JP2023502792A - デジタル撮像システム及び方法 - Google Patents

Abstract

スライドの表面に貼り付けられた検体内に分布する物体の画像を取得するためのシステム及び方法であって、スライドの面と非直交角をなす光軸を有する対物レンズを有するカメラを用いて、スライド面に対して不均一な高さを有する検体から、検体の第１の直線部分の第１の複数の画像を取得することと、第１の複数の画像に撮像された検体の直線部分内の物体の焦点を評価することと、及び、第１の直線部分又は第１の直線部分とは異なる検体の第２の直線部分の第２の複数の画像を取得することと、を含み、第２の複数の画像の取得中に、第１の複数の画像に撮像された物体の評価された焦点に基づいて、スライド面に対する対物レンズの高さを変化させる、方法。【選択図】図６

Description

本出願は、２０１９年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／９４０１６３号に対して米国特許法第１１９条に基づく利益を主張し、その内容を参照により本出願に援用する。

本開示は、概して、撮像装置の被写界深度を超える厚さを有する細胞学的（細胞性）検体など、スライドの面に貼り付けられた検体のデジタル画像を取得するためのシステム及び方法に関する。

何れかの目的のために本明細書で特定された全ての米国及びＰＣＴ特許及び特許公報は、その全体が参照により援用される。

細胞学は、細胞の形成、構造及び機能を研究する生物学の一分野である。実験室の設定における適用として、細胞学者、細胞検査技師、及び他の医療専門家は、患者の細胞試料の目視検査に基づいて患者の状態の医学的診断を行う。このような試料は本明細書では「細胞学的」検体と呼ばれる。典型的な細胞学的手法には、子宮頸がんの発症の前兆である異常な細胞の存在を検出するために女性の子宮頸部から細胞を掻き取り、分析する「パップスミア」試験がある。人体の他の部分における異常な細胞及び疾患を検出するためにも細胞学的手法は使用される。

細胞学的手法が広く採用されているのは、本明細書で「病理学的」検体と呼ばれる固体組織試料を、スプリング装填された並進可能なスタイレットや固定カニューレなどを有する特殊な生検針を用いて患者から切除する生検などの伝統的な外科的病理学的手順と比べて、分析のために細胞検体を採取することは概して侵襲性が低いためである。細胞試料は、例えば、ある領域を掻き取る若しくは拭き取るか、又は、針を用いて胸腔、膀胱、脊柱管、若しくは他の適切な領域から体液を吸引することを含む様々な技術によって患者から採取され得る。採取された細胞試料は、典型的には保存液に入れられ、続いて保存液から抽出されてスライドガラスに移される。その後の染色及び検査を容易にするため、細胞試料に固定剤を塗布し、細胞がスライドガラスに確実に固定されるようにする。

概して、スライド上の細胞は、個々の細胞を検査できるように、適切な空間分布を有していることが望ましい。通常、単層の細胞が好ましい。したがって、多くの細胞（例えば、数万個）を含む液体試料から細胞学的検体を調製するには、典型的には、細胞を機械的分散、液体せん断、又は他の手法によって最初に互いに分離し、薄い単層の細胞を回収してスライド上に堆積させることができるようにすることを必要とする。このようにすることで、細胞検査技師は、患者試料中の任意の異常な細胞の存在をより容易に識別することができる。また、適切な数の細胞が評価されたことを確認するために、細胞を数えることもできる。

液体試料容器から細胞の薄い単層を作り、次にこの薄層を目視検査に有利な「検体スライド」に移すための特定の方法及び装置は、米国特許第５１４３６２７号、５２４０６０６号、５２６９９１８号、５２８２９７８号、６５６２２９９号、６５７２８２４号及び７５７９１９０号明細書に開示されている。これらの特許に開示されている方法の一つに、保存液に懸濁させて試料容器に保存されている患者の細胞を、容器に挿入した回転式サンプルコレクターで分散させる方法がある。サンプルコレクターに制御された真空をかけ、所望の細胞の量及び空間分布がサンプルコレクターのスクリーンフィルターに捕集されるまで、フィルターを通して液体を吸引する。その後、サンプルコレクターをサンプル容器から取り出し、フィルター部分をスライドガラスに押し当て、採取した細胞を採取時とほぼ同じ空間分布でスライドガラスに移す。これらの特許の１つ以上の教示に従って製造された装置は、マサチューセッツ州マルボロを拠点とするＨｏｌｏｇｉｃ社で製造、販売されているＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）２０００Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（患者試料から１つずつ処理する検体スライド）、ＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）５０００Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（患者試料からバッチ処理する検体スライド）など商業的に成功を収めている。さらに、米国特許第７５５６７７７号及び７７７１６６２号明細書も参照する。

検体スライドが調製されると、検体は、典型的には倍率下で、且つ、各種照明源を用いて或いは用いずに、細胞検査技師によって目視で検査され得る。加えて又はそれに代えて、細胞検査プロセスを補助する自動スライド撮像システムも使用されている。例えば、自動スライド撮像システムは、細胞検査技師をスライド上の潜在的に最も関連性の高い細胞に誘導して綿密な検査を実施することができるように、スライドに固定された細胞学的検体内の個々の細胞の全て又は実質的に全ての画像を撮像し、画像処理技術を用いて細胞の予備評価を実施する。このような撮像システムの例は、米国特許第７５８７０７８号、６６６５０６０号、７００６６７４号、７３６９３０４号及び７５９０４９２号明細書に開示されている。実際の検体スライドを拡大して検査する場合でも、検体の拡大画像を検査する場合でも、検体は通常、細胞検査技師によって「正常」又は「異常」のいずれかに分類され、異常試料は通常、子宮頸部／膣の細胞学的診断を報告するためのベセスダシステムで定義された主要分類のいずれかに該当する。

