JP2023147325A - Novel citric acid producing microorganism and methods for producing citric acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規なクエン酸生産菌を使用したクエン酸の製造方法、及び、該クエン酸生産菌に関する。 The present invention relates to a method for producing citric acid using a novel citric acid-producing bacterium, and to the citric acid-producing bacterium.
クエン酸は、柑橘類などに含まれる有機化合物で、ヒドロキシ酸のひとつである。爽やかな酸味を持つことから食品添加物として多用される。また、クエン酸を摂取すると運動時に嫌気呼吸が起こらないために乳酸が生成されず疲れにくいとされているところから、サプリメントとしても多用される。 Citric acid is an organic compound found in citrus fruits and is a type of hydroxy acid. It is often used as a food additive because of its refreshing sour taste. In addition, citric acid is often used as a supplement because it is said that anaerobic respiration does not occur during exercise, so lactic acid is not produced and fatigue is reduced.
クエン酸は工業的な発酵生産により供給されており、クエン酸発酵生産には、おもにアスペルギルス属の糸状菌（カビ）、おもにクロコウジカビ（Aspergillus section Nigri）の菌株が使用されている。一方、クエン酸生産能力とともに、使用する菌株により最適な培養方法が異なり、実際の生産現場でも、固体培養、半固体培養、および液内振とう培養など様々な培養方法が行われている。 Citric acid is supplied through industrial fermentation production, and strains of Aspergillus section Nigri, which are primarily filamentous fungi (molds) of the genus Aspergillus, are used for citric acid fermentation production. On the other hand, the optimal culture method differs depending on the citric acid production capacity and the strain used, and various culture methods are used in actual production sites, including solid culture, semi-solid culture, and submerged shaking culture.
クエン酸生産菌として、(1)サツマイモデンプン加水分解物を原料として固体培養で収率54％のクエン酸を生産するアスペルギルス・ニガー（非特許文献１）、(2) キャッサババガスを原料として液内培養で収率22.3％のクエン酸を生産するアスペルギルス・ニガー NRRL2001（非特許文献２）、(3)可溶性デンプンを含有する合成培地を用い半固体培養で収率46.3％のクエン酸を生産するアスペルギルス・ニガー GCMC-7（非特許文献３）、(4)サトウキビバガスを原料として固体培養で収率38.1％のクエン酸を生産するアスペルギルス・ニガー DS 1（非特許文献４）、(5)糖蜜を原料として液内培養で収率64.1％のクエン酸を生産するアスペルギルス・ニガー GCMC-7（非特許文献５）、及び、(6)てん菜糖蜜を原料として液内培養で収率70.9％のクエン酸を生産するアスペルギルス・ニガー W5（非特許文献６）等の糸状菌菌株が報告されている。 As citric acid producing bacteria, (1) Aspergillus niger produces citric acid with a yield of 54% in solid culture using sweet potato starch hydrolyzate as a raw material (Non-Patent Document 1), (2) in liquid culture using cassavabaga as a raw material. Aspergillus niger produces citric acid with a yield of 22.3% in culture NRRL2001 (Non-Patent Document 2), (3) Aspergillus produces citric acid with a yield of 46.3% in semi-solid culture using a synthetic medium containing soluble starch - Aspergillus niger GCMC-7 (Non-patent Document 3), (4) Aspergillus niger DS 1, which produces citric acid with a yield of 38.1% in solid culture using sugarcane bagasse as a raw material (Non-patent Document 4), (5) Molasses. Aspergillus niger GCMC-7 (Non-Patent Document 5), which produces citric acid with a yield of 64.1% by submerged culture as a raw material, and (6) citric acid with a yield of 70.9% by submerged culture using sugar beet molasses as a raw material. Filamentous fungal strains such as Aspergillus niger W5 (Non-Patent Document 6) have been reported that produce .
一方、近年、低コスト化や持続可能な生産のため、未利用バイオマス資源からのクエン酸生産が重要となっている。しかし、これらの資源の形状は様々であり、利用する資源により培養方法が異なり、これまでの菌株では培養方法ごとに変更が必要となっていた。また、固体培養（半固体培養を含む）は液体培養に比べて不純物などのストレスの影響が出にくいため、新規な固体培養に適した菌株がとくに重要である。 On the other hand, in recent years, citric acid production from unused biomass resources has become important for cost reduction and sustainable production. However, these resources come in a variety of shapes, and the culture method differs depending on the resource used, and conventional bacterial strains require changes for each culture method. In addition, since solid culture (including semi-solid culture) is less susceptible to stress such as impurities than liquid culture, it is especially important to find strains suitable for new solid culture.
そこで、様々な培養方法で高収率のクエン酸生産が可能な微生物の提供が求められている。 Therefore, there is a need to provide microorganisms that can produce citric acid at high yields using various culture methods.
