JP2023508138A - 炎症性腸疾患を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

炎症性腸疾患を治療するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明では、例えば、RORγt+Th又はRORγt+Treg細胞レベルを監視する工程、及びこれに応じて対象を治療する工程を含む、対象における炎症性腸疾患の進行を診断、治療、及び監視する方法を提供する。

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １，２０２０，Ｖｏｌ．１１７，Ｎｏ．３５，ｐｐ．２１５３６－２１５４５ に、「Ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｔｈ１７／ＲＯＲγｔ▲＋▼ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｓ」について公開
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、NIHにより認められたNIGMS GM108505の下、政府支援により行った。政府は、本発明における一定の権利を有する。
配列表
本出願は、印刷された紙面による複写の代わりにCD-Rにより提出された「冗長な」配列表を含み、この全体を参照により本明細書に組み込む。2019年12月17日に記録された上記CD-Rは、「CRF」、「Copy 1」及び「Copy 2」とそれぞれ標識し、それぞれが、唯一同一である280,467,968バイトのファイル(MS-0006-P2_SL.txt)を含む。
関連出願
本出願では、2019年12月20日に出願された米国特許仮出願第62/951,167号の利点を主張し、この全体を参照により組み込む。
哺乳動物胃腸(GI)管は、通常、共生的バランスで維持される多種多様な微生物群を内包する。微生物集団における微生物間、並びに微生物及び宿主の間の相互作用は、宿主と内部微生物群との両方に影響する。例えば、哺乳動物免疫系の大多数は、GI管に方向づけられる。これは、一部の微生物を排除したり、その他を増殖させたりすることによって、内部微生物群構造に影響し得る。宿主の食餌でさえも、頻繁に新たな微生物を導入するか、一部の微生物に利益をもたらすか、又はその他を阻害することにより、GI微生物群を形成する。
健常なGI微生物叢も宿主に利益をもたらす。これによって、宿主が広範囲の病原体によるコロニー形成に対して抵抗性となり、免疫刺激がもたらされ、健常な腸上皮の維持が促進されて、吸収のための必須栄養素、例えば、ビタミンKが供給され得る。一部の個体では、この共生的バランスが破壊される。このような状態では、微生物機能の破壊が引き起こされ、病原体に対する感受性の増大、自己免疫を生じる炎症性シグナル伝達カスケードの誘導、及び栄養素吸収の破壊が引き起こされ得る。結果的に、GI微生物叢は、多くの疾患及び障害の病態形成における重要な要素である。一部の患者は、正常な腸管微生物叢フローラを破壊する広範囲の抗生物質の使用後に病原体感染に対して更に感受性となる。このような疾患及び障害の多く、例えば、炎症性腸疾患(IBD)は、患者の生活の質を著しく低下させ、最終的に致死的となり得る慢性症状である。
IBDは、クローン病(CD)及び潰瘍性腸炎(UC)を含む多様な腸管障害を説明し、これらはすべて、罹患患者におけるGI免疫応答調節不全及び炎症性シグナル局在化により特徴づけられる。腸内微生物叢を構成する微生物株が、免疫系の形成において重大な役割を果たし、自己免疫、炎症性疾患、及び感染症に対する宿主感受性に結果として影響することが、多数の動物モデルによって示唆される。例えば、K. Atarashiら(2017) Science 358, 359～365; K. Atarashiら(2011) Science 331, 337～341; Ivanov, II,ら(2009) Cell 139, 485～498; A. Chudnovskiyら(2016) Cell 167, 444～456 e414を参照されたい。更に、微生物操作による遺伝的欠陥は、疾患に関係づけられる。L. Jostins,ら(2012) Nature 491, 119～124。
したがって、微生物叢を標的とする介入は、IBDの治療への潜在的経路である。P. Moayyedi,ら(2015) Gastroenterology 149, 102～109; S. Paramsothy,ら(2017), Lancet 389, 1218～1228。最近の研究では、IBDのマーカーとしてGIにおける特定の免疫細胞集団の誘導に着目している。一部の研究では、IBDのマウスモデルにおいてTh17細胞の分化と特定の細菌を相互に関連づけている。Ivanov, II,ら(2008) Cell Host Microbe, 4 (4): 337;及びTan, T.G.,ら(2016) PNAS USA, 113(50): E8141。別の研究では、IgA被覆大腸菌(E. coli)により、クローン病患者の腸において炎症及びTh17蓄積が誘導されることを示す。Viladomiu, M.,ら(2017) Sci Transl Med, 9(376)。Th17細胞の分化に必要とされるサイトカインであるIL-23を阻害する抗体により、クローン病を有する個体において臨床的改善が引き起こされる。Sands,ら(2017) Gastroenterology 153(1):77～86。また、ある研究では、腸内微生物叢によるTh17細胞の誘導によって、腸内病原体からの防御がもたらされることを示した。Ivanov, II,ら、(2009) Cell 139(3): 485。
一免疫シグナルが、罹患した個体においてIBDと相関し得るという示唆が、このような研究によりもたらされるが、IBDと関連する複数の免疫マーカーに基づいてIBDを有する対象を検出、ステージ分類、及び治療するための改善方法の必要性が当技術分野において存在する。また、IBDに罹患した個体のGIにおいて、このような免疫原性シグナルの作用を調節するための治療薬を同定する必要性が存在する。本開示は、IBD疾患と相関し、この進行と関連する、複数の微生物叢誘導T細胞集団を初めて同定することにより、このような必要性を満たす。
K. Atarashiら(2017) Science 358, 359～365 K. Atarashiら(2011) Science 331, 337～341 Ivanov, II,ら(2009) Cell 139, 485～498 A. Chudnovskiyら(2016) Cell 167, 444～456 e414 L. Jostins,ら(2012) Nature 491, 119～124 P. Moayyedi,ら(2015) Gastroenterology 149, 102～109 S. Paramsothy,ら(2017), Lancet 389, 1218～1228 Ivanov, II,ら(2008) Cell Host Microbe, 4 (4): 337 Tan, T.G.,ら(2016) PNAS USA, 113(50): E8141 Viladomiu, M.,ら(2017) Sci Transl Med, 9(376) Sands,ら(2017) Gastroenterology 153(1):77～86 Faithら2014 Geva-Zatorskyら2017 Sefikら2015 Ohnmachtら2015
本開示は、例えば、RORγt+Th又はRORγt+Treg細胞レベルを監視する工程、及びこれに応じて対象を治療する工程を含む、対象における炎症性腸疾患の進行の診断、治療、及び監視に一般に関する。また、本開示は、RORγt+Th細胞の増殖若しくは蓄積を阻害するか、又は免疫若しくは炎症応答を調節するための方法に関する。また、本開示は、RORγt+Treg細胞の増殖若しくは蓄積を誘導するか、又は免疫若しくは炎症応答を調節するための方法に関する。このような方法は、薬物、ワクチン、プロバイオティクス、又は他の手段による胃腸管における、RORγt+Th細胞により生じる炎症の減少又はRORγt+Treg細胞の防御作用の増強を含み得る。診断及び監視は、同定された特定の微生物株と関連する、対象におけるバイオマーカーを追跡することにより達成することができる。
図1A～Jは、IBD関連微生物叢により、ノトバイオートマウスにおいて健常ドナー微生物叢と比較して腸RORγt+Thの誘導が増強されることを示す図である。 図2AからFは、腸FoxP3+Tregの誘導において、健常及びIBD微生物叢によりコロニー形成させたマウス間で有意差がないことを示す図である。 図３A～Fは、健常ドナー微生物叢により、IBD関連微生物叢と比較して腸RORγt+Tregの誘導が特異的に増強されることを示す図である。 図4A～Iは、IBD関連微生物叢により、腸炎重症度の増強が感受性マウスに伝播することを示す図である。 図5A～Bは、RORγt+Treg及びRORγt+Thの恒常的誘導により、実験的腸炎の重症度及びヒト微生物叢ドナーの健康を予測することを示す図である。 RORγt+Treg細胞が、健常ドナー微生物叢によりコロニー形成させた腸炎感受性T細胞移入マウスにおける疾患重症度を低下させるのに必要とされることを示す図である。 図7A～Cは、IBDを有する個体由来のRORγt+Treg低誘導微生物叢を内包するノトバイオートマウスに治療カクテルとして与えた場合、(培養した)ドナー微生物叢により、結腸RORγt+Tregが誘導可能であることを示す図である(左パネルのデータは健常非曝露マウスによる)。 非曝露ノトバイオートマウスにおけるRORγt+Treg及びRORγt+Th(Th17細胞)のヒト微生物叢により誘導された比率により、腸炎感受性T細胞移入マウスにおいて疾患重症度が予測可能であり、ヒトドナーの病状が予測可能であることを示す図である。 図9A～Dは、腸Tヘルパー集団の割合が微生物叢ドナーにより影響されることを示す図である。 図10A～Fは、健常ドナー微生物叢により、IBD関連微生物叢と比較して腸RORγt+Tregの誘導が特異的に増強されることを示す図である。 図11A～Fは、IBD関連微生物叢により、819腸炎重症度の増強が感受性マウスに伝播することを示す図である。 図12A～Bは、腸微生物叢の相対存在量が、腸炎誘導後に安定することを示す図である。 図13A～Dは、恒常的誘導T細胞集団及び腸炎重症度の間の関連性を示す図である。
定義
