JP2023502593A

JP2023502593A - Ｘ連鎖慢性肉芽腫症を治療するための、造血幹細胞中のレンチウイルスベクター

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Publication number: JP2023502593A
Application number: JP2022527208A
Authority: JP
Inventors: ドナルド・ビー・コーン; ライアン・エル・ウォン; ロジャー・ポール・ホリス
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2023-01-25
Also published as: KR20220097487A; CN114829614A; US20220378937A1; CA3161175A1; EP4058068A1; WO2021097109A1; EP4058068A4; AU2020384286A1

Abstract

特定の実施形態では、Ｘ連鎖慢性肉芽腫症（Ｘ－ＣＧＤ）を治療するためのレンチウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターは、ＣＹＢＢプロモーターまたはその効果的な断片を含む核酸構築物を含む発現カセット；及び、ＣＹＢＢプロモーターまたはプロモーター断片に作動可能に連結されたｇｐ９１ｐｈｏｘをコードする核酸を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１２日に出願された、ＵＳＳＮ６２／９３４，３５２に対する優先権及び利益を主張し、あらゆる目的のためその全体が本明細書に参照により組み込まれる。

政府援助の記述
［該当なし］

テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１９年１１月１１日に作成され、４６．４ｋｂのサイズを有する、「ＵＣＬＡ－Ｐ２１８Ｐ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というテキストファイルとして、本明細書と共に提供される。テキストファイルの内容は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。

Ｘ連鎖慢性肉芽腫症（Ｘ－ＣＧＤ）は、食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＰＨＯＸ）複合体のウイルス性サブユニットをコードするＣＹＢＢ遺伝子の中での変異により引き起こされる、一次免疫不全である。欠損性ＲＨＯＸ複合体により、免疫系の食細胞が、感染症を適切に取り除くことができなくなる。

それ故、患者は、再発性の、生命を脅かす細菌及び真菌感染症を非常に罹りやすく、苦しむ。典型的な対象では、免疫系は感染を遮断しようとするが感染を取り除くことができず、それらの組織の損傷をもたらす可能性のある、肉芽腫の特徴的な形成をもたらす。慢性肉芽腫症の特徴は通常、まず小児期に現れるが、個体の中には、人生の後期まで症状を示さないものもある。

慢性肉芽腫症を患う人は典型的には、３～４年毎に、少なくとも１つの深刻な細菌または真菌感染症を有する。肺は、最も頻繁に感染する領域であり、肺炎が、この病状の典型的な特徴である。慢性肉芽腫症を有する個体では、マルチ肺炎（ｍｕｌｃｈｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ）と呼ばれる、一種の真菌肺炎が進行し得、これは、マルチ、干し草、または枯れ草などの、衰えている有機材料に曝露した後で、発熱及び息切れを引き起こす。これらの有機材料、及び、それらの分解に伴う多数の真菌への曝露により、人で慢性肉芽腫症が生じ、肺で真菌感染症が進行する。慢性肉芽腫症を有する人における、他の一般的な感染領域としては、皮膚、肝臓、及びリンパ節が挙げられる。

炎症は、慢性肉芽腫症を有する人体の、多くの異なる領域で生じる可能性がある。最も一般的には、胃腸管及び泌尿生殖器官において肉芽腫が進行する。多くの場合、腸壁が炎症を起こし、重症度が異なるが、胃の痛み、下痢、血便、悪心、及び嘔吐をもたらす可能性がある、炎症性腸疾患の形態を引き起こす。慢性肉芽腫症を有する人における、他の一般的な炎症領域としては、胃、結腸、及び直腸、加えて、口、のど、及び皮膚が挙げられる。加えて、胃腸管の中での肉芽腫は、組織破壊、及び膿の生成（膿瘍）をもたらす可能性がある。胃の中での炎症は、食物が通過して腸に届くことが妨げられる可能性があり（胃流出路閉塞）、食物が分解不能となる。これらの消化の問題は、食後の嘔吐、及び体重減少を引き起こす。泌尿生殖器官では、炎症は、腎臓及び膀胱にて生じ得る。共に免疫細胞を産生する、リンパ節及び骨髄における炎症（リンパ節炎及び骨髄炎）は、免疫系のさらなる不全をもたらし得る。

まれに、慢性肉芽腫症を有する患者で自己免疫疾患が進行し、これは、免疫系が機能不全を起こし、体にある自身の組織及び器官を攻撃するときに生じる。

感染症及び炎症が繰り返し発症することで、慢性肉芽腫症を有する患者での平均余命が低下する。

ＰＨＯＸ複合体は、５つの異なる遺伝子によりコードされる、５つの異なるサブユニットで構成される。これらは、ＣＹＢＢによりコードされるｇｐ９１^ｐｈｏｘ、ＣＹＢＡによりコードされるｐ２２^ｐｈｏｘ、ＮＣＦ１によりコードされるｐ４７^ｐｈｏｘ、ＮＣＦ２によりコードされるｐ６７^ｐｈｏｘ、及び、ＮＣＦ４によりコードされるｐ４０^ｐｈｏｘである。最も一般的な変異は、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードするＣＹＢＢ遺伝子に存在し、ＣＧＤの全ての症例の約５６％～７０％を占める。病状はＸ連鎖であるため、主にオスに影響を及ぼす。

この疾患は当初、「小児期における致死性肉芽腫症」という言葉であり、治療を行わないと、患者は、生まれてから最初の１０年を過ぎてはほとんど生きられなかった。現在の標準的なケアでは、ルーティンの予防的抗菌及び抗カビ治療法を用い、約３０～４０年の、生残平均年齢がもたらされる。これらの治療法は、疾患の治癒をもたらさない。

可能性のある治癒治療法の１つは、ＨＬＡ一致ドナーからの、同種異系造血幹細胞移植である。しかし、この治療法は、好適に一致するドナーを利用することができないが故に、多くの患者にとっての有効なオプションではない。

代替の治癒療法は、エクスビボ遺伝子療法による、自己造血幹細胞（ＨＳＣ）移植である。本アプローチにおいて、患者は、自身のドナーとして機能し、免疫合併症のリスクが排除される。患者自身の血液ＨＳＣを回収し、エクスビボで遺伝子組み換えを行って、対象となる遺伝子の機能的コピーを導入し、遺伝子組み換え細胞が再度注入される。

以前のウイルスベース療法では、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターにより駆動される、γレトロウイルスベクターを利用した。これにより、有望な臨床効果がもたらされた。しかし、２／２の患者において、挿入時のがん遺伝子により、脊髄形成異常が進行した。現在の、より安全なＳＩＮレンチウイルスベクター（ｐＣｈｉｍ－ＣＹＢＢ；ＭＳＰ－Ｇｐ９１ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥとも呼ばれる）は、キメラ「骨髄特異的プロモーター」（ＭＳＰ）を用い、現在の臨床試験による初期の結果は、臨床効果の可能性を示す。しかし、ｐＣｈｉｍ－ＣＹＢＢ構築物は、野生型レベルでの、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘの発現及び制御を再利用することに失敗している。したがって、例えば、遺伝子療法の後での、患者の好中球は、通常の健常なドナー細胞と比較して、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘの発現が低下する。

Ｘ－ＣＧＤを治療するための、新規のレンチウイルスベクター（複数可）（ＬＶ）の開発を、本明細書に記載する。本明細書に記載するベクターは、現在のレンチウイルスベクターよりも良好な（高い）発現を示す。加えて、本明細書に記載するベクターは、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の発現パターンを模倣する、厳格なリネージ及び段階特異的発現を有する。これは、オフターゲット発現を有するＭＳＰ構築物とは対照的であり、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子のリネージ特異的発現パターンを再利用できない。

したがって、本明細書で想倒する様々な実施形態は、以下のうちの１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない：

実施形態１：慢性肉芽腫症の治療のための組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、上記ベクターが、
ＣＹＢＢプロモーターまたはその効果的な断片、及び
上記ＣＹＢＢプロモーターまたはプロモーター断片に作動可能に連結されたｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸
を含む核酸構築物を含む発現カセットを含む、上記ベクター。

実施形態２：上記ＣＹＢＢプロモーターまたはその効果的な断片が、完全長の内因性ＣＹＢＢプロモーター（配列番号１）を含む、実施形態１に記載のベクター。

実施形態３：上記ＣＹＢＢプロモーターが、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含み、上記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）（配列番号２）を含むか、またはこれからなる、実施形態１に記載のベクター。

実施形態４：上記ＣＹＢＢプロモーターが、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含み、上記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）（配列番号２）からなる、実施形態３に記載のベクター。

実施形態５：上記ＣＹＢＢプロモーターが、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含み、上記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）（配列番号３）を含むか、またはこれからなる、実施形態１に記載のベクター。

実施形態６：上記ＣＹＢＢプロモーターが、配列が最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）（配列番号３）からなる、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片からなる、実施形態５に記載のベクター。

実施形態７：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２（配列番号４）、またはその効果的な断片を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態８：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２コア（配列番号５）を含むか、またはこれからなる、実施形態７に記載のベクター。

実施形態９：上記エンハンサーエレメント２の効果的な断片の配列が、エンハンサーエレメント２コアの配列（配列番号５）からなる、実施形態８に記載のベクター。

実施形態１０：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２ウルトラコア（配列番号６）を含むか、またはこれからなる、実施形態７に記載のベクター。

実施形態１１：上記エンハンサーエレメント２の効果的な断片の配列が、エンハンサーエレメント２ウルトラコアの配列（配列番号６）からなる、実施形態１０に記載のベクター。

実施形態１２：上記発現カセットが、ＲＥＬＡＴＦ結合部位、またはその効果的な断片をさらに含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態１３：上記ＲＥＬＡＴＦ結合部位が、配列番号７の核酸配列を含むか、またはこれからなる、実施形態１２に記載のベクター。

実施形態１４：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント４またはその効果的な断片を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態１５：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｒ、またはその効果的な断片を含む、実施形態１４に記載のベクター。

実施形態１６：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、上記断片の核酸配列が、エンハンサーエレメント４Ｒコアの核酸配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる、実施形態１５に記載のベクター。

実施形態１７：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、上記断片の核酸配列が、エンハンサーエレメント４Ｒウルトラコアの核酸配列（配列番号１１）を含むか、またはこれからなる、実施形態１５に記載のベクター。

実施形態１８：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、上記断片の核酸配列が、エンハンサーエレメント４Ｒウルトラコアの核酸配列（配列番号１１）からなる、実施形態１６に記載のベクター。

実施形態１９：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｌまたはその効果的な断片を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態２０：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｌの効果的な断片を含み、上記断片が、４Ｌコア配列の配列（配列番号１３）を含むか、またはこれからなる、実施形態１９に記載のベクター。

実施形態２１：上記発現カセットが、イントロンエンハンサーエレメント３（配列番号１４）、またはその効果的な断片を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態２２：上記発現カセットが、配列番号１５の核酸配列を含むか、またはこれからなる、イントロンエンハンサーエレメント３中間断片を含む、実施形態２１に記載のベクター。

実施形態２３：上記発現カセットが、配列番号１６の核酸配列を含むか、またはこれからなる、イントロンエンハンサーエレメント３右断片を含む、実施形態２１～２２のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態２４：ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸をコードする上記核酸が、ＣＹＢＢｃＤＮＡまたはコドン最適化ＣＹＢＢである、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態２５：ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする上記核酸が、ＣＹＢＢｃＤＮＡ（配列番号１７）である、実施形態２４に記載のベクター。

実施形態２６：ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする上記核酸が、コドン最適化ＣＹＢＢである、実施形態２４に記載のベクター。

実施形態２７：ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする上記核酸の配列が、ｊＣＡＴコドン最適化ＣＹＢＢ（配列番号１８）、ＧｅｎｅＡｒｔ最適化ＣＹＢＢ（配列番号２０）、ＩＤＴ最適化ＣＹＢＢ（配列番号２１）、及び、以前の臨床候補（配列番号１９）からなる群から選択されるコドン最適化ＣＹＢＢである、実施形態２６に記載のベクター。

実施形態２８：ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする上記核酸の配列が、ｊＣＡＴコドン最適化ＣＹＢＢ（配列番号１８）である、実施形態２６に記載のベクター。

実施形態２９：上記ベクターが、Ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナルを含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態３０：上記ベクターが、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む５’ＬＴＲを含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態３１：上記ベクターが、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態３２：上記ベクターが中央ポリプリン帯を含む、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態３３：上記ベクターが、翻訳後制御エレメントを含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態３４：翻訳後制御エレメントが、修飾されたウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）である、実施形態３３に記載のベクター。

実施形態３５：上記ベクターが、組み換えにより、野生型レンチウイルスを再構成することができない、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態３６：上記ベクターが、図１に示すに示す完全サイズの２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥの特徴を含み、ｍＣｉｔが、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸で置き換えられている、実施形態１に記載のベクター。

実施形態３７：上記ベクターが、図２０Ａに示すＵＣ２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｃｏＧｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＲＰＥの特徴を含む、実施形態１に記載のベクター。

実施形態３８：上記ベクターが、図２０Ｂに表すベクターに示す特徴を含む、実施形態３７に記載のベクター。

実施形態３９：上記ベクターが、ウルトラコア（ＵＣ）２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－Ｐｒｏ－（ＧＰ９１－ｊｃａｔ）－ＷＰＲＥのヌクレオチド配列（配列番号２２）を含む、実施形態３８に記載のベクター。

実施形態４０：上記ベクターが、ＣＤ３３＋（バルク骨髄細胞）において高い発現、ＣＤ１９＋（Ｂ細胞）において高い発現、ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１６＋（成熟好中球）において高い発現、及び、ＣＤ３＋Ｔ細胞において低い、またはゼロの発現を示す、実施形態実施形態１～３９のいずれか１つに記載のベクター。

実施形態４１：実施形態１～４０のいずれか１つに記載のベクターを形質導入した宿主細胞。

実施形態４２：細胞が幹細胞である、実施形態４１に記載の宿主細胞。

実施形態４３：上記細胞が、骨髄由来の、及び／または臍帯血液由来の、及び／または末梢血由来の幹細胞である、実施形態４２に記載の宿主細胞。

実施形態４４：上記細胞がヒト造血前駆細胞である、実施形態４１に記載の宿主細胞。

実施形態４５：ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４＋細胞である、実施形態４４に記載の宿主細胞。

実施形態４６：対象における慢性肉芽腫症（Ｘ－ＣＧＤ）の治療方法であって、上記方法が、
上記対象由来の幹細胞及び／または前駆細胞に、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のベクターを形質導入することと、
上記対象由来の上記形質導入細胞（複数可）を上記対象に移植することであって、上記対象由来の細胞または誘導体が、上記Ｇｐ９１^ｐｈｏｘを発現する、上記移植することと、
を含む、上記方法。

実施形態４７：上記細胞が幹細胞である、実施形態４６に記載の方法。

実施形態４８：上記細胞が、骨髄由来の幹細胞である、実施形態４６に記載の宿主細胞。

実施形態４９：細胞がヒト造血幹細胞及びヒト造血前駆細胞である、実施形態４６に記載の方法。

実施形態５０：ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４^＋細胞である、実施形態４９に記載の方法。

実施形態５１：以下のうちの１つ以上をコードする組み換え核酸：
ＣＹＢＢプロモーター、もしくはその効果的な断片；及び／または
ＣＹＢＢ内因性エンハンサーエレメント２（ＣＹＢＢＢ細胞エンハンサー）、もしくはその効果的な断片；及び／または
ＣＹＢＢ内因性エンハンサー４Ｒ（ＣＹＢＢ内因性骨髄エンハンサー）、もしくはその効果的な断片；及び／または
ＣＹＢＢ内因性エンハンサー４Ｌ、もしくは効果的な断片；ならびに／または
ＣＹＢＢ内因性骨髄イントロン３エンハンサー、もしくはその効果的な断片；及び／または
Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードするコドン最適化核酸。

実施形態５２：上記核酸が、完全長内因性ＣＹＢＢプロモーターを含む、またはこれからなる配列（配列番号１）をコードする、実施形態５１に記載の核酸。

実施形態５３：上記核酸が、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含む配列をコードし、上記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）（配列番号２）を含むか、またはこれからなる、実施形態５１に記載の核酸。

実施形態５４：上記核酸が、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含む配列をコードし、上記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）（配列番号２）からなる、実施形態５３に記載の核酸。

実施形態５５：上記核酸が、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含む配列をコードし、上記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）（配列番号３）を含むか、またはこれからなる、実施形態５１に記載の核酸。

実施形態５６：上記核酸が、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含む配列をコードし、上記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）（配列番号３）からなる、実施形態５５に記載の核酸。

実施形態５７：上記核酸が、ＣＹＢＢ内因性エンハンサー２（ＣＹＢＢＢ細胞エンハンサー）の効果的な断片をコードする、実施形態５１～５６のいずれか１つに記載の核酸。

実施形態５８：上記ＣＹＢＢ内因性エンハンサーエレメント２の核酸配列が、エンハンサーエレメント２コアの配列（配列番号５）を含むか、またはこれからなる、実施形態５７に記載の核酸。

