JP2023178884A - High-affinity monoclonal antibody for his-tag added to c terminus of membrane protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、膜タンパク質のＣ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇに対する高親和性モノクローナル抗体に関する。 The present invention relates to a high-affinity monoclonal antibody against His-tag added to the C-terminus of membrane proteins.
タグ（ｔａｇ）は研究対象とするタンパク質の構造・機能等を検証する実験において、タンパク質の精製・検出等をするために非常に重要である。特に、組換えタンパク質を精製する実験においてタグ付加は不可欠である。 Tags are extremely important for purifying and detecting proteins in experiments to verify the structure, function, etc. of proteins that are the subject of research. In particular, tagging is essential in experiments to purify recombinant proteins.
ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）は６～１０個の連続したヒスチジン残基から構成されることを特徴とするタグであり、タンパク質の精製において最も使用されるタグの１つである。二価遷移金属イオンと配位結合するため、ニッケルやコバルトを固定化したカラムによる金属アフィニティー精製が可能である。 A histidine tag (His-tag) is a tag characterized by being composed of 6 to 10 consecutive histidine residues, and is one of the tags most used in protein purification. Because it coordinates with divalent transition metal ions, it is possible to perform metal affinity purification using columns immobilized with nickel or cobalt.
しかし、金属アフィニティー精製は、精製対象とするタンパク質以外に発現している宿主由来のタンパク質に起因する非特異的吸着が多い、精製対象とするタンパク質が金属配位により変性する等の問題がしばしば生じる。 However, metal affinity purification often has problems such as nonspecific adsorption due to host-derived proteins expressed in addition to the protein to be purified, and denaturation of the protein to be purified due to metal coordination. .
一方、精製におけるポリペプチドタグ抗体システムは、抗体の特徴である高い特異性で結合する性質を利用して、抗体およびそのエピトープペプチドを結合させることにより温和な条件で目的タンパク質の溶出を可能とする。さらに、抗体タンパク質が安定であり、酸性溶液によりエピトープペプチドの遊離および中和が可能なため、抗体タンパク質の再生（再利用）も可能である。このポリペプチドタグ抗体システムにおいては、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ等が代表的なタグとして知られ、これらに対する抗体を用いた、目的タンパク質の溶出も行われている。 On the other hand, the polypeptide tag antibody system for purification makes it possible to elute the target protein under mild conditions by binding the antibody and its epitope peptide, making use of the characteristic of antibodies that bind with high specificity. . Furthermore, since the antibody protein is stable and the epitope peptide can be released and neutralized using an acidic solution, the antibody protein can also be regenerated (reused). In this polypeptide tag antibody system, for example, FLAG, HA, Myc, etc. are known as representative tags, and target proteins are also eluted using antibodies against these tags.
Ｈｉｓ－ｔａｇに対する抗体も、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含め、複数種類が市販されている。 Multiple types of antibodies against His-tag are commercially available, including monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.
非特許文献１においては、市販されている４種類のＨｉｓ－ｔａｇに対するモノクローナル抗体の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定における有用性を検討している。測定基盤上に、前述の４種類の抗体をアミンカップリングにより固定した後、６個のヒスチジン残基から構成されるＨｉｓ－ｔａｇを付加した１２種類のヒト由来タンパク質に対する結合親和性を測定し、特に、解離定数について検討がされている。しかし、これらの抗体は、Ｈｉｓ－ｔａｇを付加したタンパク質の検出に用いられているのみで、抗体の詳細な性質は明らかにされていない。 Non-Patent Document 1 examines the usefulness of four types of commercially available monoclonal antibodies against His-tags in surface plasmon resonance (SPR) measurements. After immobilizing the aforementioned four types of antibodies on the measurement platform by amine coupling, binding affinities to 12 types of human-derived proteins to which His-tags consisting of six histidine residues were added were measured, In particular, the dissociation constant has been studied. However, these antibodies have only been used to detect His-tagged proteins, and the detailed properties of the antibodies have not been clarified.
非特許文献２においては、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体を用いた精製が検討されている。しかし、一度、金属アフィニティー精製した画分に対して、抗体を用いた精製がなされており、精製する場合に問題となっている、細胞（菌体）破砕液に由来するタンパク質に起因する非特異的結合については検証がなされていない。 In Non-Patent Document 2, purification using an anti-His-tag antibody is studied. However, once metal affinity purified fractions are purified using antibodies, there is a problem with purification due to non-specificity caused by proteins derived from cell (bacteria cell) disrupted liquid This combination has not been verified.
本発明は、膜タンパク質のＣ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇに対する高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。 The present invention provides a high-affinity monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof against a His-tag added to the C-terminus of a membrane protein.
本発明者らは、膜タンパク質のＣ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇに対して高い親和性を示すモノクローナル抗体を見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。 The present inventors have discovered a monoclonal antibody that exhibits high affinity for His-tag added to the C-terminus of membrane proteins. The present invention is based on these findings.
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、膜タンパク質のＣ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇをエピトープとして認識する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇが６個以上の連続するヒスチジン残基からなる、（１）に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（３）Ｈｉｓ－ｔａｇが６～１２個の連続するヒスチジン残基からなる、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（４）膜タンパク質がナノディスクを構成している、（１）～（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（５）Ｈｉｓ－ｔａｇとの相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）が４５０ｎＭ以下である 、（１）～（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（６）Ｈｉｓ－ｔａｇとの相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）が３５ｎＭ以下である、（１）～（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（７）２０２２年４月２７日に独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託された、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３５を有するハイブリドーマ細胞により産生される、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（８）（７）に記載のモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片。
（９）（１）～（８）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片が固体支持体に固定化されてなる、固定化抗体。
（１０）Ｃ末端にＨｉｓ－ｔａｇを付加した膜タンパク質を含む溶液から前記膜タンパク質を精製する方法であって、
（ａ）前記膜タンパク質を（１）～（８）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させ、前記膜タンパク質と、前記抗体またはその抗原結合断片とから構成される複合体を形成させる工程
（ｂ）工程（ａ）で形成させた複合体を単離する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で単離した複合体から前記膜タンパク質を単離し、前記膜タンパク質を含むろ過物を得る工程
を含む、方法。
（１１）膜タンパク質が組換えタンパク質である、（１０）に記載の方法。
（１２）工程（ａ）において、界面活性剤を用いて膜タンパク質を精製する工程をさらに含む、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）膜タンパク質がナノディスクを構成している、（１０）～（１２）のいずれかに記載の方法。
According to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof against a histidine tag (His-tag), which recognizes the His-tag added to the C-terminus of a membrane protein as an epitope.