本明細書において他に定義しない限り、本開示と関連して使用する科学的及び技術的用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は、明白であるべきであるが、任意の潜在的曖昧さを有する場合には、本明細書において提供する定義は、任意の辞書又は外部定義に優先する。更に、文脈により他に必要とされない限り、単数形の用語は複数性を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本明細書において使用する場合、「comprising(含む)」(並びにcomprisingの任意の形態、例えば、「comprise」、「comprises」及び「comprised」)、「having(有する)」(並びにhavingの任意の形態、例えば、「have」及び「has」)、「including(含む)」(並びにincludingの任意の形態、例えば、「includes」及び「include」)又は「containing(含む)」(並びにcontainingの任意の形態、例えば、「contains」及び「contain」)の用語は、包括的且つ無制限であり、更なる列挙しない要素又は方法工程を除外しない。
不定冠詞「a」及び「an」は、本発明の明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、相反する指示が明白にない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。「及び/又は」の句は、本発明の明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、そのように接続した要素、即ち、一部の場合では接続的に存在したり、その他の場合では離接的に存在したりする要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。相反する指示が明白にない限り、「及び/又は」の節で詳細に同定される要素以外の他の要素は、詳細に同定される要素に関する、関しないにかかわらず、任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「A及び/又はB」への言及は、無制限の言語、例えば、「comprising」と組み合わせて使用する場合、一実施形態では、Bを有しないA(任意選択で、B以外の要素を含む)、別の実施形態では、Aを有しないB(任意選択で、A以外の要素を含む)、更に別の実施形態では、AとBの両方(任意選択で、他の要素を含む)等を指すことができる。
本発明の明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、「又は」の用語は、上に定義するように「及び/又は」と同一の意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおいて項目を分離する場合、「又は」又は「及び/又は」は、包括的なもの、即ち、多数の要素又は要素のリストのうちの少なくとも1つを包含するものとして解釈されるだけでなく、この2つ以上を含み、任意選択で、更なる列挙しない項目をも含むものとする。反対に、「～のうちの唯一」若しくは「～のうちの1つのみ」のように、明白に指示する唯一の用語、又は特許請求の範囲において使用する場合の「～からなる」は、多数の要素又は要素のリストのうちの1つのみの要素を包含することを指す。一般には、本明細書において使用する「又は」の用語は、「いずれか」、「～のうちの1つ」、「～のうちの唯一」又は「～のうちの1つのみ」の排他的用語が前に付く場合、排他的選択肢(即ち、「一方又は他方であるが両方ではない」)を示すものとして単に解釈されるものとする。「～から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用する場合、特許法の分野において使用する、この通常の意味を有するものとする。
「約」の用語は、当技術分野における典型的許容範囲内を指すために本明細書において使用する。例えば、「約」は、平均からの約2つの標準偏差として理解することができる。特定の実施形態によれば、測定可能な値、例えば、量等に言及する場合、「約」は、特定の値から±20%、±10%、±5%、±1%、±0.9%、±0.8%、±0.7%、±0.6%、±0.5%、±0.4%、±0.3%、±0.2%又は±0.1%の変動を包含することにより、変動が、開示の方法を実施するのに適切であることを意図する。「約」が一連の数又は範囲の前に存在する場合、「約」により、この一連又は範囲の数のそれぞれを修飾可能であることが理解される。
本明細書において使用する場合、本開示における「個体」の用語は、特には限定せず、この例としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ及びネコが挙げられ得る。
本明細書において使用する場合、本開示による「治療組成物」の用語は、ワクチン、アジュバント、生物製剤、医薬組成物、プロバイオティクス、食品、飲料、糞便移植、微生物複合物、若しくは糞便試料、細菌株、細菌株の混合物、動物モデルにおいて使用される試薬、又はこのような成分の組合せの形態であり得る。ワクチン、アジュバント、生物製剤、医薬組成物、プロバイオティクス、食品、飲料、若しくは試薬、又は組合せ製品は、対象においてIBDを低減又は排除する作用を有し得る。また、本開示による治療組成物は、RORγt+Treg細胞の分化、蓄積、若しくは増殖を刺激若しくは増強するか、又は対象におけるRORγt+Th細胞の分化、蓄積、若しくは増殖を減少させるか、又は対象における免疫応答を刺激する作用を有し得る。このような治療組成物の投与は、経口、頬側、非経口、直腸、又は糞便移植を介する投与であり得る。
本開示における「IBD」の用語は、胃腸管障害、例えば、炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性腸炎、及びクローン病を含む。
本明細書において使用する場合、「RORγt+Th」の用語は、RORγt陽性及びFoxP3陰性であるCD4+αβT細胞を意味する。
本明細書において使用する場合、「RORγt+Treg細胞」の用語は、FoxP3及びRORγtマーカーを同時発現するCD4+αβT細胞を意味する。また、これらは、FoxP3及びニューロピリン1の同時発現により同定し得る。
本明細書において使用する場合、本開示における「RORγt+Th細胞の分化、蓄積、又は増殖の低下又は排除」の句は、RORγt+Th細胞の増殖又は蓄積を引き起こす、未成熟T細胞のRORγt+Th細胞への分化を低下又は阻害する作用を含む。加えて、本開示における「RORγt+Th細胞の分化、蓄積、又は増殖の低下又は排除」の意味は、in-vivoでの作用、in vitroでの作用、及びex vivoでの作用を含む。したがって、次の作用:IBDを阻害する治療組成物の投与又は摂取による、腸におけるRORγt+Th細胞のin vivoでの増殖又は蓄積の低下又は阻害;培養したRORγt+Th細胞に対して作用する生理活性物質の予防による、RORγt+Th細胞の増殖又は蓄積の低下又は阻害;及びRORγt+Th細胞に対して作用する生理活性物質の予防による、生きた生物から採取した後、この生物に再導入するか又は別の生物に導入することを意図したRORγt+Th細胞の増殖又は蓄積の低下又は阻害のすべてを含む。
本明細書において使用する場合、本開示における「RORγt+Th細胞の分化、蓄積、又は増殖の刺激又は増強」の句は、RORγt+Treg細胞の増殖又は蓄積を引き起こす、未成熟T細胞のRORγt+Treg細胞への分化を増加又は刺激する作用を含む。加えて、本開示における「RORγt+Treg細胞の分化、蓄積、又は増殖の刺激又は増強」の意味は、in-vivoでの作用、in vitroでの作用、及びex vivoでの作用を含む。したがって、次の作用:IBDを阻害する治療組成物の投与又は摂取による、腸におけるRORγt+Treg細胞のin vivoでの増殖又は蓄積の刺激又は増強;培養したRORγt+Treg細胞に対して作用する生理活性物質の許容又は増強による、RORγt+Treg細胞の増殖又は蓄積の増加又は増強;及びRORγt+Treg細胞に対して作用する生理活性物質の許容又は増強による、生きた生物から採取した後、この生物に再導入するか又は別の生物に導入することを意図したRORγt+Treg細胞の増殖又は蓄積の増加又は増強のすべてを含む。
詳細な説明
以下の説明では、特定の製剤及びこの一部を形成する特定の実施形態に言及する。発明を実施するための形態及び特許請求の範囲において記載する例示的実施形態は、制限することを意図していない。本発明の対象の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用してもよく、他の変更を行ってもよい。本開示の態様は、非常に多種多様な構成により手配、置換、複合、分離、及び設計することができ、これらのすべてを本明細書において検討する。
「一実施形態」、「実施形態」、「例となる実施形態」又は「一部の実施形態」等への本明細書における言及は、記載する実施形態が、特定の特徴又は特性を含み得るが、すべての実施形態が、特定の特徴、構造、又は特性を必ずしも含まない場合を有することを示す。その上、このような句は、同一の実施形態を必ずしも指してはいない。更に、特定の特徴、構造、又は特性を実施形態と関連して記載する場合、このような特徴、構造、又は特性は、明示的に記載しているかどうかにかかわらず、他の実施形態と関連して達成し得る。
IBDのマーカーとして作用し得る複数の免疫原性細胞型を、本開示において初めて同定する。本開示の一態様では、IBDと正に相関する特異的T細胞マーカーを提供する。本開示の別の態様では、IBDと逆相関する特異的T細胞マーカーを提供する。
本開示の一態様では、IBDをステージ分類、又は追跡するための生物学的マーカーを提供する。本開示の別の態様では、生物学的マーカー及びIBDを治療するための方法を提供する。本開示の別の態様では、組成物をスクリーニングする方法及びIBDを治療又は予防する方法を提供する。
本開示の一態様では、対象における免疫応答を調節するための治療組成物を提供する。本開示の別の態様では、感染性疾患、がん、及び自己免疫疾患から選択される少なくとも1つの疾患又は症状を治療又は予防するための方法を提供する。
IBDを有する個体のGI及び腸リンパ節におけるRORγt+Th細胞レベルの絶対量又は比率を決定し、また、健常な個体のGIにおけるRORγt+Th細胞レベル量のベースライン値と比較してIBD診断、予後、又は治療レジメンをもたらすことが可能な方法を、本開示において提供する。
IBDを有する個体のGI及び腸リンパ節におけるRORγt+Treg細胞レベルの絶対量又は比率を決定し、また、健常な個体のGIにおけるRORγt+Treg細胞レベル量のベースライン値と比較してIBD診断、予後、又は治療レジメンをもたらすことが可能な方法を、本開示において提供する。