しかしながら、生体検体のデジタル画像を取得するための従来のシステムや方法には、多くの欠点がある。例えば、従来のシステムや方法では、検体全体を走査する際に停止して焦点を合わせるのに時間がかかるため、撮影に時間がかかった。さらに、焦点を合わせるために停止しない従来のシステム及び方法では、通常、検体全体にわたって単一の焦点面のみを提供する。細胞学的検体及び病理学的検体の両方の生体検体は実際には３次元的なものである（すなわち、奥行きを有する）。したがって、生体検体のデジタル画像を得るためには高倍率且つ焦点距離が必要なため、画像の被写界深度は非常に限られる。そのため、焦点面内の被写界深度の外側にある検体の部分は、焦点が合っていない、又は、画像で視認できなくなる。検体の複数の異なる深度で焦点の合ったデジタル画像を得るためには、検体又はカメラを移動させるか、又は、焦点レンズを調整することによって、焦点面を調整する必要がある。しかしながら、これには焦点面ごとに検体の追加走査が必要になったり、焦点を合わせ直すために一定期間毎に停止したりする必要があるためさらに取得時間がかかる。

従来技術の撮像システムの前述の問題の多くは、ＰＣＴ国際公開第２０２０／０９１９６５（Ａ２）号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／５５４５８、２０１９年１０月９日出願）に開示及び説明されている撮像システム及び方法によって対処され、解決される。国際公開第２０２０／０９１９６５（Ａ２）号パンフレットに開示された撮像システム及び方法の主要な態様は、以下に説明及び議論されるが、検体の厚さ全体を含む焦点範囲内の画像を撮像するためにスライド面に対して傾斜した対物レンズを有するカメラの一度の走査経路によって、焦点の合った検体内で異なる深度の細胞の画像を撮像する性能を含む。しかしながら、一部の検体スライドでは、国際公開第２０２０／０９１９６５（Ａ２）号パンフレットでは対処されていない特定の問題が生じる。例えば、カバースリップが不均一であること、又は初めにスライドを調製する際の他の側面によって、検体の厚み、すなわちスライド面に対する検体の高さが不均一な場合である。この場合、検体中の細胞の一部（おそらくかなりの量）が焦点範囲外になる。したがって、国際公開第２０２０／０９１９６５（Ａ２）号パンフレットに開示される撮像システム及び技術のさらなる改良は、この焦点外の細胞の問題を解決するのに有用であろう。

開示される本発明の第１の態様によると、スライドの面に貼り付けられた検体内に分布する物体の画像を、スライドの面と非直交角をなす光軸を有する対物レンズを有するカメラを使用して取得するための方法が開示される。検体はスライド面に対して不均一な高さを有し、本方法は、（ｉ）検体の第１の直線部分の第１の複数の画像を取得することと、（ｉｉ）第１の複数の画像に撮像された検体の直線部分内の物体の焦点を評価することと、及び、（ｉｉｉ）第１の直線部分又は第１の直線部分とは異なる検体の第２の直線部分の第２の複数の画像を取得することと、を含み、第２の複数の画像の取得中に、第１の複数の画像に撮像された物体の評価された焦点に基づいて、スライド面に対する対物レンズの高さを変化させる。任意選択で、第１の複数の画像の取得中に、スライド面に対する対物レンズの高さはほぼ一定である。任意選択で、第２の直線部分は、第１の直線部分に直接隣接する。

各種実施形態では、第１の複数の画像に撮像された物体の焦点を評価することは、焦点外物体の総数が閾値数を超えるかを決定することと、そして、（ｉ）第１の複数の画像の焦点外物体の総数が閾値数を超える場合、第１の直線部分から第２の複数の画像を取得することと、又は、（ｉｉ）第１の複数の画像の焦点外物体の総数が閾値数を超えない場合、第２の直線部分から第２の複数の画像を取得することとのいずれかを含む。

各種実施形態では、第１の複数の画像に撮像された物体の焦点を評価することは、スライド面に対する焦点外物体の各々の高さを決定することと、第１の複数の画像における取得中に、各々の焦点外物体が、対物レンズの合焦範囲外であるスライド面に対する高さに位置するかを決定することとを含む。好ましくは、第１の複数の画像における物体の焦点を評価することは、第１の複数の画像における取得中に、各々の焦点外物体が、対物レンズの合焦範囲の最大高さよりも高い又は最小高さよりも低いスライド面に対する高さに位置するかを決定することを含む。

各種実施形態では、第１の複数の画像における物体の焦点を評価することは、第１の直線部分内の焦点外物体の各々の位置を決定することを含む。

各種実施形態では、カメラ及びスライドの一方又は両方は、画像の取得中に他方に対して移動し、スライド面に対する対物レンズの高さは、第１又は第２の直線部分の各々の長さ方向の位置に対するカメラの直線位置の関数として、スライド面に対するカメラの高さを増加及び／又は減少させることによって変化する。特に、画像の取得中に、スライドをカメラに対して垂直に移動させるか、カメラをスライドに対して垂直に移動させるか、あるいはその両方を行うことによって、スライド面に対する対物レンズの高さを変化させ得る。

各種実施形態では、第２の複数の画像が第１の直線部分から取得される場合、本方法は、第２の複数の画像に撮像された物体の焦点を評価することと、及び、第２の直線部分の第３の複数の画像を取得することとを更に含み、第３の複数の画像の取得中に、スライド面に対する対物レンズの高さは、第２の複数の画像で撮像された物体の評価された焦点に基づいて変化する。

本明細書に開示される本発明の別の態様によれば、スライドの面に貼り付けられた検体内に分布する物体の画像を、スライドの面と非直交角をなす光軸を有する対物レンズを有するカメラを使用して取得する方法であって、検体はスライド面に対して不均一な高さを有し、（ａ）検体の直線部分の第１の複数の画像を取得することと、（ｂ）第１の複数の画像に撮像された物体の焦点を評価することと、（ｃ）検体の同一又は異なる直線部分の第２の複数の画像を取得することと、第２の複数の画像の取得中に、第１の複数の画像に撮像された物体の評価された焦点に基づいて、スライド面に対する対物レンズの高さを変化させ、及び、（ｄ）（ａ）～（ｃ）をほぼ全体の検体の画像が取得されるまで繰り返すことと、を含む方法。第２の複数の画像が検体の異なる直線部分から取得される場合、そのような異なる直線部分は第１の複数の画像が取得された直線部分に直接隣接し得る。

