JP2023500893A - プレｍｉＲ－２１の阻害のための化合物およびモジュールならびにある種の癌の処置におけるそれらの使用 - Google Patents

プレｍｉＲ－２１の阻害のための化合物およびモジュールならびにある種の癌の処置におけるそれらの使用 Download PDF

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Abstract

プレmiR-21 RNAに対する阻害活性を有する低分子化合物および対応する二量体、ならびに、腫瘍性疾患、例えば癌、具体的には、miR-21を発現する癌の処置のための関連する方法が、開示される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2019年10月29日に出願された米国仮出願第62/927,247号に基づく優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
政府の支援に関する記述
本発明は、National Institutes of Healthによって授与されたR01GM097455-09の下で、政府の支援を受けて作られた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
背景
RNAは、タンパク質をコードし、組み立てるのみならず、無数の細胞役割に関与している。Encyclopedia of DNA Elementsプロジェクトおよびその後の分析は、ゲノムの1～2％のみがタンパク質をコードし、約80％はRNAに転写されることを示した（ENCODE,2012）。転写されたRNAの大部分が非翻訳性（non-coding）であり、多くの非翻訳RNAが、細胞活性のモジュレーションおよび疾患状態に機能的に関与している。そのような機能性の非翻訳RNAは、可能性のある治療標的を表す。
実際、RNA構造は、重要な生物学的過程および疾患状態において重要な役割を果たすことが示されている。RNAの生物学は、それが形成する構造によってしばしば仲介されるため、構造化されたRNAを標的にするアプローチは、有利であり得る。現在のところ、RNAを標的にするアプローチは、非構造化領域を優先的に標的にするオリゴヌクレオチド化合物の使用である1。従って、RNAを標的にする治療薬の開発は、オリゴヌクレオチドの使用に主に集中している。
RNAの三次元構造と相互作用する低分子は、RNA構造を優先的に標的にすることを可能にする。しかしながら、RNAと低分子化合物との相互作用は、十分に理解されておらず、そのため、RNAは「創薬困難」であると認知されている（Guan & Disney,2012；Thomas & Hergenrother,2008）。にも関わらず、低分子は、RNAを標的にする能力を示している。例えば、低分子は、リボソーム、リボスイッチ、ある種のウイルスRNA、およびヌクレオチドリピート伸長の三次元構造を標的にするため、研究されている（Blount and Breaker,2006；米国特許第9,586,944 B2号；米国特許出願公開第2016/0188791 A1号）。
疾患生物学において役割を果たす、構造化されたRNAの1つのクラスは、非翻訳マイクロRNA（miR）である。それらは、それぞれ、ドローシャおよびダイサーというヌクレアーゼによって、核（プリ（pri-）miR）および細胞質（プレmiR）においてプロセシングされる、高度に構造化された前駆体から産生される（図1aを参照すること）。多くのmiRが、ヒト疾患生物学において有意な役割を果たしている（D.P.Bartel,MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function.Cell 116,281-297(2004)を参照すること）。例えば、miR-21の発現は、三種陰性乳癌患者の生存と負に相関しており、固形腫瘍において発現されている（A.M.Krichevsky,G.Gabriely,miR-21:a small multi-faceted RNA.J.Cell.Mol.Med.13,39-53(2009)を参照すること）。
従って、本発明の目的は、miR-21活性の修飾、緩和、および/または消失を達成する低分子の開発である。本発明のもう1つの目的は、miR-21の発現をサイレンシングし、修飾し、かつ/または緩和するため、プレmiR-21を選択的に阻害する低分子の開発である。さらにもう1つの目的は、プレmiR-21を酵素的切断の標的にすることである。さらなる目的は、プレmiR-21との高度の結合を示し、プレmiR-21を選択的に標的にする、阻害および分解のための低分子モジュールを開発することである。
これらおよびその他の目的は、式1
Figure 2023500893000001
および薬学的に許容されるその塩を含む低分子化合物に関する本発明の態様によって達成される。
式1について、R8は水素またはメチルであり、R9はヒドロキシル、H2N-(CH2)q-NH-、またはN3-(CH2)q-NH-であり、指定子qは2～6の整数であり、指定子rは2～6の整数である。好ましくは、R8はメチルである。R9がヒドロキシルまたはα,ω-ジアミノアルキレニルまたはN3-(CH2)q-NH-である時のものを含む、式1の態様は、構造化されたRNAプレmiR-21の発現に対する阻害活性を示す。
式1の態様、具体的には、アジドアルキルアミノ基、N3-(CH2)q-NH-としてのR9を含むものは、miR-21の産生が緩和され、縮小され、最小化され、かつ/またはサイレンシングされるような、RNAプレmiR-21の発現の阻害を示す。式1の態様とプレmiR-21との相互作用は、miR-21の発現に関連した疾患、例えば、腫瘍性疾患、癌、具体的には、肺癌および乳癌の処置を可能にする。miR-21の発現の阻害および関連したヌクレアーゼ分解は、例えば、PCED4およびPTENによる、プログラム細胞死をもたらす。さらに、miR-21の発現の阻害は、腫瘍性細胞の転移特性を阻害する。
本発明の付加的な態様は、式1の連結された二量体に関する。式1の態様が、アジドアルキルアミノ基としてのR9を有する時、式1は、複数の修飾されたグリシン部分のオリゴアミドとの結合を通して二量体化され、連結された二量体に関する本発明の態様を提供することができる。連結された二量体のこれらの態様は、式2の化合物および薬学的に許容されるその塩に関し、それらを含む。
Figure 2023500893000002
式2の態様について、Lは、オリゴマーアミドの一方の末端がグリシンのアミン（末端アミン）で終わり、オリゴマーアミドの他方の末端がグリシンのカルボキシル（末端カルボキシル）で終わる、3～8グリシン残基のリガンドオリゴマーアミドであり得る。末端グリシン残基の窒素は、モノメチレン基、ジメチレン基、トリメチレン基、またはテトラメチレン基を通して、トリアゾリル基と結合している。非末端グリシン残基の窒素は、1～3炭素のアルキルによって置換されている。リガンドオリゴマーアミドのアミン末端は、1～3炭素のアルキル基で置換されていてもよいし、または2～4炭素のアシル基でアシル化されていてもよい。リガンドオリゴマーアミドのカルボキシル末端は、多様な基、例えば、水素、ポリオール、もう1つの生物学的活性基へのポリオール伸長で置換されていてもよいし、または1～3炭素のアルカノールもしくは2～6炭素のジオールでエステル化されていてもよいし、または1～3炭素のアルキルモノアミンもしくは2～6炭素のアルキルジアミンでアミド化されていてもよい。基R8は、式1について与えられたものと同一である。式2について、指定子rは2～6の整数であり、指定子sは2～6の整数である。好ましくは、式2の連結された二量体の態様は、3としての各指定子r、3としての各指定子sを有し、リガンドLは、モノメチレン基によって各トリアゾール基に結合している。
本発明によると、式2の連結された二量体の好ましい態様は、式L-1を含むリガンドLの態様を含む。
Figure 2023500893000003
式L-1の態様について、Myは、N(My)基の窒素を式2のトリアゾール基と接続する、式
(-CH2-)t
のオリゴメチレニル基である。基R10は、1～4炭素のアルキルである。基R11は、水素またはアセチルである。基Nrは、水素であってもよいし、式C1の態様を含むが、これに限定されるわけではないヌクレアーゼリクルートメント部分であってもよいし、またはブレオマイシン誘導体を含むが、これに限定されるわけではないヌクレアーゼ切断分子であってもよい。基EGは、エチレングリコール部分またはプロピレングリコール部分であり得る。基Yは、酸素または-NH-である。整数指定子は、以下の通りである：指定子mは1～6の整数であり、指定子nは1～4の整数であり、指定子oはゼロまたは1であり、指定子pは1～6の整数であり、指定子tは1～4の整数である。
本発明の付加的な態様は、式C1（スチレニルチオフェニル化合物）および薬学的に許容されるその塩を含むヌクレアーゼ酵素リクルートメント分子に関する。
Figure 2023500893000004
式C1の態様は、1～3炭素のアルキルとしてのR1、水素またはフルオロとしてのR2、ヒドロキシルまたはメトキシとしてのR3、メトキシとしてのR4、水素またはメトキシとしてのR5を有する。式C1のヌクレアーゼ酵素リクルートメント活性は、好ましくは、R3がヒドロキシルであり、R5が水素であり、R4がメトキシであり、R2が水素であり、R1がエチルである時に達成される。
本発明のもう1つの態様は、式5および薬学的に許容されるその塩を含む化合物に関する。式5は、式L-1のリガンドの好ましいバージョン、および式C1の好ましい態様としてのNrを有する、式2の好ましい態様である。式5の態様について、指定子mは2～6の整数であり、R8は水素またはメチルである。好ましくは、これらの態様について、指定子mは4である。
Figure 2023500893000005
本発明の付加的な態様は、式1、2、5、C1、薬学的に許容されるそれらの塩、および式L-1の式2への適用の態様の使用に関する。これらの態様は、薬学的に許容される担体と組み合わせられた、式1、2、5、C1、および薬学的に許容されるそれらの塩のうちの任意の1つまたは複数の薬学的組成物を含む。薬学的組成物は、腫瘍性疾患、具体的には、プレmiR-21の発現、具体的には、プレmiR-21の発癌性の発現に関連した悪性腫瘍性疾患の処置のために有用である式1、2、5、C1、および薬学的に許容されるそれらの塩のうちの任意の1つまたは複数を、有効量、含む。
限局性癌および転移性癌を含むが、これらに限定されるわけではない腫瘍性疾患、具体的には、悪性腫瘍性疾患の処置のための方法の態様は、薬学的に許容される担体と、式1、2、5の化合物、および/または式L-1の式2への適用、ならびに薬学的に許容されるそれらの塩とを含む薬学的組成物に関する。方法の態様は、好ましくは、特に、発癌能を有する、miR-21を発現する癌、例えば、以下に限定されるわけではないが、乳癌、肺癌、膵臓癌、メラノーマ、またはmiR-21によって仲介される癌の細胞を有する患者に関する。好ましくは、癌は、乳癌または肺癌である。
悪性腫瘍性疾患の処置のための方法の態様は、式1、2、5、C1のうちの1つまたは複数の薬学的組成物と、公知の抗癌剤との併用投与をさらに含む。公知の抗癌剤は、下記のリストから選択され得、本発明の薬学的組成物の態様の投与の前に、投与と同時に、投与と連続的に、または投与の後に投与され得る。
本発明の付加的な態様は、RNAモチーフとの結合を示す低分子化合物のスクリーニングおよび同定のための方法、ならびに化合物の共通の化学的特徴をマッピングし、RNAモチーフのセットまたは特定のRNAモチーフまたは個々のRNA配列と強力に結合する、そのような共通の化学的特徴を有する新たな低分子化合物を開発するための、そのような方法の結果の使用を含む。これらの態様は、結合したRNA分子を有するマイクロアレイ部位を提供するために、RNA分子のRNAモチーフライブラリを、有機低分子化合物のライブラリを含有するゲルのマイクロアレイに適用する工程を含む、RNA標的のバリデーションおよびプロファイリングのための方法を含む。別々の位置が個々の低分子化合物のアイデンティティを提供するように、低分子化合物は個々に別々にゲル上に位置している。RNAライブラリをマイクロアレイと組み合わせた後、RNA分子がマイクロアレイに結合した部位をマッピングする。係る部位は、マイクロアレイ上の化合物の不連続の独特の位置を原因として、RNA分子と結合する個々の低分子化合物のアイデンティティも提供する。結合した低分子化合物のマップを提供するため、結合したRNA分子のマップを、結合部位にある低分子化合物のアイデンティティと相関させる。化合物マップは、マッピングされた低分子化合物の少なくとも一部、好ましくは少なくとも20パーセント、より好ましくは少なくとも30パーセント、最も好ましくは40パーセントに共通である、マッピングされた低分子化合物の化学構造特徴を同定するため、使用される。具体的に、最も好ましくは、低分子化合物の少なくとも50パーセントまたは少なくとも60パーセントに共通である化学的特徴がマッピングされる。有機低分子化合物のライブラリは、公知のライブラリであってもよいし、または有機低分子化合物の公知のライブラリに適用された、この方法の以前の使用によって同定された化学構造特徴が組み込まれた、合成された有機低分子化合物のライブラリであってもよい。
さらなる態様は、発癌性非翻訳RNA前駆体を標的にすることによる細胞破壊の方法を含む。本法は、薬学的に許容される担体と共に、式1、2、および/または5の化合物が組み込まれた薬学的組成物と、非翻訳RNA前駆体を発現する細胞を接触させる工程を含む。好ましくは、非翻訳RNA前駆体は、発癌性非翻訳RNA前駆体である。そのような方法において、薬学的組成物は、式2の化合物を含み、Lのカルボキシル末端は、アルキルエステルまたはアルキルアミドである。また、好ましくは、薬学的組成物は、式2の化合物を含み、カルボキシル末端Lは、Nu置換を有する。好ましくは、Nu置換について、Nuは、式C1であり得る。
非翻訳RNA前駆体を含む上記の方法に従い、発癌性非翻訳RNA前駆体は、より好ましくは、発癌性プレマイクロRNA-21（プレmiR-21）を含む。
非翻訳RNA前駆体、例えば、発癌性プレmiR-21に関する本発明の付加的な態様において、上記の方法は、乳癌、肺癌、膵臓癌、メラノーマ、またはmiR-21によって仲介される癌の細胞を、式1、2、および/または5の化合物についての前記の1つまたは複数の薬学的組成物と接触させることによって、そのような細胞におけるPTENタンパク質の発現を増強する工程も含む。
本発明の付加的な態様において、上記の方法は、乳癌、肺癌、膵臓癌、メラノーマ、またはmiR-21によって仲介される癌の細胞を、以下のセクションにおいて詳細に示される前記の1つまたは複数の薬学的組成物と接触させることによって、そのような細胞におけるPDCD4タンパク質の発現を増強する工程を含む。好ましくは、癌細胞は、ヒト患者に存在する。これらの方法において、薬学的組成物は、好ましくは、式2の化合物を含み、式2がNuを含み、Nuが、Lと共有結合した式C1であるか、または化合物は、式5である。
方法の上記の態様のいずれかの好ましい標的は、上記の薬学的組成物のうちの1つまたは複数と細胞を接触させることによって、三種陰性乳癌細胞における浸潤を阻害する工程を含み、ここで、具体的には、薬学的組成物は、式2のLがNuによって置換されており、Nuが、Lと共有結合した式C1である式2の化合物を含む。本発明の方法のこの態様は、ヒト患者に存在する乳癌細胞に焦点を当てる。方法のこの態様は、具体的には、発癌性前駆体マイクロRNA-21（プレmiR-21）を発現する乳癌を含む。具体的には、この種類の標的にされた乳癌の処置のための薬学的組成物の化合物は、式LのLがNuによって置換されており、Nuが式C1である式2の化合物である。
異常RNAのスクリーニング、同定、および阻害または阻止のための方法の付加的な態様は、1つまたは複数のトランスクリプトームを含むRNAライブラリを含む。トランスクリプトームは、ウイルスのもの、哺乳動物のもの、細菌のもの、または合成RNA、半合成RNA、もしくは天然RNAのうちの1つもしくは複数、またはRNAウイルスのゲノムであり得る。
これらの方法の態様は、インビトロで実施されてもよいし、生細胞において実施されてもよく、かつ/または細胞は、ウイルスもしくは細菌に感染した細胞、例えば、以下に限定されるわけではないが、癌を引き起こすウイルスもしくは細菌に感染した細胞であり得る。
マイクロRNA-21を標的にする低分子の合理的設計。 図1の設計戦略によって作製された低分子。 図2-1の続きを示す図である。 低分子リクルーターによるプレmiR-21の切断。 図3-1の続きを示す図である。 マウスに注射された癌細胞のインビボ成長の阻害。
詳細な説明
本発明によって、RIBOTACと名付けられたマイクロアレイプロトコルおよびInfornaと名付けられた配列に基づく設計アプローチを使用して、プレmiR-21 RNA低分子阻害剤の態様が開発された（Disney et al.,ACS Chemical Biology,2016,11,1720-1728および"Scripps Research News"published May 22,2018"Novel RNA-Modifying Tool"Dr.Matthew Disney et al.を参照すること）。そのアプローチは、プレmiR-21 RNA内の三次元折り畳みを標的にする低分子の設計を可能にした。このアプローチは、図1bに概念的に図示される。Infornaは、低分子と結合する折り畳まれたRNA構造のアウトプットを使用する。低分子モデルは、ライブラリ対ライブラリスクリーニングアプローチに由来する（S.P.Velagapudi,S.M.Gallo,M.D.Disney,Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs.Nat.Chem.Biol.10,291-297(2014)を参照すること）。この分析は、さらに調査するための、式1の低分子化合物を同定した。次いで、式1に基づくモジュールを設計し、腫瘍性細胞、例えば、三種陰性乳癌細胞（MDA-MB-231）の成長を抑止する能力についてアッセイした。これらのモジュールは、腫瘍性細胞の成長を抑止する有意な能力を示した。さらに、マウスに移植されたMDA-MD-231細胞の転移挙動に対するこれらのモジュールの阻害活性を調査したところ、成功が見出された。
本発明による低分子化合物の態様の開発および同定に関連したRIBOTACプロトコルおよびInfornaプロトコルの方法および使用の説明、ならびに本発明の低分子化合物の態様の特徴を、以下のセクションにおいて示す。
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語が、当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
「約」という用語は、本明細書において使用されるように、数的な値または範囲をさす時、その値または範囲のある程度の可変性、例えば、明記された値または明記された範囲の限度の10％以内または5％以内の可変性を可能にする。
全てのパーセント組成が、他に明記されない限り、重量百分率として与えられる。
ポリマーの平均分子量は、全て、他に特記されない限り、重量平均分子量である。
「であり得る（may）」という用語は、本願に関して、「許可される」または「することができる」を意味し、「であり得る（can）」という用語と同義である。「であり得る」という用語は、本明細書において使用されるように、可能性または確率を意味しない。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「（a）」、「（an）」、および「（the）」は、前後関係が明白に他のことを指示しない限り、複数形を含み、例えば、「Xおよび/またはY」という用語は、「X」を意味するか、または「Y」を意味するか、または「X」および「Y」の両方を意味し、名詞の後の「（s）」の文字は、その名詞の複数形および単数形の両方を表すことも理解されるべきである。さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群によって記載される場合、本発明は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーおよびメンバーの任意のサブグループを包含し、それらによって記載されること、そしてマーカッシュ群の任意の個々のメンバーおよびメンバーの任意のサブグループを具体的にさすよう、本願または特許請求の範囲を補正する権利が保存されていることが意図され、当業者はそのことを認識するであろう。
「有効量」という表現は、疾患に罹患した個体に対する治療を記載するために使用される時、例えば、研究者または医師によって求められる、細胞、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的な応答を誘発する、本発明の薬物、薬学的薬剤、または化合物の量をさす。そのような応答には、以下に限定されるわけではないが、障害、異常、疾患等が起こっている個体の組織に関する、またはそれらの組織における、障害、異常、疾患、感染、またはその他の問題に対する、緩和、阻害、またはその他の作用が含まれ、ここで、そのような阻害またはその他の作用は、有益な治療効果を生じるために十分な程度に起こる。さらに、「治療的に有効な量」という用語は、そのような量を受容していない対応する対象と比較して、疾患、障害、もしくは副作用の改善された処置、治癒、防止、もしくは緩和、または疾患もしくは障害の進行の速度の減少をもたらす量を意味する。正常な生理学的機能を増強するために有効な量も、その用語の範囲内に含まれる。
「実質的に」という用語は、本明細書において使用されるように、完全に、または、ほぼ完全に、を意味し；例えば、ある成分を「実質的に含まない」組成物は、その成分を全く有していないか、もしくはその存在によって組成物の関連する機能的特性が影響を受けないような微量を含有するかのいずれかであり、または無視し得る程度の微量の不純物のみが存在する場合、その化合物は「実質的に純粋」である。
「処置すること」または「処置」とは、本明細書における意味において、障害もしくは疾患に関連した症状の軽減、またはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化の阻害、または疾患もしくは障害の防止もしくは予防、または疾患もしくは障害の治癒をさす。同様に、本明細書において使用されるように、本発明の化合物の「有効量」または「治療的に有効な量」とは、疾患もしくは障害に関連した症状を完全にもしくは部分的に軽減するか、またはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化を停止させるか、もしくは遅延させるか、または疾患もしくは障害を防止するか、もしくはその予防を提供する化合物の量をさす。具体的には、「治療的に有効な量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および期間で、有効な量をさす。治療的に有効な量は、本発明の化合物の有毒もしくは有害な効果より、治療的に有益な効果の方が大きいものでもある。
「を提供するために適当な条件で」または「を与えるために十分な条件で」等の語句は、合成の方法に関して、本明細書において使用されるように、反応生成物の有用な量または収率を提供する、変動させるための実験者の通常の技術の範囲内にある反応条件、例えば、時間、温度、溶媒、反応物濃度等をさす。所望の反応生成物が単離され得るか、またはその他の方法でさらに使用され得ることを条件として、所望の反応生成物が唯一の反応生成物である必要はなく、出発材料が完全に消費される必要もない。
「化学的に実現可能」とは、有機構造の一般的に理解されているルールが侵害されない結合の配置または化合物を意味し；例えば、天然には存在しない五価炭素を、ある種の状況において含有する、特許請求の範囲の定義に含まれる構造は、特許請求の範囲に含まれないことが理解される。本明細書に開示される構造は、態様の全てにおいて、「化学的に実現可能」な構造のみを含むことが意図され、例えば、可変性の原子または基によって示された構造のうち、化学的に実現可能でない記述された構造は、本明細書に開示されず、特許請求の範囲に記載されないことが意図される。
化学構造の「類似体」という用語は、本明細書において使用されるように、親構造との実質的な類似性を保存している化学構造をさすが、それは、親構造から合成によって容易には派生し得ない。親化学的構造から合成によって容易に派生する関連する化学的構造は、「誘導体」と呼ばれる。
さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群によって記載される場合、本発明は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによっても記載されることを、当業者は認識するであろう。例えば、Xが、臭素、塩素、およびヨウ素からなる群より選択されると記載された場合、Xが臭素である請求項、ならびにXが臭素および塩素である請求項が、完全に記載される。さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群によって記載される場合、本発明は、マーカッシュ群の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの任意の組み合わせによっても記載されることを、当業者は認識するであろう。従って、例えば、Xが、臭素、塩素、およびヨウ素からなる群より選択されると記載され、Yが、メチル、エチル、およびプロピルからなる群より選択されると記載された場合、Xが臭素であり、Yがメチルである請求項が、完全に記載される。
必ず整数である変数の値、例えば、アルキル基の炭素原子の数または環上の置換基の数が、範囲、例えば、0～4として記載される場合、それは、その値が、0～4（両端の値を含む）の任意の整数、即ち、0、1、2、3、または4であり得ることを意味する。
様々な態様において、本発明の方法において使用される化合物または化合物のセットは、前掲の態様の組み合わせおよび/または部分的組み合わせのうちの任意のものであり得る。
様々な態様において、実施例のいずれかにおいて示される化合物または例示的な化合物に含まれる化合物が提供される。開示されたカテゴリまたは態様のうちの任意のものに、他の前記の開示された態様または種のうちの任意の1つまたは複数が、そのようなカテゴリまたは態様から除外され得るという条件が、適用され得る。
本明細書中の様々な場所において、本発明の化合物の置換基が、群または範囲として開示される。具体的には、本発明は、そのような群または範囲のメンバーの個々の部分的組み合わせを各々全て含むことが意図される。例えば、「C1-C6アルキル」という用語は、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル等を個々に開示することが意図される。「約」という用語によって修飾された数については、2％、5％、10％、またはさらには20％の変動が、修飾された数の範囲内にある。
当技術分野において周知である、化学的な基についての標準的な略語が使用される；例えば、Me＝メチル、Et＝エチル、i-Pr＝イソプロピル、Bu＝ブチル、t-Bu＝tert-ブチル、Ph＝フェニル、Bn＝ベンジル、Ac＝アセチル、Bz＝ベンゾイル等。
「アジド」とは、N3基をさす。「アジド」は、有機アジドであってもよいし、またはアジド（N3 -）陰イオンの塩であってもよい。「ニトロ」という用語は、有機部分と結合したNO2基をさす。「ニトロソ」という用語は、有機部分と結合したNO基をさす。硝酸という用語は、有機部分と結合したONO2基、または硝酸（NO3 -）陰イオンの塩をさす。