様々な培養方法で高収率のクエン酸生産が可能な微生物を提供すると供に、該微生物を用いるクエン酸の製造方法を提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to provide a microorganism capable of producing citric acid in high yield by various culture methods, and to provide a method for producing citric acid using the microorganism.
本発明では、様々な培養方法で高収率のクエン酸生産が可能な微生物の探索を行い、アスペルギルス・ラクティコフィアタスWU-2020株による種々の培養方法での高クエン酸生産を達成した。とくに、WU-2020株は固体培養や半固体培養で高い収率でクエン酸生産が可能である。 In the present invention, we searched for microorganisms that can produce citric acid in high yields using various culture methods, and achieved high citric acid production using Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain using various culture methods. In particular, the WU-2020 strain is capable of producing citric acid with high yield in solid culture or semi-solid culture.
具体的には、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受領番号NITE AP-03551で寄託されたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株の培養を行う工程を含む、クエン酸の製造方法を提供する。 Specifically, the present invention provides a method for producing citric acid, which includes a step of culturing Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain, which has been deposited with the National Institute of Technology and Evaluation under receipt number NITE AP-03551. I will provide a.
本発明の製造方法において、前記培養が固体培養であって、前記固体培養における培地の培養基質が、バイオマス原料である場合がある。 In the production method of the present invention, the culture may be a solid culture, and the culture substrate of the medium in the solid culture may be a biomass raw material.
本発明の製造方法において、前記バイオマス原料が、キャッサバ粕と米ぬかとの混合物、トウモロコシ、サトウキビ、小麦、大麦から選択される場合がある。 In the production method of the present invention, the biomass raw material may be selected from a mixture of cassava meal and rice bran, corn, sugar cane, wheat, and barley.
本発明の製造方法において、前記培養が半固体培養であって、前記半固体培養における培地の培養基質の炭素源が、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、セロビオース、キシロビオース、デンプン、可溶性デンプン若しくはキシラン、又はこれらの組合わせから選択される場合がある。 In the production method of the present invention, the culture is a semi-solid culture, and the carbon source of the culture substrate of the medium in the semi-solid culture is glucose, fructose, mannose, xylose, cellobiose, xylobiose, starch, soluble starch or xylan, or a combination thereof.
本発明の製造方法において、前記培養が半固体培養であって、前記半固体培養における培地の担体が、バガス、ワラ、イナワラ、ムギワラ、木綿繊維、濾紙、パルプ、裁断した紙類、ミカン果皮乾燥物（陳皮）、リンゴの果皮及び／又は芯部の乾燥物、グラスウール、若しくは、紡毛糸、又は、これらの組合わせから選択される場合がある。 In the production method of the present invention, the culture is a semi-solid culture, and the carrier of the medium in the semi-solid culture is bagasse, straw, rice straw, wheat straw, cotton fiber, filter paper, pulp, shredded paper, dried tangerine peel. The material may be selected from apple peel, dried apple peel and/or core, glass wool, woolen yarn, or a combination thereof.
本発明の製造方法において、前記培養が液体培養であって、前記液体培養における培地が、SLZ培地である場合がある。 In the production method of the present invention, the culture may be a liquid culture, and the medium in the liquid culture may be an SLZ medium.
本発明の製造方法において、前記培養が液体培養であって、前記液体培養が、増粘剤を添加する工程をさらに含む場合がある。 In the production method of the present invention, the culture may be a liquid culture, and the liquid culture may further include a step of adding a thickener.
本発明の製造方法において、前記増粘剤が、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、カラギーナン、寒天、又はポリエチレンテレフタレートから選択される場合がある。 In the manufacturing method of the present invention, the thickener may be selected from carboxymethyl cellulose, gelatin, carrageenan, agar, or polyethylene terephthalate.
また、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受領番号NITE AP-03551で寄託されたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株を提供する。 The present invention also provides Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain deposited with the National Institute of Technology and Evaluation under receipt number NITE AP-03551.
本発明により、様々な培養方法で高収率のクエン酸生産が可能な微生物を提供すると供に、該微生物を用いるクエン酸の製造方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the present invention, it is possible to provide a microorganism capable of producing citric acid in high yield by various culture methods, and also to provide a method for producing citric acid using the microorganism.
１．クエン酸の製造方法
本発明の実施形態の１つは、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受領番号NITE AP-03551で寄託されたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株の培養を行う工程を含む、クエン酸の製造方法である。
1. Method for producing citric acid One embodiment of the present invention includes the step of culturing Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain deposited with the National Institute of Technology and Evaluation under receipt number NITE AP-03551. , a method for producing citric acid.
そこで本発明では、様々な培養方法で高収率のクエン酸生産が可能な微生物の探索を行い、アスペルギルス・ラクティコフィアタスWU-2020株による固体培養法、半固体培養法及び液体培養法などの種々の培養方法での高クエン酸生産を達成した。とくに、WU-2020株は固体培養や半固体培養で高い収率でクエン酸生産が可能である。 Therefore, in the present invention, we searched for microorganisms that can produce citric acid at high yields using various culture methods, and developed methods such as solid culture method, semi-solid culture method, and liquid culture method using Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain. High citric acid production was achieved using various culture methods. In particular, the WU-2020 strain is capable of producing citric acid with high yield in solid culture or semi-solid culture.
