JP2023509734A - 操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞 - Google Patents

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Abstract

本出願は、ＤＮＡ断片の相同組換えを伴うＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法に関する。さらに、本明細書では、本明細書で提供される方法を使用して組換え操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞が提供される。本明細書では、本明細書に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を使用するポリペプチドの調製方法、及び本明細書で提供される方法によって産生されるポリペプチドも提供される。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０２０年１月７日出願の米国仮出願第６２／９５８，０８８号に対する優先権を主張し、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩテキスト形式であるコンピューター可読形式（ＣＲＦ）の配列表の全体が参照によって組み込まれる。この配列表テキストファイルは、表題が「１４１９７－０１１－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」であり、その作成日は２０２０年１２月２１日であり、そのサイズは１，１１５，７７３バイトである。
１．序論
本出願は、ＤＮＡ断片の相同組換えを伴うＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法に関する。さらに、本明細書では、本明細書で提供される方法を使用して組換え操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞が提供される。本明細書では、本明細書に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を使用するポリペプチドの調製方法、及び本明細書で提供される方法によって産生されるポリペプチドも提供される。
２．背景技術
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属種は珍しい遺伝的特性を有しており、例えば、ある特定のレベルで転写制御を欠いている。遺伝子はポリシストロン性ｐｒｅ－ｍＲＮＡへと転写され、このポリシストロン性ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、その後にトランススプライシング（スプライスリーダーまたはミニエクソンの付加、及びポリアデニル化を伴う）によるプロセシングを受けて成熟ｍＲＮＡとなる。遺伝子発現の制御は転写レベルでは生じず、ＲＮＡ安定性、翻訳、及びタンパク質代謝回転のレベルで生じる（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓｉｇｒｉｄ Ｃ．（２０１１）Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ ２（６），ｐｐ．３２０－３２６）。こうしたプロセスは、遺伝子間の非コードＤＮＡ領域（遺伝子間領域（ＩＲ））による影響を受ける（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２５（２），ｐｐ．２０９－２１８）。この理由から、すべてのタンパク質コード配列が、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅまたは近縁種を起源とし得る遺伝子間領域によって分離される必要がある。このことは、組換えＤＮＡ及びベクタープラスミドを使用する場合にも当てはまる。
相同組換えを介して複数の直鎖ＤＮＡ断片を直接的にアセンブリすることは、インビボアセンブリまたは形質転換関連組換えとも称され、数キロベースから完全合成微生物ゲノムに及ぶサイズ範囲のＤＮＡコンストラクトのアセンブリへの適用に成功している。このアセンブリによって、真核生物染色体を異種ＤＮＡで完全に置き換えることも可能になっている。複数のＤＮＡ断片の複雑なインビボアセンブリは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用することで所定の手順となっており、このことが、合成生物学・生物工学宿主としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが広く使用される一因となっている（Ｓｈａｏ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７（２），ｅ１６）。
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属種では相同組換えが効率的に生じる。この相同組換えは、例えば、標的遺伝子を薬剤耐性マーカーで置き換えるために使用され、導入された薬剤耐性マーカーは選択機構を与える。標的指向性コンストラクトの設計では、標的遺伝子の隣接配列に相当する上流領域及び下流領域が薬剤耐性カセットと連結される。以前は、標的指向性ＤＮＡの生成は、時間の要するクローニングステップを伴うものであった（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓｉｇｒｉｄ Ｃ．（２０１１）Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ ２（６），ｐｐ．３２０－３２６）。複数のＤＮＡ断片を同時にアセンブリする手法がいくつか開発されており、こうした手法は、標的指向性コンストラクトのアセンブリをかなり単純化するものである。例としては、ＰＣＲフュージョンベースの方針を使用するもの（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７４（４），ｐｐ．９１４－９２７）及びワンステップの複数断片ライゲーション手法（Ｆｕｌｗｉｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １７５（２），ｐｐ．２０９－２１２）が挙げられる。この一般的な方針は、適切なＳｆｉＩ部位と隣接した種特異的選択可能マーカーを単に生成させるだけで、他の寄生生物及び遺伝子操作可能な生物向けの標的指向性コンストラクトの生成にも適用可能なものであると報告された（Ｆｕｌｗｉｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １７５（２），ｐｐ．２０９－２１２）。この複数断片ライゲーション手法は、欠失株の生成については報告されたが、ノックイン／挿入株については報告されなかった。
糖鎖修飾改変された治療用タンパク質（国際公開公報第ＷＯ２０１９／００２５１２Ａ２号（当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））を得るための発現宿主としてＬｅｉｓｈｍａｎｉａを使用するためには、いくつかの組換えエレメントが宿主細胞ゲノムに挿入され、それらの組換えエレメントを同時に共発現させることが行われ得る。効率的な発現を生じさせるには、すなわち、ポリシストロン性ｐｒｅ－ｍＲＮＡからプロセシング済成熟ｍＲＮＡへのプロセシング及びスプライシングを生じさせるには、目的の組換え発現遺伝子と隣接する制御ＤＮＡ配列が必要である。複数遺伝子挿入の場合では、挿入すべき遺伝子及び制御配列の数が制限となる。これは、同一の配列が同じゲノムに挿入されると、望ましくない組換え事象が生じ得るためである。本明細書では、こうした懸念に対処するための方法が提供される。
３．本発明の概要
本明細書では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を含むキット、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を使用するポリペプチドの調製方法、及びそのような方法によって産生さられるポリペプチドが提供される。
一態様では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法が本明細書で提供され、この方法は、
（ａ）２つ以上のＤＮＡ断片をＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞に導入すること、及び
（ｂ）ＤＮＡ断片の相同組換えが可能になるようにＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞をインキュベートすること、
を含み、２つ以上のＤＮＡ断片の第１のＤＮＡ断片は、５’相同領域及び／または３’相同領域を含み、５’相同領域は、２つ以上のＤＮＡ断片の第２のＤＮＡ断片の３’相同領域と相同的であり、または第１のＤＮＡ断片の３’相同領域は、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域と相同的であり、
第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列は、互いに相同的ではなく、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではなく、及び／またはそれぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のそれぞれが、５’相同領域及び／または３’相同領域を含み、２つ以上のＤＮＡ断片のそれぞれの５’相同領域は、２つ以上のＤＮＡ断片の別の１つの３’相同領域と相同的であり、または２つ以上のＤＮＡ断片のそれぞれの３’相同領域は、２つ以上のＤＮＡ断片の別の１つの５’相同領域と相同的であり、それぞれのＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、互いに相同的ではなく、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではなく、及び／またはそれぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、任意選択で２つ以上のＤＮＡ断片が互いに組換えを起こした後に、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体への組み込みに適する。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、任意選択で２つ以上のＤＮＡ断片が互いに組換えを起こした後に、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれる。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、副鞭毛桿（ｐａｒａｆｌａｇｅｌｌａｒ ｒｏｄ）タンパク質（Ｐｆｒ）遺伝子座に直列に組み込まれる。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、１８Ｓコード領域の開始部位（Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ）に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、互いに組換えを起こす前及び／または起こした後に、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれない。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことで環状プラスミドが生じる。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことでヌクレオチド配列が生じ、このヌクレオチド配列の長さは、５０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド～１００００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド～１５０００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド～２００００ヌクレオチド、２００００ヌクレオチド～２５０００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド～３００００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド～３５０００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド～４００００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド～４５０００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド～５００００ヌクレオチド、５００００ヌクレオチド～５５０００ヌクレオチド、５５０００ヌクレオチド～６００００ヌクレオチド、６００００ヌクレオチド～６５０００ヌクレオチド、６５０００ヌクレオチド～７００００ヌクレオチド、７００００ヌクレオチド～７５０００ヌクレオチド、または７５０００ヌクレオチド～８００００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域と第２のＤＮＡ断片の３’相同領域とは、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の３’相同領域と、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域とは、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、トランスフェクションによって導入される。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、同時に導入される。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、遺伝子間領域（ＩＲ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）、及びポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＩＲ、ＵＴＲ、及びＯＲＦは、それ自体の内部には相同的な配列を有さず、及び／または互いに相同的な配列を有さない。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、同じポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、同じポリペプチドの２つ以上のコピーを発現する能力を有する。ある特定の実施形態では、方法は、ポリペプチドの発現レベルを上昇させる。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことで、２つ以上のＤＮＡ断片によってコードされる遺伝情報の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含むヌクレオチド配列が生じる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間で、望ましくない削除（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｏｕｔ）及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、多くとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％である。ある特定の実施形態では、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の細胞分裂で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、多くとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％である。
ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅである。
別の態様では、本明細書で提供される方法を使用して組換え操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、方法を反復使用して組換え操作される。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅである。
別の態様では、１つ以上の容器及び使用説明を含むキットが本明細書で提供され、当該１つ以上の容器は、本明細書で提供されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を含む。
別の態様では、ポリペプチドの調製方法が本明細書で提供され、この方法は、（ａ）本明細書で提供されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を、ポリペプチド産生に適した条件の下で培養すること、及び（ｂ）ポリペプチドを単離すること、を含む。ある特定の実施形態では、方法は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入することをさらに含む。
さらに別の態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの調製方法によって産生されるポリペプチドが本明細書で提供される。
３．１ 定義
本明細書で使用される「末端」という用語は、別段の指定がない限り、ＤＮＡ断片の５’末端または３’末端に位置する領域を指す。
本明細書で使用される「約」という用語は、数との関連で使用される場合、別段の指定がない限り、任意の数の変動率が、当該言及数の±１％以内、±５％以内、または±１０％以内であることを指す。
本明細書で使用される「対象」という用語は、別段の指定がない限り、動物（例えば、鳥類、爬虫類、及び哺乳類）を指す。別の実施形態では、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス）ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）を含む哺乳類である。ある特定の実施形態では、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、対象は、家畜またはペット（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ロバ、またはニワトリ）である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
治療用物（例えば、本明細書に記載の組成物）を対象に投与する文脈において本明細書で使用される「有効量」という用語は、別段の指定がない限り、予防効果及び／または治療効果（複数可）を有する治療用物量を指す。ある特定の実施形態では、「有効量」は、下記の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数を達成する上で十分な治療用物量を指す：（ｉ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の重症度の低減もしくは軽減、（ｉｉ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の期間の低減、（ｉｉｉ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の進行の阻止、（ｉｖ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の退縮誘導、（ｖ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の発症もしくは発生の阻止、（ｖｉ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の再発の阻止、（ｖｉｉ）疾患／障害と関連する臓器不全の低減、（ｖｉｉｉ）疾患／障害を有する対象の入院回数の低減、（ｉｘ）疾患／障害を有する対象の入院期間の低減、（ｘ）疾患／障害を有する対象の生存期間の延長、（ｘｉ）対象における疾患／障害の除去、及び／または（ｘｉｉ）別の治療の予防効果もしくは治療効果（複数可）の増強もしくは改善。
３．２ 一般用語及び略語
Figure 2023509734000001
Figure 2023509734000002
４．図面の簡単な説明
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅは、相同組換えによって複数のＤＮＡ断片から染色体組み込みコンストラクトをアセンブリすることができる。全長モノクローナル抗体（ｍＡｂ）発現コンストラクトの模式図である。リツキシマブの組み込みコンストラクト（上部）は、ｓｓｕ遺伝子座への組み込みのための相同組換え部位（Ｌｈｒ［ｓｓｕ］及びＲｈｒ［ｓｓｕ］）、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングを正しく確実に生じさせる４つの遺伝子間領域（ＩＲ１＝ａｐｒｔＩＲ；ＩＲ２＝Ｌ．ｅｎｒｉｅｔｔｉ由来のａＴｕｂＩＲ；ＩＲ３＝Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来のＣａｍＩＲ；ＩＲ４＝ｄｈｆｒ－ｔｓ）、ならびにオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（リツキシマブの軽鎖のＯＲＦ（ＯＲＦ１）及びリツキシマブの重鎖のＯＲＦ（ＯＲＦ２）ならびに選択マーカーＮＴＣのＯＲＦ（ＯＲＦ３））を含む。完全なコンストラクトは、プラスミドｐＬＭＴＢ５０２６上に存在するか、またはドナープラスミドであるｐＬＭＴＢ５０２４上及びｐＬＭＴＢ５０２５上に断片として分かれて存在する。ゲノムへの相同組換えのためのオーバーラップ領域（＞５００ｂｐ；図の下部）及び断片間の相同組換えのためのオーバーラップ領域（２５０ｂｐ）は灰色の棒として示される。 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅは、相同組換えによって複数のＤＮＡ断片から染色体組み込みコンストラクトをアセンブリすることができる。モノクローナル抗体（リツキシマブ）用の発現コンストラクトを形成するためにインビボで組換えを起こすことになる２つのＤＮＡ断片を同時トランスフェクションすることによって得られた株の細胞培養上清のウエスタンブロット分析である。陽性対照＝リツキシマブ（抗ＣＤ２０，Ｌｕｂｉｏ：Ａ１０４９－１００）。軽鎖または重鎖に特異的な抗体によって、細胞培養上清中において全長モノクローナル抗体の発現を直接的に検出することが可能である。
異種コード配列の複数の相同組換え事象によって、機能操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞が生じる。組み込みコンストラクトの模式図（上部）である。この組み込みコンストラクトは、ＡＱＰ遺伝子座への組み込みのための相同組換え部位（Ｌｈｒ［ＡＱＰ］及びＲｈｒ［ＡＱＰ］）、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングを正しく確実に生じさせる制御エレメント（ＰｏｌＡ；プロモーター）及び遺伝子間領域（Ｌ．ｅｎｒｉｅｔｔｉ由来のａＴｕｂＩＲ；Ｐｆｒ ＩＲ＝Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来の副鞭毛桿タンパク質のＩＲ；Ｖａｌ ＩＲ（Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来のバロシン由来のＩＲ）；Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来のＣａｍ ＩＲ、及びＵｔｒＡ＝ｄｈｆｒ－ｔｓ）、ならびに異種グリコシルトランスフェラーゼのコード配列（ｓｆＧｎｔＩ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｄｒＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１（例えば、国際公開公報第ＷＯ２０１９／００２５１２Ａ２号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）及びハイグロマイシン選択マーカーのコード配列（Ｓｍ［ｈｙｇ］）を含む。完全なコンストラクトは１０個の断片に分かれており、これらの断片は、１０個のドナープラスミドから切り出されたものである。ゲノムへの相同組換えのためのオーバーラップ領域（５００ｂｐ）は、末端に位置する黒色ボックス内に位置し、断片間の相同組換え領域（２００ｂｐ）は灰色の棒として示される。下部のグラフは、糖鎖修飾改変効率の機能的読み出し値（Ｎ－グリカンの相対％として示される）を示し、これらのＮ－グリカンは、細胞タンパク質から遊離させたものであり、所定のＮ－グリカン分析（ＲＦ－ＭＳまたはＰＣ標識化など）によって測定した。
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅの制御エレメント及び遺伝子間領域（ＩＲ）が間に存在する異種コード配列の複数の相同事象である。（Ａ）糖鎖修飾改変効率の機能的読み出し値がＮ－グリカンの相対％として示され、これらのＮ－グリカンは、細胞タンパク質から遊離させたものであり、所定のＲＦ－ＭＳによって測定した。これらの読み出し値は、Ｓｔ１５３６８ではすべての酵素ステップの活性が存在することを示す。Ｓｔ１５４４８ではＭＧＡＴ２による第２の糖鎖修飾改変酵素ステップ以降の活性が存在しないことは、所望の組み込み事象及び望ましくない組み込み事象に基づいて表現型差異が生じたことを示唆している。（Ｂ）組み込み物の模式図（上部）である。この組み込み物は、アクアポリン（ＡＱＰ）を逆転破壊するための相同組換え部位（暗灰色のボックス（Ｌｈｒ及びＲｈｒ））、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングを正しく確実に生じさせる制御エレメントＰｏｌＡ及び遺伝子間領域（縞模様のボックス）（Ｌ．ｅｎｒｉｅｔｔｉ由来のａＴｕｂＩＲ；Ｐｆｒ ＩＲ＝Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来の副鞭毛桿タンパク質のＩＲ；Ｖａｌ ＩＲ（Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来のバロシン由来のＩＲ）；Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来の６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２３）、ならびに選択マーカー遺伝子（ＳｍＡ）の下流に位置する３’ＵＴＲを含む。ｒｎＭＧＡＴ２（ＧｔＤ）、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１（ＧｔＥ）、ｓｆＧｎｔＩ（ＧｔＡ）、及びｄｒＭＧＡＴ１（ＧｔＢ）は異種グリコシルトランスフェラーゼのコード配列であり、ＳｍＡはハイグロマイシン選択マーカーのコード配列である。挿入遺伝エレメント領域は、灰色のドット付き背景の影付きで示される。正しい組み込みの例として、Ｓｔ１５３６８の例が示される（上部）。黒色背景及び白色ドットで印付けされた領域は、Ｓｔ１５４４８においてＰｆｒ ＩＲが２９番染色体中の同一Ｐｆｒ ＩＲ配列と望ましくない交叉を起こし、それによって組換え遺伝エレメント（ｒｎＭＧＡＴ２（ＧｔＤ）及びｈｓＢ４ＧａｌＴ１（ＧｔＥ））が排除され（下部）、（Ｃ）ハイブリッド染色体（ＰａｃＢｉｏシークエンシング（ＰａｃＢｉｏの生のサブリードｍ５４０７３＿１８１００１＿１３０８２９／９３０７００６／０＿３２１１０）によって同定された）が生じたことを示す。 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅの制御エレメント及び遺伝子間領域（ＩＲ）が間に存在する異種コード配列の複数の相同事象である。（Ａ）糖鎖修飾改変効率の機能的読み出し値がＮ－グリカンの相対％として示され、これらのＮ－グリカンは、細胞タンパク質から遊離させたものであり、所定のＲＦ－ＭＳによって測定した。これらの読み出し値は、Ｓｔ１５３６８ではすべての酵素ステップの活性が存在することを示す。Ｓｔ１５４４８ではＭＧＡＴ２による第２の糖鎖修飾改変酵素ステップ以降の活性が存在しないことは、所望の組み込み事象及び望ましくない組み込み事象に基づいて表現型差異が生じたことを示唆している。（Ｂ）組み込み物の模式図（上部）である。この組み込み物は、アクアポリン（ＡＱＰ）を逆転破壊するための相同組換え部位（暗灰色のボックス（Ｌｈｒ及びＲｈｒ））、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングを正しく確実に生じさせる制御エレメントＰｏｌＡ及び遺伝子間領域（縞模様のボックス）（Ｌ．ｅｎｒｉｅｔｔｉ由来のａＴｕｂＩＲ；Ｐｆｒ ＩＲ＝Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来の副鞭毛桿タンパク質のＩＲ；Ｖａｌ ＩＲ（Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来のバロシン由来のＩＲ）；Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来の６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２３）、ならびに選択マーカー遺伝子（ＳｍＡ）の下流に位置する３’ＵＴＲを含む。ｒｎＭＧＡＴ２（ＧｔＤ）、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１（ＧｔＥ）、ｓｆＧｎｔＩ（ＧｔＡ）、及びｄｒＭＧＡＴ１（ＧｔＢ）は異種グリコシルトランスフェラーゼのコード配列であり、ＳｍＡはハイグロマイシン選択マーカーのコード配列である。挿入遺伝エレメント領域は、灰色のドット付き背景の影付きで示される。正しい組み込みの例として、Ｓｔ１５３６８の例が示される（上部）。黒色背景及び白色ドットで印付けされた領域は、Ｓｔ１５４４８においてＰｆｒ ＩＲが２９番染色体中の同一Ｐｆｒ ＩＲ配列と望ましくない交叉を起こし、それによって組換え遺伝エレメント（ｒｎＭＧＡＴ２（ＧｔＤ）及びｈｓＢ４ＧａｌＴ１（ＧｔＥ））が排除され（下部）、（Ｃ）ハイブリッド染色体（ＰａｃＢｉｏシークエンシング（ＰａｃＢｉｏの生のサブリードｍ５４０７３＿１８１００１＿１３０８２９／９３０７００６／０＿３２１１０）によって同定された）が生じたことを示す。 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅの制御エレメント及び遺伝子間領域（ＩＲ）が間に存在する異種コード配列の複数の相同事象である。（Ａ）糖鎖修飾改変効率の機能的読み出し値がＮ－グリカンの相対％として示され、これらのＮ－グリカンは、細胞タンパク質から遊離させたものであり、所定のＲＦ－ＭＳによって測定した。これらの読み出し値は、Ｓｔ１５３６８ではすべての酵素ステップの活性が存在することを示す。Ｓｔ１５４４８ではＭＧＡＴ２による第２の糖鎖修飾改変酵素ステップ以降の活性が存在しないことは、所望の組み込み事象及び望ましくない組み込み事象に基づいて表現型差異が生じたことを示唆している。（Ｂ）組み込み物の模式図（上部）である。この組み込み物は、アクアポリン（ＡＱＰ）を逆転破壊するための相同組換え部位（暗灰色のボックス（Ｌｈｒ及びＲｈｒ））、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングを正しく確実に生じさせる制御エレメントＰｏｌＡ及び遺伝子間領域（縞模様のボックス）（Ｌ．ｅｎｒｉｅｔｔｉ由来のａＴｕｂＩＲ；Ｐｆｒ ＩＲ＝Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来の副鞭毛桿タンパク質のＩＲ；Ｖａｌ ＩＲ（Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来のバロシン由来のＩＲ）；Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来の６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２３）、ならびに選択マーカー遺伝子（ＳｍＡ）の下流に位置する３’ＵＴＲを含む。ｒｎＭＧＡＴ２（ＧｔＤ）、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１（ＧｔＥ）、ｓｆＧｎｔＩ（ＧｔＡ）、及びｄｒＭＧＡＴ１（ＧｔＢ）は異種グリコシルトランスフェラーゼのコード配列であり、ＳｍＡはハイグロマイシン選択マーカーのコード配列である。挿入遺伝エレメント領域は、灰色のドット付き背景の影付きで示される。正しい組み込みの例として、Ｓｔ１５３６８の例が示される（上部）。黒色背景及び白色ドットで印付けされた領域は、Ｓｔ１５４４８においてＰｆｒ ＩＲが２９番染色体中の同一Ｐｆｒ ＩＲ配列と望ましくない交叉を起こし、それによって組換え遺伝エレメント（ｒｎＭＧＡＴ２（ＧｔＤ）及びｈｓＢ４ＧａｌＴ１（ＧｔＥ））が排除され（下部）、（Ｃ）ハイブリッド染色体（ＰａｃＢｉｏシークエンシング（ＰａｃＢｉｏの生のサブリードｍ５４０７３＿１８１００１＿１３０８２９／９３０７００６／０＿３２１１０）によって同定された）が生じたことを示す。
所期の組み込み物の模式図である。この組み込み物は、２３番染色体中のＰｔｒ１を逆転破壊するための５００ｂｐの相同組換え部位（暗灰色のボックス）（Ｌｈｒ及びＲｈｒ）、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングを正しく確実に生じさせる制御エレメントＰｏｌＩ（「ＰｏｌＡ」）及び遺伝子間領域（ＩＲ（縞模様のボックス））、ならびに選択マーカー遺伝子（ＳｍＡ）の下流に位置する３’ＵＴＲを含む。ｈｓＢ４ＧａｌＴ１（ＯＲＦ１）、ｈｓＭＧＡＴ１（ＯＲＦ２）、及びｒｎＭＧＡＴ２（ＯＲＦ３）は異種グリコシルトランスフェラーゼのコード配列であり、ＳＭはハイグロマイシン選択マーカーのコード配列である。完全な発現カセットは、８つの断片に分かれており、これらの断片は、それらのドナープラスミドから切り出されたものである。ゲノムへの相同組換えのためのオーバーラップ領域（末端に位置する５００ｂｐ）及び断片間の相同組換えのためのオーバーラップ領域（２００ｂｐ）は、灰色のボックスとして示される。黒色の括弧内の白色ドットを伴う暗灰色の影付き領域は、ドナー断片ＧｔＣ＿５ＩｒＬｍＭ（８０８１）中のｈｓＭＧＡＴ１ ＯＲＦのＣ末端に位置する３×ＨＡタグ由来の９３ｂｐの同一区間と、ｒｎＭＧＡＴ２ ＯＲＦのＣ末端に同じく存在する３×ＨＡタグ由来のＩｒＬｍＯ＿５ＧｔＤ（８０８５）中の同一配列と、を示す。これらの断片が相同組換えを起こすと、ＩＲ２及びｒｎＭＧＡＴ２の遺伝情報の望ましくない削除及び欠失が生じる。表現型はＧＴの糖鎖修飾改変活性によって表され、Ｇ０グリカン及びＧ２グリカンが存在しないことはＭＧＡＴ２活性（Ｎ－グリカンの相対％のグラフ（左上部）として示される）が存在しないことを示唆する。