「塩」には、当技術分野において周知であるように、対イオンと結合したイオン形態の有機化合物、例えば、カルボン酸、スルホン酸、またはアミンが含まれる。例えば、陰イオン形態の酸は、陽イオン、例えば、金属陽イオン、例えば、ナトリウム、カリウム等；アンモニウム塩、例えば、NH4 +または様々なアミンの陽イオン、例えば、テトラアルキルアンモニウム塩、例えば、テトラメチルアンモニウム、またはその他の陽イオン、例えば、トリメチルスルホニウム等と塩を形成することができる。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」塩とは、ヒトによる消費のために承認されており、一般的に、無毒であるイオンから形成された塩、例えば、塩化物塩またはナトリウム塩である。「双性イオン」とは、相互にバランスを取るよう機能する、少なくとも2個のイオン化可能基（一方は陰イオンを形成し、他方は陽イオンを形成する）を有する分子において形成され得る分子内塩である。例えば、グリシンなどのアミノ酸は、双性イオンとして存在し得る。「双性イオン」は、本明細書における意味において、塩である。本発明の化合物は、塩の形態を取ることができる。「塩」という用語には、本発明の化合物である遊離酸または遊離塩基の付加塩が包含される。塩は、「薬学的に許容される塩」であり得る。「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的適用における利用可能性を与える範囲内の毒性プロファイルを保有する塩をさす。にも関わらず、薬学的に許容されない塩は、本発明の実施における利用可能性、例えば、本発明の化合物の合成、精製、または製剤化の過程における利用可能性を有する特性、例えば、高度の結晶化度を保有し得る。
適当な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸または有機酸から調製され得る。無機酸の例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸が含まれる。適切な有機酸は、脂肪族クラス、脂環式クラス、芳香族クラス、アラリファティック（araliphatic）クラス、複素環式クラス、カルボン酸クラス、およびスルホン酸クラスの有機酸より選択され得、それらの例には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、βヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸が含まれる。薬学的に許容されない酸付加塩の例には、例えば、過塩素酸塩およびテトラフルオロホウ酸塩が含まれる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（naphthylate）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリルスルホン酸塩、およびアミノ酸塩等が含まれる（例えば、Berge et al.(1977)"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.66:1-19を参照すること）。
本発明の化合物の適当な薬学的に許容される塩基付加塩には、例えば、金属塩、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、および遷移金属塩、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、および亜鉛塩が含まれる。薬学的に許容される塩基付加塩には、塩基性アミン、例えば、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、およびプロカインから作られた有機塩も含まれる。薬学的に許容されない塩基付加塩の例には、リチウム塩およびシアン酸塩が含まれる。薬学的に許容されない塩は、一般的に、医薬として有用でないが、そのような塩は、例えば、式（I）の化合物の合成における中間体として、例えば、再結晶による精製において有用であり得る。これらの塩は、全て、式（I）による対応する化合物から、従来の手段によって、例えば、適切な酸または塩基を、式（I）による化合物と反応させることによって調製され得る。「薬学的に許容される塩」という用語は、無毒の無機または有機の酸付加塩および/または塩基付加塩をさす（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Lit et al.,Salt Selection for Basic Drugs(1986),Int J.Pharm.,33,201-217を参照すること）。
「アルキル」とは、本明細書において他に特記されない限り、直鎖状、分岐鎖状、または環式のヒドロカルビル（hydrocarbyl）基、例えば、1～約20個の炭素原子を含む「シクロアルキル」をさす。好ましいアルキル基は、1～10個の炭素原子または1～6個の炭素原子を有し得る。例示的なアルキルには、直鎖アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等が含まれ、直鎖アルキル基の分岐鎖異性体、例えば、非限定的に、-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2等も含まれる。従って、アルキル基には、第一級アルキル基、第二級アルキル基、および第三級アルキル基が含まれる。アルキル基は、置換されていなくてもよいし、または本明細書中の下記の1個もしくは複数個の置換基によって置換されていてもよい。
「置換されたアルキル」という語句は、1個または複数個の位置、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、またはさらには6個の位置において置換されたアルキルであって、本明細書に記載される置換によって、安定的な化合物を生成するため、任意の利用可能な原子に置換基が付着しているアルキルをさす。「置換されていてもよいアルキル」とは、アルキルまたは置換されたアルキルをさす。
「ハロゲン」、「ハロゲン化物」、および「ハロ」という用語は、各々、-F、-Cl、-Br、または-Iをさす。
「アルケニル」という用語は、1～3個、1～2個、または少なくとも1個の炭素間二重結合を有する、直鎖状、分岐鎖状、または環式のヒドロカルビル基、例えば、2～約20個の炭素原子を含む「シクロアルケニル」をさす。「シクロアルケニル」という用語は、具体的には、環式アルケニル、例えば、C3-C6-シクロアルケニルをさす。アルケニル基は、置換されていなくてもよいし、または本明細書中の下記の1個もしくは複数個の置換基によって置換されていてもよい。
「置換されたアルケニル」とは、1個または複数個、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、またはさらには6個の位置において置換されたアルケニルであって、本明細書に記載される置換によって、安定的な化合物を生成するため、任意の利用可能な原子に置換基が付着しているアルケニルをさす。「置換されていてもよいアルケニル」とは、アルケニルまたは置換されたアルケニルをさす。
「アルキン」または「アルキニル」とは、示された数の炭素原子および少なくとも1個の三重結合を有する直鎖状または分岐鎖状の不飽和炭化水素をさす。(C2-C8)アルキニル基の例には、アセチレン、プロピン、1-ブチン、2-ブチン、1-ペンチン、2-ペンチン、1-ヘキシン、2-ヘキシン、3-ヘキシン、1-ヘプチン、2-ヘプチン、3-ヘプチン、1-オクチン、2-オクチン、3-オクチン、および4-オクチンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。アルキニル基は、置換されていなくてもよいし、または本明細書中の下記の1個もしくは複数個の置換基によって置換されていてもよい。
「置換されたアルキニル」とは、1個または複数個、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、またはさらには6個の位置において置換されたアルキニルであって、本明細書に記載される置換によって、安定的な化合物を生成するため、任意の利用可能な原子に置換基が付着しているアルキニルをさす。「置換されていてもよいアルキニル」とは、アルキニルまたは置換されたアルキニルをさす。
「アルコキシ」という用語は、示された数の炭素原子を有する-O-アルキル基をさす。例えば、(C1-C6)アルコキシ基には、-O-メチル、-O-エチル、-O-プロピル、-O-イソプロピル、-O-ブチル、-O-sec-ブチル、-O-tert-ブチル、-O-ペンチル、-O-イソペンチル、-O-ネオペンチル、-O-ヘキシル、-O-イソヘキシル、および-O-ネオヘキシルが含まれる。
「カルボシクリル」という用語は、飽和、例えば、「シクロアルキル」、または不飽和、例えば、「シクロアルケニル」のいずれかである、単環式、二環式、三環式、または多環式の3～14員環系をさす。カルボシクリルは、任意の原子を介して付着していてよい。例えば、カルボシクリルは、例えば、カルボシクリルが、本明細書において定義されるアリール環またはヘテロアリール環と縮合している縮合環も企図する。カルボシクリルの代表的な例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、フェニル、ナフチル、アントラシル、ベンゾフラニル、およびベンゾチオフェニルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。カルボシクリル基は、置換されていなくてもよいし、または本明細書中の下記の1個もしくは複数個の置換基によって置換されていてもよい。
「置換されたカルボシクリル」とは、1個または複数個、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、またはさらには6個（いくつかのケースにおいて、1個または2個）の位置において置換されたカルボシクリルであって、本明細書に記載される置換によって、安定的な化合物を生成するため、任意の利用可能な原子に置換基が付着しているカルボシクリルをさす。「置換されていてもよいカルボシクリル」とは、カルボシクリルまたは置換されたカルボシクリルをさす。
「アリール」とは、単独で使用される時、またはもう1つの用語の一部として使用される時、指定された数の炭素原子を有し、数が指定されない場合には、14個までの炭素原子を有する、縮合していてもよいし、縮合していなくてもよい炭素環式芳香族基、例えば、C6-C14-アリールを意味する。具体的なアリール基は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナントレニル、ナフタセニル（naphthacenyl）等である（例えば、Lang's Handbook of Chemistry(Dean,J.A.,ed)13th ed.Table 7-2[1985]を参照すること）。具体的なアリールは、フェニルである。「アリール」には、本明細書において定義されるカルボシクリル環と縮合していてもよい芳香環系も含まれる。アリール基は、置換されていなくてもよいし、または本明細書中の下記の1個もしくは複数個の置換基によって置換されていてもよい。
「置換されたアリール」とは、安定的な化合物を生成するため、任意の利用可能な原子に付着した1個または複数個の置換基によって独立に置換されているアリールであり、ここで、置換基は、本明細書に記載されるようなものである。いくつかのケースにおいて、アリールは、1個、2個、または3個の置換基で置換されている。「置換されていてもよいアリール」とは、アリールまたは置換されたアリールをさす。
「ヘテロ原子」という用語は、N、O、およびSをさす。N原子またはS原子を含有する本発明の化合物は、任意で、対応するN-オキシド化合物、スルホキシド化合物、またはスルホン化合物に酸化され得る。
単独の、または本明細書に記載される他の任意の部分と組み合わせられた「ヘテロアリール」とは、O、S、およびNからなる群より独立に選択される1個または複数個、例えば、1～4個、1～3個、または1～2個のヘテロ原子を含有する、5～10個、例えば、5個もしくは6個の環原子を含有する単環式芳香環構造、または8～10個の原子を有する二環式芳香族基をさす。ヘテロアリールは、酸化されたSまたはN、例えば、スルフィニル、スルホニル、および第三級環窒素のNオキシドを含むことも意図される。安定的な化合物が生成されるような炭素またはヘテロ原子が、ヘテロアリール環構造の付着点である。ヘテロアリール基の例には、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、キナオキサリル（quinaoxalyl）、インドリジニル、ベンゾ[b]チエニル、キナゾリニル、プリニル、インドリル、キノリニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、イソキサゾリル、オキサチアジアゾリル、イソチアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、フラニル、ベンゾフリル、およびインドリルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。ヘテロアリール基は、置換されていなくてもよいし、または本明細書中の下記の1個もしくは複数個の置換基によって置換されていてもよい。
「置換されたヘテロアリール」とは、他に示されない限り、安定的な化合物を生成するため、任意の利用可能な原子に付着した1個または複数個、例えば、1個、2個、3個、4個、または5個の置換基（1個、2個、または3個の置換基であってもよく、1個の置換基であってもよい）によって独立に置換されているヘテロアリールであり、ここで、置換基は、本明細書に記載されるようなものである。「置換されていてもよいヘテロアリール」とは、ヘテロアリールまたは置換されたヘテロアリールをさす。
「ヘテロシクロアルキル」とは、環内の1～3個の炭素原子がO、S、またはNのヘテロ原子に交換されている、3～14個、例えば、3～6個の原子を有する飽和または不飽和の非芳香族の単環式、二環式、三環式、または多環式の環系を意味する。ヘテロシクロアルキルは、5～6員のアリールまたはヘテロアリールと縮合していてもよく、酸化されたSまたはN、例えば、スルフィニル、スルホニル、および第三級環窒素のN-オキシドを含む。ヘテロシクロアルキル環の付着点は、安定的な環が保持されるような炭素またはヘテロ原子にある。ヘテロシクロアルキル基の例には、非限定的に、モルホリノ、テトラヒドロフラニル、ジヒドロピリジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ジヒドロベンゾフリル、およびジヒドロインドリルが含まれる。ヘテロシクロアルキル基は、置換されていなくてもよいし、または本明細書中の下記の1個もしくは複数個の置換基によって置換されていてもよい。
「置換されていてもよいヘテロシクロアルキル」とは、安定的な化合物を生成するため、任意の利用可能な原子に付着した1～3個の置換基、例えば、1個、2個、または3個の置換基によって置換されているヘテロシクロアルキルを意味し、ここで、置換基は、本明細書に記載されたようなものである。
「ニトリル」または「シアノ」という用語は、交換可能に使用され得、ヘテロアリール環、アリール環、およびヘテロシクロアルキル環の炭素原子と結合した-CN基をさす。
「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」とは、-OH基をさす。
本明細書に記載された化合物は、様々な異性体の形態、例えば、立体配置異性体、幾何異性体、および立体配座異性体、例えば、cis-立体配座またはtrans-立体配座で存在し得る。化合物は、1つまたは複数の互変異性体の形態で存在してもよく、例えば、1種の互変異性体として存在してもよいし、互変異性体の混合物として存在してもよい。「異性体」という用語は、本開示の化合物の全ての異性体の形態、例えば、化合物の互変異性体の形態を包含することが意図される。本開示の化合物は、鎖状の形態で存在してもよいし、または環状の形態で存在してもよい。いくつかのケースにおいて、環状の形態のうちの1つまたは複数は、水の喪失に起因し得る。鎖状の形態および環状の形態の具体的な組成は、化合物が単離され、保管され、または投与される方法に依存し得る。例えば、化合物は、酸性条件では主として鎖状の形態で存在するが、中性条件では環化するものであり得る。全ての形態が、本開示に含まれる。
本明細書に記載されたいくつかの化合物は、不斉中心を有し、従って、異なるエナンチオマーおよびジアステレオマーの形態で存在し得る。本発明の化合物は、光学異性体またはジアステレオマーの形態であり得る。従って、本開示は、光学異性体、ジアステレオ異性体、およびそれらの混合物、例えば、ラセミ混合物の形態の本明細書に記載される化合物、ならびにそれらの使用を包含する。本開示の化合物の光学異性体は、公知の技術、例えば、不斉合成、キラルクロマトグラフィ、擬似移動床テクノロジーによって、または光学活性分割剤の利用を通した立体異性体の化学的分離を介して、得ることができる。
他に示されない限り、「立体異性体」という用語は、ある化合物の1種の立体異性体であって、その化合物の他の立体異性体を実質的に含まないものを意味する。従って、1個の不斉中心を有する立体的に（stereomerically）純粋な化合物は、その化合物の反対のエナンチオマーを実質的に含まない。2個の不斉中心を有する立体的に純粋な化合物は、その化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まない。典型的な立体的に純粋な化合物は、約80重量％超のその化合物の1種の立体異性体および約20重量％未満のその化合物の他の立体異性体、例えば、約90重量％超のその化合物の1種の立体異性体および約10重量％未満のその化合物の他の立体異性体、または約95重量％超のその化合物の1種の立体異性体および約5重量％未満のその化合物の他の立体異性体、または約97重量％超のその化合物の1種の立体異性体および約3重量％未満のその化合物の他の立体異性体、または約99重量％超のその化合物の1種の立体異性体および約1重量％未満のその化合物の他の立体異性体を含む。前記の立体異性体は、本明細書に記載されたそれぞれの重量百分率で存在する2種の立体異性体を含む組成物と見なされ得る。
図示された構造と、その構造に与えられた名称との間に矛盾が存在する場合には、図示された構造が優先される。さらに、構造または構造の一部分の立体化学が、例えば、太線または破線によって示されない場合、その構造またはその構造の一部分は、その全ての立体異性体を包含すると解釈されるべきである。しかしながら、いくつかのケースにおいて、複数の不斉中心が存在する場合、構造および名称は、相対的な立体化学の記載を助けるため、1種のエナンチオマーとして表され得る。有機合成の当業者は、化合物が1種のエナンチオマーとして調製されるか否かを、それらを調製するために使用された方法から知るであろう。
本明細書において使用されるように、他に特記されない限り、「化合物」という用語は、化合物または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、および/または互変異性体を包含するという点で、包括的である。従って、例えば、式Iの化合物は、化合物の互変異性体の薬学的に許容される塩を含む。
「防止する」、「防止すること」、および「防止」という用語は、予防剤または治療剤の投与に起因する、患者における疾患の発症、再発、または蔓延の防止をさす。
「患者」または「対象」には、動物、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、仔ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットが含まれる。いくつかの態様によると、動物は、哺乳動物、例えば、非霊長類ならびに霊長類（例えば、サルおよびヒト）である。1つの態様において、患者は、ヒト、例えば、乳児期、幼児期、青年期、または成人期のヒトである。
「核酸」という用語は、本明細書において使用されるように、RNAおよびDNAをさすものとする。
「RNA」とは、本明細書において使用されるように、リボ核酸分子およびオリゴマーをさすものとする。RNAには、mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、siRNA、shRNA等が含まれる。
「DNA」とは、本明細書において使用されるように、デオキシリボ核酸分子およびオリゴマーをさすものとする。
「標識されたRNA」という用語は、本明細書において使用されるように、放射標識、蛍光タグ、発色タグ、またはその他の検出可能プローブを含有するよう標識されたRNAをさす。標識されたRNAは、RNAライブラリから提供されるか、または調製され得る。
「RNAライブラリ」という用語は、本明細書において使用されるように、本発明の使用においてスクリーニングされ得るRNAのコレクションをさす。多くの機関がRNAライブラリを有しており、いくつかは市販されている。RNAライブラリには、非翻訳RNAライブラリ、RNAモチーフライブラリ、miRNAライブラリ、ウイルスRNAライブラリ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。RNAモチーフライブラリは、分子内ループモチーフライブラリ、ヘアピンループモチーフライブラリ、バルジモチーフライブラリ、マルチブランチループモチーフライブラリ、シュードノットモチーフライブラリ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
「RNAモチーフ」という用語は、本明細書において使用されるように、標的にすることが可能な分子内ループ、ヘアピンループ、バルジ、または標的にすることが可能なその他のRNA構造モチーフをさすものとする。RNAモチーフの例には、対称分子内ループ、非対称分子内ループ、1×1分子内ループ、1×2分子内ループ、1×3分子内ループ、2×2分子内ループ、2×3分子内ループ、2×4分子内ループ、3×3分子内ループ、3×4分子内ループ、4×4分子内ループ、4×5分子内ループ、5×5分子内ループ、1塩基バルジ、2塩基バルジ、3塩基バルジ、4塩基バルジ、5塩基バルジ、4塩基ヘアピンループ、5塩基ヘアピンループ、6塩基ヘアピンループ、7塩基ヘアピンループ、8塩基ヘアピンループ、9塩基ヘアピンループ、10塩基ヘアピンループ、マルチブランチループ、シュードノット等が含まれる。DNAモチーフの例には、対称分子内ループ、非対称分子内ループ、バルジ、およびヘアピンループが含まれる。いくつかのケースにおいて、「モチーフ」という用語は、RNA二次構造全般を含むが、場合により、既に同定された特定のRNA構造をさすこともできる。
「チェイス（chase）オリゴヌクレオチド」には、本明細書において使用されるように、スクリーニングされる化合物が、RNAモチーフ（即ち、RNAモチーフライブラリの可変性の領域）と相互作用し、メンバー間で変動しない核酸領域（例えば、不変ステム領域、不変ヘアピンループ領域等）とは相互作用しないことを確実にするために設計されたオリゴヌクレオチドが含まれるものとする。そのようなステムチェイスオリゴヌクレオチドおよびヘアピンオリゴヌクレオチドの設計は、メンバー間で変動しない核酸領域において使用される配列に依存し得る。チェイスヌクレオチドは、時に、DNAチェイスオリゴヌクレオチド（即ち、相互作用がRNA特異的であることを確実にするためのオリゴヌクレオチド）を含み得る。適当なDNAチェイスオリゴヌクレオチドの例には、二重鎖AT十量体、二重鎖CG十量体、およびそれらの組み合わせが含まれる。ある種の態様において、1つまたは複数のチェイスオリゴヌクレオチドは、ステムチェイスオリゴヌクレオチドを含む。ある種の態様において、1つまたは複数のチェイスオリゴヌクレオチドは、ヘアピンチェイスオリゴヌクレオチドを含む。ある種の態様において、1つまたは複数のチェイスオリゴヌクレオチドは、DNAチェイスオリゴヌクレオチドを含む。例えば、1つまたは複数のチェイスオリゴヌクレオチドが、ステムチェイスオリゴヌクレオチド、ヘアピンチェイスオリゴヌクレオチド、およびDNAチェイスオリゴヌクレオチドを含むケースのように、これらおよびその他のチェイスオリゴヌクレオチドの組み合わせが利用されてもよい。
「ゲル」という用語は、本明細書において使用されるように、液体によってその体積全体に広がる非液体のコロイドネットワークまたはポリマーネットワークをさすものとする。例えば、ゲルは、共有結合的に架橋されたポリマーネットワーク；ネットワーク接合点として作用する局所的な秩序（local order）の領域をもたらす水素結合、結晶化、ヘリックス形成、複合体形成等によって引き起こされたポリマー鎖の物理的凝集を通して形成されたポリマーネットワーク；ガラス状（glassy）接合点を通して形成されたポリマーネットワーク、例えば、ブロックコポリマーに基づくものを含有し得るが、そのことが必要とされるわけではない。ゲルは、ハイドロゲルであり得る。
「非共有結合的に接着した」または「接着した」という用語は、本明細書において使用されるように、化合物とゲルとの間に共有結合が形成されることなく、ゲルの不連続の区域に密接に接着した化合物をさすものとする。接着は、例えば、ゲル溶媒系の液体成分への吸収を介したものであってもよいし、または、例えば、ゲルの表面への吸着を介したものであってもよいし、またはそれらの組み合わせであってもよい。もう1つの例として、接着は、例えば、熱力学的および/もしくは動力学的安定化、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、溶媒和、またはそれらの組み合わせの結果であってもよい。いくつかのケースにおいて、接着は、水素結合の結果であってもよい。いくつかのケースにおいて、接着は、機能的または経験的に記載され得、例えば、接着は、マイクロアレイゲル上の不連続の位置に化合物が留まるような、最小の拡散を示す化合物によって記載され得る。もう1つの例として、接着は、マイクロゲルが洗浄またはインキュベートされた時に実質的に接着し続ける化合物によって記載され得る。化合物の群は、共有結合を形成することなく、少なくとも70％、80％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％がゲルに接着している時、非共有結合的に接着していると見なされ得る。上記の例は、化合物がゲルに接着する様式または程度を限定することを意図したものではなく、例示のために提供されるに過ぎない。
本明細書において使用されるように、例えば、アジドとアルキンとのヒュスゲン環化付加を介して形成される、トリアゾール結合を介して、ゲルにカップリングされた化合物は、非共有結合的な接着に含まれない。ゲルがウェルを有し、ウェルに物理的に含有されている溶媒に化合物が溶解または懸濁している場合のように、ゲルから空間的に離れている化合物も、接着には含まれない。もう1つの例として、ゲル上にあるが、ゲルと混合されない不連続の液滴によって含有されている化合物は、接着に含まれない。例えば、エアロゾルデポジションテクノロジーを使用して、RNAモチーフライブラリと次いで接触させられる、不連続の液滴として固定化された化合物は、接着に含まれない。さらに、ドライケミカルマイクロアレイとしてのマイクロアレイの上に単に置かれた化合物は、接着に含まれない。例えば、ドライケミカルマイクロアレイは、洗浄、インキュベーション、または両方を受けた場合に、付着した化合物が、混合されるか、またはスポッティングされた不連続の位置から完全に除去されるという短所を有する。
「結合相互作用」という用語は、本明細書において使用されるように、低分子とRNA分子またはRNAモチーフとの間の結合またはその他の安定化された会合をさすものとする。会合は、熱力学的に安定化されていてもよいし、または動力学的に安定化されていてもよいし、またはその両方であってもよく、相互作用は、共有結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、またはこれらおよび/もしくはその他の型の相互作用の組み合わせであり得る。
