JP2023503259A - アデノ随伴ウイルスの増強された生産のための高密度細胞呼吸器を含むバイオプロダクトの生産のためのシステム、デバイスおよび方法 - Google Patents
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Abstract
微生物を培養し、細胞を高密度で増殖させるための細胞培養装置が提供される。本装置は、細胞配置のためにメンブレンの第1の側に複数の表面特徴部を含むメンブレンを含む。表面特徴部は、細胞を配置することができる1つ以上の区画を含む。メンブレンは、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む。メンブレンの第2の側は、ガス領域を画定する。メンブレンの第2の側は、メンブレンによってメンブレンの第1の側から分離されている。本装置は、培地を受容するための培地領域をさらに含む。区画は、区画内の1つ以上の細胞に対する培地流剪断力を少なくとも部分的に低減するように構成されている。表面特徴部は、隆起、突起、フィン、ウェル、および/またはポストであり得る。
Description
優先権
本出願は、2019年11月15日に出願された「HIGH DENSITY CELL RESPIRATOR FOR PRODUCTION OF BIOPRODUCT」と題する米国仮特許出願第62/936,308号に対する優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年11月15日に出願された「HIGH DENSITY CELL RESPIRATOR FOR PRODUCTION OF BIOPRODUCT」と題する米国仮特許出願第62/936,308号に対する優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示された技術の実施形態は、概して、微生物、組織および細胞を含むバイオプロダクトを生産、培養および/または増殖させるための呼吸器を含むシステム、デバイスおよび方法に関する。一部の例示的な実施形態では、呼吸器は高密度細胞呼吸器(HDCR)である。HDCRは、バイオリアクターであり得る。HDCRバイオリアクターを含む、本開示のシステム、デバイスおよび方法は、アデノ随伴ウイルス(AAV)、腫瘍溶解性ウイルス、および他の形態の細胞ベースの生産を含む広範な種々の生体物質の増強された生産のための有効なプラットフォームである。HDCRシステム、デバイスおよび方法は、AAVのような治療に関連する、時として法外に高い商品コストを引き下げ、過剰な現金支出なしに、より多くの必要な個人がかかる治療をより広く利用できるようにするものである。
遺伝子治療では、バイオプロダクトの生産をスケールアップするために、非効率的な細胞工場および撹拌タンクリアクター(STR)が採用されている。しかしながら、文献において繰り返し指摘されているように、全身治療用のAAVの需要は、STRの生産能力を大きく上回っている。
多くの疾患の遺伝的基盤が解明されるにつれて、遺伝子導入および遺伝子編集による治療の可能性が臨床的に現実になりつつある。これらの新しい治療の多くは、ウイルスベクターに依存する。開発された細胞ベースのベクター生産は、生産能力が頭打ちになった従来の組織培養技術に依存している。これらの用途に必要なウイルス粒子の量は多く、現在の製造方法では効率が悪いため、これらの医薬品のコストは驚くほど高くなっている。
コストおよび生産時間は、フェーズIおよびII段階での有望なアプローチの臨床研究に対する最大の障壁の1つである。コストが高いのは、治験に必要とされるウイルスベクターの量が、1兆個の細胞スケール(1012個の細胞スケール)での細胞培養を必要とするためである。既存の開発技術では、早期治験に十分なベクターの製造には9~12ヶ月かかる場合があり、既存の製造施設はすでに最大生産能力に近い状態である。ベクターの生産から治験までの待ち時間は2~3年であり、革命的な治療法の試験および臨床応用を遅らせている。
高いコストおよび生産における長い待ち時間が、苦痛を和らげ、生命を維持する可能性のある破壊的な治療法の実現を遅らせている。有望なアプローチの中には、多大な金銭的障害のために完全に放棄されるものもあり得る。
研究開発および前臨床段階であっても、ベクターの開発には、10億個の細胞スケール(109個の細胞スケール)での細胞培養が必要となる。現状では、数十本のフラスコまたはペトリ皿の管理は面倒なものであり、作業者の貴重な時間および限られたインキュベータ空間を占有している。
より多くの取り組みを並行して進めるために、培地効率に優れ、コンパクトで確実にウイルスを生産できる新しい培養系が求められている。何百というウイルスの候補をスクリーニングして、その中から進めるべきものが見出されることが多いため、スクリーニングを容易にし、研究機関の余力を拡大し、人類の治療法開発を加速させる新しい技術の必要性も生じている。
ワクチンの生産は、ヒト公衆衛生における大きな進歩であった。最も重要かつ一般的なヒト病原体についての定期接種は、インフルエンザ、ポリオ、はしかを含む多くの疾患の制御、および痘瘡を含む一部の破壊的な疾患の根絶をもたらした。インフルエンザなどの季節性および変異性ウイルスに対する予防接種では、毎年、数百万回分のワクチンを生産する必要がある。米国のインフルエンザワクチン供給物の生産および販売のための時間は、ほぼ1年を要する。したがって、次のインフルエンザシーズンに最も流行するウイルス血清型は、ほぼ1年前に推測する必要がある。このため、シーズンによっては、接種したワクチンで流行株を防げない場合がある。生産タイムラインを短縮することで、生産されるワクチン株をより適切に決定することができ、新たに出現した株の場合には、「土壇場」での変更も可能になり得る。現在の技術では、パンデミックが発生した場合、またはさらに悪いことに、ウイルス性バイオテロ兵器が解放された場合、70億人を超える世界人口にワクチン接種するのに十分な量を生産するのに5~10年かかる可能性がある。生産時間を2~10倍短縮すれば、多くの人命が救われる。
多くの疾患の遺伝的基盤の理解の向上は、遺伝子導入および遺伝子編集による多くの疾患の治療を可能にする。これらの新しい治療の開発および生産は、ウイルスベクターおよび他のバイオプロダクトの1兆個の細胞規模の生産に依存している。既存の組織培養物および培養技術は、非効率的でコストが高く、ウイルスベクター、医薬品、ワクチン、その他のバイオプロダクトの生産に高いコストおよび長い遅延をもたらすことが多い。
細胞特異的AAVの生産能については、文献上で、トランスフェクション時の細胞密度が約105~107個の細胞/mL、特異的生産能が103~106vg/細胞の開発されたシステム、デバイス、方法のみが考察されている。
本明細書に説明される実施形態は、概して、細胞および組織増殖生産装置および方法を改良することに関するものである。本明細書に開示されるのは、ウイルスベクターの生産のコストおよび時間を低減し、有望な治療の試験および臨床使用を容易にするシステム、デバイスおよび方法である。また、開示されたシステム、デバイスおよび方法は、大幅なコスト削減を実現し、新しい治療法および世界的なアクセスを可能にする。本システム、デバイスおよび方法は、STRを含む既存の開発技術の能力を超えて生産を進めるものである。
大規模および小規模の高密度細胞および組織培養は、細胞が特定の分子、タンパク質、ウイルス、または他の産物を生産するために使用される多くのバイオテクノロジー用途にとって重要である。細胞密度を高めることで、単位体積当たりの生産量を増やすことができ、省スペース化および産物の高濃度化によるコスト削減が可能になる。
高密度細胞増殖の1つの課題は、特に酸素、栄養素、および廃棄物に関する物質輸送制限から生じている。低密度細胞培養系において、代謝物の受動拡散は、細胞の代謝要求を満たすのに十分であり得る。しかしながら、高密度細胞培養系では、細胞の代謝需要は、拡散のみによる供給を上回り、対流などの質量輸送機構を追加する必要がある。
高密度細胞培養のさらなる要件は、特に付着性細胞集団の場合、高い表面積対体積比である。これは、多くの細胞が単層で増殖し、それらがコンフルエントになると増殖が抑制されるためである。
細胞密度を高めるために、細胞工場システム、マイクロキャリアを用いたウェーブ/撹拌バイオリアクター、および灌流透析メンブレンシステムを含む複数の技術が開発されている。本発明者らは、既存の開発技術には数多くの欠点があると判断した。
細胞工場システムは、細胞工場システムが単一のフラスコ内に複数層の増殖基質を含むことを除いて、従来のフラスコ培養系と最も類似している。層間の間隔が大きいため表面対体積比が小さく、すべての代謝物を拡散輸送に依存するため、達成できる細胞密度はそれほど高くならない。
ウェーブおよび撹拌バイオリアクターシステムは、培地の容器内で、細胞マイクロキャリア、細胞付着および増殖に好適な表面化学的性質を有する小さな中性浮遊性粒子を穏やかに混合することによって、対流を加えて質量輸送を強化するものである。マイクロキャリアによってもたらされる高い表面積と対流混合との組み合わせにより、細胞工場システムと比較してより高い細胞密度を達成することが可能になる。しかしながら、対流混合は、細胞に望ましくない剪断力を引き起こし、これは細胞死を誘導し得、それによって達成され得る混合および細胞への物質輸送の程度が制限される。かかるシステムは、表面積が制限されるのではなく、混合を通じて物質移動を高める必要があるため、剪断力が制限されることが多い。
灌流透析メンブレンシステムは、密に充填された半透過性透析チューブを通してガスまたは酸素供給培地を灌流し、拡散させて酸素を細胞に送達させることによって、剪断力の問題を克服するものである。しかしながら、透析チューブの形状から、非常に高い表面積対体積比を実現することはできない。さらに、細胞が増殖する高度多孔性メンブレンからの細胞除去に関する課題が存在する。
したがって、高密度細胞増殖の一部の課題としては、1)高い増殖表面積対体積比を達成すること、2)系内で適切な代謝物輸送を維持すること、および3)細胞が受ける剪断力を増殖阻害レベルまたは致死レベル未満に維持することが挙げられる。既存の技術でもこれらの課題を克服する試みはなされているが、技術的な改良の余地は大きい。本明細書では、細胞培養、組織培養および微生物培養のための種々の改良されたシステム、デバイスおよび方法が記載される。
1つの特徴は、細胞培養装置である。装置は、メンブレンを含む。メンブレンは、メンブレンの第1の側に表面特徴部を含む。表面特徴部は、1つ以上の細胞を閉じ込めることができる1つ以上の区画を含む。メンブレンは、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む。メンブレンの第2の側は、ガス領域の1つの境界を画定する。メンブレンは、ガスがメンブレンの第2の側を通ってメンブレンの第1の側に通過することができるように構成されている。装置は、メンブレンの第1の側に1つの境界を有する培地領域をさらに含む。培地領域は、メンブレンの第1の側の上に培地を通過させるように構成されている。1つ以上の区画は、区画内の培地流剪断力を少なくとも部分的に低減するように構成されている。
別の特徴は、ペトリ皿である。ペトリ皿は、皿を形成する底面および側壁を含む。底面は、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む。底面は、第1の側および第2の側を含む。第1の側は、第1の側の基部から延在する複数の構造を含み、複数の構造の上面の下方に1つ以上の細胞ニッチ領域(区画)を形成する。側壁は底面に接続されている。側壁は、底面の外周の周りに連続的かつ実質的に垂直な壁を形成する。
別の特徴は、マルチウェル細胞増殖デバイスである。デバイスは、複数のウェルを含む。ウェルは、ウェルの内部と接触する第1の側と、マルチウェル細胞増殖デバイスの外部と接触する第2の側とを含む底面を含む。第1の側は、複数の細胞増殖区画を提供するトポグラフィを含む。底面は、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む。底面は、マルチウェル増殖デバイスの外部からのガスがウェルの外部から内部に通過して複数の細胞増殖区画のうちの1つ以上と接触することができ、かつ/または1つ以上の細胞増殖区画内からのガスが第1の側から第2の側に通過することができるように構成されている。
別の特徴は、細胞培養装置である。装置は、メンブレンを含む。メンブレンは、互いに実質的に平行に延びる複数のフィン構造を含む。実質的に平行なフィン構造は、隣接するフィン構造間に溝を画定する。メンブレンの第1の側上の少なくとも1つの溝は、少なくとも細胞配置のための区画を提供する。メンブレンは、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む。メンブレンの第2の側は、ガス領域を画定する。メンブレンの第2の側は、メンブレンによってメンブレンの第1の側から分離されている。ガスは、メンブレンを通過することができる。メンブレンの第1の側の培地領域は、区画内に堆積可能な1つ以上の細胞を含む培地を受容するように構成されている。
別の特徴は、細胞呼吸器装置である。装置は、1つ以上のメンブレンを含む。1つ以上のメンブレンのうちの少なくとも1つのメンブレンは、複数の細胞を保持するように構成された複数の区画のうちの第1の区画を形成するために、メンブレンの第1の表面から突出する少なくとも第1のフィンおよび第2のフィンを含む複数のフィンを有する。メンブレンは、フィンの下方のメンブレンの第1の表面の下に形成された1つ以上のチャネルを通して複数の区画にガスを送達することを容易にするために、ガス透過性および透気性である物質から形成される。1つ以上のチャネルのうちの少なくとも第1のチャネルは、ガスを第1の区画に直接送達するように構成されている。
別の特徴は、生体細胞を培養する方法である。方法は、上記特徴のいずれかによる装置を提供することを含む。方法は、生体細胞を装置に導入することをさらに含む。本方法は、細胞培地が生体細胞と接触するように、装置の第1の側に細胞培地を提供することをさらに含む。
細胞培養装置は、メンブレンの第1の側に複数の表面特徴部を含み得るメンブレンであって、表面特徴部が、1つ以上の細胞を閉じ込めることができる1つ以上の区画を含み得、メンブレンが、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含み得る、メンブレンと、ガス領域の1つの境界を画定するメンブレンの第2の側であって、メンブレンは、ガスがメンブレンの第2の側を通ってメンブレンの第1の側に通過できるように構成されている、第2の側と、メンブレンの第1の側に1つの境界を有し、メンブレンの第1の側にわたって培地を通過させるように構成された培地領域であって、1つ以上の区画が、区画内の培地流剪断力を少なくとも部分的に低減するように構成されている、培地領域と、を含み得る。
装置は、培地領域に流体接続された1つ以上の培地入口および1つ以上の培地出口を含み得、1つ以上の培地入口は、メンブレンの第1の側の培地領域への培地の導入を容易にするように構成され、1つ以上の培地出口は、培地領域からの培地の除去を容易にするように構成されている。
1つ以上の培地入口のうちの少なくとも1つが、培地出口のうちの少なくとも1つに流体接続されて、メンブレンの第1の側の培地領域への培地の再導入を容易にする、装置。
装置が、培地領域からの培地の導入または除去の際に、1つ以上の区画における培地流剪断力を最小化するように構成されている、装置。
ガス領域と流体接触する1つ以上のガス入口および1つ以上のガス出口をさらに含み得、1つ以上のガス入口が、ガス領域にガスを導入するように構成され、1つ以上のガス出口が、ガス領域からのガスの除去のために構成されている、装置。
メンブレンの第2の側に形成された1つ以上のチャネルを含み得、1つ以上のチャネルのうちの少なくとも第1のチャネルが、メンブレンの透過および拡散によってメンブレンを介して区画のうちの少なくとも1つにガスを送達するように構成されている、装置。
メンブレンの第1の側の上方に配置されたエンクロージャを含み得る、装置。
エンクロージャが、培地領域の第2の境界を画定する、装置。
装置が、少なくとも第2の細胞培養装置と積み重ねられるように構成されている、装置。
培地入口もしくはガス入口または培地出口もしくはガス出口のうちの1つ以上が、積み重ねられた際に、培地入口もしくはガス入口または培地出口もしくはガス出口のうちの1つ以上がすぐ隣の装置の入口または出口と流体連通するように構成されている、装置。
培地入口またはガス入口のうちの1つ以上が、積み重ねられた際に、装置に導入された培地またはガスが、合流されて、複数のメンブレンに送るための合流入口ラインに入るように構成されている、装置。
培地出口またはガス出口のうちの1つ以上が、積み重ねられた際に、装置から除去された培地またはガスが、合流されて、複数のメンブレンから送るための合流出口ラインに入るように構成されている、装置。
装置を保持するための液密容器を含み得る、装置。
メンブレンが、メンブレンを通過する酸素の透過および拡散を許容するサイズを有する細孔を含む、装置。
1つ以上の区画が、細胞の体積が1つ以上の細胞を閉じ込めることができる1つ以上の区画の体積の少なくとも約10%を占めるように、組織レベルの細胞密度を支持する、装置。
陰圧が、1つ以上の区画のうちの少なくとも1つの区画の底面を下方に変形させ、少なくとも1つの細胞ニッチの上部の開口部を介して少なくとも1つの区画内に液体培地を引き込み、かつ/または陽圧が、1つ以上の細胞ニッチのうちの少なくとも1つの細胞ニッチの底面を上方に変形させ、少なくとも1つの区画の上部の開口部を介して少なくとも1つの区画から液体培地を押し出す、装置。
メンブレンの機械的伸張が、1つ以上の区画のうちの少なくとも1つの区画を広げて、少なくとも1つの区画の上部の開口部を介して少なくとも1つの細胞ニッチからの1つ以上の細胞の放出を容易にする、装置。
脈動圧力をメンブレンの第1の表面に垂直な正味の流れに整流するように構成された複数のマイクロディフューザを含み得る、装置。
流体培地を1つ以上の区画に輸送するように構成された少なくとも1つの多孔質ウィックを含み得る、装置。
メンブレンが、メンブレンに形成された区画への酸素透気速度を最大化するために著しく高いガス交換面積対体積比を提供するように設計された複数の区画を有する微細パターン化アーキテクチャを含む、装置。
メンブレンが、ガスに関連する圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている、装置。
メンブレンが、液体培地に関連付けられた圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている、装置。
メンブレンが、ガスおよび液体培地のうちの少なくとも1つに関連付けられた圧力または流れの変化に応答して、膨張または収縮して、1つ以上の区画における試薬または細胞の均一な分散を促進するように構成されている、装置。
メンブレンが、メンブレン内の1つ以上の区画内に位置する細胞の効率的な培養または採取を容易にするために、ガスおよび液体培地のうちの少なくとも1つに関連付けられた圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている、装置。
培地のための流体経路が、メンブレンの第1の側にわたる液体培地流を調節する1つ以上の流量調節器によって重力的に支持されている、装置。
細胞が付着することができる複数のマイクロキャリアを含み得る、装置。
複数の表面特徴部が、互いに実質的に平行に延びる複数のフィン構造を含み、実質的に平行なフィン構造が、隣接するフィン構造間に溝を画定し、メンブレンの第1の側の少なくとも1つの溝が、細胞配置のための1つ以上の区画のうちの少なくとも1つを提供し、少なくとも1つの溝の長手方向が、1つ以上の区画の長手方向に対応する、装置。
1つ以上の培地入口が、培地領域に培地を導入して、溝の長手方向に平行でない培地流を生成するように構成されている、装置。
1つ以上の培地入口が、培地領域に培地を導入して、溝に対して実質的に垂直な培地流を生成するように構成されている、装置。
1つ以上の培地入口が、培地領域に培地を導入して、溝と実質的に整列した培地流を生成するように構成されている、装置。
1つ以上の細胞ニッチのうちの1つ以上の上部の開口部が、開口部の下方の幅よりも狭い、装置。
複数のフィンが、メンブレンの基部から突出して、1つ以上の細胞ニッチ内の細胞の1つ以上を、培地送達によって生成される培地流剪断力から保持および保護する、装置。
メンブレンが、ガスを送達するための1つ以上のチャネルがメンブレンの第1の層に形成され、区画が第1の層の上方のメンブレンの第2の層における複数のフィンの間に形成されるように、多層モノリシック構造を有する、装置。
複数のフィンの間に形成された複数の区画の上方に専用空間が設けられて、複数のフィンの上方を流れ、複数のフィンと実質的に垂直な液体培地のための流体経路を支持する、装置。
複数のフィンの間に形成された複数の区画の上方に専用空間が設けられて、複数のフィンの上方を流れ、複数のフィンと実質的に整列した液体培地のための流体経路を支持する、装置。
流体経路が、複数のフィンの上方を流れる液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する、装置。
表面特徴部が、複数のウェル構造を含み、複数のウェル構造のうちの少なくとも1つが、細胞配置のための1つ以上の区画の少なくとも1つを提供する、装置。
ウェル構造のうちの少なくとも1つの上部の開口部が、開口部の下方のウェル構造の直径の幅よりも狭い直径の幅を含む、装置。
ウェル構造のうちの1つ以上が、円形、楕円形、正方形、長方形、六角形、または八角形である開口部を含む、装置。
ウェル構造が、ウェル構造の1つ以上の細胞ニッチ内の1つ以上の細胞を、培地送達によって生じる剪断力から保護する、装置。
メンブレンが、ガスを送達するための1つ以上のチャネルがメンブレンの第1の層に形成され、区画が第1の層の上方のメンブレンの第2の層におけるウェル構造内に形成されるように、多層モノリシック構造を有する、装置。
複数のウェル構造の上方に専用空間が設けられて、複数のウェル構造の上方を流れる液体培地のための流体経路を支持する、装置。
流体経路が、複数のウェル構造の上方を流れる液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する、装置。
複数のウェル構造の上方に専用空間が設けられて、複数のウェル構造の上方を流れる液体培地のための流体経路を支持する、装置。
少なくとも1つのウェル構造が、円形の開口部を有する、装置。
少なくとも1つのウェル構造が、多角形の開口部を有する、装置。
少なくとも1つのウェル構造が、湾曲した開口部を有する、装置。
表面構造が、複数のポスト構造を含み、少なくとも1つのポスト構造が、細胞配置のための複数の区画のうちの少なくとも1つを提供する、装置。
細胞が、少なくとも1つのポスト構造に付着している、装置。
メンブレンが、ガスを送達するための1つ以上のチャネルがメンブレンの第1の層に形成され、細胞ニッチが第1の層の上方のメンブレンの第2の層におけるポスト構造の近位に形成されるように、多層モノリシック構造を有する、装置。
複数のポスト構造の上方に専用空間が設けられて、複数のポスト構造の上方を流れる液体培地のための流体経路を支持する、装置。
流体経路が、複数のポスト構造の上方を流れる液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する、装置。
複数のポスト構造の上方に専用空間が設けられて、複数のポスト構造の上方を流れる液体培地のための流体経路を支持する、装置。
少なくとも1つのポスト構造が、円形断面を有する、装置。
少なくとも1つのウェルポストが、多角形の断面を有する、装置。
少なくとも1つのポスト構造が、湾曲した、山形の、三日月形の、またはU字形の断面を有する、装置。
メンブレンを収容するように構成されたペトリ皿を含み得る、装置。
メンブレンが、ペトリ皿の底面を形成する、装置。
メンブレンを緊張状態に保ち、剛性を追加するように構成された張力リングを含み得る、装置。
第1の表面とは反対側のメンブレンの第2の表面から突出する間隔ピラーであって、メンブレンを通して細胞ニッチへのガス交換を可能にするように構成された間隔ピラーを含み得る、装置。
皿を形成する底面および側壁を含み得、底面が、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含み得、底面が、第1の側および第2の側を含み得、第1の側が、第1の側の基部から延在する複数の構造を含み得、複数の構造の上面の下方に1つ以上の細胞ニッチ領域を形成し、側壁が、底面に接続され、底面の外周の周りに連続的かつ実質的に垂直な壁を形成する、ペトリ皿。
底面および側壁が、同じ物質を含む、ペトリ皿。
底面および側壁が、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む、ペトリ皿。
側壁が、底面とは異なる少なくとも1つの物質を含む、ペトリ皿。
側壁に支持を提供する1つ以上の保持要素を含み得る、ペトリ皿。
外部環境に曝露されるペトリ皿の底面が、外部環境からのガスが少なくとも部分的にガス透過性のメンブレンを通って第1の側に通過することができ、かつ/または第1の側からのガスが第1の側から少なくとも部分的にガス透過性のメンブレンを通って外部環境に通過することができるように、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む、ペトリ皿。
ペトリ皿の底面が、メッシュ、布、または他の開放孔物質上に配置されて、外部環境からのガスがメンブレンと交換することを可能にする、ペトリ皿。
外部環境に曝露されるペトリ皿の底面が、皿が平坦な表面上に配置される場合に、ガスが底面の下方を少なくとも部分的に通過することを可能にする、その形状における1つ以上の変形形態を含む、ペトリ皿。
形状が、ピラー、チャネル、溝、バンプ、突起、または脚を含む、ペトリ皿。
形状が、1つ以上の間隔ピラーを含む、ペトリ皿。
上面を含み得、上面が、封止メンブレンを含み得る、ペトリ皿。
上面が、シリコーンベースのメンブレンを含む、ペトリ皿。
培地をペトリ皿に、またはペトリ皿から移送するための密封可能なポートを含み得る、ペトリ皿。
複数のウェルを含み得、ウェルが、ウェルの内部と接触する第1の側と、マルチウェル細胞増殖デバイスの外部と接触する第2の側とを含む底面を含み得、第1の側が、複数の細胞増殖区画を提供するトポグラフィを含み、底面が、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含み、底面が、マルチウェル増殖デバイスの外部からのガスがウェルの外部から内部に通過して複数の細胞増殖区画のうちの1つ以上と接触することができ、かつ/または1つ以上の細胞増殖区画内からのガスが第1の側から第2の側に通過することができるように構成されている、マルチウェル細胞増殖デバイス。
第1の側のトポグラフィが、フィン、サブウェル、およびピラーのうちの1つ以上を含み、フィン、サブウェル、およびピラーが、複数の細胞増殖区画を少なくとも部分的に画定する、マルチウェル細胞増殖デバイス。
複数のウェルの側壁が、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む、マルチウェル細胞増殖デバイス。
第2の側が、平坦な表面上にあるときにガスが少なくとも部分的に底面の下方を通過することを可能にする、その形状の1つ以上の変形形態を含む、マルチウェル細胞増殖デバイス。
形状が、ピラー、チャネル、溝、バンプ、突起、または脚を含む、マルチウェル細胞増殖デバイス。
形状が、1つ以上の間隔ピラーを含む、マルチウェル細胞増殖デバイス。
互いに実質的に平行に延びる複数のフィン構造を含み得るメンブレンであって、実質的に平行なフィン構造が、隣接するフィン構造間に溝を画定し、メンブレンの第1の側の少なくとも1つの溝が、少なくとも細胞配置のための区画を提供し、メンブレンが、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含み得る、メンブレンと、ガス領域を画定するメンブレンの第2の側であって、メンブレンによってメンブレンの第1の側から分離され、ガスがメンブレンを通過することができる、メンブレンの第2の側と、区画内に堆積可能な1つ以上の細胞を含む培地を受容するように構成された、メンブレンの第1の側の培地領域と、を含み得る、細胞培養装置。
1つ以上のメンブレンと、複数の細胞を保持するように構成された複数の区画のうちの第1の区画を形成するために、メンブレンの第1の表面から突出する少なくとも第1のフィンおよび第2のフィンを含む複数のフィンを有する、1つ以上のメンブレンのうちの少なくとも1つのメンブレンと、を含み得、メンブレンが、複数のフィンの下方のメンブレンの第1の表面の下に形成された1つ以上のチャネルを通して複数の区画にガスを送達することを容易にするために、ガス透過性および透気性である物質から形成され、1つ以上のチャネルのうちの少なくとも第1のチャネルが、第1の区画にガスを直接送達するように構成されている、細胞呼吸器装置。
上記の装置のいずれかを提供することと、生体細胞を装置に導入することと、細胞培地が生体細胞と接触するように、装置の第1の側に細胞培地を提供することと、を含み得る、生体細胞を培養する方法。
メンブレンの第2の側にガスを提供することを含み得る、方法。
1つ以上の細胞区画上に培地を流すことを含み得る、方法。
培地を流すことが、入口を通して培地を導入することと、出口を通して培地を除去することと、を含む、方法。
メンブレンの第2の側にガスを流すことを含み得る、方法。
ガスを流すことが、入口を通してガスを導入することと、出口を通してガスを除去することと、を含む、方法。
1つ以上の区画内に陰圧を生成することによって、培地、生体細胞または別の物質を1つ以上の細胞区画内に流すことを含み得る、方法。
1つ以上の区画内に陰圧を生成することによって、1つ以上の区画内に細胞を維持することを含み得る、方法。
1つ以上の区画内に陽圧を生成することによって、培地、生体細胞、または別の物質を1つ以上の細胞区画から流出させることを含み得る、方法。
1つ以上の区画内に陽圧を生成することによって、細胞を1つ以上の区画から外に誘導することを含み得る、方法。
1つ以上の区画内に陽圧および/または陰圧を生成することによって、1つ以上の区画内の生体細胞のうちの1つ以上を混合することを含み得る、方法。
陽圧および/または陰圧が、ガスをガス領域に流し、培地を培地領域に流し、ガスおよび培地の両方をそれらのそれぞれの領域に流し、ガス領域へのガスの流れを防ぎ、かつ/または培地領域への培地の流れを防ぎ、それによって2つの領域の間に圧力差を生成することによって生成される、方法。
