JP2023506288A - サンプル中の可逆光スイッチ型化学種の検出方法 - Google Patents
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Abstract
ａ）サンプル（Ｓ）を、化学種により吸収されるのに適した光で照明し、化学種の光特性に影響を与える反応をトリガするステップであって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調されるステップと、ｂ）光特性の変化を測定するステップと、ｃ）前記変化を表す信号の、基本変調周波数の偶数倍である周波数の同相成分と、基本変調周波数の奇数倍である周波数の直交成分の少なくとも一方を抽出するステップと、ｄ）抽出された１つ又は複数の成分を使って化学種を検出するステップと、を含む、サンプル中の可逆光スイッチ型化学種の検出方法。この方法を実行する装置。
Description
本発明は、サンプル中の可逆光スイッチ型化学種、例えば可逆光スイッチ型蛍光タンパク質（ＲＳＦＰ：ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を検出するため、及び／又はサンプル中に存在する、又は存在するのに適した複数の光化学的活性種の間でそれを区別するための方法に関する。本発明の方法はまた、適当な不均一照明が使用されることを条件とした観察対象領域中の可逆光スイッチ型化学種の位置特定や、可逆光スイッチ型化学種の混合物の組成の特定等、他の各種の用途にも供される。
このような方法は、特に蛍光顕微鏡検査法及び生物／生化学的分析の分野に適用される。
本発明はまた、このような方法を実行するための装置にも関する。
「化学種」という用語は、分子、分子イオン、又は錯体を意味すると理解されたい。本発明の範囲内で、化学種はその特性、特に光化学的特性により定義される。したがって、同じ分子、分子イオン、又は錯体であっても、これらの特性に影響を与える異なる環境中にあれば異なる種と考えられ得る。
「光化学的活性」種は、光の影響下で電子構成及び／又は化学構造を変化させる化学種である。例えば、蛍光分子は光化学的に活性であると考えられる。
「可逆的光スイッチ型」という表現は、異なる特性（例えば、蛍光特性）を有する少なくとも２つの異なる状態を有し、光の影響下で１つの状態から他の状態へと可逆的に移行させられ得る化学種（典型的にはタンパク質）を意味すると理解されたい。可逆的化学スイッチ型種の例は、「ドロンパ」及び錯体である“Ｓｐｉｎａｃｈ－ＤＦＨＢＩ”（“Ｓｐｉｎａｃｈ”はＲＮＡアプタマ、ＤＦＨＢＩは蛍光発生プローブである）である。これらの種は、特に標識又はマーカとして使用され得る。
蛍光イメージング及び、特に蛍光顕微鏡検査法は、蛍光標識の高い感度と多用性から、生物学にとって不可欠となっている。蛍光標識を同定し、判別するための一般的な方法は、スペクトルドメインで蛍光信号を読み出すことである。しかし、スペクトル判別法には高度に多重化された観察において限界が見られる。豊富な光源用ハードウェア、色収差が補正された光学系、ダイクロイックミラー、光フィルタ等を用いたとしても、重複する吸収及び発光バンドのスペクトル分析で通常判別できる標識の数は、最大でも４つである。
蛍光体（光吸収のための断面積、ルミネッセンスの量子収量、吸収／発光バンドの半値幅）の最適化は基本的にその物理的限界に到達しており、蛍光は依然として生体細胞のイメージングにとってきわめて好ましいオブザーバブルであるはずであるため、スペクトル次元を、蛍光体をさらに判別するための１つ又は複数の追加の次元で補うことが非常に望ましい。また、実際に、蛍光体をその吸収－蛍光発光光周期を特徴付ける動的－すなわち時間的－情報を使用して判別するための幾つかの技術が開発されている。
例えば、蛍光寿命イメージング顕微鏡検査法（ＦＬＩＭ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）では、励起状態の寿命が蛍光体の区別に利用される（［Ｌａｋｏｗｉｃｚ １９９２］）。しかしながら、高度な器具と高速電子機器が必要となることのほか、この技術は蛍光イメージングにおいて現在使用されている高輝度蛍光体の寿命分散範囲が狭い（一桁未満）ことにより限定される。したがって、多重的な蛍光寿命イメージングでは、デコンボリューション（時間がかかる）又は減法方式の適用（ロバストさに欠け、信号対ノイズ比が低下する）が必要となっている。
可逆光スイッチ型蛍光体（ＲＳＦｓ－ＲＳＦＰｓはそのサブクラスである）にはこのような欠点がない。これらの標識は、吸収－蛍光発光の光周期をはるかに超える豊富な光化学の恩恵を受ける。ＲＳＦｓでは、照明が光化学的及び熱的ステップを含む幾つかの光周期を駆動し、これらは生物学的現象のリアルタイムでの観察と両立するような時間スケールで判別しやすくするために、様々な緩和時間（μｓ～ｓ）にわたり干渉する。そのため、ＯＬＩＤ、ＳＡＦＩＲｅ、ＴＲＡＳＴ、ＯＰＩＯＭ、及びＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭ等の複数のプロトコルでは、分光的に類似するＲＳＦｓをイメージングするために光の変動に対する蛍光の時間応答（「ダイナミックコントラスト」）が利用され、デコンボリューションにも減法方式にも依存しない。
ＯＬＩＤは、“Ｏｐｔｉｃａｌ Ｌｏｃｋ－Ｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”の略であり、［Ｍａｒｒｉｏｔｔ ２００８］に記載されている。この技術の１つの欠点は、ＲＳＦ濃度に関する定量的情報が提供されないことである。また、これには少なくとも１つの基準ピクセルが必要である。
ＳＡＦＩＲｅは、“Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ”の略であり、［Ｒｉｃｈａｒｄｓ ２０１０］に記載されている。ダイナミックコントラストの最適化には、それが経験的に行われ、それによって実装がさらに複雑となるという欠点がある。
ＴＲＡＳＴは、“ＴＲＡｎｓｉｅｎｔ ＳＴａｔｅイメージング顕微鏡法の略である。これは［Ｗｉｄｅｎｇｒｅｎ ２０１０］に記載されている。
ＯＰＩＯＭは、“Ｏｕｔ－ｏｆ－Ｐｈａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｆｔｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ”の略である。この方法は、［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１５］及び国際公開第２０１５０７５２０９号パンフレットに記載されている。この方法では、ＲＳＦを含むサンプルが周期変調される光波で照明される。励起波に関して同じ周波数及び矩象で蛍光体により発せられる蛍光強度の成分は共鳴挙動を示す、すなわち蛍光強度が照明強度及び変調周波数の特定の種依存ピーク値を示すことが示されている。
Ｓｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭ（［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１７］及び国際公開第２０１８／０４１５８８号パンフレット）はＯＰＩＯＭの変形で、２波長照明の使用によりより短い取得時間を実現する。
Ｓｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭにより、１Ｈｚのオーダの取得周波数で分光的に類似する３つのＲＳＦＰｓを独立してイメージングできるようになった。
［Ｒｏｗｅ ２００２］及び［Ｊｅｎｋｉｎｓ ２０１５］には、方形波照明を使用する位相蛍光測定法の改良が説明されている。蛍光信号の複数の高調波成分の位相シフト及び／又は変調率が、蛍光寿命の特定に使用される。
Ｌａｋｏｗｉｃｚ １９９２
Ｍａｒｒｉｏｔｔ ２００８
Ｒｉｃｈａｒｄｓ ２０１０
Ｗｉｄｅｎｇｒｅｎ ２０１０
Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１５
Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１７
Ｒｏｗｅ ２００２
Ｊｅｎｋｉｎｓ ２０１５
本発明は、ＯＰＩＯＭ及びＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭと比較して、ダイナミックコントラストを利用して分光的に類似するＲＳＦｓのよりよい判別を示す改良された検出方法と、改良されたスペクトル干渉の除去を提供することを目的とする。さらに、本発明は蛍光分子及び蛍光検出のケースに限定されず、その異なる状態において異なる測定可能特性、すなわち「オブザーバブル」（例えば、蛍光発光だけでなく、光吸収、ラマン信号等）を有する何れの可逆光スイッチ型種にも応用できる。また、異なるオブザーバブルを組み合わせることも可能となる。
本発明によれば、この目的は、検出信号（例えば、蛍光信号）の高調波成分を考慮するという点で、ＯＰＩＯＭ及びＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭとは異なる方法により達成される。換言すれば、ＯＰＩＯＭ及びＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭの何れにおいても、検出信号の「基本」成分（すなわち、励起波と同じ周波数の成分）の直交部分だけが利用されるが、本発明の方法は、基本成分に加えて、又はその代わりに、信号の高調波成分を使って可逆光スイッチ型種を判別する。高調波成分は、信号の、励起波の周波数の整数倍である周波数を有するフーリエ成分である（一定の、すなわちゼロ周波数成分と基本成分自体は高調波とはみなされない）。
より詳しくは、本発明は、奇数調波の直交成分及び／又は偶数調波の同相成分を利用するものであり、それはこれらの成分が、奇数調波の同相成分及び偶数調波の直交成分には当てはまらない共鳴挙動を示すからである。
すると、本発明の目的はサンプル中の可逆光スイッチ型化学種を検出する方法であり、これは：
ａ）サンプルを、化学種により吸収されるのに適した第一の波長の第一の光で照明して、化学種の少なくとも１つの光特性に影響を与える反応をトリガするステップであって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調されるステップと、