(2) The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to (1), wherein the His-tag consists of six or more consecutive histidine residues.
(3) The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to (1) or (2), wherein the His-tag consists of 6 to 12 consecutive histidine residues.
(4) The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (3), wherein the membrane protein constitutes a nanodisc.
(5) The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (4), which has an equilibrium dissociation constant (KD) of interaction with His-tag of 450 nM or less.
(6) The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (5), which has an equilibrium dissociation constant (KD) of interaction with His-tag of 35 nM or less.
(7) A monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof produced by a hybridoma cell deposited with the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) on April 27, 2022 and having receipt number NITE AP-03635.
(8) An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the epitope bound by the monoclonal antibody described in (7).
(9) An immobilized antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (8) immobilized on a solid support.
(10) A method for purifying a membrane protein from a solution containing a membrane protein with a His-tag added to the C-terminus, comprising:
(a) Contacting the membrane protein with the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (8) to form a complex composed of the membrane protein and the antibody or antigen-binding fragment thereof. (b) isolating the complex formed in step (a); and (c) isolating the membrane protein from the complex isolated in step (b), and filtration containing the membrane protein. A method comprising the step of obtaining an object.
(11) The method according to (10), wherein the membrane protein is a recombinant protein.
(12) The method according to (10) or (11), further comprising the step of purifying the membrane protein using a surfactant in step (a).
(13) The method according to any one of (10) to (12), wherein the membrane protein constitutes a nanodisk.
本発明によれば、膜タンパク質のＣ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇに対する高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a high-affinity monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof against a His-tag added to the C-terminus of a membrane protein.
本発明の一つの態様によれば、Ｈｉｓ－ｔａｇに対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供され、該モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は膜タンパク質のＣ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇをエピトープとして認識する。 According to one embodiment of the present invention, a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof against His-tag is provided, and the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof recognizes the His-tag added to the C-terminus of a membrane protein as an epitope. .
本発明のモノクローナル抗体は、公知の方法により得ることができる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、Ｈｉｓ－ｔａｇをＣ末端に付加した抗原膜タンパク質、または前記抗原膜タンパク質のＨｉｓ－ｔａｇを含む部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫し、免疫させた非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞（例えば、Ｂ細胞）を採取し、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞株）を作製し、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより得ることができる。膜タンパク質に付加するＨｉｓ－ｔａｇとしては、限定されるわけではないが、例えば、６～１０個の連続するヒスチジン残基からなるＨｉｓ－ｔａｇを用いることができる。 The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by known methods. The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by immunizing a non-human mammal using, for example, an antigenic membrane protein with a His-tag added to the C-terminus, or a partial peptide containing the His-tag of the antigenic membrane protein. Collecting antibody-producing cells (e.g., B cells) from a human mammal, fusing the antibody-producing cells with myeloma cells to produce a hybridoma (fused cell line), and collecting the antibody produced from this hybridoma. It can be obtained by The His-tag to be added to a membrane protein is not limited, but for example, a His-tag consisting of 6 to 10 consecutive histidine residues can be used.
本発明のモノクローナル抗体を得るため、Ｈｉｓ－ｔａｇをＣ末端に付加した膜タンパク質の全長タンパク質を免疫抗原として用いることができる。Ｈｉｓ－ｔａｇをＣ末端に付加した膜タンパク質の全長タンパク質は、限定されるわけではないが、公知の方法により得てもよい。このような方法としては、限定されるわけではないが、例えば、大腸菌等を用いて目的とするＨｉｓ－ｔａｇをＣ末端に付加した膜タンパク質を細胞内で発現させ、精製すること等により得ることができ、また、市販品を用いても良い。また、本発明のモノクローナル抗体を得るため、Ｈｉｓ－ｔａｇをＣ末端に付加した膜タンパク質の、Ｈｉｓ－ｔａｇを含む部分ペプチドを合成し、これを免疫抗原として用いても良い。 To obtain the monoclonal antibody of the present invention, a full-length membrane protein with a His-tag added to the C-terminus can be used as an immunizing antigen. A full-length membrane protein with a His-tag added to the C-terminus may be obtained by a known method, but is not limited to this. Examples of such methods include, but are not limited to, methods such as expressing in cells a membrane protein with a desired His-tag added to the C-terminus using Escherichia coli, etc., and purifying the protein. Alternatively, commercially available products may be used. Furthermore, in order to obtain the monoclonal antibody of the present invention, a partial peptide containing a His-tag of a membrane protein with a His-tag added to the C-terminus may be synthesized and used as an immunizing antigen.
本発明のモノクローナル抗体を得るため、免疫する非ヒト哺乳動物の種類は、限定されるわけではないが、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ等が挙げられ、好ましくはマウスである。また、免疫する非ヒト哺乳動物は自己免疫疾患動物であってもよい。免疫は、限定されるわけではないが、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行ってもよい。免疫の間隔は、限定されるわけではないが、数日から数週間間隔、好ましくは１～２週間間隔で、１～１０回程度免疫を行ってもよい。 The type of non-human mammal to be immunized to obtain the monoclonal antibody of the present invention is not limited, but includes, for example, mice, rats, guinea pigs, rabbits, dogs, goats, etc., with mice being preferred. . Additionally, the non-human mammal to be immunized may be an animal with an autoimmune disease. Immunization may be carried out by, but not limited to, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, or subcutaneous injection into the footpad. The interval between immunizations is not limited, but immunizations may be performed about 1 to 10 times at intervals of several days to several weeks, preferably 1 to 2 weeks.
本発明のモノクローナル抗体を得るための抗体産生細胞は、特に限定されるわけではないが、免疫した非ヒト哺乳動物の脾臓細胞等または所属リンパ節等から調製してもよく、好ましくは脾臓細胞から調製する。採取した細胞集団から特に抗体産生細胞の分離操作を行わなくてもよいが、好ましくは細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離する。 Antibody-producing cells for obtaining the monoclonal antibody of the present invention are not particularly limited, but may be prepared from spleen cells or regional lymph nodes of an immunized non-human mammal, preferably from spleen cells. Prepare. Although it is not necessary to specifically separate antibody-producing cells from the collected cell population, it is preferable to separate only antibody-producing cells from the cell population.