(1) 固体培養によるクエン酸産生
「固体培養法」又は「固体培養」とは、一般に使用される意味で本明細書で使用される。すなわち、固体培養とはその名の通り、少量の水分を含む固体状の物質表面あるいは内部に微生物を生育させる培養法として利用される。
(1) Citric acid production by solid-state culture "Solid-state culture method" or "solid-state culture" is used herein in its commonly used meaning. That is, as the name suggests, solid culture is used as a culture method in which microorganisms are grown on or inside a solid substance containing a small amount of water.
こうした固体培養を産業的に利用しようとした場合、伝統的な醸造食品製造のように培養基質と菌体を含む培養物そのものを利用できる、呼吸のための酸素は大気から直接利用できるため液体培養のような酸素供給のための動力を必要としない。培養基質として安価なバイオマス原料を利用することができ低コスト、低水分のため生産物当たりの培養槽が小さくて済む、といった利点がある。 If we try to use such solid-state culture industrially, we can use the culture itself, including the culture substrate and bacterial cells, as in traditional brewed food production, or we can use liquid culture because oxygen for respiration can be used directly from the atmosphere. It does not require power for oxygen supply such as. This method has the advantage of being able to use inexpensive biomass raw materials as the culture substrate, requiring only a small culture tank per product due to its low cost and low moisture content.
本明細書において、「バイオマス原料」とは、一般に使用される意味で本明細書で使用される。すなわち、動植物から生まれた、再利用可能な有機性の資源（石油などの化石燃料を除く）のことを言う。一般には、主に木材、海草、生ゴミ、紙、動物の死骸・ふん尿、プランクトンなどを指す。 As used herein, "biomass feedstock" is used herein in its commonly used meaning. In other words, it refers to reusable organic resources (excluding fossil fuels such as oil) derived from plants and animals. In general, it mainly refers to wood, seaweed, garbage, paper, animal carcasses/feces, plankton, etc.
本発明の製造方法において、前記培養が固体培養のとき、前記固体培養における培地の培養基質の例として、バイオマス原料である場合がある。 In the production method of the present invention, when the culture is a solid culture, an example of the culture substrate of the medium in the solid culture may be a biomass raw material.
本発明において、前記バイオマス原料の例としては、キャッサバ粕と米ぬかとの混合物、トウモロコシ、サトウキビ、小麦、大麦から選択できる。 In the present invention, examples of the biomass raw material can be selected from a mixture of cassava meal and rice bran, corn, sugar cane, wheat, and barley.
(2) 半固体培養によるクエン酸産生
本明細書において、「半固体培養法」又は「半固体培養」とは、一般に使用される意味で使用される。すなわち、半固体培養は、担体に液体培地を含浸させたものを半固体培地として用いて培養することを言う。
(2) Citric acid production by semi-solid culture In this specification, "semi-solid culture method" or "semi-solid culture" are used in the commonly used meaning. That is, semi-solid culture refers to culturing using a carrier impregnated with a liquid medium as a semi-solid medium.
半固体培養を用いたクエン酸の製造に用いる培地は、グルコースが230g/Lまでの糖濃度でクエン酸を生産可能である。 The medium used for producing citric acid using semi-solid culture is capable of producing citric acid at sugar concentrations up to 230g/L of glucose.
また、半固体培養を用いたクエン酸の製造に用いる培地の炭素源の例としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、セロビオース、キシロビオース、デンプン、可溶性デンプン若しくはキシラン、又はこれらの組合わせなどが利用可能である。 Examples of carbon sources for the medium used in the production of citric acid using semi-solid culture include glucose, fructose, mannose, xylose, cellobiose, xylobiose, starch, soluble starch or xylan, or a combination thereof. It is possible.
また、半固体培養を用いたクエン酸の製造に用いる培地の塩類の組成の例としては、無機窒素塩については、硫酸アンモニウムをはじめアンモニウム塩などが利用可能である。 Furthermore, as an example of the composition of salts in a medium used for producing citric acid using semi-solid culture, ammonium salts such as ammonium sulfate can be used as inorganic nitrogen salts.
また、半固体培養を用いたクエン酸の製造に用いる培地のｐHとしては、2.70～5.70の間で利用可能である。 Furthermore, the pH of the medium used for producing citric acid using semi-solid culture can be between 2.70 and 5.70.