各種実施形態では、第１の複数の画像に撮像された物体の焦点を評価することは、焦点外物体の総数が閾値数を超えるかを決定することを含み得る。

好ましい実施形態では、第１の複数の画像における物体の焦点を評価することは、第１の複数の画像における取得中に、各々の焦点外物体が、対物レンズの合焦範囲の最大高さよりも高い又は最小高さよりも低いスライド面に対する高さに位置するかを決定することと、焦点外物体の直線部分内の各々の位置を決定することとを含む。

好ましい実施形態では、第１及び第２の複数の画像の各々の取得中に、カメラ及びスライドの一方又は両方は他方に対して側面方向に移動し、スライド面に対する対物レンズの高さは、各々の直線部分の長さ方向の位置に対するカメラの直線位置の関数として、スライド面に対するカメラの高さを増加及び／又は減少させることによって変化する。繰り返すが、スライド面に対する対物レンズの高さは、画像の取得中にカメラに対してスライドを垂直に移動させるか、又はスライドに対してカメラを垂直に移動させるか、又はその両方によって変化させることができる。

開示される本発明のさらなる態様によると、スライドの面に貼り付けられた検体内に分布する物体の画像を取得するためのシステムが提供され、検体は、スライド面に対して不均一な高さを有し、システムは光軸を有する対物レンズを有するカメラを含み、カメラは光軸がスライドの面と非直交角をなすように位置決めされる。システムはカメラと動作可能に接続された画像処理部をさらに含み、画像処理部は、カメラによって取得された検体の第１の直線部分の第１の複数の画像を受信し、第１の複数の画像に撮像された検体の直線部分内の物体の焦点を評価し、カメラに、第１の直線部分又は第１の直線部分とは異なる検体の第２の直線部分から第２の複数の画像を取得させるように構成され、第２の複数の画像の取得中に、第１の複数の画像に撮像された物体の評価された焦点に基づいて、スライド面に対する対物レンズの高さを変化させる。

一実施形態では、第１の複数の画像の取得中に、スライド面に対する対物レンズの高さはほぼ一定である。

一実施形態では、画像処理部は、焦点外物体の総数が閾値数を超えるかを少なくとも部分的に決定することによって、第１の複数の画像に撮像された物体の焦点を評価する。

一実施形態では、画像処理部は、スライド面に対する焦点外物体の各々の高さを少なくとも部分的に決定することによって、第１の複数の画像に撮影された物体の焦点を評価する。

一実施形態では、画像処理部は、第１の複数の画像における取得中に、各々の焦点外物体が対物レンズの合焦範囲外にあるスライド面に対する高さに位置するかを少なくとも部分的に決定することによって、第１の複数の画像における物体の焦点を評価する。

一実施形態では、画像処理部は、第１の複数の画像における取得中に、各々の焦点外物体が、対物レンズの合焦範囲の最大高さより高いか又は最小高さよりも低いスライド面に対する高さに位置するかを少なくとも部分的に決定することによって、第１の複数の画像における物体の焦点を評価する。

一実施形態では、画像処理部は、第１の直線部分内の焦点外物体の各々の位置を少なくとも部分的に決定することによって、第１の複数の画像内の物体の焦点を評価する。

各種実施形態では、好ましくは、画像の取得中に、カメラ及びスライドの一方又は両方は他方に対して側面方向に移動するように構成される。

限定されないが、一実施形態では、スライド面に対する対物レンズの高さは、各々の直線部分の長さ方向の位置に対するカメラの直線位置の関数として、カメラに対するスライド面の高さを増加及び／又は減少させることによって変化する。同じ又は別の実施形態では、スライド面に対する対物レンズの高さは、第１又は第２の直線部分の各々の長さ方向の位置に対するカメラの直線位置の関数として、スライド面に対するカメラの高さを増加及び／又は減少させることによって変化する。

第２の複数の画像は、第１又は第２の直線部分から取得されてもよい。一実施形態では、第２の複数の画像は第１の直線部分から取得され、画像処理部は、第２の複数の画像に撮像された物体の焦点を評価し、そして、カメラに第２の直線部分の第３の複数の画像を取得させるようにさらに構成され、第３の複数の画像の取得中に、第２の複数の画像で撮像された物体の評価された焦点に基づいて、スライド面に対する対物レンズの高さが変化する。限定するものではないが、第２の直線部分は、第１の直線部分に直接隣接していてもよい。

開示された実施形態の他の及びさらなる態様及び特徴は、添付の図面と併せて後述する詳細な説明から明らかになるであろう。

実施形態の前述の態様及び他の態様は、添付の図面を参照してさらに詳細に説明され、同様の参照番号は同様の構成要素を意味し、同様の構成要素に対する説明は、記載された関連する全ての実施形態に対して適用される。

図１は、自動デジタル撮像システムで用いられる検体スライドを示す。

図２は、図１のスライドの検体領域の断面図である。

図３は、細胞内容の相対的な高さの調査結果の表である。

図４Ａは３Ｄフォーカスマップで、検体全体の細胞内容の相対的な高さを示す。 図４Ｂはヒートマップで、検体全体の細胞内容の相対的な高さを示す。

図５は、一実施形態に係わる、デジタル撮像装置が検体スライドの走査に使用する蛇行走査パターンを示す模式図である。

図６は、スライドに対する撮像装置の傾斜角度を説明するための模式図である。

図７は、フォーカスマージ操作を示すグラフである。

図８Ａは、細胞経路、体積走査によってカバーされる領域、及びＺ曲線追従体積走査によってカバーされる領域を示す検体領域の断面図である。 図８Ｂは、細胞経路、体積走査によってカバーされる領域、及びＺ曲線追従体積走査によってカバーされる領域を示す検体領域の断面図である。 図８Ｃは、細胞経路、体積走査によってカバーされる領域、及びＺ曲線追従体積走査によってカバーされる領域を示す検体領域の断面図である。