異なる染色体組み込み方針の模式図である。薄灰色の矢印は染色体コード配列を示し、暗灰色の矢印は異種コード配列を示し、これらの異種コード配列は、その末端に位置する相同末端を介して挿入される（灰色の影付きで示される）。制御エレメントＰｏｌＩは、ＰｏｌＩ転写のプロモーター領域であり、逆転組み込みコンストラクト中の転写開始に使用される。
非同一異種配列は、染色体組み込み及び内的な断片組換えを正しく確実に生じさせ、選択した異種制御配列はＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅカスタムグリカン宿主細胞において機能性である。総表面糖タンパク質由来のＮ－グリカンの相対％としてＧＴの糖鎖修飾改変活性が評価され、ＩＲが異なるが、ＧＴコード配列及びＳＭコード配列が同じである異なる株の間で比較されている。 非同一異種配列は、染色体組み込み及び内的な断片組換えを正しく確実に生じさせ、選択した異種制御配列はＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅカスタムグリカン宿主細胞において機能性である。異なる組み込み物及び得られた株（Ｓｔ１７２１２＝ＬｍＩＲ、Ｓｔ１７３１１＝ＬｄＩＲ、Ｓｔ１７１７６＝ＬｉＩＲ、Ｓｔ１７１８０＝ＬｍｘＩＲ）についてのＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシング分析結果の模式図である。各組み込み物は、１０番染色体のＧＰ６３遺伝子座への組み込みのための相同組換え部位（ＬｈｒＤ［ＧＰ６３］及びＲｈｒＤ［ＧＰ６３］）を含む。異なるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種（Ｌ．ｍａｊｏｒ（Ｌｍ）、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ（Ｌｄ）、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ（Ｌｉ）、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ（Ｌｍｘ））に由来し、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングを正しく確実に生じさせる遺伝子間領域（Ｉｒ）が、縞模様のボックスとして示され、各ＩＲについてのテキスト説明が併せて示される。異種グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）のコード配列（ｓｆＧｎｔＩ、ｒｎＭＧＡＴ２、ｄｒＭＧＡＴ１、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１）は白色の矢印として示され、ハイグロマイシン選択マーカーのコード配列は灰色で示され、これらのコード配列は４つすべての株で同一である。
いくつかの遺伝モジュールをトランスフェクションすることによってＮ－グリカン変換効率が段階的に上昇する。このことは、連続的に得た３つの株（Ｓｔ１７２３８（１番目）、Ｓｔ１７２９４（２番目）、及びＳｔ１７８２６（３番目））の表面糖タンパク質から得られたＮ－グリカン（相対％で示される）として示される。グリコシルトランスフェラーゼのコピー数の増加は、異なる種（ｈｓ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ｒｎ，Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ｄｒ，Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、ｇｊ，Ｇｅｋｋｏ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、ａｇ，Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）に由来するコドン多様化酵素及びホモログを使用することによって達成した。
グリコシルトランスフェラーゼを含む親細胞株（Ｓｔ１７３１１）へと１３個の断片を複数の相同組換えによって組み込むことによる、Ｎ－グリカンシアリル化能力を有する細胞株Ｓｔ１７５２７の生成。Ｓｔ１７５２７のゲノム改変の模式図である。上部は、親細胞株Ｓｔ１７３１１由来のｇｐ６３遺伝子座（１０番染色体）に存在するゲノム組み込み発現カセットを示す。新たな組み込み物は、１３番染色体のアルファチューブリン遺伝子座に対する相同組換え部位（Ｌｈｒ［ａＴｕｂ］及びＲｈｒ［ａＴｕｂ］）、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングのための遺伝子間領域（Ｉｒ）（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ由来のＩｒ（ＩｒＬｉ）及びＬ．ｍａｊｏｒ由来のＩｒ（ＩｒＬｍ））（縞模様のボックスとして示される）を含む。シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）生合成、ゴルジへの移入、及びＮ－グリカンへの転移を生じさせるためのコード配列（ＮｅｕＣ３×Ｍｙｃ：ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ、ＣｇＮａｌ：Ｎ－アセチルノイラミン酸合成を支援するＮ－アセチルノイラミン酸リアーゼ、ＮｅｕＢ３×ＨＡ：ＣＭＰ－シアル酸合成酵素、３×ＨＡＳＴ６：ベータ－ガラクトシドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ１、ＮｅｕＡ３×ＨＡ：ＣＭＰ－シアル酸合成酵素、及びＣＳＴ３×ｍｙｃＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃトランスポーターなど）は白色の矢印として示され、選択マーカーのコード配列（ｐａｃ）は灰色で示される。 グリコシルトランスフェラーゼを含む親細胞株（Ｓｔ１７３１１）へと１３個の断片を複数の相同組換えによって組み込むことによる、Ｎ－グリカンシアリル化能力を有する細胞株Ｓｔ１７５２７の生成。Ｓｔ１７５２７の細胞ペレットから抽出し、ＤＭＢ標識した総シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ＋ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）及びＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡｃをＨＰＬＣで追跡したものであり、この追跡は、Ｎｅｕ５Ａｃ及び活性化糖ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃが存在することを示しており、したがって、シアル酸前駆体生合成が機能していることを実証するものである。 グリコシルトランスフェラーゼを含む親細胞株（Ｓｔ１７３１１）へと１３個の断片を複数の相同組換えによって組み込むことによる、Ｎ－グリカンシアリル化能力を有する細胞株Ｓｔ１７５２７の生成。ＧＴの糖鎖修飾改変活性は、総表面糖タンパク質由来のＮ－グリカンの相対％として表される。総ガラクトシル化率及び総シアリル化率も示され、これらは、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ宿主細胞の機能がカスタマイズされていることを実証するものである。
発現するグリコシルトランスフェラーゼの糖鎖修飾改変活性レベルを高めるための、異なる染色体遺伝子座への同じ糖鎖修飾改変コンストラクトの染色体組み込み。２９番染色体上のＰｆｒ遺伝子座を標的とする染色体組み込み方針、ならびに２７番染色体上のｒＤＮＡ発現遺伝子座を標的とする染色体組み込み方針の模式図である。薄灰色の矢印は染色体コード配列を示し、暗灰色の矢印は異種コード配列を示し、これらの異種コード配列は、その末端に位置する相同末端を介して挿入される（灰色の影付きで示される）。示される染色体領域は複数コピー遺伝子座であるため、いくつかの異なる場所で組み込みが生じ得る。このことは、異なって影が付けられた灰色の棒によって示される。ｐｒｅ－ｍＲＮＡのプロセシングを正しく確実に生じさせる制御エレメントは、１番目の組み込み異種コード配列の５’末端と隣接するボックスとして（ｒＤＮＡ遺伝子座（Ｓｓｕ及びＳｓｕ－ＰｏｌＩ）への組み込みの場合）、及び組み込みコンストラクトの最後の異種コード配列の３’末端と隣接するボックスとして示されており、これらのボックスには異なる縞模様が付けられている。 発現するグリコシルトランスフェラーゼの糖鎖修飾改変活性レベルを高めるための、異なる染色体遺伝子座への同じ糖鎖修飾改変コンストラクトの染色体組み込み。異なる染色体組み込み遺伝子座（「Ｐｆｒ」、「Ｓｓｕ」、または「Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ」）を標的とする同じＧ０組み込みコンストラクトによってコードされるＧＴの糖鎖修飾改変活性を比較したものである。それぞれの株の総表面糖タンパク質から得られたＮ－グリカンの相対％が示される。 発現するグリコシルトランスフェラーゼの糖鎖修飾改変活性レベルを高めるための、異なる染色体遺伝子座への同じ糖鎖修飾改変コンストラクトの染色体組み込み。ｒＤＮＡ染色体組み込み遺伝子座の異なるバリアント（「Ｓｓｕ」対「Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ」）を標的とする同じＧ０組み込みコンストラクトによってコードされるＧＴの糖鎖修飾改変活性を比較したものである。同時発現するモノクローナル抗体（アダリムマブ）のＦｃのＮ－グリコシル化部位から遊離させたＮ－グリカンの相対％が示される。
異種コード配列の複数の相同組換え事象によって、機能操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞が生じる。組み込みコンストラクトの模式図（上部）であり、この組み込みコンストラクトは、「Ｐｆｒ」遺伝子座への組み込みのための相同組換え部位（ＬｈｒＰ及びＲｈｒＰ）、ｍＲＮＡの転写及びスプライシングを正しく確実に生じさせる遺伝子間領域（１５個の異なるＩＲ（Ｌ．ｍａｊｏｒ（Ｌｍ）由来のＩＲ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ（Ｌｄ）由来のＩＲ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ（Ｌｉ）由来のＩＲ、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ（Ｌｔ）由来のＩＲ）及びＵｔｒＡ＝ｄｈｆｒ－ｔｓが縞模様のボックスとして示される）、ならびに異種グリコシルトランスフェラーゼのコード配列（ＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１の異なるオルソログが白色のボックスとして示される。例えば、国際公開公報第ＷＯ２０１９／００２５１２Ａ２号を参照のこと。当該文献はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、シアル酸生合成及び移送経路の酵素のコード配列（暗灰色のボックスとして示される）、及びピューロマイシン耐性のための選択マーカーのコード配列（ＳｍＤ（薄灰色のボックスとして示される））を含む。完全なコンストラクトは２５個の断片に分かれており、これらの断片は、２５個のドナープラスミドから切り出されたものである。ゲノムへの相同組換えのためのオーバーラップ領域（５００ｂｐ）は、末端に位置する黒色ボックス内に位置し、断片間の相同組換え領域（２００ｂｐ以上）は灰色の棒として示される。下部のグラフは、糖鎖修飾改変効率の機能的読み出し値（Ｎ－グリカンの相対％として示される）を示し、これらのＮ－グリカンは、細胞タンパク質から遊離させたものであり、所定のＮ－グリカン分析（ＰＣ標識化）によって測定した。 異種コード配列の複数の相同組換え事象によって、機能操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞が生じる。いくつかの遺伝モジュールをトランスフェクションすることによってＮ－グリカン変換効率が上昇する。このことは、連続的に得た３つの株（Ｓｔ１８７００（１番目）、Ｓｔ１９０８４（２番目）、及びＳｔ１９３８４（３番目））の総表面糖タンパク質から得られたＮ－グリカン（相対％として示される）として示される。グリコシルトランスフェラーゼのコピー数の増加は、異なる種に由来するコドン多様化酵素及びホモログを使用することによって達成した。 異種コード配列の複数の相同組換え事象によって、機能操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞が生じる。Ｎ－グリカンをＧ２Ｓ２へとほぼ均一に変換することが可能な、異なる遺伝組成を有する代替株である。この図は、３つの代替株（Ｓｔ２０１５７、Ｓｔ２０２０８、及びＳｔ２０２２４）の総表面糖タンパク質から得られたＮ－グリカン（相対％として示される）を示す。
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅにおける、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコスミドでのハイブリッド原核生物遺伝子クラスターのアセンブリ。設計断片、及び灰色の影付きまたは灰色の縞模様を有する２００ｂｐの相同領域を介して生じると予測される組換えを示す模式図である。 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅにおける、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコスミドでのハイブリッド原核生物遺伝子クラスターのアセンブリ。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖を発現させるためのいくつかの多クローンから単離したプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに対するウエスタンブロット分析である。レーン１：ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）染色済プロテインラダー（１０～１８０ｋＤａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、レーン２：多クローン１．２、レーン３：多クローン１．３、レーン４：多クローン１．４、レーン５：多クローン１．５、レーン６：多クローン１．６、レーン７：多クローン１．７、レーン８：多クローン１．８、レーン９：多クローン２．３。 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅにおける、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコスミドでのハイブリッド原核生物遺伝子クラスターのアセンブリ。異なる多クローンから単離したプラスミドの制限酵素消化。Ａ：トランスフェクション＃１及び＃２から得られた多クローンに対する制限酵素消化。上パネル：ＢｓｔＢＩ制限酵素消化（正しいコンストラクトの予想サイズ：２２２１０ｂｐ、９０４２ｂｐ、３７８７ｂｐ；空ベクターの予想サイズ：２０８０１ｂｐ）、下パネル：ＢｓｉＷＩ制限酵素消化（正しいコンストラクトの予想サイズ：３２５３６ｂｐ、２５０３ｂｐ；空ベクターの予想サイズ：消化なしの場合２０８０１ｂｐ）。レーン１：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（商標）１ｋｂ ＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、レーン２：多クローン１．１、レーン３：多クローン１．７、レーン４：多クローン２．１、レーン５：多クローン２．２、レーン６：ｐＧＶＸＮ７７５。 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅにおける、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコスミドでのハイブリッド原核生物遺伝子クラスターのアセンブリ。トランスフェクション＃３から得られた多クローンに対する制限酵素消化。ＳａｃＩ制限酵素消化（正しいコンストラクトの予想サイズ：１９６２８ｂｐ、３７２３ｂｐ；空ベクターの予想サイズ：２０８０１ｂｐ）。レーン１：多クローン３．１、レーン２：多クローン３．２、レーン３：ｐＬＭＴＢ６４１２、レーン４：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（商標）１ｋｂ ＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
５．本発明の詳細な説明
本明細書では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法、本明細書で提供される方法を使用して操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞、本明細書で提供されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を使用する標的ポリペプチドの調製方法、及び方法によって産生される標的ポリペプチドが提供される。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法については、セクション５．１に記載される。得られるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の特性については、セクション５．２に記載される。そのようなＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を標的ポリペプチド（例えば、治療用タンパク質）の発現系として使用することについては、セクション５．３に記載される。本明細書で提供されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞において発現する標的ポリペプチドの特性については、セクション５．４に記載される。
本明細書では、ｉ）Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ宿主細胞において少なくとも約２０ｋｂの大きな人工染色体挿入物を創出するための迅速な複数断片相同組換え、ｉｉ）組換えで挿入される遺伝エレメントの望ましくない削除を避けるための特定方針、及びｉｉｉ）任意の異種シャトルベクターの使用に適用可能な環状ＤＮＡをアセンブリするための複数の相同組換えの使用、が提供される。さらに、本明細書では、複数の発現遺伝子コピーを同じ宿主細胞に挿入することによるポリペプチドの発現増加方法も提供される。
挿入ＤＮＡ配列が相同的／同一である場合、宿主細胞操作に複数の相同組換え事象を使用すると問題が生じる。１００ｂｐ未満という短い区間でさえ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅでの天然の組換え効率が非常に高いことに起因して、望ましくない交叉が生じ得る。
理論によって拘束されることはないが、本明細書で提供される方法は、そのような望ましくない交叉を低減または排除するものである。具体的には、本明細書では、ｉ）互いに十分に異なり、かついずれの染色体配列とも異なることで、望ましくない交叉を回避しつつ、ポリシストロン性ｐｒｅ－ｍＲＮＡのプロセシング及びスプライシングを機能させて、タンパク質発現のためのプロセシング済成熟ｍＲＮＡを形成させることが可能な複数の制御ＤＮＡ配列（そのような配列は、関連種から取得したものであり、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅから取得したものではない）、ならびにｉｉ）複数のコピーとして挿入することが意図される遺伝子のコード配列を、それら自体が組換えを起こさず、依然として効率的に発現するような様式で多様化させる方針、について記載される。
操作された宿主細胞を創出するための本明細書に記載の複数断片ライゲーション方針は、伝統的な手法と比較して著しく迅速であり、さらに、伴う選択マーカーが１つのみで複数ＯＲＦを同時に組み込むことを可能にするものであり、それ故に、これまでは能力が限られていた遺伝子工学の可能性を広げるものである。さらに、異なる挿入エレメント（遺伝子間制御配列またはコドン多様化目的遺伝子）を選択することで、糖鎖修飾改変治療薬を発現させると共に、遺伝子コピー数を増加させることによって収量を増やすことが可能になる。本出願は、完全に機能カスタマイズされた宿主細胞について説明するものであり、こうした宿主細胞は、記載の遺伝学的方法によって創出したものである。
さらに、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅの自然相同組換え系は非常に効率的なものであることから、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ染色体と相同的な部位が存在しない場合、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅを使用することで、複数の異種ＤＮＡ断片をアセンブリして環状ＤＮＡにすることができる。Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅは、複製起点が存在しないエピソーム（プラスミド）ＤＮＡを増やすことができる。こうした方法は、ドナープラスミド及び一連のＤＮＡ断片（それらの末端同士で相同性を共有し、それらの末端とレシピエントベクターとの間で相同性を共有する）を同時にトランスフェクションすることからなるものである。Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ向けの選択マーカーが付加され、この選択マーカーもまた、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ宿主細胞の陽性トランスフェクタントを選択するために２つの断片へと分割される。ＰＣＲ陽性Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ細胞から核酸を抽出することができ、抽出した物質は、レシピエントベクター中に存在する所望の選択マーカーでの増殖を行う標的微生物へと形質転換／トランスフェクションされる。この技術では、任意の非改変レシピエント環状ＤＮＡを使用することができ、制限酵素認識部位が利用可能である必要はない。
まとめると、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａでは複数の相同組換え事象が効率的に生じることから、制御エレメントと隣接するコード配列を含む部位特異的に組み込まれた遺伝情報を有する宿主細胞を創出するために、複数の相同組換え事象を利用して２～２０個、可能性としては２０個をさらに超えるＤＮＡ断片（それらの末端同士で相同性を共有する）が導入される。制御エレメントは、関連種から同定したものであり、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅに導入されても依然として機能性である。最終的な遺伝情報は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞の染色体に部位特異的に挿入された２０ｋｂ／の区間を含み、挿入サイズをさらに大きくすることも可能である。この応用は、「プラグ・アンド・プレイ」モジュールを使用して、機能操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞を効率的に創出する新規のツールについて説明するものである。さらに、この効率的な部位特異的相同組換え事象を利用することで、複数のＤＮＡ断片がアセンブリされてエピソームコンストラクトとなり、このエピソームコンストラクトは、異なる非関連宿主生物向けのシャトルベクターとして適することから、複雑なシャトルベクターに有効なクローニングツールとなり得る。
５．１ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法
一態様では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法が本明細書で提供され、この方法は、（ａ）２つ以上のＤＮＡ断片をＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞に導入すること、及び（ｂ）ＤＮＡ断片の相同組換えが可能になるようにＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞をインキュベートすること、を含み、２つ以上のＤＮＡ断片の第１のＤＮＡ断片は、５’相同領域及び／または３’相同領域を含み、５’相同領域は、２つ以上のＤＮＡ断片の第２のＤＮＡ断片の３’相同領域と相同的であり、または第１のＤＮＡ断片の３’相同領域は、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域と相同的であり、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列は、互いに相同的ではなく、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではなく、及び／またはそれぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない。
５．１．１ ＤＮＡ断片
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ断片の５’相同領域または３’相同領域と相同的な５’相同領域または３’相同領域を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ断片の３’相同領域と相同的な５’相同領域を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ断片の５’相同領域と相同的な３’相同領域を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ断片の３’相同領域と相同的な５’相同領域と、第３のＤＮＡ断片の５’相同領域と相同的な３’相同領域と、を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、互いに相同的ではない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、それぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片の第１のＤＮＡ断片は、５’相同領域及び／または３’相同領域を含む。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域は、２つ以上のＤＮＡ断片の第２のＤＮＡ断片の３’相同領域と相同的である。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の３’相同領域は、２つ以上のＤＮＡ断片の第２のＤＮＡ断片の５’相同領域と相同的である。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列は、互いに相同的ではなく、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではなく、及び／またはそれぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のそれぞれが、５’相同領域及び／または３’相同領域を含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のそれぞれの５’相同領域は、２つ以上のＤＮＡ断片の別の１つの３’相同領域と相同的である。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のそれぞれの３’相同領域は、２つ以上のＤＮＡ断片の別の１つの５’相同領域と相同的である。ある特定の実施形態では、それぞれのＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、互いに相同的ではなく、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではなく、及び／またはそれぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ断片は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体中の領域と相同的な５’相同領域または３’相同領域を含む。ある特定の実施形態では、そのような相同領域は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体へのＤＮＡ断片の組み込みを可能にする。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ断片の３’相同領域と相同的な５’相同領域と、相同領域の外側に位置する領域と、別のＤＮＡ断片の５’相同領域と相同的な３’相同領域と、を含む。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、任意選択で２つ以上のＤＮＡ断片が互いに組換えを起こした後に、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体への組み込みに適する。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、任意選択で２つ以上のＤＮＡ断片が互いに組換えを起こした後に、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれる。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、副鞭毛桿タンパク質（Ｐｆｒ）遺伝子座に直列に組み込まれる。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、１８Ｓコード領域の開始部位（Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ）に組み込まれる。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、互いに組換えを起こす前及び／または起こした後に、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれない。
５．１．２ 相同領域