生体細胞が、ヒト、非ヒト哺乳動物、昆虫、細菌、真菌、酵母、ハイブリドーマ、プロデューサー細胞、誘導性プロデューサー細胞、CAR-T、3T3-L1、4T1、9L、A20、A172、A253、A431、A549、A2780、A2780ADR、A2780cis、AB9、AHL-1、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BOSC23、BT-20、BxPC-3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Caco-2、Cal-27、Calu-3、CAP、CGR8、CHO、CML T1、CMT12、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23-、COS-7、COV-434、CT26、D17、DAOY、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、vEL4、EM-2、EM-3、vEMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、GL261、H1299、HaCaT、HCA2、HEK293、HEK293T、HeLa、Hep G2、Hepa1c1c7、High Five、HL-60、HT-29、HT-1080、J558L、Jurkat、JY、K562、KBM-7、KCL-22、KG1、Ku812、KYO-1、L243、L1210、LNCaP、MA-104、Ma-Mel、MA2.1、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-157、MDA-MB-231、MDA-MB-361、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MIA PaCa-2、Mono-Mac-6、MOR/0.2R、MRC-5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX4、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、Neuro-2a、Neuro2a、NIH-3T3、NK-92、NTERA-2、NW-145、OK、OPCN/OPCT細胞株、P3X63Ag8、PANC-1、PC-3、PC12、Peer、PNT1A、PNT2、Pt K2、Raji、RBL-1、RenCa、RIN-5F、RMA-S、S2、SaOS-2、Sf9、Sf21、SH-SY5Y、SiHa、SK-BR-3、SK-N-SH、SK-OV-3、T-47D、T2、T84、T98G、THP-1、U2OS、U87、U373、U937、VCaP、Vero、VG-1、WM39、WT-49、YAC-1、およびYAR細胞などからなる群のいずれか1つ以上から選択され得る、方法。
ガスが、酸素、二酸化炭素、窒素、一酸化炭素、亜酸化窒素、硫化水素、エチレンオキシド、オゾン、二酸化塩素、および二酸化窒素からなる群から選択される、方法。
培地が、DMEM、FCS、293SFM II、AEM、CDM4HEK293、SFM4HEK293、Ex-Cell293、SFM4Transfx-293、Freestyle293、ESF SFM、CDM4CHO、CHO培地、MEM、MEM Alpha、RPMI、F-10、F-12、IMDM、Medium199、Leibovitz L-15、McCoyの5A、MCDB培地、Williamの培地、CMRL培地、OptiMEM、OptiPro、AIM V、OptiPEAK Tリンパ球、ExCellerateヒトT細胞増殖培地、StemXVivo無血清ヒトT細胞ベース培地、ExpiSf CD培地、Sf-900 II/III SFM、およびTC-100昆虫培地からなる群から選択される、方法。
他の物質が、廃棄物質、細胞から分泌される物質、細胞内部の物質、細胞破片、およびガスからなる群から選択される、方法。
ガス領域に凍結剤を導入して、複数の区画内の細胞および細胞成分を凍結させることであって、凍結剤が、0℃未満の温度を有し、凍結剤が、気体状態または液体状態である、凍結させることを含み得る、方法。
表面特徴部のうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、装置。
表面特徴部のうちの少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、装置。
表面特徴部のうちの少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、装置。
表面特徴部のうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、装置。
高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、装置。
高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、装置。
複数の構造のうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、ペトリ皿。
複数の構造のうちの少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、ペトリ皿。
複数の構造のうちの少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、ペトリ皿。
複数の構造のうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、ペトリ皿。
高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、ペトリ皿。
高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、ペトリ皿。
複数の細胞増殖区画のうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、マルチウェル細胞増殖デバイス。
複数の細胞増殖区画のうちの少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、マルチウェル細胞増殖デバイス。
複数の細胞増殖区画のうちの少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、マルチウェル細胞増殖デバイス。
複数の細胞増殖区画のうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、マルチウェル細胞増殖デバイス。
高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、マルチウェル細胞増殖デバイス。
高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、マルチウェル細胞増殖デバイス。
複数のフィン構造のうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、細胞培養装置。
複数のフィン構造のうちの少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、細胞培養装置。
複数のフィン構造のうちの少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、細胞培養装置。
複数のフィン構造のうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、細胞培養装置。
高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、細胞培養装置。
高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、細胞培養装置。
複数のフィンのうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、細胞呼吸器装置。
複数のフィンのうちの少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、細胞呼吸器装置。
複数のフィンのうちの少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、細胞呼吸器装置。
複数のフィンのうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、細胞呼吸器装置。
高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、細胞呼吸器装置。
高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、細胞呼吸器装置。
装置が、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する少なくとも1つの表面特徴部を含む、方法。
装置が、約700μm~約1000μmの高さを有する少なくとも1つの表面特徴部を含む、方法。
装置が、約700μmの高さを有する少なくとも1つの表面特徴部を含む、方法。
装置が、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である少なくとも1つの表面特徴部を含む、方法。
高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、方法。
高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、方法。
バイオリアクターが提供される。バイオリアクターは、ガス入口と、ガス出口と、ガス入口とガス出口との間に接続されたガス経路と、培地入口と、培地出口と、培地入口と培地出口との間に接続された培地経路と、ガス供給経路と培地供給経路とを分離するメンブレンと、のうちの1つ以上を含み得、メンブレンは、細胞保護領域を含み、細胞保護領域は、培地経路と液体連通しており、細胞保護領域は、培地経路とは流体的に異なり、細胞保護領域は、メンブレン全体にわたってガス経路とガス連通しており、細胞保護領域は、細胞保護領域で生産された細胞に対する培地経路を流れる培地の剪断力の影響を低減するように構成されている。
バイオリアクターが、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、バイオリアクター。
培地入口での培地の速度が、約1μm/秒~約1m/秒である、バイオリアクター。
培地入口での培地の速度が、約100μm/秒であり、バイオリアクターが、約40cmの長さを有し、約108個の細胞/mLを生産する、バイオリアクター。
培地入口での培地の速度が、約1μm/秒であり、バイオリアクターが、約106個の細胞/mLを生産する、請求項135~138のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
装置が、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109個の細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、装置、ペトリ皿、マルチウェル細胞増殖デバイス、細胞培養装置、細胞呼吸器装置、および方法のいずれか。
培地入口での培地の速度が、約1μm/秒~約1m/秒である、装置、細胞培養装置、細胞呼吸器装置、および方法のいずれか。
培地入口での培地の速度が、約100μm/秒であり、装置が、約40cmの長さを有し、約108個の細胞/mLを生産する、装置、細胞培養装置、細胞呼吸器装置、および方法のいずれか。
培地入口での培地の速度が、約1μm/秒であり、装置が、約106個の細胞/mLを生産する、装置、細胞培養装置、細胞呼吸器装置、および方法のいずれか。
ペトリ皿およびマルチウェル細胞増殖デバイスのいずれかは、約40cmの長さを有し、約106個の細胞/mL~約108個の細胞/mLを生産するように構成されている。
本明細書に記載される主題の1つ以上の変形形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本明細書に記載される主題の他の特徴および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、本明細書に開示される主題の特定の特徴を示し、説明とともに、開示される実装形態に関連する原理の一部を説明するのに役立つ。
実用的な場合、同様の参照番号は、同様の構造、特徴、または要素を示す。
以下の詳細な説明では、本開示の一部を形成する添付の図面を参照する。図面では、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、類似の符号は典型的には類似の構成要素を特定する。発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意図しない。詳細な説明は、例示的な実施形態の説明として意図されており、実践され得る唯一の実施形態を表すことは意図されていない。本明細書で使用される「例示的」という用語は、「一例、事例、または例示としての役割を果たす」ことを意味し、必ずしも他の実施形態よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきではない。本明細書に提示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてもよく、他の変更が行われてもよい。本明細書で概して説明され、図に示される本開示の特徴は、多種多様な異なる構成で配置され、置換され、組み合わされ、設計され得、それらのすべてが本開示によって明示的に企図され、本開示の一部を形成することが容易に理解されるであろう。
本システム、デバイスおよび方法は、代謝的に有効なプロデューサー細胞またはパッケージング細胞を維持しながら、細胞密度を増加させる。代謝的に有効なプロデューサー細胞またはパッケージング細胞を維持しながら細胞密度を増加させることによって、空間-時間生産能は、細胞当たりの生産能に関して改善される。
本明細書で使用される場合、高密度細胞培養の文脈における「高密度」という用語(など)は、以下を含む特定の意味を有し得る。AAV生産のために開発されたほとんどのプロセスでは、約106個の細胞/mLの細胞密度が達成されており、これは約0.1体積%、すなわち培地1nLに1個の細胞ということになる。107および108個の細胞/mLになると、細胞密度はそれぞれ1体積%および10体積%の占有率である。109の細胞密度は、組織レベル密度に対応する。次いで、本発明者らは、バイオリアクター中の細胞密度を106個の細胞/mLの範囲に制限しているものに着目した。
一次近似として、ガス交換の必要性から、バイオリアクター中の細胞密度が106個の細胞/mLの範囲に制限されると判断した。細胞の代謝要求の観点から、酸素の必要な物質移動容量係数を計算し、例えばグルコースと比較することができる。106個の細胞/mLについては、1時間に約1回培地中の酸素を交換する必要があり、107個の細胞/mLについては、1時間に約8回培地中の酸素を交換する必要があり、そして108個の細胞/mLについては、1分に約1回培地中の酸素を交換する必要がある。対照的に、グルコースについての物質移動容量係数を考慮すると、交換速度は、酸素交換の100分の1であり、廃棄物の排出および他の栄養素についてもほぼ同じことが言える。したがって、既存の開発されたバイオリアクター(STRおよび固定床)は、細胞に酸素を供給する必要性から混合/灌流レジーム下で動作しているが、可溶性栄養素については100倍過剰である。最終的には、剪断力の制限により、酸素交換の可能性が制限される。ガスと可溶性栄養素の交換を切り離すことで、灌流/混合の必要性を大いに削減し、より高密度なノードを実現した。
本発明の高密度細胞呼吸器(HDCR)システム、デバイスおよび方法、ならびにそれらの合理的な変形例は、ガスおよび栄養素交換を分離し、灌流/混合の必要性を低減し、そして既存の開発技術におけるよりも高い密度ノートを達成する。
用途および必要性
本明細書に記載される高密度細胞呼吸器(HDCR)の実施形態は、特に、先天性代謝異常および神経疾患(例えば、血友病、鎌状赤血球貧血、サラセミア、パーキンソン病、アルツハイマー病)に対する遺伝子導入および編集のためのアデノ随伴ウイルス(AAV)などのベクターと、がん殺傷および免疫療法のための腫瘍溶解性ウイルスと、特に、肝不全、人工皮膚、およびHIV感染を含む損傷組織の置換のための幹細胞増殖および遺伝子編集と、抗体および治療用タンパク質と、代謝物および他の細胞ベースの産物と、を含む、多種多様な適用のためのバイオプロダクトを生成するために使用され得る。
本明細書に記載される高密度細胞呼吸器(HDCR)の実施形態は、特に、先天性代謝異常および神経疾患(例えば、血友病、鎌状赤血球貧血、サラセミア、パーキンソン病、アルツハイマー病)に対する遺伝子導入および編集のためのアデノ随伴ウイルス(AAV)などのベクターと、がん殺傷および免疫療法のための腫瘍溶解性ウイルスと、特に、肝不全、人工皮膚、およびHIV感染を含む損傷組織の置換のための幹細胞増殖および遺伝子編集と、抗体および治療用タンパク質と、代謝物および他の細胞ベースの産物と、を含む、多種多様な適用のためのバイオプロダクトを生成するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「バイオプロダクト」という用語および変形例は、ウイルス、ウイルス様粒子、バクテリオファージ、タンパク質、組み換えタンパク質、抗体、代謝物、細胞、真核細胞、細菌細胞、藻類、細胞小器官、液胞、ミトコンドリア、脂質、エキソソーム、DNA、RNA、プラスミド、抗生物質などを指し得る。
本明細書中で使用される場合、「ウイルス」という用語および変形例は、アデノ随伴ウイルス、アイチウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、BKポリオーマウイルス、バンナウイルス、バーマ森林ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、Bunyavirus La Crosse、カンジキウサギブニアウイルス、細胞コピテシンヘルペスウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、コサウイルスA、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、ドリウイルス、ダグベウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、東部馬脳炎ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス、GBウイルスC/G型肝炎ウイルス、ハンタンウイルス、ヘンドラウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、ホースポックスウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス68、70、ヒトヘルペスウイルス1型ヒトヘルペスウイルス2型、ヒトヘルペスウイルス6型、ヒトヘルペスウイルス7型、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス1型、ヒトパピローマウイルス2型、ヒトパピローマウイルス16型、18型、ヒトパラインフルエンザ、ヒトパルボウイルスB19、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトSARSコロナウイルス、ヒトスプマレトロウイルス、ヒトTリンパ球向性ウイルス、ヒトトロウイルス、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、イスファハンウイルス、JCポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、ジュニンアレナウイルス、KIポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、ランガットウイルス、ラッサウイルス、ロードスデールウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マヤロウイルス、MERSコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、モコラウイルス、伝染性軟腫症ウイルス、サル痘ウイルス、おたふく風邪ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ニューヨークウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オニョンニョンウイルス、羊痘ウイルス、オロポーチウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、プンタトロフレボウイルス、プーマラウイルス、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロザウイルスA、ロスリバーウイルス、ロタウイルスA、ロタウイルスB、ロタウイルスC、風疹ウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスA、サンドフライフィーバーシシリアンウイルス、サッポロウイルス、SARSコロナウイルス2、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、シミアンフォーミーウイルス、シミアンウイルス5、シンドビスウイルス、サウサンプトンウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性ポワッサンウイルス、トルクテノウイルス、トスカーナウイルス、ウクニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、天然痘ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、WUポリオーマウイルス、ウエストナイルウイルス、矢場猿腫瘍ウイルス、矢場様病ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルスなどに基づく、天然、改変、キメラ、および組み換えウイルスおよびウイルス様粒子を指し得る。
遺伝子治療および編集のためのAAVベクターの使用は、精力的に研究されており、代謝の先天異常および幹細胞の遺伝子操作の治療を含む臨床治療となりつつある。フェーズI/IIの治験でも、約1017を超えるベクターゲノム(vg)が必要とされる場合がある。AAVベクターの生産能力およびコストは、AAV遺伝子治療の広範な使用にとって最大の障害となっている。同様に、がんと戦う免疫腫瘍溶解性ウイルスが全人類に手の届くものになるには、十分なベクターの生産およびそれに伴うコストが大きな障害となる。最近、免疫腫瘍溶解性ウイルスは、黒色腫の治療薬として米国およびEUで承認され、さらに多くのウイルスが承認段階に達している。開示された技術は、21世紀に臨床製品を生み出してきた遺伝子ベクターと免疫腫瘍溶解性ウイルスの2つの分野において、既存のベクター生産方法を破壊し得る細胞培養プラットフォームを実現し、効率を大幅に高め、治療用ベクターの生産時間(2~10倍)およびコスト(10倍)の両方を減少させる。
ウイルスおよびウイルスベクターは、実験薬としてだけでなく、遺伝子治療およびがん治療のための医薬として、ならびに感染症のためのワクチンとしても非常に重要になっている。AAVベクターは、多くの遺伝性および後天性疾患の治療を期待できる有効な遺伝子導入および遺伝子編集ツールとして機能する。AAVベクターは、例えば、先天性代謝異常、欠陥構造および分泌タンパク質生産の治療として集中的に研究されており、血友病、サラセミア、鎌状赤血球貧血、ムコ多糖症、嚢胞性線維症および筋ジストロフィーなどの多様な疾患の治療薬となり得る。あるAAVベースの治療薬(Glybera、uniQure、N.V.、アムステルダム)は、リポタンパク質リパーゼ欠損症の治療用に欧州連合によってすでに承認されている。また、2017年には遺伝性の失明症の治療薬として承認されている(Spark Therapeutics)。Glyberaの組み換えAAVウイルス粒子の投与量は1016個であるため、患者1人当たり120万ドルのコストがかかる。同様に、Sparkの失明治療薬「Luxturna」は、1人当たり約850,000ドルのコストがかかる。ノバルティスのSMA用AAVゾルゲンスマは、1回の投与に210万ドルのコストがかかる。これは、ウイルス生産のコストに部分的に起因している。最近の治験の成功により、高品質で機能的に活性なベクターに対する需要が指数関数的に増大している。この分野全体に共通する問題は、臨床試験に十分なウイルスベクターを生産することである。フェーズI/IIの治験でも、約1017~1018個のウイルス粒子が必要とされ、通常、数百万ドルのコストがかかり、達成するのに1年以上かかる。この長い生産プロセスの中で、たった一つの汚染物質が、プログラムまたは会社全体を破滅させることもある。近年の治験の成功により、高品質で機能的な活性ベクターの需要は飛躍的に伸びており、この傾向は今後数十年間続くと予想される。したがって、より迅速かつ安価な生産方法を設計することで、より多くの製品を治験に供することができ、治験で実証された遺伝子編集ツールを社会的に安価に提供することが可能になる。
免疫腫瘍溶解性ウイルス療法は、がんに直接感染して死滅させることができるだけでなく、持続的な免疫記憶を誘発することによって再発を減少させ得るウイルスでがんを治療するものである。免疫腫瘍溶解性ヘルペスウイルス(T-VEC、Amgen、Thousand Oaks、カリフォルニア州)は、米国および欧州において黒色腫における使用が承認されている。アデノウイルス(Oncorine、SunwayBio、上海、中国)は、頭頸部がんの中国での使用が承認されている。他の多くのウイルスは、単剤として、および他の免疫刺激分子との組み合わせの両方で臨床試験中であり、有望な結果が得られている。これらおよび試験下のほとんどのウイルスは、1回の投与に数千ドルのコストがかかる。治験のために多くの有望なウイルス構築物を生産することは困難であった。これらの薬剤が貧困国のがん患者に利用可能であるように、ウイルス薬剤のコストを十分に低く保つことも困難であった。そのため、生産効率を上げたり、コストを下げたりする方法があれば、人命救助に大きく貢献することができる。オルソポックスウイルスの生産プロセスの開発はまた、パンデミックまたはバイオテロに対応した迅速なワクチン開発のための概念実証を兼ねている。
AAVは、一本鎖DNAゲノムを有する複製欠損性非病原性パルボウイルスであり、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する。AAVは、肝臓、心臓、筋肉、および他の臓器に安全かつ効率的に形質導入できることから、過去20年以上にわたり、遺伝性疾患の治療を目的とした遺伝子治療用ベクターの開発が精力的に行われてきた。AAV遺伝子療法の治療的利益は、持続することが予測される。AAVの臨床遺伝子治療試験は、特に脊髄性筋萎縮症(SMA)、血友病および複数の形態の失明において、非常に有望な結果をもたらした。より最近では、AAVベクターはまた、ゲノム編集プラットフォームの構成要素のための送達剤として使用されており、特にインビボで使用される場合に有効かつ効率的であることが示されている。したがって、AAVベクターは、臨床ゲノム編集において重要な役割を果たす可能性が高い。それらはまた、治療のための幹細胞の遺伝子操作のためのベクターであり得る。
AAVベクターが遺伝的医薬に対して有効であるという大きな見込みにもかかわらず、その広範な使用に対する唯一の最大の制限は、十分な量のAAVベクターを適時にかつ低コストで製造することができないことである。現在、臨床用GMPグレードのAAVは、世界でも数少ない商業施設および学術施設で製造されている。
しかしながら、生産の相対的非効率性および労働集約的なプロセスを使用していることから、現在の需要に対応できない状況が広がっている。結果として、現在、臨床グレードのAAVは、約2年待ちとなっている。さらに、大手製薬会社が自社のタイムラインを早めるためにAAV生産CMOを買収したことも、この状況を悪化させている。低コストで高力価のAAVベクターを迅速に生産する能力は、遺伝子治療およびゲノム編集の分野に大きな変革をもたらすと期待される。生産能力を高め、AAVベクターを生産する能力を汎用化できなければ、多くの発見は実用化されない可能性がある。
フェーズIIの臨床試験でも、約1017を超えるベクターゲノムが必要である。現在、これらの薬剤は数十万ドルから百万ドルを超えるコストがかかるので、ベクターの生産およびコストは、これらのベクターが人類によって手頃な価格になるための大きな障害となっている。このような驚異的な数値は、世界的な治療薬として持続可能なものではない。生産を約2~10倍スピードアップし、効率および収率を約10倍増加させる必要がある。これらの目標が達成されれば、より多くの候補者が治験に参加できるようになり、製品もより手頃な価格で入手できるようになるはずである。
本明細書に記載されるHDCRの実施形態はまた、ウイルスおよびワクチン生産のために使用され得る。ウイルスの生産性を高めることは、腫瘍溶解性ウイルス療法の成長分野に有用である。腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に特異的に感染し、がん細胞内で複製し、がん細胞を死滅させるように操作されたウイルスである。これらのウイルスは、宿主の免疫系を刺激して、がんに対する免疫学的反応を強固で全身的、かつ持続的なものにするタンパク質をがんの部位で産生させることができる遺伝子ペイロードを保有し得る。かかる2つのウイルス(1つはアデノウイルスに基づき、そして1つは単純ヘルペスウイルスに基づく)は、がん治療としてヒトにおける使用について承認されている。中でも、ワクシニア、粘液腫、水疱性口内炎ウイルス、および麻疹に基づくものを含む多くの他のウイルスが、現在研究中である。腫瘍溶解性ウイルスと免疫チェックポイント阻害剤とを組み合わせる治験もまた、潜在的なヒトがん療法として非常に有望であることが示されている。コストもまた、腫瘍溶解性ウイルスの生産における考慮事項である。TVECを使用する腫瘍溶解性ウイルス療法の6ヶ月コースのコストは、現在約65,000ドルである。生産コストを低減することは、世界的な入手可能性の向上につながる。ウイルス生産時間を短縮することはまた、新規薬剤の治験に対する障壁を低下させる。
ウイルス生産技術の向上はまた、ワクチン開発に影響を与える。ワクチンのために日常的に生産されるウイルスには、ワクシニア、VSV、麻疹、およびHSVがある。現在のインフルエンザワクチンは、卵ベースの生産プロセスによって作製されている。現在、卵ベースのワクチン生産には、ワクチン効果の低さの一因となるウイルス株の変異およびワクチンの免疫原性の低さ、卵アレルギーのため予防接種の対象者が限定されるなどの問題がある。本明細書に記載されるHDCRは、現在の卵ベースの生産方法の効率を上回るようにウイルス生産を最適化し、より高い収率、より迅速な生産、および全人類のためのワクチンへのアクセスを可能にし得るものである。
コストおよび量の圧力から、ウイルスベクターの細胞ベースの生産は、ペトリ皿からフラスコ、ローラーボトル、細胞工場、撹拌タンクリアクター、および最後に灌流ベースのリアクター(例えば、中空ファイバ)に進化しており、この技術は数十年にわたって存続している。これらのシステムは、培養培地を介した栄養素、増殖因子、廃棄物、および酸素/二酸化炭素の輸送に依存している。バイオリアクターシステムにおける最大細胞密度は、これまで培地へのガスの溶解度が低いこと、細胞の酸素摂取量が多いことから、ガス交換によって制限されてきた。混合またはガススパージングによって酸素送達量を増加させる努力は、最終的に、細胞生存率に対する剪断力の負の効果によって制限される。約106個の細胞/mL(多くの系における一般的な密度)では、リアクター空間の約0.1~1%(v/v)のみが細胞によって占有される。灌流バイオリアクターを使用するワクチン生産のための高密度細胞培養の最近の試みは、連続培養およびバッチ供給培養の過去の密度の限界を克服しているが、これらの特定のシステムにおける特定の培地使用の増加およびウイルス収率の減少に部分的に起因して、関連コストは大きく減少していない。
