JP2023502664A - 分子プロファイリングのためのマルチフォーカルイメージングのためのシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、一般的に、例えば、細胞または他のサンプルにおいて核酸を特定するように、マルチフォーカルイメージングのためのシステム及び方法に関する。ある場合において、複数の焦点面は、例えば、同じサンプルを撮像するが、少なくとも一部がサンプルにおける異なる焦点面に集光されている複数のカメラ等の複数の検出器を用いて、同時に特定されてもよい。したがって、サンプルは、例えば、サンプル再フォーカス無しで３次元において撮像されてもよい。特定の場合において、これは、空間及び／または時間においてイメージングの解像度を向上できる。様々な実施の形態は、例えば、マルチエラーロバスト蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＭＥＲＦＩＳＨ）等の単一細胞分子プロファイリングまたは他の用途等のイメージに基づく手法において、イメージングスループット及び／または解像度を向上させるために使用されてもよい。

Description

（関連出願）
本出願は、モフィット等による、「分子プロファイリングのためのマルチフォーカルイメージングのためのシステム及び方法」と題された、２０１９年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９３８，１９４号の利益を主張し、参照によって、本明細書にその出願の全体が含まれる。

本開示は、一般的に、マルチフォーカルイメージングのためのシステム及び方法に関する。

超マルチｉｎ ｓｉｔｕイメージング（massively multiplexed in situ imaging）による単一の細胞及び他の生物学的サンプルの深層（deep）分子プロファイリングの方法は、幅広い生物学的問題に対処するために有力な方法として出現している。これらの手法において、多数の別個の分子ターゲットの２次元分布は、マルチワイドフィールドイメージングモダリティ（multiplexed wide-field imaging modalities）を通じて、生物学的サンプル内において特定され、このような測定は、複数の別個の焦点面、即ち、ｚ－スタックの集合のイメージングによってサンプルの３次元分布を特定するように拡張される。しかしながら、スループット、単位時間ごとに特徴付けられるサンプルの量または細胞の数は、サンプルを撮像できる速度及びサンプルに再フォーカスできる速度によって制限される。同様に、これらのサンプルにおける別個の分子種類の解像度は、軸方向の軸に沿った光学点拡がり関数の実質的に大きい程度によって制限される場合がある。したがって、このようなサンプルのスループットを増加するように単位時間ごとに取得される画像を増やし、及び／またはｚ軸に沿って向上した光学的解像度を提供できる改善したイメージングモダリティが求められている。

本開示は、一般的に、マルチフォーカルイメージングのためのシステム及び方法に関する。本開示の対象は、ある場合において、特定の問題に対する相互に関連する製品、代替的な解決策、及び／または１つまたは複数のシステム及び／または物品の複数の異なる用途に関する。

実施の形態の１つのセットは、一般的に、複数の核酸プローブにサンプルを露出することと、それぞれの核酸プローブにおいて、サンプルにおける異なる焦点面に集光される少なくとも４つの検出器を使用してサンプルの画像を撮影することと、画像を使用してサンプル内における核酸プローブのバインディングを特定することと、複数の核酸プローブのバインディングに対応するサンプル内の核酸の量及び／または空間的分布を特定することと、を含む方法に向けられている。

実施の形態の他のセットは、一般的に、複数の核酸プローブにサンプルを露出することと、それぞれの核酸プローブにおいて、そこに結合するように増幅核酸に核酸プローブを露出させることと、それぞれの核酸プローブにおいて、サンプルにおける異なる焦点面に集光される少なくとも４つのカメラを使用してサンプルの画像を撮影することと、を含む方法に向けられている。ここで、核酸プローブに直接的にまたは間接的に結合できる増幅核酸プローブの最大数は、有限である。

実施の形態のさらに他のセットにおいて、方法は、ＭＥＲＦＩＳＨを用いてサンプルを分析することを有し、分析の動作は、複数のカメラを用いて画像を撮影することを有する。方法は、さらに他の態様において、複数のカメラを用いて、サンプル内の核酸の量及び／または空間的分布を特定することを有する。さらに他の態様において、方法は、単一細胞等のサンプルにおいて、数百から数千個のＲＮＡ及び／またはＤＮＡ等の核酸種類のコピー数及び／または空間的分布を、選択的に同時に、特定することを有する。

他の態様において、本開示は、本明細書にて説明される、例えば、マルチフォーカルイメージングの装置等、１つまたは複数の実施の形態を製造する方法を包含する。さらに他の態様において、本開示は、本明細書にて説明される、例えば、マルチフォーカルイメージングの装置等、１つまたは複数の実施の形態を使用する方法を包含する。

本開示の他の利点及び新規な特徴は、添付の図面とともに考慮されると、本開示の非限定的な様々な実施の形態の後続の詳細な説明から明らかになる。

本開示の非限定的な実施の形態は、添付の図面を参照することによって、例示によって説明される。図面は模式的なものであり、縮尺が正確であることは意図されていない。図面において、それぞれの同一または略同一の部品は、通常単一の符号によって示されて図示される。明確性のため、全ての図面において全ての部品に符号は付されていない。また、当業者が本開示を理解するために図示が不要である場合、本開示のそれぞれの実施の形態の全ての部品が図示されていない。

本開示の一の実施の形態による装置の模式図である。 本開示の他の実施の形態による装置の模式図である。 シグナルを増幅させるプライマリ及びセカンダリ増幅核酸を使用する実施の形態の模式図である。 シグナルを増幅させるプライマリ及びセカンダリ増幅核酸を使用する実施の形態の模式図である。 シグナルを増幅させるプライマリ及びセカンダリ増幅核酸を使用する実施の形態の模式図である。 シグナルを増幅させるプライマリ及びセカンダリ増幅核酸を使用する実施の形態の模式図である。 シグナルを増幅させるプライマリ及びセカンダリ増幅核酸を使用する実施の形態の模式図である。 本開示の他の実施の形態による装置の模式図である。

本開示は、一般的に、例えば、細胞または他のサンプルにおいて核酸を特定するためのマルチフォーカルイメージングのためのシステム及び方法に関する。ある場合において、複数の焦点面は、例えば、同じサンプルを撮像するが、少なくとも一部はサンプル内において異なる焦点面に集光される複数のカメラ等の複数の検出器を用いて、同時に特定されてもよい。したがって、サンプルは、例えば、サンプル再フォーカス無しで３次元において撮像されてもよい。特定の場合において、これは空間及び／または時間においてイメージングの解像度を向上できる。様々な実施の形態は、例えば、マルチプレックスエラーロバストｉｎ ｓｉｔｕ（multiplexed error robust in situ）ハイブリダイゼーション等の単一細胞分子プロファイリングまたは他の用途のために、画像に基づく手法におけるイメージングのスループット及び／または解像度を向上させるように使用されてもよい。

例えば、特定の態様は、サンプル再フォーカスを要せずにｚ－スタックの全体の集合及び完全な体積イメージングを可能にするように、及び／または軸方向に沿った分子ターゲットの位置を分解する能力を向上させるように、同じサンプルを同時に撮像するカメラのバンクを用いるシステムに関する。これらは、単一細胞分子プロファイリング等または他の用途の画像に基づく手法においてにおいて、イメージングスループット及び／または解像度を向上できる。

多くの生物学的問題は、固有の生物学的環境において、単一細胞の内部のゲノム－スケール分子プロファイルの測定を要する。この要求を満たすために、超マルチ分子イメージング技術における最近の開発で、単一細胞の分子性質のゲノム－スケールプロファイリングを実現できるものがある。このような技術は、ゲノム遺伝子座、ｍＲＮＡ、及び／またはタンパク質を含むがこれに限定されない、細胞内における複数の別個のタイプの分子をターゲットするように使用されてもよい。

分子特定性は、対象の分子に結合するプローブを用いて実現できる。例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、シーケンスを用いて異なる核酸種類を選択的にラベルする（label）ように使用されてもよい。シーケンスは、部分的に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等の技術を用いて、対応するターゲットのシーケンスに対して相補的である。同様に、核酸アプタマーまたは抗体は、異なるタンパク質、または免疫蛍光若しくは免疫組織化学等の技術を用いて選択的な翻訳後の変更を経験しているタンパク質を、選択的に名付けるように使用されてもよい。これらのプローブの結合は、蛍光物質等の光学的に検出可能な部分によって名付けて、複数の蛍光顕微鏡方法によってサンプルを撮像することによって特定されてもよい。別個の分子は、光学的に区別可能な蛍光物質を用いて同じサンプル内において同時に特定できる。代わって、個別の分子種類の数は、サンプルを繰り返し染色して撮像する方法を通じて区別可能な蛍光物質の数を大きく超えることができる。ある場合において、同じサンプルの繰り返しの染色及び撮像のプロセスは、多数の分子ターゲットの識別を可能にする組み合わせバーコードを構成するように使用されてもよい。

例えば、ＭＥＲＦＩＳＨは、単分子ＦＩＳＨの超マルチ（massively multiplexed）な形態である。ＭＥＲＦＩＳＨの１つの実施の形態において、個別のバイナリバーコードは、ターゲットとされた核酸種類のそれぞれに割当されてもよい。これらのバーコードは、それぞれの核酸種類をターゲットとして、これらの分子に対応するバーコードを割り当てるエンコーディングプローブに翻訳される。この方法の１つの実施例において、固有のオリゴヌクレオチドシーケンス、リードアウトシーケンスは、バイナリバーコードにおいて各ビットのために設計される。それぞれのターゲットとされる核酸のための特定のバーコードは、対応する核酸ターゲットをターゲットとするエンコーディングプローブ上に存在するリードアウトシーケンスの組み合わせを特定する。特に、バーコードがあるビットにおいて「１」を有すると、対応するエンコーディングプローブは、そのリードアウトシーケンスを有する。一方で、そのビットにおいて「０」を有すると、そのプローブはそのリードアウトシーケンスを有しない。これらのプローブは、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法を用いて、生物学的サンプルに交雑（hybridize）されている。どの分子ターゲットが特定のリードアウトシーケンスを有するプローブによってラベルされているのかを特定するように、サンプルは、そのリードアウトシーケンスに相補的であって蛍光的にラベルされたリードアウトプローブと交雑されてもよい。サンプルは撮像され、測定された蛍光の分布は、ターゲットとされたリードアウトシーケンスに対応するビットにおいて「１」を有するバーコードを有する分子の位置を特定するように使用されてもよい。蛍光シグナルは、サンプルから除去されてもよく、サンプルは、そのビットにおいて「１」を有する分子ターゲットを特定するように異なるリードアウトシーケンスに相補的であって、異なる蛍光的にラベルされたリードアウトプローブによって染色されてもよい。サンプルは撮像され、蛍光シグナルは除去され、このプロセスは、バーコードにおける全てのビットが測定されるまで繰り返される。複数の区別可能な蛍光物質が異なるリードアウトプローブに関連していると、複数のリードアウトプローブは、同時に染色されてもよく、多色蛍光イメージングは、同時に複数のビットの値をプローブするように使用されてもよい。

本明細書にて、より一般的なバーコード手法を採用する類似の手法も考慮されていると理解されよう。例えば、あるバーコード手法は、トリットまたはより大きいバーコードアルファベットに関連してもよい。ある場合において、リードアウトシーケンスの一部または全部は、例えば、特定のビットにおいて「１」の値に関連する１つの固有のリードアウトシーケンスと、そのビットにおいて「０」の値に関連する他の固有のリードアウトシーケンス等と、アルファベットの全ての取り得る値に割り当てられてもよい。さらに他の例示として、シグナルの不在は、特定のバーコード入力において、１つの値に関連してもよい。

このような測定はリードアウトエラーを招く恐れがあり、特定のビットの値が適切に測定されない。このような測定エラーは、マルチプレックス測定において問題を起こし、エラーは１つのバーコードを他のバーコードに変換し、及び／または分子ターゲットの誤った識別をもたらす。様々な機構は、核酸プローブの一部の結合の欠落または間違った分子ターゲットへのプローブの誤った結合等のリードアウトエラーをもたらす恐れがある。このようなエラーを克服するため、ＭＥＲＦＩＳＨは、不正確に測定されたビットまたは他の要素を検出及び／または修正することができるバイナリまたは他のバーコード仕組み（scheme）を使用してもよい。ハミング符号、一定重みハミング符号、ゴレイ符号、ターボ符号、リード・ソロモン符号、リード・ソロモン削除符号等を含む幅広いエラーに対してロバスト性を有し、修正するエンコーディング仕組みは、この手法において使用されてもよい。加えて、バイナリバーコードを使用しないエンコーディング仕組みは、かかわらず、バイナリバーコードとして表示されてもよい。したがって、バイナリバーコードを仮定しても、一般性が喪失されない。これらのバーコードのエラー検出と修正能力は、例えば、１つのバーコードを他のバーコードに変更するために変更されていなければならないビットの数、１つの有効なバーコードを他のバーコードから分離するハミング距離等によって生じる。ハミングコード等のバーコード仕組みは、全ての有効なバーコードが最小ハミング距離によって分離されているように設計される。しかしながら、他のバーコード仕組みは、可能な全てのバーコードの充分小さいサブセットをランダムに選択することによって生成されてもよく、生成されたバーコードの多くは、最小の希望されたハミング距離によって分離され、よって、望ましいエラー検出及び修正性質を有する。ある最小ハミング距離によって分離されるバーコードを使用するいずれかのコーディング仕組みは、ある程度のエラー検出及び／または修正を提供するようにこのような用途において使用されてもよい。当業者によって理解されるように、同一の長さを有する２つのバーコードの間の「ハミング距離」は、対応するシンボルが異なる位置の数である。言い換えれば、ハミング距離は、１つのバーコードを他のバーコードに変更するために必要な最小数の代替、または１つのバーコードを他のバーコードに変換したエラーの最小数を測定する。

幅広い２次元イメージングモダリティは、様々な実施の形態において、ＭＥＲＦＩＳＨと他の画像に基づく分子プロファイリング技術とともに使用されてもよい。例えば、落射蛍光顕微鏡またはスピニングディスク共焦点顕微鏡等のワイドフィールドイメージング技術が使用されてもよい。同様に、ある場合において、例えば、スキャン点またはライン共焦点等の２次元スキャンモダリティが使用されてもよい。加えて、確率的光学再構築顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）、誘導放出抑制顕微鏡法（ＳＴＥＤ）、または構造化照明顕微鏡法を含む超解像イメージングモダリティが使用されてもよい。さらに解像度を改善するように、拡張顕微鏡等のサンプルを物理的に拡張するサンプル準備方法を、これらのいずれかのイメージングモダリティと組み合わせてもよい。

ある場合において、これらのイメージングモダリティは、特定の時間において単一の光学平面を撮像して、よって、２次元（２Ｄ）画像を生成できる。しかしながら、３次元（３Ｄ）において、多くの場合において、生物学的サンプルの分子プロファイルを再構築することにおいて、大きな利益がある。このような方法によって、３Ｄ分布を再構築するためには、サンプルは、イメージング対象物とサンプルとの間の距離を変更することによって、再フォーカスされ、よって、イメージングシステムはサンプルにおける異なる軸方向の平面に焦点合わせされる。２次元画像が収集される。イメージングシステムの焦点が調節され、他の画像が収集される。プロセスを繰り返すことによって、それぞれが異なった焦点面において収集された２Ｄ画像のシリーズは、３Ｄ体積を再構築するように使用されてもよい。このプロセスにおいて、単一のカメラまたは点またはライン検出器は３Ｄ体積を再構築するように使用されてもよい。

３Ｄ体積について情報を収集するこれらの手法の１つの欠点は、時間がかかることである。第一に、異なる焦点面（またはｚ位置）における画像は、直列に収集される。したがって、Ｎ個の異なる画像のスタックを収集するためには、１つの画像における露出時間の少なくともＮ倍の時間を要する。第二に、１つの焦点面から他の焦点面にシステムを再フォーカスすることは、多くの場合において、対象物レンズの移動またはサンプルの移動によって、システムの物理的な移動を要し、システムがこれらの移動を実行し、新しい位置に落ち着くまで有限の時間がかかる。

対応して、特定の実施の形態は、一般的に、複数の焦点面に同時にワイドフィールドまたは点スキャン画像を可能にする方法または装置に関する。ある場合において、これらは、生物学的サンプルにおける分子プロファイリングのための超マルチプレックス画像に基づく方法の性能を向上させるために使用されてもよい。ある実施の形態において、これらの手法は、サンプルを撮像するように１つまたは２つの検出器を使用する通常の光学器具ではなく、１つまたは複数の検出器バンクを使用してもよい。装置は、複数の検出器、例えば、２、４、８、１６または３２以上の検出器を有してもよく、それぞれの検出器は、サンプルの同じ２Ｄ位置において異なる焦点面を撮像する。単一の検出器バンクにおける検出器にわたってサンプルのこの部分から光を分布するように、部分反射型ミラー（例えば、５０％ミラー）が使用されてもよい。それぞれの検出器バンクにおける光学系は、バンクにおけるそれぞれの検出器が、サンプルにおける同じ２Ｄ位置を撮像するように構成されてもよいが、その平面において異なるフォーカル（ｚ）位置またはフォーカルオフセットを撮像してもよい。ある場合において、システムは、同時に望ましいｚ－スタックにおける焦点面の全部または一部を撮像することができる。例えば、図１を参照する。

図１は、装置を示す実施の形態の模式図である。この非限定的な例示において、照射システムは、サンプルにおいて蛍光を励起するように光を供給し、ダイクロイックミラーを通じて撮像レンズ内に係合される。サンプルのための蛍光は、チューブレンズを通じて収集され、検出器バンクに向けられている。検出器バンク内において、部分ミラーは、発振された光を２つの光路に分離する。追加的な部分ミラーのシリーズは、これらのパスをそれぞれ４つのパスに分離し、４つのパスのそれぞれは、部分ミラーの他のセットを通じて２つの追加パスに分離される。これらのミラーは、システムの位置合わせを可能にするように調整されてもよい。それぞれのパスからの光は、その検出器においてサンプル平面の画像を形成するようにそれぞれのパスに関連する検出器に集光される。それぞれの検出器と対応する撮像レンズとの間の相対距離を調節することで、特定の検出器によって撮像されるサンプルにおける特定の焦点面を選択できる。これらの全てのレンズを体系的に位置合わせすることによって、アレーにおけるそれぞれの検出器は、サンプルにおける異なる焦点面を撮像できる。

ある実施の形態において、検出器はカメラである。カメラは、ピクセルの２次元アレーを有してもよく、それぞれのピクセルに衝突する光量を定量化できる。他の実施の形態において、検出器は、例えば、フォト検出器またはアバランシェフォトダイオード等の点検出器であってもよい。さらに他の実施の形態において、検出器は、例えば、ライン検出器等のピクセルの１次元アレーであってもよい。さらに他の実施の形態において、検出器は、発振された光の色、発振された光のタイミング等のサンプルの他の異なる性質またはパラメータをそれぞれ検出する検出器の追加のバンクを有してもよい。

他の実施の形態において、このようなシステムによって、特定の位置における複数の焦点面の平行な集合体は、比例的な量によって、サンプルを撮像するために必要な時間を減少させることができる。例えば、システムの焦点をスキャンしてこれらの画像を直列的に収集する標準的な方法に対して、８カメラが８画像のｚ－スタックにおいて８つの異なる焦点面を撮像するように使用される場合、このスタックを収集するために必要な時間を少なくとも８分の１に減少させることができる。他の実施の形態において、このようなカメラバンクの使用は、例えば、システムがｚ－スタックにおけるそれぞれの画像の収集の間で再フォーカスするために一定の時間を要する場合において、カメラの数に比例する量以上、このようなｚ－スタックを収集するために要する時間を減少させることができる。

