JP2023163455A - Polymer having reactive functional groups - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、反応性官能基を有するポリマーに関する。より具体的には、本発明は、反応性官能基を有する、ポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンに関する。 The present invention relates to polymers having reactive functional groups. More specifically, the present invention relates to polyetheresteramides and polyetheresterurethanes having reactive functional groups.
従来、ポリエーテルエステルアミド、ポリエーテルエステルウレタンといったポリマーの中には、ゲル、ミセル、ファイバー、フィルム等に成形して、例えばナノバイオ分野、バイオマテリアル分野に適用可能なポリマーがあることが知られている。例えば特許文献１には、ポリエーテルエステルアミド型医療用粘着剤が例示されている。特許文献２には、ドラッグデリバリ－に用いられることのあるＰＥＧ（ポリエチレングリコ－ル）の活性化に関する例が示されている。特許文献３には、薬剤等の運搬に用いることが可能な、ポリエステルエーテルアミド骨格を有するポリマーが記載されている。特許文献４には、ポリエステルアミド骨格を有し、薬剤等を運搬可能な化合物が記載されている。 It has been known that some polymers such as polyether ester amide and polyether ester urethane can be molded into gels, micelles, fibers, films, etc. and can be applied to the fields of nanobio and biomaterials, for example. There is. For example, Patent Document 1 exemplifies a polyether ester amide type medical adhesive. Patent Document 2 shows an example of activation of PEG (polyethylene glycol), which is sometimes used for drug delivery. Patent Document 3 describes a polymer having a polyester ether amide skeleton that can be used for transporting drugs and the like. Patent Document 4 describes a compound having a polyesteramide skeleton and capable of transporting drugs and the like.
また、ポリマーがアミノ酸残基を含有する例も報告されている。例えば、非特許文献１には、アミノ酸の一種であるフェニルアラニンを有するモノマーを用いて合成されるポリエステルアミドが例示されている。非特許文献２では、フェニルアラニンを用いて合成されるポリエステルアミドが報告されている。非特許文献３には、フェニルアラニンを有するモノマー及びアリルグリシンを有するモノマー等の重縮合により得られたポリエステルアミドが例示されている。非特許文献４では、アルギニンを用いて合成されるポリエステルアミドが報告されている。 Examples have also been reported in which the polymer contains amino acid residues. For example, Non-Patent Document 1 exemplifies a polyesteramide synthesized using a monomer having phenylalanine, which is a type of amino acid. Non-Patent Document 2 reports a polyesteramide synthesized using phenylalanine. Non-Patent Document 3 exemplifies a polyesteramide obtained by polycondensation of a monomer having phenylalanine and a monomer having allylglycine. Non-Patent Document 4 reports a polyesteramide synthesized using arginine.
さらに、ポリエステルアミド系化合物に反応性の官能基を付与した例も非特許文献５及び非特許文献６で報告されている。 Furthermore, examples in which reactive functional groups are added to polyesteramide-based compounds are also reported in Non-Patent Document 5 and Non-Patent Document 6.
しかしながら、特許文献１～４及び非特許文献１～４に記載されるようなポリマーをナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等に適用する場合、適用範囲に限りがあった。 However, when applying the polymers described in Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Documents 1 to 4 to the nanobio field, biomaterial field, etc., the scope of application is limited.
また、非特許文献５及び非特許文献６に記載されるようなポリマーは、そのポリマー側鎖に反応性官能基を有するが、反応性官能基の導入量増大の余地があった。 Furthermore, although the polymers described in Non-Patent Document 5 and Non-Patent Document 6 have reactive functional groups in their polymer side chains, there is room for an increase in the amount of reactive functional groups introduced.
本発明は、反応性官能基の導入量が増大したポリマーを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a polymer in which the amount of reactive functional groups introduced is increased.
本発明は次に示す［１］～［５］に関する。
［１］分子量が５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、下記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有するポリマー。
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、上記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は上記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
上記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］
［２］Ｒ３がヒドロキシ基、カルボキシ基、チオール基及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種を有する、［１］に記載のポリマー。
［３］Ｒ３に活性化官能基が修飾された［１］又は［２］に記載のポリマー。
［４］上記活性化官能基がマレイミド基である、［３］に記載のポリマー。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のポリマーと、ペプチド、抗体、抗原、ＲＮＡ及びＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１種との複合体である、バイオコンジュゲーション生成物。
The present invention relates to [1] to [5] shown below.
[1] A polymer having a molecular weight of 5,000 to 30,000 g/mol and having 2 to 15 repeating units represented by the following formula (1).
[In the formula,
A plurality of R 1s are each independently an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms or a group represented by the following formula (2),
R 4 is a polyoxyethylene group with a molecular weight of 200 to 5000 g/mol,
A plurality of R2s are each independently a group represented by the above formula (2) or a group represented by the following formula (3),
R 5 is an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms,
At least one of R 1 and R 2 is a group represented by the above formula (2),
A plurality of R3s are each independently a reactive side chain of an amino acid,
The content of R 3 in the repeating unit is 1.5 to 2 equivalents,
x+y is 1,
x and y are both greater than 0]
[2] The polymer according to [1], wherein R 3 has at least one selected from the group consisting of a hydroxy group, a carboxy group, a thiol group, and an amino group.
[3] The polymer according to [1] or [2], wherein R 3 is modified with an activated functional group.
[4] The polymer according to [3], wherein the activated functional group is a maleimide group.
[5] A bioconjugation product that is a complex of the polymer according to any one of [1] to [4] and at least one selected from the group consisting of peptides, antibodies, antigens, RNA, and DNA. .
本発明によれば、反応性官能基の導入量が増大したポリマーを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a polymer in which the amount of reactive functional groups introduced is increased.
アミノ酸側鎖の反応性官能基を用いることで、反応点が豊富であり種々の反応が可能な生分解性ポリマーマトリクス材を提供することができる。本発明のポリマーを用いることで、種々のバイオ分子、リンカー、ポリマー、第２の反応性官能基等の導入が簡便になり新たな特性を持たせたポリマー材料の提供ができると考えられる。本発明のポリマーを用いることで、ナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等の広い範囲において、新たな用途展開ができると考えられる。 By using the reactive functional group of the amino acid side chain, it is possible to provide a biodegradable polymer matrix material that has abundant reactive sites and is capable of various reactions. It is believed that by using the polymer of the present invention, it is possible to easily introduce various biomolecules, linkers, polymers, second reactive functional groups, etc., and to provide polymer materials with new properties. By using the polymer of the present invention, it is thought that new applications can be developed in a wide range of fields such as nanobio field and biomaterial field.
本発明のポリマーが有する反応性官能基の有機化学反応を介して、ポリマーの側鎖に新たな官能基の導入及び特性付与が簡便に可能である。特に、バイオ分子等との複合体を形成する、バイオコンジュゲーションへの応用が可能であると考えられる。バイオ分子としては、抗体、抗原、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が考えられる。本発明のポリマーの用途として考えられるのは、例えば、細胞培養足場、ドラッグデリバリーシステム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、イムノアッセイ（ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）、創薬探索試薬、バイオセンサ媒体、病原診断試薬等への応用である。 Through the organic chemical reaction of the reactive functional groups possessed by the polymer of the present invention, it is possible to easily introduce new functional groups and impart properties to the side chains of the polymer. In particular, it is considered possible to apply it to bioconjugation, which forms a complex with biomolecules. Examples of biomolecules include antibodies, antigens, peptides, proteins, DNA, and RNA. Possible uses for the polymers of the present invention include, for example, cell culture scaffolds, drug delivery systems (DDS), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), immunoassays, and antibody-drug conjugates ( Applications include antibody-drug conjugate (ADC), drug discovery reagents, biosensor media, and pathological diagnostic reagents.
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。 EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, the form for implementing this invention is demonstrated in detail. The present embodiment below is an illustration for explaining the present invention, and is not intended to limit the present invention to the following content. The present invention can be implemented with appropriate modifications within the scope of its spirit.
本発明の一実施形態は、分子量が５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、下記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有するポリマーである。
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、上記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は上記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
上記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］
One embodiment of the present invention is a polymer having a molecular weight of 5,000 to 30,000 g/mol and having 2 to 15 repeating units represented by the following formula (1).
[In the formula,
A plurality of R 1s are each independently an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms or a group represented by the following formula (2),
R 4 is a polyoxyethylene group with a molecular weight of 200 to 5000 g/mol,
A plurality of R2s are each independently a group represented by the above formula (2) or a group represented by the following formula (3),
R 5 is an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms,
At least one of R 1 and R 2 is a group represented by the above formula (2),
A plurality of R3s are each independently a reactive side chain of an amino acid,
The content of R 3 in the repeating unit is 1.5 to 2 equivalents,
x+y is 1,
x and y are both greater than 0]
本実施形態に係るポリマーの分子量は、５０００～３００００ｇ／ｍｏｌであり、７０００～２００００ｇ／ｍｏｌであってよく、１００００～１５０００ｇ／ｍｏｌであってもよい。本実施形態に係るポリマーは、上記式（１）で表される繰り返し単位を２～１５個有し、５～１２個有していてよく、７～１０個有していてもよい。 The molecular weight of the polymer according to this embodiment is 5000 to 30000 g/mol, may be 7000 to 20000 g/mol, or may be 10000 to 15000 g/mol. The polymer according to this embodiment has 2 to 15 repeating units represented by the above formula (1), may have 5 to 12 repeating units, and may have 7 to 10 repeating units.
Ｒ１は炭素数２～１２のアルキレン基であってよく、炭素数４～１０のアルキレン基であってよく、炭素数６～９のアルキレン基であってもよい。炭素数２～１２のアルキレン基としては、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ウンデシレン基、ドデシレン基等が挙げられ、これらは直鎖状又は分岐鎖状であってよい。 R 1 may be an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms, an alkylene group having 4 to 10 carbon atoms, or an alkylene group having 6 to 9 carbon atoms. Examples of the alkylene group having 2 to 12 carbon atoms include ethylene group, propylene group, butylene group, pentylene group, hexylene group, heptylene group, octylene group, nonylene group, decylene group, undecylene group, dodecylene group, etc. It may be linear or branched.
