JP2023134519A - 改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質 - Google Patents

改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質 Download PDF

Info

Publication number
JP2023134519A
JP2023134519A JP2023104857A JP2023104857A JP2023134519A JP 2023134519 A JP2023134519 A JP 2023134519A JP 2023104857 A JP2023104857 A JP 2023104857A JP 2023104857 A JP2023104857 A JP 2023104857A JP 2023134519 A JP2023134519 A JP 2023134519A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
host cell
leishmania
target protein
sialyltransferase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023104857A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2023134519A5 (ja
Inventor
ファリドモアイエル アミルレザ
Faridmoayer Amirreza
マリー マヌエラ
Mally Manuela
フォランダー レイナー
Follador Rainer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Limmatech Biologics AG
Original Assignee
Limmatech Biologics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Limmatech Biologics AG filed Critical Limmatech Biologics AG
Publication of JP2023134519A publication Critical patent/JP2023134519A/ja
Publication of JP2023134519A5 publication Critical patent/JP2023134519A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
    • C12N1/105—Protozoal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/05—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a GOLGI retention signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/90—Protozoa ; Processes using protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01003—Glucosamine N-acetyltransferase (2.3.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01022—Lactose synthase (2.4.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01101—Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.101)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01143—Alpha-1,6-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.143)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C12Y204/99006—N-Acetyllactosaminide alpha-2,3-sialyltransferase (2.4.99.6)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

【課題】グリコシル化タンパク質をインビトロ及びインビボで産生する組成物及び方法を提供する。【解決手段】方法は、宿主細胞を用いてグリコシル化タンパク質を産生することを含む。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。【選択図】なし

Description

(1.関連出願の相互参照)
本出願は、その内容全体が引用により本明細書中に組み込まれる、2017年6月30日に出
願された米国仮出願第62/527,466号の優先権の恩典を主張する。
(2.配列表)
本出願は、ASCII形式で提出され、かつ引用により完全に本明細書中に組み込まれる配
列表を含有する。2018年6月28日に作成された該ASCIIコピーは、14197-005-228_ST25_FIN
AL.txtと命名され、サイズが1,065,529バイトである。
(3.序論)
本明細書に記載されるのは、グリコシル化タンパク質をインビトロ及びインビボで産生
する組成物及び方法である。該方法は、宿主細胞を用いて、グリコシル化タンパク質を産
生することを含む。また本明細書に記載されるのは、そのような方法を用いて産生される
グリコシル化タンパク質及びその使用である。
(4.背景)
タンパク質グリコシル化は、生物の全てのドメインに見られるユビキタスな翻訳後修飾
である。動物システムには顕著な複雑性が存在しており、グリカン構造は、タンパク質フ
ォールディング及び品質管理における寄与から、これらの分子の認識、安定性、作用、及
び代謝回転のような多数の生物学的事象への関与までの極めて重要な生物学的かつ生理学
的役割を有する(Moremenらの文献、2012)。モノクローナル抗体、酵素、及びホルモンの
ような治療用糖タンパク質は、バイオテクノロジー産業の主要製品であり(Lagasse, H A
Danielらの文献、2017; Dimitrovの文献、2012)、グリカン不均一性の影響は、「重要品
質特性」としてますます認識されている。製品の品質を決定する多くの特性のうち、グリ
コシル化は、タンパク質の生物学的活性、血清半減期、及び免疫原性に影響を及ぼす:最
も重要な特性のうちの1つとさえみなされる。グリカンは、血清循環時間の増加に関係し
ており、承認済又は開発中の生物製剤の多くは、治療濃度を長時間にわたって維持するた
めに頻繁な適用を必要とする不十分な半減期に悩まされている。半減期延長戦略は、改善
された薬物動態を有する長時間作用性治療薬の作製を可能にするための鍵である(Konterm
annの文献、2016)。グリコシル化は、例えば、凝集傾向の低下を通じて、タンパク質の溶
解度及び安定性を向上させるように思われ、タンパク質分解の防止による循環寿命の増大
をもたらす。さらに、異なる末端単糖を有するN-グリカンは、その分解をもたらすレクチ
ンによって認識されることができる(Blaskoらの文献、2013; Varkiの文献、2017)。結果
として、グリコシル化のモニタリング及び制御は、バイオ医薬品の製造及び規制当局の要
件において極めて重要である(Costaらの文献、2014; Eon-Duvalらの文献、2012; Reusch
及びTejadaの文献、2015)。これらの理由から、発現プラットフォームの糖鎖改変は、バ
イオ医薬品を多くの点で改善するための重要な戦略として次第に認識されつつある(Dicke
r及びStrasserの文献、2015)。
大半のタンパク質薬は、治療用タンパク質の性質に影響を及ぼすグリカン構造の付加に
よってグリコシル化されている。一般に、グリカンの数及び組成は、タンパク質のフォー
ルディング、溶解度、及び細胞内輸送に重要な役割を果たす。グリカンは、タンパク質骨
格を遮蔽して、免疫原性反応を妨げることができ、異なる細胞認識事象は、特異的なグリ
カン構造の存在に依存する。したがって、グリコシル化は、糖タンパク質の生物学的活性
に対して大きな影響を有しており、治療効力を獲得するために製造中に注意深く制御され
る必要がある。生産宿主の種、細胞型、及び生理学的状態によって、組換え糖タンパク質
上のグリコシル化パターンは、顕著に異なる。タンパク質上のグリカンは、一般に、構造
的に非常に多様であり、様々な結合によって構築される一連の単糖からなる。いずれか1
つのグリコシル化部位における成熟グリカンは、単一の糖と同じぐらい単純であっても、
リン酸、硫酸、酢酸、又はホスホリルコリンで潜在的に修飾される、200を上回る糖のポ
リマーと同じぐらい複雑であってもよい(Stanleyの文献、2011)。哺乳動物グリカンの十
分な多様性を生み出すために、約700種のタンパク質が必要であると推定されており(7,00
0種以上の構造になると推定される)、これは、わずか10種の単糖:フコース(Fuc)、ガラク
トース(Gal)、グルコース(Glc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N-アセチルグルコ
サミン(GlcNAc)、グルクロン酸(GlcA)、イゾロン酸(IdoA)、マンノース(Man)、シアル酸(
Sia)、及びキシロース(Xyl)から構築される(Moremenらの文献、2012)。
(抗体治療薬)
抗体(又は免疫グロブリン、Ig)、特に、IgG抗体は、過去10年間で開発された最も成功
した治療薬の一部である(例えば、ベバシズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ、ア
ダリムマブ、トラスツズマブ、又はセツキシマブ、その他多数)。これらは、極めて特異
的で、長い血清半減期を有し、かつこれらは、過去30年の間に開発され、改善されてきた
哺乳動物培養で常法により発現させることができる。抗体分子の基本構造は、2つの同一
の重ポリペプチド鎖と2つの同一の軽ポリペプチド鎖で構築される。これらの鎖は、「Y」
型構造を形成するジスルフィド結合によって連結されている。ヒト免疫グロブリンは、そ
の重鎖によって、IgG、IgA、IgD、IgE、及びIgMの5つのクラスに分類される。IgG及びIgA
抗体は、それぞれ、4つのサブクラス(IgG1～4)及び2つのサブクラス(IgA1～2)として見出
される。特異的抗原の認識は、軽鎖及び重鎖の可変領域及び1つの定常ドメインを含む抗
原結合断片(Fab)によって媒介される。エフェクター機能(図1)は、重鎖の定常領域の他の
2つのドメイン(CH2及びCH3)に対応する断片結晶化可能領域(Fc)とFc受容体(FcR)などのエ
フェクタータンパク質との結合によって開始される。したがって、Fab断片は、軽鎖及び
重鎖の可変ドメイン及び定常ドメインから構成されるが、Fc断片は、重鎖の定常ドメイン
から完全に構成される。このFcドメインは、新生児Fc受容体(FcRn)とのpH依存的な結合に
よって、抗体の血清半減期も延長し、それにより、タンパク質がエンドソームで分解され
ることから救い出され、それが循環し、血中に戻る(Jefferisの文献、2009)。
例えば、リガンドもしくはFc受容体に対するその結合特性を変化させることによるか、
又はその半減期をさらに延長させることにより、治療用抗体の臨床的成功をさらに前進さ
せるために、抗体エンジニアリングの手法が使用されている。典型的な手法は、突然変異
の導入又は抗体のグリコシル化の改変である。Fc鎖への突然変異の導入は、天然の配列で
はもはや機能しないという特有の欠点を有する。治療用タンパク質のグリコシル化は、通
常、循環半減期を延長させるために許容されるが、抗体については、循環からのIgの排出
速度に対するグリコシル化の効果に関する研究は、過去に結論の一致を見なかった。しか
し、より最近の理解では、Fc部分のグリカン構造の違いが実際にクリアランスに影響を及
ぼすことが示唆されている(Millwardらの文献、2008; Liuの文献、2015、2017)。抗体鎖
の翻訳後修飾の間、小胞体及びゴルジ装置内の酵素は、炭水化物鎖を抗体のポリペプチド
骨格に付加することができる。全IgGサブクラスのFc部分の位置297のアスパラギンに、単
一のN-結合型グリカンが存在する。IgG抗体の約20％は、該分子上の別の場所にグリカン
を含有する。ほとんどの組換え抗体薬は、単一のFcグリコシル化部位のみを含有するよう
に改変又は選択されている。
抗体鎖が正しくフォールディングされて会合しているとき、位置297のオリゴ糖は、CH2
ドメインによって囲まれる内部空間内に隔離され、オリゴ糖と抗体のアミノ酸の広範な非
共有結合的相互作用が存在し、結果として、立体構造に対する影響が生じる。保存された
Asn-297部位に見られるオリゴ糖は、通常、フコシル化された二分岐複合型のものである
。しかしながら、抗体分子間では、分岐の変化、鎖の長さ、及び/又は炭水化物部分の数
の変化が原因で、炭水化物構造(グライコフォーム)にかなりの不均一性が存在する。実際
、付加されるN-結合型オリゴ糖の構造は、プロセシングの程度に応じてかなり異なり、高
マンノース、並びにバイセクティングGlcNAc及びコアフコース残基を有する又は有さない
複合二分岐オリゴ糖を含むことができる(Wright及びMorrisonの文献、1997)。通常、所与
のグリコシル化部位で付加されたコアオリゴ糖構造の不均一なプロセシングが存在し、モ
ノクローナル抗体でさえも複数のグライコフォームとして存在するという結果を生じる。
重要なことに、抗体グリコシル化の主要な違いは、抗体産生細胞株間で生じ、違いは、異
なる培養条件下で成長させた所与の細胞株についても見られる。実際、哺乳動物N-グリカ
ン生合成における各々の工程は、＜100％の効率であり、いくつかの酵素は、基質をめぐ
って競合し、多くの異なるグライコフォームを生じる。治療用タンパク質の産生において
問題を引き起こす不均一なグリコシル化が認められる。例えば、グリカンは、薬物動態及
び生物学的活性に影響を及ぼすことができる(Ferraraらの文献、2011; Elliottらの文献
、2003; Krappらの文献、2003)。N-グリカンは、タンパク質フォールディングに重要であ
ることが多いので、N-グリコシル化部位を完全に除去するか、又は小胞体の前もしくは小
胞体の中でグリコシル化を妨害することにより、これらの問題を簡単に克服することはで
きない。しかしながら、抗体は、適切なフォールディングのためにN-グリカンを必要とし
ないが(Feigeらの文献、2010)、グライコフォームの問題は、異なる又は一貫しないエフ
ェクター機能をもたらし、これにより、治療上又は規制要件から抗体を使用することが難
しくなり得る。Fc部分をN-297で脱グリコシル化することにより、Fc含有分子のエフェク