図９Ａは、Ｚ曲線追従なしで取得した検体の画像である。 図９Ｂは、Ｚ曲線追従ありで取得した検体の画像である。

図１０は、Ｚ曲線追従によって検体の画像を取得する方法のフロー図である。

デジタルホールスライドイメージング（ＷＳＩ）システムの登場は、病理学や細胞学の分野に革命をもたらしている。高画質なホールスライド画像を迅速に取得できることは、特にパップテストのような大量のスクリーニング用途において、臨床ワークフローを成功させるために不可欠なステップとなるだろう。液状化細胞診スライドは、検査技師には視覚的にほぼ単層に見えるが、細胞診は本来３次元的なものである。これらのスライドは、密接に並置された材料の焦点深度が高倍率顕微鏡の対物レンズの被写界深度（ＤＯＦ）よりも桁違いに高いことがあり、ＷＳＩには困難となり得る。このため、細胞診スライドは組織診スライドよりも画像化の難易度が高い。また、フィルムカバースリップを使用したスライドは、スライドの細胞スポット領域が湾曲しているため、走査深度の要件が追加され得る。そのため、顕微鏡の対物レンズのＤＯＦに対して、細胞診検体における対象物体と検体が貼り付けられているスライドガラスとの距離が大きく変化し得る。現在のＷＳＩシステムの多くは、高品質な画像を取得するために複数の焦点面をカバーするため走査を繰り返す必要があり、撮影時間が大幅に増加する。そのため、細胞診スライドに高い焦点画質の画像を効率的に得ることは困難である。本明細書では、このようなスライドを効率的に走査して、高品質で焦点の合った画像を得るためのシステム及び方法が開示される。

図１を参照すると、顕微鏡スライド１０２の例示的な実施形態が示される。顕微鏡スライド１０２は、スライド識別領域１１２、検体領域１１４、及び基準マーク１１６を有する矩形のガラスプレート１１０（又は他の適切な材料）である。顕微鏡スライド１０２は、約７５ｍｍ×２５ｍｍである標準サイズの顕微鏡スライドであってもよいし、他の適切なサイズであってもよい。顕微鏡スライド１０２は、スライド１０２の取り扱い及び位置決めを容易にするために、面取りされた角部を有していてもよい。検体領域１１４は、約２２ｍｍまでの直径を有する円であってもよい。顕微鏡スライド１０２上の検体領域１１４の全体が撮像されてもよい。スライド識別領域１１２は、最大で約２５～２８ｍｍの長さであってもよい。スライド識別部１１２には、バーコード、ＩＤ番号、及び／又は他の情報が印刷されていてもよい。検体領域１１４は、スライドガラス１０２の透明な領域として残される。基準マーク１１６は、撮像装置に対するスライド１０２及びその特徴の位置及び／又は向きを決定するために、撮像装置によってスライド１０２上の基準点として使用され得る。スライド１０２には３次元の体積内に分布する複数の物体を含む検体１１９が、通常は検体領域１１４内に貼り付けられるが、場合によっては、検体が検体領域１１４の外にまで広がることもある。検体１１９の３次元的な体積は、長さ（ｌ）、幅（ｗ）、及び厚み又は深度（ｄ）を有する。厚み（ｄ）は、スライド１０２の面に対するｚ軸を規定する。検体１１９は、対象物が細胞である細胞診検体、対象物が組織構造である固体組織検体など、任意の適切な検体であってよい。

図１に示されるように、検体領域１１４の検体１１９を覆うためにカバースリップ１１５が使用されてもよい。検体のカバースリップ１１５は、カバースリップ１１５を通して検体１１９の画像を取得するのに充分な透明性を有している。すなわち、カバースリップ１１５は、撮像装置がカバースリップ１１５を介して画像を取得することを妨げない。カバースリップ１１５は、検体１１９を保存し、汚染しないよう、そして、他の物体を汚染させないよう保護する機能があり、また検体１１９を平坦且つ所定の位置に保持する。カバースリップ１１５は厚み１１７を有する。

図２に示すように、スライドガラス１１０とカバースリップ１１５との間に配置された検体１１９は、厚み１２０を有する。細胞１２２は、様々な深度、すなわちｚ軸方向の位置で検体層全体に分散している。検体は、検体全体にわたって、検体中の物体（細胞１２２など）の画像を取得するために使用される光学系の被写界深度を超える厚みを有し得る。これは特に、個々の細胞を採取する液状化細胞診検体で起こり得ることである。検体１１９の上に載せられるカバースリップ１１５は、ガラス製又はプラスチック製でもよく、薄い接着剤層でスライド１１０に接着される。細胞は接着剤内で浮きやすいことが観察されており、ガラス１１０の上方に浮き上がる。さらに、カバースリップ１１５は、必ずしも完全に平坦であるとは限らず、しばしば起伏、丘及び谷を呈する。これによって、接着剤の厚みが不均一になり、その結果、ガラス基板１１０からの、そして対物レンズからのセルの距離を変化させ、時には被写界深度よりも距離が大きくなってしまうことがある。本明細書に開示されるのは、所与の視野において、対物レンズの被写界深度よりも厚みのある検体をデジタル化するという問題を解決する、細胞診スライドを効率的に走査するためのデジタル撮像方法及びシステムである。

細胞診スライドは、媒質に細胞が浮遊したり、細胞が積み重なったりする可能性があり、本来は３次元的なものである。顕微鏡の対物レンズは被写界深度（ＤＯＦ）が非常に小さいため、１枚の画像ですべての細胞に焦点を合わせて撮像することはできない。実際、個々の細胞は単一のＤＯＦよりも厚みがある可能性がある。ＮＡ（開口数）が０．７５の４０倍顕微鏡の対物レンズは被写界深度が２ミクロン（μｍ）未満である。柔軟性のあるフィルム（プラスチック）カバースリップを使用した細胞診スライドは、細胞スポット領域全体が湾曲しているため、さらに深い走査（つまり、画像取得）深度が必要になり得る。細胞診スライド（ＴｈｉｎＰｒｅｐスライドなど）上のすべての細胞を高画質で撮像するためには、より広い範囲の焦点が必要となる。

一例として、２３枚のＴｈｉｎＰｒｅｐパップスライドをデジタルカメラ（Ｈｏｌｏｇｉｃ社のＴｈｉｎＰｒｅｐインテグレートイメージャ）を有するコンピュータ制御顕微鏡で走査し、細胞調製深度データを収集した。まず、細胞スポット領域を、コンピュータ駆動のＸＹステージを用いて走査した。各位置において、Ｚ高さの広い範囲（４０ミクロン（μｍ）超）で画像のスタックを撮影した。すべての画像を小さな領域（３５ミクロン（μｍ）四方）に分割し、ＺスタックのすべてのレベルについてＢｒｅｎｎｅｒ焦点スコア基準で評価した。そのタイルに最適な焦点を決定した。スライド上に印刷された基準マークに焦点を合わせることによって、スライドガラス平面全体を決定し、焦点データから差し引いて、細胞内容の相対的な高さを決定した。