ある特定の実施形態では、５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、１０～２０００ヌクレオチドであり得る。ある特定の実施形態では、５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドであり得る。ある特定の実施形態では、５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドであり得る。ある特定の実施形態では、５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチド超であり得る。ある特定の実施形態では、５’相同領域及び／または３’相同領域は、実施例セクションに記載の長さのいずれかを有するものであり得る。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、１０ヌクレオチド～５０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド～１５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド～２００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド～２５０ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド～３００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド～３５０ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド～４００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド～４５０ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド～５５０ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド～６００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド～６５０ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド～７００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド～７５０ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド～８００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド～８５０ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド～９００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド～９５０ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～１２００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド～１４００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド～１６００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド～１８００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド～２０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド～２２００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド～２４００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド～２６００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド～２８００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド～３０００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド～３２００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド～３４００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド～３６００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド～３８００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド～４０００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド～４２００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド～４４００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド～４６００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド～４８００ヌクレオチド、または４８００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、１０ヌクレオチド～５０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド～１５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド～２００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド～２５０ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド～３００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド～３５０ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド～４００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド～４５０ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド～５５０ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド～６００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド～６５０ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド～７００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド～７５０ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド～８００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド～８５０ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド～９００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド～９５０ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～１２００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド～１４００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド～１６００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド～１８００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド～２０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド～２２００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド～２４００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド～２６００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド～２８００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド～３０００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド～３２００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド～３４００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド～３６００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド～３８００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド～４０００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド～４２００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド～４４００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド～４６００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド～４８００ヌクレオチド、または４８００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての５’相同領域及び／または３’相同領域の長さは、１０ヌクレオチド～５０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド～１５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド～２００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド～２５０ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド～３００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド～３５０ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド～４００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド～４５０ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド～５５０ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド～６００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド～６５０ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド～７００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド～７５０ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド～８００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド～８５０ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド～９００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド～９５０ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～１２００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド～１４００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド～１６００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド～１８００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド～２０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド～２２００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド～２４００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド～２６００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド～２８００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド～３０００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド～３２００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド～３４００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド～３６００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド～３８００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド～４０００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド～４２００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド～４４００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド～４６００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド～４８００ヌクレオチド、または４８００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、互いに相同的な２つの相同領域は、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、互いに相同的な２つの相同領域は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、２つの相同領域は、それらの相同領域を含む対応ＤＮＡ断片の相同組換えを可能にする上で十分なレベルの相同性を有する。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域と第２のＤＮＡ断片の３’相同領域とは、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の３’相同領域と、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域とは、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の５’相同領域と第２のＤＮＡ断片の３’相同領域とは、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片の３’相同領域と、第２のＤＮＡ断片の５’相同領域とは、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する。
５．１．３ ＤＮＡ断片の相同領域の外側
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２５００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３５００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４５００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、６０００ヌクレオチド、７０００ヌクレオチド、８０００ヌクレオチド、９０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１１０００ヌクレオチド、１２０００ヌクレオチド、１３０００ヌクレオチド、１４０００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、１６０００ヌクレオチド、１７０００ヌクレオチド、１８０００ヌクレオチド、１９０００ヌクレオチド、２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１０～５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、５０～１００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１００～５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１５０～２５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、２５０～２０００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１０～５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、５０～１００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１００～５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１５０～２５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、２５０～２０００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１０～５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、５０～１００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１００～５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１５０～２５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、２５０～２０００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１０～５００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、５０～１００００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１００～５０００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、１５０～２５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片のすべての中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列の長さは、２５０～２０００ヌクレオチドである。
本明細書で使用されるように、２つのヌクレオチド配列が互いに「相同性を有さない」または互いに「相同的ではない」場合、別段の指定がない限り、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６２５ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約６７５ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７２５ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約７７５ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約８２５ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、約８７５ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約９２５ヌクレオチド、約９５０ヌクレオチド、約９７５ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１０２５ヌクレオチド、約１０５０ヌクレオチド、約１０７５ヌクレオチド、または約２０００ヌクレオチドの領域にわたって２つのヌクレオチド配列が有する配列同一性は、多くとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％である。ある特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列は、９０％以上の配列同一性を有する領域を有し得、そのような領域の長さは、長くても約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチドの領域にわたって２つのヌクレオチド配列が有する配列同一性は、多くとも７０％または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列中の相同性のレベルは、それら２つのヌクレオチド配列の相同組換えを可能にする上では不十分なものである。ある特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列中の相同性のレベルは、それら２つのヌクレオチド配列の間で生じる望ましくない組換え事象の数を、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間のインキュベート期間でヌクレオチド配列の１０，０００コピー当たり多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にすることを可能にし得る。
（ｉ）第１のＤＮＡ断片と第２のＤＮＡ断片とは、５’相同領域及び／または３’相同領域（複数可）の外側では互いに相同的ではない。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列及び第２のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、相同領域（複数可）の外側では互いに相同的ではない。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列が約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６２５ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約６７５ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７２５ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約７７５ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約８２５ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、約８７５ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約９２５ヌクレオチド、約９５０ヌクレオチド、約９７５ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１０２５ヌクレオチド、約１０５０ヌクレオチド、約１０７５ヌクレオチド、または約２０００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列は、９０％以上の配列同一性を有する領域を有し得、そのような領域の長さは、長くても約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列が約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも７０％または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列中の相同性のレベルは、相同領域の外側に位置する領域でのそれらのＤＮＡ断片の相同組換えを可能にする上では不十分なものである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列中の相同性のレベルは、相同領域の外側に位置する領域において第１のＤＮＡ断片と第２のＤＮＡ断片との間で生じる望ましくない組換え事象の数を、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間のインキュベート期間で第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片のそれぞれの１０，０００コピー当たり多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にすることを可能にし得る。
（ｉｉ）すべてのＤＮＡ断片は、５’相同領域及び／または３’相同領域（複数可）の外側では互いに相同的ではない
ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、相同領域（複数可）の外側では互いに相同的ではない。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列が約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６２５ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約６７５ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７２５ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約７７５ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約８２５ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、約８７５ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約９２５ヌクレオチド、約９５０ヌクレオチド、約９７５ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１０２５ヌクレオチド、約１０５０ヌクレオチド、約１０７５ヌクレオチド、または約２０００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列は、９０％以上の配列同一性を有する領域を有し得、そのような領域の長さは、長くても約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列が約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも７０％または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列中の相同性のレベルは、相同領域の外側に位置する領域でのそれらのＤＮＡ断片の相同組換えを可能にする上では不十分なものである。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列中の相同性のレベルは、相同領域の外側に位置する領域でのそれらのＤＮＡ断片の望ましくない組換え事象の数を、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間のインキュベート期間でそれらのＤＮＡ断片のそれぞれの１０，０００コピー当たり多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にすることを可能にし得る。
（ｉｉｉ）第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片は、５’相同領域及び／または３’相同領域（複数可）の外側では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではない。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列とは相同的ではない。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとが約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６２５ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約６７５ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７２５ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約７７５ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約８２５ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、約８７５ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約９２５ヌクレオチド、約９５０ヌクレオチド、約９７５ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１０２５ヌクレオチド、約１０５０ヌクレオチド、約１０７５ヌクレオチド、または約２０００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列及びＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムは、９０％以上の配列同一性を有する領域を有し得、そのような領域の長さは、長くても約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとが約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも７０％または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片の相同領域の外側とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとの相同性のレベルは、相同領域の外側に位置する領域でのそれらのＤＮＡ断片とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする上では不十分なものである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片の相同領域の外側とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとの相同性のレベルは、相同領域の外側に位置する領域でのそれらのＤＮＡ断片とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとの望ましくない組換え事象の数を、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間のインキュベート期間で第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片のそれぞれの１０，０００コピー当たり多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にすることを可能にし得る。
（ｉｖ）すべてのＤＮＡ断片は、５’相同領域及び／または３’相同領域（複数可）の外側では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではない。
ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではない。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとが約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６２５ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約６７５ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７２５ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約７７５ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約８２５ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、約８７５ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約９２５ヌクレオチド、約９５０ヌクレオチド、約９７５ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１０２５ヌクレオチド、約１０５０ヌクレオチド、約１０７５ヌクレオチド、または約２０００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとは、９０％以上の配列同一性を有する領域を有し得、そのような領域の長さは、長くても約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとが約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも７０％または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとの相同性のレベルは、相同領域の外側に位置する領域でのそれらのＤＮＡ断片とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする上では不十分なものである。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとの相同性のレベルは、相同領域の外側に位置する領域でのそれらのＤＮＡ断片とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノムとの望ましくない組換え事象の数を、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間のインキュベート期間でＤＮＡ断片のそれぞれの１０，０００コピー当たり多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にすることを可能にし得る。
（ｖ）第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片は、それぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列及び第２のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、それぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列及び第２のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列がそれぞれのＤＮＡ断片内に含むヌクレオチド配列が約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６２５ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約６７５ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７２５ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約７７５ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約８２５ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、約８７５ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約９２５ヌクレオチド、約９５０ヌクレオチド、約９７５ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１０２５ヌクレオチド、約１０５０ヌクレオチド、約１０７５ヌクレオチド、または約２０００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列及び第２のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列をそれぞれのＤＮＡ断片内に含み得、そのような領域の長さは、長くても約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列及び第２のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列がそれぞれのＤＮＡ断片内に含むヌクレオチド配列が約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも７０％または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列及び第２のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列におけるそれぞれのＤＮＡ断片内での相同性のレベルは、自体の内部でのそれらのＤＮＡ断片の相同組換えを可能にする上では不十分なものである。ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列及び第２のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列におけるそれぞれのＤＮＡ断片内での相同性のレベルは、そのＤＮＡ断片自体の内部で生じる望ましくない組換え事象の数を、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間のインキュベート期間でそのＤＮＡ断片の１０，０００コピー当たり多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にすることを可能にし得る。