上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させることにより、本発明の、Ｈｉｓ－ｔａｇに対するモノクローナル抗体を産生しながら半永久的に増え続ける細胞（ハイブリドーマ）を作製することができる。この融合は、公知の細胞融合方法により行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、細胞融合促進剤存在下での融合、電気刺激（例えば、エレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いた融合等により行うことができる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウス等の動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。使用する細胞株としては、限定されるわけではないが、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものを用いてもよい。ミエローマ細胞としては、限定されるわけではないが、例えばＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、ＮＳＩ、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３等が挙げられ、好ましくはＰ３Ｕ１である。 By fusing the antibody-producing cells described above and myeloma cells (myeloma cells), cells (hybridoma) of the present invention that continue to grow semi-permanently while producing monoclonal antibodies against His-tag can be produced. This fusion may be performed by known cell fusion methods, including, but not limited to, fusion in the presence of a cell fusion promoter, commercially available cells using electrical stimulation (e.g., electroporation), etc. This can be performed by fusion using a fusion device. As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, commonly available cell lines of animals such as mice can be used. Cell lines to be used are not limited, but those that cannot survive in HAT selection medium (medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin) and have the property of being able to survive only when fused with antibody-producing cells. may also be used. Examples of myeloma cells include, but are not limited to, SP2/0, P3U1, NSI, P3-X63-Ag8.653, and P3U1 is preferred.
細胞融合処理後の細胞から本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別することができる。ハイブリドーマを選別する方法は、公知の方法により行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、細胞融合処理後の細胞を一定期間、例えば、ＨＡＴ培地等の適切な培地で培養して、コロニーを形成させ、そのコロニー陽性培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、膜タンパク質のＣ末端側に付加されているＨｉｓ－ｔａｇに対する抗体価を確認することにより行ってもよい。膜タンパク質のＣ末端側に付加されているＨｉｓ－ｔａｇに対する抗体価の確認方法としては、限定されるわけではないが、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）や放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等が挙げられ、好ましくはＥＬＩＳＡである。 Hybridomas producing the monoclonal antibody of the present invention can be selected from cells after cell fusion treatment. The method for selecting hybridomas may be performed by any known method, and is not limited to this. For example, cells after cell fusion treatment may be cultured for a certain period of time in an appropriate medium such as HAT medium, This may be carried out by forming colonies, collecting the culture supernatant from each well of the colony-positive culture plate, and confirming the antibody titer against His-tag attached to the C-terminal side of the membrane protein. Methods for confirming the antibody titer against the His-tag attached to the C-terminus of membrane proteins include, but are not limited to, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA). , preferably ELISA.
選別された、ウェルにおける細胞に対して、単一の細胞にするためにクローニングを行ってもよい。クローニングは、公知の方法により行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、細胞懸濁液を適当な培地（例えば、１０～２０％のＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地）で適当に希釈後、培養プレートの各ウェルに細胞を播き（培養プレートの各ウェルに入れる細胞の数は、１つのウェルに入る細胞が１個である確率が高くするため、好ましくは各ウェルに１個入るように細胞を播く）、一定期間（例えば、７～１０日。この間に、好ましくはシングルコロニーであることを確認する）後にコロニー陽性ウェルの培養上清を回収し、回収した培養上清の抗体価を確認することにより行ってもよく、膜タンパク質のＣ末端側に付加されているＨｉｓ－ｔａｇに対して高い親和性を示す抗体を産生する細胞を選択してもよく、さらに選択したウェルの細胞をある程度増やしてハイブリドーマ株を樹立してもよい。また、クローニングは必要に応じて数回行ってもよい。これらの操作により、例えば、２０２２年４月２７日に独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託された、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３５を有するハイブリドーマ等が得られた。このハイブリドーマは、ｃＨｉｓ８と呼ばれる抗Ｈｉｓ－ｔａｇモノクローナル抗体を産生する。 The sorted cells in the wells may be cloned into single cells. Cloning may be performed by a known method, and is not limited to this. For example, a cell suspension is appropriately diluted with an appropriate medium (for example, RPMI 1640 medium containing 10 to 20% FCS), and then cultured. Seed the cells in each well of the plate (preferably, the number of cells to be placed in each well of the culture plate is such that one cell will fit in each well to increase the probability that only one cell will fit in one well). After a certain period of time (for example, 7 to 10 days; during this period, preferably confirm that it is a single colony), collect the culture supernatant of colony-positive wells, and check the antibody titer of the collected culture supernatant. Cells that produce antibodies that exhibit high affinity for His-tag attached to the C-terminal side of membrane proteins may be selected, and the number of cells in the selected wells may be increased to a certain extent. Hybridoma strains may also be established. Further, cloning may be performed several times as necessary. Through these operations, for example, a hybridoma etc. having receipt number NITE AP-03635, which was deposited with the National Institute of Technology and Evaluation (NITE), an independent administrative agency, on April 27, 2022, was obtained. This hybridoma produces an anti-His-tag monoclonal antibody called cHis8.
樹立したハイブリドーマ株からは、適切な方法により、本発明の、Ｈｉｓ－ｔａｇに対するモノクローナル抗体を精製および採取することができる。これは、公知の方法により行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等により行ってもよい。 The monoclonal antibody against His-tag of the present invention can be purified and collected from the established hybridoma strain by an appropriate method. This may be carried out by any known method, including, but not limited to, a method of preparing antibodies from a culture supernatant obtained by culturing in a medium with a reduced concentration of serum, a method of preparing antibodies from a culture supernatant obtained by culturing in a commercially available serum-free medium, etc. The antibody may be prepared from culture supernatant, or the hybridoma may be injected into the peritoneal cavity of an animal, ascites fluid may be collected, and antibodies may be prepared from the ascites fluid.
樹立したハイブリドーマ株の培養方法としては、限定されるわけではないが、例えば、培養フラスコを用いる方法、スピナーフラスコを用いる方法、シェーカーフラスコを用いる方法、バイオリアクターを使用する方法等が挙げられる。 Methods for culturing established hybridoma strains include, but are not limited to, methods using culture flasks, spinner flasks, shaker flasks, bioreactors, and the like.
