JP2023179759A - Solid-phase peptide synthesis via side chain bond - Google Patents
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り 刊行物名：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌｕｍｅ １８、第Ｓ１３４頁、発行年月日：２０１２年８月２１日、発行者名：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１０．１００２／（ＩＳＳＮ）１０９９－１３８７、に発表Article 30, Paragraph 2 of the Patent Law Published Published Published by Application: JOURNAL OF PEPTIDE SCIENCE, VOLUME 18, S134 pages, publication date: August 21, 2012, publisher name: EUROPEAN PEPTIDE SOCIETY AND JO HN Wiley & Sons, Ltd. , publication address: http://onlinelibrary. wiley. Published on com/journal/10.1002/(ISSN) 1099-1387.
特許法第３０条第２項適用申請有り 集会名：３２ｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、開催場所：ギリシャ国アテネ ザ メガロン アテネ インターナショナル カンファレンス センター（エム．エー．アイ．シー．シー．）、開催日：２０１２年９月２日～２０１２年９月７日、にて発表Application for Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act has been filed Meeting name: 32nd European Peptide Symposium, Venue: The Megaron Athens International Conference Center (M.A.I.C.C.), Athens, Greece, Date: September 2012 Announced from April 2nd to September 7th, 2012
本発明はペプチドの合成に関する。 The present invention relates to the synthesis of peptides.
要約
ポリマーに側鎖を介して取付けられたヒドロキシアミノ酸、ヒドロキシアミノ酸アミド、ヒドロキシアミノアルコール又はヒドロキシアミノ酸を含む小ペプチドを出発樹脂として使用する固相ペプチド合成により、高純度のペプチド及びぺプタイボル（peptaibol）が得られた。
Abstract Solid-phase peptide synthesis using hydroxy amino acids, hydroxy amino acid amides, hydroxy amino alcohols, or small peptides containing hydroxy amino acids attached via side chains to polymers as starting resins produces highly pure peptides and peptaibols. was gotten.
定義及び略号
「Hya」又は「ヒドロキシルアミノ酸」は、ヒドロキシル（-OH）基を含むアミノ酸を意味する。
Ｎ－末端又はアミノ末端は、ペプチド鎖中の最初のアミノ酸である。
Ｃ－末端又はカルボキシ末端は、ペプチド鎖中の最後のアミノ酸であり、下記のように示される。
Definitions and abbreviations "Hya" or "hydroxylamino acid" means an amino acid containing a hydroxyl (-OH) group.
The N-terminus or amino terminus is the first amino acid in a peptide chain.
The C-terminus or carboxy terminus is the last amino acid in the peptide chain and is indicated below.
「Ｐ」又は「固体支持体」又は「樹脂」は、アミノ酸又はペプチドと反応又は連結するのに適当な官能基を含む不溶性材料を意味する。当該固体支持体又は樹脂は、当業界においてよく知られている。 "P" or "solid support" or "resin" means an insoluble material containing suitable functional groups to react or link with amino acids or peptides. Such solid supports or resins are well known in the art.
「アルキル」、例えばC1-10-アルキル又はC1-6-アルキルは、分岐した、または分岐していない、十分に飽和した非環式炭化水素基（すなわち、二重結合又は三重結合を含まない、炭素及び水素から構成される）を意味する。幾つかの態様において、アルキルは置換されていても置換されていなくてもよい。アルキルには、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert－ブチル、ペンチル、へキシル、などが含まれるがこれらに限定されず、そして幾つかの態様においてはそれらのそれぞれは場合によっては置換されていてもよい。アルキル置換基には、C1-3－アルコキシ、ハロゲン（F、Cl、Br又はI）、ニトロ、アミノ、-SH及び-OHが含まれるがこれらに限定されない。 "Alkyl", e.g. C 1-10 -alkyl or C 1-6 -alkyl, refers to a branched or unbranched, fully saturated acyclic hydrocarbon group (i.e. containing double or triple bonds). (consisting of carbon and hydrogen). In some embodiments, alkyl can be substituted or unsubstituted. Alkyl includes, but is not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, and the like, and in some embodiments each of them is optionally May be replaced. Alkyl substituents include, but are not limited to, C 1-3 -alkoxy, halogen (F, Cl, Br or I), nitro, amino, -SH and -OH.
「取付け」は、不溶性支持体へのアミノ酸又はペプチド若しくはペプチド誘導体の連結（linking）を意味する。
「Hse」はホモセリンを意味し、「Hnv」はヒドロキシルノルバリンを意味する。
「SPPS」又は「固相ペプチド合成」は、本明細書に記載されているような樹脂の使用を伴うペプチドの合成を意味する。
「pNA」は４－ニトロアニリドを意味する。
「DME」はジメトキシエタンを意味する。
"Attachment" refers to the linking of an amino acid or peptide or peptide derivative to an insoluble support.
"Hse" means homoserine and "Hnv" means hydroxylnorvaline.
"SPPS" or "solid phase peptide synthesis" refers to the synthesis of peptides involving the use of resins as described herein.
"pNA" means 4-nitroanilide.
"DME" means dimethoxyethane.
「酸感受性樹脂」は、アミノ酸又はペプチドとの反応又は連結に適する官能基を含む不溶性材料又は樹脂を意味し、これらは酸性処理によりペプチドから開裂されることができる。
「酸感受性保護基」は、酸性処理により又は酸性条件下でアミノ酸又はペプチド若しくはペプチド誘導体から開裂されうる保護基を意味する。
「ペプタイボル」（Peptaibol）は、ペプチドであってそのＣ－末端位置にアミノ酸又はアミノ酸アミドではなくアミノアルコールを含むものを意味する。
"Acid sensitive resin" means an insoluble material or resin containing functional groups suitable for reaction or linkage with amino acids or peptides, which can be cleaved from the peptide by acid treatment.
"Acid-sensitive protecting group" means a protecting group that can be cleaved from an amino acid or a peptide or peptide derivative by acid treatment or under acidic conditions.
"Peptaibol" means a peptide that contains an amino alcohol rather than an amino acid or amino acid amide in its C-terminal position.
「段階的」（ステップ－バイ－ステップ；Step-by-step）は、ペプチド鎖中に含まれるアミノ酸のそれぞれが個別的に且つ逐次的に導入されるペプチド合成法を意味する。この方法は、中間精製工程を含んでも含まなくてもよい。
「保護されたペプチド」は、すべての官能基が保護基により保護されているか又はブロックされているペプチドを意味する。
「部分的に保護されたペプチド」は、少なくとも１個の官能基が保護基により保護されているか又はブロックされているペプチドを意味する。
"Step-by-step" refers to a method of peptide synthesis in which each of the amino acids contained in the peptide chain is introduced individually and sequentially. The method may or may not include intermediate purification steps.
"Protected peptide" means a peptide in which all functional groups are protected or blocked by protecting groups.
"Partially protected peptide" means a peptide in which at least one functional group is protected or blocked by a protecting group.
固相ペプチド合成は伝統的に、Ｃ－末端アミノ酸のそのα－カルボキシル官能基を介しての適当な固体支持体への取付け、及び段々に成長するペプチド鎖におけるアミノ酸残基の逐次的付加によるペプチドのアミノ末端方向へのペプチド鎖の延長により行われる。数十万の発表及び特許がこの方法及びペプチド医薬の製造へのその適用を記載している。 Solid-phase peptide synthesis traditionally involves the attachment of a C-terminal amino acid via its α-carboxyl functionality to a suitable solid support, and the sequential addition of amino acid residues in a stepwise growing peptide chain. This is done by extending the peptide chain towards the amino terminus of the peptide. Hundreds of thousands of publications and patents describe this method and its application to the production of peptide drugs.
Ｃ－末端カルボキシル官能基の取付けとは逆に、アミノ酸側鎖を介してのアミノ酸及びペプチドの適当な樹脂への取付け及びSPPSにおけるその応用が、非常に手短に、特に30未満の発表及び特許において記載されている。これらの発表の殆どが、Asp及びGluの側鎖カルボキシル官能基を介してのアミノ酸の取付けを記載している。 Contrary to the attachment of C-terminal carboxyl functions, the attachment of amino acids and peptides via amino acid side chains to suitable resins and their application in SPPS has been demonstrated very briefly, especially in less than 30 publications and patents. Are listed. Most of these publications describe the attachment of amino acids via the side chain carboxyl functions of Asp and Glu.
本発明者の知識では、側鎖ヒドロキシル官能基を介してのアミノ酸の側鎖取付け及びペプチド合成における応用は限定されている：Fmoc-Hya-pNA（式A1）の側鎖取付け[A. Bernhardt, M. Drewello and M. Schutkowski, The solid-phase synthesis of side-chain-phosphorylated peptide-4-nitroanilides J. Peptide Res. 50, 1997. 143-152]及び短いニトロアニリド基質の合成のためのそれらの使用、環状ペプチド調製における応用のためのマイクロウエーブの助けによる２－クロロトリチル樹脂上でのFmoc-Hya-O‐アリルエステルの合成（式A2 [L. Rizzi, K. Cendic, N. Vaiana, S. Romeo, Alcohols immobilization onto 2-chlorotritylchloride resin under microwave irradiation, Tetrahedron Letters 52 (2011) 2808-2811 ]）、及びTyr-フェノキシ官能基のMitsunobu酸化還元アルキル化によるベンジル型の樹脂上に取付けられたFmoc-Tyr-O-メチルエステルの合成（式A3 [C. Cabrele, M. Langer and A. G. Beck-Sickinger, Amino Acid Side Chain Attachment Approach and Its Application to the Synthesis of Tyrosine-Containing Cyclic Peptides, J. Org. Chem. 1999, 64, 4353-4361]）及び短い環状ペプチドの合成のためのそれらの応用。 To our knowledge, side chain attachment of amino acids via side chain hydroxyl functionality and its application in peptide synthesis is limited: side chain attachment of Fmoc-Hya-pNA (formula A1) [A. Bernhardt, M. Drewello and M. Schutkowski, The solid-phase synthesis of side-chain-phosphorylated peptide-4-nitroanilides J. Peptide Res. 50, 1997. 143-152] and their use for the synthesis of short nitroanilide substrates. , Synthesis of Fmoc-Hya-O-allyl ester (formula A2 [L. Rizzi, K. Cendic, N. Vaiana, S. Fmoc-Tyr mounted on a benzyl-type resin by Mitsunobu redox alkylation of the Tyr-phenoxy functional group. Synthesis of -O-methyl ester (formula A3 [C. Cabrele, M. Langer and A. G. Beck-Sickinger, Amino Acid Side Chain Attachment Approach and Its Application to the Synthesis of Tyrosine-Containing Cyclic Peptides, J. Org. Chem. 1999 , 64, 4353-4361]) and their application for the synthesis of short cyclic peptides.
本発明者の知識では、Hse及びHypの側鎖取付けは開示されていない。更に、保護されたペプチド、保護されたペプチドフラグメント並びに保護されたペプチドアミド及びぺプタイボル（peptaibol）の固相合成のための酸感受性樹脂上に側鎖取付けされたHyaの応用は報告されていない。 To the inventor's knowledge, side chain attachment of Hse and Hyp has not been disclosed. Furthermore, the application of side-chain attached Hya on acid-sensitive resins for solid phase synthesis of protected peptides, protected peptide fragments, and protected peptide amides and peptaibols has not been reported.
固相ペプチド合成
１つの態様において、医薬的に興味あるペプチド酸、ペプチドアミド、及びペプタイボル（peptaibol）の改良された合成が提供される。
Solid Phase Peptide Synthesis In one embodiment, improved synthesis of pharmaceutically interesting peptide acids, peptide amides, and peptaibols is provided.
本発明の１つの観点において、ヒドロキシアミノ酸をそのアミノ酸側鎖を介して、又は配列中にヒドロキシアミノ酸を含む小ペプチドをトリチル又はベンズヒドリル型の樹脂上に取付けて式Ｉ～IVのアミノ酸－樹脂接合体又はペプチド樹脂接合体を生じさせることにより、ペプチドが高い収率及び純度で非常に効果的に製造された。ここで、式Ｉ～IV中、Ｐは、固相ペプチド合成において使用される支持体から選択され、Pr1は、Ｈ又はFmoc、Boc、Trt、Dde及びAllocから選択されるアミノ保護基であり、Pr2は、Trt、Clt、Mmt、Mtt、Dpm及びtBuから選択される酸感受性ヒドロキシ保護基であり、Hyaは、D- 若しくは L-Ser、Thr、Tyr、Hse、Hyp、Hnvなどから選択されるヒドロキシアミノ酸であり、そしてＡは、OH、OTrt、OClt、OMmt、OMtt、ODpm及びOtBuから選択される酸感受性アルコキシ基、NH2、NHR1、NR1R2（ここで、R1及びR2は独立に、アルキル基又は配列中に１～10個のアミノ酸を含む保護された若しくは半保護されたペプチドである。 In one aspect of the invention, amino acid-resin conjugates of formulas I-IV are prepared by attaching a hydroxyamino acid via its amino acid side chain or a small peptide containing a hydroxyamino acid in its sequence onto a trityl or benzhydryl type resin. Alternatively, by generating peptide-resin conjugates, peptides were produced very effectively in high yield and purity. wherein in formulas I-IV, P is selected from supports used in solid phase peptide synthesis and Pr 1 is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Dde and Alloc. , Pr 2 is an acid-sensitive hydroxy protecting group selected from Trt, Clt, Mmt, Mtt, Dpm and tBu, Hya is selected from D- or L-Ser, Thr, Tyr, Hse, Hyp, Hnv etc. and A is an acid-sensitive alkoxy group selected from OH, OTrt, OClt, OMmt, OMtt, ODpm and OtBu, NH 2 , NHR 1 , NR 1 R 2 (where R 1 and R 2 is independently an alkyl group or a protected or semi-protected peptide containing 1 to 10 amino acids in the sequence.