ター機能の消失、又は安定性の低下が生じ得る。重要なことに、ヒトで合成されないグラ
イコフォームは、アレルギー性、免疫原性であり、かつ治療的投与の反復によって生じ得
る抗薬物抗体による結合抗体の血漿クリアランスを加速することができる。
Fcドメインの改変によって効力を改善し、治療的投薬量を低下させ、かつ抗体の全体的
な臨床成績を向上させることが、改変抗体の開発における次の課題である。抗体依存性細
胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性細胞性食作用(ADCP)
などのエフェクター機能、及び分子の全体的な半減期に対する影響は、抗体治療薬の特性
を改善するための主な目的である(図1)(Jennewein及びAlterの文献、2017)。市場全体は
、2016年から2026年の間に、約40％の健全な年間成長率で急激に成長すると予想されてい
る。
それらが認識する抗体の種類に基づいて、Fc受容体(FcR)は、異なるタイプ: Fcガンマ
受容体(FcγR; IgGに結合する)、Fcアルファ受容体(FcαR; IgAに結合する)、Fcイプシロ
ン受容体(FcεR; IgEに結合する)、及び新生児Fc受容体(FcRn)に分類される。このうち、
最も重要なのは、「Fcガンマ」受容体である。Fcガンマ受容体は、オプソニン化された微
生物の食作用の活性化に関与する。Fcガンマ受容体は、多様な分子構造の結果として、抗
体に対するその親和性に応じたクラスにさらに分類される。これらの一部には、FcγRI(C
D64)、FcγRII(CD32)、及びFcγRIII(CD16)が含まれる。FcγRIII(CD16)は、大部分のナ
チュラルキラー(NK)細胞、顆粒球、単球、マクロファージ上に、及びT細胞のサブセット
上に存在する。この受容体をコードする遺伝子は、FcγRIIIa又はFcγRIIIbである。Fcγ
RIIIaは、NK細胞媒介性ADCCに関与するFc受容体である。Fcアルファ受容体は、2つの細胞
外Ig様ドメインからなり、FcαRI(CD89)というただ1つのサブグループを有する。これら
は、多鎖免疫認識受容体(MIRR)とIgスーパーファミリーの両方の部分を形成する。Fcイプ
シロン受容体は、2つのタイプからなる。該受容体の1つは、低親和性受容体のC-タイプレ
クチンであるFcεRII(CD23)であり、もう1つは、高親和性受容体のIgスーパーファミリー
の1種であるFcεRIである。新生児受容体(FcRn)は、抗体のリソソーム分解の防止におい
て役割を果たし、治療用抗体の半減期を増大させることが知られている。酸性エンドソー
ム内のFcRnは、トランスサイトーシスによって内在化したIgGに結合する。IgGは、細胞表
面にリサイクルされ、血液のpHで放出され、リソソーム分解を妨げられる。アグリコシル
化は、エフェクター機能に多大な影響を及ぼすが、IgG-FcとFcRnとの相互作用は、Fcグリ
コシル化と無関係であると考えられる。
グリカンによって、蹄鉄形のFc-断片が「開くこと」が決まり、Fcグリカンの切断によ
って、「閉じた」立体構造が生じる。「開いた」IgG-Fc構造は、FcγRIIIとの相互作用に
最も有利な立体構造であり、これは、完全にガラクトシル化されているが、フコシル化さ
れているIgG-Fcで観察された(Krappらの文献、2003)。独特の炭水化物-炭水化物相互作用
がFcγRIIIとコアフコースを欠く抗体との間の高親和性結合に必要とされる。しかしなが
ら、「フコース衝突」が原因で、コアフコシル化は、高親和性FcγRIII結合を妨げる。オ
リゴ糖部分のフコース残基は、治療用抗体とFcγRIIIaとの結合(Fc受容体の活性化)を立
体的に障害することが示されている(図2A)。脱フコシル化は、Fc受容体機能のADCCを増強
するのに重要な役割を果たす。重要なことに、(Chungらの文献、2012)は、％フコシル化
とADCCの間に直線的な関係が存在することを示している。これにより、コアフコース残基
を有さない一様なグリカンの優れた特性の事例が作られる。アフコシル化抗体は、α1,6
コアフコシルトランスフェラーゼを阻害し、フコシル化の低下をもたらす構造であるコア
のβ-ManにバイセクティングGlcNAcを付加するGnT-IIIを過剰発現する細胞株で産生され
た。この低下は、約50％のアフコシル化構造を生じさせ、これは、グリコプロファイリン
グ(Gazyvaro(登録商標))によっても確認された(図42)。
これまでのデータを明確にしておくと、(Liらの文献、2017; Chenらの文献、2017)によ
る新しい研究は、化学酵素的手法を用いて、均一なN-グリカンを生じさせ、2,6伸長型の
二分岐シアル酸の場合でもFcR親和性が高度に保持され、それがADCCのようなエフェクタ
ー機能の改善につながることを示した。α1,6結合コアフコースを有する又は有さない構
造的に明確でかつ均一なグリカンに基づくこのデータは、FcR結合及び関連する下流効果
に関する理解を著しく進展させた(Liらの文献、2017; Sondermannらの文献、2013)(図2B)
。さらに、N-グリカンの二分岐末端のα2,3結合シアル酸は、FcγR親和性の増大をもたら
さず、したがって、それは、活性化経路に対するFc受容体機能の欠如により、抑制性グリ
カンとして機能すると想定することができる。したがって、シアル酸が末端にあることに
より、抗炎症と抗体の循環半減期の増大とに対するシアル酸関連効果が示唆される。より
長い循環半減期及び(例えば、潜在的に免疫原性である治療用mAbに対する抗薬物抗体の回
避のための)免疫寛容化などの改善された特性を有するが、不均一なグリコシル化、又は
抗原結合の低下などの欠点がない抗体及びFc含有分子を得ることが好都合である。さらに
、機能カスタマイズされたN-グリカンは、目標とされる下流エフェクター機能のために分
子を発展させる。
真核細胞の小胞体(ER)及びゴルジ区画におけるグリコシル化プロセスは、組換え糖タン
パク質上に見られる不均一なグリカン構造の大部分を生成させる。治療における重要性が
認識されているため、グリカン不均一性を克服するために、並びに均一な治療用糖タンパ
ク質の効率的な産生のためのインビボ及びインビトロの糖鎖改変技術を確立するために、
近年、相当な努力が行われてきた。いくつかの発現宿主でグリコシル化経路を修飾して、
ヒト化グリカンを生成させる進展があるにもかかわらず、それには、適合性、生産性の損
失、又は生存性の損失さえも伴い得る。重要なことに、特定の均一なN-グリカンを生成さ
せるインビボの系は、これまで記載されていない。
したがって、そのような均一でかつ機能カスタマイズもされた特定のグリコシル化を有
するそのような組換え治療用タンパク質を産生する発現技術は、増強された生物学的活性
及び改善された特性を有する新しいクラスの安全かつ革新的な次世代薬を表す。
(N-グリコシル化経路)
最も顕著でかつ最もよく特徴付けられている形態のタンパク質グリコシル化は、グリカ
ンと新たに合成されたタンパク質のアスパラギンの側鎖のアミドとの結合(N-グリコシル
化)である。タンパク質のN-グリコシル化は、脂質キャリア上に構築された保存されたオ
リゴ糖前駆体(Glc3Man9GlcNAc2)の新生ポリペプチド鎖上に露出したAsn-X-Ser/Thr(ここ
で、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である)コンセンサス配列への転移により、小胞
体(ER)の内腔で始まる。この最初のグリカン転移反応は、ヘテロマーのオリゴサッカリル
トランスフェラーゼ(OST)複合体によって触媒され、ERでのタンパク質のフォールディン
グよりも先に起こることになっている(Aebiの文献、2013)。オリゴ糖転移後すぐに、2つ
の末端グルコース残基がグルコシダーゼI及びIIによって切り離され、結果として生じる
モノグルコシル化グリカン構造(Glc1Man9GlcNAc2)を有するポリペプチドは、ER内在性の
膜結合レクチンであるカルネキシン又はその可溶性ホモログのカルレティキュリンと相互
作用することができる。これらのレクチンは、グリカン依存的なタンパク質品質管理サイ
クルにおけるタンパク質フォールディングを支援する。そのネイティブな立体構造を獲得
した分泌性糖タンパク質は、カルネキシン/カルレティキュリンサイクルから放出され、E
Rから出てゴルジ装置に入る。ゴルジ体では、フォールディングが成熟した糖タンパク質
上のER由来オリゴマンノース型N-グリカンがさらなるN-グリカン伸長を受け、これにより
、高度に多様な複合型N-グリカンが生成する(Stanleyの文献、2011)。
昆虫、酵母、及び植物は、哺乳動物細胞によって産生されるものとは顕著に異なるN-グ
リカンを生成させる。小胞体における最初のGlc2Man9GlcNAc2オリゴ糖からMan8GlcNAc2へ
のプロセシングは、これらの酵母から哺乳動物までの種間で顕著な類似性を示すが、ゴル
ジ体で非常に異なるプロセシング事象が起こる。例えば、酵母は、50個又はさらに多くの
Man残基をMan8-9GlcNAc2に付加することができるのに対し、昆虫細胞は、通常、ほとんど
の又は全てのMan残基を除去して、ポーシマンノース型のMan3-1GlcNAc2 N-グリカンを生
成させる。植物細胞もMan残基を除去して、Man4-5GlcNAc2を生じさせ、複雑なGlcNAc又は
Gal修飾を有することもあるが、多くの場合、潜在的に免疫原性であるβ1,2-結合キシロ
ース(Xyl)、及び昆虫細胞と一緒に、コアα1,3-結合フコース(Fuc)残基を付加する。
動物糖タンパク質のN-グリカンは、通常、ガラクトース、フコース、及び末端シアル酸
を含む。これらの糖は、酵母及び糸状菌で産生される糖タンパク質上には見られない。ヒ
ト及び他の非ヒト真核細胞において、全ての種類の糖ヌクレオチド前駆体(例えば、UDP-N
-アセチルグルコサミン、UDP-N-アセチルガラクトサミン、CMP-N-アセチルノイラミン酸
、UDP-ガラクトース、GDP-フコースなど)は、細胞質ゾルで合成されて、ゴルジ体に輸送
され、そこで、これらは、グリコシルトランスフェラーゼ(「Gnt」)によって、コアオリ
ゴ糖に付加される。
(糖鎖改変の手法)
遺伝子工学及び代謝工学の努力が、昆虫、酵母、及び植物のN-グリカンプロセシング経
路を修飾するために行われ、シアリル化された複合型N-グリカンが昆虫細胞、酵母及び植
物で産出されており、これにより、細胞株を改変して、潜在的に治療価値のある哺乳動物
様糖タンパク質を産生することができることが示された(Geislerらの文献、2015a; Stras
ser 2016; Hamiltonらの文献、2006; Jacobsらの文献、2009)。蘚類、水生植物、藻類、
及びカイコのような他の異種宿主が有益なグリコシル化について試験されたが、これらの
系は、最適には程遠い(Calowらの文献、2016; Coxらの文献、2006; Tadaらの文献、2015)
。これまで、下等真核生物の特定の異種発現グリコシルトランスフェラーゼが十分に翻訳
されるどうか、触媒活性があるかどうか、又は分泌経路内の適切なオルガネラに局在する
かどうかを予測する信頼性のある方法はない。さらに、グリコシル化経路の変化は、細胞
生存及び/又は糖タンパク質の部位占有のいずれかを変化させ、生産性又は生成物品質の
低下をもたらし得る。
シアル酸(Sia)は、ヒトデからヒトまでの後口動物系統の動物で遍在するN-アセチルノ
イラミン酸(Neu5Ac)の一群のN-又はO-置換誘導体である。これらの化合物は、ある種の細
菌、原生動物、及び真菌を含む、いくつかの他の生物でも確認されている。病原性細菌及
び哺乳動物細胞におけるシアル酸生合成は、十分に理解されている。病原性生物の表面の
シアル酸は、主に、宿主免疫系から逃れる手段であると考えられるが、これらの同じシア
ル酸分子は、タンパク質ターゲッティング、細胞-細胞相互作用、細胞-基質認識、及び接
着を含む、高等生物における多くのプロセスにも関与している(Varkiの文献、2017; Vimr
らの文献、2004; Schauerの文献、2000)。シアル酸の存在は、インビボでの糖タンパク質
の半減期に影響を及ぼす。例えば、シアル酸の重要性は、ヒトエリスロポエチン(hEPO)の
研究で証明されている。この糖タンパク質のN-結合型グリカン上の末端シアル酸残基は、
血液からのhEPOの急速なクリアランスを防ぎ、インビボ活性を向上させる。ガラクトース
残基で末端が終わるアシアリル化hEPO(アシアロ-hEPO)は、インビボでの劇的に減少した
赤血球産生活性を有する。この減少は、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体によるアシア
ロ-hEPOのクリアランスの増加によって引き起こされる(Fukudaらの文献、1989)。同様に
、多くの治療用糖タンパク質上の末端シアル酸の欠如は、インビボでの効力を低下させ、
そのため、より高頻度の患者投与レジメンを必要とし得る。
一般に、哺乳動物N-グリカン及び完全ヒト化N-グリカンを生成させる能力は、バイオテ
クノロジー産業を転換すると期待されているが、それは、一連の新しい生物が現れて、ヒ
トの健康に役立つ治療薬を産生するからである。本発明は、キネトプラスト類(Kinetopla
stid)の種のリーシュマニア・タレントラエ(Leishmania tarentolae)におけるネイティブ
かつ新規のN-グリコシル化経路の解析、保存された経路との重要な違いの発見、及び糖鎖
改変に対するその利用を記載している。糖鎖改変の手法がいくつかの例で提示されている
。
このキネトプラスト目(Kinetoplastida)の糖鎖改変発現プラットフォームは、明確でか
つ完全にカスタマイズされたN-グリカンをもたらし、単純なヒトポーシマンノースの土台
の上に改変グリカンが構築されるために極めて均一なヒト化グリコシル化を有する、より
安価で、より安全で、かつより一貫した治療薬の産生は、糖鎖改変の分野を著しく進展さ
せる。特異的でかつ驚くほど独特なN-グリカン生合成は、新規性があり、これまで一度も
記載されたことがなく、これにより、ピキア(Pichia)又は他の真核生物のような任意の他
の生物に対する糖鎖改変の手法が区別される。さらに、哺乳動物細胞と比較したより短い
開発期限及びより速い組換え株の作製は、この単純であるが、完全に機能カスタマイズさ
れた発現プラットフォームを、治療用タンパク質に対する幅広い用途のために著しく発展
させる。
(5.概要)
本明細書に記載されるのは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを含む、異種グリコシルトラン
スフェラーゼを含む単細胞キネトプラスト目の真核宿主細胞である。本明細書に記載され
る宿主細胞は、均一でかつ完全に機能カスタマイズされたN-グリカンを高い部位占有率で
含む哺乳動物(例えば、ヒト)の治療用糖タンパク質を産生することができる。本明細書に
提供される宿主細胞を用いて、全長の治療用抗体(例えば、抗CD20(リツキシマブ))及び他
の治療用タンパク質(例えば、エリスロポエチン)を発現させることができる。
また本明細書に提供されるのは、哺乳動物酵素活性(例えば、N-アセチルグルコサミン