また、半固体培養を用いたクエン酸の製造に用いる培地の担体の例としては、バガス、ワラ（イナワラ、ムギワラ、他）、木綿繊維、濾紙やパルプ、新聞紙などの紙類の裁断したもの、ミカン果皮乾燥物（陳皮）、リンゴ果皮や芯部の乾燥物、グラスウール若しくは紡毛糸、又はこれらの組合わせなどが利用可能である。 In addition, examples of carriers for the culture medium used in the production of citric acid using semi-solid culture include bagasse, straw (rice straw, wheat straw, etc.), cotton fiber, filter paper, pulp, shredded paper such as newspaper, Dried mandarin peel, dried apple peel or core, glass wool or woolen yarn, or a combination thereof can be used.
(3) 液体培養によるクエン酸産生
本明細書において、「液体培養法」又は「液体培養」とは一般に使用される意味で使用される。すなわち、液体培養は、主に微生物を、炭素源、窒素源、塩類などの生育に必要な物質を含む水溶液（培養液）で培養する手法であり、培養液を寒天などで固化した固体培養に対する用語として使用される。
(3) Citric acid production by liquid culture In this specification, "liquid culture method" or "liquid culture" is used in the commonly used meaning. In other words, liquid culture is a method of culturing microorganisms mainly in an aqueous solution (culture solution) containing substances necessary for growth such as carbon sources, nitrogen sources, and salts. used as a term.
本発明の製造方法において、前記培養が液体培養であって、前記液体培養における培地の例として、SLZ培地を使用できる。 In the production method of the present invention, the culture is a liquid culture, and as an example of a medium in the liquid culture, an SLZ medium can be used.
本発明の製造方法において、前記培養が液体培養であって、前記液体培養が、増粘剤を添加する工程をさらに含むことができる。 In the production method of the present invention, the culture may be a liquid culture, and the liquid culture may further include a step of adding a thickener.
本発明の製造方法において、前記増粘剤の例として、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、カラギーナン、寒天、及びポリエチレンテレフタレートを挙げることができる。 In the production method of the present invention, examples of the thickener include carboxymethyl cellulose, gelatin, carrageenan, agar, and polyethylene terephthalate.
増粘剤濃度としては、1.0～10.0 g/Lで利用可能であり、2.0～6.0 g/Lが好適である。 The thickener concentration can be used in a range of 1.0 to 10.0 g/L, preferably 2.0 to 6.0 g/L.
２．アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株
本発明のもう１つの実施形態は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受領番号NITE AP-03551で寄託されたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株である。
2. Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain Another embodiment of the present invention is the Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain deposited with the National Institute of Technology and Evaluation under receipt number NITE AP-03551.
本発明に係る微生物は、アスペルギルス・ラクティコフィアタスに帰属すると推定されるものであり、株名はWU-2020株である。また、本発明に係る微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（〒292-0 818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受領されており、その受領番号はNITE AP-03551である。 The microorganism according to the present invention is estimated to belong to Aspergillus lacticofiatus, and the strain name is WU-2020. In addition, the microorganism according to the present invention has been received by the Patent Organism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0 818). The number is NITE AP-03551.
なお、本発明に係る微生物については、高いクエン酸産生能力を有しつつ、紫外線照射や放射線照射などの公知の手法にて変異をさせた変異株や、自然界において変異した変異株も含まれるものである。 In addition, the microorganisms according to the present invention include mutant strains that have a high citric acid production ability but have been mutated by known methods such as ultraviolet irradiation or radiation irradiation, and mutant strains that have mutated in nature. It is.
本発明のアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株を用いることによって、固体培養、半固体培養又は液体培養などの各種培養条件で、高い収率でクエン酸を産生することができる。 By using the Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain of the present invention, citric acid can be produced in high yield under various culture conditions such as solid culture, semi-solid culture, or liquid culture.
以下、実施例で詳細に説明する。なお、本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。 Examples will be described in detail below. All documents mentioned in this specification are incorporated by reference in their entirety. The examples described herein are illustrative of embodiments of the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention.
＜クエン酸産生菌の単離＞
日本各地から採取した土壌を試料としてクエン酸生産菌、とくに糸状菌を探索した。
<Isolation of citric acid producing bacteria>
We searched for citric acid-producing bacteria, especially filamentous fungi, using soil samples collected from various parts of Japan.
分離用培地としては、下記の選択用寒天培地Aと選択用寒天培地Bを使用した。改変CD培地は、Czapek-Dox最少培地の炭素源をグルコース30 g/Lから90 g/Lに替えたもので、以下の組成である。グルコース 90 g、硝酸ナトリウム 2 g、リン酸二水素カリウム 1 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.5 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、塩化カリウム 0.5 gを 1 Lのイオン交換水に溶解したもの。塩酸でpHを6.0に調整した。この改変CD培地に、寒天 20 g/Lとなるように添加したものを選択用寒天培地Aと称する。 As the separation medium, the following selective agar medium A and selective agar medium B were used. The modified CD medium is a Czapek-Dox minimal medium in which the carbon source is changed from 30 g/L to 90 g/L glucose, and has the following composition. 90 g of glucose, 2 g of sodium nitrate, 1 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g of magnesium sulfate heptahydrate, 0.01 g of iron sulfate heptahydrate, and 0.5 g of potassium chloride dissolved in 1 L of ion-exchanged water. . The pH was adjusted to 6.0 with hydrochloric acid. This modified CD medium to which agar was added at a concentration of 20 g/L is referred to as selection agar medium A.