一実施形態では、IBDを有する個体のGI及び腸リンパ節におけるRORγt+Th細胞レベルの絶対量又は比率を決定し、また、RORγt+Th細胞レベルの比率又は絶対値を、健常な個体のベースライン値と比較して低下させる治療活性組成物を個体に投与した場合、治療活性組成物がIBDの治療において有効であることを判定する方法を、本開示において提供する。
一実施形態では、IBDを有する個体のGI及び腸リンパ節におけるRORγt+Treg細胞レベルの絶対量又は比率を決定し、また、RORγt+Treg細胞レベルの比率又は絶対値を、健常な個体のベースライン値と比較して上昇させる治療活性組成物を個体に投与した場合、治療活性組成物がIBDの治療において有効であることを判定する方法を、本開示において提供する。
一実施形態では、IBDを有する個体のGI及び腸リンパ節におけるRORγt+Th細胞レベル及びRORγt+Treg細胞レベルの絶対量又は比率を決定し、また、健常な個体のベースライン値と比較して、RORγt+Th細胞レベルの比率若しくは絶対値を低下させるか又はRORγt+Treg細胞レベルの比率若しくは絶対値を上昇させる治療活性組成物を個体に投与した場合、治療活性組成物がIBDの治療において有効であることを判定する方法を、本開示において提供する。
一実施形態では、IBDを有する個体のGI及び腸リンパ節におけるRORγt+Th細胞レベル及びRORγt+Treg細胞レベルの絶対量又は比率を決定し、また、健常な個体のベースライン値と比較して、RORγt+Th細胞レベルの比率又は絶対値を低下させ、RORγt+Treg細胞レベルの比率又は絶対値を上昇させる治療活性組成物を個体に投与した場合、治療活性組成物がIBDの治療において有効であることを判定する方法を、本開示において提供する。
一実施形態では、方法は、治療組成物の投与後の対象のGI及び腸リンパ節におけるRORγt+Th細胞のレベルを測定する工程を更に含み、この場合、治療組成物の投与後の対象のGIにおけるRORγt+Th細胞レベルの百分率又は絶対数における、投与前のレベルと比較した低下は、免疫抑制(又は免疫制御)の増強の正の指標となる。対象のGIにおけるRORγt+Th細胞レベルの測定は、当技術分野において公知の技術、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、又は免疫蛍光検査により行うことができる。
一実施形態では、方法は、治療組成物の投与後の対象のGI及び腸リンパ節におけるRORγt+Treg細胞のレベルを測定する工程を更に含み、この場合、治療組成物の投与後の対象のGIにおけるRORγt+Treg細胞レベルの百分率又は絶対数における、投与前のレベルと比較した低下は、免疫抑制(又は免疫制御)の増強の正の指標となる。対象のGIにおけるRORγt+Treg細胞レベルの測定は、当技術分野において公知の技術、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、又は免疫蛍光検査により行うことができる。
一実施形態では、(a)IBDと関連する症候を示す患者から試料を得る工程と、(b)無微生物哺乳動物又はin-vitroでの免疫環境において試料をインキュベートする工程と、(c)RORγt+Th細胞に結合する抗体と試料を接触させる工程と、(d)試料中のRORγt+Th細胞との抗体の結合を検出する工程と、(e)IBDの存在を予測するか又は患者におけるRORγt+Th細胞のレベルがRORγt+Th細胞の所定レベルよりも高い場合、IBDの状態を評価する工程とにより、患者においてIBDを診断するための方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDと関連する症候を示す患者から試料を得る工程と、(b)RORγt+Treg細胞に結合する抗体と試料を接触させる工程と、(d)試料中のRORγt+Treg細胞との抗体の結合を検出する工程と、(e)IBDの存在を予測するか又は患者におけるRORγt+Treg細胞のレベルがRORγt+Treg細胞の所定レベルよりも高い場合、IBDの状態を評価する工程とにより、患者においてIBDを診断するための方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDと関連する症候を示す患者から試料を得る工程と、(b)無微生物哺乳動物又はin-vitroでの免疫環境において試料をインキュベートする工程と、(c)試料中のRORγt+Th細胞特異的ヌクレオチドの存在を検出する工程と、(d)IBDの存在を予測するか又は患者における少なくとも1つのRORγt+Th細胞特異的ヌクレオチドのレベルがRORγt+Th細胞特異的ヌクレオチドの所定レベルよりも高い場合、IBDの状態を評価する工程とにより、患者においてIBDを診断するための方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDと関連する症候を示す患者から試料を得る工程と、(b)試料中のRORγt+Treg細胞特異的ヌクレオチドの存在を検出する工程と、(c)IBDの存在を予測するか又は患者における少なくとも1つのRORγt+Treg細胞特異的ヌクレオチドのレベルがRORγt+Treg細胞特異的ヌクレオチドの所定レベルよりも高い場合、IBDの状態を評価する工程とにより、患者においてIBDを診断するための方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDと関連する症候を示す個体を、その個体の種により同定する工程と、(b)治療組成物により個体を治療する工程と、(d)治療組成物によって個体のGIに存在するRORγt+Th細胞の量が所定レベル未満に低下するかどうかを判定する工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDと関連する症候を示す個体を、その個体の種により同定する工程と、(b)治療組成物により個体を治療する工程と、(d)治療組成物によって個体のGIに存在するRORγt+Treg細胞の量が所定レベルを超えて上昇するかどうかを判定する工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDの動物モデルであり、IBDと関連する症候を示す個体を、その個体により同定する工程と、(b)治療組成物により個体を治療する工程と、(d)治療組成物によって個体のGIに存在するRORγt+Th細胞の量が所定レベル未満に低下するかどうかを判定する工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDの動物モデルであり、IBDと関連する症候を示す個体を、その個体により同定する工程と、(b)治療組成物により個体を治療する工程と、(d)治療組成物によって個体のGIに存在するRORγt+Treg細胞の量が所定レベルを超えて上昇するかどうかを判定する工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)ヒトGIの動物モデルである個体に、IBDを有する個体由来の細菌培養物を感染させる工程と、(b)個体がIBDと関連する症候を示すまで待機する工程と、(c)治療組成物により個体を治療する工程と、(d)感染させた個体のGIに存在するRORγt+Th細胞の量を、健常な個体のRORγt+Th細胞の量と比較する工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)ヒトGIの動物モデルである個体に、IBDを有する個体由来の細菌培養物を感染させる工程と、(b)個体がIBDと関連する症候を示すまで待機する工程と、(c)治療組成物により個体を治療する工程と、(d)感染させた個体のGIに存在するRORγt+Treg細胞の量を、健常な個体のRORγt+Treg細胞の量と比較する工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDのモデルとして作用し、IBDを有する動物を同定して、この個体に治療組成物を投与する工程と、(b)動物のGIにおけるRORγt+Th細胞レベルに対する治療組成物の作用をアッセイする工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDのモデルとして作用し、IBDを有する動物を同定して、この個体に治療組成物を投与する工程と、(b)動物のGIにおけるRORγt+Treg細胞レベルに対する治療組成物の作用をアッセイする工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDと診断された患者に治療組成物を投与する工程と、(b)患者の腸におけるRORγt+Th細胞レベルに対する治療組成物の作用をアッセイする工程と、(c)治療した患者における細菌群のレベルを、健常な個体におけるRORγt+Th細胞のレベルと比較する工程と、(d)治療組成物によってRORγt+Th細胞のレベルが患者において所定レベルに達したかどうかを判定する工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
一実施形態では、(a)IBDと診断された患者に治療組成物を投与する工程と、(b)患者の腸におけるRORγt+Treg細胞レベルに対する治療組成物の作用をアッセイする工程と、(c)治療した患者における1687A6株のレベルを、健常な個体におけるRORγt+Treg細胞のレベルと比較する工程と、(d)治療組成物によってRORγt+Treg細胞のレベルが患者において所定レベルに達したかどうかを判定する工程とにより、IBDの治療又はIBDのリスクを有するヒトに有用な治療組成物をスクリーニングする方法を提供する。