ｂ）化学種の光特性の変化を測定するステップと、
を含み、
ｃ）前記変化を表す信号の、
－基本変調周波数の、ゼロではない偶数倍である周波数の同相成分と、
－基本変調周波数自体より大きい、基本変調周波数の奇数倍である周波数の直交成分
の少なくとも一方を抽出するステップと、
ｄ）抽出された１つ又は複数の成分を使用して化学種を検出するステップと、
をさらに含むことを特徴とする。
ａ）サンプルを、化学種により吸収されるのに適した第一の波長の第一の光で照明して、化学種の少なくとも１つの光特性に影響を与える反応をトリガするステップであって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調されるステップと、
ｂ）化学種の光特性の変化を測定するステップと、
を含み、
ｃ）前記変化を表す信号の、
－基本変調周波数の、ゼロではない偶数倍である周波数の同相成分と、
－基本変調周波数自体より大きい、基本変調周波数の奇数倍である周波数の直交成分
の少なくとも一方を抽出するステップと、
ｄ）抽出された１つ又は複数の成分を使用して化学種を検出するステップと、
をさらに含むことを特徴とする。
本発明のほかの目的は、このような方法を実行するための装置であり、これは：
－サンプルを第一の波長の第一の光で照明するように構成された少なくとも第一の制御光源であって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調される第一の制御光源と、
－サンプルの光特性の変化を測定するように構成された光検出器と、
－データ処理装置と、
を含み、
データ処理装置は、前記変化を表す信号の、基本変調周波数の、ゼロではない偶数倍である周波数の同相成分と、基本変調周波数の、基本変調周波数自体より大きい奇数倍である周波数の直交成分のうちの少なくとも一方を抽出し、抽出された１つ又は複数の成分を使ってサンプル中の化学種を検出するように構成されることを特徴とする。
－サンプルを第一の波長の第一の光で照明するように構成された少なくとも第一の制御光源であって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調される第一の制御光源と、
－サンプルの光特性の変化を測定するように構成された光検出器と、
－データ処理装置と、
を含み、
データ処理装置は、前記変化を表す信号の、基本変調周波数の、ゼロではない偶数倍である周波数の同相成分と、基本変調周波数の、基本変調周波数自体より大きい奇数倍である周波数の直交成分のうちの少なくとも一方を抽出し、抽出された１つ又は複数の成分を使ってサンプル中の化学種を検出するように構成されることを特徴とする。
方法及び装置の特定実施形態は、特許請求従属項の主旨を構成する。
本発明のその他の特徴及び利点は、後述の説明を下記のような添付の図面と共に読めば明らかとなるであろう。
図２Ａ－２Ｌでは、それぞれ正と負の値に関連付けられており、等濃度曲線９５％（濃い実線）、５０％（中程度の実線）、１０％（薄い実線）、０％（点線）、－１０％（薄い破線）、－５０％（中程度の破線）、－９５％（濃い破線）は絶対極値を示す。
図３Ａ－６Ｆでは、それぞれ正と負の値に関連付けられており、等濃度曲線９５％（実線）、５０％（実線）、１０％（実線）、０％（点線）、－１０％（破線）、－５０％（破線）、－９５％（破線）は絶対極値を示す。
以下に本発明の方法を、検出化学種が可逆光スイッチ型蛍光体である場合に関して説明するが、－前述のように－これはまた、その異なる状態で異なる測定可能な特性（例えば、蛍光発光だけでなく、光吸収、ラマン信号等）を有するかぎり、蛍光以外の可逆光スイッチ型種にも適用される。
図１は、本発明に基礎となる原理を図解する。サンプルＳは可逆光スイッチ型種（「標識」という）Ｐを含んでおり、これは光の影響下で、異なる輝度を有する第一の状態１と第二の状態２との間で切り替わることができる（図の中央部分）。図１の例において（図の左側部分参照）、サンプルは、正弦波変調された光強度Ｉ１の第一の波長λ１及び、それと同時に一定の光強度Ｉ２の第二の波長λ２で照明される（代替的に、Ｉ２はゼロとするか、又はＩ１と同じ周波数であるが、逆位相で正弦波変調することもでき、さらに、光は周期的に、ただし正弦波によらずに、例えば方形波で変調され得る）。一般に、蛍光発光の強度は、正弦曲線的にではないが、周期的に変化するため、それを高調波成分に分解できる。より詳しくは、各高調波次数について、励起光の位相を呈する「同相」成分Ｉｎと、励起光に関して９０°の位相遅延を呈する「位相ずれ」成分Ｏｕｔがある。高調波成分の振幅は、例えば蛍光発光の検出された強度ＩＦ（ｔ）をフーリエ変換することによって計算され得る。蛍光発光の高調波分解は、図１の右側部分に示されている。
波長λ１及びλ２での２つの成分Ｉ１（ｔ）及びＩ２（ｔ）を含む強度Ｉ（ｔ）の光で照明される可逆光スイッチ型蛍光標識Ｐの動的挙動の詳細な理論上の説明を行うが、この動的挙動は２状態切替により確実に説明できることを前提とする：
ただし、熱力学的に最も安定な状態１は熱力学的により不安定な状態２へと
ｋ１２（ｔ）＝δ１２，１Ｉ１（ｔ）＋δ１２，２Ｉ２（ｔ） （２）
の速度定数で光化学的に変換され、そこから
の速度定数で光化学的又は熱的駆動プロセスの何れかにより初期状態１に再び緩和でき、
ただし、σ１２，１Ｉ１（ｔ）、σ１２，２１２（ｔ）、σ２１，１Ｉ１（ｔ）、σ２１，２Ｉ２（ｔ）、及び
はそれぞれ、速度定数への光化学的及び熱的寄与を提供する。その場合、光異化のための分子作用断面σ１２，１とσ２１，１（λ１による）、σ１２，２とσ２１，２（λ２による）、及び熱速度定数
は、可逆光スイッチ型蛍光標識の動的挙動を十分に定義する。
ｋ１２（ｔ）＝δ１２，１Ｉ１（ｔ）＋δ１２，２Ｉ２（ｔ） （２）
の速度定数で光化学的に変換され、そこから
ただし、σ１２，１Ｉ１（ｔ）、σ１２，２１２（ｔ）、σ２１，１Ｉ１（ｔ）、σ２１，２Ｉ２（ｔ）、及び
システムに対して以下による照明の変調が行われると考える：
ただし、α１とｈ１（ωｔ）（又は、α２と
）はそれぞれ、波長λ１（又はλ２）での光変調の振幅と基本放射周波数ωとの周期関数を指す。システムは均一に照明されるか、又はその進展の何れの時点においても均一と考えることができると仮定する。
次に、２状態切替（１）に基づいて、濃度変化を規定する等式を書く：
ただし、
１＋２＝Ｐｔｏｔ （６）
であり、
Ｐｔｏｔは総濃度である。濃度２の安定値は
２０＝［Ｋ１２ ０／（１＋Ｋ１２ ０）］Ｐｔｏｔ （７）
であり、
は平衡定数であり、
は光強度
で照明したときの反応（１）に関連する速度定数である。
ｆ＝（２－２０）Ｎ／（Ｐｔｏｔ（α１＋α２）） （１１）
ただし、Ｎは照明の変調光成分の数（Ｎ＝１又は２）である、の場合、１及び２の濃度の時間的変化を規定する微分方程式（式（５））は
となり、
ただし、
であり、反応（１）の緩和時間
は
で、
（又は
）は１から２への（又は、２から１への）遷移を駆動する波長
（又は
）での変調光の平均の相対的寄与の差であり、
である。
１＋２＝Ｐｔｏｔ （６）
であり、
Ｐｔｏｔは総濃度である。濃度２の安定値は
２０＝［Ｋ１２ ０／（１＋Ｋ１２ ０）］Ｐｔｏｔ （７）
であり、
ｆ＝（２－２０）Ｎ／（Ｐｔｏｔ（α１＋α２）） （１１）
ただし、Ｎは照明の変調光成分の数（Ｎ＝１又は２）である、の場合、１及び２の濃度の時間的変化を規定する微分方程式（式（５））は
ただし、
ここで、３種類のケースにおいてこの式を解く：
１．ケース１．まず、その正及び逆変換がどちらも、一方のみ（λ１）が変調される（Ｎ＝１、α２＝０）２種類の波長を使って光化学的に駆動される可逆光スイッチ型種のケースを考える。以下において、このケースは、報告されているほとんどのシステムで有効性が確認されている以下の仮定により扱われる：
ａ．状態１から状態２への遷移は波長
での照明によって制御されると仮定され、状態２から状態１への遷移は、波長
での照明によって駆動され、これは、光強度
が十分に高い状態にあると考えることを意味する。
ｂ．波長λ１での照明は、状態２から状態１の場合より状態１から状態２の速度定数への寄与度の方が大きい（σ２１，１＜＜σ１２，１）。それゆえ、式（８）、（１５）、及び（１６）は
となる。
この仮定により、式（１２）から
が得られる。
２．ケース２．次に、その正変換が光化学的に駆動され、逆反応には熱制御が係わる可逆光スイッチ型種のケースを考える。それに対応して、
（Ｎ＝１，α２＝０）を適用し、報告された結果に基づいて、さらに以下のように仮定する：
ａ．波長λ１での照明は、状態２から状態１の場合より状態１から状態２の速度定数への寄与度の方が大きい（σ２１，１＜＜σ１２，１）。
ｂ．状態２から状態１への遷移は熱的寄与
により駆動される。それゆえ、式（８）、（１５）、及び（１６）は
となる。
この仮定により、式（１２）から
が得られる。
３．ケース３．最後に、その正及び逆変換がどちらも、両方が変調される（Ｎ＝２）２種類の波長を使って光化学的に駆動される可逆光スイッチ型種のケースを考える。ケース１の仮定（ａ）及び（ｂ）に加えて、このケースを扱うにはさらに以下の仮定を適用する：
ａ．波長λ２での照明は、状態１から状態２より状態２から状態１の速度定数への寄与度の方が大きい（σ１２，２＜＜σ２１，２）。それゆえ、式（８）、（１５）、（１６）、及び（１７）は
となる。
ｂ．周期関数ｈ１（θｘ）及びｈ２（θｘ）は反対の（ｈ２（θｘ）＝－ｈ１（θ（ｘ））である。
この仮定により、式（１２）から
が得られる。
１．ケース１．まず、その正及び逆変換がどちらも、一方のみ（λ１）が変調される（Ｎ＝１、α２＝０）２種類の波長を使って光化学的に駆動される可逆光スイッチ型種のケースを考える。以下において、このケースは、報告されているほとんどのシステムで有効性が確認されている以下の仮定により扱われる：
ａ．状態１から状態２への遷移は波長
ｂ．波長λ１での照明は、状態２から状態１の場合より状態１から状態２の速度定数への寄与度の方が大きい（σ２１，１＜＜σ１２，１）。それゆえ、式（８）、（１５）、及び（１６）は
この仮定により、式（１２）から
２．ケース２．次に、その正変換が光化学的に駆動され、逆反応には熱制御が係わる可逆光スイッチ型種のケースを考える。それに対応して、
