JP2023506560A - 無細胞ｄｎａ断片化およびヌクレアーゼ - Google Patents
無細胞ｄｎａ断片化およびヌクレアーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023506560A JP2023506560A JP2022537721A JP2022537721A JP2023506560A JP 2023506560 A JP2023506560 A JP 2023506560A JP 2022537721 A JP2022537721 A JP 2022537721A JP 2022537721 A JP2022537721 A JP 2022537721A JP 2023506560 A JP2023506560 A JP 2023506560A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amount
- cell
- terminal
- free dna
- fragments
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 title description 27
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 title description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 419
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 166
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 88
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 65
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims abstract description 65
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 194
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 97
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 88
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 88
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 88
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 88
- 102100030012 Deoxyribonuclease-1 Human genes 0.000 claims description 64
- 101000863721 Homo sapiens Deoxyribonuclease-1 Proteins 0.000 claims description 64
- 102100031149 Deoxyribonuclease gamma Human genes 0.000 claims description 56
- 101000845618 Homo sapiens Deoxyribonuclease gamma Proteins 0.000 claims description 56
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 51
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 48
- 102100038023 DNA fragmentation factor subunit beta Human genes 0.000 claims description 46
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 41
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 38
- 108010014064 CCCTC-Binding Factor Proteins 0.000 claims description 33
- 102000016897 CCCTC-Binding Factor Human genes 0.000 claims description 33
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 22
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 22
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 14
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 10
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 claims description 8
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 5
- 230000035602 clotting Effects 0.000 claims description 5
- 101000950965 Homo sapiens DNA fragmentation factor subunit beta Proteins 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 69
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 84
- 101150063735 DNASE1 gene Proteins 0.000 description 58
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 50
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 47
- 101710147299 DNA fragmentation factor subunit beta Proteins 0.000 description 44
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 37
- 101150017771 Dffb gene Proteins 0.000 description 35
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 35
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 35
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 31
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 29
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 23
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 23
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 10
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 10
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 8
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 6
- 101150041872 DNASE1L3 gene Proteins 0.000 description 6
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 5
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 3
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 208000028622 Immune thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 2
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 2
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000009801 radical cystectomy Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 2
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N vinblastine Chemical compound C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-CFWMRBGOSA-N 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 201000005657 Antithrombin III deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100022977 Antithrombin-III Human genes 0.000 description 1
- 102100040124 Apoptosis-inducing factor 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 206010003658 Atrial Fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 206010006223 Breast discharge Diseases 0.000 description 1
- 101100008049 Caenorhabditis elegans cut-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 1
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100021008 Endonuclease G, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101150025764 FGFR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- 206010019837 Hepatocellular injury Diseases 0.000 description 1
- 101000890622 Homo sapiens Apoptosis-inducing factor 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699667 Mus spretus Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150095461 Tfrc gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010046308 Type II DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000007537 Type II DNA Topoisomerases Human genes 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000006470 autoimmune attack Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 108010047964 endonuclease G Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229950004444 erdafitinib Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 101150088071 fgfr2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009795 fibrotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000003168 generic drug Substances 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000437 hepatocellular injury Toxicity 0.000 description 1
- 208000033666 hereditary antithrombin deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- OLAHOMJCDNXHFI-UHFFFAOYSA-N n'-(3,5-dimethoxyphenyl)-n'-[3-(1-methylpyrazol-4-yl)quinoxalin-6-yl]-n-propan-2-ylethane-1,2-diamine Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(N(CCNC(C)C)C=2C=C3N=C(C=NC3=CC=2)C2=CN(C)N=C2)=C1 OLAHOMJCDNXHFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009598 prenatal testing Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940061969 rheumatrex Drugs 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011521 systemic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 229940066453 tecentriq Drugs 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940111528 trexall Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
- G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
- C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/113—Time
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
ヌクレアーゼに関連する遺伝子における遺伝性障害を検出するため、抗凝固剤の投与量の有効性を決定するため、およびヌクレアーゼの活性を監視するための、様々な方法、装置、およびシステムが提供される。測定されたパラメータ値を参照値と比較して、遺伝性障害、効率、または活性の分類を決定することができる。断片末端での（例えば、末端モチーフにおける）特定の塩基の量、特定のサイズの断片末端での特定の塩基の量、または無細胞ＤＮＡ断片の総量（例えば、濃度として）が使用され得る。特定の試料は、抗凝固剤で処理され得、異なるインキュベーション時間が特定の方法に使用され得る。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１８日に出願された「Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」と題する米国仮特許出願第６２／９４９，８６７号、および２０２０年１月８日に出願された「Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」と題する米国仮特許出願第６２／９５８，６５１号の利益を主張し、これらは、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１２月１８日に出願された「Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」と題する米国仮特許出願第６２／９４９，８６７号、および２０２０年１月８日に出願された「Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」と題する米国仮特許出願第６２／９５８，６５１号の利益を主張し、これらは、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、妊娠およびがんなどの多くの生理学的および病理学的状態の診断および予後予測に適用され得る豊富な情報源である（Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７７，５１３－５２２、Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，２０４５８－２０４６３、Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５０，４８５－４８７）。循環ｃｆＤＮＡは現在、非侵襲的バイオマーカーとして一般的に使用されており、短い断片の形態で循環することが知られているが、ｃｆＤＮＡの断片化および分子プロファイルを支配する生理学的要因は、依然として理解しにくいままである。
近年の研究は、ｃｆＤＮＡの断片化が、ヌクレオソームの位置決定に関連する非ランダムプロセスであることを示唆している（Ｃｈａｎｄｒａｎａｎｄａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５），ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８，２９、Ｉｖａｎｏｖ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５），ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６，Ｓ１、Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２，６１ｒａ９１－６１ｒａ９１、Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｃｅｌｌ １６４，５７－６８、Ｓｕｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（２０１９），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９，４１８－４２７））。以前に、我々は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３ヌクレアーゼが血漿中のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルに寄与することを実証している（Ｓｅｒｐａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６，６４１－６４９）。
様々な実施形態は、ヌクレアーゼに関連する遺伝子における遺伝性障害を検出するため、抗凝固剤の投与量の有効性を決定するため、およびヌクレアーゼの活性を監視するための、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の定量的断片化情報を使用する。測定されたパラメータ値を参照値と比較して、遺伝性障害、効率、または活性の分類を決定することができる。断片末端での（例えば、末端モチーフにおける）特定の塩基の量、特定のサイズの断片末端での特定の塩基の量、または無細胞ＤＮＡ断片の総量（例えば、濃度として）が使用され得る。特定の試料は、抗凝固剤で処理され得、異なるインキュベーション時間がいくつかの実施形態において使用され得る。
例えば、参照値と比較した断片末端での特定の塩基の量を使用して、抗凝固剤で処理された試料中の特定のサイズの断片末端での特定の塩基の量を使用して、および異なる時間にわたって抗凝固剤とインキュベートされた試料についての断片末端での特定の塩基の量を比較して、遺伝子についての遺伝性障害を検出するための、いくつかの実施形態が提供される。
例えば、抗凝固剤を投与された対象の試料中の断片末端での特定の塩基の量を使用して、および抗凝固剤を投与された対象の試料中の特定のサイズの断片末端での特定の塩基の量を使用して、抗凝固剤の投与量の有効性を決定するための、いくつかの実施形態が提供される。
例えば、参照値と比較して試料中の断片末端での特定の塩基の量を使用して、および試料中の特定のサイズの断片末端での特定の塩基の量を使用して、ヌクレアーゼの活性を監視するための、いくつかの実施形態が提供される。
本開示のこれらの実施形態および他の実施形態を、以下で詳細に説明する。例えば、他の実施形態は、本明細書に記載の方法に関連付けられたシステム、デバイス、およびコンピュータ可読媒体を対象とする。
本開示の実施形態の性質および利点のより良好な理解は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して得ることができる。
用語
「組織」は、機能単位としてともにグループ化する細胞のグループに対応する。２つ以上のタイプの細胞が、単一の組織内に見出され得る。種々のタイプの組織は、種々のタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞、または血球細胞）からなり得るが、種々の生物（母体対胎児）由来の組織または健常細胞対腫瘍細胞にも対応し得る。「参照組織」は、組織特異的メチル化レベルを決定するために使用される組織に対応し得る。種々の個体由来の同じ組織タイプの複数の試料を使用して、その組織タイプの組織特異的メチル化レベルを決定することができる。
「組織」は、機能単位としてともにグループ化する細胞のグループに対応する。２つ以上のタイプの細胞が、単一の組織内に見出され得る。種々のタイプの組織は、種々のタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞、または血球細胞）からなり得るが、種々の生物（母体対胎児）由来の組織または健常細胞対腫瘍細胞にも対応し得る。「参照組織」は、組織特異的メチル化レベルを決定するために使用される組織に対応し得る。種々の個体由来の同じ組織タイプの複数の試料を使用して、その組織タイプの組織特異的メチル化レベルを決定することができる。
「生物学的試料」は、対象（例えば、妊婦、がんもしくは他の疾患を有する人、またはがんもしくは他の疾患を有する疑いがある人などのヒト（または他の動物）、臓器移植レシピエント、または臓器が関与する疾患プロセス（例えば、心筋梗塞における心臓、脳卒中における脳、もしくは貧血における造血系）を有する疑いがある対象）から採取され、目的の１つ以上の核酸分子を含有する任意の試料を指す。生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、膣液、水腫（例えば、精巣の）からの液体、膣洗浄液体、胸膜液、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳首からの排出液、体の種々の部分（例えば、甲状腺、乳腺）からの吸引液、眼内液（例えば、房水）などの体液であり得る。便試料もまた、使用され得る。様々な実施形態において、無細胞ＤＮＡのために濃縮された生物学的試料（例えば、遠心分離プロトコルを介して取得された血漿試料）におけるＤＮＡの大部分は、無細胞であり得、例えば、ＤＮＡの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、または９９％超は、無細胞であり得る。遠心分離プロトコルは、例えば、３，０００ｇ×１０分で流体部分を取得することと、残留細胞を除去するために３０，０００ｇでさらに１０分間再遠心分離することと、を含み得る。生物学的試料の分析の一部として、統計的に有意な数の無細胞ＤＮＡ分子が、生物学的試料について分析され得る（例えば、正確な測定値を提供するために）。いくつかの実施形態において、少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子が分析される。他の実施形態において、少なくとも１０，０００個または５０，０００個または１００，０００個または５００，０００個または１，０００，０００個または５，０００，０００個、またはそれより多い無細胞ＤＮＡ分子が分析され得る。少なくとも同数の配列リードが分析され得る。
「配列リード」は、核酸分子の任意の部分または全部から配列決定されるヌクレオチドの鎖を指す。例えば、配列リードは、核酸断片から配列決定された短鎖ヌクレオチド（例えば、約２０～１５０ヌクレオチド）、核酸断片の片端もしくは両端の短鎖ヌクレオチド、または生物学的試料中に存在する核酸断片全体の配列決定であり得る。配列リードは、例えば、配列決定技術を使用した、またはプローブを使用した種々の方法で、例えば、ハイブリダイゼーションアレイもしくはマイクロアレイで使用され得るような捕捉プローブで、または単一プライマーもしくは等温増幅を使用した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは線形増幅などの増幅技術で、取得することができる。生物学的試料の分析の一部として、少なくとも１，０００個の配列リードが分析され得る。他の例として、少なくとも１０，０００個または５０，０００個または１００，０００個または５００，０００個または１，０００，０００個または５，０００，０００個、またはそれより多い配列リードが分析され得る。
配列リードは、断片の末端に関連する「末端配列」を含み得る。末端配列は、断片の最も外側のＮ塩基、例えば断片の末端の１～３０塩基に対応し得る。配列リードが断片全体に対応する場合、配列リードは２つの末端配列を含み得る。対の末端配列決定が断片の末端に対応する２つの配列リードを提供する場合、各配列リードは１つの末端配列を含み得る。
「配列モチーフ」は、ＤＮＡ断片（例えば、無細胞ＤＮＡ断片）における塩基の短い繰り返しパターンを指し得る。配列モチーフは、断片の末端に生じ得、したがって、末端配列の一部であるか、またはそれを含み得る。「末端モチーフ」は、潜在的に特定のタイプの組織について、ＤＮＡ断片の末端で優先的に生じる末端配列についての配列モチーフを指し得る。末端モチーフはまた、断片の末端の直前または直後に生じ得、それにより、依然として末端配列に対応する。ヌクレアーゼは、特定の末端モチーフに対する特定の切断選択、ならびに第２の末端モチーフに対する２番目に好ましい切断選択を有し得る。
「対立遺伝子」という用語は、同じ物理的ゲノム遺伝子座にある代替ＤＮＡ配列を指し、異なる表現型の特徴をもたらす場合ともたらさない場合がある。各染色体のコピーが２つある任意の特定の二倍体生物（男性の対象の性染色体を除く）では、各遺伝子の遺伝子型は、ホモ接合体においては同じであり、ヘテロ接合体においては異なる、その遺伝子座に存在する対立遺伝子の対を含む。生物の集団または種は、典型的には、様々な個体の各遺伝子座に複数の対立遺伝子を含む。集団内に２つ以上の対立遺伝子が見られるゲノム遺伝子座は、多型部位と呼ばれる。遺伝子座での対立遺伝子多様性は、存在する対立遺伝子の数（すなわち、多型の程度）、または集団内のヘテロ接合体の割合（すなわち、ヘテロ接合性率）として測定可能である。本明細書で使用される「多型」という用語は、その頻度に関係なく、ヒトゲノムにおける任意の個体間の多様性を指す。そのような多様性の例は、一塩基多型、単純なタンデムリピート多型、挿入－欠失多型、変異（疾患を引き起こし得る）、およびコピー数の多様性を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ハプロタイプ」という用語は、同じ染色体または染色体領域上で一緒に伝達される複数の遺伝子座での対立遺伝子の組み合わせを指す。ハプロタイプは、わずか１対の遺伝子座、または染色体領域、または染色体全体または染色体腕を指し得る。
「相対頻度」（単に「頻度」とも称される）は、割合（例えば、パーセンテージ、画分、または濃度）を指し得る。特に、特定の末端モチーフ（例えば、ＣＣＧＡまたは単一塩基のみ）の相対頻度は、例えば、ＣＣＧＡの末端配列を有することによって、末端モチーフＣＣＧＡに関連する試料中の無細胞ＤＮＡ断片の割合を提供し得る。
「集計値」は、例えば、末端モチーフのセットの相対的頻度の集合的特性を指し得る。例には、平均、中央値、相対頻度の合計、相対頻度間の変動（例えば、エントロピー、標準偏差（ＳＤ）、変動係数（ＣＶ）、四分位範囲（ＩＱＲ）、または種々の相対頻度中の特定のパーセンタイルカットオフ（例えば９５または９９パーセンタイル））、またはクラスタリングで実装し得る相対頻度の参照パターンからの差（例えば、距離）を含む。
「較正試料」は、所望の測定値（例えば、ヌクレアーゼ活性、遺伝性障害の分類、または他の所望の特性）が既知であるか、または較正方法を介して、例えば、有効投与量の測定のための凝固測定、またはヌクレアーゼ量を測定するためのＥＬＩＳＡ、またはヌクレアーゼ活性を測定するためのヌクレアーゼによるＤＮＡ消化の速度を定量化するアッセイなどの他の測定技術を使用して決定される、生物学的試料に対応することができる。例示的な測定は、ｃｆＤＮＡ量の蛍光測定または分光光度測定を含み得、これは、それ自体で、またはヌクレアーゼ含有試料の添加の前、後、および／またはそれとリアルタイムで行われ得る。別の例は、放射状酵素拡散法を使用することである。較正試料は、別々の測定値（例えば、特定の末端モチーフを有するか、または特定のサイズを有する断片の量）を有することができ、所望の測定値がどれに相関し得るかが決定され得る。
「較正データ点」は、「較正値」（例えば、特定の末端モチーフを有するか、または特定のサイズを有する断片の量）、および他の試験試料について決定されることが望まれる測定値もしくは既知の値を含む。較正値は、試料のＤＮＡ分子から測定された様々なタイプのデータから決定され得る（例えば、末端モチーフを有するか、または特定のサイズを有する断片の量）。較正値は、所望の特性、例えば、遺伝性障害の分類、ヌクレアーゼ活性、または抗凝固剤投与の有効性に相関するパラメータに対応する。例えば、較正値は、所望の特性が既知である較正試料に対して決定された測定値から決定され得る。較正データ点は、様々な方法で、例えば、離散点として、または較正関数（検量線または較正面とも呼ばれる）として定義され得る。較正関数は、較正データ点の追加の数学的変換から導出され得る。
「部位」（「ゲノム部位」とも呼ばれる）は、単一の塩基位置、または相関する塩基位置の群、例えば、ＣｐＧ部位、ＴＳＳ部位、Ｄｎａｓｅ過敏性部位、または相関する塩基位置のより大きい群であり得る、単一の部位に対応する。「遺伝子座」は、複数の部位を含む領域に対応し得る。遺伝子座は、遺伝子座をその文脈における部位と等価にするであろうただ１つの部位を含み得る。
「ｃｆＤＮＡプロファイル」は、試料中のｃｆＤＮＡ断片（単にＤＮＡ断片とも称される）の末端配列（例えば、１～３０塩基）の関係を指し得る。例えば、特定の末端配列（末端モチーフ）を有するｃｆＤＮＡ断片の量、１つ以上の他の末端配列と比較した特定の末端配列を有するｃｆＤＮＡ断片の相対頻度、ならびにサイズなどの他のパラメータを含む、様々な関係が提供され得る。ｃｆＤＮＡプロファイルは、様々なサイズのｃｆＤＮＡ断片について提供され得る。そのようなｃｆＤＮＡプロファイル（ｃｆＤＮＡサイズプロファイルと称されることもある）は、所与のサイズ（単一の長さまたはサイズ範囲）について１つ以上の特定の末端配列を有するｃｆＤＮＡ断片の量を示す様々な方法で提供され得る。
「分離値」は、２つの値を包含する差または比、例えば、２つの画分寄与または２つのメチル化レベルに相当する。分離値は、単純な差または比であり得る。例として、ｘ／ｙの直接比は、ｘ／（ｘ＋ｙ）と同様に分離値である。分離値は、他の因子、例えば、乗法的因子を含み得る。他の例として、値の関数の差または比、例えば、２つの値の自然対数（ｌｎ）の差または比が使用され得る。分離値には、差および比を含み得る。
「分離値」および「集計値」（例えば、相対頻度）は、異なる分類（状態）間で変化する試料の測定値を提供するパラメータ（メトリックとも呼ばれる）の２つの例であり、したがって様々な分類を決定するために使用され得る。集計値は、例えば、クラスタリングで行われるように、試料の相対頻度のセットと相対頻度の参照セット間で差が取られる場合の分離値であり得る。
本明細書で使用される「分類」という用語は、試料の特定の特性と関係した任意の数または他の特徴を指す。例えば、「＋」という記号（または「陽性」という語）は、試料が欠失または増幅を有するものとして分類されることを意味し得る。分類は、二者択一（例えば、陽性もしくは陰性）であり得、またはより多くのレベルの分類（例えば、１～１０もしくは０～１のスケール）を有し得る。
「カットオフ」および「閾値」という用語は、ある操作において使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、それを超えると断片が除外されるサイズを指し得る。閾値は、特定の分類が適用されるのを上回るまたは下回る値であり得る。これらの用語のいずれかは、これらの文脈のいずれかにおいて使用され得る。カットオフまたは閾値は、「参照値」であり得るか、または特定の分類を表すか、もしくは２つ以上の分類間を区別する参照値から導出され得る。そのような参照値は、当業者によって理解されるように、様々な方法で決定され得る。例えば、メトリックは、異なる既知の分類を有する対象の２つの異なるコホートについて決定され得、参照値は、１つの分類（例えば、平均）の代表として、またはメトリックの２つのクラスター間の値（例えば、所望の感度および特異度を取得するために選択された）として選択され得る。別の例として、参照値は、試料の統計シミュレーションに基づいて決定され得る。カットオフ、閾値、参照などの特定の値は、所望の精度（例えば、感度および特異度）に基づいて決定され得る。
「病理のレベル」（または障害のレベル）とは、生物に関連する病理の量、低度、または重症度を指し得る。一例は、ヌクレアーゼの発現における細胞障害である。病理の別の例は、移植された臓器の拒絶反応である。他の病理の例には、自己免疫発作（例えば、腎臓を損傷するループス腎炎または多発性硬化症）、炎症性疾患（例えば、肝炎）、線維化プロセス（例えば、肝硬変）、脂肪浸潤（例えば、脂肪肝疾患）、変性プロセス（例えば、アルツハイマー病）、および虚血性組織損傷（例えば、心筋梗塞または脳卒中）を含み得る。対象の健康な状態は、病理のない分類とみなし得る。病理は、がんであり得る。