伸長、ガラクトシル化、及びシアリル化に関与するもの)をキネトプラスト類の真核宿主
細胞の細胞内区画にうまくターゲッティングし、そこで発現させることができる核酸及び
コンビナトリアルライブラリーである。このプロセスにより、改変された宿主細胞が提供
され、これを用いて、グリコシル化に関与する任意の望ましい遺伝子を発現させ、ターゲ
ッティングすることができる。シアリル化糖タンパク質の産生のためのCMP-シアル酸生合
成経路の設計も提供されている。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコード
する組換え核酸;及び(b)異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含
むリーシュマニア宿主細胞である。
ある実施態様において、該異種グリコシルトランスフェラーゼは、N-アセチルグルコサ
ミントランスフェラーゼ;及び/又は異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は異種
シアリルトランスフェラーゼである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供され
るのは、2以上のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを含む宿主細胞である。他
の実施態様において、該異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAc
を生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-グリカン生合成経路由来の1以
上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されてい
る宿主細胞である。
さらなる実施態様において、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、表9に
掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ、もしくはシアリルトランスフェラーゼ、又はこれらの任意の機能性ホモログ、ア
イソフォーム、もしくは変異体に由来する。
さらなる実施態様において、CMP-NeuAcを生成させることができるCMP-Sia生合成経路タ
ンパク質は、表11に掲載されているCMP-Sia生合成経路タンパク質、又はこれらの任意の
機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体と少なくとも約70％、71％、72％、73
％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％
、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、
又は100％同一である。
別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-Iであ
る。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-IIで
ある。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-I
及びGnT-IIである。別の実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、B4GA
LT1である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、該N-アセチルグルコサ
ミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、該ガラクトシルトランスフェラーゼ
がB4GALT1である宿主細胞である。別の実施態様において、該シアリルトランスフェラー
ゼは、2,6-SiaT又は2,3-SiaTである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは
、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、該ガラクト
シルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、該シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT又
は2,3-SiaTである宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるの
は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、該ガラク
トシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、該シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT
又は2,3-SiaTであり、かつ該シアリルトランスフェラーゼがCMP-NeuAcを生成させること
ができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む、宿主細胞である。
ある実施態様において、該宿主細胞は、リーシュマニア・タレントラエ細胞である。他
の実施態様において、該宿主細胞は、表13に掲載されている任意の株である。
ある実施態様において、該宿主細胞は、図53に示されている原核生物又は真核生物酵素
を有するCMP-Neu5Ac経路を含む。
他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び/又は保持配列は、N-アセチルグ
ルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリル
トランスフェラーゼに付加され、ここで、該シグナル配列は、N-アセチルグルコサミント
ランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェ
ラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ該保持配列は、N-
アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又
はシアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。別の実施態様におい
て、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシル
トランスフェラーゼを宿主細胞の小胞体に保持する。別の実施態様において、該保持配列
は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラ
ーゼを宿主細胞のシスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、N-
アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを
宿主細胞の中間ゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、ガラクト
シルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様にお
いて、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保
持する。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼ及びガラク
トシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-グリカン生合成経路由来の1以
上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されてい
る宿主細胞である。
別の実施態様において、該シグナル配列及び/又は保持配列は、任意のリーシュマニア
種に由来するシグナル配列又は保持配列である。さらなる実施態様において、該シグナル
配列及び/又は保持配列は、リーシュマニア・タレントラエに由来するシグナル配列又は
保持配列である。
別の実施態様において、該シグナル配列は、プロセシングされ、除去される。
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニア・タレントラエタンパク質
に由来する細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。別の実施態様において、該CTS配列は
、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2に由来する。別の
実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26の配列
、又はこれらの機能的活性断片を含む。さらに別の実施態様において、該CTS配列は、配
列番号24の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％
、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又は
その機能的活性断片;配列番号25の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、7
5％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88
％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは10
0％同一である配列又はその機能的活性断片;或いは配列番号26の配列と少なくとも約70％
、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97
％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片を含む。
別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する。別
の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアに由来するGRIP配列又はその
機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又はそ
の機能的活性断片を含む。さらに別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配
列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％
、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活
性断片を含む。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアタンパク質に
由来するCTS配列又はその機能的活性断片、及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又は
その機能的活性断片を含む。
他の実施態様において、該標的タンパク質は、リーシュマニア宿主細胞にとって異種で
ある。
別の実施態様において、該標的タンパク質は、リーシュマニア由来のシグナル配列を含
むように改変されている。他の実施態様において、該シグナル配列は、リーシュマニア・
タレントラエ由来のシグナル配列である。いくつかの実施態様において、該シグナル配列
は、配列番号28もしくは配列番号29の配列又はこれらの機能的活性断片を含む。具体的な
実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28の配列又はその機能的活性断片を含む
。さらに別の実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28の配列少なくとも約70％
、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97
％、98％、99％、もしくは100％である配列又はその機能的活性断片を含む。他の実施態
様において、該シグナル配列は、プロセシングされ、該標的タンパク質から除去される。
他の実施態様において、該標的タンパク質は、ヒトインターフェロン-α(INF-α)、イ
ンターフェロン-β(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)
、キメラジフテリアトキシン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(
IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、腫
瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、イン
スリン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド
-1アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲
状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7
)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長
因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(FGF20)、線維芽細胞成
長因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3
、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリ
スロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因
子(GM-CSF)、CTLA4の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)、又はTNF受容体の細胞外ドメ
イン(例えば、FC-融合体)のアミノ酸配列を含む。
他の実施態様において、該標的タンパク質は、治療用タンパク質である。他の実施態様
において、該標的タンパク質は、Fc-融合タンパク質である。他の実施態様において、該
標的タンパク質は、抗体である。
別の実施態様において、該標的タンパク質は、ヒトタンパク質に対する抗体である。さ
らなる実施態様において、該抗体は、アダリムマブ(Humira); Remicade(インフリキシマ
ブ); ReoPro(アブシキシマブ); Rituxan(リツキシマブ); Simulect(バシリキシマブ); Sy
nagis(パリビズマブ); Herceptin(トラスツズマブ); Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマイ
シン); Campath(アレムツズマブ); Zevalin(イブリツモマブチウキセタン); Xolair(オマ
リズマブ); Bexxar(トシツモマブ-I-131); Erbitux(セツキシマブ); Avastin(ベバシズマ
ブ); Tysabri(ナタリズマブ); Actemra(トシリズマブ); Vectibix(パニツムマブ); Lucen
tis(ラニビズマブ); Soliris(エクリズマブ); Cimzia(セルトリズマブペゴール); Simpon
i(ゴリムマブ); Ilaris(カナキヌマブ); Stelara(ウステキヌマブ); Arzerra(オファツム
マブ); Prolia(デノスマブ); Numax(モタビズマブ); ABThrax(ラキシバクマブ); Benlyst
a(ベリムマブ); Yervoy(イピリムマブ); Adcetris(ブレンツキシマブベドチン); Perjeta
(ペルツズマブ); Kadcyla(アド-トラスツズマブエムタンシン);又はGazyva(オビヌツズマ
ブ)のアミノ酸配列を有する。
他の実施態様において、該抗体は、全長抗体、Fab、F(ab')2、Scfv、又はsdAbである。
他の実施態様において、該標的タンパク質は、酵素又はその阻害因子のアミノ酸配列を含
む。別の実施態様において、該標的タンパク質は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、
第X因子、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織
プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びtPA変異体、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキ
ナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロ
ニダーゼ)、イデュルスルファーゼ(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、
アガルシダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、
ヒトDNアーゼ-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸
オキシダーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテア
ーゼ阻害因子(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロ
テアーゼ)、及びアデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列を含む。
別の実施態様において、該治療用タンパク質は、アバタセプト(例えば、Orencia)、ア
フリベルセプト(例えば、Eylea)、アガルシダーゼベータ(例えば、Fabrazyme)、アルビグ
ルチド(例えば、Eperzan)、アルデスロイキン(例えば、Proleukin)、アレファセプト(例
えば、Amevive)、アルグルセラーゼ(例えば、Ceredase)、アルグルコシダーゼアルファ(
例えば、LUMIZYME)、アリスキレン(例えば、Tekturna)、アルファ-1-プロテイナーゼ阻害
因子(例えば、Aralast)、アルテプラーゼ(例えば、Activase)、アナキンラ(例えば、Kine
ret)、アニストレプラーゼ(例えば、Eminase)、ヒト炭疽菌免疫グロブリン(例えば、ANTH
RASIL)、抗血友病因子(例えば、Advate)、アンチインヒビター血液凝固複合体(例えば、F
eiba Nf)、アンチトロンビンアルファ、ヒトアンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリ
ン(例えば、抗胸腺細胞グロブリン)、抗胸腺細胞グロブリン(ウマ)(例えば、ATGAM)、抗
胸腺細胞グロブリン(ウサギ)(例えば、ATG-Fresenius)、アプロチニン(例えば、Trasylol
)、アスフォターゼアルファ、アスパラギナーゼ(例えば、Elspar)、エルウィニア・クリ
サンテミ(erwinia chrysanthemi)のアスパラギナーゼ(例えば、Erwinaze)、ベカプレルミ
ン(例えば、REGRANEX)、ベラタセプト(例えば、Nulojix)、ベラクタント、ビバリルジン(
例えば、Angiomax)、A型ボツリヌストキシン(例えば、BOTOXE)、B型ボツリヌストキシン(
例えば、Myobloc)、ブレンツキシマブベドチン(例えば、Adcetris)、ブセレリン(例えば
、Suprecur)、C1エステラーゼ阻害因子(ヒト)、C1エステラーゼ阻害因子(組換え体)(例え
ば、Ruconest)、セルトリズマブペゴール(例えば、Cimzia)、コリオゴナドトロピンアル
ファ(例えば、コリオゴナドトロピンアルファ)、絨毛性ゴナドトロピン(ヒト)(例えば、O
vidrel)、絨毛性ゴナドトロピン(組換え体)(例えば、Ovitrelle)、凝固因子ix(例えば、A
lprolix)、凝固因子VIIa(例えば、NovoSeven)、ヒト凝固因子X(例えば、Coagadex)、凝固
因子XIIIA-サブユニット(組換え体)、コラゲナーゼ(例えば、Cordase)、コネスタットア
ルファ、コルチコトロピン(例えば、H.P.Acthar)、コシントロピン(例えば、Cortrosyn)
、ダルベポエチンアルファ(例えば、Aranesp)、デフィブロチド(例えば、Noravid)、デニ
ロイキンディフチトクス(例えば、Ontak)、デシルジン、ジゴキシン免疫Fab(ヒツジ)(例
えば、DIGIBIND)、ドルナーゼアルファ(例えば、Pulmozyme)、ドロトレコギンアルファ(
例えば、Xigris)、デュラグルチド、エフモロクトコグアルファ(例えば、ELOCTA)、エロ
スルファーゼアルファ、エンフュービルタイド(例えば、FUZEON)、エポエチンアルファ(
例えば、Binocrit)、エポエチンゼータ(例えば、Retacrit)、エプチフィバチド(例えば、
INTEGRILIN)、エタネルセプト(例えば、Enbrel)、エキセナチド(例えば、Byetta)、第IX
因子複合体(ヒト)(例えば、AlphaNine)、フィブリノリジン、別名、プラスミン(例えば、
Elase)、フィルグラスチム(例えば、N.A.)、フィルグラスチム-sndz、フォリトロピンア
ルファ(例えば、Gonal-F)、フォリトロピンベータ(例えば、Follistim AQ)、ガルスルフ
ァーゼ(例えば、Naglazyme)、胃内因子、ゲムツズマブオゾガマイシン(例えば、Mylotarg
)、グラチラマー酢酸塩(例えば、Copaxone)、グルカゴン組換え体(例えば、GlucaGen)、
グルカルピダーゼ(例えば、Voraxaze)、グラミシジンD(例えば、Neosporin)、B型肝炎免
疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒト破傷風菌(clostridium tetani)トキソイド免疫グ
ロブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン(例えば、Hyperabヒト狂犬病免疫グロブリ
ン)、ヒトRho(D)免疫グロブリン(例えば、Hyp Rho D Inj 16.5％)、ヒト血清アルブミン(
例えば、Albuminar)、ヒト水痘・帯状疱疹免疫グロブリン(例えば、Varizig)、ヒアルロ
ニダーゼ(例えば、HYLENEX)、ヒアルロニダーゼ(ヒト組換え体)、イブリツモマブチウキ
セタン(例えば、Zevalin)、イズルスルファーゼ(例えば、Elaprase)、イミグルセラーゼ(
例えば、Cerezyme)、ヒト免疫グロブリン、インスリンアスパルト(例えば、NovoLog)、ウ
シインスリン、インスリンデグルデク(例えば、Tresiba)、インスリンデテミル(例えば、
LEVEMIR)、インスリングラルギン(例えば、Lantus)、インスリングルリジン(例えば、API
DRA)、インスリンリスプロ(例えば、Humalog)、ブタインスリン(例えば、Iletin II)、レ
ギュラーインスリン(例えば、Humulin R)、ブタインスリン(例えば、vetsulin)、イソフ
ェンインスリン(例えば、Novolin N)、インターフェロンアルファ-2a、組換え体(例えば
、Roferon A)、インターフェロンアルファ-2b(例えば、INTRON A)、インターフェロンア
ルファコン-1(例えば、INFERGEN)、インターフェロンアルファ-n1(例えば、Wellferon)、
インターフェロンアルファ-n3(例えば、Alferon)、インターフェロンベータ-1a(例えば、
Avonex)、インターフェロンベータ-1b(例えば、Betaseron)、インターフェロンガンマ-1b
(例えば、Actimmune)、静注用免疫グロブリン(例えば、Civacir)、ラロニダーゼ(例えば
、Aldurazyme)、レノグラスチム(例えば、Granocyte)、レピルジン(例えば、Refludan)、
ロイプロリド(例えば、Eligard)、リラグルチド(例えば、Saxenda)、ルシナクタント(例
えば、Surfaxin)、ルトロピンアルファ(例えば、Luveris)、メカセルミン(例えば、N.A.)
、メノトロピン(例えば、Menopur)、メトキシポリエチレングリコール-エポエチンベータ
(例えば、Mircera)、メトレレプチン(例えば、Myalept)、天然αインターフェロンもしく
はマルチフェロン(例えば、Intron/Roferon-A)、ネシリチド(例えば、NATRECOR)、オクリ
プラスミン(例えば、Jetrea)、オプレルベキン(例えば、Neumega)、OspAリポタンパク質(
例えば、Lymerix)、オキシトシン(例えば、Pitocin)、パリフェルミン(例えば、Kepivanc
e)、パンクレリパーゼ(例えば、Pancrecarb)、ウシペガデマーゼ(例えば、Adagen)、ペグ
アスパラガーゼ(例えば、Oncaspar)、ペグフィルグラスチム(例えば、Neulasta)、ペグイ
ンターフェロンアルファ-2a(例えば、Pegasys)、ペグインターフェロンアルファ-2b(例え
ば、PEG-Intron)、ペグインターフェロンベータ-1a(例えば、Plegridy)、ペグロティカー
ゼ(例えば、(Krystexxa))、ペグビソマント(例えば、SOMAVERT)、ポラクタントアルファ(
例えば、Curosurf)、プラムリンタイド(例えば、Symlin)、プレオタクト(例えば、Preota
ct E)、プロタミン硫酸塩(例えば、プロタミン硫酸塩注射液、USP)、ヒトプロテインS(例
えば、ヒトプロテインS)、プロトロンビン(例えば、Feiba Nf)、プロトロンビン複合体(
例えば、Cofact)、プロトロンビン複合体濃縮製剤(例えば、Kcentra)、Rasbウリカーゼ(
例えば、Elitek)、レテプラーゼ(例えば、Retavase)、リロナセプト(例えば、Arcalyst)
、ロミプロスチム(例えば、Nplate)、サクロシダーゼ(例えば、Sucraid)、サケカルシト
ニン(例えば、Calcimar)、サルグラモスチム(例えば、Leucomax)、サツモマブペンデチド
(例えば、OncoScint)、セベリパーゼアルファ(例えば、Kanuma)、セクレチン(例えば、Se
creFlo)、セルモレリン(例えば、酢酸セルモレリン)、血清アルブミン(例えば、Albunex)
、ヨウ素標識血清アルブミン(例えば、Megatope)、シモクトコグアルファ(例えば、Nuwiq
)、シプリューセル-T(例えば、Provenge)、ソマトトロピン組換え体(例えば、NutropinAQ
)、ソマトロピン組換え体(例えば、BioTropin)、ストレプトキナーゼ(例えば、Streptase
)、スソクトコグアルファ(例えば、Obizur)、タリグルセラーゼアルファ(例えば、Elelys
o)、テデュグルチド(例えば、Gattex)、テネクテプラーゼ(例えば、TNKase)、テリパラチ
ド(例えば、Forteo)、テサモレリン(例えば、Egrifta)、トロンボモデュリンアルファ(例
えば、Recomodulin)、サイマルファシン(例えば、Zadaxin)、サイログロブリン、チロト
ロピンアルファ(例えば、Thyrogen)、ツベルクリン精製タンパク質誘導体(例えば、Aplis
ol)、ツロクトコグアルファ(例えば、Zonovate)、ウロフォリトロピン(例えば、BRAVELLE
)、ウロキナーゼ(例えば、Kinlytic)、バソプレッシン(例えば、Pitressin)、ベラグルセ
ラーゼアルファ(例えば、Vpriv)、アブシキシマブ(例えば、ReoPro)、アダリムマブ(例え
ば、Humira)、アレムツズマブ(例えば、CAMPATH)、アリロクマブ(例えば、Praluent)、ア
ルシツモマブ(例えば、CEA-Scan)、アテゾリズマブ(例えば、Tecentriq)、バシリキシマ
ブ(例えば、Simulect)、ベリムマブ(例えば、Benlysta)、ベバシズマブ(例えば、Avastin
)、ブリナツモマブ(例えば、Blincyto)、ブロダルマブ(例えば、Siliq)、カナキヌマブ(
例えば、ILARISE)、カナキヌマブ(例えば、Ilaris)、カプロマブ(例えば、ProstaScint)
、セツキシマブ(例えば、Erbitux)、ダクリズマブ(例えば、Zenapax)、ダラツムマブ(例
えば、DARZALEX)、デノスマブ(例えば、Xgeva)、ジヌツキシマブ(例えば、unituxin)、エ
クリズマブ(例えば、Soliris)、エファリズマブ(例えば、RAPTIVA)、エロツズマブ(例え
ば、EMPLICITI)、エボロクマブ(例えば、Repatha)、ゴリムマブ(例えば、Simponi注射液)
、イブリツモマブ(例えば、Zevalin)、イダルシズマブ(例えば、Praxbind)、インフリキ
シマブ(例えば、REMICADE)、イピリムマブ(例えば、YERVOY)、イキセキズマブ(例えば、T
altz)、メポリズマブ(例えば、Nucala)、ムロモナブ(例えば、ORTHOCLONE OKT3)、ナタリ
ズマブ(例えば、Tysabri)、ネシツムマブ(例えば、Portrazza)、ニボルマブ(例えば、Opd
ivo)、オビルトキサキシマブ(例えば、Anthim)、オビヌツズマブ(例えば、Gazyva)、オフ
ァツムマブ(例えば、Arzerra)、オマリズマブ(例えば、Xolair)、パリビズマブ(例えば、
Synagis)、パニツムマブ(例えば、Vectibix)、ペンブロリズマブ(例えば、Keytruda)、ペ
ルツズマブ(例えば、Perjeta)、ラムシルマブ(例えば、Cyramza)、ラニビズマブ(例えば
、Lucentis)、ラキシバクマブ(例えば、ラキシバクマブ)、リツキシマブ(例えば、Rituxa
n)、セクキヌマブ(例えば、Cosentyx)、シルツキシマブ(例えば、Sylvant)、トシリズマ
