JP2023145568A5 - - Google Patents
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- 複数の細胞内のRNA分子を固有に標識化する方法であって、
(a)ステップ(b)の前に第1の複数の細胞を固定および透過処理するステップであって、前記第1の複数の細胞は、約4℃以下で固定および透過処理されるステップ;
(b)前記第1の複数の細胞内で前記RNA分子を逆転写して、前記第1の複数の細胞内で相補的DNA(cDNA)分子を形成するステップであって、前記RNA分子を逆転写するステップは、プライマーを前記RNA分子にカップリングするステップを含み、前記プライマーは、ポリ(T)配列またはランダム配列の少なくとも1つを含むステップ;
(c)cDNA分子を含む前記第1の複数の細胞を少なくとも2つの一次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも2つの一次アリコートは、第1の一次アリコートおよび第2の一次アリコートを含むステップ;
(d)一次核酸タグを前記少なくとも2つの一次アリコートに提供するステップであって、前記第1の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグは、前記第2の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグとは異なるステップ;
(e)前記少なくとも2つの一次アリコートの各々の内の前記cDNA分子を、提供された前記一次核酸タグとカップリングするステップ;
(f)前記少なくとも2つの一次アリコートを組み合わせるステップ;
(g)組み合わせた前記一次アリコートを少なくとも2つの二次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも2つの二次アリコートは、第1の二次アリコートおよび第2の二次アリコートを含むステップ;
(h)二次核酸タグを前記少なくとも2つの二次アリコートに提供するステップであって、前記第1の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグは、前記第2の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグとは異なるステップ;
(i)前記少なくとも2つの二次アリコートの各々の内の前記cDNA分子を、提供された前記二次核酸タグとカップリングするステップ;
(j)最終アリコートを組み合わせるステップ;
(k)前記第1の複数の細胞を溶解して、前記第1の複数の細胞内から前記cDNA分子を放出させて、ライセートを形成するステップ;ならびに
(l)プロテアーゼ阻害剤および結合剤を前記ライセートに添加し、前記cDNA分子が前記結合剤に結合するようにするステップ
を含む方法。 - ステップ(k)の前に、組み合わせた前記最終アリコートを少なくとも2つの最終アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも2つの最終アリコートは、第1の最終アリコートおよび第2の最終アリコートを含むステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)または4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩(AEBSF)を含む、請求項1または2に記載の方法。
- (m)前記結合剤に結合した前記cDNA分子のテンプレートスイッチを実行するステップ;
(n)前記cDNA分子を増幅して、増幅cDNA分子溶液を形成するステップ;および
(o)固相可逆的固定化(SPRI)ビーズ溶液を前記増幅cDNA分子溶液に導入するステップであって、SPRIビーズ溶液対増幅cDNA分子溶液の比は約0.7:1または0.8:1であるステップ
をさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記共通アダプター配列は、テンプレートスイッチを行うことにより、放出された前記cDNA分子の前記3’末端に付加される、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)の前記プライマーは、第1の特異的バーコードをさらに含み、前記方法は、
(p)第2の複数の細胞内でRNA分子を逆転写して、前記第2の複数の細胞内でcDNA分子を形成するステップであって、前記RNA分子を逆転写するステップは、特異的プライマーを前記RNA分子にカップリングするステップを含み、前記プライマーは、第2の特異的バーコードと、ポリ(T)配列またはランダム配列の少なくとも1つとを含み、前記第1の特異的バーコードは、前記第1の複数の細胞に由来する前記cDNA分子を、前記第2の複数の細胞に由来する前記cDNA分子と比較して識別することができるように、前記第2の特異的バーコードとは異なるステップ;
(q)cDNA分子を含む前記第2の複数の細胞を少なくとも2つの一次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも2つの一次アリコートは、第1の一次アリコートおよび第2の一次アリコートを含むステップ;
(r)一次核酸タグを前記少なくとも2つの一次アリコートに提供するステップであって、前記第1の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグは、前記第2の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグとは異なるステップ;
(s)前記少なくとも2つの一次アリコートの各々の内の前記cDNA分子を、提供された前記一次核酸タグとカップリングするステップ;
(t)前記少なくとも2つの一次アリコートを組み合わせるステップ;
(u)組み合わせた前記一次アリコートを少なくとも2つの二次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも2つの二次アリコートは、第1の二次アリコートおよび第2の二次アリコートを含むステップ;
(v)二次核酸タグを前記少なくとも2つの二次アリコートに提供するステップであって、前記第1の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグは、前記第2の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグとは異なるステップ;ならびに
(w)前記少なくとも2つの二次アリコートの各々の内の前記cDNA分子を、提供された前記二次核酸タグとカップリングするステップ
をさらに含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記核酸タグの各々は、
3’末端および5’末端を含むバーコード配列、ならびに
前記バーコード配列の前記3’末端および前記5’末端にそれぞれ隣接する3’ハイブリダイゼーション配列および5’ハイブリダイゼーション配列
を含む第1の鎖;ならびに
前記5’ハイブリダイゼーション配列および前記アダプター配列の少なくとも1つに相補的な第1の部分、ならびに
前記3’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第2の部分
を含む第2の鎖
を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。 - 前記cDNA分子に結合している前記核酸タグの少なくとも2つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ライゲーションは、前記第1の複数の細胞内で実施される、請求項8に記載の方法。
- 放出された前記cDNA分子に結合している前記核酸タグの少なくとも2つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
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2024
- 2024-02-16 AU AU2024201002A patent/AU2024201002A1/en active Pending
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