「薬物様化合物」という用語は、FDAによって承認された低分子薬物に典型的な特徴を有する低分子化合物をさす。例えば、化合物は、以下の特徴のうちの1つまたは複数を有し得るが、そのことが必要とされるわけではない。5個以下の水素結合ドナー、10個以下の水素結合アクセプター、500g/mol未満の分子量、および5以下のオクタノール水分配係数log P。もう1つの例として、化合物は、以下の特徴のうちの1つまたは複数を有し得るが、そのことが必要とされるわけではない。3個以下の水素結合ドナー、3個以下の水素結合アクセプター、300g/mol未満の分子量、および3以下のオクタノール水分配係数log P。もう1つの例として、化合物は、薬理学的に非適合性の部分を含まないものであり得る。薬物様化合物の他の例には、臨床的に承認された（例えば、FDAによって承認された）低分子薬物、およびそれらの誘導体である化合物が含まれる。全てのFDA承認薬物のリストは、参照によりその全体が組み入れられる、Drugs＠FDA（www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/daf/）またはFDA Orange Bookに見出され得る。
RIBOTECおよびINFORNAマイクロアレイ法
下記の本発明の式1、2、5、および20の化合物の態様は、マイクロアレイRIBOTAC低分子ライブラリスクリーニングプロトコルおよびInforna迅速同定プログラムによって開発された。Scripps Research News,May 22,2018"Novel RNA-Modifying Tool"Dr.Matthew Disney et al.を参照すること。RIBOTACプロトコルは、ゲルによってコーティングされた基質と、不連続の位置においてゲルに非共有結合的に接着した複数の化合物とを含むマイクロアレイを提供する。2018年6月19日に出願された米国仮特許出願第62/686834号に基づく2019年6月18日に出願されたPCT/US2019/037762（以後、PCT'762と呼ぶ）（これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる）も参照すること。PCT'762は、これらのプロトコルの完全な詳細を提供し、これらの方法を特許請求の範囲に記載しており、そのプロトコルおよび特許請求の範囲は、その全てが完全にここに繰り返されたかのごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
RIBOTECプロトコルおよびINFORNAプロトコルに起因する化合物リードの同定は、学術的、商業的、オープンソースの研究機関からの既存の低分子、および類似の複数の化合物ライブラリによって、マイクロアレイ調査を集積することによって開始され得る。これらには、FDA承認薬物、第I相臨床試験において使用された化合物、第II相臨床試験において使用された化合物、キナーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、mRNAスプライシングモジュレーター、RNAをモジュレートする活性を有することが予測されるか、もしくは既知である化合物、薬物様化合物、市販されている生物活性化合物、またはそれらの任意の組み合わせのライブラリが含まれ、化合物はそれらから修飾されていない。
マイクロアレイゲル
RIBOTACスクリーニングのために有用なマイクロアレイは、並べられる化合物が固定化化学を受けることを必要としない。従って、スクリーニングされる化合物は、化合物をマイクロアレイにカップリングするため、従って、固定化するため、従来必要とされていた官能化を含まなくてよい。一例として、マイクロアレイの化合物は、アジド部分、アルキン部分、シリルクロリド部分、マレイミド部分、チオール部分の一部または全部を含まなくてよい。同様に、化合物は、ゲルに不可逆的かつ共有結合的に結合する官能基を含まないことを条件として、多様な官能基を含んでいてよい。例えば、マイクロアレイは、アジドを含まなくてもよく、化合物の一部はアルキンを含んでいてよい。
最初に、化合物がゲルに組み込まれるよう、ゲルが部分的に乾燥しており少なくとも部分的に溶媒和されている時に、ゲルに付着させることによって、少なくとも2～1000またはそれ以上の範囲の全ての整数の複数の化合物を、ゲルに接着させることができる。次いで、非共有結合的に接着した化合物を有するゲルがもたらされるよう、ゲルを乾燥させることができる。化合物は、例えば、ゲル溶媒系の液体成分への吸収を介して、ゲルに接着し得る。化合物は、例えば、ゲルの表面への吸着を介して、ゲルに接着してもよい。化合物は、マイクロアレイ上の不連続の位置に化合物が留まるよう、最小の拡散を示すものであり得る。化合物は、マイクロゲルが洗浄またはインキュベートされた時に実質的に接着し続けるものであり得る。
マイクロアレイのゲルは、多糖、ポリアクリルアミド、アガロース、セパロース（separose）、寒天、ポリデキストラン、およびそれらの機能的誘導体を含み得る。様々な態様において、ゲルは、約0.5％～約5％(w/v)アガロースゲルであり得る。
ゲルは、任意の形状であってよく、特定の成形された構造もしくは肉眼的構成を必要とせず、またはそれらを含まなくてもよい。様々な態様において、化合物が結合パートナーと自由に相互作用することができるよう、付着した化合物が、少なくともある程度の拡散および/またはある程度の移動の自由を示すよう、マイクロアレイは、十分な溶媒または水分を保持していてよい。
基質は、事実上任意の適当な安定的な材料、例えば、ガラス、ポリカーボネート等から作られた剛体または半剛体であり得る。
ゲル上の不連続の位置は、付着した化合物が接着しているオーバーラップしない区域を表し得る。不連続の位置は、アレイ状に配置され得、各々少なくとも100μm離れていてよい。アレイは、格子またはその他の繰り返されたパターンであり得る。様々な態様において、マイクロアレイは、アガロースゲルによってコーティングされた基質を含み、複数の化合物が、不連続の位置において、アガロースゲルに非共有結合的に接着している。不連続の位置は、RNAモチーフと結合した後の化合物の容易な同定を可能にする。
化合物とRNAとの間の相互作用の同定
マイクロアレイおよびRIBOTECプロトコルは、RNAおよびRNAによって仲介される疾患が低分子化合物によってモジュレートされ得る程度の評価のための方法を可能にする。低分子化合物リードは、前記のように選択され得る。これらのリードを含むマイクロアレイゲルは、前記およびPCT'762に記載されたように構築され得る。所望のRNAに対する親和性を有するリードをアッセイするためのこれらの方法は、複製された（dubbed）二次元コンビナトリアルスクリーニング（2DCS）であるパラレルライブラリ対ライブラリスクリーニングアプローチにおいて記載されたRNAモチーフを使用して探索され得る。Childs-Disney et al.,ACS Chem.Biol.2,745-754(2007)；およびDisney et al.,J.Am.Chem.Soc.130,11185-11194(2008)を参照すること。
リード化合物と、プレmiR-21との共通性を有するRNAモチーフとの間の結合相互作用を同定するため、これらの方法が、本発明によって使用された。方法は、以下の工程を含む。
（1）複数の標識されたRNAおよび過剰のオリゴヌクレオチドを、本明細書に記載されるマイクロアレイに適用する。
（2）標識されたRNAと、接着した化合物との間の結合を誘導するため、マイクロアレイをインキュベートする。
（3）マイクロアレイを緩衝溶液で洗浄し、過剰の緩衝溶液を除去し、マイクロアレイを乾燥させる。
（4）接着した化合物に結合した、標識されたRNAを検出するため、マイクロアレイを画像化する。
（5）結合相互作用を同定するため、結合したRNAを特徴決定する。
結合する低分子を同定するための方法の実施についてのさらなる詳細は、前出のPCT出願に提供されている。様々な態様において、方法は、標識されたRNAおよび過剰のオリゴヌクレオチドをマイクロアレイに適用する前に、標識されたRNAおよび過剰のオリゴヌクレオチドを各々別々に折り畳む工程を含み得る。
RIBOTECプロトコルおよびINFORNAプロトコルによって同定されるRNAは、リード化合物と相互作用するRNAモチーフであり得る。RNAモチーフは、多くの個々のRNA配列の間で共通性を有するRNA配列の三次元形態である。これらの配列のRNA塩基は、完全に同一でなくてもよく、典型的には、実質的な類似性を有する。RNAモチーフライブラリは、対称ループ、塩基バルジループ、ヘアピンループ、ノットループ、マルチブランチループ、およびそれらの組み合わせを含むRNA分子内ループライブラリであり得る。メンバーは、（i）RNA分子内ループ内の塩基のアイデンティティ、および/または（ii）RNA分子内ループに隣接する塩基対（いわゆる、ループを閉鎖する塩基対）のアイデンティティに関して相互に異なっていてよい。適当なRNAモチーフライブラリは、DNA鋳型、例えば、Integrated DNA Technologies（Coralville,Iowa）から市販されているDNA鋳型から、従来の転写技術（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Milligan et al.,"Synthesis of Small RNAs Using T7 RNA Polymerase,"Methods Enzymol.,180:51-62(1989)に、例えば、記載されるような、T7 RNAポリメラーゼを利用するもの）によって調製され得る。
様々な態様において、前記のマイクロアレイに接着した複数の低分子化合物を、多様な方法によって、RNAライブラリまたはRNAモチーフライブラリと接触させることができる。例えば、RNAライブラリを、適当な溶媒、緩衝液、または緩衝液系に溶解または懸濁させ、接着した化合物を、適当なハイブリダイゼーション緩衝液によって予備平衡化することができる。次いで、例えば、アレイ表面全体に均一にRNAライブラリを分布させることによって、接着した化合物にRNAライブラリを適用することができ；核酸モチーフライブラリの1つまたは複数のメンバーが、接着した化合物に結合するために有効な時間および温度で、接着した化合物およびRNAライブラリを共にインキュベートすることができる。
結合したRNAを、以下の工程に従って特徴決定することができ、その詳細は、前出のPCT'762に提供されている。これらの工程は、結合したRNAを採集する工程；採集されたRNAに対して逆転写を実施する工程；PCR増幅を実施する工程；および増幅産物を配列決定する工程を含む。
前記のように同定されたRNAと結合した低分子化合物のアイデンティティは、典型的に、一般的に、マイクロアレイのゲル上の低分子化合物の不連続の位置によって決定される。あるいは、採集されたRNAを、結合した低分子化合物を含むよう操作してもよい。これらの2つの成分を分離し、低分子は、通常の化学分光技術によって、RNAは、前記の増幅および配列決定の技術によって、別々に同定することができる。付加的な工程は、複数の化合物を、1つまたは複数のチェイスオリゴヌクレオチド、例えば、ステムチェイスオリゴヌクレオチド、ヘアピンチェイスオリゴヌクレオチド、DNAチェイスオリゴヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせと共にインキュベートする工程を含み得る。チェイスオリゴヌクレオチドは、化合物がRNAモチーフ（即ち、RNAモチーフライブラリの可変性の領域）と相互作用し、メンバー間で変動しない核酸領域（例えば、不変ステム領域、不変ヘアピンループ領域等）とは相互作用しないことを確実にするため設計されたオリゴヌクレオチドを含み得る。そのようなステムチェイスオリゴヌクレオチドおよびヘアピンオリゴヌクレオチドの設計は、メンバー間で変動しない核酸領域において使用された配列に依存し得る。
これらの方法は、特定のRNAモチーフ、例えば、多くの種類および型のRNAの間で共通の特性を有するモチーフと相互作用する低分子化合物の同定を可能にする。多くの生物学的に重要な核酸分子の核酸配列が公知であり、特定の化合物が相互作用する特定のRNAモチーフを、どの生物学的に重要な核酸分子が有するかを容易に確認することが可能である。従って、生物学的に重要なRNAと結合するか、またはその他の方法で相互作用する低分子化合物を同定し、例えば、診断または治療のため、そのような生物学的に重要なRNAを標的にするために使用することができる。
前出のPCT'762に示されるように、本法を使用して得られた化合物-RNAモチーフ相互作用に関する情報を、データベースに集めることができる。次いで、特定のRNAモチーフを有するRNAとの結合の増加した可能性を有する1つまたは複数の化合物を、複数の候補化合物から選択する方法において、そのようなデータベースを使用することができる。
本法は、付加的な分析工程、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2016/0188791 A1号に記載されたように実施され得るinformおよび/またはStARTsをさらに含み得る。
様々な態様において、方法は、ヒトマイクロRNA（miRNA）前駆体に適用される、RNAを標的にする化合物を同定するためのinformaアプローチをさらに含み得る。inforna法は、それらの遺伝子のRNA産物を標的にする低分子を同定するための促進されたルートを提供する。inforna法は、薬物発見をスピードアップさせるのみならず、有用な活性を有する可能性がより高い薬物候補を、より正確に同定する。inforna法は、情報のデータセットを利用し、比較し、どのRNA構造二次構造が、どの低分子と結合する可能性が高いかのアウトプットを提供する。これらのデータセットには、（a）問い合わせられるRNA二次構造のデータセット；および（b）同定された（例えば、二次元コンビナトリアルスクリーニング（2DCS）によって同定された）RNAモチーフ-低分子相互作用のデータセットが含まれる。例えば、ヒトトランスクリプトームの全てのmiRNA前駆体の配列を、miRBase（Griffiths-Jones et al.,Nucleic Acids Res.36,D154-158(2008)）からダウンロードし、RNAstructure（Mathews et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,7287-7292(2004)）を介して二次構造を予測することができる。二次構造要素を各問い合わせRNAから抽出し、それらの二次構造を、二次元コンビナトリアルスクリーニング（2DCS）によって同定されたRNAモチーフ-低分子相互作用のデータベースと比較することができる。そのようなデータセットは、例えば、二次元コンビナトリアルスクリーニング（2DCS）過程における本発明のマイクロアレイの使用によって生成され得る。例えば、各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2008/0188377 A1号；Childs-Disney et al.,ACS Chem.Biol.2,745-754(2007)；Disney et al.,J.Am.Chem.Soc.130,11185-11194(2008)を参照すること。
問い合わせられるRNA二次構造のデータセットは、単独の1つまたは複数のRNA配列から生成され得る。例えば、RNA二次構造は、二本鎖領域ならびに一本鎖ループおよび二本鎖領域内のミスマッチ「バブル」が形成されるよう、折り畳まれる時に、RNAによって形成される最低自由エネルギー二次構造として同定され得る。そのような低自由エネルギー二次構造は、RNAstructure（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる、Mathews et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101,7287-7292(2004)）などのプログラムによって予測され得る。
低分子と結合する可能性が高いRNA配列および二次構造のアウトプットは、他の予測過程、ならびに化学的アッセイおよび生物学的アッセイ（例えば、結合アッセイ）によって、さらに分析され得る。例えば、StARTS統計法が、予測をさらに改良するために使用され得る。StARTS法は、選択されたRNAモチーフにおける小さい構造特徴（例えば、アデニンに隣接したグアニン）の存在率を、RNAライブラリ全体における存在率と比較することによって、RNAモチーフ-低分子相互作用の親和性および選択性を予測する。従って、StARTS法は、RNA分子の集団において、どのRNA二次構造およびモチーフが、最も独特または特殊であるかの同定を容易にする。StARTSは、infornaによって同定された低分子パートナーに対するRNA二次構造の結合親和性をさらに評価するため、infornaと対にすることができる統計アプローチである。StARTSは、結合に正に寄与するRNAモチーフおよび負に寄与するRNAモチーフの特徴を同定する（各々、参照によりその全体が組み入れられる、Velagapudi et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.49,3816-3818(2010)；Velagapudi et al.,J.Am.Chem.Soc.133,10111-10118(2011)；Paul et al.,Nucleic Acids Res.37(17):5894-5907(2009)を参照すること）。
StARTSアプローチにおいては、低分子に結合するものとして同定された1つまたは複数のRNA二次構造の配列をコンパイルし、RNA二次構造における各配列特徴の存在率を、RNAモチーフのより大きい集団におけるその特徴の存在率と比較することができる。配列特徴は、RNA配列のより大きい集団に存在する配列特徴と異なっていてもよいし、または異なっていなくてもよい、任意の短いRNA配列（例えば、5'GCステップ）である。しかしながら、配列特徴は、低分子に結合するRNA二次構造の集団に存在する配列である。これらの2つの集団を比較することによって、低分子との結合のためのRNA二次構造内の特異的特徴の相対濃縮を算出することができる。従って、StARTS法は、どの配列特徴が、RNA配列のより大きい集団より、RNA配列の選択された集団において、優勢であるかを同定する。
より特殊な配列特徴には、統計的有意性またはZスコアおよび対応する両側p値が割り当てられる。Zスコアは、どの特徴が、95％より大きい信頼度で、選択されたRNA二次構造に存在するかを決定する、RNA Privileged Space Predictor（RNA-PSP）プログラムを使用した統計分析によって決定され得る（Paul et al.,Nucleic Acids Res.37(17):5894-5907(2009)を参照すること）。信頼区間はZスコアに関連し、より大きい値が、より高い信頼水準に対応する。各RNA二次構造は、RNAモチーフのより大きい集団との違いに寄与する複数の特徴を有していてよく、RNA二次構造内の全ての特徴についてのZスコアの合計（ΣZ）を、RNAモチーフの全ての構造的特殊性の指標として算出することができる。
StARTS分析を遂行するため、次いで、化合物に対するRNA二次構造の測定された結合親和性に対して、Zスコアをプロットすることができ、この関係を、RNAライブラリメンバーに対する化合物の親和性の予測を可能にする逆一次（inverse first-order）方程式に適合させることができる。
RNAに強く結合した、キナーゼ阻害剤、プレmRNAスプライシングモジュレーター、およびトポイソメラーゼ阻害剤を含む様々な薬物クラスのライブラリと共に、これらの方法を使用した。リード分子が同定された。分子の間の構造活性関係およびRNAモチーフとの結合の指標が同定された。これらのリードおよびSAR情報に基づき、付加的な低分子化合物を同定し、かつ/または合成した。RIBOTECプロトコルおよびInfornaプロトコルに基づくマイクロアレイアッセイを、付加的な化合物について実施し、プレmiR-21 RNAとの有意な結合相互作用を有するものとして、式1の化合物の態様を同定した。
化合物
構造化されたRNAを標的にする低分子の開発のためのInfornaスクリーニングおよび分子設計プログラム（ACS Chemical Biology（前記引用））は、20μMのKdで選択的に標的プレmiR-21 RNAダイサー部位と結合し、miR-21を与えるインビトロダイサープロセシングを阻害する、前記の式1の化合物の態様を提供した。式1のRNA結合特性についての実験的詳細は、下記の実施例セクションにおいて提供される。式1の化合物の態様は、水素、アルキル、またはアシル基としてのR16と結合したアミノ末端を有する前駆体式1-Pに由来する。前駆体式1-Pは、水素としてのR15を有するか、またはさらなる修飾のための官能基としてのR15を有するフェノキシ末端（ヒドロキシル基）も有する。官能基としてのR15の調製は、保護されたカルボキシル基を有するω-ヨードアルカン（alkanoic）化合物などの修飾化合物を通して達成され得る。そのようなアルカン化合物と、水素としてのR15、即ち、フェノキシ基を有する式1-Pとのカップリングは、式1-PのR15としてのPr-OOC-(CH2)r-（式中、Prはカルボキシ保護基であり、rは2～6の整数である）などの保護されたアシルアルキル基を提供する。カルボキシ保護基は、ジアミンまたはアジドアルキルアミンと結合して、基R9C(=O)-(CH2)rとしてのR15、および水素またはメチルとしてのR16を有する式1-Pを提供することができる。この化合物は、式1である。
Figure 2023500893000006
化合物式1をアビディティについて最適化するため、ヒトトランスクリプトームの全てのmiR前駆体のRNA折り畳みを、プレmiR-21と比較した。実施例セクション、項目S4～S6を参照すること。いくつかのmiR前駆体は、プレmiR-21のAバルジモチーフを示すが、他の標的は、それ、およびプレmiR-21の隣接Uバルジを含有しなかった。実施例セクション、項目S4、S5を参照すること。しかしながら、化合物式1は、両方の部位に結合し、単一化合物において両方の部位を標的にするための式1の二量体の組み立ては、式2の化合物を与えた。
Figure 2023500893000007
指定子r、s、R8、およびリガンド基Lは、概要において提供されたのと同一である。式2の化合物は、プレmiR-21に選択的に結合し、式1の化合物より20倍増強されている。実施例セクション、項目S1を参照すること。
アジドアルキルアミノ基としてのR9およびメチルとしてのR8を有する式1の化合物の態様の二量体化は、ポリアミノ酸リガンドL、例えば、3～8グリシン残基のポリグリシン誘導体によって達成され得る。ポリアミノ酸リガンドLは、式
Figure 2023500893000008
（式中、指定子tは1～4の整数である）のアルキニル基による窒素の置換によって、その末端グリシン部分の窒素において修飾されていてよい。グリシンに基づくポリアミノ酸誘導体リガンドLによる二量体化は、式2の化合物の態様を与えた。
ポリアミノ酸リガンドL、例えば、適切なアルキニル基を含むポリグリシンリガンドによる二量体化を達成するため、アミン末端およびカルボキシル末端を、アミド基として保護するか、または修飾することができる。前記の式1のアジド基の、そのようなリガンドLのアルキニル基への、銅によって触媒される付加は、式2の二量体のトリアゾール部分の接続を生じるであろう（ヒュスゲン環化付加）。リガンドのグリシン基の数に依って、プレmiR-21のRNAモデルとの結合強度は、中程度から強度まで変動し得る。これらの結果は、以下の実施例セクションにおいて提供される。
好ましくは、式2のポリグリシン誘導体Lの前駆体の態様は、Xが水素、ヒドロキシル、またはアミノであり、Yが酸素または-NH-であり、指定子nが1～4の整数であり、指定子oがゼロまたは1であり、指定子pが1～6の整数であり、R10が1～4炭素のアルキルであり、R11が水素またはアセチルであるリガンド前駆体式20である。式20のこの図示において、数字および文字、2、n、o、10、p、および11は、前記の概要の式20の添字と同一と見なされる。
Figure 2023500893000009
式20は、式1のアジド型と結合（ヒュスゲン環化付加）して前記の式2を提供することができる。式2について、リガンドLは、式L-1（式中、Nr、EG、Y、My、R10、およびR11は、前記の概要に与えられたのと同一である）である。基Nr-((EG)m-(CH2)n)o-は、Nr基を保持しているポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、およびアルキレニルジオールまたはアミノアルキレニルアルコールと結合しているその反対の末端との前縮合（precondensation）または後縮合（postcondensation）により、YがOHまたはNH2でありoがゼロである式20に付加され得る。その結果は、ヒドロキシルまたはアミノとしてのX、およびゼロ以外としての指定子oに、Nr-(EG)mを置換する。
Figure 2023500893000010
Nrが式C-1であり、その他の指定子および置換基の適切な選択がなされた時の結果は、式5である。式5は、式2の好ましいバージョンであり、プレmiR-21との有意な結合強度を提供する。
生物学
式1および2の化合物の態様の、プレmiR-21のインビトロ形態との結合能の調査に加えて、ホールセルアッセイによって、これらの化合物の阻害能も調査した。三種陰性乳癌細胞（MDA-MB-231）を、式1（メチルとしてのR8およびアジドプロピルアミノとしてのR9を有する態様、10μM）によって処理したところ、ダイサープロセシングを阻害することによって作用する化合物について予想されるように、miR-21産生は50％阻害され、プレmiR-21のレベルは1.3倍増加した。実施例セクション、項目S3を参照すること。miRプロファイリングは、式1のこの態様が、中程度に選択的であることを示した（実施例セクション、項目1dを参照すること）。
インビトロおよびMDA-MB-231細胞におけるプレmiR-21に関する化合物式2の生物学的アッセイは、式2の化合物が、1μMのIC50で、細胞におけるプレmiR-21に影響を与えることを証明した。プレmiR-21のレベルの増加は、作用モードとしてのバイオジェネシスの阻害を支持した（図1c）。全miRプロファイリングは、設計戦略に基づき予想された通り、式2がmiR-21にのみ有意に影響を与えることを示した（図1d）。
化合物を細胞標的と架橋するため、近接に基づく反応を利用する戦略である、化学的架橋およびプルダウンによる単離（Cemical Cross-Linking and Isolation by Pulldown）（Chem-CLIP）を使用することによって、式2の化合物の、プレmiR-21との結合を確認した。活性Chem-CLIPプローブおよびRNA結合モジュールを含まない不活性Chem-CLIP対照プローブの両方によって、細胞を処理した（実施例セクション、項目S7を参照すること）。活性化合物は、10μMで、およそ2.5倍、プレmiR-21のレベルを選択的に濃縮した（項目S7）。その後、MDA-MB-231細胞におけるプレmiR-21に対する式1および2の相対的な占有率を査定するため、競合的Chem-CLIP（C-Chem-CLIP）を使用した。化合物式2は、細胞におけるプレmiR-21の占有において、式1より20倍強力であり、その予測された差は、類似の細胞透過性を有する化合物による反応親和性に基づいていた（実施例セクション、項目S7）。式2をブレオマイシンRNA切断モジュールとコンジュゲートすることによって、式2のプレmiR-21との細胞結合部位をマッピングしたところ、予想通り、切断部位は、設計された結合部位の近位にあることが示された（実施例、項目S8～S10）
式2の化合物の、プログラム細胞死またはPCDをエンゲージする能力も調査した。miR-21によって翻訳的に抑制されるタンパク質には、プログラム細胞死タンパク質4（PDCD4）およびホスファターゼテンシンホモログ（phosphatase and tensin homolog）（PTEN）が含まれる。式2の化合物によるMDA-MB-231細胞の処理は、それぞれ、1μMおよび10μMで、PDCD4およびPTENのレベルを、およそ50％増加させた（実施例、項目S11）。miR-21阻害は、MDA-MB-231細胞の浸潤および転移の特性に影響を与えるため、表現型モジュレーションを評価するために浸潤アッセイを使用した。式2の化合物による処理は、MDA-MB-231の浸潤特性を阻害し（実施例、項目12）、従って、転移の処置が示された。いくつかの他の癌細胞モデル型においても、式2の化合物の生物学的効果を研究したところ、全てのケースにおいて、式2の化合物は、miR-21をサイレンシングし、miR-21関連浸潤表現型をモジュレートした（実施例、項目S3、S12）。