ある実施の形態において、検出器バンクの使用は、画像のｚ－スタックを収集するための時間を減少させることができ、特定の場合において、使用する検出器の数を単に増やすことで一般的に期待される量を超えて減少させることができる（例えば、２つのカメラを使用することによって、時間が半分になることを一般的に期待する）。このような時間の減少は、例えば、検出器バンクにおいて使用される露出時間が、ｚ－スタックが、単一の検出器を用いたサンプルの再フォーカスとイメージングの複数の回を通じて取得される比較のイメージング実験において使用される露出時間より大きい場合において、生じ得る。

非限定的な例示として、１００Ｈｚのフレームレートを有するカメラと、新しい焦点面における対象物レンズを再配置するために１００ｍｓを要する顕微鏡システムを考慮する。それぞれの画像（１０ｍｓ）のための露出時間が、システムを再フォーカスするために要する時間より大幅に早いため、ユーザは、システムが画像を収集するように再フォーカスプロセスを完成することを待たなければならない。したがって、８画像を有するｚ－スタックを収集するために要する時間は、８画像の全て（８０ｍｓ）を露出するように必要な時間と、必要な７つの再フォーカス事件（７００ｍｓ）を実行するための時間とである。対照的に、本明細書にて説明するように複数のカメラを使用することによって、再フォーカスは必要なく、このようなバンクにおけるすべての８つのカメラは同時に露出されてもよい。したがって、単一のカメラを使用して再フォーカスして完全なｚ－スタックを再構築するために必要な時間の合計（７８０ｍｓ）を、例えば、単一カメラのための時間と比較して、本明細書にて説明されるカメラバンクシステムを用いてたった１０ｍｓにまで減少させることができる。

複数のカメラの間で光を分離することは、少なくとも特定の実施の形態において、それぞれのカメラによって受信されるシグナルを減少させ得る。ある場合において、必要に応じて、光学信号におけるこの減少を、例えば、個別の分子ターゲットからの信号を増幅させることによって克服できる。適切な方法は、照射輝度を増加させること、より明るい蛍光分子を使用すること、またはより長期間サンプルを露出することを含むが、これに限定されない。それぞれの分子ターゲットに結合された蛍光分子の数を増加させる方法は、ある場合において使用されてもよい。例えば、複数の個別のＦＩＳＨプローブは、個別の核酸をターゲットとしてもよく、複数の蛍光物質はプライマリまたはセカンダリ抗体等に固定されてもよい。

ある実施の形態において、蛍光的にラベルされたプローブのための結合位置は、複製されてもよい。このような方法は、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification）（ＲＣＡ）、ハイブリダイゼーション連鎖反応(hybridization chain reaction)（ＨＣＲ）、クランプＦＩＳＨ（clampFISH）、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）増幅等を含むが、これらに限定されない。これら及び他の方法は、個別の分子ターゲットからの信号を増加させるように、ある実施の形態において使用されてもよく、例えば、複数のカメラが使用されてもよい。

他の実施の形態において、複数のカメラバンクは、個別の色チャンネルが個別のカメラバンク（図２）に向けられるように、対象物レンズから収集され、ダイクロイックミラー等の光学系を用いて色ごとに分離される光とともに使用される。それぞれのカメラバンクにおいて、個別のカメラは、異なる焦点面において集光されてもよく、個別のカメラバンクは、同一のサンプル体積を異なる色チャンネルにおいて撮像するように使用されてもよい。ある場合において、完全または部分的なｚ－スタックは、並列において複数の色チャネルにおいて収集されてもよく、単一のカメラの露出のために必要な時間において多色ｚ－スタックを収集することを可能にする。

ある実施の形態において、サンプルを撮像するために必要な時間は減少されてもよい。例えば、複数の異なる色を用いて、画像の完全なｚ－スタックを収集することは、それぞれのビットのためのイメージングのラウンドを要する代わりに、イメージングの染色のラウンドにおいて、複数のリードアウトプローブを測定できることを意味する。このような手法の非限定的な例示は、実施例２に示されている。

ある実施の形態において、カメラバンクは、それぞれ撮像された光学平面を分離する軸方向の距離が一定であるように設計されてもよく、他の実施の形態において、撮像平面の間の間隔は一様でなくてもよくまたは異なってもよい。特定の実施の形態において、カメラバンクは、それぞれカメラによって撮像される焦点面を、同じバンク内のカメラによって撮像される他の平面から独立して、高速で変更できるように設計されてもよい。カメラバンクにおける撮像された焦点面の間の間隔を変更できる機能は、特定の場合において、特定の測定のためのｚ－スタックの性質の最適化を可能してもよい。例えば、細胞おける分子プロファイルの測定において、狭隣接した光学平面において同じ分子を撮像することは必要でなくてもよく、単一の分子からの信号が単一の光学的平面においてのみ現れるように、イメージングシステムの拡がり関数の軸延在以上の距離によって光学的平面を分離する。このイメージングモダリティにおいて、それぞれの画像は、個別の細胞における分子プロファイルの統計学的に別個な指標を示す。対照的に、他の用途において、間隔は、光学点拡がり関数の軸延在以下であって、よって、単一の分子からの信号は、バンクに置ける複数のカメラに現れるように、撮像される光学平面の間の間隔を小さくすることが有益であってもよい。

本開示の実施の形態によって、マルチフォーカルカメラバンクからのデータを、撮像されたシステムの性質を再構築するように分析できる方法は複数ある。例えば、上述のように、個別に平面は、独立して分析されてもよく、例えば、個別の細胞等のサンプルの領域内の表現プロファイルの統計的に独立した指標を提供するように使用されてもよい。ある場合において、複数の平面からの情報はｚ－スタックの分析において共同的に使用されてもよい。言い換えると、１つのｚ－平面からの画像は、異なるｚ－平面の画像の分析において使用されてもよい。例えば、特定の実施の形態において、単一のカメラバンクから収集された画像は、例えば、システムの光学的解像度より高い解像度において、サンプルの撮像された体積において分子の分布の３Ｄ画像を再構築するように、光学デコンボリューションアルゴリズムと併せて使用されてもよい。加えて、このような画像は分析されてもよく、ある実施の形態において、回折限界より低い解像度を用いて、単一の分子の３Ｄ位置を特定することを可能にするマルチ平面ローカライゼーションアルゴリズムを用いて分析されてもよい。加えて、光学再構築技術は、ある実施の形態において、サンプルから放出される光の強度及び位相を特定し、よって、撮像される体積における蛍光シグナルの全３Ｄ分布を再構築するように、１つの平面における焦点合わせされた強度情報と、第２平面において収集される焦点合わせされていない光とを組み合わせるように使用されてもよい。

ある実施の形態において、個別の色チャネル専用のそれぞれの複数のカメラバンクを採用するシステムにおいて、これらの分析は、これらの色チャネルのそれぞれにおいて独立に実行されてもよい。しかしながら、異なる色バンクから収集された画像からの情報を組み合わせることが特定の場合において可能である。例えば、個別のカメラバンクが、別個の蛍光物質の発振スペクトラムの異なる部分から光を収集すると、スペクトラム脱混合（demixing）等の方法は、別個であるが重なった発振スペクトラムを有する２つ以上の蛍光物質の分布を特定するように使用されてもよい。

さらに他の実施の形態において、カメラに基づくワイドフィールドイメージングは、点検出器のバンクに換えられてもよい。ある実施の形態において、サンプルを通じて軸位置に沿って配置される照射点のセットは、点検出器のバンクにおけるそれぞれの点検出器にマップされてもよい。照射点と、サンプルにおいて点検出器が光を収集する位置とを同時にスキャンすることによって、異なるｚ－平面が同時に撮像されるスキャン画像のｚ－スタックが構築されてもよい。これは、ライン照射及びライン検出器等の他の検出器において使用されてもよい。発振される光を適切にマスクすることによって、このような測定は共焦点モダリティにおいて実行されてもよい。様々な実施の形態において、光に反応するいずれかのタイプの検出器は、サンプルにおいて、複数の軸位置を同時に特徴付けるように、ワイドフィールド及びスキャン等を含む幅広いイメージングモダリティを可能にするようにこのようなバンクにおいて使用されてもよい。

さらに他の実施の形態において、バンク及び可能性として複数のバンクにおける検出器は、電子機器を通じて、それぞれの検出器がその取得を同時に開始及び終了するように同期されてもよい。ある実施の形態において、定義された時間的遅延は、バンクにおける異なる検出器における取得の開始の間に設定されてもよい。同様に、カメラバンクの間の取得は、同時にまたは既定の時間遅延において開始してもよく、よって取得期間は、少なくともある実施の形態において、完全に重なっている、部分的に重なっている、または一切重なっていなくてもよい。このタイプの取得タイミングを制御できる複数の方法が存在する。ある実施の形態において、バンクにおけるそれぞれの検出器の取得タイミングは、バンクにおける１つの「メイン」検出器によって生成されるタイミングシグナルを参照することによって、設定されてもよい。ある場合において、バンクにおける全ての検出器のタイミングは、別のバンクにおけるカメラによって生成されたタイミングシグナルによって設定されてもよい。さらに他の実施の形態において、バンクにおける全てのカメラのタイミングは、シグナルジェネレータまたはコンピュータ等の外部のソースによって生成されるタイミングシグナルによって設定されてもよい。ある実施例において、カメラの外部タイミング自体は、一部または全部のカメラがトリガーを受ける準備ができていることを示すときに、トリガーされてもよい。

ある実施の形態において、それぞれの検出器バンクによって生成されるデータは、例えば、コンピュータ等のシグナル取得システムを通じて収集されてもよい。ある実施の形態において、バンクにおける個別の検出器によって生成されるデータは、専用のシグナル取得システム、即ちコンピュータによって取得されてもよい。

ある実施の形態において、取得されたデータは、バンク内における全ての検出器によって共有される例えば、ハードドライブ等のストレージシステムにおいて記憶されてもよい。特定の実施の形態において、取得されるデータは、それぞれの検出器にとって固有であるストレージシステムにおいて記憶されてもよい。ある場合において、これらのデータは、バンクまたはシステムにおいて全ての検出器に共有されているコンピュータのリソースによって、またはそれぞれの検出器またはストレージシステム等にとって固有なコンピュータリソースを通じて、別のストレージに蓄積、組み合わせられ、及び／または移動されてもよい。ある実施例においては、バンクにおけるカメラに関連した単一ボードコンピュータまたは他のコンピュータは、ソリッドステートドライブ等の内部ストレージシステムを収容してもよく、画像をこの内部ストレージに、リアルタイムで、１つまたは複数のカメラからストリームしてもよい。このストレージは、他の外部システムに移送する前にデータをステージするための一時的なストレージとして機能してもよい。

ある実施の形態において、例えば、クラウドストレージにストリームするイーサネット通信、または当業者によって知られているデータ移送の他の技術等のシステムを用いて、例えば、リアルタイムで、オフサイトストレージシステムにストリームしてもよい。

ある実施の形態において、収集されたデータは、例えば、リアルタイムで、処理されてもよい。例えば、特定の実施の形態において、バンクにおける全ての検出器の間で共有されている、またはバンクにおいてそれぞれの検出器にとって固有であるコンピュータリソースは、データを処理するように使用されてもよい。このような処理は、イメージデコンボリューション、ローパスフィルタリング、ハイパスフィルタリング、特徴識別等のコンピュータタスクを含んでもよいが、これらに限定されない。ある実施の形態において、特徴識別は、例えば、蛍光発振器の重心を特定するように点広がり関数の近似等のこれらの検出器によって収集された画像における点またはスポット状の特徴の識別に関する。ある実施の形態において、複数の焦点面からの情報を示すバンクにおける複数の検出器からのデータは、併せて分析されてもよい。例えば、イメージデコンボリューションの内容において、３Ｄデコンボリューションアルゴリズムは、より高い解像度において３Ｄ分布を再構築するようにｚ－スタックの全体に適用されてもよい。他の非限定的は例示において、スポット近似アルゴリズムは、そのようなｚ－スタックにおける個別の蛍光発振器の３Ｄ重心を識別するように使用されてもよい。

ある実施の形態において、画像分析の全部または一部は、検出器バンクの検出器内における専用の機能性によって実行されてもよい。例えば、個別のカメラまたは他の検出器は、収集された画像のデコンボリューションを可能にして、特定の関心領域が特定され、蛍光スポット等の特徴が特定されるような機能性を有してもよい。ある場合において、これらの分析結果のみが保存され、及び／またはコンピュータに送信される。

ある実施の形態において、サンプルから取得された画像は、このような分析が実行された後、破棄されてもよい。

ある実施の形態において、単一のマスター制御プログラムを実行する単一のコンピュータは、単一の顕微鏡に取り付けられた全ての検出器バンクにおける全ての検出器からのデータ収集の整合のために使用されてもよい。特定の場合において、それぞれの検出器バンクは、個別のプログラムを実行する独自のコンピュータを通じて制御されてもよく、これらのコンピュータは、ある場合において、それぞれの検出器バンクに関連したコンピュータ上で実行されるプログラムと通信し、これらを整合するマスターコンピュータ実行ソフトウェアを通じて制御されてもよい。ある実施の形態において、バンクにおけるそれぞれの検出器は、制御プログラムを実行するカメラに関連したコンピュータによって制御されてもよい。特定の実施の形態において、これらのコンピュータは、それぞれの検出器バンクに関連したマスターコンピュータによって制御されてもよく、マスターコンピュータは、バンクにおける全てのコンピュータとの通信を果たすマスター制御プログラムを実行してもよい。

さらに、ある実施の形態において、カメラのセット、例えば、２、３、４または５以上のカメラは、単一のコンピュータによって制御されてもよく、カメラバンクは、例えば、１つより多くて、カメラの全数より少ない数のコンピュータによって制御される。加えて、ある実施の形態において、カメラバンクシステムを制御する機能を果たす単一ボードコンピュータの小さいグループは、イメージングシステムの他の部分を制御する機能を果たす、例えば、タワーまたはパーソナルコンピュータ等の別のコンピュータによって制御されてもよい。単一ボードコンピュータは、複数のＣＰＵｓまたはＧＰＵｓを収容してもよく、複数のＣＰＵｓまたはＧＰＵｓはカメラバンクにおける個別のカメラまたはカメラのセットからのデータのリアルタイム処理を容易にしてもよい。これらのコンピュータとの間の通信は、例えば、イーサネットまたは無線通信方法を用いて、例えば、１０Ｇｂまたは１Ｇｂ等の様々な速度によって実行されてもよい。加えて、通信はＵＳＢ、シリアル、デジタルＴＴＬ等を通じて実行されてもよい。

ある実施の形態において、画像の分析は、少なくとも部分的に機械学習手法を通じて、実行されてもよい。例えば、ある実施の形態において、ニューラルネットワークは、適切なサンプルを用いて検出器バンクにおける個別の検出器または全ての検出器上に収集されるデータのサブセットとともに学習されてもよく、よって、このようなネットワークは、検出器バンクにおける個別の検出器によって収集されたデータを分析するように使用されてもよく、またはバンクにおける全ての検出器等に対して合同分析を実行するように使用されてもよい。ある実施の形態において、このような分析は、検出器バンクにおけるそれぞれの検出器によって撮像される光学平面の間隔の正確なカリブレーションの代わりに使用されてもよい。ある実施の形態において、このような分析は、例えば、他の分析方法と比較して、これらの画像において関心特徴が特定される速度を増加させるように使用されてもよい。特定の場合において、これらの方法は、検出器バンクにおける検出器の全てから再構築された画像の有効解像度を増加するように使用されてもよい。ある実施の形態において、これらの方法は、例えば、蛍光発振器の異なる色等、サンプルの異なる部分を撮像する複数の検出器バンクから収集されたデータを併せて分析するように使用されてもよい。これらの方法は、例えば、サンプルを撮像するように使用される検出器バンクの数より多くの蛍光物質の発振を区別するように使用されてもよい。

幅広い機械学習の手法は使用可能であり、サポートベクタ機械、線形及び非線形回帰、及び異なる形態のニューラルネットワークを支持する方法を含むが、これらに限定されない。加えて、このような分析を実行するための幅広い技術があり、リアルタイムで、即ち画像の保存の前に、この分析を実行する方法を含む。これらに方法は、フィールドプログラマブルゲートアレー（ＦＰＧＡｓ）、グラフィックプロセッサユニット（ＧＰＵｓ）、ＣＰＵｓ等を含むが、これらに限定されない。

ある実施の形態において、本明細書にて、説明されるいずれかの光学装置が使用されてもよく、例えば、マルチプレックス単一分子ＲＮＡイメージング測定、マルチプレックス免疫蛍光イメージング、マルチプレックスゲノム測定、上述の手法の２つ以上及び／または追加の手法を組み合わせるマルチモーダル測定が使用されてもよい。特定の場合において、本明細書にて説明される光学装置は、単一の細胞における蛍光的にラベルされた分子を追跡する等、リアルタイムで３Ｄ空間において物体の移動を追跡するように使用されてもよい。

特定の実施の形態は、システムと、このようなシステムの位置合わせする及び／または位置合わせを維持する方法に関する。例えば、固定されたセットの基準点、例えば、ヒドロゲルに埋め込まれたまたはサンプルの表面に配置された蛍光ビーズは、光軸に沿ってスキャンされてもよく、それぞれの検出器において特定の基準点と焦点が合う相対的スキャン位置は、それぞれの検出器によって撮像される焦点面の間の相対的オフセットを特定するように、及び／または既定の望ましい焦点面と一致するようにそれぞれの検出器のために撮像されたフォーカル位置を調節するように使用されてもよい。

ある実施の形態において、コリメートされたレーザ等の参照光源は、例えば、システムの位置合わせのために、検出器バンクを通じて向けられている。ある実施の形態において、それぞれの検出器に関連する集光またはイメージングレンズは、この位置合わせソースのための最良焦点の位置を特定するようにスキャンされてもよい。その後、イメージングレンズは、この焦点の位置から既定のオフセット分において移動されてもよい。一部の検出器がイメージングレンズを共有するある実施の形態において、相対的にはアラインメントは、それぞれの検出器を光軸に沿って移動することによって実行されてもよい。同様に、バンクにおけるそれぞれの検出器のアラインメントは、アラインメントソースによって形成されるスポットの測定された幅等、それぞれの検出器におけるアラインメントソースの画像によって設定されてもよい。同様に、それぞれのミラー、レンズ、または検出器は、検出器アレーによって構築される画像を位置合わせするように移動されてもよく、よって、これらの画像の２Ｄ位置が揃っている。例えば、カメラによって、このアラインメントは、サンプルにおいて同じ位置に検出バンクにおける２つの異なるカメラにおける対応するピクセルの位置を認識してもよい。このようなアラインメントは、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、または１０００ｎｍより高い精度によって実行されてもよい。同様に、それぞれの検出器に関連する望ましい焦点面のアラインメントは、例えば、１０ｎｍ、２５ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、及び１０００ｎｍより高い精度によって実行されてもよい。

本開示は、上述の例示にのみ限定されていない。他の実施の形態も可能である。対応して、より一般的に、本開示の様々な態様は、マルチフォーカルイメージングのための様々なシステム及び方法に関する。

例えば、本開示の特定の実施の形態は、例えば、サンプルにおいて様々な焦点面に集光される複数の検出器を使用するシステム及び方法に関する。検出器の例示は、カメラ、受光器、光ダイオード等を含むがこれらに限定されない。カメラの例示は、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラまたは光学カメラを含むがこれらに限定されない。ある場合において、カメラは、それぞれのピクセルに到達する光量を定量化するように使用されてもよいピクセルの２次元アレーを含む。このようなカメラの多くは、商業的に入手可能であって、多くの場合は低コストである。検出器の他の例は、受光器または光ダイオード等のライン検出器または点検出器を含む。検出器はそれぞれ同一または異なってもよい。例えば、ある場合において、検出器は、発振される光の色、発振される光のタイミング等のサンプルの様々な性質を検出できる。