他の態様において、本発明者は、天然のヒドロキシアミノ酸に由来するアミノアルコールから選択される式III～VI（式中、Ｐ、Ｘ、Ｖ、Ｚ及びPr1は上に定義したとおりであり、R3及びR4はアルキル、アリール又はアラルキル基であり、そしてPr2はトリチル、ベンズヒドリル又はベンジル型の酸感受性保護基である）の樹脂結合アミノアルコールを用いる固相合成によりペプタイボル（peptraibol）例えばオクトレオチド（octreotide）が得られたことを開示する。 In other embodiments, the inventors provide compounds of formulas III-VI selected from amino alcohols derived from natural hydroxy amino acids, where P, X, V, Z and Pr 1 are as defined above; By solid-phase synthesis using resin-bound amino alcohols (R 3 and R 4 are alkyl, aryl or aralkyl groups and Pr 2 is an acid-sensitive protecting group of trityl, benzhydryl or benzyl type), peptraibol, e.g. octreotide (octreotide) was obtained.
更に、本件発明者は、式Ｉ～IVの樹脂の応用により調製されたペプチドは、ヒドロキシアミノ酸の側鎖ヒドロキシル官能基を介してトリチル型の樹脂上に取付けられる場合、穏和な酸性処理により当該樹脂から開裂されることができ、そしてこの場合tBu及びベンジル型の側鎖保護基はそのまま残ることを最初に開示する。１つの観点において、樹脂からの開裂は、１～３％の酸溶液、例えばTFA、希釈HCl溶液による処理により、場合によっては溶剤中スカベンジャーを添加して生じさせる。１つの観点において、開裂は、溶剤、例えばDCM又はアセトン中で行うことができる。そのような部分的に保護されたペプチドは、溶液中又は固相上でのフラグメント縮合による更に長いペプチドの合成において有用であることが見出された。本発明の方法は、この明細書に記載される樹脂の応用の多様性を拡張し、そしてまた、得られる医薬ペプチド純度に有意な改良をもたらし、そして同時にそれらの合成のコストを実質的に低下させる。 Furthermore, the inventors have discovered that when peptides prepared by application of resins of formulas I-IV are attached onto trityl-type resins via the side chain hydroxyl functionality of the hydroxy amino acids, the resins can be cured by mild acidic treatment. It is first disclosed that tBu and the benzylic type side chain protecting groups remain intact. In one aspect, cleavage from the resin is effected by treatment with a 1-3% acid solution, such as TFA, dilute HCl solution, optionally with addition of a scavenger in the solvent. In one aspect, cleavage can be performed in a solvent, such as DCM or acetone. It has been found that such partially protected peptides are useful in the synthesis of longer peptides by fragment condensation in solution or on solid phase. The method of the invention extends the versatility of applications of the resins described herein and also results in significant improvements in the purity of the pharmaceutical peptides obtained, and at the same time substantially reduces the cost of their synthesis. let
医薬的に興味ある若干のペプチドが、この明細書に記載される新規な方法の代表として、溶液中及び固相上での段階的（ステップ－バイ－ステップ）方法又はフラグメント縮合、あるいはそれらの組合せにより製造された。下記の例は代表例であり、他のペプチドへの応用はなんら限定されない。 Some peptides of pharmaceutical interest can be prepared by step-by-step methods or fragment condensation in solution and on solid phase, or a combination thereof, as representative of the novel methods described herein. Manufactured by. The examples below are representative examples, and the application to other peptides is not limited in any way.
ランレオチド（Lanreotide）:
１つの態様において、ランレオチドは、下記に示すように、樹脂に結合したThr-アミドを用いた固相合成によって製造された。
Lanreotide :
In one embodiment, lanreotide was made by solid phase synthesis using a resin-bound Thr-amide, as shown below.
ヒトインスリンＢ鎖：
任意には、ヒトインスリンＢ鎖は、SPPSにより合成された。１つの観点において、合成は、４－メトキシベンズヒドリル樹脂を用いて、実施例に記載されるような樹脂に結合したThr-t-ブチルから始まる。任意には、合成はまた、固相上で１－８部分保護されたBoc-Phe-Val-Asn(Trt)-Gln(Trt)-His(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH フラグメントを樹脂に結合した９－30フラグメントとの縮合により行うことができ、或いは部分的に保護された９－30フラグメントの樹脂からの開裂の後、１－８フラグメント及び９－30フラグメントの溶液中での縮合により行うことができる。
Human insulin B chain :
Optionally, human insulin B chain was synthesized by SPPS. In one aspect, the synthesis begins with Thr-t-butyl bound to the resin as described in the Examples using 4-methoxybenzhydryl resin. Optionally, the synthesis also includes 1-8 partially protected Boc-Phe-Val-Asn(Trt)-Gln(Trt)-His(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH on solid phase. This can be done by condensation of the fragment with the 9-30 fragment attached to the resin, or after cleavage of the partially protected 9-30 fragment from the resin, the 1-8 fragment and the 9-30 fragment in solution. This can be carried out by condensation.
サケカルシトニン:
任意には、サケカルシトニンは、樹脂に結合したFmoc-Thr-Pro-NH2からの合成を開始することにより製造することができる。次に、ペプチド鎖はFmoc-アミノ酸を用いて延長される。
Salmon calcitonin :
Optionally, salmon calcitonin can be produced by starting the synthesis from resin-bound Fmoc-Thr-Pro- NH2 . The peptide chain is then extended using Fmoc-amino acids.
任意には、樹脂に結合したサケカルシトニンは、２～４フラグメントを用いて、上に示すように樹脂上での、又は下に示すように溶液中での、フラグメント縮合により製造される。 Optionally, resin-bound salmon calcitonin is produced by fragment condensation using 2-4 fragments, either on the resin, as shown above, or in solution, as shown below.
オクトレオチド（Octreotide）:
他の態様において、オクトレオチドは、下に示すようにスレオニノール（threoninol ）の側鎖を介しての４－メトキシベンズヒドリル樹脂へのFmoc-threoninol-OTrt の取付け、それに続くFmoc-アミノ酸を用いてのオクトレオチド鎖の集合、及び最後に逐次的又は同時的Cys－酸化を用いる樹脂からのオクトレオチドの開裂により効率的に合成された。Fmoc-スレオニノール-OTrtは、適当な樹脂上のスレオニノールのヒドロキシメチル基を介して樹脂上に取付けられ得るFmoc-Thr(tBu)-オールに比べて非常に製造しやすい。この理由は、Fmoc-Thr(tBu)-オールの製造のための出発材料として使用されるH-Thr(OtBu)-オールが、樹脂上への側鎖を介してのスレオニノールの取付けに使用されるFmoc-スレオニノール-OTrtに比べて非常に製造しにくいからである。
Octreotide :
In another embodiment, octreotide is obtained by attachment of Fmoc-threoninol-OTrt to 4-methoxybenzhydryl resin via the side chain of threoninol, followed by Fmoc-amino acid as shown below. It was efficiently synthesized by assembly of octreotide chains and finally cleavage of octreotide from the resin using sequential or simultaneous Cys-oxidation. Fmoc-threoninol-OTrt is much easier to prepare than Fmoc-Thr(tBu)-ol, which can be attached onto a resin via the hydroxymethyl group of threoninol on a suitable resin. The reason for this is that H-Thr(OtBu)-ol, which is used as the starting material for the production of Fmoc-Thr(tBu)-ol, is used for the attachment of threoninol via the side chain onto the resin. This is because it is much more difficult to produce than Fmoc-threoninol-OTrt.
エキセナチド（Exenatide）:
他の例において、Fmoc-Ser-NH2は、その側鎖を介してトリチル樹脂に取付けられ、そしてエキセナチドの合成のために使用される。この合成は、下記のように、穏和な酸性処理による樹脂からの、部分的の保護されたエキセナチドフラグメントの開裂の後に溶液中で又は固相上で、段階的（ステップ－バイ－ステップ）態様により、又はフラグメント縮合により、実施することができる。この方法によれば、多くのPro及びGly残基を含むペプチドの合成の間に典型的に生成される殆どの不純物が完全に回避され、そして高純度のペプチドが得られる。この方法はまた、当業界において知られている他の方法を用いるペプチドアミドリンカーからのペプチドの開裂から生ずる不純物の完全な回避を可能にする。上記の当業界で知られている方法は、ペプチドの収率及び純度を有意に低下させる。
Exenatide :
In another example, Fmoc-Ser- NH2 is attached to a trityl resin via its side chain and used for the synthesis of exenatide. The synthesis is carried out in a step-by-step manner in solution or on solid phase after cleavage of the partially protected exenatide fragment from the resin by mild acidic treatment, as described below. , or by fragment condensation. According to this method, most impurities typically generated during the synthesis of peptides containing many Pro and Gly residues are completely avoided and highly pure peptides are obtained. This method also allows complete avoidance of impurities resulting from cleavage of the peptide from the peptide amide linker using other methods known in the art. The art-known methods described above significantly reduce the yield and purity of the peptide.
１つの観点において、エキセナチドは、部分的に保護されたペプチド12－39を樹脂から開裂させ、そしてそれを、下に示すように溶液中で、部分的に保護された１－11フラグメントと縮合させることにより製造することができる。或いは、フラグメント１－13及びフラグメント１４－39を用いて縮合を行い、保護されたエキセナチドを得ることができる。 In one aspect, exenatide cleaves partially protected peptide 12-39 from the resin and condenses it with the partially protected 1-11 fragment in solution as shown below. It can be manufactured by Alternatively, a condensation can be performed using fragment 1-13 and fragment 14-39 to yield the protected exenatide.
プラムリンチド（Pramlintide）:
この方法はまた、アミリン（amylin）ペプチドの製造においても非常に効果的に使用される。１つの観点において、アミリン又はその誘導体、例えばプラムリンチドのＣ－末端Ser、Thr又はTyr残基の１つを用いて側鎖の取付けを行うことができる。合成は、溶液中又は固相上での段階的（ステップ－バイ－ステップ）態様により又はフラグメント縮合により行うことができる。シュードプロリン（pseudoprolines）(Ψ, Mutter et al, Peptide Res. (1995 8, 145) を参照のこと）を成長中のペプチド鎖に導入することにより、合成が加速され、そして得られるペプチドの純度が改良される。
Pramlintide :
This method is also used very effectively in the production of amylin peptides. In one aspect, one of the C-terminal Ser, Thr or Tyr residues of amylin or a derivative thereof, such as pramlintide, can be used to effect side chain attachment. The synthesis can be carried out in a step-by-step manner in solution or on solid phase or by fragment condensation. Introduction of pseudoprolines (Ψ, see Mutter et al, Peptide Res. (1995 8, 145)) into the growing peptide chain accelerates the synthesis and increases the purity of the resulting peptide. Improved.
或いは、プラムリンチドの合成は、プラムリンチドの純度及び収率に関して同様の成功をもって、液相中で行うことができる。１つの態様において、Fmoc-Tyr-NH2の側鎖を介して樹脂の結合した保護されたペプチドは、tBu－型の側鎖保護基をそのまま残して、穏和な酸性処理を用いてペプチド鎖の種々の位置で、樹脂から定量的に開裂させることができる。１つの例において、下に示すように、２－クロロトリチル樹脂上で調製された部分的に保護された１－10フラグメントが、部分的に保護された11－37フラグメントアミドと、段階的（ステップ－バイ－ステップ）態様で成功裏に縮合された。 Alternatively, the synthesis of pramlintide can be carried out in the liquid phase with similar success with respect to purity and yield of pramlintide. In one embodiment, the protected peptide attached to the resin via the side chain of Fmoc-Tyr-NH 2 is cleaved to the peptide chain using mild acidic treatment, leaving the tBu-type side chain protecting group intact. It can be quantitatively cleaved from the resin at various positions. In one example, a partially protected 1-10 fragment prepared on a 2-chlorotrityl resin is combined with a partially protected 11-37 fragment amide in a stepwise manner, as shown below. It was successfully condensed in a -by-step) manner.
プラムリンチド（Pramlintide）:
テトラコサクチド（Tetracosactide）（ACTH 1-24）:
他の例において、下に示すように、ACTH 1-24が、樹脂に結合したFmoc-Tyr-Pro-OtBuから出発して段階的（ステップ－バイ－ステップ）方法により、或いは部分的に保護された１－10フラグメントを溶液中で11－24フラグメントと、又は樹脂の結合した11－24フラグメントと縮合させることにより効果的に調製された。
Tetracosactide (ACTH 1-24) :
In other examples, ACTH 1-24 is protected in a step-by-step manner or partially starting from resin-bound Fmoc-Tyr-Pro-OtBu, as shown below. It was effectively prepared by condensing the 1-10 fragment with the 11-24 fragment in solution or with the resin-bound 11-24 fragment.