ａ．波長λ１での照明は、状態２から状態１の場合より状態１から状態２の速度定数への寄与度の方が大きい（σ２１，１＜＜σ１２，１）。
ｂ．状態２から状態１への遷移は熱的寄与
この仮定により、式（１２）から
３．ケース３．最後に、その正及び逆変換がどちらも、両方が変調される（Ｎ＝２）２種類の波長を使って光化学的に駆動される可逆光スイッチ型種のケースを考える。ケース１の仮定（ａ）及び（ｂ）に加えて、このケースを扱うにはさらに以下の仮定を適用する：
ａ．波長λ２での照明は、状態１から状態２より状態２から状態１の速度定数への寄与度の方が大きい（σ１２，２＜＜σ２１，２）。それゆえ、式（８）、（１５）、（１６）、及び（１７）は
ｂ．周期関数ｈ１（θｘ）及びｈ２（θｘ）は反対の（ｈ２（θｘ）＝－ｈ１（θ（ｘ））である。
この仮定により、式（１２）から
最後の式（２１）及び（２５）は類似している。以下で、それに対応して、最初の２つのケースに
を、３つ目のケースには
の一般式を当てはめる。
緩和時間
を超えると、ｆ（θｘ）が連続周期関数である永久状態に入る。すると、ｆ（θｘ）はフーリエ級数として表現できる
ただし、ａｎ及びｂｎはフーリエ級数のｎ番目の成分の振幅を示す。ａｎ及びｂｎの項は、同じ次数（調波平衡）の成分の振幅を特定したときに式（３１）、（３２）から抽出できる。
すると、１及び２の濃度の以下の表現が得られる：
次のような明確な表記が導入される：
ただし、ｉｎは同相、ｏｕｔは光変調による直交を意味し、ｎｏｒｍは振幅のスケーリングを表す。
はそれぞれ、状態２の（Ｐｔｏｔに関して）正規化された濃度のｎ次成分の同相及び位相ずれ部分を表す。同様に、
を定義することができる。
光スイッチ型プローブＰからの多くのオブザーバブル（例えば、吸収率、電気泳動移動度等）は、１及び２の濃度と共に線形に変化する。したがって、これらのオブザーバブルの時間依存性の高調波成分は、（比例成分とは別に）１と２の高調波成分に関する前述の式により表現される。
蛍光発光は、例えば生物学への本発明の実用的応用にとってきわめて重要なオブザーバブルであり、より複雑な時間依存性を有する：
ＩＦ（ｔ）＝［Ｑ１，１１（ｔ）＋Ｑ２，１２（ｔ）］Ｉ１（ｔ）＋［Ｑ１，２１（ｔ）＋Ｑ２，２２（ｔ）］Ｉ２（ｔ） （３７）
ただし、Ｑｉ，ｊは、波長λｊ（ｊ＝１，２）で照明されたときの状態１の輝度（ｉ＝１，２）である。
ＩＦ（ｔ）＝［Ｑ１，１１（ｔ）＋Ｑ２，１２（ｔ）］Ｉ１（ｔ）＋［Ｑ１，２１（ｔ）＋Ｑ２，２２（ｔ）］Ｉ２（ｔ） （３７）
ただし、Ｑｉ，ｊは、波長λｊ（ｊ＝１，２）で照明されたときの状態１の輝度（ｉ＝１，２）である。
濃度と同様に、蛍光発光の強度も同相及び位相ずれ高調波成分に分割され得る：
本発明の方法は蛍光強度（又はその他のオブザーバブル）の高調波成分を使って可逆光スイッチ型種を検出及び／又は判別するため、本発明の好ましい実施形態では、光強度の変調は正弦波で行われ、それによって種の動的反応の線形部分により何れの高調波成分も導入されない。そこで、以下では１つ又は複数の波長での正弦波変調の具体的なケースを詳しく考える。しかしながら、本発明はこれらの好ましいケースに限定されず、正弦波以外の光変調も使用され得る。特に興味深いケースは、方形波（すなわち、オン－オフ）光強度変調であり、これは特に実装が容易である。方形波のフーリエ展開には奇数調波しか含まれないため、オン－オフ強度変調が適用される場合、関連するオブザーバブル（複数の場合もある）の偶数調波のみを考慮することによって可逆光スイッチ型種の検出／同定を実行することが有利である。
１つの波長で正弦波変調された光の強度は
のように表現できる。
（３８）を（３０）に代入し、（３２）による高調波成分を抽出すると、ａｎ及びｂｎの項（位相ずれ及び同相高調波成分の振幅であり、ｎは高調波次数である）を数値計算できる。
５次（ｎ＝５）での切捨ては、収束を求めるのに十分であることがわかっている：ａ０、ａ１、ｂ１、ａ２、及びｂ２の依存性は３次（ｎ＝３）を超えると大きく変化しないのに対し、４次（ｎ＝４）及び５次（ｎ＝５）を超えるとそれぞれａ３、ｂ３及びａ４、ｂ４の収束が観察される。
振幅ａｉ及びｂｉは全てが同じ符号を共有するとはかぎらない：ａ０、ａ１、ｂ３、ａ４、及びｂ４は負であり、ｂ１、ａ２、ｂ２、及びａ３は正である。奇数次の位相ずれ（ａ２ｋ＋１、
）と偶数次の同相（ｂ２ｋ、
）の振幅は、
空間の座標
で最適値を示し、その位置は、ｋが増大するとそれぞれより高い、及びより低い
及びθの値へとシフトし、換言すれば、これらは共鳴挙動を示す（ａ１の項の共鳴挙動はすでに特定されており、前述のＯＰＩＯＭ技術で利用されていることに留意されたい）。
さらに、共鳴バンド幅はθに沿ってより高速で減少する。後述のように、このことにより、ＯＰＩＯＭ技術と比較して、本発明の方法の分解能を向上できる。
それに対して、他方の振幅（ａ２ｋ、
及びｂ２ｋ＋１、
）はリッジ形状を示し、これらは
について最適化できるが、θに関する閾値挙動のみを示す。これらの成分は、本発明の好ましい実施形態では破棄される。
他の興味深い結果は、高調波成分の強度は、次数ｎが１ずつ増えると必ず低下するが、その速度は遅く、ほぼ係数２で低下することである。これは、実践的関心対象のケースのほとんどにおいて、少なくとも最初の数次高調波（３次は４次まで）が使用可能となることを意味する。
本発明者らは、同相偶数調波及び位相ずれ奇数調波の振幅について、以下のような近似解析表現を見出した：
奇数次の位相ずれ成分：
については：
偶数次の同相成分：
については：
であり、Ａｎは正の振幅率、Ｐｎはｎ次の多項式、
の場合にＰｎ［θ２］～１である。
奇数次の位相ずれ成分：
濃度１及び２に比例する特性が光スイッチ型種の検出及び／又は判別に使用される場合、正規化されたオブザーバブルを利用することが有益である：
ただし、Ｑ１，ｊ及びＱ２，ｊは、それぞれ状態１及び２に関する波長λｊでの観察に関連する特定の正規化されたオブザーバブルを示す。高調波分解により：
が得られる。
同様に、可逆光スイッチ型種を検出／同定するために使用されるオブザーバブルが蛍光発光である場合、正規化された蛍光強度を定義することが有益である：
高調波分解により、
が得られ、
ｎ＞１、
の場合に
となる。
ｎ＞１、
反対の位相の２つの波長で正弦波変調される光強度は、次のように表現できる：
（５２）を（３１）に代入し、（３２）にしたがって高調波成分を抽出すると、ａｎ及びｂｎの項（位相ずれ及び同相高調波成分の振幅であり、ｎは高調波次数である）を数値計算できる。
５次（ｎ＝５）での切捨ては、収束を求めるのに十分であることがわかっている：ａ０、ａ１、ｂ１、ａ２、及びｂ２の依存性は３次（ｎ＝３）を超えると大きく変化しないのに対し、４次（ｎ＝４）及び５次（ｎ＝５）を超えるとそれぞれａ３、ｂ３及びａ４、ｂ４の収束が観察される。
振幅ａｉ及びｂｉは全てが同じ符号を共有するとはかぎらない：ａ１及びｂ３は負であり、ｂ１及びａ３は正であり、ａ０、ａ２、ｂ２、ａ４、及びｂ４は正と負の成分を示す。奇数次の振幅（ａ２ｋ＋１及びｂ２ｋ＋ｋ１、
）は
で対称軸を示し、偶数次の振幅（ａ２ｋ ｂ２ｋ、
）は
で逆対称軸を示す。奇数次の位相ずれ（ａ２ｋ＋１、
）及び偶数次の同相（ｂ２ｋ、
）の振幅は、（
，θ）空間中に少なくとも１つの最適値を示す。より具体的には、ａ１は１つの最適値を示し、それより高次（ａ２ｋ＋１及びｂ２ｋ，ｋ＞０）は２つの最適値を示し、その位置は、ｋが増大すると、それぞれより高い、及びより低い
（
で対称）及びより小さいθの値へとシフトし、換言すれば、これらは共鳴挙動を示す（ａ１の項の共鳴挙動はすでに特定されており、前述のＯＰＩＯＭ技術で利用されていることに留意されたい）。
さらに、共鳴バンド幅はθに沿ってより高速で減少する。後述のように、このことにより、ＯＰＩＯＭ及びＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭ技術と比較して、本発明の方法の分解能を向上できる。
それに対して、他方の振幅（ａ２ｋ、
及びｂ２ｋ＋１、
）は少なくとも１つのリッジ形状を示し、すなわち、ｂ１は１つのリッジ形状を示すが、それより高次（ｂ２ｋ＋１及びａ２ｋ、ｋ＞０）は２つのリッジ形状を示して、これらは
について最適化できるが、θについては閾値挙動しか示さない。これらの成分は、本発明の好ましい実施形態では破棄される。
１光変調の場合に、また、分析を少なくとも共鳴を示す項のみに限定することによって行われる観察に関して：
・θ軸に沿った共鳴の位置及びバンド幅の変化は同様である。
・
軸に沿った共鳴の位置及びバンド幅は、濃度の項の次数ｎを高くするとより速くシフトする。
・高調波次数の上昇に伴う高調波強度の減少は小さい。
・
空間中の最適振幅は、２倍高いａ１を除いて同じである。
・θ軸に沿った共鳴の位置及びバンド幅の変化は同様である。
・
・高調波次数の上昇に伴う高調波強度の減少は小さい。
・
本発明者らは、同相偶数調波及び位相ずれ奇数調波の振幅について、以下の近似解析表現を見出した：
奇数次の位相ずれ成分：
については：
偶数次の同相成分：
については：
であり、Ａｎは正の振幅率、Ｐｎはｎ次の多項式、
の場合にＰｎ［θ２］～１である。
奇数次の位相ずれ成分：
濃度１及び２に比例する特性が光スイッチ型種の検出及び／又は判別に使用される場合、正規化されたオブザーバブルを利用することが有益である：
ただし、Ｑ１，ｊ及びＱ２，ｊは、それぞれ状態１及び２に関する波長λｊでの観察に関連する特定の正規化されたオブザーバブルを示す。高調波分解により：
が得られる。
同様に、可逆光スイッチ型種を検出／同定するために使用されるオブザーバブルが蛍光発光である場合、正規化された蛍光強度を定義することが有益である：
高調波分解により、
が得られ、
ｎ＞１、
の場合に
となる。
ｎ＞１、
上の式により、以下の制御パラメータの関数として、状態２の蛍光強度及び濃度の異なる高調波成分のマップを計算することができる：Ｉ１、Ｉ２、ω、又はその適当な関数。図２Ａ－２Ｌは、
空間内のこのようなマップを示している。前述のように、
は、Ｉ２
０＝０の場合はＩ１
０、又はそれ以外はＩ１
０／Ｉ２
０に比例する無次元パラメータであり、θはωに比例する無次元パラメータである。興味深いことに、高調波成分が
とθの関数として表現される場合に、これらは可逆光スイッチ型種の光化学特性に明確には依存しない（これが可能であるのは、