検出器は、それぞれ異なる焦点面に集光されてもよく、及び／または２つ以上の検出器は同一の平面に集光されてもよい。例えば、ある実施の形態において、焦点面は、互いに比較的近くに配置されてもよい。例えば、焦点面は、最も隣接している焦点面から１０００ｎｍ以下離れた位置に配置されてもよく、ある場合において、最も隣接している焦点面から７５０ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、７５ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、または１０ｎｍ以下離れて配置されてもよい。焦点面は、（例えば、それぞれの隣接した焦点面の間の距離が略一定であるように）均一に分布されてもよく、またはある実施の形態において不均一に分布されてもよい。ある場合において、焦点面は互いに実質的に平行である。

特定の実施の形態において、複数の焦点面の使用は、物体のｚ（軸方向）位置を、例えば、１０００ｎｍ、７５０ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、または１０ｎｍ以上等の比較的高い解像度において特定することを可能にする。ある場合において、解像度は焦点面の分離に関連してもよい。

焦点面は、少なくとも部分的に、例えば、図１に示すように、一部または全ての検出器を個別的に影響するように配置されたイメージングレンズによって規定されてもよい。したがって、例えば、それぞれの検出器は、特定の検出器の焦点面を制御するように使用されてもよいそれぞれのイメージングレンズによって影響されてもよい。しかしながら、レンズ、ミラー、ビームスプリッタ等の他の光学素子が、例えば、サンプルから検出器に延びる光路内において、存在してもよいと、理解されよう。加えて、特定の場合において、個別のイメージングレンズは検出器の一部のみに影響を及ぼす。

ある場合において、イメージングレンズは、例えば、検出器に画像が集光されることを可能にする位置にレンズを独立して移動することによって、または他の集光手法によって、個別的に集光される。ある場合において、複数のイメージングレンズは、サンプルに（例えば、テストイメージに）イメージングレンズを用いて一部または全部の検出器を集光することによって、その後、一部または全部のレンズを、そのレンズの焦点面を変更するように様々な量によって移動することによって、異なるイメージング平面に集光するように制御されてもよい。例えば、少なくとも一部のレンズは、オフセット（または複数のオフセット）によって移動されてもよく、焦点面もオフセットされることをもたらす。例えば、オフセットによってレンズを移動させることは、焦点面もオフセットによって移動されることをもたらし、レンズのオフセットは、焦点面のオフセットに比例してもよい。ある場合において、オフセットは固定量である。したがって、例えば、第１レンズは、第１オフセットによって移動されてもよく、第２レンズは、（例えば、第１オフセットの２倍と等しい）第２オフセットによって移動されてもよく、イメージングレンズの焦点面が異なることをもたらしてもよい。加えて、特定の実施の形態において、集光は、例えば、レンズを移動せず、光軸に沿って検出器自体を移動することによって実行されてもよい。

ある場合において、カメラ及びレンズの配置は、イメージングの異なる態様に関連したカメラを効果的にインターリンクしてもよい。例えば、２つのチャネルに光を分離し、２つの８カメラバンクのそれぞれにそれぞれのカラーバンドを向けるダイクロイックビームスプリッタによって光学的に分離された２つの８カメラバンクを形成することによって、１６つのカメラは、８画像平面において２つの色を撮像するように使用されてもよい。他の例示において、色から独立して光を分離する非ダイクロイックビームスプリッタのシリーズは、８つの分離した光路に収集された光を分割するように使用されてもよく、それぞれの光路は、それぞれの８つの光路に関連した２つのカメラに２つの異なるカラーバンドの光を分離して方向付けるダイクロイックビームスプリッタを収容する。ある場合において、光学素子を異なる位置に配置することによって、幅広い異なるカメラバンク組織、または本明細書にて説明される他の配置が実施されてもよく、２色、８光学平面画像が同時に収集される結果を維持できる。加えて、この手法の一般化は、容易に２つより多くの色（例えば、３、４、５、６つ等の色）、光学平面の異なる数（例えば、４平面、６平面、１０平面、１２平面、１４平面、１６平面等）及び／または偏光等の光において差別可能な他の性質に拡張されてもよいと認識される。

ある場合において、比較的大きい数の検出器が使用されてもよい。例えば、サンプルからの光は、様々な検出器の内部へ光を導入するように（例えば、ビームスプリッタを用いて）異なる光路に分割されてもよい。したがって、例えば、使用されるビームスプリッタの数ｎに基づいて、２^ｎ検出器が存在してもよい。例えば、２つのビームスプリッタが使用されると、２^２＝４つの検出器があってもよく、３つのビームスプリッタが使用されると、２^３＝８つの検出器があってもよい。他の例示として、４、５、６、７、８またはこれより多くのビームスプリッタが使用されてもよく、例えば、少なくとも１６、３２、６４、１２８またはこれより多くの使用される検出器に対応してもよい。

検出器は、独立して同じであっても、異なってもよい。例えば、検出器は、実質的に同じの周波数を捉えるように設定されてもよく、及び／または一部の検出器または検出器のグループは、異なる周波数を捉えるように、例えば、サンプルから異なる「色」を捉えるように設定されてもよい。例えば、第１色を捉えるための第１グループまたはカメラのバンクがあってもよく、第２色を捉えるための第２グループまたはカメラのバンクがあってもよい。

加えて、検出器は、同時にまたは異なる時に、画像を捉えるように独立して設定されてもよい。例えば、第１時間において画像を捉えるための第１グループまたはカメラのバンクがあって、第２時間において画像を捉えるための第２グループまたはカメラのバンクがあってもよい。充分な数の検出器が使用されると、特定の実施の形態において、サンプルの「動画」が形成されてもよい。加えて、例えば、２つ以上の色においてサンプルの「動画」を捉えるために、本明細書にて説明されるいずれかの技術は組み合わせられてもよい。

ある場合において、それぞれの検出器に到達する光の量は、光が通過するビームスプリッタの数によって影響される。したがって、例えば、３つのビームスプリッタを通過した後に検出器に到達する光は、元の強度の１／８（１／２^３）であってもよい。したがって、特定の実施の形態において、サンプルからの光は、増幅されてもよく、例えば、サンプルにおけるシグナリング物体は、生成する光の量を増加させてもよく、よってそれぞれの検出器に到達する光は分析のために充分な強度を有する。シグナルを発する物体は、本明細書にて開示される物体を含むが、これに限定されず、シグナリング物体の非限定的な方法は下記及び米国特許出願第６２／７７９，３３３号において提供され、本出願は参照によって、その全体において本明細書にて含まれる。

特定の態様は、よって、細胞培養、細胞の懸濁液、生物学的組織、生検、生物等を含んでもよいサンプルを特定するように向けられている。サンプルは、ある場合において、細胞無しであって、核酸を有してもよい。サンプルが細胞を含む場合、細胞は人間の細胞または他のいずれかの適切な細胞であってもよく、例えば、哺乳類の細胞、魚の細胞、昆虫の細胞、植物の細胞等であってもよい。ある場合において、１つより多くの細胞が存在してもよい。

サンプル内において、特定すべきターゲットは、核酸、タンパク質等を含んでもよい。特定すべき核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、細胞内（または他のサンプル）に存在する他の核酸を含んでもよい。核酸は、細胞において内因性であってもよく、または細胞に追加されてもよい。例えば、核酸はウイルス性または人工的に生成されてもよい。ある場合において、特定すべき核酸は細胞によって表現される。ある実施の形態において、核酸はＲＮＡである。ＲＮＡはコーディングＲＮＡ及び／またはノンコーディングＲＮＡであってもよい。例えば、ＲＮＡはタンパク質をコード化してもよい。細胞内で分析されてもよいＲＮＡの非限定的な例示は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡｓ、ｓｎＲＮＡｓ、ｅｘＲＮＡｓ、ｐｉＲＮＡｓ等を含んでもよい。

ある場合において、細胞内における核酸の大きな部分は、分析されてもよい。例えば、ある場合において、細胞において存在するＲＮＡの充分な量が特定されてもよく、よって細胞の部分的なまたは全体的なトランスクリプトームを生成してもよい。ある場合において、少なくとも４タイプのｍＲＮＡｓが細胞内において特定されてもよく、ある場合において、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６，少なくとも２２、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも５０、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２７、少なくとも１２８、少なくとも１４０、少なくとも２５５、少なくとも２５６、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも７５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００、または少なくとも１００，０００タイプのｍＲＮＡｓが細胞内において特定されてもよい。

ある場合において、細胞のトランスクリプトームが特定されてもよい。トランスクリプトームは一般的にｍＲＮＡだけではなく、細胞において生成される全てのＲＮＡ分子を包含するものと理解される。したがって、例えば、トランスクリプトームは、特定の場合において、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を含んでもよい。ある実施の形態において、細胞のトランスクリプトームの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が特定されてもよい。

ある実施の形態において、特定すべき他のターゲットは、核酸、タンパク質等にリンクされたターゲットを含んでもよい。例えば、ある実施の形態のセットにおいて、ターゲットを認識できる結合物体は、核酸プローブに抱合されてもよい。結合物体は、特定的にまたは非特定的に、ターゲットを認識できるいずれかの物体であってもよい。非限定的な例示は、酵素、抗体、受容体、相補的な核酸鎖、アプタマー等を含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドリンク抗体（oligonucleotide-linked antibody）はターゲットを特定するように使用されてもよい。ターゲットは、オリゴヌクレオチドリンク抗体に結合してもよく、オリゴヌクレオチドは、本明細書にて説明されるように特定される。

細胞または他のサンプルにおける核酸等のターゲットの特定は、定性的または定量的であってもよい。加えて、特定は、空間的であってもよく、例えば、細胞におけるまたは他のサンプルにおける核酸または他のターゲットの位置は、２または３次元で特定されてもよい。ある実施の形態において、細胞におけるまたは他のサンプルにおける核酸または他のターゲットの位置、数、または濃度が特定されてもよい。

ある場合において、細胞のゲノムの大きな部分が特定されてもよい。特定されたゲノムセグメントはゲノム上で連続しても、散在してもよい。ある場合において、少なくとも４つのゲノムセグメントが細胞内において特定されてもよく、ある場合において、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも２２、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも５０、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２７、少なくとも１２８、少なくとも１４０、少なくとも２５５、少なくとも２５６、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも７５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００、または少なくとも１００，０００ゲノムセグメントが細胞内において特定されてもよい。

ある場合において、細胞の全ゲノムが特定されてもよい。ゲノムは一般的に染色体ＤＮＡだけではなく、細胞内に生成される全てのＤＮＡ分子を包含するものと理解される。したがって、例えば、ゲノムは、特定の場合において、染色体ＤＮＡに加えて（またはそれに代わって）ミトコンドリアＤＮＡ、クロロプラストＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等を含んでもよい。ある実施の形態において、細胞のゲノムの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が特定されてもよい。

本明細書にて説明されるように、様々な核酸プローブは、細胞または他のサンプルにおいて１つまたは複数のターゲットを特定するように使用されてもよい。プローブは、核酸、（または核酸に交雑できる物体、例えば、特に）ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（ロックされた核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）及び／またはこれらの組み合わせ等を有してもよい。ある場合において、追加の要素は、例えば、下記で説明されるように、核酸プローブの内部に存在してもよい。加えて、いずれかの適切な方法は細胞に核酸プローブを導入するように使用されてもよい。

例えば、ある実施の形態において、細胞は、核酸プローブを導入する前に固定されて、よって、例えば、細胞内の核酸または他のターゲットの位置を維持する。細胞を固定する技術は当業者によって知られている。非限定的な例示として、細胞は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸などの化学物質を用いて固定されてもよい。１つの実施の形態において、細胞は、ＨＥＰＥＳ－グルタミン酸バッファ媒介有機溶媒（ＨＯＰＥ）を用いて固定されてもよい。

核酸プローブは、いずれかの適切な方法を用いて細胞に（または他のサンプルに）導入されてもよい。ある場合において、細胞は、充分透過性にされて（permeabilized）もよく、よって、細胞の周りで、核酸プローブを含む流体を流すことによって細胞に核酸プローブが導入されてもよい。ある場合において、細胞は固定プロセスの一部として充分透過性にされてもよく、他の実施の形態において、細胞は、エタノール、メタノール、トリトン等の特定の化学物質に露出することによって透過性にされてもよい。加えて、ある実施の形態において、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクション等の手法は、細胞または他のサンプルに核酸プローブを導入するように使用されてもよい。

特定の態様は、一般的に、細胞（または他のサンプルに）導入されてもよい核酸プローブに関する。プローブは、用途によって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ等、通常ワトソン－クリック塩基ペアリングによって、核酸と交雑できる様々な物体のいずれかを有してもよい。核酸プローブは、通常、例えば、ターゲット核酸等のターゲットの少なくとも一部に結合できるターゲットシーケンスを含む。ある場合において、結合は特定結合（例えば、相補的な結合を通じて）であってもよい。細胞または他のシステムに導入されると、ターゲットシーケンスは、特定のターゲット（例えば、ｍＲＮＡまたは本明細書にて説明される他の核酸）に結合できてもよい。核酸プローブは、下記において説明されるように、１つまたは複数のリードシーケンスを含んでもよい。

ある場合において、核酸プローブの１つより多くのタイプは、例えば、順次にまたは同時にサンプルに適用されてもよい。例えば、サンプルに適用される少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１０００、少なくとも３０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも３０，０００つの区別可能な核酸プローブが存在してもよい。ある場合において、核酸プローブは順次に追加されてもよい。しかしながら、ある場合において、１つより多くの核酸プローブが、同時に追加されてもよい。

核酸プローブは、１つまたは複数のターゲットシーケンスを含んでもよく、核酸プローブ内においていずれかの位置に配置されてもよい。ターゲットシーケンスは、例えば、ターゲット核酸等のターゲットの一部に実質的に相補的である領域を含んでもよい。例えば、ある場合において、部分は、特定の結合を形成するように、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％において相補的であってもよい。通常、相補性は、ワトソン－クリックヌクレオチド塩基ペアリングに基づいて特定される。

ある場合において、ターゲットシーケンスは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００また少なくとも４５０ヌクレオチドの長さを有してもよい。ターゲットシーケンスは、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１７５以下、１５０以下、１２５以下、１００以下、７５以下、６０以下、６５以下、６０以下、５５以下、５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２０以下、または１０以下のヌクレオチドの長さを有してもよい。これらのいずれかの組み合わせが可能であって、例えば、ターゲットシーケンスは１０から３０ヌクレオチド、２０から４０ヌクレオチド、５から５０ヌクレオチド、１０から２００ヌクレオチド、または２５から３５ヌクレオチド、１０から３００ヌクレオチド等の長さを有してもよい。

核酸プローブのターゲットシーケンスは、細胞または他のサンプルにおいて、存在すると思われるターゲットに対する参照によって特定されてもよい。例えば、タンパク質に対するターゲット核酸は、タンパク質を形成するように表現される核酸を特定することによって、タンパク質のシーケンスを用いて特定されてもよい。ある場合において、上述のような長さを有するタンパク質をコード化（encode）する核酸の一部のみが使用される。加えて、ある場合において、特定のターゲットを識別するために使用できる１つより多くのターゲットシーケンスが使用されてもよい。例えば、同じターゲットの同一または異なる領域に結合または交雑できる複数のプローブは、順次に及び／または同時に使用されてもよい。ハイブリダイゼーションは、通常、二本鎖核酸を形成するように（水素結合、グアニン－シトシン、アデニン－チミン）ワトソン－クリックヌクレオチド塩基ペアリングを通じて相補的な一本鎖核酸が関連するアニーリングプロセスを意味する。

ある実施の形態において、核酸プローブは１つまたは複数の「リード」シーケンスを有してもよい。リードシーケンスは、例えば、下記で説明されるようにシグナリング物体との関連を通じて、核酸プローブを識別するために使用されてもよい。ある実施の形態において、核酸プローブは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６以上、２０以上、２４以上、３２以上、４０以上、４８以上、５０以上、６４以上、７５以上、１００以上、１２８以上のリードシーケンスを有してもよい。リードシーケンスは、核酸プローブにおいていずれかの位置において配置されてもよい。１つより多くのリードシーケンスが存在すると、リードシーケンスは、互いに隣り合って配置されてもよく、及び／または他のシーケンスと散在されてもよい。

リードシーケンスは、いずれかの長さであってもよい。１つより多くのリードシーケンスが使用されると、リードシーケンスは同じまたは異なる長さを有してもよい。例えば、リードシーケンスは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００また少なくとも４５０ヌクレオチドの長さを有してもよい。ある場合において、リードシーケンスは、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１７５以下、１５０以下、１２５以下、１００以下、７５以下、６０以下、６５以下、６０以下、５５以下、５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２０以下、または１０以下のヌクレオチドの長さを有してもよい。これらのいずれかの組み合わせが可能であって、例えば、ターゲットシーケンスは１０から３０ヌクレオチド、２０から４０ヌクレオチド、５から５０ヌクレオチド、１０から２００ヌクレオチド、または２５から３５ヌクレオチド、１０から３００ヌクレオチド等の長さを有してもよい。

リードシーケンスは、ある実施の形態において、恣意的またはランダムであってもよい。特定の場合において、リードシーケンスは、細胞または他の細胞の他の要素とともにホモロジーを減少または最小化するように使用されてもよく、よって、例えば、リードシーケンス自体は、細胞または他のサンプルにおいて存在すると推測される他の核酸と結合または交雑しない。ある場合において、相同性は１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満であってもよい。ある場合において、２０未満の塩基ペア、１８未満の塩基ペア、１５未満の塩基ペア、１４未満の塩基ペア、１３未満の塩基ペア、１２未満の塩基ペア、１１未満の塩基ペア、または１０未満の塩基ペアの相同性であってもよい。ある場合において、このような塩基ペアは連続的である。

ある実施の形態の１つのセットにおいて、核酸プローブの人口は、特定の数のリードシーケンスを含んでもよく、特定の数は、ある場合において、核酸プローブのターゲットの数より少なくてもよい。当業者は、１つのシグナリング物体とｎ個のリードシーケンスがあると、一般的に２ｎ－１個の異なる核酸ターゲットが固有に識別されてもよいことを認識する。しかしながら、全ての可能な組み合わせは使用しなくてもよい。例えば、核酸プローブの人口は、１２個の異なる核酸シーケンスをターゲットしてもよく、一方で、８個のリードシーケンス以下のシーケンスを収容してもよい。他の例示において、核酸プローブの人口は、１４０個の異なる核酸種類をターゲットとしてもよく、一方で、１６個のリードシーケンス以下のシーケンスを収容してもよい。異なる核酸シーケンスターゲットは、各プローブ内におけるリードシーケンスの異なる組み合わせを使用することによって、異なる核酸シーケンスターゲットは別々に識別されてもよい。例えば、各プローブは、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６またはこれ以上のリードシーケンスを含んでもよい。ある場合において、核酸プローブの人口は、同一の数のリードシーケンスを収容してもよく、他の場合において、様々なプローブ上には異なる数のリードシーケンスが存在してもよい。

非限定的な例示として、第１核酸プローブは、第１ターゲットシーケンス、第１リードシーケンス、及び第２リードシーケンスを収容してもよく、一方で、異なる第２核酸プローブは、第２ターゲットシーケンス、同一の第１リードシーケンス、及び第２リードシーケンスの代わりに第３リードシーケンスを含んでもよい。したがって、このようなプローブは、本明細書にて説明するように、特定のプローブまたは位置において存在するまたはそれと関連する様々なリードシーケンスを特定することによって、区別されてもよい。例えば、プローブは、下記のように、「コードワード」を使用して順次に識別及びコード化されてもよい。選択的に、コードワードを、エラー検出及び／または修正の対象としてもよい。

加えて、核酸プローブの人口（及びエンコーディングプローブにおけるそれらの対応する補足的な位置）は、特定の実施の形態において、プローブの人口における全ての「Ｇ」または全ての「Ｃ」を除く等、自然に発生するヌクレオチド塩基の４個のうち２個のみまたは３個のみを使用して形成されてもよい。「Ｇ」または「Ｃ」を有しないシーケンスは、特定の実施の形態において、極めて小さいセカンダリ構造を形成してもよく、より均一な、より高速なハイブリダイゼーションに貢献できる。したがって、ある場合において、核酸プローブは、Ａ、Ｔ及びＧのみ、Ａ、Ｔ及びＣのみ、Ａ、Ｃ及びＧのみ、またはＴ、Ｃ、及びＧのみを含んでもよい。