「がんのレベル」という用語は、がんが存在するかどうか（すなわち、存在または不在）、がんのステージ、腫瘍のサイズ、転移があるかどうか、体の総腫瘍負荷、治療に対するがんの応答、および／またはがんの重症度の他の尺度（例えば、がんの再発）を指し得る。がんのレベルは、数字、または、記号、アルファベット文字、および色などの他のしるしであり得る。レベルは、ゼロであり得る。がんのレベルは、前悪性病態または前がん性病態（状態）も含み得る。がんのレベルは、様々な方法で使用され得る。例えば、スクリーニングは、がんを有することを今まで知らなかった人物においてがんが存在するかどうかをチェックし得る。評価は、がんと診断されている人物を調べて、がんの進行を経時的に監視し、療法の有効性を研究し、または予後を決定し得る。一実施形態では、予後は、患者ががんで死亡する可能性、または特定の持続時間または特定の時間の後、がんが進行する可能性、またはがんが転移する可能性もしくは程度として表すことができる。検出は、「スクリーニング」を意味することができ、またはがんの示唆的な特徴（例えば、症状または他の陽性検査）を有する人物ががんを有するかどうかをチェックすることを意味し得る。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し得、これは値の測定または決定方法、すなわち測定システムの制限について部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例により、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、「約」または「およそ」という用語は、値の１桁以内、５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本出願および特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容誤差範囲内の「約」という用語を想定すべきである。「約」という用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有し得る。「約」という用語は、±１０％を指し得る。「約」という用語は、±５％を指し得る。
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、がんおよび出生前検査のための強力な非侵襲的バイオマーカーであり、血漿（および他の無細胞試料）中を短い断片として循環する。本開示において、ｃｆＤＮＡ断片化におけるＤＮＡＳＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、およびＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ、カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅとしても既知）のそれぞれの役割を調査した。ｃｆＤＮＡ断片化の生物学を解明するために、これらのヌクレアーゼの各々を欠損したマウスを用いて、ＤＮＡＳＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、およびＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）の役割を分析した。
分析例において、ｃｆＤＮＡ断片の末端塩基を含む、各タイプのヌクレアーゼを欠損したマウスと野生型の対応物との間でｃｆＤＮＡプロファイル（ｃｆＤＮＡサイズプロファイルを含む）を比較した。ＤＮＡ断片の末端塩基は、あるタイプの末端モチーフであり、特定の塩基で終わるｃｆＤＮＡ断片の相対量（例えば、割合）の測定は、組織ヌクレアーゼ活性、組織ヌクレアーゼ活性に関連するｃｆＤＮＡ断片源、ヌクレアーゼ機能、およびヌクレアーゼに影響を与える障害に関する情報を提供することができる。各ヌクレアーゼが、ｃｆＤＮＡ断片化において異なるが補完的な役割を果たしたことを発見した。
各タイプのヌクレアーゼ欠損マウスにおけるｃｆＤＮＡ断片の末端を野生型マウスの末端と分析することによって、各ヌクレアーゼが、ｃｆＤＮＡ断片化の段階的なプロセスを明らかにする特定の切断選択（例えば、特定の末端モチーフ）を有することを示す。ｃｆＤＮＡが、最初にＤＦＦＢを用いて細胞内で、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３および他のヌクレアーゼを用いて細胞内で生成されることを実証する。次いで、ｃｆＤＮＡ断片化は、循環ＤＮＡＳＥ１Ｌ３およびＤＮＡＳＥ１を用いて細胞外で継続する。ヌクレオソーム構造を破壊するためにヘパリンを使用することで、１０ｂｐの周期性が無傷のヌクレオソーム構造内のＤＮＡの切断に由来したことも示した。要するに、本開示は、ｃｆＤＮＡ断片化のモデルを確立する。
ヌクレアーゼに関連する遺伝子における遺伝性障害を検出するため、抗凝固剤の投与量の有効性を決定するため、およびヌクレアーゼの活性を監視するための、様々な実施形態が提供される。
例えば、参照値と比較した断片末端での特定の塩基の量を使用して、抗凝固剤で処理された試料中の特定のサイズの断片末端での特定の塩基の量を使用して、および異なる時間にわたって抗凝固剤とインキュベートされた試料についての断片末端での特定の塩基の量を比較して、遺伝子についての遺伝性障害を検出するための、様々な技術が提供される。
例えば、抗凝固剤を投与された対象の試料中の断片末端での特定の塩基の量を使用して、および抗凝固剤を投与された対象の試料中の特定のサイズの断片末端での特定の塩基の量を使用して、抗凝固剤の投与量の有効性を決定するための、様々な技術が提供される。
例えば、参照値と比較して試料中の断片末端での特定の塩基の量を使用して、および試料中の特定のサイズの断片末端での特定の塩基の量を使用して、ヌクレアーゼの活性を監視するための、様々な技術が提供される。
Ｉ．無細胞ＤＮＡ末端モチーフ
末端モチーフは、無細胞ＤＮＡ断片の末端配列、例えば、断片のいずれかの末端でのＫ塩基の配列に関する。末端配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７などの様々な数の塩基を有するｋ ｍｅｒであり得る。末端モチーフ（または「配列モチーフ」）は、参照ゲノムの特定の位置とは対照的に、配列自体に関する。したがって、同じ末端モチーフは、参照ゲノム全体の多数の位置に生じ得る。末端モチーフは、例えば、開始位置の直前または終了位置の直後の塩基を同定するために、参照ゲノムを使用して決定され得る。このような塩基は、例えば、断片の末端配列に基づいて同定されるため、無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する。
末端モチーフは、無細胞ＤＮＡ断片の末端配列、例えば、断片のいずれかの末端でのＫ塩基の配列に関する。末端配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７などの様々な数の塩基を有するｋ ｍｅｒであり得る。末端モチーフ（または「配列モチーフ」）は、参照ゲノムの特定の位置とは対照的に、配列自体に関する。したがって、同じ末端モチーフは、参照ゲノム全体の多数の位置に生じ得る。末端モチーフは、例えば、開始位置の直前または終了位置の直後の塩基を同定するために、参照ゲノムを使用して決定され得る。このような塩基は、例えば、断片の末端配列に基づいて同定されるため、無細胞ＤＮＡ断片の末端に対応する。
図１は、本開示の実施形態による末端モチーフの例を示す。図１は、分析する４ｍｅｒ末端モチーフを定義する２つの方法を示す。技術１４０において、４ｍｅｒ末端モチーフは、血漿ＤＮＡ分子の各末端の最初の４ｂｐ配列から直接構築される。例えば、配列決定された断片の最初の４ヌクレオチドまたは最後の４ヌクレオチドが使用され得る。技術１６０において、４ｍｅｒ末端モチーフは、断片の配列決定された末端からの２ｍｅｒ配列およびその断片の末端に隣接するゲノム領域からの他の２ｍｅｒ配列を利用することによって共同で構築される。他の実施形態において、他のタイプのモチーフ、例えば、１ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ末端モチーフが使用され得る。
図１に示すとおり、無細胞ＤＮＡ断片１１０は、例えば、遠心分離などによる血液試料の精製プロセスを使用して取得される。血漿ＤＮＡ断片に加えて、例えば、血清、尿、唾液、および本明細書で言及される他の試料由来の他のタイプの無細胞ＤＮＡ分子が使用され得る。一実施形態において、ＤＮＡ断片は、平滑末端化され得る。
ブロック１２０で、ＤＮＡ断片は、対末端配列決定に供される。いくつかの実施形態において、対末端配列決定は、ＤＮＡ断片の２つの末端から２つの配列リード、例えば、配列リード当たり３０～１２０塩基を生成し得る。これらの２つの配列リードは、ＤＮＡ断片（分子）の一対のリードを形成し得、各配列リードは、ＤＮＡ断片のそれぞれの末端の末端配列を含む。他の実施形態において、ＤＮＡ断片全体が配列決定され得、それにより、ＤＮＡ断片の両端の末端配列を含む単一の配列リードを提供する。両端の２つの末端配列は、単一の配列決定操作から一緒に生成された場合でも、対の配列リードとみなされ得る。
ブロック１３０で、配列リードは、参照ゲノムにアラインメントされ得る。このアラインメントは、配列モチーフを定義するための異なる方法を説明するためのものであり、いくつかの実施形態において使用されない場合がある。例えば、断片の末端にある配列は、参照ゲノムにアラインメントする必要なく直接使用され得る。しかしながら、アラインメントは、対象における変動（例えば、ＳＮＰ）に依存しない、末端配列の均一性を有することが望ましい場合がある。例えば、変動または配列決定誤差により、末端塩基が参照ゲノムと異なる可能性があるが、参照における塩基は、カウントされたものであり得る。あるいは、配列リードの末端の塩基は、個々に合わせて調整されるように使用され得る。アラインメント手順は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｂｏｗｔｉｅ、ＢＷＡ、ＢＦＡＳＴ、ＳＨＲｉＭＰ、ＳＳＡＨＡ２、ＮｏｖｏＡｌｉｇｎ、およびＳＯＡＰなど（であるがこれらに限定されない）様々なソフトウェアパッケージを使用して実施され得る。
技術１４０は、ゲノム１４５へのアラインメントを有する、配列決定された断片１４１の配列リードを示す。５’末端を開始とみなして、第１の末端モチーフ１４２（ＣＣＣＡ）は、配列決定された断片１４１の開始にある。第２の末端モチーフ１４４（ＴＣＧＡ）は、配列決定された断片１４１の尾部にある。ｃｆＤＮＡ断片の末端優位性を分析する場合、この配列リードは、５’末端のＣ末端カウントに寄与する。そのような末端モチーフは、一実施形態において、酵素がＣＣＣＡを認識し、次に最初のＣの直前に切断を行うときに生じ得る。その場合、ＣＣＣＡは優先的に血漿ＤＮＡ断片の末端にある。ＴＣＧＡの場合、酵素がそれを認識し、次いで、Ａの後に切断を行い得る。Ａについてカウントが決定されると、この配列リードは、Ａ末端カウントに寄与する。
技術１６０は、ゲノム１６５へのアラインメントを有する、配列決定された断片１６１の配列リードを示す。５’末端を開始とみなして、第１の末端モチーフ１６２（ＣＧＣＣ）は、配列決定された断片１６１の開始の直前に生じる第１の部分（ＣＧ）、および配列決定された断片１６１の開始の末端配列の一部である第２の部分（ＣＣ）を有する。第２の末端モチーフ１６４（ＣＣＧＡ）は、配列決定された断片１６１の尾部の直後に生じる第１の部分（ＧＡ）、および配列決定された断片１６１の尾部の末端配列の一部である第２の部分（ＣＣ）を有する。そのような末端モチーフは、一実施形態において、酵素がＣＧＣＣを認識し、次いで、ＧおよびＣの直前を切断するときに生じ得る。その場合、ＣＣは、その直前にＣＧが生じている血漿ＤＮＡ断片の末端に優先的に存在し、それによってＣＧＣＣの末端モチーフを提供するであろう。第２の末端モチーフ１６４（ＣＣＧＡ）については、酵素はＣとＧとの間を切断し得る。その場合、ＣＣは優先的に血漿ＤＮＡ断片の末端に存在するであろう。技術１６０について、隣接するゲノム領域および配列決定された血漿ＤＮＡ断片からの塩基の数を変えられ得、必ずしも固定比率に制限されるとは限らず、例えば、２：２の代わりに、比率は２：３、３：２、４：４、２：４などであり得る。
無細胞ＤＮＡ末端のシグネチャに含まれるヌクレオチドの数が多いほど、モチーフの特異性が高くなり、これは、ゲノムにおいて正確な構成で順序付けられた６塩基を有する確率が、ゲノムにおいて正確な構成で順序付けられた２塩基を有する確率よりも低いためである。したがって、末端モチーフの長さの選択は、使用目的の用途に必要な感度および／または特異度によって支配され得る。
末端配列は、配列リードを参照ゲノムにアラインメントするために使用されるため、末端配列、または直前／直後から決定された任意の配列モチーフは、依然として末端配列から決定される。したがって、技術１６０は、他の塩基への末端配列の関連を作成し、参照は、その関連を作成するためのメカニズムとして使用される。技術１４０と１６０間の差は、特定のＤＮＡ断片がどの２つの末端モチーフに割り当てられるかであり、これは、相対頻度についての特定の値に影響を与える。しかし、全体的な結果（例えば、遺伝性障害の検出、投与量の有効性の決定、ヌクレアーゼの活性の監視など）は、一貫した技術が、例えば、機械学習モデルを使用して生じ得る、参照値を決定するための任意の訓練データに使用される限り、ＤＮＡ断片が末端モチーフにどのように割り当てられるかによって影響されないであろう。
特定の末端モチーフ（例えば、特定の塩基）に対応する末端配列を有するＤＮＡ断片のカウントされた数は、特定の末端モチーフの量を決定するためにカウントされ得る（例えば、メモリ内のアレイに保存され得る）。量は、生のカウントまたは頻度など、量が正規化される様々な方法で測定され得る。正規化は、ＤＮＡ断片の総数またはＤＮＡ断片の指定された群内の数（例えば、指定された領域から、指定されたサイズを有する、または１つ以上の指定された末端モチーフを有する）を使用して（例えば、それで除算して）行われ得る。遺伝性障害が存在する場合、ならびに有効量の抗凝固剤が投与された場合、ならびにヌクレアーゼの活性が変化（例えば、増加または減少）した場合）、末端モチーフの量の差が検出されている。
ＩＩ．循環ＣＦＤＮＡおよび新鮮なＣＦＤＮＡにおける末端選択
循環ｃｆＤＮＡは、対象から取得された試料、例えば、血液または血漿から直接見つけることができる。そのような循環ｃｆＤＮＡは、体内に無細胞形態で存在する。したがって、無細胞ＤＮＡは、体内の細胞から（例えば、アポトーシスまたは壊死を介して）産生され、次いで、無細胞ＤＮＡは循環し始めた（例えば、血液中）。対照的に、新鮮なｃｆＤＮＡは、身体由来の細胞から取得され、次いで、細胞が体外にある間に、例えばインキュベーションなどの様々な方法のいずれかで細胞を死滅させることによって、無細胞ＤＮＡが生成される。好ましい末端配列の差が観察された。
循環ｃｆＤＮＡは、対象から取得された試料、例えば、血液または血漿から直接見つけることができる。そのような循環ｃｆＤＮＡは、体内に無細胞形態で存在する。したがって、無細胞ＤＮＡは、体内の細胞から（例えば、アポトーシスまたは壊死を介して）産生され、次いで、無細胞ＤＮＡは循環し始めた（例えば、血液中）。対照的に、新鮮なｃｆＤＮＡは、身体由来の細胞から取得され、次いで、細胞が体外にある間に、例えばインキュベーションなどの様々な方法のいずれかで細胞を死滅させることによって、無細胞ＤＮＡが生成される。好ましい末端配列の差が観察された。
Ａ．典型的な循環ＣＦＤＮＡにおけるＣ末端選択
野生型（ＷＴ）マウスにおける異なるゲノム領域内のｃｆＤＮＡ断片の５’末端での塩基含有量の割合を分析して、ｃｆＤＮＡ断片化がランダムではないという仮説を検証した。血液試料の場合、ＥＤＴＡを抗凝固剤として使用し、血漿ヌクレアーゼを阻害して、低温、例えば、－５℃～２０℃などの標準的な冷蔵庫温度に保持された場合に初期状態に比較的近い無細胞ＤＮＡのサイズプロファイル、末端モチーフの頻度、および濃度を維持することができる。より高い温度（例えば、室温）でインキュベートされた場合、新鮮なｃｆＤＮＡは、インキュベーション時間の量に依存する量で生成される。０の時間は、室温でのインキュベーションがないことを示す。
野生型（ＷＴ）マウスにおける異なるゲノム領域内のｃｆＤＮＡ断片の５’末端での塩基含有量の割合を分析して、ｃｆＤＮＡ断片化がランダムではないという仮説を検証した。血液試料の場合、ＥＤＴＡを抗凝固剤として使用し、血漿ヌクレアーゼを阻害して、低温、例えば、－５℃～２０℃などの標準的な冷蔵庫温度に保持された場合に初期状態に比較的近い無細胞ＤＮＡのサイズプロファイル、末端モチーフの頻度、および濃度を維持することができる。より高い温度（例えば、室温）でインキュベートされた場合、新鮮なｃｆＤＮＡは、インキュベーション時間の量に依存する量で生成される。０の時間は、室温でのインキュベーションがないことを示す。
図２Ａ～２Ｅは、本開示の実施形態による、異なる領域内の参照ゲノム含有量と比較した、ＷＴ ｃｆＤＮＡ断片の５’末端の塩基含有量を示す。これらの図は、参照ゲノムの一般的な塩基含有量と比較した末端モチーフ（この例では単一塩基）の塩基含有率を使用した、Ｔ／Ａと比較したＣ／Ｇでの断片化についての選択を示す。
１．断片の末端モチーフについての塩基含有率の定義
図２Ａは、断片がアラインメントされている凝集領域２０５を示し、断片は、５’末端の末端塩基に基づいてラベル付けされている。横軸は、領域の中心に対する相対位置を示す。そのような領域のタイプの例には、オープンクロマチン領域、ＣＴＣＦ領域、例えば、特定のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）の過敏性部位に関連する領域、Ｐｏｌ ＩＩ領域（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）、および転写開始部位（ＴＳＳ）に関連する領域が含まれる。参照ゲノムには各タイプの領域のインスタンスが多くあるため、アラインメントされたカウントデータ（例えば、領域の所与のインスタンスの各位置についての末端モチーフのカウント）は、領域タイプの多くのインスタンスにわたって集計される。位置０は、各インスタンスについて選択され、これによりカウントは、各末端モチーフ、この例では特定の塩基の所与の位置について集計され得る。
図２Ａは、断片がアラインメントされている凝集領域２０５を示し、断片は、５’末端の末端塩基に基づいてラベル付けされている。横軸は、領域の中心に対する相対位置を示す。そのような領域のタイプの例には、オープンクロマチン領域、ＣＴＣＦ領域、例えば、特定のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）の過敏性部位に関連する領域、Ｐｏｌ ＩＩ領域（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）、および転写開始部位（ＴＳＳ）に関連する領域が含まれる。参照ゲノムには各タイプの領域のインスタンスが多くあるため、アラインメントされたカウントデータ（例えば、領域の所与のインスタンスの各位置についての末端モチーフのカウント）は、領域タイプの多くのインスタンスにわたって集計される。位置０は、各インスタンスについて選択され、これによりカウントは、各末端モチーフ、この例では特定の塩基の所与の位置について集計され得る。
縦線２６０は、各位置についてパーセンテージがどのように決定されるかを例示する。パーセンテージは、特定の塩基でラベル付けされたリードのものであり、これは上記のように、５’末端の末端塩基に対応する。したがって、所与の位置でのパーセンテージの計算は、その位置で終わる断片のすべてを使用する。図２Ａ中、塩基含有量は、縦線２６０に対応する位置で５０％のＡおよび５０％のＣである。末端モチーフが１ｍｅｒを超える場合、パーセンテージの決定は、３以上である可能な末端モチーフの数、例えば、２ｍｅｒである末端モチーフについては１６を説明することができる。
２．参照の一般的な塩基含有量と比較した末端塩基含有量
図２Ｂは、参照ゲノム含有量についての（すなわち、参照ゲノムの）ランダム領域内の位置での塩基含有率のプロットを示す。ランダム領域を、１０００個の塩基の領域を定義する位置０をランダムに選択し、次いで、その位置と比較して参照ゲノムにおける塩基含有量を決定することによって生成した。したがって、図２Ｂは、ＤＮＡ断片の末端塩基を使用して決定されるのではなく、代わりに、ランダムに選択された位置と比較した参照ゲノムの塩基含有量が使用される。図２Ｂは、位置０までの相対距離についての末端塩基のパーセンテージの変動がないことを示す。異なる塩基についてのパーセンテージは、参照ゲノムにおける塩基の発生の差の結果としての差を有するが、所与の塩基についてのパーセンテージは、一定である。図２Ｂの特定のデータの場合、約１０，０００個のランダムな位置を選択し、それらの位置の周辺の塩基を分析した。これらの位置は、位置０に示される。参照ゲノム含有量のランダムな領域において、ＡおよびＴの割合は等しく、ＣおよびＧの割合は等しい。ランダムな領域の場合、塩基含有率は、均一である。ＴおよびＡについてのパーセンテージは、３０％をわずかに下回り、ＧおよびＣについては２０％をわずかに上回る。
図２Ｂは、参照ゲノム含有量についての（すなわち、参照ゲノムの）ランダム領域内の位置での塩基含有率のプロットを示す。ランダム領域を、１０００個の塩基の領域を定義する位置０をランダムに選択し、次いで、その位置と比較して参照ゲノムにおける塩基含有量を決定することによって生成した。したがって、図２Ｂは、ＤＮＡ断片の末端塩基を使用して決定されるのではなく、代わりに、ランダムに選択された位置と比較した参照ゲノムの塩基含有量が使用される。図２Ｂは、位置０までの相対距離についての末端塩基のパーセンテージの変動がないことを示す。異なる塩基についてのパーセンテージは、参照ゲノムにおける塩基の発生の差の結果としての差を有するが、所与の塩基についてのパーセンテージは、一定である。図２Ｂの特定のデータの場合、約１０，０００個のランダムな位置を選択し、それらの位置の周辺の塩基を分析した。これらの位置は、位置０に示される。参照ゲノム含有量のランダムな領域において、ＡおよびＴの割合は等しく、ＣおよびＧの割合は等しい。ランダムな領域の場合、塩基含有率は、均一である。ＴおよびＡについてのパーセンテージは、３０％をわずかに下回り、ＧおよびＣについては２０％をわずかに上回る。
図２Ｄは、参照ゲノム含有量についてのＣＴＣＦ領域内の位置での塩基含有率のプロットを示す。ＣＴＣＦ領域は、真核生物ゲノム内にほぼ不変の位置を有するヌクレオソームが隣接していることが知られており、それによってゲノム領域の機能に応じて任意の選択を示す。ＣＴＣＦ領域の場合、塩基含有率は、ＣＴＣＦ部位で反転し、Ｇ／Ｃの含有量は、Ｔ／Ａよりも高い。
図２Ｃは、ランダム領域内のＷＴ ＥＤＴＡ ０時間試料におけるｃｆＤＮＡ断片の５’末端の塩基含有量を示す。したがって、図２Ｃについては、インキュベーションは行われなかった。末端塩基についてのカウントデータを、ランダムに選択された位置に対する各位置で集計し、パーセンテージを、その位置で終わる各塩基の相対頻度について決定した。塩基含有率は、Ａ末端２１０、Ｇ末端２２０、Ｔ末端２３０、およびＣ末端２４０について示される。断片化が完全にランダムであった場合、末端ヌクレオチドの割合は、図２Ｂに示されるように、２８．８％のＡ、２８．８％のＴ、２１．２％のＣ、および２１．２％のＧであるマウスゲノムの組成を反映するはずである。しかしながら、ランダムに選択されたゲノム領域ないｃｆＤＮＡ断片の５’末端は、図２Ｃに示されるように、Ｃ（３２．６％）の実質的な過剰表現、Ｇ（２４．４％）のわずかな過剰表現、ならびにＡ（１９．８％）およびＴ（２３．２％）の過少表現を示す。そのような変化は、Ａ／Ｔ部位が参照ゲノムにおいてより一般的であるが、断片末端ではあまり頻繁に現れないため、ＤＮＡがＣおよびＧ位置で不均衡に断片化されていることを示す。
図２Ｅは、ＣＴＣＦ領域内のＷＴ ＥＤＴＡ ０時間試料におけるｃｆＤＮＡ断片の５’末端の塩基含有量を示す。塩基含有率は、Ａ末端２１０、Ｇ末端２２０、Ｔ末端２３０、およびＣ末端２４０について示される。これらの試料において、参照ゲノム含有量と比較して、ｃｆＤＮＡ断片の５’末端で、ＡおよびＴが過小表現されているのに対し、ＣおよびＧは、過剰表現されている。したがって、この場合もやはり、循環ｃｆＤＮＡの自然な断片化が、Ａ／Ｔ部位よりもＣ／Ｇ部位にあることが選択される。そのような非対称表現は、他の領域についても見られ得る。
図３Ａ～３Ｂは、本開示の実施形態による、ＴＳＳ領域内の塩基含有量の割合を示す。ＴＳＳ（図３Ａ）領域内の参照ゲノム含有量は、ＷＴ ＥＤＴＡ ０時間試料（図３Ｂ）におけるｃｆＤＮＡの５’末端塩基含有量と比較される。図３Ｂは、参照含有量と比較したＣ末端の増加を示す。Ａ末端およびＴ末端は、概してより低く、Ｇ末端は、ほぼ同じである。
図３Ｃ～３Ｄは、本開示の実施形態による、Ｐｏｌ ＩＩ領域内の塩基含有量の割合を示す。Ｐｏｌ ＩＩ（図３Ｃ）領域内の参照ゲノム含有量は、ＷＴ ＥＤＴＡ ０時間試料（図３Ｄ）におけるｃｆＤＮＡの５’末端塩基含有量と比較される。図３Ｄは、参照含有量と比較したＣ末端の大きな増加、およびＧ端についてのより小さな増加を示す。Ａ末端およびＴ末端は、概してより低い。他の図と同様に、塩基含有率は、Ａ末端２１０、Ｇ末端２２０、Ｔ末端２３０、およびＣ末端２４０について示される。
したがって、この非対称表現のパターンは、ＴＳＳおよびＰｏｌ ＩＩ領域にアラインメントするｃｆＤＮＡにおいても見られた。ＣＴＣＦ領域が、ＣＴＣＦ結合部位に隣接する安定した位置にあるヌクレオソームのアレイを含有するため、ならびにＴＳＳおよびＰｏｌ ＩＩ領域が、既知のオープンクロマチン領域であるため、ゲノムのヌクレオソーム領域およびオープン領域の両方が、同じＣ末端過剰表現を示す。
３．異なる断片サイズについての末端塩基含有量
図４は、本開示の実施形態による、断片サイズの範囲にわたるＷＴ ｃｆＤＮＡの５’末端の塩基含有量を示す。縦軸は、塩基含有率であり、横軸は、断片サイズである。断片の各末端は、独立してカウントされる。異なる断片サイズにおいて、ｃｆＤＮＡ断片の５’末端で、ＡおよびＴが過小表現されているのに対し、ＣおよびＧは、過剰表現されている。図５に示されるように、５’末端が、ｃｆＤＮＡ断片サイズの０～６００ｂｐの範囲にわたってプロットされている場合、Ｃ末端の過剰発現およびＡ末端の過少発現は、明らかであり、野生型ｃｆＤＮＡのすべての断片サイズにわたって比較的均一である。したがって、Ｃ末端優位性のｃｆＤＮＡは、すべての断片サイズにわたってＷＴマウスにおける典型的なｃｆＤＮＡプロファイルであるように思われる。
図４は、本開示の実施形態による、断片サイズの範囲にわたるＷＴ ｃｆＤＮＡの５’末端の塩基含有量を示す。縦軸は、塩基含有率であり、横軸は、断片サイズである。断片の各末端は、独立してカウントされる。異なる断片サイズにおいて、ｃｆＤＮＡ断片の５’末端で、ＡおよびＴが過小表現されているのに対し、ＣおよびＧは、過剰表現されている。図５に示されるように、５’末端が、ｃｆＤＮＡ断片サイズの０～６００ｂｐの範囲にわたってプロットされている場合、Ｃ末端の過剰発現およびＡ末端の過少発現は、明らかであり、野生型ｃｆＤＮＡのすべての断片サイズにわたって比較的均一である。したがって、Ｃ末端優位性のｃｆＤＮＡは、すべての断片サイズにわたってＷＴマウスにおける典型的なｃｆＤＮＡプロファイルであるように思われる。
Ｂ．新鮮なｃｆＤＮＡの断片化パターン（例えば、ＤＦＦＢについて）
新鮮なＤＮＡは、全血試料中の細胞から取得され得、ＥＤＴＡ中で室温において一定期間、全血をインキュベートすることによって、細胞を死滅させる。このようにして、得られた血漿試料は、新鮮なＤＮＡが濃縮され得る。
新鮮なＤＮＡは、全血試料中の細胞から取得され得、ＥＤＴＡ中で室温において一定期間、全血をインキュベートすることによって、細胞を死滅させる。このようにして、得られた血漿試料は、新鮮なＤＮＡが濃縮され得る。
この典型的なｃｆＤＮＡプロファイル（すなわち、前のセクションで示されるような）が、細胞源から「そのまま」作られたのか、または血漿内でのさらなる消化後に産生されたのかを調査した。したがって、瀕死細胞から新たに生成されたｃｆＤＮＡを捕捉および分析し、そのプロファイルを上に示される典型的なＣ末端優位性なｃｆＤＮＡプロファイルと比較しようとした。
１．インキュベーションによるｃｆＤＮＡの量の変化
図５Ａ～５Ｂは、本開示の実施形態による、新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＥＤＴＡ ６時間試料の集合体を示す。
図５Ａ～５Ｂは、本開示の実施形態による、新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＥＤＴＡ ６時間試料の集合体を示す。
図５Ａは、２つの期間にわたってＥＤＴＡで処理されているＷＴマウスからのｃｆＤＮＡを示す。全血を室温においてＥＤＴＡ中で６時間インキュベートすることによって、試料を新鮮なｃｆＤＮＡで濃縮した。ＥＤＴＡと室温でインキュベートすると、細胞が死滅し、それによって新鮮なｃｆＤＮＡ（すなわち、試料が最初に収集されたときに無細胞ではなかったが、無細胞になったＤＮＡ）が放出される。各対の試料におけるインキュベーション後の新鮮なｃｆＤＮＡの流入は、血漿ｃｆＤＮＡ量の１．１から５．９倍の増加によって確認された。
図５Ｂは、インキュベーションなしから室温での６時間のインキュベーションへのｃｆＤＮＡの濃度（ゲノム当量ＧＥ／ｍＬ）の増加を示す。長いｃｆＤＮＡ断片の増加も観察される。
図６は、５つの異なる野生型プールについて、インキュベーションなし（０時間）の試料のサイズプロファイル７１０、およびインキュベーションあり（６時間）のサイズプロファイル７２０を示す。各プールは、野生型（ＷＴ）を有するマウスの異なる群からのＤＮＡを含有する。サイズプロファイルは、横軸にＤＮＡ断片のサイズ（ｂｐ）、および所与のサイズでのＤＮＡ断片の頻度（パーセンテージとして）を示す。サイズプロファイル７２０が長いＤＮＡ断片についてのサイズプロファイル７１０よりも大きいことによって示されるように、長いＤＮＡ断片（例えば、３５０～６００ｂｐ）の頻度は、概して、インキュベーションに伴い高まる。
図５Ａ、５Ｂ、および６におけるそのような挙動は、全血が長期間保持される場合、試料中に存在する血球の一部が無細胞ＤＮＡを漏出させ始める可能性があることを示す。そのような漏出は、任意の分析で説明され、検出および他の測定などの用途に使用され得る。
２．新鮮なｃｆＤＮＡにおけるＡ末端およびＧ末端選択
２．新鮮なｃｆＤＮＡにおけるＡ末端およびＧ末端選択
ＥＤＴＡとのインキュベーションの結果としてのｃｆＤＮＡの増加に加えて、塩基末端含有量の変化も調査した。ＥＤＴＡとの血液試料のインキュベーションは、インキュベートされていない血液試料中の典型的な塩基末端含有量と比較して、Ａ末端およびＧ末端含有量の増加をもたらす。この増加は、ランダム領域、ＣＴＣＦ領域、ＴＳＳ領域、およびＰｏｌ ＩＩ領域を含む様々な領域内に見られる。
図７Ａ～７Ｄは、本開示の実施形態による、ランダム、ＣＴＣＦ、ＴＳＳ、およびＰｏｌ ＩＩ領域についての、マウスにおける新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＥＤＴＡ ６時間試料の塩基含有率を示す。図２Ｃおよび２Ｅと比較して、インキュベーションは、Ａ末端およびＧ末端の頻度を高め、インキュベーション中に生じる断片化におけるＡおよびＧの選択を示す。
図７Ａは、本開示の実施形態による、血液試料をＥＤＴＡとともに６時間にわたってインキュベートすることによって調製された、新鮮なｃｆＤＮＡ試料についてのランダム領域内の塩基含有率を示す。６時間ＥＤＴＡ試料におけるｃｆＤＮＡの５’末端を分析すると、典型的なｃｆＤＮＡに見られるＣ末端優位性は、図２Ｃに示されるように、そのベースラインの０時間インキュベーションと比較して、新鮮なｃｆＤＮＡの存在下で大幅に減少した。Ｃ末端およびＴ末端断片は、それぞれ、２８．３％および１７．０％に減少した。Ａ末端およびＧ末端断片は、ランダムに選択されたゲノム領域内で、それぞれ、２７．７％および２７．０％に大幅に増加した。
図７Ｂは、本開示の実施形態による、新鮮なｃｆＤＮＡ試料についてのＣＴＣＦ領域内の塩基含有率を示す。ランダム領域についての塩基含有量の変化も、ヌクレオソームアレイを有するＣＴＣＦ領域内で一貫して視覚化された。図７Ｂを図２Ｅと比較すると、Ａ末端含有量が２０％をわずかに下回る量から約２０～３０％に増加し、Ｇ末端含有量は、概して、３０％未満から３０％超に増加することがわかる。
図７Ｃは、本開示の実施形態による、新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＥＤＴＡ ６時間試料中のＴＳＳ領域内の塩基含有量の割合を示す。図３Ｂと比較すると、Ａ末端含有量の２０％未満から２０％超への増加、およびＧ末端含有量の３０％未満から３０％超への増加がわかる。
図７Ｄは、本開示の実施形態による、新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＥＤＴＡ ６時間試料中のＰｏｌ ＩＩ領域内の塩基含有量の割合を示す。図３Ｄと比較すると、Ａ末端含有量の２０％未満から２０％超への増加、およびＧ末端含有量の概して約３０％から４０％以上への増加がわかる。
したがって、全血インキュベーション後の新鮮なｃｆＤＮＡは、典型的なｃｆＤＮＡと比較して、Ａ末端およびＧ末端の断片が濃縮されていた。瀕死細胞からの新鮮なｃｆＤＮＡプロファイルは、ベースライン試料に見られる典型的なＣ末端優位性のｃｆＤＮＡと動揺であるようには思われないため、典型的なＣ末端優位性のｃｆＤＮＡが次のステップで作られると推測した。インキュベーション後の断片末端選択（例えば、Ａ末端の濃縮）は異なるため（例えば、Ａ末端対Ｃ末端）、新鮮なｃｆＤＮＡの生成が、典型的なｃｆＤＮＡを作ったものとは異なるメカニズムに由来する可能性が高かったとも推論した。後のセクションで示されるように、Ａ末端についての濃縮は、より長いｃｆＤＮＡにおいて生じる。
３．異なるサイズの新鮮なｃｆＤＮＡ間のＡ末端およびＧ末端
３．異なるサイズの新鮮なｃｆＤＮＡ間のＡ末端およびＧ末端
また、断片サイズごとに塩基末端選択を調査した。断片を２つの末端ヌクレオチドによって特定し、両端がＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴで終わる断片を分析した。両端が特定されたこれらの断片を、それらの末端ヌクレオチドおよびその間の記号＜＞で示し、これによりＡとしての両端を有する断片は、Ａ＜＞Ａとして指定される。異なるサイズ間でＡ＜＞Ａ、Ｇ＜＞Ｇ、Ｃ＜＞Ｃ、およびＴ＜＞Ｔ断片の比例する表現を比較し、特定のヌクレオチドを切断することの任意の選択が、これらの断片タイプで最もよく視覚化され、両端が、同じヌクレオチド選択を包含したと推論した。これらの４タイプの断片のうち、新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮された６時間試料は、１５０ｂｐ超のサイズの有意により高い割合のＡ＜＞Ａ断片を有し、２５０ｂｐ以上の長い断片においてさらに増加した。一方、Ｇ＜＞Ｇ、Ｃ＜＞Ｃ、およびＴ＜＞Ｔ断片は、サイズごとに有意に異ならなかった。したがって、新鮮なｃｆＤＮＡは、１５０ｂｐよりも長かったＡ末端断片が濃縮されていた。