ブ(例えば、ACTEMRA)、トシツモマブ(例えば、Bexxar)、トラスツズマブ(例えば、Hercep
tin)、ウステキヌマブ(例えば、Stelara)、又はベドリズマブ(例えば、Entyvio)のアミノ
酸配列を含む。
さらなる実施態様において、該宿主細胞は、(a)Stt3オリゴサッカリルトランスフェラ
ーゼ(OST)を含み、かつ(b)内在性のN-グリカン伸長を有さない。
別の実施態様は、グリコシル化標的タンパク質を作製する方法であって、宿主細胞を培
養すること、及び該標的タンパク質を培養物から精製することを含む、方法を含む。
別の実施態様は、グリコシル化標的タンパク質の組成物を含む。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000001
 (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を含むオリゴ糖を担持する該組成物中の標的タンパク質のN-結合型グリコシル化コ
ンセンサス配列の少なくとも約90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000002
 (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を特徴とするG0-Gnグリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくと
も約20％～30％、25％～35％、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％
～60％、55％～65％、60％～70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、
85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000003
 (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を特徴とするG0グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも
約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55
％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％
～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000004
 (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型
グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG1-Gnである、該標的タンパク
質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％、35
％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～75％
、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000005
 (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型
グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG2グリカンである、該標的タン
パク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％
、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～
75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000006
 (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型
グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG1グリカンである、該標的タン
パク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％
、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～
75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000007
 (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型
グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG1グリカンである、該標的タン
パク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％
、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～
75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、標的タンパク質上のグリコシル化は、対象に導入されたときに
該標的タンパク質の薬物動態特性を最適化するようにさらに修飾される。別の実施態様に
おいて、標的タンパク質上のグリコシル化は、シアリル化される。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000008
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000009
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000010
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000011
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000012
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000013
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000014
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000015
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000016
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000017
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000018
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000019
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、N-結合型グリコシル化コンセンサス配列は、Asn-X-Ser/Thrで
あり;ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、培養培地中に分泌され、ここ
で、該グリコシル化標的タンパク質は、グリコシル化されている。ある実施態様において
、グリコシル化標的タンパク質は、培養培地から精製される。別の実施態様において、グ
リコシル化標的タンパク質は、親和性精製又はイオン交換クロマトグラフィーによって培
養培地から精製される。別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、FCドメ
インを含有し、プロテイン-Aによって培養培地から親和性精製される。別の実施態様にお
いて、グリコシル化標的タンパク質は、親和性タグを含有し、親和性精製される。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の集団は、少なくとも約90％、91
％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％均一である。さらな
る実施態様において、グリコシル化によって占有されている標的タンパク質上のN-糖部位
の90％～100％。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のも
のではないN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュ
マニアのゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッド
N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼである。
ある実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは
、リーシュマニア・タレントラエ由来のものである。
他の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは
、シグナル配列及び少なくとも1つの保持配列を含むように改変されており、ここで、該
シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをリーシュマニア・タレ
ントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサ
ミントランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
別の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは
、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを小胞体に保持する。別の実施態様にお
いて、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグル
コサミントランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハ
イブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグルコサミント
ランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する。さらなる実施態様において、該ハイブリ
ッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列で
ある。
ある他の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、表9に
掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、
アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のも
のではないガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマニアの小
胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッド
ガラクトシルトランスフェラーゼである。
別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、リーシュ
マニア・タレントラエ由来のものである。
さらなる実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、シグ
ナル配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし
、該保持配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する
。
ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラク
トシルトランスフェラーゼを小胞体に保持する。ある実施態様において、該ハイブリッド
ガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラクトシルトランスフェラーゼをシスゴルジ装
置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ
は、該ガラクトシルトランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する。別の実施態様にお
いて、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラクトシルトランスフェ
ラーゼをトランスゴルジ装置に保持する。他の実施態様において、該ハイブリッドガラク
トシルトランスフェラーゼは、細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。さらなる実施態
様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、GRIP配列である。ある実施
態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、CTS配列及びGRIP配列で
ある。
他の実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、表9に掲載されている
ガラクトシルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは
変異体に由来する。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のも
のではないシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;並びに(b)リーシュマニアの小胞
体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッドシ
アリルトランスフェラーゼである。
別の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、リーシュマニ
ア・タレントラエ由来のものである。
ある実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、シグナル配列
を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該シアリルトランスフェラー
ゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列