ビバリルジン（Bivalirudin）:
他の例において、下に示すように、ビバリルジンが、樹脂に結合したFmoc-Tyr-Leu-OtBuから出発して、Fmoc-アミノ酸により段階的（ステップ－バイ－ステップ）態様でペプチド鎖を延長し、最後に脱保護し、そしてペプチドを樹脂から開裂させることにより、高収量で且つ高純度で製造された。
Bivalirudin :
In another example, as shown below, bivalirudin extends the peptide chain in a step-by-step manner with Fmoc-amino acids starting from Fmoc-Tyr-Leu-OtBu bound to the resin. , final deprotection and cleavage of the peptide from the resin in high yield and purity.
或いは、ビバリルジンは、保護されたフラグメントを樹脂上で縮合させることにより、或いは４～15アミノ酸残基を含む部分的に保護されたペプチドを樹脂から開裂させ、そしてそれを５～16アミノ酸を含むビバリルジンフラグメントと溶液中で縮合させることにより得られた。部分的に保護された１－10ビバリルジンフラグメントと、樹脂に結合した部分的に保護された11－20ビバリルジンフラグメントとの、樹脂上でのフラグメント縮合によるビバリルジンの合成を下に記載する。 Alternatively, bivalirudin can be prepared by condensing the protected fragments on a resin or by cleaving a partially protected peptide containing 4 to 15 amino acid residues from the resin and converting it to bivalirudin containing 5 to 16 amino acids. obtained by condensation with Luzin fragment in solution. The synthesis of bivalirudin by on-resin fragment condensation of a partially protected 1-10 bivalirudin fragment and a resin-bound partially protected 11-20 bivalirudin fragment is described below. .
実施例１.Example 1.
Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-OtBuの調製Preparation of Fmoc-Thr(4-methoxybenzhydrylpolystyryl)-OtBu
H-Thr-OtBuとFmoc-OSuとの常法に従う反応により調製した30 mmolのFmoc-Thr-OtBuを、20 g（30 mmol）の４－メトキシベンズヒドリルポリスチレン樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で10時間、室温にて反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そしてこの混合物を更に４時間振盪した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、DMFにより６回、IPAにより４回、DEEにより３回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.95 mmol/g 樹脂の負荷をもって、29 gの樹脂結合Fmoc-Thr-OtBuを得た。 30 mmol of Fmoc-Thr-OtBu prepared by a conventional reaction between H-Thr-OtBu and Fmoc-OSu was mixed with 20 g (30 mmol) of 4-methoxybenzhydryl polystyrene resin (product of CBL-Patras). and 60 mmol of DIPEA in 250 ml of THF for 10 hours at room temperature. Next, 60 mmol of methanol was added to the mixture and the mixture was shaken for an additional 4 hours. The resin was filtered and washed 3 times with THF/MeOH/DIPEA (85:10:5), 6 times with DMF, 4 times with IPA, 3 times with DEE, and dried under vacuum to constant weight. With a loading of 0.95 mmol/g resin, 29 g of resin-bound Fmoc-Thr-OtBu was obtained.
実施例２.Example 2.
Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-O-CltFmoc-Thr(4-methoxybenzhydrylpolystyryl)-O-Clt
H-Thr-OMeとTrt-Cl/Me3SiCl及びDIPEAとの常法に従う反応により調製した30 mmolのTrt-Thr-OMeを、20 g（30 mmol）の４－メトキシ４’ポリスチリルベンズヒドリルブロミド樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で10時間、室温にて反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そしてこの混合物を更に４時間振盪した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、DCMにより３回、DCM中1% TFAにより３回、THFにより４回、THF/水/メタノール（70:15:15）中1N-LiOHにより３回、THF/水（75:25）により３回、DMFにより４回洗浄し、そして次に室温にて２時間、60 mmolのFmoc-OSu及び30 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより３回、DCMにより３回洗浄し、そして次に、室温にて３時間50 mmolのTrt-Cl及び50 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより４回、DEEにより６回洗浄し、そして一定重量に真空乾燥した。0.78 mmol/g樹脂の負荷をもって、32.3 gの樹脂結合Fmoc-Thr-OtBuを得た。 30 mmol of Trt-Thr-OMe prepared by the reaction of H-Thr-OMe with Trt-Cl/Me 3 SiCl and DIPEA according to a conventional method was added to Reacted with drill bromide resin (product of CBL-Patras) and 60 mmol DIPEA in 250 ml THF for 10 hours at room temperature. Next, 60 mmol of methanol was added to the mixture and the mixture was shaken for an additional 4 hours. The resin was filtered and washed 3 times with THF/MeOH/DIPEA (85:10:5), 3 times with DCM, 3 times with 1% TFA in DCM, 4 times with THF, and THF/water/methanol (70:15). :15), 3 times with THF/water (75:25), 4 times with DMF, and then 60 mmol Fmoc-OSu and 30 mmol DIPEA for 2 h at room temperature. and washed 3 times with DMF, 3 times with DCM, and then with 50 mmol Trt-Cl and 50 mmol DIPEA for 3 hours at room temperature, washed 4 times with DMF, and 6 times with DEE. and vacuum dried to constant weight. With a loading of 0.78 mmol/g resin, 32.3 g of resin bound Fmoc-Thr-OtBu was obtained.
実施例３. Fmoc-Throl(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-O-Clt
Ａ）Fmoc-スレオニノールから出発
A) Starting from Fmoc-threoninol
350 mlのDCM中50 mmolの市販のFmoc-スレオニノール（CBL-Patras）を、55 mmolのモノマーClt-Cl及び55 mmolのDIPEAと、室温にて４時間反応させた。得られた混合物を通常通り水で抽出し、そしてDCM相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥しそして濾過した。生じた溶液に、30 gの４－メトキシ,４－ポリスチリルベンズヒドリルブロミド（CBL-Patras）及び50 mmolのDIPEAを添加し、そして生ずる混合物を室温にて４時間撹拌した。樹脂を濾過し、そしてDMFにより６回、IPAにより４回及びDEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.82 mmol/gの負荷をもって、38.4 gの樹脂結合Fmoc-スレオニノールを得た。 50 mmol of commercial Fmoc-threoninol (CBL-Patras) in 350 ml of DCM was reacted with 55 mmol of monomers Clt-Cl and 55 mmol of DIPEA for 4 hours at room temperature. The resulting mixture was extracted with water as usual and the DCM phase was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. To the resulting solution, 30 g of 4-methoxy,4-polystyrylbenzhydryl bromide (CBL-Patras) and 50 mmol of DIPEA were added and the resulting mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The resin was filtered and washed 6 times with DMF, 4 times with IPA and 4 times with DEE, and vacuum dried to constant weight. With a loading of 0.82 mmol/g, 38.4 g of resin-bound Fmoc-threoninol was obtained.
Ｂ）Trt-Thr(Resin)-OMeから出発
常法に従ってH-Thr-OMeとTrt-Cl/Me3SiCl及びDIPEAとの反応により調製された30 mmolのTrt-Thr-OMeを、20 g (30 mmolの４－メトキシ４’－ポリスチリルベンズヒドリルブロミド樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で、室温にて10時間反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そして混合物を更に４時間撹拌した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、THFにより５回洗浄し、そしてTHF中30 mmolのLiBH4と反応させた。 30 mmol of Trt-Thr-OMe prepared by the reaction of H-Thr-OMe with Trt-Cl/Me 3 SiCl and DIPEA according to a conventional method was mixed with 20 g (30 mmol of 4-methoxy4'-polystyrylbenzate) of Hydryl bromide resin (product of CBL-Patras) and 60 mmol DIPEA were reacted in 250 ml THF at room temperature for 10 hours. Then, 60 mmol methanol was added to this mixture, and the mixture was stirred for an additional 4 hours. The resin was filtered and washed 3 times with THF/MeOH/DIPEA (85:10:5), 5 times with THF and reacted with 30 mmol LiBH 4 in THF.
次に、樹脂を濾過し、そしてTHFにより６回、DCMにより４回、DCM中１%TFAにより６回、DMF/DIPEA（97:3）により３回洗浄し、そして次に室温にて２時間、60 mmolのFmoc-OSu及び30 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより３回、DCMにより３回洗浄し、そして次に室温にて３時間、50 mmolのClt-Cl及び50 mmol DIPEAと反応させ、DMFにより４回、IPAにより６回及びDEEにより６回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.74 mmol/g樹脂の負荷をもって、34.7 gの樹脂結合Fmoc-Throl-O-Cltを得た。 The resin was then filtered and washed 6 times with THF, 4 times with DCM, 6 times with 1% TFA in DCM, 3 times with DMF/DIPEA (97:3), and then for 2 hours at room temperature. , 60 mmol Fmoc-OSu and 30 mmol DIPEA, washed 3 times with DMF, 3 times with DCM, and then reacted with 50 mmol Clt-Cl and 50 mmol DIPEA for 3 hours at room temperature. , 4 times with DMF, 6 times with IPA and 6 times with DEE and vacuum dried to constant weight. With a loading of 0.74 mmol/g resin, 34.7 g of resin bound Fmoc-Throl-O-Clt was obtained.
実施例４. Fmoc-Ser(トリチル樹脂)-NH 2
当業界において知られている標準的手順により調製された50 mmolのFmoc-Ser-NH2を、0.5リットルのDCMに溶解した。この懸濁液に、30 gのトリチルクロリド樹脂（36 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて６時間撹拌した。次々と25 mlのメタノール及び30 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を、更に室温にて２時間撹拌した。次に、樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.71 mmol/gの負荷をもって、41.1 gのFmoc-Ser-NH2-含有樹脂を得た。
Example 4. Fmoc-Ser (trityl resin)-NH 2
50 mmol of Fmoc-Ser- NH2 , prepared by standard procedures known in the art, was dissolved in 0.5 liters of DCM. To this suspension, 30 g of trityl chloride resin (36 mmol) and 65 mmol of DIPEA were added and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. 25 ml of methanol and 30 mmol of DIPEA were added in succession and the mixture was further stirred for 2 hours at room temperature. The resin was then filtered and washed three times with DCM/MeOH/DIPEA (90:5:5), five times with DMF, four times with IPA, four times with DEE, and dried under vacuum to constant weight. With a loading of 0.71 mmol/g, 41.1 g of Fmoc-Ser-NH 2 -containing resin was obtained.
実施例５. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-NH 2
上記の手順に従って、50 mmolのFmoc-Tyr-NH2及び30 gの2-CTCクロリド樹脂から、0.81 g Tyr/g樹脂の負荷をもって、43.7 gの樹脂を得た。
Example 5. Fmoc-Tyr (2-chlorotrityl resin)-NH 2
Following the above procedure, 43.7 g of resin was obtained from 50 mmol of Fmoc-Tyr-NH 2 and 30 g of 2-CTC chloride resin with a loading of 0.81 g Tyr/g resin.
実施例６. Fmoc-Hyp(4-メチルベンズヒドリル樹脂)-NH 2
上記の手順に従って、50 mmolのFmoc-Hyp-NH2及び30 gの４－メチルベンズヒドリルブロミド樹脂から、0.49 g Hyp/g樹脂の負荷をもって、39.8 gの樹脂を得た。
Example 6. Fmoc-Hyp(4-methylbenzhydryl resin)-NH 2
Following the above procedure, 39.8 g of resin was obtained from 50 mmol of Fmoc-Hyp-NH 2 and 30 g of 4-methylbenzhydryl bromide resin with a loading of 0.49 g Hyp/g resin.
実施例７. Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリル樹脂)-Pro-NH 2
当業界において知られている標準的手順に従ってFmoc-Thr(tBu)-OHとH-Pro-NH2とのカップリングにより調製された50 mmolのFmoc-Thr-Pro-NH2を、0.5リットルDMEに溶解した。得られた溶液に、30 gの４－メトキシベンズヒドリルブロミド樹脂（45 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて６時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて２時間撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDME/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.77 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Thr-Pro-NH2含有樹脂を得た。
Example 7. Fmoc-Thr (4-methoxybenzhydryl resin)-Pro-NH 2
50 mmol of Fmoc-Thr-Pro- NH2 , prepared by coupling Fmoc-Thr(tBu)-OH with H-Pro- NH2 according to standard procedures known in the art, was added to 0.5 liters of DME. dissolved in. To the resulting solution, 30 g of 4-methoxybenzhydryl bromide resin (45 mmol) and 65 mmol of DIPEA were added and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. Then 25 ml methanol and 50 mmol DIPEA were added and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The resin was then filtered and washed 3 times with DME/MeOH/DIPEA (90:5:5), 5 times with DMF, 4 times with IPA, 4 times with DEE, and vacuum dried to constant weight. With a loading of 0.77 mmol/g, 44.5 g of Fmoc-Thr-Pro-NH 2 -containing resin was obtained.