図８Ａは、本開示の実施形態による、短い断片、中間の断片、および長い断片の間での、ＷＴマウスにおけるベースラインｃｆＤＮＡ（ＥＤＴＡ ０時間）と新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮された試料（ＥＤＴＡ ６時間）との間で比較した、Ａ＜＞Ａ断片の割合を示す。Ｐ値は、マン・ホイットニーのＵ検定によって計算される。図８Ａ中、４つの分類は、短い断片（１５０ｂｐ以下）、中間の断片（１５０～２５０ｂｐ）、長い断片（２５０ｂｐ以上）、およびすべての断片についての分析を示す。各分類について、ＥＤＴＡの０時間および６時間についての測定値が示される。パーセントは、中間の断片および長い断片、ならびにすべてのＡ＜＞Ａ断片について著しく増加する。Ａ＜＞Ａの増加は、以下で分析されるように、ＤＮＡ断片化因子サブユニットベータ（ＤＦＦＢ）ヌクレアーゼが、血液から細胞内ＤＮＡ（すなわち、細胞の内側）を切断し、次いで、その無細胞ＤＮＡを血漿中に放出することに関連し得る。
図８Ｂは、短い断片、中間の断片、および長い断片の間での、ＥＤＴＡ ０時間とＥＤＴＡ ６時間との間で比較した、ＷＴマウスにおけるＧ＜＞Ｇ断片の割合についてのサイズプロファイルを示し、図９Ａ～９Ｂは、Ｃ＜＞Ｃ、Ｔ＜＞Ｔ断片の割合についてのサイズプロファイルを示す。Ｐ値は、マン・ホイットニーのＵ検定によって計算される。上記のように、Ｇ＜＞Ｇ、Ｃ＜＞Ｃ、およびＴ＜＞Ｔ断片の量は、サイズごとに有意に異ならなかった。
図１０Ａは、それぞれのベースラインの非インキュベーションＥＤＴＡレベルと比較した、各断片サイズについてのＡ末端、Ｇ末端、Ｃ末端、およびＴ末端断片の割合を示す。図１０Ａ中、カウントは、図８Ａ～９Ｂにあるように、二重末端とは対照的に単一末端についてのものである。具体的には、図１０Ａは、ＥＤＴＡ ０時間試料（灰色）におけるベースライン表現と比較した、新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＷＴ ＥＤＴＡ ６時間試料におけるＡ末端１０１０（緑色）、Ｇ末端１０２０（オレンジ色）、Ｃ末端１０４０（青色）、およびＴ末端１０３０（赤色）を有するｃｆＤＮＡのパーセンテージを示す。示されるように、Ａ末端およびＧ末端断片は増加し、Ｃ末端およびＴ末端断片は減少する。これらはパーセンテージであるため、特定の群の含有量が増加すると、対応して他の含有量が減少する。
驚くべきことに、長いＡ末端断片の増加は特定のサイズ範囲に集中しており、ヌクレオソームラダーサイズを連想させた約２００ｂｐおよび４００ｂｐを伴った。Ｇ末端断片も、これらのサイズで同様であるがより弱い周期性を有した。これらのＡ末端（およびＧ末端）ｃｆＤＮＡ断片が、ヌクレオソーム間を切断することによって作られた可能性が高く、これにより無傷のヌクレオソームＤＮＡの完全長が保持されたと仮定した。周期性のピークは、ヌクレオソーム間領域５’からＡへの切断の真の選択を裏付け、５’からＧへの切断の選択はわずかにより小さい。
４．Ａ末端を有するｃｆＤＮＡに対するＤＦＦＢの効果
４．Ａ末端を有するｃｆＤＮＡに対するＤＦＦＢの効果
Ａ末端の長い断片は瀕死細胞から新たに生成されたため、それらの生成におけるアポトーシスの役割を調べた。ＤＦＦＢは、アポトーシス中のＤＮＡ断片化に関与する主要な細胞内ヌクレアーゼであるため、Ｄｆｆｂ-/-によって示される、両方の対立遺伝子でその遺伝子がノックアウトされているＤｆｆｂ欠損マウスからの試料を調査した。
図１０Ｂは、ＥＤＴＡ ０時間試料（灰色）におけるそのベースライン表現と比較した、Ｄｆｆｂ欠損ＥＤＴＡ ６時間試料におけるＡ末端（緑色）、Ｇ末端（オレンジ色）、Ｃ末端（青色）、Ｔ末端（赤色）を有するｃｆＤＮＡのパーセンテージを示す。各断片サイズでのＡ末端、Ｇ末端、Ｃ末端、およびＴ末端断片の割合を比較すると、ベースラインと比較して６時間のＥＤＴＡインキュベーション後のＤｆｆｂ欠損マウスにおける変化はほとんどなく、Ａ末端およびＧ末端断片において周期性はなかった。したがって、Ｄｆｆｂ欠損マウスにおいて、ＷＴマウスで観察されたＡ末端断片における増加はなく、ＤＦＦＢが、これらのＡ末端の長い断片の生成に重要な役割を果たしている可能性があることを示唆する。
さらに、インキュベーション後のｃｆＤＮＡの全体的な変化、断片サイズ、および異なる領域について調査した。インキュベーション後、本質的に変化はなかった。
図１１Ａは、本開示の実施形態による、Ｄｆｆｂ欠損マウスにおけるＥＤＴＡ ０時間試料対６時間試料のｃｆＤＮＡの濃度を示す。６時間のＥＤＴＡインキュベーション後、ｃｆＤＮＡ量は有意に増加しなかった。
図１１Ｂは、本開示の実施形態による、Ｄｆｆｂ欠損マウスにおけるＥＤＴＡ ０時間試料対６時間試料のサイズプロファイルを示す。長い断片の増加はほとんどまたは全くなかった。
図１１Ｃは、本開示の実施形態による、短い断片、中間の断片、および長い断片の間での、ＥＤＴＡ ０時間とＥＤＴＡ ６時間との間で比較したＤｆｆｂ欠損マウスにおけるＡ＜＞Ａの割合を示す。Ａ＜＞Ａ断片のパーセンテージは、図８Ａに示されるように、ＷＴマウスとは異なり、Ｄｆｆｂ欠損マウスにおいて６時間のＥＤＴＡインキュベーション後に増加しなかった。
図１２Ａ～１２Ｄは、本開示の実施形態による、ランダム領域およびＣＴＣＦ領域についてのＥＤＴＡ ０時間試料および６時間試料におけるＤｆｆｂ欠損マウスの塩基含有量の割合を示す。図１３Ａ～１３Ｄは、本開示の実施形態による、ＴＳＳ領域およびＰｏｌ ＩＩ領域についてのＥＤＴＡ ０時間試料および６時間試料におけるＤｆｆｂ欠損マウスの塩基含有量の割合を示す。ランダムゲノム領域、ＣＴＣＦ、ＴＳＳ、およびＰｏｌ ＩＩ領域内で、Ａ末端断片は増加しなかった。
図１０Ａの変化が見られなかった場合、これは、動物（例えば、ヒトまたはマウス）が、ヌクレアーゼ、例えば、ＤＦＦＢの欠損を有したことを示すであろう。そのような変化は、２つの異なる時間（例えば、０時間および６時間）でインキュベートし、それらの２つの異なる時間でのサイズプロファイルを比較することによって分析され得る。変化がないことは、細胞内切断を行うヌクレアーゼのいずれか１つの欠損を示し得、さらなる分析は、どのヌクレアーゼかに関する詳細を提供する能性がある。
ＩＩＩ．典型的なＣＦＤＮＡに対するＤＮＡＳＥ１Ｌ３の効果
上記の分析は、新たに生成されたｃｆＤＮＡの末端塩基含有量およびサイズプロファイルを特徴付けるが、このセクションは、典型的なＣ末端優位性が血漿ｃｆＤＮＡにおいてもたらされたプロセスを分析する。図４に見られる循環ｃｆＤＮＡ断片のすべてのサイズにおけるＣ末端のこの明確な選択は、Ｃに対して５’を切断することを選択するヌクレアーゼの存在を示唆する。以前に、ＷＴマウスからのｃｆＤＮＡが、ＣＣＮＮモチーフで終わる断片の高い頻度を有したこと、およびｃｆＤＮＡ断片におけるＣＣＮＮモチーフのこの選択が、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウスでは低減されたことを実証している（Ｓｅｒｐａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６，６４１－６４９）。Ｃ末端選択に関与するヌクレアーゼもＤＮＡＳＥ１Ｌ３であり得ると仮定した。この仮説を調査するために、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウス（Ｄｎａｓｅ１ｌ３-/-）とＷＴマウスとの間で、特定のＡ＜＞Ａ、Ｇ＜＞Ｇ、Ｃ＜＞Ｃ、およびＴ＜＞Ｔ断片の割合を比較した。
上記の分析は、新たに生成されたｃｆＤＮＡの末端塩基含有量およびサイズプロファイルを特徴付けるが、このセクションは、典型的なＣ末端優位性が血漿ｃｆＤＮＡにおいてもたらされたプロセスを分析する。図４に見られる循環ｃｆＤＮＡ断片のすべてのサイズにおけるＣ末端のこの明確な選択は、Ｃに対して５’を切断することを選択するヌクレアーゼの存在を示唆する。以前に、ＷＴマウスからのｃｆＤＮＡが、ＣＣＮＮモチーフで終わる断片の高い頻度を有したこと、およびｃｆＤＮＡ断片におけるＣＣＮＮモチーフのこの選択が、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウスでは低減されたことを実証している（Ｓｅｒｐａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６，６４１－６４９）。Ｃ末端選択に関与するヌクレアーゼもＤＮＡＳＥ１Ｌ３であり得ると仮定した。この仮説を調査するために、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウス（Ｄｎａｓｅ１ｌ３-/-）とＷＴマウスとの間で、特定のＡ＜＞Ａ、Ｇ＜＞Ｇ、Ｃ＜＞Ｃ、およびＴ＜＞Ｔ断片の割合を比較した。
図１４Ａは、本開示の実施形態による、Ａ＜＞Ａ断片の構築を示す。図１４Ａは、Ａ末端断片およびＡ＜＞Ａ断片を示す。Ａ末端断片は、ワトソン鎖の５’端またはクリック鎖の５’端にＡを有する。塩基は任意の塩基であり得るため、他方の末端は、Ｎで示され得る。Ａ＜＞Ａ断片は、ワトソン鎖の５’端およびクリック鎖の５’端にＡを有する。そのような命名法は、Ｃ＜＞Ｃ、Ｇ＜＞Ｇ、およびＴ＜＞Ｔにも適用され、これらのすべては、本開示全体を通して使用される。
図１４Ｂは、本開示の実施形態による、ＷＴ試料と比較したＤｎａｓｅ１ｌ３欠損試料の末端塩基含有量を示す。塩基含有量データは、同じ塩基の両側末端についてである。図１４Ｂは、ＷＴマウス対Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損（１ｌ３-/-）マウス（両方ともＥＤＴＡ ０時間）におけるＡ＜＞Ａ、Ｇ＜＞Ｇ、Ｃ＜＞Ｃ、およびＴ＜＞Ｔ断片のパーセンテージを示す。縦軸は、試料中の断片パーセントである。横軸は、４つの分類（他の分類、例えば、Ａ＜＞Ｔ、図示せず）についてのＷＴおよび１ｌ３-/-に対応する。Ｐ値は、マン・ホイットニーのＵ検定によって計算される。Ａ＜＞ＡおよびＧ＜＞Ｇのパーセンテージは、１ｌ３-/-について増加し（すなわち、ＷＴよりも高かった）、一方で、１ｌ３-/-について、Ｃ＜＞Ｃのパーセンテージは、大幅に減少し、Ｔ＜＞Ｔのパーセンテージは、減少した（すなわち、ＷＴよりも低かった）。そのような変化は、Ｄｎａｓｅ１ｌ３の欠如がＣで切断しないため、Ｃを切断することを選択するＤｎａｓｅ１ｌ３と一致しているが、他の塩基切断選択を有する他のヌクレアーゼはまだ存在し、それらの他の塩基で切断する。
図１５は、本開示の実施形態による、断片サイズ当たりのＷＴ試料と比較したＤｎａｓｅ１ｌ３欠損試料の末端塩基含有量を示す。図１５は、ＷＴ ＥＤＴＡ ０時間ｃｆＤＮＡ（灰色）のベースライン表現と比較した、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠損ＥＤＴＡ ０時間ｃｆＤＮＡにおけるＡ末端１５１０（緑色）、Ｇ末端１５２０（オレンジ色）、Ｃ末端１５４０（青色）、およびＴ末端１５３０（赤色）のパーセンテージを示す。
図１５中、ＥＤＴＡ ０時間試料におけるＤｎａｓｅ１１３欠損マウスとＷＴマウスとの間で、各断片サイズのＡ末端、Ｇ末端、Ｃ末端、およびＴ末端の断片の割合を比較すると、Ｃ＜＞Ｃ断片が減少するという我々の発見と一致して、すべての断片サイズでＣ末端断片が減少する。Ａ末端断片はまた、約２００ｂｐおよび４００ｂｐの頻度のピークを有するヌクレオソーム周期パターンも実証する。したがって、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウスにおいて、特にこれらのピークでＡ末端断片が増加する。特にこれらのピークで、対応してＴ末端断片が減少する。Ａ末端断片のこのヌクレオソーム周期パターンは、新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＷＴ ＥＤＴＡ ６時間試料において以前に観察されたものと同様である（図１０Ａ）。したがって、ＤＦＦＢ切断の結果は、周期パターンを有するＡ末端の断片になり、これは通常、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３によってすぐにＣ末端に変換される。しかし、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３がそこにないため、Ａ末端断片は増加する。また、結果として、Ｃ末端とは対照的にＡ末端が優位種になる。
これらの結果は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３がＣ末端およびＴ末端断片の両方を生成し、Ｃ＜＞Ｃ断片のパーセンテージがより大幅に低減されるため、Ｃ末端の選択がより大きいことを示唆する。
したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３の欠損により、新鮮なｃｆＤＮＡのプロファイルが明らかにされたように思われた。基質－酵素－生成物の関係において、酵素が欠損していると、生成物は減少し、基質は増加する。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠損ｃｆＤＮＡは、その基質ｃｆＤＮＡプロファイルを明らかにしたように見え、これは、ＤＦＦＢによって作られたｃｆＤＮＡプロファイルであるように思われた。これは、ＤＦＦＢ切断が細胞内で生じる傾向がある一方で、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３による少なくともある程度の切断が循環血液ちゅうで生じることを示唆する。
ｃｆＤＮＡ断片の両端を使用して断片タイプをより詳細に調べると、Ａ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、およびＡ＜＞Ｃ断片のみが、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損試料および新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＷＴ ＥＤＴＡ ６時間試料の両方において、このヌクレオソーム周期パターンを実証したことがわかった。
図１６Ａは、本開示の実施形態による、ＷＴ ＥＤＴＡ ０時間ｃｆＤＮＡのベースライン表現（灰色）と比較した、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損ＥＤＴＡ ０時間ｃｆＤＮＡにおけるＡ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、およびＡ＜＞Ｃ断片のパーセンテージを示す。図１６Ｂは、本開示の実施形態による、ＷＴ ＥＤＴＡ ０時間ｃｆＤＮＡのベースライン表現（灰色）と比較した、新鮮なｃｆＤＮＡが濃縮されたＷＴ ＥＤＴＡ ６時間試料におけるＡ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、およびＡ＜＞Ｃ断片のパーセンテージを示す。データ１６１０は、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損試料についてのものである。２つの図の灰色の線は、ＷＴ ＥＤＴＡ ０時間についての異なるバッチに対応する。
これら２つの試料タイプの断片の間には、多数の顕著な差があった。Ｄｎａｓｅ１１３欠損マウスにおいて、Ａ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、およびＡ＜＞Ｃ断片の周期パターンは、非常に顕著であった（図１６Ａ）。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３活性は、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウスにおいて存在しないため、ｃｆＤＮＡにおけるこの顕著さは、残りの活性な細胞内ヌクレアーゼ、特にＤＦＦＢでのヌクレオソームの周期的切断の真の選択を反映する可能性が高い。
一方で、新鮮なｃｆＤＮＡに見られる周期パターンは、弱められており、これは、Ａ＜＞Ｃ断片の中で特に顕著であった（図１６Ｂ）。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３活性は、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウスと比較して新鮮なｃｆＤＮＡの生成において保持されるため、この差は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３がＡ＜＞Ｃ断片の作成において役割を果たすことを示し、これは、Ｃ＜＞Ｃ断片の作成のための中間ステップであり得る。これらの結果はまた、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３がＤＦＦＢ後に切断することによって、ＤＦＦＢヌクレアーゼの優先的な切断を弱めることも示す。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３切断が、主にＤＦＦＢ切断の後続ステップとして生じること、およびＤＮＡＳＥ１Ｌ３が、ｃｆＤＮＡにおいてＣ末端優位性を有する典型的なプロファイルの作成において役割を有し得るだけではなく、実際に優位な役割を果たすものであり得ると推測され得る（図４）。
ＩＶ．ＣＦＤＮＡに対するＤＮＡＳＥ１の効果（ヘパリンを用いる）
Ｃ末端優位性を有する典型的なｃｆＤＮＡ断片の作成に関与するステップを実証したが、ｃｆＤＮＡ断片がさらに消化され得、これによりｃｆＤＮＡの恒常性の全体像が構築され得る方法についても調査する。Ｃ末端断片は、１５０ｂｐ未満の短い断片でも最も一般的であり続けるが、典型的なｃｆＤＮＡプロファイルにおいて約５０～１５０ｂｐおよび約２５０ｂｐのサイズのＴ末端断片の濃縮に注目した（図４）。これらのピークは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３選択に関連したＣ末端断片、またはＤＦＦＢ切断選択に関連したＡ末端断片のいずれとも一致していなかった。断片末端がヌクレアーゼ選択と相関しているという我々の理論を用いて、これらのＴ末端がＤＮＡＳＥ１選択に関連している可能性があるかどうかを調査した。
Ｃ末端優位性を有する典型的なｃｆＤＮＡ断片の作成に関与するステップを実証したが、ｃｆＤＮＡ断片がさらに消化され得、これによりｃｆＤＮＡの恒常性の全体像が構築され得る方法についても調査する。Ｃ末端断片は、１５０ｂｐ未満の短い断片でも最も一般的であり続けるが、典型的なｃｆＤＮＡプロファイルにおいて約５０～１５０ｂｐおよび約２５０ｂｐのサイズのＴ末端断片の濃縮に注目した（図４）。これらのピークは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３選択に関連したＣ末端断片、またはＤＦＦＢ切断選択に関連したＡ末端断片のいずれとも一致していなかった。断片末端がヌクレアーゼ選択と相関しているという我々の理論を用いて、これらのＴ末端がＤＮＡＳＥ１選択に関連している可能性があるかどうかを調査した。
Ａ．Ｄｎａｓｅ１における欠失の高価
ＤＮＡＳＥ１の切断選択を特定するために、Ｄｎａｓｅ１-/-、Ｄｎａｓｅ１+/-、およびＷＴマウスからの全血を採取し、タイプ内で試料をプールし、ヘパリンとの０時間または６時間のインキュベーションのために各プールをチューブに均等に分配した。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３を阻害しながらＤＮＡＳＥ１活性を強化することが知られているため、ＥＤＴＡの代わりにヘパリンを使用した（Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００５），Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３８９，３５５－３６４）。ヘパリンは、ヌクレオソームに取って代わることも示されている。
ＤＮＡＳＥ１の切断選択を特定するために、Ｄｎａｓｅ１-/-、Ｄｎａｓｅ１+/-、およびＷＴマウスからの全血を採取し、タイプ内で試料をプールし、ヘパリンとの０時間または６時間のインキュベーションのために各プールをチューブに均等に分配した。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３を阻害しながらＤＮＡＳＥ１活性を強化することが知られているため、ＥＤＴＡの代わりにヘパリンを使用した（Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００５），Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３８９，３５５－３６４）。ヘパリンは、ヌクレオソームに取って代わることも示されている。
図１７Ａ～１７Ｂは、本開示の実施形態による、ヘパリン中でのインキュベーションを伴うＷＴ、Ｄｎａｓｅ１+/-、およびＤｎａｓｅ１-/-マウスのｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを示す。普通（図１７Ａ）および対数（図１７Ｂ）のスケールが提供される。図１７Ａは、６時間後のＥＤＴＡを含む血液（灰色）１７１０についてのｃｆＤＮＡサイズプロファイル、ならびにＷＴ、（青色）１７２０、Ｄｎａｓｅ１+/-（緑色）１７３０、およびＤｎａｓｅ１-/-（赤色）１７４０マウスについての６時間後のヘパリンで処理された血液についてのデータを示す。ＷＴおよびＤｎａｓｅ１+/-マウスにおいて、６時間のヘパリンインキュベーションが、１６６ｂｐのピークの低減およびヌクレオソームパターンの喪失を伴う、短い断片の著しい増加をもたらしたことがわかった。Ｄｎａｓｅ１-/-において、サイズの変化は生じず、サイズパターンは、ＥＤＴＡ血液からのｃｆＤＮＡと本質的に同じであった。
この効果がＤｎａｓｅ１によるものであることを示すために、青色曲線１７２０（ＷＴヘパリン６時間）は、赤色曲線１７４０（Ｄｎａｓｅ１のホモ接合ノックアウトを有するマウスから採取れた血漿であるＤｎａｓｅ１-/-）と比較され得る。Ｄｎａｓｅ１が存在しない場合、非常に短いＤＮＡ分子の増加はない。そして、Ｄｎａｓｅ１+/-についての緑色曲線１７３０において、非常に短いＤＮＡ分子がまだ出現しており（より少ないが）、これは、ヘテロ接合であり、このため１つの対立遺伝子のみが、遺伝子が欠損している。対数プロットは、より長い断片の量の変化を示すのに役立つ。
したがって、実施形態は、試料をヘパリンで処理し、試料をＷＴサイズ分布と比較することによって、Ｄｎａｓｅ１における障害（例えば、欠失）を検出することができる。
また、断片末端の割合の差についてこれらの試料を調べた。
図１８Ａ～１８Ｂは、本開示の実施形態による、ヘパリン中でのインキュベーションを伴うＷＴおよびＤｎａｓｅ１-/-マウスのｃｆＤＮＡのサイズプロファイルおよび塩基含有量を示す。末端断片についてのデータは、単一末端データについてのものである。
図１８Ａは、ヘパリン０時間（灰色）におけるそのベースライン表現と比較した、ＷＴヘパリン６時間試料のＡ末端１８１０（緑色）、Ｇ末端１８２０（オレンジ色）、Ｃ末端１８４０（青色）、およびＴ末端１８３０（赤色）のパーセンテージを示す。図１８Ｂは、ヘパリン０時間（灰色）におけるそのベースライン表現と比較した、Ｄｎａｓｅ１-/-マウスのＡ末端１８６０（緑色）、Ｇ末端１８７０（オレンジ色）、Ｃ末端１８９０（青色）、およびＴ末端１８８０（赤色）のパーセンテージを示す。
図１９は、本開示の実施形態による、ヘパリン中でのインキュベーションを伴うＤｎａｓｅ１+/-マウスのｃｆＤＮＡのサイズプロファイルおよび塩基含有量を示す。．ＷＴ、Ｄｎａｓｅ１+/-、Ｄｎａｓｅ１-/-マウスにおけるヘパリン効果。図１９は、０時間インキュベーション（灰色）におけるそのベースラインと比較した、６時間ヘパリンインキュベーション後のＤｎａｓｅ１+/- ｃｆＤＮＡにおけるＡ末端１９１０（緑色）、Ｇ末端１９２０（オレンジ色）、Ｃ末端１９４０（青色）、およびＴ末端１９３０（赤色）を有するｃｆＤＮＡのパーセンテージを示す。
ＷＴおよび６時間のヘパリンインキュベーション後のＤｎａｓｅ１+/-マウスにおいて、Ｔ末端断片の割合は、約５０～１５０ｂｐのサイズの断片において増加した（図１８Ａ、図１９）。対照的に、Ｄｎａｓｅ１-/-マウスにおいて、この増加はなかった（図１８Ｂ）。これらの観察結果は、ＤＮＡＳＥ１がＴ末端断片の作成を選択する可能性があるという我々の仮説を裏付けた。概して、Ｔ末端の塩基含有量は、Ｄｎａｓｅ１-/-についてよりもＷＴおよびＤｎａｓｅ１+/-についてより高かった。さらに、ヌクレオソーム周期性を有する長いＡ末端断片は、ＷＴ、Ｄｎａｓｅ１+/-、およびＤｎａｓｅ１-/-マウスにおいて、６時間のヘパリンインキュベーション後に存在していた。Ａ末端断片のそのような観察結果は、ＥＤＴＡと同様に、血液試料中の細胞の細胞死によるｃｆＤＮＡの増加と一致している。
図２０は、本開示の実施形態による、ヘパリン中の０時間試料および６時間試料を有するＷＴ、Ｄｎａｓｅ１+/-、およびＤｎａｓｅ１-/-マウスについてのｃｆＤＮＡ量を示す。１ｍＬ当たりのゲノム当量におけるｃｆＤＮＡの濃度は、縦軸にあり、横軸は、ヘパリンとのインキュベーションの異なる時間を有する。示されるように、ｃｆＤＮＡの量は、インキュベーション時間とともに増加する。
３つすべての遺伝子型におけるｃｆＤＮＡ量の増加を、アポトーシスを誘導するヘパリンインキュベーションに関する文献（Ｍａｎａｓｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９４，４８－５２）と組み合わせると、新たにアポトーシスを起こしたｃｆＤＮＡからのＡ末端ＤＦＦＢシグネチャは、一致していた。ＤＦＦＢからの新鮮なＡ末端断片を有するｃｆＤＮＡの増加は、（ＷＴマウスにおけるＤＮＡＳＥ１のヘパリン強化により）短いＴ末端断片に迅速に消化され、ＤＮＡＳＥ１がＴに対して５’を切断することを選択したことを示唆する。
Ｂ．ヌクレオソームから切断された断片からの周期性
Ｂ．ヌクレオソームから切断された断片からの周期性
ＥＤＴＡ、ヘパリン、および異なるインキュベーション時間を用いて断片の周期性を分析した。結果は、Ｔ末端を切断することを選択するＤＮＡＳＥ１、および血漿中のヌクレオソーム構造を破壊するヘパリンと一致している。
図２１Ａは、本開示の実施形態による、ＥＤＴＡ ０時間ＷＴ試料中のＡ末端、Ｇ末端、Ｃ末端、およびＴ末端断片のｃｆＤＮＡサイズプロファイルを示す。頻度は、特定の末端塩基タイプ内で決定され、例えば、Ｇ末端についての特定のサイズでの各頻度値は、Ｇ末端断片の総数によって正規化される。特に、すべてのＡ末端、Ｇ末端、Ｃ末端、およびＴ末端の断片タイプは、すべてのマウス遺伝子型（ＷＴ、Ｄｎａｓｅ１ｌ３-/-、Ｄｆｆｂ-/-、Ｄｎａｓｅ１+/-、およびＤｎａｓｅ１-/-）の間で、短い１５０ｂｐ以下の断片において１０ｂｐの周期性を実証した。図２２Ａ～２２Ｄは、本開示の実施形態による、Ｄｆｆｂ-/-、Ｄｎａｓｅ１ｌ３-/-、Ｄｎａｓｅ１+/-、およびＤｎａｓｅ１-/-マウスのＥＤＴＡ ０時間試料におけるＡ末端、Ｇ末端、Ｃ末端、およびＴ末端断片のｃｆＤＮＡサイズプロファイルを示す。ピーク値における１０ｂｐの周期性は、Ｄｎａｓｅ１ｌ３-/-について図２２Ｂで特に顕著である。
すべてのｃｆＤＮＡサイズのＣ末端選択を除いて、１０ｂｐ周期断片に関連する特定の末端選択はなかった。したがって、単一の特定のヌクレアーゼが１０ｂｐの周期性に関与する可能性は低いであろう。実際、１０ｂｐの周期性についての一般的な理論は、１０ｂｐの周期性が無傷のヌクレオソーム内でのＤＮＡのヌクレアーゼ消化の結果であるというものである。これは、ヒストンに巻かれたＤＮＡへのヌクレアーゼアクセスの制限と、ＤＮＡヘリックスの１ターン当たり１０ｂｐの構造によるＤＮＡの一方の鎖のもう一方の鎖への周期的曝露との複合効果から仮定された（Ｋｌｕｇ，Ａ．，ａｎｄ Ｌｕｔｔｅｒ，Ｌ．Ｃ．（１９８１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９，４２６７－４２８３）。
図２１Ｂは、本開示の実施形態による、ヘパリン６時間ＷＴ試料中のＡ末端、Ｇ末端、Ｃ末端、およびＴ末端断片のｃｆＤＮＡサイズプロファイルを示す。血漿中のヌクレオソーム構造を破壊した我々のヘパリンモデルにおいて、ＷＴにおける６時間のヘパリンインキュベーション後、すべての断片タイプで１０ｂｐの周期性が破壊された。さらに、Ｔ末端２１３０は、小さな断片の間で増加する。ヘパリンがヌクレオソーム構造を破壊した結果としてのＴ末端２１３０のこの増加は、ＤＮＡＳＥ１が（無傷の細胞内とは対照的に）血漿中で一般的であり、Ｔ末端を切断することを選択することと一致している。ヘパリンインキュベーションによる約５０～１５０ｂｐのサイズのＴ末端断片のそのような変化は、例えば、Ｔ末端断片について予想された増加が生じない場合、ＤＮＡＳＥ１での遺伝性障害を検出するために使用され得る。
図２３Ａは、本開示の実施形態による、ベースライン試料（ＥＤＴＡ ０時間および６時間、ヘパリン０時間）（灰色の線２３２０）と比較した、ヘパリン６時間試料（赤色の線２３１０）におけるＣＴＣＦ領域内の断片末端密度を示す。灰色の線２３２０は、３つの特定された試料からのものである。これらの３つの線は、位置０の周辺である程度の差を示すが、位置０から離れてピークの同様の周期性を有する。
ＣＴＣＦ領域は、ヌクレオソームの間隔が非常に明確であるという点で特別である。灰色の線２３２０（ＥＤＴＡおよびインキュベーションなしのヘパリン）を見ると、非常に良好な周期性があるが、ヘパリンの存在下（赤色の線２３１０）では波のパターンが低減され、これはヌクレオソーム構造を破壊し、これにより通常は比較的アクセスできないヌクレオソームＤＮＡ内の場所に切断が生じ得る。したがって、ＣＴＣＦ領域の十分に段階的なヌクレオソームでは、ＷＴでのヘパリンの６時間のインキュベーションに伴い、ヌクレオソーム内の断片末端が増加する。したがって、（ヘパリンインキュベーションの結果として）破壊されたヌクレオソーム構造は、ヌクレオソーム内ＤＮＡの切断をもたらした。
図２３Ｂ～２３Ｃは、本開示の実施形態による、ＷＴのヘパリン０時間試料および６時間試料のＣＴＣＦ領域内の５’末端塩基表現を示す。どの断片タイプが上記のヌクレオソーム内断片に寄与するかを調査した。ＷＴヘパリン６時間において、ヌクレオソーム内位置に対応するＴ末端断片の周期性が明らかであった（図２３Ｃ）。また、ＷＴヘパリン０時間（図２３Ｂ）において、最低約１５％（位置０）で平均して約２０％を有するＴ末端断片２３３０の、３０％のピークで位置０において最低２０％を有するＴ末端断片２３８０への増加があった。これらの結果は合わせて、ヘパリンがＤＮＡＳＥ１を強化し、ヌクレオソーム構造を破壊し、Ｔ末端選択を有するＤＮＡＳＥ１がヌクレオソーム内で切断することを可能にすることを裏付ける。
図２４～２４Ｂは、本開示の実施形態による、Ｄｎａｓｅ１-/-マウスのヘパリン０時間試料および６時間試料のＣＴＣＦ領域内の５’末端塩基表現を示す。ＷＴ（図２３Ｂ～２３Ｃ）での周期性およびＴ末端断片の増加に見られる効果は、Ｄｎａｓｅ１-/-マウス（図２４Ａ～２４Ｂ）においては存在しなかった。これは、０時間Ｔ末端断片２４３０および６時間Ｔ末端断片２４８０で見られ得る。ＤＮＡＳＥ１は、マウスにおけるＤｎａｓｅ１-/-遺伝性障害により存在しないため、ヘパリンインキュベーションの結果としてヌクレオソームを含まない断片は、Ｔ末端でＤＮＡＳＥ１によって切断されていない。したがって、周期性は欠損し、６時間Ｔ端断片２４８０の割合は、０時間Ｔ端断片２４３０と比較して減少し、対応してＡ末端およびＧ末端が増加する。
図２５は、本開示の実施形態による、Ｔ末端断片ピークが、ヘパリン６時間において増加した末端密度を有するヌクレオソーム２５１０間のヌクレオソーム内領域に対応することを示すために重ね合わされた図２３Ａおよび２３Ｃを示す。線２５１１は、ＥＤＴＡ ０時間に対応する。線２５１２は、ＥＤＴＡ ６時間に対応する。線２５１３は、ヘパリン０時間に対応する。線２５１４は、ヘパリン６時間に対応する。
リンカー領域は、すでに他の酵素（Ｃ／Ｇ／Ａ末端）によって切断されており、Ｔ切断酵素は、弱い競合相手であるため、リンカー領域は、Ｔ末端と比較してＣ／Ｇ末端において依然としてより豊富である。（細胞内のこのヌクレオソーム間切断は、依然としてヌクレオソームの存在によって導かれる）。しかしながら、ヌクレオソームが血漿中にあり、ヘパリンに曝露されると、構造は破壊され、次いで、ヌクレオソーム内領域は、大きなＴ末端選択を有するヘパリン強化ＤＮＡＳＥ１によって切断され得る。
図２３Ｃ中の他の塩基（すなわち、Ｔではない）は、Ｃ末端を作るＤＮＡＳＥ１Ｌ３がほとんどの時間優位に立つため、ヘパリン（またはＥＤＴＡ）中でのインキュベーションで明確な周期性を示さない。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３はまた、ヌクレオソーム内で切断することもでき、したがって、非常に明確なパターンは観察されない。配列決定深度がより高いほど、他の末端、特にＥＤＴＡ ６時間におけるＡ末端において周期パターンが見られ得る可能性があり、図７Ｂ中では、それはほんのわずかである。
Ｖ．細胞および血漿中のヌクレアーゼの切断選択
上記の観察により、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、およびＤＮＡＳＥ１Ｌ３についての塩基末端切断選択、ならびにヌクレアーゼが細胞内または血漿などの細胞外環境内で切断する普及度を有するかどうかの決定が可能になる。
上記の観察により、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、およびＤＮＡＳＥ１Ｌ３についての塩基末端切断選択、ならびにヌクレアーゼが細胞内または血漿などの細胞外環境内で切断する普及度を有するかどうかの決定が可能になる。
図２６は、本開示の実施形態による、ヌクレアーゼＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、およびＤＮＡＳＥ１Ｌ３について示される切断選択を有するｃｆＤＮＡ生成および消化のモデルを示す。ＤＦＦＢは、新鮮なｃｆＤＮＡを生成し（つまり、細胞内で切断することによって）、切断は、Ａ末端について選択され、Ａ末端濃縮されたｃｆＤＮＡをもたらす。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、典型的な末端プロファイルに見られる主にＣ末端濃縮されたｃｆＤＮＡを生成する。そのような切断は、細胞内および細胞外で生じる。ＤＮＡＳＥ１は、ヘパリンおよび内因性プロテアーゼの助けを得て、細胞外環境（例えば、血漿）中でｃｆＤＮＡをＴ末端断片にさらに消化することができる。
図２６は、細胞内に示されるＤＦＦＢ（緑色のはさみ２６１０）およびＤＮＡＳＥ１Ｌ３（青色のはさみ２６２０）を有するアポトーシス細胞を示す。説明文は、異なる塩基についての３つのヌクレアーゼを切断する選択順序を示す。ＤＦＦＢは、細胞内でのみ作用していることが示される。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、細胞内および血漿中でも作用していることが示される。ヘパリンを有するＤＮＡＳＥ１（赤色のはさみ２６３０）は、血漿中で作用していることが示される。末端塩基での得られた断片が、対応するヌクレアーゼについて異なる色で示される。ＤＮＡ分子は、細胞内で切断された後により短くなり、次いで、血漿中で切断された後にさらにより短くなる。