図３の表は、これら２３枚のスライドから得られたデータの概要を示す。この表から、ＴｈｉｎＰｒｅｐスライドの平均細胞深度は、ガラスカバースリップ付きスライドで１１．０９ミクロン（μｍ）、フィルムカバースリップ付きスライドで２３．６ミクロン（μｍ）であることがわかる。場合によっては、細胞の深度が４０ミクロン（μｍ）を超える可能性がある。ガラスカバースリップを使用しても、スライド内の細胞の高さの局所的な変動は、顕微鏡の対物レンズの被写界深度の７倍にもなることに留意されたい。各スライドの表面プロットフォーカスマップを作成し、精査した。図４Ａ及び４Ｂは、フィルムカバースリップスライドの一例を示し、細胞スポット領域の範囲にわたる湾曲の影響を示す。特に、図４Ａ及び４Ｂに示される例では、検体の中央部の細胞はスライドガラスに近く、一方、検体の縁部の周りの細胞はカバースリップに近い。

図５に示されるように、撮像中、検体領域１１４全体（又は、例えば、実検体１１９が検体領域１１４とは異なる領域をカバーし、実検体１１９の境界が予め決定されている場合、実検体１１９全体の所定の領域）にわたってカメラの視野を走査するため、スライド１０２はＸＹスライドステージによって移動する。ＸＹスライドステージは、スライド１０２を蛇行経路で往復移動させ、各経路上の検体１１９のスワス（swath）、列、又は直線部分の微小画像を撮像する。スワスを撮影するには、ＸＹスライドステージがスライド１０２を連続的に移動させ、ステージのエンコーダ位置に従って各トリガポイントに到達した時点でＸＹスライドステージがカメラをトリガして画像を撮像する。スライドとカメラとの間の相対的な動きが連続するように、非常に高速なカメラが使用される。このように高速で、スライドの直線部分に沿って画像を取得することは列の「走査」と呼ばれてもよい。このとき、検体１１９全体を走査するのに必要な時間を最小限にするために、連続する各スワスの開始点が前のスワスの終了点に接近しているような蛇行した経路が使用される。スライド１０２をスワスに沿って移動させると、カメラは検体１１９の微小画像を撮影する。すなわち、撮像装置は、図５に示すような走査パターンに従って、検体領域全体をカバーする複数の画像を撮像する。走査パターンは、図５の横向き矢印１３０で表される複数の直線部分を含む。この検体は、複数の焦点ゾーンに分割され、図５の正方形１３２で表される。このように、画像が取得される各直線部分１３０は、複数の焦点ゾーン１３２を含む。各直線部分１３０は、３０～７０の焦点ゾーンを含み得る。別の例では、スライド１０２が移動するのではなく、スライド１０２は静止したままカメラが走査パターンに沿って移動する。スライド１０２が移動する場合も、カメラが移動する場合も、スライド１０２はカメラに対して移動する。

現在のほとんどのＷＳＩシステムは、一度に単一の焦点面を走査する。一般的なスキャナは、１５×１５ｍｍの走査を１分で完了する。この速度で円形のＴｈｉｎＰｒｅｐ細胞スポット領域を１４個の焦点面の深度まで走査するには、少なくとも２６分かかるであろう。スライドデジタイザのスループットを劇的に向上させるために、一部のシステムは対物レンズとスライドガラスとの間に傾斜角があるように設計されている。この方法では、被写界深度を利用して、少しずつ異なる深度の異なるレイヤーを同時にデジタル化することができる。このとき、最も焦点の合ったレイヤー（又はレイヤーの一部）を選び、その焦点の合った領域をつなぎ合わせるフォーカスマージと呼ばれる操作を行うことで、レイヤーを焦点が合った１つの複合レイヤーにすることができる。この方法では、スライドは、焦点を合わせるために停止することなく、対物レンズの下で連続的に移動することが可能になる。様々なレイヤーをデジタル化してマージし、基本的に取得後の焦点合わせを行うシステムを構築できる。このようなシステムの唯一の制限は対物レンズの被写界深度であり、これは撮像可能な検体の最大厚さと解釈される。このようなシステムの明確な利点は、停止と焦点合わせが不要であることである。

傾斜面体積走査法を用いることで、細胞内容領域全体を走査するための取得時間が大幅に短縮される。ＴｈｉｎＰｒｅｐパップのスライドは約２．５分で完了できる。図６に示されるように、撮像光学系及びカメラ２０２は、スライド１０２に対して傾斜している。カメラフレームの一方の端にある画像の領域では、カメラフレームの他方の端にある領域よりもスライドガラスに近い画像が取得される。１つの例では、４８ミリラジアンの傾斜角と０．５ｍｍのスライドの画像フレーム幅は、０．５×ｓｉｎ（０．０４８）、つまり２４ミクロン（μｍ）の走査深度を提供する。

図６に最もよく示されるように、対物レンズの光軸２０４は、スライド１０２の平面の走査方向の垂線に対して傾斜角２０６で傾斜している（図５参照）。つまり、その結果、スライドの面におけるカメラ及び光学系の光軸２０４は、スライド１０２の平面に対して非直交となる。国際公開第２０２０／０９１９６５（Ａ２）号パンフレットでより詳細に説明されているように、傾斜角２０６によって、撮像装置がスライド１０２上の検体１１９の体積画像（すなわち、検体１１９の深度まで広がる画像）を取得することが可能になる。つまり、微小画像は、検体１１９の直交角度で撮像された画像の場合の単一の焦点面のみではなく、スライド１０２上の検体１１９の異なる深度における特徴の合焦画像を含む。各微小画像がスライド１０２の面の下にあるスライド１０２深度の少なくとも一部を含む微小画像を取得するように撮像ステーションが構成されてもよい。スライド１０２上にカバースリップ１１５が使用される場合、撮像ステーションは、各微小画像がカバースリップ１１５の深度の少なくとも一部を含む微小画像を取得するように構成され得る。