Ｒ１及び／又はＲ２は、上記式（２）で表される基である。上記式（２）において、Ｒ４の分子量は２００～５０００ｇ／ｍｏｌであり、５００～４５００ｇ／ｍｏｌであってよく、１０００～４０００ｇ／ｍｏｌであってよい。ポリオキシエチレン基におけるオキシエチレン基の重合度は４～１１５であってよく、１０～１００であってよく、２０～８０であってよい。 R 1 and/or R 2 are groups represented by the above formula (2). In the above formula (2), the molecular weight of R 4 is 200 to 5000 g/mol, may be 500 to 4500 g/mol, or may be 1000 to 4000 g/mol. The degree of polymerization of the oxyethylene group in the polyoxyethylene group may be from 4 to 115, from 10 to 100, from 20 to 80.
Ｒ２は、上記式（３）で表される基であってよい。上記式（３）において、Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であってよく、炭素数４～１０のアルキレン基であってよく、炭素数６～９のアルキレン基であってもよい。炭素数２～１２のアルキレン基としては、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ウンデシレン基、ドデシレン基等が挙げられ、これらは直鎖状又は分岐鎖状であってよい。 R 2 may be a group represented by the above formula (3). In the above formula (3), R 5 may be an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms, an alkylene group having 4 to 10 carbon atoms, or an alkylene group having 6 to 9 carbon atoms. . Examples of the alkylene group having 2 to 12 carbon atoms include ethylene group, propylene group, butylene group, pentylene group, hexylene group, heptylene group, octylene group, nonylene group, decylene group, undecylene group, dodecylene group, etc. It may be linear or branched.
Ｒ３は、アミノ酸の反応性側鎖である。本明細書において、「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」とは、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸両者を示す。アミノ酸は立体配置によってＤ体又はＬ体に大別されるが、本明細書におけるポリマーを構成するアミノ酸残基はＬ体であることが好ましい。「反応性側鎖」とは、反応性官能基を有する側鎖である。反応性官能基としては、例えば、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、アミノ基等が挙げられる。Ｒ３がヒドロキシ基、カルボキシ基、チオール基及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種を有していてよい。反応性側鎖を有するアミノ酸としては、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）等が例示される。 R3 is the reactive side chain of the amino acid. As used herein, "amino acid" or "amino acid residue" refers to both naturally occurring amino acids and non-naturally occurring amino acids. Amino acids are broadly classified into D-form and L-form depending on their steric configuration, and the amino acid residues constituting the polymer in this specification are preferably in the L-form. A "reactive side chain" is a side chain that has a reactive functional group. Examples of the reactive functional group include a hydroxy group, a thiol group, a carboxy group, and an amino group. R 3 may have at least one selected from the group consisting of a hydroxy group, a carboxy group, a thiol group, and an amino group. Amino acids with reactive side chains include serine (Ser, S), threonine (Thr, T), cysteine (Cys, C), methionine (Met, M), aspartic acid (Asp, D), glutamic acid (Glu, E), lysine (Lys, K), arginine (Arg, R), asparagine (Asn, N), glutamine (Gln, Q), tyrosine (Tyr, Y), histidine (His, H), tryptophan (Trp, W) ) etc. are exemplified.
Ｒ３は、活性化官能基により修飾されていてよい。活性化官能基は、アミノ基、チオール基、ヒドロキシ基、カルボキシ基等と反応し、生成された共有結合を介して架橋又はリンカーを形成することができる官能基を意味する。活性化官能基としては、アミン反応性基、ヒドロキシ反応性基、チオール反応性基、アルデヒド又はケトン反応性基、カルボキシ反応性基等が挙げられる。活性化官能基としては、より具体的には、アミン、エポキシ、イソチオシアネ－ト、イソシアネ－ト、スクシンイミジルエステル、ハロゲン化スルホニル、アリ－ルハライド、アルデヒド、グルタルアルデヒド、無水物、イミダゾールカルバメート等のアミン基と反応可能な官能基；アルキレンハライド、アリ－ルハライド、マレイミド、過酸化物、ビニ－ルスルホン、ジスルフィド等のチオール基と反応可能な官能基；アミン、ヒドロキシ等のカルボン酸基と反応可能な官能基；エポキシ、アジド等のヒドロキシ基と反応可能な官能基が例示される。活性化官能基は、マレイミド基であることが好ましい。活性化官能基がマレイミド基である場合、チオール基等との反応時に余計な触媒を必要とせず、また、人体及び環境に悪影響のある副生成物が産生されないため、生体への適合性がより向上する。加えて、生体内でマレイミド基とチオール基等との結合が分解されたとしても生体に影響が少ないという利点もある。活性化官能基がマレイミド基である場合、本実施形態に係るポリマーは生分解性及び生体適合性により優れることから、ナノバイオ分野及びバイオマテリアル分野においてより好適に用いることができる。 R 3 may be modified with an activated functional group. The activated functional group refers to a functional group that can react with an amino group, thiol group, hydroxy group, carboxy group, etc., and form a crosslink or linker through the generated covalent bond. Activated functional groups include amine-reactive groups, hydroxy-reactive groups, thiol-reactive groups, aldehyde- or ketone-reactive groups, carboxy-reactive groups, and the like. More specifically, activated functional groups include amines, epoxies, isothiocyanates, isocyanates, succinimidyl esters, sulfonyl halides, aryl halides, aldehydes, glutaraldehydes, anhydrides, imidazole carbamates, etc. Functional groups that can react with amine groups; Functional groups that can react with thiol groups such as alkylene halide, aryl halide, maleimide, peroxide, vinyl sulfone, and disulfide; React with carboxylic acid groups such as amines and hydroxy Functional group: Examples include functional groups that can react with hydroxy groups such as epoxy and azide. Preferably, the activated functional group is a maleimide group. When the activated functional group is a maleimide group, no extra catalyst is required during the reaction with a thiol group, etc., and by-products that are harmful to the human body and the environment are not produced, making it more compatible with living organisms. improves. In addition, there is an advantage that even if the bond between the maleimide group and the thiol group is broken down in the living body, there is little effect on the living body. When the activated functional group is a maleimide group, the polymer according to this embodiment has better biodegradability and biocompatibility, and can therefore be more suitably used in the nanobio field and biomaterial field.
上記式（１）で表される繰り返し単位中のＲ３の含有量は、１．５～２当量であり、１．６～１．９当量であってよく、１．７～１．８当量であってもよい。本明細書において、「当量」とは、１モルの上記式（１）で表される繰り返し単位に含まれるＲ３のモル数を意味する。 The content of R 3 in the repeating unit represented by the above formula (1) is 1.5 to 2 equivalents, may be 1.6 to 1.9 equivalents, and may be 1.7 to 1.8 equivalents. It may be. As used herein, "equivalent" means the number of moles of R 3 contained in 1 mole of the repeating unit represented by the above formula (1).
ｘ及びｙは、それぞれ、０．１及び０．９、０．２及び０．８、０．３及び０．７、０．４及び０．６、０．４５及び０．５５、０．５及び０．５、０．５５及び０．４５、０．６及び０．４、０．７及び０．３、０．８及び０．２、又は、０．９及び０．１であってよい。ｘ及びｙは、それぞれ０．４５及び０．５５、又は、０．６５及び０．４５であることが好ましく、０．５及び０．５であることがより好ましい。 x and y are respectively 0.1 and 0.9, 0.2 and 0.8, 0.3 and 0.7, 0.4 and 0.6, 0.45 and 0.55, 0.5 and may be 0.5, 0.55 and 0.45, 0.6 and 0.4, 0.7 and 0.3, 0.8 and 0.2, or 0.9 and 0.1. . Preferably, x and y are 0.45 and 0.55, or 0.65 and 0.45, respectively, and more preferably 0.5 and 0.5.
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンは、少なくとも２種のモノマーの重縮合によって得られるポリマーである。本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンは、下記式（４）で表されるモノマー（モノマー（Ａ））及び下記式（５）で表されるモノマー（モノマー（Ｂ））を含む原料を用いた重縮合によって製造することができる。重縮合の方法は後述する。
上記式（４）において、Ｒ１としては、上記式（１）が有するＲ１として例示された基と同じ基が例示される。Ｒ１が炭素数２～１２のアルキレン基であった場合、モノマー（Ａ）はジカルボン酸の活性化形態の疎水性モノマーである。Ｒ１が上記式（２）で表される基である場合、モノマー（Ａ）は、ジカルボン酸の活性化形態の親水性モノマーである。 In the above formula (4), R 1 is exemplified by the same group as the group exemplified as R 1 in the above formula (1). When R 1 is an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms, the monomer (A) is a hydrophobic monomer in the activated form of a dicarboxylic acid. When R 1 is a group represented by the above formula (2), the monomer (A) is a hydrophilic monomer in the activated form of dicarboxylic acid.
上記式（４）において、複数存在するＬＧ１は、独立して、脱離性を有する電子吸引性置換基である。脱離性を有する電子吸引性置換基としては、例えば、ｐ－フルオロフェノール、ｐ－クロロフェノール、ｐ－ブロモフェノール、ｐ－ニトロフェノール、ｐ－シアノフェノール、ｐ－フルオロチオフェノール、ｐ－クロロチオフェノール、ｐ－ブロモチオフェノール、ｐ－ニトロチオフェノール、ｐ－シアノチオフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－トリメチルシリルイミダゾ－ル等に由来する基が挙げられる。 In the above formula (4), a plurality of LG 1 's are independently electron-withdrawing substituents having elimination properties. Examples of the electron-withdrawing substituent having elimination properties include p-fluorophenol, p-chlorophenol, p-bromophenol, p-nitrophenol, p-cyanophenol, p-fluorothiophenol, and p-chlorothiophenol. Examples include groups derived from phenol, p-bromothiophenol, p-nitrothiophenol, p-cyanothiophenol, N-hydroxysuccinimide, N-trimethylsilylimidazole, and the like.