プレmiR-21のウクレアーゼ（UCLEASE）分解
天然に、2'-5'-結合オリゴアデニル酸（2'-5'A）は、RNase Lを二量体化し、活性化する。M.G.Costales,Y.Matsumoto,S.P.Velagapudi,M.D.Disney,Small molecule targeted recruitment of a nuclease to RNA.J.Am.Chem.Soc.140,6741-6744(2018)を参照すること。オリゴアデニル酸に加えて、いくつかのモデルのスチレニルチオフェニル複素環およびチオフェニルピリミジニル複素環が、この過程を中程度に活性化する2'-5'Aの代用物として同定された（C.S.Thakur,B.K.Jha,B.Dong,J.Das Gupta,K.M.Silverman,H.Mao,H.Sawai,A.O.Nakamura,A.K.Banerjee,A.Gudkov,R.H.Silverman,Small-moledule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104,9585-9590(2007)を参照すること）。
この情報に基づき、適切に活性化する複素環モデルを作製するため、モデル複素環の研究および構造改良を行った。結果は、R3がヒドロキシルであり、R4がメトキシであり、R5が水素である式C1のスチレニルチオフェニル化合物であった。このスチレニルチオフェニル化合物は、不活性単量体RNase Lと結合し、それを活性ヌクレアーゼへと二量体化することが見出された。R3がメトキシであり、R4がヒドロキシルであり、R5が水素である式C1は、RNase Lの適切な活性化を提供せず、R3がヒドロキシルであり、R4およびR5の両方が水素である式C1は、RNase Lの最小の活性化のみを提供することも見出された。研究されたモデルは、R1が1～3炭素のアルキルであり、R2が水素またはフルオロであり、R3が水素、ヒドロキシル、またはメトキシであり、R4が水素、ヒドロキシ、メトキシ、またはジメチルアミノであり、R5が水素、ヒドロキシ、またはメトキシである式C1を含んでいた。
Figure 2023500893000011
R3がヒドロキシルであり、R4がメトキシであり、R5が水素である式C-1のスチレニルチオフェニル化合物を、R4位において、式1および2の化合物とコンジュゲートした。コンジュゲーションは、式1および2の化合物の効力を改善した。コンジュゲーションは、コンジュゲートが、プレmiR-21の酵素的切断を誘導するため、RNase Lをリクルートすることを可能にする。式2の化合物とのコンジュゲーションは、Nuが式C1である式2を提供し、このコンジュゲーションの態様は、概要に示された式5の化合物である（実施例、項目2、3a、13、S14）。
Figure 2023500893000012
さらに、R3がメトキシであり、R4がヒドロキシルであり、R5が水素である式C-1の化学的置換により、RNase Lをリクルートする活性のない化合物（式4）が同定された（図2）。2におけるmiR-21結合モジュールを含まない活性RNase Lリクルーターである対照化合物式6、および2が不活性リクルーター4に追加されたものである化合物7も、合成し、研究した。実施例セクションおよび図2を参照すること。
式5のMDA-MB-231細胞への適用は、miR-21レベルに影響を与えるための、親2より20倍増強された活性（IC50およそ0.05μM）を示した（図3b）。対照化合物式7は、式2より増強された活性を有しておらず、式6は不活性であった（図3b、3c）。プレmiR-21のレベルは、切断化合物について予想される通り、式5によって減少した。式5がRNase Lリクルートメントを介してプレmiR-21を直接切断することをさらに支持するため、（i）RNase LのsiRNAによる除去が、式5のプレmiR-21を切断する能力を減少させること（図3c）；（ii）一定量の式5と共に、増加する量の式2を細胞に添加することによって、両者がプレmiR-21の同一部位に結合するため、プレmiR-21の切断が競合によって減少すること（図3d）；および（iii）式5によって処理された細胞に由来するRNase Lの共免疫沈降が、濃縮された画分におけるプレmiR-21のレベルの増加を与えること（図3e）が証明された。
式5によるさらなる研究は、1モルの式5が26モルのプレmiR-21を切断するため、式5は、MDA-MB-231細胞において、プレmiR-21を準化学量論的に切断することを示した（SI付録、表S1）。この値は、2と比べた5の効力の増強と一致する。それぞれ、48時間および96時間にわたり、式2（1000nM）および式5（50nM）の単一用量によって、有意に減少したmiR-21レベルも観察され、そのことから、切断化合物式5のより強力で長期持続性の効果が示唆された（実施例、項目S15）。
RNase Lによって仲介される酵素的切断と、ブレオマイシンによって仲介される非酵素的切断との違いを査定するため、式5、および2のブレオマイシンコンジュゲートの効果を、MDA-MB-231細胞において試験した。酵素的切断の方が10倍強力であった（実施例、項目S15）。さらに、式5による切断は、様々な癌細胞株において、miR-21レベルを有意に阻害し、そのことから、その広い適用可能性が示唆された（実施例、項目S15）。ヌクレアーゼリクルートメントが一般的に適用可能であり得ることを支持するため、プレmiR-210を切断するため、RNase Lをリクルートするための化合物を設計した。結果は、予想通り、標的特異的な切断を示した（実施例、項目S16）。全般的なRNase L活性化は、抗ウイルス応答および自然免疫応答を誘発することが公知であるため16、自然免疫バイオマーカーのモジュレーションを測定するため、RT-qPCRおよびELISAを使用した。有意な変化は観察されず、そのことから、5が、自然抗ウイルス免疫応答の一般的な刺激によって機能するのではなく、RNase Lの局所的な標的特異的なリクルートメントによって機能することが証明された（実施例、項目S17）。
選択性を定量化するため、ジニ（Gini）係数（GC）を計算するため、細胞miR阻害プロファイルを使用した。GCは、選択性を単一の値にスコア化することを可能にし；0のGCは非選択的な化合物を示し、完全な選択性は1.0のGCを有する。P.P.Graczyk,Gini coefficient:a new way to express selectivity of kinase inhibitors against a family of kinases.J.Med.Chem.50,5773-5779(2007)を参照すること。参考のため、高い選択性を有する（例えば、試験されたキナーゼ85種中1種を阻害する）プロテインキナーゼ阻害剤のGCは、0.65～0.91の範囲のスコアを有する。式1および2の化合物は、それぞれ、良好な選択性を示す、0.52および0.68のGCを有する（実施例、項目S6）。重要なことに、ヌクレアーゼリクルーター式5によって、選択性の増加が観察された（0.84のGC）（図3f、実施例、項目S6）。さらに、化合物式5は、トランスクリプトームの多様な集団に及ぶ大量に存在する転写物のパネルに対して有意な効果を示さず、そのことから、その広い選択性がさらに証明された（実施例、項目S18）。従って、ヌクレアーゼリクルートメントは、結合剤と比較した時、効力および選択性を減少させず、むしろ増強し、RNAを標的にするために設計された化合物は、タンパク質を標的にするものと同等に選択的であり得る。
miR-21は、MDA-MB-231における浸潤表現型を刺激するため、浸潤に対する式5の効果を測定した。実際、式5は、浸潤を効果的に阻害した（実施例、項目S19）。表現型におけるこの効果が、プレmiR-21を標的にすることによるものであることを示すため、プレmiR-21を一過性過剰発現させたところ、式5の阻害効果は除去された。さらに、式5は、メラノーマ細胞株および肺癌細胞株においても広範囲に浸潤性を減少させた（実施例、項目S19）。式5がプレmiR-21の阻害によって表現型に影響を与えることをバリデートするためのさらなる実験には、プレmiR-21を認識し得る程度に発現しない健常乳房の細胞モデル、MCF-10aに対する効果の試験が含まれ、それは、浸潤に対する効果を有していなかった。MCF-10aへのプレmiR-21の一過性トランスフェクションは、その細胞株を浸潤性にし、これらの条件での、式5のMCF-10aへの適用は、浸潤を阻害した（実施例、項目S19）。
MBA-MB-231細胞のプロテオームに対する式5の効果を研究した。4181種中47種のタンパク質のみが、有意に影響を受けた（実施例、項目データS1）。2種の最も増強されたタンパク質は、miR-21の直接標的であるPDCD4、ならびに細胞増殖の減少およびゲノム完全性の保護に関与しているコヒーシンサブユニットSA-1、STAG1であった（図3g、実施例、項目S20、表S2）。有意にモジュレートされたタンパク質の経路分析は、式5が、細胞の分裂および増殖ならびに細胞周期の制御に関与する経路に影響を与えることを見出した。全般的に、ゲノム安定性に関与するタンパク質がアップレギュレートされ、癌遺伝子がダウンレギュレートされた。重要なことに、miR-21の予測された下流タンパク質標的(TargetScanHuman v7.2,V.Agarwal,G.W.Bell,J.-W.Nam,D.P.Bartel,Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.eLife 4,e05005(2015)）の対数倍率変化（log fold-change）中央値は、式5による処理後に、全タンパク質と比べて有意にアップレギュレートされた（実施例、項目S21）。対照的に、同様に発現されるmiR-let-7-5pの下流タンパク質標的においては、有意なシフトが観察されなかった（実施例、項目S21）。従って、プロテオームに対する効果は、選択的であり、miR-21枯渇によって予想されるものと一致する。
MDA-MB-231細胞のマウスへの静脈内送達は、乳癌転移のモデルであり、転移挙動は、miR-21の阻害によって影響を受け得る（S.Yang,J.J.Zhang,X.-Y.Huang,Mouse models for tumor metastasis.Methods Mol.Biol.928,221-228(2012)）。腹腔内注射を介した式5の送達（10mg/kg、q.o.d.）は、マウスにおいて、耐容性が良く、低ナノモル濃度で維持された（実施例、項目S22）。化合物処理は、肺小結節の減少によって証拠付けられるように、肺への乳癌転移を阻害した（図4a、実施例、項目S23）。肺の組織学的研究は、式5がヘマトキシリンエオシン（HE）染色を減少させることを示した（図4b）。式5の作用モードをさらにバリデートするため、予想通り、miR-21およびプレmiR-21のレベルが減少し、スクランブル対照によっては効果が観察されなかった（図4c、4d、実施例、項目S22）。免疫組織化学は、式5が、PDCD4タンパク質発現の増加を刺激することを示した（図4e）。従って、前臨床動物モデルにおいて、式5は、miR-21によって仲介される経路をモジュレートする。
作用機序および医学的処置
ある種の態様において、本発明は、プレmiR-21を阻害する方法に関する。本明細書に開示された方法において使用するための、本発明の式1、2、および5の化合物は、プレmiR-21の活性部位に結合する。ある種のそのような態様において、結合は、可逆的または不可逆的であり得る。
本発明の化合物およびそれらの薬学的組成物は、プレmiR-21の「阻害剤」として作用することができ、即ち、プレmiR-21の発現を阻止するか、または低下させることができ、例えば、プレmiR-21の様々な活性を阻害することができる。阻害剤は、競合的、不競合的、または非競合的な阻害によって作用することができる。阻害剤は、可逆的または不可逆的に結合することができ、従って、その用語には、構造化されたRNAのヌクレアーゼ分解を引き起こすことができる化合物、または機能を防止するための、構造化されたRNAの何らかのコンフォメーション変化を引き起こすことができる化合物が含まれる。
本発明の化合物およびそれらの薬学的組成物は、障害または状態を防止し、緩和させ、修飾し、かつ/または影響を与えることができるため、治療剤として機能する。それは、統計的な標本において、未処置の対照標本と比べて、処置された標本において、障害もしくは状態の発生を低下させるか、または未処置の対照標本と比べて、障害もしくは状態の1つもしくは複数の症状の発症を遅延させるか、もしくはその重症度を低下させる化合物をさす。
ある状態、例えば、局所的再発（例えば、疼痛）、疾患、例えば、癌、シンドロームコンプレックス（syndrome complex）、例えば、心不全、またはその他の任意の医学的状態を防止し、緩和させ、修飾し、かつ/または影響を与える能力は、当技術分野においてよく理解されており、組成物を受容していない対象と比べて、対象における医学的状態の症状の頻度を低下させるか、または発症を遅延させる組成物の投与を含む。従って、癌の防止には、例えば、統計的かつ/または臨床的に有意な量の、例えば、未処置の対照集団と比べた、処置された集団における、検出可能な癌性成長物の集団の数の低下、および/または検出可能な癌性成長物の出現の遅延が含まれる。感染の防止には、例えば、未処置の対照集団と比べた、処置された集団における、感染の診断の数の低下、および/または未処置の対照集団と比べた、処置された集団における、感染の症状の発症の遅延が含まれる。疼痛の防止には、例えば、未処置の対照集団と比べた、処置された集団における、対象が経験する疼痛感覚の大きさの低下、あるいは遅延が含まれる。
本発明の化合物およびそれらの薬学的組成物は、予防的かつ/または治療的に機能することができ、本発明の組成物のうちの1つまたは複数の、宿主への投与を含む。望まれない状態（例えば、宿主動物の疾患またはその他の望まれない状態）の臨床的顕在化の前に投与される場合、その処置は、予防的であり（即ち、望まれない状態を発症しないよう宿主を保護する）、望まれない状態の臨床的顕在化の後に投与される場合、その処置は、治療的である（即ち、存在する望まれない状態またはその副作用を減少させるか、緩和させるか、または安定化することが意図される）。
本発明の化合物およびそれらの薬学的組成物は、予防的かつ/または治療的な処置が可能である。化合物または薬学的組成物が、望まれない状態（例えば、宿主動物の疾患またはその他の望まれない状態）の臨床的顕在化の前に投与される場合、その処置は、予防的であり（即ち、望まれない状態を発症しないよう宿主を保護する）、望まれない状態の臨床的顕在化の後に投与される場合、その処置は、治療的である（即ち、存在する望まれない状態またはその副作用を減少させるか、緩和させるか、または安定化することが意図される）。本明細書において使用されるように、「処置すること」または「処置」という用語には、対象の状態が改善されるか、または安定化されるよう、状態の症状、臨床的徴候、および基礎病理を逆転させるか、低下させるか、または抑止することが含まれる。
本発明の化合物およびそれらの薬学的組成物は、本発明の処置の方法に関して、「治療的に有効な量」で投与され得る。治療的に有効な量とは、所望の投薬計画の一部として（哺乳動物、好ましくは、ヒトへ）投与された時に、例えば、医学的処置に適用可能な合理的な利益/リスク比で、処置される障害もしくは状態、または美容的目的についての臨床的に許容される基準に従って、症状を軽減するか、状態を緩和させるか、または疾患状態の発症を遅延させる、薬学的組成物中の化合物の量である。
投与
本明細書に記載されたように調製された本発明の化合物およびそれらの薬学的組成物は、当技術分野において周知であるように、処置される障害、ならびに患者の年齢、状態、および体重に依って、様々な形態で投与され得る。一貫しており、医療に関する当局および医薬品に関する政府の規制当局によって推奨され、要求されるように、投与は、最終的には、主治医の指導および処方の下で提供され、主治医の見識、経験、および知識が、患者の処置をコントロールする。
例えば、化合物は、経口投与される場合、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、もしくはシロップ剤として製剤化され得；または非経口投与のため、注射剤（静脈内、筋肉内、もしくは皮下）、点滴調製物、もしくは坐剤として製剤化され得る。眼粘膜ルートまたはその他の類似の経粘膜ルートによる適用のため、それらは、滴剤または軟膏剤として製剤化されてもよい。
経口投与または経粘膜ルートによる投与のためのこれらの製剤は、従来の手段によって調製され得、所望により、活性成分は、任意の従来の添加剤または賦形剤、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、コーティング剤、シクロデキストリン、および/または緩衝剤と混合され得る。投薬量は、患者の症状、年齢、および体重、患者の性別、処置または防止される障害の性質および重症度、投与ルート、ならびに薬物の形態に依って変動するが、一般的に、0.0001～2000mg、好ましくは0.001～1000mg、より好ましくは0.001～500mg、具体的に、より好ましくは0.001～250mg、最も好ましくは0.001～150mgの化合物という1日投薬量が、成人患者のために推奨され、これは、単回投与されてもよいし、または分割投与されてもよい。あるいは、1日用量は、体重に依って、例えば、1ナノグラム/kg（ng/kg）～200mg/kg、好ましくは10ng/kg～100mg/kg、より好ましくは10ng/kg～10mg/kg、最も好ましくは10ng/kg～1mg/kgで投与されてもよい。単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、一般的に、治療効果を生じる化合物の量である。
所定の患者において、処置の効力に関して、最も有効な結果を与える組成物の投与の正確な時間および/または量は、特定の化合物の活性、薬物動態、および生物学的利用率、患者の生理学的状態（例えば、年齢、性別、疾患の型および病期、全身的な身体状態、所定の投薬量に対する応答性、ならびに薬物療法の型）、投与ルート等に依る。しかしながら、前記の指針は、対象のモニタリングならびに投薬量および/またはタイミングの調整からなるルーチンの実験法のみを必要とする、処置の微調整、例えば、投与の最適な時間および/または量の決定のための基礎として使用され得る。
「薬学的に許容される」という語句は、正当な医学的判断の範囲内で、過剰の毒性、刺激性、アレルギー応答、またはその他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するために適当であり、合理的な利益/リスク比に相応する、賦形剤、材料、組成物、および/または剤形をさすため、本明細書において利用される。
式1、2、および5の化合物が組み込まれた薬学的組成物
本発明の薬学的組成物には、本発明の式1、2、および5の化合物の態様と、薬学的に許容される担体とが組み込まれる。本発明の組成物およびそれらの薬学的組成物は、投薬単位製剤として、経口投与されてもよいし、局所投与されてもよいし、非経口投与されてもよいし、吸入もしくはスプレーによって投与されてもよいし、または直腸内投与されてもよい。非経口という用語は、以下に詳細に説明される。薬学的担体の性質、ならびに式1、2、および5の化合物の用量は、選択された投与ルート、そのようなルートのために有効な用量、ならびに主治医の見識および経験に依る。
「薬学的に許容される担体」とは、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または被包材料である。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者にとって傷害性でないという意味で、「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる:（1）糖、例えば、ラクトース、ブドウ糖、およびショ糖；（2）デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、および置換された、または置換されていない(3-シクロデキストリン；（3）セルロース、ならびにその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；（4）トラガント末；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）タルク；（8）賦形剤、例えば、カカオ脂および坐剤用ロウ；（9）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油；（10）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（11）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；（12）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（15）アルギン酸；（16）発熱物質不含水；（17）等張生理食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）リン酸緩衝溶液；ならびに（21）薬学的製剤において利用されるその他の無毒の適合性の物質。
湿潤剤、乳化剤、ならびに滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのみならず、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、および抗酸化剤も、組成物中に存在し得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、以下のものが含まれる：（1）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（2）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、αトコフェロール等；および（3）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等。
経口投与のために適当な製剤は、各々、予定された量の本発明の化合物を活性成分として含有する、カプセル剤、カシェ剤（cachets）、丸剤、錠剤、（風味剤を含む基剤、一般的には、ショ糖およびアラビアゴムもしくはトラガントを使用した）ロゼンジ剤、散剤、顆粒剤、または水性もしくは非水性の液体による溶液もしくは懸濁液、または水中油型もしくは油中水型の液体乳濁液、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤、または（不活性マトリックス、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、もしくはショ糖およびアラビアゴムを使用した）トローチ剤（pastilles）、ならびに/または含嗽剤等の形態であり得る。組成物は、ボーラス剤、舐剤、またはペースト剤として投与されてもよい。
経口投与のための固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤等）において、本発明の化合物は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸水素カルシウム、および/または以下のもののうちの任意のものと混合される：
（1）増量剤またはエキステンダー（extenders）、例えば、デンプン、シクロデキストリン、ラクトース、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、および/またはケイ酸；
（2）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、および/またはアラビアゴム；
（3）保水剤、例えば、グリセロール；
（4）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸、および炭酸ナトリウム；
（5）溶解遅延（solution retarding）剤、例えば、パラフィン；
（6）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物；
（7）湿潤剤、例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；
（8）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土；
（9）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物；ならびに
（10）着色剤。カプセル剤、錠剤、および丸剤のケースにおいて、薬学的組成物は、緩衝剤も含み得る。類似の型の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用した軟充填ゼラチンカプセル剤および硬充填ゼラチンカプセル剤において、増量剤としても利用され得る。
錠剤は、任意で、1つまたは複数の補助成分によって、圧縮または成形によって作られ得る。圧縮錠は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を使用して調製され得る。成形錠は、不活性液体希釈剤によって湿らされた粉末状の阻害剤の混合物を、適当な機器において成形することによって作られ得る。
錠剤、およびその他の固体剤形、例えば、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤は、任意で、割線を付されてもよいし、またはコーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティングおよび薬学的製剤化の分野において周知のその他のコーティングを含んで調製されてもよい。それらは、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための変動する割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、リポソーム、および/またはマイクロスフェアを使用して、その中の活性成分の徐放または放出制御を提供するため、製剤化されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターでの濾過によって、または使用直前に滅菌水もしくはその他の無菌の注射可能媒体に溶解させられ得る、無菌の固体組成物の形態に、滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。これらの組成物は、任意で、乳白剤を含有してもよく、唯一、または優先的に、胃腸菅の特定の部分において、任意で、遅延性の様式で、活性成分を放出する組成物であってもよい。
使用され得る包埋（embedding）組成物の例には、ポリマー性物質およびロウが含まれる。本発明の化合物は、適宜、前記の賦形剤のうちの1つまたは複数を含む、マイクロカプセル形態であってもよい。
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容される乳濁液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野において一般的に使用されている不活性希釈剤、例えば、水またはその他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有し得る。
不活性希釈剤の他に、経口組成物は、佐剤、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、風味剤、着色剤、芳香剤、ならびに保存剤も含み得る。