（ｖｉ）すべてのＤＮＡ断片は、それぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない
ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、それぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列がそれぞれのＤＮＡ断片内に含むヌクレオチド配列が約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６２５ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約６７５ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７２５ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約７７５ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約８２５ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、約８７５ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約９２５ヌクレオチド、約９５０ヌクレオチド、約９７５ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１０２５ヌクレオチド、約１０５０ヌクレオチド、約１０７５ヌクレオチド、または約２０００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列をそれぞれのＤＮＡ断片内に含み得、そのような領域の長さは、長くても約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列がそれぞれのＤＮＡ断片内に含むヌクレオチド配列が約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１２５ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチドの領域にわたって有する配列同一性は、多くとも７０％または８０％であり得る。ある特定の実施形態では、すべての断片のヌクレオチド配列におけるそれぞれのＤＮＡ断片内での相同性のレベルは、自体の内部でのそれらのＤＮＡ断片の相同組換えを可能にする上では不十分なものである。ある特定の実施形態では、すべてのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列におけるそれぞれのＤＮＡ断片内での相同性のレベルは、そのＤＮＡ断片自体の内部で生じる望ましくない組換え事象の数を、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間のインキュベート期間でそのＤＮＡ断片の１０，０００コピー当たり多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にすることを可能にし得る。
ある特定の実施形態では、第１のＤＮＡ断片中及び第２のＤＮＡ断片中で相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列は、反復配列を有さない。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片の数は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５である。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である。
５．１．４ ＤＮＡ断片の翻訳産物
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、遺伝子間領域（ＩＲ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）、及びポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、実施例セクションに記載の遺伝子間領域（ＩＲ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）、及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＩＲ、ＵＴＲ、及びＯＲＦは、それ自体の内部には相同的な配列を有さず、及び／または互いに相同的な配列を有さない。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、セクション５．４に記載の標的ポリペプチドをコードするＯＲＦである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、標的ポリペプチドの産生と関連する酵素をコードするＯＲＦである。酵素の例は、限定されないが、国際公開公報第ＷＯ２０１９／００２５１２Ａ２号（当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）及び本明細書と出願日が同じ「Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ Ｃｅｌｌｓ」と題する国際出願において見つけることができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、異種グリコシルトランスフェラーゼをコードするＯＲＦである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ産物（例えばリボザイム、制御ＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、及びｃｒｉｓｐｒＲＮＡ）へと転写され得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、代謝反応及びＤＮＡ複製の触媒、刺激に対する応答、ある場所から別の場所への分子の輸送、細胞及び生物への構造付与、凝集及び他の細胞への接着、分子の局在化、炭素、糖質、窒素、リン、及び硫黄の利用、バイオミネラリゼーション、細胞の増殖、発生、及び有糸分裂、移動、生物学的制御、タンパク質フォールディング、及び／または毒素、と関連する機能を有するポリペプチドをコードするＯＲＦであり得る。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片中で相同領域の外側に位置するヌクレオチド配列は、同じポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、同じポリペプチドの複数のコピーを発現する能力を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ポリペプチドの発現レベルを上昇させる。ある特定の実施形態では、同じポリペプチドをコードする複数のＤＮＡ断片を使用することで、ポリペプチドをコードする１つのＤＮＡ断片を使用する手法で得られる発現レベルと比較してポリペプチドの発現レベルが上昇し得る。
（ｉ）ＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことで生じるヌクレオチド配列
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことでヌクレオチド配列が生じ、このヌクレオチド配列の長さは、５０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド～１００００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド～１５０００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド～２００００ヌクレオチド、２００００ヌクレオチド～２５０００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド～３００００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド～３５０００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド～４００００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド～４５０００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド～５００００ヌクレオチド、５００００ヌクレオチド～５５０００ヌクレオチド、５５０００ヌクレオチド～６００００ヌクレオチド、６００００ヌクレオチド～６５０００ヌクレオチド、６５０００ヌクレオチド～７００００ヌクレオチド、７００００ヌクレオチド～７５０００ヌクレオチド、または７５０００ヌクレオチド～８００００ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことで、２つ以上のＤＮＡ断片によってコードされる遺伝情報の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含むヌクレオチド配列が生じる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことで生じるヌクレオチド配列は、２つ以上のＤＮＡ断片中にコードされる遺伝情報をすべて含む。
５．１．５ 望ましくない削除及び／または交叉
一般に、本明細書で提供される方法は、望ましくない遺伝的組換え事象を回避することが可能なものである。ある特定の実施形態では、望ましくない遺伝的組換え事象には、交叉及び削除が含まれる。ある特定の実施形態では、望ましくない遺伝的組換え事象は、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（Ｚｈａｎｇ（２０１９）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ Ｐｌａｙｓ ａ Ｍａｊｏｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ Ｂｒｅａｋ Ｒｅｐａｉｒ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＳｐｈｅｒｅ．００４０８－１９．）であり得る。ある特定の実施形態では、望ましくない削除及び／または交叉は、ＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことで生じるヌクレオチド配列からの、それらのＤＮＡ断片の遺伝情報の欠失を引き起こし得る。ある特定の実施形態では、望ましくない削除及び／または交叉は、内在性の染色体ＤＮＡの遺伝情報の欠失を引き起こし得る。
ある特定の実施形態では、望ましくない削除及び／または交叉は、当該技術分野で知られる遺伝子シークエンシング技術を使用して検出することができる。ある特定の実施形態では、望ましくない削除及び／または交叉は、得られる遺伝的に操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の表現型試験によって検出することができ、例えば、本明細書に記載の方法において使用される１つ以上のＤＮＡ断片によってコードされる酵素の活性を試験することによって検出される。ある特定の実施形態では、望ましくない削除及び／または交叉は、本出願のアッセイ及び実施例セクションに記載の方法を使用して検出することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生じる望ましくない削除及び／または交叉のレベルは低い。ある特定の実施形態では、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、多くとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％である。ある特定の実施形態では、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％である。
ある特定の実施形態では、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、多くとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％である。ある特定の実施形態では、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％である。
ある特定の実施形態では、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の細胞分裂で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、多くとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％である。ある特定の実施形態では、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の細胞分裂で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％である。
ある特定の実施形態では、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の細胞分裂で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、多くとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％である。ある特定の実施形態では、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の細胞分裂で、望ましくない削除及び／または交叉が生じるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％である。
５．１．６ 染色体組み込み
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体への組み込みに適する。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片の１つは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体中の領域と相同的な５’相同領域と、別のＤＮＡ断片の５’相同領域と相同的な３’相同領域と、を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片の１つは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体中の別の領域と相同的な３’相同領域と、別のＤＮＡ断片の３’相同領域と相同的な５’相同領域と、を含む。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体中の領域と相同的な相同領域は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体へのＤＮＡ断片の組み込みを可能にする。本明細書に記載の染色体組み込みの例は、限定されないが、実施例セクションに見つけることができ、少なくとも図１Ａ、図３Ｂ、図４、図６Ｂ、及び図８Ａに示され得る。
５．１．７ 染色体外プラスミド
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれない。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことで環状プラスミドが生じる。ある特定の実施形態では、環状プラスミドは、ｃｏｓ部位を含む。ある特定の実施形態では、環状プラスミドは、コスミドである。ある特定の実施形態では、プラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコスミドである。本明細書に記載の染色体外プラスミドの例としては、限定されないが、実施例６に記載され、少なくとも図１１Ａに示されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコスミドが挙げられる。
５．１．８ 宿主細胞へのＤＮＡ断片の導入
宿主細胞（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞）へのＤＮＡ断片（例えば、その遺伝子断片）の導入には、当該技術で知られる任意の方法を使用することができる。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は、トランスフェクション、感染、もしくは電気穿孔、熱ショックによる化学的形質転換、自然形質転換、ファージ形質導入、または接合を使用して、本明細書に記載の宿主細胞に導入される。別の実施形態では、ＤＮＡ断片は、導入されて、相同組換えによって宿主細胞ゲノムに部位特異的に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は、プラスミドを使用して、本明細書に記載の宿主細胞に導入される。例えば、ＤＮＡ断片は、プラスミド（例えば、発現ベクター）によって宿主細胞で発現し、この改変宿主細胞へのこのプラスミドの導入は、トランスフェクション、感染、もしくは電気穿孔、熱ショックによる化学的形質転換、自然形質転換、ファージ形質導入、または接合によって行われる。特定の実施形態では、上記改変宿主細胞への上記プラスミドの導入は、安定トランスフェクションによって行われる。
ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、トランスフェクションによって導入される。ある特定の実施形態では、２つ以上のＤＮＡ断片は、同時に導入される。
５．１．９ 細胞培養方法
本明細書では、宿主細胞（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ宿主細胞）の培養方法が提供される。一実施形態では、宿主細胞は、当該技術分野で知られる標準的な培養手法のいずれかを使用して培養される。例えば、細胞は、ブレインハートインフュージョン、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅソイブロス、または酵母エキス（これらはすべて、５μｇ／ｍｌのヘミンを含む）のような富栄養培地中で所定通り培養される。さらに、インキュベートは、２６℃、暗所で静置培養または振とう培養として２～３日間実施される。いくつかの実施形態では、組換え細胞株の培養物は、適切な選択薬剤を含む。表１には選択薬剤の例が示されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、培養物は、増殖を支援するために最終濃度１０μＭのビオプテリンを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、アッセイ及び実施例セクションに記載の方法を使用して培養され得る。
５．２ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞
本明細書では、遺伝的に操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞も提供される。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、本明細書のセクション５．１に記載の方法を使用して遺伝的に操作される。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、本明細書に記載の方法を反復使用して組換え操作される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、セクション５．１．１に記載のＤＮＡ断片を発現させるために使用され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、セクション５．３に記載の発現系として使用され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、セクション５．４に記載のポリペプチドの調製に使用され得る。
５．２．１ 遺伝的に操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞
ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、ＤＮＡ断片のＯＲＦの発現に使用し得るように遺伝的に操作される。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれない。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は、相同組換えを起こすことで環状化して染色体外プラスミドとなる。ある特定の実施形態では、プラスミドは、コスミドである。ある特定の実施形態では、プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉコスミドである。
５．２．２ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ及びＫｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａ株
ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ種複合体の一部である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｒｉｓｔｉｄｅｓｉ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｅａｎｅｉ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ種複合体の一部である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｃｈａｇａｓｉ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｈｅｒｔｉｇｉ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ種の一部である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｒｔｉｎｉｑｕｅｎｓｉｓ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ種の一部である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｐｉｆａｎｏｉ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ種の一部である。ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ細胞である。
ある特定の実施形態では、他の宿主細胞は、本明細書に記載の方法を使用して遺伝的に操作され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｓのｂｏｄｏｎｉｄａｅ科に属する。特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｂｏｄｏ ｓａｌｔａｎｓ細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｓのｉｃｈｔｈｙｏｂｏｄｏｎｉｄａｅ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｓのｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｂｌａｓｔｏｃｒｉｔｈｉｄｉａ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｂｌｅｃｈｏｍｏｎａｓ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｈｅｒｐｅｔｏｍｏｎａｓ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｊａｅｎｉｍｏｎａｓ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｌａｆｏｎｔｅｌｌａ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｌｅｉｓｈｍａｎｉｉｎａｅ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｎｏｖｙｍｏｎａｓ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｐａｒａｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｐｈｙｔｏｍｏｎａｓ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｓｅｒｇｅｉａ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｓｔｒｉｇｏｍｏｎａｄｉｎａｅ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｗａｌｌａｃｅｍｏｎａｓ科に属する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅのｂｌａｓｔｏｃｒｉｔｈｉｄｉａ科に属する。
５．３ 発現系としてのＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の使用
ある特定の実施形態では、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞（セクション５．２に記載のもの）は、ポリペプチドを調製するための発現系として使用され得る。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、異種の非Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａタンパク質（治療用タンパク質（例えば、抗体）など）であり得る。
５．３．１ 宿主細胞を含む組成物
一態様では、本明細書に記載の宿主細胞を含む組成物が本明細書で提供され、こうした組成物は、例えば、セクション５．２に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を含む組成物である。そのような組成物は、セクション５．４に記載の標的ポリペプチドを生成するための方法において使用され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞を含む組成物は、ポリペプチドの産生に適した条件の下で培養され得る。その後、こうしたポリペプチドは、当該技術分野で知られる方法を使用して上記の宿主細胞含有組成物から単離され得る。
本明細書で提供される宿主細胞を含む組成物は、本明細書に記載の宿主細胞の維持及び生存に適した追加成分を含み得ると共に、宿主細胞によるポリペプチドの産生に必要または有利な追加成分をさらに含み得る。こうした追加成分は、例えば、誘導性プロモーター用の誘導物質（アラビノース、ＩＰＴＧ、テトラサイクリン、及びドキシサイクリンなど）である。
ある特定の実施形態では、１つ以上の容器及び使用説明を含むキットが本明細書で提供され、当該１つ以上の容器は、本明細書に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を含む。
５．３．２ 標的ポリペプチドの産生方法
一態様では、セクション５．４に記載の標的ポリペプチドの調製方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞を使用してセクション５．４に記載の標的ポリペプチドをインビボで産生させる方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、標的ポリペプチドの産生方法が本明細書で提供され、当該方法は、（ｉ）本明細書で提供される宿主細胞を、ポリペプチド産生に適した条件の下で培養すること、及び（ｉｉ）当該標的ポリペプチドを単離すること、を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）標的ポリペプチドをコードする組換え核酸、及び（ｂ）１つ以上の異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸、を含む。ある特定の実施形態では、異種グリコシルトランスフェラーゼは、Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、または異種ガラクトシルトランスフェラーゼ、または異種シアリルトランスフェラーゼである。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞である。
一態様では、セクション５．４に記載のポリペプチドの調製方法が本明細書で提供され、この方法は、（ａ）本明細書のセクション５．２に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を、ポリペプチド産生に適した条件の下で培養すること、及び（ｂ）ポリペプチドを単離すること、を含む。ある特定の実施形態では、方法は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入することをさらに含む。
ある特定の実施形態では、提供される宿主細胞によって産生される標的ポリペプチドは、治療用ポリペプチドであり、すなわち、疾患または障害の治療に使用されるポリペプチドである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞によって産生される標的ポリペプチドは、酵素、サイトカイン、または抗体であり得る。セクション５．４には標的ポリペプチドの一覧が例として示されるが、これらに限定されない。
５．４ 標的ポリペプチド
一態様では、セクション５．３に記載の方法によって産生されるポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、提供されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞によって産生される標的ポリペプチドは、治療用ポリペプチドであり、すなわち、疾患または障害の治療に使用されるポリペプチドである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞によって産生される標的ポリペプチドは、酵素、サイトカイン、または抗体であり得る。ある特定の実施形態では、標的ポリペプチドは、アダリムマブ、リツキシマブ、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される。
当該技術分野で知られる任意のポリペプチド（またはそうしたポリペプチドに相当するペプチド／ポリペプチド）が、本明細書に記載の方法に従って標的ポリペプチドとして使用され得る。既知のポリペプチドの核酸配列ならびに新たに同定されるポリペプチドの核酸配列を、当該技術分野で知られる方法を使用して容易に推定できることを当業者なら理解するであろう。したがって、任意の目的ポリペプチドをコードする核酸を（例えば、発現ベクター（例えば、プラスミド）を介して、例えば、相同組換えによる部位特異的組み込みによって）本明細書で提供される宿主細胞に導入することは十分に当業者の能力範疇であると想定される。
ある特定の実施形態では、標的ポリペプチドは、グリコシル化（例えば、シアリル化）される。本明細書に記載の方法を使用することで標的ポリペプチドをグリコシル化することができ（このグリコシル化は、例えば、本明細書で提供される宿主細胞を使用してインビボで行われるか、またはインビトロで行われる）、こうしたグリコシル化標的ポリペプチドは、（例えば、薬物動態の改善に起因して）治療効果を有することから、こうしたグリコシル化（例えば、ポリシアリル化）標的ポリペプチドでの治療から恩恵を受けることになる疾患／障害を有する対象の治療に使用できることを当業者ならさらに認識するであろう。
