JP2023182656A

JP2023182656A - Ｃｄ３結合タンパク質の投薬レジメン

Info

Publication number: JP2023182656A
Application number: JP2023164168A
Authority: JP
Inventors: ジャンマリゲノ; Guenot Jeanmarie; エリックフェルドマン; Feldman Eric; テハン; Tae Han
Original assignee: Amphivena Therapeutics Inc
Current assignee: Amphivena Therapeutics Inc
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2023-09-27
Publication date: 2023-12-26
Also published as: US20200262920A1; EP3694553A1; JP2020536969A; EP3694553A4; WO2019075413A1

Abstract

【課題】がんの処置のための方法を提供する。【解決手段】標的細胞上に発現する抗原とT細胞上に発現する抗原とに、例えばヒトCD33とヒトCD3とに特異的に結合する二重特異性結合タンパク質、ならびに急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)、および固形腫瘍がんなどのがん、疾患、および状態の免疫療法のための治療的に有効な投薬レジメンが本明細書において記述される。【選択図】図１９

Description

相互参照
本出願は、2017年10月12日付で出願された米国仮特許出願第62/571,755号および2017年10月12日付で出願された同第62/571,767号の恩典を主張するものであり、このどちらも参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

発明の背景
CD3は、5つの鎖: 2つのCD3ε、CD3γ、CD3δ、およびCD3ζからなる多分子T細胞受容体複合体の一部としてヒトT細胞上にする抗原を意味する。例えば抗CD3抗体によるT細胞上のCD3のクラスタリングは、抗原の結合と同様のT細胞活性化をもたらすが、T細胞サブセットのクローン特異性とは無関係である。

CD33は、骨髄性細胞に特異的な膜貫通型細胞表面糖タンパク質受容体である。CD33抗原は、白血病性幹細胞を含むAML骨髄芽球のおよそ90%で発現し、また他の骨髄増殖性疾患の細胞上で発現する。ゲムツズマブオゾガマイシンを用いた研究により、抗体に基づく治療用物質の標的としてCD33が検証されたが; しかしながら、多くの患者は抗体に基づく薬物コンジュゲートから利益を得ることができていないため、CD33を標的として用いるが、T細胞リダイレクションのような異なる死滅機構を採用する他のアプローチの方が効果的でありうる。

本明細書において提供されるのは、1つの局面において、それを必要とする対象に血中の最大濃度(C_最大)を1日～28日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法である。別の局面において、それを必要とする対象に血中の最大濃度(C_最大)を1日～28日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法が本明細書において提供される。いくつかの態様において、投与の用量および頻度は、定常状態濃度(C_ss)を1日～28日間で達成するのに十分である。

いくつかの態様において、タンパク質は、連続用量、間欠用量、単回用量、複数回用量、またはそれらの組み合わせとして投与される。他の態様において、タンパク質は、1日あたり約0.5 μg～約3000 μgの連続用量として投与される。さらに他の態様において、投与は、少なくとも1時間、1日、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、または少なくとも12週間の期間にわたる。

いくつかの態様において、投与によって約20 pg/mL～約20000 pg/mLのC_最大が提供される。他の態様において、投与によって約20 pg/mL～約20000 pg/mLのC_ssが提供される。他の態様において、投与によって約200日^＊pg/mL～約600000日^＊pg/mLのAUCが提供される。

いくつかの態様において、投与は静脈内、筋肉内、病巣内、局所、または皮下である。いくつかの態様において、投与はボーラス注入または持続注入による。

いくつかの態様において、投与によって1日～28日間にわたる漸進的なT細胞または単球の活性化が提供される。他の態様において、投与によって1日～28日間にわたる漸進的なサイトカイン放出が提供される。ある特定の例において、サイトカインはTNFα、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、またはIFNγである。

さらなる態様において、投与によってC反応性タンパク質レベルが低減する。ある特定の例において、投与によって単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、または血小板のレベルが増加する。他の例において、投与によって好中球レベルが増加する。他の例において、投与によって赤血球レベルが増加する。

さらなる態様において、投与によって骨髄芽球が低減する。さらなる態様において、投与によって骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)が低減する。

いくつかの態様において、がんは白血病またはリンパ腫である。いくつかの態様において、がんは固形腫瘍がんである。いくつかの態様において、標的抗原は、EGFR、HER2、HER3、EGFRviii、PSMA、BCMA、CD19、MSLN、CD123、CD33、EpCAM、c-MET、CEA、cd79b、CD66、CD30、EphA2、CSPG4、DLL3、またはVEGFである。

いくつかの態様において、がんは、CD33を発現する細胞を有する。他の態様において、腫瘍微小環境は、CD33を発現する細胞を有する。いくつかの例において、がんは、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、前駆B細胞リンパ芽球性白血病、骨髄肉腫、多発性骨髄腫、急性リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫、骨髄異形成症候群(MDS)、骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、膵臓がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、乳がん、肺がん、肝臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん（stomach cancer）、膀胱がん、腸がん、精巣がん、子宮がん、口腔がん、鼻咽頭がん、皮膚がん、腎がん、神経膠芽腫、星細胞腫、上皮がん、骨がん、中皮腫、および黒色腫である。いくつかの例において、がんは固形腫瘍がんである。いくつかの例において、がんはAMLまたはMDSである。さらなる例において、AMLは再発性または難治性である。さらなる例において、MDSは再発性または難治性である。

本明細書において提供されるのは、別の局面において、それを必要とする対象に対して血中の最大濃度(C_最大)を1日～28日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3とCD33などの標的抗原とに結合するタンパク質を含む、対象における骨髄異形成症候群の処置のための方法である。

本明細書において提供されるのは、別の局面において、それを必要とする対象に対して血中の最大濃度(C_最大)を1日～28日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3とCD33などの標的抗原とに結合するタンパク質を含む、対象における骨髄増殖性疾患の処置のための方法である。

本明細書において提供されるのは、別の局面において、それを必要とする対象に対して血中の最大濃度(C_最大)を1日～28日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3とCD33などの標的抗原とに結合するタンパク質を含む、対象における骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)による免疫抑制または炎症の処置のための方法である。

本明細書において提供されるのは、別の局面において、それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～28日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3とCD33などの標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるMDSCを低減させるための方法である。

本明細書において提供されるのは、別の局面において、それを必要とする対象に、対象におけるMDSCを低減させるのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3とCD33などの標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法である。

上記の局面のいずれかにおいて、タンパク質は抗体または抗体誘導体である。上記の局面のいずれかにおいて、タンパク質はFab、Fab'、またはF(ab')₂ 断片を含む。上記の局面のいずれかにおいて、タンパク質は、一本鎖Fv、タンデム一本鎖Fv、二重特異性T細胞エンゲージャ、二重親和性再標的化抗体、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャ、またはタンデムダイアボディを含む。

上記の局面のいずれかにおいて、タンパク質は二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャである。いくつかの態様において、タンパク質は、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む、二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャであり、各ポリペプチドが、順々に連結された少なくとも4つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドが、
(i) 標的抗原に特異的な可変重鎖(VH)ドメイン;
(ii) 標的抗原に特異的な可変軽鎖(VL)ドメイン;
(iii) ヒトCD3に特異的なVHドメイン; および
(iv) ヒトCD3に特異的なVLドメイン
を含む。

いくつかの例では、各ポリペプチドにおいて、4つの可変鎖ドメインは、
VL(CD3)-L1-VH(標的抗原)-L2-VL(標的抗原)-L3-VH(CD3);
VH(CD3)-L1-VL(標的抗原)-L2-VH(標的抗原)-L3-VL(CD3);
VL(標的抗原)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(標的抗原); または
VH(標的抗原)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(標的抗原)
の順序で、ペプチドリンカーL1、L2、およびL3によって順々に連結されている。

いくつかの態様において、二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャは第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、順々に連結された少なくとも4つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドが、
(v) ヒトCD33に特異的な可変重鎖(VH)ドメイン;
(vi) ヒトCD33に特異的な可変軽鎖(VL)ドメイン;
(vii) ヒトCD3に特異的なVHドメイン; および
(viii) ヒトCD3に特異的なVLドメイン
を含む。

いくつかの例では、各ポリペプチドにおいて、4つの可変鎖ドメインは、
VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3);
VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3);
VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); または
VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)
の順序で、ペプチドリンカーL1、L2、およびL3によって順々に連結されている。

いくつかの例において、ヒトCD33に特異的なVLドメインは、SEQ ID NO:21～27からなる群より選択される配列からなるCDR1、SEQ ID NO:28～34からなる群より選択される配列からなるCDR2、およびSEQ ID NO:35～41からなる群の配列からなるCDR3を含む。

いくつかの例において、ヒトCD33に特異的なVHドメインは、SEQ ID NO:42～48からなる群より選択される配列からなるCDR1、SEQ ID NO:49～55からなる群より選択される配列からなるCDR2、およびSEQ ID NO:56～63からなる群より選択される配列からなるCDR3を含む。

いくつかの例において、ヒトCD33に特異的なVLドメインのCDR1、CDR2、およびCDR3は、
(i) SEQ ID NO:21、28、および35;
(ii) SEQ ID NO:22、29、および36;
(iii) SEQ ID NO:23、30、および37;
(iv) SEQ ID NO:24、31、および38;
(v) SEQ ID NO:25、32、および39;
(vi) SEQ ID NO:26、33、および40; ならびに
(vii) SEQ ID NO:27、34、および41
からなる群より選択される配列である。

いくつかの例において、CD33に特異的なVHドメインのCDR1、CDR2、およびCDR3は、
(i) SEQ ID NO:42、49、および56;
(ii) SEQ ID NO:43、50、および57;
(iii) SEQ ID NO:43、50、および58;
(iv) SEQ ID NO:43、50、および59;
(v) SEQ ID NO:43、50、および60;
(vi) SEQ ID NO:44、51、および61;
(vii) SEQ ID NO:45、52、および62;
(viii) SEQ ID NO:46、53、および63;
(ix) SEQ ID NO:47、54、および63; ならびに
(x) SEQ ID NO:48、55、および63
からなる群より選択される配列である。

いくつかの例において、CD33に特異的なVLおよびVHドメインは、
(i) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:11;
(ii) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:12;
(iii) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:13;
(iv) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:14;
(v) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:15;
(vi) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:16;
(vii) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:17;
(viii) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:18;
(ix) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:19; ならびに
(x) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:20
からなる群より選択される配列である。

いくつかの例において、ヒトCD3に特異的なVHドメインは、STYAMN (SEQ ID NO:72)のCDR1配列、

のCDR2配列、および

のCDR3配列を含む。

いくつかの例において、ヒトCD3に特異的なVLドメインは、

のCDR1配列、GTNKRAP (SEQ ID NO:91)のCDR2配列、およびALWYSNL (SEQ ID NO:92)のCDR3配列を含む。

いくつかの例において、CD3に特異的なVLおよびVHドメインは、
(i) SEQ ID NO:64およびSEQ ID NO:68;
(ii) SEQ ID NO:65およびSEQ ID NO:69;
(iii) SEQ ID NO:66およびSEQ ID NO:70; ならびに
(iv) SEQ ID NO:67およびSEQ ID NO:71
からなる群より選択される配列である。

いくつかの例において、各ポリペプチドは、
(i) SEQ ID NO:2、12、65、および69;
(ii) SEQ ID NO:3、13、65、および69;
(iii) SEQ ID NO:4、14、65、および69;
(iv) SEQ ID NO:5、15、65、および69;
(v) SEQ ID NO:1、11、64、および68;
(vi) SEQ ID NO:2、12、64、および68;
(vii) SEQ ID NO:2、12、66、および70;
(viii) SEQ ID NO:4、14、66、および70;
(ix) SEQ ID NO:5、15、66、および70;
(x) SEQ ID NO:3、13、64、および68;
(xi) SEQ ID NO:3、13、67、および71;
(xii) SEQ ID NO:4、14、64、および68;
(xiii) SEQ ID NO:5、15、64、および68;
(xiv) SEQ ID NO:7、17、64、および68;
(xv) SEQ ID NO:6、16、64、および68;
(xvi) SEQ ID NO:6、16、67、および71;
(xvii) SEQ ID NO:8、18、64、および68;
(xviii) SEQ ID NO:9、19、64、および68;
(xix) SEQ ID NO:9、19、67、および71; ならびに
(xx) SEQ ID NO:10、20、64、および68
からなる群より選択される4つの可変鎖ドメインを含む。

いくつかの例において、二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャは、SEQ ID NO:98～121からなる群より選択される配列を含む。いくつかの例において、二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャは、SEQ ID NO 123～146からなる群より選択される配列を含む。
[本発明1001]
それを必要とする対象に血中の最大濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法。
[本発明1002]
前記標的抗原がCD33である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
投与の用量および頻度が血中のC_最大を1日、3日間、または7日間で達成するのに十分である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
投与の前記用量および頻度が定常状態濃度(C_SS)を1日～21日間で達成するのに十分である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
投与の前記用量および頻度がC_SSを3日間～7日間で達成するのに十分である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記タンパク質が、連続用量、間欠用量、単回用量、複数回用量、またはそれらの組み合わせとして投与される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記タンパク質が、1日あたり約0.5 μg～約3000 μgの連続用量として投与される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記タンパク質が、1日あたり約0.5 μg、1日あたり約1.5 μg、1日あたり約5 μg、1日あたり約15 μg、1日あたり約50 μg、1日あたり約100 μg、1日あたり約150 μg、1日あたり約200 μg、1日あたり約250 μg、または1日あたり約300 μgの連続用量として投与される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記投与が、少なくとも1日、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、または少なくとも12週間の期間にわたる、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記投与が少なくとも2週間の期間にわたる、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記投与によって約20 pg/mL～約10000 pg/mLのC_最大が提供される、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記投与によって約20 pg/mL～約10000 pg/mLのC_ssが提供される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記投与によって約200日^＊pg/mL～約100000日^＊pg/mLのAUCが提供される、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記投与が静脈内、筋肉内、病巣内、局所、または皮下である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記投与がボーラス注入または持続注入による、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記投与によって、1日～21日間にわたる漸進的なT細胞または単球の活性化が提供される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記投与によって、1日～21日間にわたる漸進的なサイトカイン放出が提供される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記サイトカインが、TNFα、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、またはIFNγである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記投与によってC反応性タンパク質レベルが低減する、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記投与によって造血が増大する、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記投与によって、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、または血小板のレベルが増加する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記投与によって好中球レベルが増加する、本発明1020の方法。
[本発明1023]
前記投与によって赤血球レベルが増加する、本発明1020の方法。
[本発明1024]
前記投与によって血小板レベルが増加する、本発明1020の方法。
[本発明1025]
前記投与によって単球レベルが増加する、本発明1020の方法。
[本発明1026]
前記投与によって骨髄芽球が低減する、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記投与によって骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)が低減する、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記標的抗原が、EGFR、HER2、HER3、EGFRviii、PSMA、BCMA、CD19、MSLN、CD123、CD33、EpCAM、c-MET、CEA、cd79b、CD66、CD30、EphA2、CSPG4、DLL3、またはVEGFである、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記がんが白血病またはリンパ腫である、本発明1001の方法。
[本発明1030]
前記がんが固形腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記がんが、CD33を発現する細胞を有する、本発明1001の方法。
[本発明1032]
前記がんが、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、前駆B細胞リンパ芽球性白血病、骨髄肉腫、多発性骨髄腫、急性リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫、骨髄異形成症候群(MDS)、骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、膵臓がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、乳がん、肺がん、肝臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん（stomach cancer）、膀胱がん、腸がん、精巣がん、子宮がん、口腔がん、鼻咽頭がん、皮膚がん、腎がん、神経膠芽腫、星細胞腫、上皮がん、骨がん、中皮腫、および黒色腫である、本発明1001の方法。
[本発明1033]
前記がんがAMLまたはMDSである、本発明1001の方法。
[本発明1034]
前記AMLが再発性または難治性である、本発明1026の方法。
[本発明1035]
前記タンパク質が抗体または抗体誘導体である、本発明1001の方法。
[本発明1036]
前記タンパク質がFab、Fab'、またはF(ab')₂ 断片を含む、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記タンパク質が、一本鎖Fv、タンデム一本鎖Fv、二重特異性T細胞エンゲージャ、二重親和性再標的化抗体、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャ、またはタンデムダイアボディを含む、本発明1001の方法。
[本発明1038]
前記タンパク質が二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャである、本発明1001の方法。
[本発明1039]
前記二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャが第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、順々に連結された少なくとも4つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドが、
(i) 前記標的抗原に特異的な可変重鎖(VH)ドメイン;
(ii) 該標的抗原に特異的な可変軽鎖(VL)ドメイン;
(iii) ヒトCD3に特異的なVHドメイン; および
(iv) ヒトCD3に特異的なVLドメイン
を含む、本発明1031の方法。
[本発明1040]
各ポリペプチドにおいて、前記4つの可変鎖ドメインが、
VL(CD3)-L1-VH(標的抗原)-L2-VL(標的抗原)-L3-VH(CD3);
VH(CD3)-L1-VL(標的抗原)-L2-VH(標的抗原)-L3-VL(CD3);
VL(標的抗原)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(標的抗原); または
VH(標的抗原)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(標的抗原)
の順序で、ペプチドリンカーL1、L2、およびL3によって順々に連結されている、本発明1032の方法。
[本発明1041]
前記二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャが第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、順々に連結された少なくとも4つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドが、
(i) ヒトCD33に特異的な可変重鎖(VH)ドメイン;
(ii) ヒトCD33に特異的な可変軽鎖(VL)ドメイン;
(iii) ヒトCD3に特異的なVHドメイン; および
(iv) ヒトCD3に特異的なVLドメイン
を含む、本発明1031の方法。
[本発明1042]
各ポリペプチドにおいて、前記4つの可変鎖ドメインが、
VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3);
VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3);
VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); または
VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)
の順序で、ペプチドリンカーL1、L2、およびL3によって順々に連結されている、本発明1034の方法。
[本発明1043]
ヒトCD33に特異的な前記VLドメインが、SEQ ID NO:21～27からなる群より選択される配列からなるCDR1、SEQ ID NO:28～34からなる群より選択される配列からなるCDR2、およびSEQ ID NO:35～41からなる群の配列からなるCDR3を含む、本発明1034の方法。
[本発明1044]
ヒトCD33に特異的な前記VHドメインが、SEQ ID NO:42～48からなる群より選択される配列からなるCDR1、SEQ ID NO:49～55からなる群より選択される配列からなるCDR2、およびSEQ ID NO:56～63からなる群より選択される配列からなるCDR3を含む、本発明1034の方法。
[本発明1045]
ヒトCD33に特異的な前記VLドメインの前記CDR1、CDR2、およびCDR3が、
(i) SEQ ID NO:21、28、および35;
(ii) SEQ ID NO:22、29、および36;
(iii) SEQ ID NO:23、30、および37;
(iv) SEQ ID NO:24、31、および38;
(v) SEQ ID NO:25、32、および39;
(vi) SEQ ID NO:26、33、および40; ならびに
(vii) SEQ ID NO:27、34、および41
からなる群より選択される配列である、本発明1036の方法。
[本発明1046]
CD33に特異的な前記VHドメインの前記CDR1、CDR2、およびCDR3が、
(i) SEQ ID NO:42、49、および56;
(ii) SEQ ID NO:43、50、および57;
(iii) SEQ ID NO:43、50、および58;
(iv) SEQ ID NO:43、50、および59;
(v) SEQ ID NO:43、50、および60;
(vi) SEQ ID NO:44、51、および61;
(vii) SEQ ID NO:45、52、および62;
(viii) SEQ ID NO:46、53、および63;
(ix) SEQ ID NO:47、54、および63; ならびに
(x) SEQ ID NO:48、55、および63
からなる群より選択される配列である、本発明1037の方法。
[本発明1047]
CD33に特異的な前記VLドメインおよびVHドメインが、
(i) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:11;
(ii) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:12;
(iii) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:13;
(iv) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:14;
(v) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:15;
(vi) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:16;
(vii) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:17;
(viii) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:18;
(ix) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:19; ならびに
(x) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:20
からなる群より選択される配列である、本発明1034の方法。
[本発明1048]
ヒトCD3に特異的な前記VHドメインが、STYAMN (SEQ ID NO:72)のCDR1配列、RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:73)のCDR2配列、およびHGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:74)またはHGNFGNSYVSYFAY (SEQ ID NO:75)のCDR3配列を含む、本発明1034の方法。
[本発明1049]
ヒトCD3に特異的な前記VLドメインが、RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:90)のCDR1配列、GTNKRAP (SEQ ID NO:91)のCDR2配列、およびALWYSNL (SEQ ID NO:92)のCDR3配列を含む、本発明1034の方法。
[本発明1050]
CD3に特異的な前記VLドメインおよびVHドメインが、
(i) SEQ ID NO:64およびSEQ ID NO:68;
(ii) SEQ ID NO:65およびSEQ ID NO:69;
(iii) SEQ ID NO:66およびSEQ ID NO:70; ならびに
(iv) SEQ ID NO:67およびSEQ ID NO:71
からなる群より選択される配列である、本発明1034の方法。
[本発明1051]
各ポリペプチドが、
(i) SEQ ID NO:2、12、65、および69;
(ii) SEQ ID NO:3、13、65、および69;
(iii) SEQ ID NO:4、14、65、および69;
(iv) SEQ ID NO:5、15、65、および69;
(v) SEQ ID NO:1、11、64、および68;
(vi) SEQ ID NO:2、12、64、および68;
(vii) SEQ ID NO:2、12、66、および70;
(viii) SEQ ID NO:4、14、66、および70;
(ix) SEQ ID NO:5、15、66、および70;
(x) SEQ ID NO:3、13、64、および68;
(xi) SEQ ID NO:3、13、67、および71;
(xii) SEQ ID NO:4、14、64、および68;
(xiii) SEQ ID NO:5、15、64、および68;
(xiv) SEQ ID NO:7、17、64、および68;
(xv) SEQ ID NO:6、16、64、および68;
(xvi) SEQ ID NO:6、16、67、および71;
(xvii) SEQ ID NO:8、18、64、および68;
(xviii) SEQ ID NO:9、19、64、および68;
(xix) SEQ ID NO:9、19、67、および71; ならびに
(xx) SEQ ID NO:10、20、64、および68
からなる群より選択される4つの可変鎖ドメインを含む、本発明1034の方法。
[本発明1052]
前記二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャが、SEQ ID NO:98～121からなる群より選択される配列を含む、本発明1034～1044のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャが、SEQ ID NO 123～146からなる群より選択される配列を含む、本発明1034～1044のいずれかの方法。
[本発明1054]
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄異形成症候群の処置のための方法。
[本発明1055]
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄増殖性疾患の処置のための方法。
[本発明1056]
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)による免疫抑制または炎症の処置のための方法。
[本発明1057]
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるMDSCを低減させるための方法。
[本発明1058]
それを必要とする対象に、該対象におけるMDSCを低減させるのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法。
[本発明1059]
それを必要とする対象に血中の最大濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法。
[本発明1060]
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄異形成症候群の処置のための方法。
[本発明1061]
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄増殖性疾患の処置のための方法。
[本発明1062]
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)による免疫抑制または炎症の処置のための方法。
[本発明1063]
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるMDSCを低減させるための方法。
[本発明1064]
それを必要とする対象に、該対象におけるMDSCを低減させるのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法。