懸濁液は、活性阻害剤に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシル化（ethoxylated）イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（aluminum metahydroxide）、ベントナイト、寒天、およびトラガント、ならびにそれらの混合物も含有し得る。
直腸内投与または膣内投与のための製剤は、室温では固体であるが、体温では液体であり、従って、直腸または膣の腔内で融解し、活性薬剤を放出する、例えば、カカオ脂、ポリエチレングリコール、坐剤用ロウ、またはサリチル酸を含む1つまたは複数の適当な非刺激性の賦形剤または担体と、1つまたは複数の阻害剤を混合することによって調製され得る坐剤として提示され得る。
膣内投与のために適当な製剤には、当技術分野において適切であることが公知であるような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、またはスプレー製剤も含まれる。
阻害剤の局所投与または経皮投与のための剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液、貼付剤、および吸入剤が含まれる。活性成分は、薬学的に許容される担体、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と、無菌条件で混合され得る。
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、およびゲル剤は、本発明の化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物性および植物性の脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含有し得る。
散剤およびスプレー剤は、本発明の化合物に加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレー剤は、さらに、習慣的な噴射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素、ならびに揮発性の非置換型炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパンを含有し得る。
本発明の化合物は、あるいは、エアロゾルによって投与されてもよい。これは、組成物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物、または固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液が使用され得る。超音波式ネブライザーは、化合物の分解をもたらし得る剪断に薬剤が曝されるのを最小化するため、好ましい。
通常、水性エアロゾルは、従来の薬学的に許容される担体および安定剤と共に、本発明の化合物の水性の溶液または懸濁液を製剤化することによって作られる。担体および安定剤は、特定の組成物の必要性によって変動するが、典型的には、非イオン性界面活性剤（ツイーン、プルロニック、ソルビタンエステル、レシチン、クレモフォール）、薬学的に許容される共溶媒、例えば、ポリエチレングリコール、無害なタンパク質、例えば、血清アルブミン、オレイン酸、アミノ酸、例えば、グリシン、緩衝剤、塩、糖、または糖アルコールを含む。エアロゾルは、一般的に、等張溶液から調製される。
経皮貼付剤は、本発明の化合物の身体への調節された送達を提供するという付加的な利点を有する。そのような剤形は、薬剤を適切な媒体に溶解させるか、または分散させることによって作られ得る。皮膚を介した阻害剤の流動を増加させるため、吸収増強剤が使用されてもよい。そのような流動の速度は、速度調節膜を提供することによって、または阻害剤をポリマーマトリックスもしくはゲルに分散させることによって調節され得る。
非経口投与のために適当な本発明の薬学的組成物は、1つもしくは複数の薬学的に許容される無菌の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくは乳濁液と組み合わせられた1つもしくは複数の本発明の化合物、または意図された受容者の血液と等張にするための薬剤もしくは懸濁化剤もしくは増粘（thickening）剤を含む、無菌の注射可能な溶液もしくは分散液によって、直前に再構成され得る、無菌の散剤を含む。本発明の薬学的組成物において利用され得る適当な水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適当な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。適切な液動性は、例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用によって、分散液のケースにおいては、必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。
これらの組成物は、佐剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤も含有し得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含めることによって確実にされ得る。浸透圧調整剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な薬学的形態の吸収の長期化は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、もたらされ得る。
いくつかのケースにおいて、本発明の化合物の効果を長期化するため、皮下注射または筋肉内注射からの化合物の吸収を遅延させることが望ましい。例えば、非経口投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油性ビヒクルに溶解させるか、または懸濁させることによって達成され得る。
注射可能なデポー形態は、生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド-ポリグリコリドにおいて、阻害剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作られる。薬物とポリマーとの比、および利用される特定のポリマーの性質に依って、薬物放出の速度は調節され得る。その他の生分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が含まれる。デポー注射可能製剤は、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封入することによっても調製される。
薬学的組成物は、経口的、非経口的、局所的、または直腸内に与えられ得る。それらは、当然、各投与ルートのために適当な形態によって与えられる。例えば、それらは、錠剤またはカプセル剤の形態で、注射、吸入、眼ローション剤、軟膏剤、坐剤、注入によって；ローション剤または軟膏剤によって、局所的に；坐剤によって、直腸内に投与される。経口投与が好ましい。
「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、本明細書において使用されるように、一般的には、注射による、経腸投与および局所投与以外の投与モードを意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入を含む。
本発明の薬学的組成物は、「全身投与」および「末梢投与」され得る。それらは、患者の全身に入り、従って、代謝およびその他の類似の過程を受ける、中枢神経系への直接投与以外の、リガンド、薬物、またはその他の材料の投与、例えば、皮下投与を意味する。
本発明の化合物は、任意の適当な投与ルート、例えば、経口、鼻腔内、例えば、スプレーによるもの、直腸内、膣内、非経口、大槽内、および局所、散剤、軟膏剤、または滴剤によるもの、例えば、頬側および舌下によって、治療のため、ヒトおよびその他の動物へ投与され得る。
選択された投与ルートに関わらず、適当な水和形態で使用され得る本発明の化合物、および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
本発明の薬学的組成物における本発明の化合物の実際の投薬量レベルは、患者にとって有毒であることなく、特定の患者、組成物、および投与モードについて、所望の治療的応答を達成するために有効な活性成分の量を得るため、変動し得る。
薬学的に許容される混合物における本発明の化合物の濃度は、いくつかの要因、例えば、投与される化合物の投薬量、利用される化合物の薬物動態学的特徴、および投与ルートに依って変動する。
一般的に、本発明の組成物は、非経口投与のため、物質の中でもとりわけ、約0.1～10％w/vの本明細書に開示された化合物を含有する水性溶液として提供され得る。典型的な用量範囲は、前記のものであり、好ましくは、1～4回に分割されて与えられる、1日当たり体重1kg当たり約0.001～約500mgであり得る。分割された各用量は、本発明の同一のまたは異なる化合物を含有し得る。投薬量は、いくつかの要因、例えば、患者の全体的な健康状態、ならびに選択された化合物の製剤および投与ルートに依る、有効な量である。
併用治療
本発明のもう1つの局面は、1つまたは複数の他の治療剤が、本発明の化合物および組成物と共に投与される併用治療を提供する。そのような併用処置は、本発明の化合物以外の併用される治療剤の相加的な効果の原因となる、同一のまたは類似の処置を達成する。
ある種の態様において、本発明の化合物は、1つまたは複数のプロテアソーム阻害剤と共に併用投与され得る。ある種の態様において、本発明の化合物は、化学療法薬と共に併用投与される。適当な化学療法薬には、天然生成物、例えば、ビンカアルカロイド類（即ち、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、パクリタキセル、エピジポドフィロトキシン類（epidipodophyllotoxins）（即ち、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（ダクチノマイシン（アクチノマイシンD）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびイダルビシン）、アントラサイクリン類、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン、酵素（L-アスパラギンを全身的に代謝し、アスパラギンを自己合成する能力を有しない細胞を枯渇させるL-アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖/抗有糸分裂アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード類（メクロレタミン、シクロホスファミド、および類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン類およびメチルメラミン類（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホン酸（ブスルファン）、ニトロソウレア類（カルムスチン（BCNU）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン類（trazenes）（ダカルバジニン（dacarbazinine）（DTIC））；抗増殖/抗有糸分裂代謝拮抗薬、例えば、葉酸類似体（メトトレキサート）、ピリミジン類似体（フルオロウラシル、フロクスウリジン、およびシタラビン）、プリン類似体および関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および2-クロロデオキシアデノシン）；アロマターゼ阻害剤、カルボプラチン、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン（即ち、エストロゲン）およびホルモンアゴニスト、例えば、黄体化ホルモン放出ホルモン（LHRH）アゴニスト（ゴセレリン、リュープロリド、およびトリプトレリン）が含まれ得る。その他の化学療法剤には、メクロレタミン、カンプトテシン、イホスファミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、ゲムシタビン、ナベルビン、またはそれらの任意の類似体もしくは誘導体バリアントが含まれ得る。
ある種の態様において、本発明の化合物は、免疫治療剤と共に併用投与される。適当な免疫治療剤には、シクロスポリン、サリドマイド、およびモノクローナル抗体が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。モノクローナル抗体は、裸であってもよいし、またはコンジュゲートされていてもよく、例えば、リツキシマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ベバシズマブ、セツキシマブ、エルロチニブ、およびトラスツズマブである。
癌の処置
本発明の式1、2、および5の化合物、ならびにそれらの薬学的組成物を使用した本発明の方法によって処置され得る癌の例示的な型には、前立腺癌、膀胱癌、（小細胞癌もしくは非小細胞癌を含む）肺癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、もしくはその他の子宮癌、卵巣癌、精巣癌、陰茎癌、膣癌、尿道癌、胆嚢癌、食道癌、または膵臓癌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本発明の方法によって処置され得る癌の付加的な例示的な型には、骨格筋または平滑筋の癌、胃癌、小腸癌、唾液腺癌、肛門癌、直腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体癌、および鼻咽頭癌が含まれるが、これらに限定されるわけではない。肺癌、乳癌、膵臓癌、およびメラノーマ、ならびにそれらの転移を含む癌の型の例外的な処置も達成され得る。
本発明の化合物ならびにそれらの塩および溶媒和化合物は、不適切なプレmiR-21活性に関連した疾患または状態の処置のため、単独で利用されてもよいし、または他の治療剤と組み合わせて利用されてもよい（前記の併用治療）。
様々な態様において、本発明の化合物は、腫瘍性成長物、血管新生、感染、炎症、免疫関連疾患、虚血再灌流障害、多発性硬化症、関節リウマチ、神経変性状態、または乾癬を処置するために使用され得る。
悪性腫瘍性成長物には、癌が含まれ得る。適切には、本発明は、脳癌（神経膠腫）、神経膠芽腫、乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上衣腫、髄芽腫、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、骨巨細胞腫瘍、甲状腺癌、リンパ芽球性T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性T細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞型白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫、巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、頬癌、口腔癌、GIST（消化管間質腫瘍）、および精巣癌より選択される癌を処置するか、またはその重症度を和らげる方法に関する。
様々な態様において、癌は、脳癌（神経膠腫）、神経膠芽腫、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、および甲状腺癌より選択される。
様々な態様において、癌は、固形腫瘍である。様々な態様において、癌は、多発性骨髄腫、転移性乳癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、進行結腸直腸癌、卵巣癌、または原発性腹膜癌、ホルモン不応性前立腺癌、頭頸部扁平上皮癌、転移性膵臓腺癌、食道胃接合部もしくは胃、または非ホジキンリンパ腫より選択される。
プロテアソーム活性の不適切なレベルを特徴とする障害、またはプロテアソーム活性の正常なレベルの低下が臨床的な利益を与える障害を処置するため、本明細書に記載された化合物を使用する方法。この障害には、過剰な細胞増殖または細胞シグナリングを特徴とする癌または免疫障害が含まれ得る。
本発明の化合物は、悪液質および筋消耗性疾患を処置するために使用され得る。本発明の化合物は、癌、発熱、筋廃用（萎縮）、および除神経、神経損傷、絶食、アシドーシスに関連した腎不全、糖尿病、および肝不全に関連している、そのような状態を処置するために使用され得る。
本発明の化合物は、過剰増殖性状態、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、糖尿病性神経障害、糸球体硬化症、IgA腎症、硬変、胆道閉鎖症、うっ血性心不全、強皮症、放射線誘発線維症、ならびに肺線維症（特発性肺線維症、膠原病性脈管疾患、サルコイドーシス、間質性肺疾患、および外因性肺障害）を処置するために使用され得る。
RNase L-GSTタンパク質の調製。pGEX-4T-RNase L-GSTプラスミドを、以前に記載されたように調製し22、保存緩衝液（20mM HEPES、pH 7.4、70mM NaCl、2mM MgCl2）において維持した。
マイクロスケール熱泳動（MST）結合測定。IDTから購入され、さらなる精製なしに使用された、RNaseフリーHPLCによって精製されたmiR-21ヘアピン（A+Uバルジ）:
Figure 2023500893000013
またはmiR-21塩基対合対照（base paired control）
Figure 2023500893000014
の蛍光を使用して、Monolith NT.115系（NanoTemper Technologies）において、MST蛍光測定を実施した。RNA（5nM）を、1×MST緩衝液（8mM Na2HPO4、190mM NaCl、1mM EDTA、および0.05％(v/v)ツイーン20）で希釈し、60℃で5分間加熱し、徐々に室温に冷却することによって折り畳んだ。化合物1および2を、1×MST緩衝液で希釈した後、5nM RNAを含有する1×MST緩衝液で1:3希釈した。試料を室温で30分間インキュベートし、次いで、プレミアムコートキャピラリ（premium-coated capillaries）（NanoTemper Technologies）に負荷した。蛍光測定（Ex：605～645nm、Em：680～685nm）を、10％LEDおよび80％MSTパワーで、30秒のレーザーオン時間および5秒のレーザーオフ時間で実施した。データを熱泳動分析によって分析し、MST分析ソフトウェア（NanoTemper Technologies）において二次結合方程式によって適合させた。次いで、シングルサイトモデルを使用した曲線適合によって解離定数を決定した。最低シグナルを0、最高蛍光シグナルを1として、1とプレmiR-21 WTとの結合のMSTデータを使用して、蛍光シグナルを正規化することによって、正規化されたMSTシグナルを計算した。
インビトロ蛍光RNA切断。HPLCによって精製された、5'6-フルオレセイン（6FAM）および3'ブラックホールクエンチャー（IQ4）によって標識されたモデルRNAヘアピン15
Figure 2023500893000015
または5'6-フルオレセイン（6FAM）および3'ブラックホールクエンチャー（IQ4）によって標識されたmiR-21ヘアピン前駆体RNA
Figure 2023500893000016
を、Chemgenesから購入した。RNA溶液（100nM）を、MgCl2、βメルカプトエタノール、またはATPを含まない1×RNase L緩衝液（25mM Tris-HCl、pH 7.4、100mM KCl）において、65℃で5分間折り畳み、徐々に室温に冷却した。折り畳み後、RNAに、10mM MgCl2、新鮮な7mM βメルカプトエタノール、および50μMのATPを補足した。次に、以前に記載されたように調製された22、100nMのRNase L、および様々な濃度のスクリーニング化合物を、1×RNase L緩衝液において調製し、RNAに添加した。あるいは、5の希釈液を、1×RNase L緩衝液において調製し、RNAに添加した。次いで、試料を、Corningノンバインディングサーフェイスハーフエリア（non-binding surface half area）96穴黒色プレートに移した。試料を室温で60分間インキュベートし、その後、SpectraMax M5プレートリーダーまたはBiotek FLx800プレートリーダーを使用して、蛍光強度（Ex：485nm、Em：525nm）を測定した。未処理の蛍光シグナルに対する試料の蛍光シグナルの百分率変化（percentage change）を計算することによって、蛍光強度の百分率変化を決定し（Fi、％）、蛍光強度の増強をRNA切断の指標とした。方程式1（Eq.1）および2（Eq.2）を使用して、陽性対照分子（10または100nM 2'-5'A4）の値によって、シグナルを正規化した（Fnorm、％）。
Figure 2023500893000017
インビトロRNase Lオリゴマー化。1×RNase L緩衝液中のRNase L（3μM）のアリコートに、10mM MgCl2、新鮮な7mM βメルカプトエタノール、および50μMのATPを補足した。RNase Lオリゴマー化は、1×RNase L緩衝液において調製された2'-5'A4または化合物（2もしくは5）の希釈物を使用して、以前に記載されたように実施された13。4℃で一夜、5％脱脂粉乳を含有する1×TBST中のRNase L一次抗体（1:5000希釈；Cell Signaling Technology：D4B4J）、室温で2時間、5％脱脂粉乳を含有する1×TBST中の1:10000抗ウサギIgG西洋わさびペルオキシダーゼ二次抗体コンジュゲート（Cell Signaling Technology：7074S）を使用して、RNase Lの単量体集団およびオリゴマー集団を分離するためのウエスタンブロット（下記）を実行した。
PCR増幅＆インビトロ転写。標準的な脱塩がなされた、miR-21一次転写物RNA（プリmiR-21）のためのDNA鋳型
Figure 2023500893000018
を、IDTから購入し、さらなる精製なしに使用した。この鋳型を、50μL反応において、1×PCR緩衝液（10mM Tris、pH 9.0、50mM KCl、および0.1％(v/v)トリトンX-100）、2μM順方向プライマー
Figure 2023500893000019
、2μM逆方向プライマー
Figure 2023500893000020
、4.25mM MgCl2、330μM dNTP、および1μLのTaq DNAポリメラーゼにおいてPCR増幅した。PCRサイクリング条件は、95℃、90秒の初期変性、その後、95℃、30秒、55℃、30秒、および72℃、60秒の25サイクルであった。
標準的な脱塩がなされた、プレmiR-21 WT（野生型）のためのDNA鋳型
Figure 2023500893000021
およびプレmiR-21 BP（塩基対合）のためのDNA鋳型
Figure 2023500893000022
を、IDTから購入し、さらなる精製なしに使用した。これらの鋳型を、50μL反応において、1×PCR緩衝液（10mM Tris、pH 9.0、50mM KCl、および0.1％(v/v)トリトンX-100）、2μM順方向プライマー
Figure 2023500893000023
、2μM逆方向プライマー
Figure 2023500893000024
、4.25mM MgCl2、330μM dNTP、および1μLのTaq DNAポリメラーゼにおいてPCR増幅した。PCRサイクリング条件は、95℃、90秒の初期変性、その後、95℃、30秒、50℃、30秒、および72℃、60秒の25サイクルであった。RNAをインビトロで転写し、以前に記載されたように精製した5。オンラインのIDT Oligo Analyzer Toolを使用して消衰係数を計算した。
インビトロダイサープロセシング。miR-21前駆体（プレmiR-21 WT）または変異型塩基対合miR-21前駆体（プレmiR-21 BP）を、以前に記載されたように5、[γ-32P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼによって5'末端標識した。60℃で5分間加熱し、徐々に室温に冷却することによって、1×反応緩衝液（Genlantis）においてRNAを折り畳み、次いで、1mM ATPおよび2.5mM MgCl2を補足した後、1.5ng/μLの濃度でダイサー酵素（BPS Bioscience）を使用して、以前に記載されたように23、ダイサープロセシング反応を実行した。切断産物を変性15％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、それを、Molecular Dynamics Typhoon phosphorimagerを使用して画像化し、Bio-RadのQuantityOneソフトウェアによって定量化し、全長RNAに対して正規化した。
インビトロの化学的架橋およびプルダウンによる単離（Chem-CLIP）および競合的な化学的架橋およびプルダウンによる単離（C-Chem-CLIP）。RPMI成長培地を95℃で15分間熱不活化し、次いで、室温に冷却した。およそ10,000カウントの32P 5'末端標識miR-21前駆体ヘアピンRNA（プレmiR-21 WT）を、成長培地において、95℃で1分間折り畳んだ。室温に冷却した後、Chem-CLIPプローブ8または923の希釈物を添加し、37℃で18時間インキュベートした。あるいは、C-Chem-CLIPのため、競合する非架橋親化合物1または2の希釈物を、RNAと共に1時間インキュベートした後、Chem-CLIPプローブ化合物を添加した。次いで、RNAをプルダウンするため、ストレプトアビジン-アガロースビーズ（Sigma-Aldrich）を使用した。次いで、0.1％(v/v)ツイーン20が補足された1×PBSで試料を洗浄し、結合したRNAおよび未結合RNAの放射活性を、以前に記載されたように23、Beckman Coulter LS6500液体シンチレーションカウンタを使用して測定した。
インビトロRibo-SNAP。プリmiR-21 RNA（1μM）を前記のように折り畳んだ。切断化合物（ブレオマイシンA5または10）の希釈物を、1eq Fe2+の添加によって予備活性化し、20μLの全体積で、折り畳まれたRNAに添加した。30分後および60分後に、付加的な当量のFe2+を添加し、次いで、反応混合物を37℃で一夜インキュベートした。エタノール沈殿およびNanodropによる定量化の後、5'32P標識順方向プライマー（およそ10,000カウント）を使用して、製造業者のプロトコルに従い、SuperScript（商標）III逆転写酵素（ThermoFisher Scientific）を使用して逆転写を実施した。3:1のddNTP/dNTP比を使用することによって、A、T、G、およびCのシーケンシングラダーを生成した。RNase AおよびRNase Hの添加によって、RNAを消化し、37℃で30分間インキュベートした。次いで、等しい体積の負荷緩衝液（95％ホルムアルデヒド、50mM EDTA、0.05％(w/v)ブロモフェノールブルー、0.05％(w/v)キシレンシアノール）を各反応物に添加した。最終的な混合物を、変性15％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。
