖複合体の一本鎖に存在して、二本鎖複合体の他方の鎖はいずれの内部標的結合部分も含有せず、したがって、例えば、増幅及び検出のために、ライゲートされたテンプレートを形成するためにライゲート可能であるようになっていることが望ましい。例えば、図１５（３つの検出プローブを使用）、図１６（４つの検出プローブを使用）、及び図１７（ｎの検出プローブを使用）を参照されたい。
二本鎖複合体の鎖が少なくとも１つまたは複数の内部標的結合部分を含む一部の実施形態では、上記鎖は、内部標的結合部分がカップリングしている検出プローブのオリゴヌクレオチド鎖の末端と、別の検出プローブのオリゴヌクレオチド鎖の末端との間にギャップを含む。上記ギャップのサイズは、上記鎖が核酸リガーゼの存在下でライゲート不可能となるほど十分に大きい。一部の実施形態では、上記ギャップは、２～８のヌクレオチドのサイズまたは２～６ヌクレオチドのサイズであり得る。一部の実施形態では、上記ギャップは、６ヌクレオチドのサイズである。一部の実施形態では、上記オーバーラップ（一本鎖オーバーハング間のハイブリダイゼーション領域）は、２～１５ヌクレオチドの長さまたは４～１０ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、上記オーバーラップ（一本鎖オーバーハング間のハイブリダイゼーション領域）は、８ヌクレオチド長である。ギャップ及び／またはハイブリダイゼーション領域のサイズは、ライゲートされたテンプレート（内部標的結合部分を含まない）及びライゲートされなかったテンプレート（少なくとも１つの内部標的結合部分を含む）から最適なシグナル分離が得られるように選択する。図１５～１７は、目的の実体（例えば、生物学的実体）への検出プローブの結合を示していないが、二本鎖複合体（例えば、ライゲーションが生じる前に）は目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を含み得、その際、少なくとも３つまたはそれ以上の標的結合部分が目的の実体に同時に結合することに注意すべきである。
一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システム（例えば、本明細書に記載の二重、三重または多重標的実体検出システム）において使用するための検出プローブの組合せ（例えば、セット）の選択（例えば、検出プローブ及び／または特異的バイオマーカーの数）は、例えば、特定の用途に最適であると考えられる所望の特異性及び／または所望の感受性に基づく。例えば、一部の実施形態では、検出プローブの組合せを、卵巣癌を（例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶについて）検出するために、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％またはそれ以上を含めて、少なくとも９５％またはそれ以上の特異性をもたらすように選択する。一部の実施形態では、検出プローブの組合せを、卵巣癌を（例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶについて）検出するために、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上を含めて、少なくとも３０％またはそれ以上の感受性をもたらすように選択する。一部の実施形態では、検出プローブの組合せを、卵巣癌を（例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶについて）検出するために、例えば、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、またはそれ以上を含めて、少なくとも８％またはそれ以上の陽性予測値をもたらすように選択する。一部の実施形態では、検出プローブの組合せを、卵巣癌を（例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶについて）検出するために、例えば、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、またはそれ以上を含めて、少なくとも２％またはそれ以上の陽性予測値をもたらすように選択する。一部の実施形態では、検出プローブの組合せを、卵巣癌を（例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶについて）検出するために、例えば、７×１０６ＥＶ／試料ｍＬ未満、６×１０６ＥＶ／試料ｍＬ未満、５×１０６ＥＶ／試料ｍＬ未満、４×１０６ＥＶ／試料ｍＬ未満、３×１０６ＥＶ／試料ｍＬ未満、２×１０６ＥＶ／試料ｍＬ未満、１×１０６ＥＶ／試料ｍＬ未満、またはそれ未満を含めて、１×１０７ＥＶ／ｍＬ試料未満またはそれ未満の検出限界（ＬＯＤ）をもたらすように選択する。一部の実施形態では、そのような卵巣癌検出アッセイを、例えば、これに限定されないが、高異型度漿液性卵巣癌、類子宮内膜卵巣癌、明細胞卵巣癌、低異型度漿液性卵巣癌、または粘液性卵巣癌を含む、卵巣癌の種々のサブタイプを検出するために使用することができる。一部の実施形態では、そのような卵巣癌検出アッセイを、上皮由来の卵巣癌を検出するために使用することができる。一部の実施形態では、そのような卵巣癌検出アッセイは、高異型度漿液性卵巣癌を検出するために使用することができる。
一部の実施形態では、個々の検出プローブではなく、検出プローブの組合せ（例えば、セット）が、疾患、障害、または状態（例えば、本明細書に記載のとおりの特定の卵巣癌及び／または卵巣癌のステージ）の検出に対する特異性を付与し、例えば、１つまたは複数の個々のプローブが、それ自体はそのような卵巣癌に特異的ではない標的を指向し得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システム（例えば、本明細書に記載の二重、三重または多重標的実体検出システム）における検出プローブの有用な組合せは、関連疾患、障害、または状態に特異的な標的（すなわち、関連疾患、障害、または状態に特異的な標的）を指向する少なくとも１つの検出プローブを含み得、かつ関連疾患、障害、または状態に必ずしも、またはまったく特異的ではない（例えば、健康である一部または全部の細胞においても見い出され得、特定の疾患、障害、または状態のものではなく、及び／または目的の特定の疾患ステージのものではない）標的を指向する少なくとも１つの検出プローブをさらに含み得る。すなわち、当業者には、本明細書を読むことで分かるであろうとおり、本発明に従って利用される検出プローブのセットが、一緒になって関連疾患、障害、または状態の検出について特異的である（すなわち、関連疾患、障害、または状態と関連する検出のための生物学的実体を、検出のための目的ではない他の生物学的実体から十分に識別する）複数の個々の検出プローブであるか、またはそれを含む限り、上記セットは、本開示のある特定の実施形態に従って有用である。
一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システム（例えば、本明細書に記載の二重、三重または多重標的実体検出システム）は、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）の対照プローブを（例えば、一部の実施形態では、疾患特異的バイオマーカー、例えば、がん特異的バイオマーカー及び／または組織特異的バイオマーカーを認識するための、例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりの標的特異的検出プローブに加えて）含み得る。一部の実施形態では、対照プローブを、目的の実体（例えば、生物学的実体）へのその結合が検出シグナルの生成を（完全に、または部分的に）阻害するように設計する。
一部の実施形態では、対照プローブは、対照結合部分と、上記対照結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメイン（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）を含み、その際、上記オリゴヌクレオチドドメインは、二本鎖部分と、上記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハングとを含む。対照結合部分は、対象基準に結合する実体または部分である。一部の実施形態では、対照基準は、正常で健康な細胞に優先的に関連するバイオマーカーであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、対照基準は、非標的組織から優先的に関連するバイオマーカーであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、対照プローブを含むことで、擬陽性（例えば、対照基準を、任意選択で、検出される１つまたは複数の標的と組み合わせて含む目的の実体）から生成される検出可能なシグナルを選択的に除去する、または最小化することができる。各出願の内容全体が参照により本明細書に援用される、両方とも２０２０年２月２８日に出願され、「標的実体を検出するシステム、組成物、及び方法」と標題された米国特許出願第１６／８０５，６３７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０５２９に記載の他の対照プローブが、提供される標的実体検出システムにおいて有用であり得る。
一部の実施形態では、本開示は特に、本明細書において記載または利用するとおりの検出プローブは、固体基材表面に非特異的に結合し得、かつそのうちの一部は、何らかの過剰か、または非結合検出プローブを除去するための複数回の洗浄の後にもアッセイ試料中に残り得て；かつそのような非特異的に結合した検出プローブは、ライゲーション反応において、固体基材表面から外れて、浮遊性になり得て、したがって、それらが相互に相互作用して、望ましくないバックグラウンドシグナルを生成する非特異的なライゲートされたテンプレートを生成することを可能にするという洞察を提供する。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システム（例えば、本明細書に記載の二重、三重、または多重標的実体検出）は、目的の実体に結合しないが、ライゲーション反応において遊離作用因子として残留する残留検出プローブを捕捉して、それにより、そのような浮遊性検出プローブが、他の浮遊性相補性検出プローブと相互作用して、望ましくないバックグラウンドシグナルを生成することを阻止するように設計されている少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）の阻害因子オリゴヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、阻害因子オリゴヌクレオチドは、検出プローブ（例えば、本明細書において記載または利用するとおりのもの）の一本鎖オーバーハングのための結合ドメインを含む一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり得るか、またはそれを含み得、その際、阻害因子オリゴヌクレオチドは、プライマー結合部位を含まない。阻害因子オリゴヌクレオチド中にそのようなプライマー結合部位が存在しないことで、プライマーは、阻害因子オリゴヌクレオチドへの検出可能なプローブのライゲーションから生じる非特異的なライゲートされたテンプレートに結合することを阻止され、それにより、非特異的なライゲートされたテンプレートの、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅及び／または検出が減少するか、または阻害される。
一部の実施形態では、阻害因子オリゴヌクレオチドは、検出プローブ（例えば、本明細書において記載または利用するとおりのもの）の一本鎖オーバーハングのための結合ドメインを含み、その際、上記結合ドメインは、検出プローブの一本鎖オーバーハングに実質的に相補的であるヌクレオチド配列であるか、またはそれを含み、相補的一本鎖オーバーハングを有する遊離の非結合検出プローブが阻害因子オリゴヌクレオチドの結合ドメインに結合し得るようになっている。一部の実施形態では、阻害因子オリゴヌクレオチドは、一方の末端にヘアピンを有し得る。一部の実施形態では、阻害因子オリゴヌクレオチドは、一方の末端に検出プローブの一本鎖オーバーハングのための結合ドメインを含む一本鎖オリゴヌクレオチドであってよく、その際、一本鎖オリゴヌクレオチドの一部分は、自己ハイブリダイズして、他方の末端にヘアピンを形成し得る。
一部の実施形態では、本明細書において提供される標的実体検出システム（例えば、本明細書に記載の二重、三重または多重標的実体検出システム）は、検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインを別の検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインと会合させるコネクターオリゴヌクレオチドを含まない。一部の実施形態では、コネクターオリゴヌクレオチドは、目的の実体に結合した場合にそうでなければ相互に相互作用しないであろういずれか２つの検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインを架橋するように設計されている。一部の実施形態では、コネクターオリゴヌクレオチドは、検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインの少なくとも一部分、及び別の検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインの少なくとも一部分とハイブリダイズするように設計されている。コネクターオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、またはそれらの組合せであり得る。コネクターオリゴヌクレオチドは、いずれの標的結合部分（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）または対照結合部分も含有しない。少なくとも一部の実施形態では、コネクターオリゴヌクレオチドは、検出プローブオリゴヌクレオチドドメインを間接的に連結するために必ずしも必要なく；一部の実施形態では、そのようなコネクターオリゴヌクレオチドは利用されず、それというのも一部では、本明細書において記載及び／または利用するとおりの検出プローブは、それらのそれぞれのオリゴヌクレオチドドメインが、それらが十分に近接している場合に、例えば、検出プローブが目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）に同時に結合した場合に、相互に届いて相互作用するほどの十分な長さを有するように設計されているためである。
提供される標的実体検出システムを使用する方法
提供される標的実体検出システムは、卵巣癌の検出と関連して様々な用途及び／または目的のために、試料中で（例えば、生物学的、環境的、または他の試料中で）、目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を検出する際に有用である。したがって、本明細書において提供される一部の態様は、本開示に従って使用するために適した複数の（例えば、少なくとも２、少なくとも３、またはそれ以上の）検出プローブを使用する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、試料（例えば、ヒト女性対象からの血液または血液由来試料）中の目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を、少なくとも２つまたはそれ以上（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０またはそれ以上を含む）の本明細書において記載及び／または利用されるとおりの検出プローブを含む検出プローブのセットと接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を含む試料を、標的実体検出システム（例えば、本明細書において提供されるとおりのもの）に掛けることを含む。複数の検出プローブ（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）を、目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を含む試料に、同時に、または別の時間に（例えば、連続的に）添加することができる。一部の実施形態では、方法は、複数の検出プローブと接触させる前に、目的の実体を含む試料を、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する少なくとも１つの捕捉因子と接触させることを含み得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するために提供される標的実体検出システムは、検出プローブ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の複数（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０またはそれ以上）の別個のセット（例えば、組合せ）を含み得る。一部の実施形態では、方法は、試料（例えば、ヒト女性対象からの血液または血液由来試料）中の目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を、各セットが少なくとも２つまたはそれ以上（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０またはそれ以上を含む）の本明細書において記載及び／または利用されるとおりの検出プローブを含む検出プローブの複数のセットと接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を含む試料を、標的実体検出システム（例えば、本明細書において提供されるとおりのもの）に掛けることを含む。複数の検出プローブ及び／または検出プローブ組合せ（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）を、目的の実体（例えば、生物学的実体、例えば、細胞外小胞）を含む試料に、同時に、または別の時間に（例えば、連続的に）添加することができる。一部の実施形態では、方法は、複数の検出プローブと接触させる前に、目的の実体を含む試料を、細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する少なくとも１つの捕捉因子と接触させることを含み得る。
一部の実施形態では、試料における１つまたは複数のバイオマーカー組合せのプロファイリングからの結果（例えば、Ｃｔ値及び／またはライゲートされた核酸テンプレート（例えば、ライゲートされたＤＮＡテンプレート）の相対数）の関係を、臨床情報（例えば、これに限定されないが、患者の年齢、過去の病歴、血清ＣＡ－１２５などを含む）及び／または他の情報と組み合わせて、卵巣癌を有する、またはそのリスクを有する患者をより良好に分類することができる。様々な分類アルゴリズムを使用して、複数の変項間の関係を解釈し、アッセイの感受性及び／または特異性を上昇させることができる。一部の実施形態では、そのようなアルゴリズムには、これに限定されないが、ロジスティック回帰モデル、サポートベクターマシン、勾配ブースティングマシン、ランダムフォレストアルゴリズム、Ｎａｉｖｅ Ｂａｙｅｓアルゴリズム、Ｋ近傍アルゴリズム、及びそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載のアッセイの性能（例えば、確度）を、例えば、バイオマーカー組合せ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の選択、アルゴリズムに含める他の因子または変項（例えば、臨床情報）の選択、及び／またはアルゴリズム自体の種類の選択により改善することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の技術は、本明細書に記載のとおりのデータセットを用いて訓練または確認されている予測アルゴリズムを利用する。ある特定の実施形態では、バイオマーカーシグネチャー（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）を含む少なくとも２つ、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または５つよりも多い別々のアッセイからの結果を考慮して設計される試料を訓練することから生成されるアルゴリズムを使用して、本明細書に記載の技術を、リスクスコアを生成するために利用する。ある特定の実施形態では、アルゴリズム生成リスクスコアを少なくとも一部では、少なくとも１つの個々のアッセイ（例えば、個々のバイオマーカーシグネチャー）からの診断データ（例えば、生及び／または正規化Ｃｔ値）を使用して生成することができる。ある特定の実施形態では、基準閾値は、リスクスコア内に含まれ得る。ある特定の実施形態では、卵巣癌リスクの複数の異なる程度を示す複数の閾値レベルがリスクスコアに含まれ得る。一部の実施形態では、別々の標的バイオマーカーシグネチャーアッセイを一連のアッセイにおいて個々のアッセイとして行うことができ、個々のアッセイを、予測アルゴリズムにおいて等しく、または異なって重み付けすることができる。一部の実施形態では、例えば、１つのアルゴリズムにおいて組み合わされる個々のアッセイ（例えば、バイオマーカーアッセイのコホート）の重み付けを、これに限定されないが、個々のアッセイの感受性、個々のアッセイの特異性、個々のアッセイの再現性、個々のアッセイの変動性、個々のアッセイの陽性予測値、及び／または特異的なアッセイの検出下限を含むいくつかの因子により決定することができる。一部の実施形態では、バイオマーカーアッセイのコホートを、特徴（例えば、感受性、特異性、検出下限など）に従ってランキングすることができ、次いで、バイオマーカーアッセイを、それらの相対ランクに基づき重み付けすることができる。
一部の実施形態では、アルゴリズム（本明細書に記載のとおりのもの）により生成したリスクスコアを、適切な手法で、例えば、名義尺度で、例えば、これに限定されないが、女性が卵巣癌を有する可能性、女性が卵巣癌を発症する可能性、及び／または卵巣癌の見込みステージを含む、例えば、いくつかの可能性を反映する０～１００の尺度で表すことができる。一部の実施形態では、リスクスコアが高いほど、疾患病状の可能性が上昇していることを実証し得て、例えば、低い値から高い値へと、健康な対照、良性対照、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及びステージＩＶ卵巣癌を反映し得る。一部の実施形態では、他のがんの種類と比較する場合に、リスクスコアを、本明細書に記載のとおりの技術の交差反応性の可能性を低下させるために利用することができる。
一部の実施形態では、リスクスコアを、年齢、生活履歴、ＴＶＵＳ結果、ＣＡ－１２５レベル、またはそれらの任意の組合せなどの他の適用可能な診断データとカップリングさせた、本明細書に記載のとおりのアッセイから得られたデータの組合せから生成することができる。一部の実施形態では、リスクスコアは、従来の標準治療診断アッセイ予測値のものをはるかに超える、例えば、単独で、または組み合わせで利用されるＴＶＵＳ及び／またはＣＡ－１２５アッセイにより得られる予測値よりも高い予測値をもたらす。一部の実施形態では、卵巣癌（例えば、高異型度漿液性癌腫）について高い特異性を有し、他のがんについては低い感受性を有するリスクスコアを生成することができる。
一部の実施形態では、リスクスコアは、卵巣癌を検出するための関連臨床カットオフを有し得る。例えば、一部の実施形態では、検出のためのリスクスコア臨床カットオフは、早期及び後期ステージ卵巣癌の両方を検出するために少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれより高い感受性をもたらし、かつ２０～８９歳の一般の健康な女性集団において少なくとも９５％の特異性、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれより高い特異性を有するアッセイを必要とし得る。一部の実施形態では、感受性及び特異性標的は、標的とされる７７％の感受性及び９９．５％の特異性での両側９５％信頼区間の近似下限値である。
一部の実施形態では、リスクスコアアルゴリズムをプログラムするために要求される必要なデータを得るために、訓練研究を実行する。一部の実施形態では、そのような訓練研究は、少なくとも商用供給者、目的駆動型研究、及び／または医師を含む広範な供給者からの試料のコホートを含み得る。一部の実施形態では、訓練研究は、高異型度漿液性卵巣癌患者（例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及び／またはステージＩＶ）からの陽性試料、高異型度漿液性卵巣癌細胞系からの陽性対照試料、良性婦人科腫瘍患者（例えば、卵巣腫瘍、子宮腫瘍など）からの陰性試料、非卵巣癌患者（例えば、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、肺腺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、皮膚癌など）からの陰性試料、炎症状態患者（例えば、クローン病、子宮内膜症、ＩＩ型糖尿病、狼瘡、膵臓炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎など）からの陰性試料、健康な患者からの陰性試料、またはそれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、訓練研究は、任意の適切な年齢範囲、例えば、＜３１歳、３１～４０歳、４１～５０歳、５１～６０歳、６１～７０歳、７１～８０歳、または＞８０歳の患者からの試料を含み得る。一部の実施形態では、訓練研究は、任意の人種／民族／身分（例えば、白人、アフリカ系、アジア系など）の患者からの試料を含み得る。
一部の実施形態では、リスクスコアアルゴリズムの有用性を確認するために要求される必要なデータを得るために、確認研究を実行する。一部の実施形態では、そのような確認研究は、少なくとも商用供給者、目的駆動型研究、及び／または医師を含む広範な供給者からの試料のコホートを含み得る。一部の実施形態では、確認研究は、高異型度漿液性卵巣癌患者（例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及び／またはステージＩＶ）からの陽性試料、高異型度漿液性卵巣癌細胞系からの陽性対照試料、良性婦人科腫瘍患者（例えば、卵巣腫瘍、子宮腫瘍など）からの陰性試料、非卵巣癌患者（例えば、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、肺腺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、皮膚癌など）からの陰性試料、炎症状態患者（例えば、クローン病、子宮内膜症、ＩＩ型糖尿病、狼瘡、膵臓炎、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎など）からの陰性試料、健康な患者からの陰性試料、またはそれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、確認研究は、任意の適切な年齢範囲、例えば、＜３１歳、３１～４０歳、４１～５０歳、５１～６０歳、６１～７０歳、７１～８０歳、または＞８０歳の患者からの試料を含み得る。一部の実施形態では、確認研究は、任意の人種／民族／身分（例えば、白人、アフリカ系、アジア系など）の患者からの試料を含み得る。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、またはそれ以上を含む）の標的バイオマーカー（本明細書に記載の表面タンパク質バイオマーカー、本明細書に記載の小胞内タンパク質バイオマーカー、及び／または本明細書に記載の小胞内ＲＮＡバイオマーカーのいずれかから選択され得る）とを含む少なくとも１つの標的バイオマーカーシグネチャーを、卵巣癌検出アッセイにおいて具体化することができる。一部のそのような実施形態では、少なくとも１つの捕捉因子は細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向し、検出プローブの少なくとも１つのセットは本明細書に記載のそのような標的バイオマーカーの１つまたは複数を指向する。例えば、図２０（パネルＢ）及び図２２は、卵巣癌検出アッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）においてそれぞれ具体化することができる標的バイオマーカーシグネチャーのある特定の例を開示している。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドと、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、またはそれ以上を含む）の標的バイオマーカー（本明細書に記載の表面タンパク質バイオマーカー、本明細書に記載の小胞内タンパク質バイオマーカー、及び／または本明細書に記載の小胞内ＲＮＡバイオマーカーのいずれかから選択され得る）とをそれぞれ含む少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つまたはそれ以上を含む）の別個の標的バイオマーカーシグネチャーを、卵巣癌検出アッセイにおいて具体化することができる。例えば、図２１は、卵巣癌についての少なくとも２つの標的バイオマーカーシグネチャーを使用する卵巣癌検出アッセイを開示しており、その際、第１の標的バイオマーカーシグネチャーはＳＬＣ３４Ａ１及びＭＵＣ１６を含み、第２の標的バイオマーカーシグネチャーはＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を含む。図２１に図示されているとおり、一部の実施形態では、一部の実施形態では固体基材、例えば、磁気ビーズなどのビーズ）に固定化されていてよいＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子を、患者の血液由来試料から細胞外小胞を捕捉するために使用する。捕捉された細胞外小胞の第１のアリコットは、ＭＵＣ１６をそれぞれ指向する検出プローブの第１のセットに掛ける一方で、捕捉細胞外小胞の第２のアリコットは、ＦＯＬＲ１をそれぞれ指向する検出プローブの第２のセットに掛ける。図２９は、卵巣癌についての少なくとも３つの標的バイオマーカーシグネチャーを使用する卵巣癌検出アッセイを開示しており、その際、第１の標的バイオマーカーシグネチャーはＳＬＣ３４Ａ１及びＭＵＣ１６を含み；第２の標的バイオマーカーシグネチャーはＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を含み；第３の標的バイオマーカーシグネチャーはＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１を含む。図２９に図示されているとおり、一部の実施形態では、さらなる分析のために細胞外小胞を捕捉するために、患者の血液由来試料のアリコットを、一部の実施形態では固体基材、例えば、磁気ビーズなどのビーズ）に固定化されていてよいＳＬＣ３４Ａ２を指向する第１の捕捉因子に掛ける。ＳＬＣ３４Ａ２捕捉細胞外小胞の第１のアリコットは、ＭＵＣ１６をそれぞれ指向する検出プローブの第１のセットに掛ける一方で、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉細胞外小胞の第２のアリコットは、ＦＯＬＲ１をそれぞれ指向する検出プローブの第２のセットに掛ける。一部の実施形態では、さらなる分析のために細胞外小胞を捕捉するために、そのような患者の血液由来試料の別のアリコットを、一部の実施形態では固体基材、例えば、磁気ビーズなどのビーズ）に固定化されていてよいＭＵＣ１６を指向する第２の捕捉因子に掛ける。次いで、ＭＵＣ１６捕捉細胞外小胞を、ＭＵＣ１６を指向する第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブを含むセットに掛ける。
図２１及び２９に示されているとおり、一部の実施形態では、それぞれ別個の標的バイオマーカーシグネチャーは、試料が卵巣癌について陽性であるか否かを個別に決定するために、異なる事前決定されたカットオフ値を有し得る。一部の実施形態では、アッセイ読み出しが、複数の（例えば、少なくとも２またはそれ以上）の標的バイオマーカーシグネチャーについてのカットオフ値のうちの少なくとも１つを上回る場合に、試料は、卵巣癌について陽性であると決定される。一部の実施形態では、カットオフ値（例えば、少なくとも２、少なくとも３、またはそれ以上）の組合せを利用すると、推論上改善された感受性及び／または特異性を有する診断値を作成することができる。
したがって、一部の実施形態では、異なる捕捉因子及び／または検出プローブの異なるセット（例えば、別個の疾患または状態の検出をそれぞれ指向する）を異なるアリコットに添加することができるように、試料をアリコットに分割することができる。そのような実施形態では、提供される技術を、同時に１つのアリコットで、または同時に複数のアリコットで（例えば、スループットを上昇させるために平行アッセイで）実施することができる。