ある特定の実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトインターフェロン－α（ＩＮＦ－α）、インターフェロン－β（ＩＮＦ－β）、インターフェロン－γ（ＩＮＦ－γ）、インターロイキン－２（ＩＬ２）、キメラジフテリア毒素－ＩＬ－２（デニロイキンジフチトクス）、インターロイキン－１（ＩＬ１）、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ１１、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ１受容体アンタゴニスト（アナキンラ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インスリン、プラムリンチド、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１）、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド－１アゴニスト（ＧＬＰ－１）、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヒト骨形態形成ポリペプチド２（ｈＢＭＰ２）、ヒト骨形態形成タンパク質７（ｈＢＭＰ７）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、線維芽細胞増殖因子２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ニューロトロフィン－３、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ルトロピン－α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（例えば、ＦＣ融合体）、またはＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン（例えば、ＦＣ融合体）、のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び宿主細胞に沿って使用される標的ポリペプチドは、酵素または阻害剤である。標的ポリペプチドとして使用され得る酵素及び阻害剤の例としては、限定されないが、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ－ＩＩＩ）、ポリペプチドＣ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）及びｔＰＡバリアント、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、イデュルスルファーゼ（イズロン酸－２－スルファターゼ）、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ－β（ヒトα－ガラクトシダーゼＡ）、ボツリヌス毒素、コラゲナーゼ、ヒトＤＮＡｓｅ－Ｉ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ウリカーゼ（尿酸オキシダーゼ）、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ（グルカルピダーゼ）、α１プロテアーゼ阻害剤（α１アンチトリプシン）、ラクターゼ、膵臓酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）、ならびにアデノシンデアミナーゼが挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び宿主細胞に沿って使用される標的ポリペプチドはサイトカインである。標的ポリペプチドとして使用され得るサイトカインの例としては、限定されないが、インターフェロン－α（ＩＮＦ－α）、インターフェロン－β（ＩＮＦ－β）、インターフェロン－γ（ＩＮＦ－γ）、インターロイキン－２（ＩＬ２）、キメラジフテリア毒素－ＩＬ－２（デニロイキンジフチトクス）、インターロイキン－１（ＩＬ１）、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ１１、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ１受容体アンタゴニスト（アナキンラ）、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び宿主細胞に沿って使用される標的ポリペプチドは、ホルモンまたは増殖因子である。標的ポリペプチドとして使用され得るホルモン及び増殖因子の例としては、限定されないが、インスリン、プラムリンチド、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１）、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド－１アゴニスト（ＧＬＰ－１）、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヒト骨形態形成ポリペプチド２（ｈＢＭＰ２）、ヒト骨形態形成タンパク質７（ｈＢＭＰ７）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、線維芽細胞増殖因子２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ニューロトロフィン－３、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ルトロピン－α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及び顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び宿主細胞に沿って使用される標的ポリペプチドは受容体である。標的ポリペプチドとして使用され得る受容体の例としては、限定されないが、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（例えば、Ｆｃと融合したもの）及び可溶性ＴＮＦ受容体（例えば、Ｆｃと融合したもの）が挙げられる。
他の実施形態では、標的ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。他の実施形態では、標的ポリペプチドは、認可された生物製剤である。別の実施形態では、治療用ポリペプチドは、アバタセプト（例えば、Ｏｒｅｎｃｉａ）、アフリベルセプト（例えば、Ｅｙｌｅａ）、アガルシダーゼベータ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）、アルビグルチド（例えば、Ｅｐｅｒｚａｎ）、アルデスロイキン（例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、アレファセプト（例えば、Ａｍｅｖｉｖｅ）、アルグルセラーゼ（例えば、Ｃｅｒｅｄａｓｅ）、アルグルコシダーゼアルファ（例えば、ＬＵＭＩＺＹＭＥ）、アリスキレン（例えば、Ｔｅｋｔｕｒｎａ）、アルファ－１－ポリペプチダーゼ阻害剤（例えば、Ａｒａｌａｓｔ）、アルテプラーゼ（例えば、Ａｃｔｉｖａｓｅ）、アナキンラ（例えば、Ｋｉｎｅｒｅｔ）、アニストレプラーゼ（例えば、Ｅｍｉｎａｓｅ）、ヒト炭疽菌免疫グロブリン（例えば、ＡＮＴＨＲＡＳＩＬ）、抗血友病因子（例えば、Ａｄｖａｔｅ）、アンチインヒビター血液凝固複合体（例えば、ＦｅｉｂａＮｆ）、アンチトロンビンアルファ、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、抗胸腺細胞グロブリン（例えば、抗胸腺細胞グロブリン）、抗胸腺細胞グロブリン（ウマ）（例えば、ＡＴＧＡＭ）、抗胸腺細胞グロブリン（ウサギ）（例えば、ＡＴＧ－Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）、アプロチニン（例えば、Ｔｒａｓｙｌｏｌ）、アスホターゼアルファ、アスパラギナーゼ（例えば、Ｅｌｓｐａｒ）、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー（例えば、Ｅｒｗｉｎａｚｅ）、ベカプレルミン（例えば、ＲＥＧＲＡＮＥＸ）、ベラタセプト（例えば、Ｎｕｌｏｊｉｘ）、ベラクタント、ビバリルジン（例えば、Ａｎｇｉｏｍａｘ）、Ａ型ボツリヌス毒素（例えば、ＢＯＴＯＸＥ）、Ｂ型ボツリヌス毒素（例えば、Ｍｙｏｂｌｏｃ）、ブレンツキシマブベドチン（例えば、Ａｄｃｅｔｒｉｓ）、ブセレリン（例えば、Ｓｕｐｒｅｃｕｒ）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（ヒト）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（組換え）（例えば、Ｒｕｃｏｎｅｓｔ）、セルトリズマブペゴル（例えば、Ｃｉｍｚｉａ）、絨毛性ゴナドトロピンアルファ（例えば、絨毛性ゴナドトロピンアルファ）、絨毛性ゴナドトロピン（ヒト）（例えば、Ｏｖｉｄｒｅｌ）、絨毛性ゴナドトロピン（組換え）（例えば、Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅ）、凝固第ＩＸ因子（例えば、Ａｌｐｒｏｌｉｘ）、凝固第ＶＩＩａ因子（例えば、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）、凝固第Ｘ因子ヒト（例えば、Ｃｏａｇａｄｅｘ）、凝固第ＸＩＩＩ因子Ａ－サブユニット（組換え）、コラゲナーゼ（例えば、Ｃｏｒｄａｓｅ）、コネスタットアルファ、コルチコトロピン（例えば、Ｈ．Ｐ．Ａｃｔｈａｒ）、コシントロピン（例えば、Ｃｏｒｔｒｏｓｙｎ）、ダルベポエチンアルファ（例えば、Ａｒａｎｅｓｐ）、デフィブロチド（例えば、Ｎｏｒａｖｉｄ）、デニロイキンジフチトクス（例えば、Ｏｎｔａｋ）、デシルジン、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ヒツジ）（例えば、ＤＩＧＩＢＩＮＤ）、ドルナーゼアルファ（例えば、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、ドロトレコギンアルファ（例えば、Ｘｉｇｒｉｓ）、デュラグルチド、エフモロクトコグアルファ（例えば、ＥＬＯＣＴＡ）、エロスルファーゼアルファ、エンフビルチド（例えば、ＦＵＺＥＯＮ）、エポエチンアルファ（例えば、Ｂｉｎｏｃｒｉｔ）、エポエチンゼータ（例えば、Ｒｅｔａｃｒｉｔ）、エプチフィバチド（例えば、ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ）、エタネルセプト（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ）、エキセナチド（例えば、Ｂｙｅｔｔａ）、第ＩＸ因子複合体（ヒト）（例えば、ＡｌｐｈａＮｉｎｅ）、フィブリノリジン（プラスミンとしても知られる）（例えば、Ｅｌａｓｅ）、フィルグラスチム（例えば、Ｎ．Ａ．）、フィルグラスチム－ｓｎｄｚ、ホリトロピンアルファ（例えば、Ｇｏｎａｌ－Ｆ）、ホリトロピンベータ（例えば、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ ＡＱ）、ガルスルファーゼ（例えば、Ｎａｇｌａｚｙｍｅ）、胃内因子、ゲムツズマブオゾガマイシン（例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、酢酸グラチラマー（例えば、Ｃｏｐａｘｏｎｅ）、組換えグルカゴン（例えば、ＧｌｕｃａＧｅｎ）、グルカルピダーゼ（例えば、Ｖｏｒａｘａｚｅ）、グラミシジンＤ（例えば、Ｎｅｏｓｐｏｒｉｎ）、Ｂ型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒトｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ毒素免疫グロブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン（例えば、Ｈｙｐｅｒａｂ Ｒａｂｉｅｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｕｍａｎ）、ヒトＲｈｏ（Ｄ）免疫グロブリン（例えば、Ｈｙｐ Ｒｈｏ Ｄ Ｉｎｊ １６．５％）、ヒト血清アルブミン（例えば、Ａｌｂｕｍｉｎａｒ）、ヒト水痘帯状疱疹免疫グロブリン（例えば、Ｖａｒｉｚｉｇ）、ヒアルロニダーゼ（例えば、ＨＹＬＥＮＥＸ）、ヒアルロニダーゼ（ヒト組換え）、イブリツモマブチウキセタン（例えば、Ｚｅｖａｌｉｎ）、イデュルスルファーゼ（例えば、Ｅｌａｐｒａｓｅ）、イミグルセラーゼ（例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ）、ヒト免疫グロブリン、インスリンアスパルト（例えば、ＮｏｖｏＬｏｇ）、ウシインスリン、インスリンデグルデク（例えば、Ｔｒｅｓｉｂａ）、インスリンデテミル（例えば、ＬＥＶＥＭＩＲ）、インスリングラルギン（例えば、Ｌａｎｔｕｓ）、インスリングルリジン（例えば、ＡＰＩＤＲＡ）、インスリンリスプロ（例えば、Ｈｕｍａｌｏｇ）、ブタインスリン（例えば、ＩｌｅｔｉｎＩＩ）、レギュラーインスリン（例えば、ＨｕｍｕｌｉｎＲ）、ブタインスリン（例えば、ｖｅｔｓｕｌｉｎ）、イソフェンインスリン（例えば、ＮｏｖｏｌｉｎＮ）、組換えインターフェロンアルファ－２ａ（例えば、ＲｏｆｅｒｏｎＡ）、インターフェロンアルファ－２ｂ（例えば、ＩＮＴＲＯＮ Ａ）、インターフェロンアルファコン－１（例えば、ＩＮＦＥＲＧＥＮ）、インターフェロンアルファ－ｎ１（例えば、Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ）、インターフェロンアルファ－ｎ３（例えば、Ａｌｆｅｒｏｎ）、インターフェロンベータ－１ａ（例えば、Ａｖｏｎｅｘ）、インターフェロンベータ－１ｂ（例えば、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、インターフェロンガンマ－１ｂ（例えば、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）、静脈内免疫グロブリン（例えば、Ｃｉｖａｃｉｒ）、ラロニダーゼ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ）、レノグラスチム（例えば、Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ）、レピルジン（例えば、Ｒｅｆｌｕｄａｎ）、ロイプロリド（例えば、Ｅｌｉｇａｒｄ）、リラグルチド（例えば、Ｓａｘｅｎｄａ）、ルシナクタント（例えば、Ｓｕｒｆａｘｉｎ）、ルトロピンアルファ（例えば、Ｌｕｖｅｒｉｓ）、メカセルミン（例えば、Ｎ．Ａ．）、メノトロピン（例えば、Ｍｅｎｏｐｕｒ）、メトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ（例えば、Ｍｉｒｃｅｒａ）、Ｍｅｔｒｅｌｅｐｔｉｎ（例えば、Ｍｙａｌｅｐｔ）、天然アルファインターフェロンまたはｍｕｌｔｉｆｅｒｏｎ（例えば、Ｉｎｔｒｏｎ／Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ）、ネシリチド（例えば、ＮＡＴＲＥＣＯＲ）、オクリプラスミン（例えば、Ｊｅｔｒｅａ）、オプレルベキン（例えば、Ｎｅｕｍｅｇａ）、ＯｓｐＡリポポリペプチド（例えば、Ｌｙｍｅｒｉｘ）、オキシトシン（例えば、Ｐｉｔｏｃｉｎ）、パリフェルミン（例えば、Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ）、パンクレリパーゼ（例えば、Ｐａｎｃｒｅｃａｒｂ）、ウシペガデマーゼ（例えば、Ａｄａｇｅｎ）、ペグアスパラガーゼ（例えば、Ｏｎｃａｓｐａｒ）、ペグフィルグラスチム（例えば、Ｎｅｕｌａｓｔａ）、ペグインターフェロンアルファ－２ａ（例えば、Ｐｅｇａｓｙｓ）、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ（例えば、ＰＥＧ－イントロン）、ペグインターフェロンベータ－１ａ（例えば、Ｐｌｅｇｒｉｄｙ）、ペグロチカーゼ（例えば、（Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ））、ペグビソマント（例えば、ＳＯＭＡＶＥＲＴ）、ポラクタントアルファ（例えば、Ｃｕｒｏｓｕｒｆ）、プラムリンチド（例えば、Ｓｙｍｌｉｎ）、Ｐｒｅｏｔａｃｔ（例えば、ＰｒｅｏｔａｃｔＥ）、硫酸プロタミン（例えば、硫酸プロタミン注射液、ＵＳＰ）、ヒトポリペプチドＳ（例えば、ヒトポリペプチドＳ）、プロトロンビン（例えば、ＦｅｉｂａＮｆ）、プロトロンビン複合体（例えば、Ｃｏｆａｃｔ）、濃縮プロトロンビン複合体（例えば、Ｋｃｅｎｔｒａ）、ラスブリカーゼ（例えば、Ｅｌｉｔｅｋ）、レテプラーゼ（例えば、Ｒｅｔａｖａｓｅ）、リロナセプト（例えば、Ａｒｃａｌｙｓｔ）、ロミプロスチム（例えば、Ｎｐｌａｔｅ）、サクロシダーゼ（例えば、Ｓｕｃｒａｉｄ）、サケカルシトニン（例えば、Ｃａｌｃｉｍａｒ）、サルグラモスチム（例えば、Ｌｅｕｃｏｍａｘ）、サツモマブペンデチド（例えば、ＯｎｃｏＳｃｉｎｔ）、セベリパーゼアルファ（例えば、Ｋａｎｕｍａ）、セクレチン（例えば、ＳｅｃｒｅＦｌｏ）、セルモレリン（例えば、酢酸セルモレリン）、血清アルブミン（例えば、Ａｌｂｕｎｅｘ）、ヨウ化血清アルブミン（例えば、Ｍｅｇａｔｏｐｅ）、シモクトコグアルファ（例えば、Ｎｕｗｉｑ）、シプロイセル－Ｔ（例えば、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）、組換えソマトトロピン（例えば、ＮｕｔｒｏｐｉｎＡＱ）、組換えソマトロピン（例えば、ＢｉｏＴｒｏｐｉｎ）、ストレプトキナーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔａｓｅ）、スソクトコグアルファ（例えば、Ｏｂｉｚｕｒ）、タリグルセラーゼアルファ（例えば、Ｅｌｅｌｙｓｏ）、テデュグルチド（例えば、Ｇａｔｔｅｘ）、テネクテプラーゼ（例えば、ＴＮＫａｓｅ）、テリパラチド（例えば、Ｆｏｒｔｅｏ）、テサモレリン（例えば、Ｅｇｒｉｆｔａ）、トロンボモジュリンアルファ（例えば、Ｒｅｃｏｍｏｄｕｌｉｎ）、サイマルファシン（例えば、Ｚａｄａｘｉｎ）、サイログロブリン、チロトロピンアルファ（例えば、Ｔｈｙｒｏｇｅｎ）、精製ポリペプチド誘導体ツベルクリン（例えば、Ａｐｌｉｓｏｌ）、ツロクトコグアルファ（例えば、Ｚｏｎｏｖａｔｅ）、ウロフォリトロピン（例えば、ＢＲＡＶＥＬＬＥ）、ウロキナーゼ（例えば、Ｋｉｎｌｙｔｉｃ）、バソプレシン（例えば、Ｐｉｔｒｅｓｓｉｎ）、ベラグルセラーゼアルファ（例えば、Ｖｐｒｉｖ）、アブシキシマブ（例えば、ＲｅｏＰｒｏ）、アダリムマブ（例えば、Ｈｕｍｉｒａ）、アレムツズマブ（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ）、アリロクマブ（例えば、Ｐｒａｌｕｅｎｔ）、アルシツモマブ（例えば、ＣＥＡ－Ｓｃａｎ）、アテゾリズマブ（例えば、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、バシリキシマブ（例えば、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、ベリムマブ（例えば、Ｂｅｎｌｙｓｔａ）、ベバシズマブ（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ）、ブリナツモマブ（例えば、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）、ブロダルマブ（例えば、Ｓｉｌｉｑ）、カナキヌマブ（例えば、ＩＬＡＲＩＳＥ）、カナキヌマブ（例えば、Ｉｌａｒｉｓ）、カプロマブ（例えば、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ）、セツキシマブ（例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ダクリズマブ（例えば、Ｚｅｎａｐａｘ）、ダラツムマブ（例えば、ＤＡＲＺＡＬＥＸ）、デノスマブ（例えば、Ｘｇｅｖａ）、ジヌツキシマブ（例えば、ｕｎｉｔｕｘｉｎ）、エクリズマブ（例えば、Ｓｏｌｉｒｉｓ）、エファリズマブ（例えば、ＲＡＰＴＩＶＡ）、エロツズマブ（例えば、ＥＭＰＬＩＣＩＴＩ）、エボロクマブ（例えば、Ｒｅｐａｔｈａ）、ゴリムマブ（例えば、Ｓｉｍｐｏｎｉ注射液）、イブリツモマブ（例えば、Ｚｅｖａｌｉｎ）、イダルシズマブ（例えば、Ｐｒａｘｂｉｎｄ）、インフリキシマブ（例えば、ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、イピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ）、イキセキズマブ（例えば、Ｔａｌｔｚ）、メポリズマブ（例えば、Ｎｕｃａｌａ）、ムロモナブ（例えば、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ３）、ナタリズマブ（例えば、Ｔｙｓａｂｒｉ）、ネシツムマブ（例えば、Ｐｏｒｔｒａｚｚａ）、ニボルマブ（例えば、Ｏｐｄｉｖｏ）、オビルトキサキシマブ（例えば、Ａｎｔｈｉｍ）、オビヌツズマブ（例えば、Ｇａｚｙｖａ）、オファツムマブ（例えば、Ａｒｚｅｒｒａ）、オマリズマブ（例えば、Ｘｏｌａｉｒ）、パリビズマブ（例えば、Ｓｙｎａｇｉｓ）、パニツムマブ（例えば、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、ペムブロリズマブ（例えば、Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、ペルツズマブ（例えば
、Ｐｅｒｊｅｔａ）、ラムシルマブ（例えば、Ｃｙｒａｍｚａ）、ラニビズマブ（例えば、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、ラキシバクマブ（例えば、ＲＡＸＩＢＡＣＵＭＡＢ）、リツキシマブ（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ）、セクキヌマブ（例えば、Ｃｏｓｅｎｔｙｘ）、シルツキシマブ（例えば、Ｓｙｌｖａｎｔ）、トシリズマブ（例えば、ＡＣＴＥＭＲＡ）、トシツモマブ（例えば、Ｂｅｘｘａｒ）、トラスツズマブ（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ウステキヌマブ（例えば、Ｓｔｅｌａｒａ）、またはベドリズマブ（例えば、Ｅｎｔｙｖｉｏ）、のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、標的ポリペプチドは、抗体である。別の実施形態では、抗体は、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン）、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ－Ｉ－１３１）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（ナタリズマブ）、Ａｃｔｅｍｒａ（トシリズマブ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ラニビズマブ）、Ｓｏｌｉｒｉｓ（エクリズマブ）、Ｃｉｍｚｉａ（セルトリズマブペゴル）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）、Ｉｌａｒｉｓ（カナキヌマブ）、Ｓｔｅｌａｒａ（ウステキヌマブ）、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ）、Ｐｒｏｌｉａ（デノスマブ）、Ｎｕｍａｘ（モタビズマブ）、ＡＢＴｈｒａｘ（ラキシバクマブ）、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（ベリムマブ）、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブベドチン）、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ）、Ｋａｄｃｙｌａ（Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン）、またはＧａｚｙｖａ（オビヌツズマブ）、のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｓｃｆｖ、またはｓｄＡｂである。他の実施形態では、標的ポリペプチドは、酵素またはその阻害剤のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、標的ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ－ＩＩＩ）、ポリペプチドＣ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）及びｔＰＡバリアント、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、ラロニダーゼ（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、イデュルスルファーゼ（イズロン酸－２－スルファターゼ）、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ－β（ヒトα－ガラクトシダーゼＡ）、ボツリヌス毒素、コラゲナーゼ、ヒトＤＮＡｓｅ－Ｉ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ウリカーゼ（尿酸オキシダーゼ）、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ（グルカルピダーゼ）、α１プロテアーゼ阻害剤（α１アンチトリプシン）、ラクターゼ、膵臓酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）、ならびにアデノシンデアミナーゼ、のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び宿主細胞に沿って使用される標的ポリペプチドは受容体である。標的ポリペプチドとして使用され得る受容体の例としては、限定されないが、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（例えば、Ｆｃと融合したもの）及び可溶性ＴＮＦ受容体（例えば、Ｆｃと融合したもの）が挙げられる。
別の実施形態では、標的ポリペプチドは、培養培地に分泌される。ある特定の実施形態では、標的ポリペプチドは、培養培地から精製される。別の実施形態では、標的ポリペプチドは、親和性精製またはイオン交換クロマトグラフィーによって培養培地から精製される。別の実施形態では、標的ポリペプチドはＦｃドメインを含み、ポリペプチド－Ａによって培養培地から親和性精製される。別の実施形態では、標的ポリペプチドは親和性タグを含み、親和性精製される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び宿主細胞に沿って使用される標的ポリペプチドは、全長ポリペプチド、その短縮物、ポリペプチドドメイン、領域、モチーフ、またはペプチドであり得る。
ある特定の実施形態では、標的ポリペプチドは、ＦＣ融合ポリペプチドである。
ある特定の実施形態では、標的ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃドメインを含む生物製剤である。
ある特定の実施形態では、標的ポリペプチドは、改変され得る。別の実施形態では、標的ポリペプチドは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ由来のシグナル配列を含むように操作されている。他の実施形態では、シグナル配列は、プロセシングを受け、標的ポリペプチドから除去される。別の実施形態では、標的ポリペプチドは、１つ以上のタグ（複数可）を含むように操作されている。他の実施形態では、タグは、プロセシングを受け、標的ポリペプチドから除去される。
５．４．１ ポリペプチドを含む組成物及び／または製剤
別の態様では、本明細書に記載の標的ポリペプチドの１つ以上を含む組成物（例えば、医薬組成物）が本明細書で提供される。本明細書に記載の組成物は、対象（例えば、ヒト対象）における疾患／障害の治療及び／または予防に有用である（セクション５．４．２を参照のこと）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）は、本明細書に記載の標的ポリペプチドに加えて、医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用される「医薬的に許容可能」という用語は、動物での使用、より具体的にはヒトでの使用を目的として、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に掲載されていることを意味する。本明細書において医薬的に許容可能な担体の文脈で使用される「担体」という用語は、医薬組成物の投与に用いられる希釈剤、補助剤、賦形剤、または媒体を指す。生理食塩水ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液として用いられ得る。適切な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脂肪粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、及び同様のものが含まれる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、対象への所期の投与経路に適するように製剤化される。例えば、本明細書に記載の組成物は、皮下投与、非経口投与、経口投与、皮内投与、経皮投与、結腸直腸内投与、腹腔内投与、及び直腸内投与に適するように製剤化され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与、経口投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、気管内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、皮内投与、経皮投与、または経肺投与向けに製剤化され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、１つ以上の緩衝剤をさらに含み得る。こうした緩衝剤は、例えば、リン酸緩衝剤及びスクロースリン酸グルタミン酸緩衝剤である。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、緩衝剤を含まない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、１つ以上の塩をさらに含む。こうした塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、及びアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）、またはそのようなアルミニウム塩の混合物）である。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、塩を含まない。
本明細書に記載の組成物は、投与説明と共にキット、容器、パック、またはディスペンサーに含められ得る。
本明細書に記載の組成物は、使用時まで保存され得る。例えば、組成物は、凍結保存（例えば、約－２０℃もしくは約－７０℃）されるか、冷蔵条件（例えば、約４℃）の下で保存されるか、または室温で保存され得る。
５．４．２ 予防的使用及び治療的使用
一態様では、対象における疾患または障害の予防方法または治療方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の標的ポリペプチドまたはその組成物を対象に投与することを含む。本明細書では、対象における疾患または障害の予防方法がさらに提供され、この方法は、本明細書に記載の標的ポリペプチドまたはその組成物を対象に投与することを含む。
一態様では、対象における疾患または障害の治療方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の標的ポリペプチドまたはその組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、対象における疾患または障害の予防方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の標的ポリペプチドまたはその組成物を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、対象における疾患または障害の予防方法または治療方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の方法に従って産生されるポリシアリル化された標的ポリペプチドを対象に投与することを含む。
ある特定の実施形態では、疾患または障害は、標的ポリペプチドの欠陥バージョンが対象に存在すること、標的ポリペプチドが対象に存在しないこと、対象において標的ポリペプチドの発現が減少すること、によって引き起こされ得るものであり、本明細書に記載の方法を使用して産生される標的ポリペプチドを使用して治療または予防され得る。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、本明細書に記載の方法を使用して産生される標的ポリペプチドが結合する受容体によって媒介されるか、または本明細書に記載の方法を使用して産生される標的ポリペプチドが結合するリガンドによって媒介され得る（例えば、標的ポリペプチドは、リガンドに対する受容体である）。
ある特定の実施形態では、対象における疾患または障害の予防方法または治療方法は、本明細書に記載の標的ポリペプチドまたはその組成物を有効量で対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、有効量は、予防効果及び／または治療効果（複数可）を有する治療用物量である。ある特定の実施形態では、「有効量」は、下記の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数を達成する上で十分な治療用物量を指す：（ｉ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の重症度の低減もしくは軽減、（ｉｉ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の期間の低減、（ｉｉｉ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の進行の阻止、（ｉｖ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の退縮誘導、（ｖ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の発症もしくは発生の阻止、（ｖｉ）疾患／障害もしくはそれと関連する症状の再発の阻止、（ｖｉｉ）疾患／障害と関連する臓器不全の低減、（ｖｉｉｉ）疾患／障害を有する対象の入院回数の低減、（ｉｘ）疾患／障害を有する対象の入院期間の低減、（ｘ）疾患／障害を有する対象の生存期間の延長、（ｘｉ）対象における疾患／障害の除去、及び／または（ｘｉｉ）別の治療の予防効果もしくは治療効果（複数可）の増強もしくは改善。