実施例８. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-Pro-OtBu
当業界において知られている標準的手順に従って、50 mmolのFmoc-Tyr-Pro-OtBuを調製し、0.5リットルのDCMに溶解した。得られた溶液に、30 gの２－クロロトリチルクロリド樹脂（48 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて12時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を更に２時間室温にて撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.64 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Tyr-Pro-OtBu含有樹脂を得た。
Example 8. Fmoc-Tyr (2-chlorotrityl resin)-Pro-OtBu
Following standard procedures known in the art, 50 mmol of Fmoc-Tyr-Pro-OtBu was prepared and dissolved in 0.5 liters of DCM. To the resulting solution, 30 g of 2-chlorotrityl chloride resin (48 mmol) and 65 mmol of DIPEA were added and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours. Then 25 ml methanol and 50 mmol DIPEA were added and the mixture was stirred for a further 2 hours at room temperature. The resin was then filtered and washed 3 times with DCM/MeOH/DIPEA (90:5:5), 5 times with DMF, 4 times with IPA, 4 times with DEE, and dried under vacuum to constant weight. With a loading of 0.64 mmol/g, 44.5 g of Fmoc-Tyr-Pro-OtBu-containing resin was obtained.
実施例９. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-Leu-OtBu
当業界において知られている標準的手順に従って調製した50 mmolのFmoc-Tyr-Leu-OtBuを、0.5リットルのTHFに溶解した。得られた溶液に、30 gの2-CTCクロリド樹脂（48 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を60℃にて12時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて更に２時間撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量に真空乾燥した。0.64 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Tyr-Leu-OtBu含有樹脂を得た。
Example 9. Fmoc-Tyr (2-chlorotrityl resin)-Leu-OtBu
50 mmol of Fmoc-Tyr-Leu-OtBu, prepared according to standard procedures known in the art, was dissolved in 0.5 liters of THF. To the resulting solution, 30 g of 2-CTC chloride resin (48 mmol) and 65 mmol of DIPEA were added, and the mixture was stirred at 60° C. for 12 hours. Then 25 ml methanol and 50 mmol DIPEA were added and the mixture was stirred for a further 2 hours at room temperature. The resin was then filtered and washed 3 times with DCM/MeOH/DIPEA (90:5:5), 5 times with DMF, 4 times with IPA, 4 times with DEE, and vacuum dried to constant weight. With a loading of 0.64 mmol/g, 44.5 g of Fmoc-Tyr-Leu-OtBu containing resin was obtained.
実施例10. ペプチド及び保護されたペプチドセグメントの固相合成
一般的手順
A1. 負荷された２－クロロトリチル樹脂の調製 一般的手順
２－クロロトリチルクロリド樹脂（CTC-Cl）（100 g;負荷1.6 mmol/g）（CBL-Patras）を、２Ｌのペプチド合成反応器に入れ、そして700 mLのジクロロメタン（DCM）：ジメチルホルムアミド（DMF）1:1により25℃にて30分間膨潤させる。樹脂を濾過し、そして500 mLのDCM中100 mmolのFmoc-アミノ酸及び300 mmolのジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の溶液を添加する。この混合物を25℃にて２時間窒素の下で撹拌する。
Example 10. Solid phase synthesis of peptides and protected peptide segments
General procedure
A1. Preparation of loaded 2-chlorotrityl resin General procedure
2-chlorotrityl chloride resin (CTC-Cl) (100 g; loading 1.6 mmol/g) (CBL-Patras) was placed in a 2 L peptide synthesis reactor and 700 mL dichloromethane (DCM):dimethylformamide (DMF ) 1:1 at 25℃ for 30 minutes. The resin is filtered and a solution of 100 mmol Fmoc-amino acid and 300 mmol diisopropylethylamine (DIEA) in 500 mL DCM is added. The mixture is stirred at 25° C. for 2 hours under nitrogen.
次に、2-CTC樹脂の残っている活性部位を、10 mLのメタノール（MeOH）の添加及び１時間の反応により中和する。樹脂を濾過し、そして400 mLのDMFにより２回洗浄する。樹脂を濾過し、そしてDMF中25体積％のピペリジン500 mLにより30分間で２回洗浄する。次に樹脂を、500 mLのDMFにより４回処理する。樹脂を、500 mLのイソプロパノール（IPA）による３回の洗浄によって解膨潤する。樹脂を一定重量に乾燥する。この樹脂に、使用したアミノ酸のmmolの70～95％が結合した。 The remaining active sites of the 2-CTC resin are then neutralized by adding 10 mL of methanol (MeOH) and reacting for 1 hour. The resin is filtered and washed twice with 400 mL DMF. The resin is filtered and washed twice for 30 minutes with 500 mL of 25% by volume piperidine in DMF. The resin is then treated with 4 times 500 mL of DMF. The resin is de-swollen by washing three times with 500 mL of isopropanol (IPA). Dry the resin to constant weight. To this resin, 70-95% of the mmol of amino acids used was bound.
Ｂ． 固相合成 一般的プロトコール
パートＡ又は実施例１に記載したように、トリチル若しくはベンズヒドリル型の樹脂にエステル化された又は側鎖を介して取付けられた1.0ｇのアミノ酸又はペプチドを用いて、24℃にて固相合成を実施した。合成においては下記のプロトコールを使用した。
B. Solid Phase Synthesis General Protocol
Solid phase synthesis was performed at 24 °C using 1.0 g of amino acids or peptides esterified or attached via side chains to trityl or benzhydryl type resins as described in Part A or Example 1. carried out. The following protocol was used in the synthesis.
B1. 樹脂の膨潤
樹脂を15 mlの反応器に入れ、そして7 mLのNMPにより２回処理し、次に濾過した。
B2. アミノ酸の活性化
アミノ酸（3.0当量）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（4.0当量）を秤り取り、そしてそれらの2.5体積を有するNMPに反応器中で溶解し、そして０℃に冷却した。次に、DICを添加し（3.0当量）、そしてこの混合物を15分間撹拌した。
B1. Resin swelling
The resin was placed in a 15 ml reactor and treated twice with 7 ml of NMP, then filtered.
B2. Activation of amino acids
Amino acids (3.0 equivalents) and 1-hydroxybenzotriazole (4.0 equivalents) were weighed out and dissolved in their 2.5 volumes of NMP in a reactor and cooled to 0°C. DIC was then added (3.0 eq.) and the mixture was stirred for 15 minutes.
B3. カップリング
次に、B2で調製された溶液をB1の反応器に添加した。反応器を１体積のDCMにより１回洗浄し、そしてこの反応器に加え、これを25℃～30℃において１～３時間撹拌した。サンプルにおいてカイゼルテスト（Kaiser Test）を行うことにより、反応の完結を決定した。３時間後にカップリング反応が完結していない場合（カイゼルテスト陽性）、反応混合物を濾過し、そして活性化されたアミノ酸の新たな溶液を用いて再カップリングを行った。カップリングの完結の後、反応混合物を濾過し、そしてNMP（洗浄当たり５体積）により４回洗浄した。
B3.Coupling
The solution prepared in B2 was then added to the reactor in B1. The reactor was washed once with 1 volume of DCM and added to the reactor, which was stirred at 25° C.-30° C. for 1-3 hours. Completion of the reaction was determined by performing a Kaiser Test on the samples. If the coupling reaction was not complete after 3 hours (positive Kaiser test), the reaction mixture was filtered and recoupling was performed using a fresh solution of activated amino acid. After completion of the coupling, the reaction mixture was filtered and washed four times with NMP (5 volumes per wash).
B4. Fmoc-基の除去
B3において得られた樹脂を濾過し、そして次に、25体積％のピペリジンを含む5 mLの溶液により30分間処理した。次にこの樹脂を５mLのNMPにより３回洗浄した。
B4. Removal of Fmoc-group
The resin obtained in B3 was filtered and then treated with 5 mL of a solution containing 25% by volume piperidine for 30 minutes. The resin was then washed three times with 5 mL of NMP.
B5. ペプチド鎖の延長
各アミノ酸の導入の後、工程B1～B5を、ペプチド鎖の完成まで反復した。
各個々のアミノ酸の導入のため次のFmoc-アミノ酸を使用した：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-D-Trp-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Clt)-OH、Fmoc-Val-OH、Boc-D-Cys(Trt)-OH、Boc-His(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH、Boc-D-2-Nal-OH、Boc-D-Phe-OH、Boc-Ser(tBu)-OH。
B5. Extension of peptide chain
After the introduction of each amino acid, steps B1-B5 were repeated until the peptide chain was completed.
The following Fmoc-amino acids were used for the introduction of each individual amino acid: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-D. -Cys(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His (Trt)-OH, Fmoc-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-D-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro -OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-D-Trp-OH, Fmoc-Trp -OH, Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(Clt)-OH, Fmoc-Val-OH, Boc-D -Cys(Trt)-OH, Boc-His(Trt)-OH, Boc-Lys(Boc)-OH, Boc-D-2-Nal-OH, Boc-D-Phe-OH, Boc-Ser(tBu) -OH.
Ｃ. Ｎ－末端にFmoc-又はBoc-基を含むペプチド又は保護されたペプチドセグメントのCTC－樹脂からの酸性開裂のための一般的方法
上記B1～B5において記載されたようにして製造された、樹脂の結合したぺプチド又はペプチドセグメントを、5 mLのNMPにより４回、５mlのIPAにより３回そして最後に７mlのDCMにより５回洗浄することにより、すべての残留NMP又は他の塩基性成分を完全に除去した。次に、樹脂を０℃に冷却し、DCMから濾過し、そして10 mLの１～２％TFA/DCM溶液により２回、５℃にて処理した。次にこの混合物を０℃にて20分間撹拌し、そして濾過した。次に樹脂を10 mLのDCMにより３回洗浄した。
C. General method for acidic cleavage of peptides or protected peptide segments containing Fmoc- or Boc-groups at the N-terminus from CTC-resins
Wash the resin-bound peptides or peptide segments prepared as described in B1-B5 above 4 times with 5 mL NMP, 3 times with 5 mL IPA and finally 5 times with 7 mL DCM. This completely removed any residual NMP or other basic components. The resin was then cooled to 0°C, filtered from DCM, and treated twice with 10 mL of 1-2% TFA/DCM solution at 5°C. The mixture was then stirred at 0° C. for 20 minutes and filtered. The resin was then washed three times with 10 mL of DCM.
次に、ロ液にピリジンを添加（TFAに対して1.3当量）してTFAを中和した。次に、DCM中の開裂溶液を同体積の水と混合する。生ずる混合物を減圧下で蒸留してDCMを除去する（28℃にて350 torr）。DCMの除去後にペプチド又はペプチドセグメントが沈殿する。次に、生ずるペプチドを水で洗浄し、そして15 Torrの真空の下で30～35℃にて乾燥する。 Next, pyridine was added to the filtrate (1.3 equivalents relative to TFA) to neutralize TFA. Next, mix the cleavage solution in DCM with the same volume of water. The resulting mixture is distilled under reduced pressure to remove DCM (350 torr at 28°C). The peptide or peptide segment is precipitated after removal of DCM. The resulting peptide is then washed with water and dried at 30-35°C under a vacuum of 15 Torr.
実施例11. Ｎ－末端が保護されたフラグメントと樹脂に結合したＣ－末端が保護されたフラグメントとの縮合による樹脂に結合した保護されたペプチドの合成
一般的手順
DMSO/DCM（95:5）中0.15 mmol/mlのＮ－末端が保護されたペプチドフラグメントの溶液に、0.2 mmolのHOBtを添加し、そして生ずる溶液を５℃に冷却する。次に、0.14 mmolのDICを添加し、そして混合物を15℃にて20分間撹拌し、そして次に0.1 mmolの樹脂結合Ｃ－末端フラグメントに加え、そして室温にて更に６時間撹拌する。縮合反応の完結をカイゼルテストによりチェックする。カイゼルテストが青色のままである場合、縮合を完結させるため第２の縮合を行った。
Example 11. Synthesis of a resin-bound protected peptide by condensation of an N-terminally protected fragment with a resin-bound C-terminally protected fragment.
General procedure
To a solution of the N-terminally protected peptide fragment at 0.15 mmol/ml in DMSO/DCM (95:5) is added 0.2 mmol HOBt and the resulting solution is cooled to 5°C. Next, 0.14 mmol of DIC is added and the mixture is stirred at 15° C. for 20 minutes, and then 0.1 mmol of resin-bound C-terminal fragment is added and stirred for a further 6 hours at room temperature. Completion of the condensation reaction is checked by Kaiser test. If the Kaiser test remained blue, a second condensation was performed to complete the condensation.
実施例12. Ｎ－末端が保護されたフラグメントとＣ－末端が保護されたフラグメントとの溶液中での縮合による部分的に保護されたペプチドの合成
一般的手順
DCM中0.15 mmol/mlのＮ－末端が保護されたフラグメントの溶液に、0.2 mmolのHOBtを添加し、そして生ずる溶液を５℃に冷却する。次に、0.15 mmolのEDACを添加し、そしてこの混合物を15℃にて20分間撹拌し、そして次に0.15 mmolのＣ－末端が保護されたフラグメントに添加し、そして室温にて更に２～５時間撹拌する。縮合反応の完結をHPLCによりチェックする。不完全な縮合が観察された場合には、追加分の0.015 mmolのEDACを添加し、そして室温にて更なる時間にわたって反応を続ける。
Example 12. Synthesis of a partially protected peptide by condensation of an N-terminally protected fragment and a C-terminally protected fragment in solution.
General procedure
To a solution of the N-terminally protected fragment at 0.15 mmol/ml in DCM, 0.2 mmol of HOBt is added and the resulting solution is cooled to 5°C. Next, 0.15 mmol of EDAC was added and the mixture was stirred for 20 minutes at 15°C, and then 0.15 mmol of the C-terminally protected fragment was added and an additional 2-5 minutes was added at room temperature. Stir for an hour. Completion of the condensation reaction is checked by HPLC. If incomplete condensation is observed, add an additional 0.015 mmol of EDAC and continue the reaction for an additional period of time at room temperature.