カメラが連続的に移動する際、カメラが自身の幅の１／１４を移動するたびに新しい画像を取得するようにトリガされる。非常に高速（＞１００ｆｐｓ）のカメラが使用される。図７に示されように、且つ、国際公開第２０２０／０９１９６５号パンフレットでより詳細に説明されるように、これらの重なり合う画像をスライスして再構成し１４個の焦点面画像を得ることができる。記憶空間を最適化するために、様々な平面から合焦画素を選択することによって、焦点面は単一の拡張被写界深度画像に合成される。画像処理は、ＧＰＵハードウェアアクセラレーションを使用して実時間で行われる。

カバースリップは完全に平坦ではないが、平坦度の変化は本質的に緩やかである。これは、カバースリップがスライドの中心に隆起を形成する、又は、スライド面を横切る複数の波から隆起を形成する可能性があるが、カバースリップとその下のガラスとの間の距離に急激な変化がないことを意味する。例えば、完全に平坦なカバースリップ１１５を図８Ａに示し、波状又はでこぼこした面を有するカバースリップを図８Ｂ及び８Ｃに示す。

この間隙が緩やかに変化することで、撮影後に焦点を合わせる撮像システムは、光学系のみで得られる被写界深度よりもはるかに大きな有効被写界深度を得ることができる。基本的には、各経路の終わりに（次の列又はスワスを調べるために走査方向を反転する前に）通常はラスター往復パターンを使用して（図５に示すように）スライドが走査されると、収集したレイヤーが分析され、フォーカスマージ操作中に最適な焦点が決定される。生体検体がカバースリップのうねりに追従して上昇するとき、前のスワスで最も焦点が合った層から、次にスキャンするスワスの最適な焦点パターンを予測することができる。フォーカスマージ中に個々の対象物体が見つかり、その深度が記録される。次に、各列は次の行の最適な焦点を予測するのに使用される。

スワスの端で焦点外領域が検出されると、その焦点外領域に焦点が合った別の高さでスワスを再走査することができる。結果として得られる焦点の高さは、次のスワスを通知するために使用され、その結果、スワスの再走査が必要な回数が最小限に抑えられる。

このようなシステムの利点は、停止して焦点を合わせる必要がなく、また焦点外領域に戻って再走査する必要もあまりないため、より高いスループット（短い走査時間）を達成できることである。代わりに、このシステムは検体全体をデジタル化（フォーカスマージ）するまで単純に往復走査を行う。トラバース中は、前のスワスから与えられたフォーカスマップに従って対物レンズを上下に駆動させ、スライドガラス面からの距離が変わっても物体全てに焦点が合うように、物体を被写界深度内に維持するように設計されている。

フィルムカバースリップ付きのスライドに見られるようなより大きな全細胞深度範囲を扱うために、図８Ａ～８Ｃに示されるように、撮像光学系をＺ軸方向に駆動して湾曲に追従させることができる。細胞経路８０２は起伏があり、全体的に傾いている。上記のように傾いたカメラを用いた体積スキャンは、単一の焦点深度で行われる走査よりも厚みのある走査領域８０４を提供するが、細胞経路８０２の底部８０６及び上部８０８の合焦画像を提供することができない。Ｚ曲線追従体積走査８１０は、検体の細胞経路８０２全体を撮像する。カメラの視野サイズ内の局所的な細胞深度は傾斜面の走査深度内に収まるが、より長い距離ではより大きな焦点深度の変動が必要になり得る。

曲線追従走査方式により、局所的な焦点誤差を最小限に抑え、より高品質なＷＳＩ画像が提供される。図９Ａ及び９Ｂの画像の作成に使用したスライドは、４０ミクロン（μｍ）を超えるＺ焦点深度を有する。Ｚ曲線を追従しない体積走査Ｚを図９Ａに示す。Ｚ曲線追従体積走査を図９Ｂに示す。図９Ｂの画像は、図９Ａの画像よりも鮮明で焦点が合っている。

次に、図１０を参照して、スライドの面に貼り付けられた検体内に分布する物体の画像を取得するための方法５００について説明する。特に、スライドの面に対して不均一な高さで、光学系の被写界深度を超える厚さの検体について、Ｚ曲線追従体積走査で画像を取得する。方法５００の第１ステップ５０２では、検体スライド上の離散的な位置をサンプリングして、初期焦点高さ（Ｚ）を決定する。次に、ステップ５０４では、第１の直線部分の各焦点ゾーンについて、ステップ５０２で決定された初期焦点高さを用いて、検体の第１の直線部分に沿っていくつかの画像を取得する。初期焦点高さは第１の直線部分に沿って一定のままであり、これは、ステップ５０４における検体の第１の直線部分における画像の取得中にスライド面に対する対物レンズの高さがほぼ一定であることを意味する。検体の各列（直線部分）は、複数の焦点ゾーンを含む。

例えば、図５を参照すると、直線部分に沿った各正方形を焦点ゾーンとしてもよい。撮像装置によって走査される各直線部分は、例えば、３０～７０個の焦点ゾーンを含み得る。あるいは、ステップ５０４のようにほぼ一定の焦点高さを用いるのではなく、ステップ５０２でサンプリングされた離散的な位置を使用して、第１の直線部分のｚ曲線を決定することができ、第１の直線部分に沿った画像はそのｚ曲線に追従することによって取得され得る。このように、対物レンズは、第１の直線部分に沿った画像の取得時にｚ曲線に従い、スライドに対してｚ軸に沿って上下に移動する。

次に、ステップ５０６において、走査したばかりの直線部分における各焦点ゾーンに対して、画像に撮像された物体に焦点が合っているかを評価することにより、最適な焦点が決定される。この評価には、焦点外物体が、対物レンズの合焦範囲外のスライド面に対する高さで検体内にあるかの決定が含まれる。評価はまた、検体の直線部分に沿った焦点外物体の相対位置に基づいて焦点外物体を識別することを含み得る。すなわち、直線部分に沿った各焦点ゾーンについて画像が評価され、どの焦点面が最も焦点が合っているかが決定される。図７に示されるように、傾斜角画像を取得することで、一度に１２個の焦点面で画像が撮像される。例えば、最適な焦点が最上部又は最下部の焦点面（焦点面１又は１２）にあることが判明した場合、より良好な焦点を有する画像を得るために、スライドに対する対物レンズのｚ軸位置をそれぞれ上下に移動させる必要があるかもしれない。さらに、最適な焦点が最上部又は最下部の焦点面にあることが判明した場合、検体の次の隣接する直線部分における画像取得中に、スライドに対する対物レンズのｚ軸位置をそれぞれ上下に移動させる必要があるかもしれない。