本発明のモノクローナル抗体の精製は、公知の方法で行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、Ｈｉｓ－ｔａｇアフィニティカラムで精製する方法、イオン交換クロマトグラフィーで精製する方法、プロテインＡまたはプロテインＧ等のイムノグロブリン結合性タンパク質のアフィニティカラムで精製する方法等が挙げられる。これら公知の方法を適宜選択し、または組み合わせることにより本発明のモノクローナル抗体を精製することができる。 The monoclonal antibody of the present invention may be purified by any known method, including, but not limited to, a method using a His-tag affinity column, a method using an ion exchange chromatography method, a method using a protein A or Examples include a method of purifying an immunoglobulin-binding protein such as protein G using an affinity column. The monoclonal antibody of the present invention can be purified by appropriately selecting or combining these known methods.
本発明のモノクローナル抗体のエピトープ（抗原決定基）は、本発明のモノクローナル抗体が高い親和性を示す、膜タンパク質のＣ末端側に付加されているＨｉｓ－ｔａｇであり、具体的には、限定されるわけではないが、好ましくは６個以上の連続するヒスチジン残基からなり、より好ましくは６～１５個の連続するヒスチジン残基からなり、より好ましくは６～１２個の連続するヒスチジン残基からなり、より好ましくは７～１０個の連続するヒスチジン残基からなり、より好ましくは８個の連続するヒスチジン残基からなる。また、本発明における膜タンパク質は、限定されるわけではないが、ナノディスクを形成していることが好ましく、前記のナノディスクは、限定されるわけではないが、少なくとも以下の成分、ＭＳＰ、脂質、および膜タンパク質により構成されていてもよい。前記脂質は、限定されるわけではないが、例えば、リン脂質、脂質二重膜、天然物由来抽出脂質、合成脂質、およびこれらの混合物等であってもよい。 The epitope (antigenic determinant) of the monoclonal antibody of the present invention is a His-tag added to the C-terminal side of a membrane protein, to which the monoclonal antibody of the present invention exhibits high affinity. Although it is not limited to More preferably, it consists of 7 to 10 consecutive histidine residues, and more preferably it consists of 8 consecutive histidine residues. In addition, the membrane protein in the present invention is preferably, but not limited to, a nanodisc, and the nanodisc includes, but is not limited to, at least the following components, MSP, and lipids. , and membrane proteins. The lipid is not limited to, but may be, for example, a phospholipid, a lipid bilayer membrane, a natural product-derived extracted lipid, a synthetic lipid, a mixture thereof, or the like.
本発明のモノクローナル抗体と、Ｈｉｓ－ｔａｇをＣ末端に付加した膜タンパク質の相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、限定されるわけではないが、好ましくは４５０ｎＭ以下であり、より好ましくは３５ｎＭ以下であり、より好ましくは３０ｎＭ以下であり、より好ましくは２５ｎＭ以下である。 The equilibrium dissociation constant (KD) of the interaction between the monoclonal antibody of the present invention and a membrane protein with a His-tag added to the C-terminus is, although not limited, preferably 450 nM or less, more preferably 35 nM or less. , more preferably 30 nM or less, more preferably 25 nM or less.
本発明のモノクローナル抗体の抗原結合断片とは、本発明のモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、限定されるわけではないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）等が挙げられる。上記抗原結合断片は、限定されるわけではないが、例えば、本発明のモノクローナル抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断すること、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡから遺伝子組換え体を作製すること等により、得ることができる。本発明のモノクローナル抗体の抗原結合断片は、本発明のモノクローナル抗体が結合する抗原（特にエピトープ）と同じ抗原に結合するものである。 The antigen-binding fragment of the monoclonal antibody of the present invention refers to a partial region of the monoclonal antibody of the present invention, and includes, but is not limited to, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diabody. (dibodies), dsFv, scFv (single chain Fv), and the like. The above-mentioned antigen-binding fragments include, but are not limited to, cDNAs encoding the VH and VL of the monoclonal antibody of the present invention, which may be obtained by cleaving the monoclonal antibody of the present invention with various proteolytic enzymes depending on the purpose. It can be obtained by, for example, producing a genetically recombinant plant from. The antigen-binding fragment of the monoclonal antibody of the present invention binds to the same antigen (especially epitope) that the monoclonal antibody of the present invention binds to.
上記の、Ｆａｂは、例えば、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２は、例えば、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、上記のＦａｂ’は、例えば、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。 The above Fab can be obtained, for example, by treating an antibody molecule with papain, and F(ab')2 can be obtained, for example, by treating an antibody molecule with pepsin. Further, the above Fab' can be obtained, for example, by cleaving the disulfide bond in the hinge region of the above F(ab')2.
上記のｓｃＦｖは、例えば、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、前記発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることで得ることができる。 The above scFv can be produced, for example, by obtaining cDNA encoding the V H and V L of an antibody, constructing a DNA encoding the scFv, inserting this DNA into an expression vector, and introducing the expression vector into a host organism. It can be obtained by expressing it.
上記のｄｉａｂｏｄｙは、例えば、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、前記発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることで得ることができる。 The above diabody can be obtained by, for example, obtaining a cDNA encoding the V H and V L of an antibody, constructing a DNA encoding an scFv so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less, and using this DNA. can be obtained by inserting the vector into an expression vector, introducing the expression vector into a host organism, and expressing it.
上記のｄｓＦｖは、例えば、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、前記発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることで得ることができる。 The above dsFv can be produced, for example, by obtaining cDNA encoding the V H and V L of an antibody, constructing a DNA encoding the dsFv, inserting this DNA into an expression vector, and introducing the expression vector into a host organism. It can be obtained by expressing it.
本発明のモノクローナル抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体または抗原結合断片とすることもでき、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体としてもよい。本発明におけるこれらの抗体は、限定されるわけではないが、公知の方法にしたがって調製してもよく、例えば、重鎖および軽鎖の組換え発現によって調製してもよい。 Monoclonal antibodies of the invention may also be genetically engineered antibodies or antigen-binding fragments prepared and expressed by recombinant means, eg, chimeric, humanized, or fully human antibodies. These antibodies in the present invention may be prepared according to known methods, including, but not limited to, by recombinant expression of heavy and light chains.
また、本発明においては、ハイブリドーマまたは前記ハイブリドーマから抽出したＤＮＡまたはＲＮＡ等を原料として、公知の方法にしたがってキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を調製してもよい。 Furthermore, in the present invention, chimeric antibodies, humanized antibodies, and humanized antibodies may be prepared according to known methods using hybridomas or DNA or RNA extracted from the hybridomas as raw materials.