モノマー（Ａ）は、一般的な有機合成法における公知のエステル化反応により製造することができる。モノマー（Ａ）の製造方法を、ＬＧ１がいずれもｐ－ニトロフェノールに由来する基である場合を例にとって説明する。溶媒中で、縮合剤及び触媒の存在下で飽和ジカルボン酸の二塩化物（ジクロリド）とｐ－ニトロフェノールとのエステル化反応を進行させる。エステル化反応における溶媒は、有機塩基試薬（例えばピリジン）を含んでいてよい。得られたエステル化合物を再結晶化して精製することで、モノマー（Ａ）を得ることができる。 Monomer (A) can be produced by a known esterification reaction in a general organic synthesis method. The method for producing monomer (A) will be explained by taking as an example the case where all LG 1 are groups derived from p-nitrophenol. An esterification reaction between a saturated dicarboxylic acid dichloride and p-nitrophenol is carried out in a solvent in the presence of a condensing agent and a catalyst. The solvent in the esterification reaction may contain an organic base reagent (eg, pyridine). Monomer (A) can be obtained by recrystallizing and purifying the obtained ester compound.
飽和ジカルボン酸としては、ブタン二酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、トリデカン二酸、テトラデカン二酸等が挙げられ、好適な飽和ジカルボン酸ジクロリドとしては、ブタン二酸ジクロリド、グルタル酸ジクロリド、アジピン酸ジクロリド、ピメリン酸ジクロリド、スベリン酸ジクロリド、アゼライン酸ジクロリド、セバシン酸ジクロリド、ウンデカン二酸ジクロリド、ドデカン二酸ジクロリド、トリデカン二酸ジクロリド、テトラデカン二酸ジクロリド等が挙げられる。 Saturated dicarboxylic acids include butanedioic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, undecanedioic acid, dodecanedioic acid, tridecanedioic acid, tetradecanedioic acid, etc., and preferred Saturated dicarboxylic acid dichlorides include butanedioic acid dichloride, glutaric acid dichloride, adipic acid dichloride, pimelic acid dichloride, suberic acid dichloride, azelaic acid dichloride, sebacic acid dichloride, undecanedioic acid dichloride, dodecanedioic acid dichloride, tridecanedioic acid dichloride , tetradecanedioic acid dichloride, and the like.
上記式（５）において、Ｒ２としては、上記式（１）が有するＲ２として例示された基と同じ基が例示される。Ｒ２が上記式（２）で表される基である場合、モノマー（Ｂ）は親水性モノマーである。Ｒ２が上記式（３）で表される基である場合、モノマー（Ｂ）は疎水性モノマーである。 In the above formula (5), R 2 is exemplified by the same group as the group exemplified as R 2 in the above formula (1). When R 2 is a group represented by the above formula (2), the monomer (B) is a hydrophilic monomer. When R 2 is a group represented by the above formula (3), the monomer (B) is a hydrophobic monomer.
上記式（５）において、Ｒ６は上記式（１）が有するＲ３であってもよく、反応性官能基が保護基によって保護されたＲ３であってもよい。 In the above formula (5), R 6 may be R 3 of the above formula (1), or may be R 3 whose reactive functional group is protected with a protecting group.
上記式（５）において、複数存在するＬＧ２は、独立して、アミノ酸残基のＮ末端と塩化合物を形成可能な酸類である。アミノ酸残基のＮ末端と塩化合物を形成可能な酸としては、例えば、スルホン酸類、トリフルオロ酢酸、塩酸等が挙げられる。 In the above formula (5), a plurality of LG 2 's are acids that can independently form a salt compound with the N-terminus of an amino acid residue. Examples of acids that can form a salt compound with the N-terminus of an amino acid residue include sulfonic acids, trifluoroacetic acid, and hydrochloric acid.
モノマー（Ｂ）は、例えば後述する第１工程及び第２工程によって合成することができる。第１工程及び第２工程を、ＬＧ２がｐ－トルエンスルホン酸である場合を例にとって説明する。第１工程では、アミノ酸と、飽和炭化水素ジオール又はポリオキシエチレン化合物とを溶媒に溶解させ、縮合剤及び触媒の存在下でエステル化反応を進行させる。これにより、アミノ酸のＣ末端のカルボキシ基と飽和炭化水素ジオール又はポリオキシエチレン化合物の水酸基とのエステル化反応が進み、モノマー（Ｂ）の中間体が生成される。エステル化反応に用いるアミノ酸のＮ末端と、側鎖に存在する反応性官能基とは、そのいずれか又は両方が保護基で保護されていてよい。 Monomer (B) can be synthesized, for example, by the first step and second step described below. The first step and the second step will be explained using an example in which LG 2 is p-toluenesulfonic acid. In the first step, the amino acid and the saturated hydrocarbon diol or polyoxyethylene compound are dissolved in a solvent, and the esterification reaction is allowed to proceed in the presence of a condensing agent and a catalyst. As a result, the esterification reaction between the C-terminal carboxy group of the amino acid and the hydroxyl group of the saturated hydrocarbon diol or polyoxyethylene compound progresses, and an intermediate of monomer (B) is produced. Either or both of the N-terminus of the amino acid used in the esterification reaction and the reactive functional group present in the side chain may be protected with a protecting group.
第２工程では、中間体のアミノ酸残基のＮ末端と、ｐ－トルエンスルホン酸とを塩化反応させることで、Ｂｏｃ基の脱保護が生じ、モノマー（Ｂ）が得られる。反応性側鎖に保護基が結合している場合、常法に従って保護基を除去してもよい。 In the second step, the Boc group is deprotected by subjecting the N-terminus of the intermediate amino acid residue to a salt reaction with p-toluenesulfonic acid, yielding monomer (B). When a protecting group is bonded to the reactive side chain, the protecting group may be removed according to a conventional method.
飽和炭化水素ジオールとしては、１，２－エタンジオール、プロパンジオール、１，３－プロパンジオール、１，４－ブタンジオール、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，７－ヘプタンジオール、１，８－オクタンジオール、１，９－ノナンジオール、１，１０－デカンジオール、１，１１－ウンデカンジオール、１，１２－ドデカンジオール等が挙げられる。 Saturated hydrocarbon diols include 1,2-ethanediol, propanediol, 1,3-propanediol, 1,4-butanediol, 1,5-pentanediol, 1,6-hexanediol, 1,7-heptane Examples include diol, 1,8-octanediol, 1,9-nonanediol, 1,10-decanediol, 1,11-undecanediol, 1,12-dodecanediol, and the like.
アミノ酸の保護基としては、例えばｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジル基（Ｂｚｌ基）、メチル基（Ｍｅ基）、トリチル基（Ｔｒｔ基）、アセトアミドメチル基（Ａｃｍ基）、スルホキシド基（ＳＯ基）、メチルエステル基（ＯＭｅ基）、ベンジルエステル基（ＯＢｚｌ基）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、４－メチルトリチル基（Ｍｔｔ基）、４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ基）、メタンチオスルフォネ－ト基（Ｍｔｓ基）、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル基（Ｐｂｆ基）、キサンチル基（Ｘａｎ基）等が挙げられる。 Examples of protecting groups for amino acids include tert-butoxycarbonyl group (Boc group), benzyl group (Bzl group), methyl group (Me group), trityl group (Trt group), acetamidomethyl group (Acm group), sulfoxide group ( SO group), methyl ester group (OMe group), benzyl ester group (OBzl group), 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc group), benzyloxycarbonyl group (Cbz group), 4-methyltrityl group (Mtt group), 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl group (Mtr group), methanethiosulfonate group (Mts group), 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran- Examples include a 5-sulfonyl group (Pbf group) and a xantyl group (Xan group).
例えば、アミノ酸のＮ末端がＢｏｃ基で保護され、且つ、側鎖に存在する反応性官能基がＢｚｌ基で保護された状態はＢｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨと表記される。Ｎ末端と側鎖に存在する反応性官能基とが保護基で保護されたアミノ酸としては、例えば、Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｈｒ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｍｅｔ（ＳＯ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＭｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｍｔｒ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｍｔｓ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｃｂｚ）２－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ，Ｂｏｃ－Ａｓｎ（Ｘａｎ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）－ＯＨ等が挙げられる。本実施形態で原料として用いるアミノ酸は、Ｎ末端がＢｏｃ基で保護され、側鎖が有する反応性官能基がＣｂｚ基で保護されたリジン（Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨ）であることが好ましい。 For example, a state in which the N-terminus of an amino acid is protected with a Boc group and the reactive functional group present in the side chain is protected with a Bzl group is expressed as Boc-Ser(Bzl)-OH. Examples of amino acids in which the N-terminus and the reactive functional group present in the side chain are protected with a protecting group include Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Ser(Me)-OH, and Boc-Ser(Trt). -OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Thr(Me)-OH, Boc-Cys(Acm)-OH, Boc-Cys(Trt)-OH, Boc-Cys(Bzl)-OH, Boc- Cys(Me)-OH, Boc-Met(SO)-OH, Boc-Asp(OMe)-OH, Boc-Asp(OBzl)-OH, Boc-Glu(OBzl)-OH, Boc-Glu(OMe)- OH, Boc-Lys(Fmoc)-OH, Boc-Lys(Cbz)-OH, Boc-Lys(Mtt)-OH, Boc-Arg(Mtr)-OH, Boc-Arg(Mts)-OH, Boc-Arg (Cbz)2-OH, Boc-Arg(Pbf)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Asn(Trt)-OH, Boc-Gln(Trt)-OH, Boc-Tyr(Bzl)- Examples include OH, Boc-Tyr(Me)-OH, Boc-His(Cbz)-OH, Boc-Trp(Mts)-OH, and the like. The amino acid used as a raw material in this embodiment is preferably lysine (Boc-Lys(Cbz)-OH) whose N-terminus is protected with a Boc group and whose side chain has a reactive functional group protected with a Cbz group. .