実施例13. 樹脂からのペプチドの同時的開裂及び脱保護
一般的方法
上記のようにして製造された1.00 gの保護された樹脂結合ペプチドを、20 mLのTFA/DTT/水（90:5:5）により５℃にて３時間及び15℃にて１時間処理する。次に、樹脂を開裂溶液により３回洗浄し、そして次に、一緒にしたロ液を真空濃縮し、そして粗ペプチドをエーテルの添加により沈澱させ、エーテルにより数回洗浄し、そしてKOH上で一定重量まで真空乾燥する。
Example 13. Simultaneous cleavage and deprotection of peptides from resins
General Method 1.00 g of the protected resin-bound peptide prepared as described above was incubated with 20 mL of TFA/DTT/water (90:5:5) for 3 hours at 5°C and 1 hour at 15°C. Process time. The resin was then washed three times with cleavage solution and then the combined filtrates were concentrated in vacuo and the crude peptide was precipitated by addition of ether, washed several times with ether and fixed on KOH. Vacuum dry to weight.
実施例14. ペプチドの脱保護
一般的方法
上記のようにして製造された1.00 gの保護されたペプチドを、20 mLのTFA/DTT/水（90:5:5）により、５℃にて３時間及び15℃にて１時間処理した。生ずる溶液を真空濃縮し、そして次に、脱保護されたペプチドをジイソプロピルエーテルの添加により沈澱させ、そして10 mLのジイソプロピルエーテルにより３回洗浄した。生ずる固体を、KOHの下で一定重量まで真空乾燥（25℃、15 Torr）した。
Example 14. Deprotection of peptides
General Method 1.00 g of the protected peptide prepared as described above was dissolved in 20 mL of TFA/DTT/water (90:5:5) for 3 hours at 5°C and 1 hour at 15°C. Processed. The resulting solution was concentrated in vacuo, and the deprotected peptide was then precipitated by addition of diisopropyl ether and washed three times with 10 mL of diisopropyl ether. The resulting solid was vacuum dried (25°C, 15 Torr) to constant weight under KOH.
実施例15. 粗ペプチドの精製 ペプチドの単離
一般的手順
上記のようにして得られたペプチドの溶液を真空濃縮し、そして氷水及びエーテルを添加した。有機相を分離した後、ペプチドの残った水溶液をエーテルにより更に２回抽出し、そして生ずる溶液に窒素又はヘリウムを吹き込み、濾過しそして半調製用カラム10x25 cm, Lichrospher 100, RP-18, 12ミクロン（Merck）に直接付加した；Ａ相＝アセトニトリル中１％-TFA、Ｂ相＝水中１％-TFA；又はクロマシル（Kromasil）。精製されたペプチドを含むHPLC画分を真空濃縮してできるだけ多くの汚染アセトニトリルを除去し、そして標準的凍結乾燥プログラムを用いて凍結乾燥した。
Example 15. Purification of crude peptide Isolation of peptide
General Procedure The solution of peptide obtained above was concentrated in vacuo and ice water and ether were added. After separating the organic phase, the remaining aqueous solution of the peptide is extracted two more times with ether and the resulting solution is sparged with nitrogen or helium, filtered and applied to a semi-preparative column 10x25 cm, Lichrospher 100, RP-18, 12 micron. (Merck); Phase A = 1%-TFA in acetonitrile, Phase B = 1%-TFA in water; or Kromasil. HPLC fractions containing purified peptides were concentrated in vacuo to remove as much contaminating acetonitrile as possible and lyophilized using a standard lyophilization program.
下に記載する実施例16～23を、上記の手順を用いて実施して、下記にリストされた化合物を調製した。
実施例16. ランレオチド（Lanreotide）
実施例17. インスリンＢ－鎖
実施例18. サケカルシトニン
実施例19. オクトレオチド（Octreotide）
実施例20. エキセナチド（Exenatide）
実施例21. プラムリンチド（Pramlintide）
実施例22. テトラコサクチド（Tetracosactide）（ACTH 1-24）
実施例23. ビバリルジン（Bivalirudin）
本件明細書の開示の概要
〔項１〕
下記式Ｉ又はII：
Pr1は、Ｈ又は樹脂に対して及び他の保護基に対してオルソゴナル（orthogonal）アミノ保護基であり；
Ａは、ヒドロキシル基、又はtBu、Trt及びCltから選択される酸感受性ヒドロキシル保護基、又はNR1R2（式中、R1及びR2はＨ又はC1-10アルキルである）、或いは０～30個のアミノ酸を含むペプチドエステル、ペプチドアミド又はペプタイボルであり；
Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C1-10アルキル又はC1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー－樹脂接合体である）
により表される樹脂接合体。
〔項２〕
下記式III～VI：
Pr2は、Ｈ、又は樹脂に対してオルソゴナル（orthogonal）ヒドロキシル保護基であり；
R3及びR4は、それぞれ独立に、Ｈ又はC1-10アルキルであり；
Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C1-10アルキル又はC1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー－樹脂結合体である）
により表される樹脂接合体。
〔項３〕
式Ｉ～VIの樹脂接合体の製造方法において、
ヒドロキシル含有アミノ酸若しくはアミノアルコール又はペプチド誘導体であって、含まれるヒドロキシルアミノ酸若しくは含まれるアミノアルコールの側鎖の少なくとも１つにおいて保護されていないものを調製し、或いはヒドロキシルアミノ酸若しくはヒドロキシルアミノアルコール又はペプチド誘導体をヒドロキシルアミノ酸若しくはヒドロキシルアミノアルコールの側鎖において選択的に脱保護し、そして次に、それを樹脂ハライドとの反応により適当な樹脂に取付け、ここで当該樹脂はトリチル型樹脂及びリンカー、又はベンズヒドリル型樹脂、又はベンジル型樹脂の群から選択され；そして
未反応の樹脂ハライドをマスクするためにアルコール又はチオアルコールを添加する；
工程を含む方法。
〔項４〕
モノアルキル化されたFmoc－アミノジアルコールの製造方法において、Fmoc－ジアミノアルコールとアルキルハライドとを、塩基、例えばtert－アミン塩基の存在下で、有機溶媒、例えばジクロロメタン中で反応させることを含んでなり、この前記アルキルがトリチル、４－メチルトリチル、４－メトキシトリチル及び２－クロロトリチルから選択される、当該製造方法。
〔項５〕
生物学的に活性な遊離の又は部分的に保護されたペプチド、環状ペプチド又はペプタイボル（peptaibol）の固相合成方法であり、固相ペプチド合成において、項１又は２に記載の樹脂接合体を官能化された樹脂として使用することを含む方法。
〔項６〕
下記式：
E-D-2-Nal-Cys(A)-Tyr(C)-D-Trp(F)-Lys(E)-Val-Cys(A)-Thr(Resin)-NH2
（式中：
D-は、Ｄ－アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mmt、Acm又はStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Mtt、Mmt、Trt又はBocから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。
〔項７〕
前記ペプチドが、樹脂に結合したランレオチド（lanreotide）である、項６に記載のペプチド。
〔項８〕
ランレオチド（lanreotide）の製造方法において、項７に記載のペプチド樹脂接合体を、所望によりスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液から選択される穏和な酸により処理し；そして
生ずるペプチドを、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される酸化剤を用いて酸化する；
ことを含んでなる方法。
〔項９〕
ランレオチド（lanreotide）の製造方法において、項７に記載のペプチド樹脂接合体を穏和な酸、例えばヨウ素を含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理する、ことを含んでなる方法。
〔項１０〕
下記式：
E-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(A)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(Resin)-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド又はイミダゾール保護基であり；
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Pbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ、或いは固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。
〔項１１〕
前記ペプチドが、ヒトインスリンＢ－鎖である、項10に記載のペプチド。
〔項１２〕
インスリンＢ－鎖の製造方法において、項10に記載の樹脂結合ペプチドを、酸溶液、例えば所望によりスキャベンジャーを含むジクロロメタン中トリフルオロ酢酸の溶液と接触させることを含んでなる方法。
〔項１３〕
下記式：
E-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(B)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(Resin)-O-
（式中、
Ａは、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。
〔項１４〕
前記ペプチドが、ヒトインスリンＢ－鎖の部分的に保護された９－30フラグメントに対応する、項13に記載のペプチド。
〔項１５〕
インスリンＢ－鎖の製造方法において、項13に記載のペプチドを、保護された１－８インスリンフラグメントBoc-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-OHと縮合させることを含んでなる方法：
ここで、Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt及びMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；そして
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基である。
〔項１６〕
下記式：
E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(Resin)-Pro-NH2
（式中、
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Pbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。
〔項１７〕
前記ペプチドがサケカルシトニンである、項16に記載のペプチド。
〔項１８〕
サケカルシトニンの製造方法において、
項16に記載のペプチドを、穏和な酸、例えば所望によりスキャベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；
得られたペプチド溶液を、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される適当な酸化剤を用いて酸化し；
ペプチドを脱保護し；
ペプチドをクロマトグラフィーにより精製し；そして
ペプチドを凍結乾燥する；
ことを含んでなる方法。
〔項１９〕
サケカルシトニンの製造方法において、
項16に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えばトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；
ペプチドをヨウ素により酸化し；
ペプチドを、酸、例えば場合によってはスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸又は塩酸の溶液で処理することにより脱保護し；そして
サケカルシトニンペプチドをクロマトグラフィーにより精製し、そして凍結乾燥する；
ことを含んでなる方法。
〔項２０〕
項17に記載のペプチドの製造方法において、式：H-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(Resin)-Pro-NH2で表される、サケカルシトニンの部分的に保護された11－32フラグメントを、式：E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-OHで表される、サケカルシトニンの部分的に保護された１－10フラグメントと縮合させることを含んでなる方法：
ここで、
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。
〔項２１〕
下記式：
Ａは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt又はMmtから選択されるアミノ保護基であり；
D-は、Ｄ－アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ｂは、Trt、Mmt、Acm又はStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される部分的に保護されたペプチド。
〔項２２〕
前記ペプチドが、樹脂に結合したオクトレオチド（octreotide）である、項21に記載のペプチド。
〔項２３〕
オクトレオチド（octreotide）の製造方法において、
項22に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えば場合によってはスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；そして
得られたペプチド溶液を、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される適当な酸化剤を用いて酸化する；
ことを含んでなる方法。
〔項２４〕
オクトレオチド（octreotide）の製造方法において、
項22に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えばヨウ素を含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；そして
脱保護し、精製し、凍結乾燥し、そして99％より高い純度のオクトレオチドを得る、
ことを含んでなる方法。
〔項２５〕
下記式：
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Lys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH2
（式中、
Ｘは、Leu-Ser(tBu)又はLeu-ΨSerであり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；そして
Resinは、固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される部分的に保護されたペプチド。
〔項２６〕
前記ペプチドがエキセナチド（exenatide）である、項25に記載のペプチド。
〔項２７〕
下記式：
Y-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH2
（式中、
Ｙは、Ｈ、E-Glu(C)、E-Met-Glu(C)、E-Gln(A)-Met-Glu(C)又はE-Lys(E’)-Gln(A)-Met-Glu(C)であり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド保護基であり；
Ｅ及びＥ’は、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ－又はカルボキシル－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、部分的に保護されたエキセナチド（exenatide）フラグメント12－39、13－39又は14－39であるペプチド。
〔項２８〕
下記式：
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Y
（式中、
Ｘは、Leu-Ser(tBu)又はLeu-ΨSerであり；
Ｅは、Fmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ－又はカルボキシル－保護基であり；
Ｙは、OZ、Lys(E)-Gln(A)-OZ、Lys(E)-Gln(A)-Met-OZ、又はLys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-OZであり、ここで、Ｚは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはBt、Su、Pfp、Tcp又はPnpから選択される、カルボキシル基を親電子的に活性化する基である）
により表される部分的に保護されたペプチド、特にエキセナチド（exenatide）フラグメント１－11、１－13、１－14及び１－15。
〔項２９〕
エキセナチド（exenatide）の製造方法において、
項27に記載の１つのフラグメントを、項28に記載の１つのフラグメントと縮合させて、部分的に保護された又は樹脂に結合したエキセナチド配列を形成し、
脱保護し又は樹脂から開裂させ、そして
エキセナチドを脱保護し、クロマトグラフィー精製し、凍結乾燥する、
ことを含んでなる方法。
〔項３０〕
下記式：
E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin)-NH2
（式中、
Ｘは、Ser(tBu)-Ser(tBu)又はSer(tBu)-ΨSerであり；
Ｙは、Ala-Thr(tBu)又はAla-ΨThrであり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり;
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、部分的に保護されたペプチド。
〔項３１〕
保護されているか又は部分的に保護されているプラムリンチドである、項30に記載のペプチド。
〔項３２〕
下記式：
配列Z-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin)-NH2
（式中、
Ｚは、Ｈ、或いはE-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala、E-Arg(D)-Leu-Ala、E-Leu-Ala又はE-Alaであり；
Ｘは、Ser(tBu)-Ser(tBu)又はSer(tBu)-ΨSerであり；
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド、特に保護された又は部分的に保護された10－38、11－38、12－38及び14－38のプラムリンチド（pramlintide）フラグメント。
〔項３３〕
下記式：
保護されたペプチドを、酸感受性樹脂、例えば2-CTC-樹脂上で集合（assembling）し；
樹脂から保護されたペプチドを開裂させ；
樹脂に結合したペプチドを、穏和な酸、例えばジクロロメタンのごとき有機溶媒中希トリフルオロ酢酸と接触させることにより酸化する、ここで、当該溶剤は、フラグメントに対して２～200モル過剰量のヨウ素を含む；
ことを含んでなる方法。
〔項３４〕
プラムリンチド（pramlintide）の製造方法において、項33に記載のフラグメントを、溶液中又は固相上で、請求項32若しくは請求項33に記載のフラグメントの１つ、又は次の式：E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-OZ、E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-OZ、E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-OZ、若しくはE-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-OZで表されるフラグメントの１つと縮合させることを含んでなる方法：
ここで、
Ｙは、それぞれ独立に、Ala-Thr(tBu)又はAla-ΨThrであり；
Ｚは、Ｈ、或いはBt、Su、Pfp、Tcp又はPnpから選択される基であり;
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。
〔項３５〕
下記式：
E-D-Phe-Pro-Arg(D)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(A)-Gly-Asp(C)-Phe-Glu(C)-Glu(C)-Ile-Pro-Glu(C)-Glu(C)-Tyr(Resin)-Leu-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはMtt又はMmtから選択されるカルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル－又はカルボキシル－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド。
〔項３６〕
前記保護されたペプチドがビバリルジン（bivalirudin）である、項35に記載の保護されたペプチド。
〔項３７〕
下記式：
E-X-Tyr(Resin)-Leu-O-C
（式中、
Ｘは、ビバリルジン（bivalirudin）ペプチド配列であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル－又はカルボキシル－保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたフラグメント。
〔項３８〕
ビバリルジン（bivalirudin）の製造方法において、請求項37に記載の式：E-X-Tyr(Resin)-Leu-O-Cのビバリルジンフラグメントを、溶液中で又は固相上で、式：E-D-Phe-Y-OZのビバリルジンフラグメントと縮合させてE-D-Phe-Y-X-Tyr(Resin)-Leu-O-Cを生じさせ；
脱保護、又は樹脂からの開裂と脱保護によりビバリルジンをもたらし；
ビバリルジンをクロマトグラフィーにより精製し；
凍結乾燥により99％より高純度のビバリルジンを得る、
ことを含んでなる方法。
ここで、
Ｘ及びＹは、独立に、ビバリルジンペプチド配列である；
D-は、Ｄ－アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｅは、Fmoc、Mtt、Mmt、Trt、Boc又はNpsから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。
〔項３９〕
下記式：
E-Ser(C)-Tyr(C)-Ser(C)-Met-Glu(C)-His(A)-Phe-Arg(D)-Trp(F)-Gly-Lys(E)-Pro- Val-Gly-Lys(E)-Lys(E)-Arg(D)-Arg(D)-Pro-Val-Lys(E)-Val-Tyr(Resin)-Pro-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、それぞれ独立の、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立の、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド。
〔項４０〕