とθが確かにこれらに依存するからである）。その結果、図２Ａ－２Ｌのマップは「ユニバーサル」であり、これらは照明条件（１波長、１波長変調の２波長、逆位相の２波長変調の２波長）に依存するが、特定の可逆光スイッチ型種には依存しない。全てのケース、すなわち１波長変調又は逆位相の２波長変調の２波長照明において、変調は正弦波変調で、振幅が大きい（α＝１）。１波長照明は、１波長変調の２波長照明の中の、定数成分の強度がゼロの特定のケースとして扱われる。より具体的には：
－図２Ａは１波長変調の
のマップである。
－図２Ｂは１波長変調の
のマップである。
－図２Ｃは１波長変調の
のマップである。
－図２Ｄは１波長変調の
のマップである。
－図２Ｅは２波長変調の
のマップである。
－図２Ｆは２波長変調の
のマップである。
－図２Ｇは２波長変調の
のマップである。
－図２Ｈは２波長変調の
のマップである。
－図２Ｉは１波長変調の
のマップである。
－図２Ｊは１波長変調の
のマップである。
－図２Ｋは１波長変調の
のマップである。
－図２Ｌは１波長変調の
のマップである。
－図２Ａは１波長変調の
－図２Ｂは１波長変調の
－図２Ｃは１波長変調の
－図２Ｄは１波長変調の
－図２Ｅは２波長変調の
－図２Ｆは２波長変調の
－図２Ｇは２波長変調の
－図２Ｈは２波長変調の
－図２Ｉは１波長変調の
－図２Ｊは１波長変調の
－図２Ｋは１波長変調の
－図２Ｌは１波長変調の
２つの波長を含む１波長変調の場合、図２Ｉ－２Ｌに示される蛍光マップは、変調波長が種を変調波長での高輝度に関連付けられる明るい状態から暗い状態へと切り替える場合に対応する。変調波長が種を暗い状態から明るい状態に切り替える場合の蛍光マップは、図２Ｉ－２Ｌに示されるマップと符号のみが異なる。２波長での２つの異なる輝度の明るい状態に関して、最小輝度に関連する波長での光変調については定性的に異なる蛍光マップが得られる。この場合、蛍光マップは濃度マップに近い。
１次振幅
は小さい振幅の両方の光変調で得られる位相ずれ応答によってよく近似されることがわかる。（［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１５］：［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１７］）１及び２波長光変調の何れにおいても、
及びθに関して同様の対称ピークが示され、バンド幅はθに沿うより
に沿った方が長い。
及びθ＝１でのその共鳴によって、光変調により発生する組成シフト（照明により駆動される正及び逆反応が同じ速度で発生し、
となったときに最大となる）と光変調に対する応答の位相遅れ（光変調の放射周波数ωが切替緩和時間
とマッチし、θ＝１となったときにπ／２となる）の両方が最適となる。興味深いことに、共鳴時の
は２波長では１波長光変調の場合の２倍高くなる。
とは対照的に、１及び２波長変調で生成される異なる濃度変調のより高次項のマップは異なる。１波長変調では、共鳴位置は
及びθについて、それぞれより高い、及びより低い値に向かって、
から
へとシフトする。
軸に沿って、近似解析表現で
の場合の共鳴が得られ、ｎは高調波次数を示す。それに対して、θ軸に沿った共鳴の単純な解析表現は導き出すことができない。数値計算では、共鳴θＲの値がｎの増加と共に１から低下することが示されている。２波長変調を用いると、それ以降は
空間内のより高次で１ではなく２回の共鳴が観察され、
軸に関して対称又は逆対称関係となる。これらの共鳴の位置は
（
）ではより高い、及びより低い値に向かって、及びθについてはより低い値に向かって
から
へと対称にシフトする。どちらの変調照明についても、
から
に移行すると、共鳴ピークはますます非対称となり、そのバンド幅は
及びθ軸に沿って減少する。
蛍光に関して、
は基本的に
の共鳴を示すが、振幅はより低く、形状がわずかに変化する。
と対称的に、
空間内に１つ（λ２＝４０５ｎｍが変調された場合）又は２つ（λ１＝４８０ｎｍが変調された場合）の共鳴を示す。興味深いことに、λ１＝４８０ｎｍが変調された場合、
には消失振幅の線が１本あり、
には消失振幅の線が２本ある。最高ピークでは、ｎが増大すると、対応する濃度の項について観察される共鳴より、バンド幅のより顕著な低下が起こる。特に、この低下は
軸よりθ軸に沿って顕著である。
無次元の
空間は理論上の計算及び分析にとって適当であるが、これは、全ての可逆光スイッチ型種がこの空間内で同じ挙動を示すからである。しかしながら、分析又はイメージングの用途にとっては、照明制御パラメータ
のほうがより妥当である。実際に、このような空間では共鳴ピークの位置は種に依存し、そのため、異なる可逆光スイッチ型種の判別が可能となる。１波長照明の場合、適当なパラメータ空間は
となり、２波長照明の場合は
が使用されることが好ましい。
これについて、図３Ａ－３Ｆ、４Ａ－４Ｆ、５Ａ－５Ｆ、及び６Ａ－６Ｆを使って説明する。
図３Ａ－３Ｆは、
空間内で２波長照明が行われた可逆光スイッチ型蛍光タンパク質のドロンパ－２に関する異なる次数ｎ＝１，２、３、及び４での振動濃度及び蛍光強度成分のマップを示す（Ｋ１２
０，θ）空間内の
での２波長照明の特定のケースと考えることのできる１波長照明は、これらのマップでは考慮されていない）。ドロンパ－２は、青色光（４８０ｎｍ）により暗い状態に切り替わり、紫色光（４０５ｎｍ）により当初の明るい状態に戻り、この挙動は逆フォトクロミズムと呼ばれる。
より詳しくは：
－図３Ａは、λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の振動濃度成分
（ｎ＝１、３では“ｏｕｔ”：ｎ＝２、４では“ｉｎ”）のマップである。
－図３Ｂは、λ１＝４０５ｎｍ（変調）及びλ２＝４８０ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の振動濃度成分
（ｎ＝１、３では“ｏｕｔ”：ｎ＝２、４では“ｉｎ”）のマップである。
－図３Ｃは、λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の振動濃度成分
（ｎ＝１、３では“ｏｕｔ”：ｎ＝２、４では“ｉｎ”）のマップである。
－図３Ｄは、λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の振動蛍光強度成分
（ｎ＝１、３では“ｏｕｔ”：ｎ＝２では“ｉｎ”）のマップである。
－図３Ｅは、λ１＝４０５ｎｍ（変調）及びλ２＝４８０ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の振動蛍光強度成分
（ｎ＝１、３では“ｏｕｔ”：ｎ＝２では“ｉｎ”）のマップである。
－図３Ｆは、λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の振動蛍光強度成分
（ｎ＝１、３では“ｏｕｔ”：ｎ＝２では“ｉｎ”）のマップである。
－図３Ａは、λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の振動濃度成分
－図３Ｂは、λ１＝４０５ｎｍ（変調）及びλ２＝４８０ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の振動濃度成分
－図３Ｃは、λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の振動濃度成分
－図３Ｄは、λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の振動蛍光強度成分
－図３Ｅは、λ１＝４０５ｎｍ（変調）及びλ２＝４８０ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の振動蛍光強度成分
－図３Ｆは、λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の振動蛍光強度成分
強度は
（２５０Ｗ／ｃｍ２）に設定され、ドロンパ－２の光化学特性は次のパラメータにより表現される：σ１２，１＝１９６ｍ２・ｍｏｌ－１、σ２１，２＝４１３ｍ２・ｍｏｌ－１（λ１＝４８０ｎｍ、λ２＝４０５ｎｍの場合）。
ここでは
により、ｎ次の濃度振幅について証明された共鳴座標を示す。前述の挙動を証明するほかに、図は共鳴ピークの対角線方向へのシフトを明瞭に示している。１波長変調の場合、検討された光変調のどちらのケース（λ１＝４８０ｎｍ、λ２＝４０５ｎｍ）においても、振幅の次数ｎが
の対応する変化によって増大すると、共鳴はそれぞれ、
のより低い値へとシフトする。２波長変調の場合、振幅の次数ｎが
の対応する変化によって増大すると、共鳴はそれぞれ
のより高い、及びより低い値と
のより低い値へと２種類のシフトを示す。
上で展開した一般的理論では、２つの異なる限定的なケースにおける共鳴条件について、次の表現を特定できる
１．蛍光体の可逆光変換が波長λ１で駆動される（逆反応は熱により駆動される）。式（１４、（２２）、（２３）を使用すると、共鳴条件は：
となる。
及びωの両制御パラメータをここで、ｎ次の振幅の共鳴に固定する：
１．蛍光体の可逆光変換が波長λ１で駆動される（逆反応は熱により駆動される）。式（１４、（２２）、（２３）を使用すると、共鳴条件は：
特に、式（６７）、（６８）により、ｎ及びｍ次間の共鳴ピークのシフトを対数スケールで導出できる：
２．蛍光体の可逆光変換が２つの波長λ１及びλ２により駆動される。式（１４）、（１８）、（１９）を使用すると、共鳴条件は：
となる。
強度
が逆反応への熱の寄与を無視する条件を満たすと、制御パラメータ
及びωはどちらも、ｎ次の共鳴振幅を最適化するように固定される：
式（７３）、（７４）により、ｎ及びｍ次間の共鳴ピークのシフトを対数スケールで導出できる：
図４Ａ－４Ｆ、５Ａ－５Ｆ、６Ａ－６Ｆは、調査対象の８種類の可逆光スイッチ型蛍光タンパク質（ＲＳＦＰｓ）、ドロンパ、ドロンパ－２、ドロンパ－３、ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ、ｒｓＥＧＦＰ２、及びＰａｄｒｏｎに関する制御パラメータ中の振動濃度の振幅
と蛍光発光