は、該シアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラク
トシルトランスフェラーゼを小胞体に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッド
シアリルトランスフェラーゼは、該シアリルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に
保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、CTS
配列である。さらなる実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは
、GRIP配列である。他の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ
は、CTS配列及びGRIP配列である。
ある他の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、表9に掲
載されているシアリルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、
もしくは変異体に由来する。
他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドN-アセチルグルコサ
ミントランスフェラーゼをコードする核酸である。さらなる実施態様において、本明細書
に提供されるのは、ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸であ
る。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドシアリルトランス
フェラーゼをコードする核酸である。
(5.1 用語法及び略語)
「約」という用語は、数字と併用される場合、言及された数字の±1、±5、又は±10％
以内の任意の数字を指す。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物(例えば、鳥類、爬虫類、及
び哺乳動物)を指す。別の実施態様において、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、
シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)並びに
霊長類(例えば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含む、哺乳動物である。ある実施態様
において、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施態様において、対象は、家畜又は
ペット(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ロバ、又はニワトリ)である。
具体的な実施態様において、対象は、ヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、
本明細書で互換的に使用されてもよい。
「α[数字]」、「α[数字],[数字]」、「β[数字]」、又は「β[数字],[数字]」という
略語は、炭水化物残基を別の基に接続する共有結合であるグリコシド結合(glycosidic bo
nd)又はグリコシド結合(glycosidic linkage)を指す。α-グリコシド結合は、両方の炭素
が同じ立体化学を有する場合に形成されるが、β-グリコシド結合は、2つの炭素が異なる
立体化学を有する場合に生じる。
(6.図面の簡単な説明)
図1:抗体の組合せ多様性は抗体エフェクター機能を推進する((Jennewein及びAlterの文献、2017)から抜粋)。IgG Fcを抗体のFcドメインに対する2つの変化:(i)グリコシル化の選択(36の選択肢)及び(ii)サブクラス(4つのサブクラス)の選択により修飾して、144の理論上の組合せ及び関連する機能的状態を作り出した。抗体-グリカン組合せに応じて、抗炎症応答;抗体依存性細胞性食作用(ADCP)、抗体依存性細胞性細胞傷害性(ADCC)などの機能的応答;又は補体活性化及びサイトカイン分泌を含む炎症応答の誘導を含む、多くの異なる機能的応答を誘発することができる。略語: IL、インターロイキン。
図2A、2B、及び2C: IgG Fc断片のグリコシル化による構造変化((Sondermannらの文献、2013)から抜粋)。図2A:シアリル化によるFc断片内の提案される構造変化のポンチ絵。非ガラクトシル化(G0F) Fc-断片は、FcγRの結合を可能にする開いた立体構造を維持している。三角は、フコース及び低結合を表す。図2B:完全にα2,6-シアリル化されたFc(G2FS2)において、α1,3-アームは、Cγ2ドメインのタンパク質コアと会合し、閉じた立体構造を誘導する。結果として得られる3次構造が変化したFc断片の閉じた立体構造によって、DC-SIGNの結合部位が露出するが、FcγRの結合部位は遮断される。図2C:(Chenらの文献、2017; Liらの文献、2017)に従って、このモデルを、FcγRに対するより高い親和性結合を可能にする、フコースを欠く糖鎖改変型N-グリカン上に開いた立体構造を有するように適合させることができる。フコースを含まないN-グリカンがシアル酸末端を有する二分岐状である場合、立体構造変化は、開いて密集している状態であることができる。Fc構造は、2つのグリカンラッチ(glycan latch)によって安定化され、Fcの適切な立体構造を維持するが、異なるグリカン残基によって媒介される。Chenの結果は、Fcの構造完全性の維持におけるN-グリコシル化の役割を示唆しており、末端シアル酸による調節によるグリカン-グリカン相互作用における多様な様式の可能性を示した。
図3A及び3B:リーシュマニア・タレントラエにおける小胞体(ER) N-グリカン生合成のバイオインフォマティクス的評価及び保存された経路との比較((Varkiの文献、2009)から抜粋)。図3A:リーシュマニア・タレントラエにおける欠損遺伝子は、×印と末梢線で表示されている。図3B:生合成の各々の工程を触媒する酵素は、主に、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)という酵母の突然変異体の研究から同定された。各々の酵母突然変異によって影響を受ける遺伝子は、ALG遺伝子(グリコシル化が変化した(altered in glycosylation )を表す)として知られている。ドリコール-P-P-GlcNAc2Man9Glc3の合成。ER膜の細胞質側に位置するドリコール(赤色の曲がりくねった曲線)リン酸(Dol-P)は、細胞質でUDP-GlcNAcからGlcNAc-1-Pを受け取って、Dol-P-P-GlcNAcを生成させる。Dol-P-P-GlcNAcは、表示されているALG酵素によって、Dol-P-P-GlcNAc2Man5へと伸長した後、ER膜を越えて、内腔側に「反転する」。ER膜の内腔側では、4つのマンノース残基がDol-P-Manから付加され、3つのグルコース残基がDol-P-Glcから付加される。Dol-P-Man及びDol-P-Glcは、ERの細胞質側でも作られ、内腔側に「反転する」。L.タレントラエに存在するホモログは、レ点で記されており、欠損ホモログは、×印で示されている。ALG12、6、8、9、及び10が存在せず、ALG3が機能喪失型突然変異を含むと推定されるので、man3構造は、反転して、それ以上マンノシル化されずに、ポリペプチドに直接転移されると考えられる。ALG5(ドリチル-リン酸β-グルコシルトランスフェラーゼ)は存在しない。OSTは、Stt3のみから構成される(表4)。
図4A、4B、及び4C:小胞体(ER) N-グリカン生合成、トリミング、及びタンパク質受容体への転移のバイオインフォマティクス的評価。図4A:×印と末梢線で表示された生合成におけるALGホモログの欠損は、縮小したMan3前駆体を示唆している。Man4又はMan5前駆体種の欠損(ALG3、9、11、12の欠損による)とグルコシル化前駆体種の欠損(ALG6、8、及び10、並びにALG5の欠損による)が推定されるにもかかわらず、図4Bに示されるトリミング酵素(GCS1、GNAB、MAN1)は存在している(欠損酵素は、末梢線で表示されている)。図4C:最終的なグリカンのMan3のみがStt3によってタンパク質アクセプターのN-コンセンサス部位に転移されると考えられる。フォールディング中間体のGlc1Man9GlcNAc2は、品質管理について、関与するレクチンのリガンドとは考えられない。
図5:(Moremenらの文献、2012)に基づく、タンパク質N-グリコシル化及びタンパク質フォールディングの品質管理のバイオインフォマティクス的評価。a)糖タンパク質生合成の間、新生ポリペプチドの翻訳に続いて、SEC61ポアを通るそのトランスロケーションとオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)による脂質結合中間体からペプチドアクセプターシークオンへのグリカンの同時転移が起こる。OSTのSTT3サブユニット中の1つの溝がAsn-X-Ser/Thrアクセプターシークオンをスキャンする一方、隣接する溝がグリカンドナーに結合する。b)Glc除去によるグリカントリミングは、α-グルコシダーゼI(GIsI)とα-グルコシダーゼIIのα-βヘテロ二量体(GIsIIα/β)による転移のすぐ後に起こる。Glc1Man9GlcNAc2構造を含有するフォールディング中間体は、ERp57との複合体で機能するレクチンであるカルネキシン(L.タレントラエには存在しない)又はカルレティキュリン(L.タレントラエには存在しない)のリガンドである。これらのレクチンからの解離に続いて、さらなるGlc切断が起こる。さらなるシャペロン支援は、ATP駆動型シャペロンBiP(GRP78としても知られる)によって提供される。正しくフォールディングされた糖タンパク質は、ゴルジ体への輸送のためにパッケージングされる。c)不完全にフォールディングされた糖タンパク質は、フォールディングセンサーであるUDP-Glc:糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ(UGGT1、L.タレントラエには存在しない)によって認識される。その後、これらは、グリカン構造にGlc残基を付加し直すことにより再グルコシル化され、カルネキシンサイクルに再び組み入れられる。d)末端がミスフォールディングした糖タンパク質は、Manトリミング(ER α-マンノシダーゼI(ERManI＝L.タレントラエに存在するMAN1の活性を介する)又はゴルジManIA、ゴルジManIB、及びゴルジManIC(図示せず)による小胞体(ER)廃棄を受け、その後、ER分解増強α-マンノシダーゼ様1(EDEM1)、EDEM2、及びEDEM3(これは、酵母でMnl1としても知られるHtm1のホモログであり、全てL.タレントラエには存在しない)の活性を受ける。トリミングされたグリカンは、ERレクチンOS9又はXTP3B(図示せず)に結合し、細胞質ゾルのユビキチン結合タンパク質の駆動力とバロシン含有タンパク質(VCP; TER ATPアーゼとしても知られる;酵母でCdc48、Ufd1、又はNpl4としても知られる)のATPアーゼ機能とを用いて、デルリン1(DER1)とDER2とDER3の複合体(SEL1L複合体;酵母のHrd3)を介して細胞質ゾルに移行する。このペプチドは、細胞質ゾルのPNGアーゼ(L.タレントラエには存在しない)によって脱グリコシル化され、プロテアソーム149よって分解される。L.タレントラエに存在しないホモログは、×印で表示され、存在するホモログは、四角の枠の中に示されている。比較に関するさらなる詳細については、表8も参照されたい。
図6:野生型リーシュマニア・タレントラエと比較した、(Kellokumpuらの文献、2016)から抜粋した哺乳動物N-グリコシル化経路。模式的ポンチ絵は、小胞体(ER)及びゴルジ体におけるグリコシルトランスフェラーゼによるN-グリカンの逐次的プロセシングを示している。関与する酵素(グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ)は、従来、成長しているオリゴ糖鎖に糖残基を一度に1つずつ特定の順序で付加するか又は成長しているオリゴ糖鎖から糖残基を一度に1つずつ特定の順序で除去することにより、個別に順々に機能すると考えられている(左側)(「哺乳動物」)。図6の右側は、哺乳動物系と比較して縮小した前駆体及び異なる成熟N-グリカンを有する野生型リーシュマニア・タレントラエを表している。
図7:野生型リーシュマニア・タレントラエと比較した、(Kellokumpuらの文献、2016)から抜粋した哺乳動物N-グリコシル化経路。哺乳動物経路の模式的ポンチ絵は、表示されたグリカンを糖鎖改変リーシュマニアで産生する糖鎖改変工程を用いて、図6を補完している。
図8:リーシュマニア・タレントラエにおける提案されたN-グリコシル化生合成経路。N-グリカン前駆体は、ERの細胞質側でMan3として構築され、その後、ER内腔に反転する。その後、このMan3グリカンは、通常見られるOST複合体の唯一のパーツであるStt3によって直接転移される。アクセプタータンパク質のN-糖部位上の最終的なグリカンはMan3であり、これは、シスゴルジに移行する。シスゴルジでは、異種酵素が、ヒト二分岐N-グリカンを構築するグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒する。これらは、最初の2つのGlcNAc残基を付加する哺乳動物又は昆虫源由来のGnt-I及びGnt-IIである。対応するグライコフォームは、そのテキスト略語とともに下の四角の枠の中に記載されている。トランスゴルジでは、リーシュマニアで発現した哺乳動物源由来のGalT及びSiaT酵素がN-グリカンの完成までの反応を触媒し、このN-グリカンは、α2,3又はα2,6結合シアル酸(Neu5Ac)に応じて異なる予想される機能を媒介する、均一で、フコースを含有しないが、二分岐シアリル化したヒト化グリカンである。
図9: 3つの異なるwt株における全リーシュマニア・タレントラエ細胞ペレット由来のPNGアーゼFもしくはPNGアーゼAにより放出され、かつRF標識されたN-グリカン又は模擬処理物のUPLC分離及びMSによるm/z決定。(Man)3(GlcNAc)2＝Man3は、MSにより、計算値m/z＝1222.7166; [M+Na]+ 1244.6985; [M+K]+ 1260.6724で検出された。Man3は、PNGアーゼF又はPNGアーゼAで放出された場合9.16; 9.27; 9.34のRTで、全てのペレット試料で観察されたが、模擬処理試料では観察されなかった。模擬処理試料は、例えば、細胞壁糖脂質(ポリヘキソースシグナチャーを有する)からの、株(真ん中及び下のパネル)への混入を示した。RT 15.76では、別のピークがFLRトレース中に観察されたが、良好なMSスペクトルが得られたにもかかわらず、化合物を同定することができなかった。通常、FLRトレース中にはそれほど多くのバックグラウンドは観察されないが、MSトレースには早いRTでかなりのバックグラウンドが観察された(＜8分のRT、図示せず)。