異なるマウスモデルにおけるｃｆＤＮＡ断片末端に関する本研究から、ｃｆＤＮＡを生成した断片化プロセスの概要を示すモデルの全貌を明らかにすることができる。ＥＤＴＡ中で全血をインキュベートした後に自発的に作られた新たに放出されたｃｆＤＮＡの我々の分析において、新鮮でより長いｃｆＤＮＡが、Ａ末端断片が濃縮されていることを実証した。特に、Ａ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、およびＡ＜＞Ｃ断片は、約２００ｂｐおよび４００ｂｐで強いヌクレオソーム周期性を実証する。この同じ実験モデルがＤｆｆｂ欠損マウスの全血に適用されると、長いＡ末端断片の濃縮は見られない。したがって、ＤＦＦＢがこれらのＡ末端断片の生成に関与している可能性が高いと結論付けることができる。
この仮説は、アポトーシス中のＤＮＡ断片化において重要な役割を果たすＤＦＦＢ酵素について発表された文献によって実証されている（Ｅｌｍｏｒｅ，Ｓ．（２００７），Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５，４９５－５１６、Ｌａｒｓｅｎ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｓφｒｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｓ．（２０１７），Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８４，１１６０－１１７０）。酵素の特性評価研究は、ＤＦＦＢが、ＡおよびＧヌクレオチド（プリン）を選択して、開いたヌクレオソーム間ＤＮＡ領域に鈍い二本鎖切断をもたらすことを示している（Ｌａｒｓｅｎ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｓφｒｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｓ．（２０１７），Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８４，１１６０－１１７０、Ｗｉｄｌａｋ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇａｒｒａｒｄ，Ｗ．Ｔ．（２００５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９４，１０７８－１０８７、Ｗｉｄｌａｋ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５，８２２６－８２３２））。ヌクレオソーム間リンカー領域のみでの鈍い二本鎖切断のこの生物学は、例えば、図１６Ｂによって例示されるように、Ａ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、およびＡ＜＞Ｃ断片におけるヌクレオソームパターン形成を説明するであろう。
本研究では、インキュベーション前に取得された血漿中の典型的なｃｆＤＮＡが、すべての断片サイズにわたって主にＣで終わることも実証しており、このＣ末端の過剰表現は、ゲノム全体にわたって複数の異なる領域で一致している。ｃｆＤＮＡの典型的なプロファイルは、新鮮なｃｆＤＮＡとは非常に異なるため、１）１つ以上の他のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＦＦＢ以外）がこのプロファイルを作ること、２）このヌクレアーゼまたはこれらのヌクレアーゼが典型的なｃｆＤＮＡにおける切断プロセスで優位に立つこと、および３）このプロセスが、新鮮なＡ末端断片（例えば、ＤＦＦＢから）の生成後に主に生じることを推測することができる。
このＣ末端優位性は、Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウスにおいて失われるため、このＣ末端断片の過剰発現に関与する１つのヌクレアーゼは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３であると考えられる。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３の特定のヌクレオチド切断選択を調査する既存の酵素研究はないが、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、タンパク質分解の助けなしにほとんど検出できないレベルまで高効率でクロマチンを切断することが知られている（Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７６，１０５９－１０７３）、Ｓｉｓｉｒａｋ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｃｅｌｌ １６６，８８－１０１）。すべての断片サイズ間でＣ末端断片がかなり均一に存在することは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３がすべてのＤＮＡ、さらにはヌクレオソーム内ＤＮＡを効率的に切断することができることを示唆する。
ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、興味深い特性を有し、これは、小胞体で発現して、主要な血清ヌクレアーゼのうちの１つとして細胞外に分泌され、またアポトーシスが誘導された後、その小胞体を標的とするモチーフが切断されると核に移行する（Ｅｒｒａｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８，３４６０－３４６８）、Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００５），Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３８９，３５５－３６４））。アポトーシス細胞内エンドヌクレアーゼとしてのその役割において、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、ＤＮＡ断片化においてＤＦＦＢと協働することが示唆されている（Ｅｒｒａｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８，３４６０－３４６８）、Ｋｏｙａｍａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２１，１１５０－１１６３））。新鮮なｃｆＤＮＡ（例えば、図１６Ｂ）の断片末端プロファイルをＤｎａｓｅ１ｌ３欠損マウス（例えば、図１６Ａ）のものと比較すると、Ａ末端断片、特にＡ＜＞Ｃ断片において周期性の顕著な減衰がある。この減衰は、ＷＴ対Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウスにおけるアポトーシスから新たに断片化されたＤＮＡを生成する最中の、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３およびＤＦＦＢの共存する細胞内活性によるものと疑われる。
血漿ヌクレアーゼとして、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、アポトーシス後に食作用を免れた循環中のＤＮＡを消化するのに役立つ。したがって、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３は、細胞内断片化が生じた後、断片化されたｃｆＤＮＡに対して効果を発揮する可能性が高い。二段階プロセスにおいて、第２のステップを阻害すると、第１のステップ（すなわち、細胞内断片化）の通常は一時的な結果が明らかになるはずである。Ｄｎａｓｅ１ｌ３欠損マウスの血漿は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３作用のこの第２のステップを阻害し、第１のステップのｃｆＤＮＡプロファイルであるアポトーシスからの細胞内ＤＮＡ断片化を明らかにする。これはまさに我々が発見したものであり、Ｄｎａｓｅ１１３欠損マウスのｃｆＤＮＡ断片プロファイル（例えば、図１６Ａ）は、新たに生成されたｃｆＤＮＡに見られるもの（例えば、図１６Ｂ）と非常に類似している。したがって、血漿内でのＤＮＡＳＥ１Ｌ３消化は、典型的な恒常性ｃｆＤＮＡをもたらす後続のステップになる。
Ｄｎａｓｅ１欠損マウスからのｃｆＤＮＡのサイズプロファイルが、ＷＴマウスのものと実質的に異なるようには思われなかったことを以前に発見したが（図１７Ａ）、ＤＮＡＳＥ１は、「裸の」ＤＮＡの切断を好むことが知られており、インビボでタンパク質分解の助けを得てクロマチンを切断することだけができる（Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１８），Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ６４，４０６－４０８、Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７６，１０５９－１０７３））。ヘパリンを使用してインビボプロテアーゼの機能に取って代わり、ＤＮＡＳＥ１活性を強化することで、ＤＮＡＳＥ１が、ＤＮＡをＴ末端断片に切断することを好むことを実証している（図１８Ａと比較した図１８Ｂ）。ヘパリンインキュベーションによるＴ末端断片の増加は、主にサブヌクレオソームサイズ（５０～１５０ｂｐ）であり、ＤＮＡＳＥ１が短い１５０ｂｐ未満の断片の生成において役割を果たすことを示唆する（図１８Ａ）。ＤＮＡＳＥ１が裸のＤＮＡをＴ末端断片に切断することを好むことが知られているため、典型的なｃｆＤＮＡプロファイルから、５０～１５０ｂｐおよび２５０～３００ｂｐの範囲のＴ末端断片ピークが、ほとんど裸であり得ると推測することができる。
ヘパリンインキュベーションおよび末端分析の使用はまた、１０ｂｐの周期性の起源への独特の洞察を提供している。すべての断片タイプが１０ｂｐの周期性を実証するため（図２１Ａ）、短い断片における１０ｂｐの周期性に完全に関与する特定のヌクレアーゼはないことを示す。代わりに、すべての断片タイプについて、ヘパリンが使用されると１０ｂｐの周期性が破壊されることを実証する（図２１Ｂ）。ＤＮＡＳＥ１活性を強化することに加えて、ヘパリンは、図２３Ａに示されるように、ヌクレオソーム構造を破壊する（Ｖｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕ，Ｂ．（１９９２），Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ２８８（Ｐｔ３），９５３－９５８）。多くの人が、１０ｂｐの周期性が無傷のヌクレオソーム構造内のＤＮＡの切断に由来すると仮定しているが、本研究が裏付けとなる証拠を提供し、破壊されたヌクレオソームの存在下では１０ｂｐの周期性が生じないことを示すと考えている。
近年、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．は、渡辺らは、Ｄｎａｓｅ１Ｌ３およびＤｆｆｂ欠損マウスにおけるアセトアミノフェンの過剰摂取および抗Ｆａｓ抗体治療により、インビボ肝細胞壊死およびアポトーシスを誘導した（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５１６，７９０－７９５）。Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．は、ｃｆＤＮＡがＤＮＡＳＥ１Ｌ３およびＤＦＦＢによって生成されることを示したと主張しているが、彼らのデータは、Ｄｎａｓｅ１ｌ３およびＤｆｆｂダブルノックアウトマウスにおける肝細胞損傷後に血清ｃｆＤＮＡが増加しているようには思われないことを示すだけである。その場合でさえ、彼らの方法からの肝細胞損傷の程度は、野生型でも大きく変動し、彼らのアポトーシス抗Ｆａｓ抗体実験におけるｃｆＤＮＡ量との相関は驚くほど低い。ノックアウトマウスにおいて誘導されるアポトーシスの程度に不確実性を与えるこれらの不一致に加えて、彼らは、本研究で提供された断片末端に関する詳細をなにも有していない。
本研究において、典型的なｃｆＤＮＡ断片が２つの主要なステップ：１）ＤＦＦＢ、細胞内ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、および他のアポトーシスヌクレアーゼによる細胞内ＤＮＡ断片化、ならびに２）血清ＤＮＡＳＥ１Ｌ３による細胞外ＤＮＡ断片化で作られ得ることを実証している。次いで、おそらくインビボタンパク質分解により、ＤＮＡＳＥ１は、ｃｆＤＮＡを短いＴ末端断片にさらに分解することができる（図１８Ａと１８Ｂとの間のＴ末端グラフの差を比較する）。この最初のモデルは、ｃｆＤＮＡ生成に関与する多くの主要なヌクレアーゼを含んでいたと考えられるが、モデルは、将来さらに改良され得る。例えば、他の潜在的なアポトーシスヌクレアーゼには、エンドヌクレアーゼＧ、ＡＩＦ、トポイソメラーゼＩＩ、およびシクロフィリンが含まれ、おそらくさらに発見されるであろう（Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（２０１８），Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３６，４８９－５１７、Ｓａｍｅｊｉｍａ，Ｋ．ａｎｄ Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．（２００５），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６，６７７－６８８、Ｙａｎｇ，Ｗ．（２０１１），Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ４４，１－９３）。ダブルノックアウトモデルを用いたこれらのヌクレアーゼのさらなる研究は、このモデルをさらに改良し、Ｇ末端選択を有するヌクレアーゼを明らかにし得る。本研究において、異なるヌクレアーゼの作用をｃｆＤＮＡ断片末端プロファイルに明確に関連付けている。
ヌクレアーゼ生物学とｃｆＤＮＡ生理学との間のこの関連性が確立されたことで、ｃｆＤＮＡの分野に多くの重要かつ実用的な影響がある。第一に、病理学的結果を伴うヌクレアーゼ生物学の異常は、異常なｃｆＤＮＡプロファイルに反映され得る（Ａｌ－Ｍａｙｏｕｆ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４３，１１８６－１１８８、Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ａｌｃａｚａｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３５８，１２０２－１２０６、Ｏｚｃａｋａｒ，Ｚ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６５，２１８３－２１８９））。第二に、血漿末端モチーフ分析は、ｃｆＤＮＡ生物学を調査するための強力なアプローチであり、診断用途があり得る。そして最後に、抗凝固剤のタイプおよび血液分離の時間遅延などの分析前の変数は、エピジェネティック情報および遺伝情報についてｃｆＤＮＡをマイニングするときに覚えておくべき重要な交絡因子である。そのようなｃｆＤＮＡプロファイリングの例示的な用途が以下に記載される。
さらに、データはマウスについて提供されているが、そのような生物学的機能は、血液または他の無細胞試料を有するすべての生物に共通している。
ＶＩ．ヌクレアーゼの遺伝性障害を検出するための方法
上記のように、様々な技術を使用して、例えばヌクレアーゼに関連する遺伝性障害を検出することができる。遺伝性障害は、特定の遺伝子に対応するヌクレアーゼの変異（例えば、欠失）に関連し得る。そのような変異により、ヌクレアーゼは存在しないか、または不規則に機能する可能性がある。正常／参照ｃｆＤＮＡプロファイル（例えば、断片末端および／またはサイズによる）は、遺伝性障害が存在しない場合に決定され得、新たな試料について比較が行われ得る。正常／参照ｃｆＤＮＡプロファイルは、他の対象から、または同じ対象についてだが、異なる条件（例えば、以前に、または異なるインキュベーション量で採取された試料）で決定され得る。そのような方法の例が以下のフローチャートに示される。１つのフローチャートについて説明される技術は、他のフローチャートにも適用可能であり、簡潔にするために繰り返されない。
上記のように、様々な技術を使用して、例えばヌクレアーゼに関連する遺伝性障害を検出することができる。遺伝性障害は、特定の遺伝子に対応するヌクレアーゼの変異（例えば、欠失）に関連し得る。そのような変異により、ヌクレアーゼは存在しないか、または不規則に機能する可能性がある。正常／参照ｃｆＤＮＡプロファイル（例えば、断片末端および／またはサイズによる）は、遺伝性障害が存在しない場合に決定され得、新たな試料について比較が行われ得る。正常／参照ｃｆＤＮＡプロファイルは、他の対象から、または同じ対象についてだが、異なる条件（例えば、以前に、または異なるインキュベーション量で採取された試料）で決定され得る。そのような方法の例が以下のフローチャートに示される。１つのフローチャートについて説明される技術は、他のフローチャートにも適用可能であり、簡潔にするために繰り返されない。
Ａ．経時的なインキュベーションを使用した遺伝性障害の検出
試料の異なるインキュベーション量は、遺伝性障害が存在するかどうかに応じて、異なるｃｆＤＮＡプロファイルをもたらし得る。特定のｃｆＤＮＡプロファイルの挙動は、特定のヌクレアーゼが適切に発現され、機能しているかどうかに依存し得るため、そのような挙動の正常からの変化は、遺伝性障害が存在することを示し得る。
試料の異なるインキュベーション量は、遺伝性障害が存在するかどうかに応じて、異なるｃｆＤＮＡプロファイルをもたらし得る。特定のｃｆＤＮＡプロファイルの挙動は、特定のヌクレアーゼが適切に発現され、機能しているかどうかに依存し得るため、そのような挙動の正常からの変化は、遺伝性障害が存在することを示し得る。
図２７は、本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法２７００を例示するフローチャートを示す。本明細書の方法２７００および他の方法は、コンピュータシステムによって制御されることを含めて、コンピュータシステムを用いて全体的または部分的に実施され得る。例として、遺伝子は、ヌクレアーゼをコードすること、その転写のためのエピジェネティックマーカーを有すること、そのＲＮＡ転写物が存在すること、可変的にスプライシングされたＲＮＡを有すること、またはそのＲＮＡが可変的に翻訳されることによって、ヌクレアーゼに関連付けられ得る。遺伝性障害は、特定の組織（例えば、腫瘍組織）にのみ存在する可能性がある。したがって、遺伝性障害の検出は、がんのレベルを決定するために使用され得る。
ブロック２７１０で、第１の配列リードを、対象の第１の生物学的試料中の第１の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得し、受け取る。例示的な生物学的試料、例えば、血液、血漿、血清、尿、および唾液が本明細書に提供される。配列決定は、例えば本明細書に記載されるような様々な方法で実施することができる。例示的な配列決定技術には、超並列配列決定もしくは次世代シーケンシング、単一分子配列決定の使用、および／または二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ配列決定ライブラリ調製プロトコルが含まれる。当業者は、使用され得る様々な配列決定技術を理解するであろう。配列決定の一部として、得られた配列リードの一部が細胞核酸に対応し得ることが可能である。
配列決定は、例えば本明細書に記載されるような標的化配列決定であり得る。例えば、生物学的試料は、ＣＴＣＦ領域、ＴＳＳ領域、Ｄｎａｓｅ過敏性部位、またはＰｏｌ ＩＩ領域などの特定の領域からのＤＮＡ断片が濃縮され得る。濃縮は、例えば参照ゲノムによって定義されるように、ゲノムの一部または全体に結合する捕捉プローブを使用することを含み得る。別の例として、濃縮は、プライマーを使用して、ゲノムの特定の領域を増幅することができる（例えば、ＰＣＲ、ローリングサークル増幅、または多重置換増幅（ＭＤＡ）を介して）。
第１の生物学的試料は、抗凝固剤で処理され、第１の時間の長さにわたってインキュベートされ得る。インキュベーションは、特定の温度以上、例えば、摂氏５°、１０°、１５°、２０°、２５°、または３０°を超えることができる。より低温での保管は、インキュベーション時間の一部としてカウントされない場合がある。第１の時間の長さは、ゼロであり得る。他の実装例において、第１の生物学的試料は、抗凝固剤で処理されることなく、第１の時間の長さにわたってインキュベートされる。例として、抗凝固剤は、ＥＤＴＡまたはヘパリンであり得る。ＥＤＴＡは、血漿ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡＳＥ１およびＤＮＡＳＥ１Ｌ３）を阻害して、分析用にｃｆＤＮＡを保存するのに役立ち得る。
ブロック２７２０で、第１の配列リードを使用して、特定の塩基で終わる第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１の量を決定する。特定の塩基は、対末端配列についてリードの配向（例えば、配列決定された第１の塩基）を使用して決定され得る、断片の末端に対応する第１の配列リードの末端を特定することによって決定され得る。特定の断片末端、例えば、５’末端または３’末端が使用され得る。第１の量は、特定の塩基を含む特定の末端モチーフについて決定され得る。したがって、第１の量は、２つ以上の塩基についてのものであり得る特定の末端配列についてのものであり得る。第１の量は、パラメータ値の一例である。
いくつかの実施形態において、第１の量は、断片の一方の末端に第１の末端モチーフ（例えば、第１の塩基）を有し、断片のもう一方の末端に第２の末端モチーフ（例えば、第２の塩基）を有するＤＮＡ断片についてのものであり得る。
いくつかの実装例において、第１の量を決定する前に第１の無細胞ＤＮＡ断片が濾過され、例えば、特定の領域（例えば、ＣＴＣＦ）からの断片のみが、第１の量を決定するために使用され得る。第１の配列リードは、参照ゲノムにアラインメントされ得る。次いで、参照ゲノムの特定の位置で、または特定の位置から指定された距離で終わる配列リードの第１のセットが特定され得、特定の位置は、参照ゲノムにおける指定された特性を有する特定の座標またはゲノム位置に対応する。次いで、第１の量は、特定の塩基で終わる配列リードの第１のセットの量として決定され得る。ゲノム位置は、ＣＴＣＦ領域の中心であり得る。他の例として、ゲノム位置は、オープンクロマチン領域、Ｐｏｌ ＩＩ領域、ＴＳＳ領域、および／または特定の酵素（例えば、特定のＤＮａｓｅ）の過敏性部位に関連付けられ得る。
ブロック２７３０で、対象の第２の生物学的試料中の第２の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された第２の配列リードを受け取る。第２の生物学的試料は、抗凝固剤で処理され、第１の時間の長さよりも長い第２の時間の長さにわたってインキュベートされ得る。他の実装例において、第２の生物学的試料は、抗凝固剤によって処理されることなくインキュベートされ得る。時間の長さは、温度係数を含むことができ、例えば、より高い温度は、時間の長さを取得するために時間単位を乗算した重み付け係数として機能し得る。このように、より大きい／同じ量の細胞死が、より高い温度でのインキュベーションにより、試料／より短い時間で生じ得る。
ブロック２７４０で、第２の配列リードを使用して、特定の塩基で終わる第２の無細胞ＤＮＡ断片の第２の量を決定する。いくつかの実装例において、第１の量および第２の量は、特定の塩基での両端を有する無細胞ＤＮＡ断片のものである。第２の量はまた、特定の塩基を含む特定の末端モチーフについて決定され得る。したがって、第２の量は、２つ以上の塩基についてのものであり得る特定の末端配列についてのものであり得る。いくつかの実施形態において、第１の量は、断片の一方の末端に第１の末端モチーフ（例えば、第１の塩基）を有し、断片のもう一方の末端に第２の末端モチーフ（例えば、第２の塩基）を有するＤＮＡ断片についてのものであり得る。
量は、パーセンテージとして決定され得、本明細書において塩基含有量または頻度とも称される。他の実装例において、量は、測定されたＤＮＡ断片の量（例えば、配列リードによって測定される）を使用して直接正規化（例えば、それによって除算）されない生の量であり得る。代わりに、同じサイズの試料を使用することによって、または２つの試料について同じ数のＤＮＡ断片を配列決定することによって、間接的な正規化が行われ得る。
量は、ＤＮＡ断片のサイズに関連し得る。例えば、第１の配列リードを使用して、特定の塩基またはより大きな末端モチーフで終わる第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１のサイズを決定することができる。第１の量は、特定のサイズを有する第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１のセットを使用して決定され得る。第２の配列リードを使用して、特定の塩基またはより大きな末端モチーフで終わる第２の無細胞ＤＮＡ断片の第２のサイズを決定することができる。第２の量は、特定のサイズを有する第２の無細胞ＤＮＡ断片の第２のセットを使用して決定され得る。特定のサイズは、サイズ範囲であり得る。サイズの使用例は、図１０Ｂと比較した図１０Ａならびに他の同様の図に見られ得る。
ブロック２７５０で、第１の量を第２の量と比較して、遺伝子が対象において遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定する。いくつかの実装例において、第１の量を第２の量と比較することは、第１の量が第２の量と少なくとも閾値量だけ異なるかどうかを決定することを含み、統計的に有意な差または他の分離値がある場合、どの量が他よりも大きいかを含み得る。したがって、分類は、第１の量が第２の量の閾値内にあるときに遺伝性障害が存在することであり得る。
いくつかの実施形態において、量の比較は、第１の量と第２の量との間の分離値を決定することを含み得る。分離値を参照値（例えば、カットオフ）と比較して、分類を決定することができる。参照値は、既知の分類を有する較正（参照）試料を使用して決定された較正値であり得、参照値または較正関数を決定するために集合的に分析され得る（例えば、分類が連続変数である場合）。第１の量および第２の量は、参照／較正値と比較され得るパラメータ値の例である。そのような技術は、本明細書のすべての方法に使用され得、さらなる詳細は、他のセクションに提供される。
分類は、例えば、ヌクレアーゼのコード遺伝子が両方の染色体において、一方の染色体においてのみ欠損しているか、特定の組織においてのみ欠損しているか、または変異が発現を低減するが、ヌクレアーゼの存在を排除しないかからの、障害のレベルまたは重症度であり得る。ヌクレアーゼの発現のそのような部分的低減は、変異（例えば、欠失）が特定の組織においてのみ存在する場合、または変異が支持領域内、例えば、ヌクレアーゼの発現レベルに影響を及ぼすｍｉＲＮＡなどの非コード領域内に存在する場合に生じ得る。参照レベルと比較した差の異なる量の結果としての、遺伝性障害の異なるレベルまたは重症度。複数の参照レベルを使用して、差の分類を決定することができる。
いくつかの例において、第１の量が第２の量の閾値内にある場合、分類は、例えば、図１０Ｂにあるように、遺伝性障害が存在することであり得る。図１０Ｂに示されるように、末端塩基のいずれについても断片の量に有意差はないが、図１０Ａに示されるＷＴの場合、塩基のすべてについて有意差がある。様々な実装例において、量が、すべてのサイズについてもしくは特定のサイズのセットについて集計され得るか、または各サイズの差が集計され得る。例えば、ＷＴについての差が約１０％であり、Ｄｆｆｂ-/-についての差が約１パーセント以内であるため、２００塩基でのＡ末端断片についての閾値量は、約５％であり得る。特定の末端モチーフを有する特定のＤＮＡ断片の量に変化がない例は、図８Ａと図１１Ｃとの比較においても見られ得、断片の両端が使用され得ることを例示する。特定の末端モチーフを有する特定のＤＮＡ断片の量に変化がない別の例は、図１２Ａ～１２Ｄおよび１３と図４Ｂおよび４Ｃとの比較においても見られ得、分析が、特定のタイプの領域内の、およびさらには特定のタイプの領域内の特定の位置でのＤＮＡ断片（配列リード）のものであり得ることを例示する。
他の例において、第２の量が第１の量よりも少なくとも閾値だけ少ない場合（例えば、Ｔ末端について）、分類は、ＷＴがＴ末端についてより大きい第２の量を有する場合（図２３Ｂおよび２３Ｃ）とは対照的に、例えば図２４Ａ～２４Ｂにあるように、遺伝性障害が存在することであり得る。他の例において、分類は、ＷＴが、例えば図２３Ａおよび２３Ｂにあるように、第１および第２の量についてほぼ同じである場合とは対照的に、例えば図２４Ａ～２４Ｂにあるように、第２の量がより大きい場合（例えば、Ａ末端について）、遺伝性障害が存在することであり得る。
他の例において、ＷＴおよび変異の両方が、特定の末端モチーフを有するＤＮＡ断片の同じ変化（例えば、増加または減少）を引き起こし得るが、変化の量は異なり得る。例えば、図１６Ａおよび１６Ｂは、Ｄｎａｓｅ１ｌ３-/-のＡ＜＞Ｇ断片についてよりも、２０ｂｐでのＡ＜＞Ｇ断片のＷＴについて大きな増加を示す。
試験されている遺伝性障害のタイプは、ｃｆＤＮＡの挙動が異なるため、障害が存在するかどうかを決定するために使用される基準のタイプを提供することができる。
一例として、遺伝性障害には、遺伝子の欠失が含まれ得る。例として、遺伝子は、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、またはＤＮＡＳＥ１であり得る。ヌクレアーゼは、細胞内ＤＮＡを切断するもの、例えば、ＤＦＦＢまたはＤＮＡＳＥ１Ｌ３であり得る。ヌクレアーゼは、細胞外ＤＮＡを切断するもの、例えば、ＤＮＡＳＥ１またはＤＮＡＳＥ１Ｌ３であり得る。
Ｂ．参照値を使用した遺伝性障害の検出
上記のように、異なるインキュベーションを伴う試料間の特定の塩基含有量の差または他の分離値（例えば、小さいか大きいか）を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を分類することができる。あるいは、特定の塩基の測定された量が参照値と比較され得る。そのような参照値は、健康な対象において測定された特定の塩基の量に対応し得る。
上記のように、異なるインキュベーションを伴う試料間の特定の塩基含有量の差または他の分離値（例えば、小さいか大きいか）を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を分類することができる。あるいは、特定の塩基の測定された量が参照値と比較され得る。そのような参照値は、健康な対象において測定された特定の塩基の量に対応し得る。
例えば、ＥＤＴＡ ０時間の図１２Ａ（ＤＦＦＢ欠損）とＥＤＴＡ ０時間の図２Ｃ（ＷＴ）との比較は、ランダム領域についてＤｆｆｂ欠損マウスにおけるＡ末端含有量の減少を示す。したがって、Ｄｆｆｂ欠損において測定されたＡ末端含有量の比較は、ＷＴについての参照値と比較され得、測定された量が統計的に有意な量だけ参照値よりも低い場合、障害が決定される。そのような差は、インキュベーションなしで存在する。ＣＴＣＦ領域（図１２Ｂ対図２Ｅ）、ＴＳＳ領域（図１３Ａ対図３Ｂ）、およびＰｏｌ ＩＩ領域（図１３Ｃ対図３Ｄ）について同様の差が存在する。Ｇ末端含有量の減少はまたは、ＤＦＦＢ欠損の結果として見られる。
別の例が図１５に見られ得る。ＤＮＡＳＥ１Ｌ３欠損は、Ｔ末端断片およびＣ末端断片の減少をもたらし、Ａ末端断片およびＧ末端断片の増加をもたらす。一実装例は、ＷＴについての（例えば、すべてのサイズまたは特定のサイズ範囲のみについての）参照Ｔ末端含有量を使用し、測定されたＴ末端含有量が統計的により低いかどうかを決定することができ、これは、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３についての障害の分類を提供する。図１６Ａは、そのような差のさらなる例を提供し、この場合、量が両端についての例である。図１４Ｂは、別の例を提供する。
図２８は、本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法２８００を例示するフローチャートを示す。方法２７００に使用されるのと同様の技術が、方法２８００で使用され得る。例として、遺伝子は、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＦＦＢ、またはＤＮＡＳＥ１である。
ブロック２８１０で、対象の第１の生物学的試料中の第１の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された第１の配列リードを受け取る。配列決定は、例えば本明細書に記載されるような様々な方法で実施することができる。第１の生物学的試料は、抗凝固剤で処理され、例えば、図１８Ａと比較して図１８Ｂについて記載されるように、少なくとも指定された時間にわたってインキュベートされ得る。ブロック２７１０に使用されるのと同様の技術が、ブロック２８１０で使用され得る。
ブロック２８２０で、第１の配列リードを使用して、特定の塩基で終わる第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１の量を決定する。ブロック２７２０に使用されるのと同様の技術が、ブロック２８２０で使用され得る。例えば、特定のサイズの配列リードが、特定の塩基で終わる量を決定するために使用され得る。別の例として、量は、特定の塩基を含む特定の末端モチーフについて決定され得る。
ブロック２８３０で、第１の量を参照値と比較して、遺伝子が対象において遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定する。様々な実施形態において、第１の量を第２の量と比較することは、（１）第１の量が参照値と少なくとも閾値量だけ異なるかどうか、もしくは差が閾値量よりも小さいかどうかを決定すること、（２）第１の量が参照値よりも少なくとも閾値量だけ少ないかどうかを決定すること、または（３）第１の量が参照値よりも少なくとも閾値量だけ大きいかどうかを決定することを含み得る。第１の量は、パラメータ値の一例であり、参照値は、較正値であり得るか、または較正試料の較正値から決定され得る。さらなる詳細が他の方法について提供されるが、方法２８００にも同様に適用される。
Ｃ．サイズを使用した遺伝性障害の検出
Ｃ．サイズを使用した遺伝性障害の検出
上記のように、特定のサイズの断片を使用して、特定の塩基での配列リードの量を決定することができる。いくつかの実装例において、サイズは、塩基含有量または特定の塩基で終わる断片の他の測定された量の決定なしに使用され得る。そのような例は、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）とのインキュベーションを含む、図１７Ａおよび１７Ｂに示される。遺伝性障害（この場合は様々なレベルのＤＮＡＳＥ１欠損）を有する対象は、特定のサイズで異なる頻度のＤＮＡ断片を有する。例えば、５０～１５０ｂｐで、ＷＴ（参照値）は、Ｄｎａｓｅ１+/-対象よりも高い頻度を有し、これは、Ｄｎａｓｅ１-/-対象よりも高い頻度を有する。１５０～２３０ｂｐのサイズ範囲において、ＤＮＡ断片の頻度について反対の関係が存在する。