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンは、上記式（４）で表されるモノマー及び上記式（５）で表されるモノマーのみを構成単位として含んでいてよく、上記式（４）及び（５）で表されるモノマー以外の第３のモノマーを構成単位として含んでいてもよい。第３のモノマーの両末端は、それぞれ、上記式（４）及び（５）で表されるモノマーのいずれかの末端と同じであってよい。本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンの質量を基準として、反応性官能基を有するアミノ酸残基を有するモノマー（モノマー（Ｂ））の含有量が、５０質量％以上を占めるのが好ましく、６０質量％以上であるのがより好ましく、７０質量％以上であるのが更に好ましい。 The polyether ester amide and polyether ester urethane according to the present embodiment may contain only the monomer represented by the above formula (4) and the monomer represented by the above formula (5) as constituent units, and the polyether ester amide and the polyether ester urethane according to the above formula ( A third monomer other than the monomers represented by 4) and (5) may be included as a structural unit. Both ends of the third monomer may be the same as either end of the monomer represented by formulas (4) and (5) above, respectively. The content of the monomer having an amino acid residue having a reactive functional group (monomer (B)) is 50% by mass or more based on the mass of the polyetheresteramide and polyetheresterurethane according to the present embodiment. The content is preferably 60% by mass or more, more preferably 70% by mass or more.
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンは、下記式（６）で表される繰り返し構造を有するポリマーであってよい。ｎは２～１５であり、５～１２であってよく、７～１０であってもよい。
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンを製造するための重縮合は、例えば次のように行うことができる。まず、モノマー（Ａ）及びモノマー（Ｂ）と、必要に応じて第３のモノマーとを、溶媒に分散させて、６０℃で完全に溶解させる。溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等が挙げられる。次に、得られたモノマー溶液に有機塩基試薬を加えて７０℃で４８時間重縮合反応を行う。有機塩基試薬としては、例えば、ジアザビシクロノネン、ジアザビシクロウンデセン、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、ピリジン等が挙げられる。得られた反応液から、透析及び／又は凍結乾燥により、下記式（７）で表される繰り返し単位を有するポリマーを得ることができる。
上記式（７）で表される繰り返し単位において、Ｒ６がＲ３である場合は、上記モノマー同士の重縮合反応で得られたポリマーが、本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンである。上記式（７）で表される繰り返し単位において、Ｒ６が、反応性官能基が保護基で保護されているＲ３である場合は、当該保護基を除去して脱保護することにより、本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタンを得ることができる。脱保護反応は、保護基の種類により適切な公知の脱保護法にて行うことができる。例えば、Ｃｂｚ基、Ｂｚｌ基等で保護された側鎖は、トリフルオロ酢酸系カクテル試薬、メタンスルホン酸系カクテル試薬、臭化水素酸系カクテル試薬、パラジウム／炭素－水素還元剤等を用いて脱保護することができる。メチルエステル基で保護された側鎖は、塩基性試薬カクテル処理により脱保護することができる。Ｔｒｔ基、Ｐｂｆ基等で保護された側鎖はトリフルオロ酢酸系カクテル試薬処理により脱保護することができる。 In the repeating unit represented by the above formula (7), when R 6 is R 3 , the polymer obtained by the polycondensation reaction of the monomers is the polyether ester amide and polyether ester according to the present embodiment. It is urethane. In the repeating unit represented by the above formula (7), when R 6 is R 3 whose reactive functional group is protected with a protecting group, by removing the protecting group and deprotecting, the main Polyetheresteramides and polyetheresterurethanes according to embodiments can be obtained. The deprotection reaction can be carried out by a known deprotection method appropriate for the type of protecting group. For example, side chains protected with Cbz groups, Bzl groups, etc. can be removed using trifluoroacetic acid cocktail reagents, methanesulfonic acid cocktail reagents, hydrobromic acid cocktail reagents, palladium/carbon-hydrogen reducing agents, etc. can be protected. Side chains protected with methyl ester groups can be deprotected by basic reagent cocktail treatment. Side chains protected with Trt groups, Pbf groups, etc. can be deprotected by treatment with a trifluoroacetic acid cocktail reagent.
モノマー（Ａ）及びモノマー（Ｂ）の少なくとも一方が親水性モノマーであれば、得られたポリマーに親水性を持たせることができる。モノマー（Ａ）が疎水性モノマーであり、モノマー（Ｂ）が親水性モノマーである場合に得られるポリマーをポリエーテルエステルアミドと呼称する。モノマー（Ａ）が親水性モノマーであり、モノマー（Ｂ）が疎水性モノマーである場合に得られるポリマーをポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）と呼称する。モノマー（Ａ）及びモノマー（Ｂ）がいずれも親水性モノマーである場合に得られるポリマーをポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）と呼称する。 When at least one of the monomer (A) and the monomer (B) is a hydrophilic monomer, the resulting polymer can be made hydrophilic. The polymer obtained when the monomer (A) is a hydrophobic monomer and the monomer (B) is a hydrophilic monomer is called a polyether ester amide. The polymer obtained when monomer (A) is a hydrophilic monomer and monomer (B) is a hydrophobic monomer is called polyether ester urethane (I). The polymer obtained when both monomer (A) and monomer (B) are hydrophilic monomers is called polyether ester urethane (II).
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタン（ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ））によれば、反応性官能基及び／又は活性化反応基を有するポリマーを簡便に提供することができる。本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド並びにポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ）は、バイオ分子等のコンジュゲーション（バイオコンジュゲーション）に好適に用いることができる。バイオコンジュゲーションとは、複数のバイオ分子を安定した共有結合で結合させる化学的手段である。本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド並びにポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ）は、直接的に又は低分子リンカーを介して間接的に、様々なバイオ分子に結合することができる。 According to the polyether ester amide and polyether ester urethane (polyether ester urethane (I) and (II)) according to the present embodiment, a polymer having a reactive functional group and/or an activated reactive group can be easily provided. be able to. The polyether ester amide and polyether ester urethane (I) and (II) according to this embodiment can be suitably used for conjugation of biomolecules and the like (bioconjugation). Bioconjugation is a chemical means of joining multiple biomolecules through stable covalent bonds. The polyether ester amide and polyether ester urethane (I) and (II) according to this embodiment can be bonded to various biomolecules directly or indirectly via a low molecule linker.
本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド並びにポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ）は、原料としてアミノ酸を用いているため、生体親和性及び生分解性が高い。また、主鎖にポリオキシエチレン基を有するために、親水性に優れている。これらのことから、上述したようなバイオマテリアルの分野で好適に用いることができる。加えて、原料のモノマー１モル中に１当量以上の反応性側鎖を有するアミノ酸残基が導入されることにより、反応性官能基の導入量及び／又は種類が増える。これにより、本実施例に係るポリマーは、種々の化合物と反応しやすくなり、展開できる用途が増えると考えられる。 The polyether ester amide and polyether ester urethane (I) and (II) according to this embodiment use amino acids as raw materials, and therefore have high biocompatibility and biodegradability. Furthermore, since it has a polyoxyethylene group in its main chain, it has excellent hydrophilicity. For these reasons, it can be suitably used in the field of biomaterials as described above. In addition, by introducing an amino acid residue having 1 equivalent or more of a reactive side chain into 1 mole of the raw material monomer, the amount and/or type of reactive functional groups introduced increases. This makes it easier for the polymer according to this example to react with various compounds, and it is thought that the number of applications that can be developed will increase.
バイオ分子としては、抗体、抗原、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、脂質等が挙げられる。これらのバイオ分子と、本実施形態に係るポリエーテルエステルアミド並びにポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）及び（ＩＩ）との複合体を「バイオコンジュゲーション生成物」という。バイオコンジュゲーション生成物は、バイオ分子と、本実施形態に係るポリマーと、それ以外の分子との複合体であってもよい。それ以外の分子としては、低分子リンカーが例示され、より具体的には、ペプチドリンカーが例示される。バイオコンジュゲーション生成物は、例えば、細胞培養足場、ドラッグデリバリ－システム、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、イムノアッセイ、抗体－薬物複合体、創薬探索試薬、バイオセンサ媒体、病原診断試薬等へ応用することができる。 Examples of biomolecules include antibodies, antigens, peptides, proteins, DNA, RNA, enzymes, and lipids. A complex of these biomolecules and the polyether ester amide and polyether ester urethane (I) and (II) according to this embodiment is referred to as a "bioconjugation product." The bioconjugation product may be a complex of a biomolecule, a polymer according to this embodiment, and another molecule. Examples of other molecules include low-molecular linkers, and more specifically peptide linkers. Bioconjugation products have applications, for example, in cell culture scaffolds, drug delivery systems, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), immunoassays, antibody-drug conjugates, drug discovery reagents, biosensor media, pathogen diagnostic reagents, etc. can do.
ペプチドリンカーとしては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ａｃ－ＧＣＲＧＧＰＡＧＭＲＧＫＧＲＣＧ－ＮＨ２：配列番号１）を用いることができる。配列番号１において、Ｎ末端のＡｃ－はＮ末端がアセチル化されていることを意味し、Ｃ末端の－ＮＨ２は、Ｃ末端がアミド化されていることを意味する。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、種々のプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９）によって開裂可能なアミノ酸配列であり、次のようにして製造することができる。 As the peptide linker, for example, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Ac-GCRGGPAGMRGKGRCG-NH 2 :SEQ ID NO: 1) can be used. In SEQ ID NO: 1, Ac- at the N-terminus means that the N-terminus is acetylated, and -NH 2 at the C-terminus means that the C-terminus is amidated. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence that can be cleaved by various proteases (eg, MMP-2, MMP-3, and MMP-9), and can be produced as follows.