の依存性を示す。ドロンパ、ドロンパ－３、ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ、ｒｓＥＧＦＰ２は、ドロンパ－２のように逆フォトクロミズムを示すが、Ｐａｄｒｏｎは正フォトクロミズムを示す（青色光により明るい状態に切り替わり、紫色光により暗い状態に戻る）。これらの種は全て、４０５ｎｍ及び４８０ｎｍの光を吸収し、分光的に同様の蛍光を放出するため、先行技術の方法では判別が難しい。図が乱雑になりすぎないようにするために、蛍光体の小グループごとのマップを別の図群に表示してある：ドロンパ、ドロンパ－２、ドロンパ－３、及びＰａｄｒｏｎは図４Ａ－４Ｆ、ドロンパ、ドロンパ－２、ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ、及びＰａｄｒｏｎは図５Ａ－５Ｆ、ドロンパ、ドンパ－２、ｒｓＥＧＦＰ２、及びドロンパは図６Ａ－６Ｆ。
より詳しくは：
－図４Ａ、５Ａ、及び６Ａは、波長λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の基本振動蛍光強度成分
のマップである。
－図４Ｂ、５Ｂ、及び６Ｂは、波長λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の基本振動蛍光強度成分
のマップである。
－図４Ｃ、５Ｃ、及び６Ｃは、波長λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の２次高調波蛍光強度成分
のマップである。
－図４Ｄ、５Ｄ、及び６Ｄは、波長λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の２次高調波蛍光強度成分
のマップである。
－図４Ｅ、５Ｅ、及び６Ｅは、波長λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の３次高調波蛍光強度成分
のマップである。
－図４Ｆ、５Ｆ、及び６Ｆは、波長λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の３次高調波蛍光強度成分
のマップである。
・共鳴条件（７３）、（７４）から予想されるように、ＲＳＦＰｓ共鳴の位置は制御パラメータの空間内で散乱しており、これは、ＲＳＦＰｓが異なる光化学パラメータ（例えば、光スイッチのための断面積）を示すからである。特筆すべき点として、λ１＝４８０ｎｍでの変調にかかわる共鳴座標は、λ２＝４０５ｎｍの変調の有無を問わず、λ２＝４０５ｎｍでの１波長変調に関連する座標とは異なる。λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調では、散乱がより顕著である。
・それに対して、
の値から推測されるように（式（７４）、（７６）参照）、制御パラメータの空間内の異なる次数ｎでの共鳴位置のシフトは、ＲＳＦＰｓでも、変調波長でも見られない。そのため、ＲＳＦＰの共鳴の相対位置は次数ｎにより変化しない。共鳴振幅のｎ依存性は
空間で同じである点に留意されたい。
・変調の全てのケースで、濃度振幅の共鳴バンド幅は１次から４次へとゆっくりと減少する。この効果は、λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調又は２波長変調について、３次から、より顕著となる。
・λ２＝４０５ｎｍでの１波長変調の場合の蛍光強度振幅の挙動は、濃度振幅と同様である。それに対して、バンド幅の減少は、λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調で次数が高くなるとより顕著となる。２次では、すでに１次よりＲＳＦＰ判別力が向上しており、マップでは３次以降が明らかとなる（例えば、ドロンパが際立っている）。２波長変調の場合、２次は１次より広いバンド幅を示すが、３次では１次よりＲＳＦＰ判別力が高くなる。しかしながら、全ての次数で、λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調により、２波長変調より高いＲＳＦＰ判別力がもたらされる。
・図は、λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調について、蛍光の３次振幅の共鳴重複の減少を４つのＲＳＦＰｓの判別に使用できることを明瞭に示している：ドロンパ、ドロンパ－２、ドロンパ－３又はｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ、及び他の３つに関して反対の符号の蛍光振幅を示すＰａｄｒｏｎ。
・光変調に対する蛍光発光の高次応答の利用は、異なるＲＳＦＰｓの判別にとって好ましい。しかしながら、ｎ次応答の振幅はｎと共に減少するため、バンド幅（より高次になるとよりよく判別できる）と振幅（より低次になるとより高い振幅を示す）との間の妥協点を見つけなければならない。
・ＯＰＩＯＭ及びＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭで使用される基本成分とは異なり、高調波成分は応答ピークのほかにゼロ振幅線を示し、それによって特定の次数でのＲＳＦＰの寄与を選択的に「オフにする」ことができる。したがって、２つの種を判別するために、ユーザには、一方の種からの寄与を最大化する、他方の種からの寄与を消失させる、又はダイナミックコントラストを最大にするのに適した妥協点を見つける、という選択肢がある。幾つかの振動（基本及び高調波）の寄与を同時に検出に使用し得る。幾つかの可逆光スイッチ型種は、例えば検出対象となる異なる種の共鳴等、異なる照明条件での幾つかの測定を行うことにより判別され得る。
・どのオブザーバブルが使用されるかを問わず、信号は検出された種の濃度に比例する。これは欠点である可能性があるが、なぜなら優占種のオフ共鳴（ｏｕｔ－ｏｆ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）信号が検出対象の、より少量の種の共鳴信号を干渉し得るからである。しかしながら、前述のようにゼロ振幅線が存在することから、適当な照明パラメータを選択することによって干渉信号を「オフにする」ことができる。さらに、これにより、可逆光スイッチ型種の絶対又は相対濃度を異なる照明条件で行われた幾つかの測定から推定することが可能となる。例えば、これは訓練用の既知の組成のサンプルを使用する機械学習（例えば、ニューラルネットワーク、回帰分析等）、又はアンミキシングアルゴリズムにより実行できる。
－図４Ａ、５Ａ、及び６Ａは、波長λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の基本振動蛍光強度成分
－図４Ｂ、５Ｂ、及び６Ｂは、波長λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の基本振動蛍光強度成分
－図４Ｃ、５Ｃ、及び６Ｃは、波長λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の２次高調波蛍光強度成分
－図４Ｄ、５Ｄ、及び６Ｄは、波長λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の２次高調波蛍光強度成分
－図４Ｅ、５Ｅ、及び６Ｅは、波長λ１＝４８０ｎｍ（変調）及びλ２＝４０５ｎｍ（一定強度）での１波長変調の場合の３次高調波蛍光強度成分
－図４Ｆ、５Ｆ、及び６Ｆは、波長λ１＝４８０ｎｍ及びλ２＝４０５ｎｍでの２波長変調の場合の３次高調波蛍光強度成分
・共鳴条件（７３）、（７４）から予想されるように、ＲＳＦＰｓ共鳴の位置は制御パラメータの空間内で散乱しており、これは、ＲＳＦＰｓが異なる光化学パラメータ（例えば、光スイッチのための断面積）を示すからである。特筆すべき点として、λ１＝４８０ｎｍでの変調にかかわる共鳴座標は、λ２＝４０５ｎｍの変調の有無を問わず、λ２＝４０５ｎｍでの１波長変調に関連する座標とは異なる。λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調では、散乱がより顕著である。
・それに対して、
・変調の全てのケースで、濃度振幅の共鳴バンド幅は１次から４次へとゆっくりと減少する。この効果は、λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調又は２波長変調について、３次から、より顕著となる。
・λ２＝４０５ｎｍでの１波長変調の場合の蛍光強度振幅の挙動は、濃度振幅と同様である。それに対して、バンド幅の減少は、λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調で次数が高くなるとより顕著となる。２次では、すでに１次よりＲＳＦＰ判別力が向上しており、マップでは３次以降が明らかとなる（例えば、ドロンパが際立っている）。２波長変調の場合、２次は１次より広いバンド幅を示すが、３次では１次よりＲＳＦＰ判別力が高くなる。しかしながら、全ての次数で、λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調により、２波長変調より高いＲＳＦＰ判別力がもたらされる。
・図は、λ１＝４８０ｎｍでの１波長変調について、蛍光の３次振幅の共鳴重複の減少を４つのＲＳＦＰｓの判別に使用できることを明瞭に示している：ドロンパ、ドロンパ－２、ドロンパ－３又はｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ、及び他の３つに関して反対の符号の蛍光振幅を示すＰａｄｒｏｎ。
・光変調に対する蛍光発光の高次応答の利用は、異なるＲＳＦＰｓの判別にとって好ましい。しかしながら、ｎ次応答の振幅はｎと共に減少するため、バンド幅（より高次になるとよりよく判別できる）と振幅（より低次になるとより高い振幅を示す）との間の妥協点を見つけなければならない。
・ＯＰＩＯＭ及びＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭで使用される基本成分とは異なり、高調波成分は応答ピークのほかにゼロ振幅線を示し、それによって特定の次数でのＲＳＦＰの寄与を選択的に「オフにする」ことができる。したがって、２つの種を判別するために、ユーザには、一方の種からの寄与を最大化する、他方の種からの寄与を消失させる、又はダイナミックコントラストを最大にするのに適した妥協点を見つける、という選択肢がある。幾つかの振動（基本及び高調波）の寄与を同時に検出に使用し得る。幾つかの可逆光スイッチ型種は、例えば検出対象となる異なる種の共鳴等、異なる照明条件での幾つかの測定を行うことにより判別され得る。