参照による組み入れ
本明細書において言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されたのと同じ程度まで参照により本明細書に組み入れられる。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が用いられる例示的な態様を記載する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
CD3/CD33二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャの遺伝子構成およびドメイン順序の略図。例示的な2×2 T細胞エンゲージャは、短いペプチドリンカーL1、L2、およびL3を介して連結された4つの可変ドメインから構成される単一のポリペプチドとして発現される。発現後、2つの単量体ポリペプチドが非共有結合的に頭から尾へと会合し、機能的なホモ二量体分子を形成する。L1、L2、L3: リンカー; V_H: 重鎖可変ドメイン; V_L: 軽鎖可変ドメイン。 CD3エンゲージング2×2 T細胞エンゲージャおよびその作用機序。2×2 T細胞エンゲージャは、T細胞の活性化および増殖につながる各抗原に対する2つの結合部位を有する二重特異性タンパク質である。CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャは、4つの結合ドメインのうち2つでCD33⁺腫瘍細胞に結合し、他の2つの結合ドメインでCD3に結合する。このT細胞/標的細胞の結合は、T細胞の活性化を促進し、アポトーシスを介した腫瘍細胞のその後の破壊を促進する免疫学的シナプスを形成する。 CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャのドメイン順序変種。2×2 T細胞エンゲージャをコードする遺伝子配列内の可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)のドメイン順序の差異により、分子の内側または外側に位置したCD33およびCD3特異性を有する抗体の産生が可能とされる。ドメイン特異性、シグナル配列(ss)およびリンカー(L1, L2, L3)および親和性タグ(His)の位置ならびに5'末端および3'末端が示されている。陽性濃縮された健常ドナーT細胞対陰性選択された健常ドナーT細胞の比較。KG-1a細胞を、10 pM (およそ1 ng/mL)および25 pM (およそ2.5 ng/mL)の10種類の選択された2×2 T細胞エンゲージャのうちの1種類および陰性選択された健常ドナーT細胞または陽性選択された健常ドナーT細胞のいずれかとともに、表示のように、1:1または3:1のE:T細胞比率でインキュベートした。48時間後、細胞数を測定し、細胞障害性をDAPI染色で評価した。結果は、二つ組のウェルで実施された3つの独立した実験からの死細胞の割合(上のパネル)および特異的細胞障害性の割合(下のパネル)の平均±SEMとして示されている。分析戦略。1つの健常ドナーT細胞のアリコートおよび1つの代表的なAML細胞株(HL-60)および原発性AML標本(AMP002)からの散布図およびヒストグラムプロットは、それぞれ2×2 T細胞エンゲージャ誘導細胞障害性を判定するために追求された戦略を例示する。FSC, 前方散乱; SSC, 側方散乱。 CD33+ AML細胞株における細胞障害性アッセイ法のスクリーニング。親HL-60 (A、B)およびKG-1a (C、D)細胞を10 pM (およそ1 ng/mL)および25 pM (およそ2.5 ng/mL)の22種類のCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ分子のうちの1種類または非結合対照2×2 T細胞エンゲージャ(00)および健常ドナーT細胞とともに、表示のように1:1 (A、C)または5:1 (B、D)のいずれかのE:T細胞比率でインキュベートした。48時間後、細胞数を測定し、DAPI染色を用いて細胞障害性を評価し、薬物特異的な細胞障害性を定量化した。結果は、二つ組のウェルで実施された3つの独立した実験からのDAPI⁺細胞の割合の平均±SEMとして示されている。細胞障害性を特異的細胞障害性の割合として表した場合、質的に類似した結果が得られた。研究のための原発性AML標本の選択。分析のために原発性ヒトAML標本の総数からの凍結アリコートを得た。融解時のAML芽球の割合は、CD45/側方散乱特性に基づくフローサイトメトリーによって測定された。標本の生存性は、生/死細胞マーカーとしてDAPIを用いるフローサイトメトリーにより、サイトカイン含有液体培養(2×2 T細胞エンゲージャ分子または健常ドナーT細胞の添加なく)において融解時におよび48時間後に判定された。58%超のAML芽球を有していた、全ての標本について融解後および48時間後の生存性の結果が図示されている。四角: 最終分析に含まれたサイトカイン含有液体培養において融解時に50%超および48時間後に50%超の生存性を示した原発性AML標本。原発性AML標本における2×2 T細胞エンゲージャ誘導細胞障害性。原発性AML標本を2.5 pM (およそ250 pg/mL)、10 pM (およそ1 ng/mL)、および25 pM (およそ2.5 ng/mL)の9種類の2×2 T細胞エンゲージャ分子のうちの1種類とともに、表示のように健常ドナーT細胞を加えずに(A)または健常ドナーT細胞を加え1:3 (B)もしくは1:1 (C)のいずれかのE:T細胞比率でインキュベートした。48時間後、細胞数を測定し、DAPI染色を用いて細胞障害性を評価し、薬物特異的な細胞障害性を定量化した。結果は、二つ組のウェルで実施された実験からの特異的細胞障害性の割合の平均±SEMとして示されている。ヒトCD33の細胞外ドメインのアミノ酸配列(aa 18～259) (SEQ ID NO: 93)。アミノ酸配列： (A) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ1の完全配列(SEQ ID NO:98); (B) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ2の完全配列(SEQ ID NO:99); (C) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ3の完全配列(SEQ ID NO:100); (D) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ4の完全配列(SEQ ID NO:101); (E) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ5の完全配列(SEQ ID NO:102); (F) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ6の完全配列(SEQ ID NO:103); (G) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ7の完全配列(SEQ ID NO:104); (H) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ8の完全配列(SEQ ID NO:105); (I) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ9の完全配列(SEQ ID NO:106); (J) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ10の完全配列(SEQ ID NO:107); (K) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ11の完全配列(SEQ ID NO:108); (L) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ12の完全配列(SEQ ID NO:109); (M) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ13の完全配列(SEQ ID NO:110); (N) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ14の完全配列(SEQ ID NO:111); (O) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ15の完全配列(SEQ ID NO:112); (P) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ16の完全配列(SEQ ID NO:113); (Q) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ17の完全配列(SEQ ID NO:114); (R) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ18の完全配列(SEQ ID NO:115); (S) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ19の完全配列(SEQ ID NO:116); (T) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ20の完全配列(SEQ ID NO:117); (U) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ21の完全配列(SEQ ID NO:118); (V) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ22の完全配列(SEQ ID NO:119); (W) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ23の完全配列(SEQ ID NO:120); および (X) C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャ24の完全配列(SEQ ID NO:121)。下線が引かれた配列は、リンカーL1、L2、およびL3を表す。図10-1の説明を参照のこと。図10-1の説明を参照のこと。図10-1の説明を参照のこと。図10-1の説明を参照のこと。図10-1の説明を参照のこと。図10-1の説明を参照のこと。図10-1の説明を参照のこと。アミノ酸配列： (A) 2×2 T細胞エンゲージャ1の完全配列(SEQ ID NO:123); (B) 2×2 T細胞エンゲージャ2の完全配列(SEQ ID NO:124); (C) 2×2 T細胞エンゲージャ3の完全配列(SEQ ID NO:125); (D) 2×2 T細胞エンゲージャ4の完全配列(SEQ ID NO:126); (E) 2×2 T細胞エンゲージャ5の完全配列(SEQ ID NO:127); (F) 2×2 T細胞エンゲージャ6の完全配列(SEQ ID NO:128); (G) 2×2 T細胞エンゲージャ7の完全配列(SEQ ID NO:129); (H) 2×2 T細胞エンゲージャ8の完全配列(SEQ ID NO:130); (I) 2×2 T細胞エンゲージャ9の完全配列(SEQ ID NO:131); (J) 2×2 T細胞エンゲージャ10の完全配列(SEQ ID NO:132); (K) 2×2 T細胞エンゲージャ11の完全配列(SEQ ID NO:133); (L) 2×2 T細胞エンゲージャ12の完全配列(SEQ ID NO:134); (M) 2×2 T細胞エンゲージャ13の完全配列(SEQ ID NO:135); (N) 2×2 T細胞エンゲージャ14の完全配列(SEQ ID NO:136); (O) 2×2 T細胞エンゲージャ15の完全配列(SEQ ID NO:137); (P) 2×2 T細胞エンゲージャ16の完全配列(SEQ ID NO:138); (Q) 2×2 T細胞エンゲージャ17の完全配列(SEQ ID NO:139); (R) 2×2 T細胞エンゲージャ18の完全配列(SEQ ID NO:140); (S) 2×2 T細胞エンゲージャ19の完全配列(SEQ ID NO:141); (T) 2×2 T細胞エンゲージャ20の完全配列(SEQ ID NO:142); (U) 2×2 T細胞エンゲージャ21の完全配列(SEQ ID NO:143); (V) 2×2 T細胞エンゲージャ22の完全配列(SEQ ID NO:144); (W) 2×2 T細胞エンゲージャ23の完全配列(SEQ ID NO:145); および(X) 2×2 T細胞エンゲージャ24の完全配列(SEQ ID NO:146)。下線が引かれた配列は、リンカーL1、L2、およびL3を表す。図11-1の説明を参照のこと。図11-1の説明を参照のこと。図11-1の説明を参照のこと。図11-1の説明を参照のこと。図11-1の説明を参照のこと。図11-1の説明を参照のこと。図11-1の説明を参照のこと。 NOD/scidマウスにおけるHL-60細胞の増殖に対する2×2 T細胞エンゲージャ16および12の効果。免疫不全NOD/scidマウスの8つの実験群に、0日目に4×10⁶個のHL-60細胞の懸濁液を皮下注射により異種移植した。注射前に、HL-60細胞を健常ドナー由来3×10⁶個の精製T細胞と混合した。腫瘍細胞およびT細胞を移植された実験群の全ての動物は、0、1、2、3、および4日目にビヒクル(対照)または2×2 T細胞エンゲージャ16もしくは12のいずれかの、表示のように3つの異なる用量レベル(0.1 μg、1 μgおよび10 μg)での静脈内ボーラスを受けた。エフェクタ細胞およびビヒクル処置なしの1群を、さらなる陰性対照として役立てた。 AML異種移植片モデルにおける2×2 T細胞エンゲージャ16の抗腫瘍活性。NOD/scidマウスに亜致死的に放射線を照射し(2 Gy)、4×10⁶個のHL-60細胞を皮下接種した。9日目に、動物は抗アシアロGM1ウサギAbの単回ボーラス注射を受けた。腫瘍が10日目に50～150 mm³ (平均73 ± 11 mm³)の体積に達すると、動物を3つの処置群に割り当てた。群2および3 (n = 8)には、1.5×10⁷個の拡張および活性化されたヒトT細胞を腹腔内注射した。13日目から21日目(qdxd9)まで、動物は2×2 T細胞エンゲージャ16 (群3)またはビヒクルを側尾静脈(群1および群2)へ受けた。 5 μg (0.25 mg/kg)または50 μg (2.5 mg/kg) CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ12および16による処置後38日目のNSGマウスの骨髄(BM)および脾臓におけるヒトAML芽球の相対量(A)および絶対数(B)。 CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16を介した標的細胞溶解の動態。1×10⁴個のカルセイン標識HL-60標的細胞を、エフェクタ細胞としての初代ヒトT細胞とともに25:1のE:T比率で2×2 T細胞エンゲージャ16の連続希釈液の存在下または抗体なし(w/o)で30分間、1時間、2時間、3時間、4時間または5時間インキュベートした。各時点で、溶解した標的細胞から放出された蛍光カルセインを用いて、特異的溶解を計算した。3回反復の平均およびSDがプロットされている。 EC₅₀の動態およびCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16の特異的溶解値。EC₅₀値(黒丸)および2×2 T細胞エンゲージャ16を介した標的細胞溶解(白四角)を非線形回帰/ S字型用量応答により表示のインキュベーション時間でカルセイン放出細胞障害性アッセイ法において判定し、プロットした。新たに診断された、再発性かつ難治性AML患者サンプルにおける細胞障害活性。 0.5 μg/日の用量で14日間の対象02-001、-002、および-003におけるCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16 (AMV564)の血清濃度。再発性/難治性の急性骨髄性白血病を有する患者に対する表示された用量レベルでの14日間のCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16の血清濃度。実施例14にしたがって14日間0.5 μg/日の用量でCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16を投薬された対象における例示的なレベルの骨髄芽球(左上のパネル)、絶対好中球数(右上のパネル)、ヘモグロビン(左下のパネル)およびC反応性タンパク質(CRP) (右下のパネル)。実施例14にしたがって14日間1.5 μg/日の用量でCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16を投薬された対象における例示的なレベルの血液数、すなわち赤血球(左上のパネル)および白血球(右上のパネル)、インターロイキン-6 (左下のパネル)、ならびにCRP (右下のパネル)。対象における14日間1.5マイクログラム用量レベルでのAMV564の投与後の改善されたヘモグロビン、好中球、血小板、および単球数改善(上のパネル)。対象における14日間1.5マイクログラム用量レベルでのAMV564の投与後の改善されたヘモグロビン、好中球、および血小板数、ならびに減少したCRPレベル(下のパネル)。再発性/難治性急性骨髄性白血病を有する患者への14日間のAMV564投与後のベースラインからの骨髄白血病性芽球%の最良の相対的変化。 AMV564の例示的な投薬レジメン。5 μg → 15 μg → 100 μgの用量設定による隔日の間欠投薬(上のパネル)。15 μgの持続注入×3日間による間欠投薬と、それに続く100 μg → 200 μgの用量設定による隔日投薬。

発明の詳細な説明
治療用タンパク質、特に標的細胞上にする抗原およびT細胞上にする抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与に基づく免疫学的、医学的介入のための薬学的手段および方法が本明細書において記述される。本明細書において記述される二重特異性抗体は、がんまたは非固形腫瘍もしくは固形腫瘍の予防、処置または改善に有用であり、ここで該二重特異性抗体はある特定の投薬スケジュールおよび/または処置レジメンに対して投与される。

抗体に基づく治療用物質は、ヒト疾患の処置において広く使われている。ある特定の抗体療法で観察される一般的な現象は、サイトカイン放出症候群(「CRS」)のような、副作用の発生である。CRSは、T細胞に結合する抗体の注入に応答して起こる即時の合併症である。CRSはT細胞/単球の活性化と関連付けられており、第二に、補体カスケードの活性化と関連付けられている。これらのプロセスは、T細胞および単核細胞を架橋し、補体を活性化しうる抗体のFc部分を通じて媒介される。例えば、CRSの病因は、抗CD3抗体であるOKT3によるTリンパ球の刺激に応答した腫瘍壊死因子(TNF)α、IL-2およびIL-6、ならびにγ-インターフェロンの合成に起因している。CRSでは、活性化T細胞によって放出されるサイトカイン(TNFα、インターロイキン(IL-2、IL-6)、およびインターフェロン(IFNγ)など)は、重症感染症で見られ、低血圧、発熱、および硬直を特徴とするものと同様の一種類の全身性炎症応答をもたらす。CRSに関連すると記述されている他の有害な副作用は、疲労、嘔吐、頻脈、高血圧、頭痛、および背痛である。

さまざまなモノクローナル抗体を投与した場合にCRSが観察されている。例えば、抗CD20抗体リツキシマブの抗腫瘍活性は、B細胞慢性リンパ性白血病(B-CLL)の処置に用いられる。リツキシマブが単剤として重要な臨床活性をもたらすには、週3回の投薬により達成される用量漸増、すなわち用量の増加が必要である。しかしながら、この投与スキームはサイトカインTNF-αおよびIL-6の放出を引き起こし、その血清レベルは各注入を開始してから90分後にピークに達する。サイトカインのこの上昇は、発熱、悪寒、低血圧、および吐き気を伴う。注入の毒性は、適切な前処理およびステップアップされる投与スキームで低減されうる(Lin, 2003, Seminar Oncol. 30, 483-492)。

CRSは、二重特異性抗体のような、他の抗体形式を適用した場合にも観察されている。乳がん患者におけるGCSF (顆粒球コロニー刺激因子)と組み合わせて二重特異性抗体MDX-2H12 (抗Fcγ受容体I×抗Her-2/neu)の単回注入により、それぞれ、2時間および4時間の時点でTNF-αおよびIL-6の最大レベルに至った。TNF-αおよびIL-6のピークレベルは、適用された二重特異性抗体の用量と相関していなかった(Repp, 2003, Br. J. Cancer, 89, 2234-43)。WO 99/54440では、CRSは、B細胞由来慢性リンパ性白血病(B-CLL)を有する患者への反復注入で抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体を適用して実施された内部臨床試験で観察されている。WO 99/54440の図19および20に示されるように、TNF、IL-6、およびIL-8の放出は、2回投与された20分注入(それぞれ3 μgおよび10 μgの二重特異性一本鎖抗体)の各々に応答して見られ、各投与後にサイトカイン放出があった。二重特異性一本鎖抗体10 μgの投与後に最大のサイトカイン放出が観察された。

したがって、患者の忍容性が向上した抗体に基づく医学的療法のための薬学的手段および方法を提供することが、本明細書において記述される本態様の目的である。具体的には、そのような手段および方法が、投与される抗体の生物活性の最大の保持を可能にする一方で、この投与による望ましくない有害な副作用が最小限に抑えられることが目的である。

CD33およびCD3に対する二重特異性抗体
第1の局面によれば、標的細胞上にする抗原およびT細胞上に発現する抗原に対する特異性を有する二重特異性抗体が本明細書において記述される。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、少なくともCD33、好ましくはヒトCD33に対する特異性を有する。いくつかの態様において、本明細書において記述される二重特異性抗体CD33結合ドメインは、ヒトおよびカニクイザルCD33に対する特異性を有し、すなわち交差反応性である。いくつかの態様において、これらの交差反応性結合ドメインは、類似の親和性でヒトおよびカニクイザルCD33に結合する。

CD33は、骨髄性細胞に特異的な膜貫通型細胞表面糖タンパク質受容体である。CD33抗原は、急性骨髄性白血病(AML)骨髄芽球球のおよそ90%においてならびに白血病性幹細胞および骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)を含む、他の骨髄増殖性疾患の細胞において発現する。CD33は、単球、樹状細胞、好中球、常在マクロファージ、好塩基球、および好酸球に発現する。下流シグナル伝達に影響を与えうる2つの選択的にスプライスされたアイソフォームが同定されている。

ヒトCD33などのCD33に特異的な抗体ドメインの単離の場合、抗体ライブラリがスクリーニングされうる。例えば、IgMファージディスプレイライブラリは、例えば、ヒトCD33の細胞外ドメインのアミノ酸番号1～243 (図9、SEQ ID NO:93)を含む組み換えCD33-Fc融合タンパク質を用いることによりスクリーニングすることができる。

いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む少なくとも1つのCD33結合部位を有する。軽鎖可変ドメインは軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含み、重鎖可変ドメインは重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの態様において、これらの軽鎖CDR (CDR1、CDR2、およびCDR3)は、表1に示されるヒトCDR配列(SEQ ID NO:21～41)から選択される。ある特定の例において、軽鎖CDR1はSEQ ID NO:21～27から選択される。ある特定の例において、軽鎖CDR2はSEQ ID NO:28～34から選択される。ある特定の例において、軽鎖CDR3はSEQ ID NO:35～41から選択される。

いくつかの態様において、これらの重鎖CDR (重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3)は、表2に示されるヒトCDR配列(SEQ ID NO:42～63)から選択される。ある特定の例において、重鎖CDR1はSEQ ID NO:42～48から選択される。ある特定の例において、重鎖CDR2はSEQ ID NO:49～55から選択される。ある特定の例において、重鎖CDR3はSEQ ID NO:56～63から選択される。

いくつかの態様において、軽鎖および重鎖CDRは、他の免疫グロブリンまたはコンセンサスフレームワーク領域からのフレームワーク配列を含む、各可変ドメインの周囲のフレームワーク配列なしで選択され、任意でさらに変異されおよび/または他の適当なフレームワーク配列により置換されてもよい。それゆえ、本明細書において提供されるのはいくつかの態様において、軽鎖CDR1がSEQ ID NO:21であり; 軽鎖CDR2がSEQ ID NO:28であり、かつ軽鎖CDR3がSEQ ID NO:35である、軽鎖可変ドメインを含むCD33結合ドメインである。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、軽鎖CDR1がSEQ ID NO:22であり; 軽鎖CDR2がSEQ ID NO:29であり、かつ軽鎖CDR3がSEQ ID NO:36である、軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、軽鎖CDR1がSEQ ID NO:23であり; 軽鎖CDR2がSEQ ID NO:30であり、かつ軽鎖CDR3がSEQ ID NO:37である、軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、軽鎖CDR1がSEQ ID NO:24であり; 軽鎖CDR2がSEQ ID NO:31であり、かつ軽鎖CDR3がSEQ ID NO:38である、軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、軽鎖CDR1がSEQ ID NO:25であり; 軽鎖CDR2がSEQ ID NO:32であり、かつ軽鎖CDR3がSEQ ID NO:39である、軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、軽鎖CDR1がSEQ ID NO:26であり; 軽鎖CDR2がSEQ ID NO:33であり、かつ軽鎖CDR3がSEQ ID NO:40である、軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、軽鎖CDR1がSEQ ID NO:27であり; 軽鎖CDR2がSEQ ID NO:34であり、かつ軽鎖CDR3がSEQ ID NO:41である、軽鎖可変ドメインを含む。