実施形態５９：上記ＣＹＢＢ内因性エンハンサーエレメント２の核酸配列が、エンハンサーエレメント２ウルトラコアの配列（配列番号６）を含むか、またはこれからなる、実施形態５７に記載の核酸。

実施形態６０：上記核酸が、ＣＹＢＢ内因性エンハンサー４Ｒ（ＣＹＢＢ内因性骨髄エンハンサー）の効果的な断片を含む、実施形態５１～５９のいずれか１つに記載の核酸。

実施形態６１：ＣＹＢＢ内因性エンハンサー４Ｒの上記効果的な断片の核酸配列が、エンハンサーエレメント４Ｒウルトラコアの配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる、実施形態６０に記載の核酸。

実施形態６２：上記核酸が、エンハンサーエレメント４Ｌの効果的な断片を含む、実施形態５１～６１のいずれか１つに記載の核酸。

実施形態６３：エンハンサーエレメント４Ｌの上記効果的な断片が、４Ｌコア配列の配列（配列番号１３）を含むか、またはこれからなる、実施形態６２に記載の核酸。

実施形態６４：上記核酸が、ＣＹＢＢ内因性骨髄イントロン３エンハンサーの効果的な断片を含む、実施形態５１～６３のいずれか１つに記載の核酸。

実施形態６５：ＣＹＢＢ内因性骨髄イントロン３エンハンサーの上記効果的な断片の核酸配列が、エレメント３中間断片核酸配列（配列番号１５）を含むか、またはこれからなる、実施形態６４に記載の核酸。

実施形態６６：ＣＹＢＢ内因性骨髄イントロン３エンハンサーの上記効果的な断片の核酸配列が、イントロンエンハンサーエレメント３右断片（配列番号１６）を含むか、またはこれからなる、実施形態６４～６５のいずれか１つに記載の核酸。

実施形態６７：上記核酸が、ｊＣＡＴコドン最適化ＣＹＢＢ（配列番号１８）を含む、実施形態５１～６６のいずれか１つに記載の核酸。

実施形態６８：上記核酸が発現カセットを含む、実施形態５１～６７のいずれか１つに記載の核酸。

実施形態６９：上記発現カセットが、インビボでＧｐ９１^ｐｈｏｘを発現するのに効果的である、実施形態６８に記載の核酸。

実施形態７０：上記核酸が、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のレンチウイルスベクターを含む、実施形態５１～６９のいずれか１つに記載の核酸。

定義。
「プロモーター」とは、遺伝子（例えば、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子）の転写を開始するために必要な、核酸中の制御配列を意味する。

「エンハンサー」とは、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質により結合されたときに、会合する遺伝子の転写を向上させる制御性ＤＮＡ配列を意味する。

プロモーターに関して使用する場合の「効果的な断片」（例えば、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片）とは、当該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を開始するのに十分な完全長プロモーターの断片を意味する。

エンハンサーに関して使用する場合の「効果的な断片」（例えば、ＣＹＢＢエンハンサーの効果的な断片）とは、転写因子により結合されたときに、作動可能に連結された遺伝子の発現の制御をもたらすのに十分な完全長エンハンサーの断片を意味する。特定の実施形態では、制御は、完全長エンハンサーによりもたらされる発現レベル及び／またはリネージに匹敵するものである。

用語「作動可能に連結された」とは、別の核酸配列との機能的関係に置かれた核酸配列を意味する。例えば、プロモーターは、遺伝子に、当該プロモーターが当該遺伝子の転写を開始させる位置に、当該プロモーターが配置されるときに、作動可能に連結される。エンハンサーは、遺伝子に、当該エンハンサーが、適切な転写因子により結合されたときに、当該遺伝子の発現を制御（例えば、上方制御）可能となるときに、作動可能に連結される。

「組み換え」とは、当該技術分野における使用と一致して使用され、単一の配列の一部として、自然には一緒に存在しない部分、または、自然に存在する配列と比較して再配列されている部分を含む核酸配列を意味する。組み換え核酸は、人の手を伴うプロセスにより作製される、及び／または、人の手により（例えば、複製、増幅、転写などの、１つ以上のサイクルにより）作製された核酸から生成される。組み換えウイルスは、組み換え核酸を含むウイルスである。組み換え細胞は、組み換え核酸を含む細胞である。

本明細書で使用する場合、用語「組み換えレンチウイルスベクター」または「組み換えＬＶ」とは、人の介入及び操作の結果として、ＬＶ、及び複数の追加のセグメントから組み立てられた、人工的に作製されたポリヌクレオチドを意味する。

「有効量」とは、未治療の患者と比較して、疾患の症状を緩和または排除するのに必要な剤、または、当該剤を含む組成物の量を意味する。疾患の治療的処置のために、本明細書に記載の方法を実施するために使用する組成物（複数可）の有効量は、患者の投与様式、年齢、体重、及び総体的な健康に応じて変化する。究極的には、担当医師または獣医が、適切な量及び投薬レジメンを決定するだろう。そのような量は、「有効」量と呼ばれる。

ヒト血液細胞での、ｇｐ９１^ｐｈｏｘの内因性発現パターンを示す。エンハンサー活性を証明するために使用した構築物を示す。１６日目における、ＣＢＣＤ３４＋分化好中球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋）における、エンハンサー構築物の発現を示す。１６日目における、ＣＢＣＤ３４＋分化単球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）における、エンハンサー構築物の発現を示す。形質導入ＲＡＭＯ（Ｂ細胞株）Ｄ１４フローにおける、エンハンサー構築物の発現を示す。形質導入Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）Ｄ１６フローにおける、エンハンサー構築物の発現を示す。１６日目における、ＣＢＣＤ３４＋分化好中球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋）における、エンハンサー構築物の発現を示す。１６日目における、ＣＢＣＤ３４＋分化単球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）における、エンハンサー構築物の発現を示す。形質導入Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）Ｄ１６フローにおける、エンハンサー構築物の発現を示す。形質導入ＲＡＭＯ（Ｂ細胞株）Ｄ１４フローにおける、エンハンサー構築物の発現を示す。Ｅ２－Ｅ４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥベクター（上）の構造、及び同一のベクターを示し、ｍＣｉｔｒｉｎｅが、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸で置き換えられている（下）。１６日目における、ＣＢＣＤ３４＋分化好中球における、サイズが低下したベクターの発現を示す（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋）。１６日目における、ＣＢＣＤ３４＋分化単球における、サイズが低下したベクターの発現を示す（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）。Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞株）における、サイズが低下したベクターの発現を示す。ＲＡＭＯ細胞（Ｂ細胞株）における、サイズが低下したベクターの発現を示す。「コア」、「ウルトラコア」、「エクストラコア」、及び「エクストラウルトラコア」構築物の、そのままの小スケール力価を示す。ＰＬＢ－９８５Ｘ－ＣＧＤ^－／－細胞における、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘの様々なコドン最適化により生み出された発現レベルを示す。ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥの様々なコドン最適化の、そのままの力価を示す。Ｘ－ＣＧＤの治療のためのレンチウイルスベクターの、一実施形態を示す。治療で使用するために、ｍＣｉｔレポーターを、例えば、本明細書に記載するＧｐ９１ｐｈｏｘをコードする核酸配列で置き換える。Ｘ－ＣＧＤを治療するために最適化されたレンチウイルスベクターの、一実施形態を示す。ＵＣ２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｃｏＧｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＲＰＥのエレメントを概略的に示す。Ｘ－ＣＧＤを治療するために最適化されたレンチウイルスベクターの、一実施形態を示す。ベクターの「マップ」を示す。ベクターを、元の２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥからコアバリアント、及び、ウルトラコア（ＵＣ）バリアントに最適化したときの、力価（上）及び感染性（下）の改善を示す。ＵＣバリアント（ＭｙｅｌｏＶｅｃはリード候補ベクターである）。ＭｙｅｌｏＶｅｃが、血液細胞において、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の内因性発現パターンを再利用可能であることを示す。ＭｙｅｌｏＶｅｃが、骨髄細胞において、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の内因性発現パターンを再利用可能であることを示す。ＭｙｅｌｏＶｅｃは、好中球の成長を通して、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の一時的発現パターンを再利用可能であることを示す。好中球が成熟するにつれ、発現は高くなり、これは、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子のパターンを模倣している。Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ発現の回復を示す。野生型レベルまでの、オキシダーゼ活性の回復を示す。末梢血における、好中球及び単球でのＧｐ９１^ｐｈｏｘ発現の回復を示す。血液好中球及び単球における、野生型レベルとほぼ同じまでの、オキシダーゼ活性の回復を示す。骨髄好中球及び単球における、高レベルのＧｐ９１^ｐｈｏｘ発現の回復を示す。野生型レベルのオキシダーゼ活性の回復を示す。ＭｙｅｌｏＶｅｃが、ヒトＸ－ＣＧＤ好中球において、野生型レベルのＧｐ９１^ｐｈｏｘ発現を回復する能力を示す。ＭｙｅｌｏＶｅｃが、ヒトＸ－ＣＧＤ好中球において、野生型レベルの細胞オキシダーゼ活性を回復する能力を示す（ＤＨＲアッセイ）。ＭｙｅｌｏＶｅｃが、１．６３の平均ＶＣＮにおいて、ヒトＸ－ＣＧＤ好中球における野生型レベルのバルクオキシダーゼ活性を回復する能力を示す（シトクロムＣアッセイ）。

様々な実施形態では、Ｘ連鎖慢性肉芽腫症（Ｘ－ＣＧＤ）の治療（または予防）に供されるレンチウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターは、ベクターのサイズを低下させ、発現レベル及び力価を増加させるように最適化される。加えて、様々な実施形態では、ベクターは、例えば、本明細書に記載する、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子のリネージ特異的発現パターンを再利用する（例えば、図１を参照されたい）。

本明細書に記載するように（例えば、実施例１を参照されたい）、食細胞抗細菌オキシダーゼ系のｇｐ９１^ｐｈｏｘ構成成分を産生する、ＣＹＢＢ遺伝子についてのバイオインフォマティクス情報を分析することによって、ヒストン標識、ＤＮＡｓｅ高感受性部位、及び、転写因子を結合するための配列モチーフに基づく、いくつかの推定の転写制御ドメインが識別された。

１５個の推定の内因性エンハンサーエレメントを、ネイティブＣＹＢＢの位相的に関連するドメイン（ＴＡＤ）の中で識別した。ＣＹＢＢ遺伝子を制御する決定的なエンハンサーエレメントを実験により識別するために、各推定のエンハンサーエレメントを内因性ＣＹＢＢプロモーターの上流でクローニングし、レポーター遺伝子（ｍＣｉｔｒｉｎｅ）の発現を駆動した（例えば、図２を参照されたい）。推定の各エンハンサーエレメントの機能を明らかにするために、３つのオンターゲット細胞リネージである、臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋分化成熟好中球及び単球、加えて、ＲＡＭＯ細胞（Ｂリンパ球細胞株）において、ベクターのそれぞれの活性をアッセイした。

エンハンサーエレメント４は、成熟好中球及び単球において、Ｂ細胞を発現することなく、高レベルの発現を駆動することが判明した。エンハンサーエレメント２は、好中球において発現することなく、Ｂ細胞において高レベルのリネージ特異的発現を駆動することもまた判明した。エンハンサーエレメントのいずれもが、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）では発現せず、このことは、各エンハンサーエレメントのリネージ特異的発現を示唆している。

エンハンサーエレメント４は、２つの異なるエンハンサーモジュール（４Ｌ及び４Ｒ）で構成されることもまた判明し、これらを評価し、これらのエレメントのうちの１つを除去して、ベクターのサイズを低下させることが可能か否かを評価した。

加えて、エンハンサーエレメント２、エンハンサーエレメント４、イントロンエンハンサー３、及びＣＹＢＢ内因性プロモーターの減少バリアントを作製し評価した。Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸のコドン最適化物もまた評価した。

これらの発見の見地から、様々な実施形態では、慢性肉芽腫症の治療のための組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、上記ベクターが、ＣＹＢＢ内因性プロモーターまたはその効果的な断片を含む核酸構築物を含む発現カセット；及び、ＣＹＢＢプロモーターまたはプロモーター断片に作動可能に連結されたｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸を含む、上記ベクターを提供する。特定の実施形態では、ＣＹＢＢプロモーターまたはその効果的な断片は、完全長内因性ＣＹＢＢプロモーターを含む（例えば、表１、配列番号１を参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＹＢＢプロモーターは、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含み、上記断片は、最小ＣＹＢＢプロモーターを含むか、またはこれからなる（例えば、表１、配列番号３を参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＹＢＢプロモーターは、配列が最小ＣＹＢＢプロモーターからなるＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片からなる（例えば、表１、配列番号３を参照されたい）。

特定の実施形態では、レンチウイルスベクター中の発現カセットは、エンハンサーエレメント２（例えば、表１、配列番号４を参照されたい。）、またはその効果的な断片を含む。特定の実施形態では、エンハンサーエレメント２の効果的な断片の配列は、エンハンサーエレメント２「コア」の配列を含むか、またはこれからなる（例えば、表１、配列番号５を参照されたい）。特定の実施形態では、エンハンサーエレメント２の効果的な断片の配列は、エンハンサーエレメント２コアの配列からなる（例えば、表１、配列番号５を参照されたい）。特定の実施形態では、エンハンサーエレメント２の効果的な断片の配列は、エンハンサーエレメント２「ウルトラコア」配列を含むか、またはこれからなる（例えば、表１、配列番号６を参照されたい）。特定の実施形態では、エンハンサーエレメント２の上記効果的な断片の配列は、エンハンサーエレメント２ウルトラコアの配列からなる（例えば、表１、配列番号６を参照されたい）。

特定の実施形態では、レンチウイルスベクターを含む発現カセットは、ＲＥＬＡＴＦ結合部位、またはその効果的な断片をさらに含む。特定の実施形態では、ＲＥＬＡＴＦ結合部位は、表１の配列番号７の核酸配列を含むか、またはこれからなる。

特定の実施形態では、レンチウイルスベクター中の発現カセットは、エンハンサーエレメント４（例えば、表１、配列番号８を参照されたい。）、またはその効果的な断片を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント４Ｒ（例えば、表１、配列番号９を参照されたい。）、またはその効果的な断片を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、核酸配列は、エンハンサーエレメント４Ｒコアの核酸配列を含むか、またはこれからなる（例えば、表１、配列番号１０を参照されたい）。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、上記断片の核酸配列は、エンハンサーエレメント４Ｒ「ウルトラコア」の核酸配列を含むか、またはこれからなる（例えば、表１、配列番号１１を参照されたい）。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、上記断片の核酸配列は、エンハンサーエレメント４Ｒ「ウルトラコア」の核酸配列からなる（例えば、表１、配列番号１１を参照されたい）。

特定の実施形態では、レンチウイルスベクター中の発現カセットは、エンハンサーエレメント４Ｌ（例えば、表１、配列番号１２を参照されたい。）、またはその効果的な断片を含む。特定の実施形態では、エンハンサーエレメント４Ｌの効果的な断片は、４Ｌコア配列の配列を含むか、またはこれからなる（例えば、表１、配列番号１３を参照されたい）。特定の実施形態では、エンハンサーエレメント４Ｌの効果的な断片は、４Ｌコア配列の配列からなる（例えば、表１、配列番号１３を参照されたい）。

特定の実施形態では、レンチウイルスベクター中の発現カセットは、イントロンエンハンサーエレメント３（例えば、表１、配列番号１４を参照されたい。）、またはその効果的な断片を含む。特定の実施形態では、レンチウイルスベクター中の発現カセットは、表１の配列番号１５の核酸配列を含むか、またはこれからなる、イントロンエンハンサーエレメント３中間断片を含むか、またはこれからなる。特定の実施形態では、レンチウイルスベクター中の発現カセットは、表１の配列番号１５の核酸配列からなる、イントロンエンハンサーエレメント３中間断片を含むか、またはこれからなる。特定の実施形態では、レンチウイルスベクター中の発現カセットは、表１の配列番号１６の核酸配列を含むか、またはこれからなる、イントロンエンハンサーエレメント３右断片を含むか、またはこれからなる。

特定の実施形態では、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸は、完全ＣＹＢＢ遺伝子、ＣＹＢＢｃＤＮＡ、またはコドン最適化ＣＹＢＢである。特定の実施形態では、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸は、ＣＹＢＢｃＤＮＡである（例えば、表１、配列番号１７を参照されたい）。特定の実施形態では、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸は、コドン最適化ＣＹＢＢ（例えば、ｊＣＡＴコドン最適化ＣＹＢＢ）（例えば、表１、配列番号１８を参照されたい。）、ＧｅｎｅＡｒｔ最適化ＣＹＢＢ（例えば、表１、配列番号２０を参照されたい。）、ＩＤＴ最適化ＣＹＢＢ（例えば、表１、配列番号２１を参照されたい。）、及び、以前の臨床候補（例えば、表１、配列番号１９を参照されたい。）である。特定の実施形態では、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする上記核酸の配列は、ｊＣＡＴコドン最適化ＣＹＢＢである（例えば、表１、配列番号１８を参照されたい）。