一般的に、抗体は、例えば、水不溶性基材からなる固体支持体に公知の方法を用いて固定化することが可能であり、この固定化した抗体と抗原の、特異的な分子間の親和力に基づいて、様々なタンパク質を含む溶液から目的の膜タンパク質を選択的に捕集する（結合させる）ことが可能である。 Generally, antibodies can be immobilized, for example, on a solid support made of a water-insoluble base material using a known method, and the specific molecular affinity between the immobilized antibody and the antigen can be Based on this, it is possible to selectively collect (bind) membrane proteins of interest from solutions containing various proteins.
したがって、本発明のＨｉｓ－ｔａｇ抗体を、例えば、固体支持体の表面に固定化し、前記固体支持体を充てんしたカラム上でＨｉｓ－ｔａｇをＣ末端に付加した膜タンパク質を前記の固定化した抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体に捕捉させることにより、Ｈｉｓ－ｔａｇをＣ末端に付加した膜タンパク質を精製することが可能である。 Therefore, the His-tag antibody of the present invention is immobilized, for example, on the surface of a solid support, and a membrane protein having a His-tag added to the C-terminus is transferred onto a column packed with the solid support. By capturing it with a His-tag antibody, it is possible to purify a membrane protein with a His-tag added to the C-terminus.
したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片を固体支持体に固定化されてなる、固定化抗体が提供される。 Therefore, one aspect of the present invention provides an immobilized antibody comprising the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof immobilized on a solid support.
本発明における固体支持体とは、限定されるわけではないが、例えば、レジン等が挙げられる。本発明の抗体またはその抗原結合断片の固体支持体への固定化は、限定されるわけではないが、例えば、アミンカップリング法等により行ってもよい。 The solid support in the present invention includes, but is not limited to, resin and the like. The antibody of the present invention or antigen-binding fragment thereof may be immobilized on a solid support by, for example, but not limited to, an amine coupling method.
また、本発明の一つの態様によれば、Ｃ末端にＨｉｓ－ｔａｇを付加した膜タンパク質を含む溶液から前記膜タンパク質を精製する方法が提供され、前記方法は、（ａ）前記膜タンパク質を本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させ、前記膜タンパク質と、前記抗体またはその抗原結合断片とから構成される複合体を形成させる工程、（ｂ）工程（ａ）で形成させた複合体を単離する工程、および（ｃ）工程（ｂ）で単離した複合体から前記膜タンパク質を単離し、前記膜タンパク質を含むろ過物を得る工程を含むことを特徴とする。本発明の方法は、工程（ａ）において、界面活性剤を用いて膜タンパク質を精製する工程をさらに含んでいてもよい。 Further, according to one aspect of the present invention, there is provided a method for purifying a membrane protein from a solution containing a membrane protein with a His-tag added to the C-terminus, the method comprising: (a) purifying the membrane protein directly from the membrane protein; (b) bringing the complex formed in step (a) into contact with the antibody of the invention or an antigen-binding fragment thereof to form a complex composed of the membrane protein and the antibody or antigen-binding fragment thereof; and (c) isolating the membrane protein from the complex isolated in step (b) to obtain a filtrate containing the membrane protein. The method of the present invention may further include, in step (a), a step of purifying the membrane protein using a surfactant.
本発明における膜タンパク質は、限定されるわけではないが、例えば、ＧＰＣＲ（G-Protein Coupled Receptor）、イオンチャネル、トランスポーター等が挙げられ、好ましくは組換えタンパク質である。 Membrane proteins in the present invention include, but are not limited to, GPCRs (G-Protein Coupled Receptors), ion channels, transporters, etc., and are preferably recombinant proteins.
本発明における膜タンパク質は、ナノディスクを構成していてもよい。本発明の方法によれば、従来の方法と比較して、ナノディスクを構成している膜タンパク質の収率を向上させることが可能である。 The membrane protein in the present invention may constitute a nanodisk. According to the method of the present invention, it is possible to improve the yield of membrane proteins constituting nanodiscs compared to conventional methods.
以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。含有量は特記しない限り、質量％で示す。 The present invention will be specifically explained based on the following examples, but the present invention is not limited to these examples. The content is expressed in mass % unless otherwise specified.
精製タンパク質の調製
FLAG-mNeonGreen(mNG)-8xHis（配列番号１）、mNG-3xFLAG-8xHis（配列番号２）、MBP-TEVsite-tagRFP-8xHis（配列番号３）、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ（配列番号４）、ＴＥＶプロテアーゼ（配列番号５）、FLAG-BRIL-6xHis（配列番号６）、ヒスチジンが６～１０残基並んだＨｉｓ－ｔａｇがＮ末端／Ｃ末端に付加したＴ４Ｌ（それぞれ配列番号７および８）、ＭＳＰ１Ｄ１（配列番号９）、ＭＳＰ２Ｎ２（配列番号１０）を発現させるため、各タンパク質に対応する遺伝子を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ２８に挿入し、FLAG-mNeonGreen(mNG)-8xHis、mNG-3xFLAG-8xHis、MBP-TEVsite-tagRFP-8xHis、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ、ＴＥＶプロテアーゼ、FLAG-BRIL-6xHis、ヒスチジンが６～１０残基並んだＨｉｓ－ｔａｇがＮ末端／Ｃ末端に付加したＴ４Ｌは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ＭＳＰ１Ｄ１、ＭＳＰ２Ｎ２は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬを形質転換して発現させ、付加してあるＨｉｓ－ｔａｇをＮｉ Sepharose 6 Fast Flow カラム（Cytiva社製）の金属アフィニティカラムにより精製した。MBP-TEVsite-tagRFP-8xHisは精製後、ＴＥＶプロテアーゼ消化して、MBPとtagRFP-8xHisとして使用した。
Preparation of purified protein
FLAG-mNeonGreen(mNG)-8xHis (SEQ ID NO: 1), mNG-3xFLAG-8xHis (SEQ ID NO: 2), MBP-TEVsite-tagRFP-8xHis (SEQ ID NO: 3), HRV 3C protease (SEQ ID NO: 4), TEV protease ( SEQ ID NO: 5), FLAG-BRIL-6xHis (SEQ ID NO: 6), T4L with a His-tag consisting of 6 to 10 histidine residues added to the N-terminus/C-terminus (SEQ ID NO: 7 and 8, respectively), MSP1D1 (SEQ ID NO: 6), No. 9), MSP2N2 (SEQ ID No. 10), the genes corresponding to each protein were inserted into the expression vector pET28 for E. coli, and FLAG-mNeonGreen(mNG)-8xHis, mNG-3xFLAG-8xHis, MBP-TEVsite- tagRFP-8xHis, HRV 3C protease, TEV protease, FLAG-BRIL-6xHis, T4L with a His-tag consisting of 6 to 10 histidine residues added to the N-terminus/C-terminus, infects E. coli BL21 (DE3), MSP1D1, MSP2N2 was expressed by transforming E. coli BL21 (DE3) RIL, and the added His-tag was purified using a metal affinity column of Ni Sepharose 6 Fast Flow column (manufactured by Cytiva). After purification, MBP-TEVsite-tagRFP-8xHis was digested with TEV protease and used as MBP and tagRFP-8xHis.