また本明細書において提供されるのはいくつかの態様において、重鎖CDR1がSEQ ID NO:42であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:49であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:56である、重鎖可変ドメインを含むCD33結合ドメインである。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:43であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:50であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:57である、重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:43であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:50であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:58である、重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:43であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:50であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:59である、重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:43であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:50であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:60である、重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:44であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:51であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:61である、重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:45であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:52であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:62である、重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:46であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:53であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:63である、重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:47であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:54であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:63である、重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、CD33結合ドメインは、重鎖CDR1がSEQ ID NO:48であり; 重鎖CDR2がSEQ ID NO:55であり、かつ重鎖CDR3がSEQ ID NO:63である、重鎖可変ドメインを含む。

さらなる態様において、CD33結合ドメインは、表3に示されるアミノ酸配列SEQ ID NO:1～10から選択される可変軽鎖ドメインを含む。さらなる態様において、CD33結合ドメインは、表4に示されるアミノ酸配列SEQ ID NO:11～20から選択される可変重鎖ドメインを含む。さらなる態様において、CD33結合ドメインは、表3に示されるアミノ酸配列SEQ ID NO:1～10から選択される可変軽鎖ドメインおよび表4に示されるアミノ酸配列SEQ ID NO:11～20から選択される可変重鎖ドメインを含む。

「結合ドメイン」という用語は、抗原結合特性を有する免疫グロブリン誘導体、すなわち、抗原結合部位を含む免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片をいう。結合ドメインは、抗体またはその断片の可変ドメインを含む。各抗原結合ドメインは抗体、すなわち免疫グロブリン、同じエピトープに結合する可変重鎖ドメイン(VH)および抗体可変軽鎖ドメイン(VL)によって形成されるが、可変重鎖ドメイン(VH)は3つの重鎖相補性決定領域(CDR): CDR1、CDR2、およびCDR3を含み; ならびに可変軽鎖ドメイン(VL)は3つの軽鎖相補性決定領域(CDR): CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの例において、本明細書におけるいくつかの態様による結合ドメインは、免疫グロブリン定常ドメインを欠いている。いくつかの例において、抗原結合部位を形成する可変軽鎖および重鎖ドメインは、例えばペプチドリンカーによって、互いに共有結合され、または他の例において、可変軽鎖および重鎖ドメインが互いに非共有結合して抗原結合部位を形成する。「結合ドメイン」という用語はまた、例えば、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv断片、一本鎖Fv、タンデム一本鎖Fv ((scFv)₂、二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE(登録商標))、二重親和性再標的化抗体(DART(商標))、ダイアボディ、タンデムダイアボディ(TandAb(登録商標))、DuoBody(登録商標) IgG分子、単一ドメイン抗体(例えば、VHH)、2×2 T細胞エンゲージャ、TriTacsなどを含む抗体断片または抗体誘導体をいう。さらに、ある特定の例において、結合ドメインは多価であり、すなわち、標的抗原、例えば、CD33またはCD3に対する2つ、3つ、またはそれ以上の結合部位を有する。

（表１）抗CD33可変軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列

（表２）抗CD33可変重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列

（表３）全ての抗CD33可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列(可変軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列は太字で下線付きである)

（表４）抗CD33可変重鎖ドメインのアミノ酸配列(可変重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列は太字で下線付きである)

いくつかの態様において、CD33に対する特異性を付与する結合ドメインは、表3および表4に示されるヒトCD33結合部位を形成する可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインの以下の組み合わせのうちの1つから選択される。非限定的な例としては、(i) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:11、(ii) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:12、(iii) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:13、(iv) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:14、(v) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:15、(vi) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:16、(vii) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:17、(viii) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:18、(ix) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:19、ならびに(x) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:20が挙げられる。

本明細書において記述される二重特異性抗体は、CD33に対する特異性を有するだけでなく、少なくとも1つのさらなる機能的ドメインも有する結合ドメインを有する。さらなる態様において、少なくとも1つのさらなる機能的ドメインは、エフェクタドメインである。「エフェクタドメイン」は、細胞障害性、食作用、抗原提示、サイトカイン放出を刺激または誘発することができる、エフェクタ細胞に特異的な抗体の結合部位を含む。そのようなエフェクタ細胞は、例えば、T細胞であるが、これに限定されることはない。特に、エフェクタドメインは、例えば、ヒトCD3のような、T細胞上の抗原に対する抗原結合部位を形成する少なくとも1つの抗体可変重鎖ドメインおよび少なくとも1つの可変軽鎖ドメインを含む。

したがって、いくつかの態様において、本明細書において記述される二重特異性抗体は多機能性である。本明細書において用いられる多機能という用語は、結合タンパク質が2つまたはそれ以上の異なる生物学的機能を示すことを意味する。例えば、異なる生物学的機能は、異なる抗原に対する異なる特異性である。ある特定の例において、多機能性CD33結合タンパク質は多重特異性であり、すなわち、CD33および1つまたは複数のさらなる抗原に対する結合特異性を有する。ある特定の例において、結合タンパク質は、CD33およびCD3に対する特異性を有する二重特異性であり、他のタンパク質、タンパク質断片または化学構造でマスキングまたはアンマスキングされうる。そのような二重特異性結合タンパク質は、例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMクラスの二重特異性モノクローナル抗体、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ(scDb)、一本鎖抗体、ナノボディ、タンデム一本鎖Fv (scFv)2、例えば二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE(登録商標))、二重親和性再標的化抗体(DART(商標))、タンデムダイアボディ(TandAb(登録商標))、2×2 T細胞エンゲージャ、およびフレキシボディを含む。

本明細書において用いられるCD3は、5つの鎖: 2つのCD3-ε、CD3-γ、CD3-δ、およびCD3ζからなる多分子T細胞受容体複合体の一部としてヒトT細胞上に発現する抗原を意味する。例えば抗CD3抗体によるT細胞上でのCD3のクラスタリングは、抗原の結合と同様のT細胞活性化をもたらすが、上記のように、T細胞サブセットのクローン特異性とは無関係である。したがって、二重特異性抗体の特異性のうちの1つでヒトCD3抗原に特異的に結合する二重特異性抗体は、ヒトT細胞上に発現するヒトCD3複合体に結合可能な、かつ標的細胞の除去/溶解を誘導可能なCD3特異的コンストラクトに関し、ここでそのような標的細胞は、二重特異性一本鎖抗体の他の非CD3結合部分によって結合される抗原を保有/提示する。CD3特異的結合剤(例えば、本発明の薬学的手段および方法によって投与されるような二重特異性一本鎖抗体)によるCD3複合体の結合は、T細胞の活性化をもたらす。

ある特定の態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、ヒトCD3および、いくつかの例において、カニクイザルCD3に対する特異性を有する。そのような結合部位の例は、表5に示される配列からのVHドメインCDR1、CDR2、およびCDR3 (SEQ ID NO:64～67)、ならびに表6に示される配列からのVLドメインCDR1、CDR2、およびCDR3 (SEQ ID NO:68～71)を含むポリペプチドである。ある特定の例において、CD3結合部位は、SEQ ID NO:64の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:68の可変軽鎖ドメインの組み合わせである。ある特定の例において、CD3結合部位は、SEQ ID NO:65の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:69の可変軽鎖ドメインの組み合わせである。ある特定の例において、CD3結合部位は、SEQ ID NO:66の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:70の可変軽鎖ドメインの組み合わせである。ある特定の例において、CD3結合部位は、SEQ ID NO:67の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:71の可変軽鎖ドメインの組み合わせである。

（表５）抗CD3可変重鎖ドメインのアミノ酸配列(可変重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列は太字で下線付きである)

（表６）抗CD3可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列(可変軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列は太字で下線付きである)

さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、STYAMN (SEQ ID NO:72)のCDR1を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、

のCDR2配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、

のCDR3配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、

のCDR3配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD3結合部位は、それぞれSEQ ID NO:72～74のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD3結合部位は、それぞれSEQ ID NO:72、73および75のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む可変重鎖ドメインを有する。

さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、

からなる群より選択されるCDR1配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、

からなる群より選択されるCDR2配列を含む可変重鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、

からなる群より選択されるCDR3配列を含む可変重鎖ドメインを有する。

さらなる態様において、CD3結合部位は、それぞれSEQ ID NO:76、73、および74、それぞれSEQ ID NO:76、79、および74、それぞれSEQ ID NO:76、80、および74、それぞれSEQ ID NO:76、81、および74、それぞれSEQ ID NO:76、82、および74、それぞれSEQ ID NO:76、83、および74、それぞれSEQ ID NO:72、83、および74、それぞれSEQ ID NO:72、83、および85、それぞれSEQ ID NO:76、83、および86、それぞれSEQ ID NO:77、83、および74、それぞれSEQ ID NO:72、83、および87、それぞれSEQ ID NO:78、73、および88またはそれぞれSEQ ID NO:78、84、および89のCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む可変重鎖ドメインを有する。

のCDR1配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、GTNKRAP (SEQ ID NO:91)のCDR2配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のCD3結合部位は、ALWYSNL (SEQ ID NO:92)のCDR3配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。さらなる態様において、CD3結合部位は、それぞれSEQ ID NO:90～92のCDR1、CD2、およびCD3配列を含む可変軽鎖ドメインを有する。

ある特定の例において、CD3結合部位は、CD3に対する高い親和性を有する。あるいは、他の例において、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインまたは、任意で、可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインからのCDR1、CDR2、CDR3は、例えばUCHT1、ムロモナブ-CD3 (OKT3)、オテリキシズマブ(TRX4)、テプリズマブ(MGA031)、ビシリズマブ(ヌビオン(Nuvion))などのような、他のCD3抗体に由来する。

別の局面において、ヒト化されているまたは完全にヒトのものである、すなわちヒト由来のものであるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体が本明細書において記述される。さらなる態様において、ラクダまたはラマのものであるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体が本明細書において記述される。

いくつかの態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、CD33およびCD3の可変軽鎖および重鎖ドメインによりCD33およびCD3特異性を提供する以下の組み合わせのうちの1つを有し、この組み合わせは、(i) SEQ ID NO:2、12、65、および69、(ii) SEQ ID NO:3、13、65、および69、(iii) SEQ ID NO:4、14、65、および69、(iv) SEQ ID NO:5、15、65、および69、(v) SEQ ID NO:1、11、64、および68、(vi) SEQ ID NO:2、12、64、および68、(vii) SEQ ID NO:2、12、66、および70、(viii) SEQ ID NO:4、14、66、および70、(ix) SEQ ID NO:5、15、66、および70、ならびに(x) SEQ ID NO:3、13、64、および68、(xi) SEQ ID NO:3、13、67、および71、(xii) SEQ ID NO:4、14、64、および68、(xiii) SEQ ID NO:5、15、64、および68、(xiv) SEQ ID NO:7、17、64、および68、(xv) SEQ ID NO:6、16、64、および68、(xvi) SEQ ID NO:6、16、67、および71、(xvii) SEQ ID NO:8、18、64、および68、(xviii) SEQ ID NO:9、19、64、および68; (xix) SEQ ID NO:9、19、67、および71、ならびに(xx) SEQ ID NO:10、20、64、および68を含むが、これらに限定されることはない。

CDR配列ならびに重鎖および軽鎖ドメインの保存変種
代替的な態様において、重鎖および軽鎖ドメインは、本明細書において記述されるCDR配列の免疫学的に活性な相同体または変種を組み入れている。したがって、いくつかの態様において、CD33またはCD3に結合する重鎖または軽鎖ドメインにおけるCDR配列は、SEQ ID NO:21～63または72～92に示されるアミノ酸配列と類似しているが、同一ではない。ある特定の例において、CDR変種配列は、SEQ ID NO: 21～63または72～90の配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、または80%の配列同一性を有し、かつこれは免疫学的に活性である。

さらなる例において、CDR変種配列は、1、2、3、4、または5個の保存されたアミノ酸置換を組み入れている。保存的置換は、所与のアミノ酸を同様の特徴の別のアミノ酸で置換するアミノ酸置換を含み、脂肪族アミノ酸の中でアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの交換; ヒドロキシル残基のセリンおよびスレオニンの交換、酸性残基アスパラギン酸およびグルタミン酸の交換、アミド残基アスパラギンおよびグルタミン間の置換、塩基性残基リジンおよびアルギニンの交換、ならびに芳香族残基フェニルアラニンおよびチロシンの中での置き換えをさらに含む。

なおいっそうさらなる例において、CDR変種配列は、安定性の増加、プロテアーゼに対する耐性および/またはCD33もしくはCD3に対する結合親和性のようなCDRの特性を増強する置換を組み入れている。

他の例において、CDR変種配列は、重要でない残基または重要でない領域の残基を変えるために改変される。重要でないアミノ酸は、親和性成熟、CDRウォーキング、部位特異的変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、光親和性標識、またはアラニンスキャン変異誘発のような、公知の方法により同定することができる。

さらなる代替的な態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、本明細書において提供される重鎖および軽鎖ドメイン配列の免疫学的に活性な相同体または変種である重鎖および軽鎖ドメインを含む。したがって、いくつかの態様において、CD33およびCD3結合タンパク質は、SEQ ID NO:1～20または64～71に示されるアミノ酸配列と類似しているが、同一ではない重鎖または軽鎖ドメイン配列を含む。ある特定の例において、変種重鎖または軽鎖ドメイン配列は、SEQ ID NO:1～20または64～71の配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、または80%の配列同一性を有し、かつこれは免疫学的に活性である。

さらなる例において、変種重鎖または軽鎖ドメイン配列は、1、2、3、4、または5個の保存されたアミノ酸置換を組み入れている。保存的置換は、所与のアミノ酸を同様の特徴の別のアミノ酸で置換するアミノ酸置換を含み、脂肪族アミノ酸の中でアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの交換; ヒドロキシル残基のセリンおよびスレオニンの交換、酸性残基アスパラギン酸およびグルタミン酸の交換、アミド残基アスパラギンおよびグルタミン間の置換、塩基性残基リジンおよびアルギニンの交換、ならびに芳香族残基フェニルアラニンおよびチロシンの中での置き換えをさらに含む。

なおいっそうさらなる例において、変種重鎖または軽鎖ドメイン配列は、安定性の増大、プロテアーゼに対する耐性および/またはCD33もしくはCD3に対する結合親和性のようなCDRの特性を増強する置換を組み入れている。

他の例において、変種重鎖または軽鎖ドメイン配列は、重要でない残基または重要でない領域の残基を変えるために改変される。重要でないアミノ酸は、親和性成熟、CDRウォーキング、部位特異的変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、光親和性標識、またはアラニンスキャン変異誘発のような、公知の方法により同定することができる。

CD33およびCD3 2×2 T細胞エンゲージャ
別の局面において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体は二量体であり、すなわち、CD33およびCD3に対する抗原結合部位を有する2つのポリペプチドを含む。

また本明細書において提供されるのは別の局面において、2×2 T細胞エンゲージャの形式のCD33およびCD3に対する二量体かつ二重特異性抗体である。そのような2×2 T細胞エンゲージャは、4つの抗体可変結合ドメイン(2つの重鎖可変ドメイン(VH)および2つの軽鎖可変ドメイン(VL)を単一の遺伝子コンストラクトのなかで連結することにより構築され(図1)、ホモ二量体化を可能にする。そのような2×2 T細胞エンゲージャにおいて、リンカーの長さは、可変ドメインの分子内対合を妨げるので、一本鎖ダイアボディを形成するように分子はそれ自体に折り返されることができず、別の鎖の相補的ドメインと対合するほかないようなものである。ドメインはまた、この二量体化中に対応するVHおよびVLドメインが対合するように配置される。単一の遺伝子コンストラクトからの発現に続いて、2つの同一のポリペプチド鎖が頭から尾へと折り畳まれ、およそ105 kDaの機能的な非共有ホモ二量体を形成する(図1)。分子間共有結合がないにもかかわらず、ホモ二量体はいったん形成されると非常に安定しており、無傷のままであり、単量体型に戻らない。

2×2 T細胞エンゲージャは、従来のモノクローナル抗体およびその他の小さな二重特異性分子に勝る利点を提供するいくつかの特性を有する。2×2 T細胞エンゲージャは抗体可変ドメインのみを含むため、Fc部分に関連しうる副作用または非特異的相互作用を欠くものと考えられている。例えば、Fcドメインに結合できるFc受容体は、白血球(例えば、好塩基球、B細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好中球など)またはクッパー細胞のような多くの細胞型に見られる。2×2 T細胞エンゲージャはCD33およびCD3の各々への二価結合を可能にするため、分子は単一の標的に対するIgG抗体の結合力と同様の結合力を有する。およそ105 kDaの、2×2 T細胞エンゲージャのサイズは、IgGのサイズよりも小さく、これが腫瘍への浸透の増強を可能としうる。ただし、このサイズは初回通過クリアランスの腎閾値をはるかに超えており、抗体結合ドメインまたは非抗体足場に基づくいっそう小さな二重特異性形式と比較して、薬物動態の利点を供与する。さらに2×2 T細胞エンゲージャは、これらの薬物動態および結合力特性に基づいてBiTEまたはDART分子のような他の二重特異性結合タンパク質よりも有利であり、いっそう長い固有半減期および迅速な細胞障害性をもたらす。2×2 T細胞エンゲージャは宿主細胞、例えば哺乳動物CHO細胞において十分に発現される。強固な上流および下流の製造プロセスが2×2 T細胞エンゲージャに使用可能であると考えられる。

本明細書において記述されるCD33およびCD3二重特異性2×2 T細胞エンゲージャは、細胞傷害性T細胞を動員することによりCD33を発現する、MDSCのような、腫瘍微小環境における細胞および腫瘍細胞の特異的ターゲティングを可能とするようにデザインされる。対照的に、これらの細胞に特異的に発現するCD3分子を結合することにより、2×2 T細胞エンゲージャは細胞傷害性T細胞およびCD33発現細胞を非常に特異的に結合し、それによってそのような分子の細胞障害性の可能性を大幅に増大させることができる。この機構の概要を図2に示す。T細胞が腫瘍成長の制御に関与しうると報告されている。例えば、結腸直腸腫瘍およびNHL患者からのリンパ節における細胞傷害性T細胞の存在は、より良好な臨床転帰と相関することが示された。さらに、T細胞応答を誘導するようにデザインされた治療法の可能性は、黒色腫ワクチン、およびT細胞活性化の負の調節因子であるCTLA-4に対する抗体で実証されている。本明細書において記述される2×2 T細胞エンゲージャは、T細胞受容体の一部を形成する表面発現CD3への結合を介して細胞傷害性T細胞に関与する。特定の腫瘍細胞の表面に発現したCD3およびCD33へのこの2×2 T細胞エンゲージャの同時結合は、T細胞活性化を引き起こし、悪性細胞のその後の溶解を媒介する(図2)。

それゆえ、さらなる局面においては、多重特異性2×2 T細胞エンゲージャである。いくつかの態様において、多重特異性2×2 T細胞エンゲージャは、2つ、3つ、またはそれ以上の異なるエピトープに対する特異性を有し、ここで2つまたはそれ以上のエピトープは、同じ抗原標的または異なる抗原標的のものでありうる。ある特定の態様において、多重特異性2×2 T細胞エンゲージャは二重特異性かつ四価であり、すなわち、4つの抗原結合部位を含む。そのような二重特異性2×2 T細胞エンゲージャは、ヒトCD3およびヒトCD33に、少なくとも1つの抗原結合部位で結合し、ここである特定の例において、2×2 T細胞エンゲージャは、ヒトCD3に2つの抗原結合部位で結合し、ヒトCD33に2つの他の抗原結合部位で結合し、すなわち2×2 T細胞エンゲージャは各抗原に二価結合する。

いくつかの態様において、二重特異性抗原結合2×2 T細胞エンゲージャは、ヒトCD33およびヒトCD3に特異的であり、該2×2 T細胞エンゲージャは第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、順々に連結された少なくとも4つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドが、
(i) ヒトCD33に特異的な可変重鎖(VH)ドメイン;
(ii) ヒトCD33に特異的な可変軽鎖(VL)ドメイン;
(iii) ヒトCD3に特異的なVHドメイン; および
(iv) ヒトCD3に特異的なVLドメイン
を含む。

特定の態様において、二重特異性2×2 T細胞エンゲージャは、ヒトCD33の₆₂DQEVQEETQ₇₀ (SEQ ID NO:94) (SEQ ID NO:93のアミノ酸残基番号62～70)内にあるヒトCD33のエピトープに特異的に結合する。特定の例において、そのような2×2 T細胞エンゲージャは第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、順々に連結された少なくとも4つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドが、
(i) ヒトCD33の₆₂DQEVQEETQ₇₀ (SEQ ID NO:94) (SEQ ID NO:93のアミノ酸残基番号62～70)内にあるヒトCD33のエピトープに特異的な可変重鎖ドメイン;
(ii) ヒトCD33の₆₂DQEVQEETQ₇₀ (SEQ ID NO:94) (SEQ ID NO:93のアミノ酸残基番号62～70)内にあるヒトCD33のエピトープに特異的な可変軽鎖ドメイン;
(iii) ヒトCD3に特異的な可変重鎖ドメイン; および
(iv) ヒトCD3に特異的な可変軽鎖ドメイン
を含む。