図２９は、本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法２９００を例示するフローチャートを示す。方法２７００および２８００に使用されるのと同様の技術が、方法２９００で使用され得る。
ブロック２９１０で、対象の第１の生物学的試料中の第１の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された第１の配列リードを受け取る。生物学的試料は、抗凝固剤で処理され、少なくとも指定された時間にわたってインキュベートされ得る。例として、抗凝固剤は、ヘパリンであり得る。
ブロック２９２０で、例えば、図１７Ａおよび１７Ｂに記載されるように、第１の配列リードを使用して、特定のサイズを有する第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１の量を決定することができる。特定のサイズは、範囲であり得る。例えば、サイズ範囲は、サイズカットオフよりも大きいかまたは小さい、例えば、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、または２００ｂｐであり得る。他の例として、サイズ範囲は、最小サイズおよび最大サイズ、例えば、５０～８０、５０～１００、５０～１５０、１００～１５０、１００～２００、１５０～２００、１５０～２３０、２００～３００、または３００～４００塩基、ならびに他の範囲によって指定され得る。サイズ範囲の幅は、例えば５０、１００、１５０、または２００塩基になるように異なり得る。例として、第１の量は、生のカウントであり得るか、または例えば、分析された配列リードまたはＤＮＡ断片の総数を使用して、頻度として正規化され得る。
ブロック２９３０で、第１の量を参照値と比較して、遺伝子が対象において遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定する。分離値は、第１の量と参照値との間で決定され得る。一例において、遺伝子は、ＤＮＡＳＥ１である。方法２９００の分類は、他の方法について記載されるものと同じであり得、例えば、参照レベルと比較した差の異なる量の結果としての、遺伝性障害の異なるレベルまたは重症度の分類である。複数の参照レベルを使用して、差の分類を決定することができる。
第１の量は、パラメータ値の一例である。参照値は、パラメータの所与の測定値についての（例えば、所与の較正値についての）既知の有効性を有する１つ以上の較正試料から決定される較正データ点の一部であり得る。既知の有効性は、後に記載されるように、血液凝固試験を使用して決定され得る。
方法２７００～２９００の様々な実施形態において、参照値は、遺伝性障害を有しない１つ以上の参照試料から決定され得る、および／または遺伝性障害を有する１つ以上の参照試料から決定され得る。
ＶＩＩ．抗凝固剤の投与量の有効性の決定
一部の人々は、例えば深部静脈血栓症（ＤＶＴ）のために抗凝固剤で治療され、これは、一部の静脈において血栓をもたらす。一治療法は、ヘパリンである。いくつかの実施形態は、抗凝固剤が作用しているかどうかを決定することができる。例として、ヘパリンの効果は、ｃｆＤＮＡ量の増加、および／またはＤＮＡＳＥ１活性の上昇、および／または短い断片の増加とともに見られ得る。これは、サイズプロファイル、サイズ中央値のシフト、または特定のサイズ、例えば１５０ｂｐ未満の断片の増加に見られ得る。
一部の人々は、例えば深部静脈血栓症（ＤＶＴ）のために抗凝固剤で治療され、これは、一部の静脈において血栓をもたらす。一治療法は、ヘパリンである。いくつかの実施形態は、抗凝固剤が作用しているかどうかを決定することができる。例として、ヘパリンの効果は、ｃｆＤＮＡ量の増加、および／またはＤＮＡＳＥ１活性の上昇、および／または短い断片の増加とともに見られ得る。これは、サイズプロファイル、サイズ中央値のシフト、または特定のサイズ、例えば１５０ｂｐ未満の断片の増加に見られ得る。
Ａ．断片末端の特定の塩基の量を使用した有効性の決定
いくつかの実施形態において、有効性は、断片末端の特定の塩基の量（例えば、塩基含有量）を使用して決定され得る。
いくつかの実施形態において、有効性は、断片末端の特定の塩基の量（例えば、塩基含有量）を使用して決定され得る。
図３０は、本開示の実施形態による、血液障害を有する対象の治療の有効性を決定するための方法３０００を例示するフローチャートを示す。他の方法に使用されるのと同様の技術が、方法３０００で使用され得る。
ブロック３０１０で、対象の血液試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された配列リードを受け取る。血液試料は、第１の投与量の抗凝固剤を投与された対象の後に取得される。抗凝固剤は、ヘパリンであり得る。方法３０００は、第１の投与量の抗凝固剤を対象に投与することを含み得る。
配列リードを受け取る前に、血液試料は、対象から取得され得、血液試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定が実施されて、配列リードを取得することができる。
ブロック３０２０で、配列リードを使用して、特定の塩基で終わる無細胞ＤＮＡ断片の量を決定することができる。例として、量は、特定のサイズであってもよいか（例えば、図１８Ｂに示されるように）、または例えば、図７Ｂ～７Ｄに示されるように、指定された特性を有する特定の座標もしくはゲノム位置に（またはそれに隣接して）あってもよい。断片の末端の特定の塩基の量に対する抗凝固剤の効果は、図１８Ａに見られ得る。例えば、Ａ末端断片の増加は、合計で、および特定のサイズ範囲で予想される。他の方法と同様に、特定の塩基は、例えば、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなどのより大きな末端モチーフの一部であり得る。さらに、特定の塩基は、ＤＮＡ断片の両端にある必要があり得るか、または異なる末端モチーフの特定の対を使用して、ＤＮＡ断片の特定のセットを選択することができる。
特定の塩基で終わる無細胞ＤＮＡ断片の量に加えて、ｃｆＤＮＡの総量（すなわち、あらゆる末端についての）は、例えば、後に図３２Ａに示されるように決定および使用され得る。この方法および他の方法で測定された量は、例えば、試料の特性（例えば、試料の体積もしくは質量）を使用して、または指定された基準を満たす無細胞ＤＮＡ断片または配列リードの別の量（例えば、試料中のＤＮＡ断片の総量、もしくは異なる末端モチーフを有する断片の数）を使用して正規化され得る。
ブロック３０３０で、量を参照値と比較して、治療の有効性の分類を決定することができる。参照値は、例えば本明細書に記載されるように、様々な方法で決定され得る。例えば、予想量は、必要に応じて応答する患者について決定され得る。量と参照値との間の差の量は、分類を提供することができる。差が十分に小さい（例えば、カットオフ未満である）場合、第１の投与量は、有効であると分類され得る。差がカットオフよりも大きい場合、第１の投与量は、有効ではないと決定され得る。１つ以上の追加のカットオフ値を使用することによって決定され得る、例えば、中程度のまたは大きな無効性など、異なるレベルの無効な投与量があり得る。
量が参照値と一致しない場合（例えば、参照値の指定された範囲内で）、比較に基づいて第２の投与量の抗凝固剤が対象に投与され得、第２の投与量は、第１の投与量よりも大きい。他の例において、例えば、量が参照値を超える場合、第２の投与量は、第１の投与量よりも少なくなり得る。
量は、パラメータ値の一例である。参照値は、パラメータの所与の測定値についての（例えば、所与の較正値についての）既知の有効性を有する１つ以上の較正試料から決定される較正データ点の一部であり得る。既知の有効性は、後に記載されるように、血液凝固試験を使用して決定され得る。さらなる詳細が他の方法およびセクションについて提供されるが、方法３０００にも同様に適用される。
一例として、参照値は、抗凝固剤を投与する前に対象において以前に実施された測定に対応し得る。以前の測定からの量の変化は、抗凝固剤の投与量の有効性を示し得る。別の実装例において、参照値は、健康な対象において測定された量に対応し得る。有効な投与量は、量を健康な対象についての参照値の閾値内に導くものであり得る。さらに別の実装例において、参照値は、血液障害を有する対象において測定された量に対応し得る（例えば、抗凝固剤を投与する前に対象において以前に測定され得るか、または血液障害を有する別の対象で測定され得るような）。
Ｂ．断片のサイズを使用した有効性の決定
いくつかの実施形態において、有効性は、断片末端のサイズを使用して決定され得る。
いくつかの実施形態において、有効性は、断片末端のサイズを使用して決定され得る。
図３１は、本開示の実施形態による、血液障害を有する対象の治療の有効性を決定するための方法３１００を例示するフローチャートを示す。他の方法に使用されるのと同様の技術が、方法３１００で使用され得る。
ブロック３１１０で、対象の血液試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された配列リードを受け取る。血液試料は、第１の投与量の抗凝固剤を投与された対象の後に取得される。抗凝固剤は、ヘパリンであり得る。方法３１００は、第１の投与量の抗凝固剤を対象に投与することを含み得る。
ブロック３１２０で、配列リードを使用して、特定のサイズを有する無細胞ＤＮＡ断片の量を決定することができる。ブロック３１２０は、方法１１００のブロック１１２０と同様の方法で実施され得る。サイズに対する効果は、図１７Ａおよび１７Ｂに例示されるとおりであり得る。
ブロック３１３０で、量を参照値と比較して、治療の有効性の分類を決定することができる。参照値は、方法３０００に関するものと同様の方法で決定され得る。第１の量は、パラメータ値の一例であり、参照値は、較正値であり得るか、または較正試料の較正値から決定され得る。さらなる詳細が他の方法について提供されるが、方法３１００にも同様に適用される。
量が参照値と一致しない場合（例えば、参照値の指定された範囲内で）、比較に基づいて第２の投与量の抗凝固剤が対象に投与され得、第２の投与量は、第１の投与量よりも大きい。他の例において、例えば、量が参照値を超える場合、第２の投与量は、第１の投与量よりも少なくなり得る。
Ｃ．結果
図３２Ａは、本開示の実施形態による、ヘパリンで治療された４つの症例についての表３２００を示す。各列は、異なる患者に対応する。１行目は、４人の患者の各々の止血障害を特定する。ＩＴＰは、免疫性血小板減少性紫斑病：出血傾向につながる血小板の免疫介在性破壊である。ＤＶＴは、深部静脈血栓症である。ＡＴＩＩＩは、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症：凝固カスケードにアンチトロンビンＩＩＩがなく、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子などの阻害がなく、血栓（血餅形成）傾向（すなわち、ＤＶＴ）につながることである。Ｓｅｑ４は、ヘパリンの投与以外の不明な臨床例の詳細を有する。
図３２Ａは、本開示の実施形態による、ヘパリンで治療された４つの症例についての表３２００を示す。各列は、異なる患者に対応する。１行目は、４人の患者の各々の止血障害を特定する。ＩＴＰは、免疫性血小板減少性紫斑病：出血傾向につながる血小板の免疫介在性破壊である。ＤＶＴは、深部静脈血栓症である。ＡＴＩＩＩは、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症：凝固カスケードにアンチトロンビンＩＩＩがなく、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子などの阻害がなく、血栓（血餅形成）傾向（すなわち、ＤＶＴ）につながることである。Ｓｅｑ４は、ヘパリンの投与以外の不明な臨床例の詳細を有する。
２行目は、血漿試料中のｃｆＤＮＡの濃度を測定するために使用する方法を列挙する。３行目は、ＧＥ／ｍｌでの無細胞ＤＮＡの濃度を示す。４行目は、抗凝固剤で治療されておらず、血液障害を有しない３，８４４個の参照試料から決定された参照値を示す。５行目および６行目は、２行目の測定値と３行目の参照値との差を示す。示されるように、大幅な増加がある。最後の行は、無細胞ＤＮＡ量についての平均からの有意な偏差を示し、これは、ヘパリンの投与量が無細胞ＤＮＡの量に影響を及ぼしており、大幅な増加をもたらすことを示す。
５行目および６行目に示されるように、ヘパリンが凝固を予防する働きをするにつれて、無細胞ＤＮＡの量は、大幅に増加する。したがって、ＤＮＡの総量を使用して投与量の有効性を決定することができる。以下に記載されるように、ｃｆＤＮＡの絶対減少または倍率減少を決定し、目標と比較して、現在の用量の有効性を決定すること、および／または投与量をどれだけ増加もしくは減少させるべきかを決定することができる。パラメータが高すぎる場合、目標を達成するために投与量を減少させることができる。
図３２Ｂ～３２Ｃは、本開示の実施形態による、ヘパリンで治療されたＤＶＴ患者の異なる時間に採取された２つの試料についてのデータを示す。異なる時間は、妊娠の週および日によって指定される。図３２Ｂ～３２Ｃは、参照に対する対象の相対的な頻度対サイズのプロットを示す。図３２Ｂ～３２Ｃに見られるように、対象のサイズ分布は、図１７Ａと一致して、ヘパリンの効果を示すようにより小さなサイズにシフトした。他の実施形態は、ワーファリンまたは第Ｘａ因子阻害剤などの他の抗凝固剤を使用することができる（例えば、心房細動のために）。
血液凝固試験を、特定の投与量の抗凝固剤を用いた各対象についての較正データとして使用して、量またはサイズのどの変化が量／サイズの有効な変化と相関するかを特定することができる。例えば、抗凝固剤を投与された患者（例えば、ＤＶＴ患者）の群で行われた相関研究は、ｃｆＤＮＡの総量の倍率変化、特定の末端モチーフを有する量の変化、またはサイズプロファイルの変化を決定することができ、ＤＶＴ血餅のクリアランスの最適速度をもたらし得る。測定された変化（絶対または倍率）は、目標のまたは測定された特性（例えば、クリアランスのための最適速度）に対応する較正値に対応し得る。量／サイズについてのこの値または値の範囲は、療法を監視するために治療のための目標になり得る。対象の血液をインビトロで凝固させてもよく、次いで、抗凝固剤が有効である用量について、抗凝固剤をインビトロで滴定することができる。ｃｆＤＮＡの量／サイズは、血餅が溶解した後に試料中で測定され得、これらの値または値の範囲は、対象についての治療目標になり得る。例えば、凝固試験は、対象が適切な量で凝固していることを特定することができ、対応する量／サイズは、現在の投与量の有効性を分類するために使用され得る参照（較正）値として使用され得る。
有効な変化を達成するために、投与量は、個人ごとに異なり得、これは、そのような技術が、得られた変化の測定を可能にするために有利であり得る理由である。断片のサイズまたは量のそのような変化は、すべての人が同じ用量に対して同じように反応することを単に予想することとは対照的に、体内の実際の効果を測定することができる。
ＶＩＩＩ．ヌクレアーゼの活性の監視
いくつかの実施形態を使用して、ヌクレアーゼ、例えば、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、およびＤＮＡＳＥ１Ｌ３の活性を監視することができる。そのような活性は、内部ヌクレアーゼから（すなわち、身体の自然なプロセスとして）、および／またはヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡＳＥ１を添加した結果からのものであり得る。そのような監視を使用して、治療の有効性について遺伝性障害の変化を決定することができる。例えば、ＤＮＡＳＥ１を使用して対象を治療することができる。処理の効果は、Ｔ末端断片のパーセンテージまたはサイズを分析することによって測定され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡＳＥ１（例えば、外因的に添加された）を使用して、ＳＬＥなどの自己免疫状態を治療することができる。活性の決定に応じて、ヌクレアーゼの治療の投与量が変更され得る。
いくつかの実施形態を使用して、ヌクレアーゼ、例えば、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１、およびＤＮＡＳＥ１Ｌ３の活性を監視することができる。そのような活性は、内部ヌクレアーゼから（すなわち、身体の自然なプロセスとして）、および／またはヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡＳＥ１を添加した結果からのものであり得る。そのような監視を使用して、治療の有効性について遺伝性障害の変化を決定することができる。例えば、ＤＮＡＳＥ１を使用して対象を治療することができる。処理の効果は、Ｔ末端断片のパーセンテージまたはサイズを分析することによって測定され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡＳＥ１（例えば、外因的に添加された）を使用して、ＳＬＥなどの自己免疫状態を治療することができる。活性の決定に応じて、ヌクレアーゼの治療の投与量が変更され得る。
異常なヌクレアーゼ活性（例えば、正常／健康な値に対応する参照値よりも上または下）の決定は、単独で、または他の要因と組み合わせて、病理のレベルを示すことができる。病理は、がんであり得る。
Ａ．試料にＤＮＡＳＥ１を添加する効果
図３３は、本開示の実施形態による、異なる投与量のＤＮＡＳＥ１についての異なる末端の含有率対断片のサイズのプロットを示す。塩基含有率は、右側の縦軸にあり、横軸は、ｂｐごとのサイズである。緑色の線３３１１は、Ａ末端断片の頻度に対応する。赤色の線３３１２は、Ｔ末端断片の頻度に対応する。青色の線３３１３は、Ｃ末端断片の頻度に対応する。灰色の線３３１４は、Ｇ末端断片の頻度に対応する。ＤＮＡＳＥ１をインビトロで投与した。
図３３は、本開示の実施形態による、異なる投与量のＤＮＡＳＥ１についての異なる末端の含有率対断片のサイズのプロットを示す。塩基含有率は、右側の縦軸にあり、横軸は、ｂｐごとのサイズである。緑色の線３３１１は、Ａ末端断片の頻度に対応する。赤色の線３３１２は、Ｔ末端断片の頻度に対応する。青色の線３３１３は、Ｃ末端断片の頻度に対応する。灰色の線３３１４は、Ｇ末端断片の頻度に対応する。ＤＮＡＳＥ１をインビトロで投与した。
図３３はまた、本開示の実施形態による、すべての断片のサイズについての頻度プロットを示す。頻度は、左側の縦軸にある。黄色の線３３０５は、すべての断片のサイズに対応する。ＧＥ／ｍｌの濃度は、各試料について提供される。プロットは、ＤＮＡＳＥ１を投与する１Ｕ／ｍｌ（ｍｌごとの単位）、１０Ｕ／ｍｌ、および２０Ｕ／ｍｌの３つの異なる用量についてのものであり、これは、対象から血漿を取得した後、試料にインビトロで添加された。
Ｔ末端断片３３１２は、ＤＮＡＳＥ１用量とともに増加する。示されるように、赤色の線３３１２は、投与量が高くなるにつれて左から右に増加する。ヌクレアーゼ活性に対する塩基含有量（合計またはサイズ当たり）のこの依存は、特定の活性を有するものとしての試験試料の分類を可能にすることができる。Ｔ末端の総量、または特定のサイズもしくはサイズ範囲の特定の量が使用され得る。本開示の他の箇所に記載され、ヌクレアーゼ活性に依存する特徴のいずれか（例えば、特定のサイズまたはすべての断片サイズにわたる他の塩基の含有量）を使用して、例えば、既知の分類を有する他の試料において決定された参照値を使用して、ヌクレアーゼ活性を測定することができる。
サイズプロファイル３３０５はまた、ＤＮＡＳＥ１活性を反映することができる。例えば、より小さなＤＮＡ断片の増加は、ＤＮＡＳＥ１活性の上昇を示し得る。図の左から右への進行に見られるように、ＤＮＡＳＥ１の投与量が高くなるにつれて、より小さなＤＮＡ断片の数が増加し、より多くの小さなＤＮＡ断片は、２０Ｕ／ｍｌの最高用量を有する。
これらのプロットのいずれかからのデータのいずれかが、参照値として使用され得るか、または参照値と比較され得る。例えば、特定のサイズ範囲（特定のサイズを含む）でのＤＮＡ断片の頻度は、用量の各々について決定され得る。次いで、新しい試料についての測定値をこれらの各参照値と比較して、試験試料中の相対活性量を決定することができる。ヌクレアーゼ活性のそのような分類は、定性的（例えば、低、中、もしくは高）または定量的（特定の数値）であり得る。これらの試料は、既知の活性に対応しているため、試験試料中の活性を決定するための較正値としての役割を果たすことができる。必要に応じて、内挿または回帰を使用して、試験試料中の測定値についての特定の活性を推定することができる。
図３４Ａは、本開示の実施形態による、未処理およびＥＤＴＡ処理（９時間および６時間）と比較した、ＤＮＡＳＥ１で処理された血清についてのサイズプロファイルを示す。より多くのＤＮＡＳＥ１を添加するほど、より小さなＤＮＡ断片へのシフトが大きくなる。これはまた、図３３と一致して、ヌクレアーゼ活性に対するサイズの依存を示す。図３４Ｂは、血漿中の同様の効果を示す。図３４Ａおよび３４Ｂに示されるように、普通血漿は、普通（抗凝固剤を含まない）ファルコンチューブに入れられ、４℃で直ちに分離された血液である。対照的に、抗凝固剤を含まないファルコンチューブで１時間以上凝固させた血清試料。
図３５は、本開示の実施形態による、６時間後の血清に対する異なる用量のＤＮＡＳＥ１の効果を示す。説明文において、「ｕｎｔｘ‘ｄ」は「未処理」に対応する。サイズに対する効果は、サイズプロファイルのより小さなＤＮＡ断片へのさらに顕著なシフトを示す。図３５は、インキュベーションがある場合にサイズへの依存が存在することを示す。インキュベーションなし（０時間）よりも効果が大きいため、各試料から取得された参照値の差は、より大きくなり得、それによって既知の分類を有する試料についての参照値の差がより大きくなるため、より高い分類（区別）の精度を可能にする。
Ｂ．尿中のＤＮＡＳＥ１活性
他の無細胞試料は、本明細書に記載の方法のいずれかに使用され得る。一例として、尿が使用され得る。血漿中のヌクレアーゼの量は、血液とは異なり得、サイズを含む異なるｃｆＤＮＡプロファイルをもたらす。
他の無細胞試料は、本明細書に記載の方法のいずれかに使用され得る。一例として、尿が使用され得る。血漿中のヌクレアーゼの量は、血液とは異なり得、サイズを含む異なるｃｆＤＮＡプロファイルをもたらす。
図３６は、本開示の実施形態による、尿試料中の頻度対サイズおよび塩基含有量対サイズを示す。ＤＮＡＳＥ１がＴ末端を切断しなければならないという選択の結果として、Ｔ末端が最も高い。血液と比較して尿中のＴ普及度が高いことは、血液中よりも尿中のＤＮＡＳＥ１の相対活性が高いことを示す。
図３７は、異なる組織についてのＤＮＡＳＥ１発現を示す。腎臓発現は、血球と比較して比較的高い。腎臓細胞のより高い発現は、尿中に現れる。これは、ＤＮＡＳＥ１活性およびＴ末端頻度の相関関係を例示する。
Ｃ．断片末端の特定の塩基の量を使用した監視
したがって、いくつかの実施形態は、末端に特定の塩基を有するＤＮＡ断片の量を使用して、ヌクレアーゼ活性を監視することができる。本明細書の様々な図は、１人以上の対象の試料を使用したそのような監視についての例示的なデータを示す。
したがって、いくつかの実施形態は、末端に特定の塩基を有するＤＮＡ断片の量を使用して、ヌクレアーゼ活性を監視することができる。本明細書の様々な図は、１人以上の対象の試料を使用したそのような監視についての例示的なデータを示す。
図３８は、本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼの活性を監視するための方法３８００を例示するフローチャートである。方法３８００の態様は、本明細書に記載の他の方法と同様の方法で実施され得る。
ブロック３８１０で、配列リードを受け取る。配列リードは、対象の生物学的試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得され得る。
ブロック３８２０で、特定の塩基で終わる無細胞ＤＮＡ断片の量を、配列リードを使用して決定する。他の方法と同様に、特定の塩基は、例えば、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなどのより大きな末端モチーフの一部であり得る。さらに、特定の塩基は、ＤＮＡ断片の両端にある必要があり得るか、または異なる末端モチーフの特定の対を使用して、ＤＮＡ断片の特定のセットを選択することができる。
量は、パラメータ値の一例である。この方法および他の方法で測定された量は、例えば、試料の特性（例えば、試料の体積もしくは質量）を使用して、または指定された基準を満たす無細胞ＤＮＡ断片または配列リードの別の量（例えば、試料中のＤＮＡ断片の総量、もしくは異なる末端モチーフを有する断片の数）を使用して正規化され得る。そのような正規化は、本明細書に記載の量（パラメータ）のいずれかについて実施され得る。
ブロック３８３０で、量を参照値と比較して、ヌクレアーゼの活性の分類を決定する。いくつかの実施形態において、活性が参照値を下回る場合、対象は、障害を有すると分類され得る。そのような場合、対象は、例えば本明細書に記載されるように治療され得る。分類は、数分類値であり得、これをカットオフと比較して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子が対象において遺伝性障害を示すかどうかの第２の分類を決定することができる。
参照値は、既知の分類を有する較正（参照）試料を使用して決定された較正値であり得、参照値または較正関数を決定するために集合的に分析され得る（例えば、分類が連続変数である場合）。例えば、ヌクレアーゼ活性は、連続変数であり得、量と参照値との比較は、例えば、本明細書に記載されるように、量を較正関数に入力することによって決定され得る。
Ｄ．断片のサイズを使用した監視
実施形態はまた、特定のサイズ値を含む特定のサイズ範囲のＤＮＡ断片の量を使用したヌクレアーゼ活性の監視を提供することができる。本明細書の様々な図は、１人以上の対象の試料を使用したそのような監視についての例示的なデータを示す。
実施形態はまた、特定のサイズ値を含む特定のサイズ範囲のＤＮＡ断片の量を使用したヌクレアーゼ活性の監視を提供することができる。本明細書の様々な図は、１人以上の対象の試料を使用したそのような監視についての例示的なデータを示す。
図３９は、本開示の実施形態による、無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼの活性を監視するための方法を例示するフローチャートである。方法３８００の態様は、本明細書に記載の他の方法と同様の方法で実施され得る。
ブロック３９１０で、配列リードを受け取る。配列リードは、対象の生物学的試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得され得る。生物学的試料は、抗凝固剤で処理され、少なくとも指定された時間にわたってインキュベートされ得る。
ブロック３９２０で、特定のサイズを有する無細胞ＤＮＡ断片の量を、配列リードを使用して決定する。他の方法と同様に、特定の塩基は、例えば、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなどのより大きな末端モチーフの一部であり得る。さらに、特定の塩基は、ＤＮＡ断片の両端にある必要があり得るか、または異なる末端モチーフの特定の対を使用して、ＤＮＡ断片の特定のセットを選択することができる。量は、パラメータ値の一例である。
ブロック３９３０で、量を参照値と比較して、ヌクレアーゼの活性の分類を決定する。いくつかの実施形態において、活性が参照値を下回る場合、対象は、障害を有すると分類され得る。そのような場合、対象は、例えば本明細書に記載されるように治療され得る。
特定の塩基の量またはサイズの使用に関係なく、参照値は、ヌクレアーゼの活性の第１の分類を有する較正試料から決定され得る。量が参照値と同様である場合、生物学的試料（およびそれが取得された対象）は、ヌクレアーゼ活性についての第１の分類を有すると特定され得る。例として、第１の分類は、正常、増加、または減少であり得る。
様々な実施形態において、量を参照値と比較することは、量が参照値と少なくとも閾値量だけ異なるかどうかを決定すること含み得る。量を参照値と比較することは、量が参照値よりも少なくとも閾値量だけ少ないかどうかを決定することを含む。量を参照値と比較することは、量が参照値よりも少なくとも閾値量だけ大きいかどうかを決定することを含む。
例として、ヌクレアーゼは、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、またはＤＮＡＳＥ１であり得る。生物学的試料は、ヌクレアーゼで処理された対象から取得され得る。この方法は、量と参照値との比較に基づいて治療の有効性の分類を決定することをさらに含み得る。
ＩＸ．分類の較正
本明細書に記載されるように、参照値は、既知の分類を有する１つ以上の参照（較正）試料を使用して決定され得る。例えば、参照試料は、健康であることが知られ得るか、または遺伝性障害を有することが知られ得る。他の例として、参照／較正試料は、所与の較正値（例えば、本明細書に記載の量のいずれかを含むパラメータ）について、既知のまたは測定されたヌクレアーゼ活性または有効性値を有することができる。
本明細書に記載されるように、参照値は、既知の分類を有する１つ以上の参照（較正）試料を使用して決定され得る。例えば、参照試料は、健康であることが知られ得るか、または遺伝性障害を有することが知られ得る。他の例として、参照／較正試料は、所与の較正値（例えば、本明細書に記載の量のいずれかを含むパラメータ）について、既知のまたは測定されたヌクレアーゼ活性または有効性値を有することができる。
１つ以上の較正値は、１つ以上の参照値であり得るか、または参照値を決定するために使用され得る。参照値は、分類についての特定の数値に対応することができる。例えば、較正データ点（較正値、およびヌクレアーゼ活性または有効性のレベルなどの測定された特性）を、補間または回帰を介して分析して、較正関数（例えば、線形関数）を決定することができる。次いで、較正関数の点を使用して、測定された量または他のパラメータ（例えば、２つの量間、もしくは測定された量と参照値との間の分離値）の入力に基づいて、入力としての数値分類を決定することができる。そのような技術は、本明細書に記載の方法のいずれにも適用され得る。
方法３０００および３１００の例では、参照値は、治療の有効性についての既知のまたは測定された分類を有する、１つ以上の参照試料を使用して決定され得る。１つ以上の参照試料についての治療の有効性は、１つ以上の参照試料に対して凝固試験を実施することによって測定され得る。対応する量（例えば、ブロック３０２０または３１２０の量）は、１つ以上の参照試料で測定され得、それによって参照／較正試料についての２つの測定値を含む較正データ点を提供する。１つ以上の参照試料は、複数の参照試料であり得る。複数の参照試料の測定された有効性および測定された量に対応する較正データ点を、例えば、補間または回帰によって近似する較正関数が決定され得る。
方法３８００および３９００の例では、参照値は、ヌクレアーゼの活性についての既知のまたは測定された分類を有する、１つ以上の参照試料を使用して決定され得る。１つ以上の参照試料についてのヌクレアーゼの活性は、本明細書に記載されるように、例えば、ｃｆＤＮＡ量の蛍光測定または分光光度測定で測定され得、これは、それ自体で、またはヌクレアーゼ含有試料の添加の前、後、および／またはそれとリアルタイムで行われ得る。別の例は、放射状酵素拡散法を使用することである。対応する量（例えば、ブロック３８２０または３９２０の量）は、１つ以上の参照試料で測定され得、それによって参照／較正試料についての２つの測定値を含む較正データ点を提供する。１つ以上の参照試料は、複数の参照試料であり得る。複数の参照試料の測定された活性および測定された量に対応する較正データ点を、例えば、補間または回帰によって近似する較正関数が決定され得る。
Ｘ．治療
実施形態は、対象についての分類を決定した後、患者における遺伝性障害または低いヌクレアーゼ活性（例えば、閾値よりも低い）を治療することをさらに含み得る。治療後の対象についての分類は、ｃｆＤＮＡ末端プロファイルを強化するために、インビボまたはインビトロで抗凝固剤を添加することを伴う場合と伴わない場合がある。さらに、現在の投与量が低い有効性を有する場合、治療は、現在の治療（例えば、抗凝固剤）の代替として決定され得、例えば、投与量の増加または異なる抗凝固剤が使用され得る。治療は、決定された障害のレベル、任意の特定された変異、および／または起源の組織に従って提供され得る。例えば、（例えば、多型実装例の）特定された変異は、特定の薬物または化学療法によって標的化され得る。起源の組織を使用して、手術または任意の他の形態の治療を誘導することができる。そして、障害のレベルを使用して、任意のタイプの治療についてどれほど積極的にするかを決定することができ、任意のタイプの治療もまた、障害のレベルに基づいても決定され得る。障害（例えば、がん）は、化学療法、薬物、食事療法、療法、および／または手術によって治療され得る。いくつかの実施形態において、パラメータの値（例えば、量またはサイズ）が参照値を超えるほど、治療は、より積極的になり得る。
実施形態は、対象についての分類を決定した後、患者における遺伝性障害または低いヌクレアーゼ活性（例えば、閾値よりも低い）を治療することをさらに含み得る。治療後の対象についての分類は、ｃｆＤＮＡ末端プロファイルを強化するために、インビボまたはインビトロで抗凝固剤を添加することを伴う場合と伴わない場合がある。さらに、現在の投与量が低い有効性を有する場合、治療は、現在の治療（例えば、抗凝固剤）の代替として決定され得、例えば、投与量の増加または異なる抗凝固剤が使用され得る。治療は、決定された障害のレベル、任意の特定された変異、および／または起源の組織に従って提供され得る。例えば、（例えば、多型実装例の）特定された変異は、特定の薬物または化学療法によって標的化され得る。起源の組織を使用して、手術または任意の他の形態の治療を誘導することができる。そして、障害のレベルを使用して、任意のタイプの治療についてどれほど積極的にするかを決定することができ、任意のタイプの治療もまた、障害のレベルに基づいても決定され得る。障害（例えば、がん）は、化学療法、薬物、食事療法、療法、および／または手術によって治療され得る。いくつかの実施形態において、パラメータの値（例えば、量またはサイズ）が参照値を超えるほど、治療は、より積極的になり得る。
治療には、経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）が含まれ得る。この手順は、診断、病期分類、および治療に使用される。ＴＵＲＢＴ中、外科医は、膀胱鏡を尿道から膀胱に挿入する。次いで、小型ワイヤーループ、レーザー、または高エネルギー電気を備えたツールを使用して、腫瘍が切除される。ＮＭＩＢＣを有する患者の場合、がんの治療または除去のためにＴＵＲＢＴが使用され得る。別の治療には、根治的膀胱切除術およびリンパ節郭清が含まれ得る。根治的膀胱切除術は、膀胱全体、ならびに場合によっては周囲の組織および臓器の除去である。