細胞培養物の化合物処理およびトランスフェクション。化合物による処理のため、DMSO中または水中のストックを成長培地で希釈し、24～72時間、細胞に添加した。24穴プレートにおいて、pcDNA3.1（Addgene 21114）またはpcDNA3-RNaseL（R.H.Silverman,Cleveland Clinic24）の中のmiR-21ヘアピン前駆体を過剰発現させるための、プラスミドDNAのトランスフェクションのため、リポフェクタミン2000を製造業者のプロトコルに従い使用した。トランスフェクション後、培地を除去し、前記のように調製された化合物を含有する成長培地に交換した。対照（Santa Cruz Biotechnology：sc-37007）またはRNase Lを標的にするsiRNA（Santa Cruz Biotechnology：sc-45965）のトランスフェクションのため、製造業者のプロトコルに従い、2'-5'A4を含むオリゴヌクレオチドのトランスフェクションのため、リポフェクタミンRNAiMAX試薬を使用した。
細胞Chem-CLIP/C-Chem-CLIP。MDA-MB-231細胞を、60mmディッシュにおいて、単層として、およそ70％コンフルエンシーに成長させた。細胞を、Chem-CLIP化合物（8もしくは9）および/または非架橋競合剤（1もしくは2）によって48時間処理した。製造業者のプロトコルに従い、Quick-RNA MiniPrepキット（Zymo Research）を使用して、全RNAを抽出した。次いで、およそ20～30μgの全RNAを、100μLのストレプトアビジン-アガロースビーズ（Sigma-Aldrich）と共にインキュベートし、室温で1時間振とうした。溶液を除去し、ビーズを1×PBSで6回洗浄した。以前に記載されたように23、ビーズに結合したRNAを放出させ、精製し、RT-qPCRのために使用した。プルダウンの前後に測定されたRNAの相対倍率濃縮（fold enrichment）を、方程式3（Eq.3）を使用して測定した：
相対倍率濃縮＝2-(プルダウン前のΔCt - プルダウン後のΔCt)（Eq.3）
式中、「プルダウン前のΔCt」とは、細胞由来の全RNAの中の関心対象のRNAについてのCt値と、ハウスキーピング遺伝子についてのCt値との差であり、「プルダウン後のΔCt」とは、プルダウン後のRNAの中の関心対象のRNAについてのCt値と、同ハウスキーピング遺伝子についてのCt値との差である。
Ribo-SNAPマップ。MDA-MB-231細胞を、100mmディッシュにおいて、およそ70％コンフルエンシーに成長させ、切断化合物（10）によって6時間処理した。次いで、TRIzol（ThermoFisher Scientific）による処理によって全RNAを抽出し、Nanodropによって定量化した。およそ10μgの全RNAを、Superscript III（SSIII；Life Technologies）を使用した、プリmiR-21特異的プライマー
Figure 2023500893000025
による逆転写のために使用した。およそ10μgのRNAを、2pmolの遺伝子特異的プライマーおよび1μLの10mM dNTPミックスと共に、13μLの全体積で、65℃で5分間インキュベートし、次いで、氷上に5分間置いた。次に、4μLの5×First-Strand緩衝液、1μLの0.1M DTT、1μLのRNaseOUT、および1μLのSuperScript（商標）III RTを添加し、混合物を、50℃で1時間、続いて、85℃で10分間インキュベートした。RNase AおよびRNase Hによる消化の後、残存するcDNAをRNAClean XPビーズ（Beckman Coulter；1.8倍体積のビーズおよび3倍体積のイソプロパノール）を使用して精製した。
精製されたcDNAを、製造業者の推奨するプロトコル（2μLの10×T4 RNAリガーゼ緩衝液、1μLの1mM ATP、10μLの50％PEG 8000、5μLのcDNA、1μLの20μM ssDNAアダプター、および1μLのT4 RNAリガーゼ）に従って、T4 RNAリガーゼ1（New England BioLabs；NEB）によって、3'アダプター
Figure 2023500893000026
とライゲートした。次いで、アダプターにライゲートされたcDNAを、前記のRNAClean XPビーズによって精製した。98℃、20秒、64℃、20秒、および72℃、90秒のサイクリング条件、ならびに以下の順方向プライマー
Figure 2023500893000027
および逆方向プライマー
Figure 2023500893000028
と共に、Phusionポリメラーゼ（NEB）を使用することによって、ライゲートされたcDNAによってPCR増幅を実施した。PCR産物を、変性15％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、標的バンドを、ゲルから切り出し、エタノール沈殿させた。精製されたDNAを、製造業者のプロトコルに従い、NEBのPCRクローニングキットを使用して、ベクターとライゲートした。抗生物質耐性コロニーを選択し、Genewizによるサンガー配列決定に供した。切断剤によって処理された試料と未処理の試料とを比較することによって、切断の部位および百分率を決定した。
PTENルシフェラーゼアッセイ。MDA-MB-231細胞を、48穴プレートにおいて、およそ60％コンフルエンシーに成長させ、次いで、製造業者のプロトコルに従い、リポフェクタミン2000を使用して、PTENの3'非翻訳領域（UTR）をコードするホタルルシフェラーゼプラスミド25および対照ウミシイタケルシフェラーゼプラスミドによって一過性コトランスフェクトした。トランスフェクションの5時間後に、成長培地で希釈された化合物を細胞に添加し、次いで、48時間インキュベートした。以前に記載されたプロトコル23,26を使用して、ルシフェラーゼアッセイを遂行した。発光シグナルは、Biotek Flx800プレートリーダーで測定された。
PDCD4ウエスタンブロット：MDA-MB-231細胞を、6穴プレートにおいて、およそ60％コンフルエンシーに成長させた。細胞を、成長培地で希釈された化合物と共に48時間インキュベートした。製造業者のプロトコルに従い、哺乳動物細胞用の1×プロテアーゼ阻害剤カクテルIII（Research Products International Corp.）が補足されたM-PER哺乳動物タンパク質抽出試薬（Pierce Biotechnology）を使用して、全タンパク質を抽出した。Micro BCAタンパク質アッセイキット（Pierce Biotechnology）を使用して、全タンパク質溶解物を定量化した。全タンパク質の30μgのアリコートを、5％スタッキング層を有する10％Bis-Tris SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離し、次いで、PVDF膜に移した。次いで、1×TBST中の5％(w/v)脱脂粉乳で、室温で1時間、膜をブロッキングした。次いで、5％(w/v)脱脂粉乳を含有する1×TBST中の1:2000ウサギmAb PDCD4一次抗体（Cell Signaling Technology：D29C6）と共に、4℃で一夜、膜をインキュベートした。膜を、1×TBSTで各5分間、5回洗浄し、次いで、5％(w/v)脱脂粉乳を含有する1×TBST中の1:5000抗ウサギIgG西洋わさびペルオキシダーゼ二次抗体コンジュゲート（Cell Signaling Technology：7074S）と共に、室温で1時間インキュベートした。1×TBSTで各5分間、7回洗浄した後、製造業者の推奨に従って、SuperSignal West Pico化学発光基質（Pierce Biotechnology）を使用した化学発光によって、タンパク質レベルを定量化した。各5分間、2回、1×ストリッピング緩衝液（200mMグリシン、pH 2.2、1％ツイーン20、および0.1％SDS）で膜をストリッピングした後、1×TBSTで3回洗浄した。次いで、膜をブロッキングし、1:5000マウスβアクチン一次抗体（Cell Signaling Technology：8H10D10）を使用して、前記と同一の手順に従って、βアクチンについて探索した。1×TBSTで5回、膜を洗浄し、1:10000抗マウスIgG西洋わさびペルオキシダーゼ二次抗体コンジュゲート（Cell Signaling Technology：7076S）と共にインキュベートした。1×TBSTで各5分、7回洗浄した後、タンパク質レベルを前記のように定量化した。バンド強度を定量化するため、ImageJソフトウェアを使用した。
IFNγの測定：MDA-MB-231細胞を24穴プレートに播種し、70％コンフルエンシーに成長させた。リポフェクタミンRNAiMAX（Life Technologies）を使用して、2'-5'A4によって細胞をトランスフェクトした。あるいは、MDA-MB-231細胞をモックトランスフェクトし、ビヒクル（DMSO）または5（5、50、500、5000nM）によって処理した。細胞培養上清を24時間後に除去した。製造業者の説明に従って、上清からのインターフェロンγレベルを測定するため、ヒトIFNγ ELISAキット（Bon Opus Biosciences：BE010020）を使用した。
ボイデンチャンバー浸潤アッセイ。MDA-MB-231細胞、MDA-LM2細胞、A375細胞、A549細胞、またはMCF-10a細胞（5×104個）を、無血清成長培地において、8.0μmの孔を有するコーティングされていない膜を有する24穴プレート用ハンギングセルカルチャーインサート（Millicell）に播種した。無血清成長培地で希釈されたマトリゲルの3mg/mLの層（100μL）（Fisher Scientific：CB40234）を、各膜の内部で調製した。細胞を、化合物によって処理し、または処理せずに、前記のように培養し、16～24時間、ボトムウェルの完全成長培地に向かって浸潤させた後、ボトムウェルの培地およびインサートを除去することによって、実験を終了させた。ハンギングセルカルチャーインサートおよびボトムウェルを、混合するため静かに振とうしながら、1×PBSで2回洗浄した。インサート内部の過剰の液体および細胞をコットンスワブで除去し、その後、400μLの4％パラホルムアルデヒドをボトムウェルに置き、細胞を固定するため、室温で20分間インキュベートした。ウェルおよびインサートを1×PBSで2回洗浄し、次いで、細胞を染色するため、室温で20分間、400μLの0.1％クリスタルバイオレット溶液によって処理した。ウェルおよびインサートを水で2回洗浄した後、1×PBSで1回洗浄した。インサート内部の過剰の染料および細胞を除去するため、インサートをコットンスワブで乾燥させ、次いで、空気乾燥させた後、Leica DMI3000 B正立蛍光顕微鏡を使用して明視野顕微鏡分析を行った。捕捉された各画像からの4つの異なる視野を、クリスタルバイオレットで染色された細胞または未染色の細胞について計数した。正規化された細胞浸潤を、方程式5（Eq 5）によって計算した：
Figure 2023500893000029
式中、染色された細胞とは、化合物によって処理された試料またはビヒクルによって処理された試料において観察された、クリスタルバイオレット染色によって計数された細胞を表す。
触媒活性の測定。MDA-MB-231細胞を24穴プレート（Corning）に播種した。およそ80％コンフルエンシーで、培地を吸引し、細胞単層を1×DPBSで洗浄した。次いで、細胞を、細胞培養培地で希釈された5（500nM）またはビヒクル（DMSO）と共に24時間インキュベートした。次いで、細胞を、Quick-RNA MiniPrepキット（Zymo Research）からの250μLのRNA溶解緩衝液を使用して溶解した。100μLのアリコートを、黒色ノンバインディングサーフェイスハーフエリア96穴プレート（Corning）に移した。未処理の細胞溶解物の画分を合わせ、既知濃度の5のスパイキングによって、細胞溶解物中の5の標準曲線を生成するために使用した。次いで、細胞溶解物中の化合物濃度を決定するため、蛍光強度（Ex：345nm、Em：460nm）を、Molecular Devices SpectraMax M5プレートリーダーで測定した。次いで、生成された標準曲線を使用して、250μLの全体積中の5の量（pmol）を外挿するため、50μLの細胞溶解物のアリコート中の5の濃度を使用した。
RNAを細胞溶解物から抽出した後、前記のようにRT-qPCRを行った。Ct値を正確に較正するため、各ランによって遂行された、インビトロで転写されたプレmiR-21（10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0ng）を使用して、プレmiR-21 WT転写物についての標準曲線を生成した。次いで、未処理の試料におけるプレmiR-21のpmolと、5によって処理された試料におけるプレmiR-21のpmolとの間の差を得ることによって、切断されたプレmiR-21の量を計算した。切断されたプレmiR-21のpmolと、試料中の5のpmolとの比を得ることによって、触媒活性またはターンオーバーを計算した。
LC-MS/MSを使用した網羅的プロテオミクスプロファイリング。ビヒクル（DMSO）または5（50nM）によって処理されたMDA-MB-231細胞を、PBSで洗浄し、擦過によって採集し、4℃で1500×gで5分間遠心分離し、次いで、PBSに再懸濁させた。細胞を超音波によって溶解し、Bradfordアッセイ（Bio-Rad）を使用して、溶解物タンパク質濃度を決定した。タンパク質試料（40μg）を50mM NH4HCO3中の6M尿素によって変性させ、10mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）によって30分間還元し、次いで、暗所で30分間、25mMヨードアセトアミドによってアルキル化した。試料を50mM NH4HCO3を含む2M尿素で希釈し、1mM CaCl2の存在下で、37℃で12時間、トリプシン（2μLの0.5μg/μL）によって消化した。次いで、試料を5％酢酸の最終濃度に酸性化し、セルフパックC18スピンカラムで脱塩し、乾燥させた。試料をLC-MS/MSによって分析し（下記を参照すること）、MSデータをMaxQuantおよびProteome Discovererによって処理した（下記を参照すること）。
LC-MS/MS分析：ペプチドを、0.1％ギ酸（FA）を含む水に再懸濁させ、Q Exactive HF-X Quadrupole-Orbitrap質量分析計（Thermo Scientific）と接続されたEASY-nLC 1200 nano-UHPLCを使用して分析した。クロマトグラフィカラムは、5μmのチップによってキャッピングされ、ReproSil-Pur 120 C18-AQ 2.4μmビーズ（Dr.Maisch GmbH）が充填された、長さ50cm、i.d.75μmのマイクロキャピラリからなる。LC溶媒は、H2O中の0.1％FA（緩衝液A）および90％MeCN：10％H2O中の0.1％FA（緩衝液B）であった。ペプチドを、65℃で、240分の直線勾配（5～35％緩衝液B）で、300nL/分の流速で、質量分析計に溶出させた。フルMSスキャン（R＝60000、m/z 400～1300）の後に、データ依存モード（top-20、NCE 28、R＝7500）で、データを取得した。動的排除は、10秒に設定され、ペプチドマッチは、好ましい（prefer）に設定され、同位体排除は、可能（enabled）にされた。PDCD4およびPTENの標的特異的な取得のため、ペプチドインクルージョンリストを作成し、動的排除を2秒に設定したことを除き、前記と同様にデータを取得した。
MaxQuant分析：MSデータを、MaxQuant（V1.6.1.0）27によって分析し、ヒトプロテオーム（Uniprot）および（MaxQuantに含まれる）汚染物質の一般的なリストに対して検索した。最初のペプチド検索トレランスは、20ppmに設定され、主要ペプチド検索のためには、10ppmが使用され、フラグメントマストレランスは、0.02Daに設定された。ペプチド、タンパク質、および部位の同定についての偽発見率は、1％に設定された。最小ペプチド長は、6アミノ酸に設定され、ペプチド再定量化およびラベルフリー定量化（MaxLFQ）は、可能にされた。各タンパク質についてのペプチドの最小数は、2に設定された。メチオニン酸化は、可変性の修飾として検索され、システインのカルバミドメチル化は、固定された修飾として検索された。
Proteome Discoverer分析：MSデータを、Sequest HTアルゴリズム26を使用して、Proteome Discoverer（V2.1.1.21）によって処理し、ヒトプロテオーム（Uniprot）に対して検索した。プリカーサーマストレランスは、10ppmに設定され、0.02Daが、フラグメントマストレランスのために使用された。最小ペプチド長は、6アミノ酸に設定され、各タンパク質についての最小ペプチドは、2に、q値は、≦1％に、タンパク質FDRは、高に設定された。メチオニン酸化は、動的修飾として、システインのカルバミドメチル化は、静的修飾として、検索された。
タンパク質経路分析：中程度の信頼度設定（0.400）を使用したタンパク質間相互作用分析のため、有意にディファレンシャルに発現されたタンパク質（1％のFDRおよびS0（0.1））を、STRINGデータベース（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins）29（http://www.string-db.org）にアップロードした。機能的分析（カノニカルパスウェイ、上流レギュレーター）を、Ingenuity Pathway分析（IPA,v01-12；QIAGEN Inc.,https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway- analysis）30の使用を通して生成した。
DMPK測定：雄C57BL/6マウス（n＝3、5～7週）を、薬物動態（PK）査定のために使用した。マウスに、DMSO/ツイーン80/H2O（10/10/80）の製剤として、5をi.p.投与し（10mg/kg）、0.25、0.5、1、2、4、6、8、および24時間の時点で、血液（25μL）を採取した。血漿中の化合物レベルの検出を、QTRAP 5500 LC-MS/MS系（AB Sciex）において、LC/MS-MSを使用して決定した。
統計分析：他に示されない限り、全てのプロットが、S.E.M.を表すエラーバーと共に平均値を示す。実験はトリプリケートで独立して遂行された。データは、プロットされ、統計量は、市販のソフトウェア（GraphPad Prism、Perseus）を使用して計算された。2群間の比較は、独立両側スチューデントt検定を使用して行われた。qPCRプロファイリングおよびプロテオミクスデータからのボルケーノプロットのため、1％のFDRおよびS0（0.1）の群間分散を計算するため、Perseusが使用された。ジニ係数は、以前に記載されたように18、計算された。分布間のp値は、両側コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して計算された。他に特記されない限り、p＜0.05で有意と認めた。
データの入手可能性：全ての関連データが、本書およびSupplementary Informationに含まれる。結晶学的データは、リファレンス番号：CCDC 1912054で、Cambridge Crystallographic Data Centreより無料で入手可能である。
コードの入手可能性：カスタムコードが、以前に記載された方法45を使用して、RNAによってRNA結合剤をモデル化するため、クラスタ分析のために使用された。計算的モデリングについてのさらなる考察は、Supplementary Textとして、Supplementary Informationにおいて入手可能である。
合成実験の手順
全般。試薬および溶媒は、標準的な供給業者より購入され、さらなる精製なしに使用された。HPLCによって精製された合成2'-5'A4（リチウム塩）は、ChemGenesより購入された。インビトロ切断スクリーニングアッセイのために使用されたライブラリ化合物（図S13）は、Zelinsky Institute Inc.（全てのC1シリーズおよびC2-6、7、10～19）ならびにLabNetwork（C2-1～5、8、および9）より購入された。反応はTLCシリカ（Agela Technologies）によってモニタリングされた。スポットは、UV光、ホスホモリブデン酸、またはニンヒドリン染料によって可視化された。生成物は、プレパックシリカゲルカラム（Agela Technologies）を使用したIsolera One（Biotage）、または5mL/分の流速でSunFire（登録商標）Prep C18 OBD（商標）5μmカラム（19×150mm）を使用したHPLC（Waters 2489および1525）によって精製された。生成物の純度は、1mL/分の流速で、SunFire（登録商標）C18 3.5μmカラム（4.6×150mm）を使用したHPLC（Waters 2487および1525）によって分析された。NMRスペクトルは、400 UltraShield（商標）（Bruker）（1Hについては400MHz、13Cについては100MHz）、またはAscend（商標）600（Bruker）（1Hについては600MHz、13Cについては150MHz）を使用して測定された。化学シフトは、1Hについては、TMS、13Cについては、残存溶媒を内部標準として、相対ppmで表される。カップリング定数（J値）は、ヘルツで表される。高分解能質量スペクトルは、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸マトリックスおよびTOF/TOFキャリブレーション混合物（AB Sciex Pte.Ltd.）を使用して、4800 Plus MALDI TOF/TOF分析計（Applied Biosystems）で、またはPoroshell 120 EC-C18カラム（Agilent、50mm×4.6mm、2.7μm）が装備されたAgilent 6230 TOF（HR-ESI）と接続されたAgilent 1260 Infinity LC系で記録された。インビトロ切断スクリーニングアッセイは、FLx800プレートリーダー（BioTek）を使用して実施された。X線結晶解析についての回折は、Smart APEX検出器によってBruker AXSで収集された。
ペプトイド合成。ペプトイドは、以前に報告された手順21を使用して合成された。化学物質は、以下の商業的供給業者より：2-クロロトリチルクロリド樹脂（負荷＝1.46mmol/g）、Rink Resin SS（負荷＝0.50mmol/g）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、およびシアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エチル（オキシマ）は、Chem-Impex Int'l Inc.より；1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt）は、Advanced Chem Techより；1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート（HATU）およびトリフルオロ酢酸（TFA）は、Oakwood Chemicalより；1-プロピルアミンは、Alfa Aesarより；プロパルギルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）、および2-ブロモ酢酸は、Sigma Aldrichより；N,N-ジメチルホルムアミド（DMF、無水）およびジメチルスルホキシド（DMSO、無水）は、EMDより調達され、さらなる精製なしに使用された。
化合物ストック溶液の濃度の決定。溶液中の合成された化合物の濃度は、DU（登録商標）800分光光度計（Beckman Coulter）で記録された溶液の吸光度によって決定された。PBS（1％DMSO）における各分子の以下の消衰係数（M-1cm-1）を使用した：化合物1（340nmで13,000）、化合物3（340nmで14,902、345nmで16,472）、化合物4（340nmで10,967）、および化合物24（345nmで45,000）。
Figure 2023500893000030
スキームS1. 2および13の合成
Figure 2023500893000031
スキームS2. 8の合成
Figure 2023500893000032
スキームS3. 10の合成
Figure 2023500893000033
スキームS4. 5の合成
Figure 2023500893000034
スキームS5. 6の合成
Figure 2023500893000035
スキームS6. 7の合成
Figure 2023500893000036
スキームS7. 25の合成
化合物2：
DMF（2.5mL）中のペプトイド11（62mg、100μmol）および化合物1（115mg、200μmolの溶液に、CuSO4・5H2O（54.9mg、220μmol）およびL-アスコルビン酸（38.7mg、220μmol）を添加した。混合物を室温で24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、生成物をHPLC（40～65％MeOH/H2O、0.1％TFA）によって精製し、黄色の固体として2を得た（73mg、37.4μmol、37％）。
Figure 2023500893000037
Figure 2023500893000038
図S24-1. 2の1Hおよび13C NMRスペクトル
Figure 2023500893000039
図S24-2. MALDI-TOFによる2のHR-MS
化合物2ファミリー
異なるペプトイドリンカー長を有する化合物2ファミリー（2A～2E）（図S3b）を、2と同一の方法によって合成した。
化合物2A（n＝1、図S3b）:
収率：1.4μmol、28％。HR-MS（MALDI）：C77H95N20O7 +[M+H]+についての計算値、1411.7687；実測値、1411.7665。
Figure 2023500893000040
図S25-1. MALDI-TOFによる2AのHR-MS
化合物2B（n＝2、図S3b）:
収率：0.6μmol、12％。HR-MS（MALDI）：C82H104N21O8 +[M+H]+についての計算値、1510.8371；実測値、1510.8385。
Figure 2023500893000041
図S26-1. MALDI-TOFによる2BのHR-MS
化合物2C（n＝4、図S3b）:
収率：1.9μmol、37％。HR-MS（MALDI）：C92H122N23O10 +[M+H]+についての計算値、1708.9740；実測値、1708.9730。
Figure 2023500893000042
図S27-1. MALDI-TOFによる2CのHR-MS
化合物2D（n＝5、図S3b）:
収率：3.0μmol、60％。HR-MS（MALDI）：C97H131N24O11 +[M+H]+についての計算値、1808.0424；実測値、1808.0428。
Figure 2023500893000043
図S28-1. MALDI-TOFによる2DのHR-MS
化合物2E（n＝6、図S3b）:
収率：3.7μmol、73％。HR-MS（MALDI）：C102H140N25O12 +[M+H]+についての計算値、1907.1108；実測値、1907.1100。
Figure 2023500893000044
図S29-1. MALDI-TOFによる2EのHR-MS
化合物13：
DMF（10mL）中のペプトイド12（109.3mg、200μmol）および化合物1（221mg、400μmol）の溶液に、CuSO4・5H2O（110mg、440μmol）およびL-アスコルビン酸（77.5mg、440μmol）を添加した。混合物を室温で24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を水で洗浄した。乾燥させた後、粗反応混合物を、さらに精製することなく、次の反応のために使用した。13の粗生成物が、薄茶色の固体として得られた（275mg、166μmol、83％）。以下のスペクトルが、HPLC（20～40％MeCN/H2O、0.1％TFA）による精製の後に収集された。
Figure 2023500893000045