ACTH(1-24)ペプチドである、項39に記載の保護された又は部分的に保護されたペプチド。
〔項４１〕
下記式：
E-X-Tyr(Resin)-Pro-O-C
（式中、
Ｘは、ACTH(1-24)配列であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたフラグメント。
〔項４２〕
ACTH(1-24)の製造方法において、
項37に記載の式：E-X-Tyr(Resin)-Pro-O-CのACTHフラグメントを、溶液中で又は固相上で、式：E-Y-OZのACTHフラグメントと縮合させてE-Y-X-Tyr(Resin)-Pro-O-Cを生じさせ；
脱保護、又は樹脂からの開裂と脱保護によりACTH(1-24)をもたらし；
ACTH(1-24)をクロマトグラフィーにより精製し；
凍結乾燥により99％より高純度のACTH(1-24)を得る、
ことを含んでなる方法：
ここで、
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、ACTH配列であり；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｅは、Fmoc, Mtt、Mmt、Trt、Boc又はNpsから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。
Examples 16-23, described below, were performed using the procedures described above to prepare the compounds listed below.
Example 16. Lanreotide
Example 17. Insulin B-chain
Example 18. Salmon calcitonin
Example 19. Octreotide
Example 20. Exenatide
Example 21. Pramlintide
Example 22. Tetracosactide (ACTH 1-24)
Example 23. Bivalirudin
Summary of disclosure of the specification [Section 1]
The following formula I or II:
Pr 1 is H or an orthogonal amino protecting group to the resin and to other protecting groups;
A is a hydroxyl group, or an acid-sensitive hydroxyl protecting group selected from tBu, Trt and Clt, or NR 1 R 2 , where R 1 and R 2 are H or C 1-10 alkyl, or 0 is a peptide ester, peptide amide or peptibol containing ~30 amino acids;
X, Y, Z and V are each independent substituents in the ortho, meta or para position and are selected from H, Cl, F, C 1-10 alkyl or C 1-10 alkoxy; and P is , an insoluble support or an insoluble linker-resin conjugate suitable for solid phase synthesis of peptides).
A resin bonded body represented by
[Section 2]
Formulas III to VI below:
Pr 2 is H, or a hydroxyl protecting group orthogonal to the resin;
R 3 and R 4 are each independently H or C 1-10 alkyl;
X, Y, Z and V are each independent substituents in the ortho, meta or para position and are selected from H, Cl, F, C 1-10 alkyl or C 1-10 alkoxy; and P is , an insoluble support or an insoluble linker-resin conjugate suitable for solid phase synthesis of peptides).
A resin bonded body represented by
[Section 3]
In the method for producing a resin bonded body of formulas I to VI,
A hydroxyl-containing amino acid or amino alcohol or peptide derivative is prepared that is unprotected in at least one side chain of the hydroxyl amino acid or amino alcohol involved; Selective deprotection at the side chain of the hydroxylamino acid or hydroxylaminoalcohol and then attachment of it to a suitable resin by reaction with a resin halide, where the resin is a trityl-type resin and linker, or a benzhydryl-type resin. , or benzyl-type resins; and adding alcohol or thioalcohol to mask unreacted resin halides;
A method that involves a process.
[Section 4]
A method for producing a monoalkylated Fmoc-amino dialcohol, comprising reacting an Fmoc-diamino alcohol and an alkyl halide in an organic solvent, such as dichloromethane, in the presence of a base, such as a tert-amine base. and the said alkyl is selected from trityl, 4-methyltrityl, 4-methoxytrityl and 2-chlorotrityl.
[Section 5]
A solid phase synthesis method for biologically active free or partially protected peptides, cyclic peptides or peptaibols, which comprises functionalizing the resin conjugate according to item 1 or 2 in solid phase peptide synthesis. A method comprising using the resin as a modified resin.
[Section 6]
The following formula:
ED-2-Nal-Cys(A)-Tyr(C)-D-Trp(F)-Lys(E)-Val-Cys(A)-Thr(Resin) -NH2
(In the formula:
D- indicates the chirality of the amino acid according to the D-amino acid;
A is each independently a thiol protecting group selected from Trt, Mmt, Acm or StBu;
C is a hydroxy protecting group selected from Clt, Trt or tBu;
F is H or Boc;
E is an amino protecting group selected from Mtt, Mmt, Trt or Boc; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
Peptide represented by.
[Section 7]
7. The peptide according to item 6, wherein the peptide is resin-bound lanreotide.
[Section 8]
In the process for producing lanreotide, the peptide-resin conjugate according to item 7 is treated with a mild acid selected from a solution of trifluoroacetic acid, optionally containing a scavenger; and the resulting peptide is treated with air, peroxide, etc. oxidizing with an oxidizing agent selected from hydrogen, DMSO or iodine;
A method that includes:
[Section 9]
A method for producing lanreotide, comprising treating the peptide-resin conjugate according to item 7 with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid containing iodine.
[Section 10]
The following formula:
E-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala -Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(A)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E )-Thr(Resin)-OC
(In the formula,
A is H or a carboxamide or imidazole protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxy-, carboxyl- or phenoxy-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is H or an acid-sensitive resin suitable for solid phase peptide synthesis)
Peptide represented by.
[Section 11]
11. The peptide according to item 10, wherein the peptide is human insulin B-chain.
[Section 12]
A method for producing insulin B-chain, comprising contacting a resin-bound peptide according to paragraph 10 with an acid solution, such as a solution of trifluoroacetic acid in dichloromethane, optionally containing a scavenger.
[Section 13]
The following formula:
E-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(B)-Gly-Glu(C)-Arg(D) -Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(Resin)-O-
(In the formula,
A is a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxy-, carboxyl- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
Peptide represented by.
[Section 14]
14. Peptide according to paragraph 13, wherein said peptide corresponds to a partially protected 9-30 fragment of human insulin B-chain.
[Section 15]
In the method for producing insulin B-chain, the peptide according to item 13 is added to the protected 1-8 insulin fragment Boc-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys( B) A method comprising condensing with -Gly-OH:
wherein A is a carboxamide- or imidazole-protecting group, each independently selected from Trt, Mtt and Mmt; and B is a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu. .
[Section 16]
The following formula:
E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-Lys(E)-Leu-Ser(C )-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr( C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(Resin)-Pro-NH 2
(In the formula,
A is a carboxamide- or imidazole-protecting group, each independently selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is each independently a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxyl-, carboxy- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
Peptide represented by.
[Section 17]
17. The peptide according to item 16, wherein the peptide is salmon calcitonin.
[Section 18]
In the method for producing salmon calcitonin,
treating the peptide according to paragraph 16 with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid optionally containing a scavenger;
oxidizing the resulting peptide solution using a suitable oxidizing agent selected from air, hydrogen peroxide, DMSO or iodine;
deprotecting the peptide;
purifying the peptide by chromatography; and lyophilizing the peptide;
A method that includes:
[Section 19]
In the method for producing salmon calcitonin,
treating the peptide-resin conjugate according to paragraph 16 with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid;
oxidizing the peptide with iodine;
The peptide is deprotected by treatment with an acid, such as a solution of trifluoroacetic acid or hydrochloric acid optionally containing a scavenger; and the salmon calcitonin peptide is purified by chromatography and lyophilized;
A method that includes:
[Section 20]
In the method for producing a peptide according to item 17, the formula: H-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu -Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(Resin )-Pro- NH2 , a partially protected 11-32 fragment of salmon calcitonin with the formula: E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C )-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-OH:
here,
A is a carboxamide- or imidazole-protecting group, each independently selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is each independently a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxyl-, carboxy- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis.
[Section 21]
The following formula:
A is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt or Mmt;
D- indicates the chirality of the amino acid according to the D-amino acid;
B is a thiol protecting group selected from Trt, Mmt, Acm or StBu;
C is H or Boc;
E is a hydroxy protecting group selected from Clt, Trt or tBu; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A partially protected peptide represented by
[Section 22]
22. The peptide of paragraph 21, wherein the peptide is resin-bound octreotide.
[Section 23]
In the method for producing octreotide,
treating the peptide-resin conjugate according to paragraph 22 with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid optionally containing a scavenger; and the resulting peptide solution being treated with a solution selected from air, hydrogen peroxide, DMSO or iodine. oxidize using a suitable oxidizing agent;
A method that includes:
[Section 24]
In the method for producing octreotide,
Treating the peptide-resin conjugate according to paragraph 22 with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid containing iodine; and deprotecting, purifying, lyophilizing and obtaining octreotide of greater than 99% purity. ,
A method that includes:
[Section 25]
The following formula:
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Lys(E)-Gln(A)- Met-Glu(C)-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn (A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH 2
(In the formula,
X is Leu-Ser(tBu) or Leu-ΨSer;
A is each independently H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is a hydroxyl-, carboxy- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
F is H or Boc; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for solid-phase peptide synthesis)
A partially protected peptide represented by
[Section 26]
26. The peptide according to paragraph 25, wherein the peptide is exenatide.
[Section 27]
The following formula:
Y-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly -Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH 2
(In the formula,
Y is H, E-Glu(C), E-Met-Glu(C), E-Gln(A)-Met-Glu(C) or E-Lys(E')-Gln(A)-Met- Glu(C);
A is each independently H, or a carboxamide protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
E and E' are each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
F is H or Boc;
C is a hydroxy- or carboxyl-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A peptide that is a partially protected exenatide fragment 12-39, 13-39 or 14-39, represented by
[Section 28]
The following formula:
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-XY
(In the formula,
X is Leu-Ser(tBu) or Leu-ΨSer;
E is an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
A is H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is a hydroxy- or carboxyl-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
Y is OZ, Lys(E)-Gln(A)-OZ, Lys(E)-Gln(A)-Met-OZ, or Lys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-OZ (where Z is each independently H or a group electrophilically activating a carboxyl group selected from Bt, Su, Pfp, Tcp or Pnp)
Particularly exenatide fragments 1-11, 1-13, 1-14 and 1-15.