一部の実施形態では、検出プローブが、目的の実体（例えば、生物学的実体）に結合せずに、少なくとも多大に無作為に相互に近接しないことを保証するために、試料に添加される検出プローブの量は、混合物中で検出プローブの十分に低い濃度をもたらす。したがって、多くの実施形態で、検出プローブが、検出プローブのそれぞれの標的結合部分と目的の実体（例えば、生物学的実体）の結合部分との間の結合相互作用を介して、同じ目的の実体（例えば、生物学的実体）に同時に結合した場合、検出プローブは、二本鎖複合体（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）を形成するほど十分に相互に近接する。一部の実施形態では、試料と組み合わせた後の混合物中の検出プローブの濃度は、約１ｆＭ～１μＭ、例えば、約１ｐＭ～約１００ｎＭを含めて、約１ｐＭ～約１ｎＭの範囲であり得る。
一部の実施形態では、同じ目的の実体（例えば、生物学的実体）にそれぞれの検出プローブが結合せずに、ある目的の実体（例えば、生物学的実体）に結合している検出プローブが、別の目的の実体（例えば、生物学的実体）に結合している別の検出プローブと、少なくとも多大に無作為に近接しないように、試料中の目的の実体（例えば、生物学的実体）の濃度は十分に低い。例にすぎないが、目的の非標的実体（例えば、非癌性生物学的実体、例えば、第１の標的を含む細胞外小胞）に結合している第１の標的検出プローブが、別の目的の非標的実体（例えば、非癌性生物学的実体、例えば、細胞外小胞）に結合している別の異なる標的検出プローブと、少なくとも多大に無作為に近接せず、擬陽性検出可能なシグナルを生成しないように、試料中の目的の実体（例えば、生物学的実体）の濃度は十分に低い。
試料中の目的の実体（例えば、生物学的実体）を検出プローブのセットと接触させた後に、そのような混合物を、検出プローブが、存在するならば目的の実体中の対応する標的（例えば、分子標的）に結合して、二本鎖複合体（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）を形成するために十分な時間にわたってインキュベートすることができる。一部の実施形態では、そのような混合物を、約３０分～約２時間を含む約５分～約５時間の範囲の期間にわたって、約２０℃～約３７℃を含む約１０～約５０℃の範囲の温度でインキュベートする。
次いで、二本鎖複合体（目的の実体、例えば生物学的実体を検出プローブと接触させたことから生じた）を続いて、核酸リガーゼと接触させて、検出プローブのオリゴヌクレオチド鎖の遊離３’末端ヒドロキシル及び５’末端リン酸末端の核酸ライゲーションを行って、それにより、少なくとも２つまたはそれ以上の検出プローブのオリゴヌクレオチド鎖を含むライゲートされたテンプレートを生じさせることができる。一部の実施形態では、二本鎖複合体を含むアッセイ試料を核酸リガーゼと接触させる前に、少なくとも１つまたは複数の阻害因子オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）をアッセイ試料に添加することができ、そうして、阻害因子オリゴヌクレオチドが、そうでなければライゲーション反応中に相互に相互作用し得るいずれの残留浮遊性検出プローブも捕捉することができるようにする。
当技術分野で公知であるとおり、リガーゼは、２つの直接的に隣接する核酸が相補的である第３の核酸配列にアニーリングまたはハイブリダイズした場合に、それらの並置された３’－ヒドロキシルと５’－リン酸末端との間でのホスホジエステル結合の形成を触媒する。任意の既知の核酸リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ）を使用することができ、これに限定されないが、温度感受性及び／または熱安定性リガーゼが含まれる。温度感受性リガーゼの非限定的例には、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ７リガーゼ、及びＥ．ｃｏｌｉリガーゼが含まれる。熱安定性リガーゼの非限定的例には、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、及びＰｆｕリガーゼが含まれる。熱安定性リガーゼは、これに限定されないが、原核、真核、または古細菌生体を含む好熱または超好熱生物から得ることができる。一部の実施形態では、核酸リガーゼは、ＤＮＡリガーゼである。一部の実施形態では、核酸リガーゼは、ＲＮＡリガーゼであり得る。
一部の実施形態では、ライゲーションステップにおいて、必要であり、及び／または望ましい適切な核酸リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ）及び任意の試薬を反応混合物と合わせ、ハイブリダイズされたライゲーションオリゴヌクレオチドのライゲーションが生じるために十分な条件下で維持する。ライゲーション反応条件は、当業者に周知である。ライゲーション中、反応混合物を、一部の実施形態では、約２０℃～約４５℃、例えば、約２５℃～約３７℃の範囲の温度で、約５分～約１６時間、例えば、約１時間～約４時間の範囲の時間にわたって維持することができる。また他の実施形態では、反応混合物を、約３５℃～約４５℃、例えば約３７℃～約４２℃の範囲、例えば、３８℃、３９℃、４０℃または４１℃の温度か、またはほぼその温度で、約５分～約１６時間、例えば約２～約８時間を含む約１時間～約１０時間の範囲の時間にわたって維持することができる。
そのようなライゲートされたテンプレートの検出は、試料中の目的の実体（例えば、生物学的実体）が、検出プローブが指向する標的について陽性または陰性であるかどうかに関する情報をもたらし得る。例えば、そのようなライゲートされたテンプレートの検出可能なレベルは、試験された目的の実体（例えば、生物学的実体）が目的の標的（例えば、分子標的）を含むことを示している。一部の実施形態では、検出可能なレベルは、基準レベルを、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上を含む、例えば、少なくとも１０％またはそれ以上超えるレベルである。一部の実施形態では、基準レベルは、陰性対照試料、例えば、そのような標的を含む目的の実体が存在しない試料において観察されるレベルであり得る。逆に、そのようなライゲートされたテンプレートの検出不可能なレベル（例えば、検出可能なレベルの閾値未満であるレベル）は、目的の標的（例えば、分子標的）の少なくとも１つが、試験された目的の実体（例えば、生物学的実体）に存在しないことを示している。当業者は、検出可能なレベルを検出不可能なレベルから分ける閾値を、例えば、それぞれの用途及び／または目的に最適であると考えられる所望の感受性レベル、及び／または所望の特異性レベルに基づき決定することができることが分かるであろう。例えば、一部の実施形態では、９９．７％の特異性を、本明細書で提供されるシステムを使用して、例えば、基準レベル（例えば、陰性対照試料、例えば、１つまたは複数の正常で健康な個体に由来する試料などにおいて観察されるレベル）を３標準偏差超える閾値を設定することにより達成することができる。加えて、または別法では、当業者は、検出可能なレベル（例えば、検出シグナル強度により反映されるとおりのレベル）の閾値が基準レベルの１～１００倍超であってよいことが分かるであろう。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、ライゲーションの後に、ライゲートされたテンプレートを、例えば、試料中の目的の実体の存在及び／または量の測定として検出することを含む。様々な実施形態で、ライゲートされたテンプレートの検出は、定性的または定量的であり得る。したがって、検出が定性的である一部の実施形態では、方法は、少なくとも２つまたはそれ以上の標的（例えば、分子標的）を含む目的の実体（例えば、生物学的実体）が、アッセイされる試料中に存在するかしないかの読取りまたは評価、例えば、評定を提供する。他の実施形態では、方法は、少なくとも２つまたはそれ以上の標的（例えば、分子標的）を含む目的の実体（例えば、生物学的実体）がアッセイされる試料中に存在するかどうかの定量的検出、例えば、アッセイされる試料中に少なくとも２つまたはそれ以上の標的（例えば、分子標的）を含む目的の実体（例えば、生物学的実体）の実際量の評価または評定を提供する。一部の実施形態では、そのような定量的検出は、絶対的または相対的であり得る。
本明細書において提供される技術を使用することにより形成されるライゲートされたテンプレートを、当技術分野で公知の適切な方法により検出することができる。当業者は、適切な検出方法を、例えば、所望の感受性レベル及び／または方法が実行されている用途に基づき選択することができることが分かるであろう。一部の実施形態では、ライゲートされたテンプレートを、何らかの増幅を伴わずに直接的に検出することができる一方で、他の実施形態では、例えば、特定のアッセイの感受性を増強するために、ライゲートされたテンプレートのコピー数を増加させるように、ライゲートされたテンプレートを増幅することができる。増幅を伴わずに検出が実行可能である場合、ライゲートされたテンプレートを、種々の方法で検出することができる。例えば、検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）のオリゴヌクレオチドドメインは、ライゲートされたテンプレートが直接的に標識されるように、直接的に標識、例えば、蛍光または放射性同位体標識されていてよい。例えば、一部の実施形態では、検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）のオリゴヌクレオチドドメインは、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、導電的、光学的または化学的手段により検出可能な組成物であってよい。そのような標識には、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートで染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３４Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用されるホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、及びコロイド金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの熱量ラベルが含まれる。一部の実施形態では、ライゲートされたテンプレートを検出するために、直接的に標識されライゲートされたテンプレートを、ライゲートされていない直接的に標識されたライゲーションオリゴヌクレオチドを含む反応混合物の残りからサイズ分離することができる。
一部の実施形態では、ライゲートされたテンプレートの検出は、例えば、アッセイの感受性を増強するために、ライゲートされた核酸のコピー数を増加させる増幅ステップを含み得る。上記増幅は、所望に応じて、直線的または指数関数的であってよく、その際、増幅には、これに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；定量的ＰＣＲ、等温増幅、ＮＡＳＢＡ、デジタルドロップレットＰＣＲなどが含まれ得る。
ＰＣＲ増幅を達成するための様々な技術が当技術分野で公知であり；当業者は、ＰＣＲ技術の様々な実施形態を十分に熟知しているであろうし、かつ本明細書において提供される技術を使用して生成されるライゲートされたテンプレートを増幅するために適したものを容易に選択することができるであろう。例えば、一部の実施形態では、ライゲートされたテンプレートを含む反応混合物を、プライマー伸長反応において使用される１つまたは複数のプライマー、例えば、ＰＣＲプライマー（幾何学的（または指数関数的）増幅で用いられるフォワード及びリバースプライマー、または直線的増幅で用いられる単一プライマーなど）と合わせる。１つまたは複数のライゲートされたテンプレートを接触させるオリゴヌクレオチドプライマーは、適切なアニーリング条件下で相補的テンプレートＤＮＡへのハイブリダイゼーションをもたらすために十分な長さのものであるべきである。プライマーは典型的には、例えば、少なくとも１５ｂｐ長、少なくとも２０ｂｐ長、少なくとも２５ｂｐ長、少なくとも３０ｂｐ長またはそれ以上を含めて、少なくとも１０ｂｐ長である。一部の実施形態では、プライマーの長さは典型的には、約１５～５０ｂｐ長、約１８～３０ｂｐ長、または約２０～３５ｂｐ長の範囲であり得る。テンプレートＤＮＡのプライマー伸長、直線的、または指数関数的増幅が所望であるかどうかに応じて、ライゲートされたテンプレートを、単一のプライマーまたは２つのプライマーのセット（フォワード及びリバースプライマー）と接触させることができる。
上記の構成成分に加えて、ライゲートされたテンプレートを含む反応混合物は典型的には、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。所望のポリメラーゼ活性を、１つまたは複数の別個のポリメラーゼ酵素により得ることができる。反応混合物を調製する際に、例えば、ライゲートされたテンプレートを増幅するために、様々な構成成分を、任意の簡便な順序で合わせることができる。例えば、適切なバッファーを、１つまたは複数のプライマー、１つまたは複数のポリメラーゼ及び検出されるライゲートされたテンプレートと合わせることができるか、または様々な構成成分のすべてを同時に合わせて、反応混合物を生成することができる。
ＶＩ．使用
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載のとおりの検出方法及び／またはアッセイを使用して、卵巣癌についての１つまたは複数の標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるバイオマーカーを生物学的実体（例えば、細胞、循環腫瘍細胞、細胞非含有ＤＮＡ、細胞外小胞などを含む）を含む試料において検出することができる。一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載のとおりの検出方法及び／またはアッセイを使用して、卵巣癌についての１つまたは複数の標的バイオマーカーシグネチャーの１つまたは複数の提供されるバイオマーカーを、細胞外小胞を含む試料において検出することができる。
一部の実施形態では、試料は、生物学的試料であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、生物学的試料は、そのようなアッセイを必要とする対象（例えば、ヒト女性対象、例えば、ヒト成人女性対象）の血液または血液由来試料に由来し得る。一部の実施形態では、生物学的試料は、そのようなアッセイを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に由来する一次試料（例えば、組織または腫瘍試料）であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、目的の非標的実体から１つまたは複数の目的の実体（例えば、生物学的実体）を分離するために、及び／または１つまたは複数の目的の実体（例えば、生物学的実体）を富化するために、生物学的試料を処理することができる。一部の実施形態では、試料中に存在する目的の実体は、生物学的実体、例えば、細胞または細胞外小胞（例えば、エクソソーム）であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、例えば、生物学的実体中のアッセイされる標的（例えば、提供される標的バイオマーカー）を安定化及び／または架橋するために、及び／または検出プローブとの非特異的結合を減少させるために、そのような生物学的実体（例えば、細胞外小胞）を処理するか、または化学試薬と接触させることができる。一部の実施形態では、生物学的実体は、細胞であるか、またはそれを含み、これを任意選択で、例えば、標的（例えば、分子標的）を安定化及び／または架橋するために、及び／または非特異的結合を減少させるために化学試薬で処理することができる。一部の実施形態では、生物学的実体は、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）であるか、またはそれを含み、これを、任意選択で、例えば、標的（例えば、分子標的）を安定化及び／または架橋するために、及び／または非特異的結合を減少させるために化学試薬で処理することができる。
一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、例えば、１つまたは複数の個々の対象について、及び／または対象の集団全体で患者看護を管理するために有用であり得る。例に過ぎないが、一部の実施形態では、提供される技術を、例えば、周期的に、例えば、当業者が適切と考えるであろう年１回、半年に１回、２年に１回、またはいくつかの他の頻度で行うことができるスクリーニングで利用することができる。一部の実施形態では、そのようなスクリーニングは、一時的に動機づけられた、または偶発的に動機づけられたものであってよい。例えば、一部の実施形態では、提供される技術を、ある特定の年齢（例えば、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０歳超、またはそれ以上）よりも高齢である１つまたは複数の個々の対象についての、または対象の集団（例えば、無症候性女性対象）全体での、一時的に動機づけられたスクリーニングにおいて利用することができる。当業者には分かるであろうとおり、一部の実施形態では、スクリーニング年齢及び／または頻度を、例えば、これに限定されないが、疾患、障害、または状態（例えば、がん、例えば、卵巣癌）の有病率に基づき決定することができる。一部の実施形態では、提供される技術を、特定の疾患、障害、または状態（例えば、がん、例えば、卵巣癌）についてのスクリーニングを動機づける出来事または事象を経験していてもよい個々の対象のための偶発的動機づけのスクリーニングにおいて利用することができる。例えば、一部の実施形態では、当業者には分かるであろうとおり、疾患、障害、もしくは状態（例えば、がん、例えば、卵巣癌）またはそれへの易罹患性の１つまたは複数の指標の決定に関連する偶発的動機づけは、例えば、それらの家族歴（例えば、近親者、例えば、血縁者が以前にそのような疾患、障害、または状態、例えば、卵巣癌または乳癌がんと診断されている）、疾患、障害、または状態（例えば、卵巣癌）についての１つまたは複数の危険因子の同定及び／または遺伝子検査（例えば、ゲノムシーケンシング）からの先行の偶発的所見、及び／または画像診断検査（例えば、超音波、コンピューター断層撮影（ＣＴ）及び／または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン）、特定の疾患、障害、または状態に特徴的な１つまたは複数の徴候または症状の発生（例えば、卵巣癌を潜在的に示す生理中の異常な出血など）及び／または他の出来事または事象に基づく出来事であり得るか、またはそれを含み得る。
一部の実施形態では、患者看護を管理するために提供される技術は、処置及び／または支払い（例えば、処置費の償還）の決定及び／または行為を通知することができるものである。例えば、一部の実施形態では、提供される技術は、個々の対象が疾患または障害（例えば、がん、例えば、卵巣癌）のリスク、発生または再発の１つまたは複数の指標を有するかどうかの決定を提供することができ、それにより、医師及び／または患者に、そのような所見を考慮して、治療または予防の推奨を提供する／投与する、及び／またはそのような治療を開始する時を通知する。一部の実施形態では、そのような個々の対象は、定期的な頻度（例えば、年１回、半年に１回、２年に１回、または当業者が適切と考えるであろう他の頻度）で、一時的動機づけ、または偶発的動機づけでスクリーニングされ得る無症候性対象であり得る。一部の実施形態では、定期的な頻度（例えば、年１回、半年に１回、２年に１回、または当業者が適切と考えるであろう他の頻度）で、一時的動機づけ、または偶発的動機づけでスクリーニングされ得るそのような個々の対象は、卵巣癌と関連し得る１つまたは複数の症状を経験しているかもしれない。一部の実施形態では、定期的な頻度（例えば、年１回、半年に１回、２年に１回、または当業者が適切と考えるであろう他の頻度）で、一時的動機づけ、または偶発的動機づけでスクリーニングされ得るそのような個々の対象は、良性婦人科腫瘍及び／または慢性炎症状態を有する対象であり得る。一部の実施形態では、定期的な頻度（例えば、年１回、半年に１回、２年に１回、または当業者が適切と考えるであろう他の頻度）で、一時的動機づけ、または偶発的動機づけでスクリーニングされ得るそのような個々の対象は、卵巣癌について遺伝的リスクを有する対象であり得る。一部の実施形態では、定期的な頻度（例えば、年１回、半年に１回、２年に１回、または当業者が適切と考えるであろう他の頻度）で、一時的動機づけ、または偶発的動機づけでスクリーニングされ得るそのような個々の対象は、生活歴関連リスクを有する対象であり得る。一部の実施形態では、定期的な頻度（例えば、年１回、半年に１回、２年に１回、または当業者が適切と考えるであろう他の頻度）で、一時的動機づけ、または偶発的動機づけでスクリーニングされ得るそのような個々の対象は、閉経後対象であり得る。一部の実施形態では、そのような閉経後対象は、腹部疼痛及び／または骨盤疼痛と経験していてよい。
加えて、または別法では、一部の実施形態では、提供される技術は、例えば、特異的応答性バイオマーカー（例えば、がん応答性バイオマーカー）の所見に基づき、医師及び／または患者に、処置の選択を通知することができる。一部の実施形態では、提供される技術は、例えば、疾患と関連する１つまたは複数の分子標的のレベルの変化の所見に基づき、個々の対象が現行の処置に応答性であるかどうかの決定を提供することができ、それにより、医師及び／または患者に、そのような所見を考慮して、そのような治療及び／または決定の有効性を通知し、治療を維持または変更することができる。一部の実施形態では、提供される技術は、例えば、個々の対象に対して推奨される処置の治療効果を予測する分子標的（例えば、卵巣癌についての１つまたは複数の標的バイオマーカーシグネチャーの提供されるバイオマーカー）の所見に基づき、個々の対象が、推奨される処置に応答しそうかどうかの決定を提供し得る、それにより、医師及び／または患者に、そのような所見を考慮して、そのような治療の潜在的有効性及び／または治療を投与する、または変更する決定を通知することができる。
一部の実施形態では、提供される技術は、例えば、（１）スクリーニング自体（例えば、周期的／定期的なスクリーニングにのみ利用可能な、または一時的及び／または偶発的に動機づけられたスクリーニングにのみ利用可能な償還）について；及び／または（２）提供される技術による所見を考慮して治療を開始する、維持する、及び／または変更するかについて、健康保険提供者が償還する（または償還しない）かどうかについてに関する判定を通知し得る。例えば、一部の実施形態では、本開示は、（ａ）提供される技術を用いるスクリーニングの結果を受け取ること、及び同じく、スクリーニング及び／または特定の治療レジメンの償還についての要求を受け取ること；（ｂ）適切なスケジュール（例えば、ある特定の年齢よりも高齢であるなどのスクリーニング年齢、例えば、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０歳またはそれ以上、及び／またはスクリーニング頻度、例えば、３カ月ごと、６か月ごと、毎年、２年ごと、３年ごと、または一部の他の頻度に基づく）または関連の出来事に対する応答に従って対象で行われた場合に、スクリーニングの償還を承認すること、及び／または受け取ったスクリーニング結果を考慮して適切な処置である場合に、治療レジメンの償還を承認すること；ならびに、任意選択で（ｃ）償還を実施すること、または償還が拒否されるとの通知を提供することに関する方法を提供する。一部の実施形態では、受け取ったスクリーニング結果が、関連治療レジメンについて承認されたバイオマーカーであるバイオマーカーを検出している場合に、治療レジメンは、受け取ったスクリーニング結果を考慮して適切である（例えば、処方情報ラベルにおいて、及び／または承認されているコンパニオン診断により注記され得るとおり）。
別法では、または加えて、本開示は、スクリーニング結果（例えば、本開示に従って生成されるもの）、及び／または本明細書に記載のとおりの償還決定の報告及び処理を可能または容易にする報告システム（例えば、適切な電子デバイス（複数可）及び／またはコミュニケーションシステム（複数可）により実行される）を企図する。様々な報告システムが当技術分野で公知であり；当業者は、様々なそのような実施形態を十分に熟知しているであろうし、かつ実施態様に適したものを容易に選択することができるであろう。
例示的な使用
Ａ．卵巣癌発生または再発の検出
本開示は特に、単一の生物学的実体（例えば、個々の細胞外小胞）の分析ではなく、バルク試料に基づく生物学的実体（例えば、細胞外小胞）または複数のがん関連バイオマーカーにおける単一のがん関連バイオマーカーの検出が典型的には、その生物学的実体を得た対象ががん（例えば、卵巣癌）におそらく罹患しているか、またはそれに易罹患性であるかどうかを決定する際に十分な特異性及び／または感受性をもたらし得ないことを認識している。本開示は特に、例えば、検出のための実体（例えば、細胞外小胞）が少なくとも２つまたはそれ以上の標的（例えば、卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの少なくとも２つまたはそれ以上の提供されるバイオマーカー）の組合せの存在により特徴づけられることを特異的に必要とすることによることを含む、そのような問題を解決する組成物及び／または方法を含む技術を提供する。特定の実施形態では、本開示は、そのような実体（例えば、細胞外小胞）が、がんに特異的である分子標的の組合せ（すなわち、関連がん、例えば、卵巣癌の「標的バイオマーカーシグネチャー」）の存在により（例えば、発現により）特徴づけられる一方で、標的化組合せ（例えば、標的バイオマーカーシグネチャー）を含まない生物学的実体（例えば、細胞外小胞）は、検出可能なシグナルを生成しないことを必要とする技術を教示する。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、対象においてがんのリスク、発生、及び／または再発を検出するために有用であり得る。一部のそのような実施形態では、本明細書において提供される技術は、女性対象において卵巣癌のリスク、発生、及び／または再発を検出するために有用である。例えば、一部の実施形態では、２つまたはそれ以上の提供されるバイオマーカーの組合せを、特異的がん（例えば、卵巣癌）または様々ながん（その１つに卵巣癌が含まれる）を検出するために選択する。一部の実施形態では、卵巣癌を検出するための提供されるバイオマーカーの特異的組合せを、そのような予測組合せを同定するために卵巣癌患者生検及び／または患者データの集団またはライブラリ（例えば、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、またはそれ以上）を分析することにより決定することができる。一部の実施形態では、バイオマーカーの関連組合せは、例えば、データ解析を介して同定される、及び／または特徴づけられるものであり得る。一部の実施形態では、例えば、多様なセットの卵巣癌関連データ（例えば、一部の実施形態では、バルクＲＮＡシーケンシング、単一細胞ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）シーケンシング、質量分析法、組織診、翻訳後修飾データ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ実験データのうちの１つまたは複数を含む）を、卵巣癌に高度に特異的である予測マーカーの組合せを同定するために、機械学習及び／または計算モデルを介して分析することができる。一部の実施形態では、がん（例えば、卵巣癌）のステージを識別するための予測マーカーの組合せを、異なるステージのがん（例えば、卵巣癌）に関連する多様なデータ（例えば、一部の実施形態では、バルクＲＮＡシーケンシング、ｓｃＲＮＡシーケンシング、質量分析法、組織診、翻訳後修飾データ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ実験データを含む）を比較する、及び解析することに基づきｉｎ ｓｉｌｉｃｏで決定することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供される技術を、卵巣癌がん対象を、例えば、健康な女性対象、良性腫瘍または付属器腫瘤を有すると診断されている女性対象、及び非卵巣関連疾患、障害、及び／または状態を有する対象（例えば、非卵巣癌を有する女性対象、または炎症性腸疾患もしくは障害を有する女性対象）を含む非卵巣癌対象から識別するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、卵巣癌を早期検出する、例えば、ステージＩまたはステージＩＩの卵巣癌を検出するために有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、例えば、高異型度漿液性卵巣癌、類子宮内膜卵巣癌、明細胞卵巣癌、低異型度漿液性卵巣癌、または粘液性卵巣癌を含む、１つまたは複数の卵巣癌サブタイプを検出するために有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、早期ステージ高異型度漿液性卵巣癌について遺伝的リスクまたは平均的リスクを有する女性をスクリーニングするために有用であり得る。
一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、単一アッセイにおいて、特異的ながんのリスク、発生、または再発について対象をスクリーニングするために有用であり得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供される技術は、卵巣癌のリスク、発生、または再発について対象をスクリーニングするために有用である。一部の実施形態では、本明細書において提供される技術を、単一のアッセイにおいて、特異的ながんまたは複数（例えば、少なくとも２、少なくとも３、またはそれ以上）のがんのリスクまたは発生について対象をスクリーニングするために使用することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供される技術を、単一のアッセイにおいて、その１つに卵巣癌が含まれ、スクリーニングされるべき他のがんは、脳癌（例えば、神経膠芽腫を含む）、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、及び皮膚癌からなる群から選択され得る複数のがんについて、対象をスクリーニングするために使用することができる。
一部の実施形態では、卵巣癌（例えば、早期卵巣ステージがん）またはがん再発についてヒト対象（例えば、ヒト女性対象）をスクリーニングするために、提供される技術を周期的に（例えば、毎年、２年ごと、３年ごとなど）使用することができる。一部の実施形態では、そのようなスクリーニングに適したヒト対象は、それぞれ成人または高齢者であり得る。一部の実施形態では、そのようなスクリーニングに適したヒト対象は、閉経後女性であり得る。一部の実施形態では、そのようなスクリーニングに適したヒト対象は、例えば、６５歳超、７０歳超、少なくとも７５歳超、少なくとも８０歳、またはそれ以上の高齢女性であり得る。一部の実施形態では、一部の実施形態では、そのようなスクリーニングに適したヒト対象は、約５０歳またはそれ以上の年齢を有し得る。一部の実施形態では、そのようなスクリーニングに適したヒト対象は、５０歳またはそれ未満の年齢を有し得る。一部の実施形態では、そのようなスクリーニングに適したヒト対象は、３５歳超の年齢を有し得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の発生または再発を検出するために、提供される技術に適した対象は、一部の実施形態では、腹部疼痛及び／または骨盤疼痛を経験しているかもしれない閉経後ヒト女性対象であり得る。一部の実施形態では、卵巣癌の発生または再発を検出するために、提供される技術に適した対象は、少なくとも５５歳であり、かつ良性婦人科腫瘍及び／または１つまたは複数の慢性炎症状態を有すると決定されているヒト女性対象であり得る。一部の実施形態では、卵巣癌の発生または再発を検出するために、提供される技術に適した対象は、乳癌及び／または卵巣癌の家族歴を有する（例えば、乳癌及び／または卵巣癌の履歴を有する１人または複数の第一度近親者を有する女性）、がん（例えば、卵巣癌）について以前に処置されたことがある、がん処置後に卵巣癌再発のリスクを有する、卵巣癌処置後で寛解中である、及び／または例えば、卵巣癌について、少なくとも１つの卵巣癌バイオマーカーの存在についてスクリーニングすることにより（例えば、血清タンパク質ＣＡ－１２５を検出することにより、及び／または経腟超音波検査（ＴＶＵＳ）により）以前に、または周期的にスクリーニングされている、少なくとも５５歳の閉経後ヒト女性対象またはヒト女性対象であり得る。別法では、一部の実施形態では、閉経後ヒト女性対象または少なくとも５５歳のヒト女性対象は、卵巣癌について以前にスクリーニングされたことがない、卵巣癌について診断されたことがない、及び／または卵巣癌治療を以前に受けたことがない、女性対象であり得る。一部の実施形態では、閉経後ヒト女性対象または少なくとも５５歳のヒト女性対象は、良性婦人科腫瘍を有する女性対象であり得る。一部の実施形態では、閉経後対象は、（例えば、平均的集団リスクで、生活歴因子により上昇したリスクで、閉経期により上昇したリスクで、または卵巣癌についての遺伝的リスクで）卵巣癌に易罹患性である対象であり得る。