あまりにも多くの物体が焦点外の場合（すなわち、焦点外物体の数が予め定められた閾値数を超えている）、焦点外物体の各々の焦点高さ（Ｚ）が調整され、ステップ５０８で新しい焦点高さ曲線に従って直線部分が再走査される。カメラが焦点高さ曲線に追従する場合、スライド面に対する対物レンズのｚ軸位置は、検体の直線部分に沿ったカメラの相対位置の関数として、スライド面に対するカメラの高さを増加及び／又は減少させることによって変化する。スライドに対する対物レンズのｚ軸位置は、検体の直線部分に沿って１つの焦点ゾーンから次の焦点ゾーンで変化し得る。一実施形態では、スライド１１０は、対物レンズのｚ軸位置を静止させたまま上下に移動する。代替の実施形態では、対物レンズは、スライドのｚ軸位置が一定のまま、上下に移動する。

焦点ゾーンのほとんど又は全てに焦点が合っている場合、ステップ５１０で、現在の列の各焦点ゾーンの最適な焦点に基づいて、各焦点ゾーンの次の値を算出する。次の列の焦点ゾーンのいくつかは上に移動して、（すなわち、ｚ位置がカバースリップに近く、スライドガラスから遠くなるように）カバースリップに近い目的の物体を追跡してもよく、一方、次の列の焦点ゾーンのうちのいくつかは下に移動して、スライドガラスに近い目的の物体を追跡してもよい。次に、ステップ５１２で、ステップ５１０で算出した焦点曲線を用いて、次の直線部分を走査する。ステップ５０６～５１２は、検体全体の画像が取得されるまで、検体内の直線部分毎に繰り返される。すなわち、検体の直線部分毎に画像が取得された後、それらの画像内の物体の焦点が評価される（ステップ５０６）。評価に基づいて、検体の次の直線部分の焦点曲線が決定され（ステップ５１０）、走査されたばかりの直線部分に直接隣接する次の直線部分の物体の画像を取得するために使用される（ステップ５１２）。あるいは、焦点評価により焦点外物体が多すぎることが判明した場合には、焦点曲線を調整し、調整された焦点曲線を用いて同じ直線部分を再度走査する（ステップ５０８）。

特定の実施形態が示され、説明されてきたが、上記の説明はこれらの実施形態の範囲を限定することを意図するものではなく、そのような開示は、説明及び例示の目的のみのために提供されることが理解されたい。したがって、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に様々な変更及び修正が行われ得る。

Claims (35)