[Section 29]
In the method for producing exenatide,
condensing one fragment according to paragraph 27 with one fragment according to paragraph 28 to form a partially protected or resin-bound exenatide sequence;
deprotecting or cleaving from the resin, and exenatide is deprotected, chromatographically purified, and lyophilized;
A method that includes:
[Section 30]
The following formula:
E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-Asn(A)- Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly -Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin)-NH 2
(In the formula,
X is Ser(tBu)-Ser(tBu) or Ser(tBu)-ΨSer;
Y is Ala-Thr(tBu) or Ala-ΨThr;
A is each independently H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is each independently a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxyl-, carboxyl- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A partially protected peptide represented by
[Section 31]
31. The peptide according to paragraph 30, which is a protected or partially protected pramlintide.
[Section 32]
The following formula:
Sequence Z-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)- Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin) -NH2
(In the formula,
Z is H, or E-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala, E-Arg(D)-Leu-Ala, E-Leu-Ala or E-Ala;
X is Ser(tBu)-Ser(tBu) or Ser(tBu)-ΨSer;
A is H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is a hydroxyl-, carboxy- or phenoxy-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
Protected or partially protected peptides, especially protected or partially protected pramlintide fragments of 10-38, 11-38, 12-38 and 14-38.
[Section 33]
The following formula:
assembling the protected peptide on an acid-sensitive resin, such as 2-CTC-resin;
cleaving the protected peptide from the resin;
The resin-bound peptide is oxidized by contacting it with a mild acid, such as dilute trifluoroacetic acid in an organic solvent such as dichloromethane, where the solvent contains a 2-200 molar excess of iodine over the fragments. include;
A method that includes:
[Section 34]
In the method for producing pramlintide, the fragment according to item 33 is added in solution or on a solid phase to one of the fragments according to claim 32 or claim 33, or one of the fragments according to the following formula: E-Lys(E )-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-OZ, E-Lys(E)-Cys (B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-OZ, E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A )-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-OZ, or E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys( B) A method comprising condensing with one of the fragments represented by -Y-OZ:
here,
Y is each independently Ala-Thr(tBu) or Ala-ΨThr;
Z is H or a group selected from Bt, Su, Pfp, Tcp or Pnp;
A is each independently H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is each independently a hydroxy-, carboxy- or phenoxy-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is each independently H, or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
B is each independently a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu; and
Resin is an acid sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis.
[Section 35]
The following formula:
ED-Phe-Pro-Arg(D)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(A)-Gly-Asp(C)-Phe-Glu(C)-Glu(C)-Ile-Pro-Glu (C)-Glu(C)-Tyr(Resin)-Leu-OC
(In the formula,
A is H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Mtt or Mmt;
C is each independently a hydroxyl- or carboxyl-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A protected or partially protected peptide represented by
[Section 36]
36. The protected peptide according to paragraph 35, wherein the protected peptide is bivalirudin.
[Section 37]
The following formula:
EX-Tyr(Resin)-Leu-OC
(In the formula,
X is a bivalirudin peptide sequence;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
C is a hydroxyl- or carboxyl-protecting group selected from tBu, Trt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A protected or partially protected fragment represented by
[Section 38]
In the method for producing bivalirudin, a bivalirudin fragment of the formula: EX-Tyr(Resin)-Leu-OC according to claim 37 is added to the bivalirudin fragment of the formula: ED-Phe-Y in a solution or on a solid phase. condensation with the bivalirudin fragment of -OZ to yield ED-Phe-YX-Tyr(Resin)-Leu-OC;
Deprotection or cleavage from the resin and deprotection yields bivalirudin;
Purifying bivalirudin by chromatography;
Obtain bivalirudin with a purity higher than 99% by freeze-drying,
A method that includes:
here,
X and Y are independently bivalirudin peptide sequences;
D- indicates the chirality of the amino acid according to the D-amino acid;
C is a hydroxy protecting group selected from Clt, Trt or tBu;
E is an amino protecting group selected from Fmoc, Mtt, Mmt, Trt, Boc or Nps; and
Resin is an acid sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis.
[Section 39]
The following formula:
E-Ser(C)-Tyr(C)-Ser(C)-Met-Glu(C)-His(A)-Phe-Arg(D)-Trp(F)-Gly-Lys(E)-Pro- Val-Gly-Lys(E)-Lys(E)-Arg(D)-Arg(D)-Pro-Val-Lys(E)-Val-Tyr(Resin)-Pro-OC
(In the formula,
A is H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is each independently a hydroxy-, carboxyl- or phenoxy-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is each independently a guanidine protecting group selected from H, or Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
F is H or Boc; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A protected or partially protected peptide represented by
[Section 40]
The protected or partially protected peptide according to paragraph 39, which is an ACTH(1-24) peptide.
[Section 41]
The following formula:
EX-Tyr(Resin)-Pro-OC
(In the formula,
X is an ACTH(1-24) sequence;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and C is hydroxy-, carboxyl- or phenoxy- selected from tBu, Trt or Clt. is a protecting group; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A protected or partially protected fragment represented by
[Section 42]
In the method for producing ACTH(1-24),
The ACTH fragment of formula: EX-Tyr(Resin)-Pro-OC described in item 37 is condensed with the ACTH fragment of formula: EY-OZ in solution or on a solid phase to produce EYX-Tyr(Resin)- Produces Pro-OC;
Deprotection or cleavage from the resin and deprotection yields ACTH(1-24);
Purify ACTH(1-24) by chromatography;
Obtain ACTH(1-24) with a purity higher than 99% by freeze-drying.
How to do it includes:
here,
X and Y are each independently an ACTH sequence;
C is a hydroxy protecting group selected from Clt, Trt or tBu;
E is an amino protecting group selected from Fmoc, Mtt, Mmt, Trt, Boc or Nps; and
Resin is an acid sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis.
Claims (42)
Pr1は、Ｈ又は樹脂に対して及び他の保護基に対してオルソゴナル（orthogonal）アミノ保護基であり；
Ａは、ヒドロキシル基、又はtBu、Trt及びCltから選択される酸感受性ヒドロキシル保護基、又はNR1R2（式中、R1及びR2はＨ又はC1-10アルキルである）、或いは０～30個のアミノ酸を含むペプチドエステル、ペプチドアミド又はペプタイボルであり；
Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C1-10アルキル又はC1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー－樹脂接合体である）
により表される樹脂接合体。 The following formula I or II:
Pr 1 is an amino protecting group that is H or orthogonal to the resin and to other protecting groups;
A is a hydroxyl group, or an acid-sensitive hydroxyl protecting group selected from tBu, Trt and Clt, or NR 1 R 2 where R 1 and R 2 are H or C 1-10 alkyl, or 0 is a peptide ester, peptide amide or peptibol containing ~30 amino acids;
X, Y, Z and V are each independent substituents in the ortho, meta or para position and are selected from H, Cl, F, C 1-10 alkyl or C 1-10 alkoxy; and P is , an insoluble support or an insoluble linker-resin conjugate suitable for solid phase synthesis of peptides).
A resin bonded body represented by
Pr2は、Ｈ、又は樹脂に対してオルソゴナル（orthogonal）ヒドロキシル保護基であり；
R3及びR4は、それぞれ独立に、Ｈ又はC1-10アルキルであり；
Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C1-10アルキル又はC1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー－樹脂結合体である）
により表される樹脂接合体。 Formulas III to VI below:
Pr 2 is H, or a hydroxyl protecting group orthogonal to the resin;
R 3 and R 4 are each independently H or C 1-10 alkyl;
X, Y, Z and V are each independent substituents in the ortho, meta or para position and are selected from H, Cl, F, C 1-10 alkyl or C 1-10 alkoxy; and P is , an insoluble support or an insoluble linker-resin conjugate suitable for solid phase synthesis of peptides).
A resin bonded body represented by
ヒドロキシル含有アミノ酸若しくはアミノアルコール又はペプチド誘導体であって、含まれるヒドロキシルアミノ酸若しくは含まれるアミノアルコールの側鎖の少なくとも１つにおいて保護されていないものを調製し、或いはヒドロキシルアミノ酸若しくはヒドロキシルアミノアルコール又はペプチド誘導体をヒドロキシルアミノ酸若しくはヒドロキシルアミノアルコールの側鎖において選択的に脱保護し、そして次に、それを樹脂ハライドとの反応により適当な樹脂に取付け、ここで当該樹脂はトリチル型樹脂及びリンカー、又はベンズヒドリル型樹脂、又はベンジル型樹脂の群から選択され；そして
未反応の樹脂ハライドをマスクするためにアルコール又はチオアルコールを添加する；
工程を含む方法。 In the method for producing a resin bonded body of formulas I to VI,
preparing a hydroxyl-containing amino acid or amino alcohol or peptide derivative that is unprotected in at least one side chain of the hydroxyl amino acid or amino alcohol involved; Selective deprotection at the side chain of the hydroxylamino acid or hydroxylaminoalcohol and then attachment of it to a suitable resin by reaction with a resin halide, where the resin is a trityl-type resin and linker, or a benzhydryl-type resin. , or benzyl-type resins; and adding alcohol or thioalcohol to mask unreacted resin halides;
A method that involves a process.
E-D-2-Nal-Cys(A)-Tyr(C)-D-Trp(F)-Lys(E)-Val-Cys(A)-Thr(Resin)-NH2
（式中：
D-は、Ｄ－アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mmt、Acm又はStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Mtt、Mmt、Trt又はBocから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。 The following formula:
ED-2-Nal-Cys(A)-Tyr(C)-D-Trp(F)-Lys(E)-Val-Cys(A)-Thr(Resin) -NH2
(In the formula:
D- indicates the chirality of the amino acid according to the D-amino acid;
A is each independently a thiol protecting group selected from Trt, Mmt, Acm or StBu;
C is a hydroxy protecting group selected from Clt, Trt or tBu;
F is H or Boc;
E is an amino protecting group selected from Mtt, Mmt, Trt or Boc; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
Peptide represented by.
生ずるペプチドを、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される酸化剤を用いて酸化する；
ことを含んでなる方法。 In a process for the production of lanreotide, the peptide-resin conjugate according to claim 7 is treated with a mild acid selected from a solution of trifluoroacetic acid optionally containing a scavenger; and the resulting peptide is oxidizing with an oxidizing agent selected from hydrogen oxide, DMSO or iodine;
A method that includes:
E-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(A)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(Resin)-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド又はイミダゾール保護基であり；
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Pbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ、或いは固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。 The following formula:
E-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala -Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(A)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E )-Thr(Resin)-OC
(In the formula,
A is H or a carboxamide or imidazole protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxy-, carboxyl- or phenoxy-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is H or an acid-sensitive resin suitable for solid phase peptide synthesis)
Peptide represented by.
E-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(B)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(Resin)-O-
（式中、
Ａは、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。 The following formula:
E-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(B)-Gly-Glu(C)-Arg(D) -Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(Resin)-O-
(In the formula,
A is a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxy-, carboxyl- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
Peptide represented by.
ここで、Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt及びMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；そして
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基である。 In the method for producing insulin B-chain, the peptide according to claim 13 is added to the protected 1-8 insulin fragment Boc-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys. A method comprising condensing with (B)-Gly-OH:
wherein A is a carboxamide- or imidazole-protecting group, each independently selected from Trt, Mtt and Mmt; and B is a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu. .
E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(Resin)-Pro-NH2
（式中、
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Pbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。 The following formula:
E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-Lys(E)-Leu-Ser(C )-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr( C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(Resin)-Pro-NH 2
(In the formula,
A is a carboxamide- or imidazole-protecting group, each independently selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is each independently a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxyl-, carboxy- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
Peptide represented by.
請求項16に記載のペプチドを、穏和な酸、例えば所望によりスキャベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；
得られたペプチド溶液を、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される適当な酸化剤を用いて酸化し；
ペプチドを脱保護し；
ペプチドをクロマトグラフィーにより精製し；そして
ペプチドを凍結乾燥する；
ことを含んでなる方法。 In the method for producing salmon calcitonin,
treating the peptide according to claim 16 with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid optionally containing a scavenger;
oxidizing the resulting peptide solution using a suitable oxidizing agent selected from air, hydrogen peroxide, DMSO or iodine;
deprotecting the peptide;
purifying the peptide by chromatography; and lyophilizing the peptide;
A method that includes:
請求項16に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えばトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；
ペプチドをヨウ素により酸化し；
ペプチドを、酸、例えば場合によってはスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸又は塩酸の溶液で処理することにより脱保護し；そして
サケカルシトニンペプチドをクロマトグラフィーにより精製し、そして凍結乾燥する；
ことを含んでなる方法。 In the method for producing salmon calcitonin,
treating the peptide-resin conjugate according to claim 16 with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid;
oxidizing the peptide with iodine;
The peptide is deprotected by treatment with an acid, such as a solution of trifluoroacetic acid or hydrochloric acid optionally containing a scavenger; and the salmon calcitonin peptide is purified by chromatography and lyophilized;
A method that includes:
ここで、
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。 In the method for producing a peptide according to claim 17, the formula: H-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)- Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr( The partially protected 11-32 fragment of salmon calcitonin , represented by the formula: E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser( A method comprising condensing with a partially protected 1-10 fragment of salmon calcitonin, represented by C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-OH:
here,
A is a carboxamide- or imidazole-protecting group, each independently selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is each independently a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxyl-, carboxy- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis.