ある態様において、核酸プローブ上のリードシーケンスは、プライマリ増幅核酸上の対応する認識シーケンスに（例えば、特定的に）結合してもよい。したがって、核酸プローブが生物学的サンプルにおけるターゲット、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡターゲットを認識すると、プライマリ増幅核酸は、例えば、相補的結合等、核酸プローブのリードシーケンスとプライマリ増幅核酸上の対応する認識シーケンスとの間の相互作用とともに、核酸プローブを通じてターゲットと関連できる。例えば、認識シーケンスは、ターゲットリードシーケンスを認識できるが、他の非ターゲットリードシーケンスを実質的に認識またはこれと結合できない。プライマリ増幅核酸は、用途によって、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ及び／またはＰＮＡ等の核酸と交雑できるいずれかの種類の物体を有してもよい。例えば、このような物体は、認識シーケンスの一部または全部を形成してもよい。

ある場合において、認識シーケンスは、ターゲットリードシーケンスに実質的に相補的であってもよい。ある場合において、シーケンスは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％において相補的であってもよい。通常、相補性は、ワトソン－クリックヌクレオチド塩基ペアリングに基づいて特定される。ターゲットリードシーケンスは、前述のものを含んでもよい。

ある場合において、認識シーケンスは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００また少なくとも４５０ヌクレオチドの長さを有してもよい。ある場合において、認識シーケンスは、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１７５以下、１５０以下、１２５以下、１００以下、７５以下、６０以下、６５以下、６０以下、５５以下、５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２０以下、または１０以下のヌクレオチドの長さを有してもよい。これらのいずれかの組み合わせが可能であって、例えば、認識シーケンスは１０から３０ヌクレオチド、２０から４０ヌクレオチド、５から５０ヌクレオチド、１０から２００ヌクレオチド、または２５から３５ヌクレオチド、１０から３００ヌクレオチド等の長さを有してもよい。

ある実施の形態において、プライマリ増幅核酸は、下記で説明されるようにセカンダリ増幅核酸に結合できる１つまたは複数のリードシーケンスを有してもよい。例えば、プライマリ増幅核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６以上、２０以上、２４以上、３２以上、４０以上、４８以上、５０以上、６４以上、７５以上、１００以上、１２８以上のリードシーケンスを有してもよい。リードシーケンスは、プライマリ増幅核酸においていずれかの位置において配置されてもよい。１つより多くのリードシーケンスが存在すると、リードシーケンスは、互いに隣り合って配置されてもよく、及び／または他のシーケンスと散在されてもよい。１つの実施の形態において、プライマリ増幅核酸は、第１端に認識シーケンスを有し、第２端に複数のリードシーケンスを有する。

ある場合において、プライマリ増幅核酸におけるリードシーケンスは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００また少なくとも４５０ヌクレオチドの長さを有してもよい。ある場合において、リードシーケンスは、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１７５以下、１５０以下、１２５以下、１００以下、７５以下、６０以下、６５以下、６０以下、５５以下、５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２０以下、または１０以下のヌクレオチドの長さを有してもよい。これらのいずれかの組み合わせが可能であって、例えば、リードシーケンスは１０から２０ヌクレオチド、１０から３０ヌクレオチド、２０から４０ヌクレオチド、５から５０ヌクレオチド、１０から２００ヌクレオチド、または２５から３５ヌクレオチド、１０から３００ヌクレオチド等の長さを有してもよい。

プライマリ増幅核酸内において、いずれかの数のリードシーケンスがあってもよい。例えば、プライマリ増幅核酸内において、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０またはこれ以上のリードシーケンスがあってもよい。プライマリ増幅核酸内において、１つより多くのリードシーケンスが存在すると、リードシーケンスは同じまたは異なってもよい。ある場合において、例えば、リードシーケンスは全て同一であってもよい。

ある実施の形態において、プライマリ増幅核酸の人口は、核酸の人口における全ての「Ｇ」または全ての「Ｃ」を除く等、自然に発生するヌクレオチド塩基の４個のうち２個のみまたは３個のみを使用して形成されてもよい。「Ｇ」または「Ｃ」を有しないシーケンスは、特定の実施の形態において、極めて小さいセカンダリ構造を形成してもよく、より均一な、より高速なハイブリダイゼーションに貢献できる。したがって、ある場合において、プライマリ増幅核酸は、Ａ、Ｔ及びＧのみ、Ａ、Ｔ及びＣのみ、Ａ、Ｃ及びＧのみ、またはＴ、Ｃ、及びＧのみを含んでもよい。

ある場合において、１つより多くのタイプのプライマリ増幅核酸が、例えば、順次にまたは同時にサンプルに適用されてもよい。例えば、サンプルに適用される少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１０００、少なくとも３０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも３０，０００つの区別可能なプライマリ増幅核酸が存在してもよい。ある場合において、プライマリ増幅核酸は順次追加されてもよい。しかしながら、ある場合において、１つより多くのプライマリ増幅核酸は同時に追加されてもよい。

実施の形態の１つのセットにおいて、プライマリ増幅核酸上のリードシーケンスは、セカンダリ増幅核酸上の対応する認識シーケンスに（例えば、特定的に）結合してもよい。したがって、核酸プローブが生物学的サンプルにおけるターゲット、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡターゲットを認識すると、セカンダリ増幅核酸は、例えば、相補的結合等、プライマリ増幅核酸のリードシーケンスとセカンダリ増幅核酸上の対応する認識シーケンスとの間の相互作用とともに、プライマリ増幅核酸を通じてターゲットと関連できる。例えば、セカンダリ増幅核酸上の認識シーケンスは、プライマリ増幅核酸上のリードシーケンスを認識できるが、他の非ターゲットリードシーケンスを実質的に認識またはこれと結合できない。セカンダリ増幅核酸は、用途によって例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ及び／またはＰＮＡ等の核酸と交雑できるいずれかの種類の物体を有してもよい。例えば、このような物体は、認識シーケンスの一部または全部を形成してもよい。

ある場合において、セカンダリ増幅核酸上の認識シーケンスは、プライマリ増幅核酸上のリードシーケンスに実質的に相補的であってもよい。ある場合において、シーケンスは、少なくともなくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％において相補的であってもよい。

ある場合において、セカンダリ増幅核酸上の認識シーケンスは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００また少なくとも４５０ヌクレオチドの長さを有してもよい。ある場合において、認識シーケンスは、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１７５以下、１５０以下、１２５以下、１００以下、７５以下、６０以下、６５以下、６０以下、５５以下、５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２０以下、または１０以下のヌクレオチドの長さを有してもよい。これらのいずれかの組み合わせが可能であって、例えば、認識シーケンスは１０から３０ヌクレオチド、２０から４０ヌクレオチド、５から５０ヌクレオチド、１０から２００ヌクレオチド、または２５から３５ヌクレオチド、１０から３００ヌクレオチド等の長さを有してもよい。

ある実施の形態において、セカンダリ増幅核酸は、下記で説明されるようにシグナリング物体に結合できる１つまたは複数のリードシーケンスを有してもよい。例えば、セカンダリ増幅核酸は、シグナリング物体に結合できる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６以上、２０以上、２４以上、３２以上、４０以上、５０以上、６４以上、７５以上、１００以上、１２８以上のリードシーケンスを有してもよい。リードシーケンスは、セカンダリ増幅核酸においていずれかの位置において配置されてもよい。１つより多くのリードシーケンスが存在すると、リードシーケンスは、互いに隣り合って配置されてもよく、及び／または他のシーケンスと散在してもよい。１つの実施の形態において、セカンダリ増幅核酸は、第１端に認識シーケンスを有し、第２端に複数のリードシーケンスを有する。この構造は、プライマリ増幅核酸の構造と同じまたは異なってもよい。

ある場合において、セカンダリ増幅核酸におけるリードシーケンスは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００また少なくとも４５０ヌクレオチドの長さを有してもよい。ある場合において、リードシーケンスは、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１７５以下、１５０以下、１２５以下、１００以下、７５以下、６０以下、６５以下、６０以下、５５以下、５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２０以下、または１０以下のヌクレオチドの長さを有してもよい。これらのいずれかの組み合わせが可能であって、例えば、セカンダリ増幅核酸におけるリードシーケンスは１０から２０ヌクレオチド、１０から３０ヌクレオチド、２０から４０ヌクレオチド、５から５０ヌクレオチド、１０から２００ヌクレオチド、または２５から３５ヌクレオチド、１０から３００ヌクレオチド等の長さを有してもよい。

セカンダリ増幅核酸において、いずれかの数のリードシーケンスがあってもよい。例えば、セカンダリ増幅核酸において、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０またはこれ以上のリードシーケンスがあってもよい。セカンダリ増幅核酸において、１つより多くのリードシーケンスがあると、リードシーケンスは同じまたは異なってもよい。ある場合において、例えば、リードシーケンスは全て同一であってもよい。加えて、プライマリ増幅核酸とセカンダリ増幅核酸とにおいて、同じまたは異なった数のリードシーケンスがあってもよい。

ある実施の形態において、セカンダリ増幅核酸の人口は、特定の実施の形態において、例えば、全ての「Ｇ」または全ての「Ｃ」を除く等、自然に発生するヌクレオチド塩基の４個のうち２個のみまたは３個のみを使用して形成されてもよい。「Ｇ」または「Ｃ」を有しないシーケンスは、特定の実施の形態において、極めて小さいセカンダリ構造を形成してもよく、より均一な、より高速なハイブリダイゼーションに貢献できる。したがって、ある場合において、セカンダリ増幅核酸は、Ａ、Ｔ及びＧのみ、Ａ、Ｔ及びＣのみ、Ａ、Ｃ及びＧのみ、またはＴ、Ｃ、及びＧのみを含んでもよい。

ある場合において、１つより多くのタイプのセカンダリ増幅核酸が、例えば、順次にまたは同時にサンプルに適用されてもよい。例えば、例えば、サンプルに適用される少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１０００、少なくとも３０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも３０，０００つの区別可能なセカンダリ増幅核酸が存在してもよい。ある場合において、セカンダリ増幅核酸は順次追加されてもよい。しかしながら、ある場合において、１つより多くのセカンダリ増幅核酸は同時に追加されてもよい。

加えて、特定の実施の形態において、上述と同様に、このパターンは、例えば、第３増幅核酸、第４増幅核酸等を用いて、シグナリング物体の前で繰り返されてもよい。シグナリング物体は、よって、終了増幅核酸に結合されてもよい。したがって、非限定的な例示として、ターゲットはエンコーディング核酸プローブに結合され、エンコーディング核酸プローブにはプライマリ増幅核酸が結合され、プライマリ増幅核酸にはセカンダリ増幅核酸が結合され、セカンダリ増幅核酸には第３増幅核酸が結合され、第３増幅核酸にはシグナリング物体が結合され、または、ターゲットはエンコーディング核酸プローブに結合され、エンコーディング核酸プローブにはプライマリ増幅核酸が結合され、プライマリ増幅核酸にはセカンダリ増幅核酸が結合され、セカンダリ増幅核酸には第３増幅核酸が結合され、第３増幅核酸には第４増幅核酸が結合され、第４増幅核酸にはシグナリング物体が結合されてもよい。したがって、終了増幅核酸は、全ての実施の形態において、必ずセカンダリ増幅核酸でなくてもよい。

他の部品も、核酸プローブまたは増幅核酸内に存在してもよい。例えば、１つのセットの実施の形態において、酵素増幅を容易にするように１つまたは複数のプライマーシーケンスが存在してもよい。当業者は、（例えば、ＰＣＲまたは他の適切な技術を用いて）増幅等の用途のために適切なプライマーシーケンスがあると認識する。多くのプライマーシーケンスは、商業的に入手可能である。プライマリ核酸プローブ内に存在し得るシーケンスの他の例示は、プロモータシーケンス、オペロン、識別シーケンス、ナンセンスシーケンス等を含むが、これに限定されない。

通常、プライマーは、一本鎖または部分的な二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）であって、核酸合成のための始点として機能して、核酸ポリメラーゼ等のポリメラーゼ酵素がプライマーを延ばして、相補的な鎖を複製できる。プライマーは、ターゲット核酸に相補的であるように、及びターゲット核酸に交雑するようになっている（例えば、そのように設計されている）。ある実施の形態において、プライマーは合成プライマーである。ある実施の形態において、プライマーは、自然に発生しないプライマーである。プライマーは、通常、１０から５０ヌクレオチドの長さ有する。例えば、プライマーは、１０から４０ヌクレオチド、１０から３０ヌクレオチド、１０から２０ヌクレオチド、２５から５０ヌクレオチド、１５から４０ヌクレオチド、１５から３０ヌクレオチド、２０から５０ヌクレオチド、２０から４０ヌクレオチド、または２０から３０ヌクレオチド等の長さを有してもよい。ある実施の形態において、プライマーは、１８から２４ヌクレオチドの長さを有する。

ある実施の形態において、１つまたは複数のシグナリング物体は、セカンダリ増幅核酸（または他の終了増幅核酸）の上の認識物体に結合されてもよい。シグナリング物体の非限定的な例示は、例えば、下記で説明されるように、蛍光物体（蛍光物質）または蓄光物体を含む。シグナリング物体は、例えば、核酸プローブまたはターゲットを特定するように特定されてもよい。ある場合において、特定は、例えば、２または３次元において空間的であってもよい。加えて、ある場合において、特定は定量的であってもよく、例えば、シグナリング物体及び／またはターゲットの量または濃度が特定されてもよい。

１つの実施の形態のセットにおいて、シグナリング物体は、セカンダリ増幅核酸（または他の終了増幅核酸）に接続されてもよい。シグナリング物体は、サンプルにおけるターゲットにセカンダリ増幅核酸が関連する前または後で、セカンダリ増幅核酸（または他の終了核酸）に接続されてもよい。例えば、シグナリング物体は、初期段階において、またはセカンダリ増幅核酸がサンプルに適用された後に、セカンダリ増幅核酸に接続されてもよい。ある場合において、シグナリング物体は、増幅核酸に追加され、その後それに接続するように反応する。

１つのセットの実施の形態において、シグナリング物体は、シグナリング物体を開放するように切断されてもよい結合を通じてヌクレオチドシーケンスに接続されてもよい。例えば、

サンプルにおける核酸プローブの分布を特定するように、シグナリング物体は核酸プローブ及び／または増幅核酸の他のラウンド（round）の前に開放または無効化されてもよい。したがって、ある実施の形態において、結合は、例えば、ジスルフィド結合または光切断可能な結合等の切断可能な結合であってもよい。光切断可能な結合の例示は、本明細書にて説明される。ある場合において、このような結合は、例えば、還元剤または光（例えば、紫外線）に対する露出によって、切断されてもよい。より詳細な説明のためには下記を参照する。シグナリング物体を無効化及び／または除去するシステム及び方法の他の例示は、本明細書にてより詳細に説明される。

特定の実施の形態において、プライマリ及びセカンダリ増幅核酸の使用は、特定の核酸プローブに結合できるシグナリング物体の最大数があることを示唆する。例えば、有限のプライマリ増幅核酸に結合できるセカンダリ増幅核酸の最大数によって、及び／または核酸プローブ上の有限の数のリードシーケンスに結合できるプライマリ増幅核酸の最大数によって、核酸プローブに結合できるプライマリ増幅核酸の最大数があってもよい。それぞれの可能な位置が、シグナリング物体によって満たされなくてもよい一方で、この構造は、シグナリング物体の飽和限界があることを示唆し、それを超えて存在する追加のシグナリング物体は、核酸プローブまたはそのターゲットに関連できない。

したがって、開示の特定の実施の形態は、一般的に、飽和可能な核酸プローブまたはターゲットを示す、即ち、核酸プローブまたはターゲットに関連できるシグナリング物体の数の飽和上限があることを示すシグナルを増幅するシステム及び方法に一般的に関する。通常、その数は１より大きい。例えば、シグナリング物体の上限は少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００等であってもよい。ある場合においては、上限は、５００未満、４００未満、３００未満、２５０未満、２００未満、１７５未満、１５０未満、１２５未満、１００未満、７５未満、５０未満、４０未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、５未満等であってもよい。ある場合において、上限は、セカンダリ増幅核酸に結合できるシグナリング物体の最大数に、プライマリ増幅核酸に結合できるセカンダリ増幅核酸の最大数をかけて、ターゲットに結合する核酸プローブに結合できるプライマリ増幅核酸の最大数をかけたものとして特定されてもよい。対照的に、ローリングサークル増幅またはヘアピンアンフォールディング（hairpin unfolding）等の技術は、制御できない方法においてシグナルの増幅を可能にして、即ち、充分な試薬が存在すると、増幅は、既定の終点または飽和限界なく継続できる。したがって、このような技術は、核酸プローブまたはターゲットに関連できるシグナリング物体の数において、理論上の上限はない。

しかしながら、核酸プローブまたはターゲットに実際に結合されるシグナリング物体の平均数は、上限と同じである必要がなく、即ち、シグナリング物体は、（それにあってもよいが）完全な飽和になくてもよい。例えば、飽和の量（または、結合できる最大数に対して、結合されたシグナリング物体の数）は、97％未満、95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満など、および／または、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％等であってもよい。ある場合において、結合が発生するためにより多くの時間を設けることで、及び／または試薬の濃度を増加させることで、飽和の量を増加させてもよい。

核酸プローブまたはターゲットに実際に結合されたシグナリング物体の数の可能な上限によって、サンプルにおいて、例えば、空間的に分布された結合事実は、上述のような制御されていない増幅と比較して、実質的に一様な大きさ及び／または輝度を示してもよい。例えば、プライマリ増幅核酸に結合できるセカンダリ増幅核酸の特定の数によって、セカンダリ増幅核酸は、核酸プローブまたはターゲットから固定された距離より大きい距離において発見されず、これは、結合を示す「スポットサイズ」またはシグナリング物体からの蛍光の直径を制限し得る。

特定の実施の形態において、結合事実の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、実質的に同じ輝度、大きさ（例えば、見かけ上の直径）、色等を示してもよく、よって、非特定的な結合、ノイズ等の他の事実から結合事実が区別しやすくなる。

加えて、前述のように、開示の特定の態様は、様々な結合事実をコード化するコードスペースを使用し、選択的に、ターゲットへの核酸プローブの結合を特定するようにエラー検出及び／または修正を使用してもよい。ある場合において、核酸プローブの人口は、特定の「リードシーケンス」を含んでもよく、上述のように、特定の増幅核酸を結合できて、例えば、本明細書にて説明するように、特定のコードスペース内において、増幅核酸に関連するシグナリング物体を用いて、核酸プローブまたはターゲットの位置をサンプルにおいて特定できる。本明細書にて参照によってその全体が含まれるＷＯ２０１６／０１８９６０及びＷＯ２０１６／０１８９６３を参照する。上述のように、ある場合において、核酸プローブにおけるリードシーケンスの人口は、様々な組み合わせにおいて組み合わせされてもよく、よって、例えば、比較的小さい数のリードシーケンスは、本明細書にて説明するように、比較的大きい数の異なる核酸プローブを特定するように使用されてもよい。

したがって、ある場合において、核酸プローブの人口は、それぞれリードシーケンスの特定数を収容してもよく、異なる核酸プローブの間で共有され、よって核酸プローブの全人口は特定のリードシーケンスを収容してもよい。核酸プローブの人口は、いずれかの適切な数のリードシーケンスを有してもよい。例えば、核酸プローブの人口は、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０等のリードシーケンスを有してもよい。ある実施の形態において、２０より多くが可能である。加えて、ある場合において、核酸プローブの人口は、合計で、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、２０以上、２４以上、３２以上、４０以上、５０以上、６０以上、６４以上、１００以上、１２８以上の存在する可能なリードシーケンスを有してもよく、一方で、一部または全部のプローブは、本明細書にて説明するように、１つより多くのリードシーケンスをそれぞれ収容してもよい。加えて、ある実施の形態において、核酸プローブの人口は、１００以下、８０以下、６４以下、６０以下、５０以下、４０以下、３２以下、２４以下、２０以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下のリードシーケンスを有してもよい。これらのいずれかの組み合わせが可能であって、例えば、核酸プローブの人口は、合計で１０と１５との間のリードシーケンスを有してもよい。