Ｈｉｓ－ｔａｇを付加した、Ａ２ａ（配列番号１１）、ｈＥＲＧ（配列番号１２）、Ｐ－糖タンパク質（配列番号１３）の各タンパク質に対応する遺伝子は、３Ｃプロテアーゼsite-mNeonGreen-8xHisとなるように設計し、動物細胞用発現ベクターｐＥＧに挿入した。発現宿主には浮遊細胞培養のできるＥｘｐｉ２９３Ｆ(サーモ社製)を用い、培地にはＨＥ２００ＣＤ培地（Ｇｍｅｐ社製）を用いて震盪培養を行った。Ａ２ａ、Ｐ－糖タンパク質についてはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）による一過性発現を、ｈＥＲＧについては公知文献（doi:10.1016/j.cell.2017.03.048.）に記載された方法に従い、バキュロウイルスを作製して感染発現を、それぞれ行った。 The His-tagged genes corresponding to A2a (SEQ ID NO: 11), hERG (SEQ ID NO: 12), and P-glycoprotein (SEQ ID NO: 13) are 3C protease site-mNeonGreen-8xHis. It was designed and inserted into the expression vector pEG for animal cells. Expi293F (manufactured by Thermo Co., Ltd.), which can perform suspension cell culture, was used as an expression host, and HE200CD medium (manufactured by Gmep Co., Ltd.) was used as a medium for shaking culture. A2a and P-glycoprotein were transiently expressed using polyethyleneimine (PEI), and baculovirus was produced for hERG according to the method described in a known document (doi:10.1016/j.cell.2017.03.048.) Infection and expression were performed respectively.
抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体ｃＨｉｓ８の樹立、産生、および精製
精製したFLAG-mNG-8xHisを７日おきに５回、自己免疫疾患マウス（MRL/MpJJmsSLC-lpr/lpr 日本ＳＬＣ社製）へ免疫させた。免疫させたマウスから脾臓細胞を採取し、ＰＥＧ法にてミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマ培養上清中に産生された抗体は原液のまま、または精製して使用した。精製は、ハイブリドーマ培養上清をProtein G Sepharose Fast Flow(Cytiva社製)に供することでＩｇＧ抗体をアフィニティー精製することにより行った。抗体の濃縮、およびバッファー置換はアミコンウルトラ５０ＭＷＣＯ（メルクミリポア社製）を用いて行った。
Establishment, Production, and Purification of Anti-His-tag Antibody cHis8 Autoimmune disease mice (MRL/MpJJmsSLC-lpr/lpr, manufactured by Nippon SLC) were immunized with the purified FLAG-mNG-8xHis five times every 7 days. Spleen cells were collected from the immunized mice and fused with myeloma cells (P3U1) using the PEG method to produce hybridomas. Antibodies produced in hybridoma culture supernatants were used as they were or purified. Purification was performed by affinity purifying the IgG antibody by subjecting the hybridoma culture supernatant to Protein G Sepharose Fast Flow (manufactured by Cytiva). Antibody concentration and buffer replacement were performed using Amicon Ultra 50MWCO (manufactured by Merck Millipore).
ハイブリドーマに産生された抗体の結合特異性を検証した。検証はＥＬＩＳＡ法により行った。イムノプレート（サーモ社製）へ精製した抗原タンパク質を１～１０μｇ／ｍＬの濃度で固相化した。続いて１％BSA／PBST溶液にてブロッキングを行った。一次抗体としてはハイブリドーマ培養上清の原液、または１０μｇ／ｍＬの精製抗体ＩｇＧを用いた。二次抗体としては抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）のＨＲＰ標識抗体を１００００倍希釈で使用した。各工程においては、３７℃、１時間で反応させ、その後、プレートウォッシャーを用いて洗浄を行った。その後、１－ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ(サーモ社製)を用いて発色させ、目的とするタンパク質の検出を行った。このＥＬＩＳＡ法によりmNG-8xHisに特異的に反応する抗体を選抜し、かつ抗ｍNG抗体の可能性を排除するため、抗原であるＨｉｓ－ｔａｇを付加した複数のタンパク質への結合を確認することにより、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体であるｃＨｉｓ８を樹立した。 The binding specificity of antibodies produced by hybridomas was verified. Verification was performed by ELISA method. The purified antigen protein was immobilized on an immunoplate (manufactured by Thermo) at a concentration of 1 to 10 μg/mL. Subsequently, blocking was performed with a 1% BSA/PBST solution. As the primary antibody, a stock solution of hybridoma culture supernatant or 10 μg/mL purified antibody IgG was used. As the secondary antibody, an anti-mouse IgG (Fc-specific) HRP-labeled antibody was used at a 10,000-fold dilution. In each step, the reaction was carried out at 37°C for 1 hour, and then washed using a plate washer. Thereafter, the protein of interest was detected by developing color using 1-step Ultra TMB ELISA (manufactured by Thermo). In order to select antibodies that specifically react with mNG-8xHis using this ELISA method and exclude the possibility of anti-mNG antibodies, we confirmed binding to multiple His-tagged proteins, which are antigens. , established an anti-His-tag antibody, cHis8.