図10A及び10B: SfGnT-I、TbGnT-I、又はTbGnT-IIインビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。SfGnT-I、TbGnT-I、又はTbGnT-IIを発現する組換えL.タレントラエ由来の免疫濃縮物(図10A)又は可溶化画分(図10B)を遊離ポーシマンノース(Man3)に対するインビトロアッセイで基質として使用した。洗浄され、2AB標識された反応産物をHPLCで分離し、標準のMan3-2AB、G0-Gn(NGA3-N)、及びG0(NGA2)と比較した。RT 76.7'のピークは、アステリスクで印が付けられた異種GnT-I酵素の活性を示している。
図11A及び11B: MGAT1インビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。MGAT1を発現する組換えL.タレントラエ由来のSN又はペレット並びに可溶化画分及びライセート由来の免疫濃縮MGAT1を:(図11A)既知のN-グリコシル化経路におけるMGAT1の一般に使用される生合成アクセプターである2AB標識高マンノース(Man5)に対する又は(図11B)リーシュマニアのN-グリカン経路におけるゴルジ体での伸長のためのMan3アクセプターを模倣する基質としての2AB-ポーシマンノース(Man3)に対するインビトロアッセイで使用した。陰性対照として、wt L.タレントラエ細胞由来のライセートをこれらの反応で使用した。洗浄された2AB標識反応産物をHPLCで分離し、標準と比較した。図11A)Man5又は図11B)Man3; G0-Gn(NGA2-N、緑)。アステリスクで印が付けられたピークは、異種GnT-I酵素の活性を示している。
図12A及び12B: MGAT2インビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。組換えL.タレントラエ由来のSN又はペレット由来の免疫濃縮MGAT2を、既知のN-グリコシル化経路におけるMGAT2の一般に使用される生合成アクセプターである2AB標識G0-Gn(NGA2-N)に対する(図12A)又はMGAT2によって伸長されない、リーシュマニアのN-グリカン経路におけるゴルジ体での伸長のためのMan3アクセプターを模倣する基質としての2AB-ポーシマンノース(Man3)に対する(図12B)インビトロアッセイで使用した。洗浄された2AB標識反応産物をHPLCで分離し、標準のMan3、G0-Gn(NGA2-N)、及びG0(NGA2)と比較した。アステリスクで印が付けられたピークは、異種GnT-II酵素の活性を示している。
図13A、13B、及び13C: SfGnT-IIインビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。SfGnT-IIを発現する組換えL.タレントラエ由来の粗ライセートを:リーシュマニアのN-グリカン経路におけるゴルジ体での伸長のためのMan3アクセプターを模倣する基質としての2AB-ポーシマンノース(Man3)に対する(図13A);既知のN-グリコシル化経路におけるGnt-II反応のための一般に使用される生合成アクセプターである2AB-標識G0-Gn(NGA2-N)に対する(図13B)、又はGnT-IIの基質ではない2AB標識Man5に対する(図13C)インビトロアッセイで使用した。洗浄された2AB標識反応産物をHPLCで分離し、標準のMan3、G0-Gn(NGA2-N)、及びMan5と比較した。アステリスクで印が付けられたピークは、異種GnT-II酵素の活性を示している。
図14A、14B、及び14C: B4GALT1インビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。図14A:組換えL.タレントラエ由来の免疫濃縮B4GALT1を2AB-G0-Gn(NGA2-N)に対するインビトロアッセイで使用した。洗浄された2AB標識反応産物をHPLCで分離し、標準のG0-Gn(NGA2-N)、G1(NA2G1)、NA2(G2)と比較した。星で印が付けられたピークは、異種GalT酵素の活性を示している。図14Bは、市販のNGA2-N(G0-Gn)標準の組成物の模式的グライコフォーム表示及び2つの異なる分岐上のG1-Gn形態を示すB4GALT1インビトロアッセイ後の予想される反応結果を示している。図14Cは、G0(NGA2)をGalTの基質として使用した場合の予想される反応産物を表す。
図15:完全メチル化され、PNGアーゼFにより放出されたwt及び糖鎖改変リーシュマニア・タレントラエのN-グリカンの範囲m/z 1000～2200のMALDI-TOF MSスペクトル。グライコフォームの注釈は、m/zピークの上に付けられている。
図16:同定されたグライコフォームのMALDI-TOF/TOF MSフラグメンテーションスペクトル。wt St10569からのm/z 1171.6(＝Man3)(上)、SfGnT-Iを発現する組換え株St11707のスペクトルからのm/z 1416.7(＝G0-Gn)(中)、及びSfGnT-I及びSfGnT-IIを共発現する組換えSt12320(下)のスペクトルからのm/z 1661.8(＝G0)のスペクトル中に存在するフラグメントイオンにより、Man3(上)、G0-Gn(中)、及びG0(下)の完全メチル化N-グリカンが確認される。
図17A、17B、及び17C: UPLC分離及び組換え糖鎖改変リーシュマニア・タレントラエ細胞ペレット由来のPNGアーゼFにより放出され、RF標識されたN-グリカン又は模擬処理物のMSによるm/z決定が図17Aに示されており、破線は、模擬試料中に見られるバックグラウンドピークを表している。RF標識されたN-グリカンを: 16.260－St11707(SfGnT-I)、PNGアーゼFによる; 16.261－St11707(SfGnT-I)－模擬; 16.263－St12525(SfGnT-I及びSfGnT-II)－PNGアーゼF、並びに16.264－St12767(SfGnT-I及びMGAT2)－PNGアーゼFから得て、重ね合わせた。m/zで確認されたグリカンピークは、太字の矢印で示されている。図17Bは、St 13065(MGAT1及びMGAT2)由来のN-グリカン、図17Cは、St13066(SfGnT-I及びB4GalT1)のN-グリカンを示しており、m/zは、上に図式化して注釈が付けられているピークにより確認され、[M+H] m/z＝1222 Man3、m/z＝1425 G0-Gn、m/z＝1628(G0)、及びm/z＝1587(G1-Gn)であった。標識されていないピークは、模擬消化物中にも見られ、細胞壁糖脂質断片と推定されるものを含有していた(破線矢印、「バックグラウンド」)。
図18:糖鎖改変リーシュマニアで発現された組換えhEPOのN-グリカン伸長。GnT-I候補のSfGnT-Iを組換え発現させて、ネイティブなN-グリカンをG0-Gnまで伸長させた。組換え標的タンパク質のヒトエリスロポエチン(rhEPO)を単独で発現させるか(St11521)又はSfGnT-Iとともに共発現させた(St11895)。rhEPOをリーシュマニアの分泌経路により分泌させ、培養上清から精製した。2つの精製EPO試料のクマシーSDS PAGE。分子量は、GlcNAc伸長を高分子量になるまで付加したときに変化する。
図19:ペプチドマッピングによるrhEPO部位占有。薄灰色:糖ペプチド濃縮工程のフロースルー画分中のEPOペプチド。灰色:フロースルー画分中及び濃縮糖ペプチド画分中に存在するペプチド。濃灰色: PNGアーゼA＋Fによる脱グリコシル化後の濃縮糖ペプチド画分中でその脱アミド化形態に見られるN-グリコシル化部位N24及びN38を包含するEPOペプチド。このペプチドは、その非グリコシル化形態では検出されなかった。N-グリコシル化部位N83を有するペプチドは、本研究で(その非グリコシル化形態でも、その脱グリコシル化形態でも)明白には検出されなかった。N-グリコシル化部位は、太字で表示されている。配列番号108が示されている。
図20:同定されたN-グリカンを有するrhEPOの糖ペプチド。N-グリコシル化N24及びN38部位が表示されている。配列番号109が示されている。
図21A及び21B:ネイティブな分泌糖タンパク質の同定。図21A)は、ワークフローを四角の枠の中にまとめたものであり、クマシーSDS PAGEは、ConA濃縮後の溶出プロファイル(E1～E5)を示している。主要なタンパク質は、60～80kDaの間を泳動した。溶出物をN-グリカン放出及び2AB標識に使用し、ペプチドマッピングを用いるプロテオミクス的手法を用いて、タンパク質を同定した。図21B:同定されたタンパク質は、＞96％の確率を示す配列カバレッジで同定されたペプチドの数とともに示されている。
図22A及び22B:ネイティブな分泌糖タンパク質であるインベルターゼのプロセシングされたN-末端の同定。図22A:ワークフローを四角の枠の中にまとめた。St10881の上清を(NH4)2SO4沈殿させ、ConAを用いて精製した。ConA溶出物E1～E8がクマシーSDS PAGEで示されている。サイズ排除後、rhEPO以外の最も顕著な分泌タンパク質を回収し、EDMAN N-末端シークエンシングに供した。図22Bは、ペプチドマッピングによって同定されたインベルターゼの配列を示しており、薄灰色の印のペプチドが見出された。丸は、EDMAN N-末端シークエンシングからのプロセシングされたN-末端
Figure 2023134519000020
 を示している。配列番号110が示されている。
図23: rhEPOは、インベルターゼ由来のインベルターゼ分泌配列に遺伝子融合されたときに分泌された。上清中に分泌されるために、分泌移行のための2つの異なるシグナルペプチドを付けて、EPOを発現させた。免疫ブロッティングしたSDS PAGE(左)又はクマシー染色したSDS PAGE(右)のいずれかに、15 ODの細胞に相当するTCA沈殿上清を充填した。各々5つの異なる単クローンを用いた、LMSAP分泌シグナル(St11376)又はインベルターゼ由来の分泌シグナル(St11377)のいずれかを有する両方のrhEPO変異体は、そのN-グリコシル化形態を示す分子量に泳動するSN中に見られた。
図24A及び24B:ネイティブなゴルジ体局在タンパク質のドメイン予測。ゴルジ体局在グリコシルトランスフェラーゼの大部分は、短いN-末端細胞質ドメイン、約20アミノ酸のらせん状TM-ドメイン、ステムドメイン、及び分泌経路の内腔内のC-末端球状触媒ドメインを有するII型膜タンパク質である(Kellokumpuらの文献、2016)。図24A。示されているのは、分泌シグナル及びN-末端のCTSと、それに続く、球状/触媒ドメインを有するGnt(Gnt-x)又はSfGnT-Iの代表例である。図24Bは、バイオインフォマティクス的比較によって同定され、かつ模式的バーの下に予測されたCTSドメインのアミノ酸配列を伴って掲載されている、L.タレントラエ由来のネイティブかつ推定上のゴルジタンパク質MAN1、LtaNTPDアーゼ1及び2を示している。GRIPドメインをLTAR_110005600.1(以前の命名体系: LtaP11.0070)中に同定した。このC末端アミノ酸配列は、バーの下に示されている。配列番号24～27が示されている。
図25A、25B、及び25C: Gntのドメイン予測並びにゴルジターゲッティング、保持、及びホモ又はヘテロ二量体化の改善のためのハイブリッド設計。Gnt-Xは、示されている例のように、Sf-Gnt-Iである白色のバーとして表示されている。濃灰色のものは、Gnt-Y、示されている例では、MGAT1である。下の数字は、Gnt-y/MGAT1のCTSの後ろにあるハイブリッド設計の融合点を示している。図25Bは、N-末端切断型(Δ90、Δ110、Δ130、Δ150アミノ酸)のGnt-X/SfGnT-Iのヌクレオチドにヌクレオチド配列として遺伝子融合されたGnt-Y/MGAT1のN-末端の90、110、130、又は150アミノ酸を示している。全長(FL) Gnt-Y(MGAT1)は、図25Cに表示されているFLのGnt-X/SfGnT-I(上)又はN-末端でCTSが切断されたGnt-X/SfGnT-I(下)に融合されている。
図26A及び26B:経時的なrhEPO又はSfGnT-I組換え細胞の成長挙動並びにrhEPO又はSfGnT-Iの発現及び局在。rhEPOを発現する細胞(St11357)又はSfGnT-Iを発現する細胞(St11521)の静止培養物対振盪培養物で成長をモニタリングした－成長(OD)及び形状は、図26Aに示されているようにグラフで経時的に表示されている。rhEPO又はSfGnT-Iの経時的な発現率及びその局在を、抗Strep抗体を用いる免疫ブロットにより、TCA沈殿上清(SN)及び全細胞抽出物(WCE)で決定した(図26B)。
図27A及び27B: SfGnT-I、TbGnT-I、及びTbGnT-IIの局在。15 ODに相当する充填量の培養物SNからTCA沈殿されたか又はTritonXで可溶化された細胞ライセートからストレプトアビジンで親和性濃縮されたStrepタグ化Sf-GnT-Iを検出している免疫ブロット(図27A)。トリパノソーマに由来し、かつHAタグ化されたTbGnT-I及びTbGnT-IIを、免疫ブロットにより、粗画分及びTriton-X可溶化画分中で検出した(図27B)。
図28A及び28B: SfGnT-IのハイブリッドGnt変異体の局在。ネイティブなSfGnT-I或いはMan1-CTS又はLTaNTPDアーゼ1もしくは2のCTSのハイブリッドを発現させ、培養物SN(図28A)から、又はtritonを含む(TrX+)もしくはtritonを含まない(TrX-)もしくは不溶性部分(Ins)からホモジナイズされた粗ライセート(図28B)から沈殿させた。
図29: MGAT1の局在及び親和性濃縮。HAタグ化MGAT1を組換え細胞培養物SN由来又はペレット由来のいずれかの親和性濃縮画分からの精製(Purif.)から免疫ブロットにより検出した。Eluは、インビトロアッセイに使用された溶出物である。局在化のために、MGAT1を、tritonを含む(TrX+)もしくはtritonを含まない(TrX-)又は不溶性部分(Insol. fr.)もしくは残渣からホモジナイズされたライセート中で検出した。
図30: SfGnT-IIの局在及び親和性濃縮。HAタグ化SfGnT-IIを、組換え細胞培養物SN由来又はペレット由来のいずれかの親和性濃縮画分からの精製(Purif.)からの免疫ブロットにより検出した。Eluは、インビトロアッセイに使用された溶出物である。局在化のために、SfGnT-IIを、tritonを含む(TrX+)もしくはtritonを含まない(TrX-)又は不溶性部分(Insol. fr.)もしくは残渣からホモジナイズされたライセート中で検出した。