＜反応溶液、緩衝液等の組成＞
・脱保護液：ピペリジン（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ジメチルホルムアミド；ＤＭＦ（富士フィルム和光純薬（株）、７５ｖｏｌ％）
・アミノ酸カクテル：Ｎ末Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨはメルク（株）製、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨはシグマ・アルドリッチ社製、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨはＣｈｅｍｓｃｅｎｅ社製を使用、反応点に対して６当量）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル；Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ（商標）（メルク（株）製、反応点に対して６当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（富士フィルム和光純薬（株）、反応点に対して６当量）、２，４，６－トリメチルピリジン（東京化成工業（株）、反応点に対して１２当量）、ＤＭＦ（溶媒量）
・不活性化液：無水酢酸（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ＤＭＦ（７５ｖｏｌ％）
・脱樹脂液：トリフルオロ酢酸；ＴＦＡ（東京化成工業（株）、９５ｍａｓｓ％）、トリイソプロピルシラン（富士フィルム和光純薬（株）、２．５ｍａｓｓ％）、蒸留水（２．５ｍａｓｓ％）
・溶離液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／蒸留水
・溶離液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル（高速液体クロマトグラフ用、富士フィルム和光純薬（株））
<Composition of reaction solution, buffer solution, etc.>
・Deprotection solution: Piperidine (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 25 vol%), dimethylformamide; DMF (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 75 vol%)
・Amino acid cocktail: N-terminal Fmoc protected amino acids (Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gln(OtBu)-OH, Fmoc -Val-OH and Fmoc-Trp(Boc)-OH are manufactured by Merck, Fmoc-Met-OH is manufactured by Sigma-Aldrich, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH and Fmoc-Cys(Trt)-OH (manufactured by Chemscene, 6 equivalents relative to the reaction point), ethyl cyano(hydroxyimino)acetate; Oxyma pure (trademark) (manufactured by Merck Co., Ltd., 6 equivalents relative to the reaction point) equivalent), N,N'-diisopropylcarbodiimide (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 6 equivalents relative to the reaction point), 2,4,6-trimethylpyridine (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., relative to the reaction point) 12 equivalents), DMF (solvent amount)
・Inactivation liquid: Acetic anhydride (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 25 vol%), DMF (75 vol%)
-Resin removal liquid: trifluoroacetic acid; TFA (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., 95 mass%), triisopropylsilane (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 2.5 mass%), distilled water (2.5 mass%)
・Eluent A: 0.1% TFA/distilled water ・Eluent B: 0.1% TFA/acetonitrile (for high performance liquid chromatography, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
＜Ｆｍｏｃペプチド固相合成＞
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、Ｆｍｏｃ固相合成法で合成する。マルチ固相合成器（ＫＭＳ－３、国産化学（株））にエコノパックカラム（２０ｍＬ、ＢＩＯ ＲＡＤ製）をセットし、Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＡＭ ｒｅｓｉｎ（１００－２００ｍｅｓｈ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ、メルク（株））を０．０５ｍｍｏｌスケールとなるように秤量した後、ジクロロメタン；ＤＣＭ（ペプチド合成用グレード、富士フィルム和光純薬（株））２ｍＬを添加し過流攪拌下で１２～２４時間膨潤させる。膨潤液を除液後、脱保護液を２ｍＬ添加し樹脂上のＦｍｏｃ基を脱保護する（２ｍＬ×２回、各１０分処理）。脱保護液を除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄した後にアミノ酸カクテルを添加し、過流攪拌下で２～３時間反応させることで樹脂担体上にアミノ酸をカップリングさせる。反応液の除液後、不活性化液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３０分間処理することで未反応点をキャッピングする。不活性化液の除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄してＦｍｏｃアミノ酸導入樹脂担体を得る。以降、上記脱保護、カップリング反応、未反応点の不活性化を繰り返し実施することで配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成する。
<Fmoc peptide solid phase synthesis>
A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is synthesized by Fmoc solid phase synthesis method. An Econopack column (20 mL, BIO RAD) was set in a multi-solid phase synthesizer (KMS-3, Kokusan Kagaku Co., Ltd.), and Rink amide AM resin (100-200 mesh, 0.7 mmol/g, Merck Co., Ltd.) was added. ) to a 0.05 mmol scale, 2 mL of dichloromethane; DCM (grade for peptide synthesis, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added and allowed to swell for 12 to 24 hours under supercurrent stirring. After removing the swelling solution, 2 mL of a deprotection solution is added to deprotect the Fmoc group on the resin (2 mL x 2 times, 10 minutes each). After removing the deprotection solution and washing with DMF and DCM, an amino acid cocktail is added and reacted for 2 to 3 hours under turbulent stirring to couple the amino acids onto the resin carrier. After removing the reaction solution, 2 mL of an inactivating solution is added and the mixture is treated under supercurrent stirring for 30 minutes to cap unreacted spots. After removing the inactivation solution, the carrier is washed with DMF and DCM to obtain an Fmoc amino acid-introduced resin carrier. Thereafter, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is synthesized by repeatedly performing the above deprotection, coupling reaction, and inactivation of unreacted sites.
＜粗精製、ＬＣ分離精製＞
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成した後、Ｎ末に存在するＦｍｏｃ基を脱保護し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びメタノールで洗浄し、デシケータ内で２４時間静置することで乾燥樹脂担体を得る。上記乾燥樹脂担体に冷やした脱樹脂液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３～４時間処理することで脱樹脂及び側鎖保護基の脱保護を達成する。ペプチドを含む上澄み液を回収後、さらに上記脱樹脂液を２ｍＬ添加して樹脂担体を洗浄する。上記上澄み液及び洗浄液（計４ｍＬ）に冷ジエチルエーテルを１０倍量添加した後、遠心分離（２，０００×ｇ、１０分）して沈殿物を回収する。沈殿物は再度冷ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥して粗ポリペプチドを得る。得られた粗ポリペプチドを溶離液Ａに溶解した後、溶離液Ａ及び溶離液Ｂを用いて中圧液体クロマトグラフ（型式：ＥＰＣＬＣ－ＡＩ－５８０Ｓ、山善（株））によって目的成分を分画し、アセトニトリルを減圧留去した後、凍結乾燥して精製ペプチドを得る。
<Rough purification, LC separation and purification>
After synthesizing a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the Fmoc group present at the N-terminus is deprotected, washed with DMF, DCM, and methanol, and left standing in a desiccator for 24 hours to dry the resin. Obtain a carrier. 2 mL of the cooled resin removal solution is added to the dry resin carrier and treated under turbulent stirring for 3 to 4 hours to achieve resin removal and deprotection of side chain protecting groups. After collecting the supernatant containing the peptide, 2 mL of the above resin removal solution is further added to wash the resin carrier. After adding 10 times the amount of cold diethyl ether to the above supernatant liquid and washing liquid (4 mL in total), centrifugation (2,000 x g, 10 minutes) is performed to collect the precipitate. The precipitate is washed again with cold diethyl ether and then dried under reduced pressure to obtain a crude polypeptide. After dissolving the obtained crude polypeptide in eluent A, the target component was fractionated using eluent A and eluent B using a medium pressure liquid chromatograph (model: EPCLC-AI-580S, Yamazen Co., Ltd.). After distilling off the acetonitrile under reduced pressure, the product is freeze-dried to obtain a purified peptide.
以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また、下記例示は本発明の範囲内で適宜変更して実施することができる。なお、断りのない限り試薬としては市販品を用いた。「ＮＭＲ測定結果」は、核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ／ＬＩ、４００ＭＨｚ）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析の結果である。「収率」（％）は、１００×目的物（疎水性モノマーＩ若しくはＩＩ又は親水性モノマーＩ並びにＩＩ）の収量（ｍｏｌ）／原料（アゼライン酸クロリド、ポリエチレングリコ－ル（ＰＥＧ）又は１，９－ノナンジオール）の使用量（ｍｏｌ）によって算出された値である。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by citing embodiments for carrying out the present invention, but these are merely examples for explaining the present invention, and are not intended to limit the present invention to the following contents. Moreover, the following examples can be modified and implemented as appropriate within the scope of the present invention. Note that unless otherwise specified, commercially available reagents were used. "NMR measurement results" are the results of proton nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR) spectrum analysis using a nuclear magnetic resonance measurement device (manufactured by JEOL Ltd., trade name JNM-ECZ400S/LI, 400MHz). . "Yield" (%) is 100 x yield (mol) of target product (hydrophobic monomer I or II or hydrophilic monomer I and II) / raw material (azelaic acid chloride, polyethylene glycol (PEG) or 1, 9-nonanediol) used (mol).
＜疎水性モノマーＩ合成＞
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、３当量のｐ－ニトロフェノール（原料）及び４当量のピリジンをアセトン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに１当量のアゼライン酸クロリドを滴下し、室温にて５時間撹拌してｐ－ニトロフェノール及びアゼライン酸を反応させた。得られた粗生成物を塩酸水溶液及び塩水で洗浄し、再結晶化により精製した。これらの操作により、白色粉末状の疎水性モノマーＩが収率９５％で得られた。疎水性モノマーＩは下記式（８）で表される化合物である。図１にＮＭＲ測定結果を示す。図１の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図１から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
In a flask purged with nitrogen gas, 3 equivalents of p-nitrophenol (raw material) and 4 equivalents of pyridine were dissolved in acetone (100 mL). One equivalent of azelaic acid chloride was added dropwise to the same flask and stirred at room temperature for 5 hours to react p-nitrophenol and azelaic acid. The obtained crude product was washed with an aqueous hydrochloric acid solution and brine, and purified by recrystallization. Through these operations, white powdery hydrophobic monomer I was obtained with a yield of 95%. Hydrophobic monomer I is a compound represented by the following formula (8). Figure 1 shows the NMR measurement results. The vertical axis of FIG. 1 is the relative intensity of the proton signal, and the horizontal axis is the chemical shift (ppm). From FIG. 1, it was found that the desired monomer was synthesized.