レンチウイルスベクターの文脈において本明細書に記載する発現カセットは、本文脈に限定される必要がないことが理解されよう。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載するＣＹＢＢ制御エレメントのうちのいずれか１つ以上を含む組み換え核酸が想到される。特定の実施形態では、組み換え核酸は、発現カセット、例えば、インビボでＧｐ９１^ｐｈｏｘを発現するのに効果的な発現カセットを含む。このような発現カセットを、他の構築物と共に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築物と組み合わせて使用することができることが理解されよう。

様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、例えば、インスレーター（例えば、３’ＬＴＲ中のＦＢインスレーター）の存在を含むことができる、様々な「安全性」特徴を有することができる。加えて、または代替的に、特定の実施形態では、ＨＩＶＬＴＲは、代替のプロモーター（例えば、ＣＭＶ）で置換されており、パッケージングの間にＨＩＶＴＡＴタンパク質を含めることなく、より高い力価のベクターが得られる。他の強力なプロモーター（例えば、ＲＳＶなど）もまた、使用することができる。

様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターで典型的に発見されるエレメントのうちの、いずれか１つ以上を含有する。このようなエレメントとしては、例えば、後述するような、Ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナル、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ポリプリン帯（例えば、中央ポリプリン帯、３’ポリプリン帯など）、翻訳後制御エレメント（例えば、修飾ウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ））、インスレーターなどが挙げられるが、これらに限定される必要はない。

様々な実施形態では、ベクターは、組み換えによる野生型レンチウイルスの再構成が実質的に不可能な、ＳＩＮベクターである。

特定の実施形態では、ベクターは、図２０Ａに示す「ウルトラコア」（ＵＣ）２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－Ｐｒｏ－（ＧＰ９１－ｊｃａｔ）－ＷＰＲＥの特徴を含む。特定の実施形態では、ベクターは、図２０Ｂに表すベクターに示す特徴を含む。特定の実施形態では、ベクターは、ウルトラコア（ＵＣ）２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－Ｐｒｏ－（ＧＰ９１－ｊｃａｔ）－ＷＰＲＥのヌクレオチド配列（配列番号２２）を含む。

様々な実施形態では、ベクターは、ＣＤ３３＋（バルク骨髄細胞）において高い発現、及び／またはＣＤ１９＋（Ｂ細胞）において高い発現、ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１６＋（成熟好中球）において高い発現、及び／または、ＣＤ３＋（Ｔ細胞）において低い、もしくはゼロの発現を示す。様々な実施形態では、ベクターは、ＣＤ３３＋（バルク骨髄細胞）において高い発現、ＣＤ１９＋（Ｂ細胞）において高い発現、ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１６＋（成熟好中球）において高い発現、及び、ＣＤ３＋Ｔ細胞において低い、またはゼロの発現を示す。

上で示すように、実施例１において、本明細書に記載するベクターは、高力価で細胞を形質導入し、または、高レベルのＧｐ９１^ｐｈｏｘの発現をもたらすのに効果的である。

これらの結果を鑑みると、本明細書に記載するＬＶ、例えば、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸を発現する、組み換えＴＡＴ独立ＳＩＮＬＶを使用して、対象（例えばヒト、及び非ヒト哺乳類）において、Ｘ連鎖慢性肉芽腫症（Ｘ－ＣＧＤ）を効果的に治療することができると考えられる。これらのベクターを、治療のために、幹細胞（例えば、造血幹細胞及び造血前駆細胞）の改変を必要とする対象（例えば、Ｘ－ＣＧＤを有するものと識別された対象）に導入可能な、幹細胞の改変に使用することができると考えられている。さらに、得られた細胞は、対象の健康の著しい改善を示すのに十分なトランスジェニックＧｐ９１^ｐｈｏｘタンパク質を産生すると考えられている。ベクターを、対象に直接投与して、標的（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）のインビボ形質導入を実現することができ、これによって、治療を必要とする対象の治療に影響を及ぼすことができるともまた、考えられている。

上述のとおり、様々な実施形態では、本明細書に記載するＬＶは、様々な安全性特徴を含むことができる。例えば、ＨＩＶＬＴＲは、ＣＭＶプロモーターで置換されており、パッケージングの間にＨＩＶＴＡＴタンパク質を含めることなく、より高い力価ベクターが得られる。特定の実施形態では、インスレーター（例えば、ＦＢインスレーター）を、安全性のために３’ＬＴＲに導入することができる。ＬＴをまた構築して、効率的な形質導入、及び高い力価をもたらす。

前述のエレメントは例示的であり、限定を行う必要はないことが理解されよう。本明細書で提供する教示の観点から、これらのエレメントに対する好適な置換が当業者により認識され、本明細書で提供する教示の範囲内で想倒される。

Ｇｐ９１^ｐｈｏｘコドン最適化。
上述のとおり、様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＹＢＢ遺伝子またはｃＤＮＡを含むことができる。しかし、特定の実施形態では、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸はコドン最適化されている。コドン最適化の様々な方法は、当業者に既知である。例示的な一方法は、ＪＣａｔ（Ｊａｖａコドン適応ツール）である。ｊＣＡＴツールは、遺伝子コドンの使用法を、大部分の配列決定された原核生物、及び様々な真核細胞遺伝子宿主に適用する。多くのツールとは対照的に、ＪＣａｔは、非常に発現した遺伝子のマニュアル定義を必要とせず、それ故に、非常に迅速で容易な方法である。コドン適応のためのＪＣａｔのさらなるオプションとしては、制限酵素及びＲｈｏ独立転写ターミネーターに対する、不必要な切断部位の回避が挙げられる。ＪＣａｔの出力は共に図形によるものであり、入力配列、及び新規に適応した配列に対して、コドン適応指数（ＣＡＩ）値として与えられる。ＪＣａｔ最適化は、Ｇｒｏｔｅｅｔａｌ．（２００５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３３（ｓｕｐｐｌ２）：Ｗ５２６－Ｗ５３１）により記載されており、ＪＣａｔツールは、ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅにてオンラインで利用可能である。

別のコドン最適化ツールは、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）製）により提供される。

更に別のコドン最適化ツールはＩＤＴである。新しい生体での、各コドンの使用法の頻度に基づき、コドン使用法を再度割り当てることにより、発現のために、ある生体由来のＤＮＡまたはタンパク質配列を、別の生体に対して最適化するために、ＩＤＴコドン最適化ツールを開発した。例えば、バリンは、４つの異なるコドン（ＧＵＧ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、及びＧＵＡ）によりコードされる。しかし、ヒト細胞株では、ＧＵＧコドンが優先的に使用される（４６％の使用、これに対してそれぞれ１８、２４、及び１２％）。コドン最適化ツールはこの情報を考慮して、バリンコドンを、これらと同一頻度で割り当てる。さらに、ツールのアルゴリズムは、コドンを１０％未満の頻度で取り除き、残りの頻度を１００％に再度正規化する。さらに、最適化ツールは、製造及び下流発現、例えば反復、ヘアピン、及び極度のＧＣ含有量と干渉する可能性がある複雑性を低下させる。ＩＤＴ最適化ツールは、ＩＤＴ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）から入手可能であり、ｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔで発見することができる。

他のコドン最適化ツールとしては、ｃｏｄｏｎｗ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで発見することができる、オープンソースのソフトウェアプログラムであるＣｏｄｏｎＷ、及び、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ製のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）アルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、実施例１に示すように、コドン最適化Ｇｐ９１^ｐｈｏｘは、現在の臨床候補ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥで使用する配列であることができる。

これらのコドン最適化は例示的であり、非限定的である。本明細書、及び実施例１で提供する教示を使用して、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘコドンの使用法を、特定用途に対して速やかに最適化することができる。

ＴＡＴ独立及び自己不活型レンチウイルスベクター。
安全性をさらに改善するために、様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクターは、ＴＡＴ独立自己不活型（ＳＩＮ）構成を含む。したがって、さまざまな実施形態では、本明細書に記載するＬＶ内で、野生型ＬＴＲと比較してプロモーター活性が低下したＬＴＲ領域を用いるのが望ましい。効果的に「自己不活型」（ＳＩＮ）であり、バイオセーフティの特徴をもたらす、このような構築物を提供することができる。ＳＩＮベクターは、形質導入した細胞内での、完全長ベクターＲＮＡの産生が大幅に減少している、または、完全になくなっているベクターである。この特徴は、複製能を有する組み換え物（ＲＣＲ）が出現するリスクを最小化する。さらに、この特徴は、ベクター組み込み部位に隣接して位置する細胞コード配列が、異常に発現するリスクを低下させる。

さらに、ＳＩＮの設計は、ＬＴＲと、導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターとが干渉する可能性を低下させる。ＳＩＮＬＶは多くの場合、内部プロモーターの完全な活性を可能にすることができる。

ＳＩＮの設計は、ＬＶのバイオセーフティを増加させる。ＨＩＶＬＴＲの大部分は、Ｕ３配列を含む。Ｕ３領域は、感染細胞内で、及び、細胞の活性化に応答して、ＨＩＶゲノムの基礎的な、及び誘発された発現を制御する、エンハンサー及びプロモーターエレメントを含有する。これらのプロモーターエレメントのいくつかは、ウイルス複製のために不可欠である。エンハンサーエレメントのいくつかは、ウイルス単離物の間で非常に保存され、ウイルス性病原体における、決定的な病原性因子であることが示唆されている。エンハンサーエレメントは、ウイルスの異なる細胞標的において、複製速度に影響を及ぼす可能性がある。

５’ＬＴＲのＵ３領域の３’末端にて、ウイルス転写が開始するため、これらの配列は、ウイルスｍＲＮＡの一部ではなく、３’ＬＴＲからのこのコピーは、組み込まれたプロウイルスの両方のＬＴＲを生成するためのテンプレートとして機能する。Ｕ３領域の３’複写がレトロウイルスベクター構築物に変更される場合、ベクターＲＮＡは依然として、プロデューサー細胞内のインタクトな５’ＬＴＲから産生されるが、標的細胞内では再生成することができない。このようなベクターを形質導入することにより、後代ウイルスにおいて、両方のＬＴＲの不活化がもたらされる。したがって、レトロウイルスは自己不活型（ＳＩＮ）であり、これらのベクターは、ＳＩＮ転写ベクターとして知られている。

特定の実施形態では、自己不活化は、ベクターＤＮＡ、即ち、ベクターＲＮＡを作製するために使用するＤＮＡの、３’ＬＴＲのＵ３領域における、欠失の導入により実現される。ＲＴの間、この欠失を、プロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲに移す。典型的には、十分なＵ３配列を取り除いて、ＬＴＲの転写活性を大幅に減少させる、または、完全になくし、これにより、形質導入細胞における完全長ベクターＲＮＡの産生を大幅に減少させる、または完全になくすのが望ましい。しかし、典型的にはＵ３、Ｒ、及びＵ５にわたり拡大する機能である、ウイルスＲＮＡのポリアデニル化に関与する、ＬＴＲのこれらのエレメントを保持するのが一般的に望ましい。したがって、特定の実施形態では、ポリアデニル化決定基を節約しながら、できるだけ多くの、ＬＴＲ由来の転写に重要なモチーフを取り除くのが望ましい。

ＳＩＮ設計は、Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．（１９９８）ＪＶｉｒｏｌ．７２（１２）：９８７３－９８８０、及び、米国特許第５，９９４，１３６号に詳述されている。しかし、これらに記載されているように、３’ＬＴＲにおいて、欠失の程度が制限されている。まず、Ｕ３領域の５’末端は、ベクター移動における別の不可欠な機能を果たし、組み込み（末端ジヌクレオチド＋ａｔｔ配列）のために必要である。したがって、末端ジヌクレオチド及びａｔｔ配列は、欠失可能なＵ３配列の５’の境界を示し得る。さらに、いくつかの緩やかに定められた領域は、Ｒ領域内の下流ポリアデニル化部位の活性に影響を及ぼし得る。３’ＬＴＲから、Ｕ３配列が過度に欠失されることによって、ベクター転写物のポリアデニル化が低下し得、プロデューサー細胞内でのベクターの力価、及び、標的細胞内での導入遺伝子発現の両方において、逆の結果を伴う。

追加のＳＩＮ設計は、米国特許公開第２００３／００３９６３６号に記載されている。当該明細書に記載されているように、特定の実施形態では、ＬＴＲから取り除かれたレンチウイルス配列を、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来の相当する配列で置き換えることにより、ハイブリッドＬＴＲを形成する。具体的には、ＬＴＲ内のレンチウイルスＲ領域を、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来のＲ領域によって、全体で、または部分的に置き換えることができる。特定の実施形態では、ＴＡＴタンパク質と相互作用してウイルス複製を向上させる配列である、レンチウイルスＴＡＲ配列を、Ｒ領域から、好ましくは全て取り除く。次に、ＴＡＲ配列を、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来のＲ領域の相当する部分で置き換えることによって、ハイブリッドＲ領域を形成する。ＬＴＲをさらに組み換え、レンチウイルスＵ３及びＵ５領域の全部分または一部を取り除くことができる、及び／または、当該部分を、非レンチウイルス配列で置き換えることができる。

したがって、特定の実施形態では、ＳＩＮ構成は、そのＴＡＲ配列の全部分または一部を欠くハイブリッドレンチウイルスＲ領域を含むレトロウイルス型ＬＴＲを提供し、これにより、ＴＡＴにより、任意の可能性のある活性化が取り除かれ、ここで、ＴＡＲ配列またはその一部は、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来のＲ領域の相当する部分で置き換えられることにより、ハイブリッドＲ領域が形成される。特定の実施形態では、レトロウイルスＬＴＲはハイブリッドＲ領域を含み、ハイブリッドＲ領域は、ＴＡＲ配列を欠く、ＨＩＶＲ領域の一部（例えば、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１０に示すヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる一部）、及び、ＨＩＶＲ領域を欠くＴＡＲ配列に相当する、ＭｏＭＳＶＲ領域の一部（例えば、２００３／００３９６３６において配列番号９に示すヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる一部）を含む。別の特定の実施形態では、ハイブリッドＲ領域全体は、２００３／００３９６３６において配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。

Ｒ領域が由来することができる好適なレンチウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ（ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）、ＥＩＶ、ＳＩＶ、ならびにＦＩＶが挙げられる。非レンチウイルスである配列が由来することができる好適なレトロウイルスとしては、例えば、ＭｏＭＳＶ、ＭｏＭＬＶ、Ｆｒｉｅｎｔ、ＭＳＣＶ、ＲＳＶ、及びスプマウイルスが挙げられる。例示的な一実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶであり、非レンチウイルスであるレトロウイルスはＭｏＭＳＶである。

ＵＳ２００３／００３９６３６に記載されている別の実施形態では、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは、左（５’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流にあるプロモーター配列をさらに含む。好ましいプロモーターは、由来が非レンチウイルスであり、例えば、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来のＵ３領域（例えば、ＭｏＭＳＶのＵ３領域）が挙げられる。特定の一実施形態では、Ｕ３領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１２に示すヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、左（５’）ＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域の下流にあるレンチウイルスＵ５領域をさらに含む。一実施形態では、Ｕ５領域は、ゲノム組み込みに必要なＨＩＶａｔｔ部位を含む、ＨＩＶのＵ５領域である。別の実施形態では、Ｕ５領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１３に示すヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、左（５’）ハイブリッドＬＴＲ全体は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む。

別の例示的な実施形態では、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは、右（３’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流にある、改変（例えば、切頭）レンチウイルスＵ３領域をさらに含む。改変レンチウイルスＵ３領域はａｔｔ配列を含むことができるが、プロモーター活性を有する任意の配列を欠いていることで、ウイルス転写が、染色体組み込み後の第１ラウンドの複製を超えて進むことができないという点で、ベクターがＳＩＮとなることを引き起こす。特定の実施形態では、ハイブリッドＲ領域の上流にある改変レンチウイルスＵ３領域は、最大でレンチウイルスＵ３ａｔｔ部位までで、この部位を含む、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）Ｕ３領域の３’末端からなる。一実施形態では、Ｕ３領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１５に示すヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、右（３’）ＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域の下流にあるポリアデニル化配列をさらに含む。別の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１６に示すヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、右（５’）ＬＴＲ全体は、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号２または１７に示すヌクレオチド配列を含む。

したがって、ＨＩＶベースのＬＶの場合、このようなベクターは、ベクター力価が著しく低下することなく、ＬＴＲＴＡＴＡボックスの除去（例えば、－４１８～－１８の欠失）を含む、著しいＵ３の欠失を許容することが発見された。これらの欠失は、ＬＴＲの転写能力が約９０％以下まで低下するという点で、ＬＴＲ領域を実質的に転写不活性にする。