HDCR
開示される技術は、酸素供給を増加させ、細胞を剪断力から保護し、培地を効率的に利用して、顕著に改善された空間-時間生産能を達成する独自の設計において、ガスおよび可溶性栄養素の送達を切り離すことによって、バイオ生産の技術を進歩させるものである。実施形態は、ガス灌流可能かつ高度に透気性である積層可能な細胞保持メンブレンから構成される高密度細胞呼吸器(HDCR)を含み、これは、メンブレンの透過および拡散を介した細胞ニッチの直接酸素供給を可能にする。酸素分子(O2)は細胞培地への溶解度が低く、細胞増殖に最も制限的な代謝物であると考えられ得るため、直接的な酸素供給は重要である。ガス対流送達を他の栄養素送達から分離することによって、有害な剪断力を増加させることなく、細胞への酸素送達を大幅に増加させることが可能である。HDCRカートリッジは、独立して灌流可能な培地流に浸されており、これにより、可溶性栄養素または試薬の送達、廃棄物の除去、およびバイオプロダクトの採取が可能となる。これらの設計は、区画内の細胞密度が>約108個の細胞/mLの組織レベルの細胞、または約10%~25%のVcell/Vbioreactor比に対応することができ、これは従来のバイオリアクターに対して100倍の改善に相当する。細胞ベースの生産プロセスを増強することで、高価で限定された優良製造所基準(「GMP」)空間のより効率的な使用が可能になる。
開示される技術は、酸素供給を増加させ、細胞を剪断力から保護し、培地を効率的に利用して、顕著に改善された空間-時間生産能を達成する独自の設計において、ガスおよび可溶性栄養素の送達を切り離すことによって、バイオ生産の技術を進歩させるものである。実施形態は、ガス灌流可能かつ高度に透気性である積層可能な細胞保持メンブレンから構成される高密度細胞呼吸器(HDCR)を含み、これは、メンブレンの透過および拡散を介した細胞ニッチの直接酸素供給を可能にする。酸素分子(O2)は細胞培地への溶解度が低く、細胞増殖に最も制限的な代謝物であると考えられ得るため、直接的な酸素供給は重要である。ガス対流送達を他の栄養素送達から分離することによって、有害な剪断力を増加させることなく、細胞への酸素送達を大幅に増加させることが可能である。HDCRカートリッジは、独立して灌流可能な培地流に浸されており、これにより、可溶性栄養素または試薬の送達、廃棄物の除去、およびバイオプロダクトの採取が可能となる。これらの設計は、区画内の細胞密度が>約108個の細胞/mLの組織レベルの細胞、または約10%~25%のVcell/Vbioreactor比に対応することができ、これは従来のバイオリアクターに対して100倍の改善に相当する。細胞ベースの生産プロセスを増強することで、高価で限定された優良製造所基準(「GMP」)空間のより効率的な使用が可能になる。
本明細書に記載される種々の実装形態は、メンブレン設計への表面特徴部の一体化を含む。例えば、表面特徴部は、フィン、ウェル、またはポストであってもよい。これらの表面特徴部は、2つの重要な機能を果たす。
第1に、表面特徴部は、付着性細胞、懸濁細胞またはマイクロキャリア付着細胞が増殖し得る剪断保護された区画を生成する。一部の実施形態では、隣接するフィンは、区画に対応する溝を形成する。他の実施形態では、ウェルは区画に対応する。さらに他の実施形態では、ポストは、ポストに付着する細胞のための区画を形成する。従来のシステムでは、ウイルス生産時に細胞の付着性が失われる(細胞変性効果(CPE))ことでウォッシュアウトが生じるため、これらの区画は、ウイルス生産に不可欠なものである。音響フィルタ、接線流濾過(「TFF」)、および連続遠心分離を含む既存の方法は高価で複雑なため、高密度細胞培養系における細胞保持の新たな手段を求める声が文献に繰り返し掲載されている。
第2に、表面特徴部は、高度にガス透過性であるため、細胞ニッチの周囲/内部でのガス交換を容易にする。これは、酸素の物質移動容量係数(すなわち、kLa)を増加させ、より高い細胞密度を達成することを可能にする。さらに、表面特徴部によって、細胞凝集体のサイズが制約されるため、すべての細胞が必要な量の酸素を受け取ることが確実となる(すなわち、それらは拡散制限されない)。ガス/栄養素の勾配を克服することは、文献上では大きな課題となっているが、本開示はこの課題を克服している。
用語
本明細書で使用される「区画」は、メンブレン構造の一部であり、メンブレンの全表面に対してメンブレン表面の一部に1つ以上の細胞(またはウイルス、細胞小器官、リポソーム、担体(ビーズなど)などを含む同様のサイズの物質)を空間的に閉じ込める能力を有する。区画は、フィン、ポスト、ウェル、チャネル、ケージ、およびこれらの特徴の組み合わせを含むがこれらに限定されない種々の構造および形状を含み得る。区画は、本明細書に記載されるものを含む、任意の形状、構造、形状またはアーキテクチャを有し得る。例えば、区画は、円形、卵形、楕円形、正方形、長方形、五角形、六角形、七角形、八角形、不規則または他の形状、開口部、側部、底部などを含んでもよい。
本明細書で使用される「区画」は、メンブレン構造の一部であり、メンブレンの全表面に対してメンブレン表面の一部に1つ以上の細胞(またはウイルス、細胞小器官、リポソーム、担体(ビーズなど)などを含む同様のサイズの物質)を空間的に閉じ込める能力を有する。区画は、フィン、ポスト、ウェル、チャネル、ケージ、およびこれらの特徴の組み合わせを含むがこれらに限定されない種々の構造および形状を含み得る。区画は、本明細書に記載されるものを含む、任意の形状、構造、形状またはアーキテクチャを有し得る。例えば、区画は、円形、卵形、楕円形、正方形、長方形、五角形、六角形、七角形、八角形、不規則または他の形状、開口部、側部、底部などを含んでもよい。
メンブレンなどの「ガス透過性」または「半透過性」物質には、ガスを透過させるが液体の水の透過を防止するもの、または当技術分野で適用可能かつ公知のものが含まれる。透過性は、標準的な室温(すなわち、25℃)および大気圧または他の適用可能な温度および圧力で測定することができる。例えば、哺乳動物細胞の培養のための標準温度は37℃である。好熱菌の場合、温度は122℃まで上昇し得る。圧力は、浸水からの静水圧などにより、標準大気圧よりも高くまたは低く調整され得る。ガスは、分子状酸素、二酸化炭素、一酸化炭素、窒素、通常の空気、一酸化炭素、亜酸化窒素、硫化水素、エチレンオキシド、オゾン、二酸化塩素、二酸化窒素、または他の適用可能なものであってもよい。
「フィン」は、表面上に突出する長くて薄い隆起構造を含む。フィンは、フィンの長さに沿って実質的に一定の多角形および/または湾曲した断面形状を有し得る。
「フィンのアレイ」は、表面の上方に突出する一連のフィンを含み、一連のフィン内の隣接するフィン間のフィンの長さに沿って実質的に一定の間隔を有する。フィンのアレイは、互いに整列され、実質的に平行であってもよい。
「溝」は、隣接するフィンによって形成された細長い凹部である。溝の断面形状は、溝を画定する隣接するフィンの壁の形状と、隣接するフィンが突出する表面の部分とによって画定することができる。隣接するフィン壁および表面の一部は、溝の断面の3つの面を形成することができる。溝は、表面に対向する開口部を有し得る。開口部は、溝を形成する隣接するフィンの壁の間の溝の幅より狭くても広くてもよい。表面が水平であり、フィンが上向きに突出する場合、開口部は溝の上部にある。
「溝のアレイ」は、フィンのアレイの隣接するフィンによって形成される一連の溝を含む。溝は、一連の溝内の隣接する溝間で溝の長さに沿って実質的に一定の間隔を有し得る。溝のアレイは、互いに整列され、実質的に平行であってもよい。
「ピラー」または「マイクロピラー」は、表面から垂直に延在する、または別様で当技術分野で公知のカラムまたは他の構造を含む。「マイクロピラー」は、小さいピラーを含み、マイクロメートル(ミクロン)またはマイクロインチのスケールのピラーに限定されない。
「スペーサのアレイ」は、シートを互いから固定距離に保つように構成されたスペーサの高さおよび中心間間隔を有するか、または別様で当技術分野で公知の幾何学的に規則的または不規則なパターンのマイクロピラーまたは他のスペーサを含む。
「耐圧潰性バッグ」は、対向する側の内部表面が通常の操作において互いに接触することを防止するように、内部にスペーサを有するバッグを含む。
「耐膨張性バッグ」は、加圧されたときにバッグがバルーンのような形状になることを防止する内部溶接点、接続されたスペーサ、もしくは他の接続部、または別様で当技術分野で公知の他の接続部を有するバッグを含む。耐膨張性バッグは、実質的に平坦であってもよい。凸状および凹状の窪みおよび湾曲を有してもよい。
「気密封止」は、単に、気密であるか、または少なくとも液体に対して透過性ではないが、おそらくガスに対して透過性であるか、または別様で当技術分野で公知の他の方法で封止されていることを意味する。
実施形態では、細胞培養装置が提供され、細胞培養装置は、メンブレンの第1の側に複数の表面特徴部を含み得るメンブレンであって、表面特徴部が、1つ以上の細胞を閉じ込めることができる1つ以上の区画を含み、メンブレンが、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む、メンブレンと、ガス領域の1つの境界を画定するメンブレンの第2の側であって、メンブレンは、ガスがメンブレンの第2の側を通ってメンブレンの第1の側に通過できるように構成されている、第2の側と、メンブレンの第1の側に1つの境界を有し、メンブレンの第1の側にわたって培地を通過させるように構成された培地領域であって、1つ以上の区画が、区画内の培地流剪断力を少なくとも部分的に低減するように構成されている、培地領域と、を含む。
実施形態では、装置は、培地領域に流体接続された1つ以上の培地入口および1つ以上の培地出口をさらに含み得、1つ以上の培地入口は、メンブレンの第1の側の培地領域への培地の導入を容易にするように構成され、1つ以上の培地出口は、培地領域からの培地の除去を容易にするように構成されている。
実施形態では、1つ以上の培地入口のうちの少なくとも1つは、培地出口のうちの少なくとも1つに流体接続されて、メンブレンの第1の側の培地領域への培地の再導入を容易にする。
実施形態では、培地領域に導入される培地は液体状態である。
実施形態では、培地領域から除去された培地は、複数の細胞、使用済み培地、細胞廃棄物、分泌物、および複数の細胞からの生体物質のうちの少なくとも1つを含む。
実施形態では、装置は、培地領域からの培地の導入または除去の際に、1つ以上の区画における培地流剪断力を最小化するように構成されている。
実施形態では、装置は、ガス領域と流体接触する1つ以上のガス入口および1つ以上のガス出口をさらに含み、1つ以上のガス入口は、ガス領域にガスを導入するように構成され、1つ以上のガス出口は、ガス領域からのガスの除去のために構成されている。
実施形態では、装置は、メンブレンの第2の側に形成された1つ以上のチャネルをさらに含み、1つ以上のチャネルのうちの少なくとも第1のチャネルは、メンブレンの透過および拡散によってメンブレンを介して区画のうちの少なくとも1つにガスを送達するように構成されている。
実施形態では、装置は、メンブレンの第1の側の上方に配置されたエンクロージャをさらに含む。
実施形態では、エンクロージャは、培地領域の第2の境界を画定する。
実施形態では、装置は、少なくとも第2の細胞培養装置と積み重ねられるように構成されている。
実施形態では、培地入口もしくはガス入口または培地出口もしくはガス出口のうちの1つ以上は、積み重ねられた際に、培地入口もしくはガス入口または培地出口もしくはガス出口のうちの1つ以上がすぐ隣の装置の入口または出口と流体連通するように構成されている。
実施形態では、培地入口またはガス入口のうちの1つ以上は、積み重ねられた際に、装置に導入された培地またはガスが、合流されて、複数のメンブレンに送るための合流入口ラインに入るように構成されている。
実施形態では、培地出口またはガス出口のうちの1つ以上は、積み重ねられた際に、装置から除去された培地またはガスが、合流されて、複数のメンブレンから送るための合流出口ラインに入るように構成されている。
実施形態では、液体培地およびガスは、積層可能なメンブレンを含有するための液密容器に接続された別個のガス送達管および培地送達管によって、積み重ねられた培養装置の各メンブレン上に独立して灌流される。
実施形態では、装置は、装置を保持するための液密容器をさらに含む。
実施形態では、メンブレンは、メンブレンを通過する酸素の透過および拡散を許容するサイズを有する細孔を含む。
実施形態では、メンブレンの第1の表面上の液体培地灌流は、細胞を1つ以上の区画に導入する。
実施形態では、メンブレンの第1の表面上を灌流する培地は、栄養素または試薬を1つ以上の区画に送達する。
実施形態では、メンブレンの第1の表面上の培地灌流は、1つ以上の区画からの廃棄物除去を可能にする。
実施形態では、メンブレンの第1の表面上の培地灌流は、1つ以上の区画からバイオプロダクトを採取することを可能にする。
実施形態では、1つ以上の区画は、1ミリリットル当たり約108細胞を超える組織レベルの細胞密度、または約10%~25%のVcell/Vbioreactorを超える組織レベルの細胞密度を支持し、ここで、Vcellは細胞の体積であり、Vbioreactorはリアクター空間細胞増殖の体積である。
実施形態では、複数の表面特徴部のうちの少なくとも1つは、微細加工されたシリコーンから形成され、1つ以上の区画の周囲のメンブレンの透過を介して起こるガス交換を容易にする。
実施形態では、シリコーン表面特徴部は、1つ以上の区画へのメンブレンの透過を介して起こるガス交換を容易にするように構成されている。
実施形態では、陰圧は、1つ以上の区画のうちの少なくとも1つの区画の底面を下方に変形させ、少なくとも1つの細胞ニッチの上部の開口部を介して少なくとも1つの区画内に液体培地を引き込み、かつ/または陽圧は、1つ以上の細胞ニッチのうちの少なくとも1つの細胞ニッチの底面を上方に変形させ、少なくとも1つの区画の上部の開口部を介して少なくとも1つの区画から液体培地を押し出す。
実施形態では、メンブレンの機械的伸張は、1つ以上の区画のうちの少なくとも1つの区画を広げて、少なくとも1つの区画の上部の開口部を介して少なくとも1つの細胞ニッチからの1つ以上の細胞の放出を容易にする。
実施形態では、装置は、脈動圧力をメンブレンの第1の表面に垂直な正味の流れに整流するように構成された複数のマイクロディフューザをさらに含む。
実施形態では、装置は、流体培地を1つ以上の区画に輸送するように構成された少なくとも1つの多孔質ウィックをさらに含む。
実施形態では、メンブレンは、メンブレンに形成された区画への酸素透気速度を最大化するために著しく高いガス交換面積対体積比を提供するように設計された複数の区画を有する微細パターン化アーキテクチャを含む。
実施形態では、メンブレンは、ガスに関連する圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている。
実施形態では、メンブレンは、液体培地に関連付けられた圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている。
実施形態では、メンブレンは、ガスおよび液体培地のうちの少なくとも1つに関連付けられた圧力または流れの変化に応答して、膨張または収縮して、1つ以上の区画における試薬または細胞の均一な分散を促進するように構成されている。
実施形態では、メンブレンは、メンブレン内の1つ以上の区画内に位置する細胞の効率的な培養または採取を容易にするために、ガスおよび液体培地のうちの少なくとも1つに関連付けられた圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている。
実施形態では、培地のための流体経路は、メンブレンの第1の側にわたる液体培地流を調節する1つ以上の流量調節器によって重力的に支持されている。
実施形態では、細胞が付着することができる複数のマイクロキャリアをさらに含む。
実施形態では、複数の表面特徴部は、互いに実質的に平行に延びる複数のフィン構造を含み、実質的に平行なフィン構造は、隣接するフィン構造間に溝を画定し、メンブレンの第1の側の少なくとも1つの溝は、細胞配置のための1つ以上の区画のうちの少なくとも1つを提供し、少なくとも1つの溝の長手方向は、1つ以上の区画の長手方向に対応する。
実施形態では、1つ以上の培地入口は、培地領域に培地を導入して、溝の長手方向に平行でない培地流を生成するように構成されている。
実施形態では、1つ以上の培地入口は、培地領域に培地を導入して、溝に対して実質的に垂直な培地流を生成するように構成されている。
実施形態では、1つ以上の培地入口は、培地領域に培地を導入して、溝と実質的に整列した培地流を生成するように構成されている。
実施形態では、1つ以上の細胞ニッチのうちの1つ以上の上部の開口部は、開口部の下方の幅よりも狭い。
実施形態では、複数のフィンは、メンブレンの基部から突出して、1つ以上の細胞ニッチ内の細胞の1つ以上を、培地送達によって生成される培地流剪断力から保持および保護する。
実施形態では、メンブレンは、ガスを送達するための1つ以上のチャネルがメンブレンの第1の層に形成され、区画が第1の層の上方のメンブレンの第2の層における複数のフィンの間に形成されるように、多層モノリシック構造を有する。
実施形態では、複数のフィンの間に形成された複数の区画の上方に専用空間が設けられて、複数のフィンの上方を流れ、複数のフィンと実質的に垂直な液体培地のための流体経路を支持する。
実施形態では、複数のフィンの間に形成された複数の区画の上方に専用空間が設けられて、複数のフィンの上方を流れ、複数のフィンと実質的に整列した液体培地のための流体経路を支持する。
実施形態では、流体経路は、複数のフィンの上方を流れる液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する。
実施形態では、表面特徴部は、複数のウェル構造を含み、複数のウェル構造のうちの少なくとも1つが、細胞配置のための1つ以上の区画の少なくとも1つを提供する。
実施形態では、ウェル構造のうちの少なくとも1つの上部の開口部は、開口部の下方のウェル構造の直径の幅よりも狭い直径の幅を含む。
実施形態では、ウェル構造のうちの1つ以上は、円形、楕円形、正方形、長方形、六角形、または八角形である開口部を含む。
実施形態では、ウェル構造は、ウェル構造の1つ以上の細胞ニッチ内の1つ以上の細胞を、培地送達によって生じる剪断力から保護する。
実施形態では、メンブレンは、ガスを送達するための1つ以上のチャネルがメンブレンの第1の層に形成され、区画が第1の層の上方のメンブレンの第2の層におけるウェル構造内に形成されるように、多層モノリシック構造を有する。
実施形態では、複数のウェル構造の上方に専用空間が設けられて、複数のウェル構造の上方を流れる液体培地のための流体経路を支持する。
実施形態では、流体経路は、複数のウェル構造の上方を流れる液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する。
実施形態では、複数のウェル構造の上方に専用空間が設けられて、複数のウェル構造の上方を流れる液体培地のための流体経路を支持する。
実施形態では、少なくとも1つのウェル構造は、円形の開口部を有する。
実施形態では、少なくとも1つのウェル構造は、多角形の開口部を有する。
実施形態では、少なくとも1つのウェル構造は、湾曲した開口部を有する。
実施形態では、表面構造は、複数のポスト構造を含み、少なくとも1つのポスト構造は、細胞配置のための複数の区画のうちの少なくとも1つを提供する。
実施形態では、細胞は、少なくとも1つのポスト構造に付着している。
実施形態では、メンブレンは、ガスを送達するための1つ以上のチャネルがメンブレンの第1の層に形成され、細胞ニッチが第1の層の上方のメンブレンの第2の層におけるポスト構造の近位に形成されるように、多層モノリシック構造を有する。
実施形態では、複数のポスト構造の上方に専用空間が設けられて、複数のポスト構造の上方を流れる液体培地のための流体経路を支持する。
実施形態では、流体経路は、複数のポスト構造の上方を流れる液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する。
実施形態では、複数のポスト構造の上方に専用空間が設けられて、複数のポスト構造の上方を流れる液体培地のための流体経路を支持する。
実施形態では、少なくとも1つのポスト構造は、円形断面を有する。
実施形態では、少なくとも1つのウェルポストは、多角形の断面を有する。
実施形態では、少なくとも1つのポスト構造は、湾曲した、山形の、三日月形の、またはU字形の断面を有する。
実施形態では、メンブレンを収容するように構成されたペトリ皿をさらに含む。
実施形態では、メンブレンは、ペトリ皿の底面を形成する。
実施形態では、メンブレンを緊張状態に保ち、剛性を追加するように構成された張力リングをさらに含む。
実施形態では、第1の表面とは反対側のメンブレンの第2の表面から突出する間隔ピラーであって、メンブレンを通して細胞ニッチへのガス交換を可能にするように構成された間隔ピラーをさらに含む。
実施形態では、皿を形成する底面および側壁を含むペトリ皿が提供され、底面は、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含み、底面は、第1の側および第2の側を含み、第1の側は、第1の側の基部から延在する複数の構造を含み、複数の構造の上面の下方に1つ以上の細胞ニッチ領域を形成し、側壁は、底面に接続され、底面の外周の周りに連続的かつ実質的に垂直な壁を形成する。
実施形態では、底面および側壁は、同じ物質を含む。
実施形態では、底面および側壁は、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む。
実施形態では、側壁は、底面とは異なる少なくとも1つの物質を含む。
実施形態では、側壁に支持を提供する1つ以上の保持要素をさらに含む。
実施形態では、外部環境に曝露されるペトリ皿の底面は、外部環境からのガスが少なくとも部分的にガス透過性のメンブレンを通って第1の側に通過することができ、かつ/または第1の側からのガスが第1の側から少なくとも部分的にガス透過性のメンブレンを通って外部環境に通過することができるように、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む。
実施形態では、ペトリ皿の底面は、メッシュ、布、または他の開放孔物質上に配置されて、外部環境からのガスがメンブレンと交換することを可能にする。
実施形態では、外部環境に曝露されるペトリ皿の底面は、皿が平坦な表面上に配置される場合に、ガスが底面の下方を少なくとも部分的に通過することを可能にする、その形状における1つ以上の変形形態を含む。
実施形態では、形状は、ピラー、チャネル、溝、バンプ、突起、または脚を含む。
実施形態では、形状は、1つ以上の間隔ピラーを含む。
実施形態では、ペトリ皿は、上面をさらに含み、上面が、封止メンブレンを含む。
実施形態では、上面は、シリコーンベースのメンブレンを含む。
実施形態では、ペトリ皿は、培地をペトリ皿に、またはペトリ皿から移送するための密封可能なポートを含む。
実施形態では、メンブレンの第1の側に複数の表面特徴部を含むメンブレンが提供され、表面特徴部は、1つ以上の細胞を閉じ込めることができる1つ以上の区画を含み、メンブレンは、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む。
実施形態では、複数のウェルを含むマルチウェル細胞増殖デバイスが提供され、ウェルは、ウェルの内部と接触する第1の側と、マルチウェル細胞増殖デバイスの外部と接触する第2の側とを含む底面を含み、第1の側は、複数の細胞増殖区画を提供するトポグラフィを含み、底面は、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含み、底面は、マルチウェル増殖デバイスの外部からのガスがウェルの外部から内部に通過して複数の細胞増殖ニッチのうちの1つ以上と接触することができ、かつ/または1つ以上の細胞増殖ニッチ内からのガスが第1の側から第2の側に通過することができるように構成されている。
実施形態では、第1の側のトポグラフィは、フィン、サブウェル、およびピラーのうちの1つ以上を含み、フィン、サブウェル、およびピラーは、複数の細胞増殖区画を少なくとも部分的に画定する。
実施形態では、複数のウェルの側壁は、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む。
実施形態では、第2の側は、平坦な表面上にあるときにガスが少なくとも部分的に底面の下方を通過することを可能にする、その形状の1つ以上の変形形態を含む。
実施形態では、形状は、ピラー、チャネル、溝、バンプ、突起、または脚を含む。
実施形態では、形状は、1つ以上の間隔ピラーを含む。
実施形態では、細胞培養装置が提供され、細胞培養装置は、互いに実質的に平行に延びる複数のフィン構造を含み得るメンブレンであって、実質的に平行なフィン構造が、隣接するフィン構造間に溝を画定し、メンブレンの第1の側の少なくとも1つの溝が、少なくとも細胞配置のための区画を提供し、メンブレンが、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む、メンブレンと、ガス領域を画定するメンブレンの第2の側であって、メンブレンによってメンブレンの第1の側から分離され、ガスがメンブレンを通過することができる、メンブレンの第2の側と、区画内に堆積可能な1つ以上の細胞を含む培地を受容するように構成された、メンブレンの第1の側の培地領域と、を含む。
実施形態では、細胞呼吸器装置が提供され、細胞呼吸器装置は、1つ以上のメンブレンと、複数の細胞を保持するように構成された複数の区画のうちの第1の区画を形成するために、メンブレンの第1の表面から突出する少なくとも第1のフィンおよび第2のフィンを含む複数のフィンを有する、1つ以上のメンブレンのうちの少なくとも1つのメンブレンと、を含み、メンブレンは、複数のフィンの下方のメンブレンの第1の表面の下に形成された1つ以上のチャネルを通して複数の区画にガスを送達することを容易にするために、ガス透過性および透気性である物質から形成され、少なくとも第1のチャネルは、第1の区画にガスを直接送達するように構成されている。
実施形態では、生体細胞を培養する方法が提供され、方法は、請求項1~83のいずれか一項に記載の装置を提供することと、生体細胞を装置に導入することと、細胞培地が生体細胞と接触するように、装置の第1の側に細胞培地を提供することと、を含む。
実施形態では、方法は、メンブレンの第2の側にガスを提供することをさらに含む。
実施形態では、方法は、1つ以上の細胞ニッチ上に培地を流すことをさらに含む。
実施形態では、培地を流すことは、入口を通して培地を導入することと、出口を通して培地を除去することと、を含む。
実施形態では、方法は、メンブレンの第2の側にガスを流すことをさらに含む。
実施形態では、ガスを流すことは、入口を通してガスを導入することと、出口を通してガスを除去することと、を含む。
実施形態では、方法は、1つ以上の区画内に陰圧を生成することによって、培地、生体細胞、または別の物質を1つ以上の細胞ニッチ内に流すことをさらに含む。
実施形態では、方法は、1つ以上の区画内に陰圧を生成することによって、1つ以上の区画内に細胞を維持することをさらに含む。
実施形態では、方法は、1つ以上の区画内に陽圧を生成することによって、培地、生体細胞または別の物質を1つ以上の細胞ニッチから流出させることをさらに含む。
実施形態では、方法は、1つ以上の区画内に陽圧を生成することによって、細胞を1つ以上の区画から外に誘導することをさらに含む。
実施形態では、方法は、1つ以上の区画内に陽圧および/または陰圧を生成することによって、1つ以上の区画内の生体細胞のうちの1つ以上を混合することをさらに含む。
実施形態では、陽圧および/または陰圧は、ガスをガス領域に流し、培地を培地領域に流し、ガスおよび培地の両方をそれらのそれぞれの領域に流し、ガス領域へのガスの流れを防ぎ、かつ/または培地領域への培地の流れを防ぎ、それによって2つの領域の間に圧力差を生成することによって生成される。
実施形態では、生体細胞は、ヒト、非ヒト哺乳動物、昆虫、細菌、真菌、酵母、3T3-L1、4T1、9L、A20、A172、A253、A431、A549、A2780、A2780ADR、A2780cis、AB9、AHL-1、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BOSC23、BT-20、BxPC-3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Caco-2、Cal-27、Calu-3、CGR8、CHO、CML T1、CMT12、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23-、COS-7、COV-434、CT26、D17、DAOY、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、vEL4、EM-2、EM-3、vEMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、GL261、H1299、HaCaT、HCA2、HEK293、HEK293T、HeLa、Hep G2、Hepa1c1c7、High Five、HL-60、HT-29、HT-1080、J558L、Jurkat、JY、K562、KBM-7、KCL-22、KG1、Ku812、KYO-1、L243、L1210、LNCaP、MA-104、Ma-Mel、MA2.1、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-157、MDA-MB-231、MDA-MB-361、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MIA PaCa-2、Mono-Mac-6、MOR/0.2R、MRC-5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX4、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、Neuro-2a、Neuro2a、NIH-3T3、NK-92、NTERA-2、NW-145、OK、OPCN/OPCT細胞株、P3X63Ag8、PANC-1、PC-3、PC12、Peer、PNT1A、PNT2、Pt K2、Raji、RBL-1、RenCa、RIN-5F、RMA-S、S2、SaOS-2、Sf9、Sf21、SH-SY5Y、SiHa、SK-BR-3、SK-N-SH、SK-OV-3、T-47D、T2、T84、T98G、THP-1、U2OS、U87、U373、U937、VCaP、Vero、VG-1、WM39、WT-49、YAC-1、およびYAR細胞からなる群から選択される。
実施形態では、ガスは、酸素、二酸化炭素、窒素、一酸化炭素、亜酸化窒素、硫化水素、エチレンオキシド、オゾン、二酸化塩素、および二酸化窒素からなる群から選択される。
実施形態では、培地は、DMEM、FCS、293SFM II、AEM、CDM4HEK293、SFM4HEK293、Ex-Cell293、SFM4Transfx-293、Freestyle293、ESF SFM、CDM4CHO、CHO培地、MEM、MEM Alpha、RPMI、F-10、F-12、IMDM、Medium199、Leibovitz L-15、McCoyの5A、MCDB培地、Williamの培地、CMRL培地、OptiMEM、OptiPro、AIM V、OptiPEAK Tリンパ球、ExCellerateヒトT細胞増殖培地、StemXVivo無血清ヒトT細胞ベース培地、ExpiSf CD培地、Sf-900 II/III SFM、およびTC-100昆虫培地からなる群から選択される。