図1は、IBD関連微生物叢により、ノトバイオートマウスにおいて健常ドナー微生物叢と比較して腸RORγt+Thの誘導が増強されることを示す。(A及びB)腸RORγt+Thの割合は、種々のドナー微生物叢によりコロニー形成させた個々のマウスにおいて異なる。CD4+FoxP3のRORγt+細胞の割合を示す。フローサイトメトリーのプロットは、種々の時点で取得したデータを含み、このためゲーティングは、プロット間で異なる。(C)IBDドナー微生物叢によりコロニー形成させたマウスの群の結腸、回腸、及びmLNにおいて誘導されたRORγt+Thの平均的割合は、健常微生物叢による割合よりも高い。(D)各微生物叢により結腸、回腸、及びmLNにおいて誘導されたRORγt+Thの割合間の相関性を示す。(E)微生物叢により誘導されたRORγt+Th及びIL-17A+ CD4 T細胞の割合は、相関する。(F、G及びH)直腸及び回腸において誘導された(F)IL-17A+Th17細胞、(G)IFNγ+Th1細胞、(H)IL-22+T細胞の平均的割合は、健常又はIBDドナー微生物叢と等価である。細胞は、図1Aのようにゲーティングする。(I)種々のドナー微生物叢によりコロニー形成させた個々のマウスにおける腸GATA3+Thの割合を示す。CD4+FoxP3のGATA3+細胞の割合を示す。(J)健常及びIBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスの群の直腸及び回腸において誘導されたGATA3+Thの平均的割合を示す。(A～J)n=15健常、8UC及び7CD微生物叢(RORγt)、n=11健常、6UC及び7CD微生物叢(IFNγ及びIL-17A)、n=8健常、4UC及び6CD微生物叢(IL-22)、n=10健常、5UC及び2CD微生物叢(GATA3);(B及びI)各点は、マウス1匹のデータを表し、他のすべてのプロットでは、各点は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス2～12匹の群の平均値を表す。ns-有意性なし、*p<0.05、ステューデントt検定;実線の水平線は平均±SEMを示し、破線の水平線は、無菌マウスにおける細胞型の平均的割合を表す。(E)の回帰p値はf検定により計算する。
図2は、腸FoxP3+Tregの誘導において、健常及びIBD微生物叢によりコロニー形成させたマウス間で有意差がないことを示す。(A及びB)FoxP3+Tregの割合は、種々のドナー微生物叢によりコロニー形成させた個々のマウス間で異なる。FoxP3+細胞の割合をCD4+T細胞の百分率として示す。フローサイトメトリーのプロットは、種々の実験のデータを含み、このためゲーティングは、プロット間で異なる。(C及びD)結腸及び回腸において誘導されたFoxP3+Treg(C)及びIL-10+CD4 T細胞(D)の平均的割合において、健常及びIBDドナー微生物叢間で有意差がない。FoxP3+又はIL-10+細胞の割合をCD4+T細胞の百分率として示す。(E)IL-10分泌は、FoxP3+粘膜固有層T細胞に主に限定される。CD4+T細胞に対してゲーティングし、健常3つ及びIBD3つの微生物叢によりコロニー形成させたマウスを代表する、フローサイトメトリーのプロットを示す。(F)種々の微生物叢により誘導された腸RORγt+Th及びFoxP3+Tregの割合は、相関しない。(A～E)n=11健常、6UC及び7CD微生物叢;(B)各点は、マウス1匹のデータを表し、他のすべてのプロットでは、各点は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス3～12匹の群の平均値を表す。ns-有意性なし、ステューデントt検定;実線の水平線は平均±SEMを示し、破線の水平線は、無菌マウスにおける細胞型の平均的割合を表す。(F)の回帰p値はf検定により計算する。
図3は、健常ドナー微生物叢により、IBD関連微生物叢と比較して腸RORγt+Tregの誘導が特異的に増強されることを示す。(A及びB)腸RORγt+Tregの割合は、種々のドナー微生物叢によりコロニー形成させた個々のマウス間で異なる。RORγt+細胞の割合をCD4+FoxP3+T細胞の百分率として示す。フローサイトメトリーのプロットは、種々の実験のデータを含み、このためゲーティングは、プロット間で異なる。(C及びD)健常ドナー微生物叢によりコロニー形成させたマウスの群の結腸又は回腸において誘導されたRORγt+Tregの平均的割合は、IBD微生物叢によるものよりも高い(C)。(D)は、コホートにより分離した(C)のデータを示す。(E)mLNにおいて誘導されたRORγt+Tregの平均的割合において、健常又はIBDドナー微生物叢によりコロニー形成させたマウスの群間で有意差がない。(F)各微生物叢により誘導されたRORγt+Tregの割合は、結腸及び回腸の間で相関するが、mLN及び腸組織のいずれかの間では相関しない。(G)結腸粘膜固有層T細胞からのIL-17A分泌の大多数は、FoxP3-細胞からである。1微生物叢あたり少なくとも3匹のマウスを代表するフローサイトメトリーのプロットを示す。CD4+RORγt+細胞に対してゲーティングし、フローサイトメトリーのプロットは、種々の実験のデータを含み、このためゲーティングは、プロット間で異なる。(A～F)n=15健常、8UC及び7CD微生物叢;(B)各点は、マウス1匹のデータを表し、他のすべてのプロットでは、各点は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス2～12匹の群の平均値を表す。ns-有意性なし、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、ステューデントt検定;実線の水平線は平均±SEMを示し、破線の水平線は、無菌マウスにおける細胞型の平均的割合を表す。回帰p値はf検定により計算する。
図4は、IBD関連微生物叢により、腸炎の重症度の増強が感受性マウスに伝播することを示す。健常又はIBDドナー微生物叢によりコロニー形成させたマウスにおけるRag-/-T細胞移入(RagTCT)腸炎を示す。(A及びB)体重減少(A)及び糞便リポカリン2(LCN2)(B)は、IBDドナー微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウスにおいて、健常微生物叢と比較して有意に高かった。(C)T細胞移入から5～7週後における、種々のヒトドナー微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウス由来の代表的H&E染色結腸切片を示す。(D)6週目に、ヒトUC又はCD微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウスにおいて、体重減少が更に大きかった。(E及びF)腸炎の重症度の悪化は、2つのコホートのIBDドナー(E)並びに便及び培養したIBD微生物叢(F)により伝播する。(G)IBDドナー微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウスの結腸において誘導されたCD4+T細胞のRORγt+Th及びIFNγ+IL-17A+の割合は、TCTから4週後において、健常微生物叢による割合よりも高い。各点は、マウス1匹のデータを表し、各色は、異なる微生物叢を表す。(H)TCTから4週後における、結腸粘膜固有層における、移入ナイーブT細胞の後代由来のRORγt+Tregの誘導を実証する代表的フローサイトメトリーのプロットである。CD4+細胞に対してゲーティングする。(I)RagTCTマウスの結腸において誘導されたFoxP3+Treg及びRORγt+Tregの割合では、TCTから4週後において、IBD及び健常微生物叢間で有意差がない。各点は、マウス1匹のデータを表し、各色は、異なる微生物叢を表す。FoxP3+Tregの割合は、CD4+T細胞の百分率であり、RORγt+Tregは、CD4+FoxP3+の百分率である。(A、B)細線は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス5～15匹の群の平均データを表し、太線は、健常ドナー又はIBDドナーのいずれかの微生物叢によりコロニー形成させたマウスのすべての群の平均±SEMを表す。(C)スケールバー=200μm。(DG)各点は、T細胞移入から6週後における、マウス5～15匹の群の平均的体重変化を示す(n=16健常ドナー、n=6 CDドナー、n=6 UCドナー(このうちUC 2匹及びCD 2匹は活動性疾患を有した)。P値は、多重比較のためにANOVAとともにテューキーの補正を使用するか、又は(D)ステューデントt検定を使用して計算する(他のすべてのパネル)。ns-有意性なし、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001;ステューデントt検定。また、図11及び12を参照されたい。(G及びI)各点は、マウス1匹のデータを表し、各色は、異なる微生物叢を表す。
図5は、RORγt+Treg及びRORγt+Thの恒常的誘導により、実験的腸炎の重症度及びヒト微生物叢ドナーの健康を予測することを示す。(A)RagTCT腸炎重症度は、同一の微生物叢によりコロニー形成させたB6ノトバイオートマウスの結腸及び回腸において恒常的に誘導された、RORγt+Th及びRORγt+Tregと有意に相関する。腸炎重症度は、B6ノトバイオートマウスにおいてGATA3+Th又はFoxP3+Tregの割合とは相関しない。(B)微生物叢ドナーの健康を予測する二項分類子として、ヒト化微生物叢マウスにおいて取得した測定値に基づくロジスティックモデルの値を評価する、受信者動作特性(ROC)曲線である。(A及びB)体重データは、単一ヒトドナー微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウス5～15匹の群の平均測定値を表し、表現型決定データは、同一の単一微生物叢によりコロニー形成させたB6マウス2～12匹の群の平均値である。P値は、f検定により計算する。
図6は、RORγt+Treg細胞が、健常ドナー微生物叢によりコロニー形成させた腸炎感受性T細胞移入マウスにおける疾患重症度を低下させるのに必要とされることを示す。詳細には、RORγt+Treg高誘導健常ドナー微生物叢(HD2021)により、疾患重症度(体重減少)が、潰瘍性腸炎を有する個体由来のRORγt+Treg低誘導微生物叢(UC1024)によりコロニー形成させたノトバイオート腸炎感受性マウスのそれよりも低くなる。T細胞移入マウスが、RORγt+Tregに分化不能なナイーブT細胞(RORγt flox x FoxP3-creドナー細胞)を受けた場合、疾患重症度のこの低下は排除される。RORγt+Treg欠損細胞を受けた健常微生物叢及び野生型細胞を受けた潰瘍性腸炎微生物叢コロニー形成マウス間の疾患重症度に、相違は存在しない。
図7(A及びB)は、IBDを有する個体由来のRORγt+Treg低誘導微生物叢を内包するノトバイオートマウスに治療カクテルとして与えた場合、2つの(培養した)ドナー微生物叢により、結腸RORγt+Tregが誘導可能であることを示す(左パネルのデータは健常非曝露マウスによる)。同一のRORγt+Treg誘導カクテルを、RORγt+Treg低誘導IBD微生物叢を内包する腸炎感受性T細胞移入マウスに移植した場合、疾患の病態形成(体重減少)は、両方の場合において低減する。(C)は、IBDを有するドナー由来の微生物叢を内包するノトバイオートマウスへのRORγt+Treg誘導カクテルの移植後に微生物叢密度が上昇し、微生物叢密度のこの上昇が、結腸におけるRORγt+Treg細胞の増加と相関することを示す。