・どのオブザーバブルが使用されるかを問わず、信号は検出された種の濃度に比例する。これは欠点である可能性があるが、なぜなら優占種のオフ共鳴（ｏｕｔ－ｏｆ－ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）信号が検出対象の、より少量の種の共鳴信号を干渉し得るからである。しかしながら、前述のようにゼロ振幅線が存在することから、適当な照明パラメータを選択することによって干渉信号を「オフにする」ことができる。さらに、これにより、可逆光スイッチ型種の絶対又は相対濃度を異なる照明条件で行われた幾つかの測定から推定することが可能となる。例えば、これは訓練用の既知の組成のサンプルを使用する機械学習（例えば、ニューラルネットワーク、回帰分析等）、又はアンミキシングアルゴリズムにより実行できる。
図７Ａ－７Ｉは、落射蛍光顕微鏡に応用された本発明の方法の判別力を示している。
マイクロ流体デバイスの４つのチャンバにそれぞれドロンパ、ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ、ドロンパ－２、及びＥＧＦＰの溶液を充填した：図ではチャンバはそれぞれＤ、ＦＬ、Ｄ２、及びＥと表示されている。ドロンパ、ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ及びドロンパ－２は分光的に類似したＲＳＦＰｓであり、本発明者らはＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭを使用してこれらを判別することができず、ＥＧＦＰは分光的に類似しているが光化学的に活性でない蛍光体である。マイクロ流体デバイスをλ１＝４８０ｎｍの正弦波変調光及びλ２＝４０５ｎｍの一定光を使い、３つのＲＳＦＰｓのための共鳴条件で照明した。より具体的には：
－図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、ドロンパ（図７Ａ）、ドロンパ－２（図７Ｂ）、及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ（図７Ｃ）の、共鳴条件での蛍光強度の直交基本成分
を抽出することによって得られた画像を示す。ドロンパ－２の共鳴で記録された画像は他の２つのＲＳＦＰｓの干渉的な寄与をほとんど排除できるものの、ドロンパ及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅの共鳴で記録された画像はそれぞれｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ及びドロンパ－２からの強い干渉を受けている。実際、このような結果は図５Ａから予測されていたものであり、同図は
がこれら３つのＲＳＦＰｓについて大きく重複していることを示している。したがって、１次成分のみを使用すること（すなわちＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭ）はこれら３つのＲＳＦＰｓを判別するのに適していない。
－図７Ｄ、７Ｅ、及び７Ｆは、ドロンパ（図７Ｄ）、ドロンパ－２（図７Ｅ）、及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ（図７Ｆ）の、共鳴条件での蛍光強度の２次同相成分
を抽出することによって得られた画像を示す。ＥＧＦＰ信号はここでも全ての画像から効率的に除去されており、最も重要な点として、３つのＲＳＦＰｓをそれらのそれぞれの共鳴で選択的に標的にできることがわかる。共鳴バンド幅の低下のほかに、この実現はおそらく、２次高調波成分の判別マップ（図７Ｃ参照）で観察される０ラインから得られると推定できる。実際、ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ及びドロンパ－２の０ラインはそれぞれ、ドロンパ及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅの共鳴を通る。したがって、ドロンパ及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅの共鳴での２次高調波成分の画像は、１次の寄与を使って観察されるそれそぞれｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ及びドロンパ－２との干渉を排除する。
－図７Ｇ、７Ｈ、及び７Ｉは、ドロンパ（図７Ｇ）、ドロンパ－２（図７Ｈ）、及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ（図７Ｉ）の、共鳴条件での蛍光強度の３次直交成分
を抽出することによって得られた画像を示す。理論上のマップ、２次成分について得られたものとよく似た挙動を示唆しているが、信号対ノイズ比が低すぎて、何れの明確な結論にも到達し得ないことがわかった。
－図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、ドロンパ（図７Ａ）、ドロンパ－２（図７Ｂ）、及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ（図７Ｃ）の、共鳴条件での蛍光強度の直交基本成分
－図７Ｄ、７Ｅ、及び７Ｆは、ドロンパ（図７Ｄ）、ドロンパ－２（図７Ｅ）、及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ（図７Ｆ）の、共鳴条件での蛍光強度の２次同相成分
－図７Ｇ、７Ｈ、及び７Ｉは、ドロンパ（図７Ｇ）、ドロンパ－２（図７Ｈ）、及びｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ（図７Ｉ）の、共鳴条件での蛍光強度の３次直交成分
可逆光スイッチ型種には、変調照明（Ｉ１、Ｉ２）の空間プロファイルが均一でない場合、目立った光スイッチ運動特性があるため、特定の高調波（又は基本波）の寄与に関する共鳴条件は限定的な位置でしか満たすことができず、それによって蛍光寄与がオフ共鳴領域から除去される。そのため、本発明の方法には固有のオプティカルセクショニング特性が備わっている。図８のプロットは、サンプルの厚さによる空間積分信号強度の変化を示す（三角は平均強度、四角は１次直交成分、円盤は２次同相寄与に対応する）。１５μｍを超えると、１次及び２次成分は平坦域に到達し、それらの応答がサンプルの空間的に限定された部分から発することを示していることがわかる。それに対して、平均蛍光強度は引き続き、サンプルの厚さと共に（劣線形ではあるが）増大する。
本発明の方法のセクショニング能力は、例えば生物学におけるイメージング応用に非常に有益であり得ることが容易に理解されるであろう。
図９は、本発明のある実施形態による、本発明を実行するための装置のブロック図及び光学レイアウトを示す。この装置は、落射蛍光顕微鏡に基づく。
装置には、焦点面周辺に大きいフォーカルフィールドを生成するために、励起源として、中心が４８０ｎｍのＬＳ１と中心が４０５ｎｍのＬＳ２の２色のＬＥＤｓが組み込まれている。光フィルタＯＦ１、ＯＦ２は、生成された光のスペクトル幅を縮小するために使用される。各ＬＥＤは図示されていないＬＥＤドライバ（ＤＣ ４１０４，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ，ＵＳ）によりトリガされる。すると、ＬＥＤドライバは波長発生器ＷＦＧにより制御され、それによって所望の強度変調（複数の場合もある）が導入される。
各光源からの光はまず、レンズＬ１（ＡＣ２５４－２００－Ａ，ｆ＝２００ｍｍ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ，ＵＳ）によりコリメートされ、その後、２つのレンズ（Ｌ２：ＬＡ１１３４－Ａ，ｆ＝６０ｍｍ、Ｌ３：ＬＣ２６７９－Ａ，ｆ＝－３０ｍｍ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ）からなる擬似アフォーカルシステムによりビーム径が縮小される。縮小された径のビームはダイクロイックミラー（Ｔ４２５ＬＰＸＲ，Ｃｈｒｏｍａ，Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ，ＶＴ）により合波されて、収束レンズＬ４（ＬＡ１１３１－Ａ，ｆ＝５０ｍｍ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ，ＵＳ）により合焦される。Ｌ４の焦点面は対物レンズ（ＵＰＬＳＡＰＯ６０ＸＷ，６０×，ＮＡ １．２、オリンパス株式会社、東京、日本）の焦点面と、チューブレンズシステムＬ５及びＬ６（ＡＣ２５４－２００－Ａ，ｆ＝２００ｍｍ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ，ＵＳ）を利用して共役とされる。対物レンズはチューブレンズＬ５及びＬ６と共に全体として１００：３の倍率を実現し、サンプルに１５μｍの照明エリアが形成される。Ｌ４の後の結像面の位置は、素子Ｌ３を光軸に沿って前後にわずかに移動させることによって有効に変化させることができ、それによって各波長を別々に対物レンズの焦点面からデフォーカスすることが可能となる。ソフトウェアのシミュレーションによれば、素子Ｌ３を１ｍｍ移動させると、対物レンズの焦点面で４μｍのデフォーカスが実現する。サンプルからの蛍光信号は、他のダイクロイックミラー（Ｔ５０５ＬＰＸＲ，Ｃｈｒｏｍａ，Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ，ＶＴ）により励起光から分離され、その後、光検出器の役割を果たすＣＣＤカメラ ＣＡＭ（Ｌｕｃａ－Ｒ Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｌｆａｓｔ，ＵＫ）により記録される。
コンピュータＤＰＤ等のテータ処理装置は、波形生成の動作を制御して所望の照明条件を特定する。さらに、コンピュータはカメラにより生成された、蛍光強度を表す信号を受信して処理し、それらをサンプルＳ中の可逆光スイッチ型種を検出するために使用される振動成分を抽出することによって処理する。