転写ベクター構築物中の上流ＬＴＲの一部が、恒常的活性型プロモーター配列により置き換えられる場合、Ｔａｔのｔｒａｎｓ作用機能が分配可能となることもまた、示されている（例えば、Ｄｕｌｌｅｔａｌ．（１９９８）ＪＶｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３－８４７１を参照されたい）。さらに、ｔｒａｎｓ内でのｒｅｖの発現により、ｇａｇ及びｐｏｌのみを含有するパッケージング構築物からの、高力価のＨＩＶ由来のベクターストックの産生が可能となることを示す。この設計により、プロデューサー細胞内でのみ利用可能な相補性を条件とした、パッケージング機能の発現がなされる。得られる遺伝子導入システムは、ＨＩＶ－１の９個の遺伝子のうち３つのみを保存し、形質導入粒子を産生するための、４つの個別の転写ユニットに左右される。

実施例１に示す一実施形態では、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸を発現するカセットは、５’ＬＴＲで置換されたＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含むＳＩＮベクターである。

ＣＭＶプロモーターは典型的には、高レベルの非組織特異性発現をもたらすことが理解されよう。同様の構成活性を有する他のプロモーターとしては、ＲＳＶプロモーター、及びＳＶ４０プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。βアクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、伸長因子１αプロモーター、チューブリンプロモーターなどといった哺乳類プロモーターもまた、使用することができる。

前述のＳＩＮ構成は例示的なものであり、非限定的なものである。多数のＳＩＮ構成が、当業者に既知である。上述のように、特定の実施形態では、ＬＴＲ転写は、約９５％～約９９％低下する。特定の実施形態では、ＬＴＲは、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、転写不活性となり得る。

インスレーターエレメント
特定の実施形態では、バイオセーフティをさらに高めるために、インスレーターを、本明細書に記載するレンチウイルスベクターに挿入する。インスレーターは、ゲノム全体に存在するＤＮＡ配列エレメントである。これらは、クロマチンを改変して局所的な遺伝子発現を変化させるタンパク質に結合する。本明細書に記載するベクターにインスレーターを配置することによって、とりわけ、１）染色体を隣接させることにより、ベクターを、発現の位置的な効果ふ入りを遮断すること（即ち、バリア活性）と；２）ベクターにより、染色体の、遺伝子発現の挿入性ｔｒａｎｓ活性化との隣接を遮断すること（エンハンサーブロッキング）と、を含む、様々な潜在的な利益がもたらされる。したがって、インスレーターは、その発現が、別の場合においては、ゲノムまたは遺伝のコンテクストでは制御シグナルにより影響を受け得る、ゲノムまたは遺伝コンテクストに埋め込まれる、遺伝子または転写ユニットの独立した機能を保存するのに役立つことができる（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ－Ｂｅｕｓｓｅｅｔａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６４３３；及びＺｈａｎｅｔａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照されたい）。本文脈では、インスレーターは、レンチウイルスが発現する配列を、組み込み部位の影響から保護するのに寄与し得、これは、ゲノムＤＮＡに存在する、ｃｉｓ作用エレメントにより媒介され得、移った配列の制御緩和された発現をもたらす。様々な実施形態では、インスレーター配列が、細胞ゲノムに組み込むベクターの、１つもしくは両方のＬＴＲ、または領域内の他の箇所に挿入されるＬＶが提供される。

第１の、及び、最も特性決定された脊椎動物クロマチンインスレーターは、ニワトリのβグロビン座位制御領域の中に存在する。ＤＮａｓｅ－Ｉ高感受性部位（ｃＨＳ４）を含有する本エレメントは、ニワトリβグロビン座位の５’境界を構成するようである（Ｐｒｉｏｌｅａｕｅｔａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯＪ．１８：４０３５－４０４８）。ｃＨＳ４エレメントを含有する１．２ｋｂの断片は、細胞株（Ｃｈｕｎｇｅｔａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ，７４：５０５－５１４）における、グロビン遺伝子プロモーターとエンハンサーとの相互作用を遮断する能力、ならびに、位置効果から、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｉｄ．）、形質転換細胞株（Ｐｉｋａａｒｔｅｔａｌ．（１９９８）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１２：２８５２－２８６２）、及び、トランスジェニック哺乳類（Ｗａｎｇｅｔａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２３９－２４３；Ｔａｂｏｉｔ－Ｄａｍｅｒｏｎｅｔａｌ．（１９９９）ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．，８：２２３－２３５）において発現カセットを保護する能力を含む、典型的なインスレーター活性を示す。本活性の大部分は、２５０ｂｐの断片に含まれる。この伸長の中には、エンハンサー遮断アッセイ（Ｂｅｌｌｅｔａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８：３８７－３９６）で示唆される、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質ＣＴＣＦと相互作用する、４９ｂｐのｃＨＳ４コア（Ｃｈｕｎｇｅｔａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：５７５－５８０）が存在する。

例示的な１つの、かつ好適なインスレーターは、Ｒａｍｅｚａｎｉｅｔａｌ．（２００８）ＳｔｅｍＣｅｌｌ２６：３２５７－３２６６により記載されている、ニワトリβグロビンの５’ＨＳ４インスレーターの最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサー遮断構成要素、及び、ヒトＴ細胞受容体のα／δ遮断エレメントα／δＩ（ＢＥＡＤ－Ｉ）インスレーター由来の相同領域を含有する、７７ｂｐのインスレーターエレメントであるＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ－Ａ）である。ＦＢ「合成」インスレーターは、完全なエンハンサー遮断活性を有する。本インスレーターは、例示的であり限定を行うものではない。例えば、完全長ニワトリβグロビンＨＳ４またはそのインスレーターサブ断片、アンキリン遺伝子インスレーター、及び、他の合成インスレーターエレメントを含む、他の好適なインスレーターを使用することができる。

パッケージングシグナル。
様々な実施形態では、本明細書に記載するベクターは、パッケージングシグナルをさらに含む。「パッケージングシグナル」、「パッケージング配列」、または「ＰＳＩ配列」は、配列がパッケージングシグナルを含む核酸の、レトロウイルス粒子へのパッケージングを指示するのに十分な、任意の核酸配列である。この用語は、自然に存在するパッケージング配列、及びまた、その組み換えられたバリアントを含む。レンチウイルスを含む、多数の異なるレトロウイルスのパッケージングシグナルが、当技術分野において既知である。非限定的な、例示的な１つのＰＳＩは、配列番号２５により提供される。

Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）。
特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクターは、スプライシングされていないＲＮＡの核外搬出を向上させるための、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む。ＲＲＥは、当業者に周知である。例示的なＲＲＥとしては、ＨＩＶＮＬ４－３ゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００３８８７）の位置７６２２～８４５９に位置するものなどのＲＲＥ、加えて、ＨＩＶの他の株または他のレトロウイルス由来のＲＲＥが挙げられるが、これらに限定されない。このような配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、または、ｈｉｖ－ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘのＵＲＬのデータベースから速やかに入手することができる。非限定的な例示的な１つのＲＲＥを、配列番号２６に示す。

ポリプリン帯（ｃＰＰＴ、３’ＰＰＴ）。
様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクターは、ポリプリン帯（例えば、中央ポリプリン帯（ｃＰＰＴ）、３’ポリプリン帯（３’ＰＰＴ））をさらに含む。レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）ベクター構築物に、３’ＰＰＴ（例えば、配列番号２８を参照されたい。）、または、中央ポリプリン帯（ｃＰＰＴ）を含有する断片を挿入することで、形質導入の効率が向上することが知られている。

発現刺激転写後制御エレメント（ＰＲＥ）
特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、転写物内での存在が、タンパク質レベルでの異種核酸（例えば、ｇｐ９１^ｐｈｏｘ）の発現を増加させる、様々な転写後制御エレメント（ＰＲＥ）のいずれかを含むことができる。ＰＲＥは特に、特定の実施形態、特に、適度なプロモーターを含むレンチウイルス構築物を伴う実施形態で有用であり得る。

ＰＲＥの一種は、遺伝子発現を発現することができる、発現カセット内に位置するイントロンである。しかし、イントロンは、レンチウイルスの生活環事象の間にスプライシングされることができる。故に、イントロンがＰＲＥとして使用される場合、イントロンは通常、ベクターゲノム転写物とは反対方向に配置される。

スプライシング事象に依存しない転写後制御エレメントは、ウイルスの生活環の間に取り除かれないという利点をもたらす。いくつかの例は、単純ヘルペスウイルスの転写後処理エレメント、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の転写後制御エレメントである。これらのうち、ＨＰＲＥでは見出されない、追加のｃｉｓ作用エレメントを含有するため、ＷＰＲＥが通常は好まれる。本制御エレメントは典型的には、ベクター内に配置され、導入遺伝子のＲＮＡ転写産物の中には含まれるが、導入遺伝子翻訳ユニットの終止コドンの外に位置する。

ＷＰＲＥは特性決定されており、米国特許第６，１３６，５９７号に記載されている。当該明細書に記載されているように、ＷＰＲＥは、ＲＮＡの、核から細胞質への効率的な輸送を媒介する、ＲＮＡエクスポートエレメントである。ＷＰＲＥは、エレメント及び導入遺伝子が単一の転写物に含有されるように、ｃｉｓ作用核酸配列を挿入することにより、導入遺伝子の発現を向上させる。センス方向にＷＰＲＥが存在することにより、導入遺伝子の発現が、最大７～１０倍増加することが示された。イントロンとしての、完全なイントロン含有遺伝子は一般的に、レトロウイルス粒子の形成をもたらす事象の配列の間にスプライシングされる代わりに、レトロウイルスベクターは、ｃＤＮＡの形態で配列を輸送する。イントロンは、一時転写物の、スプライシング機構との相互作用を媒介する。スプライシング機構によるＲＮＡの処理が、その細胞質エクスポートを容易にするため、スプライシングと輸送機構との結合により、ｃＤＮＡは多くの場合、発現が非効率的となる。したがって、ベクターにＷＰＲＥ（例えば、配列番号２７を参照されたい。）を含めることにより、導入遺伝子の発現の向上がもたらされる。

形質導入宿主細胞、及び細胞形質導入の方法。
組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）、及び、本明細書に記載する、得られるウイルスは、異種核酸配列（例えば、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸）を哺乳類細胞に輸送することが可能である。様々な実施形態では、細胞に送達するために、本明細書に記載するベクターは、好適なパッケージング細胞株と組み合わせて使用する、または、必要なレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ）を含有する他のベクタープラスミドと共に、細胞にインビトロで同時トランスフェクションして、本発明の細胞をパッケージングし、細胞を感染させることが可能な、複製能を有しないヴィリオンを形成するのが好ましい。

特定の実施形態では、ベクターは、トランスフェクションによりパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ベクターゲノムを含有するウイルス粒子を作製する。トランスフェクションの方法は、当業者により周知である。パッケージングベクター及び転写ベクターをパッケージング細胞株に同時トランスフェクションした後で、組み換えウイルスを培養培地から回収し、当業者により使用される標準的な方法により滴定する。したがって、パッケージング構築物は、一般的に、ネオマイシン、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼなどの、優れた選択マーカーと共に、またはこれらなしで、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法を行い、続いて、適切な剤の存在下における選択、及びクローンの単離を行うことにより、ヒト細胞株に導入されることができる。特定の実施形態では、選択マーカーは、構築物中のパッケージング遺伝子に物理的に結合することができる。

パッケージング機能が、好適なパッケージング細胞により発現するように構成されている安定した細胞株が知られている（例えば、パッケージング細胞について記載している、米国特許第５，６８６，２７９号を参照されたい）。一般に、ウイルス粒子を作製するために、レンチウイルスＧａｇ及びＰｏｌ遺伝子の発現と適合性がある任意の細胞、または、このような発現を指示するために組み換え可能な任意の細胞を用いることができる。例えば、２９３Ｔ細胞及びＨＴ１０８細胞などのプロデューサー細胞を使用することができる。

パッケージング細胞は、当該明細書に組み込まれているレンチウイルスベクターと共に、プロデューサー細胞を形成する。したがって、プロデューサー細胞は、対象となる治療用遺伝子（例えば、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ）を運搬するパッケージ化された感染性ウイルス粒子を、作製または放出可能な細胞または細胞株である。これらの細胞はさらに、アンカレッジ依存性であることができ、これは、これらの細胞が、ガラスまたはプラスチックなどの表面に付着した際に、最適に増殖、生残、または機能を維持することを意味する。ベクターが複製可能であるときに、レンチウイルスベクターパッケージング細胞株として使用される、アンカレッジ依存性細胞株のいくつかの例は、ＨｅＬａまたは２９３細胞、及びＰＥＲＣ．６細胞である。

したがって、特定の実施形態では、遺伝子を細胞に送達し、これを次に、当該細胞のゲノムに組み込む方法であって、当該細胞を、本明細書に記載するレンチウイルスベクターを含有するヴィリオンと接触させることを含む、上記方法を提供する。細胞（例えば、組織または器官の形態である）を、エクスビボでヴィリオンと接触（例えば、感染）させ、次に、遺伝子（例えば、ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸）が発現する対象（例えば、哺乳類、動物、またはヒト）に送達することができる。様々な実施形態では、細胞は、対象に対して自己由来である（即ち、対象に由来する）ことができるか、または、対象に対して非自己である（即ち、同種異系もしくは異種である）ことができる。さらに、本明細書に記載するベクターは、分裂及び非分裂細胞の両方に送達可能であるために、細胞は、例えば、骨髄細胞、（例えば、脂肪組織から入手される）間葉幹細胞、ならびに、ヒト及び動物源に由来する他の一次細胞を含む、様々な種類から由来することができる。あるいは、ヴィリオンは、対象、または、対象の局在的な範囲（例えば、骨髄）に、インビボで直接投与することができる。

特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチベクターは特に、骨髄、末梢血、または臍帯血のいずれかから入手される、ヒト造血前駆細胞または造血幹細胞の形質導入、加えて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞などの形質導入で有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞及び前駆細胞である。

遺伝子療法。
さらに他の実施形態では、ヒト造血幹細胞を形質導入する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、造血幹細胞を含むヒト細胞の集団を、ベクターにより、上記集団においてヒト造血前駆細胞の形質導入をもたらす条件下において、前述のレンチベクターのうちの１つと接触させることを伴う。幹細胞は、最終用途に応じて、インビボまたはインビトロで形質導入することができる。ヒト幹細胞の遺伝子療法といった、ヒト遺伝子療法の文脈において、幹細胞をインビボで、または、代替的に、インビトロで形質導入した後、形質導入した幹細胞をヒト対象に注入することができる。本実施形態の一態様では、ヒト幹細胞は、当業者に周知の方法を使用して、ヒト、例えば、Ｘ－ＣＧＤ患者から取り除くことができ、上述のとおりに形質導入することができる。形質導入した幹細胞を次に、同一または異なるヒトに再導入する。

幹細胞／前駆細胞遺伝子療法。
様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチベクターは、骨髄、末梢血、または臍帯血のいずれかから入手される、ヒト造血前駆細胞または造血幹細胞（ＨＳＣ）の形質導入、加えて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞などの形質導入に特に有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞及び前駆細胞である。

細胞、例えば、ＣＤ３４^＋細胞、樹状細胞、末梢血細胞、または腫瘍細胞がエクスビボに形質導入されたときに、ベクター粒子は、一般的に、１０^５ｃｅｌｌｓ当たりで、ウイルスベクターの１×１０^５～５０×１０^５個の形質導入ユニットにもまた対応する、１～５０の感染多重度（ＭＯＩ）のオーダーの用量で使用して細胞と共にインキュベートされる。これは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、及び５０ＭＯＩに対応するベクターの量を含むことができる。典型的には、ベクターの量は、ＨＴ－２９形質導入ユニット（ＴＵ）の観点で表現することができる。

特定の実施形態では、細胞ベースの療法は、幹細胞及び／または造血前駆体を提供することを伴い、細胞に、例えば、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードするレンチウイルスを形質導入した後で、当該治療法を必要とする対象（例えば、ＣＹＢＢ遺伝子に変異を有する対象）に形質転換細胞を形質導入する。

特定の実施形態では、方法は、対象由来の細胞、例えば、幹細胞の集団を単離することを伴い、任意選択的に、細胞を組織培地で増殖させ、細胞内で存在することにより、インビトロで細胞内でのＧｐ９１^ｐｈｏｘの産生がもたらされるレンチウイルスベクターを投与する。次に、細胞を対象に戻し、ここで、例えば、細胞は、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘを産生する食細胞の集団をもたらし得る。

いくつかの例示的かつ非限定的実施形態では、細胞株由来の、または、対象以外の個体由来の細胞であり得る細胞の集団を使用することができる。幹細胞、免疫系細胞などを対象から単離し、当該対象にこれらの細胞を戻す方法は、当該技術分野において周知である。このような方法は、例えば、化学療法を受ける患者において、骨髄移植、末梢血幹細胞移植などのために使用される。

幹細胞が使用される予定の場合、このような細胞は、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）などを含む多数の源に由来することができることが理解されよう。特定の実施形態では、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の使用が想倒される。造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離し、このような細胞を形質導入して哺乳類対象に導入する方法は、当業者に周知である。

特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクター（例えば、図１９を参照されたい。）を、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸を、Ｘ－ＣＧＤを有する患者の骨髄幹細胞に導入した後、自己移植を行うことによりＸ－ＣＤＧのために幹細胞遺伝子療法で使用する。