５．５ アッセイ
５．５．１ 株、増殖方法、及び遺伝学的方法
本明細書では、宿主細胞の培養方法が提供される。
宿主細胞は、当該技術分野で知られる標準的な培養手法のいずれかを使用して培養される。例えば、細胞は、ブレインハートインフュージョン、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅソイブロス、または酵母エキス（これらはすべて、５μｇ／ｍｌのヘミンを含む）のような富栄養培地中で所定通り培養される。さらに、インキュベートは、２６℃、暗所で静置培養または振とう培養として２～３日間実施される。いくつかの実施形態では、組換え細胞株の培養物は、適切な選択薬剤を含む。
表１には選択薬剤の一覧が例として示されるが、これらに限定されない。
Figure 2023509734000003
５．５．２ プラスミド
プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉでの増殖用にｐＵＣ５７ベクター骨格から得たものであり、アンピシリン選択マーカーまたはカナマイシン選択マーカーが含まれたものである。発現カセットは、切除に適した制限酵素認識部位と隣接する。カセットの組成は、所期の使用に依存するものであり、それぞれの方法及び実施例に記載される。目的遺伝子は、低頻度コドン（頻度＜１０％）を除外しつつＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅのコドン使用頻度に基づいて確率的にコドンを選択するカスタムＰｙｔｈｏｎ３スクリプトを使用してタンパク質配列をヌクレオチド配列へと戻し翻訳することによってＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ向けにコドン使用を最適化したＯＲＦとして含まれる。コドン使用は、アノテーションされたすべてのＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅヌクレオチドコード配列に対してｃｕｓｐ（Ｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ １６（６），ｐｐ．２７６－２７７）を使用して計算されている。最適化配列は、制限酵素認識部位が回避され、反復区間またはホモポリマー区間が削除されるように手動で精選した。
人工ポリシストロン生成用の新たな遺伝子間領域を選択するために、相対発現転写産物レベルが高いことが示されたＬ．ｍａｊｏｒ遺伝子（Ｒａｓｔｒｏｊｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４，ｐ．２２３）のホモログをＬ．ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、及びＬ．ｉｎｆａｎｔｕｍのゲノムから検索すると共に、ｂｌａｓｔｎ（Ｃａｍａｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．（２００９）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １０，ｐ．４２１）を使用して関連３’遺伝子間領域（Ｍｕｒｒａｙ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １５３（２），ｐｐ．１２５－１３２）をさらに選別することで、（ｃｄ－ｈｉｔ（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２（１３），ｐｐ．１６５８－１６５９）を使用した場合に）互いの同一性が８０％を超える３’遺伝子間領域、またはＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅゲノムと同一の３０ｂｐ超の区間を除外した。
長い組み込みコンストラクトについては、互いの断片との相同組換えのための領域（通常は２００ｂｐ）または染色体組み込み遺伝子座との相同組換えのための領域（通常は５００ｂｐ）を自体の末端に含むことでＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ相同組換え系によるアセンブリを可能にする通常は２５００ｂｐ未満のいくつかの小片へとコンストラクトを分割した。
プラスミドの生成及びシークエンシングは遺伝子合成プロバイダーによって行われた。プラスミド及び説明は配列表に示される。
（ｉ）トランスフェクション方法
（Ａ）ＤＮＡの調製
制限酵素消化（総体積２４０μＬ中ＤＮＡ１２μｇ）は、標準的な制限酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、好ましくは、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ）を製造者の説明に従って使用して実施した。制限酵素消化は、３０℃で完了時点までまたは一晩実施し、ＤＮＡ精製は、ＥｔＯＨ沈殿によって実施した。このＥｔＯＨ沈殿では、１倍体積量の消化ＤＮＡに対して１００％の氷冷ＥｔＯＨを２倍体積量添加し、氷上で３０分間インキュベートし、１７’５００×ｇの遠心分離に４℃で３０分間供した。７０％のＥｔＯＨでペレットを洗浄し、その後に最大１５分間乾燥させてからｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。環状プラスミドを最適に除去するために、ベクター骨格中に認識部位を有する制限酵素を１つまたは２つ選択し、３７℃で１時間消化を実施し、上記のようにＥｔＯＨによって精製した。消化物の分析は、０．７～２％のアガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液）中でのアガロースゲル電気泳動によって実施した。任意選択で、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲルを用いてゲルからの抽出を実施し、製造者の説明に従ってＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を使用することで、未消化プラスミドを調製物から除去した。
（Ｂ）トランスフェクションのためのＤＮＡ調製
組み込み用の直鎖ＤＮＡ断片は、断片当たり１μｇとして必要な組み合わせでトランスフェクション向けに混合される。この混合物は、トランスフェクションにつき約２μｌとなるように３０℃、減圧濃縮器中でその体積を低減した。プラスミドのエピソームトランスフェクションについては、０．１～１μｇのプラスミドＤＮＡを直接的にトランスフェクションに使用した。
（Ｃ）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いるトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に、親株の濃密増殖培養物を、１：１０希釈となるように新鮮培地（ブレインハートインフュージョン＋ヘミン「ＢＨＩＨ」または酵母エキス＋ヘミン「ＹＥＨ」）（事前に組み込んだ選択マーカーに対応する抗生物質をすべて含む）に含め、２６℃で一晩培養した。
Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘキット（Ｌｏｎｚａ）と共に４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）＿Ｃｏｒｅ＿Ｘを使用してトランスフェクションを実施した。これについては、上記のように調製したＤＮＡをＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ溶液１６．４μｌ及びサプリメント溶液３．６μｌと混合した。１０７個の細胞を含む等体積の培養物（ＯＤは約０．３～１．０／ｍｌ、細胞形状は円形～滴状であるべきである）を、１８００ｇで５分間遠心分離することによってペレット化し、上清を除去した。この細胞ペレットを上記ＤＮＡ混合物中に再浮遊させ、パルスＦＩ－１５８（実施例によっては、ＦＰ１６７、ＣＭ１５０、ＥＯ１１５、ＤＮ１００、ＦＰ１５８、ＦＢ１５８を代替パルスとして使用した）で１６ウェル電気穿孔ストリップを使用してトランスフェクションした。陰性対照として、追加の培養物をｄｄＨ２Ｏのみと共にトランスフェクションに供した。
８０μｌの新鮮培地（ＢＨＩＨまたはＹＥＨ＋親細胞株選択マーカー）を各ウェルに添加し、４５μｌの当該混合物（２連）を、２００μｌの新鮮培地を事前に入れた９６ウェル培養プレートの個々のウェルに移した。暗所、２６℃での２４時間のインキュベート（回復）後、新たな選択マーカーを５０％濃度で添加した（事前選択（表２を参照のこと））。さらに１～２日間のインキュベートを実施後、選択マーカーを補給して１００％とし（主要選択（表を参照のこと））、いくつかの希釈（１：２～１：１０）を９６ウェル形式（最終体積２５０μｌ）で実施した。暗所、２６℃で培養物を最大７日間さらにインキュベートした。増殖が観察されない場合は培養培地の交換（１８００ｇ、室温での１０分間の遠心分離）を実施し、培養物を再び最大７日間インキュベートした。必要に応じてこのステップを繰り返した。分析前に、１：５～１：２０の範囲の希釈によって増殖培養を拡大して培養体積を増やした。
（Ｄ）Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ）を用いるトランスフェクション
トランスフェクションの前日にＢＨＩＨ中またはＹＥＨ中での高密度増殖培養物を１：１０希釈することによってトランスフェクション用のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ培養物（静置、２６℃）の調製を実施した。光度計を用いて使い捨てキュベット中で６００ｎｍでのＯＤを測定し、効率を最適化するために、このＯＤが０．４～１．０（４～６×１０＊７個細胞）の範囲に入るようにした。細胞は対数増殖期に入っていることになり、このことは、円形及び滴状の細胞の混合集団が存在することによって示される。円形の細胞が多い方が好ましかった。１つのトランスフェクションに１０ｍｌの培養物を使用し、それぞれの選択マーカーに対する陰性対照として、常に１つの培養物をｄｄＨ２Ｏと共に電気穿孔に供した。トランスフェクションについては、培養物を１’８００×ｇでのスピンダウンに室温で５分間供した。上清を除去し、ペレットを５ｍｌのトランスフェクション緩衝液（２００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、６ｍＭの無水デキストロース（グルコース）、ろ過滅菌（孔径０．２２ｕｍ）済）に再浮遊させた。細胞を再び遠心分離し、ペレットを４００μｌのトランスフェクション緩衝液に再浮遊させた。４００μｌの細胞をＤＮＡに添加し、キュベットに移し、氷上で１０分間インキュベートした。低電圧プロトコール（μ指数関数的減衰波：４５０Ｖ、４５０μＦ、５～６ｍ秒、キュベット：ｄ＝２ｍｍ）を使用してＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ）で電気穿孔を実施し、その直後に正確に１０分間氷上に置いた。キュベットの全内容物を、いずれの選択マーカーも含まない１０ｍｌのＢＨＩＨまたはＹＥＨに移し、暗所で通気しながら細胞を２６℃で２０～２４時間静置培養して増殖させた。ポリクローナル細胞株の選択については、半分濃度の選択マーカーを添加し、培養物を２６℃で１～２日間インキュベートした後、完全濃度の選択マーカーを含む１０ｍｌのＢＨＩＨまたはＹＥＨ中で比を１：１０として継代した。暗所、２６℃で細胞をさらに増殖させた。７日後に培養物が濁った培養物へと変化すれば、細胞は１’８００×ｇでの５分間のスピンダウンに室温で供されることになり、完全濃度の選択マーカーを含む新たなＢＨＩＨ培地またはＹＥＨ培地にペレットが再浮遊される。
（ｉｉ）クローン選択
クローン選択については、液体培養物が濁った段階ですぐにＢＨＩＨプレートまたはＹＥＨプレート（１．４％の寒天及び適切な１００％選択薬剤を含む）上に細胞をストリークした。プレートをｐａｒａｆｉｌｍで覆い、暗所、２６℃、上下反転状態で７～１０日インキュベートした。単一コロニー（１～２ｍｍサイズ）を、ｌｍｌのＢＨＩＨまたはＹＥＨを含む２４ウェルプレートに移し、ｐａｒａｆｉｌｍで覆い、暗所、２６℃で約７～１０日間インキュベートした。その後、１ｍｌの培養物を２４ウェルプレートから、１０ｍｌのＢＨＩまたはＹＥＨを含むフラスコへと移し、通常通りさらに静置培養して増殖させた。
（ｉｉｉ）ロングリードシークエンシングのための、重力流手法によるゲノムＤＮＡの抽出
Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＣＢ１００キット＃７４０５０８（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ ＩＶ ＃７４０６０４＋ＡＸＧ１００カラム）を使用することによってＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅの高密度培養物１０ｍｌ（３日間増殖させたもの（ＯＤ値約２））からゲノムＤＮＡを抽出した。これについては、１６００ｇで細胞を１５分間ペレット化し、１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再浮遊させ、製造者の説明に従って抽出プロトコールに供した。
（ｉｖ）Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシング
Ｓｔ１６８３４株、Ｓｔ１７３１１株、Ｓｔ１７２１２株、Ｓｔ１７１８０株の構築の検証は、ロングリードＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシングによって行った。ライブラリー調製は、製造者の説明（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）に従って実施した。Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングは、リアルタイムでのベースコーリングが可能なＧｒｉｄＩＯＮ Ｘ５機器（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実施した。シークエンシングの実行は４８時間後に終了させた。生リードのアセンブリは、Ｃａｎｕ階層的アセンブラ（バージョン１．８）（Ｋｏｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７（５），ｐｐ．７２２－７３６）を使用して実施した。アセンブリしたコンティグを、ＢＬＡＳＴ（Ｃａｍａｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．（２００９）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １０，ｐ．４２１）及びＡｒｔｅｍｉｓ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｔｏｏｌ（Ｃａｒｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１（１６），ｐｐ．３４２２－３４２３）を使用して標的インシリコ参照配列と比較した。
（ｖ）ＰａｃＢｉｏシークエンシング
ＰａｃＢｉｏロングリードゲノムシークエンシングは、製造者の指定に従ってライブラリーを調製して、Ｓｔ１５４４８については２つのＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴセル（ｖ２．１ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｓｔ１７５２７については１つのＰａｃＢｉｏ ｓｅｑｕｅｌ ＳＭＲＴセルで実施した。
ロングコンティグへのＰａｃＢｉｏ生リードのアセンブリは、ＨＧＡＰを使用して実施し［ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－Ｔｒａｉｎｉｎｇ／ｗｉｋｉ／ＨＧＡＰ－ｉｎ－ＳＭＲＴ－Ａｎａｌｙｓｉｓ］、ＰａｃＢｉｏ生リードのエラー補正はＡｒｒｏｗを２回適用して実施した［ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＧｅｎｏｍｉｃＣｏｎｓｅｎｓｕｓ］。
（ｖｉ）Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング
Ｓｔ１７５２７のゲノムＤＮＡについては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでのシークエンシング（２×１５０ｂｐのペアエンドシークエンシング；製造者の指定に従ってＴｒｕＳｅｑライブラリーを調製した）にさらに供した。得られたクオリティトリミングデータは、株当たり約２０Ｍのペアリードからなるものである。こうしたリードと参照配列とのアライメントには、ＢＷＡ－ＭＥＭ（Ｌｉ，Ｈｅｎｇ（２０１３）Ａｌｉｇｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ，ｃｌｏｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｏｎｔｉｇｓ ｗｉｔｈ ＢＷＡ－ＭＥＭ。ｈｔｔｐ：／／ａｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｐｄｆ／１３０３．３９９７ｖ２にてオンラインで利用可能）を使用した。
５．５．３ 発現分析
（ｉ）Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅからの試料調製
細胞を２６℃で静置培養して２～３日間増殖させた（この増殖培養は、例えば、６ウェルプレート中３ｍｌで実施した）。全細胞抽出物（ＷＣＥ）及び対応する無細胞培養上清の解析はウエスタンブロットによって行われる。上清分析については、増殖培養物を１８００ｇ、室温での遠心分離に５分間供し、無細胞上清を新たなチューブに移し、還元条件または非還元条件の下でＬａｅｍｍｌｉ色素と混合した。ＷＣＥ用の細胞ペレットについては、１×ＰＢＳで洗浄し、１８００ｇ、室温での遠心分離に再び５分間供し、－８０℃で最小限に３０分間凍結した。このペレットを室温で再び解凍した後、ペレットをＬａｅｍｍｌｉ（還元）緩衝液に溶解し、９５℃で１０分間、再び煮沸し、激しくボルテックスした。
（ｉｉ）ウエスタンブロットによる発現分析
ＭＯＰＳ泳動緩衝液を使用して２００Ｖでの４～１２％ビス－トリスＳＤＳ ＰＡＧＥに試料を６０分間供した。Ｉｂｌｏｔ装置を使用してＰＶＤＦ膜へのゲルの転写処理を７分間実施した。１０％の乳中での膜のブロッキング処理を室温で少なくとも３０分間実施した。１％の乳を含む１×ＰＢＳＴで希釈した一次抗体（すなわち、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（Ａ６０２９、Ｓｉｇｍａ）１：２０００希釈液、マウス抗ヒトカッパ軽鎖（Ｋ４３７７、Ｓｉｇｍａ）１：５０００希釈液、またはウサギ抗Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖（ＳＳＩ、＃１６７４４）１：１００希釈液）を、４℃での一晩のインキュベートに供した。その後、ブロットを１×ＰＢＳＴでの５分間の洗浄に３回供し、その後に、１％の乳を含む１×ＰＢＳＴに含めた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型二次抗体（抗マウス多価－ＨＲＰ（Ａ０４１２、Ｓｉｇｍａ）１：２０００希釈液または抗ウサギ－ＨＲＰ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１１１－０３５－００８）１：２０００希釈液）と共に３０℃で３時間旋回させてブロットの検出を行った後、１×ＰＢＳＴでの５分間の洗浄にブロットを３回供し、比色検出のための３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（１液組成タイプ）（ＴＭＢＭ－１０００－０１、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）での染色に供した。
５．５．４ アダリムマブの小スケール発現、精製
１４０ｒｐｍで振とうしながらＢＨＩＨ中またはＹＥＨ中での５０ｍｌ培養を行って宿主細胞を２６℃で４８時間所定通り増殖させた。培養物を収集し、１８００×ｇの遠心分離に室温で１０分間供した。培地上清を孔径０．２２μｍのフィルター（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、ＳＣＧＰ００５２５）に通してろ過し、ＥＤＴＡ（０．５Ｍ ｐＨ８）の１：１００希釈液を各ロード液に添加した。各株の培地上清を、Ｆａｌｃｏｎチューブ当たり１００μｌのプロテインＡ樹脂（プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ９４２４）と共に振とうしながらバッチで４時間、室温でインキュベートした。プロテインＡ樹脂での処理後、試料を５００×ｇの遠心分離に５分間供し、非吸着部を捨て、樹脂をスピンカラムに移した。１００μｌの樹脂に対して５００μｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ＨＣｌでｐＨを７．２０に調整した））（５ＣＶ）を使用して洗浄を３回実施した。この洗浄では、各ステップ間で１０００×ｇの遠心分離を室温で１分間実施した。溶出は、１００μｌの樹脂に対して１００μｌの緩衝液Ｂ（０．１Ｍの酢酸、１００ｍＭのＮａＣｌ（１ＭのＮａＯＨでｐＨを３．２０に調整した）を使用して実施した（いくつかのＣＶで実施）。この溶出（例えば、１ＣＶで３回及び０．５ＣＶで１回）では、各ステップ間で１０００×ｇの遠心分離を室温で１分間実施した。溶出画分をプールし、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（１Ｍ ｐＨ８）を添加することによって迅速に中和した。その後、プールした溶出液を、７Ｋ ＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラム（２ｍｌ）を使用するＰＢＳ（ｐＨ６）への緩衝液交換に供し、任意選択で、Ａｍｉｃｏｎ ３０Ｋ濃縮器（０．５ｍｌ）を使用して濃縮した。
５．５．５ 精製タンパク質及び細胞表面から遊離させたＮ－グリカンのＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣ－ＭＳ分析
精製タンパク質からのＮ－グリカンの酵素的な遊離は、供給元によって推奨されるようにＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。８μｌの試料（１５μｇのタンパク質）を２μｌのＲａｐｉｄ緩衝液及び１μｌのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅＦと混合した。この混合物を５０℃で１０分間インキュベートした後、９０℃で１分間インキュベートした。
細胞表面からのＮ－グリカンの酵素的な遊離は、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。細胞（１４０ｒｐｍで振とうしながら２６℃で４８時間または７２時間増殖させたもの）を収集し、１８００×ｇの遠心分離に室温で１０分間供すことによってＰＢＳで洗浄した。５０ｍｇの細胞ペレットをＧｌｙｃｏ緩衝液２に再浮遊させ、１μｌのＰＮＧａｓｅＦと共に３７℃、６５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。遠心分離によって細胞を再びペレット化し、７５μｌの上清をＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器中で遠心乾燥させた。グリカンを１０μｌの水に再懸濁させた。グリカンの遊離後、以前の報告（Ｂｅｈｒｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２８（１１），ｐｐ．８２５－８３１）のようにプロカインアミドでグリカンを直接的に標識した。簡潔に記載すると、１μｌの酢酸、８μｌのプロカインアミドストック溶液（ＤＭＳＯ中５５０ｍｇ／ｍｌ）、及び１２μｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウムストック溶液（Ｈ２Ｏ中２００ｍｇ／ｍｌ）と遊離グリカンとを混合した。試料を６５℃で６０分間インキュベートし、製造者の説明に従ってＬＣ－ＰＲＯＣ－９６精製プレート（Ｌｕｄｇｅｒ Ｌｔｄ）を使用して精製した。
プロカインアミド標識Ｎ－グリカンの分析は、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）と接続された蛍光検出可能なＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して親水性相互作用クロマトグラフィー－超高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＨＩＬＩＣ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって実施した。グリカンの分離は、５０ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）を溶媒Ａ、アセトニトリルを溶媒ＢとしてＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨアミドカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍＭ×１５０ｍＭ；Ｗａｔｅｒｓ）を使用して実施した。この分離は、０．５ｍｌ／分で溶媒Ｂ含量を４０分かけて７２％→５５％とするリニアグラジエントを使用して実施した。蛍光検出は、励起波長を３１０ｎｍ、検出波長を３７０ｎｍとして実施した。Ｚｓｐｒａｙエレクトロスプレーイオン源を備えたＳｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ質量分析計をポジティブ分解能モードで質量検出に使用した。この検出では下記のパラメーターを使用した：走査範囲：ｍ／ｚ３００～３５００、走査時間：１秒、キャピラリー電圧：２．２ｋＶ、イオン源温度：１２０℃、及びサンプリングコーン電圧：７５Ｖ。データの取得にはＭａｓｓＬｙｎｘ４．２（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。データの処理及び解析は、Ｕｎｉｆｉ １．９．４．０５３（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して実施した。プロカインアミド標識デキストランラダー（Ｌｕｄｇｅｒ Ｌｔｄ）の保持時間に基づいて５次多項分布曲線を使用してグルコース単位の帰属を行った。グリカン構造を、そのｍ／ｚ値及びその保持時間に基づいて帰属し、これまでに構築したＮ－グリカンライブラリーに対するマッチングに供した。個々の試料について、同等の設定を使用してＵＰＬＣとＳｙｎａｐｔ ＨＤＭＳ質量分析計とを組み合わせた。
少数の試料については、Ｗａｔｅｒｓ ＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識キット（Ｗａｔｅｒｓの使用説明：＜＜Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｆｒｉｅｎｄｌｙ ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ Ｎ－Ｇｌｙｃａｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ＞＞に大部分は従って使用した）で標識し、プロカインアミド標識グリカン（ＲＦ－ＭＳ）の場合と同じ機器を使用して分析した。
５．５．６ Ｎｅｕ５Ａｃ及びＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡｃのＤＭＢ標識化
フルオロフォア１，２－ジアミノ－４，５－メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）を使用する蛍光標識と還元とを組み合わせることによってヌクレオチド活性化シアル酸の濃度を定量化するための高感度方針を採用した。ＤＭＢでの標識化には、シアル酸分子の遊離ケト基ならびにカルボキシル基が必要である。標識化プロセスの前にケト基を還元すると、非活性化シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）は標識化されなくなる。ヌクレオチド活性化シアル酸については、ケト基がＣＭＰ置換されていることによって還元から保護されるため、還元後でも標識化することは依然として可能である。その後にＤＭＢ－高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を併用することで、総Ｎｅｕ５Ａｃ及び修飾ＣＭＰ－シアル酸の両方を同定し、フェムトモル範囲での定量化を行うことが可能になる（Ｇａｌｕｓｋａ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８２（１１），ｐｐ．４５９１－４５９８）。
ＯＤ値４の各試料（遠心分離によって収集し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、凍結させたもの）に対して、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ細胞ペレット用のＭｅＯＨ／クロロホルム抽出手順を実施した。抽出については、ペレットを解凍し、４８０μｌのＭｅＯＨに再浮遊させ、２０μｌの水を添加し、水浴中で１５分間、室温で超音波処理した。試料を卓上遠心分離機での１８０００ｇの遠心分離に４℃で１０分間供した。上清をガラスバイアルに移し、２６８μｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスした。次に、５００μｌのＨ２Ｏ（ＭＳグレード）を添加し、試料を再びボルテックスした。このＭｅＯＨ／クロロホルム／Ｈ２Ｏ（１／０．５４／１）混合物を２２００ｇの遠心分離に室温で２０分間供してＣＨＣｌ３相へとタンパク質、脂質、及びＤＮＡを除去した。上に位置するＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ相の約半分（５２５μｌ）を収集し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。この量は、ＯＤ値２のペレットからの抽出物質に相当する。この試料をｓｐｅｅｄ－ｖａｃ中で乾燥させ、１６μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、８μｌの試料２つに分割し、これらの試料を、還元条件下でのＤＭＢ標識化及び非還元条件下でのＤＭＢ標識化に別々に供した。対照として、Ｎｅｕ５Ａｃを含むＨ２ＯをＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥させ、乾燥物質をＨ２Ｏで希釈し、両方の標識化手順用に２つに分割した。１つの試料セットについては、氷冷した０．４Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を１０μｌ添加すると共に、新たに解凍した２Ｍの水素化ホウ素を含む０．５ＭのＮａＯＨを２μｌ添加し（最終＝０．２Ｍの水素化ホウ素を含む０．２Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，８））、室温で２時間インキュベートした（還元試料）。第２の試料セットについては、氷冷した０．４Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を１０μｌ添加すると共に、０．５ＭのＮａＯＨを２μｌ添加し（最終＝０．２Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，８））、室温で２時間インキュベートした（非還元試料）。その後、ｓｐｅｅｄＶａｃ中で試料を乾燥させ、３μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、製造者の説明に従ってＴａｋａｒａ標識化キット（＃４４００）を使用する標準的なＤＭＢ標識化に供した。最終的に、ＲＰ－Ｃ１８－ＬＣによって試料を２連で分析した。定量化は、標準溶液をホウ酸ナトリウム緩衝液（非還元）中でインキュベートし、非還元試料について上に記載した手順と同様にＤＭＢで標識して得られた定義された標準曲線を使用して実施した。
６．実施例
６．１ 実施例１
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅが相同組換えによって複数のＤＮＡ断片から染色体組み込みコンストラクトをアセンブリする能力を分析するために、同じコンストラクト（モノクローナル抗体（リツキシマブ）を発現させるためのもの）のトランスフェクションを、１断片バージョン及び２断片バージョンによって平行して試みた。
１断片バージョン（ｐＬＭＴＢ５０２６）は、軽鎖のコード配列、重鎖のコード配列、及び選択マーカーのコード配列（ノーセオスリシン（ｎｔｃ））を含み、これらのコード配列の隣及び間には遺伝子間領域が存在する。これらの遺伝子間領域を合成ポリシストロンの構築においてスペーサー（遺伝子間領域（ＩＲ））として使用する理由は、そうした遺伝子間領域が、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａにおける天然のポリシストロン性遺伝子クラスターのうちで、ｐｒｅ－ｍＲＮＡの適切なスプライシングを確保する中心的な要素であり、さらには、そうした遺伝子間領域が、転写産物の安定性を制御することによって遺伝子発現に影響を及ぼすと考えられることによるものである。さらに、コンストラクトをゲノムに組み込むために、ＤＮＡ断片の末端は、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅのｒＤＮＡ遺伝子座（ｓｓｕ）と相同的な領域（６００～１０００ｂｐ）を含む（国際公開公報第ＷＯ２０１９／００２５１２Ａ２号の図３４を参照のこと（当該文献は、その全体が参照によって組み込まれる））。
２断片バージョンも同じ遺伝エレメントを含むが、これらの遺伝エレメントは２つのＤＮＡ断片にまたがって分布する。断片Ｐ１（ｐＬＭＴＢ５０２４）は、軽鎖のコード配列及び重鎖のコード配列、ならびにこれらのＣＤＳの上流に位置する遺伝子間領域を含む。この断片の５’末端は、ｓｓｕ遺伝子座への組み込みのための相同組換え部位を含む。重鎖ＣＤＳの最後の２５０ｂｐ（Ｐ１コンストラクトの３’末端）は、第２の断片（Ｐ２；ｐＬＭＴＢ５０２５）の最初の２５０ｂｐと同一の配列を有することで、これら２つの断片の間でそれらの同一配列を介して相同組換えを起こすことが可能である。さらに、Ｐ２は、重鎖の下流に位置する遺伝子間領域（ＣａｍＩＲ）、選択マーカー（ｎｔｃ）、ｎｔｃの下流に位置する別の遺伝子間領域（３’ＵＴＲ＝ｄｈｆｒ－ｔｓ）、及びｓｓｕ遺伝子座への組み込みのための３’相同組換え部位を含む（図１Ａ）。