一部の実施形態では、本開示は特に、本明細書において記載及び／または利用される技術が、女性対象、例えば、卵巣癌を発症する高い罹患性を有する女性対象のある特定の集団をスクリーニングするために特に有用であり得るという洞察を提供する。一部の実施形態では、本開示は特に、ＨＧＳＯＣ検出について本明細書において記載及び／または利用される技術で生じるＰＰＶは、卵巣癌易発生または易罹患性の集団において、より高くなり得ることを認識している。一部の実施形態では、本開示は特に、閉経後個体のスクリーニング、例えば、症状（複数可）の発症前、またはそうでなければその非存在下での定期的なスクリーニングが、卵巣癌の有効な管理（例えば、成功裏の処置）に有利であり、重要でもあり得るという洞察を提供する。一部の実施形態では、本開示は、一部の実施形態では、閉経後個体（例えば、卵巣癌の遺伝的及び／または生活歴リスクを有する、または有さない、及び／または腹部及び／または骨盤疼痛などの症状を有する、または有さない）において、早期ステージがんを含む卵巣癌を検出するために実行することができる卵巣癌スクリーニングシステムを提供する。一部の実施形態では、提供される技術は、閉経後個体（例えば、卵巣癌の遺伝的及び／または生活歴リスクを有する、または有さない、及び／または腹部及び／または骨盤疼痛などの症状を有する、または有さない）の定期的なスクリーニングを達成するために実施することができる。一部の実施形態では、提供される技術は、提供される技術の単回及び／または定期的な（例えば、周期的）評価への有用な適用を可能にする適切な感受性及び／または特異性（例えば、擬陽性及び／または偽陰性結果の割合）で、卵巣癌の１つまたは複数の特徴（例えば、発生、進行、治療に対する応答性、再発など）の検出（例えば、無症候性個体（複数可）及び／または集団（複数可）における、例えば、早期検出）を達成する。一部の実施形態では、提供される技術は、マンモグラム、ＨＰＶ、及び／またはＰａｐスミアスクリーニングなどの女性の周期的な理学的検査（例えば、毎年、１年おき、または主治医の推奨間隔で）と併せて有用である。一部の実施形態では、提供される技術は、処置レジメン（複数可）と併せて有用である；一部の実施形態では、提供される技術は、そのような処置レジメン（複数可）の１つまたは複数の特徴（例えば、認められているパラメーターによる成功の割合）を改善し得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の発生または再発を検出するために、提供される技術に適した対象は、無症候性ヒト女性対象及び／または女性対象の無症候性集団全体であり得る。そのような無症候性対象及び／または女性対象の無症候性集団全体は、乳癌及び／または卵巣癌の家族歴を有する（例えば、乳癌及び／または卵巣癌の履歴を有する１人または複数の第一度近親者を有する女性）、がん（例えば、卵巣癌）について以前に処置されたことがある、がん処置後に卵巣癌再発のリスクを有する、卵巣癌処置後で寛解中である、及び／または、例えば、少なくとも１つの卵巣癌バイオマーカーの存在についてスクリーニングすることにより（例えば、血清タンパク質ＣＡ－１２５を検出することにより、及び／または経腟超音波検査（ＴＶＵＳ）により）卵巣癌について以前に、または周期的にスクリーニングされている、対象(複数可）であり得る。別法では、一部の実施形態では、無症候性対象は、卵巣癌について以前にスクリーニングされたことがない、卵巣癌について診断されたことがない、及び／または卵巣癌治療を以前に受けたことがない、女性対象であり得る。一部の実施形態では、無症候性対象は、良性婦人科腫瘍を有する女性対象であり得る。一部の実施形態では、無症候性対象は、（例えば、平均集団リスクで、または卵巣癌についての遺伝的リスクで）卵巣癌に易罹患性である対象であり得る。
一部の実施形態では、卵巣癌を検出するために、提供される技術に適した対象または対象の集団は、年齢、人種、遺伝的履歴、病歴、個人的履歴（例えば、喫煙、アルコール、薬物、発がん因子、食事、肥満、身体活動、日光曝露、放射線曝露、感染因子、例えば、ウイルスへの暴露、及び／または職業上の危険）などの１つまたは複数の特徴に基づき選択することができる。例えば、一部の実施形態では、卵巣癌を検出するために提供される技術に適した対象または対象の集団は、これに限定されないが、例えば、ＢＡＲＤ１、ＢＲＩＰ１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＣＨＥＫ２、ＭＲＥ１１Ａ、ＲＡＤ５０、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＡＬＢ２、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、及びそれらの組合せを含む、卵巣癌関連遺伝子における１つまたは複数の生殖細胞系変異を有すると決定された女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る。一部の実施形態では、卵巣癌を検出するために提供される技術に適した対象または対象の集団は、これに限定されないが、例えば、ＷＮＴ４、ＲＳＰＯ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＨＯＸＤ３、ＨＡＧＬＲ、ＴＩＰＡＲＰ、ＳＹＮＰＯ２、ＴＥＲＴ、ＧＰＸ６、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＬＩＮＣ００８２４、ＣＯＬ１５Ａ１、ＳＭＣ２－ＡＳ１、ＭＬＬＴ１０、ＩＮＣＥＮＰ、ＲＣＣＤ１、ＡＴＡＤ５、ＨＮＦ１Ｂ、ＰＬＥＫＨＭ１、ＳＫＡＰ１、ＡＮＫＬＥ１、ＧＡＴＡＤ２Ａ、Ｃｙｔｏｂａｎｄｓ及びＳＮＰｓ ２ｑ１３ ｒｓ７５２５９０、４ｑ３２．３ ｒｓ４６９１１３９、９ｐ２２ ｒｓ３８１４１１３、９ｑ３４．２ ｒｓ６３５６３４、１０ｐ１１．２１ ｒｓ１１９２６９１、及び／または１９ｑ１３．２ ｒｓ６８８１８７を含む、卵巣癌と関連するとゲノムワイド関連解析により決定された特異的な遺伝子座で、またはある特定の遺伝子内に１つまたは複数の生殖細胞系一塩基多型を有すると決定された女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る（Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．、２０１７；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。
一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２及び／またはＰＡＬＢ２において生殖細胞系変異を有すると決定された乳癌を有する女性対象（例えば、成人女性）または女性対象の集団（例えば、女性）であり得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、年齢、人種、遺伝的履歴、病歴、個人的履歴（例えば、喫煙、アルコール、薬物、発がん因子、食事、肥満、糖尿病、未経産／不妊、経口避妊薬使用の履歴がないこと／短期履歴、身体活動、日光曝露、放射線曝露、会陰部タルク使用、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）、感染因子、例えば、ウイルスへの暴露、及び／または職業上の危険）などの１つまたは複数の特徴に基づき選択することができる。例えば、一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、１つまたは複数の生活歴関連危険因子を有すると決定されている女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、画像で確認される付属器腫瘤または骨盤腫瘤を有すると診断されている女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、リスク低減卵管卵巣摘出術を受ける前の、遺伝的リスクを有する女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、卵巣癌の１つまたは複数の非特異的症状を有する女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る。一部の実施形態では、卵巣癌の例示的な非特異的症状には、過敏性腸症候群の１つまたは複数の症状と同様の症状が含まれ得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の発生または再発を検出するために、提供される技術に適した対象は、症候性ヒト女性対象及び／または女性対象の症候性集団全体であり得る。そのような症候性対象及び／または女性対象の症候性集団全体は、乳癌及び／または卵巣癌の家族歴を有する（例えば、乳癌及び／または卵巣癌の履歴を有する１人または複数の第一度近親者を有する女性）、がん（例えば、卵巣癌）について以前に処置されたことがある、がん処置後に卵巣癌再発のリスクを有する、卵巣癌処置後で寛解中である、及び／または、例えば、少なくとも１つの卵巣癌バイオマーカーの存在についてスクリーニングすることにより（例えば、血清タンパク質ＣＡ－１２５を検出することにより、及び／または経腟超音波検査（ＴＶＵＳ）により）卵巣癌について以前に、または周期的にスクリーニングされている、対象（複数可）であり得る。別法では、一部の実施形態では、症候性対象は、卵巣癌について以前にスクリーニングされたことがない、卵巣癌について診断されたことがない、及び／または卵巣癌治療を以前に受けたことがない、女性対象であり得る。一部の実施形態では、症候性対象は、良性婦人科腫瘍を有する女性対象であり得る。一部の実施形態では、症候性対象は、（例えば、平均集団リスクで、または卵巣癌についての遺伝的リスクで、卵巣癌についての生活歴関連リスクで、及び／または卵巣癌についての年齢関連リスクで）卵巣癌に易罹患性である対象であり得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、アジア人、アフリカ系アメリカ人、白人、ハワイもしくは他の太平洋諸島の先住民、ヒスパニックもしくはラテン系、北米インディアンもしくはアラスカ先住民、非ヒスパニック系黒人、または非ヒスパニック系白人の女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る。一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、アジア太平洋諸島の先住民、ヒスパニック、北米インディアン／アラスカ先住民、非ヒスパニック系黒人、または非ヒスパニック系白人の女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る。一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、任意の人種及び／または任意の民族の女性対象（例えば、成人女性）または女性対象（例えば、成人女性）の集団であり得る。
一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、正常な血清ＣＡ－１２５レベル（例えば、３５Ｕ／ｍＬ未満のレベル）を有すると決定されていてよい。一部の実施形態では、卵巣癌の検出のために提供される技術に適した対象または対象の集団は、正常な血清ＣＡ－１２５レベル（例えば、３５Ｕ／ｍＬ未満のレベル）と同等か、またはそれよりも高い血清ＣＡ－１２５レベルを有すると決定されていてよい。
一部の実施形態では、本明細書において提供される技術を、例えば、これに限定されないが（ｉ）女性の毎年の理学的検査（例えば、子宮頸癌ではＨＰＶ、及び／またはＰａｐスミアスクリーニング及び乳癌ではマンモグラムスクリーニングを含む）；（ｉｉ）血清ＣＡ－１２５及び／またはＴＶＵＳスクリーニング検査；（ｉｉｉ）がんに関連する循環腫瘍ＤＮＡ及び／またはタンパク質バイオマーカーにおける遺伝子変異について血漿をスクリーニングするための遺伝子アッセイ；（ｉｖ）細胞表現型及びマーカー発現を同定するための免疫蛍光染色、続いて、次世代シーケンシングによる増幅及び分析を含むアッセイ；ならびに（ｖ）ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２生殖細胞系及び体細胞変異アッセイ、または細胞非含有腫瘍ＤＮＡ、リキッドバイオプシー、血清タンパク質及び細胞非含有ＤＮＡ、ＯＶＡ１（登録商標）及びＯＶＥＲＡ（登録商標）検査、及び／または循環腫瘍細胞を伴うアッセイを含む、他の診断アッセイと組み合わせて使用することができる。
Ｂ．がん治療（例えば、卵巣癌治療）の選択
一部の実施形態では、提供される技術を、がん患者（例えば、卵巣癌に罹患しているか、またはそれに易罹患性である患者）のために適切な処置を選択するために使用することができる。例えば、本明細書において提供される一部の実施形態は、がん治療（例えば、卵巣癌及び／または補助処置）のために患者を分類するためのコンパニオン診断アッセイに関し、これは、本明細書において提供される技術を使用して、提供されるバイオマーカーの選択された組合せを患者試料（例えば、卵巣癌患者由来の血液または血液由来試料）において評価することを含む。そのようなアッセイ結果に基づき、がん治療（例えば、オラパリブ、シスプラチン、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブを含む、例えば、卵巣癌治療及び／または補助治療）におそらく応答するであろうと決定された患者に、そのような治療を投与することができるか、または特異的なそのような治療に応答しないであろうと決定された患者に、異なる治療を投与することができる。
Ｃ．処置有効性（例えば、がん処置有効性）の評価
一部の実施形態では、本明細書において提供される技術を、がん患者（例えば、卵巣癌患者）に投与される抗がん治療の有効性をモニター及び／または評価するために使用することができる。例えば、第１の時点で、血液または血液由来試料を、抗がん治療（例えば、オラパリブ、シスプラチン、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ）前か、または治療を受けている卵巣癌患者から収集して、卵巣癌の検出に特異的であるバイオマーカーの選択された組合せを含む細胞外小胞の存在または量を検出することにより、腫瘍量を検出または測定することができる。処置期間後に、第２の血液または血液由来試料を同じ卵巣癌患者から収集して、例えば、卵巣癌の検出に特異的であるバイオマーカーの選択された組合せを含む細胞外小胞の非存在またはその量の減少を検出することにより、腫瘍量の変化を検出することができる。処置の間に腫瘍量のレベル及び／または変化をモニターすることにより、適切な行動計画、例えば、治療薬の用量の増減、及び／または異なる治療薬の投与を採用することができる。
ＶＩＩ．キット
上記のとおりの技術を実行する際に使用することができるキットも提供する。一部の実施形態では、キットは、複数の検出プローブ（例えば、本明細書において記載及び／または利用されるとおりのもの）を含む。一部の実施形態では、提供されるキットは、２つまたはそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）の検出プローブを含み得る。一部の実施形態では、個々の検出プローブは、異なる標的を指向し得る。一部の実施形態では、２つまたはそれ以上の個々の検出プローブは、同じ標的を指向し得る。一部の実施形態では、提供されるキットは、異なる標的を指向する２つまたはそれ以上の異なる検出プローブを含み、任意選択で、別の検出プローブが指向する標的を同じく指向する少なくとも１つの追加の検出プローブを含み得る。一部の実施形態では、提供されるキットは、同じ標的を指向する２つまたはそれ以上の検出プローブをそれぞれ含む検出プローブの複数のサブセットを含む。一部の実施形態では、複数の検出プローブを、１つの容器中で混合物として提供することができる。一部の実施形態では、検出プローブの複数のサブセットを、別々の容器中で個々の混合物として提供することができる。一部の実施形態では、それぞれの検出プローブを、別々の容器中で個々に提供する。
一部の実施形態では、卵巣癌を検出するためのキットは、（ａ）細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む捕捉因子；及び（ｂ）卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの標的バイオマーカーをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含む検出プローブのセットを含み、その際、上記検出プローブはそれぞれ、（ｉ）卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの標的バイオマーカーを指向する標的結合部分と；（ｉｉ）上記標的結合部分にカップリングしたオリゴヌクレオチドドメインとを含み、上記オリゴヌクレオチドドメインは、二本鎖部分と、上記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハング部分とを含み、上記少なくとも２つの検出プローブの一本鎖オーバーハング部分は、少なくとも２つの検出プローブが同じ細胞外小胞に結合した場合にそれらが相互にハイブリダイズし得ることにおいて特徴づけられる。これらの実施形態では、卵巣癌についてのそのような標的バイオマーカーシグネチャーは：
少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、及び小胞内ＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含み、その際：
・ 上記表面タンパク質バイオマーカーは、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せから選択され；
・ 上記小胞内タンパク質バイオマーカーは、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せから選択され；
・ 上記小胞内ＲＮＡバイオマーカーは、ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せから選択される；
一部の実施形態では、少なくとも１つの標的バイオマーカーが、提供される表面タンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数から選択される場合に、選択される表面タンパク質バイオマーカー（複数可）及び少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは異なる。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的バイオマーカーが、提供される表面タンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数から選択される場合に、選択される表面タンパク質バイオマーカー（複数可）及び少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドは、同じである（同じか、または異なるエピトープを用いる）。
一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む。
一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＣＤ２４ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＰＴＧＳ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ｓＴｎポリペプチドグリコシル化であるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＡＬＰＬポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＢＳＴ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＣＬＤＮ３ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。一部の実施形態では、キットで提供される捕捉因子は、ＣＬＤＮ６ポリペプチドであるか、またはそれを含む細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む。
一部の実施形態では、キットで提供される少なくとも２つの検出プローブの標的結合部分はそれぞれ、標的バイオマーカーシグネチャーの同じ標的バイオマーカーを指向する。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＭＵＣ１６であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＦＯＬＲ１であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＣＬＤＮ３であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＣＬＤＮ６であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＳＬＣ３４Ａ２であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＳＬＣ２Ａ１であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＭＵＣ１であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＭＳＬＮであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＡＱＰ５であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ｓＴｎであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、そのような同じ標的バイオマーカーは、ＴＡＣＳＴＤ２であるか、またはそれを含む。一部のそのような実施形態では、そのような少なくとも２つの検出プローブのオリゴヌクレオチドドメインは異なる。
一部の実施形態では、キットで提供される少なくとも２つの検出プローブの標的結合部分はそれぞれ、標的バイオマーカーシグネチャーの別個の標的バイオマーカーを指向する。例えば、一部の実施形態では、キットは、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する少なくとも２つの検出プローブを含む。一部の実施形態では、キットは、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドを指向する少なくとも２つの検出プローブを含む。一部の実施形態では、キットは、ＦＯＬＲ１ポリペプチド及びＣＬＤＮ３ポリペプチドを指向する少なくとも２つの検出プローブを含む。一部の実施形態では、キットは、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＣＬＤＮ６ポリペプチドを指向する少なくとも２つの検出プローブを含む。
一部の実施形態では、検出プローブの標的結合部分は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）であり得るか、またはそれらを含み得る。
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つの化学試薬、例えば、固定剤、透過化剤、及び／または遮断剤を含み得る。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の核酸ライゲーション試薬（例えば、核酸リガーゼ、例えば、ＤＮＡリガーゼ及び／またはバッファー液）を含み得る。
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つまたは複数の増幅試薬、例えば、ＰＣＲ増幅試薬を含み得る。一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）、１つまたは複数の対のプライマー、ヌクレオチド、及び／または緩衝液を含み得る。
一部の実施形態では、キットは、目的の実体（例えば、生物学的実体）を捕捉するための固体基材を含み得る。例えば、そのような固体基材は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、そのような固体基材は、表面であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、表面は、アッセイチャンバーの捕捉表面（例えば、実体捕捉表面）、例えば、フィルター、マトリックス、膜、プレート、管、及び／またはウェル（例えば、これに限定されないが、マイクロウェル）などであり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、固体基材の表面（例えば、捕捉表面）を、目的の実体（例えば、生物学的実体）のための捕捉因子（例えば、ポリペプチドまたは抗体因子）でコーティングすることができる。
一部の実施形態では、キットに提供される検出プローブのセットを、卵巣癌を診断するために選択することができる。
一部の実施形態では、キットは、検出プローブの複数のセットを含み得、その際、検出プローブのそれぞれのセットは、特異的がんの検出を指向し、少なくとも２つまたはそれ以上の検出プローブを含む。例えば、そのようなキットを、単一のアッセイにおいて、そのうちの１つは卵巣癌であり、他のがんは、皮膚癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、及び肝臓癌から選択されてよい様々ながんについて対象をスクリーニングするために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるキットは、本明細書に記載の方法を実行するための指示書を含み得る。これらの指示書は、様々な形態でキット内に存在してよく、そのうちの１つまたは複数は、キット内に存在し得る。これらの指示書が存在し得る１つの形態は、キットのパッケージング内、添付文書内などで、適切な媒体または基材上の印刷された情報、例えば、情報が印刷された紙片としてである。また別の手段は、指示情報が記録されているコンピューター読み取り可能な媒体、例えば、ディスク、ＣＤ、ＵＳＢドライブなどであってよい。存在し得るまた別の手段は、インターネットを介して指示情報にアクセスするために使用することができるウェブサイトアドレスである。任意の簡便な手段がキット内に存在してよい。
キットがコンパニオン診断として使用される一部の実施形態では、そのようなキットは、治療薬におそらく応答する患者を同定するための指示書（例えば、治療薬に対する患者応答性を示すバイオマーカーの同定）を含み得る。一部の実施形態では、そのようなキットは、コンパニオン診断検査とタンデムで使用するための治療薬を含み得る。
本発明を説明するために示すものであって、本発明を限定することを意図したものではない例示的な実施形態の次の記載の過程で、本発明の他の特徴が明らかになるであろう。
実施例１：卵巣癌と関連する個々の細胞外小胞における例示的な標的バイオマーカーシグネチャーの検出
本実施例では、標的結合部分と、その標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメイン（二本鎖部分及び一本鎖オーバーハングを含む）とをそれぞれ含む、標的（例えば、標的バイオマーカー（複数可））のための検出プローブの合成を記載する。本実施例ではさらに、２つまたはそれ以上の別個の標的を含む生物学的実体（例えば、細胞外小胞）の存在または非存在を検出するためのそのような検出プローブの使用を実証する。
一部の実施形態では、検出プローブは、一方の末端には標的がんバイオマーカーに特異的な抗体因子、及び別の末端には一本鎖オーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含み得る。２つまたはそれ以上の検出プローブが同じ生物学的実体（例えば、細胞外小胞）に結合する場合、検出プローブの一本鎖オーバーハングが近接して、それらが相互にハイブリダイズし、後でライゲートして検出のために増幅することができる二本鎖複合体を形成し得るようになっている。
この研究では、１つのセットにおいて少なくとも２つの検出プローブを用いた。一部の実施形態では、そのような少なくとも２つの検出プローブは、同じ標的を指向し、同じ標的の異なるエピトープまたは同じ標的の同じエピトープを指向し得る。一部の実施形態では、そのような少なくとも２つの検出プローブは、別個の標的を指向する。本開示を読む当業者は、２つの検出プローブが、異なる標的バイオマーカーを指向し得るか、または別個の標的タンパク質をそれぞれ指向する３つもしくはそれ以上の検出プローブを使用してもよいことを理解するであろう。さらに、この実施例に記載の組成物及び方法を、異なる生物学的試料（例えば、細胞外小胞を含むもの）での適用に拡大することができる。
本実施例は、本明細書において提供される技術が、本明細書に記載のとおりの例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６、例えば、一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉をＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体ベースの検出プローブと共に使用）を使用して、患者試料において卵巣癌（例えば、卵巣嚢胞腺癌、及び／または高異型度漿液性卵巣癌）を検出することができることを実証するある特定の実験からの実験データを示す。第１の実験は、本明細書に記載の二重システムアッセイを使用して、ＰＢＳ中で２つの異なる卵巣癌細胞系由来細胞外小胞（ＣＬＤ－ＥＶ）の検出を実証した。例えば、図３を参照されたい。
ＣＬＤ－ＥＶを検出することができるそのような二重システムアッセイで、それぞれのステージ（ステージＩ～ＩＶ）及び／またはサブタイプの卵巣癌からの、及び様々な対照群（例えば、健康な対象、良性婦人科腫瘍を有する対象、及び非卵巣癌）からの患者試料を含む研究を実行した。ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を含む標的バイオマーカーシグネチャーを伴う例示的な二重システムアッセイの実行を示す実施例６、図７～１３を参照されたい。
例示的なアッセイの概観
一部の実施形態では、本明細書に記載の標的実体検出システムは二重システムである。一部の実施形態では、例えば、図２に図示のとおりのそのような二重システムは、それぞれ異なるエピトープを認識する２つの抗体を利用する。対合二本鎖テンプレートＤＮＡもｑＰＣＲで利用し、それらはそれぞれ、そのパートナー上の５’オーバーハングに相補的な特異的な４塩基５’オーバーハングを有する。各抗体を、２つの二本鎖ＤＮＡテンプレートの一方とコンジュゲートさせる。抗体がそれらの標的エピトープに結合すると、それぞれのテンプレートの接着性末端がハイブリダイズし得る。次いで、ＰＣＲ増幅前に、これらの接着性末端をＴ７リガーゼにより一緒にライゲートする。２つのＤＮＡテンプレート間でハイブリダイゼーションが生じるためには、上記２つの抗体は、相互に十分に近接して結合している必要がある（例えば、５０～６０ｎｍ以内、ＤＮＡリンカー及び抗体因子の長さ）。結合しているが、ライゲートされないままであるテンプレートはいずれも、図２に示されているとおり、ＰＣＲ産物を生成しないこととなる。
健康な対照 対 ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ卵巣嚢胞腺癌（ＯＣ）血漿：
健康な対照及びＯＣ患者からの血漿試料を処理して、精製された細胞外小胞を得、これを、下記のとおりの例示的なアッセイを使用して調べた。
抗ＳＬＣ３４Ａ２抗体と共有結合性にコンジュゲートした磁気ビーズを使用して、精製ＥＶを捕捉した。ビーズにより捕捉されたＥＶを、抗ＭＵＣ１６抗体と、別個のオリゴヌクレオチドドメイン（例えば、本明細書に記載のもの）とをそれぞれ含む２つの検出プローブのセットを使用してプロファイルした。
ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６のバイオマーカー組合せを、健康な組織由来の細胞外小胞との交差反応性を最小限にするように慎重に選択した。一部では、標的がん、例えば、卵巣嚢胞腺癌において示差的に発現されるｍＲＮＡのヒートマップを使用することにより、そのようなバイオマーカー組合せと健康な組織との交差反応性をバイオインフォマティクスで予測した。したがって、マーカーの種々の組合せが、健康な組織からの細胞外小胞の表面上においてよりも、卵巣癌細胞外小胞の表面上でかなり豊富であると予測され得る。一部の実施形態では、そのようなバイオマーカー組合せは、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を含む。