ベクターの直接導入。
特定の実施形態では、本明細書に記載するベクター（複数可）の直接導入による、対象の直接治療が想倒される。レンチウイルス組成物は、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、直腸、及び膣内を含むがこれらに限定されない、任意の利用可能な経路による送達のために製剤化することができる。一般に使用される送達経路としては、吸入、非経口、及び経粘膜が挙げられる。

様々な実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、ＬＶを含むことができる。本明細書で使用する場合、言葉「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与において適合性がある溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗カビ剤、等張化剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。補足的活性成分を組成物に組み込むこともできる。

いくつかの実施形態では、活性剤、即ち、本明細書に記載するレンチウイルス、及び／または、ベクターと共に投与可能な他の剤は、化合物が体から急速に取り除かれることを防ぐ担体、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む制御放出製剤により調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような組成物の調製方法は、当業者には明白であろう。好適な材料は、ＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から、商業的に入手することもまた可能である。リポソームもまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に知られている方法に従い調製することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、特定の細胞型、または、ウイルスにより感染した細胞に対して標的化される。例えば、組成物は、細胞表面マーカー、例えば、内因性マーカーに対するモノクローナル抗体、または、感染した細胞の表面で発現するウイルス性抗原を使用して標的化することができる。

投与を容易にし、用量を均一にするために、単位剤形で組成物を製剤化するのが有利である。本明細書で使用される単位剤形は、対象を治療するための単位の投薬（ｕｎｉｔａｒｙｄｏｓａｇｅｓｓ）として適した、物理的に別々の単位を指し、各単位は、医薬担体に関連して所望の治療効果をもたらすように算出された、既定量のＬＶを含む。

単位用量は、単回注射として投与される必要はないものの、一連の時間にまたがる連続注入を含むことができる。本明細書に記載するＬＶの単位用量は、便利には、ＨｅＬａまたは２９３などの細胞株でベクターを滴定することで定義される、レンチベクターの形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）の観点で記載するができる。特定の実施形態では、単位用量は、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３Ｔ．Ｕ．、及びそれ以上の範囲で変化することができる。

医薬組成物は、様々な間隔で、及び、必要に応じて、異なる期間にわたり、例えば、約１～約１０週間；約２～約８週間；約３～約７週間；約４週間、約５週間、約６週間などで、１週間当たり１回、投与することができる。治療用組成物を無期限にわたり投与する必要がある場合がある。当業者は、病気または疾患の重症度、以前の治療、総体的な健康及び／または対象の年齢、ならびに存在する他の病気を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響を与え得ることを理解するであろう。ＬＶを有する対象の治療は、１回の治療を含むことができ、または、多くの場合において、一連の治療を含むことができる。

遺伝子療法ベクターを投与するための、例示的かつ非限定的な用量、及び、好適な用量を決定する方法は、当技術分野において既知である。ＬＶの適切な用量は、特定のレシピエント、及び投与方法に左右され得ることがさらに理解されている。任意の特定の対象に対する適切な用量レベルは、対象の年齢、体重、総体的な健康、性別、及び食事、投与時期、投与経路、排泄速度、投与される他の治療剤などを含む様々な因子に応じて変化し得る。

特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルス遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与、または、定位注射により、対象に送達することができる（例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３０５４を参照されたい）。特定の実施形態では、ベクターは経口または吸入により送達可能であり、ベクターの分解を保護し、組織または細胞への取り込みを向上させるといったように、封入または別の方法で操作されることができる。医薬調製物は、許容される希釈剤にＬＶを含むことができるか、または、ＬＶが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、またはさらに、ベクターが組み換え細胞からインタクトに作製される場合において、本明細書に記載するレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターに対する場合におけるように、医薬調製物は、ベクターを作製する１つ以上の細胞を含むことができる。本明細書に記載するＬＶを含む医薬組成物は、任意選択的に、投与のための取扱説明書と共に、容器パックまたはディスペンサーに含めることができる。

前述の組成物、方法、及び使用は例示的なものであり、非限定的であることが意図される。本明細書で提供する教示を使用すると、組成物、方法、及び使用の他のバリエーションが、当業者には速やかに入手可能となるであろう。

実施例１
Ｘ－ＣＧＤの治療のためのレンチウイルスベクターの開発
本実施例は、Ｘ連鎖慢性肉芽腫症（Ｘ－ＣＧＤ）の治療のための、新規のレンチウイルスベクターの開発について記載する。具体的には、Ｘ－ＣＧＤに対する臨床試験を受ける現在のレンチウイルスベクターよりも高い発現レベルを示す、ベクター（複数可）の開発について記載した（ｐＣｈｉｍ－ＣＹＢＢ：ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥとも呼ばれる。Ｓａｎｔｉｌｌｉｅｔａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．，１９（１）：１２２－１２２を参照されたい）。本レンチウイルスベクターは、キメラ骨髄特異的プロモーター（ＭＳＰ）を使用し、成熟ヒト好中球集団において慢性的に発現が低下し、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子のリネージ特異的発現パターンを再利用できない。対照的に、本実施例に記載するベクターは、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の発現パターンを模倣する、厳格なリネージ及び段階特異的発現を有する（例えば、図１を参照されたい）。

我々は、バイオインフォマティクスアプローチを実装し、ヒトゲノムにおいて内因性ＣＹＢＢ遺伝子を制御するエレメントを明らかにした。ネイティブＣＹＢＢの位相的に関連するドメイン（ＴＡＤ）は、ＣＹＢＢ遺伝子の１００ｋｂ上流から５００ｋｂ下流にまたがる、６００ｋのウィンドウを含む。このＣＹＢＢＴＡＤはそれ故に、ヒトゲノムにおいて６００，０００個の塩基対をもたらし、遺伝子を適切に制御する。

我々は、６００，０００個の塩基対ウィンドウ内で機能的エンハンサーエレメントを明らかにし、９，０００個未満の塩基対のレンチウイルスベクターに、重要なエレメントをパッケージすることを試みた。バイオインフォマティクスアプローチを使用して、１５個の推定の内因性エレメントを、ネイティブＣＹＢＢの位相的に関連するドメイン（ＴＡＤ）の中で識別した。

ＣＹＢＢ遺伝子を制御する決定的なエンハンサーエレメントを実験により識別するために、各推定のエンハンサーエレメントを内因性ＣＹＢＢプロモーターの上流でクローニングし、レポーター遺伝子（ｍＣｉｔｒｉｎｅ）の発現を駆動した（例えば、図２を参照されたい）。推定の各エンハンサーエレメントの機能を明らかにするために、３つのオンターゲット細胞リネージである、臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋分化成熟好中球及び単球、加えて、ＲＡＭＯ細胞（Ｂリンパ球細胞株）において、ベクターのそれぞれの活性をアッセイした。ベクターを全て、ＭＳＰ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ構築物と比較した。

図３に示すように、エンハンサーエレメント４は、成熟好中球において高レベルの発現を駆動する。加えて、発現レベルは、臨床試験を受けている現在のＸ－ＣＧＤベクターを用いて入手したものよりも著しく高い。同様に、図４に示すように、エンハンサーエレメント４は、単球においても同様に高レベルの発現を駆動し、ここでも再び、発現レベルは、臨床試験を受けている現在のＸ－ＣＧＤベクターを用いて入手したものよりも著しく高い。

エンハンサーエレメント２が、Ｂ細胞における高レベルのリネージ特異的発現を駆動することを、図５は示す。エンハンサーエレメントのいずれもが、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）では発現せず、このことは、各エンハンサーエレメントのリネージ特異的発現を示唆している（例えば、図６を参照されたい）。対照的に、ＭＳＰ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ構築物は、最も高レベルのオフターゲット発現を示した。

したがって、エンハンサーエレメント４は、成熟好中球及び単球において増加したリネージ特異的発現を付与するようであり、ＭＳＰ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥベクターよりも２倍高い発現を示す。エンハンサーエレメント４が駆動した発現は、Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）またはＢ細胞（ＲＡＭＯ）において観察されなかった。エンハンサーエレメント２は、Ｂ細胞（ＲＡＭＯ）において増加したリネージ特異的発現を付与するようである。エンハンサーエレメント２が駆動した発現は、好中球、単球、またはＴ細胞では観察されなかった。

故に、エンハンサーエレメント２及び４をレンチウイルスベクターに組み込み、好中球、単球、及びＢ細胞においてオンターゲットリネージ特異的発現を処理するベクターを設計することを決めた。エンハンサーエレメント４は、２つの異なるエンハンサーモジュール（４Ｌ及び４Ｒ）で構成されることを記しておく。これらを評価し、これらのエレメントのうちの１つを除去して、ベクターのサイズを低下させることが可能か否かを評価した。

したがって、５つの新しいベクターを、評価のために作製した。これらは、４Ｌ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ、４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ、２＋４Ｌ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ、２＋４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ、及び、２＋４－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥであった。これらの新しいベクターを、ＣＢＣＤ３４＋分化好中球、及び単球、及びＲＡＭＯ、及びＪｕｒｋａｔで評価した。

図７に示すように、エンハンサーエレメント４、４Ｌ、及び４Ｒの２つの断片は、好中球において相乗的に作用する。しかし、エレメント４Ｒのみは、依然として、ＭＳＰベクター（臨床試験を受けている現在のベクター）よりも高い発現を有する。単球では、４Ｒ断片は、全体のエレメント４と同様のレベルで発現するようである（図８を参照されたい）。リネージ特異性が維持された（図９を参照されたい）。ＭＳＰ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（臨床試験を受けている現在のベクター）とは異なり、候補ベクターは全て、Ｔ細胞においてオフターゲット発現をもたらさなかった。加えて、エンハンサーエレメント２を組み込むことで、Ｂ細胞における発現が増加するようである（図１０を参照されたい）。

これらの結果を考えて、エレメント４の右半分（４Ｒ）が、好中球及び単球において、リネージ特異的エンハンサー活性に対する鍵となる寄与因子のようであると結論づけた。しかし、４Ｌ及び４Ｒは、好中球中で組み合わせたときに発現が相乗的に増加し、単球で組み合わせたときに相加効果を有するようである。骨髄エンハンサーエレメント４、４Ｌ、または４Ｒのいずれかと組み合わせたときに、エレメント２はＢ細胞エンハンサーを維持するようであり、これは骨髄リネージに挿入される。ベクター２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥは、ＣＢＣＤ３４＋分化好中球及び単球において、ＭＳＰ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥよりも１．６倍高く発現する。しかし、このベクターは、ＲＡＭＯ細胞（Ｂ細胞リネージ）においＭＳＰ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥの発現の５０％を有する一方で、これは、治療用となるには十分な量の発現であり得る。

２－４Ｆｕｌｌ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥは、それぞれ好中球及び単球において、ＭＳＰ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥよりも２倍及び１．６倍高く発現する。

特に関心が持たれているＸ－ＣＧＤベクターの一候補は、ｍＣｉｔがＧｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸（例えば、図１１を参照されたい。）で置き換え可能であり、リネージ特異的発現を処理し、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の発現パターンを再利用し、かつまた、成熟好中球及び単球において、ＭＳＰ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥよりも高く発現するという目標を達成する、２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥである。

別の目標は、発現を維持しながらベクターのサイズを下げることである。特定の実施形態では、設計した欠失は、「コア」、及び「ウルトラコア」バリアントを作製することができる。それぞれ、７．６ｋｂ及び５．９ｋｂのベクターを作製するための組み換え（ＯＲＦにおいて、ｗ／Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ）。２つ目の目標は、発現を増加させながら、ベクターを縮めることである。特定の実施形態では、このことは、「エクストラ４Ｌコア」、及び／または「エクストラ２」を、コア及びウルトラコアバリアントに添加することを伴うことができる。加えて、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘの異なるコドン最適化を利用して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内でｍＣｉｔｒｉｎｅを置き換える。

完全長エレメント２は、１０９２個の塩基対を含む。２００ｂｐの欠失を作製し、８９２ｂｐの「コア」バリアントを生成した（例えば、表１、配列番号５を参照されたい）。７４５ｂｐの欠失を作製し、３４７ｂｐのエンハンサーエレメント２「ウルトラコア」バリアントを生成した（例えば、表１、配列番号６を参照されたい）。

同様に、完全長エレメント４Ｒは９９５ｂｐの欠失を含み、４９６ｂｐの欠失を作製して、５００ｂｐのエンハンサーエレメント４Ｒ「コア」バリアントを作製した（例えば、表１、配列番号１０を参照されたい）。７４１ｂｂｐの欠失を作製して、２５４ｂｐエレメント４Ｒエンハンサー「ウルトラコア」バリアントを生成した（例えば、表１、配列番号１１を参照されたい）。

同様に、２４２ｂｐの欠失を作製して、イントロン３エンハンサー（１７７８ｂｐ）を作製して、１５３６ｂｐのイントロン３エンハンサー「コア」バリアントを生成し、１０５８ｂｐの欠失を作製して、中間断片（例えば、表１、配列番号１５を参照されたい。）、及び、右断片（例えば、表１、配列番号１６を参照されたい。）を含む、７２０ｂｐのイントロン３エンハンサー「ウルトラコア」断片を生成した。

２４０ｂｐの欠失を作製し、５０７ｂｐの完全長ＣＹＢＢ内因性プロモーター（例えば、表１、配列番号１を参照されたい。）を作製して、２６７ｂｐのＣＹＢＢプロモーター「コア」断片（配列番号２）を生成し、３３７ｂｐの欠失を作製して、最小ＣＹＢＢプロモーター「ＣＹＢＢウルトラコアプロモーター」（例えば、表１、配列番号３を作製されたい。）を生成した。

「コア」及び「ウルトラコア」欠失を作製することで、ベクターのサイズがそれぞれ、表２に示すように、１１８２ｂｐ、及び２８８２ｂｐ減少した。

加えて、特定の実施形態では、「エクストラ」断片を含める。したがって、例えば、ＲＥＬＡＴＦ結合部位がＢ細胞発現を増加させ得るという仮説を立てた。ＲＥＬＡは、炎症及び免疫を含む、多くの細胞プロセスにおいて役割を果たす。さらに、ＲＥＬＡ結合部位において、Ｂ細胞リネージ特異的ＤＮＡｓｅＩ高感受性が存在する。したがって、特定の実施形態では、ＴＦ結合フットプリントを、エレメント２構成成分に含めることができる（例えば、表１、配列番号７を参照されたい）。

加えて、特定の実施形態では、４Ｌ「コア」バリアント、または４Ｌ「ウルトラコア」バリアントを、４Ｒ構成成分と共に含めることができる。これらの「エクストラ」断片構築物のサイズは、表２においても示されている。

表３に示す構築物を試験した：

ウルトラコア、及びエクストラウルトラコアバリアントベクターは、ＣＢＣＤ３４＋分化好中球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋）（図１２）、及び、ＣＢＣＤ３４＋分化単球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）（図１３）において、Ｅ２－Ｅ４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ構築物、または現在の臨床ベクター（ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥ）よりも、著しく高い発現を示す。

ウルトラコア、及びエクストラウルトラコアバリアントベクターの全てが、Ｊｕｒｋａｔ細胞において低い発現（現在の臨床ベクターよりも低い）を示した（図１４）。

図１６に示すように、ウルトラコアベクター、及びエクストラウルトラコアベクターは、コア、及びエクストラコアバリアントよりも高い力価を示した。

この観点から、我々のリードベクターに２．９ｋｂの欠失を作製することで、以下のとおりに発現が増加したと結論づける：
・好中球において１８０％増加（ＭＳＰよりも３．４Ｘ高い）
・単球において１５０％増加（ＭＳＰよりも２．２Ｘ高い）
・ＲＡＭＯ（Ｂ細胞株）において１２９％増加（ＭＳＰよりも１．１６Ｘ高い）。
ベクターはまた、Ｔ細胞発現を行わずに特異性を保持する（変化なし）。加えて、１．２ｋｂの欠失を作製することで、以下のとおりに発現が増加した：
・好中球において１５％の減少
・単球において３３％の減少
・ＲＡＭＯ（Ｂ細胞株）において６％の減少。

特定の実施形態では、特に好適な一ベクターは、２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥのウルトラコアバリアント（ＵＣ２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ）である。ｍＣｉｔｒｉｎｅのＯＲＦを治療用導入遺伝子（Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸）で置き換え、臨床上関係するベクターをもたらすことができる。

さらに、発現及び力価を最大化するために、多数の異なるコドン最適化を評価した。これらは、ｊＣＡＴ、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＩＤＴ、現在の臨床ベクターにおけるコドン最適化配列（ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥ）、及びＧｐ９１^ｐｈｏｘｃＤＮＡを含む。

我々は元々、Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥベクター骨格において、異なるコドン最適化をスクリーニングした。しかし、Ｉｎｔ３－ｐｒｏベクターは、高いリネージ特異的発現を有し、成熟好中球においてのみ発現し、ＰＬＢ－９８５ＣＹＢＢ^－／－細胞株（ヒト前骨髄球細胞株）においては十分に発現しなかった。ＰＬＢ－９８５Ｘ－ＣＧＤ細胞株を使用するために、ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥベクター骨格を用いて、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘの異なるコドン最適化をスクリーニングすることを決めた。