図8は、非曝露ノトバイオートマウスにおけるRORγt+Treg及びRORγt+Th(Th17細胞)のヒト微生物叢により誘導された比率により、腸炎感受性T細胞移入マウスにおいて疾患重症度が予測可能であり、ヒトドナーの病状が予測可能であることを示す。また、AUCを提供する図5Bを参照されたい。
図9は、腸Tヘルパー集団の割合が微生物叢ドナーにより影響されることを示す。(A)この試験において使用したヒトドナー微生物叢の16Sr DNAアンプリコンシーケンシングの重みなしUniFrac距離に基づくPCoAにより、有意な疾患関連クラスタリングはないことが明らかとなる。Table 1(表1)に関連する。(B)結腸及び回腸のIFNγ+、IL-17A+及びIL-22+CD4+T細胞の割合は、ドナー微生物叢により有意に影響される。各記号は、マウス1匹のデータを表す。(C)微生物の培養した採取物又は全便微生物叢のいずれかによりコロニー形成させたB6ノトバイオートマウスの結腸及び回腸における、ドナー微生物叢により誘導されたRORγt+Thの割合を示す。各点は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス2～12匹の群の平均値を表す。データは、図1Cにも示すが、ここでは、微生物叢接種菌の種に従って分離する。(D)ドナーの独立的コホート2つ由来の微生物叢によりコロニー形成させたB6ノトバイオートマウスの結腸及び回腸における、ドナー微生物叢により誘導されたRORγt+Thの割合を示す。各点は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス2～12匹の群の平均値を表す。データは、図1Cにも示すが、ここでは、ドナーコホートに従って分離する。(B)n=11健常、6UC及び7CD微生物叢(IFNγ及びIL-17A)、n=8健常、4UC及び6CD微生物叢(IL-22)、各点は、マウス1匹のデータを表す。(C及びD)各点は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス2～12匹の群の平均値を表す。ns-有意性なし、*p<0.05、ステューデントt検定;水平線は、平均±SEMを示す。また、図1を参照されたい。
図10は、健常ドナー微生物叢により、IBD関連微生物叢と比較して腸RORγt+Tregの誘導が特異的に増強されることを示す。(A)微生物の培養採取物又は全便微生物叢のいずれかによりコロニー形成させたB6ノトバイオートマウスの結腸及び回腸における、ドナー微生物叢により誘導されたRORγt+Tregの割合を示す。各点は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス2～12匹の群の平均値を表す。データは、図3Cにも示すが、ここでは、微生物叢接種菌の種に従って分離する。(B)結腸及び回腸におけるHelios+Tregの平均的割合は、健常又はIBDドナー微生物叢と等価である。Helios+細胞の平均的割合をCD4+FoxP3+細胞の百分率として示す。(C)結腸及び回腸におけるGATA3+Tregの平均的割合は、健常又はIBDドナー微生物叢と等価である。Helios+細胞の平均的割合をCD4+FoxP3+細胞の百分率として示す。(D)種々のヒト微生物叢により誘導された結腸及び回腸FoxP3+Treg、GATA3+Treg、Helios+Treg及びRORγt+Tregの割合間の相関性を示す。(E)異なるヒト微生物叢4つによる結腸IL-22+、Csf2+及びIL-17A+ILC3の誘導を示す。サイトカイン陽性細胞の割合をCD45+、CD3/CD19-、NKp46-、RORγt+細胞の百分率として示す。各点は、マウス1匹のデータを表し、各群は、種々の微生物叢のデータを示す。健常又はIBD微生物叢によりコロニー形成させたすべてのマウスのデータを使用して統計学的比較を行う。(F)種々のヒト微生物叢により誘導されたRORγt+Th、GATA3+Th及びIFNγ+Thとの結腸及び回腸RORγt+Tregの割合間の相関性を示す。各点は、マウス2～12匹の群の平均値を表す。(G)代表的健常(高RORγt+Treg、低RORγt+ Th)及びIBD(低RORγt+Treg、高RORγt+Th)微生物叢によりコロニー形成させたマウス由来のDC及びマクロファージ/単球上のCD80及びCD86の発現を示す。DCは、MHCII+、CD64-、CD11c+についてゲーティングした。マクロファージ/単球(Mac/mono)は、MHCII+、CD64+についてゲーティングした。(A～C及びF)n=15健常、8UC及び7CD微生物叢、各点は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス2～12匹の群の平均値を表す。(E及びG)各点は、マウス1匹のデータを表す。ns-有意性なし、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.0001、ステューデントt検定(A～C、E、G)又はf検定(F);実線の水平線は平均±SEMを示し、破線の水平線は、無菌マウスの群由来の細胞の平均的割合を表す。また、図2及び3を参照されたい。
図11は、IBD関連微生物叢により、819腸炎重症度の増強が感受性マウスに伝播することを示す。(A)ドナー微生物叢UC1024によりコロニー形成させたマウスの群は、腸炎誘導の有効性及び一貫性を評価する、すべてのT細胞移入腸炎実験に含まれた。マウスの7つの群の体重減少曲線を示し、これは、およそ24カ月にわたる間隔を置いて実施したTCT実験のための対照群として作用した。(B)T細胞移入腸炎の誘導後、体重の減少は、糞便リポカリン2の上昇と有意に相関する。(C)IBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスにおける腸炎の悪化が、T細胞移入後早期に検出され得る。(D)ドナーコホート2人由来のIBD関連微生物叢により、健常ドナー微生物叢よりも重度の腸炎がマウスに伝播する。(E)IBDドナー由来の完全糞便微生物叢及び細菌の培養採取物の両方により、健常ドナーに由来する等価な微生物叢よりも重度の腸炎がマウスに伝播する。(F)腸炎重症度は、活動性疾患を有するか又は寛解期にあるドナー由来のIBD微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウスにおいて等価である。(G)マウスにおける腸炎惹起性について、便及び培養採取物の両方として評価したドナー微生物叢10種の比較を示す。(A)線は、ドナーUC1024によりコロニー形成させたマウスの群の平均±SEMを表す。(B)各点は、T細胞移入時からある時点におけるマウス1匹のデータを示す。(C)各点は、T細胞移入後の指示時における、微生物叢によりコロニー形成させたマウス5～15匹の群の体重減少平均値を表す。線は、すべての健常又はIBD微生物叢の平均±SEMを表す。(D及びE)各細線は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス5～15匹の群の平均データを表す。太線は、健常ドナー又はIBDドナーのいずれかの微生物叢によりコロニー形成させたマウスのすべての群の平均±SEMを表す。(F)各点は、T細胞移入から6週後における、微生物叢によりコロニー形成させたマウス5～15匹の群の体重減少平均値を表す。(G)完全便微生物叢又は培養採取物のいずれかによりコロニー形成させたマウス5～15匹の群の平均的体重変化を示す。
図12は、腸微生物叢の相対存在量が、腸炎誘導後に安定することを示す。(A)我々は、微生物叢ドナーのアルファ多様性(シャノン指数により定義される)及び健康状態の有意な関連を見出さなかった。また、アルファ多様性は、T細胞移入から6週後において、有意には変化しない。(B)T細胞移入前及びこの6週後において、健常又はIBD微生物叢によりコロニー形成させたRag欠損マウスの糞便において検出された5つの主要な門の相対存在量の有意な変化は存在しなかった。線は、同一微生物叢によりコロニー形成させたマウスの同一群の平均的割合を結合する。ボックスプロットは、中央値及び四分位範囲を示す。対応ステューデントt検定による統計学的比較。また、図4を参照されたい。
図13は、恒常的誘導T細胞集団及び腸炎重症度の間の関連性を示す。(A～D)B6ノトバイオートマウスの回腸ではなく結腸において恒常的に誘導された(A)IL-CD4+T細胞は、同一の微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウスの腸炎重症度と相関する(体重減少により測定した場合)。対照的に、B6ノトバイオートマウスの結腸及び回腸における、恒常的に誘導された(B)IFNγ+Th、(C)Helios+Treg又は(D)IL-10+CD4 T細胞の割合は、同一の微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウスの腸炎重症度と相関しない(体重減少により測定した場合)。(A～D)各記号は、単一微生物叢によりコロニー形成させたマウス3～12匹の群の平均値を表す。p値は、f検定により計算する。また、図5を参照されたい。
RORγt+Th細胞の分化、増殖、又は蓄積を低下又は阻害する作用は、例えば、治療組成物をIBDを有する対象に投与し、CD4陽性細胞をGIから単離し、フローサイトメトリーによりCD4陽性細胞に含まれるRORγt+Th細胞の比率を測定し、RORγt+Th細胞の投与前の比率又は所定のレベルに対して投与後のRORγt+Th細胞の比率を比較することにより評価することができる。
RORγt+Treg細胞の分化、蓄積、又は増殖を刺激又は増強する作用は、例えば、治療組成物をIBDを有する対象に投与し、CD4陽性細胞をGIから単離し、フローサイトメトリーによりCD4陽性細胞に含まれるRORγt+Treg細胞の比率を測定し、RORγt+Treg細胞の投与前の比率又は所定のレベルに対して投与後のRORγt+Treg細胞の比率を比較することにより評価することができる。
「RORγt+Th細胞の分化、増殖、又は蓄積の低下又は排除」が生じているかどうかを、例えば、GIのT細胞群におけるRORγt+Th細胞の比率、GIにおけるRORγt+Th細胞の機能、又はGIにおけるRORγt+Th細胞マーカーの発現をアッセイすることにより判定することもできる。
「RORγt+Treg細胞の分化、蓄積、又は増殖の刺激又は増強」が生じているかどうかを、例えば、GIのT細胞群におけるRORγt+Treg細胞の比率、GIにおけるRORγt+Treg細胞の機能、又はGIにおけるRORγt+Treg細胞マーカーの発現をアッセイすることにより判定することもできる。