選択用寒天培地Bとしては、改変SLZ培地に寒天 30 g/Lを添加して凝固させたものを使用した。すなわち、SLZ培地の各成分を2倍濃度とし（グルコース濃度240 g/L；終濃度120 g/L）、オートクレーブで蒸気滅菌した後、クエン酸 50 g/Lを添加した。この500 mLを約40 ℃まで冷却した（A溶液）。一方、寒天 60 gを1 Lのイオン交換水に懸濁し、オートクレーブで蒸気滅菌した後、約40 ℃まで冷却した（B寒天懸濁液）。A溶液5 mLとB寒天懸濁液 5 mLを約40 ℃で混合し、内径15 cmのシャーレ（ペトリ皿）に入れ、常温で固化させた。これを選択用寒天培地Bと称する。SLZ培地の組成は、グルコース 120 g/L、硫酸アンモニウム 3 g/L、リン酸二水素カリウム 1 g/L、リン酸水素二カリウム 1 g/L、硫酸マグネシウム七水和物 0.50 g/L、硫酸マンガン五水和物 0.22 g/L、塩化鉄六水和物 0.010 g/L、塩化亜鉛 0.075 mg/Lから成り、pHを3.0に調整したものである。 As selection agar medium B, a modified SLZ medium with 30 g/L of agar added and solidified was used. That is, each component of the SLZ medium was doubled in concentration (glucose concentration: 240 g/L; final concentration: 120 g/L), and after steam sterilization in an autoclave, 50 g/L of citric acid was added. This 500 mL was cooled to about 40°C (solution A). On the other hand, 60 g of agar was suspended in 1 L of ion-exchanged water, steam sterilized in an autoclave, and then cooled to approximately 40°C (Agar suspension B). 5 mL of solution A and 5 mL of agar suspension B were mixed at approximately 40 °C, placed in a Petri dish with an inner diameter of 15 cm, and solidified at room temperature. This is called selection agar medium B. The composition of SLZ medium is glucose 120 g/L, ammonium sulfate 3 g/L, potassium dihydrogen phosphate 1 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 0.50 g/L, sulfuric acid. It consists of manganese pentahydrate 0.22 g/L, iron chloride hexahydrate 0.010 g/L, and zinc chloride 0.075 mg/L, and the pH was adjusted to 3.0.
20 mL容量の試験管に生理食塩水 5 mLを分注し、0.01 g の土壌を添加した。ボルテックスミキサーで回転振とうしながら3分間撹拌し、5分間静置し、上部の懸濁液0.1 mLを上述の選択用寒天培地Aに接種した。30 ℃で7日間静置培養し、出現した集落を選択用寒天培地Aに移植した。移植した選択用寒天培地A上でさらに7日間静置培養し、黒い胞子を付ける糸状菌（カビ）を選択した。純粋分離するため、取得した糸状菌の胞子を白金耳で採取し、生理食塩水に懸濁し、この懸濁液0.1 mLを通常のCzapek-Dox寒天培地（注：グルコース 30 g/L）に接種し、7日間静置培養して単一の集落を分離した。この操作をさらに2回繰り返し、純粋分離の操作を行った糸状菌として100株を取得し、さらにつぎの選択試験に供した。 5 mL of physiological saline was dispensed into a 20 mL test tube, and 0.01 g of soil was added. The mixture was stirred for 3 minutes while rotating with a vortex mixer, left to stand for 5 minutes, and 0.1 mL of the upper suspension was inoculated onto the selective agar medium A described above. After static culture at 30°C for 7 days, the colonies that appeared were transplanted to selective agar medium A. The cells were further cultured for 7 days on the transplanted selective agar medium A, and filamentous fungi (molds) that produced black spores were selected. For pure isolation, the obtained filamentous fungal spores were collected with a platinum loop, suspended in physiological saline, and 0.1 mL of this suspension was inoculated onto a regular Czapek-Dox agar medium (note: glucose 30 g/L). Then, a single colony was isolated by static culture for 7 days. This operation was repeated two more times to obtain 100 strains of filamentous fungi that had undergone pure isolation and were further subjected to the next selection test.