治療には、化学療法が含まれ得、これは、通常がん細胞の成長および分裂を防ぐことによって、がん細胞を破壊するための薬物の使用である。薬物には、例えば、膀胱内化学療法のためのマイトマイシン－Ｃ（ジェネリック医薬品として入手可能）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、およびチオテパ（Ｔｅｐａｄｉｎａ）が含まれ得るが、これらに限定されない。全身化学療法には、例えば、シスプラチンゲムシタビン、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｔｒｅｘａｌｌ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）、ドキソルビシン、およびシスプラチンが含まれ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、治療には、免疫療法が含まれ得る。免疫療法には、ＰＤ－１と呼ばれるタンパク質をブロックする免疫チェックポイント阻害剤が含まれ得る。阻害剤には、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、およびペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）が含まれ得るが、これらに限定されない。
治療の実施形態はまた、標的療法を含み得る。標的療法は、がんの成長および生存に寄与するがんの特定の遺伝子および／またはタンパク質を標的とする治療である。例えば、エルダフィチニブは、がん細胞の成長または拡散を続けているＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ２遺伝子変異を伴う局所進行性または転移性尿路上皮がんを有する人々を治療するために承認された、経口投与される薬物である。
一部の治療法には、放射線療法が含まれ得る。放射線療法は、がん細胞を破壊するために高エネルギーＸ線または他の粒子を使用することである。各個々の治療に加えて、本明細書に記載のこれらの治療の組み合わせが使用され得る。いくつかの実施形態において、パラメータの値が閾値を超え、閾値自体が参照値を超える場合、治療の組み合わせが使用され得る。参考文献における治療に関する情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＸＩ．実験モデルおよび対象の詳細
Ａ．マウス
Ｄｎａｓｅ１ｌ３-/-マウスについての血漿ＤＮＡデータを、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｇｅｎｏｍｅ－ｐｈｅｎｏｍｅ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＧＡ；アクセッション番号ＥＧＡＳ００００１００３１７４）（Ｓｅｒｐａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６，６４１－６４９）から読み出した。Ｄｎａｓｅ１の標的対立遺伝子［Ｄｎａｓｅ１tm1.1(KOMP)Vlcg］を担持するマウス、およびＤｆｆｂの標的対立遺伝子［ＤｆｆｂC57BL/6N-Dffbem1Wtsi］を担持するマウス（両方ともＢ６バックグラウンドの）を、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｄａｖｉｓから取得した。詳細については、「Ｋｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｔａｂｌｅ」を参照されたい。マウスを、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ（ＣＵＨＫ）で維持した。すべての実験手順は、Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ＣＵＨＫによって承認され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって作成された「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（第８版、２０１１年）に準拠して実施された。１３～１７週齢の雄および雌のマウスを実験に使用した。血液試料がプールされたため、結果に対する雌雄および性別の影響に関する分析を行わなかった。
Ａ．マウス
Ｄｎａｓｅ１ｌ３-/-マウスについての血漿ＤＮＡデータを、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｇｅｎｏｍｅ－ｐｈｅｎｏｍｅ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＧＡ；アクセッション番号ＥＧＡＳ００００１００３１７４）（Ｓｅｒｐａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６，６４１－６４９）から読み出した。Ｄｎａｓｅ１の標的対立遺伝子［Ｄｎａｓｅ１tm1.1(KOMP)Vlcg］を担持するマウス、およびＤｆｆｂの標的対立遺伝子［ＤｆｆｂC57BL/6N-Dffbem1Wtsi］を担持するマウス（両方ともＢ６バックグラウンドの）を、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｄａｖｉｓから取得した。詳細については、「Ｋｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｔａｂｌｅ」を参照されたい。マウスを、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ（ＣＵＨＫ）で維持した。すべての実験手順は、Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ＣＵＨＫによって承認され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって作成された「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（第８版、２０１１年）に準拠して実施された。１３～１７週齢の雄および雌のマウスを実験に使用した。血液試料がプールされたため、結果に対する雌雄および性別の影響に関する分析を行わなかった。
Ｂ．マウス試料収集
心臓穿刺によってマウスを屠殺し、放血させた。各マウスからの血液をプールし、すぐに実験条件に均等に分配した：０時間のインキュベーションのＥＤＴＡ、および６時間のインキュベーションのＥＤＴＡ、または０時間のインキュベーションのヘパリン、および６時間のインキュベーションのヘパリン。Ｄｆｆｂ-/-実験について、合計１４匹のＷＴマウスおよび１４匹のＤｆｆｂ-/-マウスを使用して、５つの血液プールを作り、各々は、２～４匹のマウスからの血液を含有した。Ｄｎａｓｅ１-/-実験について、合計１２匹のＷＴマウス、１２匹のＤｎａｓｅ１+/-マウス、および１１匹のＤｎａｓｅ１-/-マウスから、各遺伝子座について１つのプールを作った。ＥＤＴＡチューブは、商業的に購入した１．３ｍＬ Ｋ３Ｅマイクロチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）であった。ヘパリンチューブは、血液１ｍｌ当たり１８ＩＵのヘパリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加された２ｍＬのマイクロ遠心チューブであった。インキュベーションは、ロッカー上で室温（１２～２０℃）において行った。
心臓穿刺によってマウスを屠殺し、放血させた。各マウスからの血液をプールし、すぐに実験条件に均等に分配した：０時間のインキュベーションのＥＤＴＡ、および６時間のインキュベーションのＥＤＴＡ、または０時間のインキュベーションのヘパリン、および６時間のインキュベーションのヘパリン。Ｄｆｆｂ-/-実験について、合計１４匹のＷＴマウスおよび１４匹のＤｆｆｂ-/-マウスを使用して、５つの血液プールを作り、各々は、２～４匹のマウスからの血液を含有した。Ｄｎａｓｅ１-/-実験について、合計１２匹のＷＴマウス、１２匹のＤｎａｓｅ１+/-マウス、および１１匹のＤｎａｓｅ１-/-マウスから、各遺伝子座について１つのプールを作った。ＥＤＴＡチューブは、商業的に購入した１．３ｍＬ Ｋ３Ｅマイクロチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）であった。ヘパリンチューブは、血液１ｍｌ当たり１８ＩＵのヘパリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加された２ｍＬのマイクロ遠心チューブであった。インキュベーションは、ロッカー上で室温（１２～２０℃）において行った。
室温（ＲＴ）インキュベーション時間が完了した後、血液試料を二重遠心分離プロトコル（４℃で１０分間１，６００×ｇ、次いで４℃で１０分間１６，０００×ｇでの血漿の再遠心分離）によって分離した（Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（２００１），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７，１６０７－１６１３）。得られた血漿を収集し、各条件および時点で０．４～１．５ｍＬの血漿を得た。
Ｃ．血漿ＤＮＡ抽出およびライブラリ調製
血漿ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って抽出した。インデックス付き血漿ＤＮＡライブラリを、ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｎａｎｏ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、製造業者の指示に従って構築した。アダプターを連結したＤＮＡを、８サイクルのＰＣＲで濃縮し、品質管理およびゲルベースのサイズ決定について、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ライブラリを、配列決定前にＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。
血漿ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って抽出した。インデックス付き血漿ＤＮＡライブラリを、ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｎａｎｏ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、製造業者の指示に従って構築した。アダプターを連結したＤＮＡを、８サイクルのＰＣＲで濃縮し、品質管理およびゲルベースのサイズ決定について、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ライブラリを、配列決定前にＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。
Ｄ．ＤＮＡ配列決定およびアラインメント
多重化ＤＮＡライブラリを、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で、２×７５ｂｐ対末端リードについて配列決定した。配列を、６塩基インデックス配列に基づいて、対応する試料に割り当てた。Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ２（ＳＯＡＰ２）を使用して、マウス血漿からの対末端リードを参照マウスゲノム（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３７／ＵＣＳＣ ｍｍ９；非リピートマスク）にアラインメントした（Ｌｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１９６６－１９６７）。最大２つのヌクレオチドのミスマッチが許容された。正しい配向の、６００ｂｐ未満の挿入サイズに及ぶ同じ染色体にアラインメントされた対末端リードのみを、下流サイズ分析のために保持した。同じ開始および終了ゲノム座標を共有する対末端リードは、ＰＣＲ重複とみなされ、下流分析から破棄された。
多重化ＤＮＡライブラリを、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で、２×７５ｂｐ対末端リードについて配列決定した。配列を、６塩基インデックス配列に基づいて、対応する試料に割り当てた。Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ２（ＳＯＡＰ２）を使用して、マウス血漿からの対末端リードを参照マウスゲノム（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３７／ＵＣＳＣ ｍｍ９；非リピートマスク）にアラインメントした（Ｌｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１９６６－１９６７）。最大２つのヌクレオチドのミスマッチが許容された。正しい配向の、６００ｂｐ未満の挿入サイズに及ぶ同じ染色体にアラインメントされた対末端リードのみを、下流サイズ分析のために保持した。同じ開始および終了ゲノム座標を共有する対末端リードは、ＰＣＲ重複とみなされ、下流分析から破棄された。
図４０は、本開示の実施形態による、各条件について取得された非重複断片の数を要約する。アラインメントされた末端のゲノム座標を使用して、配列決定されたｃｆＤＮＡの断片全体のサイズを推定した。Ｄｎａｓｅ１およびＤｆｆｂ遺伝子の欠失は、それぞれ、Ｄｎａｓｅ１-/-およびＤｆｆｂ-/-マウスデータにおけるアラインメント後に観察された。
図４１Ａ～４１Ｂは、ＷＴ（青色）、Ｄｎａｓｅ１-/-マウス（Ａ、赤色）、およびＤｆｆｂ-/-マウス（プール１～５）（Ｂ、赤色）の血漿についての配列リード範囲を示す。ノックアウト領域を黄色で強調する。図４１Ａは、両方のコピーについてのＤｎａｓｅ１遺伝子における欠失を示す（Ｄｎａｓｅ１-/-）。ＷＴは、１行目にあり、Ｄｎａｓｅ１遺伝子についての領域にアラインメントする配列リードの標準のカウントを示す。２行目は、欠失を有する試料についての配列リードの欠如を示す。図４１Ｂは、両方のコピーにおけるＤｆｆｂ遺伝子についての欠失を示す。Ｄｆｆｂ遺伝子についての領域内のリードカウントの欠如は、縦棒によって示される。
Ｅ．塩基末端分析および断片タイプ分析
ＣＴＣＦおよびＰｏｌ ＩＩ領域を、マウスＥＮＣＯＤＥプロジェクトからダウンロードした（Ｓｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｎａｔｕｒｅ ４８８，１１６－１２０）。参照マウスゲノムＵＣＳＣ ｍｍ９におけるすべての遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）を、ＵＣＳＣからダウンロードした。１０，０００ｂｐの長さの１０，０００個のランダムな非重複領域を、ＢＥＤＴｏｏｌｓ（ｖ２．２７．１）によってゲノム全体にわたってランダムに選択した（Ｑｕｉｎｌａｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｉ．Ｍ．（２０１０），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６，８４１－８４２）。±５００ｂｐのウィンドウサイズを使用した。末端ド密度分析について、ＣＴＣＦ領域の±１５００ｂｐのウィンドウの末端密度を、±３０００ｂｐのＣＴＣＦ領域内の末端カウント中央値によって正規化した。
ＣＴＣＦおよびＰｏｌ ＩＩ領域を、マウスＥＮＣＯＤＥプロジェクトからダウンロードした（Ｓｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｎａｔｕｒｅ ４８８，１１６－１２０）。参照マウスゲノムＵＣＳＣ ｍｍ９におけるすべての遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）を、ＵＣＳＣからダウンロードした。１０，０００ｂｐの長さの１０，０００個のランダムな非重複領域を、ＢＥＤＴｏｏｌｓ（ｖ２．２７．１）によってゲノム全体にわたってランダムに選択した（Ｑｕｉｎｌａｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｉ．Ｍ．（２０１０），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６，８４１－８４２）。±５００ｂｐのウィンドウサイズを使用した。末端ド密度分析について、ＣＴＣＦ領域の±１５００ｂｐのウィンドウの末端密度を、±３０００ｂｐのＣＴＣＦ領域内の末端カウント中央値によって正規化した。
ランダム、ＣＴＣＦ、およびＰｏｌ ＩＩ領域について、ワトソン鎖の方向に配向したｃｆＤＮＡ断片のみを分析に使用した。ＴＳＳ領域について、ＴＳＳ領域と同じ方向に配向したｃｆＤＮＡ断片のみを使用した。これらの領域内の各位置で、５‘末端の第１のヌクレオチドを各断片について特定し、塩基末端のパーセンテージを計算した（例えば、Ａ末端断片／すべての断片であり、すべての断片は、Ａ末端、Ｇ末端、Ｃ末端、およびＴ断片を含む）。断片サイズによって塩基末端のパーセンテージを分析するために、ｃｆＤＮＡ断片の両方の５’末端（それぞれのワトソン鎖またはクリック鎖上）を、断片ごとにカウントし、各サイズでの塩基末端のパーセンテージを計算した。
断片タイプ分析について、各断片を、２つの末端ヌクレオチドに基づいて断片タイプに割り当てた。両端が特定されたこれらの断片を、それらの末端ヌクレオチドおよびその間の記号＜＞で示し、これによりＡとしての両端を有する断片は、Ａ＜＞Ａとして指定される。すべての断片は、Ａ＜＞Ａ、Ａ＜＞Ｇ、Ａ＜＞Ｃ、Ａ＜＞Ｔ、Ｃ＜＞Ｃ、Ｃ＜＞Ｇ、Ｃ＜＞Ｔ、Ｇ＜＞Ｇ、Ｇ＜＞Ｔ、Ｔ＜＞Ｔ断片を含む。各断片タイプのパーセンテージを計算した（例えば、Ａ＜＞Ａ断片パーセント＝Ａ＜＞Ａ断片／すべての断片）。
Ｆ．ｃｆＤＮＡ定量化
ヘパリンは、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で有意な正の干渉を有することがわかった（データは図示せず）。代わりに、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）プラットフォームをすべてのｃｆＤＮＡ定量化に使用し、これは、ＤＮＡ標的分子のヘパリン干渉が、ｄｄＰＣＲの反応分割によって改善され得るためである（Ｄｉｎｇｌｅ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５９，１６７０－１６７２）。ヘパリン試料を５倍に希釈し、試料当たり少なくとも４つのウェルを作った。マウスｃｆＤＮＡを、トランスフェリン受容体遺伝子（Ｔｆｒｃ）を標的とするマウスＴａｑＭａｎコピー数参照アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。
ヘパリンは、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で有意な正の干渉を有することがわかった（データは図示せず）。代わりに、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）プラットフォームをすべてのｃｆＤＮＡ定量化に使用し、これは、ＤＮＡ標的分子のヘパリン干渉が、ｄｄＰＣＲの反応分割によって改善され得るためである（Ｄｉｎｇｌｅ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５９，１６７０－１６７２）。ヘパリン試料を５倍に希釈し、試料当たり少なくとも４つのウェルを作った。マウスｃｆＤＮＡを、トランスフェリン受容体遺伝子（Ｔｆｒｃ）を標的とするマウスＴａｑＭａｎコピー数参照アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。
Ｇ．定量化および統計分析
分析を、ＰｙｔｈｏｎおよびＲ言語で記述された特注のプログラムを使用して実施した。統計的差異を、特に指定がない限り、マン・ホイットニーのＵ検定を使用して計算した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意なものとみなし、全ての確率は、両側検定であった。
分析を、ＰｙｔｈｏｎおよびＲ言語で記述された特注のプログラムを使用して実施した。統計的差異を、特に指定がない限り、マン・ホイットニーのＵ検定を使用して計算した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意なものとみなし、全ての確率は、両側検定であった。
ＸＩＩ．例示的なシステム
図４２は、本開示の実施形態による、測定システム４２００を例示する。示されるようなシステムは、アッセイデバイス４２１０内に無細胞ＤＮＡ分子などの試料４２０５を含み、アッセイ４２０８は、試料４２０５に対して実施され得る。例えば、試料４２０５をアッセイ４２０８の試薬と接触させて、物理的特性４２１５の信号を提供することができる。アッセイデバイスの一例は、アッセイのプローブおよび／もしくはプライマー、または液滴が（アッセイを含む液滴とともに）移動するチューブを含む、フローセルであり得る。試料からの物理的特性４２１５（例えば、蛍光強度、電圧、または電流）は、検出器４２２０によって検出される。検出器４２２０は、データ信号を構成するデータ点を取得するために、間隔をおいて（例えば、周期的な間隔）測定し得る。一実施形態において、アナログ－デジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形態へと複数回変換する。アッセイデバイス４２１０および検出器４２２０は、アッセイシステム、例えば、本明細書に記載の実施形態に従って配列決定を実施する配列決定システムを形成し得る。データ信号４２２５は、検出器４２２０から論理システム４２３０へ送信される。一例として、データ信号４２２５を使用して、ＤＮＡ分子の参照ゲノムにおける配列および／または位置を決定することができる。データ信号４２２５は、同時に行われる様々な測定、例えば、試料４２０５の異なる分子について異なる色の蛍光染料または異なる電気信号を含むことができ、したがって、データ信号４２２５は、複数の信号に対応することができる。データ信号４２２５は、ローカルメモリ４２３５、外部メモリ４２４０、または記憶デバイス４２４５に保存され得る。
図４２は、本開示の実施形態による、測定システム４２００を例示する。示されるようなシステムは、アッセイデバイス４２１０内に無細胞ＤＮＡ分子などの試料４２０５を含み、アッセイ４２０８は、試料４２０５に対して実施され得る。例えば、試料４２０５をアッセイ４２０８の試薬と接触させて、物理的特性４２１５の信号を提供することができる。アッセイデバイスの一例は、アッセイのプローブおよび／もしくはプライマー、または液滴が（アッセイを含む液滴とともに）移動するチューブを含む、フローセルであり得る。試料からの物理的特性４２１５（例えば、蛍光強度、電圧、または電流）は、検出器４２２０によって検出される。検出器４２２０は、データ信号を構成するデータ点を取得するために、間隔をおいて（例えば、周期的な間隔）測定し得る。一実施形態において、アナログ－デジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形態へと複数回変換する。アッセイデバイス４２１０および検出器４２２０は、アッセイシステム、例えば、本明細書に記載の実施形態に従って配列決定を実施する配列決定システムを形成し得る。データ信号４２２５は、検出器４２２０から論理システム４２３０へ送信される。一例として、データ信号４２２５を使用して、ＤＮＡ分子の参照ゲノムにおける配列および／または位置を決定することができる。データ信号４２２５は、同時に行われる様々な測定、例えば、試料４２０５の異なる分子について異なる色の蛍光染料または異なる電気信号を含むことができ、したがって、データ信号４２２５は、複数の信号に対応することができる。データ信号４２２５は、ローカルメモリ４２３５、外部メモリ４２４０、または記憶デバイス４２４５に保存され得る。
論理システム４２３０は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサなどであり得るか、またはそれらを含み得る。それはまた、ディスプレイ（例えば、モニタ、ＬＥＤディスプレイなど）、およびユーザ入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、ボタンなど）を含み得るか、またはそれらに連結され得る。論理システム４２３０および他の構成要素は、スタンドアローンもしくはネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であり得るか、または検出器４２２０および／またはアッセイデバイス４２１０を含むデバイス（例えば、配列決定デバイス）に直接取り付けられ得るか、もしくは組み込まれ得る。論理システム４２３０はまた、プロセッサ４２５０において実行するソフトウェアを含み得る。論理システム４２３０は、本明細書に説明される方法のいずれかを実施するようにシステム４２００を制御するための命令を保存するコンピュータ可読媒体を含み得る。例えば、論理システム４２３０は、配列決定または他の物理的操作が実施されるように、アッセイデバイス４２１０を含むシステムにコマンドを提供し得る。そのような物理的操作は、特定の順序で、例えば、試薬が特定の順序で追加および除去されるように、実施され得る。そのような物理的操作は、試料を取得してアッセイを実施するために使用され得るように、例えば、ロボットアームを含む、ロボットシステムによって実施され得る。
測定システム４２００はまた、対象に治療を提供することができる治療デバイス４２６０を含み得る。治療デバイス４２６０は、治療を決定し得る、および／または治療を実施するために使用され得る。そのような治療の例には、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、および幹細胞移植が含まれ得る。論理システム４２３０は、例えば、本明細書に記載の方法の結果を提供するために、治療デバイス４２６０に接続され得る。治療デバイスは、画像化デバイスおよびユーザ入力などの他のデバイスからの入力を受け取り得る（例えば、ロボットシステムの制御など、治療を制御するために）。
本明細書で言及されるコンピュータシステムのうちのいずれも、任意の好適な数のサブシステムを利用し得る。コンピュータシステム１０においてそのようなサブシステムの例を図４３に示す。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムは、コンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態において、コンピュータシステムは、各々がサブシステムであり、内部構成要素を備える、複数のコンピュータ装置を含み得る。コンピュータシステムは、デスクトップコンピュータおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびに他の携帯デバイスを含み得る。
図４３に示されるサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続されている。プリンタ７４、キーボード７８、記憶デバイス７９、ディスプレイアダプター８２に接続されたモニタ７６（例えば、ＬＥＤなどのディスプレイスクリーン）、およびその他などの追加のサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ７１に結合する周辺機器および入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））などの当技術分野において既知の任意の数の手段によって、コンピュータシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、Ｗｉ－Ｆｉなど）を使用して、Ｉｎｔｅｒｎｅｔなどの広域ネットワーク、マウス入力デバイス、またはスキャナに、コンピュータシステム１０を接続し得る。システムバス７５を介した相互接続は、中央プロセッサ７３が、各サブシステムと通信し、システムメモリ７２または記憶デバイス７９（例えば、ハードドライブまたは光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令の実行、およびサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリ７２および／または記憶デバイス７９は、コンピュータ可読媒体を具現化し得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロホン、および加速度計、ならびにこれらに類するものなどのデータ収集デバイス８５である。本明細書に言及されるデータのうちのいずれも、１つの構成要素から別の構成要素に出力されてもよく、ユーザに対して出力されてもよい。
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１によって、内部インターフェースによって、または１つの構成要素から別の構成要素に接続し、取り外され得るリムーバブル記憶デバイスを介して、ともに接続された、複数の同じ構成要素またはサブシステムを含み得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワーク上で通信することができる。そのような例において、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバとみなすことができ、各々が、同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアントおよびサーバは各々、複数のシステム、サブシステム、または構成要素を含むことができる。
実施形態の態様は、制御ロジックの形態で、ハードウェア回路（例えば、特定用途向け集積回路もしくはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、および／またはモジュール式もしくは集積様態で汎用プログラマブルプロセッサを有するコンピュータソフトウェアを使用して、実装され得る。本明細書で使用される場合、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同じ集積チップ上のマルチコアプロセッサ、または単一の回路基板もしくはネットワーク化された上の複数の処理ユニット、ならびに専用のハードウェアを含み得る。本開示および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、ハードウェア、およびハードウェアとソフトウェアとの組み合わせを使用して、本発明の実施形態を実装するための他の方式および／または方法を認識および理解するであろう。
本出願で説明されるソフトウェアコンポーネントまたは関数のうちのいずれも、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの任意の好適なコンピュータ言語、または、例えば、従来の技術もしくは物体指向の技術を使用するＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を使用する、処理デバイスによって実行されるソフトウェアコードとして実装され得る。ソフトウェアコードは、記憶および／または伝送のためのコンピュータ可読媒体上に一連の命令またはコマンドとして記憶され得る。好適な非一時的コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リード専用メモリ（ＲＯＭ）、磁気媒体（ハードドライブもしくはフロッピー（登録商標）ディスク等）、または光学媒体（コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）等）、またはブルーレイディスクおよびフラッシュメモリ等を含み得る。コンピュータ可読媒体は、そのようなストレージまたは伝送デバイスの任意の組み合わせであってもよい。
そのようなプログラムはまた、コード化され、インターネットを含む様々なプロトコルに従う有線ネットワーク、光ネットワーク、および／または無線ネットワークを介した伝送に適合した搬送波信号を使用して伝送され得る。したがって、コンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムでコード化されたデータ信号を使用して作成され得る。プログラムコードでコード化されたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスでパッケージ化されてもよく、または（例えば、インターネットダウンロードを介して）他のデバイスとは別個に提供され得る。任意のそのようなコンピュータ可読媒体は、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、もしくはコンピュータシステム全体）上もしくはその内部に存在し得、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ製品上もしくはその内部に存在し得る。コンピュータシステムは、モニタ、プリンタ、または本明細書に記載の結果のうちのいずれかをユーザに提供するための他の好適なディスプレイを含み得る。
本明細書に記載される方法のうちのいずれも、ステップを行うように構成することができる、１つ以上のプロセッサを含むコンピュータシステムで全体的または部分的に行われ得る。したがって、実施形態は、本明細書に説明される方法のうちのいずれかのステップを実施するように構成されたコンピュータシステムを対象とし得、潜在的には異なるコンポーネントがそれぞれのステップまたはそれぞれのステップの群を実施する。番号付けされた工程として提示されるが、本明細書の方法の工程は、同時に若しくは異なる時間に、または異なる順序で実施され得る。加えて、これらのステップの部分は、他の方法からの他のステップの部分と併用され得る。また、あるステップのすべてまたは部分は、任意選択的であり得る。加えて、本方法のうちのいずれかの任意の工程は、これらの工程を実行するためのシステムのモジュール、ユニット、回路、または他の手段で実行することができる。
特定の実施形態の具体的な詳細は、本発明の実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく、任意の好適な様態で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の他の実施形態は、各個々の態様、またはこれらの個々の態様の特定の組み合わせに関する特定の実施形態を対象とし得る。
本開示の例示的実施形態の上の説明は、例示および説明の目的で提示されている。網羅的であること、または本開示を説明された正確な形態に限定することは意図されず、多くの修正および変更が、先の教示に鑑みて可能である。