実施形態では、他の物質は、廃棄物質、細胞から分泌される物質、細胞内部の物質、細胞破片、およびガスからなる群から選択される。
実施形態では、方法は、ガス領域に凍結剤を導入して、複数の区画内の細胞および細胞成分を凍結させることであって、凍結剤が、0℃未満の温度を有し、凍結剤が、気体状態または液体状態である、凍結させることをさらに含む。
実施形態では、本明細書に開示されるメンブレンおよびデバイスは、細胞を単離するための方法において使用され得る。例えば、細胞を単離する方法は、乱流および収集出口への流れを生成するために培地で脈動させることを含んでもよい。代替的に、細胞を単離する方法は、ガス領域から圧力を生じさせて、メンブレンの一部を1つ以上の区画の側部から上方および/または内側に押して、細胞を1つ以上の区画から付勢することを含んでもよい。さらに、細胞を単離する方法は、乱流を生成するために培地で脈動させることと、ガス領域から圧力を生じさせて、メンブレンの一部を1つ以上の区画の側部から上方および/または内側に押して、細胞を1つ以上の区画から付勢することとの組み合わせを含んでもよい。さらに、細胞を単離する方法は、メンブレン全体にわたって培地を流すことと組み合わせて、メンブレンを機械的に伸張させることを含んでもよい。代替的に、細胞を単離する方法は、メンブレンを機械的に伸張させ、メンブレンを倒して細胞を1つ以上の区画から遊離させることを含んでもよい。
実施形態では、本明細書に開示されるメンブレンおよびデバイスは、ウイルス粒子、タンパク質、細胞代謝物などの細胞以外の生体物質を培養物から単離するための方法において使用され得る。実施形態では、本方法は、タンパク質を単離するために使用され得る。実施形態では、本方法は、ウイルス(ウイルス粒子)を単離するために使用され得る。実施形態では、方法は、細胞代謝物を単離するために使用され得る。
実施形態では、生体物質を単離するための方法は、細胞が1つ以上の区画内に留まっている間に、培地を1つ以上の区画に流して生体物質を1つ以上の区画から洗い出し、培地を収集出口に流すことを含み得る。例えば、生体物質を単離するための方法は、メンブレンのガス領域から圧力を印加することを含んでもよい。代替的に、生体物質を単離するための方法は、1つ以上の区画に培地を流すことと、ガス領域から圧力を印加することと、を含んでもよい。実施形態では、生体物質を単離する方法は、細胞から生体物質を分離することを含む。例えば、方法は、培養中に生体物質を連続的に分離することを含んでもよい。代替的に、方法は、培養後に生体物質を分離することを含んでもよい。
HDCR用メンブレン
図1は、ウイルスベクターの高収率のために栄養素および酸素送達を分離するHDCR100の機能的概要を提供している。細胞呼吸器100は、メンブレン110、メンブレン110を貫通するガスチャネル125、およびメンブレン110の第1の側のフィン構造120の形態の表面特徴部を含む。メンブレン110の第1の側は、図1におけるメンブレンの上側面に対応する。フィン構造120は、図1に断面で示され、図7に斜視図で示されている(図7のフィン720を参照)。フィン構造120は、フィン構造120の長さに沿って互いに実質的に平行に延びている。実質的に平行なフィン構造120は、隣接するフィン構造間に溝130a~dを画定する。隣接するフィン構造間の溝130は、細胞の配置および生産に使用され得る区画を提供する。
図1は、ウイルスベクターの高収率のために栄養素および酸素送達を分離するHDCR100の機能的概要を提供している。細胞呼吸器100は、メンブレン110、メンブレン110を貫通するガスチャネル125、およびメンブレン110の第1の側のフィン構造120の形態の表面特徴部を含む。メンブレン110の第1の側は、図1におけるメンブレンの上側面に対応する。フィン構造120は、図1に断面で示され、図7に斜視図で示されている(図7のフィン720を参照)。フィン構造120は、フィン構造120の長さに沿って互いに実質的に平行に延びている。実質的に平行なフィン構造120は、隣接するフィン構造間に溝130a~dを画定する。隣接するフィン構造間の溝130は、細胞の配置および生産に使用され得る区画を提供する。
ガスチャネル125は、図1に示すように、メンブレン110を貫通している。間隔ピラー190はまた、下方からメンブレン110の外部のガスのためのインターフェースを提供する。種々の例示的な実施形態は、ガスチャネル125、および/または間隔ピラー190を含まなくてもよく、1つ含んでもよく、または1つ以上を含んでもよい。一部の例示的な実施形態では、間隔ピラー190は、積み重ねられたときに培地灌流のための間隙が残るように、メンブレン110の上部に配置されてもよい。メンブレン110の上部に位置する間隔ピラー190は、カートリッジ式HDCR(例えば、図8D、8Eおよび/または8F)において使用される実装形態である。底部の間隔ピラーは、24ウェルおよびペトリ型のHDCRデバイスにおいて使用され得る。
メンブレン110は、ガスに対して透過性である物質から形成され、その結果、酸素および他のガスが、溝130a~dによって形成される区画と交換され得る。これは、溝130a~dによって形成された区画の下方から、および側面上でのガス交換を可能にする。
メンブレン110は、ガスに対して透過性であってもよいが、液体または懸濁液状態の培地に対しては透過性が低いか、または非透過性であってもよい。培地領域140は、溝130a~dへの培地の流れを可能にする。培地は、フィン構造120および溝130a~dに対して実質的に垂直な方向に流れる。実施形態では、細胞採取のために、培地は、フィン構造120と実質的に整列した方向に流れてもよい。フィン構造120に対して実質的に垂直な培地流は、溝130a~d内の細胞保持を容易にする。フィン構造120と実質的に整列した培地流は、溝130a~dからの細胞の採取を容易にする。
第1の段階では、細胞を含有する培地は、培地領域140を横断して、溝130a~dによって形成されるシード区画に流れ得る。次いで、細胞150aは、溝130aに示されるように、区画に流入し得る。生産タイムラインを例示するために、5つの細胞生産段階が、初期細胞流動160、区画内の細胞保持165、ガス透過性メンブレン110を介したガス交換170、細胞の生産175、および細胞採取180について番号付けされている。明確にするために、細胞保持165は溝130aに示され、ガス交換は溝130bに示され、培地交換を伴う生産は溝130cに示され、採取は溝130dに示されている。ただし、これらの段階の各々は、溝130a~dのすべてにわたって時系列で生じる。例えば、細胞は、生産後、実質的に同時にすべての区画から採取される。
初期細胞流動160の間、溝130a~dに輸送される細胞150aを含有する培地は、培地領域140を通って流れる。溝130aに表されるように、溝130a~dに輸送された細胞は、大部分が区画内に保持される165。培地領域140を横切って溝130a~130d内の区画に流れる培地は、区画内の細胞150a~dに栄養素または試薬を供給することもできる。
培地は、フィン構造120および溝130a~dの長さに実質的に垂直な方向に流れる。例えば、図1において、培地は、フィン120および溝130a~dを有するメンブレン110の第1の表面上の培地領域を通って、左から右に流れる。溝130a~d内に形成された区画に対して実質的に垂直なこの培地流は、培地流が溝a~fと一致している場合、または深さを有する区画が存在しない場合よりも、培地領域から溝130a~d内の区画への運動量の伝達を少なくする。したがって、培地領域から区画への運動量の伝達は、培地が溝の長さと一致する方向に流れた場合、またはメンブレン110上の表面構造によって形成された区画が存在しなかった場合よりも低い。区画への運動量の伝達および流れが低減または最小化されることにより、溝によって形成された区画内の細胞150aに対する剪断力が低減または最小化され、これにより、区画内の細胞150aに対する細胞変性の影響が低減され、細胞またはバイオプロダクト生産の段階中の細胞の流失が防止される。
培地が培地領域140を介して上方から流れる間に、区画間で、フィン120を有するガス透過性メンブレン110を介してガス交換170が生じる。例えば、ガスチャネル125またはピラー190からの酸素は、溝130b内の細胞ニッチに流入して細胞150bを酸素供給してもよく、細胞からの二酸化炭素廃棄ガスは、溝130b内の細胞ニッチからフィン120を有するメンブレン110に流出してもよい。このガス交換により、二酸化炭素の蓄積を防止しながら、細胞150bを酸素供給された状態に保つことが可能となる。
細胞は、高密度に増殖し、バイオプロダクト(例えば、タンパク質、ウイルス、代謝物)生産175を生じるか、または生じるように誘導される。ガス交換に加えて、細胞、ウイルス、およびバイオプロダクト生産175はまた、細胞増殖のための栄養素の送達、および廃棄物の除去を必要とする。細胞増殖のための栄養素は、培地領域140を介して、溝130cによって形成される細胞ニッチ内の細胞150cに、培地中で送達され得る。さらに、細胞150cの呼吸からの廃棄物は、培地領域140を介して培地中に運び去られ得る。
培地中の可溶性栄養素の送達から酸素供給を分離することで、HDCR100は、現在のバイオリアクターよりもはるかに高い細胞密度を維持することができる。また、一体化された細胞保持溝により、従来のバイオリアクターにおける細胞生存率に典型的に影響を及ぼす剪断力から細胞を保護し、それにより生産能が増加する。これは、より高い収率、より速い生産、およびより低いコストをもたらし得る。
例えば、細胞の体積(Vcell)は、細胞増殖に利用可能なリアクターの体積(Vbioreactor)の約10%~25%を占める場合がある。細胞増殖に利用可能なリアクターの体積は、溝130a~dの体積に対応し得る。一部の実施形態における一部の細胞について、これは、約108個の細胞/mLの密度に変換され得る。
一旦生成されると、細胞またはウイルス含有細胞150dなどのバイオプロダクトは、トリプシン、EDTA、または乱流を使用して採取され得る。
メンブレン100は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を含むシリコーンなどの高いガス透過(溶解度および拡散速度の関数)を可能にする物質から形成され得る。
ガス透気速度は、概してメンブレンの厚さに反比例する。非常に薄い寸法では、物質の透過性はまた、薄いパリレン(<10μm)で観察されるように、大幅に増加し得る。この事実を用いると、従来はガスのバリアと考えられていたポリマーが、好適に透気性を持つようになり得る。また、小さな細孔の吹き出し点が十分に高いため、表面からガスの泡を発生させることなく、中空メンブレン内で圧力駆動の流れを作ることができる多孔質メンブレン物質も使用することができる。メンブレンの所望の高いガス透気特性を達成するために、アプローチの組み合わせを使用することもできる。
メンブレン100および表面特徴部を表面処理することで、細胞付着および増殖を容易にすることができる。広く適用可能な手法として、パリレンの薄層でメンブレンをコーティングし、酸素プラズマ処理および/またはアンモニアプラズマ処理を用いてメンブレンをプラズマエッチングして、メンブレンを親水性にし、かつ/または細胞付着を改善することが挙げられる。
さらなる方法としては、タンパク質(例えば、アガロース、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリン)でのコーティングまたは他のコーティング(例えば、乳酸、ラミニン、ポリ-D-リジン、またはポリ-L-リジン)が挙げられる。
図1と一致するメンブレンを含むHDCRは、以下の特徴および利点を有する。第1に、ガス交換および栄養素送達が切り離される。特に、酸素および二酸化炭素の交換は、区画におけるメンブレンおよび表面特徴部(フィンなど)の透過を介して行われ、一方、培地は、独立して区画全体に灌流される。これは、約108個の細胞/mLのオーダーの細胞密度、または約10%~25%のVcell/Vbioreactor比の生産を可能にし、これは、細胞生産の従来の方法よりも効率的な培地使用を可能にし、そして細胞生産の従来の方法において必要とされるような塩基添加の必要性を排除する。
第2に、HDCRメンブレンにおける区画および/またはパターン化された凹部は、一体化された細胞保持を提供する。この場合、メンブレン100は、細胞を保持し、そしてこれらを剪断力および区画上の培地の灌流によって生じる流出から保護する。メンブレン100のこの構造は、細胞変性効果による細胞の喪失を低減または排除する。また、補助音響、TFF、または他の補助濾過システムの必要性を排除する。区画および/またはパターン化された凹部は、懸濁液中で細胞を増殖させるため、付着性細胞を増殖させるため、またはマイクロキャリア適合性細胞を増殖させるために好適である。
第3に、メンブレン100は、高細胞密度であっても、ガスおよび培地拡散限界の両方を下回るように操作された、実質的に同一の区画または細胞増殖のための区画を有するHDCRメンブレンの微細パターン化アーキテクチャを有する均一な条件を提供する。非常に高いガス交換面積対体積比は、しばしば細胞呼吸の制限因子である酸素透気速度が最大となっていた。これらのメンブレンは、細胞生産のための装置全体にわたって均一な条件を可能にする。また、より速い細胞増殖およびより高いウイルス力価のために、酸素分圧の正確な制御を提供する。均一な条件により、酸素の開ループ制御が可能となり、例えば、酸素の物質移動容量係数がkLa>約40/時間となる。
細胞ニッチの形状は、細胞の代謝要求および生産プロセスに応じて調整することができる。例えば、体積代謝率の低い培養物には、溝が深く広いニッチを使用することで、細胞増殖のための体積比Vcell/Vbioreactorを高くすることができる。逆に、体積代謝率の高い培養物(バクテリアなど)は、Vcell/Vbioreactorを犠牲にして、より浅く狭い溝を使用することで対応できるようになる。ニッチ体積、ガス交換速度、細胞保持、および栄養素/廃棄物交換の間の最適なトレードオフは、統合マルチフィジックス有限要素モデルを使用して実行される。
第4に、メンブレンは、既存の充填床設計における4cmの床長と比較して、例えば40cmを超える床長を有する空間効率のよい実装形態を可能にする。これは、GMP空間の容積生産能を増加させるためのより最適なフォームファクタの生成を可能にする。さらに、メンブレン100は、積み重ねられ、包装され、標準的な細胞インキュベータに適合され得る。シミュレーションおよび予備データは、約108個の細胞/mLの極めて高密度または約10%~25%のVcell/Vbioreactor比を達成するという目標を支持する。細胞当たり約104~105ベクターゲノム(vg/細胞)の収率は、1013vg/mlの生産に換算される。したがって、約1016~17vgバッチのcGMPベクターの生産は、現在の方法で必要とされる約500~1000リットルではなく、約1~10リットルの培地で可能とすることができる。これまで一部屋分の生産スペースが必要だったものが、インキュベータ1台で生産できるようになる。かかる高い効率では、本明細書に記載される実施形態は、生産コストを減少させ、生産を速め、ウイルス、ベクター、およびワクチン生産の分野を破壊し、体積を約10倍増加させ、生産速度を約2~10倍増加させることができる。
第5に、メンブレン100は、例えば液体シリコーンゴム(LSR)射出成形に適合する、大量生産可能でスケーラブルな設計を有する。メンブレンは容易にスケーリングし、積み重ねることができる。したがって、メンブレン100は、確立された生産エコシステムにおいて低コストで生産することができる。それらは、臨床スケールまで拡張可能なバッチサイズで実装され得る。
第6に、メンブレン100は、低抵抗流体経路を可能にする区画の上方の専用培地空間とともに、低流体抵抗を提供する。これは、高価なポンプまたは動力ポンプの必要性を排除する。メンブレン100を有するカートリッジは、流量調節器とともに重力供給される培地を有し得る。
第7に、メンブレン100は、区画内の混合を誘発するために、ガスまたは流体圧力の変動または脈動に応答して膨張および収縮するように構成されている。かかる混合は、区画内の試薬またはウイルスのより均一な分散を可能にする。かかる混合能力はまた、細胞の採取を容易にし得る。
高密度細胞調節因子のモデリング
図2は、図1のHDCRデバイスのモデルを示している。マルチフィジックス有限要素モデル(FEM)(Comsol Inc、MA、USA)の開発により、図2のHDCRデバイス200における細胞増殖、栄養素およびガス輸送、細胞保持、灌流速度、ならびに圧力低下の間の相互関係の理解が可能になる。HDCR200は、フィン20を有するメンブレン210を含み、溝230a~d内に区画を有する。
図2は、図1のHDCRデバイスのモデルを示している。マルチフィジックス有限要素モデル(FEM)(Comsol Inc、MA、USA)の開発により、図2のHDCRデバイス200における細胞増殖、栄養素およびガス輸送、細胞保持、灌流速度、ならびに圧力低下の間の相互関係の理解が可能になる。HDCR200は、フィン20を有するメンブレン210を含み、溝230a~d内に区画を有する。
240において、液体培地は、メンブレン210の上方の培地領域を通って流れる。265において、液体培地中の細胞は、溝230a内の細胞ニッチに沈降し、保持される。ニッチ上の細い実線(U字型、細胞ニッチの底部に向かって下降するメニスカス)は、流速の上向き成分が細胞の沈降速度未満である流体境界(すなわち、ウォッシュアウト境界)を示している。したがって、境界より下の細胞は保持される。この実験では、培地の入口速度を約100μm/秒と仮定した。デバイスおよびシステムは、約1μm/秒~約1m/秒のオーダーの培地入口速度に対して構成することができる。比較的低速の動作速度は、区画内の流体定常状態(すなわち、保持モード)に対応し得る。比較的高い動作速度は、区画内の流体的乱流状態(すなわち、フラッシングモード)に対応し得る。培地の100μm/秒の入口速度は、区画と比較して、一次培地経路における層流またはほぼ層流の栄養素の流れ、グルコースの投入、細胞の増殖および保持、廃棄物の排出、過剰な細胞損失を伴わない十分な混合を促進するのに十分であった。増殖プロセスの間、細胞-細胞および細胞-基質付着が増加し、それにより、「真の」ウォッシュアウト境界がより高くなり得ることに留意されたい。灌流培地区画内の矢印の長さは流速に比例しているため、より小さい矢印はより低い流速に対応する。
専用培地経路を設けることにより、異なる培地速度で動作する自由度は高い。流量は、1μm/秒程度の低流量から数cm/秒、1m/秒程度の高流量まで可能である。さらに、培地灌流は、脈動的または間欠的であり得る(すなわち、新鮮な培地のボーラスがシステムに供給され、その後停止し、消費され、新鮮な培地のボーラスで置換される、など)。培地の流速は、リアクターを出る際に培地が培地のグルコース含量の約50%を失うように設定することができる。流速は、フィードバック制御され得る。細胞密度が比較的低い場合、灌流の必要性は比例して低くなり得る。例えば、長さ(y軸)が約40cmのバイオリアクターで約108個の細胞/mLを生産するには、約100μm/秒の速度で十分であると判断された。また、播種工程では、約1μm/秒の速度が、約106個の細胞/mL(すなわち、合理的な播種密度)を生産するのに十分であると判断された。
225において、ガスは、メンブレン210の表面下のガスチャネルからフィン220を有するメンブレン210を通って、溝230b内の細胞ニッチ(区画)へ、かつそこから灌流する。270において、これは、溝230b内の細胞ニッチへの酸素の送達およびそこからの二酸化炭素の除去を可能にする。245において、グルコースを含む可溶性栄養素は、拡散によって培地流から溝230c内の細胞ニッチに送達される。280において、可溶性廃棄物は、拡散によって溝230内の細胞ニッチから培地流に除去される。提示を明確にするために、これらの工程265、270、275、および280は、それぞれ溝230a、230b、230c、および230d内の個々の区画内で行われるものとして示されているが、実施形態では、有限要素モデルと同様に、これらの工程は、メンブレン210全体にわたる溝内の複数の区画にわたって行われる。
有限要素モデルは、高密度ガス呼吸器200のための細胞送達および保持265、ガス交換270、栄養素送達275、ならびに廃棄物除去280の動作の各々をモデル化している。このモデルは、寸法、流量、濃度、配向、および圧力を調節して、異なる用途のためのメンブレンの設計に役立ち得る。
例えば、実施形態は、約0.1mm/秒の培地流速で、約2×108個の細胞/cm3のシステム細胞密度を支持する設計を含む。この培地流速は、単一細胞保持のために十分に遅いものであり、約40cm長を超えるメンブレンを送達し得る。この実施形態は、約5Paのみの圧力ヘッドを必要とし、そしてすべての細胞が、酸素についての代表的な細胞のMichalis-Menten定数(KM,O2=約1μM)より大きい酸素分圧を受けることを確実にする。
この実施形態のためのメンブレンは、シリコーン鋳造またはLSR射出成形による精密なメンブレン構造を可能にする、CNC機械加工による鋳型作製プロセスを使用して作製され得る。これにより、ピラー、コネクタ、ニッチ、およびマニホールドを高収率および低コストでメンブレンに直接組み込むことが可能になる。化学蒸着およびプラズマプロセスは、メンブレン表面を親水性/湿潤性にし、細胞付着を可能にするために使用され得る。
この実施形態のためのメンブレンは、図8A~8Fに関して以下に記載されるカートリッジのようなHDCRカートリッジを作製するために接続および積み重ねられ得る。
メンブレンの動的特徴
図3は、圧力変動の存在下での図1のメンブレンの変形を示しており、その結果、図1のHDCRデバイスの区画に出入りする培地が流れる。概して、メンブレンは圧力の変化に応答して変形し得る。例えば、圧力に向かってまたは圧力から離れて上方または下方に変形してもよい。
図3は、圧力変動の存在下での図1のメンブレンの変形を示しており、その結果、図1のHDCRデバイスの区画に出入りする培地が流れる。概して、メンブレンは圧力の変化に応答して変形し得る。例えば、圧力に向かってまたは圧力から離れて上方または下方に変形してもよい。
図3の300aにおいて、メンブレン310aは中立圧力にある。したがって、フィン320aおよび溝330aを有するメンブレン310aは変形しない。メンブレン310aの上方を流れる培地中の細胞、栄養素または廃棄物は、溝330aと溝の上方の培地流との間で拡散し得るが、細胞または他の液体は、圧力変動に起因して、溝330aに引き込まれることも溝330aから排出されることもない。
図3の300bにおいて、メンブレン310bは陰圧である。したがって、フィン320b間の溝330bの領域におけるメンブレン310bの下面は、メンブレン310bに作用する陰圧によって下方に変形する。細胞、栄養素、または他の物質は、メンブレン310bの変形および陰圧(図3の下方向)に起因して、溝330b内に引き込まれる。
図3の300cにおいて、メンブレン310cは陽圧である。したがって、フィン320c間の溝330cの領域におけるメンブレン310cの下面は、メンブレン310cに作用する陽圧によって上方に変形する。細胞、廃棄物、または他の物質は、メンブレン310cの変形および陽圧(図3における上向き方向)に起因して、溝330bから引き出される。
圧力は、300a、300b、および300cの中立圧力、陰圧、および陽圧状態の間で変動、循環、または脈動させることができる。この変動、サイクリング、または脈動は、300a、300b、および300cの段階によって示されるように、周期的移動または脈動移動を可能にし得る。かかる変動、循環、または脈動は、溝330a~c内の区画の内容物を混合するために使用することができる。
図4は、開示された技術の種々の例示的な実施形態による混合および栄養素の輸送を強化するための脈動流の使用を示している。メンブレンを通る/メンブレンを横切る流体圧力の周期的な脈動化は、細胞区画における増殖および培地混合または噴出を誘導して、栄養素および酸素輸送を強化することができる。平面(シート)メンブレンは、主流路に垂直な正味の流れに脈動圧力を整流するためにマイクロディフューザを組み込むことができる。周期的脈動の段階が、段階400a、400b、および400cに示されている。400aにおいて、メンブレン410aは中立状態にあり、流体圧力は増加しているので、流れ420aは上方に向かって流れている。400bにおいて圧力が増加し、その結果、メンブレン410bのサイズが拡大し、流体をより大きな強度で上方に流動させ420b、より多くの混合が生じる。次いで、400cにおいて圧力が低下し、流体が下方に流れ420、メンブレンの上縁部に対する圧力が低下し、410aにおけるメンブレンのサイズまでサイズが縮小して戻る。これらの段階400a、400b、および400cは繰り返すことができ、細胞ニッチにおける混合をもたらす。
メンブレンアーキテクチャおよび表面特徴部
図5は、開放メンブレンアーキテクチャを示している。
図5は、開放メンブレンアーキテクチャを示している。
メンブレン510aは、フィン520aと、フィン520a間の溝530a内の区画とを有する。培地は培地領域540aを通って流れる。培地からの細胞は溝530a内に沈降する。流体マニホールドは、培地領域540aに培地を供給する。培地は収集、再循環または廃棄することができる。
メンブレン510bは、フィン520bと、フィン520b間の溝530b内の区画とを有する。培地は培地領域540bを通って流れる。メンブレンは、培地が下り坂を流れるときに培地流が重力によって駆動されるような角度で配置される。流体マニホールドは、培地領域540bに培地を供給する。培地は収集、再循環または廃棄することができる。
メンブレン510cは、フィン520cと、フィン520c間の溝530c内の区画とを有する。培地は培地領域540bを通って流れる。メンブレンは、培地が下り坂を流れるときに培地流が重力によって駆動されるような角度で配置される。培地の流れは、空気を引き込むように作用する。流体マニホールドは、培地領域540bに培地を供給する。培地は収集、再循環または廃棄することができる。
メンブレン510dは、フィン520dと、フィン520d間の溝530d内の区画とを有する。培地は、培地領域540dにおいて多孔性または繊維状のメンブレン550を通って流れる。多孔性または繊維状のメンブレン550は、溝530d内に流体を引き込み、溝530dへ、または溝530dから流体を送達するウィックとして作用する。メンブレンは、培地が下り坂を流れるときに培地流が重力によって駆動されるような角度で配置される。培地の流れは、空気を引き込むように作用する。流体マニホールドは、培地領域540bに培地を供給する。培地は収集、再循環または廃棄することができる。
図6は、キーストーン形状を有するフィン620aを有するメンブレン610aを示しており、これは、溝630aの上部の開口635aがメンブレン610aの表面により近い少なくとも一部の点よりも狭い溝630aを形成する。このキーストーン状フィンの形状は、図1、2、3および5に示したフィンの形状とは異なる。
他のフィン形状も可能である。フィンは、先細であってもよく、涙滴形状を有する溝を形成するように湾曲していてもよく、角柱であってもよく、またはニッチ内の細胞を剪断から保護する区画を形成する任意の他の形状を有してもよい。涙滴形状などの一部の他の形状に適用されるキーストーン形状の1つの特徴は、溝の上部における開口部が、メンブレンの表面により近い、より低い高さにおける断面幅より狭くなり得ることである。かかる狭い開口部は、細胞を剪断からさらに保護することができ、増殖する細胞を保持する能力を改善することができる。
メンブレン610bの機械的伸張は、メンブレン610の長さをフィン620bおよび溝630bの断面に沿った方向に伸張させる。この結果、溝630bの上部の開口部635bが広がり、図6に示すように、溝630bの内容物を取り出すことが容易になる。
機械的な伸張に加えて、フィン620cおよび対応する溝630cが反転される(上向きではなく下向きになる)ように、メンブレン610cを反転させてもよい。溝630cは、溝630cの内容物が重力によって落ちるように、下向きの開口部635cを有する。メンブレン610cは、伸張および/または反転させることができる。
図7は、異なる実施形態に対応する種々のメンブレンを示している。
メンブレン700aは、突出フィン720を有する平坦な表面710を含む。フィン720は実質的に平行である。隣接するフィン720の間には溝730が形成されている。フィン720は、フィン間に形成された溝730と同様に、矩形または角柱状の断面を有する。図6に関して述べたように、キーストーン、涙滴形、角柱形、先細形、多角形、または湾曲形などの他のフィン断面形状が可能である。一部のフィン720は、より低い高さ(表面710により近い)における断面の幅よりも狭い開口部を有するように成形され得る。メンブレン710およびフィン720はガス透過性であり、その結果、ガスはメンブレンおよび/またはフィンを通って溝730内の区画に灌流することができる。培地は、溝730の長さに平行でない方向に、フィン720および溝730の上部を横切って流れることができる。代わりに、培地は、フィン720および溝730の長さに実質的に垂直な方向に流れて、フィン内の区画内の細胞に対する剪断力を減少させてもよい。
メンブレン700bは、ウェル740の二次元アレイを含む。ウェル740は、培地が表面上を流れるときに細胞を剪断から保護する保護区画を形成するという点で、溝720と同様の機能を果たす。メンブレン700bはガス透過性であり、その結果、ガスはメンブレンおよびウェル壁を介してウェルへ、かつそこから灌流する。
メンブレン700cは、表面特徴部を含まない。表面特徴部がない実施形態では、メンブレン700cはガス透過性である。
メンブレン700dは、ポスト750のアレイを含む。ポスト750は、ポストに近接する区画を形成する。三日月形、山形、またはU字形を有するポストは、他の形状を有するポストよりも流れの一方向において良好な保護を提供することができる。これらの区画は、ウェル740または溝730内のニッチよりも開放されているが、ポスト750に付着し得る付着性細胞に対してある程度の保護を提供する。ポスト750は、ガス透過性であり、その結果、ガスは、ポスト750に付着した細胞またはその近傍の細胞へ、およびそこから灌流する。
フィン720、ウェル740、およびポスト750は、メンブレンから突出する、またはメンブレンの中に陥凹する表面特徴部の例である。表面特徴部はすべてガス透過性であってもよい。
HDCRは、フィンおよび溝を有するメンブレン700a、ウェルを有するメンブレン700b、表面特徴部を有さないメンブレン700c、および/またはポストを有するメンブレン700dのうちの1つまたは組み合わせを使用し得る。
HDCRカートリッジ
図8Aは、HDCRデバイスの構造および形成を示している。図8Aは、ガス層820に接合された培地層810の4分の1の図を示している。培地層810およびガス層820である。ガス層820は、培地層810の下に接合され、その結果、下方からのガス交換および酸素供給は、上からの液体培地灌流から物理的に分離される。培地層810およびガス層820は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)から形成され得る。