Figure 2023500893000046
図S30-1. 13の1Hおよび13C NMRスペクトル
Figure 2023500893000047
図S30-2. MALDI-TOFによる13のHR-MS
化合物8:
DMF（2.5mL）中のビオチンペプトイド14（2.9mg、5μmol）および化合物1（5.8mg、10μmol）の溶液に、CuSO4・5H2O（2.7mg、11μmol）およびL-アスコルビン酸（1.9mg、11μmol）を添加した。混合物を室温で24時間攪拌した。溶媒を濃縮し、粗生成物を過剰量のエーテルによって沈殿させた。10分間攪拌した後、粗生成物（1.1mg、1.0μmol）に、DMF（1mL）中のクロラムブシル（3.6mg、1.2μmol）、HATU（0.8mg、2.0μmol）、HOAt（0.3mg、2.0μmol）、およびDIPEA（0.9μL、5.0μmol）の混合物を添加した。混合物を室温で一夜攪拌し、生成物を過剰量のエーテルによって沈殿させた。固体を0.1％TFAを含む水中の50％MeCNに溶解させ、HPLC精製に供した。生成物をHPLC（0～100％MeCN/H2O、0.1％TFA）によって精製し、化合物8を得た（0.2mg、15％）。HPLCクロマトグラム：0～100％/60分 MeCN/H2O（0.1％TFA）。HR-MS（MALDI）：C70H94Cl2N17O9S+[M+H]+についての計算値、1418.6513；実測値、1418.6487。
Figure 2023500893000048
図S31-1. MALDI-TOFによる8のHR-MS
化合物10:
DMF（1mL）中の酸13（1.63mg、1.0μmol）、HATU（0.8mg、2.0μmol）、HOAt（0.3mg、2.0μmol）、およびDIPEA（0.9μL、5.0μmol）の溶液を10分間攪拌し、次いで、ブレオマイシンA5（2.26mg、1.5μmol）のDMSO溶液に添加した。混合物を室温で一夜攪拌し、生成物を過剰量のエーテルによって沈殿させた。固体を、0.1％TFAを含む水中の50％MeOHに溶解させ、HPLC精製に供した。溶液の注入後、銅イオンを除去するため、カラムを50mM EDTA（pH 6.7）で30分間洗浄し、次いで、さらに30分間、水で洗浄した。次いで、目標生成物を、HPLC（0～100％MeOH/H2O、0.1％TFA）によって精製した（0.9mg、29％）。HR-MS（MALDI）：C146H201N40O31S2 +[M+H]+についての計算値、3074.4817；実測値、3074.4932。
Figure 2023500893000049
図S32-1. MALDI-TOFによる10のHR-MS
化合物17：
DMF（1mL）中のフェノール15（41.4mg、0.3mmol）、ブロモPEG 16（107mg、0.3mmol）、およびK2CO3（41.5mg、0.3mmol）の溶液を、50℃で一夜加熱した。溶媒を蒸発させ、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン:AcOEt＝1:1～0:1）によって精製し、薄黄色の油状物質として17を得た（53mg、43％）。
Figure 2023500893000050
Figure 2023500893000051
図S33-1. 17の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物19：
EtOH（7mL）中のチオフェン18（350mg、1.32mmol）、アルデヒド17（500mg、1.21mmol）、およびピペリジン（120μL、0.17mmol）の溶液を、マイクロ波によって80℃で4時間加熱した。溶媒を蒸発させ、生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（AcOEtのみ）によって精製し、黄色の固体として19を得た（688mg、86％）。
Figure 2023500893000052
Figure 2023500893000053
図S34-1. 19の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物20：
2mLのジクロロメタン中の19（45mg、68.3μmol）の溶液に、1,4-ジオキサン（0.5mL、2mmol）中の4M HClを添加した。混合物を室温で30分間攪拌した後、溶媒を蒸発させ、黄色の固体として20を得た（38.9mg、65.4μmol、96％）。
Figure 2023500893000054
Figure 2023500893000055
図S35-1. 20の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物5：
DMF（5mL）中の酸13（265mg、160μmol）、HATU（73mg、192μmol）、HOAt（26mg、192μmol）、およびDIPEA（83.6μL、480μmol）の溶液を10分間攪拌し、アミン20（114.2mg、192μmol）およびDIPEA（83.6μL、480μmol）の溶液を2mLのDMFに添加した。混合物を室温で24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、生成物をHPLC（45～75％MeOH/H2O、0.1％TFA）によって精製し、黄色の固体として5を得た（70.1mg、28.9μmol、18％）。
Figure 2023500893000056
Figure 2023500893000057
図S36-1. 5の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物6：
DMF（120μL）中の酸12（12mg、22μmol）、HATU（10.9mg、28.6μmol）、HOAt（3.9mg、28.6μmol）、およびDIPEA（3.8μL、22μmol）の溶液を10分間攪拌し、次いで、100μLのDMF中のアミン20（17mg、28.6μmol）およびDIPEA（7.6μL、44μmol）の溶液を添加した。混合物を室温で24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、生成物をHPLC（50～90％MeOH/H2O、0.1％TFA）によって精製し、黄色の固体として6を得た（13mg、11.9μmol、54％）。
Figure 2023500893000058
Figure 2023500893000059
図S37-1. 6の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物21：
DMF（2mL）中のNaH（84mg 60％油分散、2.1mmol）の溶液に、0℃で、DMF（2mL）中の3,4-ジヒドロキシベンズアルデヒド15（228.3mg、1mmol）の溶液を添加した。30分間攪拌した後、DMF（2mL）中のブロモPEG 16（356mg、1mmol）を添加した。混合物を徐々に室温に加温し、一夜攪拌した。1eq.の酢酸の添加によって、反応を中止し、その後、溶媒を蒸発させた。粗混合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン:AcOEt＝1:1～0:1）によって精製し、無色の油状物質として21を得た（110mg、出発材料の回収に基づき、54％）。
Figure 2023500893000060
Figure 2023500893000061
図S38-1. 21の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物22：
EtOH（1mL）中のチオフェン18（58.4mg、220μmol）、アルデヒド21（83.3mg、220μmol）、およびピペリジン（19.8μL、220μmol）の溶液を、マイクロ波によって80℃で4時間加熱した。溶媒を蒸発させ、生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（AcOEtのみ）によって精製し、黄色の油状物質として22を得た（89.1mg、68％）。
Figure 2023500893000062
Figure 2023500893000063
図S39-1. 22の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物23：
4mLのジクロロメタン中の22（89.1mg、135μmol）の溶液に、1,4-ジオキサン（1mL,4mmol）中の4M HClの溶液を添加した。混合物を室温で30分間攪拌した。溶媒の蒸発によって、黄色の固体として23を得た（73.3mg、123μmol、91％）。
Figure 2023500893000064
Figure 2023500893000065
図S40-1. 23の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物7：
DMF（1mL）中の酸13（66.1mg、40μmol）、HATU（18.3mg、48μmol）、HOAt（6.5mg、48μmol）、およびDIPEA（20.9μL、120μmol）の溶液を10分間攪拌し、0.5mLのDMF中のアミン23（28.5mg、48μmol）およびDIPEA（13.9μL、80μmol）の溶液に添加した。混合物を室温で24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、生成物をHPLC（45～75％MeOH/H2O、0.1％TFA）によって精製し、黄色の固体として7を得た（9.4mg、3.9μmol、10％）。
Figure 2023500893000066
Figure 2023500893000067
図S41-1. 7の1Hおよび13C NMRスペクトル
化合物25：
DMF（50μL）中の酸24（1 TFA塩）（1.4mg、2.2μmol）、EDC（1.3mg、6.7μmol）、HOBt（1.0mg、6.7μmol）、およびDIPEA（1.2μL、6.7μmol）の溶液を、10分間攪拌し、30μLのDMF中のアミン20（4mg、6.7μmol）およびDIPEA（1.2μL、6.7μmol）の溶液に添加した。混合物を室温で24時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、生成物をHPLC（50～70％MeOH/H2O、0.1％TFA）によって精製し、黄色の油状物質として25を得た（0.9mg、0.8μmol、34％）。HR-MS（ESI）：C57H65N8O10S3+[M+3H]3+についての計算値、351.1509；実測値、351.1533。
Figure 2023500893000068
図S42-1. LC-MS（ESI-TOF）による25のHR-MS
リクルーターのオレフィンにおける幾何学の決定
低分子RNase LリクルーターC1-3（3、図2＆図S13）は、20の合成と同一の手順を使用して合成され、新たに合成されたC1-3（C1-3-S）およびライブラリ内のC1-3（C1-3-L）は、1H-NMR（DMSO-d6）によると同一であった（図S43）。C1-3-SのオレフィンのZ-異性体幾何学が、X線結晶解析によって確認された（表S5）。最後に、CDCl3におけるC1-3-Sおよび20の1H-NMR（図S44）の比較によって、本発明者らは、C1-3-L、C1-3-S、および20のオレフィンの幾何学が全てZであると結論付けた。
Figure 2023500893000069
図S43. C1-3-LおよびC1-3-Sの1H-NMRスペクトル（400MHz、DMSO-d6）の比較
陰性対照リクルーターC1-4のオレフィンにおける幾何学の決定
不活性低分子RNase LリクルーターC1-4（4、図2＆図S13）は、23の合成と同一の手順を使用して合成され、新たに合成されたC1-4（C1-4-S）およびライブラリ内のC1-4（C1-4-L）は、1H-NMR（DMSO-d6）によると同一であった（図S45）。赤矢印によって示されたオレフィンプロトンにおけるCDCl3におけるC1-4-Sおよび23の1H-NMR（図S46）の比較によると、C1-4-Sおよび23は同一の幾何学を有する。23の合成手順は20と同一であるため、本発明者らは、C1-4-L、C1-4-S、および23のオレフィンの幾何学が全てZであると結論付けた。
Figure 2023500893000070
図S45. C1-4-LおよびC1-4-Sの1H-NMRスペクトル（400MHz、DMSO-d6）の比較
RNA結合剤のパラメータ化。RNA結合分子は、（i）結合モジュール（図S47a）および（ii）リンカー（図S47b）という2つの別個の部分を含有する。これらの部分についての力場パラメータを、Generalized Amber Force Field（GAFF）34を使用して作成した。結合モジュールについてのRESP電荷をrespプロトコルを使用して得た：最初に、分子を最小化し、次いで、HF/6-31G＊基本セット35,36において、格子点のセットにおける静電ポテンシャルを計算した。計算は、Gaussian0937を使用して実施された。リンカーについての原子電荷は、AM1-BCC法38ビルトインAntechamberプログラム39によって作製された。結合モジュールおよびリンカーについての全ての力場パラメータおよび電荷情報が、表S6＆S7において入手可能である。
結合研究。結合研究を実施するため、モデルのAバルジおよびUバルジを表す2種のRNA分子、
Figure 2023500893000071
を、AMBER1640において、nucgenモジュールによって作製した。修正されたχ42およびα/γ43ねじれパラメータによるAmber99力場41を、RNAを記載するために使用した。A型幾何学を維持するため、ワトソンクリック（WC）塩基対合、ねじれ、およびキラリティーの制約を系に課した。結合研究についてのシミュレーションは、全て、0.3M塩濃度による修飾された陰溶媒モデル（GBOBC）44の条件で実施された。結合モジュールのAバルジRNAおよびUバルジRNAとの結合状態を調査するため、以前に使用されたダイナミックドッキング方法論45-47を適用した。最初に、バルジRNA部位から40Åの距離に結合モジュールを置くことによって、各系について一次構造を作成した。バルジ領域に隣接する塩基の重原子と結合モジュールの重原子との質量中心間の距離を、一次結合過程において反応座標として使用した。反応座標が0Åに近づくまで、結合モジュールを、バルジ領域に向かって、徐々に、1Åずつ移動させた。いわゆる、「接近移動（move-close）」過程においては、A型幾何学を表すWC塩基対合、ねじれ、およびキラリティーの制約を、バルジ領域を除くRNAに課した。これは、結合モジュールと相互作用しながらのバルジ部位の再配向を可能にした。0Åになった後は、距離が40Åに到達するまで、結合モジュールを、バルジ部位から1Åずつ移動させた。このいわゆる「離反移動（move-away）」過程においては、A型幾何学を表すWC塩基対合、ねじれ、およびキラリティーの制約を、全てのRNA残基に課した。結合研究のためのMDシミュレーションにおいて使用される50の異なる一次結合状態を提供するため、この過程を連続的に50回繰り返した。これらの一次結合状態を使用して、50の独立の陰溶媒MDシミュレーションを実施した。これらのMDシミュレーションにおいては、再び、結合モジュールがバルジ部位の周辺において自由に移動できるよう、WC塩基対合、ねじれ、およびキラリティーの制約を、バルジ領域を除くRNAに課した。各MDシミュレーションを120ns実行し、全部で6μsの組み合わせられた（combined）MDトラジェクトリを得、それを、結合モジュール/AバルジRNA複合体についてのクラスタ分析において使用した。
クラスタ分析。インハウスコードをクラスタ分析において使用した。組み合わせられたMDトラジェクトリは、60Kスナップショットを含有した。平均二乗偏差（RMSD）をスナップショット全体で調査し、RMSD＜＝1Åを有するスナップショットを、同一群にクラスタ化した。RMSDを計算する際には、結合モジュールの環原子の対称性を考慮した。
MM-PBSAを使用した相対結合自由エネルギー計算。結合モジュール/バルジRNA複合体についての最低結合自由エネルギー状態を決定するため、各クラスタに対してMM-PBSA分析を実施した。AMBER1640のMMPBSA.pyモジュールを使用し、100を超える構造を有するクラスタに適用した（表S8＆S9）。モデルのAバルジRNAおよびUバルジRNAに対する結合モジュールの最低結合エネルギー状態は、図S48に示される。
RNA結合剤によるプレmiR-21の調製。RNA配列
Figure 2023500893000072
を、プレmiR-21をモデリングするために使用した。ViennaRNA（http://rna.tbi.univie.ac.at/）によって予測された二次構造を使用して、RNAComposer（http://rnacomposer.cs.put.poznan.pl/）において、標的RNA構造をモデリングした。プレmiR-21のAバルジ領域およびUバルジ領域を、結合モジュールと相互作用する予測されたAバルジおよびUバルジに交換する、RNA結合剤と相互作用するプレmiR-21 RNAの設計において、モデルのAバルジRNAおよびUバルジRNAに対する結合モジュールの最低結合自由エネルギー状態を利用した（図S48）。この目的のため、本発明者らは、構造をホモロジーモデリングするため、VMD（Visual Molecular Dynamics）48を利用した。RNA結合剤と相互作用するプレmiR-21 RNAの構造を完全にするため、2つの結合モジュールの末端にリンカーを付着させた。最後に、構造を最小化した。
例示による実験結果
Figure 2023500893000073
項目S1。インビトロの1および2のマイクロスケール熱泳動（MST）結合親和性分析。a、上、MST結合分析のために使用された5'Cy5標識プレmiR-21 WT模倣物の二次構造。下、プレmiR-21 WT RNAに対する1および2の代表的な結合等温線。b、上、MST結合分析のために使用された塩基対合したAバルジおよびUバルジを有する5'Cy5標識プレmiR-21 BP対照の二次構造。下、プレmiR-21 BP RNAに対する1および2の代表的な結合等温線。100μMの化合物の添加によって、結合等温線の飽和は観察されなかった。MSTシグナルは、プレmiR-21 WTに対する1の蛍光シグナルに対して正規化された。データは平均値±s.e.m.（n≧3）を表す。
Figure 2023500893000074
項目S2。1および2のインビトロダイサー阻害アッセイ。a、左、インビトロで転写された32P 5'末端標識プレmiR-21 WT RNAのマッピングゲル。右、1および2の処理によるプレmiR-21 WTのダイサー保護の定量化。化合物による保護は、U23（緑色ボックス）ならびにU26およびU27（青色ボックス）において観察される。b、インビトロで転写された32P 5'末端標識プレmiR-21 BP RNAのマッピングゲル。右、1および2の処理によるプレmiR-21 BPのダイサー保護の定量化。化合物による保護は、U26およびU27（青色ボックス）において観察される。化合物を適切なRNAと共にプレインキュベートし、ダイサーエンドヌクレアーゼをRTで1時間添加した。生成物を15％PAGEゲルで分離した。OHは、全ての塩基において切断する加水分解ラダーを示し；T1は、全てのG塩基の後で切断するT1エンドヌクレアーゼによる変性切断条件を示し；（-）は、未処理のRNAを示し；+/-ダイサーは、それぞれ、ダイサーエンドヌクレアーゼありまたはなしのRNAを示し；ビヒクルは、DMSOによる処理を示す。破線は、未処理のRNAからのシグナルを示す。データは平均値±s.e.m.（n≧3）として表される。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000075
項目S3。細胞における1および2のオンターゲット効果。a、単量体化合物1は、MDA-MB-231細胞において、成熟miR-21-5pバイオジェネシスを阻害し（青色ボックス）、プレmiR-21のレベルを押し上げる（黄褐色ボックス）。b、上、RNA-結合モジュール間のリンカー長を最適化するためのペプトイドリンカー戦略の合成スキーム。下、二量体のスクリーニングをHEK293T細胞において実施した。20μMの1および変動するリンカー長（n＝1～6）を有する二量体による処理後のRT-qPCRによる成熟miR-21-5pレベルの測定は、n＝2～4が最も効果的に機能することを示した。c、プレmiR-21において示されたAバルジとUバルジとの間の距離にかかるN-プロピルペプトイドリンカーによって、n＝3またはn＝4が最適な長さであることを、以前の研究が示したため31、n＝3およびn＝4のリンカー長ならびに1を用量応答において試験した。n＝3リンカーが、RT-qPCRによって測定されるmiR-21レベルを最も有意に阻害し、従って、最適な二量体2として選択された。d、様々な癌細胞株環境における二量体化合物2の成熟miR-21-5pレベルに対する効力。破線は、未処理の試料またはビヒクル試料における相対RNAレベルを示す。データは平均値±s.e.m.（n≧3）として表される。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000076
項目S6。miR-21を標的にする化合物の選択性の分析。a、1（10μM、オレンジ色）、2（1μM、青色）、または5（0.05μM、緑色）によって処理されたMDA-MB-231における定量化可能なmiRNAを測定したボルケーノプロットのオーバーレイ。全てのケースにおいて、1％のFDRおよびS0（0.1）の分散（破線）で、miR-21は、最も有意に阻害されたmiRNAである。b、統計的ばらつきの尺度であるジニ係数（GC）を、反応選択性の尺度として適用した。ジニ係数は、キナーゼ選択性の尺度として以前に適用されており、ゼロに近い値は、選択性がほとんど乃至全くないことを示し、1に近い値は、より高い選択性を示す。即ち、非選択的阻害剤、例えば、スタウロスポリンは、0.150のGCを有するが、カイノームのうちの10種未満のキナーゼに影響を与える高度に選択的な化合物、例えば、選択的なPD184352阻害剤は、0.905のGCを有する18。RT-qPCRプロファイリング実験において測定された全てのmiRNAに適用された、示された濃度での1、2、および5についてのGCの計算は、0.52、0.68、および0.84というGCをもたらし、それは、5が最も高い選択性を有することを示している。c、miR-21と同一のAバルジおよびUバルジを含有する全ての定量化可能なmiRNAアイソフォーム33のみを示すボルケーノプロットのオーバーレイ（図S4＆S5）。d、1についてのGCは、0.31に低下し、それは、miR-21アイソフォームの間の選択性の減少を示した。2および5についてのGCは、いずれも、0.65および0.78にわずかに減少し、それは、これらの二量体化合物が、他のmiRNAアイソフォームと比べたmiR-21に対する選択性を維持することを示す。
Figure 2023500893000077
項目S7。8および9を使用した化学的架橋およびプルダウンによる単離（Chem-CLIP）分析。a、Chem-CLIP研究のために使用された構造。クロラムブシル核酸架橋モジュールおよびビオチン精製モジュールの追加は、miR-21に特異的なChem-CLIPプローブ、化合物8を与える。化合物9は、以前に合成された23、RNA結合モジュールを含まない対照化合物である。b、標的RNAを濃縮するためのChem-CLIPプルダウン、および親単量体1または二量体2による処理が、化合物が標的部位の占有について競合するため、標的RNAのプルダウンを枯渇させる、競合Chem-CLIP（C-Chem-CLIP）の模式図。c、インビトロの32P 5'末端標識プレmiR-21 WT RNAのプルダウン。8は、9と比較して、より大きいRNAの濃縮を示す。d、RT-qPCRによって測定されるように、MDA-MB-231細胞における8（10μM）の処理は、プレmiR-21転写物の濃縮を示し、それに対し、9（10μM）によっては濃縮されない。e、親単量体化合物1および二量体化合物2による競合によって、濃縮が枯渇する。破線は、プルダウン前の試料における相対倍率濃縮レベルを示す。この線より下の値は、プルダウン後の測定されたmiRNAのレベルの希釈（枯渇）を示す。データは、平均値±s.e.m.（n≧3）で表される。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000078
項目S8。ブレオマイシンA5切断モジュールが追加された親二量体（10）は、インビトロでプレmiR-21結合部位をマッピングする。a、（黄色で強調された）核酸を切断する天然生成物ブレオマイシンA5に追加された2は、プレmiR-21切断を可能にする化合物10を与える。b、RNAに適用された切断による低分子核酸プロファイリング（Ribo-SNAP）をインビトロで実施した。10の用量応答処理による32P 5'末端標識プリmiR-21 RNAのマッピングは、化合物が、示された部位（色付きボックス）におけるRT停止を誘導することを示した。c、プレmiR-21二次構造において、黄色、緑色、紫色、および青色のボックスによって示される4つの異なるRT停止領域が、インビトロでマッピングされた。全てのRT停止部位が、2の予測された結合部位（Aバルジ、Uバルジ、およびヘアピン領域）の近位にあり、そのことから、インビトロでの二量体の選択的結合が示唆された。d、インビトロで10によってプレmiR-21において誘導されたRT停止の定量化。A、U、G、およびCのシーケンシングラダーは、3:1のddNTP/dNTP比を使用することによって生成された。「Fe」レーンは、化合物添加なしの鉄の添加を示し、「（-）」は、未処理のRNAを示す。＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000079
項目S9。10によるMDA-MB-231細胞におけるプレmiR-21の切断。a、親二量体2、またはブレオマイシンA5が追加された親二量体10によるMDA-MB-231細胞の処理は、RT-qPCRによって測定されるように、成熟miR-21レベルを減少させる。b、10によるMDA-MB-231細胞の処理は、RT-qPCRによって測定されるように、プレmiR-21を切断し、そのレベルを減少させたが、親二量体2は、プレmiR 21のレベルを押し上げた。破線は、ビヒクル対照の相対RNA存在量レベルを表す。＊p＜0.05（両側スチューデントt検定によって測定された、ビヒクルの値との比較）。
Figure 2023500893000080
項目S10。細胞における10によるRibo-SNAPは切断を介して低分子結合部位を示す。a、10による切断を介して低分子結合部位を同定するための増幅アプローチのスキーム。b、配列決定データの分析は、未処理の試料に対して、（プリmiR-21二次構造において赤色で示される）切断部位を明らかにした；リードの57％（12/21リード）が最初のC（5'）で停止し；リードの14％（3/21リード）が2番目のA（3'）で停止し；リードの29％（6/21リード）が3番目のA（3'）で停止する。細胞切断部位は、インビトロで観察された最初のRT停止部位に相当する（図S8）。c、切断されたRNAのcDNAからの代表的なサンガー配列決定の結果。切断部位は赤色ボックスによって示される。
Figure 2023500893000081