純粋分離の操作を行った糸状菌の胞子を白金耳で採取し、生理食塩水に懸濁し、この懸濁液0.1 mLを選択用寒天培地Bに接種した。30 ℃で3日間静置培養し、集落を形成するものとして20株を選択した。さらに、選択した20株について、通常のCzapek-Dox寒天培地（注：グルコース 30 g/L）に接種して30 ℃で7日間静置培養した。培養後、形成された胞子を白金耳で採取し、生理食塩水に懸濁し、この懸濁液0.1 mLを選択用寒天培地Bに接種した。30 ℃で3日間静置培養し、集落を形成するものとして10株を選択した。 The spores of the filamentous fungi that had been purified were collected using a platinum loop, suspended in physiological saline, and 0.1 mL of this suspension was inoculated onto selective agar medium B. After static culture at 30°C for 3 days, 20 strains were selected to form colonies. Furthermore, the 20 selected strains were inoculated onto a regular Czapek-Dox agar medium (note: glucose 30 g/L) and statically cultured at 30°C for 7 days. After culturing, the formed spores were collected with a platinum loop, suspended in physiological saline, and 0.1 mL of this suspension was inoculated onto selective agar medium B. After static culture at 30°C for 3 days, 10 strains were selected to form colonies.
選択した10株をについて、バガスを担体としたクエン酸生産試験を行い、グルコースやスクロースで収率50%以上のクエン酸生産量を示す株として、WU-2020株を選択した。 A citric acid production test was conducted using bagasse as a carrier for the 10 selected strains, and strain WU-2020 was selected as a strain that produced citric acid with a yield of 50% or more using glucose or sucrose.
WU-2020株はアスペルギルス属糸状菌の形態を示し、黒い胞子（分生子）形成することから、アスペルギルス・セクション・ニグリ（Aspergillus Section Nigri、クロコウジカビ）に属すると考えられた。 Since the WU-2020 strain exhibited the morphology of a filamentous fungus of the genus Aspergillus and formed black spores (conidia), it was considered to belong to Aspergillus section nigri (Aspergillus section nigri, Aspergillus niger).
さらに、WU-2020株については常法に従いゲノムDNAを抽出し、rDNA-ITS、β-tubulin遺伝子およびcalmodulin遺伝子の領域をPCRで増幅し、その塩基配列を決定した。以上の三つの遺伝子の部分的な塩基配列を他のアスペルギルス・セクション・ニグリに属する標準株の同遺伝子の配列と比較することで、アスペルギルス・ラクティコフィアタス（Aspergillus lacticoffeatus）と同定された（図１参照）。 Furthermore, for the WU-2020 strain, genomic DNA was extracted according to a conventional method, the rDNA-ITS, β-tubulin gene, and calmodulin gene regions were amplified by PCR, and the nucleotide sequence was determined. By comparing the partial nucleotide sequences of the above three genes with the sequences of the same genes of standard strains belonging to other Aspergillus section nigri, Aspergillus lacticoffeatus was identified (Figure 1 reference).
＜固体培養によるクエン酸生産＞
アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020の固体培養によるクエン酸生産を以下の通り行った。
<Citric acid production by solid-state culture>
Citric acid production by solid culture of Aspergillus lacticofiatus WU-2020 was carried out as follows.
乾燥キャッサバ粕に対して、5倍重量の水を加え、1日静置する。ろ紙（Whatman No.4）を用いて、ろ液が出なくなるまで吸引ろ過を行い、水分添加キャッサバ粕とする。プラスティック製タッパーに水分添加キャッサバ粕300 gと米ぬか30 gを混合し、110℃、15分間オートクレーブ滅菌し、固体培地とする。合成斜面培地にて形成させたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020の分生子を白金耳にて収集し（約1×106個）、純水 1mLに懸濁して分生子懸濁液を作製する。固体培地50 g当たり、分生子懸濁液を１ ｍｌ 植菌し、30℃で３日間培養する。培養後、当初の固体培地の重量に対して5倍容量の純水を用いて、15分間撹拌して抽出液を作製する。抽出液中のクエン酸濃度をクエン酸定量キット（Ｆキット、ロッシュ・ダイアグノスティクス）を用いて分析する。 Add 5 times the weight of water to the dried cassava meal and let it stand for a day. Using filter paper (Whatman No. 4), perform suction filtration until no filtrate comes out, and obtain water-added cassava meal. Mix 300 g of water-added cassava meal and 30 g of rice bran in a plastic Tupperware, sterilize in an autoclave at 110°C for 15 minutes, and prepare a solid medium. Collect conidia of Aspergillus lacticofiatus WU-2020 formed in a synthetic slant medium using a platinum loop (approximately 1 x 106 conidia) and suspend in 1 mL of pure water to create a conidial suspension. Inoculate 1 ml of the conidial suspension per 50 g of solid medium and culture at 30°C for 3 days. After culturing, use 5 times the volume of pure water relative to the weight of the original solid medium and stir for 15 minutes to prepare an extract. The citric acid concentration in the extract is analyzed using a citric acid quantitative kit (F kit, Roche Diagnostics).