他の態様において、10 nMもしくはそれ未満、5 nMもしくはそれ未満、1 nMもしくはそれ未満、または0.5 nMもしくはそれ未満のK_DでCD33⁺細胞上のCD33に対する親和性を有するCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャが本明細書において記述される。CD33⁺細胞は、例えば、HL-60またはKG-1のような、腫瘍細胞から選択することができる。

さらなる態様において、本明細書において記述されるCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャはCD3、ある特定の例において、CD3⁺細胞、特にT細胞上のCD3のε鎖を、10 nMもしくはそれ未満、5 nMもしくはそれ未満、または2 nMもしくはそれ未満のK_Dで結合する。

いくつかの態様において、二重特異性2×2 T細胞エンゲージャの各ポリペプチドは4つの可変鎖ドメインの以下の組み合わせのうちの1つを含む: (i) SEQ ID NO:2、12、65、および69、(ii) SEQ ID NO:3、13、65、および69、(iii) SEQ ID NO:4、14、65、および69、(iv) SEQ ID NO:5、15、65、および69、(v) SEQ ID NO:1、11、64、および68、(vi) SEQ ID NO:2、12、64、および68、(vii) SEQ ID NO:2、12、66、および70、(viii) SEQ ID NO:4、14、66、および70、(ix) SEQ ID NO:5、15、66、および70、(x) SEQ ID NO:3、13、64、および68、(xi) SEQ ID NO:3、13、67、および71、(xii) SEQ ID NO:4、14、64、および68、(xiii) SEQ ID NO:5、15、64、および68、(xiv) SEQ ID NO:7、17、64、および68、(xv) SEQ ID NO:6、16、64、および68、(xvi) SEQ ID NO:6、16、67、および71、(xvii) SEQ ID NO:8、18、64、および68、(xviii) SEQ ID NO:9、19、64、および68; (xix) SEQ ID NO:9、19、67、および71、ならびに(xx) SEQ ID NO:10、20、64、および68。

本明細書において用いられる場合、「二量体」は、2つのポリペプチドの複合体をいう。ある特定の態様において、2つのポリペプチドは、特に2つのポリペプチド間に共有結合が存在しないという条件で、互いに非共有結合的に結び付いている。ある特定の例において、2つのポリペプチドは、二量体の安定化を補助するために形成されるジスルフィド結合のような共有結合を有する。ある特定の態様において、二量体はホモ二量体であり、すなわち2つの同一のポリペプチドを含む。「ポリペプチド」という用語は、アミド結合によって連結されたアミノ酸残基の重合体をいう。ポリペプチドは、ある特定の例において、分枝していない一本鎖融合タンパク質である。ポリペプチドでは、可変抗体ドメインが順々に連結されている。ポリペプチドは、他の例において、可変ドメインのN末端および/またはC末端残基に加えて、隣接するアミノ酸残基を有しうる。例えば、そのような隣接するアミノ酸残基は、いくつかの例においてC末端にタグ配列を含んでもよく、これはポリペプチドの精製および検出に有用であると考えられる。

1つの局面において、二重特異性2×2 T細胞エンゲージャの各ポリペプチドは、CD3結合タンパク質の可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)ならびにCD33結合タンパク質の可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)の4つの可変ドメインを含む。ある特定の態様において、4つの可変ドメインはペプチドリンカーL1、L2、およびL3により連結され、いくつかの例において、N末端からC末端へと以下の通りに配置される。
ドメイン順序:
(1) VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3); または
(2) VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3); または
(3) VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); または
(4) VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)。

報告された研究によれば、リンカーの長さは、抗原結合2×2 T細胞エンゲージャの柔軟性に影響を与える。したがって、いくつかの態様において、ペプチドリンカーL1、L2、およびL3の長さは、1つのポリペプチドのドメインが別のポリペプチドのドメインと分子間で結び付いて、二量体抗原結合2×2 T細胞エンゲージャを形成できるようなものである。ある特定の態様において、そのようなリンカーは「短い」、すなわち0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個のアミノ酸残基からなる。したがって、ある特定の例において、リンカーは、約12個またはそれ未満のアミノ酸残基からなる。0アミノ酸残基の場合、リンカーはペプチド結合である。そのような短いリンカーは、異なるポリペプチドの抗体可変軽鎖ドメインと抗体可変重鎖ドメインの間に的確な抗原結合部位を結合かつ形成することにより、2つのポリペプチドの分子間二量体化に有利に働く。リンカーを約12個またはそれ未満のアミノ酸残基に短縮すると、一般に、同じポリペプチド鎖の隣接するドメインが互いに分子内相互作用することを抑止する。いくつかの態様において、これらのリンカーは、約3～約10個、例えば4、5、または6個の隣接するアミノ酸残基からなる。

リンカーのアミノ酸組成に関しては、2つのポリペプチドの二量体化を妨げないペプチドが選択される。例えば、グリシンおよびセリン残基を含む、リンカーは、一般にプロテアーゼ耐性を提供する。リンカーのアミノ酸配列を、例えば、ファージディスプレイ法により最適化して、抗原結合ポリペプチド二量体の抗原結合および産生収量を改善することができる。いくつかの態様における2×2 T細胞エンゲージャに適したペプチドリンカーの例は、GGSGGS (SEQ ID NO:95)、GGSG (SEQ ID NO:96)、またはGGSGG (SEQ ID NO:97)である。

本明細書において記述される2×2 T細胞エンゲージャの非限定的な例は、表7による抗CD33 VLおよびVHドメイン、抗CD3 VLおよびVHドメイン、ドメイン順序、ならびにリンカーを有する2×2 T細胞エンゲージャである。

（表７）例示的なCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ

いくつかの態様において、2×2 T細胞エンゲージャはC末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグに付着される。いくつかの態様において、C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグを有する2×2 T細胞エンゲージャは、図10A～10Xに図示されるように2×2 T細胞エンゲージャ01 (SEQ ID NO:98)、02 (SEQ ID NO:99)、03 (SEQ ID NO:100)、04 (SEQ ID NO:101)、05 (SEQ ID NO:102)、06 (SEQ ID NO:103)、07 (SEQ ID NO:104)、08 (SEQ ID NO:105)、09 (SEQ ID NO:106)、10 (SEQ ID NO:107)、11 (SEQ ID NO:108)、12 (SEQ ID NO:109)、13 (SEQ ID NO:110)、14 (SEQ ID NO:111)、15 (SEQ ID NO:112)、16 (SEQ ID NO:113)、17 (SEQ ID NO:114)、18 (SEQ ID NO:115)、19 (SEQ ID NO:116)、20 (SEQ ID NO:117)、21 (SEQ ID NO:118)、22 (SEQ ID NO:119)、23 (SEQ ID NO:120)、または24 (SEQ ID NO:121)である。

いくつかの態様において、2×2 T細胞エンゲージャは、図11A～11Xに図示されるように2×2 T細胞エンゲージャ01 (SEQ ID NO:123)、02 (SEQ ID NO:124)、03 (SEQ ID NO:125)、04 (SEQ ID NO:126)、05 (SEQ ID NO:127)、06 (SEQ ID NO:128)、07 (SEQ ID NO:129)、08 (SEQ ID NO:130)、09 (SEQ ID NO:131)、10 (SEQ ID NO:132)、11 (SEQ ID NO:133)、12 (SEQ ID NO:134)、13 (SEQ ID NO:135)、14 (SEQ ID NO:136)、15 (SEQ ID NO:137)、16 (SEQ ID NO:138)、17 (SEQ ID NO:139)、18 (SEQ ID NO:140)、19 (SEQ ID NO:141)、20 (SEQ ID NO:142)、21 (SEQ ID NO:143)、22 (SEQ ID NO:144)、23 (SEQ ID NO:145)、または24 (SEQ ID NO:146)である。

本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体(例えば、CD33/CD3二重特異性2×2 T細胞エンゲージャ)は、いくつかの態様において、別の同一のポリペプチドと結び付く2×2 T細胞エンゲージャのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させて抗原結合2×2 T細胞エンゲージャを形成させることにより産生される。それゆえ、別の局面は、本明細書において記述される抗原結合2×2 T細胞エンゲージャのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばDNAまたはRNAである。

前記ポリヌクレオチドは、公知の方法により、例えばペプチドリンカーによって分離されたまたは他の態様においてペプチド結合により直接連結された、少なくとも4つの抗体可変ドメインをコードする遺伝子を、適当なプロモーター、および任意で適当な転写終結因子に機能的に連結された単一の遺伝子コンストラクトの中に組み合わせ、それを細菌または例えばCHO細胞のような他の適切な発現系において発現させることにより構築される。用いられるベクター系および宿主に応じて、構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の適当な転写および翻訳要素が用いられうる。プロモーターは、それが各宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動するように選択される。

いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、さらなる態様に当たる、ベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。この組み換えベクターは、公知の方法にしたがって構築することができる。

記述された抗原結合2×2 T細胞エンゲージャのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有かつ発現させるために、種々の発現ベクター/宿主系が用いられうる。大腸菌(E.coli)における発現のための発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのpSKK (Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27)またはpcDNA5 (Invitrogen)である。

したがって、本明細書において記述される抗原結合2×2 T細胞エンゲージャは、いくつかの態様において、上記のポリペプチドをコードするベクターを宿主細胞に導入し、ポリペプチド鎖が発現される条件の下で前記宿主細胞を培養することにより産生され、単離されてもよく、および任意で、さらに精製されてもよい。

他の局面において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体(例えば、CD33/CD3二重特異性2×2 T細胞エンゲージャ)は、修飾を有する。典型的な修飾は、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、薬物結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、およびユビキチン化を含むが、これらに限定されることはない。さらなる態様において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、リーダーもしくは分泌配列またはポリペプチドの精製のための配列のような、さらなるアミノ酸で修飾される。

さらなる局面において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体(例えば、CD33/CD3二重特異性2×2 T細胞エンゲージャ)は、二重特異性抗体の半減期を延長する半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインは、限定されるものではないが、HSA結合ドメイン、ペグ化、小分子、および当技術分野において公知の他の半減期延長ドメインを含むと考えられる。ヒト血清アルブミン(HSA) (分子量約67 kDa)は、血漿中で最も豊富なタンパク質であり、約50 mg/ml (600 μM)で存在し、ヒトでは20日前後の半減期を有する。HSAは、血漿pHを維持する働きをし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝産物および脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質として働く。アルブミンとの非共有結合は、タンパク質の消失半減期を延長する。いくつかの態様において、半減期延長ドメインは、HSAに特異的なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片(scFv)、単一ドメイン抗体、例えば重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)およびラクダ科動物由来の単一ドメイン抗体の可変ドメイン(VHH)、ペプチド、リガンドまたは小分子実体に由来するドメインを含むが、これらに限定されない、HSAに結合するドメインである。

他の局面において、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体、CD33およびCD3に対する二重特異性抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはこのベクターによって形質転換された宿主細胞および少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。「薬学的に許容される担体」という用語は、成分の生物学的活性の有効性を妨げず、それが投与される患者に対して毒性がない任意の担体を含むが、これらに限定されることはない。適当な薬学的担体の例は当技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、油/水乳濁液のような乳濁液、さまざまなタイプの湿潤剤、無菌溶液などを含む。そのような担体は、従来の方法により製剤化することができ、適当な用量で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物はまた、保存料、乳化剤および分散剤のような補助剤を含有しうる。微生物の作用の阻止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤を含めることによって確実にされうる。さらなる局面において、薬学的組成物は、持続放出のための賦形剤、例えばPLGAナノ粒子などを含む。さらなる局面において、薬学的組成物は、特定の部位での持続放出のために身体へ挿入するための装置にコーティングされる。

CD33およびCD3への高親和性結合を有するCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、多数の原発性AML標本において非常に活性であり、これらの分子が細胞遺伝学的/分子疾患スペクトラム全体にわたって、最小限のCD33発現の場合でさえ、ヒトAMLに対して活性でありうることを示唆している。注目すべきことに、薬物特異的細胞障害性は、残存自己T細胞の存在下においても観察され、制御された量の健常ドナーT細胞の添加によって大幅に増強される(実施例6参照)。

CD33およびCD3に対する二重特異性抗体、特に2×2 T細胞エンゲージャは、インビトロでCD33⁺白血病細胞の強力な細胞溶解を誘導することができる。データから、CD33とCD3の両方への高親和性結合が、二重特異性タンパク質誘導T細胞活性化および抗AML有効性を最大にすることが示唆される。本明細書において記述される2×2 T細胞エンゲージャのような、高親和性のCD33/CD3に対する二重特異性結合タンパク質は、インビトロで原発性AMLにおいて細胞溶解活性を示す。したがって、CD33およびCD3に対するこれらの二重特異性抗体、特に2×2 T細胞エンゲージャは、急性骨髄性白血病(AML)または他の血液悪性腫瘍、例えば、骨髄異形成症候群(MDS)または骨髄増殖性疾患(MPD)の処置のための治療アプローチに適している。

それゆえ、CD33⁺がん(例えば急性骨髄性白血病(AML))、疾患または状態の処置のために対象、例えば患者に有効用量で上記の本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体が投与される方法が、本明細書において提供される。CD33⁺がんは、急性白血病、例えば急性骨髄性白血病、前駆B細胞リンパ芽球性白血病を含む急性リンパ芽球性白血病(ALL)、骨髄肉腫、多発性骨髄腫、急性リンパ腫、例えば急性リンパ芽球性リンパ腫、慢性骨髄単球性白血病などを含むが、これらに限定されることはない。

CD33⁺疾患または状態の処置のために対象、例えば患者に有効用量で上記の本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体が投与される方法も、本明細書において提供される。CD33⁺疾患および状態は、ある特定のがんおよび慢性炎症での骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)に起因した免疫抑制状態または環境を含む。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、急性骨髄性白血病(AML)の処置のために投与される。ある特定の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、急性骨髄性白血病サブタイプの処置のために投与される。

仏米英の分類システムでは、AMLを8つのサブタイプに分類している: AML-M0 (最小分化)、AML-M1 (成熟なし)、AML-M2 (顆粒球成熟あり)、AML-M3 (前骨髄球性または急性前骨髄球性白血病)、AML-4 (急性骨髄単球性白血病)、AML-M5 (急性単芽球性または単球性白血病)、AML-M6 (急性赤血球性白血病)、およびAML-M7 (急性巨核芽球性白血病)。ある特定の例において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、AML-M0、AML-M1、AML-M2、AML-M3、AML-M4、AML-M5、AML-M6、またはAML-M7の処置のために投与される。

WHO AML分類スキームでは、以下のサブタイプにしたがってAMLを整理している: 再発性遺伝子異常を伴うAML、骨髄異形成関連の変化を伴うAML、治療関連の骨髄性新生物、骨髄肉腫、ダウン症候群に関連する骨髄増殖、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、および他に分類されていないAML。ある特定の他の例において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、再発性遺伝子異常を伴うAML、骨髄異形成関連の変化を伴うAML、治療関連の骨髄性新生物、骨髄肉腫、ダウン症候群に関連する骨髄増殖、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、または他に分類されていないAMLの処置のために投与される。

いくつかの他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、新たに診断されたAML、再発性AML、または難治性AMLの処置のために投与される。

さらなる態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、骨髄異形成症候群(MDS)または骨髄増殖性疾患(MPD)のような前白血病血液障害の処置のために投与される。ある特定の例において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、MDSの処置のために投与される。ある特定の例において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、MPDの処置のために投与される。

他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、多発性骨髄腫の処置のために投与される。さらなる態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、慢性骨髄単球性白血病(CMML)の処置のために投与される。

他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)を阻害または排除するために投与される。MDSCは、ある特定の孤立した病変組織においてCD33を高度に過剰発現し、強力な免疫抑制活性を保有する。ある特定のヒトがん(CD33⁺および非CD33⁺)では、MDSCが増殖し、活性化されて腫瘍特異的CD4⁺ T細胞応答を抑制し、T_reg細胞を誘導し、微小環境で腫瘍またはがんが活発に増殖することを可能にする。慢性炎症では、MDSCはT細胞免疫機能を抑制するために増殖され、炎症部位に見られると報告されている。他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、MDSCに関連する状態を処置するために投与される。さらに他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、免疫抑制を処置するために投与される。さらに他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、MDSCによって抑制される免疫抑制または炎症を処置するために投与される。さらに他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、MDSCによって引き起こされる免疫応答の低下を処置するために投与される。さらに他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、MDSCによって促進されるがんの血管新生、腫瘍浸潤、または転移を処置するために投与される。さらに他の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、MDSCによって増強、増進、悪化、または増大されるがんまたは腫瘍を処置するために投与される。そのようながんは、血液がん、ならびに膵がん、胃がん、食道がん、および黒色腫を含むがこれらに限定されない固形腫瘍を含む。

投薬および投与
本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、医薬としての使用が企図される。投与はさまざまな方法により、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、病巣内、局所、または皮内の投与により達成される。いくつかの態様において、投与の経路は、治療の種類および薬学的組成物に含有される化合物の種類に依存する。投与レジメンは主治医および他の臨床的要因によって決定される。任意の1人の患者のための投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間および経路、治療の種類、全般的健康ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。

「有効用量」は、疾患の経過および重症度に影響を及ぼし、そのような病状の低減または寛解をもたらすのに十分な活性成分の量をいう。例えば、AMLのようなCD33⁺がんを処置および/または予防するのに有用な「有効用量」は、既知の方法を用いて決定されうる。最大耐用量(MTD)および最大応答用量(MRD)は、確立された動物およびヒトの実験プロトコールを介して、ならびに本明細書において記述される実施例において決定することができる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、約0.01 μg～約1000 μg、約0.05 μg～約500 μg、約0.1 μg～約500 μg、または約0.5 μg～約300 μgの、1日あたりの用量、すなわち「連続用量」で提供される。ある特定の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、約0.01 μg、約0.02 μg、約0.05 μg、約0.07 μg、約0.1 μg、約0.2 μg、約0.3 μg、約0.4 μg、約0.5 μg、約0.6 μg、約0.7 μg、約0.8 μg、約0.9 μg、約1 μg、約1.5 μg、約2 μg、約2.5 μg、約3 μg、約4 μg、約5 μg、約6 μg、約7 μg、約8 μg、約9 μg、約10 μg、約12 μg、約15 μg、約20 μg、約25 μg、約30 μg、約35 μg、約40 μg、約45 μg、約50 μg、約55 μg、約60 μg、約65 μg、約70 μg、約75 μg、約80 μg、約85 μg、約90 μg、約95 μg、約100 μg、約125 μg、約150 μg、約175 μg、約200 μg、約250 μg、約275 μg、約300 μg、約350 μg、約400 μg、約450 μg、約500 μg、約600 μg、約700 μg、約800 μg、約900 μg、約1000 μg、約2000 μg、約3000 μg、もしくはそれ以上、またはその中で導出可能な任意の範囲の日用量または連続用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約0.5 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約1.5 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約5 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約15 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約50 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約100 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約150 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約200 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約250 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約300 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約500 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約1000 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約2000 μgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約3000 μgの日用量で提供される。

さらなる態様において、本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、体重あたり約0.0001 μg/kg～約10 μg/kgの日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約0.001 μg/kg、約0.005 μg/kg、約0.01 μg/kg、約0.03 μg/kg、約0.05 μg/kg、約0.07 μg/kg、約0.1 μg/kg、約0.2 μg/kg、約0.3 μg/kg、約0.4 μg/kg、約0.5 μg/kg、約0.6 μg/kg、約0.7 μg/kg、約0.8 μg/kg、約0.9 μg/kg、約1 μg/kg、約2 μg/kg、約3 μg/kg、約4 μg/kg、約5 μg/kg、約6 μg/kg、約7 μg/kg、約8 μg/kg、約9 μg/kgもしくは約10 μg/kg、約20 μg/kg、もしくは約30 μg/kg、またはそれ以上、あるいはその中で導出可能な任意の範囲の日用量で提供される。

さらなる態様において、本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、約0.005 μg/m²～約 500 μg/m²の患者体表面積、約0.025 μg/m²～約250 μg/m²、約0.05 μg/m²～約250 μg/m²、または約0.25 μg/m²～約150 μg/m²の1日用量で提供される。ある特定の態様において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約0.005 μg/m²、約0.01 μg/m²、約0.05 μg/m²、約0.1 μg/m²、約0.2 μg/m²、約0.3 μg/m²、約0.4 μg/m²、約0.5 μg/m²、約0.6 μg/m²、約0.7 μg/m²、約0.8 μg/m²、約0.9 μg/m²、約1 μg/m²、約1.5 μg/m²、約2 μg/m²、約2.5 μg/m²、約3 μg/m²、約4 μg/m²、約5 μg/m²、約6 μg/m²、約7 μg/m²、約8 μg/m²、約9 μg/m²、約10 μg/m²、約12 μg/m²、約15 μg/m²、約20 μg/m²、約25 μg/m²、約30 μg/m²、約35 μg/m²、約40 μg/m²、約45 μg/m²、約50 μg/m²、約60 μg/m²、約70 μg/m²、約80 μg/m²、約90 μg/m²、約100 μg/m²、約125 μg/m²、約150 μg/m²、約175 μg/m²、約200 μg/m²、約250 μg/m²、約275 μg/m²、約300 μg/m²、約350 μg/m²、約400 μg/m²、約450 μg/m²、約500 μg/m²、約600 μg/m²、約700 μg/m²、約800 μg/m²、約1000 μg/m²、約1200 μg/m²、もしくは約1500 μg/m²、またはそれ以上、あるいはその中で導出可能な任意の範囲の日用量で提供される。