RORγt+Th細胞又はRORγt+Treg細胞RNA発現マーカーを検出する方法は、例えば、ハイスループットRNAスクリーニング、ノーザンブロット、ドットブロット、及びRT-PCRを含む。タンパク質マーカーを検出するための方法の例としては、例えば、ELISA、放射免疫アッセイ、免疫ブロット、免疫沈降、及びフローサイトメトリーが挙げられる。
本開示では、IBDと診断された個体の微生物叢におけるRORγt+Th細胞又はRORγt+Treg細胞の絶対量又は比率を測定し、治療組成物により個体を治療し、RORγt+Th細胞の絶対量若しくは比率が低下するか、又はRORγt+Treg細胞の絶対量若しくは比率が上昇するどうかを、健常な個体に対する類似の評価を実施することにより得られるベースライン値と比較して評価することにより、治療組成物の作用を判定するための方法を提供することができる。
本開示の一実施形態では、治療組成物に対する患者の応答を予測して、予後をもたらすための方法を提供する。方法は、百分率又は絶対量を測定する工程と、IBDと診断された個体の微生物叢におけるRORγt+Th細胞又はRORγt+Treg細胞の絶対量又は比率を測定する工程と、健常対象におけるこのような量のベースライン値と値を比較する工程と、患者に関する更なる診断情報及び病歴データとの比較の結果を複合する工程と、特定の治療組成物の投与後に患者がIBDの低減を示し得るかどうかを評価する工程とを含む。
特定の実施形態の選択実施例を以下に提供するが、本開示は、上に列挙するこのような実施例又は特定の実施形態に制限しない。
本開示では、ヒトにおいてIBDの重症度を予測するのに使用可能な方法及びマーカーを提供する。特には、本開示では、免疫寛容原性RORγt+Treg細胞が濃縮された群を内包する個体はリスクが低く、一方、RORγt+Treg細胞が濃縮された群を内包する個体はリスクが高まっていることを示す。発明者らは、微生物叢特異的恒常性RORγt+Treg細胞の誘導及び腸炎重症度の間の密接な関連を更に発見した。その上、本開示では、IBDにおける治療介入としての微生物叢組成物を提供する。
IBD関連微生物叢により、ノトバイオートマウスにおいて健常ドナー微生物叢と比較して腸RORγt+Th17の誘導が強化される
発明者らは、ヒト腸微生物叢においてIBDと相関する特異的マーカーを同定した。このようなマーカーを同定するために、発明者らは、無菌C57B1/6Jマウスに、血縁若しくは非血縁の健常ドナー(n=15)又はIBDを有するドナー(n=15)のいずれかの2つの独立的コホート由来の糞便スラリー又は一連の培養糞便微生物叢採取物によりコロニー形成させた。以下のTable 1(表1)を参照されたい。
Figure 2023508138000001
Figure 2023508138000002
16S rDNAアンプリコンシーケンシングによる微生物叢分析では、健常ドナー及びCD又はUCを有するドナーの糞便微生物叢間で識別されなかった(p=0.58、PERMANOVA;図9A)。主座標分析では、健常、CD又はUCドナー微生物叢によりコロニー形成させたヒト化微生物叢マウスの糞便微生物叢を毎週分離した(p=0.04、PERMANOVA、図9B)。
コロニー形成から4～6週後、発明者らは、各マウスの腸管粘膜固有層をフローサイトメトリーによりプロファイリングした。結腸及び回腸におけるCD4+FoxP3-Tヘルパー細胞(RORγt+Th)の粘膜固有層RORγt+の割合は、ドナー微生物叢間で有意に異なった(p<1x10-12、ANOVA;図1A)。際立ったことには、IBD微生物叢により誘導されたRORγt+Thの平均割合は、結腸及び回腸の両方において、健常ドナー由来微生物叢よりも有意に高かった(それぞれp=0.009 p=0.034;t検定;図1A～C及び9)。この発見は、培養微生物叢を比較した場合及び非血縁ドナーのコホートにおいて最も明らかであった(図10)。RORγt+Th細胞は、6倍の範囲にわたって異なり、一般に使用するマウス参照群に対して類似の割合を誘導するヒト微生物叢を含んだ(特定病原体除去(SPF)微生物叢+/-セグメント糸状性細菌(SFB))。加えて、RORγt+Th細胞はまた、IBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスの腸間膜リンパ節(mLN)において上昇した(図1C)。RORγt+Th細胞の誘導は、結腸及び回腸の間で高度に相関し、両組織及びmLNの間でより中度に相関した(図1D)。
発明者らは、RORγt+Th細胞の割合が、各組織においてIL-17A+ CD4 T細胞の割合と相関したことを見出した(結腸; p=1.1x10-6、R2=0.65、回腸; p=0.0002、R2=0.44;図1E)。IFNγ+ Th1、IL-22+及びIL-17A+ CD4 T細胞の割合は、ドナー微生物叢により異なるが(p<1×10-10[IFNγ及びIL-17A]、p=0.001[IL-22、回腸]、ANOVA)(図S1)、発明者らは、このようなT細胞サブセットが、健常微生物叢によって、IBD微生物叢と比較して有意には変化しないことを発見した(図1F、1G及び1H)。対照的に、FoxP3 GATA3+Th2細胞の平均割合が、IBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスの結腸において高くなることを見出した((p<0.05、t検定);図1J)。
腸FoxP3+102Tregの誘導は、健常及びIBD微生物叢によりコロニー形成させたマウス間で有意差はない
これまでの研究のように(Faithら2014、Geva-Zatorskyら2017)、微生物叢の大多数により、腸FoxP3+Tregの増殖がベースライン無菌レベルを超えて引き起こされた(図2A及び2B)。発明者らは、FoxP3+Treg及びIL-10+CD4 T細胞の割合は、ドナー微生物叢により有意に影響されるが(p<1×10-15、p<0.0001[FoxP3結腸、回腸]、p=0.006、p=0.02[IL-10結腸、回腸];ANOVA)、健常又はIBD関連微生物叢により誘導されたFoxP3+Treg又はIL-10+CD4 T細胞の平均的割合の間で観察可能な差は存在しないことを発見した(図2C及び2D)。CD4+ T細胞由来IL-10の大多数は、細胞内サイトカイン染色により、FoxP3+ T細胞において検出された(図2E)。加えて、微生物叢により誘導されたRORγt+Th及びFoxP3+Tregの割合は、相関しなかった(図2F)。
健常ドナー微生物叢により、RORγt+Tregの誘導がIBD関連微生物叢と比較して特異的に増強される
最近、FoxP3及びRORγtを同時発現するTreg(RORγt+Treg)の腸特異的サブセットが、微生物叢依存性、腸炎防御性であり、腸エフェクターT細胞応答を制御することが見出された。発明者らは、結腸及び回腸におけるRORγt+Tregの誘導が、種々の微生物叢により有意に異なることを見出した(結腸及び回腸においてp<1×10-15、p<1×10-8、ANOVA;図3A及び3B)。全FoxP3+Treg集団とは対照的に、発明者らは、結腸及び回腸の両方において、健常微生物叢により誘導されたRORγt+Tregの、IBD微生物叢と比較して有意な増殖を観察した(p<0.001、t検定;図3C)。この差は、微生物叢ドナーの2つの独立的コホートにわたって(図3D)及び便又は培養微生物叢によりコロニー形成させたマウスにおいて(図10)有意であった。全FoxP3+Tregの割合は、回腸においてRORγt+Tregと相関し(p<0.001;R2=0.39)、結腸において弱相関した(p=0.04、R2 128=0.1;図10D)。コロニー形成により、mLNにおいてRORγt+ Tregの割合は増加したが、健常又はIBD微生物叢によるmLN RORγt+ Tregの誘導において有意差は存在しなかった(図3E)。結腸及び回腸におけるRORγt+Tregの割合は相関したが、いずれもmLNにおける割合とは相関しなかった(図3F)。SPFマウスにおけるこれまでの報告と同様に(Sefikら2015)、健常又はIBDのいずれかの微生物叢によりコロニー形成させたマウス由来の結腸RORγt+133Tregは、ex vivoで刺激した場合、FoxP3-RORγt+Thと比較して最小限のIL-17Aを分泌した(図3G)。
RORgt+Tregは、微生物叢からの末梢刺激に応答して誘導されると想定される一方、高い割合の粘膜固有層RORγt-Tregは、転写因子Heliosを発現し、これは胸腺起源の可能性を示す(Ohnmachtら2015)。発明者らは、IBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスの回腸において、健常ドナー微生物叢によりコロニー形成させたマウスと比較して更に高い割合のHelios+Tregが存在することを見出し、予想通りに(Sefikら2015)、RORγt+Treg及びHelios+Tregは逆相関した(図10)。低い割合のFoxP3+CD4 T細胞は、RORγtもHeliosも発現しなかった(図10)。この「二重陰性」集団は、IBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスの結腸において、健常微生物叢によりコロニー形成させたものと比較して濃縮された(図10B)。これまでに記載のように、FoxP3+GATA3+Tregは微生物叢依存性ではなく、これらは健常及びIBD微生物叢により差次的に調節されなかった(図10C)。3型自然リンパ球系細胞(ILC3)により分泌されたサイトカインは、Treg誘導を含む粘膜恒常性の維持において役割を果たす。発明者らは、健常又はIBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスの結腸粘膜固有層におけるIL-17A+、IL-22+又はCsf2+(GM-CSF+)ILC3の割合において有意差を見出さなかった(図10E)。
RORγt+Tregは、Th2応答を制御するようにユニークに配置されていることが示唆されている。発明者らは、IBD微生物叢によりコロニー形成させたノトバイオートマウスの結腸におけるTh2(GATA3+ FoxP3- CD4+)細胞の、健常微生物叢と比較した有意な増殖を観察したが(p<0.05、t検定;図1I)、Th2細胞の割合は、RORγt+Tregと相関しなかった(結腸及び回腸においてp=0.09、p=0.9、図10F)。また、発明者らは、RORγt+Treg及びRORγt+158Th又はIFNγ+CD4 T細胞の割合間に相関性を見出さなかった(図10F)。RORγt+Tregが欠損したFoxP3-cre x RORγt-floxマウスは、粘膜固有層樹状細胞(DC)活性化の上昇を示す。発明者らは、IBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスにおいて観察されたRORγt+Tregの欠損が、DC表現型に影響するのに十分であるかどうかを調べた。極度のRORγt+Treg誘導を表す、健常及びIBD微生物叢によりコロニー形成させたB6マウスでは、発明者らは、低い割合のRORγt+Tregが、CD11c+CD64-DC及びCD64+マクロファージ/単球上のCD80及びCD86の発現の増加と相関することを見出した(図10G)。