Figure 2023510911000008
例示的な方法：
オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、次の配列構造及び修飾を有し得る。下の鎖番号が、図２に示されている鎖に付随する数値に対応することに注意する。
鎖１ｖ１：
／５ＡｚｉｄｅＮ／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＴＡＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＡｚｉｄｅＮ／は、ＮＨＳエステルリンカーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアジド基を指す）、または
／５ＡｍＭＣ１２／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＴＡＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＡｍＭＣ１２／は、１２－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアミン基（例えば、第一級アミノ基）を指す）、または
／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＴＡＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／は、６－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているチオールを指す）。
鎖２ｖ１：
／５ＡｚｉｄｅＮ／ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＡｚｉｄｅＮ／は、ＮＨＳエステルリンカーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアジド基を指す）、または
／５ＡｍＭＣ１２／ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＡｍＭＣ１／は、１２－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアミン基（例えば、第一級アミノ基）を指す）、または
／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／は、６－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているチオールを指す）。
鎖３ｖ１：／５Ｐｈｏｓ／ＧＡＧＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧＡＴＴＡＡＣＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧ（ここで、／５Ｐｈｏｓ／は、オリゴヌクレオチド末端に結合したリン酸基を指す）
鎖４ｖ１：／５Ｐｈｏｓ／ＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣＴＡＡＴＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣ（ここで、／５Ｐｈｏｓ／は、オリゴヌクレオチド末端に結合したリン酸基を指す）
鎖５ｖ１：
ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴ
鎖６ｖ１：
ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡ
鎖７（プローブ）ｖ１：
／５６－ＦＡＭ／ＴＧＧＣＴＡＧＡＣ／ＺＥＮ／ＡＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／（ここで、／５６－ＦＡＭ／は、５’オリゴヌクレオチド末端のフルオレセイン（例えば、６－ＦＡＭ）を指し；かつ／３ＩＡＢｋＦＱ／は、３’オリゴヌクレオチド末端のフルオレセインクエンチャーを指す）。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、次の配列構造及び修飾を有し得る。下の鎖番号が、図２に示されている鎖に付随する数値に対応することに注意する。
鎖１ｖ２：
／５ＡｚｉｄｅＮ／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＣＧＴＴＡＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＡｚｉｄｅＮ／は、ＮＨＳエステルリンカーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアジド基を指す）、または
／５ＡｍＭＣ１２／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＣＧＴＴＡＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＡｍＭＣ１２／は、１２－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアミン基（例えば、第一級アミノ基）を指す）、または
／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＣＧＴＴＡＡＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／は、６－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているチオールを指す）
鎖２ｖ２：
／５ＡｚｉｄｅＮ／ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＡｚｉｄｅＮ／は、ＮＨＳエステルリンカーを介して５’オリゴヌクレオチドに結合しているアジド基を指す）、または
／５ＡｍＭＣ１２／ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＡｍＭＣ１／は、１２－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアミン基（例えば、第一級アミノ基）を指す）、または
／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／は、６－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているチオールを指す）
鎖３ｖ２：／５Ｐｈｏｓ／ＧＡＧＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧＡＴＴＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＣＴＧ（ここで、／５Ｐｈｏｓ／は、５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているリン酸基を指す）
鎖４ｖ２：／５Ｐｈｏｓ／ＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣＴＡＡＴＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＴＧＧＴＧ（ここで、／５Ｐｈｏｓ／は、５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているリン酸基を指す）
鎖５ｖ２：
ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＣＧＴ
鎖６ｖ２：
ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＣＡ
鎖７（プローブ）ｖ２：
／５６－ＦＡＭ／ＴＧＧＣＴＡＧＡＣ／ＺＥＮ／ＡＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／（ここで、／５６－ＦＡＭ／は、５’オリゴヌクレオチド末端のフルオレセイン（例えば、６－ＦＡＭ）を指し；かつ／３ＩＡＢｋＦＱ／は、３’オリゴヌクレオチド末端のフルオレセインクエンチャーを指す）。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、次の配列構造及び修飾を有し得る。下の鎖番号が、図２に示されている鎖に付随する数値に対応することに注意する。
鎖１ｖ１－ｍｅｄ：
／５ＡｚｉｄｅＮ／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＡｚｉｄｅＮ／は、ＮＨＳエステルリンカーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアジド基を指す）、または
／５ＡｍＭＣ１２／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＡｍＭＣ１２／は、１２－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアミン基（例えば、第一級アミノ基）を指す）、または
／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴ（ここで、／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／は、６－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているチオールを指す）。
鎖２ｖ１－ｍｅｄ：
／５ＡｚｉｄｅＮ／ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＡｚｉｄｅＮ／は、ＮＨＳエステルリンカーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアジド基を指す）、または
／５ＡｍＭＣ１２／ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＡｍＭＣ１／は、１２－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているアミン基（例えば、第一級アミノ基）を指す）、または
／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧ（ここで、／５ＴｈｉｏｌＭＣ６／は、６－炭素スペーサーを介して５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているチオールを指す）
鎖３ｖ１－ｍｅｄ：
／５Ｐｈｏｓ／ＧＡＧＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧ（ここで、／５Ｐｈｏｓ／は、５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているリン酸基を指す）
鎖４ｖ１－ｍｅｄ：
／５Ｐｈｏｓ／ＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣ（ここで、／５Ｐｈｏｓ／は、５’オリゴヌクレオチド末端に結合しているリン酸基を指す）
鎖５ｖ１：
ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴ
鎖６ｖ１：
ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡ
鎖７（プローブ）ｖ１：
／５６－ＦＡＭ／ＴＧＧＣＴＡＧＡＣ／ＺＥＮ／ＡＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／（ここで、／５６－ＦＡＭ／は、５’オリゴヌクレオチド末端のフルオレセイン（例えば、６－ＦＡＭ）を指し；かつ／３ＩＡＢｋＦＱ／は、３’オリゴヌクレオチド末端のフルオレセインクエンチャーを指す）。
抗体－オリゴヌクレオチド（例えば、抗体－ＤＮＡ）コンジュゲーション：
例えば、銅非含有クリック化学を使用して、２５～１００μｇの範囲の抗体アリコットを、オリゴヌクレオチド鎖とコンジュゲートし、例えば、抗ＭＵＣ１６抗体の６０μｇアリコットを、ハイブリダイズした鎖１＋３及び２＋４とコンジュゲートした。第１のステップは、アジド修飾オリゴヌクレオチドドメイン（例えば、ＤＮＡドメイン）とのコンジュゲーション反応に参加するＤＢＣＯ官能化抗体を調製することであった。これは、上記抗体とＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＮＨＳヘテロ二官能性架橋リンカーとの反応から開始した。ＮＨＳエステルと利用可能なリシン基との間の反応を室温で２時間にわたって行い、その後、未反応の架橋剤を、遠心限外濾過を使用して除去した。コンジュゲーションを完了するために、アジド修飾オリゴヌクレオチドドメイン（例えば、ＤＮＡドメイン）及びＤＢＣＯ官能化抗体を終夜、室温で反応させた。コンジュゲートされた抗体の濃度を、Ｑｕｂｉｔタンパク質アッセイを使用して測定した。
細胞培養
陰性対照細胞（例えば、非卵巣癌細胞、例えば、黒色腫細胞または健康な細胞）を１０％エクソソーム非含有ＦＢＳ及び１ｍＬあたり５０単位のペニシリン／ストレプトマイシンを含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で成長させた。卵巣嚢胞腺癌細胞を、１０％エクソソーム非含有ＦＢＳ及び１ｍＬあたり５０単位のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ １６４０）中で成長させた。卵巣癌を検出するためのアッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）を開発するために有用であり得る例示的な卵巣癌細胞系には、これに限定されないが、Ａ２７８０、Ｃａｏｖ－３、ＣＯＶ４１３Ａ、ＥＳ２、ＯＶＣＡＲ－３、ＯＶ９０、ＰＡ－１、ＳＫ－ＯＶ－３、ＳＷ６２６、ＴＯＶ－１１２、及び本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用されるＩｎｃｅ ｅｔ ａｌ．、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｅｎｔｙ－ｆｉｖｅ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｐｈｅｎｏｃｏｐｙ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｕｒｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６：７４１９（２０１５）に記載の細胞系が含まれる。すべての細胞系を５％ＣＯ２及び３７℃で維持し、継代数は２０未満であった。
細胞培養培地からの細胞外小胞の精製
一部の実施形態では、卵巣癌細胞及び陰性対照細胞を、約８０％の集密度に達するまでそれぞれの培地中で成長させた。細胞培養培地を収集し、３００×ｒｃｆで５分間にわたって室温で（ＲＴ）でスピンさせて、細胞及び破片を除去した。次いで、上清を収集し、－８０℃で冷凍した。
使用前に、－８０℃で貯蔵した冷凍上清を解凍し、次いで、細胞及び大きな（例えば、直径１ミクロン超）細胞断片から清澄にした。解凍した上清を、遠心分離を使用して清澄にした。
一部の実施形態では、清澄にした細胞培養培地（例えば、約５００ｕＬ）をサイズ排除精製カラムに流した。約６５ｎｍ～約１０００ｎｍのサイズ範囲を有するナノ粒子を各試料で収集した。一部の実施形態では、より小さな粒子範囲が望ましいことがある。
粒子カウント
６５～１０００ｎｍのナノ粒子範囲を測定するために、例えば、ＴＳ４００チップを用いるＳｐｅｃｔｒｏＤｙｎｅ粒子計数器を使用して、粒子カウントを得た。一部の実施形態では、より小さな粒子範囲が望ましいことがある。
患者血漿プールの生成：
一部の実施形態では、プールされた患者血漿プールを利用した。簡単に述べると、患者血漿の１ｍＬアリコットを室温で少なくとも３０分間にわたって解凍した。管を短時間ボルテックス処理し、回転させて血漿を各管の底部に圧密した。所与の患者コホートからの血漿試料を、適切にサイジングされた容器内で合わせ、転倒型混合により十分に混合した。各血漿プールをＰｒｏｔｅｉｎ Ｌｏ－ｂｉｎｄ １．５ｍＬエッペンドルフ管内で１ｍＬアリコットに分け、－８０℃で再凍結した。
全血漿清澄化（任意選択）：
一部の実施形態では、ＥＶ精製の前に、試料の取り扱いに参加しないことになっている人が、試料を盲検化した。データ解析を可能にするために、実験が完了した後に初めて、患者－同定情報を明らかにした。１ｍＬアリコットの全血漿を－８０℃での貯蔵から取り出し、３回の清澄化スピンに掛けて、細胞、血小板、及び破片を除去した。
清澄化血漿からのＥＶのサイズ排除クロマトグラフィー精製：
それぞれの清澄化血漿試料（個々の試料またはプール試料）を、使い捨てサイズ排除精製カラムに流して、ＥＶを単離した。約６５ｎｍ～約１０００ｎｍのサイズ範囲を有するナノ粒子を各試料で収集した。一部の実施形態では、より小さな粒子範囲が望ましいことがある。
磁気捕捉ビーズへの捕捉－抗体コンジュゲーション：
抗体を、磁気ビーズ（例えば、エポキシ官能化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））にコンジュゲートさせた。簡単に述べると、ビーズを滅菌環境下で秤量し、バッファー中に再懸濁させた。抗体を官能化ビーズと混合し、コンジュゲーション反応を転倒型混合で行った。ビーズを、コンジュゲーションキットが提供する洗浄バッファーを使用して複数回洗浄し、４℃で、提供された貯蔵バッファー中で貯蔵した。
抗体－コンジュゲートした磁気ビーズを使用しての精製血漿ＥＶの直接的捕捉：
ある特定の実施形態では、精製血漿ＥＶを清澄化血漿試料から直接的に捕捉した。例えば、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉のために、精製血漿ＥＶの希釈試料を、抗ＳＬＣ３４Ａ２抗体とコンジュゲートした磁気ビーズと共に適切な期間にわたって、例えば、室温でインキュベートした。
磁気捕捉ビーズ上に結合したＥＶへの抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの結合：
抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート（（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート；「抗体プローブ」）を、適切なバッファー中で、それらの最適な濃度で希釈した。抗体プローブを、磁気捕捉ビーズ上に結合したＥＶを含む試料と相互作用させた。
結合後洗浄：
一部の実施形態では、試料を、適切なバッファー中で、例えば複数回洗浄した。
ライゲーション：
洗浄して非結合抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを除去した後に、結合した細胞外小胞及び結合した抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを有するビーズをライゲーションミックスと接触させた。混合物を２０分間にわたって室温でインキュベートした。
ＰＣＲ：
ライゲーションの後に、結合した細胞外小胞及び結合した抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを有するビーズをＰＣＲミックスと接触させた。ＰＣＲを、９６ウェルプレートにおいて、例えば、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ３で、次の例示的なＰＣＲプロトコルを用いて行った：９５℃で１分間にわたって保持、９５℃で５秒間及び６２℃で１５秒間を５０サイクル実行。温度変化の速度は、標準（例えば、１秒あたり２℃）であるように選択した。単一のｑＰＣＲ反応を各実験反復で行い、ｑＰＣＲシグナルを正規化するために、ＲＯＸをパッシブ基準として使用した。次いで、データをＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ３ ｍａｃｈｉｎｅからダウンロードし、Ｐｙｔｈｏｎ ３．７で解析してグラフ化した。
データ解析：
一部の実施形態では、２項分類システムをデータ解析のために使用することができる。一部の実施形態では、検出アッセイからのシグナルを、基準シグナルに基づき正規化することができる。例えば、一部の実施形態では、単一抗体二本鎖での正規化シグナルを、基準試料を選択することにより計算した。一部の実施形態では、任意試料ｉについて正規化シグナルを計算するために使用した式を下に示すが、ここで、Ｓｉｇｎａｌｍａｘは、最高濃度の細胞系ＥＶ標準からのシグナルである。
Figure 2023510911000009
代表的な結果：
ＯＣ細胞系実験
精製細胞系ＥＶを、適切なバッファー中で最適な濃度に希釈し、ＳＬＣ３４Ａ２官能化ビーズ（例えば、１ｍＬ以下の複製物）を使用して捕捉した。捕捉されたＥＶを、ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブ（「ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブ」としても公知）を使用して分析した。代表的なｑＰＣＲデータ及びΔＣｔ値が図３に示されている。データは、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６のバイオマーカー組合せ（例えば、本実施例において記載され、かつ図１～２に図示されているとおりのものなどの、例えば、例示的なアッセイとの組合せ）が、２つのマーカーの発現と十分に相関するシグナル強度で、ＯＣ由来ＥＶを陰性対照細胞系から識別することができることを示している（表２を参照されたい）。
ＯＣパイロット患者血漿研究
ＯＣ患者血漿試料パイロット研究に含まれる患者の人口統計は図４に示されている。医療を、年齢及び性別を種々の試料コホート全体で可能な限り近くマッチさせるようにした。
患者試料血漿の１ミリリットルまたはそれ以下（例えば、５００μｌまたはそれ以下、４００μｌまたはそれ以下、３００μｌまたはそれ以下、２００μｌまたはそれ以下、または１００μｌまたはそれ以下）の複製物を上記のとおり清澄化し、ＥＶを、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。ＥＶを、抗ＳＬＣ３４Ａ２磁気ビーズを使用して捕捉した。抗ＳＬＣ３４Ａ２磁気ビーズにより捕捉されたＥＶを、ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブを使用してプロファイルした。ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を含む標的バイオマーカーシグネチャーを伴う例示的な二重システムアッセイの性能を示す実施例６及び図７～１３を参照されたい。
考察：
本実施例は、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６のバイオマーカー組合せ（例えば、本実施例において記載され、かつ図１～２に図示されているとおりの二重アッセイとの組合せで）が早期ステージ卵巣嚢胞腺癌を＞９９．５％の特異性で検出することができることを実証している。一部のそのような実施形態では、バイオマーカー組合せは、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉及びＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブを含む。アッセイシグナルは、血清ＣＡ－１２５レベルとは強くは相関しなかったが、幅広い範囲の血清ＣＡ－１２５に及ぶＯＣ陽性患者及び健康な対照患者の大きなコホートが、卵巣癌診断についての現行の臨床標準を上回る、そのようなアッセイの有用性を実証するために有用であり得る。
一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉プローブとＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブとのバイオマーカー組合せは、低及び中間レベルの血清ＣＡ－１２５を有するＯＣ陽性患者及び健康な患者試料に適用することができる。
一部の実施形態では、ＣＬＤＮ６を（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２及び／またはＭＵＣ１６との組み合わせで）含むバイオマーカー組合せを卵巣癌検出アッセイで使用することができる。
一部の実施形態では、例えば、シグナル対ノイズを増強するために、抗体１つあたり合計１６本の鎖のオリゴヌクレオチドドメイン（例えば、ＤＮＡ）になり得るデンドロンを、抗体１つあたり１または２本の鎖のＤＮＡの代わりに使用することができる。
実施例２：卵巣癌検出の実施形態
一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、例えば、健康な対照、非喫煙者（ｎ＝９３）；良性婦人科腫瘍；ステージＩ ＯＣ；ステージＩＩ ＯＣ；ステージＩＩＩ ＯＣ；ステージＩＶ ＯＣ；及び再発性ＯＣを含む様々な対象集団で使用することができる。
一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉とＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２、ＭＵＣ１６、及びＦＯＬＲ１を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉）とＭＵＣ１６＋ＦＯＬＲ１抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、ＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ６を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＭＵＣ１６捕捉（例えば、ＭＵＣ１６免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＣＬＤＮ６抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＭＵＣ１６捕捉（例えば、ＭＵＣ１６免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＦＯＬＲ１抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。一部の実施形態では、そのようなバイオマーカー組合せを、様々な対象集団において卵巣癌を検出するためのアッセイ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）において、ＭＵＣ１６免疫親和性捕捉及びＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１抗体プローブを用いて（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）実施することができる。
一部の実施形態では、ＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ３を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＭＵＣ１６捕捉（例えば、ＭＵＣ１６免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＣＬＤＮ３抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、ＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ６を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＦＯＬＲ１捕捉（例えば、ＦＯＬＲ１免疫親和性捕捉とＦＯＬＲ１＋ＣＬＤＮ６抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、ＬＲＲＴＭ１及びＭＵＣ１６を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＬＲＲＴＭ１捕捉（例えば、ＬＲＲＴＭ１免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、ＦＯＬＲ１、ＳＬＣ３４Ａ２、及びＣＬＤＮ３を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＦＯＬＲ１捕捉（例えば、ＦＯＬＲ１免疫親和性捕捉とＳＬＣ３４Ａ２＋ＣＬＤＮ３抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、ＭＵＣ１６、ＦＯＬＲ１、及びＣＬＤＮ３を含むバイオマーカー組合せ（例えば、一部の実施形態では、ＭＵＣ１６捕捉（例えば、ＭＵＣ１６免疫親和性捕捉とＦＯＬＲ１＋ＣＬＤＮ３抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、単一のバイオマーカー（例えば、本明細書に記載のいずれかのバイオマーカー）が、高い特異性及び／または感受性で卵巣癌を有効に検出するために十分であり得る。（例えば、一部の実施形態では、ＭＵＣ１６捕捉（例えば、ＭＵＣ１６免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブ）を、卵巣癌を検出するために（例えば、実施例１に記載のとおりのアッセイに従って）、様々な対象集団（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）で使用することができる。
一部の実施形態では、例えば、アッセイの感受性を上昇させるために、本明細書に記載の２つまたはそれ以上のバイオマーカー組合せを、卵巣癌を検出するために一緒に使用することができる。例えば、一部の実施形態では、卵巣癌検出のためのアッセイは、少なくとも２つのバイオマーカー組合せを含んでよく、その際、第１のバイオマーカー組合せは、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を含み得て、かつ第２のバイオマーカー組合せは、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を含み得る。例えば、一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を含む第１のバイオマーカー組合せを、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブ）を含むアッセイで実施することができる。一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を含む第２のバイオマーカー組合せを、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉とＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１抗体プローブ）を含むアッセイで実施することができる。
一部の実施形態では、例えば、アッセイの感受性を上昇させるために、本明細書に記載の３つまたはそれ以上のバイオマーカー組合せを、卵巣癌を検出するために一緒に使用することができる。例えば、一部の実施形態では、卵巣癌検出のためのアッセイは、少なくとも３つのバイオマーカー組合せを含んでよく、その際、第１のバイオマーカー組合せは、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を含み得て；第２のバイオマーカー組合せは、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を含み得て；かつ第３のバイオマーカー組合せは、ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１を含み得る。例えば、一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を含む第１のバイオマーカー組合せは、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６抗体プローブ）を含むアッセイで実施することができる。一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を含む第２のバイオマーカー組合せは、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉とＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１抗体プローブ）を含むアッセイで実施することができる。一部の実施形態では、ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１を含む第３のバイオマーカー組合せは、ＭＵＣ１６捕捉（例えば、ＭＵＣ１６免疫親和性捕捉とＭＵＣ１６＋ＦＯＬＲ１抗体プローブ）を含むアッセイで実施することができる。
実施例３：卵巣癌バイオマーカーとしての細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の評価
一部の実施形態では、卵巣癌検出は、細胞外小胞の免疫親和性捕捉の後に、少なくともＥＶ表面タンパク質（複数可）を検出することを含む。