本明細書において記述される1日用量は、ボーラス注入または持続注入によって投与することができる。本明細書において用いられるボーラス注入は、6時間より前に中断される注入をいい、一方で「持続注入」という用語は、中断なしで少なくとも6時間永続的に進行することが許容される注入をいう。「持続注入」は、永続的に投与される注入をいう。したがって、本発明の文脈では、「永続的」および「持続的」という用語は同義語として用いられる。いくつかの態様において、本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、1日あたり6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、14時間、16、18、20、22、または24時間にわたる持続注入として投与される。いくつかの態様において、二重特異性抗体は12時間の持続注入として投与される。いくつかの態様において、二重特異性抗体は24時間の持続注入として投与される。本明細書において記述される1日用量は、1日あたり1回または1日2回、1日3回、1日4回などで与えられる分割用量(sub-dose)の形で1日あたり複数回与えることができ、ここで分割用量の数は1日用量に等しい。本明細書において記述される1日用量および/またはその分割用量は、患者の同じ場所の部位または異なる部位に投与できることがさらに企図される。

本明細書において記述される1日用量は、さらなる態様において、ある特定の注入速度で投与することができる。ある特定の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、約0.01 μg/時間、約0.02 μg/時間、約0.05 μg/時間、約0.07 μg/時間、約0.1 μg/時間、約0.2 μg/時間、約0.3 μg/時間、約0.4 μg/時間、約0.5 μg/時間、約0.6 μg/時間、約0.7 μg/時間、約0.8 μg/時間、約0.9 μg/時間、約1 μg/時間、約1.5 μg/時間、約2 μg/時間、約2.5 μg/時間、約3 μg/時間、約4 μg/時間、約5 μg/時間、約6 μg/時間、約7 μg/時間、約8 μg/時間、約9 μg/時間、約10 μg/時間、約12 μg/時間、約15 μg/時間、約20 μg/時間、約25 μg/時間、約30 μg/時間、約35 μg/時間、約40 μg/時間、約45 μg/時間、約50 μg/時間、約55 μg/時間、約60 μg/時間、約65 μg/時間、約70 μg/時間、約75 μg/時間、約80 μg/時間、約85 μg/時間、約90 μg/時間、約95 μg/時間、約100 μg/時間μg、約125 μg/時間、約150 μg/時間、約175 μg/時間、約200 μg/時間、もしくはそれ以上、またはその中で導出可能な任意の範囲の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約0.25 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約0.5 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約0.75 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約1 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約1.5 μg/時間の1日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約2 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約2.5 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約3 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約4 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約5 μgの1日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約6 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約7 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約7.5 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約8 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約9 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約10 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約15 μg/時間の1日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約20 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約25 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約30 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約40 μg/時間の速度で注入される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約50 μg/時間の1日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約60 μg/時間の1日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約70 μg/時間の1日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約80 μg/時間の1日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約90 μg/時間の1日用量で提供される。ある特定の例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約100 μg/時間の1日用量で提供される。

注入速度は、サイトカイン放出症候群のような副作用のリスクを低減するために可変であってもよく、または対象を二重特異性抗体に慣らすことを可能にすることがさらに企図される。いくつかの例において、注入速度はある特定の期間ある速度で、すなわち導入(lead-in)用量で始まり、その後、高い速度に「ステップアップする」ことができる。いくつかの例において、注入速度は2つまたはそれ以上の「ステップアップする」より高い速度を含むことができる。いくつかの例において、注入速度はある特定の速度で始まり、その後、より低い速度に「ステップダウンする」ことができる。いくつかの例において、注入速度は2つまたはそれ以上の「ステップダウンする」より低い速度を含むことができる。さらなる例において、注入速度は「ステップアップ」と「ステップダウン」の両方の速度を含むことができる。ある特定の態様において、本明細書において記述されるCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、約0.01 μg、約0.02 μg、約0.05 μg、約0.07 μg、約0.1 μg、約0.2 μg、約0.3 μg、約0.4 μg、約0.5 μg、約0.6 μg、約0.7 μg、約0.8 μg、約0.9 μg、約1 μg、約1.5 μg、約2 μg、約2.5 μg、約3 μg、約4 μg、約5 μg、約6 μg、約7 μg、約8 μg、約9 μg、約10 μg、約12 μg、約15 μg、約20 μg、約25 μg、約30 μg、約35 μg、約40 μg、約45 μg、約50 μg、約55 μg、約60 μg、約65 μg、約70 μg、約75 μg、約80 μg、約85 μg、約90 μg、約95 μg、約100 μg、約125 μg、約150 μg、約175 μg、約200 μg、約250 μg、約275 μg、約300 μg、約350 μg、約400 μg、約450 μg、約500 μg、約600 μg、約700 μg、約800 μg、約900 μg、または約1000 μgの導入用量で提供される。ある特定の態様において、導入用量は5 μgである。ある特定の態様において、導入用量は10 μgである。ある特定の態様において、導入用量は15 μgである。ある特定の態様において、導入用量は20 μgである。ある特定の態様において、導入用量は25 μgである。ある特定の態様において、導入用量は30 μgである。ある特定の態様において、導入用量は35 μgである。ある特定の態様において、導入用量は40 μgである。ある特定の態様において、導入用量は45 μgである。ある特定の態様において、導入用量は50 μgである。ある特定の態様において、導入用量は55 μgである。ある特定の態様において、導入用量は60 μgである。ある特定の態様において、導入用量は65 μgである。ある特定の態様において、導入用量は70 μgである。ある特定の態様において、導入用量は75 μgである。ある特定の態様において、導入用量は80 μgである。ある特定の態様において、導入用量は85 μgである。ある特定の態様において、導入用量は90 μgである。ある特定の態様において、導入用量は95 μgである。ある特定の態様において、導入用量は100 μgである。

さらなる態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与は、本明細書において記述される用量または医師によって決定および熟慮される他の用量レベルである。ある特定の治療用途において、二重特異性抗体は、がんに既に罹患している患者に、がんの症状を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。この使用に有効な量は、がんの重症度および経過、以前の治療、患者の健康状態、体重、薬物への応答、ならびに処置医師の判断に依存する。治療的有効量は、以下の実施例に記述されているような、用量漸増臨床試験を含むが、これに限定されない、方法によって任意で決定されてもよい。

いくつかの態様において、本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、継続的または長期的に投与され、すなわち、特定の時間またはサイクルの間に毎日投薬される。いくつかの態様において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、少なくとも1週間(7日間)、少なくとも2週間(14日間)、少なくとも3週間(21日間)、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも12週間、少なくとも約16週間、少なくとも約20週間、少なくとも約24週間、少なくとも約28週間、少なくとも約32週間、少なくとも約36週間、少なくとも約40週間、少なくとも約44週間、少なくとも約48週間、少なくとも約52週間、少なくとも約56週間、少なくとも約60週間、少なくとも約64週間、少なくとも約68週間、少なくとも約72週間、少なくとも約90週間、少なくとも約100週間、少なくとも約110週間、および少なくとも約120週間投与される。

投与期間は、所定の日数または週数が1つの処置サイクルに相当する処置サイクルとさらに定義することができる。いくつかの態様において、1つの処置サイクルは、約1週間、約2週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、または約16週間の投与期間である。ある特定の態様において、1つの処置サイクルは、14日間または2週間である。本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与のための処置サイクルはまた、1サイクル、2サイクル、3サイクル、4サイクル、5サイクル、6サイクル、7サイクル、8サイクル、9サイクル、10サイクル、11サイクル、12サイクル、13サイクル、14サイクル、15サイクル、16サイクル、17サイクル、18サイクル、19サイクル、20サイクル、25サイクル、30サイクル、40サイクル、またはそれ以上を含むが、これらに限定されることはない。

本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与量は、いくつかの態様において、処置サイクルごとに同じものであることができ、あるいは投与量はサイクルごとに異なってもよくまたは投与量はサイクル内で異なってもよい。いくつかの態様において、本明細書において記述される二重特異性抗体のより高い初期用量が最初のサイクルで投与され、より低い用量が後続の全てのサイクルで投与される。他の態様において、投与量は各サイクルの投与ごとに徐々に減らされる。さらに他の態様において、投与量は各サイクルの投与ごとに徐々に増やされる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与には、1回またはそれ以上の処置サイクルにおいて「休薬日」が差し控えられるかまたは与えられる。例えば、本明細書において記述される二重特異性抗体は、1つの処置サイクルの間に投与され、その後、次の処置サイクルの間には差し控えられる。他の態様において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、1処置サイクルおきに、2処置サイクルおきに、3処置サイクルおきに、4処置サイクルおきに、または5処置サイクルおきに対象から差し控えられる。

本明細書において記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与は、他の態様において、間欠投薬計画で提供することもできる。間欠投薬計画は、本明細書において記述される二重特異性抗体を数日間投与すること、ある特定の期間投与を差し控えること、続いて二重特異性抗体を別の後続の差し控えとともに再び投与することを含む。間欠投薬は、二重特異性抗体の有効性の可能性を最大化するだけでなく、安全プロファイル内に留まるように用いることができる。非限定的な例では、14日間の処置サイクルについて、二重特異性抗体を1～4日目および8～12日目に投与することができる。別の間欠投薬計画は、1日おきの二重特異性抗体の投与である。1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日間毎日の二重特異性抗体の投与、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日間の差し控え期間、および任意の毎日の差し控え期間、ならびに処置サイクル内の直前の投与と同様のまたは異なる差し控え期間を含む、他の間欠投薬計画が企図される。非限定的な例において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、ある特定の用量で3日間毎日投与され、その後、特定の処置期間またはサイクルの同じまたは異なる用量で1日おきに投与される(例えば、図24、下部を参照のこと)。

さらなる態様において、本明細書で記述される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与は、週1回、週2回、週3回、週4回、週5回、または週6回提供される。ある特定の例において、二重特異性抗体の投与は週1回提供される。ある特定の例において、二重特異性抗体の投与は週2回提供される。ある特定の例において、二重特異性抗体の投与は週3回提供される。

ある特定の態様において、間欠投薬は用量漸増と組み合わされる。用量漸増は、ある特定の投与量での二重特異性抗体の投与と、次いで間欠期間後の投与量の増加をいう。用量は、1、2、3、4、または5回漸増することができる。例えば、1日おきの間欠投薬は5→15→100 μgの用量漸増を有することができ、ここで5日目以降に100 μgの用量に達する(図24、上部)。

薬物動態および薬力学
本明細書において提供される、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投薬レジメンおよび投与レジメンは、T細胞に結合し拘束する他の治療用タンパク質または二重特異性抗体では見られない独特な薬物動態プロファイルをさらに提供する。

多くの治療用タンパク質は、迅速なクリアランスおよび短い半減期を有する。市販されているそのようなタンパク質の例としては、インターフェロンα-2a (ロフェロン(Roferon)-A(登録商標), 半減期: 3.7～8.5時間, MW 19 kDa)、フィルグラスチム(ニューポジェン(Neupogen) (登録商標), 半減期: 3.5時間, MW 18 kDa)およびイミグルセラーゼ(セレザイム(Cerezyme) (登録商標), 半減期: 4～10分, MW 60 kDa)が挙げられる。多くの二重特異性抗体も、迅速なクリアランスおよび短い半減期を有する。例えば、抗CD19×CD3二重特異性BiTE(登録商標)抗体(MW 54 kDa)であるブリナツモマブは1～2時間前後の半減期を有する。

ある特定のタンパク質および抗体の迅速なクリアランスおよび短い半減期は、より頻繁なまたはより長い投薬レジメンを必要としうる。半減期を延長させる現行の方法は、タンパク質のFcRnリサイクルを促進するためのFcドメインの付加、グリコシル化もしくはペグ化のような修飾、またはアルブミンのような血清タンパク質への連結もしくは結合を含む。対照的に、本明細書において記述される標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、ヒト対象に投与された場合におよそ1～2日の長い半減期を有する。いくつかの態様において、本明細書において記述される標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原に対する二重特異性抗体は、2時間超、約3時間、約4時間、約6時間、約8、約時間、約10時間、約12時間、約14時間、約16時間、約18時間、約20時間、約22時間、約24時間、約30時間、約36時間、約40時間、約44時間、約48時間、または48時間超の半減期を有する。これは、本明細書において記述される標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体が既報のものなどの半減期伸長法でデザインされていないという点で注目に値する。本明細書において記述される二重特異性抗体の長い半減期は、より少ない頻度の投薬、より少ない投薬、および処置サイクルの間または後に長期にわたる有効濃度を有するなどの治療的有用性を提示する。いくつかの態様において、本明細書において記述される二重特異性抗体は、約48時間または2日の半減期を有する。

別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、血中の最大濃度(C_最大)が約1日～28日間で達成され、薬物濃度の一貫した増加がさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、1日で、2日間で、3日間で、4日間で、5日間で、6日間で、7日間で、8日間で、9日間で、10日間で、11日間で、12日間で、13日間で、14日間で、15日間で、16日間で、17日間で、18日間で、19日間で、20日間で、21日間で、またはそれ以上の日数でC_最大がさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、1日でC_最大がさらに提供される。

別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、血中の定常状態濃度(C_ss)が約1日～21日間で達成され、薬物濃度の一貫した増加がさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、1日で、2日間で、3日間で、4日間で、5日間で、6日間で、7日間で、8日間で、9日間で、10日間で、11日間で、12日間で、13日間で、14日間で、15日間で、16日間で、17日間で、18日間で、19日間で、20日間で、21日間で、またはそれ以上の日数でC_ssがさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、1日でC_ssがさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、1日～3日間でC_ssがさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、3日～7日間でC_ssがさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、1日～7日間でC_ssがさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、7日～14日間でC_ssがさらに提供される。

いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、3日～14日間でC_ssがさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、14日～21日間でC_ssがさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、7日～21日間でC_ssがさらに提供される。

さらに別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、血中のC_最大および定常状態濃度(C_ss)が約1日～28日間で達成され、薬物濃度の一貫した増加がさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、1日で、2日間で、3日間で、4日間で、5日間で、6日間で、7日間で、8日間で、9日間で、10日間で、11日間で、12日間で、13日間で、14日間で、15日間で、16日間で、17日間で、18日間で、19日間で、20日間で、21日間で、またはそれ以上の日数でC_最大およびC_ssがさらに提供される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、1日でC_最大およびC_ssがさらに提供される。

いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、約10 pg/mL、約20 pg/mL、約30 pg/mL、約40 pg/mL、約50 pg/mL、約60 pg/mL、約70 pg/mL、約80 pg/mL、約90 pg/mL、約100 pg/mL、約150 pg/mL、約200 pg/mL、約250 pg/mL、約300 pg/mL、約350 pg/mL、約400 pg/mL、約500 pg/mL、約600 pg/mL、約00 pg/mL、約800 pg/mL、約900 pg/mL、約1000 pg/mL、約2000 pg/mL、約3000 pg/mL、約4000 pg/mL、約5000 pg/mL、約6000 pg/mL、約7000 pg/mL、約8000 pg/mL、約9000 pg/mL、または約10000 pg/mLのC_最大を提供する用量および頻度で投与される。

いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、約10 pg/mL、約20 pg/mL、約30 pg/mL、約40 pg/mL、約50 pg/mL、約60 pg/mL、約70 pg/mL、約80 pg/mL、約90 pg/mL、約100 pg/mL、約150 pg/mL、約200 pg/mL、約250 pg/mL、約300 pg/mL、約350 pg/mL、約400 pg/mL、約500 pg/mL、約600 pg/mL、約00 pg/mL、約800 pg/mL、約900 pg/mL、約1000 pg/mL、約2000 pg/mL、約3000 pg/mL、約4000 pg/mL、約5000 pg/mL、約6000 pg/mL、約7000 pg/mL、約8000 pg/mL、約9000 pg/mL、または約10000 pg/mLのC_ssを提供する用量および頻度で投与される。

さらなる態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、約100日^＊pg/mL、約200日^＊pg/mL、約300日^＊pg/mL、約400日^＊pg/mL、約500日^＊pg/mL、約600日^＊pg/mL、約700日^＊pg/mL、約800日^＊pg/mL、約900日^＊pg/mL、約1000日^＊pg/mL、約2000日^＊pg/mL、約3000日^＊pg/mL、約4000日^＊pg/mL、約5000日^＊pg/mL、約6000日^＊pg/mL、約7000日^＊pg/mL、約8000日^＊pg/mL、約9000日^＊pg/mL、10000日^＊pg/mL、20000日^＊pg/mL、30000日^＊pg/mL、40000日^＊pg/mL、50000日^＊pg/mL、60000日^＊pg/mL、70000日^＊pg/mL、80000日^＊pg/mL、90000日^＊pg/mL、または100000日^＊pg/mLのAUCを提供する用量および頻度で投与される。

別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与は、既存の二重特異性抗体と比較して望ましい薬力学プロファイルをもたらす。前述のように、抗体療法で観察される一般的な現象は、CRSの発生である。例えば、ブリナツモマブの初回投与はサイトカイン放出の急速な増大をもたらし、1日目にはIL-10、IL-6、IFN-γ、TNFα、およびIL-2のレベル上昇がある。初期サイトカイン放出も用量依存的である。この報告された所見がブリナツモマブの段階的投薬レジメンにつながり、ここでは初期サイトカイン放出を低減するために初期低用量が必要とされる。

標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、ブリナツモマブおよび他の二重特異性抗体とは対照的に、制御されたまたは漸進的なサイトカイン放出が提供されることがさらに企図される。そのようなサイトカインは、TNFα、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGFβ、およびIFNγを含むが、これらに限定されることはない。さらに、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、制御されたT細胞の増大および/または活性化が提供されることが企図される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、短期のバースト様T細胞活性化が抑止される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、長期T細胞の活性化および増殖が促進される。

別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、炎症が低減する。炎症は、血液もしくは血清中のC反応性タンパク質(CRP)レベルのようなマーカー、または赤血球沈降速度(ESR)もしくは血漿粘度(PV)のような他の試験によって測定することができる。CRP (またはESRもしくはPV)レベルの上昇または亢進は、炎症の徴候である。AMLのようながんを有する多くの対象は、CRPレベルの亢進も有する。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、CRPレベルを約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%低減する。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、CRPレベルが、約90 mg/L、約80 mg/L、約70 mg/L、約60 mg/L、約50 mg/L、約40 mg/L、約30 mg/L、約20 mg/L、約10 mg/L、約5 mg/L、約2 mg/L、または約1 mg/Lにまで低減する。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、CRPレベルが正常レベル(例えば、約5～約10 mg/L)にまで低減する。

ある特定のがんでは、血球の生成が著しく低減または抑制される。別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、造血が促進、回復、または再生される。別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、骨髄造血が促進、回復、または再生される。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、造血幹細胞が増大する。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、または血小板を含む骨髄性細胞が増大する。いくつかの態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、リンパ系細胞(例えば、T細胞、B細胞、およびNK細胞)が増大する。

ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、絶対好中球数が、約10%、約120%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、もしくは約100%、またはそれ以上増加する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、絶対好中球数が、約0.1×10⁹/L、約0.2×10⁹/L、約0.3×10⁹/L、約0.4×10⁹/L、約0.5×10⁹/L、約0.6×10⁹/L、約0.7×10⁹/L、約0.8×10⁹/L、約0.9×10⁹/L、約1×10⁹/L、約1.5×10⁹/L、約2×10⁹/L、約2.5×10⁹/L、約3×10⁹/L、約3.5×10⁹/L、約4×10⁹/L、約4.5×10⁹/L、約5×10⁹/L、約5.5×10⁹/L、約6×10⁹/L、約6.5×10⁹/L、約7×10⁹/L、約7.5×10⁹/L、もしくは約8×10⁹/L、またはそれ以上にまで増加する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、絶対好中球数が正常レベル(例えば、約2×10⁹/L～約8×10⁹/L)にまで増加する。

ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、単球数が、約10%、約120%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、もしくは約100%、またはそれ以上増加する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、単球数が、約0.05×10⁹/L、約0.1×10⁹/L、約0.15×10⁹/L、約0.2×10⁹/L、約0.2.5×10⁹/L、約0.3×10⁹/L、約0.4×10⁹/L、約0.5×10⁹/L、約0.6×10⁹/L、約0.7×10⁹/L、約0.8×10⁹/L、約0.9×10⁹/L、約1×10⁹/L、またはそれ以上にまで増加する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、絶対好中球数が正常レベル(例えば、約0.2×10⁹/L～約1×10⁹/L)にまで増加する。

ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、血小板レベルが増加する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、血小板数が、約40×10⁹/L、約50×10⁹/L、約60×10⁹/L、約70×10⁹/L、約80×10⁹/L、約90×10⁹/L、約100×10⁹/L、約125×10⁹/L、約150×10⁹/L、約175×10⁹/L、約200×10⁹/L、約225×10⁹/L、約250×10⁹/L、約275×10⁹/L、約300×10⁹/L、約325×10⁹/L、約350×10⁹/L、約375×10⁹/L、約400×10⁹/L、約450×10⁹/L、約475×10⁹/L、約500×10⁹/L、またはそれ以上にまで増加する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、血小板数が正常レベル(例えば、約150×10⁹/L～約450×10⁹/L)にまで増加する。

ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、赤血球(erythrocyte)または赤血球(red blood cell)レベルが増加する。赤血球レベルは、ヘモグロビン濃度によって決定することができる。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、ヘモグロビン濃度が、約10%、約120%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、もしくは約100%、またはそれ以上増加する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、ヘモグロビン濃度が、約8 g/dL、約8.5 g/dL、約9 g/dL、約9.5 g/dL、約10 g/dL、約10.5 g/dL、約11 g/dL、約11.5 g/dL、約12 g/dL、約12.5 g/dL、約13 g/dL、約13.5 g/dL、約14 g/dL、約14.5 g/dL、約15 g/dL、約15.5 g/dL、約16 g/dL、約16.5 g/dL、約17 g/dL、約17.5 g/dL、約18 g/dL、約18.5 g/dL、約19 g/dL、約19.5 g/dL、もしくは約20 g/dL、またはそれ以上にまで増加する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、ヘモグロビン濃度が正常レベル(約12～約18 g/dL)にまで増加する。

別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、AMLを有する対象における骨髄芽球のレベルが低減する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、骨髄芽球のレベルを約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%低減させる。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、骨髄芽球のレベルを制御し、ここで骨髄芽球はそのレベルが増加しない。