核酸プローブ内に収容された比較的小さい数のリードシーケンスから、比較的大きい数の核酸プローブを組み合わせ的に識別する手法の非限定的な例示として、それぞれが１つまたは複数のリードシーケンスを有する６つの異なるタイプの核酸プローブの人口において、その人口におけるリードシーケンスの全数は４以下であってもよい。この例において、説明が容易であるように、４つのリードシーケンスが使用されているが、他の実施の形態において、より多くの核酸プローブが実現されてもよく、例えば、５，８，１０，１６，３２等、またはそれより多くのリードシーケンス、または用途に応じて、本明細書にて説明するリードシーケンスのいずれかの他の適切な数を用いてもよいと理解されよう。例えば、核酸プローブのそれぞれが２つの異なるリードシーケンスを収容し、４つのこのようなリードシーケンス（Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ）を使用することによって、６つまでのプローブが別に識別されてもよい。この例示において、核酸プローブ上のリードシーケンスの順番は本質的ではなく、即ち、「ＡＢ」と「ＢＡ」とは、同義のものとして扱われてもよいと認識される（しかしながら、他の実施の形態において、リードシーケンスの順番は本質的であってもよく、「ＡＢ」と「ＢＡ」とは必ずしも同義でなくてもよい）。同様に、核酸プローブの人口において５つのリードシーケンス（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ及びＥ）が使用されると、１０つまでのプローブが別に識別されてもよい（例えば、ＡＢ，ＡＣ，ＡＤ，ＡＥ，ＢＣ，ＢＤ，ＢＥ，ＣＤ，ＣＥ，ＤＥ）。例えば、当業者は、例えば、それぞれのプローブ上にｎリードシーケンスを有する人口におけるｋリードシーケンスにおいて、リードシーケンスの順番が本質的でないと仮定すると、

の異なるプローブが生成されてもよいと理解する。なぜなら、全てのプローブは、同じ数のリードシーケンスを有しなくてもよく、リードシーケンスの全ての組み合わせは、全ての実施の形態において使用されなくてもよく、異なるプローブのこの数より多いまたは少ない数が特定の実施の形態において使用されてもよい。加えて、それぞれのプローブ上のリードシーケンスの数は、ある実施の形態において同一でなくてもよいと理解される。例えば、あるプローブは２リードシーケンスを収容してもよく、他のプローブは、３リードシーケンスを収容してもよい。

ある態様において、サンプルにおけるリードシーケンス及び／または核酸プローブの結合のパターンは、例えば、核酸の誤った識別またはエラーを抑制または防止するようにエラー検出及び／またはエラー修正コードを規定するように使用されてもよい。当業者によって知られているように、「エラー検出コード」は、伝達におけるノイズまたは他の障害によって生じるエラーの検出を可能にするコードであって、「エラー修正コード」は、エラー検出コードと類似であるが、コードは元のデータの再構築をさらに可能にする。したがって、例えば、（シグナリング物体を用いて特定されるように等）結合が示唆されると、位置は、「１」によって識別され、逆に、結合が示唆されていないと、位置は「０」によって識別されてもよい（または、ある場合においては、その逆が成立する）。結合特定の複数ラウンドは、例えば、異なる核酸プローブを使用して、その空間的位置において「コードワード」を形成するように使用されてもよい。「コードワード」は、数字の数値的連鎖であって、それぞれの数字は、結合特定を示す位置を示す。例えば、本明細書にて説明するように、結合特定の３ラウンドは、３数字の長さを有するコードワードを形成するように使用されてもよく、それぞれの数字は１ラウンドの結合を示す。他の長さを有するコードワードは、他の実施の形態において可能である。コードワードのための他の可能な値のスペースは、コードスペースを規定してもよい。

ある実施の形態において、コードワードを、エラー検出及び／または修正の対象としてもよい。例えば、核酸プローブのリードシーケンスまたは結合パターンの特定のセットにおいて、マッチが見つからない場合、マッチがエラーとして識別されてもよいようにコードワードが整理され、選択的にエラー修正は、核酸プローブのための正しいターゲットを特定するようにシーケンスに適用されてもよい。ある場合において、コードワードは、コードワードによってコード化される核酸の全数より少ない「文字」または位置を有してもよく、例えば、それぞれのコードワードは、異なる核酸をコード化する。

このようなエラー検出及び／エラー修正コードは、様々な形式を取ってもよい。このようなコードの種類は、ゴレイコードまたはハミングコード等、通信業界等の他の内容において既に開発されている。１つの実施の形態のセットにおいて、リードシーケンスまたは核酸プローブの結合パターンは、全ての可能な組み合わせが割り当てされていないように、割り当てされる。

例えば、４リードシーケンスが可能であって、核酸プローブが２リードシーケンスを含むと、最大６核酸プローブを識別できるが、使用される核酸プローブの数は６未満であってもよい。同様に、それぞれの核酸プローブにおいてｎリードシーケンスを有する人口におけるｋリードシーケンスにおいて、

異なるプローブが生成されてもよく、使用される核酸プローブの数は、

より多くても、少なくてもよい。加えて、エラーを検出及び／または修正する能力を向上させるように、これらはランダムにまたは特定の方法で割り当てられてもよい。

他の例示として、核酸プローブの複数のラウンドが使用されると、任意のラウンド数が選択されてもよい。それぞれのラウンドにおいて、それぞれのターゲットは、例えば、検出されるまたはされない等の２つの可能な結果をもたらすことができ、ｎラウンドのプローブにおいては、最大２ｎの異なるターゲットが可能であるが、実際に使用されるターゲットの数は２ｎより小さいいずれかの数であってもよい。例えば、異なるカラーチャネルにおいて検出される等、それぞれのラウンドにおいて、それぞれのターゲットは２つより多くの可能な結果をもたらすことができると、２ｎ（例えば、３ｎ、４ｎ．．．）の異なるターゲットが、ｎラウンドのプローブにとって可能である。ある場合において、実際に使用されるターゲットの数は、これより小さいいずれかの数であってもよい。加えて、これらは、エラーを検出及び／または修正する能力を増加させるように、ランダムにまたは特定の方法において割り当てられる。

コードワードは、様々なコードスペースを定義するように使用されてもよい。例えば、１つの実施の形態のセットにおいて、コードワードまたは核酸プローブは、割り当てがハミング距離によって分離されるようにコードスペース内に割り当てられ、ハミング距離は、核酸プローブが異なる有効な核酸プローブとして誤って解釈されることをもたらす特定のパターンにおいて不正確な「リード」の数を測定する。特定の場合において、ハミング距離は少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６等であってもよい。加えて、１つの実施の形態のセットにおいて、割り当てはハミングコードとして形成されてもよく、例えば、ハミング（７，４）コード、ハミング（１５，１１）コード、ハミング（３１，２６）コード、ハミング（６３，５７）コード、ハミング（１２７，１２０）コード等として形成されてもよい。他の実施の形態のセットにおいて、割り当てはＳＥＣＤＥＤコード、例えば、ＳＥＣＤＥＤコード（８，４）コード、ＳＥＣＤＥＤ（１６，４）コード、ＳＣＥＤＥＤ（１６，１１）コード、ＳＣＥＤＥＤ（２２，１６）コード、ＳＣＥＤＥＤ（３９，３２）コード、ＳＣＥＤＥＤ（７２，６４）コード等を形成してもよい。さらに他の実施の形態のセットにおいて、割り当ては、延長されたバイナリゴレイコード、完全バイナリゴレイコード、または三進ゴレイコードを形成してもよい。他の実施の形態のセットにおいて、割り当ては上述のコードのいずれかから取得された可能な値のサブセットを示してもよい。

例えば、エラー修正コードは、ターゲットをコード化するように固定または一定の「１」のビット（または「０」のビット）を含むようにバイナリワードのみを使用して形成されてもよい。例えば、コードスペースは、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６等の「１」ビット（または「０」ビット）のみを含んでもよく、例えば、全てのコードは、「１」ビットまたは「０」ビットの同じ数を有する。他の実施の形態のセットにおいて、割り当ては、非対称なリードアウトエラーに対処する目的において上述のコードから取得された可能な値のサブセットであることを示してもよい。例えば、ある場合において、使用されるバイナリワードの全てにおいて、「１」ビットの数が固定されてもよいコードは、「０」ビットが「１」として測定される速度と、「１」ビットが「０」として測定される速度が異なると、異なる数の「１」を有するワードのバイアス測定を排除してもよい。

対応して、ある実施の形態において、（例えば、本明細書にて説明するように）コードワードが特定されると、コードワードは、知られている核酸コードワードと比較されてもよい。マッチが見つかると、核酸ターゲットは識別または特定されてもよい。マッチが見つかないと、コードワードのリードにおけるエラーが識別されてもよい。ある場合において、エラー修正は、正しいコードワードを特定するように適用されてもよく、核酸ターゲットの正しい識別をもたらす。ある場合において、コードワードは、１つのみのエラーがあると仮定して、１つのみの正しいコードワーが可能であり、したがって、核酸ターゲットの１つのみの正しい識別が可能であるように選択されてもよい。ある場合において、これは、より大きいコードワードスペーシングまたはハミング距離に一般化されてもよい。例えば、コードワードは、２つ、３つまたは４つのエラー（または、ある場合においてはより多く）が存在すると、１つのみが正しいコードワードが可能であって、したがって、核酸ターゲットの１つのみの正しい識別が可能であるように選択されてもよい。

エラー修正コードは、バイナリエラー修正コードであってもよく、または他の数値化システム、例えば、三進または四進エラー修正コード等に基づいてもよい。例えば、ある実施の形態のセットにおいて、１つより多くのタイプのシグナリング物体が使用されてもよく、エラー修正コード内の異なる数に割り当てられる。したがって、非限定的な例示として、第１シグナリング物体（または、ある場合においては１つより多くのシグナリング物体）は「１」として割り当てられ、第２シグナリング物体（ある場合において１つより多くのシグナリング物体）は「２」として割り当てられてもよく（「０」はシグナリング物体が存在しないことを示し）、コードワードは三進エラー修正コードを定義するように分布される。同様に、第３シグナリング物体は、四進エラー修正コード等を形成するように、「３」として追加的に割り当てられてもよい。

本明細書にて説明するように、特定の態様において、シグナリング物体は、例えば、核酸プローブを特定するように及び／またはコードワードを形成するように、例えば、イメージングによって特定される。シグナリング物体の例示は、本明細書にて説明するものを含む。ある場合において、サンプルにおけるシグナリング物体は、例えば、空間的に、様々な技術を用いて、特定されてもよい。ある実施の形態において、シグナリング物体は、蛍光であってもよく、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡等のサンプルにおける蛍光を特定するための技術は、細胞におけるシグナリング物体の位置を空間的に識別するために使用されてもよい。ある場合において、サンプルにおける物体の位置は２または３次元に特定されてもよい。加えて、ある実施の形態において、１つより多くのシグナリング物体（例えば、異なる色または発振を有するシグナリング物体）は、ある時間において及び／または順次に特定してもよい。

加えて、ある実施の形態において、識別されたターゲット（例えば、核酸ターゲット）のための信頼レベルは、特定されてもよい。例えば、信頼レベルは、完全なマッチと、１つまたは複数の１ビットエラーを有するマッチの数との比を用いて特定してもよい。ある場合において、特定の値より大きい信頼比を有するマッチのみは、使用されてもよい。例えば、特定の実施の形態において、マッチのために信頼比が、略０．０１より大きい、略０．０３より大きい、略０．０５より大きい、略０．１より大きい、略０．３より大きい、略０．５より大きい、略１より大きい、略３より大きい、略５より大きい、略１０より大きい、略３０より大きい、略５０より大きい、略１００より大きい、略３００より大きい、略５００より大きい、略１０００より大きい、またはその他の任意の適切な値であるときのみ、マッチが受け入れられる。加えて、ある実施の形態において、マッチは、識別されたターゲットのための信頼比は、内部標準または偽陽性対象より略０．０１、略０．０３、略０．０５、略０．１、略０．３、略０．５、略１、略３、略５、略１０、略３０、略５０、略１００、略３００、略５００、略１０００、または他の任意の適切な値より大きいときのみ、マッチが受け入れられる。

ある実施の形態において、物体の空間的位置（及びよって、その物体が関連してもよい核酸プローブ）は、比較的高い解像度において特定されてもよい。例えば、位置は、略１００マイクロメータより良好、略３０マイクロメータより良好、略１０マイクロメータより良好、略３マイクロメータより良好、略１マイクロメータより良好、略８００ｎｍより良好、略６００ｎｍより良好、略５００ｎｍより良好、略４００ｎｍより良好、略３００ｎｍより良好、略２００ｎｍより良好、略１００ｎｍより良好、略９０ｎｍより良好、略８０ｎｍより良好、略７０ｎｍより良好、略６０ｎｍより良好、略５０ｎｍより良好、略４０ｎｍより良好、略３０ｎｍより良好、略２０ｎｍより良好、又は略１０ｎｍより良好等の空間解像度において特定されてもよい。

例えば、蛍光顕微鏡を用いて、物体の空間的位置を光学的に特定または撮像することができる様々な技術がある。ある実施の形態において、１つより多くの色が使用されてもよい。ある場合において、空間的位置は超解像、または光の波長または回折限界より良好な解像度において特定されてもよい。非限定的例示は、ＳＴＯＲＭ（確率的光学再構築顕微鏡）、ＳＴＥＤ（誘導放出抑制顕微鏡法）、ＮＳＯＭ（走査型近接場光顕微鏡）、４Ｐｉ顕微鏡、ＳＩＭ（構造化照明顕微鏡）、ＳＭＩ（空間変調照明）顕微鏡、ＲＥＳＯＬＦＴ（可逆飽和可能光学線形蛍光遷移顕微鏡（Reversible Saturable Optically Linear Fluorescence Transition Microscopy））、ＧＳＤ（グラウンド状態枯渇顕微鏡（Ground State Depletion Microscopy））、ＳＳＩＭ（飽和構造化照明顕微鏡）、ＳＰＤＭ（スペクトラム精密距離顕微鏡（Spectral Precision Distance Microscopy））、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、蛍光光活性化局在性顕微鏡法（ＦＰＡＬＭ）、ＬＩＭＯＮ（３Ｄ光顕微鏡ナノサイズ顕微鏡（3D Light Microscopical Nanosizing Microscopy））、超解像光学変動イメージング（ＳＯＦＩ）等を含む。Ｚｈｕａｎｇ及びその他による２０１０年１１月２３日に発行され、「回折限界以下の画像解像度と他のイメージング技術」と題する米国特許第７，８３８，３０２号、Ｚｈｕａｎｇ及びその他による２０１３年１０月２２日に発行され、「３次元における回折限界以下の画像解像度」と題する米国特許第８，５６４，７９２号、またはＺｈｕａｎｇ及びその他による２０１３年６月２０日に公開され、「高解像度デュアル対象物顕微鏡」と題する国際出願公開第２０１３／０９０３６０号を参照し、それぞれの出願は、参照によってその全体において本明細書に含まれる。

例示的及び非限定的な例示として、１つの実施の形態のセットにおいて、サンプルは、高い開口度、１００倍の拡大機能を有し、光を電子増倍型ＣＣＤカメラ上に収集する油浸対象物レンズによって撮像されてもよい。他の例示において、サンプルは、高い開口度、４０倍の拡大機能を有し、光をワイドフィールド科学的（scientific）ＣＭＯＳカメラに収集する油浸対象物レンズによって撮像されてもよい。対象物レンズ及びカメラの異なる組み合わせによって、様々な非限定的な実施の形態において、単一の視野は４０×４０ミクロン、８０×８０ミクロン、１２０×１２０ミクロン、２４０×２４０ミクロン、３４０×３４０ミクロン、または５００×５００ミクロン等以上に対応してもよい。同様に、単一のカメラピクセルは、ある実施の形態において、８０×８０ｎｍ、１２０×１２０ｎｍ、１６０×１６０ｎｍ、２４０×２４０ｎｍ、または３００×３００ｎｍ等以上のサンプルの領域に対応してもよい。他の例示において、サンプルは低い開口度を有する１０倍の拡大機能を有し、光をｓＣＭＯＳカメラによって収集するエアレンズによって撮像されてもよい。追加の実施の形態において、サンプルは、スキャンミラーまたは回転ディスクによって生成される単一または複数のスキャン回折限界焦点を通じて照射して光学的に分割されてもよく、収集されたものは単一または複数のピンホールを通過する。他の実施の形態において、サンプルは、当業者によって知られている複数の方法のいずれか１つを通じて生成される光の薄いシートを通じて照射されてもよい。

ある実施の形態において、サンプルは、単一ガウスモードレーザラインによって照射されてもよい。ある実施の形態において、照射プロファイルは、圧電素子または他の機械的手段によって振動するマルチモードファイバを通じてこれらのレーザラインを通過させることによって平坦化されてもよい。ある実施の形態において、照射プロファイルは、単一モード、ガウスビームを、ｐｉＳｈａｐｅｒまたはスタックされたパウエル（Powell）レンズのシリーズ等の屈折ビームシェーパを通過させることによって平坦化されてもよい。さらに他の実施の形態のセットにおいて、ガウスビームは、様々な異なる拡散要素、例えば、すりガラスまたは設計された拡散板（engineered diffusers）を通過してもよく、すりガラスまたは設計された拡散板は、残留レーザスペックルを除去するようにある場合において高い速度で回転されてもよい。さらに他の実施の形態において、レーザ照射は、平坦な照射フィールドを近似する照射の重なった画像を生成するように、小型レンズアレーのシリーズを通過してもよい。

ある実施の形態において、物体の空間的位置の重心は、特定されてもよい。例えば、シグナリング物体の重心は、当業者によって知られている画像分析アルゴリズムを用いて、画像または画像のシリーズ内で特定されてもよい。ある場合において、アルゴリズムは、サンプルにおける重ならない単一発振器及び／または部分的に重なる単一発振器を特定するように選択されてもよい。適切な技術の非限定的な例示は、最尤アルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、ベイズアルゴリズム、圧縮センシングアルゴリズム等を含む。これらの技術の組み合わせもある場合において使用されてもよい。

加えて、シグナリング物体はある場合において、無効化されてもよい。例えば、ある実施の形態において、（例えば、増幅核酸を用いて）シグナリング物体に関連できる第１セカンダリ核酸プローブは、（例えば、核酸プローブ上の）第１リードシーケンスを認識できるサンプルに適用され、シグナリング物体は、（例えば、増幅核酸を用いて）シグナリング物体に関連できる第２セカンダリ核酸プローブがサンプルに適用される前に無効化されてもよい。複数のシグナリング物体が使用されると、シグナリング物体を無効化するために同じまたは異なる技術が使用されてもよく、複数のシグナリング物体の一部または全部が、例えば、順次にまたは同時に無効化されてもよい。

無効化は、（例えば、サンプルまたは核酸プローブ等からの）シグナリング物体の除去によって、または（例えば、シグナリング物体を光漂白すること、漂白すること、例えば、還元によってシグナリング物体の構造を化学的に変更することによって）ある方法でシグナリング物体を化学的に変更することによって、発生させることができる。例えば、１つの実施の形態のセットにおいて、蛍光シグナリング物体は、酸化、光漂白、化学的に漂白、厳しい洗浄または酵素の消化または酵素に対する露出による反応、他の要素（例えば、プローブ）からシグナリング物体を分離すること、（例えば、シグナリング物体の構造を変更できる反応物質との）シグナリング物体の化学反応等によって、化学的または光学的手法で無効化されてもよい。例えば、漂白は酸素、還元剤への露出によって生じてもよく、またはシグナリング物体は、核酸プローブから化学的に切断されてもよく、流体流れを通じて洗い流されてもよい。