＜親水性モノマーＩ合成＞
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量のＰＥＧ（分子量：２，０００ｇ／ｍｏｌ、重合度ａ（定数））及び４当量のピリジンをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに４当量のクロロぎ酸４－ニトロフェニルを滴下し、室温にて１８時間撹拌してＰＥＧ及びクロロぎ酸４－ニトロフェニルを反応させた。得られた粗生成物を塩酸水溶液で洗浄し、ジエチルエーテルによって沈殿させることで精製した。これらの操作により、白色ワックス状の親水性モノマーＩが収率９０％で得られた。親水性モノマーＩは下記式（９）で表される化合物である。図２にＮＭＲ測定結果を示す。図２の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図２から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
In a flask purged with nitrogen gas, 1 equivalent of PEG (molecular weight: 2,000 g/mol, degree of polymerization a (constant)) and 4 equivalents of pyridine were dissolved in dichloromethane (100 mL). Four equivalents of 4-nitrophenyl chloroformate were added dropwise to the same flask, and the mixture was stirred at room temperature for 18 hours to allow the PEG and 4-nitrophenyl chloroformate to react. The obtained crude product was purified by washing with an aqueous hydrochloric acid solution and precipitating with diethyl ether. Through these operations, white wax-like hydrophilic monomer I was obtained in a yield of 90%. Hydrophilic monomer I is a compound represented by the following formula (9). Figure 2 shows the NMR measurement results. The vertical axis of FIG. 2 is the relative intensity of the proton signal, and the horizontal axis is the chemical shift (ppm). From FIG. 2, it was found that the desired monomer was synthesized.
＜疎水性モノマーＩＩ合成＞
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量の１，９－ノナンジオール及び２．２当量のＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに縮合剤及び触媒を加え、１８時間室温で反応を進行させた。得られた粗中間生成物を酸性水溶液、塩基性水溶液及び塩水で洗浄し、中間体を得た。得られた中間体の両末端保護基であるＢｏｃ基を２．１当量のｐ－トルエンスルホン酸を用いてトルエン下で置換することにより、Ｂｏｃ基を脱離させ、ｐ－トルエンスルホン酸塩化合物を合成した。得られた粗生成物を再結晶化により生成した。これらの操作により、白色粉末状の疎水性モノマーＩＩが収率８５％で得られた。疎水性モノマーＩＩは下記式（１０）で表される化合物である。図３にＮＭＲ測定結果を示す。図３の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図３から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
In a flask purged with nitrogen gas, 1 equivalent of 1,9-nonanediol and 2.2 equivalents of Boc-Lys(Cbz)-OH were dissolved in dichloromethane (100 mL). A condensing agent and a catalyst were added to the same flask, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 18 hours. The obtained crude intermediate product was washed with an acidic aqueous solution, a basic aqueous solution, and salt water to obtain an intermediate. By substituting the Boc group, which is a protecting group at both ends of the obtained intermediate, with 2.1 equivalents of p-toluenesulfonic acid under toluene, the Boc group is removed, and a p-toluenesulfonate compound is obtained. was synthesized. The resulting crude product was produced by recrystallization. Through these operations, white powdery hydrophobic monomer II was obtained in a yield of 85%. Hydrophobic monomer II is a compound represented by the following formula (10). Figure 3 shows the NMR measurement results. The vertical axis of FIG. 3 is the relative intensity of the proton signal, and the horizontal axis is the chemical shift (ppm). From FIG. 3, it was found that the desired monomer was synthesized.
＜親水性モノマーＩＩ合成＞
窒素ガスで置換されたフラスコにおいて、１当量のＰＥＧ（分子量：２，０００ｇ／ｍｏｌ、重合度ａ（定数））及び２．２当量のＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。同じフラスコに縮合剤及び触媒を加え、１８時間室温で反応させた。得られた粗中間生成物を酸性水溶液、塩基性水溶液及び塩水で洗浄し、中間体を得た。中間体の両末端保護基であるＢｏｃ基を２．１当量のｐ－トルエンスルホン酸を用いてトルエン下で置換することにより、Ｂｏｃ基を脱離させ、ｐ－トルエンスルホン酸塩化合物を合成した。得られた粗生成物を－、ジエチルエーテルによって沈殿させることで精製した。これらの操作により、白色～黄色のワックス状の親水性モノマーＩＩが収率８５％で得られた。親水性モノマーＩＩは下記式（１１）で表される化合物である。図４にＮＭＲ測定結果を示す。図４の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図４から、目的のモノマーが合成されていることが分かった。
<Hydrophilic monomer II synthesis>
In a flask purged with nitrogen gas, 1 equivalent of PEG (molecular weight: 2,000 g/mol, degree of polymerization a (constant)) and 2.2 equivalents of Boc-Lys(Cbz)-OH were dissolved in dichloromethane (100 mL). I let it happen. The condensing agent and catalyst were added to the same flask and allowed to react at room temperature for 18 hours. The obtained crude intermediate product was washed with an acidic aqueous solution, a basic aqueous solution, and salt water to obtain an intermediate. By replacing the Boc group, which is a protecting group at both ends of the intermediate, with 2.1 equivalents of p-toluenesulfonic acid under toluene, the Boc group was removed and a p-toluenesulfonate compound was synthesized. . The crude product obtained was purified by precipitation with diethyl ether. Through these operations, a white to yellow waxy hydrophilic monomer II was obtained in a yield of 85%. Hydrophilic monomer II is a compound represented by the following formula (11). Figure 4 shows the NMR measurement results. The vertical axis of FIG. 4 is the relative intensity of the proton signal, and the horizontal axis is the chemical shift (ppm). From FIG. 4, it was found that the target monomer was synthesized.
＜ポリマー重縮合＞
下記一般式（１２）で表される化合物に含まれる、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ））、ポリエーテルエステルアミド（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミド）及びポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）（Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ））は、上述の疎水性モノマーＩ又は親水性モノマーＩと、疎水性モノマーＩＩ又は親水性モノマーＩＩとを重縮合させて得られた。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミドは疎水性モノマーＩ及び親水性モノマーＩＩの重縮合により得られ、下記一般式（１２）におけるｘはｂ（定数）、ｙはｃ（定数）、ｎはｄ（定数）であった。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）は親水性モノマーＩ及び疎水性モノマーＩＩの重縮合により得られ、下記一般式（１２）におけるｘはｅ（定数）、ｙはｆ（定数）、ｎはｇ（定数）であった。Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）は親水性モノマーＩ及び親水性モノマーＩＩの重縮合により得られた。下記一般式（１２）で表される化合物には、疎水性モノマーＩ及び疎水性モノマーＩＩの重縮合により得られた化合物であるポリエステルアミド（Ｃｂｚ－ポリエステルアミド）は含まれない。重縮合は、１当量の疎水性モノマーＩ又は親水性モノマーＩと、１当量の疎水性モノマーＩＩ又は親水性モノマーＩＩとを６０℃のＤＭＳＯ及びＤＭＡｃに溶解させた後、ＴＥＡを加えることで行われた。７０℃で４８時間重縮合反応を行い、透析法で精製して黄色ワックス状のポリマーを得た。
Polyether ester urethane (I) (Cbz-polyether ester urethane (I)), polyether ester amide (Cbz-polyether ester amide), and polyether ester contained in the compound represented by the following general formula (12) Urethane (II) (Cbz-polyetherester urethane (II)) was obtained by polycondensing the above-mentioned hydrophobic monomer I or hydrophilic monomer I and hydrophobic monomer II or hydrophilic monomer II. Cbz-polyetheresteramide is obtained by polycondensation of hydrophobic monomer I and hydrophilic monomer II, and in the following general formula (12), x is b (constant), y is c (constant), and n is d (constant). Met. Cbz-polyetherester urethane (I) is obtained by polycondensation of hydrophilic monomer I and hydrophobic monomer II, and in the following general formula (12), x is e (constant), y is f (constant), and n is g (constant). Cbz-polyetherester urethane (II) was obtained by polycondensation of hydrophilic monomer I and hydrophilic monomer II. The compound represented by the following general formula (12) does not include polyesteramide (Cbz-polyesteramide), which is a compound obtained by polycondensation of hydrophobic monomer I and hydrophobic monomer II. Polycondensation is carried out by dissolving 1 equivalent of hydrophobic monomer I or hydrophilic monomer I and 1 equivalent of hydrophobic monomer II or hydrophilic monomer II in DMSO and DMAc at 60°C, and then adding TEA. I was disappointed. A polycondensation reaction was carried out at 70° C. for 48 hours and purified by dialysis to obtain a yellow waxy polymer.
＜ポリマー側鎖脱保護＞
Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルアミド、Ｃｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）及びＣｂｚ－ポリエステルアミドのＣｂｚ基を酸処理により除去し、各ポリマーを脱保護した。得られた粗生成物を透析法で精製することで黄色ワックス状のポリマーを得た。これらの操作により得られたポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、は実施例であり、下記一般式（１３）で表される繰り返し単位を有する。これらの操作により得られたポリエステルアミドは比較例であり、下記一般式（１３）で表される繰り返し単位を有さない。
The Cbz groups of Cbz-polyetherester urethane (I), Cbz-polyetheresteramide, Cbz-polyetheresterurethane (II), and Cbz-polyesteramide were removed by acid treatment to deprotect each polymer. The obtained crude product was purified by dialysis to obtain a yellow waxy polymer. The polyether ester amide and polyether ester urethane (I) obtained by these operations are examples, and have a repeating unit represented by the following general formula (13). The polyester amide obtained by these operations is a comparative example and does not have a repeating unit represented by the following general formula (13).