リードコドン最適化配列を、本明細書に記載する様々なＸ－ＣＧＤベクターに移すことができる。コドン最適化は、特定の種において（場合によっては、細胞型においても）発現の最適化を行うためのものであることを記しておくが、理想的なコドン最適化は、発現するプロモーター／ベクターとは無関係なものでなければならない。

図１７に示すように、ｇｐ９１^ｐｈｏｘのｊＣＡＴ最適化は、試験した中で、最も高い発現レベルの最適化を生み出した。様々な最適化のそのままの力価を、（ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥ）最適化に示し、ｊＣＡＴ最適化は、著しく異なってはいなかった（図１８）。

前述したことを考慮し、ｊＣＡＴが、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘの最適なコドン最適化であると結論づける。このコドン最適化は、臨床ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥベクターにおいて、ネイティブｃＤＮＡ配列よりも２倍高く、及び、現在のコドン最適化配列よりも１．２倍高く発現を増加させる。この最適化はまた、ネイティブｃＤＮＡ配列（ＭＳＰ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥ）よりも１．２Ｘ高く、力価を増加させる。

バイオインフォマティクスによりガイドされるアプローチを実装することで、合理的に、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の発現パターンを模倣する、厳格なリネージ及び段階特異的発現を有する、新規のＸ－ＣＧＤレンチウイルスベクターを設計した。リード候補ベクターの１つは、例えば、図２０Ａに示す、ウルトラコアＵＣ２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－Ｇｐ９１ｐｈｏｘ（ｊＣＡＴ）－ＷＰＲＥベクターである。このベクターのマップを図２０Ｂに示し、配列を表１に示す（配列番号２２）。

実施例２
ＭｅｌｏＶｅｃのリネージ特異的発現
上の実施例１は、最適化されたリード候補ベクター：ＵＣ２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（ＭｙｅｌｏＶｅｃとも呼ばれる）の生成について記載する。本ベクターは、改善された力価、改善された感染性、及び改善された発現を示した。

多数の異なるコドン最適化をスクリーニングし、ｍＣｔｒｉｎｅのオープンリーディングフレームをｊＣＡＴコドン最適化Ｇｐ９１^ｐｈｏｘで置き換えて、実際の治療用導入遺伝子を発現させることを決めた。

本明細書に記載するように、形質導入したヒトの健常ドナー（ＨＤ）臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞を、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに移植することにより、（ｍＣｉｔｒｉｎｅを発現する）ＭｙｅｌｏＶｅｃの、インビトロリネージ特異的発現が示された。加えて、（コドン最適化Ｇｐ９１^ｐｈｏｘを発現する）ＭｙｅｌｏＶｅｃが、Ｘ－ＣＧＤ表現型に対して機能的に補正する能力が、
１）マウスＸ－ＣＧＤリネージ陰性（Ｌｉｎ－）造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を形質導入し、好中球にインビトロで分化して、Ｇｐ９１ｐｈｏｘ発現の回復、及び、機能的オキシダーゼ活性の回復を評価すること；
２）マウスＸ－ＣＧＤＬｉｎ－ＨＳＰＣを形質導入し、細胞を、遺伝子相同Ｂ６．ＳＪＬ－ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（Ｐｅｐｂｏｙ）マウスに移植して疾患のインビボ機能補正を示すこと；ならびに
３）ヒトＸ－ＣＧＤ患者細胞を形質導入し、好中球にインビトロ分化させてＧｐ９１^ｐｈｏｘ発現及び機能的オキシダーゼ活性の回復を示すこと
により示された。

図２１は、元の２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ由来の我々のベクターを、コアバリアント及びウルトラコア（ＵＣ）バリアントに最適化したときの、力価（上）及び感染性（下）の改善を示す。元の２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ由来の我々のベクターのサイズを、コアバリアント及びウルトラコア（ＵＣ）バリアントに対して減少すると、の力価及び感染性が改善された。

図２２に示すように、（ｍＣｉｔｒｉｎｅを発現する）ＭｙｅｌｏＶｅｃは、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の内因性発現パターンを再利用することができる。本実験では、健常なドナー（ＨＤ）臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を形質導入し、細胞をＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに移植した。遺伝子組み換え細胞は、造血系の異なるリネージ全てに対して生じた。どのリネージがｍＣｉｔｒｉｎｅを、どの程度発現するかを評価することにより、我々のベクターのリネージ特異的発現パターンを測定することが可能であり、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の内因性発現パターンを模倣するか否かを確認することができる。

ＭｙｅｌｏＶｅｃは、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の内因性発現パターンを再利用することができる－好中球において非常に高く発現し、高バルクな骨髄発現であり、Ｂ細胞発現は中レベルであり、Ｔ細胞及びＨＳＰＣにおいて最小の発現である。これは血液（図２２Ａ）、及び骨髄（図２２Ｂ）で示される。

ＭｙｅｌｏＶｅｃは、好中球の成長を通して、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子の一時的発現パターンも再利用可能である。好中球が成熟するにつれ、発現は高くなり、これは、ネイティブＣＹＢＢ遺伝子のパターンを模倣している（例えば、図２３を参照されたい）。

したがって、ＮＳＧマウスに移植された、形質導入されたヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞において、ＭｙｅｌｏＶｅｃからのｍＣｉｔｒｉｎｅ発現のパターンは、血液及び骨髄細胞における複数のリネージにまたがり、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘの内因性発現パターンを再利用した（例えば、表４を参照されたい）。

次に、ｍＣｉｔｒｉｎｅレポーター遺伝子を含有するオープンリーディングフレームを、ｊＣＡＴコドン最適化版のＧｐ９１^ｐｈｏｘで置き換え、我々の機能的研究用の治療用導入遺伝子を発現させた。

図２４及び２５は、ＭｙｅｌｏＶｅｃが、マウスＸ－ＣＧＤＨＳＰＣにおいて、インビトロでＸ－ＣＧＤ表現型に対して機能的に補正する能力を示す。本実験のために、マウスＸ－ＣＧＤリネージ陰性（Ｌｉｎ－）造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を形質導入し、細胞を成熟好中球に分化させ、我々のリード候補ベクター（ＵＣ－２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ（ｊＣＡＴ）－ＷＰＲＥ）が、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘの発現を回復する能力（図２４）及びオキシダーゼ活性（図２５）を実証した。これらの実験において、オキシダーゼ活性は、ジヒドロローダミン（ＤＨＲ）アッセイにより評価された。

図２４に示すように、Ｘ－ＣＧＤマウスｈＰＳＣから分化した好中球において、ＭｙｅｌｏＶｅｃは、現在の臨床ベクター（ＭＳＰ）よりも、高レベルのＧｐ９１^ｐｈｏｘを回復することができると考えられる。加えて、ＭｙｅｌｏＶｅｃは、形質導入マウスＸ－ＣＧＤ細胞の成熟好中球への分化において、オキシダーゼ活性をＷＴレベルまで回復することができる（例えば、図２５を参照されたい）。したがって、ＭｙｅｌｏＶｅｃは、マウスＣＹＢＢＬｉｎ－のインビトロで分化した好中球において、ＭＳＰ（現在の臨床ベクター）よりも１．６倍高くＧｐ９１ｐｈｏｘを発現し、ＭｙｅｌｏＶｅｃは、マウスＣＹＢＢＬｉｎ－分化好中球において、ＷＴレベルまでオキシダーゼ活性を回復することができるである。

図２６～２９は、ＭｙｅｌｏＶｅｃが、Ｘ－ＣＧＤマウスモデルにおいてＸ－ＣＧＤ表現型をインビボで補正する能力について示す。簡潔に述べると、ｈＰＳＣをＸ－ＣＧＤマウスから単離し、ＭｙｅｌｏＶｅｃを形質導入した。次に、遺伝子組み換え細胞を、遺伝子相同Ｂ６．ＳＪＬ－ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（Ｐｅｐｂｏｙ）マウスに移植した。異なる造血性リネージにまたがる、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ発現及びオキシダーゼ活性の回復を分析するために、マウスを、移植の１６週間後に回収した。

高レベルのＧｐ９１^ｐｈｏｘ発現が、末梢血の好中球及び単球において回復した（例えば、図２６を参照されたい）。これにより、血液好中球及び単球における、野生型レベルとほぼ同じまでの、オキシダーゼ活性の回復がもたらされた（例えば、図２７を参照されたい）。高レベルのＧｐ９１^ｐｈｏｘ発現は、骨髄好中球及び単球でもまた回復し（例えば、図２８を参照されたい）、これにより、野生型レベルのオキシダーゼ活性の回復がもたらされた（例えば、図２６を参照されたい）。したがって、我々は、Ｘ－ＣＧＤマウスモデルをインビボで補正したようである。

ＭｙｅｌｏＶｅｃが、ヒト患者Ｘ－ＣＧＤ細胞をインビボで機能的に補正する能力を実証するために、ヒトＸ－ＣＧＤＨＳＰＣにＭｙｅｌｏＶｅｃを形質導入し、細胞を成熟好中球にインビトロで分化させた。次に、ＤＨＲアッセイ、及び、シトクロムＣアッセイにより、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ発現の回復、及び、オキシダーゼ活性の回復を測定した。図３０は、ＭｙｅｌｏＶｅｃが、ヒトＸ－ＣＧＤ好中球において、野生型レベルのＧｐ９１^ｐｈｏｘ発現を回復する能力を示す。図３１は、ＭｙｅｌｏＶｅｃが、ヒトＸ－ＣＧＤ好中球において、野生型レベルの細胞オキシダーゼ活性を回復する能力を示す（ＤＨＲアッセイ）。図３２は、ＭｙｅｌｏＶｅｃが、１．６３の平均ＶＣＮにおいて、ヒトＸ－ＣＧＤ好中球における野生型レベルのバルクオキシダーゼ活性を回復する能力を示す（シトクロムＣアッセイ）。

したがって、バイオインフォマティクスベースの設計アプローチを実装することで、リード候補Ｘ－ＣＧＤベクターであるＵＣ－２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｃｏＧｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＰＲＥ（ＭｙｅｌｏＶｅｃ）を開発した（例えば、図２０Ａ及びＢ、ならびに配列番号２２を参照されたい）。

結論
上述の実験は、マウスＸ－ＣＧＤマウスモデルにおける、Ｘ－ＣＧＤ表現型をインビボで補正する能力について記載している。形質導入したマウスにおいて、Ｘ－ＣＧＤＬｉｎ－細胞を、致死照射したＰｅｐＢｏｙマウスに移植した。

ＭｙｅｌｏＶｅｃは、骨髄の好中球及び単球において、オキシダーゼ活性をＷＴレベルまで回復可能であった。

ＭｙｅｌｏＶｅｃは、１．７４以上のＶＣＮにおいて、末梢血の好中球及び単球の中で、ＷＴレベルに近いオキシダーゼ活性を達成した。

ＭｙｅｌｏＶｅｃを形質導入した、ヒトＸ－ＣＧＤ患者ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ由来の、インビトロで分化した好中球は、１．６３の平均ＶＣＮにおいて、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ発現及び機能的オキシダーゼ活性を、健常なドナーレベルまで回復させた。