ある実施の形態において、様々な核酸プローブは、例えば、本明細書にて説明する増幅核酸を用いて、１つまたは複数のシグナリング物体と関連してもよい。１つより多くの核酸プローブが使用されると、シグナリング物体は、それぞれ同一であってもよくまたは異なってもよい。特定の実施の形態において、シグナリング物体は、光を発振できるいずれかの物体である。例えば、ある実施の形態において、シグナリング物体は、蛍光性を有する。他の実施の形態において、シグナリング物体は、蓄光性、放射性、吸収性等を有してもよい。ある場合において、シグナリング物体は、例えば、可視光の波長または回折限界より良い解像度等、比較的高い解像度においてサンプル内で特定できるいずれかの物体である。シグナリング物体は、例えば、染料、小さい分子、ペプチドまたはタンパク質等であってもよい。シグナリング物体は、ある場合において単一の分子であってもよい。複数のセカンダリ核酸プローブが使用されると、核酸プローブは、同一または異なるシグナリング物体と関連してもよい。

シグナリング物体の非限定的な例示は、蛍光物体（蛍光物質）または蓄光物体を含み、例えば、シアニン系色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等)、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ａｔｔｏ色素、光スイッチング色素、光活性化色素、蛍光色素、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子または「量子ドット」、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等の蛍光蛋白質、またはＰＡＧＦＰ、ＰＳＣＦＰ、ＰＳＣＦＰ２、Ｄｅｎｄｒａ、Ｄｅｎｄｒａ２、ＥｏｓＦＰ、ｔｄＥｏｓ、ｍＥｏｓ2、ｍＥｏｓ３、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ、ＰＡｔａｇＲＦＰ、ｍＭａｐｌｅ、ｍＭａｐｌｅ２、およびｍＭａｐｌｅ３などの光活性化蛍光性タンパク質を含む。他の適切なシグナリング物体は、当業者によって知られている。米国特許第７，８３８，３０２号または国際特許出願公開第２０１５／１６０６９０号を参照し、それぞれは、参照によってその全体において本明細書に含まれる。

ある実施の形態のセットにおいて、シグナリング物体は、シグナリング物体を放出するように切断できる結合を通じオリゴヌクレオチドのシーケンスに接続されてもよい。１つの実施の形態のセットにおいて、蛍光物質は、光切断可能な結合等の切断可能な結合を通じてオリゴヌクレオチドに抱合されてもよい。光切断可能な結合の非限定的な例示は、１－（２－ニトロフェニル）エチル、２－ニトロベンジル、ビオチンホスホラミダイト、アクリルホスホラミダイト、ジエチルアミノクマリン、１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル、シクロドデシル（ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル、４－アミノメチル－３－ニトロベンジル、（４－ニトロ－３－（１－クロロカルボニルオキシエチル）フェニル）メチル－Ｓ－アセチルチオ酸エステル、（４－ニトロ－３－（１－クロロカルボニルオキシエチル）フェニル）メチル－３－２－ピリジルジチオプロピオン酸）エステル、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１、３－ジオール－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－トリフルオロアセチルカプロアミドメチル）フェニル］－エチル－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ブチラミドメチル）フェニル］－エチル－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－（Ｎ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ビオチンアミドカプローアミド－メチル）フェニル］－エチル－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］-ホスホラミダイト、または同様のリンカーを含むが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドのシーケンスは、例えば、本明細書にて説明するプライマリまたはセカンダリ（または他の）増幅核酸であってもよい。

他の実施の形態のセットにおいて、蛍光物質は、ジスルフィド結合を通じてオリゴヌクレオチドに抱合されてもよい。ジスルフィド結合は、様々な還元剤によって切断されてもよく、還元剤は、例えば、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、β－メルカプトエタノール、水素化ホウ素ナトリウム、チオレドキシン、グルタレドキシン、トリプシノーゲン、ヒドラジン、水素化ジイソブチルアルミニウム、シュウ酸、ギ酸、アスコルビン酸、リン酸、塩化スズ、グルタチオン、チオグリコレート、２，３－ジメルカプトプロパノール、２－メルカプトエチルアミン、２－アミノエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、ビス（２－メルカプトエチル）スルホン、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－Ｎ，Ｎ’－ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン、３－メルカプトプロピオン酸、ジメチルホルムアミド、チオプロジルアガロース、トリ－ｎ－ブチルホスフィン、システイン、硫酸鉄、亜硫酸ナトリウム、ホスファイト、ハイポファイト、ホスホロチオエート等、及び／またはこれらのいずれかの組み合わせであってもよいがこれらに限定されない。オリゴヌクレオチドのシーケンスは、例えば、本明細書にて説明したプライマリまたはセカンダリ（または他の）増幅核酸であってもよい。

他の実施の形態において、蛍光物質は、１つまたは複数のホスホロチオエート改造ヌクレオチドを通じて、オリゴヌクレオチドに抱合されてもよく、ホスホロチオエート改造ヌクレオチドにおいて、硫黄改造は架橋及び／または非架橋酸素を置き換える。蛍光物質は、特定の実施の形態において、ヨードエタノール、ヨウ素をエタノールに混ぜたもの、硝酸銀、塩化水銀等を含むがこれらに限定されない化合物の追加によって、オリゴヌクレオチドから切断されてもよい。他の実施の形態のセットにおいて、シグナリング物体は、還元または酸化によって化学的に無効化されてもよい。例えば、ある実施の形態において、Ｃｙ５またはＣｙ７等の発色団は、水素化ホウ素ナトリウムを用いて安定した非蛍光状態で還元されてもよい。また他の実施の形態において、蛍光物質は、アゾ結合を通じてオリゴヌクレオチドに抱合されてもよく、アゾ結合は２－［（２－Ｎ－アリールアミノ）フェニルアゾ］ピリジンによって切断されてもよい。さらに他の実施の形態において、蛍光物質は、適切な核酸セグメントを通じて、オリゴヌクレオチドに抱合されてもよく、核酸セグメントはエキソデオキシリボヌクレアーゼまたはエンドデオキシリボヌクレアーゼ等のＤＮＡｓｅに対する適切な露出によって切断されてもよい。例示は、デオキシリボヌクレアーゼＩまたはデオキシリボヌクレアーゼＩＩを含むがこれらに限定されない。実施の形態のセットの１つは、切断が制限エンドヌクレアーゼを通じて生じてもよい。適切である可能がある制限エンドヌクレアーゼは、ＢａｍＨＩ，ＢｓｒＩ，ＮｏｔＩ，ＸｍａＩ，ＰｓｐＡＩ，ＤｐｎＩ，ＭｂｏＩ，ＭｎｌＩ，Ｅｃｏ５７Ｉ，Ｋｓｐ６３２Ｉ，ＤｒａＩＩＩ，ＡｈａＩＩ，ＳｍａＩ，ＭｌｕＩ，ＨｐａＩ，ＡｐａＩ，ＢｃｌＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＴａｑＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｃＩ，ＨｉｎｄＩＩ，ＨａｅＩＩ，ＤｒａＩＩ，Ｔｓｐ５０９Ｉ，Ｓａｕ３ＡＩ，ＰａｃＩ，等を含むがこれらに限定されない。３０００より多くの制限酵素が詳細に分析され、これらのうち６００以上は商業的に入手可能である。他の実施の形態のセットにおいて、蛍光物質は、ビオチンに抱合されてもよく、オリゴヌクレオチドはアビジンまたはストレプトアビジンに抱合されてもよい。ビオチンと、アビジンまたはストレプトアビジンとの間の作用は、オリゴヌクレオチドに蛍光物質が抱合されることを可能にして、過剰な追加的なビオチンに対する充分な露出によって、自由なビオチンは、リンケージと「打ち負かすこと」ができ、よって切断が発生することをもたらす。加えて、他の実施の形態のセットにおいて、プローブは、対応する「トーホールド（toe-hold）プローブ」を用いて除去されてもよく、「トーホールドプローブ」は、エンコーディングプローブに対するホモロジーのベースの追加数（例えば、１－２０追加ベース、例えば、５追加ベース）とともに、プローブと同じシーケンスを有してもよい。これらのプローブは、鎖の転置作用を通じて、ラベルされたリードアウトプローブを除去してもよい。オリゴヌクレオチドのシーケンスは、例えば、本明細書にて説明されるプライマリまたはセカンダリ（または他の）増幅核酸であってもよい。

本明細書にて説明されるように、用語「光」は、一般的に、いずれかの適切な波長（または同様に、周波数）を有する電磁放射を意味する。例えば、ある実施の形態において、光は、（例えば、略４００ｎｍと略７００ｎｍとの間の波長を有する、即ち可視光の）光学または可視光の範囲における波長、（例えば、略３００μｍと７００ｎｍとの間の波長を有する）赤外線波長、（例えば、略４００ｎｍと１０ｎｍとの間の波長を有する）紫外線波長等を含んでもよい。特定の場合において、上述のように、１つより多くの物体は、即ち、構造的に、化学的に異なるまたは別個である物体が使用されてもよい。しかしながら、他の場合において、物体は、化学的に同一または少なくとも実質的に化学的に同一であってもよい。

実施の形態のセットの１つにおいて、シグナリング物体は、「変更可能（switchable）」であって、即ち、物体は２つ以上の状態の間で変更されてもよく、少なくとも１つの状態は望ましい波長を有する光を発振する。他の状態において、物体は光を発振しなくてもよく、または異なる波長において光を発振してもよい。例えば、物体は、望ましい波長を有する光を生成することができる第１状態に「有効化」され、同じ波長の光を発振できない第２状態に「無効化」される。物体は、適切な波長を有する入射光によって有効化が可能であると、「光有効化可能（photoactivatable）」である。非限定的な例示において、Ｃｙ５は、異なる波長の光によって、制御されて可逆な態様において、蛍光状態と暗い状態との間で変更されてもよく、即ち６３３ｎｍ（または６４２ｎｍ，６４７ｎｍ，６５６ｎｍ）の赤い光は、Ｃｙ５を安定した暗い状態に変更または無効化でき、一方で、４０５ｎｍの緑光は、Ｃｙ５を蛍光状態に戻すように変更または有効化できる。ある場合において、物体は、例えば、適切な刺激にさらされることによって、２つ以上の状態の間で可逆的に変更されてもよい。例えば、第１刺激（例えば、光の第１波長）は、変更可能な物体を有効化するように使用されてもよく、一方で第２刺激（例えば、光の第２波長）は、発振しない状態へ変更可能な物体を無効化するように使用されてもよい。いずれかの適切な方法は物体を有効化するように使用されてもよい。例えば、１つの実施の形態において、適切な波長の入射光は、光を発振するように物体を有効化するように使用されてもよく、即ち、物体は「光変更可能」である。したがって、光変更可能な物体は、例えば、異なる波長の入射光によって、異なる光発振または非発振状態の間で変更されてもよい。光は単色（例えば、レーザによって生成される）または多色であってもよい。他の実施の形態において、物体は、電場及び／または磁場による刺激によって有効化されてもよい。他の実施の形態において、物体は、例えば、ｐＨを調節することによって、または物体に関連する可逆的な化学反応等を誘発することによって等、適切な化学環境に対する露出によって有効化されてもよい。類似して、いずれかの適切な方法は、物体を無効化するように使用されてもよく、物体を有効化及び無効化する方法は同一でなくてもよい。例えば、物体は、適切な波長の入射光に対する露出によって無効化されてもよく、物体は、充分な時間を待つことによって無効化されてもよい。

第１状態における物体が励起波長に対して露出されると、光を発振できる条件を特定して、変更する波長の光に対する露出によって等、物体を第１状態から第２状態に変更して、物体が、第２状態においては、励起波長に対して露出されても光を発振できない（または大きく減少された強度において光を発振する）ことを示すことでよって、通常、「変更可能」な物体は、当業者によって特定されてもよい。

ある実施の形態のセットにおいて、上述のように変更可能な物体は光に対する露出によって変更されてもよい。ある場合において、変更可能な物体を有効化するために使用される光は、例えば、レーザ光源等の光源、変更可能な物体に近い他の光発振物体等の外部光源からきてもよい。第２の光発振物体は、ある場合において、蛍光物体であってもよく、特定の実施の形態において、第２光発振物体自体は交換可能な物体であってもよい。

ある実施の形態において、変更可能な物体は、第１の光発振部分（例えば、蛍光物質）と、第１部分を有効化または「変更」する第２部分とを含む。例えば、光に対する露出によって、変更可能な物体の第２部分は、第１部分を有効化してもよく、第１部分が光を発振することをもたらす。有効化部分の例示は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｙ２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、または他の適切な染料を含むがこれらに限定されない。光発振部分の例示は、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤｉＤ、ＤｉＲ、ＹＯＹＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＹＯ－ＰＲＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＯＴ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＯ－ＰＲＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または他の適切な染料を含むがこれらに限定されない。これらは、例えば、共有結合によって、例えば、直接的にまたはリンカーを通じて互いにリンクされてもよく、Ｃｙ５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ５－Ｃｙ２、Ｃｙ５－Ｃｙ３、Ｃｙ５－Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ５．５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ５．５－Ｃｙ２、Ｃｙ５．５－Ｃｙ３、Ｃｙ５．５－Ｃｙ３.５、Ｃｙ７－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ７－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ７－Ｃｙ２、Ｃｙ７－Ｃｙ３、Ｃｙ７－Ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ｃｙ３、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ｃｙ３．５等を含むがこれらに限定されない化合物を形成する。当業者は、これら及び他の化合物の構造を認識しており、これらの多くは商業的に入手可能である。部分は、例えば、下記において説明するような共有結合またはリンカーを通じてリンクされてもよい。他の光発振または有効化部分は、ポリメチン連鎖によって結合された２つの四級化された窒素原子を有する部分を含んでもよく、それぞれの窒素は、独立してピロール、イミダゾール、チアゾール、ピリジン、キノイン、インドール、ベンゾチアゾール等の複素芳香族部分の一部または非芳香族アミンの一部である。ある場合において、２つの窒素原子の間に５，６，７，８，９または１０以上の炭素原子があってもよい。

特定の場合において、光発振部分及び有効化部分は、互いから孤立されていると、それぞれ蛍光物質、即ち、例えば、励起波長等の波長によって刺激に露出されると、特定の発振波長の光を発振できる物質であってもよい。しかしながら、第１蛍光物質と第２蛍光物質とを有する変更可能な物体が形成されると、第１蛍光物質は、第１光発振部分を形成し、第２蛍光物質は刺激に応じて、第１部分を有効化または「変更する」有効化部分を形成する。例えば、変更可能な物体は、第２蛍光物質に直接的に結合される第１蛍光物質を有し、または第１及び第２物体はリンカーまたは共通の物体を通じて接続されてもよい。光発振部分と有効化部分との対が適切な変更可能な物体を生成するか否かは、当業者によって知られた方法によって検査されてもよい。例えば、様々な波長を有する光は、対を刺激するために使用されてもよく、光発振部分からの発振光は、対が適切な変更を形成するか否かを特定するように測定されてもよい。

非限定的な例示として、Ｃｙ３とＣｙ５とはこのような物体を形成するように互いに結合されてもよい。この例示において、Ｃｙ３は、光発振部分であるＣｙ５を有効化できる有効化部分である。したがって、物体の有効化または第２部分の吸収の最大値におけるまたはその近くの光（例えば、Ｃｙ３のためには５３２ｎｍ付近の光）は、その部分が第１、光発振部分を有効化することをもたらしてもよく、よって、第１部分が光を発振することをもたらす（例えば、Ｃｙ５においては６４７ｎｍ付近）。米国特許第７，８３８，３０２号を参照し、参照によってその全体が本明細書に含まれる。ある場合において、第１、光発振部分は、その後、いずれかの適切な方法（例えば、分子のＣｙ５部分へ６４７ｎｍの赤い光を向けることによって）無効化されてもよい。