＜コンジュゲーション：マレイミド基＞
マレイミド基は、チオール基を有する分子とマイケル反応が可能であり、副生成物が生成されないことと細胞毒性がないこととから、ナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等において広く使用されている。本実施例では、マレイミド基を有するポリマーを製造した。「＜ポリマー側鎖脱保護＞」により得られたポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、ポリエーテルエステルアミド、ポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）及びポリエステルアミドが有するリジン側鎖のフリーのアミンにマレイミド基を導入した。
<Conjugation: maleimide group>
Maleimide groups are capable of Michael reactions with molecules having thiol groups, and are widely used in the fields of nanobio, biomaterials, etc. because no by-products are produced and there is no cytotoxicity. In this example, a polymer having maleimide groups was produced. A maleimide group is introduced into the free amine of the lysine side chain of the polyether ester urethane (I), polyether ester amide, polyether ester urethane (II), and polyester amide obtained by "<Polymer side chain deprotection>" did.
親水性であるポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、ポリエーテルエステルアミド及びポリエーテルエステルウレタン（ＩＩ）にマレイミド基を導入する場合は、まず、これらのポリマーをｐＨ４．５～５のＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）バッファーに溶解させた。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び６－マレイミドヘキサン酸を加え、２４時間撹拌することでマレイミド基の付加反応を行った。反応後、酸水溶液（ｐＨ４．５～５）で透析後、凍結乾燥により白色～黄色のスポンジ状のポリマーを得た。 When introducing maleimide groups into hydrophilic polyether ester urethane (I), polyether ester amide, and polyether ester urethane (II), first, these polymers are treated with MES (2-morpholinol) at pH 4.5 to 5. ethanesulfonic acid) buffer. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC/HCl), N-hydroxysuccinimide (NHS) and 6-maleimidohexanoic acid were added and stirred for 24 hours to carry out the addition reaction of maleimide groups. went. After the reaction, a white to yellow sponge-like polymer was obtained by dialysis with an acid aqueous solution (pH 4.5 to 5) and lyophilization.
疎水性であるポリエステルアミドの場合、まず、ポリエステルアミド及びＮ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）をＤＭＦ及びＤＭＳＯに溶解させた。これらの化合物を２４時間反応させ、透析法により精製させることで、黄色ワックス状のポリマーを得た。 In the case of a hydrophobic polyester amide, the polyester amide and N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide (EMCS) were first dissolved in DMF and DMSO. These compounds were reacted for 24 hours and purified by dialysis to obtain a yellow waxy polymer.
図５に、マレイミド基を導入したポリエーテルエステルアミド（Ｍａｌ－ポリエーテルエステルアミド、ｘ＝ｂ（定数）、ｙ＝ｃ（定数）、ｎ＝ｄ（定数）、疎水性）のＮＭＲ測定結果を示す。図５の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図５に示された各ピークから、目的のポリマーが得られたことが分かった。 Figure 5 shows the NMR measurement results of polyetheresteramide into which a maleimide group has been introduced (Mal-polyetheresteramide, x = b (constant), y = c (constant), n = d (constant), hydrophobicity). show. The vertical axis in FIG. 5 is the relative intensity of the proton signal, and the horizontal axis is the chemical shift (ppm). It was found from each peak shown in FIG. 5 that the desired polymer was obtained.
図６にＧＰＣ（ゲル濾過クロマトグラフィー）による分子量測定結果を示す。図６の縦軸は検出信号強度であり、横軸は溶出時間（分）である。図６の結果及びポリスチレンスタンダードサンプルの検量線を用いて算出した結果から、「＜ポリマー重縮合＞」により得られたＣｂｚ－ポリエーテルエステルアミドの分子量（Ｍｗ）は約３３０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．７５）であり、「＜ポリマー側鎖脱保護＞」により得られたポリエーテルエステルアミドの分子量（Ｍｗ）は約２１０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．３９）であり、Ｍａｌ－ポリエーテルエステルアミドの分子量（Ｍｗ）は約２２０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．３７）であることが分かった。 FIG. 6 shows the results of molecular weight measurement by GPC (gel filtration chromatography). The vertical axis in FIG. 6 is the detected signal intensity, and the horizontal axis is the elution time (minutes). From the results shown in Figure 6 and the results calculated using the calibration curve of the polystyrene standard sample, the molecular weight (Mw) of Cbz-polyetheresteramide obtained by "<polymer polycondensation>" is approximately 33000 g/mol (PDI: 1 .75), and the molecular weight (Mw) of the polyether ester amide obtained by "<polymer side chain deprotection>" is about 21000 g/mol (PDI: 1.39), and the The molecular weight (Mw) was found to be approximately 22000 g/mol (PDI: 1.37).
図７にマレイミド基を導入したポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）（Ｍａｌ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）、ｘ＝ｅ（定数）、ｙ＝ｆ（定数）、ｎ＝ｇ（定数）、親水性）のＮＭＲ測定結果を示す。図７の縦軸はプロトンシグナルの相対強度であり、横軸は化学シフト（ｐｐｍ）である。図７に示された各ピークから、目的のポリマーが得られたことが分かった。 Figure 7 shows polyether ester urethane (I) with maleimide groups introduced (Mal-polyether ester urethane (I), x=e (constant), y=f (constant), n=g (constant), hydrophilicity) The results of NMR measurement are shown. The vertical axis in FIG. 7 is the relative intensity of the proton signal, and the horizontal axis is the chemical shift (ppm). It was found from each peak shown in FIG. 7 that the desired polymer was obtained.
図８にＧＰＣ（ゲル濾過クロマトグラフィー）による分子量測定結果を示す。図８の縦軸は検出信号強度であり、横軸は溶出時間（分）である。図８の結果及びポリスチレンスタンダードサンプルの検量線を用いて算出した結果から、「＜ポリマー重縮合＞」により得られたＣｂｚ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の分子量（Ｍｗ）は約４５０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．９０）であり、「＜ポリマー側鎖脱保護＞」により得られたポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の分子量（Ｍｗ）は約３００００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．４９）であり、Ｍａｌ－ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の分子量（Ｍｗ）は約４００００ｇ／ｍｏｌ（ＰＤＩ：１．４２）であることが分かった。 FIG. 8 shows the results of molecular weight measurement by GPC (gel filtration chromatography). The vertical axis in FIG. 8 is the detected signal intensity, and the horizontal axis is the elution time (minutes). From the results shown in Figure 8 and the results calculated using the calibration curve of the polystyrene standard sample, the molecular weight (Mw) of Cbz-polyetherester urethane (I) obtained by "<polymer polycondensation>" is approximately 45,000 g/mol ( PDI: 1.90), the molecular weight (Mw) of the polyether ester urethane (I) obtained by "<polymer side chain deprotection>" is about 30000 g/mol (PDI: 1.49), and Mal - The molecular weight (Mw) of polyether ester urethane (I) was found to be approximately 40000 g/mol (PDI: 1.42).
＜マレイミド基の反応性確認：チオールを用いたゲル化反応＞
マレイミド基は、チオール基を有する分子とマイケル反応が可能であり、副生成物も生成されないことと細胞毒性がないことから、ナノバイオ分野、バイオマテリアル分野等において広く使用されている。本発明の用途の一例として、マレイミド基を有するポリマー及びジチオール基を両末端に有するペプチドを用いたゲル化検証による反応性を実施した。ゲル化の概念図を図９に示す。
<Confirmation of reactivity of maleimide group: Gelation reaction using thiol>
Maleimide groups are widely used in the fields of nanobio, biomaterials, etc. because they can undergo Michael reactions with molecules having thiol groups, do not produce by-products, and are not cytotoxic. As an example of the application of the present invention, reactivity was tested by gelation verification using a polymer having a maleimide group and a peptide having dithiol groups at both ends. A conceptual diagram of gelation is shown in FIG.
マレイミド基が修飾されたポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を１５、２０又は２５質量／体積％（ｗ／ｖ％）の濃度になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に溶解させ、ｐＨを７～８に調整した。得られた溶液をポリマー溶液とする。ジチオールペプチドは２０ｎＭの濃度になるようにＰＢＳに溶解させ、ｐＨを７～８に調整した。得られた溶液をジチオールペプチド溶液という。本実施形態に使用されたジチオールペプチド配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ａｃ－ＧＣＲＧＧＰＡＧＭＲＧＫＧＲＣＧ－ＮＨ２：配列番号１）である。 Polyether ester urethane (I) modified with maleimide groups is dissolved in phosphate-buffered saline (PBS) to a concentration of 15, 20 or 25% by mass/volume (w/v%). , the pH was adjusted to 7-8. The obtained solution is used as a polymer solution. The dithiol peptide was dissolved in PBS to a concentration of 20 nM, and the pH was adjusted to 7-8. The resulting solution is called a dithiol peptide solution. The dithiol peptide sequence used in this embodiment is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Ac-GCRGGPAGMRGKGRCG-NH 2 :SEQ ID NO: 1).
ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）溶液（ポリマー溶液）、ジチオールペプチド溶液及び溶媒を、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が１：１、２：１、３：１又は４：１になるように混合してゲル前駆体水溶液を得た。室温で、マレイミド基及びチオール基の共有結合を介してゲルを形成させた。図１０にゲルの例の写真を示す。図１０（Ａ）は１５ｗ／ｖ％のポリマー溶液を用いたゲルであり（左からポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が１：１、２：１、３：１及び４：１）、図１０（Ｂ）は２０ｗ／ｖ％のポリマー溶液を用いたゲルであり（左からポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が１：１、２：１、３：１及び４：１）、図１０（Ｃ）は２５ｗ／ｖ％のポリマー溶液を用いたゲルである（左からポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が１：１、２：１、３：１及び４：１）。本実施例では、ポリマー溶液濃度が高いほど、又はゲル前駆体水溶液中のポリマー溶液の体積割合が高いほどゲルの粘度が高くなった。ポリマー溶液濃度が２０ｗ／ｖ％以上の条件並びにポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が３：１又は４：１の条件で、遊動性のないより良好なゲルの形成が可能であった。 Mix polyether ester urethane (I) solution (polymer solution), dithiol peptide solution, and solvent so that the volume ratio of the polymer solution and dithiol peptide solution is 1:1, 2:1, 3:1, or 4:1. A gel precursor aqueous solution was obtained. At room temperature, a gel was formed through the covalent bonding of maleimide and thiol groups. Figure 10 shows a photograph of an example gel. Figure 10(A) shows a gel using a 15 w/v% polymer solution (from the left, the volume ratios of polymer solution and dithiol peptide solution are 1:1, 2:1, 3:1, and 4:1). 10(B) is a gel using a 20 w/v% polymer solution (from the left, the volume ratio of the polymer solution and dithiol peptide solution is 1:1, 2:1, 3:1, and 4:1), FIG. (C) is a gel using a 25 w/v % polymer solution (from the left, the volume ratios of the polymer solution and dithiol peptide solution are 1:1, 2:1, 3:1, and 4:1). In this example, the higher the polymer solution concentration or the higher the volume ratio of the polymer solution in the gel precursor aqueous solution, the higher the gel viscosity. It was possible to form a better gel without mobility under conditions where the polymer solution concentration was 20 w/v % or more and the volume ratio of the polymer solution and dithiol peptide solution was 3:1 or 4:1.