図8Aは、HDCRデバイスの構造および形成を示している。図8Aは、ガス層820に接合された培地層810の4分の1の図を示している。培地層810およびガス層820である。ガス層820は、培地層810の下に接合され、その結果、下方からのガス交換および酸素供給は、上からの液体培地灌流から物理的に分離される。培地層810およびガス層820は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)から形成され得る。
図8Bは、図8Aのメンブレンの表面特徴部によって形成された区画上の培地灌流(暗)のための空間を画定する間隔ピラーを示している。
図8Cは、互いに積み重ねられた複数のメンブレン860a、860b、860c、および860dを示しており、積み重ねられたメンブレン860a~dのコーナー部にガスマニホールド850があり、積み重ねられたメンブレンの各々は図8Aおよび8Bのメンブレンに対応する。
図8Dは、ガスアクセスポート890および培地アクセスポート880を有する、図8Cの積み重ねられたメンブレン860a~dを収容するエンクロージャ870を示している。ガスアクセスポート890の各々は、ガス入口またはガス出口として機能し得る。同様に、培地アクセスポート880の各々は、培地入口または培地出口として機能し得る。図8Dは、2つの培地アクセスポート880および4つのガスアクセスポート890を示すが、他の実施形態は、異なる数のガスアクセスポートおよび/または培地アクセスポートを有してもよい。
図8Eは、図8DのHDCRカートリッジが細胞のインキュベーションのために封入され得るインキュベータ895を示している。
図8Fは、図8A~8Dに関して上述した構成要素を含むHDCRカートリッジの例を示している。HDCRは、細胞増殖ニッチを最適化し、非常に高密度の生産細胞株が増殖することを可能にする。HDCRは、独立して灌流可能な培地区画に入れられた、積層可能でガス灌流可能な透気性のポリジメチルシロキサン(PDMS)メンブレンから構成される。細胞は、メンブレンの正確にパターン化された溝に沈降し、この溝は、細胞を保持し、流体剪断力から保護し、そしてメンブレンの透過を介して十分な酸素供給を提供する。一体化された間隔ポストは、可溶性栄養素、試薬、および/またはウイルスの送達ならびに廃棄物の除去および細胞/バイオプロダクトの採取のために、細胞ニッチ上に薄い培地フィルムを維持する。メンブレンは、業界標準の液体シリコーンゴム(LSR)射出成形によって、大きなシートで安価に製造することができる。コーティング工程は、それらを親水性にし、細胞付着を促進する。かかる装置は、完全に密閉されたオートクレーブ可能なベクター生産カートリッジの基礎を形成する。一体化した細胞保持技術は、開示された設計を付着性細胞および懸濁細胞の両方に適合させる。
ガス灌流可能なガス透過性メンブレンは、高密度の細胞増殖のために十分な酸素およびガス交換を送達しながら、大きな表面積を提供する。これらのメンブレンは、折り畳むかまたは積み重ねることができ、高い表面積対体積比を達成する。細胞は、メンブレンの表面上で直接、またはメンブレンの間に挟まれた基材上で増殖させることができる。積み重ねられたメンブレンの間の間隙を溶液で灌流して、メンブレン積層体の中へまたはメンブレン積層体から成分を送達または除去することができる。灌流の間隙および速度は、デバイス内で好適な剪断速度を維持するように選択され得る。ガス供給源とは別に培地を送達するために、システム全体にわたってチューブまたはチャネルのネットワークを使用することができる。チューブまたはチャネルは、分子から細胞に及ぶ種々のサイズの粒子がチューブの中または外に通過することを可能にする細孔を含有し得る。これは、細胞をデバイス内に播種することができ、かつ/またはウイルスを送達して細胞に感染させることができる手段である。メンブレン自体に細孔を形成して、積み重ねられたメンブレンをそれらの表面に対して垂直に灌流する手段を提供することができる。この構成では、流れの方向が細胞と平行ではないので、流れは細胞に対して最小の剪断力を引き起こす。次いで、栄養素は、これらの細孔から離れて拡散することによって細胞に到達する。
ウイルス生産における酸素の役割は十分に確立されており、概説されている。いわゆる「細胞密度効果」とは、限られた酸素または栄養素の利用可能性に応答して細胞特異的ウイルスの収率が低下する傾向を指す。興味深いことに、PEIによるHEK293懸濁細胞の一過性トランスフェクションは、低密度(約106個の細胞/mL)よりも高密度(>約107個の細胞/mL)でより単純で2倍効率的であることが実証されている。したがって、代謝物の制限を克服することは、収率の向上を実現するための鍵となる。例えば、大量の酸素および栄養素を提供するためにウイルス感染段階で新鮮な培地を用いて生産量を増加させる体積拡大流加プロセスでは、付着性ウシ腎臓細胞におけるパラポックスウイルスオビスについて、細胞当たりの生産能が最大40倍増加することが報告されている。同様の改善が、ほぼすべての臨床的に関連するウイルスについて報告されている。
さらに、DNA/タンパク質合成の増加により、ウイルス複製中に酸素摂取速度が大幅に増加する。例えば、バキュロウイルスに感染したSf9細胞では、酸素摂取速度は1.3倍増加した。
バイオリアクターは、感染後のこの増加した酸素要求量に適合させる必要がある。既存の灌流システム(iCellisなど)では、細胞の保持を静止担体への付着に依存しており、酸素供給を維持するために流量を増加させることは、細胞が細胞変性効果により付着力が低下し、増加した剪断で剥離するため実行不可能であった。本発明者らの高密度バイオリアクターは、ガス供給と栄養素供給とを切り離し、細胞保持を一体化することで、ウイルス生産に最適な環境を実現している。予備的な結果およびモデリングに基づいて、本発明者らのHDCRは、業界をリードするiCellisバイオリアクターシステムと比較して、大幅に改善された空間効率(>10倍)を有しており、コストはわずかであった(<1/4倍)。
図9は、10枚の積み重ねられたメンブレンを有する開放メンブレン高容量細胞呼吸器デバイス900aの例を示している。900aの領域910が900bに示されており、これは、培地チャネル940を介してメンブレン960に培地を供給する流体マニホールド930を示している。メンブレンの溝950は、細胞を保持し増殖させる区画として機能する。900cは、10枚のメンブレン960のスタックを有する高容量細胞呼吸器デバイス900aの側面図を示している。
図10は、一体化された細胞保持ニッチ、間隔ピラー、ガス灌流空間、およびガスマニホールドを有するHDCRのプロトタイプを示している。1000aは、HDCRの上面図を示している。1000bは、1000aの領域1010の拡大図である。1000bは、細胞ニッチ溝および下にあるガス区画タイの詳細図を示している。1000cは、1000aの領域1020の拡大図である。1000cは、積層可能なガスマニホールドを示している。1000dは、1000aの1030に対応する側面図の拡大図である。この側面図1000dは、細胞および培地チャネル、ならびに間隔ピラーを示している。
図11は、HDCR1100aについての気泡、空隙、凝縮、および蒸発の管理を示している。1100bは、気泡1110を有するメンブレンを撮影した写真である。メンブレンは、イメージングおよびオートクレーブに適合性のあるエンクロージャ内に配置された。培地区画を通して液体をパージすることにより、気泡1110および空隙を効率的に排除した。予備加湿ガスは蒸発を防止する。予熱ガスはガス区画内の凝縮を防止する。パージ後、メンブレンは、写真1100cに示されるように、もはや気泡または空隙を有していない。
図12は、長さ約34cm、幅約10cmの中規模HDCRのメンブレンプロトタイプの写真1200であり、プロトタイプは、本明細書に記載される積層可能なHDCRメンブレンの生産のリスクを軽減するために、射出成形を使用して作製された。図12Aは、図12のメンブレンプロトタイプの一部の拡大図1200aである。
24ウェルプレートHDCR
図13は、ウェルプレートの各々にパターン化された溝が接着されたシリコーンインサート1320を有する24ウェルプレート1310を示している。24ウェルプレートは、百万個の細胞規模の細胞培養に使用することができる。24ウェルプレートは、10億個の細胞スケールのペトリ皿、または積み重ねられたメンブレンを有する1兆個の細胞スケールのカートリッジにスケールアップする前に、細胞播種密度、増殖曲線、培地供給速度、酸素分圧、トランスフェクション方法、生産/パッケージング、および他のパラメータを用いて最適化および実験するための高スループットスクリーニングツールとして使用され得る。ウェルプレート内のウェルは、同じではなく(例えば、溝および/またはフィンの寸法が、有効な構成および有用な形状を識別するために、ウェルにわたって変動することを意味する)、図7のウェル740と比較すると、はるかに大きいスケールである。図13Bは、図13のシリコーンインサートの1つにおける溝1330の拡大図である。
図13は、ウェルプレートの各々にパターン化された溝が接着されたシリコーンインサート1320を有する24ウェルプレート1310を示している。24ウェルプレートは、百万個の細胞規模の細胞培養に使用することができる。24ウェルプレートは、10億個の細胞スケールのペトリ皿、または積み重ねられたメンブレンを有する1兆個の細胞スケールのカートリッジにスケールアップする前に、細胞播種密度、増殖曲線、培地供給速度、酸素分圧、トランスフェクション方法、生産/パッケージング、および他のパラメータを用いて最適化および実験するための高スループットスクリーニングツールとして使用され得る。ウェルプレート内のウェルは、同じではなく(例えば、溝および/またはフィンの寸法が、有効な構成および有用な形状を識別するために、ウェルにわたって変動することを意味する)、図7のウェル740と比較すると、はるかに大きいスケールである。図13Bは、図13のシリコーンインサートの1つにおける溝1330の拡大図である。
ペトリ皿HDCR
図14は、HDCRペトリ皿1400を示しており、フィン1420を有するガス透過性メンブレン1410は、ペトリ皿1400の底面を形成し、ガスは、メンブレン1410の下方から拡散し、そして細胞および栄養素は、メンブレンの上方の深いリザーバ1450から供給される。メンブレン1410の底部の間隔ピラー1440は、ガスがペトリ皿1400の下方を流れることを可能にする。張力リング1460は、メンブレンを緊張状態に保ち、ペトリ皿1400に剛性を加える。フィン1420は、溝1430内に区画を画定する。メンブレン1410およびフィン1420はガス透過性である。例えば、酸素は、間隔ピラー1440またはメンブレン1410の側面を通ってメンブレン1410に入り、メンブレン1410およびフィン1420を通って溝1430内の区画に透過してもよい。二酸化炭素は、フィン1420およびメンブレン1410を透過することによって溝1430内の区画から除去され、間隔ピラー1440またはメンブレン1410の側面の近くでメンブレン1410から出ることができる。メンブレン1410の上方のリザーバ1450および溝1430内の区画は深く、栄養素の豊富な培地を補充または交換する必要性を減らす。多くの用途では、リザーバ1450内の培地を補充または交換する必要がない場合がある。
図14は、HDCRペトリ皿1400を示しており、フィン1420を有するガス透過性メンブレン1410は、ペトリ皿1400の底面を形成し、ガスは、メンブレン1410の下方から拡散し、そして細胞および栄養素は、メンブレンの上方の深いリザーバ1450から供給される。メンブレン1410の底部の間隔ピラー1440は、ガスがペトリ皿1400の下方を流れることを可能にする。張力リング1460は、メンブレンを緊張状態に保ち、ペトリ皿1400に剛性を加える。フィン1420は、溝1430内に区画を画定する。メンブレン1410およびフィン1420はガス透過性である。例えば、酸素は、間隔ピラー1440またはメンブレン1410の側面を通ってメンブレン1410に入り、メンブレン1410およびフィン1420を通って溝1430内の区画に透過してもよい。二酸化炭素は、フィン1420およびメンブレン1410を透過することによって溝1430内の区画から除去され、間隔ピラー1440またはメンブレン1410の側面の近くでメンブレン1410から出ることができる。メンブレン1410の上方のリザーバ1450および溝1430内の区画は深く、栄養素の豊富な培地を補充または交換する必要性を減らす。多くの用途では、リザーバ1450内の培地を補充または交換する必要がない場合がある。
図15は、HEK293細胞がマイクロキャリア上で培養された、図14のペトリ皿に対応するペトリ皿1500aの一例を示している。微細加工された溝およびフィンは、細胞増殖のための酸素最適化ニッチを提供する。図15の例では、マイクロキャリア1500b上のHEK293細胞はペトリ皿1500aの溝に集中し、単一のHDCRペトリ皿から約4億個のHEK293細胞1500cの培養および採取をもたらす。これは、従来のペトリ皿から可能な量よりもはるかに多い量である。各HDCRペトリ皿は、従来の方法を使用して細胞を培養している25個のペトリ皿と同数の細胞を生成する。これにより、インキュベータ空間および技術者の時間が約25:1の比率で解放される。プレートはオートクレーブ処理可能であり、再使用可能である。
シリコーンシート型バイオリアクター
図16は、HDCRメンブレン1600を有するシリコーンシート型バイオリアクター1600を示している。培地は、入口1630を介してメンブレン1600に流入し、メンブレン1640から流出する。図1600bは、細胞が増殖可能なマイクロキャリア1660、およびメンブレンに垂直なメンブレンタイ1670を含む拡大写真である。メンブレンタイ1670は、メンブレン1610を適所に固定する。メンブレンに垂直なフィルタポスト1680は、マイクロキャリア1660にアクセス可能な領域の境界を画定する境界またはフェンスを提供する。フィルタポスト1680は、流体抵抗がより低いマイクロキャリアのないメンブレンの領域において培地がより自由に流れるので、マイクロキャリア損失なしに培地の灌流を可能にする。フィルタポスト1680は、マイクロキャリアがフィルタポスト1680を越えて移動するのを阻止するように配列され得る。
図16は、HDCRメンブレン1600を有するシリコーンシート型バイオリアクター1600を示している。培地は、入口1630を介してメンブレン1600に流入し、メンブレン1640から流出する。図1600bは、細胞が増殖可能なマイクロキャリア1660、およびメンブレンに垂直なメンブレンタイ1670を含む拡大写真である。メンブレンタイ1670は、メンブレン1610を適所に固定する。メンブレンに垂直なフィルタポスト1680は、マイクロキャリア1660にアクセス可能な領域の境界を画定する境界またはフェンスを提供する。フィルタポスト1680は、流体抵抗がより低いマイクロキャリアのないメンブレンの領域において培地がより自由に流れるので、マイクロキャリア損失なしに培地の灌流を可能にする。フィルタポスト1680は、マイクロキャリアがフィルタポスト1680を越えて移動するのを阻止するように配列され得る。
図17は、図18のシリコーンシート型バイオリアクターなどのシリコーンシート型バイオリアクター1700の断面の上面図である。メンブレン1710の上面図は、図16のフィルタポスト1680と同様のフィルタポストのアレイ1720を含む。フィルタポスト1720は、マイクロキャリア1770にアクセス可能な領域1740、ならびにマイクロキャリア1770にアクセス可能でない領域1730を画定する。これにより、マイクロキャリア1770に付着した細胞を有するマイクロキャリア1780が領域1740に蓄積される。培地流は矢印1750から入り、メンブレン1710を通って図17の左から右へ矢印1760に向かって流れる。培地は、マイクロキャリアを伴う領域1740よりもマイクロキャリアを伴わない領域1730においてより自由に流動し、マイクロキャリア損失を低減する。加えて、マイクロキャリアは、矢印1760に近接するフィルタポスト1720によって遮断されるので、矢印1760を有する領域への洗浄を停止させることができる。
図18は、図17のシリコーンシート型バイオリアクターの拡大図を示している。1800aは、マイクロキャリアおよび培地で充填されたシリコーンメンブレンの写真である。1800bは、シリコーンメンブレン入口への入口の拡大図である。1800cは、マイクロキャリアを有するシリコーンメンブレン出口の拡大図である。1800dは、マイクロキャリアを保持するフィルタポストによって輪郭が描かれたフィルタチャネルの拡大図である。
実験結果
本明細書に記載されるHDCRは、ガスと栄養素供給を分離した高表面積メンブレンバイオリアクター上でのコンフルエントな細胞増殖を実証するために使用されている。CV-1細胞を、マイクロキャリア上の灌流されたHDCRメンブレン内で、5日間の増殖にわたって約1.2×108個の細胞/mLの密度まで増殖させた。さらに、24ウェルHDCRプレート内でA549(約0.86±0.17S.E.M.×108個の細胞/mL)、Wagner39652-1(約1.1±0.1S.E.M.×108個の細胞/mL)、および懸濁CHO-S(約0.82±0.02S.E.M108個の細胞/mL)を増殖させた。最大約5億個のHEK293細胞を、Cultisphere Gマイクロキャリア上の約150mmのHDCRペトリ皿中で増殖させ、同様にHEK293-Sを約2億5000個(ニッチ能力の約30%)まで増殖させた。
本明細書に記載されるHDCRは、ガスと栄養素供給を分離した高表面積メンブレンバイオリアクター上でのコンフルエントな細胞増殖を実証するために使用されている。CV-1細胞を、マイクロキャリア上の灌流されたHDCRメンブレン内で、5日間の増殖にわたって約1.2×108個の細胞/mLの密度まで増殖させた。さらに、24ウェルHDCRプレート内でA549(約0.86±0.17S.E.M.×108個の細胞/mL)、Wagner39652-1(約1.1±0.1S.E.M.×108個の細胞/mL)、および懸濁CHO-S(約0.82±0.02S.E.M108個の細胞/mL)を増殖させた。最大約5億個のHEK293細胞を、Cultisphere Gマイクロキャリア上の約150mmのHDCRペトリ皿中で増殖させ、同様にHEK293-Sを約2億5000個(ニッチ能力の約30%)まで増殖させた。
図19は、7日間にわたる24ウェルHDCRプレートにおける細胞増殖を示している。左側の1900aは、実験開始時のCHO-S細胞を示しており、区画1910にはCHO-S細胞が播種されている。7日間の増殖後、1900cにおいて、区画1930は、1900cに示されるように細胞で満たされているので暗く見える。右側の1900bは、実験開始時(0日目)の蛍光下でのCultisphere Gマイクロキャリア上の付着性GFP+Wagner39652-1細胞を示している。予想どおり、1900bの視野は暗い。7日後、Cultisphere Gマイクロキャリア上のWagner39652細胞は、1900dにおいて区画1950に沿って蛍光下で可視となっている。
図20は、Cultisphereマイクロキャリア上の24ウェルHDCRプレート中のA549細胞において、約2×107個の細胞/mLのニッチ密度までオルソポックスウイルスを生産する実験結果のグラフである。細胞を約0.01の感染多重度(MOI)でHOV-2に感染させ(10細胞ごとに約1ウイルス粒子)、約24、48、および72時間で採取した。測定された力価(pfu/細胞)は、組織培養プレート上で増殖させたA549細胞におけるウイルス生産に匹敵し(図20)、これは、ウイルス感染が高細胞密度で損なわれ得るという懸念を軽減するものである。このデータは、24ウェルHDCRプレートにおける約500万個の細胞/ウェルから約150mmのHDCRペトリ皿における約5億個の細胞への細胞増殖のスケーリングが成功し、本明細書中に記載されるHDCRデバイスにおけるオルソポックスウイルスの生産が成功したことを実証している。さらに、A549細胞を、24ウェルHDCRプレート中で、約4×107個の細胞/mLの細胞密度で増殖させ、そして細胞当たり約64±9pfu/細胞のCF33の収率を達成した。
図21は、HEK293細胞が、開示される技術に記載されるメンブレン構造を使用して高密度でトランスフェクトされ得るという実験結果を示している。jetPRIME試薬を使用して、HDCRメンブレン上ならびに固体(Cytodex-1およびCytodex-3)およびマイクロキャリア(Cultisphere G)上で直接増殖させた細胞に、約2×107個の細胞/mLでmCherryプラスミドをトランスフェクトした。他の実施形態は、非多孔性マクロキャリアまたはマクロ多孔性マクロキャリアなどの異なるマクロキャリアを含んでもよい。図21は、24ウェルHDCRプレートにおいてjetPRIMEを使用して、Cultisphere Gマイクロキャリア上で増殖させた高密度HEK293細胞のRFPプラスミドによるトランスフェクションの、フェーズ2110、蛍光2120、およびオーバーレイ2130の図を示している。
図22は、HDCRメンブレンにおいて増殖した高密度A549細胞由来のオルソポックスウイルス(CF33)の力価測定の実験結果を示している。
背景
歴史的には、1940年代に深部タンク発酵技術によってペニシリンのスケールアップ生産に成功したのが始まりである。撹拌タンクリアクター(STR)を使用して、遺伝子治療において重要な細胞が生成された。しかしながら、全身療法のためのAAVの需要は、STRによって提供される生産能力を上回っている。
歴史的には、1940年代に深部タンク発酵技術によってペニシリンのスケールアップ生産に成功したのが始まりである。撹拌タンクリアクター(STR)を使用して、遺伝子治療において重要な細胞が生成された。しかしながら、全身療法のためのAAVの需要は、STRによって提供される生産能力を上回っている。
今日まで(例えば、過去30年にわたって)多くの努力が、細胞特異的生産能を向上させることに多くの努力が払われてきたが、これは名目上、空間-時間生産能を向上させることに他ならない。公開された文献における細胞特異的AAV生産能は、かかる生産能の上限が106個の細胞/mLであることを明らかにしている。フラスコ、STR、および固定床リアクターのような既存の開発技術は、106個の細胞/mLのレジームで報告されている。固定床リアクターのような一部の開発されたシステムには、リアクター床の局所的な細胞密度が比較的高い(108個の細胞/mL)ものがあるが、事実上細胞が存在しないリアクターの容積が比較的大きいため、システムの有効細胞密度は、他のリアクターと同様に確実に1桁以内に制限される。
増強により、リソースとしてのスペース、労力、および現金が節約される。増強により、コストが削減され、生産能力の目標が達成される。生産の効率は、空間-時間生産能の連続性、すなわち、所与の期間に所与の体積で所与の産物をどれだけ生産することができるかという観点から評価することができる。空間-時間生産能は、細胞の細胞特異的生産能およびバイオリアクターの細胞密度の両方の積である。
上記のように、本システム、デバイスおよび方法は、代謝的に有効なプロデューサー細胞またはパッケージング細胞を維持しながら、細胞密度を増加させる。代謝的に有効なプロデューサー細胞またはパッケージング細胞を維持しながら細胞密度を増加させることによって、空間-時間生産能は、細胞当たりの生産能に関して改善される。
図23は、培地を受容し、酸素を二酸化炭素と交換し、静的体積交換速度(kLa)が約60/時間を超える、例えば約63+/-12(S.E.M.)/時間を超える廃棄物を出力するように構成されたHDCRアーキテクチャの概略図である。具体的には、例えば図23の概略図によって表されるように、HDCRアーキテクチャは、メンブレン酸素供給およびCO2交換を利用することによってデカップリングを達成し、それによってガスはメンブレンを透過して細胞に到達するが、一方で、細胞増殖ニッチを通る培地の穏やかな灌流に依存して、可溶性栄養素および廃棄物の交換を提供する。複数のHDCRメンブレンを互いの上に積み重ねることによって、空間が効率的に利用され、そして本システムがスケールアップされ得る。
HDCRアーキテクチャを用いると、フラスコ、STR、および固定床と比較して、約60/時間を超える静的体積酸素交換速度(kLa)が達成され、これは、哺乳動物細胞培養の場合、1~8/時間のオーダーで作動する。約60/時間の交換速度は、108個の細胞/mLの上方を維持するのに十分なガス交換を提供する。
例示的なHDCRメンブレンの顕微鏡画像である図16に示されるように、ここで、培地は左から右に灌流し、ガス交換はスクリーンの内外で生じる。HDCRメンブレンは、マイクロキャリア補助培養物を支持しており、これは、HDCRメンブレンに充填され得、そして例えば、フィルタポストのラインによって保持され得る。代表的な例として、145cm2(すなわち、15cmペトリ皿のサイズ)の単一のHDCRメンブレンにおいて、約5億個のHEK293細胞を増殖させた。これは、通常、培養に約25×15cmペトリ皿のオーダーを必要とする。すなわち、HDCRメンブレンは、単位面積当たり約25倍の増強を達成することができる。
HDCRメンブレンは、細胞株全体にわたって有効である。本システム、デバイスおよび方法を使用して、HEK293をAAV用途のために培養し、HEK293細胞をマイクロキャリア上で培養し、CHO懸濁細胞をタンパク質生産用途のために培養し、NS0細胞を抗体生産用途のために培養し、A549細胞、CV-1細胞を腫瘍溶解性ウイルス生産のために培養した。上記の細胞のすべてが試験され、しっかりと増殖するようであった。倍加時間は従来のフラスコ培養と同等であった。HDCRアーキテクチャおよびプラットフォームは、AAV、腫瘍溶解性ウイルス、抗体、ワクチンなどに関連する普遍的なものとみなすことができる。具体的には、図24は、例示的な実施形態による、培養日数(x軸上)に対する細胞密度(細胞/mL)(y軸上)のプロットである。図24において、AAV適用のために培養されたHEK293細胞は四角で表され、マイクロキャリア上のHEK293細胞は黒三角で表され、CHO懸濁細胞は黒丸で表され、NS0細胞は黒菱形で表されている。本発明のHDCRアーキテクチャを使用して、細胞密度は、約2~8日で、約106のオーダーから約108のオーダーまで増加した。
細胞を高密度に増殖させることは、HDCRシステムを使用するAAV生産プロセスを含む。例えば、3-プラスミドおよびPEIベースのトランスフェクションアプローチを、AAV2-mCherryベクター(3PEI:1DNA、3μgDNA/106細胞、2pHelper:1.5Rep/Cap:1AAV2-CMV-mCherry)を用いた概念の実証のために使用した。得られた粗細胞溶解物中のDNAse耐性粒子をqPCRによって観察した。細胞当たりの収率は、従来の細胞密度とより高い細胞密度とで同等であった。したがって、容積生産能の観点からは、HDCRアーキテクチャを用いることで、細胞密度の増加に伴う乗数的な向上が観察される。具体的には、図25は、例示的な実施形態による、400万個の細胞/mLおよび1600万個の細胞/mLを有する試料についての、パッケージング時間(時間単位)(x軸上)に対するAAV(vg/細胞)(y軸上)のプロットである。図26は、例示的な実施形態による、400万個の細胞/mLおよび1600万個の細胞/mLを有する試料についての、パッケージング時間(時間単位)(x軸上)に対するAAV(vg/mL)(y軸上)のプロットである。
トランスフェクションは、制限因子となり得る。例えば密度が3×107個の細胞/mLまで増加するにつれて、細胞当たりの生産能の減少が観察された。その結果、これらの高密度では、容積生産能は、細胞密度の増加に伴って収穫逓減を達成した。考慮すべき因子は多く存在するが、トランスフェクションは制限因子であり得る。具体的には、図27は、例示的な実施形態による、400万個の細胞/mL、1600万個の細胞/mLおよび3200万個の細胞/mLを有する試料についての、パッケージング時間(時間単位)(x軸上)に対するAAV(vg/細胞)(y軸上)のプロットである。図28は、例示的な実施形態による、400万個の細胞/mL、1600万個の細胞/mLおよび3200万個の細胞/mLを有する試料についての、パッケージング時間(時間単位)(x軸上)に対するAAV(vg/mL)(y軸上)のプロットである。
分散/混合工程をトランスフェクション中のプロセスに追加することで、特に高い細胞密度で細胞当たりの収率が改善された。プラスミド複合体は、比較的高い密度であるため、すべての細胞と相互作用しない可能性がある。したがって、細胞当たりの生産能が低いのは、正常に生産する細胞集団と生産しない細胞集団が平均化された結果であり得る。具体的には、図29は、例示的な実施形態による、3000万個および1億個の細胞/mLを有する試料についてのy軸上のAAV(vg/細胞)のチャートであり、静的様式と混合様式とを比較したものである。分散/混合工程は、AAV(vg/細胞)を顕著に改善した。図30は、例示的な実施形態による約37kD~約150kDにスケーリングされたHDCR産生AAV2ベクターである。
図31は、2010~2020年の文献で報告され、例示的な実施形態による本発明のHDCR産生細胞と比較した、トランスフェクション時の細胞密度(細胞/mL)(x軸上)に対する生産能(AAV vg/L)(y軸上)のプロットである。2010~2020年の文献における生産能は、約1013~約1015AAV(vg/L)であると報告され、トランスフェクションにおける細胞密度は、約105~約106(細胞/mL)であると報告されていた。一方、HDCRアーキテクチャでの生産能は、約1015~約1016AAV(vg/L)であり、トランスフェクションでの細胞密度は、約107~約108(細胞/mL)であると報告されている。要約すると、HDCRは、AAV容積生産能を、1015vg/Lのレジームまでブーストする。
HDCRは、CF33-hNISオルソポックス生産をサポートしている。HDCRにおける腫瘍溶解性ウイルス生産が証明されている。例えば、CF33-hNIS(結腸がんに対して効力を有する複製能のあるキメラオルソポックスウイルス)が生成された。A549細胞をHDCR中で2×107個の細胞/mLまで増殖させ、そして0.01のMOIでCF33に感染させた。図32は、例示的な実施形態による、感染後の時間(x軸上)に対する力価(PFU/細胞)(y軸上)のプロットであり、組織培養物(フラスコ)の生産(TCP)をHDCR産生と比較したものである。図32は、組織培養(フラスコ)生産(TCP)における従来の生産と比較して、HDCRにおける細胞当たりのCF-33の生産が同等であることを示している。上記のように、細胞密度の増加は、容積生産能の乗数的な向上につながる。(HOV-2オルソポックスウイルスは、冗長なtk遺伝子座(別名CF33-hNIS)でヒトヨウ化ナトリウム共輸送体(hNIS)をコードするキメラポックスウイルスであることに留意されたい。また、A549細胞における生産からのHOV-2力価(pfu/細胞)を、標準的な単層生産に対して高細胞密度(2×107個の細胞/mL)で24ウェルHDCRプレート中で増殖させた。さらに、細胞を感染後24、48および72時間で採取した。)
したがって、HDCRアーキテクチャにおけるガスおよび培地供給のデカップリングは、高密度細胞培養のサポートに有用であり、そしてAAVおよび腫瘍溶解性ウイルス生産に応用される。
さらなる実施例
図33は、例示的な実施形態による、約25kD~約250kDにスケーリングされたAAV2-mCherry HDCRベクター対標準の並列比較である。
図33は、例示的な実施形態による、約25kD~約250kDにスケーリングされたAAV2-mCherry HDCRベクター対標準の並列比較である。