適切である可能性がある有効化部分の他の非限定的な例示は、１，５ＩＡＥＤＡＮＳ、１，８－ＡＮＳ、４－メチルウンベリフェロン、５－カルボキシ－２，７－ジクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、５－カルボキシナプトフルオレセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン（５－ＴＡＭＲＡ）、５－ＦＡＭ（５－カルボキシフルオレセイン）、５－ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５－ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）、５－ＲＯＸ（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、５－ＴＡＭＲＡ（５－カルボキシテトラメチルローダミン）、６－カルボキシローダミン６Ｇ、６－ＣＲ ６Ｇ、６－ＪＯＥ、７－アミノ－４－メチルクマリン、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、 ７－アミノ－４－メチル－クマリン、９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン、ＡＢＱ、酸フクシン、ＡＣＭＡ（９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン）、アクリジンオレンジ、アクリジンレッド、アクリジンイエロー、アクリフラビン、アクリフラビンホイルゲンＳＩＴＳＡ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５，アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ－Ｓ、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、ＡＭＣＡ－Ｘ、アミノアクチノマイシンＤ、アミノクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、アニリンブルー、ステアリン酸アントラシル、ＡＰＴＲＡ－ＢＴＣ、ＡＰＴＳ、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ ＧＬＬ、アタブリン、ＡＴＴＯ ３９０，ＡＴＴＯ ４２５，ＡＴＴＯ ４６５，ＡＴＴＯ ４８８，ＡＴＴＯ ４９５，ＡＴＴＯ ５２０，ＡＴＴＯ ５３２，ＡＴＴＯ ５５０，ＡＴＴＯ ５６５，ＡＴＴＯ ５９０，ＡＴＴＯ ５９４，ＡＴＴＯ ６１０，ＡＴＴＯ ６１１Ｘ，ＡＴＴＯ ６２０，ＡＴＴＯ ６３３，ＡＴＴＯ ６３５，ＡＴＴＯ ６４７，ＡＴＴＯ ６４７Ｎ，ＡＴＴＯ ６５５，ＡＴＴＯ ６８０, ＡＴＴＯ ７００，ＡＴＴＯ ７２５，ＡＴＴＯ ７４０，ＡＴＴＯ－ＴＡＧ ＣＢＱＣＡ，ＡＴＴＯ－ＴＡＧ ＦＱ，オーラミン、オーロホスフィンＧ、オーロホスフィン、ＢＡＯ ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール），ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ），ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）、ベルベリン硫酸塩、ビメーン、ビスベンズアミド、ビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、ビス－ＢＴＣ、ブランコファーＦＦＧ、ブランコファーＳＶ、ＢＯＢＯ－１、ＢＯＢＯ－３、Ｂｏｄｉｐｙ ４９２／５１５、Ｂｏｄｉｐｙ ４９３／５０３、Ｂｏｄｉｐｙ ５００／５１０、Ｂｏｄｉｐｙ ５０５／５１５、Ｂｏｄｉｐｙ ５３０／５５０、Ｂｏｄｉｐｙ ５４２／５６３、Ｂｏｄｉｐｙ ５５８／５６８、Ｂｏｄｉｐｙ ５６４／５７０、Ｂｏｄｉｐｙ ５７６／５８９、Ｂｏｄｉｐｙ ５８１／５９１、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０－Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５－Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ ６６５／６７６、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ、Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ ＡＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ－Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘ抱合、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘ、ＳＥ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ ＡＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ－Ｘ ＳＥ、ＢＯ－ＰＲＯ －１、ＢＯ－ＰＲＯ －３、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、ＢＴＣ、ＢＴＣ－５Ｎ、カルセイン、カルセインブルー、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン１ Ｃａ２＋シキソ、カルシウムグリーン２ Ｃａ２＋、カルシウムグリーン５Ｎ Ｃａ２＋、カルシウムグリーンＣ１８ Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルコフローホワイト、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（５－ＲＯＸ）、カスケードブルー、カスケードイエロー、カテコラミン、ＣＣＦ２（ジーンブレイザー）、ＣＦＤＡ、クロモマイシンＡ、クロモマイシンＡ、ＣＬ－ＮＥＲＦ、ＣＭＦＤＡ、クマリンファロイジン、ＣＰＭメチルクマリン、ＣＴＣ、ＣＴＣフォーマザンＣｙ２、Ｃｙ３．１ ８、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３、Ｃｙ５．１ ８、サイクリックＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）、ダブシル、ダンシル、ダンシルアミン、ダンシルカダベリン、塩化ダンシル、ダンシルＤＨＰＥ、フッ化ダンシル、ＤＡＰＩ、ダポキシル、ダポキシル２、ダポキシル３’ＤＣＦＤＡ、ＤＣＦＨ（ジクロロジフルオレセインジアセテート）、ＤＤＡＯ、ＤＨＲ（ジヒドロホダミン１２３）、Ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＳ（比なし）、ＤｉＡ （４－Ｄｉ－１６－ＡＳＰ）、ジクロロジフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ）、ＤｉＤ親油性トレーサ、ＤｉＤ （ＤｉＩＣ１８（５））、ＤＩＤＳ、ジヒドロホダミン１２３（ＤＨＲ）、ＤｉＩ （ＤｉＩＣ１８（３））、ジニトロフェノール、ＤｉＯ （ＤｉＯＣ１８（３））、ＤｉＲ、ＤｉＲ （ＤｉＩＣ１８（７））、ＤＭ－ＮＥＲＦ（高ｐＨ）、ＤＮＰ、ドーパミン、ＤＴＡＦ、ＤＹ－６３０－ＮＨＳ、ＤＹ－６３５－ＮＨＳ、ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００、ＥＬＦ ９７、エオシン、エリスロシン、エリスロシンＩＴＣ、エチジウムブロマイド、エチジウムホモダイマー－１（ＥｔｈＤ－１）、ユークリシン、ユーコーライト、塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）、ファストブルー、ＦＤＡ、フォイゲン（パラロサニリン）、ＦＩＦ（ホルマール誘導蛍光）、ＦＩＴＣ、フラゾオレンジ、フルオ－３、フルオ－４、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フルオレセインジアセテート、フルオロエメラルド、フルオロゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）、フルオロルビー、フルオロＸ、ＦＭ １－４３、ＦＭ ４－４６、フーラレッド（高ｐＨ）、フーラレッド／フルオ－３、フーラ２、フーラ２／ＢＣＥＣＦ、ジェナクリルブリリアントレッドＢ、ジェナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ジェナクリルピンク３Ｇ、ジェナクリルイエロー５ＧＦ、ジーンブレイザー（ＧＣＦ２）、グロキサン酸、グラニュールブルー、ヘマトポルフィリン、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３４５８０、ＨＰＴＳ、ヒドロキシクマリン、ヒドロキシスチルバミジン（フルオロゴールド）、ヒドロキシトリプタミン、インド－１、高カルシウム、インド－１、低カルシウム、インドジーカーボシアニン（ＤｉＤ）、インドジーカーボシアニン（ＤｉＲ）、イントラホワイトＣｆ、ＪＣ－１、ＪＯ－ＪＯ－１、ＪＯ－Ｐｒｏ－１、レーザプロ、ローロダン、ＬＤＳ ７５１ （ＤＮＡ）、ＬＤＳ ７５１ （ＲＮＡ）、ロイコホールＰＡＦ、ロイコホールＳＦ、ロイコホールＷＳ、リサミンローダミン、リサミンローダミンＢ、カルセイン／エチジウムホモダイマー、ＬＯＬＯ－１、ＬＯ－ＰＲＯ－１、ルシファーイエロー、ライソトラッカーブルー、ライソトラッカーブルーホワイト、ライソトラッカーグリーン、ライソトラッカーレッド、ライソトラッカーイエロー、ライソセンサブルー、ライソセンサグリーン、ライソセンサイエロー／ブルー、マググリーン、マグダラレッド（フロキシンＢ）、マグ－フーラレッド、マグ－フーラ－２、マグ－フーラ－５、マグ－インド－１、マグネシウムグリーン、マグネシウムオレンジ、マラカイトグリーン、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、メロシアニン、メトキシクマリン、ミトトラッカーグリーンＦＭ、ミトトラッカーオレンジ、ミトトラッカーレッド、ミトラマイシン、モノブロモビマン、モノブロモビマン（ｍＢＢｒ－ＧＳＨ）、モノクロロビマン、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ＮＢＤ、ＮＢＤアミン、ナイルレッド、ニュークリアファストレッド、ニュークリアイエロー、ナイロサン ブリリアント イアビンＥ８Ｇ、オレゴングリーン、オレゴングリーン４８８－Ｘ、オレゴングリーン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、パラロサニリン（フォイゲン）、ＰＢＦＩ、フロキシンＢ （マグダラレッド）、フォルウィットＡＲ、フォルウィットＢＫＬ、フォルウィットＲｅｖ、フォルウィットＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、ＰＫＨ２６（シグマ）、ＰＫＨ６７、ＰＭＩＡ、ポントクロームプールブラック、ＰＯＰＯ－１、ＰＯＰＯ－３、ＰＯ－ＰＲＯ－１、ＰＯ－ＰＲＯ－３、プリムリン、プロシオンイエロー、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザール ブリリアントフラビン７ＧＦ、ＱＳＹ７、キナクリンマスタード、レゾルフィン、ＲＨ４１４、Ｒｈｏｄ－２、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミン５ ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ ２００、ローダミンＢ ｅｘｔｒａ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミングリーン、ローダミンファリキジン、ローダミンファロイジン、ローダミンレッド、ローダミンＷＴ、ローズベンガル、Ｓ６５ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、ＳＢＦＩ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベン イソチオスルホン酸）、ＳＮＡＦＬカルセイン、ＳＮＡＦＬ－１、ＳＮＡＦＬ－２、ＳＮＡＲＦカルセイン、ＳＮＡＲＦ１、ナトリウムグリーン、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッド、ＳＰＱ（６－メトキシ－Ｎ－（３－スルホプロピル）キノリニウム）、スチルベン、スルホローダミンＢカンＣ、スルホローダミンエクストラ、ＳＹＴＯ １１、ＳＹＴＯ １２、ＳＹＴＯ １３、ＳＹＴＯ １４、ＳＹＴＯ １５、ＳＹＴＯ １６、ＳＹＴＯ １７、ＳＹＴＯ １８、ＳＹＴＯ ２０、ＳＹＴＯ ２１、ＳＹＴＯ ２２、ＳＹＴＯ ２３、ＳＹＴＯ ２４、ＳＹＴＯ ２５、ＳＹＴＯ ４０、ＳＹＴＯ ４１、ＳＹＴＯ ４２、ＳＹＴＯ ４３、ＳＹＴＯ ４４、ＳＹＴＯ ４５、ＳＹＴＯ ５９、ＳＹＴＯ ６０、ＳＹＴＯ ６１、ＳＹＴＯ ６２、ＳＹＴＯ ６３、ＳＹＴＯ ６４、ＳＹＴＯ ８０、ＳＹＴＯ ８１、ＳＹＴＯ ８２、ＳＹＴＯ ８３、ＳＹＴＯ ８４、ＳＹＴＯ ８５、ＳＹＴＯＸブルー、ＳＹＴＯＸグリーン、ＳＹＴＯＸオレンジ、テトラサイクリン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッド、テキサスレッド－Ｘ－抱合、チアジカーボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チアジンレッドＲ、チアゾールオレンジ、チオフラビン５、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ（カルコフルオロホワイト）、ＴＭＲ、ＴＯ－ＰＲＯ－１、ＴＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－５、ＴＯＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルロダミンイソチオシアネート）、トルーブルー、トルーレッド、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、ＷＷ７８１、Ｘ－ローダミン、ＸＲＩＴＣ、キシレンオレンジ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、ＹＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、ＳＹＢＲグリーン、チアゾールオレンジ（インターシェレート色素）、またはこれらの組み合わせを含む。

ある態様において、本開示は、一般的に、ＭＥＲＦＩＳＨまたは他の技術を用いて、生物学的サンプルにおいて、（例えば、数１０、数１００、数１０００またはそれ以上の）ターゲットのシグナルを増幅するためのシステム及び方法に関する。例えば、ある実施の形態において、これらの技術は、例えば、生物学的サンプルの自然な環境において、数１００または数１０００のＲＮＡターゲットのシグナルを同時に増幅させる早い、簡単及び／または効率の良い方法を提供する。このような増幅は、本明細書にて説明される特定の実施の形態において、飽和可能なシステムを用いることによって、正確に制御することができる。そのため、スポットとスポットとの間における明るさにおける変動は、最小化されてもよく、ＭＥＲＦＩＳＨまたは他の手法を用いた復号化において便利である。ある実施の形態において、増幅されたスポットの大きさも増加しない。これは、例えば、互いに対して比較的近くに配置されたターゲットを特定する能力を向上できる。例えば、１つのターゲットからのシグナルは、スポットサイズが増加しすぎると、他のターゲットとのシグナルと重なる可能性がある。加えて、下記で説明するように、ある実施の形態における増幅核酸は、例えば、増幅プロセスに関係し得るヘアピン構造を含まず、これは飽和可能なシステムの生成を容易にし得る、及び／または多数のターゲットに複数の増幅システムの設計を適用し得る。加えて、下記で説明するように、増幅核酸は３つのみをヌクレオチドを用いて構築されてもよい。３文字ヌクレオチドは、４文字ヌクレオチドより大幅に少ないセカンダリ構造を有してもよく、より速い結合速度を有してもよい。加えて、ある場合において、いずれかの特定の増幅シーケンスが正しく動作する可能性は、例えば、意図しないセカンダリ構造の可能性を減少することによって増加する。

このようなシステムの非限定的な例は、図３に示されている。図３Ａにおいて、ターゲット１０（この例示においてはＲＮＡ）が図示される。生物学的サンプル（例えば、細胞または組織）内に分布される数１００または数１０００のターゲットがあってもよく、ターゲットへの核酸プローブの結合は、例えば、蛍光プローブを使用してサンプルをイメージングすることによって、その分布を特定するように使用されてもよい。しかしながら、ここでは、明確性のためには単一のターゲットのみが図示されていることを認識されよう。

ある実施の形態において、異なるシーケンスを有する複数の核酸プローブが使用され、それぞれの核酸プローブの分布は順次に分析され、それぞれの核酸プローブの結合パターンに基づいて、それぞれの場所のために「コードワード」を作成するように使用される。適切なコードスペースを規定する核酸プローブを選択することによって、観測される結合パターンにおける明白なエラーを特定できる、及び／または破棄され、及び／または正しいコードワードを、したがって、サンプルにおける核酸プローブの正しいターゲットを特定できるように修正されてもよい。このエラーロバスト性及びエラー修正システムは、マルチプレックスエラーロバスト蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＭＥＲＦＩＳＨ）のために最初に導入され、その後で様々な関連する技術において使用されている。国際特許出願公開第２０１６／０１８９６０号、第２０１６／０１８９６３号を参照し、参照によってその全体が本明細書に含まれる。

図３Ａには、エンコーディング核酸プローブの例示が図示され、エンコーディング核酸プローブ１５（点線ボックス内に示されている）はターゲット１０、例えば、ターゲットＲＮＡに結合される。他の核酸プローブ１６，１７は、ターゲットＲＮＡに結合してもよく、サンプルにおける他のターゲットに結合してもよい。プローブ１５は、（例えば、特定の結合を通じて）ターゲットＲＮＡと、リードシーケンス１２（または「リードアウト」シーケンス）、即ち、結合されたか否かを特定するように「リード」できるシーケンスとに結合できる。１つ、２つ、３つまたはそれより多くのリードシーケンスはプローブ上に存在してもよい。例えば、この例示において、２つのこのようなリードシーケンスは、プローブ１５内に存在する（リードシーケンス１２とリードシーケンス１９として特定される）。リードシーケンスは、それぞれ独立して同一であってもまたは異なってもよい。加えて、プローブ１６、１７等は、核酸プローブ１５と同一または異なった数のリードシーケンスを有してもよく、及び／または同一または異なった構造を有してもよい。

増幅が適用されない場合、その後、核酸プローブ１５は、図３Ｅに示すように、シグナリング物体４０を含む適切なセカンダリ核酸プローブ３２に露出されてもよい。この例示において、シグナリング物体は、ジスルフィドリンケージを通じて、セカンダリ核酸プローブにリンクされているが、他の実施の形態において、他の方法が使用されてもよい。しかしながら、この場合において、単一のシグナリング物体がターゲットにリンクできる。したがって、このような結合の後に生成される低いシグナル強度によって、単一のシグナリング物体を検出して、ターゲット１０への核酸プローブ１５の結合を特定するように使用することが比較的難しい。

したがって、図３Ｂにおいて、プライマリ増幅核酸２０は、特定の実施の形態に応じて使用されてもよい。プライマリ増幅核酸は、下記で説明するように、核酸プローブ１５のリードシーケンスに（例えば、特定的に）結合できる第１プライマリ認識シーケンス２２と、１つまたは複数のセカンダリ増幅核酸に（例えば、特定的に）結合できる１つまたは複数のプライマリリードシーケンス２３とを含んでもよい。この例示において、「Ｎ」リードシーケンスは、プライマリ核酸において模式的に示されている（Ｎは、例えば、５，７，９または本明細書にて説明される他の数であってもよい）。プライマリリードシーケンスは、それぞれ同一または異なるシーケンスを有してもよく、同一または異なる長さを有してもよい。この例示において、それぞれのリードシーケンスは、２０ヌクレオチドの長さを有するが、これは単なる例示である。加えて、前述のように、２つのこのようなプライマリ増幅核酸が示されているが、これは単なる例示であって、他の実施の形態において、プライマリ増幅核酸の他の数が核酸プローブに結合されてもよい。

次に、図３Ｃに示すように、セカンダリ増幅核酸３０は、プライマリ増幅核酸に結合されてもよい。セカンダリ増幅核酸は、下記で説明するように、プライマリ増幅核酸２０のリードシーケンス２３に（例えば、特定的に）結合できる第１認識シーケンス３３と、シグナリング物体に結合できる１つまたは複数のセカンダリリードシーケンス３４とを含んでもよい。

プライマリ増幅核酸と同様に、セカンダリリードシーケンスのいずれかの数が、この図に示されているようにセカンダリ増幅核酸において存在してもよい。セカンダリリードシーケンスは、それぞれ同一または異なるシーケンスを有してもよく、互いに対して同一または異なる長さを有してもよい。セカンダリリードシーケンスは、プライマリ増幅核酸のリードシーケンスと同一または異なってもよい。この例示において、それぞれのセカンダリ増幅核酸は、「Ｍ」リードシーケンスを有してもよい。Ｍは、例えば、５，７，９または本明細書にて説明される他の数であってもよく、ＭはＮと同一または異なってもよい。

図３Ｄにおいて、複数のシグナリング物体４０は、セカンダリ増幅核酸のリードシーケンスに結合される。この例示において、シグナリング物体は、ジスルフィド結合を通じてそれぞれ互いに結合されてもよいが、本明細書にて説明されるように、他の実施の形態では、他の技術が使用されてもよい。

加えて、このような場合において、ターゲットシーケンスのそれぞれのリードシーケンスに結合されたシグナリング物体の最大値または飽和限界があることを予想される。この例示において、両方が実質的に同一の構造を有する（一方で、異なる構造を有する増幅核酸を有する場合でも、必ずしも同一の構造を有しなくてもよく、即ち同じ数のＮ×Ｍ位置が可能でなくてもよい）ことを仮定して、核酸プローブのそれぞれのリードシーケンス（ここで２つのこのようなリードシーケンス）のためにはＮ×Ｍ位置が可能である。したがって、特定のターゲットに関連できるシグナリング物体の数は、有限の予測可能な数であって、無限に増加できない。

この例示において、２つのリードシーケンス１２，１９が検討され、それぞれは、プライマリ及びセカンダリ増幅核酸と、関連するシグナリング物体とを有してもよい。これらは、同一または異なる構造を有してもまたは有しなくてもよく、例えば、リードシーケンス１２と関連するシグナリング物体及び／または増幅核酸は、リードシーケンス１９に関連しなくてもよく、その逆も関連しなくてもよい。（しかしながら、上述のように、２つのリードシーケンスは、例示においてのみここで提供され、他の実施の形態において、１，２，３，４等の別個のリードシーケンスがあってもよく、例えば、同様な手法を用いて、別個の増幅核酸等を含んで、並列において増幅されてもよい。）リードシーケンスは、同一または異なるそれぞれのリードシーケンスと関連するシグナリング物体を特定することによって、独立的に、例えば、順次にまたは同時に、特定されてもよい。例えば、図３Ｄに示すように、シグナリング物体４０は、プライマリ増幅核酸２０とセカンダリ増幅核酸３０と関連することができ、最終的にリードシーケンス１２と関連することができるが、リードシーケンス１９またはその関連したプライマリ及びセカンダリ増幅核酸２９，３９のそれぞれと関連することができない。

加えて、ある実施の形態において、増幅は、（Ｎ－倍の増幅を生成する）増幅核酸の１つのみのラウンド、（Ｎ×Ｍ－倍の増幅を生成する）２つのラウンド、（分子の第３ラウンドがＯリードシーケンスを収容すると、Ｎ×Ｍ×Ｏ増幅を生成する）３つのラウンド、または他の場合においてこれより多くの結合を含んでもよい。ある場合において、いずれかの数の増幅ラウンドが適用されてもよい。

加えて、サンプルは、複数の異なるリードアウトシーケンスを有し、例えば、異なる増幅核酸またはシグナリング物体を使用することが認識される核酸プローブを含んでもよい。例えば、８，１０，１２，１４，１６，２４，３２，４８，６４，１２８または１２８ラウンドより多くを含むリードアウトシーケンスの他の数が使用されてもよい。ある場合において、固有の増幅核酸は、リードアウトシーケンスの増幅のために使用されてもよい。例えば、存在するオリジナルリードアウトシーケンスは、適切な増幅核酸を用いて、例えば、Ｎ×Ｍコピーに増幅されてもよい。特定の場合において、増幅核酸は効率的に設計されてもよい。例えば、増幅核酸のシーケンスにおける４つのヌクレオチドの内３つのみを使用することによって、増幅核酸における予想されないセカンダリ構造の確率を減少できる。いずれかの原理によって拘束されることを望まず、増幅核酸自体の結合に対するこのようなセカンダリ構造、または後続の増幅核酸の効果を予測することが難しいため、セカンダリ構造を減少させるまたは除去することは、特定の増幅核酸を正しく組み立てられるかの確率を増やすことができ、これは大きい数の直交性増幅核酸の設計及び使用を容易にする。加えて、これらの増幅核酸の結合の速度を阻害し得るセカンダリ構造を減少することによって、このような設計考慮は、このような構造を組み立てるために必要な時間を減少することができ、またはそれぞれのサンプルに必要な増幅核酸の量を減少させること等ができる。

この手法によって提供される制御された増幅は、充分な試薬があると、シグナルの増幅は効果的に制御されていない態様または無制限に増加できるヘアピンアンフォールディングまたはローリングサークル増幅等の手法と対照的である。このような無制限な増幅は、正確に特定することが難しい。なぜなら、存在するシグナルの量はターゲットの数、またはターゲットの位置によく関連していない（例えば、無制限な増幅によって生成されるシグナルのより大きい量とともに、顕微画像に映る「スポットサイズ」が増加してもよく、ターゲットの中心からずれてもよく、よって画像の解像度を制限し、または他の近くのターゲットからのシグナルと干渉する）。対照的に、本明細書において説明されるように、飽和可能な増幅手法の資料は、ターゲットと関連できるシグナリング物体の最大数を生成できて、スポットサイズを制限できて、スポットの明るさまたは強度において均一性を生成し、検出を向上できる。