培地組成は以下の通りである。合成斜面培地はグルコース 90 g/L、硝酸アンモニウム 2 g/L、リン酸二水素カリウム 10g/L、硫酸マグネシウム七水和物 0.5 g/L、硫酸マンガン五水和物 0.022 g/L、硫酸銅五水和物 0.01 g/L、アガー 30 g/Lから成り、pH を6.0 に調整したものである。 The medium composition is as follows. The synthetic slant medium contains glucose 90 g/L, ammonium nitrate 2 g/L, potassium dihydrogen phosphate 10 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g/L, manganese sulfate pentahydrate 0.022 g/L, copper sulfate pentahydrate. It consists of 0.01 g/L of hydrate and 30 g/L of agar, and the pH was adjusted to 6.0.
培養３日における抽出液中のクエン酸濃度を決定した結果、乾燥キャッサバ粕重量1 kg当たり、360 gのクエン酸生産量であった。キャッサバ粕などの未利用バイオマスからの固体培養によるクエン酸生産は過去に報告がない。 As a result of determining the citric acid concentration in the extract after 3 days of culture, the production amount of citric acid was 360 g per 1 kg of dry cassava meal weight. There have been no reports of citric acid production by solid culture from unused biomass such as cassava meal.
＜半固体培養によるクエン酸生産＞
アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020およびアスペルギルス・ラクティコフィアタスCBS101833（注：菌株保存機関におけるアスペルギルス・ラクティコフィアタスの type culture=基準株、菌株保存機関IFMより分譲）の半固体培養によるクエン酸生産を以下の通り行った。
<Citric acid production by semi-solid culture>
Citric acid production by semi-solid culture of Aspergillus lacticofiatus WU-2020 and Aspergillus lacticofiatus CBS101833 (note: type culture = reference strain of Aspergillus lacticofiatus at a strain repository, provided by IFM, a strain repository) I went as follows.
合成斜面培地にて形成させたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020あるいはアスペルギルス・ラクティコフィアタス CBS101833の分生子を白金耳にて収集し（約1×106個）、SS培地 1mLに懸濁して分生子懸濁液を作製する。つぎに、分生子懸濁液を15 mLのSS培地を含むバガス（担体）に接種し、30℃で3日間静置して培養する。所定日数培養後にバガスを200mLの温水（60℃）に懸濁し、15分間攪拌する。上記の懸濁液をろ紙（Whatman No.4）にてろ過し、ろ液をクエン酸発酵液とする。 Conidia of Aspergillus lacticofiatus WU-2020 or Aspergillus lacticofiatus CBS101833 formed in a synthetic slant medium were collected using a platinum loop (approximately 1 × 10 6 conidia), suspended in 1 mL of SS medium, and separated. Prepare a live spore suspension. Next, the conidial suspension is inoculated into bagasse (carrier) containing 15 mL of SS medium, and cultured at 30°C for 3 days. After culturing for the specified number of days, suspend the bagasse in 200 mL of warm water (60°C) and stir for 15 minutes. The above suspension is filtered through filter paper (Whatman No. 4), and the filtrate is used as a citric acid fermentation liquid.
培地組成は以下の通りである。合成斜面培地は実施例２に記載の培地組成と同一である。培養試験のためのSS培地はグルコース 140 g/L、硝酸アンモニウム 2 g/L、リン酸二水素カリウム 10 g/L、硫酸マグネシウム七水和物 0.25 g/L、硫酸マンガン五水和物 0.22 g/L,塩化鉄六水和物 0.020 g/Lから成り、pHを4.25に調整したものである。また、培養に用いたバガスは、ふるいを使用して600 μm-250 μmで分級したもの（短い枝状のもの）を2.6 g、250 μm以下で分級したもの（粉状のもの）を1.3 g混合して使用した。同様に、グルコースの代わりに、スクロース、マルトースを用いて半固体培養によるクエン酸生産を行った。 The medium composition is as follows. The synthetic slant medium has the same medium composition as described in Example 2. The SS medium for the culture test contains glucose 140 g/L, ammonium nitrate 2 g/L, potassium dihydrogen phosphate 10 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 0.25 g/L, manganese sulfate pentahydrate 0.22 g/L. L, iron chloride hexahydrate 0.020 g/L, pH adjusted to 4.25. In addition, the bagasse used for culture was 2.6 g of bagasse that was classified using a sieve at 600 μm to 250 μm (short branch-like items), and 1.3 g of bagasse that was classified at 250 μm or less (powder type). They were mixed and used. Similarly, citric acid was produced by semi-solid culture using sucrose and maltose instead of glucose.
アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020およびアスペルギルス・ラクティコフィアタスCBS101833（基準株）のクエン酸発酵液中のクエン酸生産量をHPLC分析により決定した。結果を表１に示す。表１に示すように、アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020は、アスペルギルス・ラクティコフィアタス CBS101833（基準株）に比べ、高いクエン酸生産能力を示した。
＜液体培養によるクエン酸生産＞
アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020の液体培養によるクエン酸生産を以下の通り行った。
<Citric acid production by liquid culture>
Citric acid production by liquid culture of Aspergillus lacticofiatus WU-2020 was carried out as follows.