図34は、例示的な実施形態による約37kD~約150kDにスケーリングされたHDCR産生AAV2ベクターである。
図35は、2010~2020年の文献で報告され、例示的な実施形態による比較的低い生産能での結果をさらに含む本発明のHDCR産生細胞と比較した、トランスフェクション時の細胞密度(細胞/mL)(x軸上)に対する生産能(AAV vg/L)(y軸上)の別のプロット(図31におけるデータを含む)である。
図36は、例示的な実施形態による、HDCR由来のAAV2(右側)と並べた未染色のタンパク標準(左側)の画像である。
図37は、例示的な実施形態によるAAV2-mCherry HDCRベクター(右側)と並べた未染色のタンパク標準(左側)の画像である。
図80は、2011年1月19日のNat Biotechnolにおける「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」においてZhangらによって報告されたpAAV-minCMV-mCherryの概略図である。
実施形態の概要
最初に、図38、40~45、54~56、61、65~75および79は、便宜上、例示的な座標軸を含むことに留意されたい。方向は、限定することを意図しない。例えば、図40に見られるように、デバイスの幅は、x軸方向に提供され得、ここで、「ページの中」は-x方向であり、「ページの外」は+x方向である。デバイスの長さは、y軸方向に提供され得、ここで、ページ左は-y方向であり、ページ右は+y方向である。デバイスの高さは、z軸方向に提供され得、ここで、ページ上は+z方向であり、ページ下は-z方向である。図38、40~45、54~56、61、65~75および79は、同様の表記を回転させ、図に適したラベルを付けて使用している。
最初に、図38、40~45、54~56、61、65~75および79は、便宜上、例示的な座標軸を含むことに留意されたい。方向は、限定することを意図しない。例えば、図40に見られるように、デバイスの幅は、x軸方向に提供され得、ここで、「ページの中」は-x方向であり、「ページの外」は+x方向である。デバイスの長さは、y軸方向に提供され得、ここで、ページ左は-y方向であり、ページ右は+y方向である。デバイスの高さは、z軸方向に提供され得、ここで、ページ上は+z方向であり、ページ下は-z方向である。図38、40~45、54~56、61、65~75および79は、同様の表記を回転させ、図に適したラベルを付けて使用している。
図38は、例示的な実施形態による、約5mL程度の体積および約1012vg程度の細胞密度を有する小規模HDCRプラットフォームの平面図画像である。小規模HDCRは、研究および開発用途に好適であり得る。
図39は、例示的な実施形態による、約500mL程度の体積および約1014vg程度の細胞密度を有する中規模HDCRプラットフォームの斜視画像である。中規模HDCRは、動物研究用途に好適であり得る。
図40は、例示的な実施形態による、約50L程度の体積および約1016~17vg程度の細胞密度を有する大規模HDCRプラットフォームの斜視画像である。この例示的な実施形態では、プレートは、入口から出口まで約15インチ延在している。大規模HDCRは、臨床用途に好適であり得る。
本システム、デバイスおよび方法の一部の実施形態は、高密度細胞培養のためのガス灌流可能な微細加工メンブレンを含む。酸素は、最も制限的な栄養素であり得、次に最も制限的な栄養素(すなわち、GLN)よりも約155倍制限的であることが観察された。本システム、デバイス、および方法の一部の実施形態は、従来の培養系における酸素送達制限を克服するために、細胞がその上で増殖するガス灌流可能なメンブレンから直接酸素を提供する。実現性を念頭におくと、メンブレンは、汚染物質浸出の懸念を軽減するために、医療グレードの比較的安価な物質のみから構成されてもよい。
例示的な実施形態
図41は、例示的な実施形態による、酸素を供給し、二酸化炭素を受容するように構成された離間したフィンを有するHDCRプラットフォームの概略側面図である。
図41は、例示的な実施形態による、酸素を供給し、二酸化炭素を受容するように構成された離間したフィンを有するHDCRプラットフォームの概略側面図である。
図42は、例示的な実施形態による傾斜HDCRプラットフォームの概略側面図である。図42の上部は、デバイスの端部間に7つのフィンを有する傾斜HDCRプラットフォームの高密度の実施形態である。図42の下部は、デバイスの端部間にフィンを有さない傾斜HDCRプラットフォームの低密度の実施形態である。高密度および低密度の実施形態の両方は、約10度の角度で傾斜している。種々の傾斜角度の影響の分析については、図70~78を参照されたい。
図43は、例示的な実施形態による、気泡の除去(上)および凝縮(下)を促進するように構成された傾斜HDCRプラットフォームの概略側面図である。
図44~47、52~54および79は、例示的な実施形態によるHDCRデバイスの例示的な実施形態を示している。
図44は、例示的な実施形態によるHDCRカートリッジの底面斜視図である。
図45は、例示的な実施形態による図44のHDCRカートリッジの上面斜視図である。HDCRデバイスは、互いに積み重ねるように構成された複数の積層プレートを有し得る。図45では、3枚のプレート4502、4504、4506のスタックが設けられている。各プレート4502、4504、4506は、1つ以上のチャネルを有してもよい。図45では、3つのチャネル4512、4514、4516が設けられている。3つのチャネル4512、4514、4516は、境界隆起部4522によって境界を定められ得る。境界隆起部4522は、3つのチャネル4512、4514、4516の周囲全体の境界を定める連続壁を含み得る。境界隆起部4522は、プレートの各コーナーにおいて比較的厚い部分を有し得る。プレートの各コーナーは、コネクタ(図示せず)がそこから通過することを可能にするための開口部4524を有し得る。開口部4524は、円形隆起部4526によって境界を定められ得る。各プレートの各開口部4524は、隣接するプレートの開口部と連通することができる。
図46は、例示的な実施形態によるHDCRカートリッジの図45の上面斜視図の拡大部分である。第1のチャネル4512は、第1の隆起部4605によって第2のチャネル4514から分離され得る。第2のチャネル4514は、第2の隆起部4610によって第3のチャネル4516から分離され得る。第1の隆起部4605および第2の隆起部4610の各々は、各プレート(例えば、4502)の全体または実質的に全体にわたって連続的に延在し得る。第1のチャネル4512は、第1の隆起部4605によって第2のチャネル4514から分離され得る。
図47は、例示的な実施形態による図44~46のHDCRカートリッジの上面図である。各プレート(例えば、4502、4504、4506)は、隣接するプレートまたはプレート以外の隣接する構造体に位置する開口部と連通するために、そのベースチャネル表面(例えば、4601)を通る複数の開口部を有し得る。1つのプレートの開口部は、別のプレートの開口部と連通することができる。1つのプレートの上部は、別のプレートの底部とネスト状になるように、かつ/または構造的に協働するように構成されて、図52~54に詳細に示すような一体型サンドイッチ構造を形成することができる。
図79は、例示的な実施形態によるHDCRメンブレンの拡大平面図である(図47参照)。具体的には、3層の50cm2HDCRメンブレンが設けられている。左右の培地入口チャネルおよび培地出口チャネルの非対称性に留意されたい。この構成では、メンブレンはそれらの上または下のメンブレンに対して180°回転される。これにより、蛇行流路が作製され、バイオリアクターに添加された成分の混合を改善してより良好な均一性を達成することができる。
例えば、第1のプレート4502は、第1の隆起部4605の第1の端部および第2の隆起部4610の第1の端部に隣接する境界領域4522によって囲まれた領域内に、第1の開口部4705、第2の開口部4710、および第3の開口部4715を含み得、さらに、第1のプレート4502は、第1の隆起部4605の第2の端部および第2の隆起部4610の第2の端部に隣接する境界領域4522によって囲まれた領域内に、第4の開口部4720、第5の開口部4725、第6の開口部4730、および第7の開口部4735を含み得る。第1のプレート4502の第1の開口部4705は、第2のプレート4504の第4の開口部4720の一端および第5の開口部4725の一端と連通して、第1のプレート4502および第2のプレート4504を貫通する第1の共通流体通路を形成することができる。第1のプレート4502の第2の開口部4710は、第2のプレート4504の第5の開口部4725の他端および第6の開口部4730の一端と連通して、第1のプレート4502および第2のプレート4504を貫通する第2の共通流体通路を形成することができる。第1のプレート4502の第3の開口部4715は、第2のプレート4504の第6の開口部4730および第7の開口部4735の他端と連通して、第1のプレート4502および第2のプレート4504を貫通する第3の共通流体通路を形成することができる。第1のプレート4502の第4の開口部4720は、第2のプレート4504の第1の開口部4705の一端と連通して、第1のプレート4502および第2のプレート4504を貫通する第4の共通流体通路を形成することができる。第1のプレート4502の第5の開口部4725は、第1の開口部4705の他端および第2のプレート4504の第2の開口部4710の一端と連通して、第1のプレート4502および第2のプレート4504を貫通する第5の共通流体通路を形成することができる。第1のプレート4502の第6の開口部4730は、第2のプレート4504の第2の開口部4710の他端および第3の開口部4715の一端と連通して、第1のプレート4502および第2のプレート4504を貫通する第6の共通流体通路を形成することができる。第1のプレート4502の第7の開口部4735は、第2のプレート4504の第3の開口部4715の別の端部と連通して、第1のプレート4502および第2のプレート4504を貫通する第7の共通流体通路を形成することができる。第1の開口部4705、第2の開口部4710、第3の開口部4715、第5の開口部4725、および第6の開口部4730は、ほぼ同様の形状を有してもよい。すなわち、それらは各々、図47に示されるように、丸い端部を有する比較的長いスロットであってもよい。第4の開口部4720および第7の開口部4735は、ほぼ同様の形状を有してもよい。すなわち、それらは各々、図47に示されるような丸い端部を有する比較的短いスロットであってもよい。図47に最もよく見られるように、あるセットの開口部と別のセットの開口部との重なりは、プレートを通して真っ直ぐ見下ろすときに、ほぼ円形の貫通開口部を効果的に形成することができる。
したがって、第1のプレート4502の各端部において、第1のプレート4502の第1のチャネル4512は、第2のプレート4504の第1のチャネル4512および第2のチャネル4512と連通するように構成され得、第1のプレート4502の第2のチャネル4514は、第2のプレート4504の第1のチャネル4512および第3のチャネル4516と連通するように構成され得、第1のプレート4502の第3のチャネルは、第2のプレート4504の第2のチャネル4514および第3のチャネル4514と連通するように構成され得る。
各プレート(例えば、4502)は、活性領域4699において複数の構造を有するように構成され得、この構造は、酸素および二酸化炭素の交換ならびに本明細書中に記載されるHDCRシステムの他の特徴を促進するように構成されている。活性領域4699内の複数の構造は、各プレートのベースチャネル表面4601の上および中に形成された一連の交互に突出する隆起部および陥凹した凹部であってもよい。図1、2、3、5、6、図14、41、42、43、66、67、68および72(これらを含む)に、種々の例示的な隆起部および凹部の側断面図を示している。図7の左上隅に示される溝/フィン、図7の左下隅に示されるウェル、および/または図7の右下隅に示されるポストなどの他の構造が設けられてもよい。領域4699は、図7の右上隅に示すような滑らかな構造を有してもよい。領域4699内の構造は、ピラー、チャネル、溝、バンプ、突起、および/または脚を任意の好適な組み合わせにおいて含む任意の好適な形状であってもよい。各構造は、領域4699内の他の構造と実質的に同様であってもよく、または異なる形状が領域4699内に設けられてもよい。
2-HDCRにおけるプラスミドトランスフェクション
例示的な実施形態では、例示的な実施形態によるデモスケールHDCRバイオリアクターを、顕微鏡適合性のためにガラス底を用いて組み立てた。約1.7mLの青色に染色されたCytodex 3マイクロキャリアを、約50mLのシリンジ2本を往復させて、バイオリアクターのメンブレンに流入させた。バイオリアクターおよび成分を液体サイクルで約15分間オートクレーブ処理した。
例示的な実施形態では、例示的な実施形態によるデモスケールHDCRバイオリアクターを、顕微鏡適合性のためにガラス底を用いて組み立てた。約1.7mLの青色に染色されたCytodex 3マイクロキャリアを、約50mLのシリンジ2本を往復させて、バイオリアクターのメンブレンに流入させた。バイオリアクターおよび成分を液体サイクルで約15分間オートクレーブ処理した。
1日目に、バイオフード下で三方コックとの最終接続を行った。HDCRバイオリアクター中の流体経路を、37℃で脱気したPBS+1%P/S/Aでフラッシュして、ループを含む気泡を除去した。その後、HDCRバイオリアクターを、2日目にDMEM+10%FBS+1%P/S/A(20mL)でフラッシュした。ストップコックを回転させて、デッドボリューム内の気泡をパージした。360万個のP21 HEK293AAV細胞を、ガストラップラインを通してバイオリアクター(3PM)にロードし、静置ポンプを介して3×1分間循環させて、メンブレン内に均一に播種した。ガスの流速を約0.1mL/分に設定し、培地流を約0.02mL/分に設定した。培地でパージすることによってトラップから気泡を毎日除去した。
5日目に、4mg DNA/100万個の細胞で4x107個の細胞/mLの密度を想定してトランスフェクションカクテルを作成した(232uL pDP2rs、52uL pAAV-ssG FP、1216uL DMEMと567uL PEI、933uL DMEMとの組み合わせ、約5秒間ボルテックス、RTで約10分間静置)。その後5日目に、トランスフェクションカクテルをループに注入し、3×1分間循環させた。灌流を止めてバイオリアクターをインキュベータに戻した。トランスフェクションの30分後、60分後、90分後に培地をループ上で約1分間混合した。トランスフェクションの約4時間後に培地を0.05mL/分で再開した。
8日目に、メンブレンを取り出し、光透気率を改善するためにガスチャンバをPBSで満たすことによってペトリ皿中で画像化した。細胞および上清を、最良のトランスフェクションを示したメンブレンの半分から精製のために収集した(他の半分は低いトランスフェクションを有していた)。細胞/マイクロキャリアを500g、5分でペレット化し、上清を除去した。ペレットを80℃で凍結した。
上記治験に関して、図48は、例示的な実施形態による、トランスフェクションの70時間後のGFP(pAAV)の画像(4倍)である。図49は、例示的な実施形態による、トランスフェクションの70時間後のフェーズの画像(4倍)である。図50は、例示的な実施形態による、トランスフェクションの70時間後のRFP(pHelper+RC)の画像(4倍)である。図51は、例示的な実施形態による図48、49、および50のオーバーレイである。
一体型OリングシールHDCR区画
図52~54は、HDCRプレート間のHDCR区画のためのOリングシールの種々の図を含む。図52では、周辺の1つ以上の一体型Oリング5201が、プレート4502、4504、4506などのHDCRメンブレンの整列および積層を容易にしている。図53に示すように、圧縮されると、Oリング5201はシールして、独立したガスマニホールドおよび流体マニホールドを形成する。具体的には、図52は、例示的な実施形態による、HDCRメンブレンの圧縮されていない4スタックを通る断面切断図であり、メンブレンのシールおよび整列の形成を示す。図53は、例示的な実施形態によるHDCRメンブレンの圧縮された(40%圧縮比)4スタックを通る断面切断図である。図54は、例示的な実施形態による、ガス区画開口部ならびに可能な設計の種々の圧縮比(すなわち、20%、30%、40%の圧縮比)を示す拡大断面図(左下側)を有するHDCRメンブレンのCADレンダリングである。ガス区画開口部は、ガス区画開口部の上方および下方のOリングからの圧縮力下でそれらの開存性を維持するように、(例えば、剛性管を用いて)補強され得る。
図52~54は、HDCRプレート間のHDCR区画のためのOリングシールの種々の図を含む。図52では、周辺の1つ以上の一体型Oリング5201が、プレート4502、4504、4506などのHDCRメンブレンの整列および積層を容易にしている。図53に示すように、圧縮されると、Oリング5201はシールして、独立したガスマニホールドおよび流体マニホールドを形成する。具体的には、図52は、例示的な実施形態による、HDCRメンブレンの圧縮されていない4スタックを通る断面切断図であり、メンブレンのシールおよび整列の形成を示す。図53は、例示的な実施形態によるHDCRメンブレンの圧縮された(40%圧縮比)4スタックを通る断面切断図である。図54は、例示的な実施形態による、ガス区画開口部ならびに可能な設計の種々の圧縮比(すなわち、20%、30%、40%の圧縮比)を示す拡大断面図(左下側)を有するHDCRメンブレンのCADレンダリングである。ガス区画開口部は、ガス区画開口部の上方および下方のOリングからの圧縮力下でそれらの開存性を維持するように、(例えば、剛性管を用いて)補強され得る。
4-スタックデモスケールHDCRの実行
図55~57は、機能的バイオリアクターに組み立てられた4スタック50cm2HDCRメンブレンを示している。5%CO2補充物を含む空気を、ガス区画を通してメンブレンに灌流し、一方で、培地を細胞-培地区画に灌流し、そして廃棄物を培地出口を通して処分する。混合可能なループは、調節可能なバルブを用いて培地入口と出口との間に接続されたチューブによって形成される。蠕動ポンプへのチューブの接続は、細胞-培地区画内の培地の循環を可能にし、細胞、マイクロキャリア、ウイルス、トランスフェクション剤、または他の添加剤の均一な導入に有用である。循環ループを通した流体の急速な灌流と、任意選択的にバイオリアクターの傾斜または反転を組み合わせることにより、メンブレンから細胞またはバイオプロダクトを収集することができる。気泡トラップをバイオリアクターに追加して、細胞-培地区画への気泡の導入を軽減し、それらの除去を容易にすることができる。培地およびガスの灌流は、蠕動、シリンジ、または他のポンプ(例えば、重力供給などの能動的または受動的)によって制御することができる。可視化のためにトリパンブルーで染色したCytodex-3マイクロキャリアをメンブレンにロードした後、A549細胞を播種し、これを約700,000細胞から100,000,000細胞まで10日間にわたって増殖させた。具体的には、図55は、例示的な実施形態による4スタックデモスケールHDCRの正面斜視図であり、図56は、例示的な実施形態による図55の4スタックデモスケールHDCRの背面斜視図であり、図57は、例示的な実施形態による図55および56の4スタックデモスケールHDCRのための完全なシステムの正面斜視図である。
図55~57は、機能的バイオリアクターに組み立てられた4スタック50cm2HDCRメンブレンを示している。5%CO2補充物を含む空気を、ガス区画を通してメンブレンに灌流し、一方で、培地を細胞-培地区画に灌流し、そして廃棄物を培地出口を通して処分する。混合可能なループは、調節可能なバルブを用いて培地入口と出口との間に接続されたチューブによって形成される。蠕動ポンプへのチューブの接続は、細胞-培地区画内の培地の循環を可能にし、細胞、マイクロキャリア、ウイルス、トランスフェクション剤、または他の添加剤の均一な導入に有用である。循環ループを通した流体の急速な灌流と、任意選択的にバイオリアクターの傾斜または反転を組み合わせることにより、メンブレンから細胞またはバイオプロダクトを収集することができる。気泡トラップをバイオリアクターに追加して、細胞-培地区画への気泡の導入を軽減し、それらの除去を容易にすることができる。培地およびガスの灌流は、蠕動、シリンジ、または他のポンプ(例えば、重力供給などの能動的または受動的)によって制御することができる。可視化のためにトリパンブルーで染色したCytodex-3マイクロキャリアをメンブレンにロードした後、A549細胞を播種し、これを約700,000細胞から100,000,000細胞まで10日間にわたって増殖させた。具体的には、図55は、例示的な実施形態による4スタックデモスケールHDCRの正面斜視図であり、図56は、例示的な実施形態による図55の4スタックデモスケールHDCRの背面斜視図であり、図57は、例示的な実施形態による図55および56の4スタックデモスケールHDCRのための完全なシステムの正面斜視図である。
グルコースを介した代謝のモニタリング
バイオリアクター内の細胞のグルコース消費は、グルコースメーターを使用して投入培地流および排出培地流をサンプリングすることによってモニタされる。グルコース濃度および既知の灌流速度の差から、グルコース消費が決定される。バイオリアクターへの培地およびガスの供給速度を調節することで、グルコースレベルが特定の範囲内に維持することができる。具体的には、図58は、例示的な実施形態による、理論結果と実験結果とを比較した、日数(x軸上)に対するグルコース消費(mol/時間)(y軸上)のプロットであり、図59は、例示的な実施形態による、廃液流中の流速およびグルコースから導出される代謝を測定するためのシステムの正面斜視図である。
バイオリアクター内の細胞のグルコース消費は、グルコースメーターを使用して投入培地流および排出培地流をサンプリングすることによってモニタされる。グルコース濃度および既知の灌流速度の差から、グルコース消費が決定される。バイオリアクターへの培地およびガスの供給速度を調節することで、グルコースレベルが特定の範囲内に維持することができる。具体的には、図58は、例示的な実施形態による、理論結果と実験結果とを比較した、日数(x軸上)に対するグルコース消費(mol/時間)(y軸上)のプロットであり、図59は、例示的な実施形態による、廃液流中の流速およびグルコースから導出される代謝を測定するためのシステムの正面斜視図である。
図60は、例示的な実施形態による、DNA単位で計数するために細胞を採取することによってグルコースによる代謝を測定するためのシステムの正面斜視図であり、収集された細胞およびマイクロキャリアが、HDCRバイオリアクター中でのA549細胞の10日間の増殖後にバイアルの底に現れている。
ハーフスケール(600cm2)HDCRの実行
600cm2メンブレン設計に基づくHDCRバイオリアクターシステムが提供される。HDCRカートリッジは、上部および底部圧縮プレート、培地およびガス区画のための流体カップリングおよびバルブ、ならびに循環チューブ、HDCRメンブレン、ならびにボルトおよびスペーサを含む。この例では、シリンジポンプが、バイオリアクターへの培地の灌流を制御する。気泡トラップは、灌流ストリームから気泡を除去し、それらがシステムに入ることを防止する。蠕動ポンプは、バイオリアクターへのガスの灌流を制御する。ガスバブラーを組み込んでガスを加湿し、培地区画からの水の透過気化を低減することもできる。使用済み培地は廃棄ボトルに収集され、一方、消耗ガスは大気中に排出される。追加の蠕動ポンプおよび流体バルブを適切に位置決めすることで、バイオリアクターを通る培地の循環を達成し、播種、感染/トランスフェクション、および採取を容易にすることができる。例えば、図61は、例示的な実施形態による、右から左に、培地ポンプ、気泡トラップ、ガスバブラー、600cm2HDCRカートリッジ、細胞分配器、廃棄物容器、ガスポンプ、および関連する相互接続管を含む、ハーフスケールHDCRシステムの正面斜視図である。
600cm2メンブレン設計に基づくHDCRバイオリアクターシステムが提供される。HDCRカートリッジは、上部および底部圧縮プレート、培地およびガス区画のための流体カップリングおよびバルブ、ならびに循環チューブ、HDCRメンブレン、ならびにボルトおよびスペーサを含む。この例では、シリンジポンプが、バイオリアクターへの培地の灌流を制御する。気泡トラップは、灌流ストリームから気泡を除去し、それらがシステムに入ることを防止する。蠕動ポンプは、バイオリアクターへのガスの灌流を制御する。ガスバブラーを組み込んでガスを加湿し、培地区画からの水の透過気化を低減することもできる。使用済み培地は廃棄ボトルに収集され、一方、消耗ガスは大気中に排出される。追加の蠕動ポンプおよび流体バルブを適切に位置決めすることで、バイオリアクターを通る培地の循環を達成し、播種、感染/トランスフェクション、および採取を容易にすることができる。例えば、図61は、例示的な実施形態による、右から左に、培地ポンプ、気泡トラップ、ガスバブラー、600cm2HDCRカートリッジ、細胞分配器、廃棄物容器、ガスポンプ、および関連する相互接続管を含む、ハーフスケールHDCRシステムの正面斜視図である。
CF33-GFPの生産
オルソポックスウイルスであるCF33-GFPの生産を、制御された培地およびガス灌流下でA549細胞を約4億個の細胞/メンブレンまで増殖させることによって、HDCRバイオリアクター中で行った。生産実行時のグルコース消費の理論的および実験的測定を用いて、細胞増殖をモニタした。11日目に、CF33-GFPウイルスを、細胞当たり0.03プラーク形成単位の感染多重度でバイオリアクターに導入した。感染3日後、細胞およびウイルス物質を、滴定および精製のためにバイオリアクターから採取した。図62は、例示的な実施形態による、理論結果と実験結果とを比較した、動作日数(x軸上)に対するグルコース消費(mol/時間)(y軸上)のプロットである。図63は、第1のスクロース勾配遠心分離後のCF33-GFPのバンドである。以下の表3は、精製後の600cm2HDCRメンブレンにおけるCF-33 GFPの収率および精製されていないフロースルー培地内のCF-33 GFPの収率を示している。
オルソポックスウイルスであるCF33-GFPの生産を、制御された培地およびガス灌流下でA549細胞を約4億個の細胞/メンブレンまで増殖させることによって、HDCRバイオリアクター中で行った。生産実行時のグルコース消費の理論的および実験的測定を用いて、細胞増殖をモニタした。11日目に、CF33-GFPウイルスを、細胞当たり0.03プラーク形成単位の感染多重度でバイオリアクターに導入した。感染3日後、細胞およびウイルス物質を、滴定および精製のためにバイオリアクターから採取した。図62は、例示的な実施形態による、理論結果と実験結果とを比較した、動作日数(x軸上)に対するグルコース消費(mol/時間)(y軸上)のプロットである。図63は、第1のスクロース勾配遠心分離後のCF33-GFPのバンドである。以下の表3は、精製後の600cm2HDCRメンブレンにおけるCF-33 GFPの収率および精製されていないフロースルー培地内のCF-33 GFPの収率を示している。
エキソソーム抽出
600cm2HDCRバイオリアクターからの使用済み培地を、A549細胞の増殖の8日目、9日目、10日目および11日目にわたって収集した。エキソソームを使用済み培地から精製し、続いて定量化し、ナノ粒子追跡分析を用いて特徴を明らかにした。結果は、HDCRバイオリアクターを出る培地から相当量のエキソソームを収集できることを実証している。図64は、日付(x軸上)に対するエキソソーム/日/メンブレン(y軸上)のプロット、すなわち、例示的な実施形態によるA549を有する600cm2HDCRにおけるエキソソーム産生である。
600cm2HDCRバイオリアクターからの使用済み培地を、A549細胞の増殖の8日目、9日目、10日目および11日目にわたって収集した。エキソソームを使用済み培地から精製し、続いて定量化し、ナノ粒子追跡分析を用いて特徴を明らかにした。結果は、HDCRバイオリアクターを出る培地から相当量のエキソソームを収集できることを実証している。図64は、日付(x軸上)に対するエキソソーム/日/メンブレン(y軸上)のプロット、すなわち、例示的な実施形態によるA549を有する600cm2HDCRにおけるエキソソーム産生である。
5-スタックHDCR
標準的な細胞インキュベータ内で操作される5スタックの600cm2メンブレンを含むHDCRバイオリアクターセットアップが提供される。トリパンブルーで染色されたマイクロキャリアは、メンブレン内に均一に分布していることがわかる。具体的には、図65は、例示的な実施形態による5スタックの600cm2HDCRカートリッジを含むシステムの正面斜視図である。
標準的な細胞インキュベータ内で操作される5スタックの600cm2メンブレンを含むHDCRバイオリアクターセットアップが提供される。トリパンブルーで染色されたマイクロキャリアは、メンブレン内に均一に分布していることがわかる。具体的には、図65は、例示的な実施形態による5スタックの600cm2HDCRカートリッジを含むシステムの正面斜視図である。
HDCRバイオリアクターの傾斜
HDCRバイオリアクターメンブレンをある角度で配置することで、細胞-培地区画内からの気泡の除去、ならびにガス区画からの凝縮の除去が容易になる。水平状態では、培地区画から気泡を移動させ、一掃するための灌流培地からの最小限の力のみが存在するのに対して、傾斜状態では、静水圧勾配により、気泡はより高い高度に向かって押し進められ、そこで気泡は最終的に流体マニホールドに到達し、廃棄物収集に搬出される。必須ではないが、培地を低い高度の流体マニホールド内に灌流させ、それを高い高度の流体マニホールドから収集することが有利である。これは、この構成では、気泡に対する流体力および静水圧力の両方が同じ方向であるからである。同様に、ガス区画内では、凝縮および水滴は、それらが重力ポテンシャル勾配を下方に移動する傾向に起因して、メンブレンが傾斜状態にあるときにより容易に除去される。必須ではないが、このガス区画内のガスの灌流が高い高度の流体マニホールドに入り、高い高度の流体マニホールドから出ることが有利である。これは、この構成では、液滴に対する流体力および重力の両方が同じ方向であるためである。図66は、例示的な実施形態による、メンブレンの上方の気泡およびメンブレンの下の凝縮を含むHDCRメンブレンの概略正面断面図である。対照的に、図67は、例示的な実施形態による、メンブレンの上方の気泡の除去およびメンブレンの下の凝縮の除去が強調された傾斜HDCRメンブレンの概略正面断面図である(除去前の状態が図67の上部に示され、除去後の状態が図67の下部に示されている)。