一部の実施形態では、細胞外小胞上に存在する１つまたは複数の表面タンパク質または細胞外膜タンパク質（「捕捉タンパク質」）を、卵巣癌関連細胞外小胞の免疫親和性捕捉のために使用することができる。そのような捕捉タンパク質バイオマーカーの例には、これに限定されないが、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せが含まれ得る。
一部の実施形態では、ＥＶイムノアッセイ法（例えば、本明細書に、例えば、実施例１に記載のもの）及びバイオマーカー－確認プロセス（例えば、本明細書に、例えば、実施例１に記載のもの）を、追加の表面タンパク質を卵巣癌のためのバイオマーカーとして評価するために使用することができる。一部の実施形態では、捕捉タンパク質（例えば、卵巣癌関連ＥＶに存在する表面タンパク質）を指向する抗体を磁気ビーズにコンジュゲートし、初めに細胞系ＥＶで、次いで患者試料で、特異的標的タンパク質に結合するその能力について評価する。抗体コーティングされたビーズを、卵巣癌関連ＥＶを捕捉するその能力について評価し、抗体コーティングされたビーズにより捕捉されたＥＶを、標的実体検出システム（例えば、捕捉タンパク質とは別個である標的マーカーをそれぞれ指向する２つの検出プローブのセットを含む、本明細書に記載のとおりの二重システムを使用して読み出す。
一部の実施形態では、捕捉ＥＶは、次の表面タンパク質バイオマーカー：ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せのうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）を使用して読み出すことができる。一部の実施形態では、捕捉されたＥＶは、そのうちの少なくとも２つが次の表面タンパク質バイオマーカー：ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはより）を指向する検出プローブ（例えば、本明細書において利用及び／または記載されているとおりのもの）のセットを使用して読み出すことができる。一部の実施形態では、検出プローブのセットは、同じ表面タンパク質をそれぞれ指向する２つの検出プローブを含む。一部の実施形態では、検出プローブのセットは、別個の表面タンパク質をそれぞれ指向する２つの検出プローブを含む。
実施例４：卵巣癌バイオマーカーとしての細胞外小胞内のｍＲＮＡ（小胞内ｍＲＮＡ）の評価
一部の実施形態では、卵巣癌検出は、細胞外小胞の免疫親和性捕捉の後に少なくとも小胞内ｍＲＮＡ（複数可）を検出することを含む。
一部の実施形態では、細胞外小胞上に存在する１つまたは複数の表面タンパク質または細胞外膜タンパク質（「捕捉タンパク質」）を、卵巣癌関連細胞外小胞の免疫親和性捕捉のために使用することができる。そのような捕捉タンパク質バイオマーカーの例には、これに限定されないが、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せが含まれる。
一部の実施形態では、ＥＶ核酸検出アッセイ（例えば、プライマー－プローブセットを使用する逆転写ＰＣＲ）及びバイオマーカー－確認プロセス（例えば、本明細書に、例えば、実施例１に記載のもの）を使用して、卵巣癌についてのｍＲＮＡバイオマーカー候補を評価することができる。一部の実施形態では、捕捉タンパク質（例えば、卵巣癌関連ＥＶに存在する表面タンパク質）を指向する抗体を磁気ビーズにコンジュゲートし、初めに細胞系ＥＶで、次いで患者試料で、特異的標的タンパク質に結合するその能力について評価する。抗体コーティングされたビーズを、卵巣癌関連ＥＶを捕捉するその能力について評価し、抗体コーティングされたビーズにより捕捉されたＥＶを、それらのｍＲＮＡ内容物について、例えば、１ステップ定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）マスターミックスを使用してプロファイルする。
一部の実施形態では、捕捉されたＥＶは、次のｍＲＮＡ：ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せのうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）の検出により読み出すことができる。一部の実施形態では、捕捉されたＥＶは、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用しての、次のｍＲＮＡ：ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはそれ以上）の検出により読み出すことができる。
一部の実施形態では、捕捉されたＥＶは、次のｍＲＮＡ：ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せのうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）；ならびに実施例３に記載のＥＶ表面タンパク質のうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）の検出により読み出すことができる。一部のそのような実施形態では、捕捉されたＥＶは、（ｉ）ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して次のｍＲＮＡ：ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはそれ以上）を検出することにより；ならびに（ｉｉ）そのうちの少なくとも１つは実施例３に記載のＥＶ表面タンパク質のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはより）を指向する検出プローブのセット（例えば、本明細書において利用及び／または記載されるとおりのもの）を使用することにより読み出すことができる。一部のそのような実施形態では、検出プローブのセットは、ＥＶ表面タンパク質を指向する少なくとも１つの検出プローブを含む。一部のそのような実施形態では、検出プローブのセットは、同じＥＶ表面タンパク質を指向する（同じか、または異なるエピトープを用いる）少なくとも２つの検出プローブを含む。一部のそのような実施形態では、検出プローブのセットは、別個のＥＶ表面タンパク質を指向する少なくとも２つの検出プローブを含む。一部の実施形態では、ＥＶ表面タンパク質及び小胞内ｍＲＮＡを含む試料を、小胞内ｍＲＮＡバイオマーカー（例えば、実施例４に記載のもの）のための対の２つのプライマーの一方として役立ち、抗ＥＶ表面タンパク質抗体はＥＶ表面タンパク質に結合する一方で、コンジュゲートした一本鎖オリゴヌクレオチドは同じ試料に存在する小胞内ｍＲＮＡバイオマーカーとハイブリダイズするようになっている一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）にコンジュゲートしている抗ＥＶ表面タンパク質抗体（例えば、実施例３に記載されているとおりのＥＶ表面タンパク質を指向する抗体）と接触させることができる。次いで、上記対の第２のプライマー及びＲＴ－ｑＰＣＲプローブを添加して、単一試料中の小胞内ｍＲＮＡ及びＥＶ表面タンパク質の存在を検出するためのＲＴ－ｑＰＣＲを実行する。
一部の実施形態では、捕捉されたＥＶは、次のｍＲＮＡ：ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せのうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）；ならびに実施例５に記載のＥＶ小胞内タンパク質のうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはより）の検出により読み出すことができる。一部のそのような実施形態では、捕捉されたＥＶは、（ｉ）次のｍＲＮＡ：ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはそれ以上）を検出することにより；ならびに（ｉｉ）そのうちの少なくとも１つは実施例５に記載の小胞内タンパク質のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはそれ以上）を指向する検出プローブのセット（例えば、本明細書において利用及び／または記載されるとおりのもの）を使用することにより読み出すことができる。一部の実施形態では、検出プローブのセットは、小胞内タンパク質（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）を指向する少なくとも１つの検出プローブを含む。一部の実施形態では、検出プローブのセットは、同じ小胞内タンパク質をそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブ（例えば、同じか、または異なるエピトープを用いる）を含む。一部の実施形態では、検出プローブのセットは、別個の小胞内タンパク質（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）をそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含む。一部のそのような実施形態では、ＥＶ小胞内タンパク質及び小胞内ｍＲＮＡを含む試料を、小胞内ｍＲＮＡバイオマーカー（例えば、実施例４に記載のもの）のための対の２つのプライマーの一方として役立つ一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）にコンジュゲートしている抗ＥＶ小胞内タンパク質抗体（例えば、実施例５に記載されているとおりのＥＶ小胞内タンパク質を指向する抗体）と接触させることができて、抗ＥＶ小胞内タンパク質抗体はＥＶ小胞内タンパク質に結合する一方で、コンジュゲートした一本鎖オリゴヌクレオチドは同じ試料に存在する小胞内ｍＲＮＡバイオマーカーとハイブリダイズするようになっている。次いで、上記対の第２のプライマー及びＲＴ－ｑＰＣＲプローブを添加して、単一試料中の小胞内ｍＲＮＡ及び小胞内タンパク質の存在を検出するためのＲＴ－ｑＰＣＲを実行する。
実施例５：卵巣癌バイオマーカーとしての小胞内タンパク質の評価
一部の実施形態では、卵巣癌検出は、細胞外小胞の免疫親和性捕捉の後に、少なくとも小胞内タンパク質（複数可）を検出することを含む。
一部の実施形態では、細胞外小胞上に存在する１つまたは複数の表面タンパク質または細胞外膜タンパク質（「捕捉タンパク質」）を、卵巣癌関連細胞外小胞の免疫親和性捕捉のために使用することができる。そのような捕捉タンパク質バイオマーカーの例には、これに限定されないが、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ１６、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＦＯＬＲ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せが含まれ得る。
一部の実施形態では、ＥＶイムノアッセイ法（例えば、本明細書に、例えば、実施例１に記載のもの）及びバイオマーカー－確認プロセス（例えば、本明細書に、例えば、実施例１に記載のもの）を、小胞内タンパク質を卵巣癌のためのバイオマーカーとして評価するために使用することができる。一部の実施形態では、捕捉タンパク質（例えば、卵巣癌関連ＥＶに存在する表面タンパク質）を指向する抗体を磁気ビーズにコンジュゲートし、初めに細胞系ＥＶで、次いで患者試料で、特異的標的タンパク質に結合するその能力について評価する。抗体コーティングされたビーズを、卵巣癌関連ＥＶを捕捉するその能力について評価し、抗体コーティングされたビーズにより捕捉されたＥＶを固定化及び／または透過化し、その後、標的実体検出システム（例えば、捕捉タンパク質とは別個である標的マーカーをそれぞれ指向する２つの検出プローブのセットを含む本明細書に記載のとおりの二重システムを使用して、それらの小胞内タンパク質についてプロファイルする。
一部の実施形態では、捕捉されたＥＶを固定化及び／または透過化の後に、次の小胞内タンパク質：ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、ならびにそれらの組合せのうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）を使用して読み出すことができる。一部の実施形態では、捕捉されたＥＶを固定化及び／または透過化の後に、そのうちの少なくとも２つは次の小胞内タンパク質：ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、ならびにそれらの組合せのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはより）を指向する検出プローブのセット（例えば、本明細書において利用及び／または記載されるとおりのもの）を使用して読み出すことができる。一部の実施形態では、検出プローブのセットは、同じ小胞内タンパク質をそれぞれ指向する２つの検出プローブを含む。一部の実施形態では、検出プローブのセットは、別個の小胞内タンパク質をそれぞれ指向する２つの検出プローブを含む。
一部の実施形態では、捕捉されたＥＶを固定化及び／または透過化の後に、（ｉ）次の小胞内タンパク質：ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せのうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）；ならびに（ｉｉ）実施例３に記載のＥＶ表面タンパク質のうちの少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）を使用して読み出すことができる。一部の実施形態では、捕捉されたＥＶを固定化及び／または透過化の後に、（ｉ）次の小胞内タンパク質：ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはそれ以上）を指向する第１の検出プローブ；ならびに（ｉｉ）実施例３に記載のＥＶ表面タンパク質のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、またはそれ以上）を指向する第２の検出プローブを含む、検出プローブ（例えば、本明細書において利用及び／または記載されるとおりのもの）のセットを使用して読み出すことができる。一部の実施形態では、捕捉されたＥＶを固定化及び／または透過化の後に、上の実施例４に記載のとおりの単一の試料においてＥＶ小胞内タンパク質及びＥＶ小胞内ｍＲＮＡを一緒に検出することにより読み出すことができる。
実施例６：卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発
本実施例では、例えば遺伝的－及び平均的リスク女性をスクリーニングするための卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発を記載する。すべてのがんのうちで、女性では５番目に多い死因であるにも関わらず（Ｈｏｗｌａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１９；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）、現在、平均的リスクの女性に推奨される卵巣癌スクリーニングツールは存在しない。これは一部では、提案されている卵巣癌スクリーニング技術の不十分な性能による。平均的リスクの女性における卵巣癌の発病率を考慮すると、不適当な検査特異性（＜９９．５％）は、真の陽性よりも一桁以上多い擬陽性結果をもたらしている。このことは、擬陽性結果が追加の検査、不必要な外科手術、及び感情的／物理的苦痛につながるため、健康管理システムとスクリーニングされた女性に重大な負担を与える（Ｂｕｙｓ ｅｔ ａｌ．、２０１１；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。結果として、臨床的有用性をもたらす２つの特徴：（１）擬陽性の数を最小化する非常に高い特異性（＞９９．５％）、及び（２）予後が最も好ましいステージＩ及びＩＩ卵巣癌について高い感受性（＞４０％）を示し得る卵巣癌スクリーニング検査を開発することが望まれ得る。そのような検査の開発は、毎年１万人の命を救う可能性を有する。
いくつかの異なるバイオマーカークラスが、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、バルクタンパク質、及び細胞外小胞（ＥＶ）を含む卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイのために研究されている。ＥＶは、ｃｔＤＮＡ及びＣＴＣと比べて、早期ステージがんについての感受性の改善を示唆する血流におけるそれらの豊富さ及び安定性により、特に有望である。さらに、ＥＶは、同じ細胞に由来するカーゴ（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、代謝産物）を含有し、バルクタンパク質の測定を上回る優れた特異性をもたらす。診断有用性ＥＶが研究されているが、この研究の大部分は、バルクＥＶ測定または低スループット単一ＥＶ分析に関している。
この本実施例では、ヒト血漿中の個々の細胞外小胞（ＥＶ）のプロファイリングを介して、早期ステージ卵巣癌を検出するための例示的なアプローチの一態様を記載する。エクソソーム及び微小小胞体を含むＥＶは、それらの由来細胞を表す共局在タンパク質、ＲＮＡ、代謝産物、及び他の化合物を含む（Ｋｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ．、２０１９；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。単一ＥＶ内でのストラテジーにより選択された共局在マーカーの検出は、がん細胞を正常な組織から識別できることを含めて、非常に高い特異性で、細胞型の同定を可能にし得る。バイオマーカーが血液に入る細胞死に依存する他のがん診断アプローチ（すなわち、ｃｆＤＮＡ）とは逆に、ＥＶは、細胞を機能させることにより高率で放出される。単一細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで１日あたり１０，０００という多くのＥＶを放出することが示されている（Ｂａｌａｊ ｅｔ ａｌ．、２０１１；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。加えて、がん細胞が、健康な細胞よりも高い率でＥＶを放出することが広く認められている（Ｂｅｂｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。
一態様では、本開示は、出願人の特許権下のバイオインフォマティクスバイオマーカー発見プロセスを使用して、健康な組織よりも卵巣癌において上方制御される遺伝子を同定することを伴う洞察及び技術を提供する。上方制御されるバイオマーカーのリストから、卵巣癌について高い感受性及び特異性を示すと予測されるバイオマーカー組合せを設計する。例示的な個々のＥＶアッセイ（例えば、図１または２に例示されている、及び／または本明細書に記載されているものを参照されたい）を使用して、個々の小胞でのそのようなバイオマーカーの共局在を検出するが、これは、そのバイオマーカーの組み分けが同じ細胞に由来したことを示す。これは、ＭＵＣ１６などの多くの上方制御されたがんバイオマーカーが１つまたは複数の健康な組織により発現されることを考慮すると、バルクＥＶアッセイを含むバルクバイオマーカー測定よりも優れた特異性をもたらす。バイオマーカー組合せの慎重な設計により、卵巣癌に密接に関連するものを含む競合組織からのシグナルを減少させる、または除去することができる。一部の実施形態では、本開示は、例えば、疾患の有病率が低く、高い陽性予測値（＞１０％）が必要とされる卵巣癌スクリーニング検査として特に有益である非常に高い特異性を有する技術を提供する（Ｓｅｌｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９５；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。
バイオマーカーの発見
一部の実施形態では、バイオマーカー発見プロセスは、大きなデータベースのバイオインフォマティクス解析ならびに卵巣癌及び細胞外小胞の生態学の理解を活用する。
個々の細胞外小胞分析
血液中での腫瘍由来ＥＶの検出は、幅広い健康な組織からの１０億のＥＶのバックグラウンドにおいて血漿中１ミリリットルあたり比較的少ない腫瘍由来ＥＶを検出するために、十分な選択性及び感受性を有するアッセイを必要とする。本開示は特に、この難問に対処する技術を提供する。例えば、一部の実施形態では、個々の細胞外小胞分析のためのアッセイは図１に例示されており、これは、下に略述するとおりの３つの重要なステップで行われる：
１．可溶性タンパク質及び他の干渉性化合物の９９％超を除去するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、ＥＶを患者血漿から精製する。
２．膜結合タンパク質に特異的な抗体官能化磁気ビーズを使用して、腫瘍特異的ＥＶを捕捉する。
３．近接－ライゲーション－免疫定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｌｉｑ－ＰＣＲ）の変更バージョンを行って、捕捉されたＥＶ上に、またはその中に含まれる追加のタンパク質バイオマーカーの共局在を決定する。
ｐｌｉｑ－ＰＣＲアッセイの変更バージョンの多くの実施形態で、２つまたはそれ以上の異なる抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、抗体官能化磁気ビーズにより捕捉されたＥＶに添加すると、その抗体が続いて、それらのタンパク質標的に結合する。上記オリゴヌクレオチドは、相補的である一本鎖オーバーハングを有するｄｓＤＮＡからなり、したがって、近接した場合に（すなわち、対応するタンパク質標的が同じＥＶ上に位置している場合に）ハイブリダイズし得る。非結合抗体－オリゴヌクレオチド種を洗浄除去した後に、隣接して結合した抗体－オリゴヌクレオチド種を、標準ＤＮＡリガーゼ反応を使用してライゲートする。ライゲートされたテンプレート鎖のその後のｑＰＣＲは、共局在タンパク質種の検出及び相対的定量化を可能にする。一部の実施形態では、例えば、両方ともあらゆる目的についてそれらの全体が参照により本明細書に援用される、両方とも２０２０年２月２８日に出願され、「標的実体を検出するシステム、組成物、及び方法」と標題された米国特許出願第１６／８０５，６３７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０５２９に記載されているとおり、２～２０の別個の抗体－オリゴヌクレオチドプローブをそのようなアッセイに組み込むことができる。
ｐｌｉｑ－ＰＣＲは、ＥＶをプロファイルするための他の技術を上回る多数の利点を有する。例えば、ｐｌｉｑ－ＰＣＲは、他の標準的なイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡよりも３桁高い感受性を有する（Ｄａｒｍａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、２０１０；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。十分に最適化されたｐｌｉｑ－ＰＣＲ反応の非常に低いＬＯＤは、１ｍＬあたり１０００のＥＶまでの痕跡レベルの腫瘍由来ＥＶの検出を可能にする。これは、約１０３及び約１０４のＥＶのＬＯＤをそれぞれ報告している（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．、２０１８；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｏｓｏｍｅ（ｎＰＬＥＸ）Ｓｅｎｓｏｒ（Ｉｍ ｅｔ ａｌ．、２０１４；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ－Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ エクソソーム（ｉＭＥＸ）Ｓｅｎｓｏｒ（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１６；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）を含む、他の新興のＥＶ分析技術とも有利に匹敵する。さらに、一部の実施形態では、ｐｌｉｑ－ＰＣＲアプローチの変更バージョンは、煩雑な設備を必要とせず、かつ個々のＥＶ上の複数のバイオマーカーの共局在を固有に検出することができる。
一部の実施形態では、個々のＥＶプロファイリングアッセイの感受性及び特異性をさらに改善するために、他の群のＥＶバイオマーカーにはｍＲＮＡ及び小胞内タンパク質（ＥＶ表面タンパク質に加えて）が含まれ、それらをアッセイで同定することができ、アッセイに含ませることができる。
先行研究
先行研究により、バイオマーカー候補がＥＶ中に存在し、かつ市販の抗体またはｍＲＮＡプライマー－プローブセットにより検出され得ることを確認するワークフローを開発する。目的の所与のバイオマーカーについて、目的のバイオマーカーを発現する（陽性対照）、及びそれを発現しない（陰性対照）１つまたは複数の細胞系を培養して、それらの細胞培養培地を濃縮し、かつ目的のサイズ範囲を有するナノ粒子を単離するための精製（例えば、ＳＥＣを使用）を実行することにより、それらのＥＶを収集することができる。典型的には、細胞外小胞は、直径３０ｎｍ～数マイクロメートルの範囲であり得る。例えば、種々の細胞外小胞（ＥＶ）サブタイプでのサイズ：ミグラソーム（０．５～３ｐｍ）、微小小胞体（０．１～１ｐｍ）、オンコソーム（１～１０ｐｍ）、エキソマー（＜５０ｎｍ）、小エクソソーム（６０～８０ｎｍ）、及び大エクソソーム（９０～１２０ｎｍ）の情報を提供している、本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用されるＣｈｕｏ ｅｔ ａｌ．、“Ｉｍａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２５：９１（２０１８）を参照されたい。一部の実施形態では、約３０ｎｍ～１０００ｎｍのサイズ範囲を有するナノ粒子を検出アッセイのために単離することができる。一部の実施形態では、特異的ＥＶサブタイプ（複数可）を検出アッセイのために単離することができる。
特許権下のバイオマーカー発見プロセスにより、健康な組織に対してＨＧＳＯＣで上方制御される２つの膜結合タンパク質バイオマーカー（ＭＵＣ１６及びＳＬＣ３４Ａ２）を同定し、かつ細胞系ＥＶ及び卵巣癌患者試料での概念証明型実験において使用した。膜タンパク質であるＭＵＣ１６は、卵巣癌において最も広く研究されているバイオマーカーである。本明細書に記載のとおり、血清中のＣＡ－１２５の濃度（ＭＵＣ１６ポリペプチドの割合である）が、卵巣癌について、及び卵巣癌の再発について遺伝的リスクを有する女性において従来はモニターされてきた。ＣＡ－１２５は歴史的に、血清において、その切断形態で測定される。しかしながら、本開示の一部の実施形態では、ＭＵＣ１６を、インタクトな膜貫通型タンパク質として測定する。本開示の一部の実施形態では、ＭＵＣ１６をその切断形態で測定する。理論に束縛されることはないが、ＳＬＣ３４Ａ２は、卵巣及び非小細胞肺癌のための治療標的として研究されているマルチパス膜輸送体である（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０１５；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。
共局在したＭＵＣ１６及びＳＬＣ３４Ａ２マーカーを含むＥＶからアッセイシグナルを検出するために、一部の実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉と、ＭＵＣ１６に特異的な２つの別個の抗体－オリゴヌクレオチドプローブとを含むアッセイ構成を開発した。
精製細胞系ＥＶを、抗ＳＬＣ３４Ａ２官能化磁気ビーズを使用して捕捉した。図３（パネルＡ）は、２つの陽性対照細胞系及び１つの陰性対照細胞系での代表的なｑＰＣＲトレースを例示している。このデータは、アッセイシグナルに対する遺伝子発現の影響を実証しており、その際、より多く発現する細胞系は、より少なく発現する細胞系と比べて、シグナルの３６倍の上昇（２５．２）を示した。これらの結果は、一部の実施形態では、単一のＥＶプロファイリングアッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）が単一のＥＶ上で共局在した膜結合タンパク質マーカーを非常に高い感受性で検出することができることを実証している。
卵巣癌細胞系ＥＶにおけるＭＵＣ１６及びＳＬＣ３４Ａ２の確認の後に、最適化及びオペレーター盲検アッセイプロトコルを使用して、パイロット研究（最終的に３２０の患者試料に拡大）を卵巣癌患者血漿試料で実行した。すべての血漿試料を同じ供給源から購入し、同じ血液収集プロトコルにより処理し、患者試料を、任意の処置の開始前に（すなわち、処置ナイーブ）で収集した。この実施例の研究に含まれる患者コホートは図４（パネルＡ）に記載されている。
この臨床パイロット研究の結果は、それぞれ、すべての卵巣癌について、及び高異型度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）について、図７に示されている。一部の実施形態では、すべての健康な対照（ｎ＝１７２）全体で対数正規分布を想定し、かつカットオフを特異性９９．８％では平均上の標準偏差２．８７９（カットオフ１）及び特異性９８％では平均上の標準偏差２．０５５（カットオフ２）に設定することにより、特異性を決定した。一部の実施形態では、すべての健康な対照（ｎ＝１７２）で対数正規分布を想定し、かつカットオフを特異性９９．５％（９５％信頼区間（ＣＩ）：９８．４％～１００％）では平均から標準偏差２．５７６（カットオフ１）に設定することにより、特異性を決定した。カットオフ２は、特異性９８％（９５％ＣＩ：９５．９％～１００％）では平均から標準偏差２．０５５に引いた。カットオフ１及び２でのＨＧＳＯＣのステージＩ／ＩＩ検出の感受性はそれぞれ、３９．１％（９５％ＣＩ：１９．２％～５９．０％）及び６０．９％（９５％ＣＩ：４１．０％～８０．８％）であった。一部の実施形態では、特異性９９．５％で、カットオフ１を、閉経後症候性女性をスクリーニングするためにＰＰＶを補完するために使用することができ、その際、卵巣癌の有病率は、女性５００人あたり１人と推測される（Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、２００７；本明細書に記載の目的について参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、９８％特異性カットオフを、遺伝的リスクを有する女性をスクリーニングするためのＰＰＶを補完するために使用することができ、その際、有病率は、女性１００人あたり１人と推測される。これらの別々のカットオフを、種々の患者集団における擬陽性許容性の差を説明するために確立した。ＨＧＳＯＣについて得られたＰＰＶは、１０％を十分に超えて（閉経後症候性及び遺伝的リスクを有する女性でそれぞれ１７．６％及び２７％）、一部の実施形態では、単一のＥＶプロファイリングアッセイ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）が、卵巣癌スクリーニング検査として使用される大きな可能性を有することを実証している。追加の相補的バイオマーカー組合せの評価により、そのようなアッセイの感受性を上昇させて、平均的リスクの女性において少なくとも１０％のステージＩ／ＩＩ ＰＰＶを得ることができる。一部の実施形態では、卵巣癌について遺伝的リスクを有する女性対象において、または卵巣癌と関連する１つもしくは複数の症状、例えば、腹部疼痛及び／または骨盤疼痛を経験しているかもしれない閉経後女性対象において、ステージＩ／ＩＩでのさらに高いＰＰＶを得るために、そのようなアッセイの感受性を上昇させることができる。
卵巣癌を検出するための例示的な単一のＥＶプロファイルアッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）の性能をさらに改善するために、一部の実施形態では、膜結合タンパク質及び小胞内ｍＲＮＡ／タンパク質を含む追加のバイオマーカー候補を同定することができる。
一部の実施形態では、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）転写産物を検出するための図１４（パネルＡ）に示されているとおり、バルク中の精製細胞系ＥＶを使用するＥＶ－ｍＲＮＡ検出の実行可能性を実証した。膜結合タンパク質マーカーの免疫親和性捕捉により、このアプローチは、２つの共局在バイオマーカーの検出を可能にする。さらに、免疫親和性捕捉の直後に、ＲＴ－ｑＰＣＲを実行することができるので、ＥＶ－ｍＲＮＡ検出は、よりシンプルなプロトコルを必要とする。ＥＶを使用するｍＲＮＡ検出は図１４（パネルＢ）で実証されており、その際、ＥＶを初めに、抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）修飾磁気ビーズを使用して捕捉し、ＭＩＦ ｍＲＮＡを検出した。陽性及び陰性細胞系の両方がＭＩＦを発現するが、しかしながら、陽性細胞系のみがＥｐＣＡＭを発現する。そのような検出システムを用いると、陰性細胞系ＥＶの濃度が１桁高くても、陽性細胞系の選択的検出が実証された。