樹立したｃＨｉｓ８の結合特異性を検証した。検証はウェスタンブロット法により行った。まず、上述に記載した方法でヒスチジンが６～１０残基並んだＨｉｓ－ｔａｇがＮ末端／Ｃ末端に付加したＴ４Ｌを発現させ、精製した。精製標品のタンパク質が揃っていることを確認するために、Ｈｉｓ－ｔａｇ特異的な染色液を用い、続いて、ｃＨｉｓ８を一次抗体として用いたウェスタンブロット法を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥしたポリアクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜へトリスーグリシン系のバッファーを用いてトランスファーを行った。続いてＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）にてブロッキングを行った。一次抗体は１μｇ／ｍＬの精製抗体ＩｇＧを用いた。二次抗体としては抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）のＨＲＰ標識抗体を５０００倍希釈で使用した。各工程においては、３７℃、１時間で反応させ、その後、ＰＢＳＴで洗浄を行った。その後、Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ Ｕｌｔｒａ(ナカライテスク社製)を用いて発色させ、目的とするタンパク質の検出を行った。結果、ｃＨｉｓ８は、Ｔ４ＬのＮ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇに対してはほとんど反応性を示さなかったが、Ｃ末端に付加したヒスチジン残基６～１０個から構成されるＨｉｓ－ｔａｇに対しては良好な反応性を示した（図１）。 The binding specificity of the established cHis8 was verified. Verification was performed by Western blotting. First, T4L in which a His-tag consisting of 6 to 10 histidine residues was added to the N-terminus/C-terminus was expressed and purified by the method described above. In order to confirm that the proteins in the purified sample were complete, a His-tag specific staining solution was used, followed by Western blotting using cHis8 as the primary antibody. The polyacrylamide gel subjected to SDS-PAGE was transferred to a PVDF membrane using a tris-glycine buffer. Subsequently, blocking was performed using Blocking One (manufactured by Nacalai Tesque). As the primary antibody, 1 μg/mL purified antibody IgG was used. As the secondary antibody, an anti-mouse IgG (Fc-specific) HRP-labeled antibody was used at a 5000-fold dilution. In each step, the reaction was carried out at 37° C. for 1 hour, followed by washing with PBST. Thereafter, the protein of interest was detected by color development using Chemi-Lumi One Ultra (manufactured by Nacalai Tesque). As a result, cHis8 showed almost no reactivity to the His-tag added to the N-terminus of T4L, but it showed almost no reactivity to the His-tag added to the C-terminus, which consists of 6 to 10 histidine residues. showed good reactivity (Figure 1).
ＢＬＩｔｚを用いたｃＨｉｓ８の結合親和性の測定
さらに詳細な結合親和性解析を行うため、ＢＬＩｔｚ（ザルトリウス社製）を用いた結合親和性の測定を行った。ＢＬＩｔｚのＡＭＣ（抗マウスＩｇＧ-Ｆｃ）センサーチップにｃＨｉｓ８の精製ＩｇＧを補足後、ヒスチジンが６～１０残基並んだＨｉｓ－ｔａｇがＮ末端／Ｃ末端に付加したＴ４Ｌをアナライトとして測定した（図２）。
Measurement of binding affinity of cHis8 using BLItz In order to perform more detailed binding affinity analysis, binding affinity was measured using BLItz (manufactured by Sartorius). After supplementing BLItz's AMC (anti-mouse IgG-Fc) sensor chip with purified IgG of cHis8, T4L with a His-tag consisting of 6 to 10 histidine residues added to the N-terminus/C-terminus was measured as an analyte ( Figure 2).
結果を表１に示す。ｃＨｉｓ８は、Ｎ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇに対しては低い結合親和性を示す、または測定不可であったのに対し、Ｃ末端に付加したヒスチジン残基６個から構成されるＨｉｓ－ｔａｇに対しては４００ｎＭ程度、ヒスチジン残基７～１０個から構成されるＨｉｓ－ｔａｇに対しては３０ｎＭ程度と高い親和性を示した。 The results are shown in Table 1. cHis8 showed low binding affinity or was unmeasurable for His-tag added to the N-terminus, but cHis8 showed low binding affinity or was unmeasurable for His-tag added to the C-terminus. It showed a high affinity of about 400 nM for histidine and about 30 nM for His-tag composed of 7 to 10 histidine residues.
ｃＨｉｓ８固相化レジンを用いた膜タンパク質のオンカラム精製
まず、カラムに充填するｃＨｉｓ８固相化レジンを作製した。ＰＢＳにバッファー置換した精製抗体ＩｇＧをＮＨＳ-activated Sepharose Fast Flow(Cytiva社製)を用い、付属のプロトコールにしたがって、ｃＨｉｓ８固相化レジンを作製した。各ＩｇＧ固相化濃度で作製したレジン１ｍＬあたりの膜タンパク質の結合量、および抗体稼働率を総合的に考慮し、条件は、５ｍｇ ＩｇＧ／ｍＬレジンとした。
On-column purification of membrane proteins using cHis8-immobilized resin First, cHis8-immobilized resin to be packed into a column was prepared. A cHis8 immobilized resin was prepared using NHS-activated Sepharose Fast Flow (manufactured by Cytiva) using purified antibody IgG buffer-substituted with PBS according to the attached protocol. The conditions were set to 5 mg IgG/mL resin, comprehensively considering the amount of membrane protein bound per mL of resin prepared at each IgG immobilization concentration and the antibody utilization rate.