これらの異なるコンストラクト（ＳｗａＩで直鎖化されたｐＬＭＴＢ５０２６またはＳｗａＩで直鎖化されたｐＬＭＴＢ５０２４＋ｐＬＭＴＢ５０２５、のいずれか）をＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ（Ｓｔ１０５６９）にトランスフェクションした（Ｂｉｏｒａｄ ｓｙｓｔｅｍ）。両方のバージョンについて、生存可能な多クローンが得られ、２断片バージョンによって得られたクローンのウエスタンブロット分析においても、軽鎖特異的抗体または重鎖特異的抗体を用いた検出で顕著なモノクローナル抗体発現が見られた（図１Ｂ）。このことは、いくつかのＤＮＡ断片からの発現コンストラクトの形成が実行可能であることを実証するものである。
６．２ 実施例２
内在性Ｍａｎ３をＧ２ Ｎ－グリカンへと変換するための４つの異なるグリコシルトランスフェラーゼ（最初の糖鎖修飾改変ステップを担うための機能的に重複する２つの酵素（ＳｆＧｎｔ１及びｄｒＭＧＡＴ１）ならびにさらなる伸長によってＮ－グリカン「Ｇ２」を得るためのｒｎＭＧＡＴ２及びｈｓＢ４ＧａｌＴ１）（国際公開公報第ＷＯ２０１９／００２５１２Ａ２号（当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））を発現する細胞株を得るために、１０個のＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことによって形成される発現コンストラクトを野生型Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ（Ｓｔ１０５６９）にトランスフェクションした。これらのＤＮＡ断片は、これまでに導入したコンストラクトと同様に設計したものであり、アセンブリされて得られる合成ポリシストロン中にコード配列を散在させる遺伝子間領域と、知見の多いリボソームＤＮＡ遺伝子座に由来し、逆転組み込みコンストラクトの高レベル発現を支援するＰｏｌＩプロモーター領域と、を用いた。通常、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａでは、タンパク質をコードする遺伝子のほとんどがＰｏｌＩＩによって転写されるため、そうした遺伝子に特異的なプロモーター領域を見つけることは困難であり、アクアポリン遺伝子座についても同様である。断片間の相同組換え、ならびに断片とゲノム上のアクアポリン遺伝子座（ＡＱＰ）との間の相同組換えは、それぞれ２００ｂｐの相同領域及び５００ｂｐの相同領域によって可能にした（図２の上部）。さらに、これらのオーバーラップは、異なるドナープラスミドに由来する直鎖断片の組み合わせによって個々の酵素または遺伝子間領域のモジュール式交換が可能になる様式で設計した。
複数断片の相同組換えのトランスフェクション効率を改善するために、新たなトランスフェクション系（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を旧式の系（ＢｉｏＲａｄ）と並べて試験した。
プラスミド（ｐＬＭＴＢ６８５５、ｐＬＭＴＢ６９５２、ｐＬＭＴＢ６９５８、ｐＬＭＴＢ６８０７、ｐＬＭＴＢ６８４８、ｐＬＭＴＢ６８５２、ｐＬＭＴＢ６８１１、ｐＬＭＴＢ６８６０、ｐＬＭＴＢ６９０６、ｐＬＭＴＢ６８６１）由来の直鎖ＤＮＡ断片を、Ｂｉｏｒａｄ系を使用するトランスフェクション方法１またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ系を使用するトランスフェクション方法２のいずれかによって野生型Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ（Ｓｔ１０５６９）にトランスフェクションした。両方の方法について、生存可能な多クローンが得られた。このことは、分割された選択マーカーの組換えが成功したことを示唆している。
得られた多クローンの操作されたＮ－グリカンを全細胞タンパク質レベルでＲＦ－ＭＳによって分析し（Ｓｔ１５２５７についての例が図２に示される）、最大でＧ２（１６％）までの糖鎖修飾改変が成功することが実証された。このことは、酵素のうちの少なくとも３つをカバーする発現コンストラクトがＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅによってアセンブリされたことを暗示している。これによって、糖鎖修飾改変のために複数断片アセンブリをＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅに組み込むことが一般的に実行可能であることが実証された。両方のトランスフェクション方法について、同様の特性を示すクローンが得られ、このことは、適用されるトランスフェクション方法とは無関係にトランスフェクションを実行可能であることを実証している。一方で、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒトランスフェクションによって得られたクローンの増殖速度はＢｉｏＲａｄ系から得られたものと比較してわずかに速く、このことは、トランスフェクション後の細胞生存度が良好であり、したがってトランスフェクション効率が潜在的に良好であることを示唆している。
６．３ 実施例３
これまでにリツキシマブ発現コンストラクトをトランスフェクションした株において内在性Ｍａｎ３からＧ２ Ｎ－グリカンへの変換を達成するために、１０個のＤＮＡ断片が相同組換えを起こすことによって形成される第２の発現コンストラクトをＳｔ１２４２７にトランスフェクションした。このコンストラクトは、４つの異なるグリコシルトランスフェラーゼの発現をコードしており、これら４つの異なるグリコシルトランスフェラーゼは、すなわち、最初のＧｌｃＮＡｃを付加するための機能的に重複する２つの酵素（ＳｆＧｎｔ１及びｄｒＭＧＡＴ１）、ならびにＧ２へのさらなる伸長を達成するためのｒｎＭＧＡＴ２及びｈｓＢ４ＧａｌＴ１である。
プラスミド（ｐＬＭＴＢ６９５０、ｐＬＭＴＢ６９５６、ｐＬＭＴＢ６８０８、ｐＬＭＴＢ６８４９、ｐＬＭＴＢ６８５２、ｐＬＭＴＢ６８１１、ｐＬＭＴＢ６８１６、ｐＬＭＴＢ６８７３、ｐＬＭＴＢ６８５５、ｐＬＭＴＢ６８６１）由来のＤＮＡ断片を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ系を使用するトランスフェクション方法２によってＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ Ｓｔ１２４２７にトランスフェクションした。生存可能な多クローンが得られた。このことは、分割された選択マーカーの組換えが成功したことを示唆している。
得られた多クローンを全細胞タンパク質レベルでＲＦ－ＭＳによって分析し、いくつかの株（Ｓｔ１５３６８）では最大でＧ２（４％）までの糖鎖修飾改変が生じることが実証された。このことは、酵素のうちの少なくとも３つをカバーする発現コンストラクトがＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅによってアセンブリされたことを暗示している。このことは、糖鎖修飾改変のために複数断片アセンブリをＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅに組み込むことが一般的に実行可能であること裏付けるものである。一方で、他のクローンでは最大でＧ０－Ｎまでしか変換が進まず（例えば、Ｓｔ１５４４８）、このことは、コンストラクトの組み込みが不完全であったことを示唆している（図３Ａ）。
Ｓｔ１５４４８株の遺伝組成を評価するためにｇＤＮＡを調製し（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＣＢ１００）、２つのＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴセルでのＰａｃＢｉｏロングリードゲノムシークエンシング（ｖ２．１ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ライブラリー調整は製造者の指定に従った）に供した。グリコシルトランスフェラーゼｄｒＭＧＡＴ１のコード配列及びグリコシルトランスフェラーゼＳｆＧｎｔ１のコード配列（これらの酵素は両方共、Ｍａｎ３への最初のＧｌｃＮＡｃの付加を触媒する）のみを含むコンストラクトが組み込まれたことで組み込みが不完全になっていたことが、ロングサブリードのいくつかによって示された。したがって、得られたシークエンシングデータは、観察されたＮ－グリカンプロファイル表現型と一致するものである。このデータは、３１番染色体上のＡＱＰ遺伝子座へのコンストラクトの３’末端の組み込みは正しく生じた一方で、ＡＱＰへの５’末端組み込みが生じる代わりに遺伝子間領域Ｐｆｒ ＩＲ（天然のＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ配列約２Ｋｂ）が２９番染色体上の内在性のＰｆｒ発現遺伝子座と組換わったことによって組み込みが不完全なものとなったことをさらに支持するものである。これによって、染色体交叉（図３Ｂ）が創出された。これ以外にも、天然の２９番染色体及び３１番染色体も検出され、これらの染色体は二倍体形態で存在する可能性が最も高い（図３Ｃにデータを表す模式図が示される）。
こうしたシークエンシングデータは、所期の組み込み遺伝子座よりも、誤った相同組換えが優先して生じたことを示す。このことは、Ｐｆｒ遺伝子間領域が長く（約２Ｋｂ）、天然の遺伝子座と１００％同一であるという事実、及びＡＱＰ遺伝子座が染色体のテロメアに非常に近いという事実によって促進された可能性がある。
あるコンストラクトで明らかにされた別の例は、断片間で相同性を有する区間を設けることは回避すべきであるという仮説を裏付けるものである。この別の例では、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１－Ｓｔｒｅｐ、ｈｓＭＡＧＴ１－３×ＨＡ、及びｒｎＭＧＡＴ２－３×ＨＡをＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ野生型バックグラウンドにトランスフェクションした（Ｓｔ１０５６９＋ｐＬＭＴＢ６９４６、ｐＬＭＴＢ６９５１、ｐＬＭＴＢ８０８０、ｐＬＭＴＢ８０８１、ｐＬＭＴＢ８０８２、ｐＬＭＴＢ８０８３、ｐＬＭＴＢ８０８５、ｐＬＭＴＢ６９２４）。得られたＳｔ１６８３４株では、ｈｓＭＧＡＴ１の活性はほぼ検出不可能であり、これに加えてＭＧＡＴ２活性は完全に不在であった（Ｍ３ ７８％、Ｇ０－Ｎ １１％、及びＧ１－Ｎ １１％）。Ｎａｎｏｐｏｒｅ技術を用いたロングリードシークエンシングからは、ｒｎＭＧＡＴ２－３×ＨＡを運ぶ２つの断片がゲノム遺伝子座に組み込まれていなかったことが明らかになり、この理由は、２つの近接するグリコシルトランスフェラーゼの両方が３×ＨＡタグを有しており、当該タグ領域のヌクレオチド配列が１００％同一であったことによるものである。このことは、相同組換えが生じるには９３ｂｐの区間で十分であることを実証するものである（図４）。
６．４ 実施例４
これまでの例は、異なる組み込み用断片の間で相同的な配列を使用すること、ならびにそうした断片とＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅゲノムとの間で相同的な配列を使用することによって望ましくない相同組換えが生じ得ることを示唆するものであった。一方で、このことは、特定のＮ－グリカン変換ステップ向けに遺伝子使用数を増やす場合、グリコシルトランスフェラーゼのコドン多様化バリアントまたはホモログを使用することの必要性を示すものである。他方で、この知見は、これまで成功裏に試験した遺伝子間領域を反復使用することを禁じるものでもある。Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅにおけるスプライシング及びｍＲＮＡ安定性のための正確なシグナルに関するデータは利用不可能であるため、合成遺伝子間領域を設計することは、現在のところ実現不可能である。この制限を克服するため、他のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種に由来する遺伝子間領域、ならびに異なるグリコシルトランスフェラーゼのさまざまなコドン使用バリアント及び異なるホモログを使用する新たなＤＮＡ断片セットを設計した。
相対発現転写産物レベルが高いことが示されたＬ．ｍａｊｏｒ遺伝子（Ｒａｓｔｒｏｊｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４，ｐ．２２３）に対するホモログを探すことによって、高度に発現すると考えられるＬ．ｍｅｘｉｃａｎａ由来遺伝子、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ由来遺伝子、及びＬ．ｉｎｆａｎｔｕｍ由来遺伝子を同定した。こうした遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、高いタンパク質発現レベルを支援するものになると考えられる（Ｍｕｒｒａｙ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １５３（２），ｐｐ．１２５－１３２）。望ましくない相同組換えが生じる可能性を最小化するために、互いの同一性が８０％を超える配列（ｃｄ－ｈｉｔ（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２（１３），ｐｐ．１６５８－１６５９）を使用した場合）及びＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅゲノムと同一の３０ｂｐ超の区間（ｂｌａｓｔｎ（Ｃａｍａｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．（２００９）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １０，ｐ．４２１）を使用した場合）を除外した。
低頻度コドン（頻度＜１０％）を除外しつつＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅのコドン使用頻度に基づいて確率的にコドンを選択するカスタムＰｙｔｈｏｎ３スクリプトを使用してタンパク質配列をヌクレオチド配列へと戻し翻訳した。コドン使用は、アノテーションされたすべてのＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅヌクレオチドコード配列に対してｃｕｓｐ（Ｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ １６（６），ｐｐ．２７６－２７７）を使用して計算されている。
今回もまた、これまでの複数断片相同組換えコンストラクトと同様に、断片間の２００ｂｐのオーバーラップ、及び予測組み込み部位に対する５００ｂｐの相同領域を含めることで、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａでの断片のアセンブリが可能になるようにした。新たな組み込み遺伝子座を設計し、いずれも「直列組み込み」手法において使用した（図５の下部）。この手法では、高度発現遺伝子または複数コピー遺伝子（アルファチューブリン（ａＴｕｂ）など）のコード配列と５’ＵＴＲとの間に新たなコンストラクトが組み込まれる。この場合、追加のプロモーター領域（ＰｏｌＩ）がコンストラクトに含められることはないため、組み込みコンストラクトの最初のコード配列のＰｏｌＩＩ介在性の転写は標的遺伝子座の内在性ＩＲによって制御されることになる。結果的に、組み込みコンストラクトはその３’末端が遺伝子間領域で終結する必要があり、この遺伝子間領域によって、コンストラクトの最後のＣＤＳと標的遺伝子座の内在性遺伝子との間に間隔ができる。代替的には、「破壊的組み込み」手法において新たな遺伝子座が使用される（図５上部）。この手法では、標的遺伝子のＣＤＳが組み込みコンストラクトに置き換えられる。ＬｅｉｓｈｍａｎｉａでのＲＮＡ ＰｏｌＩによる転写効率の高さを利用するために、この組み込み手法を、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ由来のＰｏｌＩプロモーター領域の使用及び逆転組み込みと併用することが可能である。逆転組み込みを行うことで、通常はＰｏｌＩＩによって転写される隣接遺伝子の転写のアンバランス化が回避されることになる（図５）。
異なる種に由来するＩＲがグリコシルトランスフェラーゼの発現を支援する能力を試験するために、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ方法を用いて一連の４つの異なるトランスフェクションを実施した。ここでは、グリコシルトランスフェラーゼ、選択マーカー、ならびに組み込み遺伝子座（示される例ではＧＰ６３遺伝子座が標的である）を不変とし、遺伝子間領域のみを変えた。適合性が特定の種（Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）に限られるかどうかを明らかにするために、各トランスフェクションコンストラクトにおいて同じ種に由来する４つの異なるＩＲを組み合わせた。Ｓｔ１７２１２については、これらの断片は、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８２３５、ｐＬＭＴＢ８２５０、ｐＬＭＴＢ８２９５、ｐＬＭＴＢ８２９７、ｐＬＭＴＢ８３０１、ｐＬＭＴＢ８３０２、ｐＬＭＴＢ８３０３、ｐＬＭＴＢ６９３３から得た。Ｓｔ１７３１１については、これらの断片は、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８２３５、ｐＬＭＴＢ８２５０、ｐＬＭＴＢ８３０６、ｐＬＭＴＢ８３０７、ｐＬＭＴＢ８３１０、ｐＬＭＴＢ８３１１、ｐＬＭＴＢ８３１２、ｐＬＭＴＢ６９３３から得た。Ｓｔ１７１７６については、これらの断片は、ｐＬＭＴＢ８２５０、ｐＬＭＴＢ８３３４、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８３３５、ｐＬＭＴＢ８２３５、ｐＬＭＴＢ８３３６、ｐＬＭＴＢ８３２８、ｐＬＭＴＢ８３３０、ｐＬＭＴＢ６９３３から得た。Ｓｔ１７１８０については、これらの断片は、ｐＬＭＴＢ８２５０、ｐＬＭＴＢ８３２２、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８３２３、ｐＬＭＴＢ８２３５、ｐＬＭＴＢ８３２４、ｐＬＭＴＢ８３１６、ｐＬＭＴＢ８３１８、ｐＬＭＴＢ６９３３から得た。
すべてのトランスフェクションにおいて、５０ｍｌの振とうフラスコ培養において増殖する生存可能なクローンを得ることに成功し、これらのクローンをＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅの表面タンパク質画分のＮ－グリカン分析に供した（Ｓｔ１７２１２＝ＬｍＩＲ、Ｓｔ１７３１１＝ＬｄＩＲ、Ｓｔ１７１７６＝ＬｉＩＲ、Ｓｔ１７１８０＝ＬｍｘＩＲ；図６Ａ）。これらのＮ－グリカンプロファイルから、４つすべてのトランスフェクションがほぼ成功であることが実証された。この成功の判断理由は、Ｌ．ｍａｊｏｒ由来のＩＲを含むバリアント、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ由来のＩＲを含むバリアント、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ由来のＩＲを含むバリアントでは変換が最大でＧ２まで進行し、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ ＩＲを含むバリアントでは、少なくともＧ１－Ｎが検出されたことによるものである（図６Ａ）。このことは、４つすべてのＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種に由来する遺伝子間領域がＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅでの組換えグリコシルトランスフェラーゼの発現支援に使用可能であり、これによって宿主細胞の機能を完全にカスタマイズすることが可能であることを実証するものである。ほとんどのＧＴの活性が検出可能であったことは、使用したＩＲの大多数が機能性であり、わずか少数のＩＲ、すなわちＳｔ１７１７６でのＭＧＡＴ２発現を支援するＩＲのみが非効率的であったことを示唆している。利用可能なデータに基づいて５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの寄与を明確に区別することは不可能であるため、「非機能性」ＩＲを明瞭に特定することは不可能である。さらに、異種コード配列が配列介在性のｍＲＮＡ安定性に寄与する可能性もある。
一方で、観察されるＮ－グリカンプロファイルが分析株で大きく異なったことは、遺伝子間領域がそれと隣接する遺伝子の発現レベルに実際に影響を及ぼすという仮説をさらに裏付けるものである。
組み込みの正しさを実証するために、Ｓｔ１７３１１、Ｓｔ１７２１２、及びＳｔ１７１８０についてＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシングを実施し、すべての試験コンストラクトの組み込みが正しいことが確認された（図６Ｂ）。
次に、こうした複数断片組み込みを１つの株内で複数組み合わせることで糖鎖修飾改変活性が改善され、Ｎ－グリカン変換の均一性が向上するかどうかを評価した。このために、プラスミド（ｐＬＭＴＢ８２５３、ｐＬＭＴＢ８３１３、ｐＬＭＴＢ８３１４、ｐＬＭＴＢ８２３６、ｐＬＭＴＢ８３１５、ｐＬＭＴＢ８２５５、ｐＬＭＴＢ８２５９、ｐＬＭＴＢ６９４０、ｐＬＭＴＢ８３７９）由来の直鎖化ＤＮＡ断片をトランスフェクションしてアダリムマブ発現株（Ｓｔ１５４４９）のアルファチューブリン遺伝子座を標的とすることによってＳｔ１７２３８を創出した。次に、第２のトランスフェクションでは、プラスミド（ｐＬＭＴＢ８３８９、ｐＬＭＴＢ８３０１、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８３０２、ｐＬＭＴＢ８２３５、ｐＬＭＴＢ８３０３、ｐＬＭＴＢ８２９５、ｐＬＭＴＢ８２９７、ｐＬＭＴＢ８３９２）由来の９断片コンストラクトをｐｆｒ遺伝子座に組み込んでＳｔ１７２９４を得た。最後に、プラスミド（ｐＬＭＴＢ８２４７、ｐＬＭＴＢ８２８５、ｐＬＭＴＢ８２３７、ｐＬＭＴＢ８２８６、ｐＬＭＴＢ８２３８、ｐＬＭＴＢ８２８７、ｐＬＭＴＢ８３８３、ｐＬＭＴＢ８２８２、ｐＬＭＴＢ６９３６）から得たＤＮＡ断片をＳｔ１７２９４にトランスフェクションしてＧＰ６３遺伝子座に第３のＧＴ発現コンストラクトを組み込んだ。得られたＳｔ１７８２６株とその前身株との、表面タンパク質のＮ－グリカン分析による比較は、ＧＴ活性が段階的に上昇した結果、最終株ではほぼ均一なＧ２ Ｎ－グリカン（８８％）が得られたことを示している（図７）。このことは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａゲノムへの複数の酵素コピーの組み込みを達成する上でこの複数断片組み込み法が有用であり、異なる種（ここでは：ｈｓ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ｒｎ，Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ｄｒ，Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、ｇｊ，Ｇｅｋｋｏ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、ａｇ，Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）に由来するコドン多様化酵素ならびにホモログを使用することによってグリコシルトランスフェラーゼのコピー数の増加を達成できることを裏付けるものである。
まとめると、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅにおいて複数の相同組換え事象を正しく生じさせることを可能にするために、他のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種に由来する異種遺伝子間領域を使用することで、宿主細胞を部位特異的に操作することに成功した。さらに、制御エレメントを含むこうした異種遺伝子間領域は、異種コード配列のスプライシング及び発現を導く上で十分なものであった。
６．５ 実施例５
最大で１０個のＤＮＡ断片による複数の組換え事象を正しく生じさせることに非同一異種配列を使用することに成功したため、１３個のドナー断片に由来する遺伝エレメントを使用することによって、さらに大きな染色体組み込みクラスターを生成させることを試験した。重要なことは、Ｎ－グリカンのシアリル化操作（国際公開公報第ＷＯ２０１９／００２５１２Ａ２号（当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））に必要なシアル酸生成能力を付与する発現コンストラクトを、ガラクトシル化能力を有する現存株Ｓｔ１７３１１（実施例４及び図６Ａに記載のもの）にトランスフェクションすることによって、さらに操作度の進んだ株を引き続き創出したということである。ＤＮＡエレメントを使用することで、直列挿入方針を使用してアルファチューブリン遺伝子座を標的とした。ＮｅｕＣ３×Ｍｙｃ、ＩｒＬｉＨ、ＣｇＮａｌ、ＩｒＬｉＩ、ＮｅｕＢ３×ＨＡ、ＩｒＬｍＲ、３×ＨＡｍｍＳＴ６、ＩｒＬｉＫＮｅｕＡ３×ＨＡ、ＩｒＬｉＬ、ｈｓＣＳＴ３×ｍｙｃ、ＩｒＬｉＭ、及びＳＭ（ｐａｃ）、ならびにＳＭの下流の３’ＵＴＲを含めた所期の発現カセットを、ｐＬＭＴＢ８４４３、ｐＬＭＴＢ８５２８、ｐＬＭＴＢ８４４８、ｐＬＭＴＢ８５２９、ｐＬＭＴＢ８５０９、ｐＬＭＴＢ８５０７、ｐＬＭＴＢ８５０５、ｐＬＭＴＢ８５３１、ｐＬＭＴＢ８４４９、ｐＬＭＴＢ８５３２、ｐＬＭＴＢ８５１７、ｐＬＭＴＢ８５２０、ｐＬＭＴＢ６９３９から切り出した１３個のドナー断片をＳｔ１７３１１にトランスフェクションすることによって宿主細胞に挿入した（図８Ａ）。得られたＳｔ１７５２７株を、１）産生されたＮｅｕ５Ａｃ及びＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡｃをＤＭＢで標識化することによってその表現型について（図８Ｂ）、及び２）その操作されたＮ－グリカンについて（図８Ｃ）さらに分析した。標準曲線（非掲載）に基づいて計算したところ、Ｓｔ１７５２７のＮｅｕ５Ａｃ産生濃度は０．４９ｎｍｏｌ／ＯＤであり、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ産生濃度は０．１７ｎｍｏｌ／ＯＤであった。さらに、タンパク質と結合したＮ－グリカンには顕著な量のシアリル化Ｎ－グリカンが見られ、総計１１．６％がシアリル化グリコフォームであった（図８Ｃ）。これらの結果は、糖鎖修飾改変経路が完全に機能していることを実証するものであり、このことは、遺伝情報が完全にＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ宿主細胞に挿入されたことを示している。このことは、ＰａｃＢｉｏシークエンシングによって最終的に確認され、これによって、完全に機能カスタマイズされたＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ宿主細胞が適用遺伝系から成功裏に生成されたことが明確に示された。
６．６ 実施例６
実施例３に既に示したように、副鞭毛桿タンパク質１Ｄ（Ｐｆｒ）の天然の発現部位へ組み込みは望ましくないものであったが、この組み込みが生じたことで、組み込まれたコンストラクトの高発現が支援されたように思われた。こうしたことがあったため、非破壊的「直列」組み込み様式で上記遺伝子座を意図的に標的とすることでも、（実施例４と比較して）高レベル発現が生じることになるかどうか、及びＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅｒ ＤＮＡ遺伝子座（「ｓｓｕ」）由来の発現にどの程度匹敵するかを評価した。さらに、ｒＤＮＡ遺伝子座への異なる型の組み込みも試験した。この組み込みでは、５’組み込み部位をｒＤＮＡ遺伝子座の転写開始部位に向けて１８Ｓ（ｓｓｕ）コード配列の開始部位まで１４１ｂｐ動かした。この部位（「Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ」）への組み込みについては、タンパク質発現コンストラクトに人工スプライスリーダーアクセプター部位を備え付けることで、プロセシングが正しく確実に生じるようにした（図９Ａ）。３’組み込み部位は、「ｓｓｕ」遺伝子座の場合のものと同じままとし、したがってｓｓｕ発現領域の１つを同じく破壊するものとした。
ｐＬＭＴＢ８３８９、ｐＬＭＴＢ８３０１、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８６２９、ｐＬＭＴＢ８２３８、ｐＬＭＴＢ８２８７、ｐＬＭＴＢ８３８３、ｐＬＭＴＢ８２８２、ｐＬＭＴＢ８８２２（Ｓｔ１８３３２用）、ｐＬＭＴＢ９２９９、ｐＬＭＴＢ８３０１、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８６２９、ｐＬＭＴＢ８２３８、ｐＬＭＴＢ８２８７、ｐＬＭＴＢ８３８３、ｐＬＭＴＢ８３８４、ｐＬＭＴＢ８９９４（Ｓｔ１８６２１用）、またはｐＬＭＴＢ８２２３、ｐＬＭＴＢ８３８１、ｐＬＭＴＢ８３０１、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８６２９、ｐＬＭＴＢ８２３８、ｐＬＭＴＢ８２８７、ｐＬＭＴＢ８３８３、ｐＬＭＴＢ８２８１、ｐＬＭＴＢ９３０４、のいずれかをトランスフェクションすることによって野生型Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ株の３つの異なる遺伝子座へと、Ｇ０グリコフォームへとＮ－グリカンを変換するための糖鎖修飾改変コンストラクト（３つのＭＧＡＴ１オルソログ（ｄｒＭＧＡＴ１、ｇｊＭＧＡＴ１、及びａｇＭＧＡＴ１）ならびに１つのＭＧＡＴ２オルソログ（ｄｒＭＧＡＴ２）をコードする）をトランスフェクションした。これらの組み込みの効率を、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ表面糖タンパク質から遊離させたＮ－グリカンのプロファイルを比較することによって比較した。３つの組み込みのすべてにおいてＧ０への変換が高レベルで生じた。２つのｓｓｕ遺伝子座バリアントへの組み込みではＧ０率９９％が区別不可能に達成され、新たな「Ｐｆｒ」遺伝子座への組み込みでは、Ｇ０ Ｎ－グリカン率は９２％となった（図９Ｂ）。得られた細胞株の生存能、増殖能、または生産性に有意差は見られなかった。したがって、「Ｐｆｒ」遺伝子座は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａの新たな高発現遺伝子座である。
ｓｓｕ遺伝子座に対する２つの組み込みバリアント（「Ｓｓｕ」対「Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ」（図９Ａを参照のこと））の間に差異が存在するかどうかをさらに評価するために、ＭＧＡＴ１の２つの機能性ホモログ（ｓｆＧＮＴ１、ｄｒＭＧＡＴ１Ｂ）及びラットＭＧＡＴ２の２つのコドン使用バリアントから構成される別のＧ０糖鎖修飾改変コンストラクトをそれぞれの遺伝子座に組み込み、標的タンパク質発現コンストラクトと組み合わせた。この高度に発現するモノクローナル抗体のＦｃ Ｎ－グリカンの立体的な拘束性はより高いものであるため、このＦｃＮ－グリカンの変換は、より厳密な糖鎖修飾改変効率尺度となる。
プラスミド（ｐＬＭＴＢ９３０１、ｐＬＭＴＢ９０７０、ｐＬＭＴＢ８５６８、ｐＬＭＴＢ９０７２、ｐＬＭＴＢ９０８０、ｐＬＭＴＢ９０８２、ｐＬＭＴＢ９０８３、ｐＬＭＴＢ８４６１、及びｐＬＭＴＢ８９９４）由来の直鎖化断片をＳｔ１８３４４にトランスフェクションして「Ｓｓｕ」遺伝子座に組み込み、その後、得られたＳｔ１８６２５株にアダリムマブ発現コンストラクト（ｐＬＭＴＢ６７３７、ｐＬＭＴＢ８６９８、ｐＬＭＴＢ７０８４、ｐＬＭＴＢ６６８１、ｐＬＭＴＢ６６８３）をトランスフェクションすることによってＳｔ１８７０３株を得た。Ｓｔ１９０４２株の生成については、プラスミド（ｐＬＭＴＢ８２２３、ｐＬＭＴＢ８５６４、ｐＬＭＴＢ９０７０、ｐＬＭＴＢ８５６８、ｐＬＭＴＢ９０７２、ｐＬＭＴＢ９０８０、ｐＬＭＴＢ９０８２、ｐＬＭＴＢ９０８３、ｐＬＭＴＢ８４６１、及びｐＬＭＴＢ８９９４）由来の直鎖化断片をアダリムマブ発現株Ｓｔ１８６０７にトランスフェクションしてＧ０コンストラクトを「Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ」遺伝子座に組み込んだ。
これら２つの株から精製したアダリムマブのＦｃ Ｎ－グリカンプロファイルを比較したところ、組み込みバリアント間の差異が明確に示され、この比較は、「Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ」組み込みバリアントの優位性を裏付けるものである（「Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ」組み込みバリアントではＧ０率８７％まで変換が進んだ一方で、Ｓｔ１８７０３で得られたＧ０率は６８％にすぎなかった）（図９Ｃ）。したがって、高レベル変換を達成するためには、「Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ」遺伝子座が最も適した組み込み遺伝子座であるが、「Ｐｆｒ」遺伝子座を標的とするか、または代替的な「Ｓｓｕ」組み込みバリアントによっても、バランスのとれた高レベル発現が達成され得る。
６．７ 実施例７