1. スライドの面に貼り付けられた検体内に分布する物体の画像を、前記スライドの前記面と非直交角をなす光軸を有する対物レンズを有するカメラを使用して取得する方法であって、前記検体は前記スライド面に対して不均一な高さを有し、
   前記検体の第１の直線部分の第１の複数の画像を取得することと、
   前記第１の複数の画像に撮像された前記検体の前記直線部分内の物体の焦点を評価することと、
   前記第１の直線部分又は前記第１の直線部分とは異なる前記検体の第２の直線部分の第２の複数の画像を取得することと、を含み、前記第２の複数の画像の取得中に、前記第１の複数の画像に撮像された前記物体の前記評価された焦点に基づいて、前記スライド面に対する前記対物レンズの高さを変化させる、方法。
2. 前記第１の複数の画像の取得中に、前記スライド面に対する前記対物レンズの高さがほぼ一定である、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の複数の画像に撮像された前記物体の焦点を評価することは、焦点外物体の総数が閾値数を超えるかを決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記第１の複数の画像に撮像された前記物体の焦点を評価することは、前記スライド面に対する前記焦点外物体の各々の高さを決定することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１の複数の画像における前記物体の焦点を評価することは、前記第１の複数の画像における取得中に、前記各々の焦点外物体が前記対物レンズの合焦範囲外である前記スライド面に対する高さに位置するかを決定することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記第１の複数の画像における前記物体の焦点を評価することは、前記第１の複数の画像における取得中に、前記各々の焦点外物体が、前記対物レンズの合焦範囲の最大高さよりも高い又は最小高さよりも低い前記スライド面に対する高さに位置するかを決定することを含む、請求項４又は５に記載の方法。
7. 前記第１の複数の画像における前記物体の焦点を評価することは、前記第１の直線部分内の焦点外物体の各々の位置を決定することを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記画像取得中に、前記カメラ及び前記スライドの一方又は両方が、他方に対して側面方向に移動する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記スライド面に対する前記対物レンズの高さは、前記直線部分の各々の長さ方向の位置に対する前記カメラの直線位置の関数として、前記カメラに対する前記スライド面の高さを増加及び／又は減少させることによって変化する、請求項８に記載の方法。
10. 前記スライド面に対する前記対物レンズの高さは、前記第１又は第２の直線部分の各々の長さ方向の位置に対する前記カメラの直線位置の関数として、前記スライド面に対する前記カメラの高さを増加及び／又は減少させることによって変化する、請求項８に記載の方法。
11. 前記第２の直線部分から前記第２の複数の画像が取得される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１の直線部分から前記第２の複数の画像が取得され、前記方法は、
    前記第２の複数の画像に撮像された前記物体の焦点を評価することと、
    前記第２の直線部分から第３の複数の画像を取得することと、を更に含み、
    前記第３の複数画像の取得中に、前記第２の複数の画像に撮影された前記物体の前記評価された焦点に基づいて、前記スライド面に対する前記対物レンズの高さを変化させる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第２の直線部分が前記第１の直線部分に直接隣接している、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第１の複数の画像における焦点外物体の総数が前記閾値数を超える場合、前記第１の直線部分から前記第２の複数の画像を取得することと、
    前記第１の複数の画像における焦点外物体の総数が前記閾値数を超えない場合、前記第２の直線部分から前記第２の複数の画像を取得することとを更に含む、請求項３に記載の方法。
15. スライドの面に貼り付けられた検体内に分布する物体の画像を、前記スライドの前記面と非直交角をなす光軸を有する対物レンズを有するカメラを使用して取得する方法であって、前記検体は前記スライド面に対して不均一な高さを有し、前記方法は、
    （ａ）前記検体の直線部分の第１の複数の画像を取得することと、
    （ｂ）前記第１の複数の画像に撮像された前記物体の焦点を評価することと、
    （ｃ）前記検体の同一又は異なる直線部分の第２の複数の画像を取得することと、前記第２の複数の画像の取得中に、前記第１の複数の画像に撮像された前記物体の前記評価された焦点に基づいて、前記スライド面に対する前記対物レンズの高さを変化させ、及び
    （ｄ）（ａ）～（ｃ）を検体のほぼ全体の画像が取得されるまで繰り返すこととを含む、方法。
16. 前記第１の複数の画像における前記物体の前記焦点を評価することは、焦点外物体の総数が閾値数を超えるかを決定することを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第１の複数の画像における前記物体の前記焦点を評価することは、前記第１の複数の画像における取得中に、前記各々の焦点外物体が、前記対物レンズの合焦範囲の最大高さよりも高い又は最小高さよりも低い前記スライド面に対する高さに位置するかを決定することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記第１の複数の画像における前記物体の前記焦点を評価することは、前記各々の直線部分内の焦点外物体の各々の位置を決定することを含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記第１及び第２の複数の画像の各々の取得中に、前記カメラ及びスライドの一方が、他方に対して側面方向に移動する、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記スライド面に対する前記対物レンズの高さは、前記各々の直線部分の長さ方向の位置に対する前記カメラの直線位置の関数として、前記カメラに対する前記スライド面の高さを増加及び／又は減少させることによって変化する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記スライド面に対する前記対物レンズの高さは、前記各々の直線部の長さ方向の位置に対する前記カメラの直線位置の関数として、前記スライド面に対する前記カメラの高さを増加及び／又は減少させることによって変化する、請求項１９に記載の方法。
22. 前記第２の複数の画像は前記異なる直線部分から取得され、前記異なる直線部分は前記第１の複数の画像が取得された前記直線部分に直接隣接している、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. スライドの面に貼り付けられた検体内に分布する物体の画像を取得するためのシステムであって、前記検体は前記スライド面に対して不均一な高さを有し、前記システムは、
    光軸を有する対物レンズを有するカメラであって、前記光軸が前記スライドの前記面と非直交角をなすように位置決めされた前記カメラと、
    前記カメラと動作可能に接続された画像処理部とを備え、前記画像処理部は、
    前記カメラによって取得された前記検体の第１の直線部分の第１の複数の画像を受信し、
    前記第１の複数の画像に撮像された前記検体の前記直線部分内の物体の焦点を評価し、そして、
    前記カメラに、前記第１の直線部分又は前記第１の直線部分とは異なる前記検体の第２の直線部分の第２の複数の画像を取得させ、前記第２の複数の画像の取得中に、前記第１の複数の画像に撮像された前記物体の前記評価された焦点に基づいて、前記スライド面に対する前記対物レンズの高さを変化させる、システム。
24. 前記第１の複数の画像の取得中に、前記スライド面に対する前記対物レンズの高さはほぼ一定である、請求項２３に記載のシステム。
25. 前記画像処理部は、焦点外物体の総数が閾値数を超えるかを少なくとも部分的に決定することによって、前記第１の複数の画像に撮像された前記物体の前記焦点を評価する、請求項２３又は２４に記載のシステム。
26. 前記画像処理部は、前記スライド面に対する前記焦点外物体の各々の高さを少なくとも部分的に決定することによって、前記第１の複数の画像に撮像された前記物体の前記焦点を評価する、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のシステム。
27. 前記第１の複数の画像における取得中に、前記画像処理部は、前記各々の焦点外物体が前記対物レンズの合焦範囲外にある前記スライド面に対する高さに位置するかを少なくとも部分的に決定することによって、前記第１の複数の画像における前記物体の前記焦点を評価する、請求項２６に記載のシステム。
28. 前記第１の複数の画像における取得中に、前記画像処理部は、前記各々の焦点外物体が、前記対物レンズの合焦範囲の最大高さよりも高いか最小高さよりも低い前記スライド面に対する高さに位置するかを少なくとも部分的に決定することによって、前記第１の複数の画像における前記物体の前記焦点を評価する、請求項２７又は２８に記載のシステム。
29. 前記画像処理部は、前記第１の直線部分内の焦点外物体の各々の位置を少なくとも部分的に決定することによって、前記第１の複数の画像における前記物体の前記焦点を評価する、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のシステム。
30. 前記画像取得中に、前記カメラ及び前記スライドの一方又は両方が、他方に対して側面方向に移動する、請求項２３から２９のいずれか一項に記載のシステム。
31. 前記スライド面に対する前記対物レンズの高さは、前記直線部分の各々の長さ方向の位置に対する前記カメラの直線位置の関数として、前記カメラに対する前記スライド面の高さを増加及び／又は減少させることによって変化する、請求項３０に記載のシステム。
32. 前記スライド面に対する前記対物レンズの高さは、前記第１又は第２の直線部分の長さ方向の位置に対する前記カメラの直線位置の関数として、前記スライド面に対する前記カメラの高さを増加及び／又は減少させることによって変化する、請求項３０に記載のシステム。
33. 前記第２の直線部分から前記第２の複数の画像が取得されることを特徴とする、請求項２３から３２のいずれか一項に記載のシステム。
34. 前記第１の直線部分から前記第２の複数の画像が取得され、前記画像処理部は、
    前記第２の複数の画像に撮像された前記物体の焦点を評価し、そして、
    前記カメラに、前記第２の直線部分の第３の複数の画像を取得させるように構成され、前記第３の複数の画像の取得中に、前記第２の複数の画像に撮像された前記物体の前記評価された焦点に基づいて、前記スライド面に対する前記対物レンズの高さが変化する、請求項２３～３２のいずれか一項に記載のシステム。
35. 前記第２の直線部分が前記第１の直線部分に直接隣接している、請求項２３～３４のいずれか一項に記載のシステム。

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