実施例７：例示的な卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発
本実施例では、例えば、平均的リスク、遺伝的リスク、生活歴リスク、及び／または閉経後リスクを有する、症状のない、または症状のある女性をスクリーニングするための例示的な卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの開発を記載する。バイオマーカーの発見に至るステップは、本開示の実施例６に記載のとおりに実行した。
実施例６及び図７において考察したとおり、ＳＬＣ３４Ａ２免疫親和性捕捉と、ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ読み出しとの単一バイオマーカー組合せを用いてステージＩ及びＩＩ卵巣癌患者を検出するために、９９．５％特異性カットオフを使用する場合に、例示的な卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の感受性を改善することができる。これは一部では、おそらくＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を同時発現する健康な組織により、健康な女性全体でアッセイシグナルの範囲が広いことに帰することができる。
感受性及び特異性を改善するために、バイオマーカーパネルを、卵巣癌で過剰発現されるとバイオインフォマティクスにより予測される追加の標的を含むように拡大した（生成されるデータのサブセットについては図１８パネルＡ～Ｄを参照されたい）。一部の実施形態では、ポリペプチドバイオマーカーＦＯＬＲ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、及びＬＲＲＴＭ１を含むリストを考案した。ＡＱＰ５（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ ５）は、唾液、涙、及び肺分泌物の生成に関係する膜内在性タンパク質のＡｑｕａｐｏｒｉｎファミリーのメンバーである水チャネルタンパク質である。ＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ６（それぞれＣｌａｕｄｉｎ ３及び６）は、タイトジャンクション鎖の膜内在性タンパク質及び構成成分であり、両方のタンパク質が、上皮及び／または内皮細胞において細胞－細胞接着により連続的密封を形成して、パラ細胞空間を介した溶質及び水の拡散を予防するように作用するタンパク質のＣｌａｕｄｉｎファミリーのメンバーである。葉酸受容体ファミリーのメンバーであるＦＯＬＲ１（葉酸受容体１）は、細胞外葉酸の結合及び後続の細胞内送達ならびに葉酸誘導体の減少に関係する膜貫通タンパク質である。ＬＲＲＴＭ１（ロイシンリッチリピート膜貫通ニューロン１）は、ニューロン機能、例えば、もしかすると統合失調症及び利き手と一般的に関連する膜貫通タンパク質であり、ＬＲＲＴＭ１は、シナプスでのタンパク質－タンパク質相互作用、及びシナプスを介してのある特定の化学物質の伝達に関係すると考えられる。
細胞系ＥＶを標的とする市販のモノクローナル抗体を使用して、これらのバイオマーカーのそれぞれを厳密にスクリーニングして、例示的なアッセイにおいて高い結合活性及び選択性を示す抗体クローンを同定した（データは図示せず）。少なくとも１つの適切な抗体クローンを各バイオマーカーについて同定した。
高い診断有用性を有する新規のバイオマーカー組合せの同定を容易にするために、プールされた患者血漿試料において組合せをスクリーニングするための手順を開発した。５５～７９歳の間の９０人の健康な女性からの血漿をプールして、平均的な健康なバックグラウンドタンパク質量レベルを各バイオマーカー組合せについて推定した。同時に、卵巣癌血漿プールを１０人のステージＩＩＩ及び１０人のステージＩＶ卵巣癌患者から作製して、進行卵巣癌症例において見い出されるシグナルを推定した。３つのバイオマーカーの組合せ（１つの捕捉プローブ及び２つのｐｌｉｑ－ＰＣＲ読み出しプローブ）を、ＡＱＰ５、ＭＵＣ１６、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＦＯＬＲ１、ＬＲＲＴＭ１、及びＳＬＣ３４Ａ２を含む７つの潜在的なバイオマーカーのリストから作製した。組合せを、プールした患者及び／または対照血漿試料においてスクリーニングした。各スクリーニング実験の間、プールした患者血漿１ｍＬを、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製し、１０のアリコット（各バイオマーカー組合せで血漿１００μＬに同等）に分割した。先行バイオマーカースクリーニングデータのサブセットが図２０Ａに提示されており、その際、各データポイントは、異なるバイオマーカー組合せを表す。血漿プール全体でアッセイシグナルに大きな差を示さなかった図２０Ａのバイオマーカー組合せは、総じて非常に低いシグナル強度を示し、ほとんどのＥＶが共局在バイオマーカーを含まないことを示唆した。図２０Ｂは、７つの異なる例示的なバイオマーカー組合せについて、プールされた健康な血漿とプールされた卵巣癌血漿との間でのアッセイシグナルの差を示している。結果は、本明細書に記載のとおりのバイオマーカー組合せが、プールされた卵巣癌血漿と比較した場合に、プールされた健康な血漿１００μＬの間でシグナルの１００倍から１０００倍の差を検出することができることを実証している。
閉経前の健康な女性、良性婦人科腫瘍を有する女性、他の炎症状態を有する女性、及び／または早期ステージＨＧＳＯＣ症例を含む追加の患者コホートからのプール血漿を検査することにより、バイオマーカー組合せスクリーニングの改善を達成することができる。
図２０Ａ及び２０Ｂのデータは、本明細書に記載のとおりのいくつかの例示的なバイオマーカー組合せ（例えば、ＭＵＣ１６捕捉プローブとＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲプローブ、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉プローブとＭＵＣ１６＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲプローブ、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉プローブとＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲプローブ、ＳＬＣ３４Ａ２捕捉プローブとＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲプローブ、ＭＵＣ１６捕捉プローブとＭＵＣ１６＋ＣＬＤＮ６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲプローブ、ＦＯＬＲ１捕捉プローブとＦＯＬＲ１＋ＣＬＤＮ６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲプローブなど）が、健康な患者と卵巣癌を有する患者とを識別することができることを示している。複数のオルトゴナル及び相補的バイオマーカー組合せの使用が、本明細書に記載の例示的なアッセイの性能を（例えば、種々のがん患者分集団を健康なコホートから識別することにより）改善するであろうことを実証するために、いくつかのバイオマーカー組合せを、実施例６及び図７において以前に調査及び／または記載した患者試料のサブセットに対して検査した。健康及びＨＧＳＯＣコホートを、図７において観察されたシグナルの範囲全体をカバーするように特異的に選択した。
図２１に示されているのは、一部の実施形態では、１）ＳＬＣ３４Ａ２捕捉、ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ読み出し（直前の図７の研究、例えば、実施例６において使用された同じ組合せ）；及び２）ＳＬＣ３４Ａ２捕捉、ＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ読み出しを含み得る少なくとも２つのバイオマーカー組合せを含む本明細書に記載の例示的なアッセイの性能を示す結果である。データは、本明細書に記載のとおりの例示的なアッセイ（例えば、少なくとも２つのバイオマーカー組合せ、例えば、少なくとも２つのオルトゴナルなバイオマーカー組合せ（例えば、統計的に独立している少なくとも２つのバイオマーカー組合せを含む）が、ＨＧＳＯＣ患者を健康な患者及び良性患者コホートから識別することができたことを実証している。バイオマーカー組合せにわたるこのオルトゴナリティが、単一のバイオマーカー組合せを含むアッセイにおいて観察された感受性と比較して、感受性を改善した。例えば、本明細書に記載のとおりの２つまたはそれ以上のバイオマーカー組合せ（例えば、本明細書に記載のとおりのオルトゴナルなバイオマーカー組合せ）をアッセイにおいて利用する一部の実施形態では、９９．５％の特異性カットオフで、ステージＩ及びＩＩ卵巣癌症例（ｎ＝２２）では５９．１％への、及び卵巣癌症例全体では６３．９％（ｎ＝３６）への全アッセイ感受性の上昇が存在した。これらの結果は、複数の（例えば、少なくとも２つまたはそれ以上）のバイオマーカー組合せを本明細書に記載の例示的なアッセイに組み込むことで、アッセイの性能（例えば、感受性及び／または特異性）が著しく改善され得ることを実証している。例えば、一部の実施形態では、９８％特異性カットオフで、少なくとも２つのバイオマーカー組合せ（例えば、（１）ＳＬＣ３４Ａ２捕捉、ＭＵＣ１６＋ＭＵＣ１６ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ読み出し；及び（２）ＳＬＣ３４Ａ２捕捉、ＦＯＬＲ１＋ＦＯＬＲ１ ｐｌｉｑ－ＰＣＲ読み出し）を含む例示的なアッセイの感受性は６６．７％であった。この実施例において両方のバイオマーカー組合せ（その際、各組合せは共通のバイオマーカー、ＳＬＣ３４Ａ２を有する）を使用しての感受性の全体の上昇は約８．３％であるが、バイオマーカー組合せが共通のバイオマーカーを共有しないある特定の実施形態も、感受性のなお大きなブーストを提供し得る。
卵巣癌を検出するための例示的な単一ＥＶプロファイルアッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）の性能をさらに改善するために、一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載のとおりの膜結合タンパク質及び小胞内ｍＲＮＡ／タンパク質を含む追加の標的バイオマーカーを、例示的な単一ＥＶプロファイルアッセイに組み込むことができる。
一部の実施形態では、バイオマーカーパネルを、卵巣癌で過剰発現されるとバイオインフォマティクスで予測されている追加の標的を含むように拡大した。ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ１６、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＦＯＬＲ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、及びＴＮＦＲＳＦ１２Ａを含むポリペプチドバイオマーカーを考察した。実施例１に記載のとおりのアッセイによりスクリーニングされたある特定のバイオマーカー組合せは表１に示されている。これらの一次スクリーニングに従い、ある特定の組合せをさらなる分析のために選択した；例示的な結果を下に記載する。
健康なプール試料（９０の個々の試料からなるプール）または良性プール（漿液性嚢胞腺腫、粘液嚢胞腺腫、内膜症性嚢胞、漿液性嚢胞腺線維腫、漿液性嚢胞腺線維腫、または成熟奇形腫を有する患者からの１０の個々の試料からなるプール）試料を、後期ステージ卵巣癌試料（ステージＩＩＩまたはＩＶ卵巣腺癌を有する患者からの２０の個々の試料からなるプール）または早期ステージ卵巣癌試料（ステージＩまたはＩＩ卵巣腺癌を有する患者からの１６の個々の試料からなるプール）と比較する、バイオマーカー組合せについて表３に示されている二次スクリーニング結果は、ある特定のバイオマーカー組合せが卵巣癌試料を基準試料から成功裏に識別した（表示のバイオマーカー組合せを用いて実施例１に記載のとおりに実行された増幅で、少なくとも４倍差で測定される場合）ことを記録した。
下に示されているとおり、様々なバイオマーカー組合せが後期ステージ卵巣癌プールと良性婦人科腫瘍プールとを識別した。特に、この所見は、本開示に従って使用されるこれらのバイオマーカー組合せが、卵巣悪性病変を良性腫瘍から特異的に識別し、それにより、開示の技術の特に有利な特徴の１つを記録していることを実証している。一部の状況では、この特徴は特に重要であり、それというのも、良性腫瘍は悪性腫瘍と同様の症状をもたらし得て、多くの場合に、従来のスクリーニング方法では分類が困難であるためである。
下に示されているとおり、様々なバイオマーカー組合せが早期ステージ卵巣癌プールを、健康なプール及び／または良性婦人科腫瘍プールから識別した。特に、これらの所見は、本開示に従って使用されるこれらのバイオマーカー組合せが、早期ステージ卵巣癌（例えば、ステージＩ／ＩＩ）において、卵巣悪性病変を健康な組織及び／または良性腫瘍から特異的に識別し、それにより、開示の技術の特に有利な特徴の１つを記録していることを実証している。一部の状況では、この特徴は特に重要であり、それというのも、早期ステージの卵巣癌をさらに検出及び診断しながら、卵巣癌試料を良性婦人科腫瘍から正確に識別することは、患者の健康を維持しながら疾患を成功裏に撲滅する際に極めて重要であり得るためである。
特に、本実施例に示されている結果は、提供される技術が卵巣嚢胞腺癌を検出することを実証しており、かつ提供される技術（例えば、ＥＶ内、及び／またはその上のバイオマーカーを検出するために本明細書に記載のとおりのバイオマーカー組合せを使用する）は、卵巣癌由来ＥＶを、健康な組織及び／または良性婦人科腫瘍に由来するものから識別することを特異的に実証している。
本実施例は、進行卵巣癌を検出するための、９０人の健康な女性からの血漿のプールよりも少なくとも４倍大きなシグナルを伴うことを含めて早期ステージ卵巣癌を検出するための、及び／または卵巣癌血漿を良性腫瘍血漿から識別するための、共局在バイオマーカーシグネチャーを検出する（例えば、個々のＥＶ内、またはその上のバイオマーカーのセットを検出する）提供される技術（例えば、本明細書に記載のとおりの近接ライゲーション技術）の有効性を実証する。本実施例は特に、共局在表面バイオマーカーシグネチャーを（例えば、個々のＥＶの表面上で）検出するためのそのような提供される技術の有効性を記録する。
表４は、ある特定のバイオマーカー組合せについての二次スクリーニングからの結果を提示している一方で、表５は、その組合せが表４に示されている所見から考案された少なくとも３つのＥＶ表面ポリペプチドバイオマーカーを含むある特定のバイオマーカーシグネチャーについての三次スクリーニングの結果を提示している。示されている結果は、健康なプール試料（９０の個々の試料からなるプール）、非卵巣癌プール試料（乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、子宮癌、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などのがんを有する患者からの２６の個々の試料からなるプール）、及び／または良性婦人科プール試料（漿液性嚢胞腺腫、粘液嚢胞腺腫、漿液性嚢胞腺線維腫、内膜症性嚢胞、内膜症性嚢胞腺腫、成熟奇形腫、子宮内膜症、または平滑筋腫を有する患者からの１４の個々の試料からなるプール）を、後期ステージ卵巣癌試料（１２の個々の試料からなるプール）、血清ＣＡ－１２５レベル、例えば、高ＣＡ－１２５（＞３５Ｕ／ｍＬ、１２の個々の試料からなるプール）、または低ＣＡ－１２５（＜３５Ｕ／ｍＬ、１１の個々の試料からなるプール）により線引きされる早期ステージ卵巣癌試料と比較している。適切な陽性及び陰性対照を各バイオマーカー組合せについて行って、アッセイが適切に機能したことを確認した（例えば、細胞外小胞を含まない試料または卵巣癌細胞系からの細胞外小胞を含む試料）。結果は、ある特定のバイオマーカー組合せが卵巣癌試料を、注記されている参照試料から成功裏に識別したことを記録した（表示のバイオマーカー組合せを用いて実施例１に記載のとおりに実行された増幅で、少なくとも２倍差で測定された場合）。
特に、下に示されているとおり、この所見は、本開示に従って使用される、これらのバイオマーカー組合せのうちのいくつかは、卵巣悪性病変を健康な組織、良性婦人科腫瘍、及び／または他のがん種類から特異的に識別することを実証しており、それにより、開示の技術の特に有利な特徴を実証している。さらに、下に示されているとおりの結果は、様々なバイオマーカー組合せが早期ステージ高ＣＡ－１２５卵巣癌試料プール及び／または早期ステージ低ＣＡ－１２５卵巣癌試料プールを、健康な試料プール、非卵巣癌試料プール、及び／または良性婦人科腫瘍試料プールから識別したことを実証している。ある特定のシナリオでは、この特徴は特に重要であり、それというのも、現行の標準治療である非侵襲性検出方法が、血清ＣＡ－１２５レベルの測定（詳細な記載において上記したとおりのもの）に依存しているためである。したがって、本実施例は、早期ステージ低ＣＡ－１２５卵巣癌診断について、現行の標準治療よりも有効な診断システムを提供し得る、本開示に従って使用されるバイオマーカーシグネチャーを記載する。加えて、本実施例の所見は、卵巣癌試料と、良性婦人科腫瘍及び／または他のがん種とを識別するアッセイを記載する。一部の状況では、この特徴は特に重要であり、それというのも、良性腫瘍及び／または他のがん種は、悪性卵巣癌と同様の症状及び／または分子シグネチャーをもたらし得、かつこれらの状態は多くの場合に、従来のスクリーニング方法を使用する場合には識別することが困難であるためである。
特に、本実施例で示される結果は、提供される技術が卵巣嚢胞腺癌を検出することを実証しており、かつ提供される技術（例えば、ＥＶ内、及びその上のバイオマーカーを検出するために本明細書に記載のとおりのバイオマーカー組合せを使用する）が卵巣癌由来ＥＶを、健康な組織、良性婦人科腫瘍に由来する、及び／またはある特定の他のがん種から誘導されるものから識別することを特異的に実証している。
本実施例は、９０の健康な女性からの血漿のプールよりも少なくとも２倍高いシグナルを伴うことを含めて進行卵巣癌を検出するための、及び／または卵巣癌を良性婦人科腫瘍血漿を識別するための、及び／または卵巣癌血漿をある特定の他のがん種類から識別するための、共局在バイオマーカーシグネチャーを検出する（例えば、個々のＥＶ内、及びその上のバイオマーカーを検出する）提供される技術（例えば、本明細書に記載のとおりの近接ライゲーション技術）の有効性を実証している。本実施例は特に、共局在表面バイオマーカーシグネチャー（例えば、個々のＥＶ上のもの）を検出するためのそのような提供される技術の有効性を記録している。
本開示はさらに、本明細書に記載のとおりのアッセイにおいて特に有用及び／または有効である特定のバイオマーカー、及びそのセットを定義する。一部の実施形態では、特定の例示されるバイオマーカー及び／またはセットは、例示のとおりに有用である。一部の実施形態では、複数の特定の例示されるバイオマーカー及び／またはセットを同じ試料に（例えば、同じ試料の異なるアリコットに）、及び／または同じ個体（複数可）及び／または供給源からの類似の試料に適用することができる。一部の実施形態では、複数の別々のバイオマーカー、またはそのセット（例えば、バイオマーカーシグネチャー）を評価し、結果のスコア（複数可）（例えば、結合の特定のレベル及び／または、感受性及び／または特異性の特定のレベルを反映）をそれぞれについて決定する。一部の実施形態では、複数のそのような評価が同じ状況（例えば、癌性または非癌性、がんのステージなど）を示すスコアを達成する場合に、診断確実性は改善される。別法では、または加えて、一部の実施形態では、そのようなスコアの決定及び／または考察が１つまたは複数の他の診断評価またはストラテジー（例えば、ＴＶＵＳ及び／または血清ＣＡ－１２５レベルなど）と組み合わされる場合に、診断確実性は改善される。
Figure 2023510911000010
Figure 2023510911000011
Figure 2023510911000012
Figure 2023510911000013
Figure 2023510911000014
Figure 2023510911000015
実施例８：例示的な卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイのさらなる特徴づけ
この実施例は、種々の細胞集団及び患者集団を用いる例示的な卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイにおける様々なバイオマーカー組合せのさらなる特徴づけを対象とする。卵巣癌を検出するための有用なバイオマーカー組合せは、プール対照及び患者血漿試料において本明細書に開示のバイオマーカー（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２、ＭＵＣ１６、ＦＯＬＲ１、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＬＲＲＴＭ１、ＣＬＤＮ１６、ＬＥＭＤ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せなどの、例えば、表面タンパク質標的バイオマーカー）の様々な組合せをスクリーニングすることにより決定することができる。プール試料は、様々な患者コホート内での平均アッセイシグナルについての推定をもたらして、バイオマーカー組合せの選別を容易にし得る。
一部の実施形態では、卵巣癌を検出するためのバイオマーカー組合せは、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上のバイオマーカー（例えば、本明細書に記載のもの）を含み得て、その際、そのような組合せは、細胞外小胞を（例えば、免疫親和性捕捉により）捕捉するための少なくとも１つのバイオマーカーと、ｐｌｉｑ－ＰＣＲアッセイにより検出するための少なくとも１つのバイオマーカー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のバイオマーカーを含む）とを含む。一部の実施形態では、細胞外小胞を捕捉するための標的バイオマーカー（例えば、免疫親和性捕捉）は、ｐｌｉｑ－ＰＣＲベースの分析のための少なくとも１つの標的バイオマーカーと同じであってもよい。一部の実施形態では、細胞外小胞の捕捉及びｐｌｉｑ－ＰＣＲベースの分析のための標的バイオマーカーはそれぞれ、別個であってもよい。様々な例示的なバイオマーカー組合せの例は図２０Ｂ、図２２～２８、及び図３３～３６に示されている。様々な例示的なバイオマーカー組合せの診断能力の例は図３７Ａ～Ｊに示されている。
様々なバイオマーカー組合せを、プールされた患者コホートにおいて確認することができる。患者コホートは、適切な患者及び／または対照集団を含み得る。ある特定の実施形態では、患者コホートは、閉経後の健康な女性（例えば、５５から７９歳の間の健康な女性）、閉経前の健康な女性（例えば、２０から５４歳の間の女性）、進行ＨＧＳＯＣを有する女性（例えば、ステージＩＩＩ及びステージＩＶ ＨＧＳＯＣ症例）、早期ステージＨＧＳＯＣを有する女性（例えば、ステージＩ及びステージＩＩ ＨＧＳＯＣ症例）、良性婦人科腫瘍を有する女性（例えば、良性婦人科増殖を有する女性）、及び／または炎症性疾患、障害、または状態を有する女性（例えば、子宮内膜症、骨盤内炎症性疾患、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び／または潰瘍性大腸炎など）、及び／または他の炎症性疾患を含む炎症状態を有する女性）を含み得る。
一部の実施形態では、２ステップスクリーニング手順は、様々なバイオマーカー組合せの性能を特徴づけ得る。例えば、様々なバイオマーカー組合せ（例えば、捕捉プローブ（例えば、免疫親和性捕捉のためのもの）及び検出プローブのためのバイオマーカーの様々な組合せ）を初めに、健康なバックグラウンドプール（様々な年齢群からのもの）及び進行ステージＨＧＳＯＣプールにおいてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、健康なプールと卵巣癌プールとの間で不十分な分離（例えば、１６倍差未満に対応する、４未満のΔＣｔ）を示すバイオマーカー組合せは、単独で使用するためのバイオマーカー組合せとしては、さらなる研究から除外され得るが、しかしながら、そのようなバイオマーカー組合せは、本明細書に記載のとおりの追加のバイオマーカー組合せと組み合わせる場合には有用であり得る。一部の実施形態では、健康なプールと卵巣癌プールとの間で不十分な分離（例えば、４倍差未満に対応する、２未満のΔＣｔ）を示すバイオマーカー組合せは、単独で使用するためのバイオマーカー組合せとしては、さらなる研究から除外され得るが、しかしながら、そのようなバイオマーカー組合せは、本明細書に記載のとおりの追加のバイオマーカー組合せと組み合わせる場合には有用であり得る。一部の実施形態では、健康なプールと卵巣癌プールとの間で不十分な分離（例えば、２倍差未満に対応する、１未満のΔＣｔ）を示すバイオマーカー組合せは、単独で使用するためのバイオマーカー組合せとしては、さらなる研究から除外され得るが、しかしながら、そのようなバイオマーカー組合せは、本明細書に記載のとおりの追加のバイオマーカー組合せと組み合わせる場合には有用であり得る。
一部の実施形態では、２ステップスクリーニング手順は、様々なバイオマーカー組合せの性能を特徴づけ得る。例えば、様々なバイオマーカー組合せ（例えば、捕捉プローブ（例えば、免疫親和性捕捉のためのもの）及び検出プローブのためのバイオマーカーの様々な組合せ）を初めに、健康なバックグラウンドプール（様々な年齢群からのもの）及び進行ステージＨＧＳＯＣプールにおいてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、健康なプールと卵巣癌プールとの間で良好な診断性能（例えば、２倍差超に対応する、１超のΔＣｔ）を示すバイオマーカー組合せを、プールされた早期ステージＨＧＳＯＣ、良性婦人科腫瘍、及び／または炎症状態を用いるスクリーニングの第２のラウンドに掛けることができる。一部の実施形態では、健康なプールと卵巣癌プールとの間で良好な診断性能（例えば、４倍差超に対応する、２超のΔＣｔ）を示すバイオマーカー組合せを、プールされた早期ステージＨＧＳＯＣ、良性婦人科腫瘍、及び／または炎症状態を用いるスクリーニングの第２のラウンドに掛けることができる。一部の実施形態では、健康なプールと卵巣癌プールとの間で良好な診断性能（例えば、１６倍差超に対応する、４超のΔＣｔ）を示すバイオマーカー組合せを、プールされた早期ステージＨＧＳＯＣ、良性婦人科腫瘍、及び／または炎症状態を用いるスクリーニングの第２のラウンドに掛けることができる。一部の実施形態では、早期及び後期ステージＨＧＳＯＣを対照プールから識別することができる最高のバイオマーカー組合せ（例えば、最良の性能のおよそ２０のバイオマーカー組合せ）をさらに評価することができる。
例示的なアッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）において１つまたは複数の追加のバイオマーカー組合せを組み込むことで、その感受性を改善することができる。実施例７に注記されているとおり、少なくとも２つのバイオマーカー組合せ利用することにより、アッセイの性能の改善（例えば、９８％の特異性で少なくともおよそ８０％の感受性；または９９．５％の特異性で少なくともおよそ７０％の感受性）を達成することができる。プールされた患者試料は、個々の患者集団、特色全体のアッセイシグナルに近似し得て、効率的な手法で多数のバイオマーカー組合せを評価するための実際的なマトリックスを提供し得る。同定された最高のバイオマーカー組合せ（例えば、２０までのバイオマーカー組合せ）を、個々の患者血漿をベースとするパイロット研究においてさらに検査することができる。一部の実施形態では、個々の患者血漿をベースとするパイロット研究は、閉経前または閉経後である対照患者、無症候性である対照患者、症候性である対照患者、良性婦人科腫瘍を有する対照患者、及び／または非卵巣癌の炎症性健康状態を有する対照患者を含み得る。一部の実施形態では、個々の患者血漿をベースとするパイロット研究は、閉経前または閉経後である検査患者、症候性である検査患者、無症候性である検査患者、ステージＩまたはステージＩＩ ＨＧＳＯＣを有する検査患者、及び／またはステージＩＩＩまたはステージＩＶ ＨＧＳＯＣを有する検査患者を含み得る。非ＨＧＳＯＣ健康状態を、卵巣癌コホートと年齢マッチさせることができる。対照試料（例えば、健康な対照、良性婦人科腫瘍、及び／または他のオフターゲット状態）が、遺伝的リスクスクリーニングアッセイでは９８％の特異性（およそ９５％ＣＩ：９５．３％～１００％で）、及び症候性選別アッセイでは９９．５％特異性（およそ９５％ＣＩ：９８．１％～１００％で）に関するシグナルカットオフを設定するための対数正規分布の推定をもたらし得ることが予測され得る。独立性を評価するために、組合せの間の二変量関連を使用して、バイオマーカー組合せ性能特性を評価することができ、卵巣癌を予測するために、三項ロジスティック回帰モデルを使用して、最高のバイオマーカー組合せをさらに検査することができる。
ＨＧＳＯＣ症例を対照から識別することができ、かつ組合せの間のオルトゴナリティを同定することができる新規のバイオマーカー組合せの同定を達成することができる。このオルトゴナリティは、ＨＧＳＯＣ症例を対照コホートから識別する際に助けとなって、本明細書に記載のとおりの例示的なアッセイの感受性を上昇させ得る。患者コホートにおける人種多様性を評価するために、多様な集団に由来する供給者から、試料を得ることができる。ある特定の実施形態では、例示的なバイオマーカー組合せは、特定の人種及び／または民族群に特異的であり得る。ある特定の実施形態では、多様な人種及び／または民族群における例示的なバイオマーカー組合せを検査することで、特異的な人種及び／または民族群についての適切な診断値のバイオマーカー組合せを同定することができる。
一次患者試料における追加の卵巣癌バイオマーカー組合せの確認で、例示的なアッセイの診断性能を改善することができる。１４９人の女性のコホートでは、本明細書に記載のとおりの例示的なアッセイは、２つのバイオマーカー組合せ（実施例７に記載されていて、図２１に例示されているとおりのもの）を用いて、９８％の特異性で６６．７％の感受性、及び９９．５％の特異性で６３．９％の感受性を達成した。追加のオルトゴナルなバイオマーカー組合せを組み込むことにより、アッセイ性能は、９８％の特異性で８０％の感受性、及び９９．５％の特異性で７０％の感受性を上回って改善し得る。
実施例９：卵巣癌を検出するための他のバイオマーカー組合せの追加の評価
この実施例では、例えば、閉経後の健康な女性（例えば、５５から７９歳の間の年齢の健康な女性）、閉経前の健康な女性（例えば、２０から５４歳の間の年齢の女性）、進行ＨＧＳＯＣを有する女性（例えば、ステージＩＩＩ及びステージＩＶ ＨＧＳＯＣ症例）、早期ステージＨＧＳＯＣを有する女性（例えば、ステージＩ及びステージＩＩ ＨＧＳＯＣ症例）、良性婦人科腫瘍を有する女性（例えば、良性婦人科増殖を有する女性）、及び／または炎症性疾患、障害、または状態を有する女性（例えば、子宮内膜症、クローン病、潰瘍性大腸炎などを有する女性）を含む様々な患者試料を使用して、１０の異なるバイオマーカー組合せを評価した。図２２は、対照対象（例えば、健康な女性対象、及び／または良性婦人科腫瘍及び／または炎症状態を有する対象）を卵巣癌患者から識別するための個々の例示的なバイオマーカー組合せを含む例示的なアッセイ（例えば、実施例１に記載のとおりのもの）の性能を示している。例示的な個々のバイオマーカー組合せを表６に表す：
Figure 2023510911000016
図２３～２８は、上の表に示されているある特定のバイオマーカー組合せを含む例示的なアッセイ（例えば、実施例１に記載されているとおりのもの）の性能を示している。各アッセイでは、カットオフ値は、（ｉ）（例えば、分布内の健康な対象のうちの９９．８３％を排除するように）健康な対照対象及び炎症状態を伴う対象の平均から離れて標準偏差２．９３または（ｉｉ）健康な対照対象からの最大アッセイシグナルのいずれかのうち、より制限的でないものを選択することにより決定された。一部の実施形態では、良性卵巣腫瘍試料は、健康な対照対象及び／または炎症状態（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、子宮内膜症）を伴う対象よりも、オフターゲットシグナルについて、懸念が少なくなり得る。したがって、一部のそのような実施形態では、良性卵巣腫瘍試料は、カットオフ値を決定するために含まれなくてもよい。図３３～３６は、上の表に示されているある特定のバイオマーカー組合せを含む追加の例示的なアッセイ（例えば、実施例１に記載されているとおり実行されるもの）の性能を示している。