＜ゲルの内部構造画像化＞
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲルの画像を取得した。図１１に、凍結乾燥されたゲルの構造を示す。図１１（Ａ）はポリマー溶液濃度が２０ｗ／ｖ％の条件、並びに、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が３：１の条件で作成したゲル、図１１（Ｂ）はポリマー溶液濃度が２５ｗ／ｖ％の条件、並びに、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比が３：１の条件で作成したゲルを５００倍で撮影した画像であり、ゲルはファイバー及び多数の孔隙で構成され、多数の孔隙はつながった構造であった。
<Imaging internal structure of gel>
Images of polyether ester urethane (I) gels were obtained using scanning electron microscopy (SEM). Figure 11 shows the structure of the lyophilized gel. Figure 11 (A) shows a gel created under the conditions that the polymer solution concentration is 20 w/v% and the volume ratio of the polymer solution and dithiol peptide solution is 3:1, and Figure 11 (B) shows that the polymer solution concentration is 25 w/v%. This is an image taken at 500x magnification of a gel prepared under conditions of /v% and a volume ratio of polymer solution and dithiol peptide solution of 3:1. The pores had a connected structure.
＜細胞培養評価－ゲルの形成無し＞
２４－ウェルプレート（平面底、直径１５．７ｍｍ）に、１ウェルあたり約１００００細胞となるようにＭＳＣを播種した。ウェルには、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を０．１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ、１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ又は１０ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌで含有するＭＳＣ専用培養培地、又は、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）のいずれも含有しないＭＳＣ専用培養培地が事前に入れられていた。通常の細胞増殖培養法にて、７日間又は１４日間継続的に培養した後、ＷＳＴ－１細胞生存度アッセイ及び細胞数計測によりポリマーの細胞毒性が評価された。培養開始から７日目又は１４日目に、ＭＳＣのアクチンファイバーをファロイジン－アクチンで、核をダーピー（ＤＡＰＩ）試薬で染色した後、画像を取得した。取得した画像を図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）に示す。図１２（Ａ）及び（Ｂ）は、ＤＡＰＩで染色された細胞核及びアクチンファイバーであり、得られた画像について、専用セルカウントソフトにより細胞数を計測した。この細胞数測定の結果を、図１２（Ｃ）のグラフに黒三角印で示す。また、培養開始から７日目（Ｄａｙ－７）又は１４日目（Ｄａｙ－１４）に、ウェルにＷＳＴ－１試薬を添加し、プレートの吸光度を観察波長４３８ｎｍで測定した。測定した結果を図１２（Ｃ）に棒グラフとして示す。図１２（Ｂ）の縦軸（左側）は吸光度を示し、縦軸（右側）は細胞数を示す。図１２（Ｃ）の横軸は、培地中のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の含有量を示す。図１２（Ｃ）より、培養開始から１４日目では、ポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）の含有量が０．１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌ及び１ｍｇ／５００μｌ／ｗｅｌｌの場合に、吸光度が高くなることが分かった。これは、本実施例に係るゲルが細胞を好適に捕捉できたためと考えられる。
<Cell culture evaluation - no gel formation>
MSCs were seeded in 24-well plates (flat bottom, 15.7 mm diameter) at approximately 10,000 cells per well. The wells were filled with either MSC-specific culture medium containing polyether ester urethane (I) at 0.1 mg/500 μl/well, 1 mg/500 μl/well, or 10 mg/500 μl/well, or polyether ester urethane (I). A dedicated culture medium for MSCs containing no MSC was added in advance. After continuous culture for 7 or 14 days using conventional cell growth culture methods, the cytotoxicity of the polymer was evaluated by WST-1 cell viability assay and cell counting. On the 7th or 14th day from the start of culture, images were obtained after staining the actin fibers of MSCs with phalloidin-actin and the nuclei with DAPI reagent. The acquired images are shown in FIGS. 12(A) and 12(B). FIGS. 12A and 12B show cell nuclei and actin fibers stained with DAPI, and the number of cells was counted using dedicated cell counting software for the obtained images. The results of this cell count measurement are shown by black triangles in the graph of FIG. 12(C). Furthermore, on the 7th day (Day-7) or 14th day (Day-14) from the start of culture, WST-1 reagent was added to the wells, and the absorbance of the plate was measured at an observation wavelength of 438 nm. The measured results are shown as a bar graph in FIG. 12(C). The vertical axis (left side) of FIG. 12(B) indicates absorbance, and the vertical axis (right side) indicates cell number. The horizontal axis in FIG. 12(C) indicates the content of polyether ester urethane (I) in the medium. From FIG. 12(C), it was found that on the 14th day after the start of culture, the absorbance was higher when the content of polyether ester urethane (I) was 0.1 mg/500 μl/well and 1 mg/500 μl/well. Ta. This is considered to be because the gel according to this example was able to capture cells favorably.
＜細胞培養評価－ゲルの形成有り＞
ＭＳＣ、上述したポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）溶液（ポリマー溶液）及びＭＳＣ専用培養培地をジチオールペプチド（２０ｎＭ）と混合した後（ポリマー溶液濃度＝２５ｗ／ｖ％、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比＝３：１）、低接着性２４－ウェルプレート（平面底、直径１５．７ｍｍ）にゲルを形成させた。１ウェル当たりの細胞数が３０００細胞となるように、最初に混合するＭＳＣの細胞濃度を調整した。ゲル内において３日間ＭＳＣを培養した後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色により細胞生存性を評価した。その結果を図１３（Ａ）に示す。本発明のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を用いた場合、死細胞がほとんど観察されないことが図１３（Ａ）より分かった。
<Cell culture evaluation - gel formation>
After mixing MSC, the above-mentioned polyetherester urethane (I) solution (polymer solution) and MSC-specific culture medium with dithiol peptide (20 nM) (polymer solution concentration = 25 w/v%, volume ratio of polymer solution and dithiol peptide solution) =3:1), the gel was formed in a low-adhesion 24-well plate (flat bottom, 15.7 mm diameter). The cell concentration of MSC to be mixed initially was adjusted so that the number of cells per well was 3000 cells. After culturing MSCs in the gel for 3 days, cell viability was evaluated by LIVE/DEAD staining. The results are shown in FIG. 13(A). It was found from FIG. 13(A) that when the polyether ester urethane (I) of the present invention was used, almost no dead cells were observed.
低接着性２４－ウェルプレート（平面底、直径１５．７ｍｍ）にポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）ゲル（ポリマー溶液濃度＝２５ｗ／ｖ％、ポリマー溶液及びジチオールペプチド溶液の体積比＝３：１）を形成させた後、ゲル表面にＭＳＣを播種した（３０００細胞／ウェル）。３日間培養した後、アクチンファイバーはファロイジン－アクチンで、核はダーピー（ＤＡＰＩ）試薬で染色し細胞の画像を取得した。得られた画像を図１３（Ｂ）に示す。本発明のポリエーテルエステルウレタン（Ｉ）を用いた場合、良好な細胞生存性を示すことが図１３（Ｂ）より分かった。 Polyetherester urethane (I) gel (polymer solution concentration = 25 w/v%, volume ratio of polymer solution and dithiol peptide solution = 3:1) was placed in a low-adhesion 24-well plate (flat bottom, diameter 15.7 mm). After formation, MSCs were seeded on the gel surface (3000 cells/well). After culturing for 3 days, actin fibers were stained with phalloidin-actin and nuclei were stained with DAPI reagent, and images of the cells were obtained. The obtained image is shown in FIG. 13(B). It was found from FIG. 13(B) that when the polyether ester urethane (I) of the present invention was used, good cell viability was exhibited.
Claims (5)
［式中、
複数存在するＲ１は、それぞれ独立して、炭素数２～１２のアルキレン基又は下記式（２）で表される基であり、
Ｒ４は、分子量が２００～５０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシエチレン基であり、
複数存在するＲ２は、それぞれ独立して、前記式（２）で表される基又は下記式（３）で表される基であり、
Ｒ５は、炭素数２～１２のアルキレン基であり、
Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は前記式（２）で表される基であり、
複数存在するＲ３は、それぞれ独立して、アミノ酸の反応性側鎖であり、
前記繰り返し単位中のＲ３の含有量は１．５～２当量であり、
ｘ＋ｙは１であり、
ｘ及びｙはいずれも０より大きい］ A polymer having a molecular weight of 5,000 to 30,000 g/mol and having 2 to 15 repeating units represented by the following formula (1).
[In the formula,
A plurality of R 1s are each independently an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms or a group represented by the following formula (2),
R 4 is a polyoxyethylene group with a molecular weight of 200 to 5000 g/mol,
A plurality of R2 's are each independently a group represented by the above formula (2) or a group represented by the following formula (3),
R 5 is an alkylene group having 2 to 12 carbon atoms,
At least one of R 1 and R 2 is a group represented by the above formula (2),
A plurality of R3s are each independently a reactive side chain of an amino acid,
The content of R 3 in the repeating unit is 1.5 to 2 equivalents,
x+y is 1,
x and y are both greater than 0]
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