本明細書に記載の実施例及び実施形態は、単に例示目的のためのものであること、ならびに、それらに照らした種々の修正または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書で引用された全ての公報、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためにそれら全体が、参照として本明細書に組み込まれる。
配列表
配列番号１ＣＹＢＢプロモーター
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配列番号２最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）
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配列番号３最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）
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配列番号４エンハンサーエレメント２
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配列番号５エンハンサーエレメント２コア
gagctccatatgcctcaatagaacctaagagcatcattgtactgcatttattcattcattcacttcacatgtttattcaacaaatgctatgtatactgagatttttctctggtcattgtactggctagaacctaaaggagtgagactattaattagagtttacaatctggcaatgatattaacagtctattcacaaaagggttaactcaagttaagccggcctaaatgtttatgcaaaataggatttttgcctaagtctaaagggtatcagaaaagtgtagccattgagaatgactcatttcatggtgttctcggatggcttaagtattattaatatgtctccatttctagtgcaggaacctccacgttttagaggaaaggaggaaagaatttgtgaagactgtgcctaaaaaaggtagaaatttgtttacaatttatttaaagataaaagtaaagaactaggttgctttaaaaaagggagggaaagaaaatcaaaatacatcttatttgaggcattaaaacttttttaagaaaataaaatttaaaataaagttgtattcttctaaaaataattttttaaaccagctgaaaatgaaaaatgcagattatactaagaagcaactgttttacattctgctttctgaatggtatttaaaaactcagttattttcagaaatgaggaagtcttgatctgctagatgaaggtcggctgcaggtggtgtttattgctttatgatggcaacaaaccgtaaacccatcactcagtaaatattaaactggctgaatgaatccaaagcatgtctaacatacaggaaaaacacagccctgttaagcagtcttgaaacccacaagctacatggaaaacacagattcaactacatcataaaaattc
配列番号６エンハンサーエレメント２ウルトラコア
Aaatcaaaatacatcttatttgaggcattaaaacttttttaagaaaataaaatttaaaataaagttgtattcttctaaaaataattttttaaaccagctgaaaatgaaaaatgcagattatactaagaagcaactgttttacattctgctttctgaatggtatttaaaaactcagttattttcagaaatgaggaagtcttgatctgctagatgaaggtcggctgcaggtggtgtttattgctttatgatggcaacaaaccgtaaacccatcactcagtaaatattaaactggctgaatgaatccaaagcatgtctaacatacaggaaaaacacagccctgttaagca
配列番号７エレメント２ＲＥＬＡＴＦ結合部位
aactgcccaggccatccacagatgactgtagatacatgtgtaagttcagttcacatcctcagaaccacccagatgtcctgtagatgcatgagaaatgttaaatgcttgttgttttaagccactaacttcagagtagtttgttatataacaaaaccgctgatgcaaatggcatcaaaaattgttgaaagagagatgggggttcagggtgagagctgtaggtgattgtatctgtgctaataccacatagcccttttttggggattgccatgaataatatattagctttgctatgagtaaaatactatatcctctgaattgtcatgaattacgtggagtcatacgtgttttggaagtgtgaaagtccctgggctcagataaaaggtgttgccatctggaaagtacaggtagtttatttcaattctgctccaataactagcacgtcattccattcatgtagaaataagctactggctatctcactatctgaaatagaagtatgaactgtgggtaagtgggtgaggacaatgtctgagcaaccaaaaaggagctcaaatcc
配列番号８エンハンサーエレメント４
aaactaatatgaccttataagaggaggaagttggggcacaggcatgtacacacagaggaaagaccatacagaggaaagaccatattaagataaaggaagaggatgaccatctacaagccaagcaaaggggccccagaaggaaaccaaacatgctgaaaccttgatcttgaatttgtagcttctaaaactgtgagaaaataaatttctgttgtttaaaacatccaggctgaggtactttgttatggaagccctgtcaaactaatgcaacaacatttcctcccattagatttcttaattcgtgtatagctggcctgataatgtcttatcagctaccccaactcaattgctgcaaatacatttttaaaagttctggtggttgtagttgattgcacacttctgtatgagccaataatgtgaggcaagtctttaaaagggtagcacaatcagtctgaggttacaccatagatatggttaaccatagtgtggtctccataacataggaagtcaagatcccccttcactcttgaccagtcagattgcacctagaacatttttctcaattctgcataccacatttaaagaggaagacaaaacccatgcgttgtgcagctaccacatgtcgagcatcagactatgtgcactgtgtacacttagtcctcccaccaacccaatgaagatggtattaatacccacctcccattgtacagatgaggagactggggctaaatgaggtcaaataggttgctcaacagagatcttcacctccatggactcccatagccacactctgaaccctgtcatctctcagaagtgcactgcttctgaaatctgcatctcatacacccatcctctgactaccacctcctgttccctggcttcctaattcactcacacccaagatgactgtccttcaacctcatcaaactttgagttctttttgactctttgactttgctcccatcttgtgttcacttcttggcattctactcatcttagactcagttcacttctgccattttcttgcacaaatcctgaattctctcatgcagtgcccttctgtaccacctgcaggcaaaaaccaaccctgatcaactcaattgtcctctatacttgctcgtgggtgggtaagaaaagctagaaaagctacccacagactcctaccattactgatttatgagctccaggctcaactgggcccttatctgggcctggaaatcattttgcatttctacagtcaagtctcctttctgaacaaaagatacaacattgaaaactgtcttctgtttcctgaaatgtctactcactacctcactttcaacagataaccttgccctctctttcacaaaggaaatggaaaccacaaagaggaagtccctcaccctgctgtccccagccctacaaatcctcctgcatctgcactctgctccttccctctttttacagagaggaggcccctcctgtctaaagcaaattccatttccttcctgccttgggctcagaaatctcaccccatccaaaatcttccatggttagcctgtccctttgttgcgactctttctcaatatttacaagctcctatattttttaaaataataaaactaggtcctcctggtgttcacatgttttcccaattgtagccaagtcctctcattcttatcacagcctcagacattttgaggtgtctcactacctcacctcaacccacaacatctggcttccctcattgttttccagtaggcccctt
配列番号９エンハンサーエレメント４Ｒ
cagagatcttcacctccatggactcccatagccacactctgaaccctgtcatctctcagaagtgcactgcttctgaaatctgcatctcatacacccatcctctgactaccacctcctgttccctggcttcctaattcactcacacccaagatgactgtccttcaacctcatcaaactttgagttctttttgactctttgactttgctcccatcttgtgttcacttcttggcattctactcatcttagactcagttcacttctgccattttcttgcacaaatcctgaattctctcatgcagtgcccttctgtaccacctgcaggcaaaaaccaaccctgatcaactcaattgtcctctatacttgctcgtgggtgggtaagaaaagctagaaaagctacccacagactcctaccattactgatttatgagctccaggctcaactgggcccttatctgggcctggaaatcattttgcatttctacagtcaagtctcctttctgaacaaaagatacaacattgaaaactgtcttctgtttcctgaaatgtctactcactacctcactttcaacagataaccttgccctctctttcacaaaggaaatggaaaccacaaagaggaagtccctcaccctgctgtccccagccctacaaatcctcctgcatctgcactctgctccttccctctttttacagagaggaggcccctcctgtctaaagcaaattccatttccttcctgccttgggctcagaaatctcaccccatccaaaatcttccatggttagcctgtccctttgttgcgactctttctcaatatttacaagctcctatattttttaaaataataaaactaggtcctcctggtgttcacatgttttcccaattgtagccaagtcctctcattcttatcacagcctcagacattttgaggtgtctcactacctcacctcaacccacaacatctggcttccctcattgttttccagtaggcccctt
配列番号１０エンハンサーエレメント４Ｒコア
catgcagtgcccttctgtaccacctgcaggcaaaaaccaaccctgatcaactcaattgtcctctatacttgctcgtgggtgggtaagaaaagctagaaaagctacccacagactcctaccattactgatttatgagctccaggctcaactgggcccttatctgggcctggaaatcattttgcatttctacagtcaagtctcctttctgaacaaaagatacaacattgaaaactgtcttctgtttcctgaaatgtctactcactacctcactttcaacagataaccttgccctctctttcacaaaggaaatggaaaccacaaagaggaagtccctcaccctgctgtccccagccctacaaatcctcctgcatctgcactctgctccttccctctttttacagagaggaggcccctcctgtctaaagcaaattccatttccttcctgccttgggctcagaaatctcaccccatccaaaatcttccatggttagcctgtccct
配列番号１１エンハンサーエレメント４Ｒウルトラコア
gcccttatctgggcctggaaatcattttgcatttctacagtcaagtctcctttctgaacaaaagatacaacattgaaaactgtcttctgtttcctgaaatgtctactcactacctcactttcaacagataaccttgccctctctttcacaaaggaaatggaaaccacaaagaggaagtccctcaccctgctgtccccagccctacaaatcctcctgcatctgcactctgctccttccctctttttacagagagg
配列番号１２エンハンサーエレメント４Ｌ
aaactaatatgaccttataagaggaggaagttggggcacaggcatgtacacacagaggaaagaccatacagaggaaagaccatattaagataaaggaagaggatgaccatctacaagccaagcaaaggggccccagaaggaaaccaaacatgctgaaaccttgatcttgaatttgtagcttctaaaactgtgagaaaataaatttctgttgtttaaaacatccaggctgaggtactttgttatggaagccctgtcaaactaatgcaacaacatttcctcccattagatttcttaattcgtgtatagctggcctgataatgtcttatcagctaccccaactcaattgctgcaaatacatttttaaaagttctggtggttgtagttgattgcacacttctgtatgagccaataatgtgaggcaagtctttaaaagggtagcacaatcagtctgaggttacaccatagatatggttaaccatagtgtggtctccataacataggaagtcaagatcccccttcactcttgaccagtcagattgcacctagaacatttttctcaattctgcataccacatttaaagaggaagacaaaacccatgcgttgtgcagctaccacatgtcgagcatcagactatgtgcactgtgtacacttagtcctcccaccaacccaatgaagatggtattaatacccacctcccattgtacagatgaggagactggggctaaatgaggtcaaataggttgctcaa
配列番号１３エンハンサーエレメント４Ｌコア
agccaataatgtgaggcaagtctttaaaagggtagcacaatcagtctgaggttacaccatagatatggttaaccatagtgtggtctccataacataggaagtcaagatcccccttcactcttgaccagtcagattgcacctagaacatttttctcaattctgcataccacatttaaagaggaagacaaaacccatgcgttgtgcagct
配列番号１４完全イントロン３エンハンサー
gatcatccctccttgacttccatacatgtggggattacaggcatgagtcacctgcctggcgagttccttgtttctaaggagacacaattcatttttattctccctacccccattagaatagtttctatttagaggaagtaaagcctgagaaacaggcaatgttttcaccaagatggcctgttaagaaatcttggttagtctacaagtccaaatttcactgccggtgagcaccatgtcccatgagcagcacatgttgtaatgccagctagaggtctcaatcattgaaactttgctttgtaatccttctggttacctagagaaagaaagccccagggttgcccaccccaccactccaggaaaggtaggggtaaaggctctcagactgctttgttgagaaaaatggagaatgggtgaagctcagcacacaaaaatctctgaggaagccttaaaaacccccaacttgccatgcagaaactaatttctgtctggatggcagtcctagtcttaagatcagaaagaaacaggaaggtgagagggtgaggttttatctgttaccttatatagtctgggagtcagaggcactcagtgtgcctctatctttaatcacgtggtctagcactagtctcttgggctttctgtctcatagtttttttttttagttgaaaaacaggtcaactaacacaaatgtaagaaggcatatgttggtctaaaagtatattaattgtttaagtctgtcaattagtgagttgtcagtcaataaatatttgttgagtgccatttatgtgctaagcactggggacatgtggtaagtaaagattaagttatagataggccatgagcttaaggagcttagagtgttaacaggagagacagagaataaatatggaacttccaaattataaacagtgctatgcaaataaggtagtgttattcatatttatcagatattctactgccagcaggtgtggatattactgtcaacttacttgcctgagttctgtagattcaaagttggattttgtaatttctcccagttgcgtataaatatctaaatcagatacattgatggtgcgtgtggtgagatcaagtgtacaaaaagtagagcttttgagtttctgtaaagtgttacaccccataaaatatgtacttctttttagttccacttcccattttcttgaaatatttttttcttactcagtttcaatagagcatagaaatctgctgaagtgactcaataatctcccttgcattagaatggtagtttattgaaatcgggcaaggcttccggtgacagtaacagagaaacttccctttagaagtcaatggcagaaagtaaagtaagttagtaaggaagctatggggcatgatggcaacgtggataattgggaagtggctggcaataatttagaagtaactcaaagcatataaatgcaatctgcctgatgatggggaacaaaaaattatgggcagtcacagacagtaaagtccttccttcctatgccaccaaccggttgtctcgcctccttttttaaggaagtggtgaggagatggtattcttaaaagcccagtatcagcatgacttgtggcttctttttggatttgtttgccattcctgtccacaccaaagagggtaggtgggaaaaattagggatttgtgccctgatggttggacccactccactgatccattagttactagtaatctcactttttcctttcaatataatatatgtgttttacattaactagctttttaaaaattacctattaagatgaaa
配列番号１５中間断片ＩＮＴ３エンハンサーウルトラコア
cttaaaaacccccaacttgccatgcagaaactaatttctgtctggatggcagtcctagtcttaagatcagaaagaaacaggaaggtgagagggtgaggttttatctgttaccttatatagtctgggagtcagaggcactcagtgtgcctctatctttaatcacgtggtctagcactagtctcttgggctttctgtctcatagtttttttttttagttgaaaaacaggtcaactaacacaaatgtaagaaggcatatgttggtctaaaagtatatta
配列番号１６ＩＮＴ３エンハンサー右断片ウルトラコア
Agcttttgagtttctgtaaagtgttacaccccataaaatatgtacttctttttagttccacttcccattttcttgaaatatttttttcttactcagtttcaatagagcatagaaatctgctgaagtgactcaataatctcccttgcattagaatggtagtttattgaaatcgggcaaggcttccggtgacagtaacagagaaacttccctttagaagtcaatggcagaaagtaaagtaagttagtaaggaagctatggggcatgatggcaacgtggataattgggaagtggctggcaataatttagaagtaactcaaagcatataaatgcaatctgcctgatgatggggaacaaaaaattatgggcagtcacagacagtaaagtccttccttcctatgccaccaaccggttgtctcgcctccttttttaaggaagtggtgagga
配列番号１７Ｇｐ９１^ｐｈｏｘｃＤＮＡ
atggggaactgggctgtgaatgaggggctctccatttttgtcattctggtttggctggggttgaacgtcttcctctttgtctggtattaccgggtttatgatattccacctaagttcttttacacaagaaaacttcttgggtcagcactggcactggccagggcccctgcagcctgcctgaatttcaactgcatgctgattctcttgccagtctgtcgaaatctgctgtccttcctcaggggttccagtgcgtgctgctcaacaagagttcgaagacaactggacaggaatctcacctttcataaaatggtggcatggatgattgcacttcactctgcgattcacaccattgcacatctatttaatgtggaatggtgtgtgaatgcccgagtcaataattctgatccttattcagtagcactctctgaacttggagacaggcaaaatgaaagttatctcaattttgctcgaaagagaataaagaaccctgaaggaggcctgtacctggctgtgaccctgttggcaggcatcactggagttgtcatcacgctgtgcctcatattaattatcacttcctccaccaaaaccatccggaggtcttactttgaagtcttttggtacacacatcatctctttgtgatcttcttcattggccttgccatccatggagctgaacgaattgtacgtgggcagaccgcagagagtttggctgtgcataatataacagtttgtgaacaaaaaatctcagaatggggaaaaataaaggaatgcccaatccctcagtttgctggaaaccctcctatgacttggaaatggatagtgggtcccatgtttctgtatctctgtgagaggttggtgcggttttggcgatctcaacagaaggtggtcatcaccaaggtggtcactcaccctttcaaaaccatcgagctacagatgaagaagaaggggttcaaaatggaagtgggacaatacatttttgtcaagtgcccaaaggtgtccaagctggagtggcacccttttacactgacatccgcccctgaggaagacttctttagtatccatatccgcatcgttggggactggacagaggggctgttcaatgcttgtggctgtgataagcaggagtttcaagatgcgtggaaactacctaagatagcggttgatgggccctttggcactgccagtgaagatgtgttcagctatgaggtggtgatgttagtgggagcagggattggggtcacacccttcgcatccattctcaagtcagtctggtacaaatattgcaataacgccaccaatctgaagctcaaaaagatctacttctactggctgtgccgggacacacatgcctttgagtggtttgcagatctgctgcaactgctggagagccagatgcaggaaaggaacaatgccggcttcctcagctacaacatctacctcactggctgggatgagtctcaggccaatcactttgctgtgcaccatgatgaggagaaagatgtgatcacaggcctgaaacaaaagactttgtatggacggcccaactgggataatgaattcaagacaattgcaagtcaacaccctaataccagaataggagttttcctctgtggacctgaagccttggctgaaaccctgagtaaacaaagcatctccaactctgagtctggccctcggggagtgcatttcattttcaacaaggaaaacttctaa
配列番号１８ｊＣＡＴコドン最適化Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ
atgggcaactgggccgtgaacgagggcctgagcatcttcgtgatcctggtgtggctgggcctgaacgtgttcctgttcgtgtggtactaccgcgtgtacgacatcccccccaagttcttctacacccgcaagctgctgggcagcgccctggccctggcccgcgcccccgccgcctgcctgaacttcaactgcatgctgatcctgctgcccgtgtgccgcaacctgctgagcttcctgcgcggcagcagcgcctgctgcagcacccgcgtgcgccgccagctggaccgcaacctgaccttccacaagatggtggcctggatgatcgccctgcacagcgccatccacaccatcgcccacctgttcaacgtggagtggtgcgtgaacgcccgcgtgaacaacagcgacccctacagcgtggccctgagcgagctgggcgaccgccagaacgagagctacctgaacttcgcccgcaagcgcatcaagaaccccgagggcggcctgtacctggccgtgaccctgctggccggcatcaccggcgtggtgatcaccctgtgcctgatcctgatcatcaccagcagcaccaa gaccatccgccgcagctacttcgaggtgttctggtacacccaccacctgttcgtgatcttcttcatcggcctggccatccacggcgccgagcgcatcgtgcgcggccagaccgccgagagcctggccgtgcacaacatcaccgtgtgcgagcagaagatcagcgagtggggcaagatcaaggagtgccccatcccccagttcgccggcaacccccccatgacctggaagtggatcgtgggccccatgttcctgtacctgtgcgagcgcctggtgcgcttctggcgcagccagcagaaggtggtgatcaccaaggtggtgacccaccccttcaagaccatcgagctgcagatgaagaagaagggcttcaagatggaggtgggccagtacatcttcgtgaagtgccccaaggtgagcaagctggagtggcaccccttcaccctgaccagcgcccccgaggaggacttcttcagcatccacatccgcatcgtgggcgactggaccgagggcctgttcaacgcctgcggctgcgacaagcaggagttccaggacgcctggaagctgcccaagatcgccgtggacggccccttcggcaccgccagcgaggacgtgttcagctacgaggtggtgatgctggtgggcgccggcatcggcgtgacccccttcgccagcatcctgaagagcgtgtggtacaagtactgcaacaacgccaccaacctgaagctgaagaagatctacttctactggctgtgccgcgacacccacgccttcgagtggttcgccgacctgctgcagctgctggagagccagatgcaggagcgcaacaacgccggcttcctgagctacaacatctacctgaccggctgggacgagagccaggccaaccacttcgccgtgcaccacgacgaggagaaggacgtgatcaccggcctgaagcagaagaccctgtacggccgccccaactgggacaacgagttcaagaccatcgccagccagcaccccaacacccgcatcggcgtgttcctgtgcggccccgaggccctggccgagaccctgagcaagcagagcatcagcaacagcgagagcggcccccgcggcgtgcacttcatcttcaacaaggagaacttctaa
配列番号１９臨床ｃｏ－ｏｐＧｐ９１^ｐｈｏｘ