項目S11。成熟miR-21の低分子による阻害の、下流タンパク質レベルに対する効果。a、PTEN 3'UTRルシフェラーゼレポーターアッセイ25,26のスキーム。成熟miR-21-5pのシード配列に対応する結合部位を提示するPTENの3'UTRを含有するルシフェラーゼレポーターが、細胞にトランスフェクトされる。モックトランスフェクトされた細胞またはスクランブルLNA（スクランブル）によって処理された細胞において、ルシフェラーゼシグナルは、成熟miR-21-5pの基底レベルによって阻害される。2またはmiR-21-5pを標的にするロックド核酸（LNA-21）による化合物処理によって、成熟miR-21-5pレベルが減少し、ルシフェラーゼシグナルの増加がもたらされる。b、2およびLNA-21の処置は、PTENルシフェラーゼシグナルを、モック対照またはスクランブル対照と比べて、およそ1.5倍増加させた。c、2または5の処理は、βアクチンと比べて、ウエスタンブロットによって測定されるMDA-MB-231細胞におけるPDCD4タンパク質のレベルを抑制解除する。d、化合物処理によるPDCD4抑制解除の定量化。破線は、モック試料における正規化されたPTENルシフェラーゼシグナルのレベルまたはビヒクル試料における相対PDCD4発現を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000082
項目S12。様々な細胞株における2の適用は、成熟miR-21レベルを減少させることによって、浸潤表現型を阻害する。上、様々な細胞株における、化合物によって処理した場合および処理しなかった場合の浸潤の代表的な画像。下、MDA-MB-231、MDA-LM2、A549、およびA375に対するLNA-21（100nM）または2（1000nM）による化合物処理は、浸潤表現型を減少させた。破線は、ビヒクルによって処理された試料における正規化された浸潤を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000083
項目S13。RNase LリクルートメントモジュールとしてのC1-3（3）を同定するための低分子のスクリーニング。a、5'末端がFAMで標識され、3'末端がブラックホールクエンチャー（BHQ）15で標識されたモデルRNAを使用したインビトロ蛍光回収アッセイのスキーム。化合物による二量体化によって、モデルRNAを切断し、BHQを分離するようRNase Lが活性化され、従って、FAMの蛍光が回収される。b、以前に使用された低分子RNase LリクルーターC1およびC215の構造。c、インビトロ蛍光回収アッセイのために使用された親C1（C1シリーズ、青色）およびC2（C2シリーズ、緑色）に基づく医薬最適化（medicinal optimization）の化合物構造。d、モデルRNA構築物を使用した130μMのC1およびC2の誘導体化合物の蛍光回収のスクリーニング。化合物C1-3（3、赤色丸）は、親C1（青色丸）および親C2（緑色三角）と比較して減少した活性を示した。化合物C1-4（4、藍緑色丸）は、3と構造的に類似しているが、RNase Lの不活性リクルーターである。e、親C1、親C2、3（C1-3）、および4（C1-4）の用量応答測定は、3（C1-3）が、RNase Lの最も高活性の活性化剤であることを明らかにした。
Figure 2023500893000084
項目S14。化合物3が追加された2（5）のインビトロ特徴決定。a、プレmiR-21標識FRETセンサーを使用したインビトロ蛍光切断は、5処理による切断の用量応答増加を示した。b、5処理によるRNase Lのインビトロオリゴマー化。破線は、ビヒクル試料におけるオリゴマー化を示す。c、5およびRNase Lの処理による標識されたプレmiR-21 WT RNAのゲルマッピング。切断は、U27（赤色ボックス）、G25（青色ボックス）、C23（紫色ボックス）、およびG21（緑色ボックス）において観察された。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000085
項目S15。miR-21を標的にする化合物の効力。a、RT-qPCRによって測定された96時間までの2（1000nM）および5（50nM）の処置によるMDA-MB-231におけるmiR-21の阻害。b、MDA-MB-231細胞における、ダイサー部位に結合する化合物を通したバイオジェネシスの阻害（2）、ブレオマイシンを通したプレmiR-21切断（10）、およびRNase Lリクルートメントを通した酵素的切断（5）による、miR-21のダウンレギュレーション。c、RT-qPCR分析によって示された成熟miR-21レベルの減少は、5によってmiR-21を標的にすることが、細胞株に広く適用可能であることを示した。破線は、ビヒクル試料中の相対RNA存在量を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000086
項目S16。25によるプレmiR-210の切断。a、プレmiR-210のダイサー部位に結合する以前に研究された化合物2631に、RNase Lリクルートモジュール3が追加されたものである、25の化合物構造。b、25処理後の低酸素MDA-MB-231細胞におけるプレmiR-210発現のRT-qPCR分析。化合物26は、プレmiR-21のレベルを押し上げる。c、25処理後の低酸素MDA-MB-231細胞における成熟miR-210発現のRT-qPCR分析。化合物26は、プレmiR-210のダイサー部位に結合し、成熟miR-210バイオジェネシスを阻害することによって、成熟miR-210レベルを阻害する。破線は、ビヒクル試料中のRNA存在量を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000087
項目S17。5処理による自然免疫応答。a、化合物5（50nM）によるMDA-MB-231細胞の処理および2'-5'A4（500nM）のトランスフェクションによる抗ウイルス自然免疫応答に関連したmRNAのレベルを測定するため、RT-qPCRを実行した。5処理によって、これらのマーカーのアップレギュレーションは観察されなかったが、2'-5'A4のトランスフェクションによって、Ifng、OAS1、RIG-I、およびMDA5の有意なアップレギュレーションが観察された。破線は、ビヒクルによって処理された試料におけるRNAの存在量を示す。b、IFNγのELISAは、5処理によって自然抗ウイルス免疫応答が活性化されないことを示した、2'-5'A4は、500nMによるトランスフェクションを示す（RNase Lによって仲介される抗ウイルス自然免疫応答についての陽性対照）。正規化されたIFNγは、ビヒクルによって処理された試料におけるタンパク質レベル（pg/mL）が1の値に正規化されることを示す。破線は、1に正規化されたビヒクル試料中のタンパク質の存在量を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000088
項目S18。大量のヒトRNAの間の5の細胞選択性。48時間後の、MDA-MB-231細胞における、5処理（50nM）による、トランスクリプトームの多様な集団に及ぶリボソーム（r）RNA、低分子（s）RNA、転移（t）RNA、およびメッセンジャー（m）RNAを含む、高度に大量の転写物のRT-qPCRプロファイリング。破線は、ビヒクルによって処理された試料におけるRNAの存在量を示す。
Figure 2023500893000089
項目S19。5による複数の細胞株における浸潤表現型の減少。a、5によるMDA-MB-231における浸潤の有意な減少は、プレmiR-21の一過性発現によって除去される（+プレmiR-21、黄色ボックス）。b、5処理による浸潤の類似の減少は、A375細胞株およびA549細胞株においても観察される。c、健常乳房細胞の代表であるMCF-10aは、プレmiR-21の一過性過剰発現によってのみ浸潤性になった（黄色ボックス）。LNA-21または5のいずれかによる処理は、プレmiR-21の過剰発現によって誘導される浸潤を減少させた。破線は、ビヒクル試料における正規化された浸潤を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（両側スチューデントt検定による測定）。
Figure 2023500893000090
項目S21。網羅的プロテオミクスにおいて観察された5のオンターゲット効果。保存された部位を含有するmiR-21-5p（n＝382）およびmiR-let-7-5p（n＝1207）の下流タンパク質標的を予測するため、TargetScanHuman v7.2を使用した。miR-21-5p標的のおよそ25％（95/382）およびmiR-let-7-5p標的の20％（241/1207）が、網羅的プロテオミクス分析において検出可能であった。予測された標的の上位およそ50％を、それぞれ、miR-let-5p標的またはmiR-21-5p標的において、＜-0.25または＜-0.15の重み付きコンテクスト（weighted context）++スコアによって表される累積分布を計算するために使用した。重み付きコンテクスト++スコアは、miRNAと標的遺伝子との間の様々な特徴（部位の型、局所AU、最小距離、6/7/8マー（mer）シードマッチ等）の重み付きの寄与の合計に基づき、部位の予測された効力を表す17。5によって処理された試料またはビヒクルによって処理された試料におけるタンパク質の倍率変化の累積分布プロットは、全タンパク質（黒色）の累積分布と比べて、miR-21-5p標的のみの有意なアップレギュレーションを示し（緑色）、miR-let-7-5p標的による有意な変化は観察されなかった（赤色）。miR-let-7-5pは、MDA-MB-231細胞におけるmiR-21-5pと類似の発現レベルを有するmiRであるため、miR-let-7-5pの標的が比較として使用された。分布間のp値は、両側コルモゴロフを使用して計算された。
Figure 2023500893000091
項目S22。インビボの5処理によるマウスの体重および肺小結節のスクランブルFISH染色。a、C57BL/6マウス（n＝3）における5による処理（i.p.、10mg/kg）後のマウス血漿中の5の検出。b、NOD/SCIDマウスにMDA-MB-231-Luc細胞をi.v.尾静脈注射した。10mg/kgの5によるマウスの処理を、腫瘍細胞注射の6日後に開始した。42日間にわたり、5処理は、ビヒクルによって処理されたマウスと比較して、有意な体重変化を引き起こさなかった。b、スクランブルFISHプローブ（陰性対照LNA）による肺組織の組織学は、ビヒクルおよび5の処理によって、ほとんどまたは全く染色を示さなかった。破線は、ビヒクル試料における正規化されたシグナル強度を示す。
Figure 2023500893000092
項目S23。インビボの5処理によるMDA-MB-231肺小結節転移。ブアン固定液で染色された、剖検後の、ビヒクル（10/10/80 DMSO/ツイーン80/水）および5によって処理され、PBSによって灌流された肺。肺小結節転移は、肺の表面上に白色小結節として観察され得る。
表
（表S1）24時間処理後の5の触媒活性の測定。データは平均値±s.d.（n＝6）として表される。
Figure 2023500893000093
a「切断されたプレmiR-21」とは、未処理の試料における平均プレmiR-21と、500nMによって処理された試料における平均プレmiR-21との差である。
b「ターンオーバー」とは、細胞における「切断されたプレmiR-21（pmol）」と「検出された5（pmol）」との比であり、触媒作用を表す。
参照
Figure 2023500893000094
Figure 2023500893000095
Figure 2023500893000096
Figure 2023500893000097
Figure 2023500893000098
概況説明
本明細書および特許請求の範囲に記載された本発明、例、生物学的アッセイ、および結果は、本願において示された、または記載された、または言及されたものを含むが、それらに限定されるわけではない属性および態様を有し得る。
本明細書において言及された、または記述された特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、ならびにその他の文書および材料は、全て、本発明が属する技術分野の当業者の技術のレベルを示すものであり、そのような言及された文書および材料は、本明細書に逐語的に組み入れられ、その全体が示されたのと同程度に、各々、参照により本明細書に組み入れられる。そのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に入手可能な情報、参考書、またはその他の言及された材料もしくは文書からの全ての任意の材料および情報を、本明細書に物理的に組み入れる権利は、保存されている。
本特許出願の説明文書には、全ての請求項が含まれる。全ての最初の請求項を含む全ての請求項が、本明細書の説明文書部分に、参照によりその全体が組み入れられ、全ての任意のそのような請求項を本願の説明文書または任意のその他の部分に物理的に組み入れる権利は、保存されている。従って、例えば、いかなる状況においても、請求項の正確な語法が、特許の説明文書部分にその通りに示されていないという主張による申し立てにより、特許が請求項についての説明文書を提供していないとは解釈され得ない。
本発明は、その詳細な説明と共に記載されたが、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するためのものであって、制限するためのものではい。従って、本発明の具体的な非限定的な態様が、例示のために本明細書に記載されたが、本発明の本旨および範囲を逸脱することなく、様々な修飾がなされ得ることが、上記から理解されるであろう。他の局面、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内であり、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
本明細書に記載された具体的な方法および組成物は、好ましい非限定的な態様を代表するものであり、例示的なものであり、本発明の範囲に対する限定として意図されない。本明細書を考慮することによって、当業者は、他の目的、局面、および態様に想到するであろうが、それらは、特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の本旨に包含される。本発明の範囲および本旨を逸脱することなく、様々な置換および修飾が、本明細書に開示された本発明に対してなされ得ることは、当業者に容易に明らかであろう。本明細書に例示的に記載された本発明は、必須であると本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または限定の非存在下で実施され得る。従って、例えば、本明細書中の各状況において、本発明の非限定的な態様または例において、「含む（comprising）」、「含む（incuding）」、「含有する（containing）」等の用語は、拡張的に、非限定的に解釈されるべきである。本明細書において例示的に記載された方法および過程は、工程の異なる順序で適切に実施され得、それらは、本明細書または特許請求の範囲に示された工程の順序に必ずしも制約されない。
利用された用語および表現は、限定のためではなく、説明のために使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され、記載された特徴またはそれらの一部分の等価物を排除する意図は存在せず、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で、様々な修飾が可能であることが認識される。従って、本発明は、様々な非限定的な態様および/または好ましい非限定的な態様および任意選択の特徴によって具体的に開示されたが、当業者によって再分類され得る、本明細書に開示された概念の全ての任意の修飾および変動が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲に含まれると見なされることが理解されるであろう。
本発明は、本明細書において、広範に、総括的に記載された。属による（generic）開示に含まれる、より狭い種（species）および亜群（subgeneric grouping）も、本発明の一部を形成する。これには、削除される材料が本明細書に具体的に記載されるか否かに関わらず、属から任意の主題を除去する条件または否定的な限定を伴う、本発明の属による開示が含まれる。

Claims (54)

  1. 式1および薬学的に許容されるその塩を含む、化合物：
    Figure 2023500893000099
    式中、R8は水素またはメチルであり、R9はヒドロキシル、H2N-(CH2)q-NH-、またはN3-(CH2)q-NH-であり、指定子qは2～6の整数であり、指定子rは2～6の整数である。
  2. R8がメチルであり、R9がN3-(CH2)q-NH-であり、rが3である、請求項1記載の化合物を含むRNAプレmiR-21阻害化合物。
  3. qが3である、請求項2記載のRNAプレmiR-21阻害化合物。
  4. 式2および薬学的に許容されるその塩を含む、請求項1記載の化合物の連結された二量体：
    Figure 2023500893000100
    式中、
    Lは、
    モノメチレン基、ジメチレン基、トリメチレン基、またはテトラメチレン基を通してトリアゾリル基と結合している、末端グリシン残基の窒素と、
    1～3炭素のアルキルによって置換されている、非末端グリシン残基の窒素と
    を有する、3～8グリシン残基のオリゴマーアミドリガンドであり、
    該オリゴマーアミドリガンドのアミン末端は、2～4炭素のアシル基でアシル化されており、
    該オリゴマーアミドリガンドのカルボキシル末端は、1～3炭素のアルカノールでエステル化されているか、または1～3炭素のアルキルモノアミンもしくは2～6炭素のアルキルジアミンでアミド化されているか、またはヌクレアーゼリクルートメント部分でエステル化もしくはアミド化されており、
    指定子rは2～6の整数であり、
    指定子sは2～6の整数である。
  5. 各指定子rが3であり、各指定子sが3であり、リガンドLがモノメチレン基によって各トリアゾール基と結合している、請求項4記載の連結された二量体。
  6. 式C1および薬学的に許容されるその塩を含む、リクルートメント分子：
    Figure 2023500893000101
    式中、R1は1～3炭素のアルキルであり、R2は水素またはフルオロであり、R3はヒドロキシルであり、R4はメトキシまたはヒドロキシであり、R5は水素またはメトキシである。
  7. R3がヒドロキシルであり、R5が水素またはメトキシであり、R4がメトキシであり、R2が水素であり、R1がエチルである、請求項6記載のリクルートメント分子。
  8. Lが式L-1を含む、請求項4記載の連結された二量体：
    Figure 2023500893000102
    式中、Myは、N(My)の窒素を式2のトリアゾール基と接続するオリゴメチレニル(-CH2-)t基であり、R10は1～4炭素のアルキルであり、R11は水素またはアセチルであり、Nrは水素、ヌクレアーゼリクルートメント部分、またはヌクレアーゼ切断部分であり、EGはエチレングリコール部分であり、Yは酸素または-NH-であり、指定子mは1～6の整数であり、指定子nは1～4の整数であり、指定子oはゼロまたは1であり、指定子pは1～6の整数であり、指定子tは1～4の整数である。
  9. Yが-NH-であり、Nrが請求項6または7記載のリクルートメント分子であり、ここで、R3がヒドロキシであり、R4が、EGと結合しているメトキシの酸素残基であり、R5が水素であり、指定子mが2、3、または4であり、指定子nが2であり、指定子oが1であり、指定子pが3または4であり、指定子tが1である、請求項8記載の連結された二量体。
  10. 指定子mが4であり、指定子pが3である、請求項9記載の連結された二量体。
  11. 指定子oがゼロであり、Yが-NH-であり、Nrがブレオマイシンであり、ブレオマイシンのS,S-ジメチル-3-チオプロパ-1-イルアミノ基がα-アミノ-3-アザヘプチル基に変更されており、そのαアミン基がブレオマイシンの末端カルボキシルと結合しており、アザヘプチル部分のメチレニル末端が式L-1のYと結合している、請求項8記載の連結された二量体。
  12. 式20を含むリガンド前駆体：
    Figure 2023500893000103
    式中、Xは水素、ヒドロキシル、またはアミノであり、Yは酸素または-NH-であり、指定子nは1～4の整数であり、指定子oはゼロまたは1であり、指定子pは1～6の整数であり、R10は1～4炭素のアルキルであり、R11は水素またはアセチルであり、Alyは式21のアルキニル
    Figure 2023500893000104
    であり、式中、指定子tは1～4の整数である。
  13. tが1である、請求項12記載のリガンド前駆体。
  14. 式5および薬学的に許容されるその塩を含む、化合物：
    Figure 2023500893000105
    式中、指定子mは4であり、R8は水素またはメチルである。
  15. プレmiR-21阻害剤であり、かつプレmiR-21の分解のためのヌクレアーゼ誘導剤である、請求項14記載の化合物。
  16. 請求項12記載のリガンド前駆体と、アジドアルキルアミノ（N3-(CH2)q-NH-）であるR9を有し指定子qが2～6の整数である請求項1記載の化合物とを、触媒的に結合させる工程を含む、請求項2記載の連結された二量体の調製のための方法。
  17. tが1である、請求項16記載の方法。
  18. 薬学的に許容される担体と、RNAプレmiR-21活性の阻害のために有効である量の請求項1～5、8～11、14、もしくは15のいずれか一項記載の化合物または薬学的に許容されるその塩とを含む、薬学的組成物。
  19. 薬学的に許容される担体と、RNAプレmiR-21活性の阻害およびプレmiR-21のヌクレアーゼ分解の誘導のために有効である量の請求項14記載の化合物または薬学的に許容されるその塩とを含む、薬学的組成物。
  20. 有効量の請求項18または19記載の薬学的組成物を患者へ投与する工程を含む、患者におけるRNAプレmiR-21活性を減少させるための方法。
  21. 有効量の請求項18または19記載の薬学的組成物を患者へ投与する工程を含む、患者における乳癌、肺癌、膵臓癌、またはメラノーマの処置のための方法。
  22. 有効量の請求項18または19記載の薬学的組成物を患者へ投与する工程を含む、患者における癌の処置のための方法であって、患者の癌細胞がmiR-21 RNA活性および/またはプレmiR-21発現を示す、前記方法。
  23. 請求項18または19記載の薬学的組成物を患者へ投与する工程を含む、患者の、異常なmiR-21 RNA活性によって仲介される疾患の処置のための方法。
  24. 請求項18または19記載の薬学的組成物が、公知の抗癌薬の投与と同時に、投与と連続的に、投与の後に、または投与の前に、併用投与される、請求項20～22のいずれか一項記載の方法。
  25. 薬学的組成物が、薬学的に許容される担体および請求項14記載の化合物である、請求項20～24のいずれか一項記載の方法。
  26. 結合したRNA分子を有するマイクロアレイ部位を提供するために、RNA分子のRNAモチーフライブラリを、有機低分子化合物のライブラリを含有するゲルのマイクロアレイに適用する工程であって、別々の位置が個々の低分子化合物のアイデンティティを提供するように低分子化合物が個々に別々にゲル上に位置している工程、
    マイクロアレイ上のRNA分子の結合部位をマッピングする工程、
    結合した低分子化合物のマップを提供するために、結合したRNA分子のマップを、結合部位における低分子化合物のアイデンティティと相関させる工程、
    マッピングされた低分子化合物の少なくとも一部、好ましくは少なくとも20パーセント、より好ましくは少なくとも30パーセント、および最も好ましくは40パーセントに共通である、マッピングされた低分子化合物の化学構造特徴を同定する工程
    を含む、RNA標的のバリデーションおよびプロファイリングのための方法。
  27. 有機低分子化合物のライブラリが公知のライブラリである、請求項26記載の方法。
  28. 有機低分子化合物のライブラリが、有機低分子化合物の以前のまたは公知のライブラリに適用された請求項26記載の方法の使用によって同定された化学構造特徴を組み込んでいる、合成された有機低分子化合物のライブラリである、請求項26記載の方法。
  29. 発癌性非翻訳RNA前駆体を発現する細胞を、請求項18または19記載の薬学的組成物と接触させる工程を含む、該非翻訳RNA前駆体を標的にすることによる細胞破壊の方法。
  30. 発癌性非翻訳RNA前駆体を発現する細胞と、請求項18または19記載の薬学的組成物とを接触させる工程を含む、該非翻訳RNA前駆体を標的にする工程を含む、細胞破壊の方法。
  31. 薬学的組成物が請求項4記載の式2の化合物を含み、式2のLのカルボキシル末端がアルキルエステルまたはアルキルアミドである、請求項30記載の方法。
  32. 薬学的組成物が請求項4記載の式2の化合物を含み、式2のカルボキシル末端LがNu置換を有する、請求項30記載の方法。
  33. Nuが式C1である、請求項32記載の方法。
  34. 発癌性非翻訳RNA前駆体が発癌性プレマイクロRNA-21（プレmiR-21）を含む、請求項29～33のいずれか一項記載の方法。
  35. 乳癌、肺癌、膵臓癌、メラノーマ、またはmiR-21によって仲介される癌の細胞を請求項18または19記載の薬学的組成物と接触させる工程を含む、該細胞におけるPTENタンパク質の発現を増強する工程を含む、請求項29～34のいずれか一項記載の方法。
  36. 乳癌、肺癌、膵臓癌、メラノーマ、またはmiR-21によって仲介される癌の細胞を請求項18または19記載の薬学的組成物と接触させる工程を含む、該細胞におけるPDCD4タンパク質の発現を増強する工程を含む、請求項29～34のいずれか一項記載の方法。
  37. 癌細胞がヒト患者に存在する、請求項35または36記載の方法。
  38. 薬学的組成物が式2の化合物を含み、式2がNuを含み、Nuが、Lと共有結合した式C1であるか、または化合物が式5である、請求項29～37のいずれか一項記載の方法。
  39. 三種陰性乳癌細胞を請求項18記載の薬学的組成物と接触させることによって該細胞における浸潤を阻害する工程を含み、該薬学的組成物が式2の化合物を含み、ここで、式2のLがNuによって置換されており、NuがLと共有結合した式C1である、請求項29～38のいずれか一項記載の方法。
  40. 乳癌細胞がヒト患者に存在する、請求項39記載の方法。
  41. 請求項18または19記載の薬学的組成物を三種陰性乳癌に罹患した患者へ投与する工程を含む、三種陰性乳癌を処置する工程を含む、請求項29～38のいずれか一項記載の方法。
  42. 乳癌が発癌性前駆体マイクロRNA-21（プレmiR-21）の発現を含む、請求項41記載の方法。
  43. 化合物が式2であり、式LのLがNuによって置換されており、Nuが式C1である、請求項42記載の方法。
  44. RNAライブラリがトランスクリプトームを含む、請求項26記載の方法。
  45. トランスクリプトームがウイルスのものである、請求項44記載の方法。
  46. トランスクリプトームが哺乳動物のものである、請求項44記載の方法。
  47. トランスクリプトームが細菌のものである、請求項44記載の方法。
  48. RNAライブラリが合成RNA、半合成RNA、または天然RNAのうちの1つまたは複数を含む、請求項26記載の方法。
  49. RNAライブラリがRNAウイルスのゲノムを含む、請求項26記載の方法。
  50. インビトロで実施される、請求項26～28のいずれか一項記載の方法。
  51. 生細胞において実施される、請求項26～28のいずれか一項記載の方法。
  52. 細胞がウイルスまたは細菌に感染した細胞である、請求項51記載の方法。
  53. 薬学的に許容される担体と、ヌクレアーゼリクルートメントおよび/またはヌクレアーゼ分解のために有効である量の請求項6もしくは7記載の化合物または薬学的に許容されるその塩とを含む、薬学的組成物。
  54. 有効用量の請求項53記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、ヌクレアーゼリクルートメントおよび/または分解を達成する方法。
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