多くの用途において、走査型顕微鏡の使用は、図９に示されるようなワイドフィールド顕微鏡の使用より好ましい場合があり得る。しかしながら、走査型顕微鏡では照明は基本的に不連続的（パルス式）であるが、本発明では連続的な、好ましくは正弦波変調（又は少なくとも、デューティサイクル約０．５の方形波変調）が必要となる。しかしながら、それでも照明が正弦波であると考えることのできるような実験的条件を定義することが可能である。そこで、時間ｔｃをピクセル上の光パルスの持続時間、ｔｄを２つのパルス間の時間と定義する。期間ｔｃ＋ｔｄが０～１で変化する方形波は、
ただし、Ω＝２π／（ｔｃ＋ｔｄ）は基本角周波数
によりフーリエ級数に分解される。
ここでは波長λｉ、ｉ＝１，２での照明を選択し、これは、方形波Ｒ（ｔ）と平均値
の周囲で振動する角周波数ωの正弦波包絡線との積により
でモデル化され、ただし、αは振動の振幅である。Ω＝ｋω、ただしｋは整数、と定めることにより、
が得られる。
によりフーリエ級数に分解される。
ここでは波長λｉ、ｉ＝１，２での照明を選択し、これは、方形波Ｒ（ｔ）と平均値
基本周波数の
での所望の項
は、ｋが十分に大きいかぎり、ｎ＝１について得られた１次高調波により汚染されない。本発明の方法を走査型顕微鏡に適応させるためには、Ω＞＞ω（より正確には≧１０ω）である必要があり、Ωはピクセル上の連続走査の周波数であり、ωは照明の正弦波包絡線の周波数である。
図１０は、本発明を実行するのに適したパルス強度プロファイルを示す。
この結果は、１波長又は２波長のどちらの光変調についても有効である。ピクセルにより認識される平均光強度は
である。広角照明のために得られる濃度及び蛍光振幅の理論上の計算は、平均光強度に関する
のこの定義を用いれば有効である。
それに加えて、走査型顕微鏡により届けられる光強度はワイドフィールド顕微鏡より強力である。条件
、ただし
は光強度に依存、により、キネティクスが確実に、２状態モデルにより説明されるように、光化学により正確に制御されることになる。さらに、２状態モデルでは無視される熱ステップは、高速のタイムスケールτΔでは発生する。熱ステップが２つのパルス間で緩和できる余裕を持たせるためには、時間ｔｄはτΔより大きくなければならない。
変調を開始する前に、変調中に用いられる平均光強度
に関連する所望の定常状態となるようにシステムを準備しなければならない。準備には、
の持続時間の２つの波長での一連のパルスが含まれ、これによって平均光強度について、１及び２の断片のみがｔｃ中に反応するように条件が付けられる。パルスは、熱ステップが２つのパルス間で緩和するためにτΔより長い時間ｔｄで分離されなければならない。パルスの数ｐは、定常状態に到達するために
となる。準備中に変調を重ねる場合も同じ効果を有し、実験全体を通じて同じプロトコルを保持するという利点がある。この場合、所望の定常状態にシステムを準備するには、少なくとも最初のｐ個のパルスが必要である。
図１１は走査型顕微鏡ＳＭを概略的に示しており、これはコンピュータＤＰＤ等のデータ処理装置に連結されており、それが光強度プロファイルを制御し、収集された光強度を表す信号を、サンプルＳ中の可逆光スイッチ型種を検出するために使用される振動成分を抽出することによって処理する。
本発明は、サンプル観察のための顕微鏡－走査型でもワイドフィールドでも－のケースに限定されない。例えば、サンプル顕微鏡ＳＭはより一般的な走査型光学機器に置き換えられ得る。例えば、国際公開第２０１５／０７５２０９号パンフレットには、ＯＰＩＯＭ方法を実行するのに適した巨視的走査型イメージング装置が記載されており、これはレーザビームの強度を変調するための電気光学変調器と、離れた標的、例えば研削面エリアを変調ビームで走査するための１対の操作可能ミラーを含む。サンプルは少なくとも１つの可逆光スイッチ型蛍光種を含んでいると仮定され、その蛍光発光はカメラの対物レンズにより離れた場所で収集される。この装置は、本発明の方法の実装に容易に適用できる。
ここまで、共鳴検出、すなわち照明強度及び角周波数がオブザーバブルの少なくとも１つの振動成分の共鳴条件とマッチするように選択されるケースのみを考えてきた。しかしながら、光変調に対する蛍光応答のフーリエ分解の振幅は、ある共鳴光スイッチ型種のキネティックフットプリントを構成し、共鳴条件から離れて消失する振幅もまた、良好な判別特性を提供する。
各共鳴光スイッチ型種について、２つの実験条件群が使用される。λ１＝４８０ｎｍでの変調の場合、１次振幅
は１つの共鳴Ｒ１を示し、２次振幅
はＲ１に近い共鳴と、より弱い振幅の別の共鳴Ｒ２を有する。実験により、それぞれ共鳴条件Ｒ１及びＲ２で評価される、位相のずれた１次振幅
と、同相の２次振幅
が得られる。
非共鳴項
により振幅を調整することにより、濃度、輝度、及び対物レンズの集光係数（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）へのそれらの依存性を排除することを選択した。この研究では、キネティックフットプリントは（ｌ１，ｌ２，ｌ３）の集合に縮小され、これは３次元空間では
であるが、より高次の振幅が検出可能であれば、ｍ次元空間へと一般化できる。あるＲＳＦ ｉについて実行された理論上の計算又は実験により、基準キネティックフットプリント｛ｌｋｉ｝が求められ、ｋ＝１，．．．，ｍである。未知の共鳴光スイッチ型種ｊのキネティックフットプリント｛ｌｋｊ｝は、距離：
を使って基準ｉと比較される。
２つの共鳴光スイッチ型種間の判別は、それらの距離が、キネティックフットプリント｛ｌｋｉ｝に関する不確実性Δｌｋｉにより誘導される、距離ｄｊｉに関する実験の正確さΔｄｊｉにより適用されるカットオフ距離ｄｃより大きければ可能となる。式（７９）を微分すると、
が求められる。
キネティックフットプリント｛ｌｋｉ｝の特定にあたり最大不確実性Ｍ＝ｍａｘｋ，ｉ（Δｌｋｉ）を導入し、Δ｜ｌｋｉ－ｌｋｊ｜≦２Ｍを得る。したがって、式（８０）は
Δｄｊｉ≦２ＭＸ （８１）
となり、
である。｜ｌｋｉ－ｌｋｊ｜の数値に関係なく、不等式：
が守られ、その結果、
となる。式（８１）を用いると、Δｄｉｊ≦ｄｃが求められ、カットオフ距離は
となる。
２つの共鳴光スイッチ型種間の判別は、それらの距離が、キネティックフットプリント｛ｌｋｉ｝に関する不確実性Δｌｋｉにより誘導される、距離ｄｊｉに関する実験の正確さΔｄｊｉにより適用されるカットオフ距離ｄｃより大きければ可能となる。式（７９）を微分すると、
キネティックフットプリント｛ｌｋｉ｝の特定にあたり最大不確実性Ｍ＝ｍａｘｋ，ｉ（Δｌｋｉ）を導入し、Δ｜ｌｋｉ－ｌｋｊ｜≦２Ｍを得る。したがって、式（８０）は
Δｄｊｉ≦２ＭＸ （８１）
となり、
２つの共鳴光スイッチ型種間のカットオフ距離は２つのパラメータ、すなわち判別次元数ｍとキネティックフットプリントの特定に関する不確実性Ｍに依存する。画像化されたＲＳＦ ｉは、距離ｄｊｉがｄｃより小さければ、共鳴光スイッチ型種ｊとして認識される。
式（７９）は一例にすぎず、判別距離は別の方法でも定義され得る。
共鳴検出と同様に、複数の共鳴以外の測定値も、好ましくは機械学習アルゴリズムと共に、可逆光スイッチ型種の絶対又は相対濃度を、異なる照明条件で行われた幾つかの測定から推定するために使用され得る。
本発明を幾つかの例に関して説明したが、これらは限定的ではない。様々な実施形態が可能であり、例えば、２より多い波長での照明が使用され得て、複数の波長での光が変調されると、異なる波長は異なる変調周波数に対応し、及び／又は異なる位相関係を有し得る。
本発明は特に、測定信号の高調波成分（すなわち、角周波数ｎ・ωを有する成分であり、ｎは１より大きい整数、ωは照明光の「基本」変調周波数）を、単独で、又はその信号の基本成分と共に使用する複数の方法に関する。しかしながら、前述の実施形態の全てにおいて、高調波成分を用いずに、信号の位相のずれた基本成分のみを使用することも可能である。この場合、照明光のオン－オフ変調の使用が好まれ得る。
これは、図１０及び１１に関して前述したように、パルス照明の場合、より詳しくは走査型顕微鏡、より一般的には走査型光学装置の場合に特に興味深い。
したがって、本願では、サンプル中の可逆光スイッチ型化学種の検出方法が開示され、これは：
ａ）サンプルを、化学種により吸収されるのに適した第一の波長の第一の光で照明して、化学種の少なくとも１つの光特性に影響を与える反応をトリガするステップであって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調されるステップと、
ｂ）化学種の光特性の変化を測定するステップと、
ｃ）前記変化を表す信号の、基本変調周波数の周波数の直交成分を抽出するステップと、
ｄ）抽出された成分を使って化学種を検出するステップと、
を含み、
光は、基本変調周波数の倍数であり、少なくともそれより１０倍大きい繰返し周波数のパルストレインを乗じた基本変調周波数の正弦波により変調される。
ａ）サンプルを、化学種により吸収されるのに適した第一の波長の第一の光で照明して、化学種の少なくとも１つの光特性に影響を与える反応をトリガするステップであって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調されるステップと、
ｂ）化学種の光特性の変化を測定するステップと、
ｃ）前記変化を表す信号の、基本変調周波数の周波数の直交成分を抽出するステップと、
ｄ）抽出された成分を使って化学種を検出するステップと、
を含み、
光は、基本変調周波数の倍数であり、少なくともそれより１０倍大きい繰返し周波数のパルストレインを乗じた基本変調周波数の正弦波により変調される。
このような方法の別の有利な実施形態によれば、
－光の平均強度と基本変調周波数は、前記抽出成分の振幅を最大にするように選択され得る。
－ステップａ）は、サンプルを第一の波長とは異なり、化学種により吸収されるのに適した第二の波長の第二の光で照明し、化学種の前記光特性に影響を与える前記又は他の反応をトリガするステップをさらに含み得て、前記第二の光は一定の強度か、第一の光と反対の位相の基本変調周波数で（又は、基本変調周波数で、第一の光と反対の位相の、基本変調周波数の倍数であり、少なくともそれより１０倍大きい繰返し周波数のパルストレインを乗じた正弦波により）変調されるかの何れかである。この場合、第一及び第二の光の平均強度と基本変調周波数の比は好ましくは、前記又は少なくとも１つの前記抽出成分の振幅を最大にするように選択される。