「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」の記述は、それとは反対に具体的に示されない限り、「１つ以上」を意味することが意図される。「または」の使用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「を除く、または」ではなく「を含む、または」を意味することが意図される。「第１」の構成要素への言及は、第２の構成要素が提供されることを必ずしも必要としない。さらに、「第１」または「第２」の構成要素への言及は、明示的に述べられていない限り、言及される構成要素を特定の場所に限定するものではない。「～に基づいて」という用語は、「少なくとも一部に基づいて」を意味することを意図している。
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、刊行物、および明細書は、すべての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。いかなるものも、先行技術であるとは認められていない。
ＸＩＩＩ．参考文献
Ａｌ－Ｍａｙｏｕｆ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｕｎｋｅｒ，Ａ．，Ａｂｄｗａｎｉ，Ｒ．，Ａｂｒａｗｉ，Ｓ．Ａ．，Ａｌｍｕｒｓｈｅｄｉ，Ｆ．，Ａｌｈａｓｈｍｉ，Ｎ．，Ａｌ Ｓｏｎｂｕｌ，Ａ．，Ｓｅｗａｉｒｉ，Ｗ．，Ｑａｒｉ，Ａ．，Ａｂｄａｌｌａｈ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ ＤＮＡＳＥ１Ｌ３ ｃａｕｓｅｓ ａ ｆａｍｉｌｉａｌ ｆｏｒｍ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４３，１１８６－１１８８．
Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．，Ｗｏｏ，Ｊ．Ｋ．Ｓ．，Ｋｉｎｇ，Ａ．，Ｚｅｅ，Ｂ．Ｃ．Ｙ．，Ｌａｍ，Ｗ．Ｋ．Ｊ．，Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｗ．Ｉ．，Ｍａｋ，Ｃ．，Ｔｓｅ，Ｉ．Ｏ．Ｌ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｓ．Ｙ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７７，５１３－５２２．
Ｃｈａｎｄｒａｎａｎｄａ，Ｄ．，Ｔｈｏｒｎｅ，Ｎ．Ｐ．，ａｎｄ Ｂａｈｌｏ，Ｍ．（２０１５）．Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ｎｏｎ－ｒａｎｄｏｍ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ．ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８，２９．
Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｔ．，Ｌｕｉ，Ｋ．Ｏ．，Ｐｅｎｇ，Ｘ．Ｌ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｊｉａｎｇ，Ｐ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．，Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．，ａｎｄ Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ． （２０１８）．ＤＮａｓｅ１ Ｄｏｅｓ Ｎｏｔ Ａｐｐｅａｒ ｔｏ Ｐｌａｙ ａ Ｍａｊｏｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ ｉｎ ａ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ６４，４０６－４０８．
Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．，Ｇａｏ，Ｙ．，Ｌａｕ，Ｖ．Ｙ．Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｗ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｆｏｏ，Ｃ．Ｈ．Ｆ．，Ｘｉｅ，Ｂ．，Ｔｓｕｉ，Ｎ．Ｂ．Ｙ．，Ｌｕｎ，Ｆ．Ｍ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，２０４５８－２０４６３．
Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．，Ｐｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．Ｍ．，Ｌａｕ，Ｔ．Ｋ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｎ．，Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ． （２００１）．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ－Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ Ｆｅｔａｌ ａｎｄ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７，１６０７－１６１３．
Ｄｉｎｇｌｅ，Ｔ．Ｃ．，Ｓｅｄｌａｋ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｏｏｋ，Ｌ．，ａｎｄ Ｊｅｒｏｍｅ，Ｋ．Ｒ．（２０１３）．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｄｒｏｐｌｅｔ－ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｖｓ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５９，１６７０－１６７２．
Ｅｌｍｏｒｅ，Ｓ．（２００７）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５，４９５－５１６．
Ｅｒｒａｍｉ，Ｙ．，Ｎａｕｒａ，Ａ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｊｕ，Ｊ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｅｌ－Ｂａｈｒａｗｙ，Ａ．Ｈ．，Ｇｈｏｎｉｍ，Ｍ．Ａ．，Ｈｅｍｅｉｄａ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｎｓｙ，Ｍ．Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ａ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＤＮＡＳ１Ｌ３，ａｎ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ－ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｈａｔ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８，３４６０－３４６８．
Ｉｖａｎｏｖ，Ｍ．，Ｂａｒａｎｏｖａ，Ａ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｔ．，Ｓｐｅｌｌｍａｎ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍｉｌｅｙｋｏ，Ｖ．（２０１５）．Ｎｏｎ－ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｒｅｆｌｅｃｔ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６，Ｓ１．
Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ａｌｃａｚａｒ，Ｍ．，Ｒａｎｇａｓｗａｍｙ，Ｃ．，Ｐａｎｄａ，Ｒ．，Ｂｉｔｔｅｒｌｉｎｇ，Ｊ．，Ｓｉｍｓｅｋ，Ｙ．Ｊ．，Ｌｏｎｇ，Ａ．Ｔ．，Ｂｉｌｙｙ，Ｒ．，Ｋｒｅｎｎ，Ｖ．，Ｒｅｎｎｅ，Ｃ．，Ｒｅｎｎｅ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｈｏｓｔ ＤＮａｓｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｙ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ） ３５８，１２０２－１２０６．
Ｋｌｕｇ，Ａ．，ａｎｄ Ｌｕｔｔｅｒ，Ｌ．Ｃ．（１９８１）．Ｔｈｅ ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｒｉｏｄｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９，４２６７－４２８３．
Ｋｏｙａｍａ，Ｒ．，Ａｒａｉ，Ｔ．，Ｋｉｊｉｍａ，Ｍ．，Ｓａｔｏ，Ｓ．，Ｍｉｕｒａ，Ｓ．，Ｙｕａｓａ，Ｍ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｄ．，ａｎｄ Ｍｉｚｕｔａ，Ｒ．（２０１６）．ＤＮａｓｅ γ，ＤＮａｓｅ Ｉ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｄｅｇｒａｄｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２１，１１５０－１１６３．
Ｌａｒｓｅｎ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｓφｒｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｓ．（２０１７）．Ｔｈｅ ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ： ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８４，１１６０－１１７０．
Ｌｉ，Ｒ．，Ｙｕ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｌａｍ，Ｔ．－Ｗ．，Ｙｉｕ，Ｓ．－Ｍ．，Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｊ．（２００９）．ＳＯＡＰ２： ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１９６６－１９６７．
Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．，Ｓｕｎ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｚ．，Ｊｉａｎｇ，Ｐ．，Ｌｕｎ，Ｆ．Ｍ．Ｆ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｌａｕ，Ｔ．Ｋ．，Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｔｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２，６１ｒａ９１－６１ｒａ９１．
Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．，Ｃｏｒｂｅｔｔａ，Ｎ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｐ．Ｆ．，Ｒａｉ，Ｖ．，Ｓａｒｇｅｎｔ，Ｉ．Ｌ．，Ｒｅｄｍａｎ，Ｃ．Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ Ｗａｉｎｓｃｏａｔ，Ｊ．Ｓ．（１９９７）．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５０，４８５－４８７．
Ｍａｎａｓｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｈｅｚａｒ，Ｊ．，Ｓｈｕｒｔｚ－Ｓｗｉｒｓｋｉ，Ｒ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｇ．，Ｔｅｎｄｌｅｒ，Ｙ．，Ｋｒｉｓｔａｌ，Ｂ．，Ｓｈａｓｈａ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｅｌａ，Ｓ．（１９９６）．Ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９４，４８－５２．
Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（２０１８）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３６，４８９－５１７．
Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｓ．，Ｍｅｚｒｈａｂ，Ｊ．，Ｋｌｏｃｋｌ，Ｔ．，ａｎｄ Ｍａｎｎｈｅｒｚ，Ｈ．Ｇ．（２００９）．Ｍｕｒｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ － ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＤＮａｓｅ１ ａｎｄ ＤＮａｓｅ１－ｌｉｋｅ ３ （ＤＮａｓｅ１ｌ３）．Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７６，１０５９－１０７３．
Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．，Ｗｕｌｆ，Ｓ．，Ｅｕｌｉｔｚ，Ｄ．，Ｍａｎｎｈｅｒｚ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ Ｋｌｏｅｃｋｌ，Ｔ．（２００５）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ １ （Ｄｎａｓｅ１） ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ １－ｌｉｋｅ ３ （Ｄｎａｓｅ１ｌ３）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３８９，３５５－３６４．
Ｏｚｃａｋａｒ，Ｚ．Ｂ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｊ．，２ｎｄ，Ｄｉａｚ－Ｈｏｒｔａ，Ｏ．，Ｋａｓａｐｃｏｐｕｒ，Ｏ．，Ｆａｎ，Ｙ．Ｓ．，Ｙａｌｃｉｎｋａｙａ，Ｆ．，ａｎｄ Ｔｅｋｉｎ，Ｍ．（２０１３）．ＤＮＡＳＥ１Ｌ３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｙｐｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｍｉｃ ｕｒｔｉｃａｒｉａｌ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６５，２１８３－２１８９．
Ｑｕｉｎｌａｎ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｉ．Ｍ．（２０１０）．ＢＥＤＴｏｏｌｓ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６，８４１－８４２．
Ｓａｍｅｊｉｍａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．（２００５）．Ｔｒａｓｈｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６，６７７－６８８．
Ｓｅｒｐａｓ，Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｗ．Ｙ．，Ｊｉａｎｇ，Ｐ．，Ｎｉ，Ｍ．，Ｓｕｎ，Ｋ．，Ｒａｓｈｉｄｆａｒｒｏｋｈｉ，Ａ．，Ｓｏｎｉ，Ｃ．，Ｓｉｓｉｒａｋ，Ｖ．，Ｌｅｅ，Ｗ．－Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｄｎａｓｅ１ｌ３ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｓ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｅｎｄ－ｍｏｔｉｆ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６，６４１－６４９．
Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｙｕｅ，Ｆ．，ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｄ．Ｆ．，Ｙｅ，Ｚ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｌ．，Ｋｕａｎ，Ｓ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｕ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｌ．，Ｌｏｂａｎｅｎｋｏｖ，Ｖ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４８８，１１６－１２０．
Ｓｉｓｉｒａｋ，Ｖ．，Ｓａｌｌｙ，Ｂ．，Ｄ’Ａｇａｔｉ，Ｖ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｏｒｔｉｚ，Ｗ．，Ｏｚｃａｋａｒ，Ｚ．Ｂ．，Ｄａｖｉｄ，Ｊ．，Ｒａｓｈｉｄｆａｒｒｏｋｈｉ，Ａ．，Ｙｅｓｔｅ，Ａ．，Ｐａｎｅａ，Ｃ．，Ｃｈｉｄａ，Ａｓｉｙａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｅｌｌ １６６，８８－１０１．
Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｋｉｒｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｄａｚａ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．（２０１６）．Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ ｔｈａｔ Ｉｎｆｏｒｍｓ Ｉｔｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ－Ｏｆ－Ｏｒｉｇｉｎ．Ｃｅｌｌ １６４，５７－６８．
Ｓｕｎ，Ｋ．，Ｊｉａｎｇ，Ｐ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｔ．，Ｗｏｎｇ，Ｊ．，Ｗｏｎｇ，Ｖ．Ｗ．Ｓ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｓ．Ｍ．，Ｍａ，Ｂ．Ｂ．Ｙ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ－ａｗａｒｅ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｏｐｅｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｆｏｒｍｓ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９，４１８－４２７．
Ｖｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕ，Ｂ．（１９９２）．Ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒｙｐｓｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｈｉｓｔｏｎｅｓ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ２８８ （ Ｐｔ ３），９５３－９５８．
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，Ｔａｋａｄａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｍｉｚｕｔａ，Ｒ．（２０１９）．Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＤＮａｓｅ１Ｌ３ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５１６，７９０－７９５．
Ｗｉｄｌａｋ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇａｒｒａｒｄ，Ｗ．Ｔ．（２００５）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ＤＦＦ４０／ＣＡＤ ａｎｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９４，１０７８－１０８７．
Ｗｉｄｌａｋ，Ｐ．，Ｌｉ，Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，ａｎｄ Ｇａｒｒａｒｄ，Ｗ．Ｔ．（２０００）．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＤＦＦ４０ （ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ ｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ） ｏｎ ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５，８２２６－８２３２．
Ｙａｎｇ，Ｗ．（２０１１）．Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ： ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ４４，１－９３
Ａｌ－Ｍａｙｏｕｆ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｕｎｋｅｒ，Ａ．，Ａｂｄｗａｎｉ，Ｒ．，Ａｂｒａｗｉ，Ｓ．Ａ．，Ａｌｍｕｒｓｈｅｄｉ，Ｆ．，Ａｌｈａｓｈｍｉ，Ｎ．，Ａｌ Ｓｏｎｂｕｌ，Ａ．，Ｓｅｗａｉｒｉ，Ｗ．，Ｑａｒｉ，Ａ．，Ａｂｄａｌｌａｈ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ ＤＮＡＳＥ１Ｌ３ ｃａｕｓｅｓ ａ ｆａｍｉｌｉａｌ ｆｏｒｍ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４３，１１８６－１１８８．
Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．，Ｗｏｏ，Ｊ．Ｋ．Ｓ．，Ｋｉｎｇ，Ａ．，Ｚｅｅ，Ｂ．Ｃ．Ｙ．，Ｌａｍ，Ｗ．Ｋ．Ｊ．，Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｗ．Ｉ．，Ｍａｋ，Ｃ．，Ｔｓｅ，Ｉ．Ｏ．Ｌ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｓ．Ｙ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７７，５１３－５２２．
Ｃｈａｎｄｒａｎａｎｄａ，Ｄ．，Ｔｈｏｒｎｅ，Ｎ．Ｐ．，ａｎｄ Ｂａｈｌｏ，Ｍ．（２０１５）．Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ｎｏｎ－ｒａｎｄｏｍ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ．ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８，２９．
Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｔ．，Ｌｕｉ，Ｋ．Ｏ．，Ｐｅｎｇ，Ｘ．Ｌ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｊｉａｎｇ，Ｐ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．，Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．，ａｎｄ Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ． （２０１８）．ＤＮａｓｅ１ Ｄｏｅｓ Ｎｏｔ Ａｐｐｅａｒ ｔｏ Ｐｌａｙ ａ Ｍａｊｏｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ ｉｎ ａ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ６４，４０６－４０８．
Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．，Ｇａｏ，Ｙ．，Ｌａｕ，Ｖ．Ｙ．Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｗ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｆｏｏ，Ｃ．Ｈ．Ｆ．，Ｘｉｅ，Ｂ．，Ｔｓｕｉ，Ｎ．Ｂ．Ｙ．，Ｌｕｎ，Ｆ．Ｍ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，２０４５８－２０４６３．
Ｃｈｉｕ，Ｒ．Ｗ．Ｋ．，Ｐｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．Ｍ．，Ｌａｕ，Ｔ．Ｋ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｎ．，Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ． （２００１）．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ－Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ Ｆｅｔａｌ ａｎｄ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７，１６０７－１６１３．
Ｄｉｎｇｌｅ，Ｔ．Ｃ．，Ｓｅｄｌａｋ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｏｏｋ，Ｌ．，ａｎｄ Ｊｅｒｏｍｅ，Ｋ．Ｒ．（２０１３）．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｄｒｏｐｌｅｔ－ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｖｓ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５９，１６７０－１６７２．
Ｅｌｍｏｒｅ，Ｓ．（２００７）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５，４９５－５１６．
Ｅｒｒａｍｉ，Ｙ．，Ｎａｕｒａ，Ａ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｊｕ，Ｊ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｅｌ－Ｂａｈｒａｗｙ，Ａ．Ｈ．，Ｇｈｏｎｉｍ，Ｍ．Ａ．，Ｈｅｍｅｉｄａ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｎｓｙ，Ｍ．Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ａ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＤＮＡＳ１Ｌ３，ａｎ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ－ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｈａｔ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８８，３４６０－３４６８．
Ｉｖａｎｏｖ，Ｍ．，Ｂａｒａｎｏｖａ，Ａ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｔ．，Ｓｐｅｌｌｍａｎ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍｉｌｅｙｋｏ，Ｖ．（２０１５）．Ｎｏｎ－ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｒｅｆｌｅｃｔ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６，Ｓ１．
Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ａｌｃａｚａｒ，Ｍ．，Ｒａｎｇａｓｗａｍｙ，Ｃ．，Ｐａｎｄａ，Ｒ．，Ｂｉｔｔｅｒｌｉｎｇ，Ｊ．，Ｓｉｍｓｅｋ，Ｙ．Ｊ．，Ｌｏｎｇ，Ａ．Ｔ．，Ｂｉｌｙｙ，Ｒ．，Ｋｒｅｎｎ，Ｖ．，Ｒｅｎｎｅ，Ｃ．，Ｒｅｎｎｅ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｈｏｓｔ ＤＮａｓｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｙ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ） ３５８，１２０２－１２０６．
Ｋｌｕｇ，Ａ．，ａｎｄ Ｌｕｔｔｅｒ，Ｌ．Ｃ．（１９８１）．Ｔｈｅ ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｒｉｏｄｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９，４２６７－４２８３．
Ｋｏｙａｍａ，Ｒ．，Ａｒａｉ，Ｔ．，Ｋｉｊｉｍａ，Ｍ．，Ｓａｔｏ，Ｓ．，Ｍｉｕｒａ，Ｓ．，Ｙｕａｓａ，Ｍ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｄ．，ａｎｄ Ｍｉｚｕｔａ，Ｒ．（２０１６）．ＤＮａｓｅ γ，ＤＮａｓｅ Ｉ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｄｅｇｒａｄｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２１，１１５０－１１６３．
Ｌａｒｓｅｎ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｓφｒｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｓ．（２０１７）．Ｔｈｅ ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ： ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８４，１１６０－１１７０．
Ｌｉ，Ｒ．，Ｙｕ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｌａｍ，Ｔ．－Ｗ．，Ｙｉｕ，Ｓ．－Ｍ．，Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｊ．（２００９）．ＳＯＡＰ２： ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１９６６－１９６７．
Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．Ａ．，Ｓｕｎ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｚ．，Ｊｉａｎｇ，Ｐ．，Ｌｕｎ，Ｆ．Ｍ．Ｆ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｌａｕ，Ｔ．Ｋ．，Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｔｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２，６１ｒａ９１－６１ｒａ９１．
Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．，Ｃｏｒｂｅｔｔａ，Ｎ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｐ．Ｆ．，Ｒａｉ，Ｖ．，Ｓａｒｇｅｎｔ，Ｉ．Ｌ．，Ｒｅｄｍａｎ，Ｃ．Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ Ｗａｉｎｓｃｏａｔ，Ｊ．Ｓ．（１９９７）．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５０，４８５－４８７．
Ｍａｎａｓｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｈｅｚａｒ，Ｊ．，Ｓｈｕｒｔｚ－Ｓｗｉｒｓｋｉ，Ｒ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｇ．，Ｔｅｎｄｌｅｒ，Ｙ．，Ｋｒｉｓｔａｌ，Ｂ．，Ｓｈａｓｈａ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｅｌａ，Ｓ．（１９９６）．Ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９４，４８－５２．
Ｎａｇａｔａ，Ｓ．（２０１８）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３６，４８９－５１７．
Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｓ．，Ｍｅｚｒｈａｂ，Ｊ．，Ｋｌｏｃｋｌ，Ｔ．，ａｎｄ Ｍａｎｎｈｅｒｚ，Ｈ．Ｇ．（２００９）．Ｍｕｒｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ － ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＤＮａｓｅ１ ａｎｄ ＤＮａｓｅ１－ｌｉｋｅ ３ （ＤＮａｓｅ１ｌ３）．Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７６，１０５９－１０７３．