検査されたバイオマーカー組合せのうち、図２９は、（パネルＡ）ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、少なくとも、ＭＵＣ１６を指向する第１の検出プローブ及びＭＵＣ１６を指向する第２の検出プローブとのセット；（パネルＢ）ＳＬＣ３４Ａ２を指向する捕捉因子と、少なくとも、ＦＯＬＲ１を指向する第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出とのセット；ならびに（パネルＣ）ＭＵＣ１６を指向する捕捉因子と、少なくとも、ＭＵＣ１６を指向する第１の検出プローブ及びＦＯＬＲ１を指向する第２の検出プローブとのセットである、３つの選択されたバイオマーカー組合せの性能（感受性を含む）を示している。図に示されているとおり、それぞれ個々のアッセイが、少なくとも５０％またはそれ以上の感受性を達成した。
卵巣癌検出アッセイの感受性をさらに上昇させるために、本明細書に記載の少なくとも２つのバイオマーカー組合せの組合せを使用することができる。例えば、図２９に示されているとおりの３つすべてのバイオマーカー組合せを使用する場合（すなわち、試料が、３つすべての個々のバイオマーカー組合せのカットオフを含む分類カットオフを満たすか、またはそれを超える場合にのみ、卵巣癌の陽性適応）、そのようなアッセイの感受性が改善される－卵巣癌ステージＩ患者：８３．３％；卵巣癌ステージＩＩ患者：８３．３％；卵巣癌ステージＩＩＩ患者：９０．０％；卵巣癌ステージＩＶ患者：７１．４％；低血清ＣＡ－１２５レベルを有する卵巣癌患者：７１．４％；良性卵巣腫瘍を有する女性：３０．０％；及び健康な対象：０．８％。これは、２つまたはそれ以上のバイオマーカー組合せ（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）を使用することで、少なくとも８０～８１％のアッセイ感受性及び少なくとも９９．２％またはそれ以上のアッセイ特異性（最高１００％の特異性）を達成することができることを示している。
図３０～３２は、ある特定のバイオマーカー組合せを使用する例示的なアッセイ（例えば、実施例１に記載されているとおりのもの）の能力が、さもなければ慣用の血清ＣＡ－１２５アッセイでは見過ごされているであろう正常な血清ＣＡ－１２５（例えば、３５Ｕ／ｍＬ未満）を有する卵巣癌患者を検出し得ることを実証している。さらに、この結果は、バイオマーカー組合せ（例えば、本明細書に記載のもの）が卵巣癌患者から、さもなければ卵巣癌と誤って診断されているであろう上昇した血清ＣＡ－１２５を有する多くの非卵巣癌患者（例えば、良性婦人科腫瘍を有するもの）を識別することができることを示している。これらの結果は、血清ＣＡ－１２５が卵巣癌についての女性のリスクと必ずしも相関し得ない一方で、本明細書において提供される技術者が卵巣癌対象を、それらの血清ＣＡ－１２５レベルとは独立に成功裏に同定することができることを示している。
実施例１０：例示的な卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの確認
この実施例は、追加の集団／コホートにおける例示的な卵巣癌リキッドバイオプシーアッセイの確認に関する。患者試料の追加のコホートを使用して、本明細書に記載のとおりの例示的な卵巣癌診断アッセイを評価するための独立した確認研究を実行することができる。試料は任意の適切な供給源から得ることができる。技術者を任意の結果分析の前に試料設計に対して盲検化し、及び／またはアッセイ結果は、外部の独立した技術が分析する。米国を代表する集団からの試料採取を確実にするため、試料利用性に応じて、試料の少なくともおよそ２０％を非白人種から得ることができる（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃｅｎｓｕｓ Ｂｕｒｅａｕ、２０１８）。
ある特定の実施形態では、分析される患者コホートには、任意のリスク低減手術を受ける前の、卵巣癌について遺伝的リスクを有する患者（例えば、卵巣癌の家族性症例を有する患者及び／または両側卵管卵巣摘出術または同様の手技を受けていないＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２病的バリアントキャリア、腹部疼痛と関連する慢性状態を有する閉経後女性（例えば、慢性炎症状態を有する５４歳超の女性、良性婦人科腫瘍を有する患者、及び／またはＨＧＳＯＣを有する患者（例えば、ステージＩ／ＩＩ卵巣癌を有する個体、及びステージＩＩＩ／ＩＶ卵巣癌を有する個体）が含まれ得る。ある特定の実施形態では、バイオマーカー組合せ（例えば、本明細書に記載のもの）は、遺伝的リスクを有する女性において、およそ９８％の特異性（９５％ＣＩ：９５．５％～１００％）で少なくともおよそ８０％の感受性（９５％ＣＩ：６８．７％～９１．３％）をもたらし得る。ある特定の実施形態では、バイオマーカー組合せ（例えば、本明細書に記載のもの）は、閉経後症候性女性について、およそ９９．５％の特異性（９５％ＣＩ：９８．２％～１００％）で少なくともおよそ７０％の感受性（９５％ＣＩ：５７％～８３％）をもたらし得る。さらに、ある特定の実施形態では、例示的なアッセイは、擬陽性をほとんど生じずに、良性腫瘍を有する女性と、ＨＧＳＯＣを有する女性とを識別することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のとおりの例示的なアッセイの追加の確認研究を、独立した供給源から縦断収集された試料を利用して行うことができる。一部の実施形態では、試料は、卵巣癌症例から縦断収集された採血（例えば、時間的に別個の時点で収集された採血）から得られるか、またはそれから誘導することができる。加えて、年齢マッチ対照からの採血を分析することができる。９８％の特異性カットオフについて例示的なロジスティック回帰モデルを使用して、９８％の一年特異性を維持しながら、診断の何年前に（例えば、採血が利用可能である卵巣癌診断の何年も前に）、例示的なアッセイは卵巣癌を検出することができるかの評価を行うことができる。特異性が対照試料において９８％に維持されることを保証しながら、アッセイ感受性を、診断前の年数を関数として計算することができる。
一部の実施形態では、診断の時点で収集された試料で、ＨＧＳＯＣについておよそ９８％の特異性（９５％ＣＩ：９３．８％～１００％）で少なくともおよそ８０％の感受性（９５％ＣＩ：６３．３％～９６．７％）を予測することができる。卵巣癌腫瘍が４年またはそれ以上の年数にわたってステージＩ／ＩＩ疾患として存在することが示されていることを考慮すると（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ、２００９）、例示的なアッセイは、臨床診断の２年前に、ＨＧＳＯＣについて少なくともおよそ６０％の感受性（９５％ＣＩ：３９．５％～８０．５％）を達成すると予測され得る。これは、臨床診断の２年前で、この高リスク患者コホートでは２３．３％のＰＰＶに関し、その際、ＰＰＶは、遺伝的リスクを有する女性についての現行の標準治療よりもはるかに良好である。
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均等物
当業者は、ルーチンを超えない実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物が分かるか、または確認することができるであろう。別段に示されていない限り、または矛盾もしくは不整合性が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、本発明は、列挙されている特許請求の範囲のうちの１つまたは複数からの１つまたは複数の限定、要素、項目、記述用語などが、同じ基本請求項（または、関連する任意の他の請求項として）に従属する別の請求項に導入されるすべての変形形態、組合せ、及び順列を包含することは理解されるべきである。さらに、具体的な除外が本明細書に記載されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様は、特許請求の範囲から明らかに除外され得ることも理解されるべきである。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されてなく、むしろ次の特許請求の範囲に記載されている。

Claims (237)

  1. 方法であって、
    （ａ）対象から血液由来試料を用意することまたは得ること；
    （ｂ）前記血液由来試料において、第１の標的バイオマーカーシグネチャーを発現する細胞外小胞（「第１の標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞」）を検出し、その際、前記第１の標的バイオマーカーシグネチャーが、
    少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと
    表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、及び小胞内ＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含み、その際、
    前記表面タンパク質バイオマーカーが、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ３、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せから選択され；
    前記小胞内タンパク質バイオマーカーが、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せから選択され；
    前記小胞内ＲＮＡバイオマーカーが、ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せから選択されること；
    （ｃ）前記血液由来試料における前記第１の標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞のレベルを示す試料情報を、第１の基準閾値レベルを含む基準情報と比較すること；
    （ｄ）前記血液由来試料が、前記第１の基準閾値レベルを基準とする分類カットオフと比べて、第１の標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞の上昇したレベルを示す場合に、前記対象を、卵巣癌を有する、またはそれに易罹患性であると分類すること
    を含む、前記方法。
  2. 前記少なくとも１つの標的バイオマーカーが、前記表面タンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数から選択される場合に、前記選択された表面タンパク質バイオマーカー（複数可）及び前記少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーが異なる、請求項１に記載の方法。
  3. （ｂ）及び（ｃ）のステップを少なくとも第２の標的バイオマーカーシグネチャーのために繰り返し、その際、前記分類カットオフが、前記第１の基準閾値レベル及び前記少なくとも第２の標的バイオマーカーシグネチャーに対応する少なくとも第２の基準閾値レベルを基準とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーが、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せであるか、またはそれを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーが、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド、ＦＯＬＲ１ポリペプチド、ＭＵＣ１６ポリペプチド、ＣＬＤＮ３ポリペプチド、ＣＬＤＮ６ポリペプチド、ＡＬＰＬポリペプチド、ＢＳＴ２ポリペプチド、ＭＳＬＮポリペプチド、ＭＵＣ１ポリペプチド、ＰＴＧＳ１ポリペプチド、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチド、ＥｐＣＡＭポリペプチド、及び／またはＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＳＣＬ３４Ａ２ポリペプチド及び／またはＣＬＤＮ６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと；（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＳＣＬ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＳＣＬ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１であるか、またはそれを含む少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ６であるか、またはそれを含む少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ６である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＳＬＣ３４Ａ２及びＣＬＤＮ３である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＦＯＬＲ１及びＭＵＣ１６である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＣＬＤＮ３及びＭＵＣ１６である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＣＬＤＮ３及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＣＬＤＮ３ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＡＬＰＬポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＢＳＴ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＳＬＮとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＦＯＬＲ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーｓＴｎグリコシル化ポリペプチドとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーｓＴｎグリコシル化ポリペプチドとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＰＴＧＳ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＦＯＬＲ１とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＳＬＮとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーＭＵＣ１６とを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）少なくとも１つの標的バイオマーカーｓＴｎグリコシル化ポリペプチドとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＭＵＣ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＳＬＮ及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＵＣ１６ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＳＬＮ及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＭＵＣ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＳＬＮ及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びｓＴｎグリコシル化ポリペプチドである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＭＵＣ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＭＳＬＮポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ＭＵＣ１６及びＭＳＬＮである少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＳＣＬ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１６である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが（ｉ）ＳＣＬ３４Ａ２ポリペプチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、（ｉｉ）ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＦＯＬＲ１である少なくとも２つの標的バイオマーカーとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記第１及び／または第２の基準閾値レベルを、非がん対象の集団からの比較可能な試料において観察された標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞のレベルにより決定する、請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 非がん対象の前記集団が、次の対象集団：健康な女性対象、良性腫瘍と診断されている女性対象、ならびに非卵巣関連疾患、障害、及び／または状態を有する女性対象条件のうちの１つまたは複数を含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 細胞外小胞を含む目的のサイズ範囲を有するナノ粒子を（例えば、前記血液由来試料から直接）単離するために、前記血液由来試料がサイズ排除クロマトグラフィーに掛けられている、請求項１～７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記検出ステップが捕捉アッセイを含む、請求項１～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記捕捉アッセイが、前記血液由来試料を、前記少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーに結合する標的捕捉部分を含む捕捉因子と接触させることを含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記捕捉因子が、コンジュゲートした前記標的捕捉部分を含む固体基材であるか、またはそれを含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記固体基材が磁気ビーズを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記標的捕捉部分が抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７４～７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記検出ステップが検出アッセイを含む、請求項１～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記検出ステップが捕捉アッセイ及び検出アッセイを含み、前記捕捉アッセイを前記検出アッセイの前に実行する、請求項１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが少なくとも１つの小胞内ＲＮＡバイオマーカーを含む場合、前記検出アッセイが逆転写ｑＰＣＲを含む、請求項７８～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが少なくとも１つの小胞内タンパク質バイオマーカーを含む場合、前記標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞を、前記検出アッセイの前に、固定化及び／または透過化を含めて処理する、請求項７８～８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. 前記第１及び／または第２の標的バイオマーカーシグネチャーが少なくとも１つの表面タンパク質バイオマーカー及び／または小胞内タンパク質バイオマーカーを含む場合、前記検出アッセイがイムノアッセイ（例えば、免疫－ＰＣＲ、及び／または近接ライゲーションアッセイを含む）を含む、請求項７８～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記検出アッセイが近接ライゲーションアッセイを含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記近接ライゲーションアッセイが、
    （ａ）前記少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを発現する前記標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞（「細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカー発現細胞外小胞」）を、前記標的バイオマーカーシグネチャーの標的バイオマーカーをそれぞれ指向する検出プローブのセットと接触させるステップであって、その際、そのセットが、少なくとも２つの検出プローブを含むので、前記細胞外小胞と、前記検出プローブのセットとを含む組合せが生じ、
    前記検出プローブがそれぞれ：
    （ｉ）前記標的バイオマーカーシグネチャーの前記標的バイオマーカーを指向する標的結合部分と；
    （ｉｉ）前記標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインであって、二本鎖部分と、前記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸張している一本鎖オーバーハング部分とを含む前記オリゴヌクレオチドドメインと
    を含み、
    前記検出プローブの前記一本鎖オーバーハング部分が、前記検出プローブが同じ細胞外小胞に結合した場合に相互にハイブリダイズし得ることにおいて特徴づけられる、前記ステップと、
    （ｂ）前記少なくとも２つの検出プローブが、前記標的バイオマーカーシグネチャーを発現する同じ細胞外小胞に結合して二本鎖複合体を形成し得るように、検出プローブの前記セットが前記細胞外小胞上のそれらのそれぞれの標的に結合することを可能にする条件下で、前記組合せを維持するステップと；
    （ｃ）前記二本鎖複合体を核酸リガーゼと接触させて、ライゲートされたテンプレートを生成するステップと；
    （ｄ）前記ライゲートされたテンプレートを検出するステップであって、前記ライゲートされたテンプレートの存在が、前記標的バイオマーカーシグネチャー発現細胞外小胞が前記血液由来試料中に存在することを示す、前記ステップと；
    （ｅ）任意選択で、少なくとも１つの追加の標的バイオマーカーシグネチャーについて、ステップａからｄを繰り返すステップ
    とを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＳＬＮを指向する、請求項８４に記載の方法。
  88. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＡＬＰＬを指向する、請求項８４に記載の方法。
  89. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  90. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドを指向する、請求項８４に記載の方法。
  91. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＢＳＴ２を指向する、請求項８４に記載の方法。
  92. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＰＴＧＳ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  93. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２を指向する、請求項８４に記載の方法。
  94. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＴＡＣＳＴＤ２を指向する、請求項８４に記載の方法。
  95. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  96. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  97. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  98. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＣＬＤＮ３を指向する、請求項８４に記載の方法。
  99. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  100. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＣＬＤＮ３及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  101. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＣＬＤＮ３及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  102. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＡＬＰＬ及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  103. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＢＳＴ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  104. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＭＳＬＮを指向する、請求項８４に記載の方法。
  105. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  106. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  107. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  108. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  109. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  110. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  111. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  112. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＰＴＧＳ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  113. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  114. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項８４に記載の方法。
  115. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＳＬＮを指向する、請求項８４に記載の方法。
  116. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＴＡＣＳＴＤ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項８４に記載の方法。
  117. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＴＡＣＳＴＤ２を指向する、請求項８４に記載の方法。
  118. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記オリゴヌクレオチドドメインが異なる、請求項８５～１１７のいずれか１項に記載の方法。
  119. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＭＵＣ１６ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  121. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  122. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＭＳＬＮポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  123. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  124. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＭＵＣ１ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  125. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  126. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＰＴＧＳ１ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  127. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＢＳＴ２ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  128. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＡＬＰＬポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  129. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＬＲＲＴＭ１ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  130. 前記捕捉アッセイの前記標的捕捉部分が、ＣＬＤＮ３ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項７７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  131. 前記対象において、早期ステージ卵巣癌、後期ステージ卵巣癌、または再発性卵巣癌についてスクリーニングするために実行する、請求項１～１３０のいずれか１項に記載の方法。
  132. 前記対象が、正常な血清ＣＡ－１２５レベルを有すると決定されている、請求項１～１３１のいずれか１項に記載の方法。
  133. 前記対象が、正常な血清ＣＡ－１２５レベルと同等か、またはそれより高い血清ＣＡ－１２５レベルを有すると決定されている、請求項１～１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. 前記対象が、次の特徴：
    （ｉ）卵巣癌に易罹患性である（例えば、平均的集団リスクを有する（すなわち、遺伝的リスクを有さない）か、または卵巣癌についての遺伝的リスクを有する）無症候性女性（例えば、成人女性）；
    （ｉｉ）閉経後女性；
    （ｉｉｉ）乳癌及び／または卵巣癌の家族歴を有する女性（例えば、成人女性）（例えば、乳癌及び／または卵巣癌の履歴を有する１人または複数の第一度近親者を有する女性（例えば、成人女性））；
    （ｉｖ）ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＡＬＢ２、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＢＡＲＤ、ＣＨＥＫ２、ＭＲＥ１１Ａ、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ及びそれらの組合せにおいて１つまたは複数の生殖細胞系変異を有すると決定されている女性（例えば、成人女性）；