前述のように、特定の実施の形態において、このような手法は、例えば、ＭＥＲＦＩＳＨまたは他の類似の手法において使用されるように、エラー修正と組み合わせてもよい。例えば、コードワードは、複数の核酸プローブの結合（または非結合）に基づいてもよく、ある場合において、コードワードは、核酸プローブの誤った識別を減少または抑制することを助けるように、エラー修正コードを定義してもよい。ある場合において、比較的大きい数の異なるターゲットは、例えば、様々な組み合わせ手法を用いて、比較的小さい数のラベルを用いることで識別されてもよい。ＳＴＯＲＭ等の画像取得技術も、このようなサンプルを撮像するように使用されてもよく、核酸プローブの特定を容易にできる。ＵＳ米国特許第９，７１２，８０５号または第１０，０７３，０３５号または国際特許出願公開第２００８／０９１２９６号または２００９／０８５２１８号を参照し、それぞれは、ＭＥＲＦＩＳＨに等の技術に関する追加の詳細のために、参照によってその全体が本明細書に含まれる。

開示の他の態様は、コンピュータ実施方法に関する。例えば、本明細書に説明されるいずれかの方法を自動的に及び／または繰り返し実行できるコンピュータ及び／または自動化されたシステムが提供されてもよい。本明細書に使用されるように、「自動化された」装置は、人間の指示無しで操作できる装置を意味し、即ち、自動化された装置は、例えば、プロセスを開始するようにコンピュータに指示を入力することによって、いずれかの人間が機能を促進するためのいずれかの動作を取り終わった後の時間の期間において、機能を実行できる。通常、自動化された装備は、この時点の後に繰り返し機能を実行できる。プロセスステップも、ある場合においては、機械リーダブル媒体に記憶されてもよい。

例えば、ある場合において、コンピュータは、例えば、本明細書に説明される蛍光顕微鏡、ＳＴＯＲＭ、または他の超解像技術を用いて、サンプルのイメージングを制御するように使用されてもよい。ある場合において、コンピュータは、ドリフト修正、物理的認識、ハイブリダイゼーション及び画像分析におけるクラスタ位置合わせ、クラスタ復号化（例えば、蛍光クラスタ復号化）、エラー検出または修正（例えば、本明細書にて説明されるように）、ノイズ減少、背景特徴（例えば、画像におけるノイズまたはデブリ）からの前景の特徴の識別等の操作も制御してもよい。例示として、コンピュータは、サンプルにおけるシグナリング物体の有効化及び／または励起、及び／またはシグナリング物体の画像の取得を制御するように使用されてもよい。１つの実施の形態のセットにおいて、サンプルは、様々な波長及び／または強度を有する光を用いて励起されてもよく、サンプルを励起するために使用される光の波長のシーケンスは、コンピュータを用いて、シグナリング物体を含むサンプルの取得画像と相関されてもよい。例えば、コンピュータは、様々な波長及び／または強度を有する光をサンプルに適用してもよく、それぞれの興味領域におけるシグナリング物体の異なる平均数をもたらしてもよい（例えば位置において１つの有効化された物体、位置において２つの有効化された物体等）。ある場合において、この情報は、画像を構築する、及び／または上述のように、ある場合において、高い解像度において、シグナリング物体の位置を特定するように使用されてもよい。

ある態様において、サンプルは顕微鏡に配置される。ある場合において、顕微鏡は、サンプルに向かってまたはそこから離れるように流体を向けるまたは制御するように、マイクロ流体チャネル等の１つまたは複数のチャネルを含んでもよい。例えば、１つの実施の形態において、本明細書にて説明される核酸プローブは、サンプルにまたはサンプルから、１つまたは複数のチャネルを通じて流体を流すことによって、サンプルに導入及び／または除去されてもよい。ある場合において、例えば、チャネル及び／またはサンプルと流体的に接続され、流体を保持する１つまたは複数のチャンバまたはレザーバがあってもよい。当業者は、サンプルにまたはサンプルから流体を移動させるためのマイクロ流体チャネルを含むチャネルを知っている。

「画像に基づく高スループットスクリーニングのためにシステム及び方法」と題したＷＯ２０１８／２１８１５０、「核酸を特定するシステム及び方法」と題したＷＯ２０１６／０１８９６０、「プローブライブラリ構築」と題したＷＯ２０１６／０１８９６３、「マトリックスインプリント及びクリアリング」と題したＷＯ２０１８／０８９４４５、「ＭＥＲＦＩＳＨ及び拡大顕微鏡を用いたマルチイメージング」と題したＷＯ２０１８／０８９４３８、「画像に基づくプールＣＲＩＳＰＲスクリーニング」と題した米国特許出願第６２／８３６，５７８号、および「ＭＥＲＦＩＳＨ及び他の用途のための増幅方法及びシステム」と題した米国特許出願第６２／７７９，３３３号は、参照によって、本明細書に含まれる。米国特許第２０１７／０２２０７３３号及び第２０１７／０２１２９８６号は、その全体において参照によって本明細書に含まれる。さらに、モフィット及びその他による、「分子プロファイリングのためのマルチフォーカルイメージングのためのシステム及び方法」と題し、２０１９年１１月２０日に出願された米国特許出願第６２／９３８，１９４は、その全体において参照によって本明細書に含まれる。

後続の実施例は、本開示の特定の実施の形態を示すことを意図するが、本開示の全範囲を示さない。

（実施例１）
ＭＥＲＦＩＳＨ測定と組み合わせた同時マルチ平面イメージングによって提供されるＭＥＲＦＩＳＨイメージング時間における可能な減少をさらに示すように、この実施例は後続の２つのシナリオを提供する。

第１シナリオにおいて、１．５ミクロンによって分離される焦点面を有する８画像のｚ－スタックは、組織のスライスにおいて複数の視野（ＦＯＶ）において複数のｍＲＮＡ分子の分布を特徴付けるように使用される。画像ごとの露出時間が０．５ｓ、再フォーカス時間が１００ｍｓであると仮定すると、それぞれのｚ－スタックを収集するためには、４．７ｓが必要になる。このような測定が１０００ＦＯＶにおいて実行され、１６ラウンドのイメージングが１６ビットバーコードを測定するように実行されると、全てのラウンドにおいてこのサンプルを撮像するために必要な合計時間は～２１時間である。

第２シナリオにおいて、同一のＭＥＲＦＩＳＨ測定を実行して、同じ数のＦＯＶにおける同一の８画像のｚ－スタックを撮像する。しかしながら、撮像されるｚ－スタックが第１シナリオにおいて雪像されるものと同一であるように、それぞれのカメラが前のカメラから１．５ミクロン分離された焦点面を撮像する８つのカメラを有するカメラバンクが使用される。

加えて、ある実施の形態は、～８倍によって、それぞれのラウンドにおける蛍光シグナルを増幅するようにブランチＤＮＡ増幅（ｂＤＮＡ）を使用する。よって、バンクにおけるそれぞれのカメラ上の全蛍光は、第１シナリオにおけるカメラ上のシグナルと同一である。このシナリオにおいて、バンクにおけるそれぞれのカメラは、０．５ｓの合計露出時間において同時に露出される。対象物は、このシナリオにおいて再フォーカスされない。したがって、単一のＦＯＶにおいて全ｚ－スタックを撮像するためにかかる時間は、０．５ｓであって、１０００ＦＯＶにおいて１６ラウンドにわたって全イメージングを実行するために必要な時間は、この特定の例示において２．２時間である。

（実施例２）
実施例は、４つのカメラバンクが、例示１において説明されるのと同一の組織体積において４つの異なる色を撮像するように使用される第３シナリオを示す。上述の第２シナリオのように、全ｚ－スタックの収集はＦＯＶごとにたった０．５ｓを要する。しかしながら、４つの異なる色チャネルを使用することで、４つのリードアウトプローブは、染色及びイメージングのそれぞれのラウンドにおいて測定されてもよく、１６ビットを測定するために１６ラウンドを要せず、たった４ラウンドが必要である。したがって、１０００ＦＯＶにわたった１６ビットバーコードの測定は、この特定の例示においてたった～３３分を要する。

（実施例３）
この実施例は、同時に２つのカラーチャネルにおいて８つの光学平面を撮像するように１６カメラのバンクが配置されるシナリオを示す（図４）。顕微鏡または他の撮像装置から収集される発振光は、ダイクロイックでないビームスプリッタによって、２つの同一のパスの間で均等に分離される。第１のパスにおいて、光は第１イメージングレンズによって集光され、理想的には、顕微鏡から収集された発振光の略同一の割合をそれぞれ収容する４つの同一の光路を生成するように、２つの追加的な非ダイクロイックビームスプリッタ（部分的ミラー）のシリーズにわたって分離される。それぞれのパスにおいて、光は、その後、８つの検出器のそれぞれにおいて画像を形成するように第２イメージングレンズを通過する。しかしながら、光が検出器に到達する前に、ダイクロイックビームスプリッタを用いて、カラー毎に分離され、２つの別のカメラにおいてそれぞれのカラーチャネルにおいて画像を形成する。ダイクロイックビームスプリッタによって分離されるこのようなカメラの対のそれぞれの位置は、共通のパスにおける最終イメージングレンズに対して設計され、よって、このシステムが接続される顕微鏡によって撮像されるサンプルにおける同一の軸平面を撮像する。しかしながら、それぞれのカメラの対に関連する最終イメージングレンズからそのカメラの対までの距離は、それぞれのカメラ対によって固有であって、よって、それぞれの対は、他のカメラの対に対してサンプルにおける異なる軸平面を撮像する。第１の非ダイクロイックビームスプリッタによって生成される第２光路は、同一のパスを収容する。

本明細書にて本開示の様々な実施の形態が説明及び図示されたが、当業者は、機能を実行する、及び／または結果を得る、及び／または本明細書にて説明される１つまたは複数の利点を得るように、様々な他の手段及び／または構造を容易に想到し、それぞれの変形例及び／または改造は、本開示の範囲内であるとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書にて説明される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構造は、例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料及び／または構造は、本開示が使用される特定の用途によることを認識する。当業者は、本明細書において説明される開示の特定の実施の形態との多くの同等品を認識する、または単に通常の実験を用いて特定できる。したがって、前述の実施の形態は、単に例示によって示され、添付の請求項の範囲及びその同等品において、開示は特定的に説明及び請求項に記載されるものと異なるように実施されてもよい。本開示は、本明細書にて説明されるそれぞれの個別の特徴、システム、物品、材料、きっと及び／または方法に向けられている。加えて、これらの特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法の２つ以上のいずれかの組み合わせは、これらの特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が互いに整合性を有しないものでなければ、本開示の範囲内に含まれる。

本明細書と、参照によって含まれた文書とが、反する及び／または整合性を有しない開示を含む場合、本明細書が支配的である。参照によって含まれた２つ以上の文書が、互いに反する及び／または整合性を有しない開示を含む場合、より遅い有効日付を有する文書が支配的である。

本明細書にて定義及び使用される全ての定義は、辞書による定義、参照によって含まれる文書による定義、及び／または定義された用語の通常の意味に対して支配的であると理解されよう。

本明細書及び請求項において使用される不定冠詞「ある」は、明示的に違うことが示されている場合を除き、「少なくとも１つ」を意味すると理解されよう。

本明細書及び請求項において使用される用語「及び／または」は、結合された要素、即ち、ある場合において結合的に存在し、他の場合において分離して存在する要素の「一方または両方」を意味することと理解されよう。「及び／または」とともに記載される複数の要素は、同様に、即ち、「１つまたは複数」の要素がこのように結合されていると理解されよう。「及び／または」文書によって特定的に特定される要素以外の選択的に特定される要素以外の他の要素が存在してもよく、特定的に特定される要素に関連してもよく関連しなくてもよい。したがって、非限定的な例示として、「有する」等のオープンな表現とともに使用されると、「Ａ及び／またはＢ」への参照は、ある実施の形態においてＡのみ（選択的にＢ以外の要素を含む）、他の実施の形態においてＢのみ（選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに他の実施の形態において、ＡとＢとの両方（選択的に他の要素を含む）等を意味する。

本明細書及び請求項において使用されるように、「または」は、上記で定義したように「及び／または」と同じ意味を有すると理解されよう。例えば、リストにおいて物品を分離するとき、「または」または「及び／または」は、包括的である、即ち、要素のリスト及び選択的に追加の記載されていない物品の少なくとも１つ及び１つより多くを含むと解釈される。例えば、「１つのみ」または「ちょうど１つ」、または請求項において「から構成される」等、明示的に違うと示されている用語は、要素のリストの数のちょうど１つの要素の包含を意味してもよい。一般的には、排他的な用語、例えば、「一方」、「１つ」、「１つのみ」、「ちょうど１つ」等の用語が前にある場合においてのみ、用語「または」は、排他的な代替案（即ち、「一方または他方、両方でない」）を示すものとして解釈する。

本明細書及び請求項において使用されるように、表現「少なくとも１つ」は、１つまたは複数の要素のリストを参照していると、要素のリストにおける要素のいずれか１つまたは複数から選択された少なくとも１つの要素を意味するものであって、要素のリストにおける特定的に記載されたそれぞれ全ての要素の少なくとも１つを含むことを要せず、要素のリストにおける要素のいずれかの組み合わせを排除しないことを理解されよう。この定義は、表現「少なくとも１つ」が参照する要素のリストにおいて特定される要素以外の要素であって、特定される要素に関連するまたは関連しないものが選択的に存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例示として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａ及び／またはＢの少なくとも１つ」）は、ある実施の形態において、Ｂ無しで、少なくとも１つのＡ、選択的に１つ以上のＡ（及びＢ以外の要素を含んでもよい）を意味してもよく、他の実施の形態において、Ａ無しで、少なくとも１つのＢ、選択的に１つ以上のＢ（及びＡ以外の要素を含んでもよい）を意味してもよく、さらに他の実施の形態において、少なくとも１つのＡ、選択的に１つ以上のＡ、及び少なくとも１つのＢ、選択的に１つ以上のＢ（及び選択的に他の要素を含んでもよい）を意味してもよい。

本明細書において、数字を参照して用語「略」が使用されると、本開示のさらなる他の実施の形態が、用語「略」の存在によって変更されていない数字を含むと理解されよう。

本明細書における全ての数字は、おおよその値であって、最も近い有効数字に近似するとともに、通常及び測定の誤差を考慮することを意図している。

１つより多くのステップまたは動作を含む本明細書において請求項に記載されたいずれかの方法において、方法のステップまたは動作の順番は、方法のステップまたは動作が記載されている順番に必ずしも限定されていないことを理解されよう。

請求項及び上述の明細書において、全ての遷移表現、例えば、「有する」、「含む」、「運ぶ」、「収容する」、「関する」、「保持する」、「構成する」等は、オープンエンドである、即ちこれを含むがこれに限定されないと理解されよう。遷移表現「から構成される」及び「本質的に構成される」のみは、米国特許庁特許審査マニュアル、セクション２１１１．０３に記載されたように、クローズまたはセミ－クローズの遷移表現である。

Claims (39)

1. サンプルを複数の核酸プローブの露出させることと、
   核酸プローブのそれぞれにおいて、前記サンプル内の異なる焦点面に集光される少なくとも２つの検出器を使用して前記サンプルの画像を取得することと、
   前記画像を使用して、前記サンプルにおける核酸プローブの結合を特定することと、
   複数の核酸プローブの結合に対応する前記サンプルにおける核酸の量及び／または空間的分布を特定することと、
   を含む方法。
2. 前記サンプルにおける異なる焦点面において集光される少なくとも４つの検出器を使用して前記サンプルの画像を取得することと、を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記サンプルにおける異なる焦点面において集光される少なくとも８つの検出器を使用して前記サンプルの画像を取得することと、を有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記サンプルにおける異なる焦点面において集光される少なくとも１６つの検出器を使用して前記サンプルの画像を取得することと、を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記サンプルにおける異なる焦点面において集光される少なくとも３２つの検出器を使用して前記サンプルの画像を取得することと、を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記異なる焦点面のそれぞれは隣接する焦点面から１０００ｎｍ以下において集光される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 光を前記サンプルから複数のビームスプリッタを通じて前記少なくとも４つの検出器に通過させることを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 検出器の少なくとも一部がカメラである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 検出器の少なくとも一部が点検出器である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 検出器の少なくとも一部が受光器である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 検出器の少なくとも一部がアバランシェフォトダイオードである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 検出器の少なくとも一部が１次元アレーである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 検出器の少なくとも一部がライン検出器である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ３００ｎｍより良い解像度において前記サンプルにおける核酸プローブの少なくとも一部のｚ位置を特定することを有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 核酸プローブに結合できるプライマリ増幅核酸に核酸プローブを露出させることと、
    前記プライマリ核酸に結合できるセカンダリ増幅核酸に前記プライマリ増幅核酸を露出させることと、を有し、
    前記プライマリ増幅核酸の最大数が、核酸プローブに結合でき、
    前記セカンダリ増幅核酸の最大数が、前記プライマリ増幅核酸に結合できる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記プライマリ核酸に結合できる前記セカンダリ増幅核酸に前記プライマリ増幅核酸を露出させることを有し、
    ターゲットへの前記プライマリ増幅核酸と前記セカンダリ増幅核酸との結合は飽和可能である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記プライマリ核酸に結合できる前記セカンダリ増幅核酸に前記プライマリ増幅核酸を露出させることを有し、
    前記セカンダリ増幅核酸は、固定距離内における前記プライマリ増幅核酸に結合する、請求項１５または１６に記載の方法。
18. ２０以下の前記プライマリ増幅核酸が核酸プローブに結合できる、請求項１５から１７にいずれか一項に記載の方法。
19. 前記プライマリ増幅核酸は３００ヌクレオチド以下の平均長さを有する、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記プライマリ核酸に結合できる前記セカンダリ増幅核酸に前記プライマリ増幅核酸を露出させることをさらに有し、
    前記セカンダリ増幅核酸の最大数が、前記プライマリ増幅核酸に結合できる、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記セカンダリ増幅核酸は、蛍光シグナリング物体を有する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記サンプルにおける拡散プローブの結合によってコードワードを形成することと、
    前記コードワードの少なくとも一部において、前記コードワードを選択的に有効なコードワードとマッチすることとをさらに有し、
    マッチが見つからないと、有効なコードワードを形成するように前記コードワードにエラー修正を適用する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記サンプルを少なくとも５つの異なる核酸プローブに露出させることを有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記サンプルを複数の核酸プローブに順に露出させることを有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 複数の核酸プローブは、異なるシーケンスを有する核酸プローブ組み合わせ的組み合わせを有する、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記複数の核酸プローブは、１０から３００ヌクレオチドの間の平均長さを有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 複数の核酸プローブの少なくとも一部は、ターゲットシーケンス及び１または複数のリードシーケンスを有する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 複数の核酸プローブのターゲットシーケンスは、１０から２００ヌクレオチドの間の平均長さを有する、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ターゲットシーケンスは、特定の結合を通じて、ターゲットに結合する、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記複数のリードシーケンスは、エラー修正コードを規定するように複数の核酸プローブの上に分布される、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 複数の核酸プローブは、少なくとも２のハミング距離を有するコードスペースを規定する、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 蛍光イメージングを用いて、核酸プローブの結合を特定することを有する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. マルチ色蛍光イメージングを用いて、核酸プローブの結合を特定することを有する、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 超解像蛍光イメージング技術を用いて、核酸プローブの結合を特定することを有する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 確率的光学再構築顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）を用いて、核酸プローブの結合を特定することを有する、請求項３４に記載の方法。
36. 前記サンプルが細胞を有する、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記細胞が人間細胞である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記細胞が固定される、請求項３６または３７に記載の方法。
39. サンプルを複数の核酸プローブの露出させることと、
    それぞれの核酸プローブにおいて、核酸プローブに結合できる増幅核酸に核酸プローブを露出させることと、
    それぞれの核酸プローブにおいて、前記サンプルにおける異なる焦点面において集光される少なくとも４つのカメラを使用して前記サンプルの画像を取得することと、
    を含み、
    前記増幅核酸の最大数が、核酸プローブに直接的にまたは間接的に結合できる、方法。

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