HDCRバイオリアクターメンブレンをある角度で配置することで、細胞-培地区画内からの気泡の除去、ならびにガス区画からの凝縮の除去が容易になる。水平状態では、培地区画から気泡を移動させ、一掃するための灌流培地からの最小限の力のみが存在するのに対して、傾斜状態では、静水圧勾配により、気泡はより高い高度に向かって押し進められ、そこで気泡は最終的に流体マニホールドに到達し、廃棄物収集に搬出される。必須ではないが、培地を低い高度の流体マニホールド内に灌流させ、それを高い高度の流体マニホールドから収集することが有利である。これは、この構成では、気泡に対する流体力および静水圧力の両方が同じ方向であるからである。同様に、ガス区画内では、凝縮および水滴は、それらが重力ポテンシャル勾配を下方に移動する傾向に起因して、メンブレンが傾斜状態にあるときにより容易に除去される。必須ではないが、このガス区画内のガスの灌流が高い高度の流体マニホールドに入り、高い高度の流体マニホールドから出ることが有利である。これは、この構成では、液滴に対する流体力および重力の両方が同じ方向であるためである。図66は、例示的な実施形態による、メンブレンの上方の気泡およびメンブレンの下の凝縮を含むHDCRメンブレンの概略正面断面図である。対照的に、図67は、例示的な実施形態による、メンブレンの上方の気泡の除去およびメンブレンの下の凝縮の除去が強調された傾斜HDCRメンブレンの概略正面断面図である(除去前の状態が図67の上部に示され、除去後の状態が図67の下部に示されている)。
図68~75は、細胞保持を容易にするメンブレンアーキテクチャを示している。アーキテクチャは、栄養素およびガスの効率的な質量輸送には大きすぎる質量で細胞が凝集またはプールする傾向に起因して、非水平配向におけるメンブレンベースのバイオリアクターの動作のために構成されている。HDCRメンブレンは、この問題を克服するために、メンブレンの細胞培地に面する側にかかるアーキテクチャ(例えば、ウェル、溝、杯、ピラー、オーバーハングなど)を組み込む。水平配向における高アスペクト比アーキテクチャおよび低アスペクト比アーキテクチャを有するメンブレン(図68および70)の比較は、細胞保持構造(例えば、フィン)の導入が、細胞増殖のために利用可能な体積(図69および71)をいかに減少させるかを示している。しかしながら、傾斜配向(図72および74)では、保持構造の存在に起因して失われる増殖体積は、細胞の保持の増加によって十分に補償される(図73および75)。具体的には、図68は、例示的な実施形態による、培地で充填された非傾斜の高アスペクト比HDCRメンブレンの概略側断面図である。図69は、例示的な実施形態による、培地で充填された非傾斜の高アスペクト比HDCRメンブレンの細胞増殖体積の表示である。図70は、例示的な実施形態による培地で、充填された非傾斜の低アスペクト比のHDCRメンブレンの概略側断面図である。図71は、例示的な実施形態による、培地で充填された非傾斜の低アスペクト比HDCRメンブレンの細胞増殖体積の表示である。図72は、例示的な実施形態による、培地で充填された傾斜した高アスペクト比HDCRメンブレンの概略側断面図である。図73は、例示的な実施形態による、培地で充填された傾斜した高アスペクト比HDCRメンブレンの細胞増殖体積の表示である。図74は、例示的な実施形態による、培地で充填された傾斜した低アスペクト比HDCRメンブレンの概略側断面図である。図75は、例示的な実施形態による、培地で充填された傾斜した低アスペクト比HDCRメンブレンの細胞増殖体積の表示である。
図76は、例示的な実施形態による、傾斜角に対する矩形チャネル内の細胞保持の形状の変数を確立する。下記式において、Wfinはフィンの幅であり、Afinはフィンの面積であり、hはフィンの高さであり、Wcellは細胞の幅であり、Acellは細胞の面積であり、θは細胞の傾斜角である。
相対細胞保持効率:
全体の細胞保持効率:
フィンの断面積:
Afin=wfin・h
アーキテクチャの単位細胞の断面積:
Aunit=(wfin+wcell)・h
保持された細胞の断面積:
相対細胞保持効率:
Afin=wfin・h
アーキテクチャの単位細胞の断面積:
Aunit=(wfin+wcell)・h
保持された細胞の断面積:
図77は、メンブレン傾斜角の関数としての、種々の幅(mm)の深さ0.8mmの長方形チャネルにおける相対細胞保持効率のプロットである。幅は約0.5mm~約128mmの範囲であり、指数関数的に増加する。
図78は、メンブレン傾斜角の関数としての、種々の幅(mm)の深さ0.8mmの長方形チャネルにおける全体的な細胞保持効率のプロットである。幅は約0.5mm~約128mmの範囲であり、指数関数的に増加する。
図83は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う10%の細胞コンフルエンスおよび400μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの12個のプロットを含む。
図84は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う33%の細胞コンフルエンスおよび400μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの12個のプロットを含む。
図85は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う100%の細胞コンフルエンスおよび400μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの12個のプロットを含む。
図86は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う10%の細胞コンフルエンスおよび700μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの11個のプロットを含む。
図87は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う33%の細胞コンフルエンスおよび700μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの12個のプロットを含む。
図88は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う100%の細胞コンフルエンスおよび700μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの12個のプロットを含む。
図89は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う10%の細胞コンフルエンスおよび1000μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの12個のプロットを含む。
図90は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う33%の細胞コンフルエンスおよび1000μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの12個のプロットを含む。
図91は、例示的な実施形態による、細胞ニッチ幅およびフィン幅の変化を伴う100%の細胞コンフルエンスおよび1000μmのフィン高さについての、バイオリアクター細胞充実度対アーキテクチャのHDCRシミュレーションの12個のプロットを含む。
上記で参照したシミュレーションの各々について、細胞ニッチ幅を200μm~500μmまで100μm刻みで変化させ、フィン幅を300μm~500μmまで100μm刻みで変化させた。
結論として、1mL当たりの生存リアクター細胞充実度(VRC)に関して、フィン高さ700μm、フィン幅300μm、ニッチ幅400μm、細胞コンフルエンス100%、およびリアクター長0.39mで、1mL当たり最も高いVRC、すなわち3.65×108VRC/mLが観察された。フィン高さ400μm、フィン幅500μm、ニッチ幅200μm、細胞コンフルエンス10%、およびリアクター長9.15mで、1mL当たりの最も低いVRC、すなわち1.49x107VRC/mLが観察された。概して言えば、より高い細胞密度および代謝は、より高い細胞密度および代謝における可溶性栄養素の関連する消費のために、比較的より短いバイオリアクター長の利用可能性に寄与し得る。
実施例
実施例
600cm2HDCRメンブレンの4-スタックをバイオリアクターカートリッジに組み立て、滅菌した。バイオリアクターを湿潤させ、80mLのマイクロキャリアを充填した。バイオリアクターおよび混合ラインを約400mLの培地(すなわち、F-12K+10%FBS+1%P/S)でフラッシュした。継代22の約1億6600万個のA549細胞を約20mLでバイオリアクターに播種し、穏やかに循環させて、メンブレンの細胞ニッチに沈降させた。気泡トラップラインをシリンジポンプと連通可能に連結して、蓄積ガスを除去した(約1mL/時間に設定)。ガスの流速を約0.5mL/分に設定し、培地の流速を約0.5mL/時間に設定した。毎日、廃液流から出てくる培地をグルコースについて測定し、流速を約100mg/dLの濃度を目標に調整した。ガス灌流を培地灌流に比例してスケーリングさせた。ウイルスによる感染前に、培地を約500mLの還元血清(F-12K+2.5%FBS+1%P/S)に交換した。CF33 hNIS-抗PDL1ウイルスを、約25mLの2.5%FBS+F-12K培地に0.1MOIで添加し、約50mL/分でループ上で約15分間循環させた。バイオリアクターをインキュベータに戻し、培地灌流を約0.5mL/分で再開し、感染後48時間維持した(F-12K+10%FBS+1%P/S)。ウイルスの添加後、廃液流を収集し、続いて約4℃で保存して、宿主細胞からのウイルスエスケープを分析した。
前述の説明は、本明細書に開示されるシステム、デバイス、および方法の特定の実施形態を詳述する。しかしながら、前述の内容が本文中にいかに詳細に現れても、デバイスおよび方法は多くの方法で実践され得ることが理解されるであろう。また上述したように、技術の特定の特徴または特徴を説明する際の特定の用語を使用することは、その用語が関連する技術の特徴または特徴の任意の特定の特性を含むことに限定されるように、用語が本明細書で再定義されていることを意味すると解釈されるべきではないことに留意されたい。したがって、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその任意の等価物に従って解釈されるべきである。
記載された技術の範囲から逸脱することなく、種々の修正および変更が行われ得ることが当業者によって理解されるであろう。かかる修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される実施形態の範囲内に含まれることが意図される。一実施形態に含まれる部分は、他の実施形態と交換可能であり、図示された実施形態からの1つ以上の部分は、任意の組み合わせで他の図示された実施形態とともに含まれ得ることも当業者によって理解されるであろう。例えば、本明細書に記載され、かつ/または図面に示される種々の構成要素のいずれかは、他の実施形態と組み合わされてもよく、交換されてもよく、または他の実施形態から除外されてもよい。
本明細書における任意の複数形および/または単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈および/または用途に適切であるように、複数形から単数形に、および/または単数形から複数形に変換することができる。種々の単数形/複数形の置換は、明確にするために本明細書に明示的に記載される場合がある。
概して、本明細書で使用される用語、特に添付の特許請求の範囲で使用される用語は、概して「オープン」な用語として意図されることが当業者によって理解されるであろう(例えば、「含む(including)」という用語は、「含むが限定されない(including but not limited to)」と解釈されるべきであり、「含む(comprising)」および「有する(having)」という用語は、それぞれ、「少なくとも含む(comprising at least)」および「少なくとも有する(having at least)」と解釈されるべきであり、「含む(includes)」という用語は、「含むが限定されない(includes but is not limited to)」などと解釈されるべきである)。導入される特許請求の範囲で具体的な数の記載が意図される場合、かかる意図は、当該特許請求の範囲において明示的に記載されることになり、かかる記載がない場合、かかる意図は存在しないことが、当業者にはさらに理解されよう。例えば、理解を助けるものとして、以下の添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲の記載を導入するために、「少なくとも1つ」および「1つ以上」という導入句の使用を含み得る。しかしながら、かかる語句の使用は、同じ特許請求の範囲が導入語句「1つ以上」または「少なくとも1つ」および「a」または「an」などの不定冠詞を含む場合であっても、不定冠詞「a」または「an」による特許請求の範囲の記載の導入が、かかる導入された特許請求の範囲の記載を含む任意の特定の特許請求の範囲を、かかる記載を1つのみ含む実施形態に限定することを示唆すると解釈されるべきではない。概して、「a」および/または「an」は、「少なくとも1つ」または「1つ以上」を意味すると解釈されるべきであり、同じことが、特許請求の範囲の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても当てはまる。
少なくとも1つの例示的な実施形態は、例示的なプロセスを実行するために複数のユニットを使用するものとして説明されるが、例示的なプロセスは、1つ以上のモジュールによって実行されてもよいことが理解される。
本明細書における「第1」、「第2」、「第3」などの用語の使用は、種々の構造、寸法または動作を識別するために提供され、いかなる順序も記載しておらず、構造、寸法または動作は、特定の順序が文脈において明確に指定されない限り、述べられた順序とは異なる順序で実行されてもよい。
本明細書および特許請求の範囲全体を通して本明細書で使用される近似表現は、それが関連する基本的機能の変化をもたらすことなく許容可能に変動し得る任意の定量的表現を修飾するために適用され得る。したがって、「約」および「実質的に」などの1つ以上の用語によって修飾される値は、指定された正確な値に限定されるべきでない。少なくとも一部の事例では、近似言語は、値を測定するための機器の精度に対応し得る。ここで、ならびに本明細書および特許請求の範囲全体を通して、範囲の限定は、組み合わせおよび/または交換することができ、かかる範囲は、文脈または言語がそうでないことを示さない限り、識別され、その中に含まれるすべての部分範囲を含む。
具体的に述べられていないか、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の2標準偏差内として理解される。「約」は、述べられた値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%以内として理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、「約」という用語によって修飾される。
さらに、「A、B、およびCなどのうちの少なくとも1つ」に類似した慣例が使用される場合、概して、かかる構成は、当業者が慣例を理解するであろう意味で意図される(例えば、「A、B、およびCのうちの少なくとも1つを有するシステム」は、Aのみ、Bのみ、Cのみ、AとBとを一緒に、AとCとを一緒に、BとCとを一緒に、および/またはAとBとCとを一緒に有するシステムなどを含むが、これらに限定されない)。「A、B、またはCなどのうちの少なくとも1つ」に類似した慣例が使用される場合、概して、かかる構成は、当業者が慣例を理解するであろう意味で意図される(例えば、「A、B、またはCのうちの少なくとも1つを有するシステム」は、Aのみ、Bのみ、Cのみ、AとBとを一緒に、AとCとを一緒に、BとCとを一緒に、および/またはA、BもしくはCを一緒に有するシステムなどを含むが、これらに限定されない)。2つ以上の代替用語を提示する事実上いかなる離接する語および/または句も、明細書、特許請求の範囲、または図面のどこにあっても、当該用語の一方(one of the terms)、当該用語のいずれか(either of the terms)、または両方の用語(both terms)を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者にはさらに理解されよう。例えば、語句「AまたはB」は、「A」または「B」または「AおよびB」の可能性を含むと理解されるであろう。本明細書に記載される主題は、所望の構成に応じて、システム、装置、方法、および/または物品において具現化され得る。前述の説明に記載される実施形態は、本明細書に記載される主題と一致するすべての実施形態を表すわけではない。代わりに、それらは、説明される主題に関連する態様と一致する一部の例にすぎない。一部の変形例が上記で詳細に説明されたが、他の修正または追加が可能である。特に、さらなる特徴および/または変形が、本明細書に記載されたものに加えて提供されてもよい。例えば、上述の実施形態は、開示された特徴の種々の組み合わせおよびサブコンビネーション、および/または上述の複数のさらなる特徴の組み合わせおよびサブコンビネーションを対象とすることができる。加えて、添付の図面に示され、かつ/または本明細書で説明される論理フローは、所望の結果を達成するために、示される特定の順序または連続的な順序を必ずしも必要としない。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内であり得る。
本明細書に開示される技術は、多数の用途を有し、本技術の特定の実施形態が詳細に説明されてきたが、開示される実施形態は、本明細書で考察される設計考慮事項を考慮して修正され得ることが当業者には明らかであろう。したがって、前述の説明は、限定ではなく例示とみなされるべきであり、本発明の真の範囲は、以下の特許請求の範囲において定義されるものである。
Claims (163)
- メンブレンであって、前記メンブレンの第1の側に複数の表面特徴部を含み、前記表面特徴部が、1つ以上の細胞を閉じ込めることができる1つ以上の区画を含み、
前記メンブレンが、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む、メンブレンと、
ガス領域の1つの境界を画定する前記メンブレンの第2の側であって、前記メンブレンが、ガスが前記メンブレンの前記第2の側を通って前記メンブレンの前記第1の側に通過できるように構成されている、第2の側と、
前記メンブレンの前記第1の側に1つの境界を有し、前記メンブレンの前記第1の側にわたって培地を通過させるように構成された培地領域であって、前記1つ以上の区画が、前記区画内の培地流剪断力を少なくとも部分的に低減するように構成されている、培地領域と、を含む、細胞培養装置。 - 前記培地領域に流体接続された1つ以上の培地入口および1つ以上の培地出口をさらに含み、前記1つ以上の培地入口が、前記メンブレンの前記第1の側の前記培地領域への培地の導入を容易にするように構成され、前記1つ以上の培地出口が、前記培地領域からの培地の除去を容易にするように構成されている、請求項1に記載の装置。
- 前記1つ以上の培地入口のうちの少なくとも1つが、前記培地出口のうちの少なくとも1つに流体接続されて、前記メンブレンの前記第1の側の前記培地領域への培地の再導入を容易にする、請求項1または2に記載の装置。
- 前記装置が、前記培地領域からの培地の導入または除去の際に、前記1つ以上の区画における培地流剪断力を最小化するように構成されている、請求項1~3のいずれか一項に記載の装置。
- 前記ガス領域と流体接触する1つ以上のガス入口および1つ以上のガス出口をさらに含み、前記1つ以上のガス入口が、前記ガス領域にガスを導入するように構成され、前記1つ以上のガス出口が、前記ガス領域からのガスの除去のために構成されている、請求項1~4のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンの前記第2の側に形成された1つ以上のチャネルをさらに含み、前記1つ以上のチャネルのうちの少なくとも第1のチャネルが、メンブレンの透過および拡散によって前記メンブレンを介して前記区画のうちの前記少なくとも1つにガスを送達するように構成されている、請求項1~5のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンの前記第1の側の上方に配置されたエンクロージャをさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の装置。
- 前記エンクロージャが、前記培地領域の第2の境界を画定する、請求項7に記載の装置。
- 前記装置が、少なくとも第2の細胞培養装置と積み重ねられるように構成されている、請求項1~8のいずれか一項に記載の装置。
- 前記培地入口もしくは前記ガス入口または前記培地出口もしくは前記ガス出口のうちの1つ以上が、積み重ねられた際に、前記培地入口もしくは前記ガス入口または前記培地出口もしくは前記ガス出口のうちの1つ以上がすぐ隣の装置の入口または出口と流体連通するように構成されている、請求項9に記載の装置。
- 前記培地入口または前記ガス入口のうちの1つ以上が、積み重ねられた際に、前記装置に導入された培地またはガスが、合流されて、複数の前記メンブレンに送るための合流入口ラインに入るように構成されている、請求項9または10に記載の装置。
- 前記培地出口または前記ガス出口のうちの1つ以上が、積み重ねられた際に、前記装置から除去された培地またはガスが、合流されて、複数の前記メンブレンから送るための合流出口ラインに入るように構成されている、請求項9~11のいずれか一項に記載の装置。
- 前記装置を保持するための液密容器をさらに含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記メンブレンを通過する酸素の透過および拡散を許容するサイズを有する細孔を含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の装置。
- 前記1つ以上の区画は、1つ以上の細胞を閉じ込めることができる前記1つ以上の区画の体積の少なくとも約10%を細胞の体積が占めるように、組織レベルの細胞密度を支持する、請求項1~14のいずれか一項に記載の装置。
- 陰圧が、前記1つ以上の区画のうちの少なくとも1つの区画の底面を下方に変形させ、前記少なくとも1つの細胞ニッチの上部の開口部を介して前記少なくとも1つの区画内に液体培地を引き込み、かつ/または陽圧が、前記1つ以上の細胞ニッチのうちの前記少なくとも1つの細胞ニッチの底面を上方に変形させ、前記少なくとも1つの区画の前記上部の前記開口部を介して前記少なくとも1つの区画から前記液体培地を押し出す、請求項1~15のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンの機械的伸張が、前記1つ以上の区画のうちの少なくとも1つの区画を広げて、前記少なくとも1つの区画の前記上部の開口部を介して前記少なくとも1つの細胞ニッチからの1つ以上の細胞の放出を容易にする、請求項1~16のいずれか一項に記載の装置。
- 脈動圧力を前記メンブレンの第1の表面に垂直な正味の流れに整流するように構成された複数のマイクロディフューザをさらに含む、請求項1~17のいずれか一項に記載の装置。
- 前記流体培地を前記1つ以上の区画に輸送するように構成された少なくとも1つの多孔質ウィックをさらに含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記メンブレンに形成された前記区画への酸素透気速度を最大化するために著しく高いガス交換面積対体積比を提供するように設計された複数の区画を有する微細パターン化アーキテクチャを含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記ガスに関連する圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている、請求項1~20のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記液体培地に関連付けられた圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている、請求項1~21のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記ガスおよび前記液体培地のうちの少なくとも1つに関連付けられた圧力または流れの変化に応答して、膨張または収縮して、前記1つ以上の区画における試薬または細胞の均一な分散を促進するように構成されている、請求項1~22のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記メンブレン内の前記1つ以上の区画内に位置する細胞の効率的な培養または採取を容易にするために、前記ガスおよび前記液体培地のうちの少なくとも1つに関連付けられた圧力または流れの変化に応答して膨張または収縮するように構成されている、請求項1~23のいずれか一項に記載の装置。
- 前記培地のための流体経路が、前記メンブレンの前記第1の側にわたる液体培地流を調節する1つ以上の流量調節器によって重力的に支持されている、請求項1~24のいずれか一項に記載の装置。
- 細胞が付着することができる複数のマイクロキャリアをさらに含む、請求項1~25のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数の表面特徴部が、互いに実質的に平行に延びる複数のフィン構造を含み、前記実質的に平行なフィン構造が、隣接するフィン構造間に溝を画定し、前記メンブレンの第1の側の少なくとも1つの溝が、細胞配置のための前記1つ以上の区画のうちの少なくとも1つを提供し、前記少なくとも1つの溝の長手方向が、前記1つ以上の区画の長手方向に対応する、請求項1~26のいずれか一項に記載の装置。
- 前記1つ以上の培地入口が、前記培地領域に培地を導入して、前記溝の長手方向に平行でない培地流を生成するように構成されている、請求項27に記載の装置。
- 前記1つ以上の培地入口が、前記培地領域に培地を導入して、前記溝に対して実質的に垂直な培地流を生成するように構成されている、請求項27または28に記載の装置。
- 前記1つ以上の培地入口が、前記培地領域に培地を導入して、前記溝と実質的に整列した培地流を生成するように構成されている、請求項27または28に記載の装置。
- 前記1つ以上の細胞ニッチのうちの1つ以上の前記上部の開口部が、前記開口部の下方の幅よりも狭い、請求項27~30のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数のフィンが、前記メンブレンの基部から突出して、前記1つ以上の細胞ニッチ内の前記細胞の1つ以上を、培地送達によって生成される培地流剪断力から保持および保護する、請求項27~31のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記ガスを送達するための前記1つ以上のチャネルが前記メンブレンの第1の層に形成され、前記区画が前記第1の層の上方の前記メンブレンの第2の層における前記複数のフィンの間に形成されるように、多層モノリシック構造を有する、請求項27~32のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数のフィンの間に形成された前記複数の区画の上方に専用空間が設けられて、前記複数のフィンの上方を流れ、前記複数のフィンと実質的に垂直な前記液体培地のための流体経路を支持する、請求項27~33のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数のフィンの間に形成された前記複数の区画の上方に専用空間が設けられて、前記複数のフィンの上方を流れ、前記複数のフィンと実質的に整列した前記液体培地のための流体経路を支持する、請求項27~34のいずれか一項に記載の装置。
- 前記流体経路が、前記複数のフィンの上方を流れる前記液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、前記液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する、請求項27~35のいずれか一項に記載の装置。
- 前記表面特徴部が、複数のウェル構造を含み、前記複数のウェル構造のうちの少なくとも1つが、細胞配置のための前記1つ以上の区画の少なくとも1つを提供する、請求項1~36のいずれか一項に記載の装置。
- 前記ウェル構造のうちの少なくとも1つの上部の開口部が、前記開口部の下方の前記ウェル構造の直径の幅よりも狭い前記直径の幅を含む、請求項37に記載の装置。
- 前記ウェル構造のうちの1つ以上が、円形、楕円形、正方形、長方形、六角形、または八角形である開口部を含む、請求項37または38に記載の装置。
- 前記ウェル構造が、前記ウェル構造の前記1つ以上の細胞ニッチ内の前記1つ以上の細胞を、前記培地送達によって生じる剪断力から保護する、請求項37~39のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記ガスを送達するための前記1つ以上のチャネルが前記メンブレンの第1の層に形成され、前記区画が前記第1の層の上方の前記メンブレンの第2の層におけるウェル構造内に形成されるように、多層モノリシック構造を有する、請求項37~40のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数のウェル構造の上方に専用空間が設けられて、前記複数のウェル構造の上方を流れる前記液体培地のための流体経路を支持する、請求項37~41のいずれか一項に記載の装置。
- 前記流体経路が、前記複数のウェル構造の上方を流れる前記液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、前記液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する、請求項37~42のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数のウェル構造の上方に専用空間が設けられて、前記複数のウェル構造の上方を流れる前記液体培地のための流体経路を支持する、請求項37~43のいずれか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つのウェル構造が、円形の開口部を有する、請求項37~42のいずれか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つのウェル構造が、多角形の開口部を有する、請求項37~43のいずれか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つのウェル構造が、湾曲した開口部を有する、請求項37~44のいずれか一項に記載の装置。
- 表面構造が、複数のポスト構造を含み、少なくとも1つのポスト構造が、細胞配置のための前記複数の区画のうちの少なくとも1つを提供する、請求項1~37のいずれか一項に記載の装置。
- 細胞が、前記少なくとも1つのポスト構造に付着している、請求項48に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記ガスを送達するための前記1つ以上のチャネルが前記メンブレンの第1の層に形成され、前記細胞ニッチが前記第1の層の上方の前記メンブレンの第2の層におけるポスト構造の近位に形成されるように、多層モノリシック構造を有する、請求項48または49に記載の装置。
- 前記複数のポスト構造の上方に専用空間が設けられて、前記複数のポスト構造の上方を流れる前記液体培地のための流体経路を支持する、請求項48~50のいずれか一項に記載の装置。