別の局面において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体の投与によって、骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)のレベルが低減する。ある特定の態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、MDSCのレベルを約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%低減させる。

さらなる組み合わせ
さらなる態様において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、がん、疾患または状態に対する標準的な治療と組み合わせて投与される。標準的な治療は、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、放射線、手術、遺伝子治療などを含む。ある特定の例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、標準的なAML治療と組み合わせて投与される。ある特定の例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシンなど)、アムサクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレキサート、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン(例えば、エトポシド、テニポシドなど)、アントラセンジオン(例えば、ミトキサントロン、ピキサントロン、ロソキサントロン、ピロキサントロン、アメタントロンなど)、抗CD20剤(例えば、リツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、またはそれらの組み合わせと組み合わせて投与される。ある特定の例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、シタラビン(ara-C)と組み合わせて投与される。ある特定の例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、アザシチジンと組み合わせて投与される。ある特定の例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、デシタビンと組み合わせて投与される。さらなる例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシンなど)と組み合わせて投与される。他の例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、チェックポイント阻害剤(例えば、PD-1阻害剤、CTLA-4阻害剤など)と組み合わせて投与される。さらに他の例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、エピポドフィロトキシン(例えば、エトポシド、テニポシドなど)と組み合わせて投与される。さらに他の例において、標的細胞上に発現する抗原およびT細胞上に発現する抗原、例えばCD33およびCD3に対する二重特異性抗体は、アントラセンジオン(例えば、ミトキサントロン、ピキサントロン、ロソキサントロン、ピロキサントロン、アメタントロンなど)と組み合わせて投与される。

以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、記述された態様をさらに例示している。

実施例1
一本鎖Fv抗体をコードするDNA発現コンストラクトのクローニング
大腸菌における抗CD33一本鎖Fv (scFv)抗体の細菌発現のために、全ての分子のDNAコード配列を細菌発現ベクターにクローニングした。全ての発現コンストラクトは、それぞれ、ペリプラズムへの抗体分泌および精製を容易にするために、N末端シグナルペプチドおよびC末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグのコード配列を含むようにデザインされた。全ての抗CD33 scFvクローンからのVLおよびVHドメインのアミノ酸配列を表3および表4に示す。

大腸菌における組み換え抗CD33一本鎖Fv抗体の発現
組み換えscFv抗体は、大腸菌ペリプラズムにおいて可溶性分泌タンパク質として発現させた。最初の段階で、アンピシリンを補充した小培地(small medium culture)に形質転換された細菌を接種し、28℃で16時間インキュベートした。続いて、アンピシリンを補充した2番目の培地を加えることによって光学密度を調整し、600 nmで0.6～0.8の範囲の光学密度に達するまで28℃でもう一度インキュベートした。50 μM IPTGの添加ならびに最大16時間21～28℃および200 rpmでの培養物のインキュベーションによってタンパク質発現を誘導した。インキュベーション後、細胞をペレット化し(30分, 4℃, 7500 rpm)、さらに処理するまで-20℃で貯蔵した。

抗CD33一本鎖Fv抗体の精製
細胞ペレットを緩衝液に再懸濁し、穏やかに撹拌しながら室温で30分間インキュベートすることにより、細菌細胞培養物の遠心分離後に組み換えペリプラズムから組み換えscFvを抽出した。細胞をペレット化し、組み換えタンパク質を含有する上清を保持した。上清をプールし、超音波処理によってホモジナイズする前に、この手法をもう一度繰り返した。ホモジネートを希釈し、低濃度のイミダゾールを補充し、プレパックされた固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)カラム(GE Healthcare)に負荷した。ベースラインに達するまでカラムを洗浄し、次に、結合したタンパク質をイミダゾール緩衝液で溶出させた。抗体含有画分をプールし、その後、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製した。最後に、タンパク質溶出液を限外ろ過によって濃縮し、貯蔵用緩衝液に対して透析した。低pH処理(37℃で20～24時間pH 3.0でインキュベーション)に続いて、Trisを用いてサンプルを中和した。精製されたタンパク質は、使用するまでアリコートとして-80℃で貯蔵された。

実施例2
2×2 T細胞エンゲージャをコードするDNA発現コンストラクトのクローニング
CHO細胞における二重特異性2×2 T細胞エンゲージャの発現のため、全ての分子のコード配列を哺乳動物発現ベクター系にクローニングした。実施例1の抗CD33 scFvドメインを用いて、表7および図3に示されるように組織化されたドメインを有する、抗-CD3 scFvドメインと組み合わせてCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャを構築した。手短に言えば、ペプチドリンカー(VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VH)によって分離された抗CD33 VHおよびVLドメインをコードする遺伝子配列を合成し、サブクローニングした。得られたコンストラクトを消化して、リンカー配列内に位置するBam HI制限部位を用いて、別々のVHおよびVLコード配列を作製した。次に、これらのVHおよびVL断片を、抗CD3のVHおよびVLドメインをコードするDNA断片(VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VH)とライゲーションして、最終的なコンストラクトを得た。CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャのドメイン順序変種1～3を図3に示す。全ての発現コンストラクトは、それぞれ、抗体分泌および精製を容易にするために、N末端シグナルペプチドおよびC末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグのコード配列を含むようにデザインされた。

安定的にトランスフェクションされたCHO細胞における2×2 T細胞エンゲージャの発現
CHO細胞発現系(Flp-In(登録商標), Life Technologies)、つまりCHO-K1チャイニーズハムスター卵巣細胞(ATCC, CCL-61)の派生物(Kao and Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968;60(4):1275-81)を用いた。付着細胞は、Life Technologiesが提供する標準的な細胞培養プロトコールに従って継代培養された。

懸濁状態での増殖への適応のため、細胞を組織培養フラスコから剥離し、無血清培地中に置いた。懸濁適応した細胞を、10% DMSOを含む培地中で凍結保存した。

懸濁適応した細胞のトランスフェクションにより、分泌された2×2 T細胞エンゲージャを安定的に発現する組み換えCHO細胞株を作製した。抗生物質ハイグロマイシンBによる選択中に、生存細胞密度を週2回測定し、細胞を遠心分離し、新鮮な選択培地中に最大密度0.1×10⁶個の生存細胞/mLで再懸濁した。2×2 T細胞エンゲージャを安定的に発現する細胞プールは、選択の2～3週間後に回収され、その時点で細胞は振盪フラスコ中の標準的な培地に移された。組み換え分泌タンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実施することによって確認された。安定的な細胞プールを、DMSO含有培地中で凍結保存した。

細胞培養上清への分泌により、安定的にトランスフェクションされたCHO細胞株の10日間の流加培養で2×2 T細胞エンゲージャを産生した。典型的には75%超の培養生存率で10日後に細胞培養上清を収集した。サンプルを1日おきに生産培養から集め、細胞密度および生存性を評価した。収集の日に、細胞培養上清を遠心分離および真空ろ過により清澄化してから、さらに使用した。

細胞培養上清におけるタンパク質発現力価および産物完全性をSDS-PAGEによって分析した。

2×2 T細胞エンゲージャの精製
2×2 T細胞エンゲージャを2段階手法でCHO細胞培養上清から精製した。His6タグ付きコンストラクトを第1の段階でNi-NTA Superflowクロマトグラフィーに供し、引き続き第2の段階でSuperdex 200での分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に供した。溶出された2×2 T細胞エンゲージャは、そのホモ二量体(2×2 T細胞エンゲージャ)含量に関して特徴決定され、ホモ二量体含量が90%またはそれ以上であった場合にプールされた。最後に、プールされたサンプルを緩衝液交換し、限外ろ過により1 mg/mL超の典型的な濃度にまで濃縮した。最終サンプルの純度および均一性(典型的には90%超)を、還元および非還元条件下でのSDS PAGEと、それに続く抗Hisタグ抗体を用いた免疫ブロッティングおよび分析SECによりそれぞれ評価した。精製されたタンパク質を、使用するまでアリコートで-80℃にて貯蔵した。

CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャのポリペプチドを表7および図3に示す。各2×2 T細胞エンゲージャは、2つの同一のポリペプチドからなる(図1)。両方の外側リンカーL1およびL3は、6つのアミノ酸GGSGGS (SEQ ID NO:95)で構成されていたが、中央のペプチドリンカー2は、それぞれ配列GGSG (SEQ ID NO:96)、GGSGG (SEQ ID NO:97)、またはGGSGGS (SEQ ID NO:95)を有し長さが異なっていた(4～6アミノ酸)。

一連の抗CD33可変ドメインおよび抗CD3可変ドメインを用いて、トランスフェクションされた細胞株で安定的に産生可能とされ、かつ体温でおよび繰り返しの凍結/解凍サイクル後に安定性を維持した多数の2×2 T細胞エンゲージャ分子が作製された。さらなる開発および前臨床毒性研究を促進するために、ヒトおよびカニクイザルCD33の両方への結合を示した2×2 T細胞エンゲージャ分子の選択に重点が置かれた。2×2 T細胞エンゲージャ12 (SEQ ID NO:109)、14 (SEQ ID NO:111) 、および16 (SEQ ID NO:113)の一本鎖についてそれぞれ図10L、10N、および10Pに完全なアミノ酸配列の例を示す。本実施例で、構造に対する可変ドメインおよびそのリンカーの順序は、VL (CD3)-L1-VH (CD33)-L2-VL (CD33)-L3-VH (CD3)である。C末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグは、精製中に切断される。ヘキサヒスチジンタグの除去後の、上記の2×2 T細胞エンゲージャの完全なアミノ酸配列は、それぞれ、図11L、11N、および11Pに示されるように、タンデムダイアボディ12 (SEQ ID NO:134)、2×2 T細胞エンゲージャ14 (SEQ ID NO:136)、および2×2 T細胞エンゲージャ16 (SEQ ID NO:138)である。

実施例3
フローサイトメトリーによる抗体親和性の測定
細胞をCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャの連続希釈液100 μLとともにインキュベートした。FACS緩衝液で3回洗浄した後に、細胞を同じ緩衝液中10 μg/mLのマウスモノクローナル抗His抗体0.1 mLとともに氷上で45分間インキュベートした。2回目の洗浄サイクル後、細胞を15 μg/mLのFITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体0.1 mLとともに以前と同じ条件の下でインキュベートした。対照として、細胞を抗His IgGとともにインキュベートした後、抗CD33 2×2 T細胞エンゲージャなしでFITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体とともにインキュベートした。次いで、細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するために2 μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)を含有するFACS緩衝液0.2 mL中に再懸濁した。MXPソフトウェアを使用するBeckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメーター(Beckman-Coulter, Krefeld, Germany)またはIncyteソフトウェアを使用するMillipore Guava EasyCyteフローサイトメーター(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)を用いて1×10⁴個の生細胞の蛍光を測定した。CXPソフトウェア(Beckman-Coulter, Krefeld, Germany)またはIncyteソフトウェア(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)を用いて細胞サンプルの平均蛍光強度を計算した。二次および三次試薬のみで染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、GraphPad Prism (Windowsの場合バージョン6.00, GraphPad Software, La Jolla California USA)の1部位結合(双曲線)の式を用いたK_D値の計算のためにその値を使った。

2×2 T細胞エンゲージャを、ヒトCD3⁺およびCD33⁺細胞ならびにカニクイザルCD3⁺およびCD33⁺細胞に対するその結合親和性について試験した。選択された2×2 T細胞エンゲージャの例示的な結合データを表8にまとめた。

（表８）CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャのCD3およびCD33の結合特性

♯カニクイザルCD33/ヒトCD33のK_D比を、カニクイザルCD33およそヒトCD33をそれぞれ発現しているCHO細胞で測定されたK_D値に基づいて計算した。^‡ヒトCD3/ヒトCD33のK_D値を、Jurkat細胞に対して測定されたK_D値(hu CD3)および3つのヒトCD33⁺腫瘍細胞株(HL-60, KG-1, U937)の平均K_Dに基づいて計算した。

CD3結合親和性および交差反応性は、CD3⁺ Jurkat細胞(Dr. Moldenhauer提供, DKFZ Heidelberg; ヒト急性T細胞白血病)およびカニクイザルCD3⁺ HSC-F細胞株(JCRB, カタログ番号:JCRB1164)に対する用量設定およびフローサイトメトリー実験において評価された。CD33結合および交差反応性は、ヒトCD33⁺腫瘍細胞株: HL-60 (DSMZ, カタログ番号:ACC 3, ヒトB細胞前駆体白血病)、U-937 (DSMZ, カタログ番号: ACC5; ヒト組織球性リンパ腫)、およびKG-1 (DSMZ, カタログ番号:ACC14; 急性骨髄性白血病)に対して評価された。交差反応性のK_D比は、組み換えヒトまたは組み換えカニクイザル抗原のいずれかを発現するCHO細胞株で測定されたK_D値を用いて計算された。

2×2 T細胞エンゲージャは1 nM未満の、試験された腫瘍細胞株のほとんどに対してヒトCD33⁺に対しての比較的高い親和性を示した。ヒトCD3に対する親和性は、2 nMまたはそれ未満であると決定された。

実施例4
細胞障害性アッセイ法
細胞障害性アッセイ法の場合、標準的な条件の下で培養された標的細胞を収集し、洗浄し、PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit中で提供される、希釈液Cに2×10⁷個の細胞/mLの密度まで再懸濁した。次に、細胞懸濁液を等量の二重濃縮PKH67標識化溶液と混合し、RTで2～5分間インキュベートした。等量のFCSを添加し、1分間インキュベートすることにより、染色反応を実施した。標識された標的細胞を完全RPMI培地で洗浄した後、細胞をカウントし、完全RPMI培地中で2×10⁵個の細胞/mLの密度に再懸濁した。次に、2×10⁴個の標的細胞を、総容量200 μL/ウェルでマイクロタイタープレートの個々のウェル中の示された2×2 T細胞エンゲージャの漸増濃度の存在下で、5:1のE:T比でエフェクタ細胞としての濃縮ヒトT細胞とともに播種した。抗体の非存在下での自然発生的な細胞死およびT細胞による標的の死滅を、各プレートで少なくとも3回の複製について判定した。遠心分離後、アッセイプレートを5% CO₂の加湿雰囲気中37℃で指定された時間インキュベートした。インキュベーション後、培養物をFACS緩衝液で1回洗浄し、次いで2 μg/mL PIを補充したFACS緩衝液150 μLに再懸濁した。生きている標的細胞の絶対量を、Beckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメーター(Beckman-Coulter)またはMillipore Guava EasyCyteフローサイトメーター(Merck Millipore)を用いてPKH67による陽性緑色染色およびPIについての陰性染色により測定した。測定された残存している標的生細胞に基づいて、特異的細胞溶解の割合を以下の式にしたがって計算した: [1-(生きている標的_{(サンプル)}の数/生きている標的_{(自然発生)}の数)]×100%。シグモイド用量応答曲線およびEC₅₀値は、GraphPadソフトウェアを用いて、非線形回帰/4パラメータロジスティックフィットにより計算された。所定の抗体濃度で得られた溶解値を用いて、Prismソフトウェアを使った4パラメータロジスティックフィット分析によりシグモイド用量応答曲線を計算した。

EC₅₀値は、5:1の比率でエフェクタ細胞として濃縮ヒトT細胞を用いた、CD33⁺ U-937 (DSMZ, カタログ番号: ACC5; ヒト組織球性リンパ腫)標的細胞に対する20～24時間のアッセイ法において測定された。一部の2×2 T細胞エンゲージャも、CD33⁺ KG-1 (DSMZ, カタログ番号:ACC14; 急性骨髄性白血病)およびHL-60標的細胞に対する細胞障害性アッセイ法において試験された。具体的には、比較的高いCD33細胞表面発現(任意のMFI [平均±SEM]: 3,133±215; n=3)を有するAMLのモデルとしてHL-60細胞を選択し、非常に限られたCD33発現(任意のMFI: 277±11; n=3)を有するAMLのモデルとしてKG-1aを選択した。選択した2×2 T細胞エンゲージャの例示的な細胞障害性データを表9にまとめた。HL-60細胞株のさらなる細胞障害性データは、表8の最後の列に見出される。

（表９）異なるCD33⁺腫瘍細胞株に対するCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャのインビトロ効力

EC₅₀値は、5:1のE:T比でエフェクタ細胞として初代ヒトT細胞を用いた、20～24時間インキュベートされた表示の標的細胞株に対するFACSに基づく細胞障害性アッセイ法において、測定された。各2×2 T細胞エンゲージャを少なくとも2つの独立した実験で各腫瘍細胞株に対して試験した。平均値が提示されている。

実施例5
48時間の時点でのヒトCD33+ AML細胞株におけるさらなる細胞障害性スクリーニング実験
上記のように、早くも24時間で有意な細胞障害性が検出されたが、より高いレベルの毒性は48時間で検出することができる。その後のアッセイ法のため、48時間の時点を選択した。T細胞選択が2×2 T細胞エンゲージャ誘導細胞障害性に及ぼす影響を試験した。これを達成するために、健常ボランティアドナーから無刺激のPBMCを得て、CD3⁺細胞をCD3マイクロビーズの使用による単純な「陽性濃縮」と、ならびにCD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123、およびCD235aに対する抗体のマイクロビーズカクテルによるいっそう複雑な「陰性選択」の両方により単離した。図4に図示されるように、2×2 T細胞エンゲージャ誘導細胞障害性は、陽性選択されたT細胞よりも陰性選択された健常ドナーT細胞で大きかった。しかしながら、個々の2×2 T細胞エンゲージャの相対的細胞障害活性は、T細胞選択の方法による影響を受けなかった。それゆえ、その後のアッセイ法は、陽性濃縮された健常ドナーT細胞を用いて実施された。

無刺激の単核細胞はFHCRC Institutional Review Boardにより承認された研究プロトコール下でFred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) Hematopoietic Cell Processing Core (Core Center of Excellence)による白血球除去を介して健常成人ボランティアから収集された。T細胞は、CD3マイクロビーズ(「陽性濃縮」)を介したまたはPan T-Cell Isolation Kit (「陰性選択」; ともにMiltenyi Biotec, Auburn, CAから)を介した磁気細胞選別により濃縮され、その後にアリコートで凍結され、液体窒素中で貯蔵された。融解された細胞アリコートを製造元の指示にしたがい3 μM CellVue Burgundy (eBioscience, San Diego, CA)で標識した。精製されたPBMCを、さまざまな濃度の2×2 T細胞エンゲージャ分子の存在下で培養した。

薬物誘導細胞障害性の定量化のため、実施例4と同様に、細胞を37℃(5% CO₂および空気中)にて、さまざまなE:T細胞比でインキュベートした。24～72時間後、生存不能細胞を検出するDAPIを用い、細胞数および薬物誘導細胞障害性を、LSRIIサイトメーター(BD Biosciences)を使って測定し、FlowJoで分析した。AML細胞を前方/側方散乱特性によりおよび、健常ドナーT細胞が加えられた実験では、CellVue Burgundy色素陰性により同定した(図5)。薬物誘導性の特異的細胞障害性は以下として提示される:細胞障害性% = 100×(1-標的生細胞_処理済/標的生細胞_対照)。細胞障害性アッセイ法の結果は、平均値±標準誤差(SEM)として提示されている。スピアマンのノンパラメトリック相関を用いて、連続するサンプル特性間の相関を算出した。全てのP値は両側である。GraphPad Prismソフトウェアを用いて統計分析を実施した。

健常ドナーT細胞の非存在下では、CD33/CD 2×2 T細胞エンゲージャのいずれも、T細胞の非存在下でAML細胞株に顕著な細胞障害効果を発揮せず、その細胞障害効果に対するT細胞の絶対要件が確認された(データ未掲載)。T細胞の存在下において、2×2 T細胞エンゲージャ誘導性の特異的細胞障害性の程度は、2×2 T細胞エンゲージャの濃度およびE:T細胞比に依存していた。CD33/CD3に対する2×2 T細胞エンゲージャ分子と1つの対照2×2 T細胞エンゲージャ(00)との間の直接比較により、HL-60細胞(図6A/Bおよび表10)およびKG-1a細胞(図6C/Dおよび表10)の両方において抗体誘導細胞障害性のかなりの差異が示され、繰り返し実験において結果の再現性が高かった。全体で、2×2 T細胞エンゲージャ誘導細胞障害性の程度は、初代ヒトT細胞でCD3に対する結合親和性と相関していた(25 pM (およそ2.5 ng/mL)およびE:T=5:1でのKG-1a細胞における細胞障害性の場合: r=-0.542, p=0.009; 25 pMおよびE:T=5:1でのHL-60細胞における細胞障害性の場合: r=-0.391, p=0.07)。2×2 T細胞エンゲージャ12、14、16は、HL-60およびKG-1a細胞の両方に対して非常に細胞障害性であった。

（表１０）CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャの48時間の時点でのCD25およびCD69の誘導ならびに細胞障害性

¹2×2 T細胞エンゲージャはCD3親和性の増大の順に記載されている。
²CD25およびCD69誘導は未分画PBMC培養物において24時間後に測定された。
³CD33+細胞が存在する未分画PBMCにおいてCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャにより誘導されたT細胞増殖。
⁴二つ組のウェルで実施された3つの独立した実験からの、5:1のE:T細胞比で健常ドナーT細胞の存在下の25 pMの2×2 T細胞エンゲージャ濃度でのDAPI+細胞の48時間後の細胞障害性(%)。
ND: 検出可能なCD25活性化がない。

実施例6
原発性ヒトAML標本における2×2 T細胞エンゲージャのさらなる特徴決定
これらの候補の細胞障害特性の包括的な特徴決定の場合、研究のためAML患者由来の標本をFHCRC標本貯蔵所から入手した。