Ｎａｐｉｒｅｉ，Ｍ．，Ｗｕｌｆ，Ｓ．，Ｅｕｌｉｔｚ，Ｄ．，Ｍａｎｎｈｅｒｚ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ Ｋｌｏｅｃｋｌ，Ｔ．（２００５）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ １ （Ｄｎａｓｅ１） ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ １－ｌｉｋｅ ３ （Ｄｎａｓｅ１ｌ３）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３８９，３５５－３６４．
Ｏｚｃａｋａｒ，Ｚ．Ｂ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｊ．，２ｎｄ，Ｄｉａｚ－Ｈｏｒｔａ，Ｏ．，Ｋａｓａｐｃｏｐｕｒ，Ｏ．，Ｆａｎ，Ｙ．Ｓ．，Ｙａｌｃｉｎｋａｙａ，Ｆ．，ａｎｄ Ｔｅｋｉｎ，Ｍ．（２０１３）．ＤＮＡＳＥ１Ｌ３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｙｐｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｍｉｃ ｕｒｔｉｃａｒｉａｌ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６５，２１８３－２１８９．
Ｑｕｉｎｌａｎ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｉ．Ｍ．（２０１０）．ＢＥＤＴｏｏｌｓ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６，８４１－８４２．
Ｓａｍｅｊｉｍａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．（２００５）．Ｔｒａｓｈｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６，６７７－６８８．
Ｓｅｒｐａｓ，Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｗ．Ｙ．，Ｊｉａｎｇ，Ｐ．，Ｎｉ，Ｍ．，Ｓｕｎ，Ｋ．，Ｒａｓｈｉｄｆａｒｒｏｋｈｉ，Ａ．，Ｓｏｎｉ，Ｃ．，Ｓｉｓｉｒａｋ，Ｖ．，Ｌｅｅ，Ｗ．－Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｄｎａｓｅ１ｌ３ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｓ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｅｎｄ－ｍｏｔｉｆ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６，６４１－６４９．
Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｙｕｅ，Ｆ．，ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｄ．Ｆ．，Ｙｅ，Ｚ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｌ．，Ｋｕａｎ，Ｓ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｕ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｌ．，Ｌｏｂａｎｅｎｋｏｖ，Ｖ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４８８，１１６－１２０．
Ｓｉｓｉｒａｋ，Ｖ．，Ｓａｌｌｙ，Ｂ．，Ｄ’Ａｇａｔｉ，Ｖ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｏｒｔｉｚ，Ｗ．，Ｏｚｃａｋａｒ，Ｚ．Ｂ．，Ｄａｖｉｄ，Ｊ．，Ｒａｓｈｉｄｆａｒｒｏｋｈｉ，Ａ．，Ｙｅｓｔｅ，Ａ．，Ｐａｎｅａ，Ｃ．，Ｃｈｉｄａ，Ａｓｉｙａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｅｌｌ １６６，８８－１０１．
Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｋｉｒｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｄａｚａ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．（２０１６）．Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ ｔｈａｔ Ｉｎｆｏｒｍｓ Ｉｔｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ－Ｏｆ－Ｏｒｉｇｉｎ．Ｃｅｌｌ １６４，５７－６８．
Ｓｕｎ，Ｋ．，Ｊｉａｎｇ，Ｐ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｔ．，Ｗｏｎｇ，Ｊ．，Ｗｏｎｇ，Ｖ．Ｗ．Ｓ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｓ．Ｍ．，Ｍａ，Ｂ．Ｂ．Ｙ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ－ａｗａｒｅ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｏｐｅｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｆｏｒｍｓ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９，４１８－４２７．
Ｖｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕ，Ｂ．（１９９２）．Ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒｙｐｓｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｈｉｓｔｏｎｅｓ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ２８８ （ Ｐｔ ３），９５３－９５８．
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，Ｔａｋａｄａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｍｉｚｕｔａ，Ｒ．（２０１９）．Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＤＮａｓｅ１Ｌ３ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５１６，７９０－７９５．
Ｗｉｄｌａｋ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇａｒｒａｒｄ，Ｗ．Ｔ．（２００５）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ＤＦＦ４０／ＣＡＤ ａｎｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９４，１０７８－１０８７．
Ｗｉｄｌａｋ，Ｐ．，Ｌｉ，Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，ａｎｄ Ｇａｒｒａｒｄ，Ｗ．Ｔ．（２０００）．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＤＦＦ４０ （ｃａｓｐａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ ｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ） ｏｎ ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５，８２２６－８２３２．
Ｙａｎｇ，Ｗ．（２０１１）．Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ： ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ４４，１－９３
Claims (57)
- 無細胞ＤＮＡを含む対象の生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法であって、
前記対象の前記生物学的試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された配列リードを受け取ることと、
前記配列リードを使用して、特定の塩基で終わる無細胞ＤＮＡ断片の第１の量を決定することと、
前記第１の量を参照値と比較して、前記遺伝子が前記対象において前記遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定することと、を含む、方法。 - 前記生物学的試料が、抗凝固剤で処理され、少なくとも指定された時間にわたってインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
- 無細胞ＤＮＡを含む生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法であって、
対象の第１の生物学的試料中の第１の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された第１の配列リードを受け取ることであって、前記第１の生物学的試料が、抗凝固剤で処理され、第１の時間の長さにわたってインキュベートされる、受け取ることと、
前記第１の配列リードを使用して、特定の塩基で終わる前記第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１の量を決定することと、
前記対象の第２の生物学的試料中の第２の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された第２の配列リードを受け取ることであって、前記第２の生物学的試料が、前記抗凝固剤で処理され、前記第１の時間の長さよりも長い第２の時間の長さにわたってインキュベートされる、受け取ることと、
前記第２の配列リードを使用して、前記特定の塩基で終わる前記第２の無細胞ＤＮＡ断片の第２の量を決定することと、
前記第１の量を前記第２の量と比較して、前記遺伝子が前記対象において前記遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定することと、を含む、方法。 - 前記第１の量および前記第２の量が、前記特定の塩基を含む特定の末端モチーフについて決定される、請求項１または３に記載の方法。
- 前記第１の配列リードを参照ゲノムにアラインメントすることと、
前記参照ゲノムの特定の位置で、または前記特定の位置から指定された距離で終わる配列リードの第１のセットを特定することであって、前記特定の位置が、前記参照ゲノムにおける指定された特性を有する特定の座標またはゲノム位置に対応する、特定することと、をさらに含み、
前記第１の量が、前記特定の塩基で終わる配列リードの前記第１のセットの量に対応する、請求項１または３に記載の方法。 - 前記ゲノム位置が、ＣＴＣＦ領域の中心である、請求項５に記載の方法。
- 前記第１の量を前記第２の量と比較することは、前記第１の量が前記第２の量と少なくとも閾値量だけ異なるかどうかを決定することを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記分類は、前記第１の量が前記第２の量の閾値内にあるときに前記遺伝性障害が存在することである、請求項３に記載の方法。
- 前記分類は、前記第２の量が前記第１の量よりも少なくとも閾値だけ少ないときに前記遺伝性障害が存在することである、請求項３に記載の方法。
- 前記第１の量および前記第２の量が、前記特定の塩基での両端を有する無細胞ＤＮＡ断片のものである、請求項３に記載の方法。
- 前記第１の配列リードを使用して、前記特定の塩基で終わる前記第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１のサイズを決定することと、
前記第２の配列リードを使用して、前記特定の塩基で終わる前記第２の無細胞ＤＮＡ断片の第２のサイズを決定することと、をさらに含み、
前記第１の量が、特定のサイズを有する前記第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１のセットを使用して決定され、
前記第２の量が、前記特定のサイズを有する前記第２の無細胞ＤＮＡ断片の第２のセットを使用して決定される、請求項３に記載の方法。 - 前記特定のサイズが、サイズ範囲である、請求項１１に記載の方法。
- 前記第１の時間の長さが、ゼロである、請求項３に記載の方法。
- 無細胞ＤＮＡを含む対象の生物学的試料を使用して、ヌクレアーゼに関連する遺伝子についての遺伝性障害を検出するための方法であって、
前記対象の前記生物学的試料中の第１の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された第１の配列リードを受け取ることであって、前記生物学的試料が、抗凝固剤で処理され、少なくとも指定された時間にわたってインキュベートされる、受け取ることと、
前記第１の配列リードを使用して、特定のサイズを有する前記第１の無細胞ＤＮＡ断片の第１の量を決定することと、
前記第１の量を参照値と比較して、前記遺伝子が前記対象において前記遺伝性障害を示すかどうかの分類を決定することと、を含む、方法。 - 前記第１の量を前記参照値と比較することは、前記第１の量が前記参照値と少なくとも閾値量だけ異なるかどうかを決定することを含む、請求項１または１４に記載の方法。
- 前記第１の量を前記参照値と比較することは、前記第１の量が前記参照値よりも少なくとも閾値量だけ少ないかどうかを決定することを含む、請求項１または１４に記載の方法。
- 前記第１の量を前記参照値と比較することは、前記第１の量が前記参照値よりも少なくとも閾値量だけ大きいかどうかを決定することを含む、請求項１または１４に記載の方法。
- 前記参照値が、前記遺伝性障害を有しない１つ以上の参照試料から決定される、請求項１または１４に記載の方法。
- 前記参照値が、前記遺伝性障害を有する１つ以上の参照試料から決定される、請求項１または１４に記載の方法。
- 前記抗凝固剤が、ヘパリンである、請求項３または１４に記載の方法。
- 前記抗凝固剤が、ＥＤＴＡである、請求項３または１４に記載の方法。
- 前記遺伝子が、ＤＮＡＳＥ１である、請求項１、３、および１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子が、ＤＦＦＢである、請求項１、３、および１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子が、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３である、請求項１、３、および１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、細胞内ＤＮＡを切断する、請求項１、３、および１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝性障害が、前記遺伝子の欠失を含む、請求項１、３、および１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の量が、正規化される、請求項１、３、および１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝性障害の前記分類に基づいて前記対象を治療すること、をさらに含む、請求項１、３、および１４のいずれか一項に記載の方法。
- 血液障害を有する対象の治療の有効性を決定するための方法であって、
前記対象の血液試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された配列リードを受け取ることであって、前記血液試料が、第１の投与量の抗凝固剤を投与された前記対象の後に取得される、受け取ることと、
前記配列リードを使用して、特定の塩基で終わる前記無細胞ＤＮＡ断片の量を決定することと、
前記量を参照値と比較して、前記治療の前記有効性の分類を決定することと、を含む、方法。 - 血液障害を有する対象の治療の有効性を決定するための方法であって、
前記対象の血液試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された配列リードを受け取ることであって、前記血液試料が、第１の投与量の抗凝固剤を投与された前記対象の後に取得される、受け取ることと、
前記配列リードを使用して、特定のサイズを有する前記無細胞ＤＮＡ断片の量を決定することと、
前記量を参照値と比較して、前記治療の前記有効性の分類を決定することと、を含む、方法。 - 前記対象から前記血液試料を取得することと、
前記血液試料中の前記無細胞ＤＮＡ断片を配列決定して、前記配列リードを取得することと、をさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。 - 前記第１の投与量の前記抗凝固剤を前記対象に投与すること、をさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
- 前記比較に基づいて、第２の投与量の前記抗凝固剤を前記対象に投与することであって、前記第２の投与量が、前記第１の投与量よりも多い、投与すること、をさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
- 前記抗凝固剤が、ヘパリンである、請求項２９または３０に記載の方法。
- 前記参照値が、前記治療の前記有効性について既知のまたは測定された分類を有する１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項２９または３０に記載の方法。
- 前記１つ以上の参照試料に対して凝固試験を実施することによって、前記１つ以上の参照試料についての前記治療の前記有効性を測定することと、
前記１つ以上の参照試料中の前記量を測定することと、をさらに含む、請求項３５に記載の方法。 - 前記１つ以上の参照試料が、複数の参照試料であり、前記方法が、
前記複数の参照試料について測定された有効性および測定された量に対応する較正データ点を近似する較正関数を決定すること、をさらに含む、請求項３６に記載の方法。 - 無細胞ＤＮＡを含む対象の生物学的試料を使用してヌクレアーゼの活性を監視するための方法であって、
前記対象の前記生物学的試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された配列リードを受け取ることと、
前記配列リードを使用して、特定の塩基で終わる前記無細胞ＤＮＡ断片の量を決定することと、
前記量を参照値と比較して、前記ヌクレアーゼの活性の第１の分類を決定することと、を含む、方法。 - 無細胞ＤＮＡを含む対象の生物学的試料を使用してヌクレアーゼの活性を監視するための方法であって、
前記対象の前記生物学的試料中の無細胞ＤＮＡ断片の配列決定から取得された配列リードを受け取ることと、
前記配列リードを使用して、特定のサイズを有する前記無細胞ＤＮＡ断片の量を決定することと、
前記量を参照値と比較して、前記ヌクレアーゼの活性の第１の分類を決定することと、を含む、方法。 - 前記第１の分類が、数分類値であり、前記方法が、
前記数分類値をカットオフと比較して、前記ヌクレアーゼに関連する遺伝子が前記対象において遺伝性障害を示すかどうかの第２の分類を決定すること、をさらに含む、請求項３８または３９に記載の方法。 - 前記生物学的試料が、抗凝固剤で処理され、少なくとも指定された時間にわたってインキュベートされる、請求項３８または３９に記載の方法。
- 前記参照値が、前記ヌクレアーゼの前記活性の特定の分類を有する較正試料から決定される、請求項３８または３９に記載の方法。
- 前記特定の分類が、正常、増加、または減少である、請求項４２に記載の方法。
- 前記量を前記参照値と比較することが、前記量が前記参照値と少なくとも閾値量だけ異なるかどうかを決定することを含む、請求項３８または３９に記載の方法。
- 前記量を前記参照値と比較することが、前記量が前記参照値よりも少なくとも閾値量だけ少ないかどうかを決定することを含む、請求項３８または３９に記載の方法。
- 前記量を前記参照値と比較することが、前記量が前記参照値よりも少なくとも閾値量だけ大きいかどうかを決定することを含む、請求項３８または３９に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、ＤＦＦＢ、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、またはＤＮＡＳＥ１である、請求項３８または３９に記載の方法。
- 前記対象は、前記生物学的試料が取得される前に、前記ヌクレアーゼによる治療を提供されている、請求項３８または３９に記載の方法。
- 前記量と前記参照値との比較に基づいて、前記ヌクレアーゼによる前記治療の有効性の第２の分類を決定すること、をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
- 前記参照値が、前記ヌクレアーゼの前記活性について既知のまたは測定された分類を有する１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項３８または３９に記載の方法。
- 前記１つ以上の参照試料についての前記ヌクレアーゼの前記活性を測定することと、
前記１つ以上の参照試料中の前記量を測定することと、をさらに含む、請求項５０に記載の方法。 - 前記１つ以上の参照試料が、複数の参照試料であり、前記方法が、
前記複数の参照試料について測定された活性および測定された量に対応する較正データ点を近似する較正関数を決定すること、をさらに含む、請求項５１に記載の方法。 - コンピュータシステムを制御して、先行請求項のいずれか一項に記載の方法を実施するための、複数の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を含む、コンピュータ製品。
- システムであって、
請求項５３に記載のコンピュータ製品と、
前記非一時的コンピュータ可読媒体上に保存される指示を実行するための１つ以上のプロセッサと、を備える、システム。 - 請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法を実施するための手段を備える、システム。
- 請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された１つ以上のプロセッサを備える、システム。
- 請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法のステップをそれぞれ実施するモジュールを備える、システム。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962949867P | 2019-12-18 | 2019-12-18 | |
| US62/949,867 | 2019-12-18 | ||
| US202062958651P | 2020-01-08 | 2020-01-08 | |
| US62/958,651 | 2020-01-08 | ||
| PCT/CN2020/137516 WO2021121368A1 (en) | 2019-12-18 | 2020-12-18 | Cell-free dna fragmentation and nucleases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023506560A true JP2023506560A (ja) | 2023-02-16 |
Family
ID=76439147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022537721A Pending JP2023506560A (ja) | 2019-12-18 | 2020-12-18 | 無細胞ｄｎａ断片化およびヌクレアーゼ |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210189494A1 (ja) |
| EP (1) | EP4077721A4 (ja) |
| JP (1) | JP2023506560A (ja) |
| CN (1) | CN115298324A (ja) |
| AU (1) | AU2020409879A1 (ja) |
| CA (1) | CA3161683A1 (ja) |
| WO (1) | WO2021121368A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022214051A1 (en) * | 2021-04-08 | 2022-10-13 | The Chinese University Of Hong Kong | Cell-free dna methylation and nuclease-mediated fragmentation |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2852680B1 (en) * | 2012-05-21 | 2019-12-25 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
| JP2017522908A (ja) * | 2014-07-25 | 2017-08-17 | ユニヴァーシティ オブ ワシントン | セルフリーｄｎａを生じる組織及び／又は細胞タイプを決定する方法、並びにそれを用いて疾患又は異常を識別する方法 |
| WO2016065295A1 (en) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Dae Hyun Kim | Enrichment of small nucleic acids |
| KR20180031742A (ko) * | 2015-07-23 | 2018-03-28 | 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 | 무세포 dna의 단편화 패턴 분석 |
| US10095831B2 (en) * | 2016-02-03 | 2018-10-09 | Verinata Health, Inc. | Using cell-free DNA fragment size to determine copy number variations |
| CN109415727A (zh) * | 2016-06-13 | 2019-03-01 | 格里尔公司 | 富集突变的无细胞核酸以供癌症检测的方法 |
| CN117604082A (zh) * | 2016-08-10 | 2024-02-27 | 格瑞尔有限责任公司 | 分析核酸片段的方法 |
| AU2019207900A1 (en) * | 2018-01-12 | 2020-07-09 | Claret Bioscience, Llc | Methods and compositions for analyzing nucleic acid |
-
2020
- 2020-12-18 CA CA3161683A patent/CA3161683A1/en active Pending
- 2020-12-18 JP JP2022537721A patent/JP2023506560A/ja active Pending
- 2020-12-18 EP EP20903846.2A patent/EP4077721A4/en active Pending
- 2020-12-18 AU AU2020409879A patent/AU2020409879A1/en active Pending
- 2020-12-18 CN CN202080095302.5A patent/CN115298324A/zh active Pending
- 2020-12-18 WO PCT/CN2020/137516 patent/WO2021121368A1/en unknown
- 2020-12-18 US US17/127,194 patent/US20210189494A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4077721A1 (en) | 2022-10-26 |
| AU2020409879A1 (en) | 2022-06-23 |
| US20210189494A1 (en) | 2021-06-24 |
| WO2021121368A1 (en) | 2021-06-24 |
| CN115298324A (zh) | 2022-11-04 |
| EP4077721A4 (en) | 2024-01-17 |
| CA3161683A1 (en) | 2021-06-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rodin et al. | The landscape of somatic mutation in cerebral cortex of autistic and neurotypical individuals revealed by ultra-deep whole-genome sequencing | |
| US20150315645A1 (en) | Methods of identifying biomarkers associated with or causative of the progression of disease | |
| JP2022544604A (ja) | がん検体において細胞経路調節不全を検出するためのシステム及び方法 | |
| EP3494235A1 (en) | Swarm intelligence-enhanced diagnosis and therapy selection for cancer using tumor- educated platelets | |
| US20220396838A1 (en) | Cell-free dna methylation and nuclease-mediated fragmentation | |
| US20210238668A1 (en) | Biterminal dna fragment types in cell-free samples and uses thereof | |
| CN113228190A (zh) | 基于预测的肿瘤突变负荷的肿瘤分类 | |
| JP2023518291A (ja) | 循環遊離ｍＲＮＡプロファイリングアッセイを使用してアルツハイマー病のリスクを検出するシステムおよび方法 | |
| US20220010353A1 (en) | Nuclease-associated end signature analysis for cell-free nucleic acids | |
| Rodin et al. | The landscape of mutational mosaicism in autistic and normal human cerebral cortex | |
| Gaksch et al. | Residual disease detection using targeted parallel sequencing predicts relapse in cytogenetically normal acute myeloid leukemia | |
| WO2022212590A1 (en) | Systems and methods for multi-analyte detection of cancer | |
| US20210189494A1 (en) | Cell-free dna fragmentation and nucleases | |
| KR20210132139A (ko) | 대립유전자 빈도에 기초한 기능 손실의 컴퓨터 모델링 | |
| JP2020533663A (ja) | Ｄｎａ修復プロファイリング及びそのための方法 | |
| Gindin et al. | Analytical principles of cancer next generation sequencing | |
| JP7090604B2 (ja) | びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫の予後予測因子、及び予後予測方法 | |
| US20240182982A1 (en) | Fragmentomics in urine and plasma | |
| WO2024114678A1 (en) | Fragmentomics in urine and plasma | |
| Palou-Márquez et al. | Variable efficiency of nonsense-mediated mRNA decay across human tissues, tumors and individuals | |
| Class et al. | Patent application title: METHODS OF IDENTIFYING BIOMARKERS ASSOCIATED WITH OR CAUSATIVE OF THE PROGRESSION OF DISEASE Inventors: Theresa Gaasterland (Del Mar, CA, US) Douglas E. Gaasterland (Colonial Beach, VA, US) Assignees: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA | |
| Suraci | Development of models to understand the complexity in cardiovascular research and diagnostic | |
| WO2021108525A1 (en) | Detecting congenital heart defects | |
| JP2021501422A (ja) | テモゾロミド反応予測因子及び方法 | |
| Reuther | INVESTIGATION OF GENETIC ALTERATIONS IN EMT SUPPRESSOR, DEAR1, THROUGH PAN-CANCER ANALYSIS AND ULTRA-DEEP TARGETED SEQUENCING IN DUCTAL CARCINOMA IN SITU |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221025 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20221025 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231201 |