atgggcaactgggccgtgaacgagggcctgagcatcttcgtgatcctggtgtggctgggcctgaacgtgttcctgttcgtgtggtactaccgggtgtacgacatcccccccaagttcttctacacccggaagctgctgggcagcgccctggccctggccagagcccctgccgcctgcctgaacttcaactgcatgctgatcctgctgcccgtgtgccggaacctgctgtccttcctgcggggcagcagcgcctgctgcagcaccagagtgcggcggcagctggaccggaacctgaccttccacaagatggtggcctggatgatcgccctgcacagcgccatccacaccatcgcccacctgttcaacgtggagtggtgcgtgaacgcccgggtgaacaacagcgacccctacagcgtggccctgagcgagctgggcgaccggcagaacgagagctacctgaacttcgcccggaagcggatcaagaaccccgagggcggcctgtacctggccgtgaccctgctggccggcatcaccggcgtggtgatcaccctgtgcctgatcctgatcatcaccagcagcaccaagaccatccggcggagctacttcgaggtgttctggtacacccaccacctgttcgtgatctttttcatcggcctggccatccacggcgccgagcggatcgtgaggggccagaccgccgagagcctggccgtgcacaacatcaccgtgtgcgagcagaaaatcagcgagtggggcaagatcaaagagtgccccatcccccagttcgccggcaacccccccatgacctggaagtggatcgtgggccccatgttcctgtacctgtgcgagcggctggtgcggttctggcggagccagcagaaagtggtgattaccaaggtggtgacccaccccttcaagaccatcgagctgcagatgaagaaaaagggcttcaagatggaagtgggccagtacatctttgtgaagtgccccaaggtgtccaagctggaatggcaccccttcaccctgaccagcgcccctgaagaggacttcttcagcatccacatcagaatcgtgggcgactggaccgagggcctgttcaatgcctgcggctgcgacaagcaggaattccaggacgcctggaagctgcccaagatcgccgtggacggcccctttggcaccgccagcgaggacgtgttcagctacgaggtggtgatgctggtcggagccggcatcggcgtgacccccttcgccagcatcctgaagagcgtgtggtacaagtactgcaacaacgccaccaacctgaagctgaagaagatctacttctactggctgtgccgggacacccacgccttcgagtggttcgccgatctgctgcagctgctggaaagccagatgcaggaacggaacaacgccggcttcctgagctacaacatctacctgaccggctgggacgagagccaggccaaccacttcgccgtgcaccacgacgaggaaaaggacgtgatcaccggcctgaagcagaaaaccctgtacggcaggcccaactgggacaacgagtttaagaccatcgccagccagcaccccaacacccggatcggcgtgtttctgtgcggccctgaggccctggccgagacactgagcaagcagagcatcagcaacagcgagagcggccccaggggcgtgcacttcatcttcaacaaagaaaacttctga
配列番号２０ＧｅｎｅＡｒｔ最適化Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ
atgggaaactgggccgtgaatgagggcctgagcatcttcgtgatcctcgtgtggctgggcctgaacgtgttcctgttcgtgtggtactaccgggtgtacgacatccctcctaagttcttctacacccggaagctgctgggctctgctctggctcttgctagagcaccagccgcctgcctgaacttcaactgcatgctgatcctgctgcctgtgtgccggaacctgctgagctttctgagaggcagcagcgcctgctgtagcaccagagttagacggcagctggacagaaacctgaccttccacaagatggtggcctggatgatcgccctgcacagcgccattcacacaatcgcccacctgttcaacgtcgagtggtgcgtgaacgccagagtgaacaacagcgacccttacagcgtggccctgagcgagctgggcgatagacagaatgagagctacctgaatttcgcccggaagcggatcaagaaccctgaaggcggactgtacctggccgtgacactgctggctggaatcacaggcgtggtcatcaccctgtgcctgatcctgatcatcaccagcagcaccaagaccatccggcggagctacttcgaggtgttctggtacacccaccacctgtttgtgatctttttcatcggcctggccatccacggcgccgagagaatcgttagaggacagacagccgagtctctggccgtgcacaatatcaccgtgtgcgagcagaaaatcagcgagtggggcaagatcaaagagtgccccattcctcagttcgccggcaatcctcctatgacctggaagtggatcgtgggccccatgttcctgtacctgtgcgaaagactcgtgcggttctggcggagccagcagaaggtggtcattaccaaggtcgtgacacacccctttaagaccatcgagctgcagatgaagaaaaagggcttcaagatggaagtgggccagtacatctttgtgaagtgccccaaggtgtccaagctggaatggcaccccttcacactgacaagcgcccctgaagaggacttcttcagcatccacatccggatcgtcggcgattggaccgagggcctgtttaatgcctgcggctgcgacaagcaagagttccaggatgcttggaagctgcccaagatcgccgtggacggaccttttggaacagccagcgaggacgtgttcagctacgaggtcgtgatgctcgttggagccggcatcggcgtgacaccttttgccagcatcctgaagtctgtgtggtacaagtactgcaacaacgccaccaacctgaagctcaagaagatctacttctactggctgtgccgggacacccacgcctttgagtggttcgctgatctcctgcagctgctggaaagccagatgcaagagagaaacaacgccggcttcctgagctacaacatctacctgaccggctgggatgagagccaggccaatcactttgccgtgcaccacgacgaagagaaggacgtgatcaccggcctgaagcagaaaaccctgtacggcagacccaactgggacaacgagttcaagacaatcgcctctcagcaccccaataccagaatcggagtgtttctgtgcggccctgaggctctggccgaaacactgagcaagcagagcatcagcaacagcgagtctggccctagaggcgtgcacttcatcttcaacaaagagaacttctga
配列番号２１ＩＤＴ最適化Ｇｐ９１^ｐｈｏｘ
atgggtaactgggcagtgaacgaggggctttctatctttgtcatactcgtgtggcttggcctcaacgtgttcttgttcgtctggtactaccgagtgtacgacattcctcctaaattcttttacacacgcaaactccttgggtctgctttggcgctcgctcgggcacctgcagcgtgcctgaattttaactgtatgctgatcctccttcctgtgtgccgaaaccttctttcattcctgcgaggtagttccgcttgctgctcaactcgggtgcgcaggcagcttgaccgcaacctgacgttccataagatggtagcatggatgattgcgttgcattccgcgatccacactatcgcgcacctctttaacgtggaatggtgtgtaaacgcgagagtaaataacagcgacccatactctgtagcactttccgaacttggagaccggcagaacgaatcttaccttaacttcgctaggaagagaattaaaaacccagaaggtggcctttatctcgcggttacgctgcttgctggcattaccggcgttgtcataactctctgtttgatacttataattacaagctccaccaagactataagacgatcctactttgaagtcttctggtacacgcaccacctgttcgtaattttctttataggactggctattcacggtgcggaaaggattgtacgaggtcagacagctgaatccctcgcggtgcacaacattacggtatgcgagcagaagataagtgagtggggaaaaattaaagagtgccccataccacagttcgccggcaatccaccaatgacatggaagtggatcgtgggcccaatgttcctctacctgtgtgagcgccttgtaaggttttggcgaagccaacagaaagtagtgataacgaaagtagttacacacccgttcaagacaatagagctccagatgaaaaaaaaaggcttcaagatggaagtcggtcaatacatattcgtgaagtgcccgaaagtctcaaagttggaatggcacccattcactctcacatcagcgcctgaagaagactttttctccattcatattcgcattgtgggcgattggacggaagggctctttaacgcttgcgggtgtgataaacaagagtttcaagacgcatggaaattgcctaagatagcagttgatggcccgttcggaaccgccagcgaagatgttttcagttacgaggtcgtcatgctcgttggtgctggaatcggagttactccgtttgcttccatacttaagagcgtctggtacaaatattgtaataatgccaccaatttgaaactcaagaagatttacttttattggttgtgtagggatactcacgctttcgaatggttcgcagaccttctccagctccttgaaagccaaatgcaggaacgaaataacgcaggatttttgagctacaatatataccttacgggttgggacgaatctcaggctaatcatttcgcggtacaccatgatgaagaaaaggatgttataacgggtttgaaacaaaaaacactctatggacgacctaactgggataatgaatttaaaacaatcgccagccaacatcctaacacccggattggagttttcctgtgcgggccagaggcactcgcggagacgctgagtaaacaatcaattagcaactctgagtccgggccacgcggggtgcattttatttttaacaaagagaacttctag
配列番号２２完全ベクター

配列番号２３ＣＭＶ：
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG
配列番号２４３’Ｒ／Ｕ５：
GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC
配列番号２５ＰＳＩ：
Tcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggag
配列番号２６ＲＲＥ：
Tccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacct
配列番号２７ＷＰＲＥ：
Cccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctgga
配列番号２８３’ＰＰＴ：
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配列番号２９３’δＵ３／Ｒ／Ｕ５
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配列番号３０ＳＶ４０ｏｒｉ：
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配列番号３１ＫＡＮｒ：
Attgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
配列番号３２ＣＯＬＥ１：
agatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg

Claims

慢性肉芽腫症の治療のための組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、前記ベクターが、
ＣＹＢＢプロモーターまたはその効果的な断片、及び
前記ＣＹＢＢプロモーターまたはプロモーター断片に作動可能に連結されたｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸
を含む核酸構築物を含む発現カセットを含む、前記ベクター。
前記ＣＹＢＢプロモーターまたはその効果的な断片が、完全長の内因性ＣＹＢＢプロモーター（配列番号１）を含む、請求項１に記載のベクター。
前記ＣＹＢＢプロモーターが、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含み、前記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）（配列番号２）を含むか、またはこれからなる、請求項１に記載のベクター。
前記ＣＹＢＢプロモーターが、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含み、前記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）（配列番号２）からなる、請求項３に記載のベクター。
前記ＣＹＢＢプロモーターが、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含み、前記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）（配列番号３）を含むか、またはこれからなる、請求項１に記載のベクター。
前記ＣＹＢＢプロモーターが、配列が最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）（配列番号３）からなる、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片からなる、請求項５に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２（配列番号４）、またはその効果的な断片を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２コア（配列番号５）を含むか、またはこれからなる、請求項７に記載のベクター。
前記エンハンサーエレメント２の効果的な断片の配列が、エンハンサーエレメント２コアの配列（配列番号５）からなる、請求項８に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２ウルトラコア（配列番号６）を含むか、またはこれからなる、請求項７に記載のベクター。
前記エンハンサーエレメント２の効果的な断片の配列が、エンハンサーエレメント２ウルトラコアの配列（配列番号６）からなる、請求項１０に記載のベクター。
前記発現カセットが、ＲＥＬＡＴＦ結合部位、またはその効果的な断片をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のベクター。
前記ＲＥＬＡＴＦ結合部位が、配列番号７の核酸配列を含むか、またはこれからなる、請求項１２に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント４またはその効果的な断片を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｒ、またはその効果的な断片を含む、請求項１４に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、前記断片の核酸配列が、エンハンサーエレメント４Ｒコアの核酸配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる、請求項１５に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、前記断片の核酸配列が、エンハンサーエレメント４Ｒウルトラコアの核酸配列（配列番号１１）を含むか、またはこれからなる、請求項１５に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｒの効果的な断片を含み、前記断片の核酸配列が、エンハンサーエレメント４Ｒウルトラコアの核酸配列（配列番号１１）からなる、請求項１６に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｌまたはその効果的な断片を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のベクター。
前記発現カセットが、エンハンサーエレメント４Ｌの効果的な断片を含み、前記断片が、４Ｌコア配列の配列（配列番号１３）を含むか、またはこれからなる、請求項１９に記載のベクター。
前記発現カセットが、イントロンエンハンサーエレメント３（配列番号１４）、またはその効果的な断片を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のベクター。
前記発現カセットが、配列番号１５の核酸配列を含むか、またはこれからなる、イントロンエンハンサーエレメント３中間断片を含む、請求項２１に記載のベクター。
前記発現カセットが、配列番号１６の核酸配列を含むか、またはこれからなる、イントロンエンハンサーエレメント３右断片を含む、請求項２１～２２のいずれか１項に記載のベクター。
ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸をコードする前記核酸が、ＣＹＢＢｃＤＮＡまたはコドン最適化ＣＹＢＢである、請求項１～２３のいずれか１項に記載のベクター。
ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする前記核酸が、ＣＹＢＢｃＤＮＡ（配列番号１７）である、請求項２４に記載のベクター。
ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする前記核酸が、コドン最適化ＣＹＢＢである、請求項２４に記載のベクター。
ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする前記核酸の配列が、ｊＣＡＴコドン最適化ＣＹＢＢ（配列番号１８）、ＧｅｎｅＡｒｔ最適化ＣＹＢＢ（配列番号２０）、ＩＤＴ最適化ＣＹＢＢ（配列番号２１）、及び、以前の臨床候補（配列番号１９）からなる群から選択されるコドン最適化ＣＹＢＢである、請求項２６に記載のベクター。
ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする前記核酸の配列が、ｊＣＡＴコドン最適化ＣＹＢＢ（配列番号１８）である、請求項２６に記載のベクター。
前記ベクターが、Ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナルを含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のベクター。
前記ベクターが、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む５’ＬＴＲを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載のベクター。
前記ベクターが、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載のベクター。
前記ベクターが中央ポリプリン帯を含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載のベクター。
前記ベクターが、翻訳後制御エレメントを含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載のベクター。
前記翻訳後制御エレメントが、修飾されたウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項３３に記載のベクター。
前記ベクターが、組み換えにより、野生型レンチウイルスを再構成することができない、請求項１～３４のいずれか１項に記載のベクター。
前記ベクターが、図１に示すに示す完全サイズの２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥの特徴を含み、前記ｍＣｉｔが、Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードする核酸で置き換えられている、請求項１に記載のベクター。
前記ベクターが、図２０Ａに示すＵＣ２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－ｐｒｏ－ｃｏＧｐ９１^ｐｈｏｘ－ＷＲＰＥの特徴を含む、請求項１に記載のベクター。
前記ベクターが、図２０Ｂに表すベクターに示す特徴を含む、請求項３７に記載のベクター。
前記ベクターが、ウルトラコア（ＵＣ）２－４Ｒ－Ｉｎｔ３－Ｐｒｏ－（ＧＰ９１－ｊｃａｔ）－ＷＰＲＥのヌクレオチド配列（配列番号２２）を含む、請求項３８に記載のベクター。
前記ベクターが、ＣＤ３３＋（バルク骨髄細胞）において高い発現、ＣＤ１９＋（Ｂ細胞）において高い発現、ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１６＋（成熟好中球）において高い発現、及び、ＣＤ３＋Ｔ細胞において低い、またはゼロの発現を示す、請求項１～３９のいずれか１項に記載のベクター。
請求項１～４０のいずれか１項に記載のベクターを形質導入した宿主細胞。
前記細胞が幹細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
前記細胞が、骨髄由来の、及び／または臍帯血液由来の、及び／または末梢血由来の幹細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
前記細胞がヒト造血前駆細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項４４に記載の宿主細胞。
対象における慢性肉芽腫症（Ｘ－ＣＧＤ）の治療方法であって、前記方法が、
前記対象由来の幹細胞及び／または前駆細胞に、請求項１～４０のいずれか１項に記載のベクターを形質導入することと、
前記対象由来の前記形質導入細胞（複数可）を前記対象に移植することであって、前記対象由来の細胞または誘導体が、前記Ｇｐ９１^ｐｈｏｘを発現する、前記移植することと、
を含む、前記方法。
前記細胞が幹細胞である、請求項４６に記載の方法。
前記細胞が、骨髄由来の幹細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
前記細胞がヒト造血幹細胞及びヒト造血前駆細胞である、請求項４６に記載の方法。
前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項４９に記載の方法。
以下のうちの１つ以上をコードする組み換え核酸：
ＣＹＢＢプロモーター、もしくはその効果的な断片；及び／または
ＣＹＢＢ内因性エンハンサーエレメント２（ＣＹＢＢＢ細胞エンハンサー）、もしくはその効果的な断片；及び／または
ＣＹＢＢ内因性エンハンサー４Ｒ（ＣＹＢＢ内因性骨髄エンハンサー）、もしくはその効果的な断片；及び／または
ＣＹＢＢ内因性エンハンサー４Ｌ、もしくはその効果的な断片；及び／または
ＣＹＢＢ内因性骨髄イントロン３エンハンサー、もしくはその効果的な断片；及び／または
Ｇｐ９１^ｐｈｏｘをコードするコドン最適化核酸。
前記核酸が、完全長内因性ＣＹＢＢプロモーターを含む、またはこれからなる配列（配列番号１）をコードする、請求項５１に記載の核酸。
前記核酸が、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含む配列をコードし、前記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）（配列番号２）を含むか、またはこれからなる、請求項５１に記載の核酸。
前記核酸が、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含む配列をコードし、前記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（コア）（配列番号２）からなる、請求項５３に記載の核酸。
前記核酸が、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含む配列をコードし、前記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）（配列番号３）を含むか、またはこれからなる、請求項５１に記載の核酸。
前記核酸が、ＣＹＢＢプロモーターの効果的な断片を含む配列をコードし、前記断片が、最小ＣＹＢＢプロモーター（ウルトラコア）（配列番号３）からなる、請求項５５に記載の核酸。
前記核酸が、ＣＹＢＢ内因性エンハンサー２（ＣＹＢＢＢ細胞エンハンサー）の効果的な断片をコードする、請求項５１～５６のいずれか１項に記載の核酸。
前記ＣＹＢＢ内因性エンハンサーエレメント２の核酸配列が、エンハンサーエレメント２コアの配列（配列番号５）を含むか、またはこれからなる、請求項５７に記載の核酸。
前記ＣＹＢＢ内因性エンハンサーエレメント２の核酸配列が、エンハンサーエレメント２ウルトラコアの配列（配列番号６）を含むか、またはこれからなる、請求項５７に記載の核酸。
前記核酸が、ＣＹＢＢ内因性エンハンサー４Ｒ（ＣＹＢＢ内因性骨髄エンハンサー）の効果的な断片を含む、請求項５１～５９のいずれか１項に記載の核酸。
ＣＹＢＢ内因性エンハンサー４Ｒの前記効果的な断片の核酸配列が、エンハンサーエレメント４Ｒウルトラコアの配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる、請求項６０に記載の核酸。
前記核酸が、エンハンサーエレメント４Ｌの効果的な断片を含む、請求項５１～６１のいずれか１項に記載の核酸。
エンハンサーエレメント４Ｌの前記効果的な断片が、４Ｌコア配列の配列（配列番号１３）を含むか、またはこれからなる、請求項６２に記載の核酸。
前記核酸が、ＣＹＢＢ内因性骨髄イントロン３エンハンサーの効果的な断片を含む、請求項５１～６３のいずれか１項に記載の核酸。
ＣＹＢＢ内因性骨髄イントロン３エンハンサーの前記効果的な断片の核酸配列が、エレメント３中間断片核酸配列（配列番号１５）を含むか、またはこれからなる、請求項６４に記載の核酸。
ＣＹＢＢ内因性骨髄イントロン３エンハンサーの前記効果的な断片の核酸配列が、イントロンエンハンサーエレメント３右断片（配列番号１６）を含むか、またはこれからなる、請求項６４～６５のいずれか１項に記載の核酸。
前記核酸が、ｊＣＡＴコドン最適化ＣＹＢＢ（配列番号１８）を含む、請求項５１～６６のいずれか１項に記載の核酸。
前記核酸が発現カセットを含む、請求項５１～６７のいずれか１項に記載の核酸。
前記発現カセットが、インビボでＧｐ９１^ｐｈｏｘを発現するのに効果的である、請求項６８に記載の核酸。
前記核酸が、請求項１～４０のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを含む、請求項５１～６９のいずれか１項に記載の核酸。