- 前記流体経路が、前記複数のポスト構造の上方を流れる前記液体培地に対して比較的低い抵抗を有し、それにより、前記液体培地流を調節するためのポンプの使用の必要性を排除または低減する、請求項48~51のいずれか一項に記載の装置。
- 前記複数のポスト構造の上方に専用空間が設けられて、前記複数のポスト構造の上方を流れる前記液体培地のための流体経路を支持する、請求項48~52のいずれか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つのポスト構造が、円形断面を有する、請求項48~53のいずれか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つのウェルポストが、多角形の断面を有する、請求項48~54のいずれか一項に記載の装置。
- 少なくとも1つのポスト構造が、湾曲した、山形の、三日月形の、またはU字形の断面を有する、請求項48~53のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンを収容するように構成されたペトリ皿をさらに含む、請求項1~56のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メンブレンが、前記ペトリ皿の底面を形成する、請求項57に記載の装置。
- 前記メンブレンを緊張状態に保ち、剛性を追加するように構成された張力リングをさらに含む、請求項57または58に記載の装置。
- 前記第1の表面とは反対側の前記メンブレンの第2の表面から突出する間隔ピラーであって、前記メンブレンを通して前記細胞ニッチへのガス交換を可能にするように構成された間隔ピラーをさらに含む、請求項57~59のいずれか一項に記載の装置。
- 皿を形成する底面および側壁を含むペトリ皿であって、
前記底面が、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含み、前記底面が、第1の側および第2の側を含み、前記第1の側が、前記第1の側の基部から延在する複数の構造を含み、前記複数の構造の上面の下方に1つ以上の細胞ニッチ領域を形成し、
前記側壁が、前記底面に接続され、前記底面の外周の周りに連続的かつ実質的に垂直な壁を形成する、ペトリ皿。 - 前記底面および前記側壁が、同じ物質を含む、請求項61に記載のペトリ皿。
- 前記底面および前記側壁が、前記少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む、請求項62に記載のペトリ皿。
- 前記側壁が、前記底面とは異なる少なくとも1つの物質を含む、請求項61~63のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記側壁に支持を提供する1つ以上の保持要素をさらに含む、請求項61~64のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 外部環境に曝露される前記ペトリ皿の前記底面が、前記外部環境からのガスが少なくとも部分的にガス透過性のメンブレンを通って前記第1の側に通過することができ、かつ/または前記第1の側からのガスが前記第1の側から前記少なくとも部分的にガス透過性のメンブレンを通って前記外部環境に通過することができるように、前記少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む、請求項61~65のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記ペトリ皿の前記底面が、メッシュ、布、または他の開放孔物質上に配置されて、前記外部環境からのガスが前記メンブレンと交換することを可能にする、請求項61~66のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記外部環境に曝露される前記ペトリ皿の前記底面が、前記皿が平坦な表面上に配置される場合に、ガスが前記底面の下方を少なくとも部分的に通過することを可能にする、その形状における1つ以上の変形形態を含む、請求項67に記載のペトリ皿。
- 前記形状が、ピラー、チャネル、溝、バンプ、突起、または脚を含む、請求項68に記載のペトリ皿。
- 前記形状が、1つ以上の間隔ピラーを含む、請求項68に記載のペトリ皿。
- 上面をさらに含み、前記上面が、封止メンブレンを含む、請求項61に記載のペトリ皿。
- 前記上面が、シリコーンベースのメンブレンを含む、請求項71に記載のペトリ皿。
- 培地を前記ペトリ皿に、または前記ペトリ皿から移送するための密封可能なポートをさらに含む、請求項71に記載のペトリ皿。
- 複数のウェルを含むマルチウェル細胞増殖デバイスであって、前記ウェルが、前記ウェルの内部と接触する第1の側と、前記マルチウェル細胞増殖デバイスの外部と接触する第2の側とを含む底面を含み、前記第1の側が、複数の細胞増殖区画を提供するトポグラフィを含み、前記底面が、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含み、前記底面が、前記マルチウェル増殖デバイスの前記外部からのガスが前記ウェルの前記外部から前記内部に通過して前記複数の細胞増殖区画のうちの1つ以上と接触することができ、かつ/または前記1つ以上の細胞増殖区画内からのガスが前記第1の側から前記第2の側に通過することができるように構成されている、マルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記第1の側の前記トポグラフィが、フィン、サブウェル、およびピラーのうちの1つ以上を含み、前記フィン、サブウェル、およびピラーが、前記複数の細胞増殖区画を少なくとも部分的に画定する、請求項74に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記複数のウェルの側壁が、少なくとも部分的にガス透過性の物質を含む、請求項74または75に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記第2の側が、平坦な表面上にあるときにガスが少なくとも部分的に前記底面の下方を通過することを可能にする、その形状の1つ以上の変形形態を含む、請求項74~76のいずれか一項に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記形状が、ピラー、チャネル、溝、バンプ、突起、または脚を含む、請求項77に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記形状が、1つ以上の間隔ピラーを含む、請求項77または78に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 互いに実質的に平行に延びる複数のフィン構造を含むメンブレンであって、前記実質的に平行なフィン構造が、隣接するフィン構造間に溝を画定し、前記メンブレンの第1の側の少なくとも1つの溝が、少なくとも細胞配置のための区画を提供し、
前記メンブレンが、ガスに対して少なくとも部分的に透過性である物質を含む、メンブレンと、
ガス領域を画定する前記メンブレンの第2の側であって、前記メンブレンによって前記メンブレンの前記第1の側から分離され、ガスが前記メンブレンを通過することができる、前記メンブレンの第2の側と、
前記区画内に堆積可能な1つ以上の細胞を含む培地を受容するように構成された、前記メンブレンの前記第1の側の培地領域と、を含む、細胞培養装置。 - 1つ以上のメンブレンと、
複数の細胞を保持するように構成された複数の区画のうちの第1の区画を形成するために、前記メンブレンの第1の表面から突出する少なくとも第1のフィンおよび第2のフィンを含む複数のフィンを有する、前記1つ以上のメンブレンのうちの少なくとも1つのメンブレンと、を含み、
前記メンブレンが、前記複数のフィンの下方の前記メンブレンの前記第1の表面の下に形成された1つ以上のチャネルを通して前記複数の区画にガスを送達することを容易にするために、ガス透過性および透気性である物質から形成され、前記1つ以上のチャネルのうちの少なくとも第1のチャネルが、前記第1の区画に前記ガスを直接送達するように構成されている、細胞呼吸器装置。 - 生体細胞を培養する方法であって、請求項1~81のいずれか一項に記載の装置を提供することと、生体細胞を前記装置に導入することと、細胞培地が前記生体細胞と接触するように、前記装置の前記第1の側に前記細胞培地を提供することと、を含む、方法。
- 前記メンブレンの前記第2の側にガスを提供することをさらに含む、請求項82に記載の方法。
- 1つ以上の細胞区画上に培地を流すことをさらに含む、請求項82または83に記載の方法。
- 前記培地を流すことが、入口を通して培地を導入することと、出口を通して培地を除去することと、を含む、請求項82~84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メンブレンの前記第2の側にガスを流すことをさらに含む、請求項82~85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ガスを流すことが、入口を通してガスを導入することと、出口を通してガスを除去することと、を含む、請求項82~86のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の区画内に陰圧を生成することによって、培地、生体細胞または別の物質を前記1つ以上の細胞区画内に流すことをさらに含む、請求項82~87のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の区画内に陰圧を生成することによって、前記1つ以上の区画内に細胞を維持することをさらに含む、請求項82~88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の区画内に陽圧を生成することによって、培地、生体細胞、または別の物質を前記1つ以上の細胞区画から流出させることをさらに含む、請求項82~89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の区画内に陽圧を生成することによって、細胞を前記1つ以上の区画から外に誘導することをさらに含む、請求項82~90のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の区画内に陽圧および/または陰圧を生成することによって、前記1つ以上の区画内の前記生体細胞のうちの1つ以上を混合することをさらに含む、請求項82~91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽圧および/または陰圧が、ガスを前記ガス領域に流し、培地を前記培地領域に流し、ガスおよび培地の両方をそれらのそれぞれの領域に流し、前記ガス領域へのガスの流れを防ぎ、かつ/または前記培地領域への培地の流れを防ぎ、それによって前記2つの領域の間に圧力差を生成することによって生成される、請求項82~92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体細胞が、ヒト、非ヒト哺乳動物、昆虫、細菌、真菌、酵母、3T3-L1、4T1、9L、A20、A172、A253、A431、A549、A2780、A2780ADR、A2780cis、AB9、AHL-1、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BOSC23、BT-20、BxPC-3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Caco-2、Cal-27、Calu-3、CGR8、CHO、CML T1、CMT12、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23-、COS-7、COV-434、CT26、D17、DAOY、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、vEL4、EM-2、EM-3、vEMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、GL261、H1299、HaCaT、HCA2、HEK293、HEK293T、HeLa、Hep G2、Hepa1c1c7、High Five、HL-60、HT-29、HT-1080、J558L、Jurkat、JY、K562、KBM-7、KCL-22、KG1、Ku812、KYO-1、L243、L1210、LNCaP、MA-104、Ma-Mel、MA2.1、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-157、MDA-MB-231、MDA-MB-361、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MIA PaCa-2、Mono-Mac-6、MOR/0.2R、MRC-5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX4、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、Neuro-2a、Neuro2a、NIH-3T3、NK-92、NTERA-2、NW-145、OK、OPCN/OPCT細胞株、P3X63Ag8、PANC-1、PC-3、PC12、Peer、PNT1A、PNT2、Pt K2、Raji、RBL-1、RenCa、RIN-5F、RMA-S、S2、SaOS-2、Sf9、Sf21、SH-SY5Y、SiHa、SK-BR-3、SK-N-SH、SK-OV-3、T-47D、T2、T84、T98G、THP-1、U2OS、U87、U373、U937、VCaP、Vero、VG-1、WM39、WT-49、YAC-1、およびYAR細胞からなる群から選択される、請求項82~93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ガスが、酸素、二酸化炭素、窒素、一酸化炭素、亜酸化窒素、硫化水素、エチレンオキシド、オゾン、二酸化塩素、および二酸化窒素からなる群から選択される、請求項82~94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培地が、DMEM、FCS、293SFM II、AEM、CDM4HEK293、SFM4HEK293、Ex-Cell293、SFM4Transfx-293、Freestyle293、ESF SFM、CDM4CHO、CHO培地、MEM、MEM Alpha、RPMI、F-10、F-12、IMDM、Medium199、Leibovitz L-15、McCoyの5A、MCDB培地、Williamの培地、CMRL培地、OptiMEM、OptiPro、AIM V、OptiPEAK Tリンパ球、ExCellerateヒトT細胞増殖培地、StemXVivo無血清ヒトT細胞ベース培地、ExpiSf CD培地、Sf-900 II/III SFM、およびTC-100昆虫培地からなる群から選択される、請求項82~95のいずれか一項に記載の方法。
- 他の物質が、廃棄物質、前記細胞から分泌される物質、前記細胞内部の物質、細胞破片、およびガスからなる群から選択される、請求項88または90に記載の方法。
- 前記ガス領域に凍結剤を導入して、前記複数の区画内の細胞および細胞成分を凍結させることであって、前記凍結剤が、0℃未満の温度を有し、前記凍結剤が、気体状態または液体状態である、凍結させることをさらに含む、請求項82~97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面特徴部のうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、請求項1~60のいずれか一項に記載の装置。
- 前記表面特徴部のうちの前記少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、請求項99に記載の装置。
- 前記表面特徴部のうちの前記少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、請求項100に記載の装置。
- 前記表面特徴部のうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、請求項1~60のいずれか一項に記載の装置。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、請求項102に記載の装置。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、請求項103に記載の装置。
- 前記複数の構造のうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、請求項61~73のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記複数の構造のうちの前記少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、請求項105に記載のペトリ皿。
- 前記複数の構造のうちの前記少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、請求項106に記載のペトリ皿。
- 前記複数の構造のうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、請求項61~73のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、請求項108に記載のペトリ皿。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、請求項109に記載のペトリ皿。
- 前記複数の細胞増殖区画のうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、請求項74~79のいずれか一項に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記複数の細胞増殖区画のうちの前記少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、請求項111に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記複数の細胞増殖区画のうちの前記少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、請求項112に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記複数の細胞増殖区画のうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、請求項74~79のいずれか一項に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、請求項114に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、請求項115に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記複数のフィン構造のうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、請求項80に記載の細胞培養装置。
- 前記複数のフィン構造のうちの前記少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、請求項117に記載の細胞培養装置。
- 前記複数のフィン構造のうちの前記少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、請求項118に記載の細胞培養装置。
- 前記複数のフィン構造のうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、請求項80に記載の細胞培養装置。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、請求項120に記載の細胞培養装置。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、請求項121に記載の細胞培養装置。
- 前記複数のフィンのうちの少なくとも1つが、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する、請求項81に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記複数のフィンのうちの前記少なくとも1つが、約700μm~約1000μmの高さを有する、請求項123に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記複数のフィンのうちの前記少なくとも1つが、約700μmの高さを有する、請求項124に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記複数のフィンのうちの少なくとも1つが、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である、請求項81に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、請求項126に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、請求項127に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記装置が、約400μm~約1000μmの高さ、約300μm~約500μmの幅、および約200μm~約500μmのピッチを有する少なくとも1つの表面特徴部を含む、請求項82~98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装置が、約700μm~約1000μmの高さを有する少なくとも1つの表面特徴部を含む、請求項129に記載の方法。
- 前記装置が、約700μmの高さを有する少なくとも1つの表面特徴部を含む、請求項130に記載の方法。
- 前記装置が、高さ対幅対ピッチの比が約4~10対約3~5対約2~5である少なくとも1つの表面特徴部を含む、請求項82~98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7~10対約3~5対約2~5である、請求項132に記載の方法。
- 前記高さ対幅対ピッチの比が、約7対約3~5対約2~5である、請求項133に記載の方法。
- ガス入口と、
ガス出口と、
前記ガス入口と前記ガス出口との間に接続されたガス経路と、
培地入口と、
培地出口と、
前記培地入口と前記培地出口との間に接続された培地経路と、
ガス供給経路と培地供給経路とを分離するメンブレンと、を含み、
前記メンブレンが、細胞保護領域を含み、
前記細胞保護領域が、前記培地経路と液体連通しており、
前記細胞保護領域が、前記培地経路とは流体的に異なり、
前記細胞保護領域が、前記メンブレン全体にわたって前記ガス経路とガス連通しており、
前記細胞保護領域が、前記細胞保護領域で生産された細胞に対する前記培地経路を流れる培地の剪断力の影響を低減するように構成されている、バイオリアクター。 - 前記バイオリアクターが、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109個の細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、請求項135に記載のバイオリアクター。
- 前記培地入口での前記培地の速度が、約1μm/秒~約1m/秒である、請求項135または136に記載のバイオリアクター。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約100μm/秒であり、前記バイオリアクターが、約40cmの長さを有し、約108個の細胞/mLを生産する、請求項135~137のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約1μm/秒であり、前記バイオリアクターが、約106個の細胞/mLを生産する、請求項135~138のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
- 前記装置が、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109個の細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、請求項1~60および99~104のいずれか一項に記載の装置。
- 前記培地入口での前記培地の速度が、約1μm/秒~約1m/秒である、請求項1~60、99~104、および141のいずれか一項に記載の装置。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約100μm/秒であり、前記装置が、約40cmの長さを有し、約108個の細胞/mLを生産する、請求項1~60、99~104、141および142のいずれか一項に記載の装置。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約1μm/秒であり、前記装置が、約106個の細胞/mLを生産する、請求項1~60、99~104および141~143のいずれか一項に記載の装置。
- 前記ペトリ皿が、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109個の細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、請求項61~73および105~110のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記ペトリ皿が、約40cmの長さを有する、請求項61~73、105~110、および145のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記ペトリ皿が、約108個の細胞/mLを生産する、請求項61~73、105~110、145および146のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記ペトリ皿が、約106個の細胞/mLを生産する、請求項61~73、105~110、145および146のいずれか一項に記載のペトリ皿。
- 前記マルチウェル細胞増殖デバイスが、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109個の細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、請求項74~79および111~116のいずれか一項に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記マルチウェル細胞増殖デバイスが、約40cmの長さを有する、請求項74~79、111~116、および149のいずれか一項に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記マルチウェル細胞増殖デバイスが、約108個の細胞/mLを生産する、請求項74~79、111~116、149および150のいずれか一項に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記マルチウェル細胞増殖デバイスが、約106個の細胞/mLを生産する、請求項74~79、111~116、149および150のいずれか一項に記載のマルチウェル細胞増殖デバイス。
- 前記細胞培養装置が、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109個の細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、請求項80および117~122のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 前記培地入口での前記培地の速度が、約1μm/秒~約1m/秒である、請求項80、117~122、および153のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約100μm/秒であり、前記細胞培養装置が、約40cmの長さを有し、約108個の細胞/mLを生産する、請求項80、117~122、153および154のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約1μm/秒であり、前記細胞培養装置が、約106個の細胞/mLを生産する、請求項80、117~122および153~155のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
- 前記細胞呼吸器装置が、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109個の細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、請求項81および123~128のいずれか一項に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記培地入口での前記培地の速度が、約1μm/秒~約1m/秒である、請求項81、123~128、および157のいずれか一項に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約100μm/秒であり、前記細胞呼吸器装置が、約40cmの長さを有し、約108個の細胞/mLを生産する、請求項81、123~128、157および158のいずれか一項に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約1μm/秒であり、前記細胞呼吸器装置が、約106個の細胞/mLを生産する、請求項81、123~128および157~159のいずれか一項に記載の細胞呼吸器装置。
- 前記方法が、約107個の細胞/ミリリットル(細胞/mL)~約109個の細胞/mLのトランスフェクション時の細胞密度、および約1015アデノ随伴ウイルスゲノム/リットル(AAV vg/L)~約1016AAV vg/Lの生産能を生じるように構成されている、請求項82~98および129~134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培地入口での前記培地の速度が、約1μm/秒~約1m/秒である、請求項82~98、129~134、および161のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約100μm/秒であり、前記方法が、約40cmの長さを有し、約108個の細胞/mLを生産する、請求項82~98、129~134、161および162のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培地入口での前記培地の前記速度が、約1μm/秒であり、前記方法が、約106個の細胞/mLを生産する、請求項82~98、129~134および161~163のいずれか一項に記載の方法。
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