麹汁寒天培地にて形成した供試菌分生子を0.8% (v/v) のTween 80に懸濁し、分生子濃度3×108 個/mLに調製して分生子懸濁液を作製した。つぎに、500 mL容肩付きフラスコ（坂口フラスコ）に分注した60 mLのSLZ培地（組成は実施例１に記載）に上記の分生子懸濁液を1 mL接種し、30℃、120 rpmの往復振盪にて12日間培養した。培養液1 mLを分取し、15000 rpm、15分で遠心分離して得られた上清液をクエン酸発酵液とした。 Conidia of the test bacteria formed on a koji juice agar medium were suspended in 0.8% (v/v) Tween 80, and the conidia concentration was adjusted to 3 x 108 cells/mL to prepare a conidial suspension. Next, 1 mL of the above conidia suspension was inoculated into 60 mL of SLZ medium (composition is described in Example 1) dispensed into a 500 mL shoulder flask (Sakaguchi flask), and the mixture was incubated at 30°C and 120 rpm. The cells were cultured for 12 days with reciprocal shaking. 1 mL of the culture solution was collected and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and the resulting supernatant was used as a citric acid fermentation solution.
アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020のクエン酸発酵液中のクエン酸生産量をHPLC分析により決定した。アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020は液体培養において、15.4 g/Lのクエン酸を生産した。半固体培養に比べクエン酸生産能力は低いものの、液体培養でもクエン酸生産が可能であった。 The amount of citric acid produced in the citric acid fermentation broth of Aspergillus lacticofiatus WU-2020 was determined by HPLC analysis. Aspergillus lacticofiatus WU-2020 produced 15.4 g/L citric acid in liquid culture. Although the citric acid production capacity was lower than that of semi-solid culture, citric acid production was also possible with liquid culture.
実施例４の液体培養において、炭素源として可溶性デンプンを使用した場合には、52.0 g/Lのクエン酸を生産した。この値は、グルコースを使用した場合より高い生産量であった。可溶性デンプンを使用した培地のように、培地の粘性が高い場合には、クエン酸生産能力が高くなる傾向が認められた。そこで、半固体培養の場合と同程度の高いクエン酸生産量を達成させるために、液体培地中に増粘剤としてカルボキシメチルセルロース（CMC、終濃度2.5 mg/mL）を添加して、アスペルギルス・ラクティコフィアタスWU-2020のクエン酸生産を行った。 In the liquid culture of Example 4, when soluble starch was used as the carbon source, 52.0 g/L of citric acid was produced. This value was a higher production than when using glucose. It was observed that when the viscosity of the medium was high, such as a medium using soluble starch, the citric acid production capacity tended to be high. Therefore, in order to achieve the same high citric acid production as in the case of semi-solid culture, carboxymethylcellulose (CMC, final concentration 2.5 mg/mL) was added as a thickener to the liquid medium, and Aspergillus lacti Citric acid production of Coffiatus WU-2020 was carried out.
増粘剤を添加した以外、培養方法は実施例４と同様に行った。結果を表２に示す。表２に示すように、増粘剤を添加することで、アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020は、液体培養でも高いクエン酸生産が可能である。
具体的には、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託番号NITE P-03551で寄託されたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株の培養を行う工程を含む、クエン酸の製造方法を提供する。
Specifically, the present invention provides a method for producing citric acid, which includes a step of culturing Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain, which has been deposited with the National Institute of Technology and Evaluation under accession number NITE P-03551. I will provide a.
また、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託番号NITE P-03551で寄託されたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株を提供する。
The present invention also provides Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain deposited with the National Institute of Technology and Evaluation under accession number NITE P-03551 .
１．クエン酸の製造方法
本発明の実施形態の１つは、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託番号NITE P-03551で寄託されたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株の培養を行う工程を含む、クエン酸の製造方法である。
1. Method for producing citric acid One embodiment of the present invention includes the step of culturing Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain deposited with the National Institute of Technology and Evaluation under accession number NITE P-03551. , a method for producing citric acid.
２．アスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株
本発明のもう１つの実施形態は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託番号NITE P-03551で寄託されたアスペルギルス・ラクティコフィアタス WU-2020株である。
2. Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain Another embodiment of the present invention is the Aspergillus lacticofiatus WU-2020 strain deposited with the National Institute of Technology and Evaluation under accession number NITE P-03551 .
本発明に係る微生物は、アスペルギルス・ラクティコフィアタスに帰属すると推定されるものであり、株名はWU-2020株である。また、本発明に係る微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（〒292-0 818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に寄託されており、その受託番号はNITE P-03551である。
The microorganism according to the present invention is estimated to belong to Aspergillus lacticofiatus, and the strain name is WU-2020. In addition, the microorganism according to the present invention has been deposited at the Patent Organism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture , 292-0 818). The number is NITE P-03551 .
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