Ａは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt又はMmtから選択されるアミノ保護基であり；
D-は、Ｄ－アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ｂは、Trt、Mmt、Acm又はStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される部分的に保護されたペプチド。 The following formula:
A is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt or Mmt;
D- indicates the chirality of the amino acid according to the D-amino acid;
B is a thiol protecting group selected from Trt, Mmt, Acm or StBu;
C is H or Boc;
E is a hydroxy protecting group selected from Clt, Trt or tBu; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A partially protected peptide represented by
請求項22に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えば場合によってはスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；そして
得られたペプチド溶液を、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される適当な酸化剤を用いて酸化する；
ことを含んでなる方法。 In the method for producing octreotide,
treating the peptide-resin conjugate according to claim 22 with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid optionally containing a scavenger; and removing the resulting peptide solution from air, hydrogen peroxide, DMSO or iodine. oxidizing using a suitable oxidizing agent selected;
A method that includes:
請求項22に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えばヨウ素を含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；そして
脱保護し、精製し、凍結乾燥し、そして99％より高い純度のオクトレオチドを得る、
ことを含んでなる方法。 In the method for producing octreotide,
The peptide-resin conjugate of claim 22 is treated with a solution of a mild acid, such as trifluoroacetic acid containing iodine; and deprotected, purified, lyophilized and yielded octreotide of greater than 99% purity. obtain,
A method that includes:
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Lys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH2
（式中、
Ｘは、Leu-Ser(tBu)又はLeu-ΨSerであり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；そして
Resinは、固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される部分的に保護されたペプチド。 The following formula:
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Lys(E)-Gln(A)- Met-Glu(C)-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn (A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH 2
(In the formula,
X is Leu-Ser(tBu) or Leu-ΨSer;
A is each independently H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is a hydroxyl-, carboxy- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
F is H or Boc; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for solid-phase peptide synthesis)
A partially protected peptide represented by
Y-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH2
（式中、
Ｙは、Ｈ、E-Glu(C)、E-Met-Glu(C)、E-Gln(A)-Met-Glu(C)又はE-Lys(E’)-Gln(A)-Met-Glu(C)であり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド保護基であり；
Ｅ及びＥ’は、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ－又はカルボキシル－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、部分的に保護されたエキセナチド（exenatide）フラグメント12－39、13－39又は14－39であるペプチド。 The following formula:
Y-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly -Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH 2
(In the formula,
Y is H, E-Glu(C), E-Met-Glu(C), E-Gln(A)-Met-Glu(C) or E-Lys(E')-Gln(A)-Met- Glu(C);
A is each independently H, or a carboxamide protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
E and E' are each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
F is H or Boc;
C is a hydroxy- or carboxyl-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A peptide that is a partially protected exenatide fragment 12-39, 13-39 or 14-39, represented by
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Y
（式中、
Ｘは、Leu-Ser(tBu)又はLeu-ΨSerであり；
Ｅは、Fmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ－又はカルボキシル－保護基であり；
Ｙは、OZ、Lys(E)-Gln(A)-OZ、Lys(E)-Gln(A)-Met-OZ、又はLys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-OZであり、ここで、Ｚは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはBt、Su、Pfp、Tcp又はPnpから選択される、カルボキシル基を親電子的に活性化する基である）
により表される部分的に保護されたペプチド、特にエキセナチド（exenatide）フラグメント１－11、１－13、１－14及び１－15。 The following formula:
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-XY
(In the formula,
X is Leu-Ser(tBu) or Leu-ΨSer;
E is an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
A is H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is a hydroxy- or carboxyl-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
Y is OZ, Lys(E)-Gln(A)-OZ, Lys(E)-Gln(A)-Met-OZ, or Lys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-OZ (wherein Z is each independently H or a group electrophilically activating a carboxyl group selected from Bt, Su, Pfp, Tcp or Pnp)
Particularly exenatide fragments 1-11, 1-13, 1-14 and 1-15.
請求項27に記載の１つのフラグメントを、請求項28に記載の１つのフラグメントと縮合させて、部分的に保護された又は樹脂に結合したエキセナチド配列を形成し、
脱保護し又は樹脂から開裂させ、そして
エキセナチドを脱保護し、クロマトグラフィー精製し、凍結乾燥する、
ことを含んでなる方法。 In the method for producing exenatide,
condensing one fragment of claim 27 with one fragment of claim 28 to form a partially protected or resin-bound exenatide sequence;
deprotecting or cleaving from the resin and deprotecting exenatide, chromatographically purifying and lyophilizing;
A method that includes:
E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin)-NH2
（式中、
Ｘは、Ser(tBu)-Ser(tBu)又はSer(tBu)-ΨSerであり；
Ｙは、Ala-Thr(tBu)又はAla-ΨThrであり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり;
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、部分的に保護されたペプチド。 The following formula:
E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-Asn(A)- Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly -Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin)-NH 2
(In the formula,
X is Ser(tBu)-Ser(tBu) or Ser(tBu)-ΨSer;
Y is Ala-Thr(tBu) or Ala-ΨThr;
A is each independently H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
B is each independently a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu;
C is a hydroxyl-, carboxyl- or phenoxy-protecting group, each independently selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A partially protected peptide represented by
配列Z-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin)-NH2
（式中、
Ｚは、Ｈ、或いはE-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala、E-Arg(D)-Leu-Ala、E-Leu-Ala又はE-Alaであり；
Ｘは、Ser(tBu)-Ser(tBu)又はSer(tBu)-ΨSerであり；
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド、特に保護された又は部分的に保護された10－38、11－38、12－38及び14－38のプラムリンチド（pramlintide）フラグメント。 The following formula:
Sequence Z-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)- Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin) -NH2
(In the formula,
Z is H, or E-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala, E-Arg(D)-Leu-Ala, E-Leu-Ala or E-Ala;
X is Ser(tBu)-Ser(tBu) or Ser(tBu)-ΨSer;
A is H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is a hydroxyl-, carboxy- or phenoxy-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
Protected or partially protected peptides, especially protected or partially protected pramlintide fragments of 10-38, 11-38, 12-38 and 14-38.
保護されたペプチドを、酸感受性樹脂、例えば2-CTC-樹脂上で集合（assembling）し；
樹脂から保護されたペプチドを開裂させ；
樹脂に結合したペプチドを、穏和な酸、例えばジクロロメタンのごとき有機溶媒中希トリフルオロ酢酸と接触させることにより酸化する、ここで、当該溶剤は、フラグメントに対して２～200モル過剰量のヨウ素を含む；
ことを含んでなる方法。 The following formula:
assembling the protected peptide on an acid-sensitive resin, such as 2-CTC-resin;
cleaving the protected peptide from the resin;
The resin-bound peptide is oxidized by contacting it with a mild acid, such as dilute trifluoroacetic acid in an organic solvent such as dichloromethane, where the solvent contains a 2-200 molar excess of iodine over the fragments. include;
A method that includes:
ここで、
Ｙは、それぞれ独立に、Ala-Thr(tBu)又はAla-ΨThrであり；
Ｚは、Ｈ、或いはBt、Su、Pfp、Tcp又はPnpから選択される基であり;
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ－、カルボキシ－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。 In a process for producing pramlintide, the fragment according to claim 33 is added in solution or on a solid phase to one of the fragments according to claim 32 or claim 33, or one of the following formula: E-Lys( E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-OZ, E-Lys(E)- Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-OZ, E-Lys(E)-Cys(B)-Asn( A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-OZ or E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys A method comprising condensing with one of the fragments represented by (B)-Y-OZ:
here,
Y is each independently Ala-Thr(tBu) or Ala-ΨThr;
Z is H or a group selected from Bt, Su, Pfp, Tcp or Pnp;
A is each independently H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is each independently a hydroxy-, carboxy- or phenoxy-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is each independently H, or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
B is each independently a Cys protecting group selected from Mmt, Trt, Acm or StBu; and
Resin is an acid sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis.
E-D-Phe-Pro-Arg(D)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(A)-Gly-Asp(C)-Phe-Glu(C)-Glu(C)-Ile-Pro-Glu(C)-Glu(C)-Tyr(Resin)-Leu-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはMtt又はMmtから選択されるカルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル－又はカルボキシル－保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド。 The following formula:
ED-Phe-Pro-Arg(D)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(A)-Gly-Asp(C)-Phe-Glu(C)-Glu(C)-Ile-Pro-Glu (C)-Glu(C)-Tyr(Resin)-Leu-OC
(In the formula,
A is H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Mtt or Mmt;
C is each independently a hydroxyl- or carboxyl-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is H or a guanidine protecting group selected from Pbf or Pmc;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A protected or partially protected peptide represented by
E-X-Tyr(Resin)-Leu-O-C
（式中、
Ｘは、ビバリルジン（bivalirudin）ペプチド配列であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル－又はカルボキシル－保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたフラグメント。 The following formula:
EX-Tyr(Resin)-Leu-OC
(In the formula,
X is a bivalirudin peptide sequence;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
C is a hydroxyl- or carboxyl-protecting group selected from tBu, Trt or Clt; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A protected or partially protected fragment represented by
脱保護、又は樹脂からの開裂と脱保護によりビバリルジンをもたらし；
ビバリルジンをクロマトグラフィーにより精製し；
凍結乾燥により99％より高純度のビバリルジンを得る、
ことを含んでなる方法。
ここで、
Ｘ及びＹは、独立に、ビバリルジンペプチド配列である；
D-は、Ｄ－アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｅは、Fmoc、Mtt、Mmt、Trt、Boc又はNpsから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。 In the method for producing bivalirudin, the bivalirudin fragment of the formula: EX-Tyr(Resin)-Leu-OC according to claim 37 is added to the bivalirudin fragment of the formula: ED-Phe-Y in a solution or on a solid phase. condensation with the bivalirudin fragment of -OZ to yield ED-Phe-YX-Tyr(Resin)-Leu-OC;
Deprotection or cleavage from the resin and deprotection yields bivalirudin;
Purifying bivalirudin by chromatography;
Obtain bivalirudin with a purity higher than 99% by freeze-drying,
A method that includes:
here,
X and Y are independently bivalirudin peptide sequences;
D- indicates the chirality of the amino acid according to the D-amino acid;
C is a hydroxy protecting group selected from Clt, Trt or tBu;
E is an amino protecting group selected from Fmoc, Mtt, Mmt, Trt, Boc or Nps; and
Resin is an acid sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis.
E-Ser(C)-Tyr(C)-Ser(C)-Met-Glu(C)-His(A)-Phe-Arg(D)-Trp(F)-Gly-Lys(E)-Pro- Val-Gly-Lys(E)-Lys(E)-Arg(D)-Arg(D)-Pro-Val-Lys(E)-Val-Tyr(Resin)-Pro-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド－又はイミダゾール－保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；
Ｄは、それぞれ独立の、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立の、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド。 The following formula:
E-Ser(C)-Tyr(C)-Ser(C)-Met-Glu(C)-His(A)-Phe-Arg(D)-Trp(F)-Gly-Lys(E)-Pro- Val-Gly-Lys(E)-Lys(E)-Arg(D)-Arg(D)-Pro-Val-Lys(E)-Val-Tyr(Resin)-Pro-OC
(In the formula,
A is H or a carboxamide- or imidazole-protecting group selected from Trt, Mtt or Mmt;
C is each independently a hydroxy-, carboxyl- or phenoxy-protecting group selected from tBu, Trt or Clt;
D is each independently a guanidine protecting group selected from H, or Pbf or Pmc;
E is each independently H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt;
F is H or Boc; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A protected or partially protected peptide represented by
E-X-Tyr(Resin)-Pro-O-C
（式中、
Ｘは、ACTH(1-24)配列であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ－、カルボキシル－又はフェノキシ－保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたフラグメント。 The following formula:
EX-Tyr(Resin)-Pro-OC
(In the formula,
X is an ACTH(1-24) sequence;
E is H or an amino protecting group selected from Fmoc, Boc, Trt, Nps, Mtt, Mmt or Clt; and C is hydroxy-, carboxyl- or phenoxy- selected from tBu, Trt or Clt. is a protecting group; and
Resin is an acid-sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis)
A protected or partially protected fragment represented by
請求項37に記載の式：E-X-Tyr(Resin)-Pro-O-CのACTHフラグメントを、溶液中で又は固相上で、式：E-Y-OZのACTHフラグメントと縮合させてE-Y-X-Tyr(Resin)-Pro-O-Cを生じさせ；
脱保護、又は樹脂からの開裂と脱保護によりACTH(1-24)をもたらし；
ACTH(1-24)をクロマトグラフィーにより精製し；
凍結乾燥により99％より高純度のACTH(1-24)を得る、
ことを含んでなる方法：
ここで、
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、ACTH配列であり；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｅは、Fmoc, Mtt、Mmt、Trt、Boc又はNpsから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。 In the method for producing ACTH(1-24),
The ACTH fragment of formula: EX-Tyr(Resin)-Pro-OC according to claim 37 is condensed with the ACTH fragment of formula: EY-OZ in solution or on a solid phase to produce EYX-Tyr(Resin). -Produces Pro-OC;
Deprotection or cleavage from the resin and deprotection yields ACTH(1-24);
Purify ACTH(1-24) by chromatography;
Obtain ACTH(1-24) with a purity higher than 99% by freeze-drying.
How to do it includes:
here,
X and Y are each independently an ACTH sequence;
C is a hydroxy protecting group selected from Clt, Trt or tBu;
E is an amino protecting group selected from Fmoc, Mtt, Mmt, Trt, Boc or Nps; and
Resin is an acid sensitive resin suitable for H or solid phase peptide synthesis.
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