－ステップａ）、ｂ）、及びｃ）は、１つ若しくは複数の光強度の、及び基本変調周波数の異なる値に対応する異なる照明条件について複数回繰り返され得て、ステップｄ）はすると、前記異なる照明条件に対応する複数の信号成分を使って複数の化学種間を判別するステップを含み得る。
－前記化学種の絶対又は相対濃度を推定するために、機械学習又はアンミキシング方法が前記複数の信号成分に適応され得る。
－光の平均強度と基本変調周波数は、前記抽出成分の振幅を最大にするように選択され得る。
－ステップａ）は、サンプルを第一の波長とは異なり、化学種により吸収されるのに適した第二の波長の第二の光で照明し、化学種の前記光特性に影響を与える前記又は他の反応をトリガするステップをさらに含み得て、前記第二の光は一定の強度か、第一の光と反対の位相の基本変調周波数で（又は、基本変調周波数で、第一の光と反対の位相の、基本変調周波数の倍数であり、少なくともそれより１０倍大きい繰返し周波数のパルストレインを乗じた正弦波により）変調されるかの何れかである。この場合、第一及び第二の光の平均強度と基本変調周波数の比は好ましくは、前記又は少なくとも１つの前記抽出成分の振幅を最大にするように選択される。
－ステップａ）、ｂ）、及びｃ）は、１つ若しくは複数の光強度の、及び基本変調周波数の異なる値に対応する異なる照明条件について複数回繰り返され得て、ステップｄ）はすると、前記異なる照明条件に対応する複数の信号成分を使って複数の化学種間を判別するステップを含み得る。
－前記化学種の絶対又は相対濃度を推定するために、機械学習又はアンミキシング方法が前記複数の信号成分に適応され得る。
参考文献
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［Ｊｅｎｋｉｎｓ ２０１５］ Ｐ．Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｎａｉｖａｒ，ａｎｄ Ｊ．Ｐ．Ｈｏｕｓｔｏｎ．Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ ｉｎ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｍｕｌｔｉ－ｈａｒｍｏｎｉｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ２０１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８（１１－１２）：９０８－９１７．
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［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１５］ Ｊ．Ｑｕｅｒａｒｄ，Ｔ．－Ｚ．Ｍａｒｋｕｓ，Ｍ．－Ａ．Ｐｌａｍｏｎｔ，Ｃ．Ｇａｕｒｏｎ，Ｐ．Ｗａｎｇ，Ａ．Ｅｓｐａｇｎｅ，Ｍ．Ｖｏｌｏｖｉｔｃｈ，Ｓ．Ｖｒｉｚ，Ｖ．Ｃｒｏｑｕｅｔｔｅ，Ａ．Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｔ．Ｌｅ Ｓａｕｘ，ａｎｄ Ｌ．Ｊｕｌｌｉｅｎ．Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｓｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｄｄ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，１２７：２６７１－２６７５，２０１５．
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［Ｒｏｗｅ ２００２］Ｈ．Ｍ．Ｒｏｗｅ，Ｓ．Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｊ．Ｎ．Ｄｅｍａｓ，ａｎｄ Ｂ．Ａ．ＤｅＧｒａｆｆ．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ ｉｎ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇａｔｅｄ－Ｐｈａｓｅ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４ ，４８２１－４８２７．
［Ｊｅｎｋｉｎｓ ２０１５］ Ｐ．Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｎａｉｖａｒ，ａｎｄ Ｊ．Ｐ．Ｈｏｕｓｔｏｎ．Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ ｉｎ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｍｕｌｔｉ－ｈａｒｍｏｎｉｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ２０１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８（１１－１２）：９０８－９１７．
Claims (15)
- サンプル中の可逆光スイッチ型化学種を検出する方法において：
ａ）前記サンプル（Ｓ）を、前記化学種により吸収されるのに適した第一の波長の第一の光で照明して、前記化学種の少なくとも１つの光特性に影響を与える反応をトリガするステップであって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調されるステップと、
ｂ）前記化学種の前記光特性の変化を測定するステップと、
を含み、
ｃ）前記変化を表す信号の、
－前記基本変調周波数の、ゼロではない、偶数倍である周波数の同相成分と、
－前記基本変調周波数自体より大きい、前記基本変調周波数の奇数倍である周波数の直交成分
の少なくとも一方を抽出するステップと、
ｄ）前記抽出された１つ又は複数の成分を使用して前記化学種を検出するステップと、
をさらに含むことを特徴とする方法。 - 前記光の平均強度と前記基本変調周波数は：
－前記又は少なくとも１つの前記抽出成分の振幅を最大にするか、
－又は、前記サンプル中の異なる化学種からの、前記、若しくは少なくとも１つの前記抽出成分の周波数の干渉信号を最小にする
ように選択される、請求項１に記載の方法。 - ステップａ）は、前記サンプルを、前記第一の波長とは異なる、前記化学種により吸収されるのに適した第二の波長の第二の光で照明し、前記化学種の前記光特性に影響を与える前記、又は他の反応をトリガするステップであって、前記第二の光は一定の強度を有するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- ステップａ）は、前記サンプルを、前記第一の波長とは異なる、前記化学種により吸収されるのに適した第二の波長の第二の光で照明し、前記化学種の前記光特性に影響を与える前記、又は異なる反応をトリガするステップであって、前記第二の光は前記第一の光と反対の位相の前記基本変調周波数で周期変調されるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記第一及び第二の光の平均強度と前記基本変調周波数の比は：
－前記、若しくは少なくとも１つの前記抽出成分の振幅を最大にするか、
－又は、前記サンプル中の異なる化学種からの、前記、若しくは少なくとも１つの前記抽出成分の周波数の干渉信号を最小にする
ように選択される、請求項３又は４に記載の方法。 - ステップａ）、ｂ）、及びｃ）は、前記１つ若しくは複数の光強度の、及び前記基本変調周波数の異なる値に対応する異なる照明条件について複数回繰り返され、ステップｄ）は、前記異なる照明条件に対応する複数の信号成分を使って複数の化学種間を判別するステップを含む、請求項１、３、及び４の何れか１項に記載の方法。
- ステップｄ）は、機械学習又はアンミキシング方法を、前記化学種の絶対又は相対濃度を推定するために前記複数の信号成分に適応するステップを含む、請求項６に記載の方法。
- 光は前記基本変調周波数で正弦的に変調される、請求項１～７の何れか１項に記載の方法。
- 光は、前記基本変調周波数の倍数で、それより少なくとも１０倍大きい繰返し周波数のパルストレインを乗じた前記基本変調周波数の正弦波により変調される、請求項１～７の何れか１項に記載の方法。
- ステップａ）及びｂ）は光走査型顕微鏡により実行される、請求項９に記載の方法。
- 前記化学種は蛍光であり、その変化が測定される前記光特性は蛍光発光の強度である、請求項１～１０の何れか１項に記載の方法。
- 請求項１～１１の何れか１項に記載の方法を実行するための装置において：
－サンプルを第一の波長の第一の光で照明するように構成された少なくとも第一の制御光源（ＬＳ１）であって、前記第一の光は基本変調周波数で周期変調される第一の制御光源と、
－前記サンプルの光特性の変化を測定するように構成された光検出器（ＣＡＭ）と、
－データ処理装置（ＤＰＤ）と、
を含み、
前記データ処理装置は、前記変化を表す信号の、前記基本変調周波数の、ゼロではない偶数倍である周波数の同相成分と、前記基本変調周波数の、前記基本変調周波数自体より大きい奇数倍である周波数の直交成分のうちの少なくとも一方を抽出し、前記抽出された１つ又は複数の成分を使って前記サンプル中の化学種を検出するように構成されることを特徴とする装置。 - 前記サンプルを、前記第一の波長とは異なる第二の波長の第二の光で照明するように構成された第二の制御光源（ＬＳ２）をさらに含み、前記第二の光は一定の強度を有する、請求項１２に記載の装置。
- 前記サンプルを、前記第一の波長とは異なる第二の波長の第二の光で照明するように構成された第二の制御光源（ＬＳ２）をさらに含み、前記第二の光は、前記第一の光と反対の位相の前記基本変調周波数で周期変調される、請求項１２に記載の装置。
- 前記サンプルを照明するための走査装置をさらに含む、請求項１２～１４の何れか１項に記載の装置。
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