IBD関連微生物叢により、腸炎重症度の増強が感受性マウスに伝播する
腸炎惹起性に対するIBD関連微生物叢の影響の程度を評価するために、発明者らは、腸炎のノトバイオートマウスモデルにおいて健常及びIBDドナー微生物叢を検査した。IBD病態生理におけるT細胞の公知の重要性を考慮して、発明者らは、ともにT細胞及び微生物叢依存性の腸炎のモデルを選択した。Rag欠損マウスへのCD45RBHI(ナイーブ)CD4T細胞の移入により、腸炎様の病態が誘導されるが、免疫原性微生物叢の存在下においてのみである(以降はRagT細胞移入、(RagTCT)モデル)。T細胞移入の4～8週前に、発明者らは、無菌Rag1-/-マウスに、健常(n=16)又はIBD(n=14、Table 1(表1)を参照)の両ヒトドナー由来の糞便微生物叢によりコロニー形成させた。同一のヒトドナー微生物叢によりコロニー形成させたB6及びRag-/-由来の微生物叢のアルファ多様性(シャノン)は、有意に相関し(r2=0.6、p=0.002、f1検定)、マウスモデル間で類似の生着を示した。腸炎モデルの反復毎に含まれた対照微生物叢は、実験間で低い多様性を実証した(図11A)。体重の減少、組織学、及び糞便リポカリン2(LCN2)の上昇により測定した場合、腸炎は、IBDを有する個体由来の糞便微生物叢によりコロニー形成させたマウスでは、健常ドナー由来の微生物叢によりコロニー形成させたマウスよりも重度であった(42日目の体重及びLCN2のそれぞれにおいてp=4.2×10-5、p=0.0058、t検定;図4A及び4B)。体重の減少は、糞便LCN2の上昇と相関した(R2=0.33、p=1.4x10-7;図11B)。
発明者らは、健常及びIBD微生物叢間の体重減少における有意差が、T細胞移入から7日後に既に検出可能であり、経時的に更に顕著となったことを発見した(図11C)。UCを有するドナー由来の微生物叢によりコロニー形成させたマウス間の腸炎重症度では、CDと比較して有意差は存在せず(p=0.59、t検定;図4D)、CD及びUC微生物叢のそれぞれにより、腸炎が独立的に誘導され、これは、健常ドナー微生物叢によりコロニー形成させたマウスの重症度よりも重度であった(UC及びCDのそれぞれにおいてp<0.01、p<0.001、ANOVA;図4D)。発明者らは、ドナーの独立的コホート2つにおいて、このような発見を再現した(図4E及び11D)。また、発明者らは、IBDを有するドナー由来の便微生物叢及び微生物の培養採取物の両方により、健常ドナー微生物叢と比較して、マウスにおける腸炎感受性の増大が同様に可能であることを見出した(図4F及び11E)。腸炎は、活動性疾患を有するか又は寛解期にあるドナー由来のIBD微生物叢によりコロニー形成させたマウスにおいて等価であった(図11F)。
ドナー10人について、発明者らは、便及び便に由来する培養微生物叢採取物の両方の腸炎惹起性をアッセイした。培養微生物叢10種のうちの8種により、同一ドナーに由来する全便微生物叢として等価な重症度の腸炎が移入された(図11G)。16S rRNAアンプリコンシーケンシングに基づいて、発明者らは、腸炎誘導前又は後のいずれにおいても、生着した健常若しくはIBD微生物叢のアルファ多様性又はこれらの広範な分類学的構成における差を観察しなかった(図12)。
健常5つ又はIBD 6つの微生物叢のうちの1つによりコロニー形成させたマウスの群において、発明者らは、移入から4週後に、移入CD45RBHIT細胞の後代の活性化及び分化を特徴づけた。このような群間の免疫集団の多様性の解釈は、微生物叢により誘導される疾患重症度の多様性により、移入から4週後に複雑となる。マウスにおける腸炎の悪化が、IFNγ-IL-17A二重陽性CD4 T細胞の割合の増加と関連することは、これまでに実証されている。このような知見と一致して、発明者らは、同一の集団が、IBD微生物叢によりコロニー形成させたT細胞移入マウスにおいて増殖することを見出した(図4G)。また、発明者らは、このようなマウスの結腸においてRORγt+Th(FoxP3-)の割合が増加することを見出した(図4G)。これまでに報告されているように、粘膜固有層において増殖した細胞の1～2%が、FoxP3を発現した(図4H)。この割合は、健常又はIBD微生物叢によりコロニー形成させたマウス間で有意差がなかった(図4I)。FoxP3+細胞の平均40～50%が、RORγtを同時発現したことは注目すべきであり、これは、脾臓起源のナイーブT細胞が、RORγt+Tregの発生を妨害しないことを示す(図4H及び4I)。しかし、RORγt+Tregの割合は、動物間で高度に可変であり、健常又はIBD微生物叢によりコロニー形成させたマウス間のRORγt+Tregの割合において、有意差は存在しなかった(図4I)。
RORγt+Treg及びRORγt+Thの恒常的誘導によって、同一微生物叢によりコロニー形成させた感受性マウスにおける腸炎重症度を予測する
発明者らは、非曝露ノトバイオートB6マウスにおいて観察したCD4 T細胞応答の変動が、同一ドナー微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウスにおいて、腸炎重症度とどのように相関するかを調べた。合計で健常15種及びIBD 14種の微生物叢を、両モデルにおいて検査した(Table 1(表1))。腸炎重症度がGATA3+Th又はFoxP3+Tregと相関しない一方(図5A)、B6マウスにおいて微生物叢により誘導された結腸及び回腸RORγt+Thの割合は、同一微生物叢によりコロニー形成させたRagTCTマウスにおける腸炎重症度と正に相関した(結腸及び回腸のそれぞれにおいてR2=0.32、p=0.001;R2=0.26、p=0.004;図5A)。B6マウスにおけるRORγt+Tregの誘導は、RagTCTマウスにおける腸炎重症度と逆相関した(結腸及び回腸のそれぞれにおいてR2=0.29、p=0.002;R2=024、p=0.006;図5A)。また、結腸において誘導されたIL-17A+ CD4 T細胞の割合は、腸炎重症度と弱い関連を有した(R2=0.25、p=0.013;図S5)。線形モデルにより、腸炎重症度における53%の変動(6週目における体重減少)が、両組織におけるRORγt+Th及びRORγt+Tregの両方の割合の関数として説明された(R2=0.53、p=0.002;F検定)。腸炎重症度は、Helios+Treg、IL-10+又はIFNγ+237 CD4 T細胞とは関連しなかった(図S5)。受信者動作特性(ROC)曲線は、ロジスティックモデルを使用するヒト微生物叢ドナーの健康状態の予測において、ヒト化微生物叢マウスデータの値を評価するために使用した(図5B)。結腸RORγt+Thの割合は、合理的な予測値を有したが(AUC=0.71)、結腸RORγt+Tregの割合は、より有益であった(AUC=0.92)(図5B)。また、T細胞移入から6週後に体重減少により測定した場合の腸炎重症度は、ドナーの健康を高度に予測した(AUC=0.93)(図5B)。発明者らは、6週における結腸RORγt+Tregの割合及び腸炎重症度をロジスティックモデルにおいて複合する場合に、最良の予測力を見出した(AUC=0.95)(図5B)。
発明者らは、図6に見られるように、RORγt+Treg細胞により、腸炎感受性対象において疾患重症度が低下することを実証した。詳細には、発明者らは、2つの異なる種類の微生物叢をT細胞移入マウスに移入する作用を比較した。健常な個体(高RORγt+Tregレベルを有する)由来の微生物叢を受けたマウスでは、潰瘍性腸炎(及び結果的に低RORγtTregレベル)を有する個体由来の微生物叢を受けたマウスと比較した場合、疾患重症度が低下した。その上、RORγt+Tregを欠き、これを生成不能なナイーブT細胞をT細胞移入マウスに移入する場合、疾患重症度におけるこの低下は排除される。このような場合、健常微生物叢を受けたマウス及び潰瘍性腸炎を有する個体由来の微生物叢を受けたマウスの間の疾患重症度の差は存在しない。症候の重症度は、マウスの体重における変化率により経時的に測定する。
また、発明者らは、RORγt+Treg誘導微生物叢を治療薬として供給することにより、IBDを有するドナー由来の微生物叢を内包するマウスにおいて病態形成を低減させることが可能であることを発見した。図7は、IBD(したがって低レベルのRORγt+Treg)を有する個体2人由来の微生物叢を内包するノトバイオートマウスが、RORγt+Tregを誘導する培養微生物叢を受けた後に症候の改善を経験することを示す。症候の重症度は、マウスの体重減少の程度により経時的に測定する。発明者らは、微生物叢により誘導されたRORγt+Tregの割合が、ノトバイオートマウスにおけるこの微生物叢の密度(既知の便塊からの微生物DNAの収率として測定)に比例することを発見した。また、図7は、微生物叢密度が、健常ドナー由来の培養微生物叢による治療後に、IBDを有する個体由来の微生物叢を内包するノトバイオートマウスにおいて上昇することを示し、この密度の上昇は、結腸におけるRORγt+Treg細胞の増加と相関する。
その上、本開示は、GIにおけるRORγt+TregのRORγt+Th17細胞に対する比率が、疾患重症度の強力な予測因子であることを示す。これは、図8に見られ、非曝露ノトバイオートマウスにおけるRORγt+TregのRORγt+Th17細胞に対する比率により、腸炎感受性T細胞移入マウスにおいて疾患重症度が予測可能であることを示す。マウスにおいて見られるように作用するこの重症度は、ヒトドナーにおける病状の予測因子である。
発明者らは、3つの細菌群が、対象におけるRORγt+Tregの誘導及びIBDの治療において特に有効であることを発見した。これらは、本開示において群1、2及び3と呼ぶ。種々の群の組成物は、以下に提供する。
細菌群1:
Bacteroides_dorei_1001099st1_G4_1001099B_141217
Bacteroides_fragilis_1001099st1_H1_1001099B_141217
Bacteroides_ovatus_1001099st1_E5_1001099B_141217
Bacteroides_thetaiotaomicron_1001099st1_D1_1001099B_141217