    （ｖ）ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２及び／またはＰＡＬＢ２において生殖細胞系変異を有すると決定されている乳癌を有する女性（例えば、成人女性）；
    （ｖｉ）例えば、６５歳またはそれ以上の高齢女性；
    （ｖｉｉ）卵巣癌の１つまたは複数の非特異的症状を有する女性（例えば、成人女性）であって、任意選択で、前記非特異的症状の少なくとも１つが過敏性腸症候群での１つまたは複数の症状と同様である女性（例えば、成人女性）；ならびに
    （ｖｉｉｉ）ＣＡ－１２５／経腟超音波検査（ＴＶＵＳ）周期的スクリーニングが推奨されている女性（例えば、成人女性）；
    （ｉｘ）画像で確認される付属器腫瘤を有すると診断されている女性（例えば、成人女性）；
    （ｘ）リスクを低減する両側卵管卵巣摘出術を施される前の、遺伝的リスクを有する女性（例えば、成人女性）；
    （ｘｉ）良性婦人科腫瘍を有する女性（例えば、成人女性）；
    （ｘｉｉ）卵巣癌について以前に処置されたことのある女性（例えば、成人女性）；ならびに
    （ｘｉｉｉ）卵巣癌について生活歴関連リスクを有する女性（例えば、成人女性）
    のうちの少なくとも１つまたは複数を有する、請求項１～１３３のいずれか１項に記載の方法。
  135. 次の診断アッセイ：
    （ｉ）前記対象の毎年の理学的検査（例えば、子宮頸癌ではＨＰＶ、及び／またはＰａｐスミアスクリーニングならびに乳癌ではマンモグラムスクリーニングを含む）；
    （ｉｉ）血清ＣＡ－１２５及び／またはＴＶＵＳスクリーニング検査；
    （ｉｉｉ）がんに関連する循環腫瘍ＤＮＡ及び／またはタンパク質バイオマーカーにおける遺伝子変異について、血漿をスクリーニングするための遺伝子アッセイ；
    （ｉｖ）細胞表現型及びマーカー発現を同定するための免疫蛍光染色、続いて、次世代シーケンシングによる増幅及び分析を含むアッセイ；ならびに
    （ｖ）ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２生殖細胞系及び体細胞変異アッセイ、または細胞非含有腫瘍ＤＮＡ、リキッドバイオプシー、血清タンパク質及び細胞非含有ＤＮＡ、ＯＶＡ１及びＯＶＥＲＡ検査、及び／または循環腫瘍細胞を含むアッセイ
    のうちの１つまたは複数と組み合わせて使用する、請求項１～１３４のいずれか１項に記載の方法。
  136. 前記卵巣癌が、高異型度漿液性卵巣癌、類子宮内膜卵巣癌、明細胞卵巣癌、低異型度漿液性卵巣癌、または粘液性卵巣癌である、請求項１～１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 前記卵巣癌が高異型度漿液性卵巣癌である、請求項１～１３６のいずれか１項に記載の方法。
  138. 前記高異型度漿液性卵巣癌が早期ステージである、請求項１３７に記載の方法。
  139. 抗卵巣癌治療（例えば、オラパリブ、シスプラチン、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ）の処置に対する応答について、及び／またはがん再発／転移について卵巣癌患者をモニターするために実行する、請求項１～１３８のいずれか１項に記載の方法。
  140. 卵巣癌を検出するためのキットであって：
    （ａ）細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む捕捉因子；及び
    （ｂ）卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーの標的バイオマーカーをそれぞれ指向する少なくとも２つの検出プローブを含む、検出プローブのセット
    を含み、
    その際、前記検出プローブがそれぞれ：
    （ｉ）卵巣癌についての前記標的バイオマーカーシグネチャーの前記標的バイオマーカーを指向する標的結合部分；及び
    （ｉｉ）前記標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインであって、二本鎖部分と、前記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハング部分とを含む、前記オリゴヌクレオチドドメイン
    を含み、
    前記少なくとも２つの検出プローブの前記一本鎖オーバーハング部分が、前記少なくとも２つの検出プローブが同じ細胞外小胞に結合している場合に、それらが相互にハイブリダイズし得ることにおいて特徴づけられ；
    卵巣癌についての前記標的バイオマーカーシグネチャーが：
    少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと、
    表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、及び小胞内ＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーと
    を含み、
    前記表面タンパク質バイオマーカーが、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ３、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せから選択され；
    前記小胞内タンパク質バイオマーカーが、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せから選択され；
    前記小胞内ＲＮＡバイオマーカーが、ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せから選択される、前記キット。
  141. 前記少なくとも１つの標的バイオマーカーが前記表面タンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数から選択される場合に、前記選択された表面タンパク質バイオマーカー（複数可）及び前記少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーが異なる、請求項１４０に記載のキット。
  142. 前記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーが、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せであるか、またはそれを含む、請求項１４０または１４１に記載のキット。
  143. 前記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーが、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド、ＭＵＣ１６ポリペプチド、ＥｐＣＡＭポリペプチド、ＦＯＬＲ１ポリペプチド、ＣＬＤＮ３ポリペプチド、ＣＬＤＮ６ポリペプチド、ＡＬＰＬポリペプチド、ＢＳＴ２ポリペプチド、ＭＳＬＮポリペプチド、ＭＵＣ１ポリペプチド、ＰＴＧＳ１ポリペプチド、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチド、及び／またはＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載のキット。
  144. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、前記標的バイオマーカーシグネチャーの同じ標的バイオマーカーを指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  145. 前記同じ標的バイオマーカーがＭＵＣ１６であるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  146. 前記同じ標的バイオマーカーがＦＯＬＲ１であるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  147. 前記同じ標的バイオマーカーがＭＳＬＮであるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  148. 前記同じ標的バイオマーカーがＡＬＰＬであるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  149. 前記同じ標的バイオマーカーがＭＵＣ１であるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  150. 前記同じ標的バイオマーカーがｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  151. 前記同じ標的バイオマーカーがＢＳＴ２であるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  152. 前記同じ標的バイオマーカーがＰＴＧＳ１であるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  153. 前記同じ標的バイオマーカーがＳＬＣ３４Ａ２であるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  154. 前記同じ標的バイオマーカーがＴＡＣＳＴＤ２であるか、またはそれを含む、請求項１４４に記載のキット。
  155. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記オリゴヌクレオチドドメインが異なる、請求項１４０～１５５のいずれか１項に記載のキット。
  156. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、前記標的バイオマーカーシグネチャーの別個の標的バイオマーカーを指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  157. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  158. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  159. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  160. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＣＬＤＮ３を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  161. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  162. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＣＬＤＮ３及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  163. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＣＬＤＮ３及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  164. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＡＬＰＬ及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  165. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＢＳＴ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  166. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＭＳＬＮを指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  167. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  168. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  169. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  170. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  171. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  172. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  173. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  174. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＰＴＧＳ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  175. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  176. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  177. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＳＬＮを指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  178. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＴＡＣＳＴＤ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  179. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＴＡＣＳＴＤ２を指向する、請求項１４０～１４３のいずれか１項に記載のキット。
  180. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  181. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＭＵＣ１６ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  182. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＦＯＬＲ１ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  183. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＭＳＬＮポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  184. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  185. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＭＵＣ１ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  186. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  187. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＰＴＧＳ１ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  188. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＢＳＴ２ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  189. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＡＬＰＬポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  190. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＬＲＲＴＭ１ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  191. 細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーを指向する標的捕捉部分を含む前記捕捉因子が、ＣＬＤＮ３ポリペプチドを指向する少なくとも１つの抗体因子を含む、請求項１４０～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  192. 少なくとも１つの追加の試薬（例えば、リガーゼ、固定化剤、及び／または透過化剤）をさらに含む、請求項１４０～１９２のいずれか１項に記載のキット。
  193. （ａ）ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む第１の捕捉因子；
    （ｂ）ＭＵＣ１６ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む第２の捕捉因子；
    （ｃ）検出プローブの少なくとも３つのセット
    を含み、その際、前記検出プローブがそれぞれ：
    （ｉ）標的表面タンパク質バイオマーカーを指向する標的結合部分；及び
    （ｉｉ）前記標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインであって、二本鎖部分と、前記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸張している一本鎖オーバーハング部分とを含む前記オリゴヌクレオチドドメイン
    を含み、
    前記少なくとも２つの検出プローブの前記一本鎖オーバーハング部分が、前記少なくとも２つの検出プローブが同じ細胞外小胞に結合した場合に相互にハイブリダイズし得ることにおいて特徴づけられ；
    その際、
    第１のセットの少なくとも２つの検出プローブが、ＭＵＣ１６標的表面タンパク質をそれぞれ指向し；
    第２のセットの少なくとも２つの検出プローブが、ＦＯＬＲ１標的表面タンパク質をそれぞれ指向し；かつ
    第３のセットの少なくとも２つの検出プローブが、ＭＵＣ１６ポリペプチド及びＦＯＬＲ１ポリペプチドをそれぞれ指向する、
    請求項１４０～１４６、または１５７～１６１のいずれか１項に記載のキット。
  194. （ａ）標的捕捉部分を含む第１の捕捉因子；
    （ｂ）標的捕捉部分を含む第２の捕捉因子；
    （ｃ）検出プローブの少なくとも２つのセット
    を含み、その際、前記検出プローブがそれぞれ：
    （ｉ）標的表面タンパク質バイオマーカーを指向する標的結合部分；及び
    （ｉｉ）前記標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインであって、二本鎖部分と、前記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸張している一本鎖オーバーハング部分とを含む前記オリゴヌクレオチドドメイン
    を含み、
    その際、前記少なくとも２つの検出プローブの前記一本鎖オーバーハング部分が、前記少なくとも２つの検出プローブが同じ細胞外小胞に結合した場合に相互にハイブリダイズし得ることにおいて特徴づけられる、請求項１４０～１９３のいずれか１項に記載のキット。
  195. （ａ）標的捕捉部分を含む第１の捕捉因子；
    （ｂ）標的捕捉部分を含む第２の捕捉因子；
    （ｃ）標的捕捉部分を含む第３の捕捉因子；
    （ｄ）検出プローブの少なくとも３つのセット
    を含み、その際、前記検出プローブがそれぞれ：
    （ｉ）標的表面タンパク質バイオマーカーを指向する標的結合部分；及び
    （ｉｉ）前記標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインであって、二本鎖部分と、前記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸張している一本鎖オーバーハング部分とを含む前記オリゴヌクレオチドドメイン
    を含み、
    その際、前記少なくとも２つの検出プローブの前記一本鎖オーバーハング部分が、前記少なくとも２つの検出プローブが同じ細胞外小胞に結合した場合に相互にハイブリダイズし得ることにおいて特徴づけられる、請求項１４０～１９３のいずれか１項に記載のキット。
  196. 複合体であって：
    （ａ）卵巣癌についての標的バイオマーカーシグネチャーを発現する細胞外小胞であって：
    少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーと
    表面タンパク質バイオマーカー、小胞内タンパク質バイオマーカー、及び小胞内ＲＮＡバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１つの標的バイオマーカーとを含み、その際、
    前記表面タンパク質バイオマーカーが、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せから選択され；
    前記小胞内タンパク質バイオマーカーが、ＣＲＡＢＰ２、ＫＬＫ７、ＭＩＦ、ＰＲＡＭＥ、及びＳ１００Ａ１、及びそれらの組合せから選択され；
    前記小胞内ＲＮＡバイオマーカーが、ＣＲＡＢＰ２、ＭＩＦ、ＣＬＤＮ６、ＰＲＡＭＥ、Ｓ１００Ａ１、ＫＬＫ７、及びそれらの組合せから選択され；
    前記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドを指向する標的捕捉部分を含む固体基材上に固定されている、前記細胞外小胞と；
    （ｂ）第１の検出プローブ及び第２の検出プローブであって、それぞれの検出プローブが、
    （ｉ）前記腫瘍標的バイオマーカーシグネチャーの前記標的バイオマーカーの一方を指向する標的結合部分；及び
    （ｉｉ）前記標的結合部分にカップリングしているオリゴヌクレオチドドメインであって、二本鎖部分と、前記オリゴヌクレオチドドメインの一方の末端から伸長している一本鎖オーバーハング部分とを含む、前記オリゴヌクレオチドドメイン
    を含み、
    前記第１及び第２の検出プローブの前記一本鎖オーバーハング部分が相互にハイブリダイズしている、前記細胞外小胞にそれぞれ結合している、前記第１の検出プローブ及び第２の検出プローブとを含む、前記複合体。
  197. 前記少なくとも１つの標的バイオマーカーが前記表面タンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数から選択される場合に、前記選択された表面タンパク質バイオマーカー（複数可）及び前記少なくとも１つの細胞外小胞関連膜結合タンパク質バイオマーカーが異なる、請求項１９７に記載の複合体。
  198. 前記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーが、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ６、ＡＱＰ５、ＣＬＤＮ１６、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＬＥＭＤ１、ＬＲＲＴＭ１、ＭＵＣ１６、ＣＨＯＤＬ、ＣＤＨ６、ＨＴＲ３Ａ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＣＤ２４、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＰＴＧＳ１、ＳＴ１４、ｓＴｎ、ＴＡＣＳＴＤ２、ＢＣＡＭ、ＣＤ７４、ＬＹ６Ｅ、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＸＣＲ４、ＤＤＲ１、ＥＦＮＢ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＬＸＮＢ１、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、及びそれらの組合せであるか、またはそれを含む、請求項１９６または１９７に記載の複合体。
  199. 前記細胞外小胞関連膜結合ポリペプチドバイオマーカーが、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド、ＦＯＬＲ１ポリペプチド、ＭＵＣ１６ポリペプチド、ＥｐＣＡＭポリペプチド、ＣＬＤＮ３ポリペプチド、ＣＬＤＮ６ポリペプチド、ＡＬＰＬポリペプチド、ＢＳＴ２ポリペプチド、ＭＳＬＮポリペプチド、ＭＵＣ１ポリペプチド、ＰＴＧＳ１ポリペプチド、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド、ＴＡＣＳＴＤ２ポリペプチド、及び／またはＬＲＲＴＭ１ポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項１９７～１９９のいずれか１項に記載の複合体。
  200. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、前記標的バイオマーカーシグネチャーの同じ標的バイオマーカーを指向する、請求項１９７～２００のいずれか１項に記載の複合体。
  201. 前記同じ標的バイオマーカーがＭＵＣ１６であるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  202. 前記同じ標的バイオマーカーがＦＯＬＲ１であるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  203. 前記同じ標的バイオマーカーがＭＳＬＮであるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  204. 前記同じ標的バイオマーカーがＡＬＰＬであるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  205. 前記同じ標的バイオマーカーがＭＵＣ１であるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  206. 前記同じ標的バイオマーカーがｓＴｎグリコシル化ポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  207. 前記同じ標的バイオマーカーがＢＳＴ２であるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  208. 前記同じ標的バイオマーカーがＰＴＧＳ１であるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  209. 前記同じ標的バイオマーカーがＳＬＣ３４Ａ２であるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  210. 前記同じ標的バイオマーカーがＴＡＣＳＴＤ２であるか、またはそれを含む、請求項２０１に記載の複合体。
  211. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記オリゴヌクレオチドドメインが異なる、請求項２０１～２１１のいずれか１項に記載の複合体。
  212. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、前記標的バイオマーカーシグネチャーの別個の標的バイオマーカーを指向する、請求項１９７～２００のいずれか１項に記載の複合体。
  213. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１６及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  214. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１６及びＣＬＤＮ６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  215. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＣＬＤＮ６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  216. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＣＬＤＮ３を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  217. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  218. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＣＬＤＮ３及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  219. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＣＬＤＮ３及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  220. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＡＬＰＬ及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  221. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＢＳＴ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  222. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＭＳＬＮを指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  223. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＦＯＬＲ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  224. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  225. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  226. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  227. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  228. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＭＵＣ１及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  229. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  230. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＰＴＧＳ１及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  231. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  232. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＦＯＬＲ１を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  233. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＭＳＬＮを指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  234. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ＴＡＣＳＴＤ２及びＭＵＣ１６を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  235. 前記少なくとも２つの検出プローブの前記標的結合部分がそれぞれ、ｓＴｎグリコシル化ポリペプチド及びＴＡＣＳＴＤ２を指向する、請求項２１３に記載の複合体。
  236. 前記固体基材が磁気ビーズを含む、請求項１９７～２３６のいずれか１項に記載の複合体。
  237. 前記標的捕捉部分が抗体因子であるか、またはそれを含む、請求項１９７～２３６のいずれか１項に記載の複合体。
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