AMLを有する成人患者由来の前処理(「診断」)末梢血または骨髄標本からフィコール単離された単核細胞の凍結アリコートをFHCRCの貯蔵所から入手した。本発明者らは、AMLを定義するために2008 WHO基準(Vardiman et al.; Blood. 2009; 114(5):937-951)および細胞遺伝学的リスクを割り当てるために洗練されたUnited Kingdom Medical Research Council (MRC)基準(Grimwalde et al.; Blood. 2010;116(3):354-365)を用いた。患者は、FHCRC Institutional Review Boardによって承認されたプロトコールに基づく研究目的での生体試料の収集と使用について、書面によるインフォームドコンセントを提供した。臨床データは、医療保険の携行性と責任に関する法律の規制に準拠して匿名化された。融解後、細胞を、CD33を認識する直接標識された抗体(クローンP67.6; PE-Cy7結合)、CD3を認識する直接標識された抗体(クローンSK7; PerCP結合)、CD34を認識する直接標識された抗体(クローン8G12; APC結合; 全てBD Biosciences, San Jose, CAから)、およびCD45を認識する直接標識された抗体(クローンHI30; APC-eFluor(登録商標)780結合; eBioscience)で染色した。非生存細胞を同定するために、サンプルを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で染色した。Canto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)で少なくとも10,000事象を取得し、FlowJo (Tree Star, Ashland, OR)を用いてDAPI細胞を分析した。

融解後、CD45/側方散乱特性に基づくフローサイトメトリーにより測定したところ、標本には58%超のAML芽球があった。標本には、解凍直後に50%超の生存細胞およびサイトカイン含有液体培養において48時間後に50%超の生存細胞があった(図7)。患者年齢の中央値は58.1(範囲: 23.9～76.2)歳であった。細胞遺伝学的疾患のリスクは、2で良好、18で中間、7で有害であった。NPM1、FLT3、およびCEBPAの変異状態に関する情報は不完全であったが; ただし、1つのサンプルはCEBPA^{二重変異体}であることが既知であり、別のサンプルはNPM1^プラス/FLT3-ITD^マイナスであった。研究した標本における骨髄芽球およびCD3⁺ T細胞の割合の中央値は、それぞれ86.1% (範囲: 58.4～97.0%)および2.0% (範囲: 0～11.9%)であり、培養48時間後のサンプル生存率の中央値は80.1% (範囲: 53.6～93.6%)であった。患者のうち15名がAMLと新たに診断されたのに対し、12名は標本採取時に再発性(n=7)または難治性(n=5)の疾患を有していた。表11に要約されているように、新たにAMLと診断された患者由来の標本の基本的な特徴は、骨髄芽球でのCD33発現、自己T細胞の量、骨髄芽球の比率、および培養生存率に関して、再発性/難治性疾患を有する標本と同様であった。

AML標本培養物への2×2 T細胞エンゲージャ分子の添加は、適度な用量依存性細胞障害性をもたらし(図8A)、活動性AMLを有する患者からの標本に含まれる自己T細胞が白血病細胞を溶解することに関与しうることを実証している。健常ドナーT細胞の存在下において、個々の2×2 T細胞エンゲージャの細胞障害活性は、薬物用量およびE:T細胞比に厳密に依存していた(図8B/C)。しかしながら、AML芽球でのCD33発現が非常に低い一部の標本でさえも、2×2 T細胞エンゲージャの高い活性が観察された。2×2 T細胞エンゲージャ分子の中で、低濃度(2.5 pM (およそ250 ng/mL)において、またそれほど顕著ではないが10 pM (およそ1 ng/mL))においてもE:T=1:3およびE:T=1:1の両方で最も高い細胞障害性を有していたので、12は最も活性が高いと考えられた。

CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャを、患者の性別、年齢、疾患状態(新規診断、再発性、難治性)、CD33発現の程度、および細胞発生リスクという観点で異なっていた代表的AML患者血液サンプルにおいてスクリーニングした(表11)。注目すべきことに、いくつかの試験された2×2 T細胞エンゲージャ(例えば、02、08、09、11、12、14、16、19、22、および23)は、図17に示されているように、疾患スペクトラム全体にわたってほぼ全ての患者サンプルで非常に活性であった。さらに、活性の程度および範囲は、新たに診断された患者、再発した患者および難治性の患者を含めて、AMLの全段階において同様である。

（表１１）原発性AML標本の特徴

実施例7
異なるレベルのCD33を発現するさまざまな起源についての異なるCD33 ⁺ 細胞株に対するCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ12および2×2 T細胞エンゲージャ16の効力および有効性
CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャの効力および有効性が標的細胞のCD33密度に依存するかどうかを評価するために、さまざまなヒトCD33⁺腫瘍細胞株および組み換えヒトCD33を発現するCHO細胞を、QIFIKIT定量キットおよび抗CD33 mAb WM53を用いそのCD33発現レベルについて試験した。表12における結果は、腫瘍細胞株のCD33密度がおよそ1300 SABC (標準化抗体結合能)からおよそ46000 SABCの範囲にあったことを示している。CHO-CD33細胞での発現はおよそ197000 SABCであり、腫瘍細胞株でよりもかなり高かった。試験された全てのCD33⁺細胞株を標的細胞として、少なくとも3回の独立したFACSに基づく細胞障害性アッセイ法においてエフェクタ細胞としてのヒトT細胞とともに5:1のエフェクタと標的との比率でCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ12および2×2 T細胞エンゲージャ16の連続希釈液の存在下において用いた。各アッセイ法において、EC₅₀および2×2 T細胞エンゲージャ媒介性溶解値は、非線形回帰により計算された。結果から、12および16の効力(EC₅₀値)も有効性(溶解%)も、標的細胞の表面のCD33密度と相関しないことが実証される。

注目に値するのは、少なくとも12および16は、1500 SABC未満の非常に低いCD33密度を有するSEMのような細胞に対してもその細胞障害活性を示すことである。

（表１２）CD33標的細胞表面発現ならびにCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ12および2×2 T細胞エンゲージャ16の細胞障害効力

CD33⁺細胞株での標準化抗体結合能(SABC)は、QIFIKITおよび抗CD33 mAb WM53を用いて判定された。2×2 T細胞エンゲージャ12および2×2 T細胞エンゲージャ16によりリダイレクトされた標的細胞溶解のEC₅₀値は、5:1のE:T比でエフェクタ細胞としてヒト初代T細胞を用いかつ20～24時間インキュベーションを行った、FACSに基づく細胞障害性アッセイ法において測定した。CD33を発現するCHO細胞によるアッセイ法では40～48時間インキュベーションを行った。少なくとも3回の独立したアッセイ法の平均およびSDが示されている。

実施例8
T細胞の2×2 T細胞エンゲージャ活性化およびAML細胞のインビトロ死滅
2×2 T細胞エンゲージャを精製ヒトT細胞およびVPD-450標識ヒトCD33⁺白血病細胞株KG-1またはCD33^-ヒトALL細胞株G2 (E:T 5:1)とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを用いて、2×2 T細胞エンゲージャによる標的細胞溶解を評価した(10^-15～10^-8M; 24時間, 37℃)。

2×2 T細胞エンゲージャ12、16、および19とヒトT細胞とのインキュベーションにより、KG-1細胞が効率的に溶解された(IC50 それぞれおよそ0.01、0.5、および5 pM)。T細胞の最大40%が活性化(CD25+)され、細胞障害活性とともに上昇した。無関係な標的00 (10^-7 M超)とでの対照2×2 T細胞エンゲージャは、インビトロでKG-1の有意な死滅をもたらさなかった。これとは別に、16はKG-1細胞の溶解を誘導し(IC50 = 5×10^-12M)、1×10^-8MではCD33- G2細胞に影響を与えなかった。この結果は、CD33+ 白血病細胞(KG-1)および原発性CD33+ AML芽球をCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャの標的にした場合に、T細胞が活性化され、腫瘍細胞を強力に溶解することを示している。

実施例9
エピトープマッピング
CD33結合エピトープを同定するために、異なるCD33結合部分を含む2×2 T細胞エンゲージャを、CLIPS Technology (Pepscan)を用いてエピトープマッピングに供した。

CLIPS Technologyでは、ペプチドの単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート様の折り畳み、らせん様の折り畳み、およびそれらの組み合わせへの構造化を促進し、標的分子の不連続なエピトープをマッピングする可能性を供与する。

7000個を超える独立したペプチドのアレイを合成し、各抗体のペプチドへの結合をELISAで試験した。

2×2 T細胞エンゲージャ12、14、16、および22は、ヒトCD33の最初のIg様ドメインにおけるストレッチ₆₂DQEVQEETQ₇₀ (SEQ ID NO:94)に結合する。各アミノ酸ストレッチは、図10および11において下線および太字で示されている。2×2 T細胞エンゲージャ01、02、04、06、08、09、13、および23はまた、これらの2×2 T細胞エンゲージャが2×2 T細胞エンゲージャ12、14 16、および12と同じCD33結合ドメイン(SEQ ID NO:2および12、3および13、5および15、9および19)を共有するので、このエピトープに結合するものと考えられる。

実施例10
予防的インビボ腫瘍モデルにおける用量応答
ヒトT細胞で再構成されたNOD/scidマウスでの予防的HL-60腫瘍異種移植片モデルにおいて2×2 T細胞エンゲージャ12および16を異なる用量レベルで比較する。用量応答を達成するために、10、1、および0.1 μg (0.5、0.05、および0.005 mg/kg)の3つの用量レベルを選択した。

免疫不全NOD/scidマウスの8つの実験群に、4×10⁶個のHL-60細胞の懸濁液を皮下注射により異種移植した。注射前に、細胞を、陰性選択を用いてバフィーコート(健常ドナー)から単離された3×10⁶個のT細胞と混合した。T細胞のドナー多様性の可能性を考慮するために、実験群の各々を、1個体ドナーのT細胞のみを各々が受けている3つのコホートに細分した。腫瘍細胞およびT細胞を移植された実験群の全ての動物は、0、1、2、3、および4 (qdxd5)日目に表示のように3つの異なる用量レベル(0.1 μg、1 μg、および10 μg)でビヒクル(対照)または16もしくは12のいずれかの静脈内ボーラスを受けた。エフェクタ細胞およびビヒクル処置なしの1群を、さらなる陰性対照として役立てた。表13には、群の割り当ておよび投薬スケジュールがまとめられている。

（表１３）

HL-60異種移植モデルにおけるインビボ用量応答研究の処置群。対照群における全ての動物は確実に腫瘍を発症し、均一な腫瘍増殖を示した。T細胞の存在は腫瘍成長に影響を与えなかった。ビヒクル処置された対照群では、T細胞の存在下または非存在下でHL-60増殖の差異は観察されなかった。

両方の試験項目による処置は、明確な用量依存性の抗腫瘍効果を明らかにした(図12)。2つの2×2 T細胞エンゲージャの間に実質的な差異は見られなかった。図12の平均腫瘍体積のプロッティングは、ほとんどの処置群が完了した29日目に限定された。研究は45日目まで続けられ、腫瘍のない生存について動物を観察した。10または1 μgの16で処置した群では、観察期間の終わりに9匹中6匹の動物に腫瘍がなく、10 μgの12を受けた動物9匹中5匹には45日目に腫瘍がなかった。1 μgの12で処置された場合に1匹の動物は腫瘍のないままであった。

対照群における全ての動物は確実に腫瘍を発症し、均一な腫瘍増殖を示した。2×2 T細胞エンゲージャのいずれかを用いた処置により、用量依存性の抗腫瘍効果が明らかにされ、29日目まで2つの2×2 T細胞エンゲージャの間に実質的な差異は見られなかった。

検出可能な差異は長時間の観察(45日目)の後にのみ観察され、その時点で、低用量群および対照群は、大きな腫瘍の増殖のため既に終結されている。16で処置された群はより多くの、腫瘍のない動物を有していた。

実施例11
樹立された腫瘍モデル
16を用いた事前樹立HL-60腫瘍を有するNOD/scidマウスの異種移植モデルを開発して、概念実証の実証を行った。

手短に言えば、雌性免疫不全NOD/scidマウスに亜致死的に放射線を照射し(2 Gy)、4×10⁶個のHL-60細胞を皮下接種した。9日目に、動物に抗アシアロGM1ウサギ抗体(Wako, Neuss, Germany)の単回ボーラス注射を受けさせて、ネズミナチュラルキラー(NK)細胞を枯渇させた。10日目に、腫瘍が50～150 mm³ (平均73 ± 11 mm³)の体積に達すると、動物を3つの処置群に割り当てた。群2および3 (各8匹の動物)には、1.5×10⁷個の活性化されたヒトT細胞を腹腔内注射した。注射前に、T細胞を、陰性選択を用いてバフィーコート(健常ドナー)から単離した。T細胞を、製造元の仕様(Miltenyi Biotech)にしたがって、T細胞活性化/拡張キット(T-Cell Activation/Expansion Kit)で拡張かつ活性化した。ドナー多様性の可能性に対処するために、群2および3を2つのコホートに細分し、各々が個々のドナーから拡張かつ活性化されたT細胞を受けた。各コホートは、1個体のT細胞ドナーのみからのT細胞を受けた。

（表１４）樹立されたHL-60異種移植モデルの処置群

13日目に始めて群3における動物は105 mm³の平均腫瘍体積を示し、計9回の静脈内投薬50 μgの2×2 T細胞エンゲージャ16 (qdx9d)で処置した。表14には、群の割り当ておよび投薬スケジュールが例示されている。群1および2はビヒクルでのみ処置された。体重および腫瘍体積を27日目まで測定した。

全ての動物は、6日目に触知できる腫瘍を確実に発症した。ビヒクル処置群1および2 (HL-60)の動物の平均腫瘍体積は、27日目の研究終了まで継続的に増大した(図13)。HL-60腫瘍細胞に加えて初代活性化ヒトT細胞を受けた群2の動物では、平均腫瘍体積が1 (HL-60のみ)に比べて速く増加した。

ヒトT細胞の存在下での2×2 T細胞エンゲージャ16 (50 μg/動物; 2.5 mg/kg)による13日目～21日目(qdxd9)の繰り返し静脈内処置(群3)により、群1および群2に比べて腫瘍成長が急速に遅延された。2×2 T細胞エンゲージャ16により、ビヒクル処置対照群(群2)と比較して群3での腫瘍成長がおよそ4～5日遅延された。6日目から27日目までの期間における統計的に有意な差が、22日目(p<0.05)、23日目(p<0.01)および27日目(p<0.01)に群2 (HL-60、T細胞、ビヒクル)および群3 (HL-60、T細胞、16)との間で同定された(ボンフェローニ事後検定による二元配置反復測定ANOVA)。群1での腫瘍の異常に遅い成長のため、群1と群3の間に統計的に有意な差は存在しなかった。

異なるドナーからT細胞を受けた群内のコホート1およびコホート2における腫瘍発生を比較した場合に、T細胞活性に関するドナー多様性は観察されなかった(表14参照)。

実施例10は、事前に樹立されたHL-60腫瘍(AML)および腹腔内移植されたヒトT細胞を有するNOD/scidマウスの異種移植モデルが成功裏に開発されたことを示す。単回用量レベルで2×2 T細胞エンゲージャ16を繰り返し投薬すると、各ビヒクル処置対照群と比較して、腫瘍成長の統計的に有意な遅延が生じる。生成されたデータは、CD33/CD3 BiTE(商標)を用いた類似の研究について公開された結果に匹敵する(Aigner et al., 2012; Leukemia, 2013, Apr;27(5):1107-15)。

実施例12
NSGマウスのAML PDXモデルにおけるCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャの有効性
CD33⁺白血病に2～4%のCD3⁺ T細胞が含まれたAML患者由来の凍結保存細胞を用いて、NSGマウスのAML PDXモデルを樹立した。照射を受けた(250 cGy) NSGマウスへの腫瘍細胞の注射1時間後に、2つの静脈内投薬(50 μgまたは5 μg; n= 8マウス/群)のいずれかで、CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16または12を200 μLボーラスで注射した。2×2 T細胞エンゲージャの追加注射を、続く4日間のそれぞれに実施した。マウスの体重を週1回測定し、その後38日目に殺処理して、フローサイトメトリーによる分析(huCD33、huCD34、huCD45、muCD45、huCD14、huCD3、huCD4、huCD8、および7AAD)のための末梢血、骨髄、および脾臓の収集を可能にした。この結果を図14に示す。

図14は、未処置マウスが38日後に骨髄および脾臓において相当量のヒト芽球を有していたことを示す。対照的に、2×2 T細胞エンゲージャ12または16の静脈内注射で毎日処置したマウスは、骨髄および脾臓において実質的により少ない数のヒトAML芽球を示した。CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャの強力な抗AML効果が両方の用量レベル(5および50 μg/注射)で観察された。

CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ12および16の両方で観察された抗AML効果は、同一のマウスモデルでAMLを標的とするCD123/CD3 DART(登録商標)抗体の効果よりもはるかに強力であった(Hussaini et al.:" Targeting CD123 In Leukemic Stem Cells Using Dual Affinity Re-Targeting Molecules (DART(登録商標)) November 15, 2013; Blood: 122 (21))。骨髄および脾臓においてほぼ全てのAML芽球を排除したCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャとは対照的に、HussainiらによってCD123/CD3 DART(登録商標)がPDXモデルで骨髄および脾臓におけるAML芽球の数を2.5および0.25 mg/kgで50～1000倍だけ低減したと報告されており、同著者らによってCD123/CD3 DART(商標)がPDXモデルで骨髄および脾臓におけるAML芽球の数を0.5 mg/kgで40～78%だけ低減したとさらに報告されている。

実施例13
CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16媒介性の標的細胞溶解の迅速な開始
CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ媒介標的細胞溶解の動態を評価するために、異なるインキュベーション時間でのカルセイン放出細胞障害性アッセイ法を実施した。カルセイン標識CD33⁺ HL-60標的細胞を、30分間、1時間、2時間、3時間、4時間または5時間25:1のE:T比でエフェクタ細胞としての初代ヒトT細胞の存在下において、2×2 T細胞エンゲージャ16の連続希釈液とともにインキュベートした。各時点で、溶解した標的細胞から放出されたカルセインを使い、非線形回帰/シグモイド用量応答を用いてEC₅₀値および2×2 T細胞エンゲージャ16媒介性の標的細胞溶解を計算した。図15は、飽和2×2 T細胞エンゲージャ濃度での30分間のインキュベーション後に40%超の溶解を伴う2×2 T細胞エンゲージャ媒介性の標的細胞溶解の予想外の迅速な開始を示す。4時間のインキュベーション後、90%超の標的細胞溶解に達した。表15および図16には、30分～5時間のインキュベーション時間で2×2 T細胞エンゲージャ16について測定されたEC₅₀および特異的溶解値がまとめられている。この結果から、使用したアッセイ条件下で2時間のインキュベーション後に最大の効力(最低のEC₅₀値)に達したこと、および5時間のインキュベーション後にほとんど全ての標的細胞が溶解したことがさらに実証される。まとめると、これらの結果から、CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャによって媒介される非常に迅速で強力かつ効果的な標的細胞溶解が実証される。

（表１５）2×2 T細胞エンゲージャ16について測定されたEC₅₀および溶解値の動態

実施例14
AML患者へのCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャの用量漸増研究のための臨床試験プロトコール
これは、CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16 (AMV 564)の安全性と忍容性を特徴決定する第I相臨床試験である。

研究成果:
一次: 用量漸増段階: (1) 持続静脈内注入による投与時のCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16の、用量制限毒性(DLT)を含む、安全性および忍容性を特徴決定すること; (2) 最大耐量(MTD)および推奨される第2相用量(RP2D)を同定すること。

二次: 持続静脈内注入(CIV)投与時のCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16の薬物動態(PK)、薬力学(PD)および免疫原性を特徴決定すること。

研究デザイン: 本研究は、再発性または難治性の急性骨髄性白血病(AML)を有する患者におけるCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16の安全性、忍容性、および予備的な抗白血病活性を評価するための、RP2Dでの拡張を伴うヒトでの最初の、第1相の、非盲検多施設用量漸増試験である。およそ50名の患者が米国またはEUにあるおよそ6つのセンターに登録されおり; 患者の総数は、RP2Dが定義されている用量レベルに依る。

CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16はCIV投与により、1サイクルあたり計14日間、1または2誘導サイクルの間に与えられる。患者は、スクリーニング時に、15日目(注入終了24時間以内)に、29日目(+5日)に、および各CD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16誘導サイクル中の血液学的回復時に、ならびに臨床的に必要であれば他の時点で骨髄評価を受ける。

用量漸増段階
標準の3 + 3用量漸増スキームを用いてMTDを決定し、それは以下の表に概説されているスキームに従う。

略語: d = 日
^＊サイトカイン放出症候群(CRS)が研究において2名以上の患者で観察された場合(任意の用量で)、研究評価チーム(Study Evaluation Team: SET)は最初の3日間、導入用量(CRSが観察された用量よりも低い)を指定し、その後に11日間、割り当てられた用量レベルで続ける。

適格性:
a. インフォームドコンセントに署名した時点で18歳以上。
b. 世界保健機関(WHO) 2008の基準によるAMLの診断。
c. 以下の基準を満たす再発性または難治性の疾患: (a) 一次不応性(Primary refractory)、すなわち、アントラサイクリンに基づく治療に不適格な患者のための標準のアントラサイクリンに基づくレジメンもしくは低メチル化剤(例えばデシタビンもしくはアザシチジン)による誘導に不応性; (b) 12ヶ月未満続く最初の完全寛解(CR)後の最初の再発; または(c) 2回目もしくはそれ以降の再発。再発とは、CRまたはCriが以前に達成された後の、末梢血中の白血病性芽球または骨髄中の5%以上の白血病性芽球の再出現と定義される。
d. 新たに診断されたAMLに対しての2以下の以前の導入療法、1以下の以前の幹細胞移植、および再発性または難治性AMLに対しての2以下の以前のサルベージ療法。個々の低メチル化剤を用いた任意の数の連続した処置サイクルは、1回の導入療法またはサルベージ療法としてカウントされる。
e. 骨髄中で少なくとも5%の芽球。
f. 末梢白血球(WBC)数: スクリーニングでは上限ないが、処置前の1日目に10×10⁹/L未満でなければならない。過剰な芽球を有する患者は、ヒドロキシ尿素で処置してカウントダウンをもたらすことができる。
g. 以下の範囲内の化学実験室パラメータ: 正常上限(ULN) 2倍以下のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT); ULN 1.5倍以下の総ビリルビン; 抱合型ビリルビンが正常範囲内であればギルバート症候群を有する患者が登録できる; 50 mL/分(Cockcroft-Gault法により測定または計算された)超のクレアチニンクリアランス。
h. 0または1の東部共同腫瘍学グループ(Eastern Cooperative Oncology Group; ECOG)の一般状態。2のECOGスコアを有する患者は、スポンサーメディカルモニター(Sponsor Medical Monitor)との議論の後、スコアが基礎AML疾患に起因する症状に影響される場合に含まれることがある。