複数相同組換え法を拡張する機会をさらに探索するために、２５個の異なるドナー断片からアセンブリされる遺伝エレメントのトランスフェクションを試みた。この遺伝モジュールでは、シアル酸生合成経路の酵素（ＮｅｕＣ３×Ｍｙｃ、３×ｆｌａｇｃｇＮａｌ、ＮｅｕＢ３×ＨＡ、ＮｅｕＡ３×ＨＡ、及び３つのＳｐｉｎｖ－Δ８８ＳＴ６コドン使用バリアント）の発現コンストラクトとグリコシルトランスフェラーゼの発現コンストラクトとが組み合わせられる。最大でＧ２までの糖鎖修飾改変を効率化するために、３つのＭＧＡＴ１コピー、３つのＭＧＡＴ２コピー、及び２つのｈｓＢ４ＧａｌＴコピーを組み合わせた。この組み合わせは、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１の場合はコドン使用バリアントを使用し、ＭＧＡＴ１及びＭＧＡＴ２の場合は異なる生物に由来するオルソログを使用することによって行った。さらに、このコンストラクトでは、これまでに記載した４つのＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種に由来する１５個の異なる遺伝子間領域を使用して、同じ配列が反復使用されることを回避した。最終的に、選択マーカー（ｐａｃ）、３’ＵＴＲ、ならびにＰｆｒ遺伝子座への直列的な相同組み込みを行うための隣接配列をコンストラクトに含めた。特筆すべきは、この場合、選択マーカーをコンストラクトの末端部に配置することはせず、糖鎖修飾改変用クラスターの間に配置したことである。
このコンストラクトの組み込みについては、プラスミド（ｐＬＭＴＢ８３８９、ｐＬＭＴＢ８３１０、ｐＬＭＴＢ８２３４、ｐＬＭＴＢ８３１１、ｐＬＭＴＢ８２３５、ｐＬＭＴＢ８３１２、ｐＬＭＴＢ８２５４、ｐＬＭＴＢ９２２０、ｐＬＭＴＢ８５２８、ｐＬＭＴＢ８４４８、ｐＬＭＴＢ８５２９、ｐＬＭＴＢ８５０９、ｐＬＭＴＢ９１３１、ｐＬＭＴＢ９１３２、ｐＬＭＴＢ８４４９、ｐＬＭＴＢ９３３９、ｐＬＭＴＢ９３４０、ｐＬＭＴＢ８３３３、ｐＬＭＴＢ８６３６、ｐＬＭＴＢ８３１３、ｐＬＭＴＢ８２３６、ｐＬＭＴＢ８３１４、ｐＬＭＴＢ８３７９、ｐＬＭＴＢ８３１５、ｐＬＭＴＢ９３２０）から切り出した２５個のドナー断片を野生型Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ（Ｓｔ１８３４４）にトランスフェクションした（図１０Ａ）。
得られたＳｔ１８７００株の表現型を、その表面糖タンパク質のＮ－グリカンプロファイリングによって分析した。この株は、Ｎ－グリカンを最大でＧ２Ｓ２にまで変換する能力が非常に高いことが明らかとなり、ガラクトシル化Ｎ－グリカン種の割合は９０％となり、シアリル化Ｎ－グリカンの割合は総計４３％となった（図１０Ａ）。このことは、糖鎖修飾改変経路が完全に機能したことを示唆しており、このように判断する理由は、これまでは表面グリカンのガラクトシル化率を９０％近くにすることは、異なる発現遺伝子座において２つのガラクトシルトランスフェラーゼ含有モジュールを組み合わせることによってのみ達成可能であったことによるものである（図７との比較）。また、得られた細胞株（Ｓｔ１９３８４（以下を参照のこと））のロングリードシークエンシングを行うことによって、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅにおいて２５個の個別断片からアセンブリされた３０ｋｂｐのコンストラクトが完全かつ正しく組み込まれていることが確認された。このことは、多数のＤＮＡ断片の相同組換えを伴う本発明の新規のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞組換え操作方法が高い潜在力を有していることをさらに明確に示すものである。
次に、得られた株を、Ｇ２Ｓ２への変換を改善することを目的として、２つの追加の糖鎖修飾改変コンストラクトを組み込むことによってさらに改変した。最初に、プラスミド（ｐＬＭＴＢ８３９１、ｐＬＭＴＢ８２８５、ｐＬＭＴＢ８２３７、ｐＬＭＴＢ８２８６、ｐＬＭＴＢ８２３８、ｐＬＭＴＢ８２８７、ｐＬＭＴＢ８３８３、ｐＬＭＴＢ８２８１、及びｐＬＭＴＢ８８２１）由来の直鎖化挿入断片をＳｔ１８７００にトランスフェクションした。これらの直鎖化挿入断片は、異なるｈｓＢ４ＧａｌＴ１コドン使用バリアント、ｒｎＭＧＡＴ２コドン使用バリアント、及び異なる生物に由来する２つの追加のＭＧＡＴ１オルソログを含む別の糖鎖修飾改変モジュールを構成するものである。この改変によって、得られたＳｔ１９０８４株の表面Ｎ－グリカンプロファイルにおけるＧ２が著しく増加した（図１０Ｂ）。
こうしたＮ－グリカン種のシアリル化を改善するために、Ｍａｎ３から高度修飾Ｎ－グリカンバリアントへの変換を強化するためのｓｆＧＮＴ１、機能性ＭＧＡＴ１ホモログ、ならびにゼブラフィッシュ由来の追加のＭＧＡＴ１コドン使用バリアント及びラット由来の追加のＭＧＡＴ２コドン使用バリアントを含む追加の糖鎖修飾改変モジュールをＳｔ１９０８４にトランスフェクションした。さらに、このモジュールには、シアル酸の活性化及びタンパク質アクセプターへのシアル酸の転移を改善するためのシアリルトランスフェラーゼＳＴ６の別のオルソログ、ｓｔｒｅｐＣＭＡＳ、及びシアル酸トランスポーターＣＳＴも含めた。このトランスフェクションについては、プラスミド（ｐＬＭＴＢ８２２３、ｐＬＭＴＢ８５６４、ｐＬＭＴＢ８５６７、ｐＬＭＴＢ８５６８、ｐＬＭＴＢ８８２３、ｐＬＭＴＢ８５９９、ｐＬＭＴＢ９４８６、ｐＬＭＴＢ８４８８、ｐＬＭＴＢ８４４７、ｐＬＭＴＢ８４９０、及びｐＬＭＴＢ９２０５）由来の直鎖化断片を親株にトランスフェクションしてＳｔ１９３８４株を得た。この場合、２つのプラスミド（８２２３及び９２０５）は代替の制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＳｍｉＩまたはＢｇｌＩＩ＋ＳｍｉＩ）で切断して所望の相同組換え用オーバーハングを創出する必要があった。このトランスフェクションによって、表面糖タンパク質から遊離させたＮ－グリカンのシアリル化率は高いものが得られ、Ｇ２Ｓ２率は７４％であった（図１０Ｂ）。
前述の糖鎖修飾改変モジュールのすべてが、この高度修飾株に正しく組み込まれたかを確認するために、Ｓｔ１９３８４から高分子量ｇＤＮＡを調製し、Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングに供した。これによって、３つの糖鎖修飾改変モジュールが標的遺伝子座に正しく組み込まれていたことが確認できた。
この例は、引き続きの一連の操作のそれぞれにおいて、複数の相同組換え事象を起こすための本明細書に記載の手法によるＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅの遺伝的改変が高い潜在力を有することを究極的に実証するものである。ＭＧＡＴ１の７つのオルソログまたは機能性ホモログ、ＭＧＡＴ２の５つのオルソログまたはコドン使用バリアント、ｈｓＢ４ＧａｌＴ１の３つのコドン使用バリアント、ＳＴ６の４つのコドン使用バリアントまたはオルソログ、及びシアル酸生合成経路の６つの酵素から構成される３つの異なる糖鎖修飾改変モジュールを確立するために、全部で４５個の直鎖化断片を細胞にトランスフェクションした。このようにして、これまでの実施例に詳細に記載したように、コンストラクトのコード領域中ならびに非コード領域中に同一の配列が反復することを回避することで、望ましくない組換えを伴わずにＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を広範に改変することが可能である。
前述のもののような広範な株操作の再現性の確認は、Ｓｔ２０１５７株、Ｓｔ２０２０８株、及びＳｔ２０２２４株で得られた。これらの株は、３つの糖鎖修飾改変コンストラクトならびにＯ－グリコシル化ノックアウト（本明細書と出願日が同じ「Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ Ｃｅｌｌｓ」と題する国際出願を参照のこと）をそれぞれが含み、共通の親株であるＳｔ１９０８４から得られたものである（図１０Ｃ）。
６．８ 実施例８
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅにおけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコスミドでのハイブリッド原核生物遺伝子クラスターのアセンブリ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１莢膜多糖を脂質結合型糖鎖（ＬＬＯ）としてＥ．ｃｏｌｉで組換え発現させるには１０個の外来遺伝子が必要である。７つの遺伝子は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいてクラスターとして存在しており、３つの遺伝子はそのゲノム中の他の場所に存在する。これら３つの遺伝子はそれらのオルソログが原核生物に広く存在していることから、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ Ｏ１７（Ｅ．ｃｏｌｉの近縁種）由来の遺伝子を選択した。この選択理由は、これらの遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで組換え発現させた場合、それらの機能が優れていることが他で明らかとなったことによるものである。
この実験の目的は、自体の末端同士で相同性を共有するＤＮＡ断片をアセンブリするＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ組換え機構の能力を利用することによってＥ．ｃｏｌｉ適合性コスミドｐＬＡＦＲ１（Ｖａｎｂｌｅｕ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００４）ＤＮＡ Ｓｅｑ １５（３）：２２５－２２７）にクローン化された機能性ハイブリッドクラスターを得ることである。ｐＬＡＦＲ１は、その選択のためのテトラサイクリン耐性を含むと共に、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ向けの広範囲複製起点を含む。ｐＧＶＸＮ７７５はｐＬＡＦＲ１の派生物であり、この派生物には、マルチクローニングサイト、構成的プロモーターＪ２３１１４（Ａｎｄｅｒｓｏｎ収集物）、及び転写ターミネーターが導入されている。ＡｓｉＳＩ及びＸｈｏＩによってｐＧＶＸＮ７７５を直鎖化すると、構成的プロモーターとターミネーターとの間にＤＮＡ断片を挿入することが可能である。
図１１Ａに記載のように１１個の断片を設計した。これらの断片の合成はＧＥＮＥＷＩＺ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨで実施した。この設計には以下の側面が考慮されている：ａ）合成速度を向上させるために断片の長さは２０００ｂｐを超えるべきでないこと、ｂ）相同組換え効率を最適化するために断片間のオーバーラップならびに断片とベクターとの間のオーバーラップを２００ｂｐとすること。
必要な５’制御エレメント及び３’制御エレメントと一緒に遺伝子クラスターの３’側に挿入されるべき選択マーカー（Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅで使用可能）を含むように最終コンストラクトを設計した。この選択マーカー遺伝子、すなわち、ストレプトスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｓａｔ）（ノーセオスリシン（ＮＴＣ）に対する耐性を付与する）は２つの断片に分かれているため、組換えが生じたときにのみインタクトなものとなる。選択マーカーカセットはその切除用の制限酵素ＢｓｉＷＩ認識部位と隣接している。
２つの組換えセットを実施した。１つのセット（「ｐＬＡＦＲ＿Ｓｐ１」セットと呼ぶ）については、生合成経路に必要な１０個の遺伝子、及び選択マーカーカセットが９つの断片に分かれており、組換えによってｐＧＶＸＮ７７５に組み込まれる。挿入断片の全サイズは１４７８９ｂｐである。産物は、Ｅ．ｃｏｌｉをＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１ ＬＬＯ産生株へと変えることが可能なものとなる。第２のセット（「ｐＬＡＦＲ＿ＳＭ」セットと呼ぶ）は、選択マーカーカセットが２つの断片に分かれてており、組換えによってｐＧＶＸＮ７７５に組み込まれる対照方針である。挿入断片の全サイズは２９５６ｂｐである。
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ Ｓｔ１０５６９において３つの異なるトランスフェクションを実施した。表２に、これらのトランスフェクションのまとめが示される。すべてのトランスフェクションについて、Ｂｉｏｒａｄのトランスフェクション法に従った。トランスフェクション＃１では、ＡｓｉＳＩ－ＸｈｏＩで直鎖化したｐＧＶＸＮ７７５及び「ｐＬＡＦＲ＿Ｓｐ１」に必要な９つの断片を細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクション＃２は、標的ベクターが直鎖化されていない点がトランスフェクション＃１と異なる。トランスフェクション＃３では、直鎖化されていないｐＧＶＸＮ７７が「ｐＬＡＦＲ＿ＳＭ」セットに必要な２つの断片と共に同時トランスフェクションされている。
製造者の説明に従ってＤｒｅａｍＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してコロニーＰＣＲによって増殖培養物を分析した。ＰＣＲ Ａでは、オリゴヌクレオチドｏ４９４９及びｏ４９７８が使用され、ＰＣＲ Ａは溶解の陽性対照である。ＰＣＲ Ｂでは、オリゴヌクレオチドｏ２２９及びｏ６７７５が使用され、ｐＧＶＸＮ７７５と挿入された「ｐＬＡＦＲ＿Ｓｐ１」セットの５’部分との間の共通部分が増幅される。ＰＣＲ Ｃでは、オリゴヌクレオチドｏ２２８及びｏ６０４５が使用され、挿入された「ｐＬＡＦＲ＿Ｓｐ１」セットの３’部分とｐＧＶＸＮ７７５との間の共通部分が増幅される。ＰＣＲ Ｄでは、オリゴヌクレオチドｏ６５１７及びｏ６５２１が使用され、「ｐＬＡＦＲ＿Ｓｐ１」セットの内部配列が増幅される。ＰＣＲ Ｅでは、オリゴヌクレオチドｏ５９７６及びｏ６７７６が使用され、挿入された「ｐＬＡＦＲ＿ＳＭ」の３’部分とｐＧＶＸＮ７７５との間の共通部分が増幅される。トランスフェクション＃１及び２＃から得られた細胞にはＰＣＲ Ａ、ＰＣＲ Ｂ、ＰＣＲ Ｃ、ＰＣＲ Ｄを適用し、トランスフェクション＃３から得られた細胞にはＰＣＲ Ａ及びＰＣＲ Ｅを適用した。すべての適用ＰＣＲが予想産物バンドを与える場合に多クローンは陽性と定義される。表２には、トランスフェクション当たりの陽性多クローンの数が報告される。
トランスフェクション＃１から得られた８つのＰＣＲ陽性Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ多クローン（多クローン１．１、多クローン１．２、多クローン１．３、多クローン１．４、多クローン１．５、多クローン１．６、多クローン１．７、多クローン１．８）、トランスフェクション＃２から得られた３つのＰＣＲ陽性多クローン（多クローン２．１、多クローン２．２、多クローン２．３）、及びトランスフェクション＃３から得られた２つのＰＣＲ陽性多クローン（多クローン３．１、多クローン３．２）から、低コピー数のＥ．ｃｏｌｉプラスミドの単離についての製造者の説明に従ってＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してＤＮＡを単離した。溶出された物質はエピソームＤＮＡ及び染色体ＤＮＡを含む可能性があるものである。このＤＮＡを使用して熱ショックによって化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの形質転換を行った。形質転換コロニーをＬＢ－寒天テトラサイクリンプレート上に播種した。増殖コロニーは、ｐＧＶＸＮ７７５中にコードされるテトラサイクリン耐性カセットを発現可能なものである。多クローン当たり１つの単一コロニーを液体ＬＢテトラサイクリン中に播種し、製造者の説明に従ってＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｐｌａｓｍｉｄキットを使用してプラスミドＤＮＡを単離した。
トランスフェクション＃１及び＃２から得られた多クローンから得られたプラスミドをすべて用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、形質転換したこれらのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を、脂質結合型糖鎖（ＬＬＯ）としてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖を発現する能力について評価した。５ｍＬのＬＢテトラサイクリン培養物を、振とう培養チューブ中、３７℃で一晩増殖させた。ＯＤ値２に相当する体積量を遠心分離し、ペレットをＬａｍｍｌｉ緩衝液中に再浮遊させ、９５℃で１０分間インキュベートし、冷却し、８００ユニット／ｍＬ以上のＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ由来プロテイナーゼＫ（２μＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ４８５０）を添加し、５５℃で１時間インキュベートした後、７０℃で１０分間インキュベートした。１０μＬ（ＯＤ値０．１相当）をＳＤＳ ｐａｇｅ用の４～１２％ビス－トリスポリアクリルアミドゲルにロードした。泳動後、ゲル物質をブロット膜に転写し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖に特異的な抗体で検出した。図１１Ｂには、一部の株に対するウエスタンブロットが示される。表２に示されるように、トランスフェクション＃１については、８つのクローン中８つにおいてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ１型多糖の産生が示され、トランスフェクション＃２については、３つ中１つにおいてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ１型多糖の産生が示された。このグリカンの産生は、アセンブリが正しく生じたことを示す。
アセンブリの正しさ確認すると共に、非産生株を調べるために、標準的な制限酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して制限酵素消化分析を実施した。多クローン１．１、多クローン１．７、多クローン２．１、及び多クローン２．２から得られたプラスミドをＢｓｔＢＩまたはＢｓｉＷＩで個別に消化した。試験したＬＬＯ陽性クローンは、予想した制限酵素消化パターンを示す。トランスフェクション＃２から得られた非産生株（多クローン２．２）も正しいパターンを示すが、その一方で非産生株２．１は陰性パターンを示す（図１１Ｃ）。トランスフェクション３から得られた多クローン３．１及び多クローン３．２についてはＳａｃＩで消化した。選択マーカーカセット挿入で予想されるパターンが観察されている（図１１Ｄ）。この予想パターンは、従来のクローニングによって得られた同一プラスミド（ｐＬＭＴＢ６４１２）との比較から推定したものである。
多クローン１．１及び多クローン２．２から得られたプラスミドを、コスミド全体のプライマーウォーキングサンガーシークエンシングによってさらに調べた。多クローン１．１は、予想される３５０３８ｂｐコンストラクトと１００％の配列同一性を示す。多クローン２．２はでは正しい制限酵素消化パターンが示されたが、活性が存在しなかった。シークエンシングで示された同一性は９９％であり、ＧＧの欠失によってｗｂｚＧでのフレームシフトが生じていることから、多糖の産生が不活化している。多クローン３．２から得られたプラスミドの挿入選択マーカーカセット及びｐＧＶＸＮ７７５とのその共通部分をサンガーシークエンシングによって分析したところ、予想配列との同一性が１００％であることが確認された。
多クローン１．１から得られたプラスミドを、選択マーカーカセットを除去するためにＢｓｉＷＩで消化し、再ライゲーションした。得られたプラスミドは、依然としてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１グリカン産生活性を有している。
９つの断片及び直鎖化ベクターを同時トランスフェクションした場合（トランスフェクション＃１）、分析したプラスミドの１００％において正しい遺伝子アセンブリが達成されていた。環状ベクターでのアセンブリの効率は劣っているように思われるが、ｐＬＡＦＲ＿Ｓｐ１セット（トランスフェクション＃２）を用いることで、３例中１例で表現型陽性が得られ、ｐＬＡＦＲ＿ＳＭセット（トランスフェクション＃３）を用いることで、２例中２例で表現型陽性が得られたことから、適切な制限酵素認識部位が存在しない場合には依然として妥当な選択肢である。
Figure 2023509734000004
７．均等物
本明細書に開示のウイルス、核酸、方法、宿主細胞、及び組成物の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態によって限定されることはない。実際、記載のものに加えて、そうしたウイルス、核酸、方法、宿主細胞、及び組成物のさまざまな改変が、前述の説明及び添付の図から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
本明細書ではさまざまな刊行物、特許、及び特許出願が引用されており、そうしたものの開示内容は、その全体が参照によって組み込まれる。
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Claims (39)

  1. Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の組換え操作方法であって、前記組換え操作方法が、
    （ａ）２つ以上のＤＮＡ断片を前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞に導入すること、及び
    （ｂ）前記ＤＮＡ断片の相同組換えが可能になるように前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞をインキュベートすること、
    を含み、
    前記２つ以上のＤＮＡ断片の第１のＤＮＡ断片が、５’相同領域及び／または３’相同領域を含み、前記５’相同領域が、前記２つ以上のＤＮＡ断片の第２のＤＮＡ断片の３’相同領域と相同的であり、または前記第１のＤＮＡ断片の前記３’相同領域が、前記第２のＤＮＡ断片の５’相同領域と相同的であり、
    前記第１のＤＮＡ断片中及び前記第２のＤＮＡ断片中で前記相同領域（複数可）の外側に位置するヌクレオチド配列が、互いに相同的ではなく、前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではなく、及び／またはそれぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない、前記組換え操作方法。
  2. 前記２つ以上のＤＮＡ断片のそれぞれが、５’相同領域及び／または３’相同領域を含み、前記２つ以上のＤＮＡ断片の前記それぞれの前記５’相同領域が、前記２つ以上のＤＮＡ断片の別の１つの３’相同領域と相同的であり、または前記２つ以上のＤＮＡ断片の前記それぞれの前記３’相同領域が、前記２つ以上のＤＮＡ断片の別の１つの５’相同領域と相同的であり、それぞれのＤＮＡ断片中で前記相同領域の外側に位置する前記ヌクレオチド配列が、互いに相同的ではなく、前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞のゲノム中の配列と相同的ではなく、及び／またはそれぞれのＤＮＡ断片内では相同性を有さない、請求項１に記載の方法。
  3. 前記２つ以上のＤＮＡ断片が、任意選択で前記２つ以上のＤＮＡ断片が互いに組換えを起こした後に、前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体への組み込みに適する、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記２つ以上のＤＮＡ断片が、任意選択で前記２つ以上のＤＮＡ断片が互いに組換えを起こした後に、前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の前記染色体に組み込まれる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記２つ以上のＤＮＡ断片が、副鞭毛桿タンパク質（Ｐｆｒ）遺伝子座に直列に組み込まれる、請求項４に記載の方法。
  6. 前記２つ以上のＤＮＡ断片が、１８Ｓコード領域の開始部位（Ｓｓｕ－ＰｏｌＩ）に組み込まれる、請求項４に記載の方法。
  7. 前記２つ以上のＤＮＡ断片が、互いに組換えを起こす前及び／または起こした後に、前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の染色体に組み込まれない、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記２つ以上のＤＮＡ断片が前記相同組換えを起こすことで環状プラスミドが生じる、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１のＤＮＡ断片中で前記相同領域の外側に位置する前記ヌクレオチド配列の長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記第２のＤＮＡ断片中で前記相同領域の外側に位置する前記ヌクレオチド配列の長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記２つ以上のＤＮＡ断片のすべての中で前記相同領域の外側に位置する前記ヌクレオチド配列の長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド、もしくは２００００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド、または５００００ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ＤＮＡ断片が前記相同組換えを起こすことでヌクレオチド配列が生じ、前記ヌクレオチド配列の長さが、５０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド～１００００ヌクレオチド、１００００ヌクレオチド～１５０００ヌクレオチド、１５０００ヌクレオチド～２００００ヌクレオチド、２００００ヌクレオチド～２５０００ヌクレオチド、２５０００ヌクレオチド～３００００ヌクレオチド、３００００ヌクレオチド～３５０００ヌクレオチド、３５０００ヌクレオチド～４００００ヌクレオチド、４００００ヌクレオチド～４５０００ヌクレオチド、４５０００ヌクレオチド～５００００ヌクレオチド、５００００ヌクレオチド～５５０００ヌクレオチド、５５０００ヌクレオチド～６００００ヌクレオチド、６００００ヌクレオチド～６５０００ヌクレオチド、６５０００ヌクレオチド～７００００ヌクレオチド、７００００ヌクレオチド～７５０００ヌクレオチド、または７５０００ヌクレオチド～８００００ヌクレオチドである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記第１のＤＮＡ断片の前記５’相同領域及び／または前記３’相同領域の長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記第２のＤＮＡ断片の前記５’相同領域及び／または前記３’相同領域の長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記２つ以上のＤＮＡ断片のすべての前記５’相同領域及び／または前記３’相同領域の長さが、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、または５００ヌクレオチドである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記第１のＤＮＡ断片の前記５’相同領域及び／または前記３’相同領域の長さが、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記第２のＤＮＡ断片の前記５’相同領域及び／または前記３’相同領域の長さが、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記２つ以上のＤＮＡ断片のすべての前記５’相同領域及び／または前記３’相同領域の長さが、長くても５００ヌクレオチド、５５０ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、６５０ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、８５０ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、９５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１２００ヌクレオチド、１４００ヌクレオチド、１６００ヌクレオチド、１８００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２２００ヌクレオチド、２４００ヌクレオチド、２６００ヌクレオチド、２８００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド、３２００ヌクレオチド、３４００ヌクレオチド、３６００ヌクレオチド、３８００ヌクレオチド、４０００ヌクレオチド、４２００ヌクレオチド、４４００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド、４８００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチドである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記第１のＤＮＡ断片の前記５’相同領域と前記第２のＤＮＡ断片の前記３’相同領域とが、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記第１のＤＮＡ断片の前記３’相同領域と前記第２のＤＮＡ断片の前記５’相同領域とが、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記２つ以上のＤＮＡ断片が、トランスフェクションによって導入される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記２つ以上のＤＮＡ断片が、同時に導入される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  23. ＤＮＡ断片の数が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記２つ以上のＤＮＡ断片中で前記相同領域の外側に位置する前記ヌクレオチド配列が、遺伝子間領域（ＩＲ）、非翻訳領域（ＵＴＲ）、及びポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる群から選択される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記ＩＲ、前記ＵＴＲ、及び前記ＯＲＦが、それ自体の内部には相同的な配列を有さず、及び／または互いに相同的な配列を有さない、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記２つ以上のＤＮＡ断片中で前記相同領域の外側に位置する前記ヌクレオチド配列が、同じポリペプチドをコードする、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞が、前記同じポリペプチドの複数のコピーを発現する能力を有する、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記方法が、前記ポリペプチドの発現レベルを上昇させる、請求項２６及び請求項２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ＤＮＡ断片が前記相同組換えを起こすことで、前記２つ以上のＤＮＡ断片によってコードされる遺伝情報の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含むヌクレオチド配列が生じる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間で、望ましくない削除及び／または交叉が生じる前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合が、多くとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回の細胞分裂で、望ましくない削除及び／または交叉が生じる前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の割合が、多くとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞がＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅである、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法を使用して組換え操作されたＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
  34. 前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞が、前記方法を反復使用して組換え操作される、請求項３３に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
  35. 前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞がＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅである、請求項３３～３４のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
  36. １つ以上の容器及び使用説明を含むキットであって、前記１つ以上の容器が、請求項３３～３５のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を含む、前記キット。
  37. ポリペプチドの調製方法であって、前記方法が、（ａ）請求項３３～３５のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を、ポリペプチド産生に適した条件の下で培養すること、及び（ｂ）前記ポリペプチドを単離すること、を含む、前記方法。
  38. 前記方法が、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 請求項３７～３８のいずれか１項に記載の方法によって産生されるポリペプチド。
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