ＧＰＣＲであるＡ２ａ、イオンチャネルであるｈＥＲＧ、ＡＢＣトランスポーターであるＰ－糖タンパク質をモデルタンパク質として、ｃＨｉｓ８固相化レジンによるオンカラム精製を行った。ＨＥＫ細胞にＡ２ａ、ｈＥＲＧ、Ｐ－糖タンパク質をそれぞれ発現させ、直接、界面活性剤を添加することで可溶化した。可溶化以降の全ての操作は４℃または氷上で行った。Ａ２ａは終濃度１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ／０．２％（ｗ／ｖ）ＣＨＳで、ｈＥＲＧは公知文献（doi:10.1016/j.cell.2017.03.048.）に記載された方法に従って、Ｐ－糖タンパク質は公知文献（doi:10.1116/science.aav7102.）に記載された方法に従って、それぞれ可溶化した。可溶化後、遠心により可溶化上清を分離し、ｃＨｉｓ８固相化レジンを添加して２～４時間ゆっくりと転倒混和した。その後、空カラムに通して、１０～３０カラムボリューム（ＣＶ）のバッファーで洗浄後、２ＣＶ程度のバッファーで回収した。その後、オンカラム精製を、界面活性剤精製およびナノディスク精製の２通りの方法により行った。 On-column purification using cHis8 immobilized resin was performed using A2a, which is a GPCR, hERG, which is an ion channel, and P-glycoprotein, which is an ABC transporter, as model proteins. A2a, hERG, and P-glycoprotein were each expressed in HEK cells and solubilized by directly adding a surfactant. All operations after solubilization were performed at 4°C or on ice. A2a was used at a final concentration of 1% (w/v) DDM/0.2% (w/v) CHS, and hERG was prepared according to the method described in a known document (doi:10.1016/j.cell.2017.03.048.). P-glycoprotein was solubilized according to the method described in a known document (doi:10.1116/science.aav7102.). After solubilization, the solubilized supernatant was separated by centrifugation, cHis8 immobilized resin was added, and the mixture was gently mixed by inversion for 2 to 4 hours. Thereafter, it was passed through an empty column, washed with 10 to 30 column volumes (CV) of buffer, and then recovered with about 2 CV of buffer. Thereafter, on-column purification was performed by two methods: surfactant purification and nanodisk purification.
界面活性剤精製について、まず、回収したｃＨｉｓ８固相化レジン懸濁液にＨＲＶ３Ｃプロテアーゼを添加し、２～１６時間ゆっくりと転倒混和した。続いて、空カラムに通した画分とその後１～３ＣＶのバッファーで洗浄した画分を集め、これを界面活性剤精製画分とした。これを必要に応じてアミコンウルトラで濃縮し、Superdex 200 Increase 10/300 GL、またはSuperose 6 Increase 10/300 GL(Cytiva社製)でゲル濾過することにより、界面活性剤精製を行った。 For surfactant purification, first, HRV3C protease was added to the collected cHis8 solid-phase resin suspension, and the mixture was slowly mixed by inversion for 2 to 16 hours. Subsequently, the fractions that passed through the empty column and the fractions that were washed with 1 to 3 CV of buffer were collected and used as surfactant-purified fractions. The surfactant was purified by concentrating it with Amicon Ultra as needed and gel filtration with Superdex 200 Increase 10/300 GL or Superose 6 Increase 10/300 GL (manufactured by Cytiva).
ナノディスク精製について、まず、回収したｃＨｉｓ８固相化レジン懸濁液に所望の精製ＭＳＰ、および脂質混合液を添加し、１～３時間ゆっくりと転倒混和した。混和したｃＨｉｓ８固相化レジン懸濁液を空カラムに通して、１０～２０ＣＶ程度のバッファーで洗浄後、２ＣＶ程度で回収したｃＨｉｓ８固相化レジン懸濁液にBio-Beads SM2(Bio-Rad社製)を添加し、一晩ゆっくりと転倒混和した。その後、Bio-Beads SM2を回収後、２ＣＶ程度で回収したｃＨｉｓ８固相化レジン懸濁液にＨＲＶ３Ｃプロテアーゼを添加し、２～１６時間ゆっくりと転倒混和した。続いて、空カラムに通した画分とその後１～３ＣＶのバッファーで洗浄した画分を集め、これをナノディスク精製画分とした。これを必要に応じてアミコンウルトラで濃縮し、Superdex 200 Increase 10/300 GL、またはSuperrose 6 Increase 10/300 GL(Cytiva社製)でゲル濾過することにより、ナノディスク精製を行った。 For nanodisk purification, first, the desired purified MSP and lipid mixture were added to the collected cHis8 solid-phased resin suspension, and the mixture was slowly mixed by inversion for 1 to 3 hours. The mixed cHis8 immobilized resin suspension was passed through an empty column and washed with about 10 to 20 CV of buffer, and then Bio-Beads SM2 (Bio-Rad Co., Ltd.) was added to the cHis8 immobilized resin suspension collected at about 2 CV. (manufactured by Manufacturer, Inc.) was added thereto, and the mixture was gently mixed by inverting overnight. Thereafter, after collecting Bio-Beads SM2, HRV3C protease was added to the cHis8 solid-phase resin suspension collected at about 2 CV, and the mixture was slowly mixed by inversion for 2 to 16 hours. Subsequently, the fraction passed through the empty column and the fraction washed with 1 to 3 CV of buffer were collected and used as the Nanodisc purified fraction. Nanodisk purification was performed by concentrating this with Amicon Ultra as necessary and gel filtration with Superdex 200 Increase 10/300 GL or Superrose 6 Increase 10/300 GL (manufactured by Cytiva).
結果を図３～５に示す。モデルタンパク質として使用した膜タンパク質（Ａ２ａ、ｈＥＲＧ、Ｐ－糖タンパク質）はいずれも、ｃＨｉｓ８固相化レジンを用いることにより、高純度で界面活性剤精製およびナノディスク精製が可能であることが示された（図３：Ａ２ａの結果、図４：ｈＥＲＧの結果、図５：Ｐ－糖タンパク質の結果）。特に、本発明のナノディスク精製は、従来のナノディスク精製と比較して、約２～５倍の収量が得られた。 The results are shown in Figures 3-5. It has been shown that membrane proteins (A2a, hERG, P-glycoprotein) used as model proteins can be purified with surfactants and nanodiscs to high purity using cHis8 immobilized resin. (Figure 3: A2a results, Figure 4: hERG results, Figure 5: P-glycoprotein results). In particular, the nanodisk purification of the present invention yielded about 2 to 5 times as much yield as the conventional nanodisk purification.
Claims (13)
（ａ）前記膜タンパク質を請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させ、前記膜タンパク質と、前記抗体またはその抗原結合断片とから構成される複合体を形成させる工程
（ｂ）工程（ａ）で形成させた複合体を単離する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で単離した複合体から前記膜タンパク質を単離し、前記膜タンパク質を含むろ過物を得る工程
を含む、方法。 A method for purifying a membrane protein from a solution containing a membrane protein with a His-tag added to the C-terminus, the method comprising:
(a) Contacting the membrane protein with the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 8 to form a complex composed of the membrane protein and the antibody or antigen-binding fragment thereof. (b) isolating the complex formed in step (a); and (c) isolating the membrane protein from the complex isolated in step (b), and filtration containing the membrane protein. A method comprising the step of obtaining an object.
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