臨床薬物動態:
（表１６）AMV 564を投薬された対象の薬物動態パラメータ

図18は、0.5 μg/日の用量で最初の14日サイクルでの対象02-001、-002、および-003におけるCD33/CD3 2×2 T細胞エンゲージャ16 (AMV 564)の血清濃度を図示している(左のパネル)。対象02-002は同じ濃度で2回目のサイクルを受けた。

図19は、再発性/難治性急性骨髄性白血病を有する患者への0.5、1.5、5、15または50マイクログラムの用量レベルでの14日間のAMV564の持続静脈内投与後の血清濃度を示す。濃度は徐々に増加し、3日間～7日間で定常状態に達することが観察された。最終的な半減期はおよそ2日である。N = 1である50 μgを除いて用量レベルあたりN = 3。濃度は検証済みの方法を用いて、指定された時点で収集された血清から測定された。

薬力学:
AMV 564を0.5 μg/日で14日間投薬した対象では、骨髄芽球数が制御され、CRPレベルが低減され、造血の増大が観察されることがヘモグロビンおよび好中球の持続および増大によって証明された通りに認められた(図20)。対象は処置の3日目に輸血を受けた。

同様の応答がAMV 564を1.5 μg/日で14日間投薬された2番目の対象において観察され、これにより血球数の劇的な改善が示される(図21)。好中球および赤血球の数が、AMV564の投与後に向上および回復した(上のパネル)。特定の時点で血液サンプルを収集し、これらの血液パラメータを決定するために処理した。インターロイキン6およびC反応性タンパク質の両方は、14日間1.5マイクログラムの用量レベルでのAMV564の投与後に減少した(下のパネル)。サンプルは指定された時点で収集された。インターロイキン6は、検証済みのマルチプレックス免疫アッセイ法で測定された。C反応性タンパク質は、適格の機器を用いて測定された。回復は、対象におけるMDSCの排除によって推進されると考えられる。

AMV 564を1.5 μg/日で14日間投薬したさらなる対象は、血球数で同様の結果を達成した。図22 (上のパネル)は、投与後にヘモグロビン、好中球、血小板、および単球数が改善した1名の対象と、ヘモグロビン、好中球、血小板、および単球数が改善し、C反応性タンパク質が減少した別の対象(下のパネル)を示す。特定の時点で血液サンプルを収集し、これらの血液パラメータを決定するために処理した。C反応性タンパク質は、適格の機器を用いて測定された。

上記の対象において観察された改善は、他の二重特異性抗体処置では見られなかった。

さらなる所見
抗白血病活性が、最初の対象でさらに観察された。図23は、再発性/難治性の急性骨髄性白血病を有する患者への14日間のAMV564投与後のベースラインからの骨髄白血病性芽球の割合の最良の相対的変化を図示している。各バーは個々の患者応答を表す。骨髄サンプルは臨床研究期間中に定期的に採取され、骨髄芽球の割合は細胞形態によって決定された。x軸はマイクログラムの単位で投与された用量を示す。

対象のうち1名では、脾臓のサイズが18 cmから11 cmに低減された。この所見は臨床的利益の証拠を提供し、研究エンドポイントを支持する。

本明細書においてある特定の態様を示し記述したが、そのような態様が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、および置換が当業者には想到されるであろう。本明細書において記述された態様のさまざまな代替が、態様を実践する際に用いられうることが理解されるべきである。添付の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにその等価物がそれによって網羅されることが意図される。

配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> AMPHIVENA THERAPEUTICS, INC.
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<170> PatentIn version 3.5

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Asn Thr Asp Phe Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Val Thr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 14
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Asn Thr Asp Tyr Ser Phe Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ala Asn Thr Asp Tyr Ser Leu Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Val Pro Ala Ala Ile Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 17
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg His Lys Arg Gly Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115

<210> 18
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Ile Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 19
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr Ser Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Thr Thr Val His
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<210> 22
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<212> PRT
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 23
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 23
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10

<210> 24
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10

<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 25
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ile Val Asn
1 5 10

<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 26
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Lys
1 5 10

<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 27
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Val Val Asn
1 5 10

<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 28
Asp Asp Asn Glu Arg Pro Ser
1 5

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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5

<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 30
Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5

<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser
1 5

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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 32
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 33
Ser Asn Asn Gln Arg Ser Ser
1 5

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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 34
Ser Thr Asn Lys Arg Pro Ser
1 5

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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 35
Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His
1 5

<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 36
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ile Gly
1 5

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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 37
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly
1 5

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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 38
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Asp
1 5

<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 39
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly
1 5

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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 40
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly
1 5

<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 41
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala
1 5

<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 42
Ser Asn Tyr Gly Ile His
1 5

<210> 43
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 43
Thr Ser Tyr Asp Ile Asn
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 44
Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5

<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5

<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 46
Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5

<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 47
Ser Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5

<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 48
Asp Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5

<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 49
Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Lys Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly

<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 50
Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly

<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 51
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
1 5 10 15
Gln Gly

<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 52
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly

<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 53
Gly Ile Tyr Pro Ile Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly

<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 54
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly

<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 55
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly

<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 56
Asp Arg Leu Glu Ser Ala Ala Phe Asp Tyr
1 5 10

<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 57
Asp Arg Ala Asn Thr Asp Phe Ser Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10

<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 58
Asp Arg Ala Val Thr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10

<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 59
Asp Arg Ala Asn Thr Asp Tyr Ser Phe Gly Met Asp Val
1 5 10

<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 60
Asp Arg Ala Asn Thr Asp Tyr Ser Leu Gly Met Asp Val
1 5 10

<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 61
Asp Val Val Pro Ala Ala Ile Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10

<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 62
His Lys Arg Gly Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10

<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 63
Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Ala Phe Asp Ile
1 5 10

<210> 64
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 65
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 66
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 67
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

<210> 68
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
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<210> 69
<211> 110
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
85 90 95
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

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<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 70
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
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Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
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Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg
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65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
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Val Lys Asp

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<400> 82
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1 5 10 15
Val Lys Asp

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<400> 83
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1 5 10 15
Val Lys Ser

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<213> Artificial Sequence
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<211> 14
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 14
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 89
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1 5 10

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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 90
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10

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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 91
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5

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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 92
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu
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Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro Tyr
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Val His

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<213> Homo sapiens
<400> 94
Asp Gln Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 95
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5

<210> 96
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 96
Gly Gly Ser Gly
1

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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 97
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5

<210> 98
<211> 494
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
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Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp
325 330 335
Ser Leu Ile Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His
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<210> 99
<211> 494
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 99
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Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
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Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
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130 135 140
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Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe
165 170 175
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Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ala Val Thr Asp Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro
245 250 255
Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly
260 265 270
Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys
275 280 285
Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg
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Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
305 310 315 320
Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp
325 330 335
Ser Leu Ile Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
370 375 380
Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
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Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg
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Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr
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450 455 460
Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His
485 490

<210> 100
<211> 494
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
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Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
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Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
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Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
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Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
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Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
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Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr
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Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ala Asn Thr Asp Tyr Ser Phe Gly
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Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
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Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro
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Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys
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Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
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Ser Leu Ile Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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485 490

<210> 101
<211> 494
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
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Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe
165 170 175
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr
180 185 190
Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ala Asn Thr Asp Tyr Ser Leu Gly
210 215 220
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro
245 250 255
Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly
260 265 270
Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys
275 280 285
Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg
290 295 300
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
305 310 315 320
Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp
325 330 335
Ser Leu Ile Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
370 375 380
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Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr
435 440 445
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450 455 460
Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His
485 490

<210> 102
<211> 495
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 108
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 109
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 133
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<210> 134
<211> 483
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
435 440 445
Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly
450 455 460
Asn Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
465 470 475 480
Thr Val Ser Ser

<210> 142
<211> 484
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 142
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
85 90 95
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
115 120 125
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
130 135 140
Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr
165 170 175
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr
180 185 190
Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val Val Pro Ala Ala Ile Asp Tyr Tyr
210 215 220
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
245 250 255
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile
260 265 270
Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
275 280 285
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
290 295 300
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
305 310 315 320
Gly Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp
325 330 335
Asp Ser Leu Asn Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
340 345 350
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
355 360 365
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
370 375 380
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
385 390 395 400
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn
405 410 415
Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser
420 425 430
Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
435 440 445
Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly
450 455 460
Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
465 470 475 480
Thr Val Ser Ser

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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 143
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Ala Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
85 90 95
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
115 120 125
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130 135 140
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Tyr Pro Ile Phe Gly Ser Ala Asn Tyr
165 170 175
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180 185 190
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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Ala
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225 230 235 240
Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro
245 250 255
Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly
260 265 270
Ser Asn Ile Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys
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Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg
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305 310 315 320
Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp
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Ser Leu Lys Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
370 375 380
Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
385 390 395 400
Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
405 410 415
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg
420 425 430
Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr
435 440 445
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn
450 455 460
Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser

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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
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Ala Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser
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85 90 95
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
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Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
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Phe Ser Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr
165 170 175
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
180 185 190
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Ala
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Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro
245 250 255
Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly
260 265 270
Ser Asn Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys
275 280 285
Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg
290 295 300
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
305 310 315 320
Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp
325 330 335
Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
370 375 380
Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
385 390 395 400
Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
405 410 415
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg
420 425 430
Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr
435 440 445
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn
450 455 460
Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser

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<211> 483
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 145
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
85 90 95
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
115 120 125
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Phe Ser Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr
165 170 175
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
180 185 190
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Ala
210 215 220
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro
245 250 255
Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly
260 265 270
Ser Asn Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys
275 280 285
Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg
290 295 300
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
305 310 315 320
Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp
325 330 335
Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
370 375 380
Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
385 390 395 400
Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
405 410 415
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420 425 430
Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr
435 440 445
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn
450 455 460
Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser

<210> 146
<211> 483
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 146
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
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Ala Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser
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Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
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Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
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Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
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Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
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Phe Asp Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
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Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr
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Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
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Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Ala
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Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
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Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro
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Asp Asn Val Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys
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Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg
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Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
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Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp
325 330 335
Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
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Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
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Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg
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Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr
435 440 445
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn
450 455 460
Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Ser Ser

Claims

それを必要とする対象に血中の最大濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法。
前記標的抗原がCD33である、請求項1に記載の方法。
投与の用量および頻度が血中のC_最大を1日、3日間、または7日間で達成するのに十分である、請求項1に記載の方法。
投与の前記用量および頻度が定常状態濃度(C_SS)を1日～21日間で達成するのに十分である、請求項1に記載の方法。
投与の前記用量および頻度がC_SSを3日間～7日間で達成するのに十分である、請求項1に記載の方法。
前記タンパク質が、連続用量、間欠用量、単回用量、複数回用量、またはそれらの組み合わせとして投与される、請求項1に記載の方法。
前記タンパク質が、1日あたり約0.5 μg～約3000 μgの連続用量として投与される、請求項1に記載の方法。
前記タンパク質が、1日あたり約0.5 μg、1日あたり約1.5 μg、1日あたり約5 μg、1日あたり約15 μg、1日あたり約50 μg、1日あたり約100 μg、1日あたり約150 μg、1日あたり約200 μg、1日あたり約250 μg、または1日あたり約300 μgの連続用量として投与される、請求項1に記載の方法。
前記投与が、少なくとも1日、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、または少なくとも12週間の期間にわたる、請求項1に記載の方法。
前記投与が少なくとも2週間の期間にわたる、請求項1に記載の方法。
前記投与によって約20 pg/mL～約10000 pg/mLのC_最大が提供される、請求項1に記載の方法。
前記投与によって約20 pg/mL～約10000 pg/mLのC_ssが提供される、請求項1に記載の方法。
前記投与によって約200日^＊pg/mL～約100000日^＊pg/mLのAUCが提供される、請求項1に記載の方法。
前記投与が静脈内、筋肉内、病巣内、局所、または皮下である、請求項1に記載の方法。
前記投与がボーラス注入または持続注入による、請求項1に記載の方法。
前記投与によって、1日～21日間にわたる漸進的なT細胞または単球の活性化が提供される、請求項1に記載の方法。
前記投与によって、1日～21日間にわたる漸進的なサイトカイン放出が提供される、請求項1に記載の方法。
前記サイトカインが、TNFα、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、またはIFNγである、請求項17に記載の方法。
前記投与によってC反応性タンパク質レベルが低減する、請求項1に記載の方法。
前記投与によって造血が増大する、請求項1に記載の方法。
前記投与によって、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、または血小板のレベルが増加する、請求項20に記載の方法。
前記投与によって好中球レベルが増加する、請求項20に記載の方法。
前記投与によって赤血球レベルが増加する、請求項20に記載の方法。
前記投与によって血小板レベルが増加する、請求項20に記載の方法。
前記投与によって単球レベルが増加する、請求項20に記載の方法。
前記投与によって骨髄芽球が低減する、請求項1に記載の方法。
前記投与によって骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)が低減する、請求項1に記載の方法。
前記標的抗原が、EGFR、HER2、HER3、EGFRviii、PSMA、BCMA、CD19、MSLN、CD123、CD33、EpCAM、c-MET、CEA、cd79b、CD66、CD30、EphA2、CSPG4、DLL3、またはVEGFである、請求項1に記載の方法。
前記がんが白血病またはリンパ腫である、請求項1に記載の方法。
前記がんが固形腫瘍である、請求項1に記載の方法。
前記がんが、CD33を発現する細胞を有する、請求項1に記載の方法。
前記がんが、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、前駆B細胞リンパ芽球性白血病、骨髄肉腫、多発性骨髄腫、急性リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫、骨髄異形成症候群(MDS)、骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、膵臓がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、乳がん、肺がん、肝臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がん、胃がん（stomach cancer）、膀胱がん、腸がん、精巣がん、子宮がん、口腔がん、鼻咽頭がん、皮膚がん、腎がん、神経膠芽腫、星細胞腫、上皮がん、骨がん、中皮腫、および黒色腫である、請求項1に記載の方法。
前記がんがAMLまたはMDSである、請求項1に記載の方法。
前記AMLが再発性または難治性である、請求項26に記載の方法。
前記タンパク質が抗体または抗体誘導体である、請求項1に記載の方法。
前記タンパク質がFab、Fab'、またはF(ab')₂ 断片を含む、請求項1に記載の方法。
前記タンパク質が、一本鎖Fv、タンデム一本鎖Fv、二重特異性T細胞エンゲージャ、二重親和性再標的化抗体、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャ、またはタンデムダイアボディを含む、請求項1に記載の方法。
前記タンパク質が二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャである、請求項1に記載の方法。
前記二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャが第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、順々に連結された少なくとも4つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドが、
(i) 前記標的抗原に特異的な可変重鎖(VH)ドメイン;
(ii) 該標的抗原に特異的な可変軽鎖(VL)ドメイン;
(iii) ヒトCD3に特異的なVHドメイン; および
(iv) ヒトCD3に特異的なVLドメイン
を含む、請求項31に記載の方法。
各ポリペプチドにおいて、前記4つの可変鎖ドメインが、
VL(CD3)-L1-VH(標的抗原)-L2-VL(標的抗原)-L3-VH(CD3);
VH(CD3)-L1-VL(標的抗原)-L2-VH(標的抗原)-L3-VL(CD3);
VL(標的抗原)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(標的抗原); または
VH(標的抗原)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(標的抗原)
の順序で、ペプチドリンカーL1、L2、およびL3によって順々に連結されている、請求項32に記載の方法。
前記二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャが第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、順々に連結された少なくとも4つの可変鎖ドメインを有し、各ポリペプチドが、
(i) ヒトCD33に特異的な可変重鎖(VH)ドメイン;
(ii) ヒトCD33に特異的な可変軽鎖(VL)ドメイン;
(iii) ヒトCD3に特異的なVHドメイン; および
(iv) ヒトCD3に特異的なVLドメイン
を含む、請求項31に記載の方法。
各ポリペプチドにおいて、前記4つの可変鎖ドメインが、
VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3);
VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3);
VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); または
VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)
の順序で、ペプチドリンカーL1、L2、およびL3によって順々に連結されている、請求項34に記載の方法。
ヒトCD33に特異的な前記VLドメインが、SEQ ID NO:21～27からなる群より選択される配列からなるCDR1、SEQ ID NO:28～34からなる群より選択される配列からなるCDR2、およびSEQ ID NO:35～41からなる群の配列からなるCDR3を含む、請求項34に記載の方法。
ヒトCD33に特異的な前記VHドメインが、SEQ ID NO:42～48からなる群より選択される配列からなるCDR1、SEQ ID NO:49～55からなる群より選択される配列からなるCDR2、およびSEQ ID NO:56～63からなる群より選択される配列からなるCDR3を含む、請求項34に記載の方法。
ヒトCD33に特異的な前記VLドメインの前記CDR1、CDR2、およびCDR3が、
(i) SEQ ID NO:21、28、および35;
(ii) SEQ ID NO:22、29、および36;
(iii) SEQ ID NO:23、30、および37;
(iv) SEQ ID NO:24、31、および38;
(v) SEQ ID NO:25、32、および39;
(vi) SEQ ID NO:26、33、および40; ならびに
(vii) SEQ ID NO:27、34、および41
からなる群より選択される配列である、請求項36に記載の方法。
CD33に特異的な前記VHドメインの前記CDR1、CDR2、およびCDR3が、
(i) SEQ ID NO:42、49、および56;
(ii) SEQ ID NO:43、50、および57;
(iii) SEQ ID NO:43、50、および58;
(iv) SEQ ID NO:43、50、および59;
(v) SEQ ID NO:43、50、および60;
(vi) SEQ ID NO:44、51、および61;
(vii) SEQ ID NO:45、52、および62;
(viii) SEQ ID NO:46、53、および63;
(ix) SEQ ID NO:47、54、および63; ならびに
(x) SEQ ID NO:48、55、および63
からなる群より選択される配列である、請求項37に記載の方法。
CD33に特異的な前記VLドメインおよびVHドメインが、
(i) SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:11;
(ii) SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:12;
(iii) SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:13;
(iv) SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:14;
(v) SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:15;
(vi) SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:16;
(vii) SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:17;
(viii) SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:18;
(ix) SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:19; ならびに
(x) SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:20
からなる群より選択される配列である、請求項34に記載の方法。
ヒトCD3に特異的な前記VHドメインが、STYAMN (SEQ ID NO:72)のCDR1配列、RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:73)のCDR2配列、およびHGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:74)またはHGNFGNSYVSYFAY (SEQ ID NO:75)のCDR3配列を含む、請求項34に記載の方法。
ヒトCD3に特異的な前記VLドメインが、RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:90)のCDR1配列、GTNKRAP (SEQ ID NO:91)のCDR2配列、およびALWYSNL (SEQ ID NO:92)のCDR3配列を含む、請求項34に記載の方法。
CD3に特異的な前記VLドメインおよびVHドメインが、
(i) SEQ ID NO:64およびSEQ ID NO:68;
(ii) SEQ ID NO:65およびSEQ ID NO:69;
(iii) SEQ ID NO:66およびSEQ ID NO:70; ならびに
(iv) SEQ ID NO:67およびSEQ ID NO:71
からなる群より選択される配列である、請求項34に記載の方法。
各ポリペプチドが、
(i) SEQ ID NO:2、12、65、および69;
(ii) SEQ ID NO:3、13、65、および69;
(iii) SEQ ID NO:4、14、65、および69;
(iv) SEQ ID NO:5、15、65、および69;
(v) SEQ ID NO:1、11、64、および68;
(vi) SEQ ID NO:2、12、64、および68;
(vii) SEQ ID NO:2、12、66、および70;
(viii) SEQ ID NO:4、14、66、および70;
(ix) SEQ ID NO:5、15、66、および70;
(x) SEQ ID NO:3、13、64、および68;
(xi) SEQ ID NO:3、13、67、および71;
(xii) SEQ ID NO:4、14、64、および68;
(xiii) SEQ ID NO:5、15、64、および68;
(xiv) SEQ ID NO:7、17、64、および68;
(xv) SEQ ID NO:6、16、64、および68;
(xvi) SEQ ID NO:6、16、67、および71;
(xvii) SEQ ID NO:8、18、64、および68;
(xviii) SEQ ID NO:9、19、64、および68;
(xix) SEQ ID NO:9、19、67、および71; ならびに
(xx) SEQ ID NO:10、20、64、および68
からなる群より選択される4つの可変鎖ドメインを含む、請求項34に記載の方法。
前記二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャが、SEQ ID NO:98～121からなる群より選択される配列を含む、請求項34～44のいずれか一項に記載の方法。
前記二価二重特異性(2×2) T細胞エンゲージャが、SEQ ID NO 123～146からなる群より選択される配列を含む、請求項34～44のいずれか一項に記載の方法。
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄異形成症候群の処置のための方法。
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄増殖性疾患の処置のための方法。
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)による免疫抑制または炎症の処置のための方法。
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるMDSCを低減させるための方法。
それを必要とする対象に、該対象におけるMDSCを低減させるのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD3と標的抗原とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法。
それを必要とする対象に血中の最大濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法。
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄異形成症候群の処置のための方法。
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄増殖性疾患の処置のための方法。
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象における骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)による免疫抑制または炎症の処置のための方法。
それを必要とする対象に最大血中濃度(C_最大)を1日～21日間で達成するのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるMDSCを低減させるための方法。
それを必要とする対象に、該対象におけるMDSCを低減させるのに十分な投与の用量および頻度で、ヒトCD33とヒトCD3とに結合するタンパク質を投与する段階を含む、対象におけるがんの処置のための方法。