Bifidobacterium_adolescentis_1001099st1_F6_1001099B_141217
Bifidobacterium_longum_1001099st1_H2_1001099B_141217
Bifidobacterium_longum_1001099st2_C11_1001099B_141217
Bifidobacterium_pseudocatenulatum_1001099st1_G10_1001099B_141217
Butyricicoccus_genus_1001099st1_D10_1001099B_141217
Clostridium_genus_1001099st1_E2_1001099B_141217
Collinsella_aerofaciens_1001099st1_A1_1001099B_141217
Escherichia_coli(大腸菌)_1001099st1_A12_1001099B_141217
Lactobacillus_casei_1001099st1_B4_1001099B_141217
Parabacteroides_distasonis_1001099st1_F9_1001099B_141217
Ruminococcus_torques_1001099st1_G7_1001099B_141217
細菌群2:
Anaerotruncus_colihominis_1001217st1_B4_1001217B_150727
Bacteroides_thetaiotaomicron_1001217st1_G7_1001217B_150727
Bacteroides_uniformis_1001217st1_B7_1001217B_150727
Clostridiales_1001217sp1_1001217st1_G3_1001217B_150727
Clostridium_ramosum_1001217st1_B8_1001217B_150727
Lactobacillus_paracasei_1001217st1_F3_1001217B_150727
Lactobacillus_rhamnosus_1001217st1_D6_1001217B_150727
Parabacteroides_1001217sp1_1001217st1_C5_1001217B_150727
Ruminococcus_albus_1001217st1_F5_1001217B_150727
細菌群3:
Anaerofustis_stercorihominis_1001271st1_D3_1001271B_150615
Bacteroides_ovatus_1001271st1_H2_1001271B_150615
Bacteroides_uniformis_1001271st1_A10_1001271B_150615
Bacteroides_vulgatus_1001271st1_G7_1001271B_150615
Bifidobacterium_adolescentis_1001271st1_A4_1001271B_150615
Bifidobacterium_bifidum_1001271st1_H11_1001271B_150615
Bifidobacterium_longum_1001271st1_B4_1001271B_150615
Bifidobacterium_pseudocatenulatum_1001271st1_F3_1001271B_150615
Clostridium_1001271sp1_1001271st1_H5_1001271B_150615
Collinsella_aerofaciens_1001271st1_C3_1001271B_150615
Eubacterium_rectale_1001271st1_F12_1001271B_150615
Ruminococcus_obeum_1001271st1_E5_1001271B_150615
Bacteroides_ovatus_1001271st1_D10_1001271B_151109
Bacteroides_vulgatus_1001271st1_F6_1001271B_151109
Bifidobacterium_adolescentis_1001271st1_E2_1001271B_151109
Bifidobacterium_bifidum_1001271st1_F2_1001271B_151109
Bifidobacterium_longum_1001271st1_A6_1001271B_151109
Bifidobacterium_catenulatum_1001271st1_H7_1001271B_151109
Collinsella_aerofaciens_1001271st1_C12_1001271B_151109
Anaerotruncus_colihominis_1001271st1_H4_1001271B_151109
Bacteroides_fragilis_1001271st1_A3_1001271B_151109
Bacteroides_xylanisolvens_1001271st1_B2_1001271B_151109
Clostridium_1001271sp2_1001271st1_D9_1001271B_151109
Clostridium_1001271sp3_1001271st1_B4_1001271B_151109
Coprococcus_comes_1001271st1_E1_1001271B_151109
Dorea_longicatena_1001271st1_G10_1001271B_151109
Enterococcus_faecium_1001271st1_G2_1001271B_151109
Enterococcus_faecium_1001271st2_G9_1001271B_151109
Escherichia_coli_1001271st1_H10_1001271B_151109
Eubacterium_eligens_1001271st1_F5_1001271B_151109
Eubacterium_siraeum_1001271st1_C8_1001271B_151109
Roseburia_1001271sp1_1001271st1_E4_1001271B_151109
Weissella_1001271sp1_1001271st1_G12_1001271B_151109
Weissella_1001271sp1_1001271st2_F1_1001271B_151109

Claims (18)

  1. RORγt+Th細胞の量を所定レベル未満に低下させるか、又は対象におけるRORγt+Treg細胞レベルの量を、所定レベルを超えて上昇させる治療組成物を投与する工程を含む、対象において炎症性腸疾患を治療する方法。
  2. 対象のGIにおいて細菌群1を所定レベルまで生着させる対象に、治療組成物を投与する工程を含む、請求項4に記載の方法。
  3. 対象のGIにおいて細菌群2を所定レベルまで生着させる対象に、治療組成物を投与する工程を含む、請求項4に記載の方法。
  4. 対象のGIにおいて細菌群3を所定レベルまで生着させる対象に、治療組成物を投与する工程を含む、請求項4に記載の方法。
  5. 対象から試料を得る工程と、無菌環境において前記試料をインキュベートする工程と、RORγt+Th細胞又はRORγt+Treg細胞の存在をスクリーニングする工程と、前記RORγt+Th又はRORγt+Treg細胞レベルを所定の量と比較する工程とを含む、対象において炎症性腸疾患を診断する方法。
  6. 核酸配列の単離を含む、請求項1に記載の方法。
  7. 試料に対してフローサイトメトリーを実施する工程を含む、請求項1に記載の方法。
  8. (a)対象のGIにおける細菌群1、細菌群2又は細菌群3のいずれかのレベルを決定する工程と、(b)前記量を所定レベルと比較する工程と、(c)対象のGIにおける細菌群1、細菌群2又は細菌群3のいずれかのレベルを所定レベルまで拡大させる対象に、治療組成物を投与する工程とを含む、対象において炎症性腸疾患を治療する方法。
  9. 細菌群1のレベルを、所定レベルを超えて上昇させる工程を含む、請求項8に記載の方法。
  10. 細菌群2のレベルを、所定レベルを超えて上昇させる工程を含む、請求項8に記載の方法。
  11. 細菌群3のレベルを、所定レベルを超えて上昇させる工程を含む、請求項8に記載の方法。
  12. 治療組成物が、ワクチン、アジュバント、生物製剤、医薬組成物、プロバイオティクス、食品、飲料、糞便移植、細菌組成物、若しくは動物モデルにおいて使用される試薬、又はこのような成分の組合せを含む、請求項1に記載の方法。
  13. (a)対象のGIにおける細菌群1、細菌群2又は細菌群3のいずれかのレベルを決定する工程と、(b)治療組成物を前記対象に投与する工程と、(c)前記対象の前記GIにおける細菌群1、細菌群2又は細菌群3のいずれかの前記レベルに対する前記治療組成物の作用をアッセイする工程と、(c)前記対象の前記GIにおける細菌群1、細菌群2又は細菌群3のいずれかの前記レベルに対する前記治療薬の前記作用を判定する工程とを含む、炎症性腸疾患を治療するための治療組成物を同定する方法。
  14. (a)対象のGIにおけるRORγt+Th細胞又はRORγt+Treg細胞のレベルを決定する工程と、(b)治療組成物を前記対象に投与する工程と、(c)前記対象の前記GIにおけるRORγt+Th細胞又はRORγt+Treg細胞の前記レベルに対する前記治療組成物の作用をアッセイする工程と、(c)前記対象の前記GIにおけるRORγt+Th細胞又はRORγt+Treg細胞の前記レベルに対する前記組成物の前記作用を判定する工程とを含む、炎症性腸疾患を治療するための治療組成物を同定する方法。
  15. 対象におけるRORγt+Treg細胞の生成を刺激する治療薬を投与することにより、対象において疾患を治療する方法であって、前記治療薬が、ワクチン、アジュバント、生物製剤、医薬組成物、プロバイオティクス、食品、飲料、糞便移植、細菌組成物、若しくは動物モデルにおいて使用される試薬、又はこのような成分の組合せを含む、方法。
  16. 疾患が、炎症性腸疾患であり、方法が、細菌群1を含む治療組成物を対象のGIに投与する工程を含む、請求項15に記載の方法。
  17. 疾患が、炎症性腸疾患であり、方法が、細菌群2を含む治療組成物を対象のGIに投与する工程を含む、請求項15に記載の方法。
  18. 疾患が、炎症性腸疾患であり、方法が、細菌群3を含む治療組成物を対象のGIに投与する工程を含む、請求項15に記載の方法。
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