図31A及び31B: MGAT2の局在及び親和性濃縮。HAタグ化MGAT2を、組換え細胞培養物SN由来又はペレット(Pell)由来のいずれかの親和性濃縮画分(W、洗浄; Elu、溶出)からの精製(Purif.)からの免疫ブロットにより検出した。細胞を96時間又は72時間成長させた。Eluは、インビトロアッセイに使用された溶出物である。局在化のために、SfGnT-IIを、tritonを含む(TrX+)もしくはtritonを含まない(TrX-)又は不溶性部分(Insol. fr.)もしくは残渣からホモジナイズされたライセート中で検出した(図31A)。様々な継代にわたる沈殿させた細胞培養物SNのMGAT2の局在及び発現レベルは、抗HA免疫ブロットにより示されている(図31B)。
図32:カスタマイズされたFcグリカンは所望の下流エフェクター機能を媒介する。免疫活性化グリカンは、ADCC、ADCP、及びCDCのような効果を媒介する。上部の表示されたグリカンを、免疫活性化、免疫阻害、及び/又はPK最適化を媒介するための、Fc分子又は抗体発現用の糖鎖改変リーシュマニアプラットフォームを用いてカスタマイズする。二分岐グリカンがα2,6結合Neu5Acで終わる場合、機能は活性化することであるが、それがα2,3結合Neu5Acで終わる場合、その機能は免疫を阻害することである。裏付け証拠は、(Chenらの文献、2017; Liらの文献、2017)で論じられている。二分岐N-グリカンが、その特定の結合とは無関係に、シアル酸で終わる場合、シアル酸の存在によって循環半減期が増大することにより、PKが改善されることになる。さらに、潜在的に免疫原性である治療薬の抗薬物抗体(ADA)の発生を回避するために、α2,6結合Neu5Acの免疫寛容化効果が期待される。下部の免疫を阻害するグリカンは、CHO細胞プラットフォーム由来の典型的なグリカン誘導体(末端シアル酸を有さない)である、コアα1,6フコシル化グリカンである。
図33:抗CD20モノクローナル抗体である組換えリツキシマブのアミノ酸配列。修飾されたインベルターゼ分泌配列を有する軽鎖(LC)及び重鎖(HC)のタンパク質配列は太字で示され、Fc N-グリコシル化部位は太字でかつ下線を付して示されている。配列番号111及び112が示されている。
図34:抗CD20モノクローナル抗体の組換えリツキシマブを含有する、リーシュマニア・タレントラエへの安定な組込みのための発現カセット。関連領域、相同組換えによる18S rRNAをコードするssu遺伝子座への部位特異的組込みのための5'相同性部位である5'ssu;スプライスリーダーアクセプター配列を含む5'非翻訳末端反復である5'UTR、インベルターゼ分泌シグナルを含有するリーシュマニア用にコドン使用が最適化された軽鎖配列;ポリアデニル化のための3'UTR及び下流遺伝子の5'UTRを含有する第一の遺伝子間領域であるIR1;インベルターゼ分泌シグナルを含有するリーシュマニア用にコドン使用が最適化された重鎖配列;ポリアデニル化のための3'UTR及び下流耐性マーカー(sat)の5'UTRを含有する第二の遺伝子間領域であるIR2、それに続く、その3'UTR及びゲノムへの部位特異的組換えのための3'相同性(3'ssu)領域の略図。KpnIは、ドナー大腸菌(E.coli)維持プラスミドから切り出されたトランスフェクション線状DNA用の記載されている発現カセットを得るために使用される制限酵素である。
図35:リツキシマブ_LMTBを分泌する組換えリーシュマニア・タレントラエからの全長モノクローナル抗体の発現及び精製。ワークフローは、上部に四角の枠として記載されている。回収された上清及び透析濾過され、5倍濃縮されたSNのクマシー染色SDS PAGEが示されている(左)。プロテインA溶出(右)は、クマシー染色された2つの主要な形態を示しており、1つは、非還元条件(「non」)下、SDS PAGEでFLリツキシマブとして移動し、1つは約100kDaの分解産物である。還元条件(「red」)下では、HC、分解産物、及びLCは分離される。疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)溶出は、非還元条件下又は還元条件下で分離したときの、これら2つの形態の分離を示している。SDS PAGEゲルがクマシー染色されている。
図36A及び36B:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)の比較。図36A:クマシー染色SDS PAGEは、N-結合グリカンを放出するためのPNGアーゼF処理なし又はあり(+)の非還元条件下のFL抗体を示している。図36Bは、抗体分子、そのドメイン及びジスルフィド架橋の略図を示している。N糖部位は、炭水化物で表示されている。ポンチ絵の分子の左側には、リーシュマニア由来抗体の均一なMan3 N-グリカンが示されているのに対し、右側には、CHO発現抗体に由来する予想されるN-グリカン微少不均一性が示されている。
図37:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)のキャピラリーゲル電気泳動及び比較。CGEは、N-結合グリカンを放出するためのPNGアーゼF処理なし(-)又はあり(+)の非還元条件下のFL抗体を示している。
図38A及び38B:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTB(図38B)とCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)(図38A)のサイズ排除クロマトグラフィー及び比較。
図39A及び39B:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTB(図39B)とCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)(図39A)のRFを用いたN-グリカンプロファイリング及び比較。N-グリカンをPNGアーゼFにより放出させ、RFで標識した。UPLC分離が示され、m/z値は、ピークの上に注釈が付けられたN-グリカンについて確認されている。
図40:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)の完全メチル化を用いたN-グリカンプロファイリング及び定量的比較。N-グリカンをPNGアーゼFにより放出させ、完全メチル化した。N-グリカンの相対強度(％)を計算して、各々のスペクトルについてのN-グリカンプロファイルを確立した。このために、脱同位体化されたN-グリカンピークの強度の合計を決定し、100％に設定した。その後、各々のグリカンの相対強度(％)をこの値との関連において決定した。黒色のバーは、リツキシマブ_LMTB及び灰色のバーは、Mabthera(登録商標)(Roche)である。m/z値は、そのフラグメンテーションスペクトルによる確認を含め、ピークの上に注釈が付けられたN-グリカンについて確認されている。
図41A及び41B:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTB(図42B)とCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)(図42A)の完全メチル化を用いたN-グリカンプロファイリング及び比較。3回の異なる獲得時にMabthera(登録商標)からPNGアーゼFにより放出された完全メチル化N-グリカンのMALDI-TOF MSスペクトル(図48A)及び2回の独立した獲得時にリツキシマブ_LMTBからPNGアーゼFにより放出された完全メチル化N-グリカンのMALDI-TOF MSスペクトル(図42B)。
図42:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)と糖鎖改変された第三世代抗CD-20 Gazyvaro(登録商標)(Roche)のN-グリカンの微少不均一性及び定量的比較。N-グリカンをPNGアーゼFにより放出させ、完全メチル化した。N-グリカンの相対強度(％)を計算して、各々のスペクトルのN-グリカンプロファイルを確立した。このために、脱同位体化されたN-グリカンピークの強度の合計を決定し、100％に設定した。その後、各々のグリカンの相対強度(％)をこの値との関連において決定した。灰色のバーは、リツキシマブ_LMTB、濃灰色のバーは、Mabthera(登録商標)(Roche)、薄灰色のバーは、Gazyvaro(登録商標)(Roche)である。m/z値は、そのフラグメンテーションスペクトルによる確認を含め、ピークの上に注釈が付けられたN-グリカンについて確認されている。
図43A及び43B:抗原結合についての組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBの機能性試験。図43Aは、対照IgG1κと比べたMabthera(登録商標)又はリツキシマブ_LMTBのFACSヒストグラムを示している。CD20抗原を発現するRaji細胞を用いて、抗CD20抗体の機能性を試験した。染色する順序は、表示された濃度のFcRブロッキング、IgG1ブロッキング、一次抗体Mabthera(登録商標)、リツキシマブ_LMTB、又は陰性対照IgG1κ、次いで、二次抗体抗IgG1 APCであった。ゲートをかけた後、各々の試料は、10000～13000個の細胞の解析を表している。矢印は、抗CD20抗体とRaji細胞の表面のCD20抗原との結合を示す平均蛍光のシフトを示している。図43Bは、メンブレン上に漸増濃度でスポットされた大腸菌でGST融合体として組換え発現されたCD20の結果を示している。様々な濃度のMabthera(登録商標)又はリツキシマブ_LMTB又は対照抗体(抗マルトース結合タンパク質、大腸菌由来の抗GroEL熱ショックタンパク質、もしくは抗His IgG抗体)或いは一次抗体なしを用いて、メンブレンストリップをインキュベートした。洗浄後、二次抗体を抗ヒトIgG-HRPとした。
図44:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)の比較の略図及びまとめ。HC及びLCのN-末端配列、C末端アミノ酸、並びにグリカンプロファイルがリツキシマブ_LMTBについては右側に、Mabthera(登録商標)については左側に示されている。表示されているジスルフィド架橋は全て、両方の試料で同定された。
図45:様々なキネトプラスト類の完全メチル化を用いたN-グリカンプロファイリング及び定量的比較。クリチディア・ファシキュラータ(Crithidia fasciculata)、クリチジア・デアネイ(Crithidia deanei)(アンゴモナス(Angomonas))、及びフィトモナス・ダビディ(Phytomonas davidii)のN-グリカンをPNGアーゼFによる脱脂質化後に放出させ、完全メチル化した。N-グリカンの相対強度(％)を計算して、各々のスペクトルについてのN-グリカンプロファイルを確立した。このために、脱同位体化されたN-グリカンピークの強度の合計を決定し、100％に設定した。その後、各々のグリカンの相対強度(％)をこの値との関連において決定した。m/z値は、そのフラグメンテーションスペクトルによる確認を含め、ピークの上に注釈が付けられた全てのN-グリカンについて確認されている。
図46A及び46B: SfGnT-IのハイブリッドGnt変異体の局在。図46Bに模式的に示されたネイティブなSfGnT-I又はSfGnT-I触媒ドメインのハイブリッドを発現させ、図46Aに示されるように、培養物SNから又はtriton Xを含む粗ライセート(WCE)から沈殿させた。
図47A及び47B:様々なGnt-Iを発現するリーシュマニア(図47A)及び様々なSf-Gnt-Iハイブリッドを発現するリーシュマニア(図47B)のRFを用いたN-グリカン定量及び比較。細胞ペレット由来の全N-グリカンをPNGアーゼFにより放出させ、RFで標識した。UPLCピークの相対的定量が、糖鎖改変のための最初のGlcNAcのインビボ付加を表す、G0-Gn変換の％で示されている。エラーバーは、数回の独立した実験の標準偏差を示している。m/z値は、G0-Gn及びMan3を含有するUPLCピークについて確認されたが、模擬試料とPNGアーゼF放出試料の間で異なるピークは他に見られなかった。
図48A及び48B:示されているのは、リーシュマニアで発現された様々なシアリルトランスフェラーゼの局在(図48A)及び相対活性(図48B)である。HAタグ化シアリルトランスフェラーゼは、細胞培養物SNと比較したtriton可溶化細胞ライセート由来の親和性濃縮画分(elu)からの抗HA免疫ブロットにより検出される。Eluは、インビトロアッセイに使用された溶出物である(図48A)。
図49A、49B、49C、及び49D:リーシュマニアで発現されたHA親和性濃縮シアリルトランスフェラーゼの2-AB標識G2標準に対するインビトロ活性。図49A:マウスST6GAL1;図49B:ラットST6GAL1、図49C:最適化されたインベルターゼ分泌シグナルを含有する細菌CstI、図49D:マウスST3GAL3。HA濃縮シアリルトランスフェラーゼを用いたG2標準に対するインビトロ反応が示されており、RT比較は市販の標準G2及びシアリル化G2S2(破線矢印)に対して行われ、インビトロ反応は矢印で示され、結果として得られたグリカンピークはアステリスクで示されている。
図50A、50B、50C、50D、及び50E:リーシュマニアにより発現され、濃縮されたmST6GAL1は、フォールディングした全長mAbのガラクトシル化N-グリカンをシアリル化することができる。図50A:細胞ライセートからのマウスST6を発現するリーシュマニアのHA親和性濃縮並びに100％であることが明らかにされている2AB標識G2標準に対するその活性の試験(図50B)及びMabThera Fc N-グリカンに対するその活性の試験(図50C)。N-グリカン組成を、RF MS(図50D)により、mAb(薄灰色)に対して、及び模擬ライセート(黒色のバー)又はHA濃縮mST6GAL1(濃灰色のバー)のいずれかを用いたプロテインA精製Mabtheraのインビトロ反応後に評価した。単鎖及び二分岐の全シアリル化グリカンのまとめが図50Eに示されている。
図51:リーシュマニアにより発現され、濃縮されたmST6GAL1は、ST6反応物がオーバーレイされた模擬反応物のN-グリカンRF-MSプロファイルを有する、UPLC分析で示されているような、フォールディングした全長mAbのガラクトシル化N-グリカンをシアリル化することができる。
図52A及び52B: Sf-Gnt-I及びMGAT2で安定にトランスフェクトされ、リツキシマブをエピソーム性に発現する糖鎖改変株は、リツキシマブ上にG0 N-グリカンを生じさせる。株を1L中で成長させ、分泌されたリツキシマブをプロテインAにより上清から精製し(図52A)、PNGアーゼF及びRF-MS分析に使用し(図52B)、Man3について半定量した。
図53:糖鎖改変のためにリーシュマニアに組換えにより付加することができる原核生物及び真核生物の酵素を含む模式的に表示されたCMP-Neu5Ac経路。
(7.詳細な説明)
本発明は、ネイティブな宿主細胞の性質、並びにN-アセチルグルコサミントランスフェ
ラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを含む、一
連のグリコシルトランスフェラーゼの異種発現との組合せによって、哺乳動物、例えば、
ヒトの治療用糖タンパク質の産生のための宿主株になるように、治療用タンパク質上での
高い部位占有を伴う、均一でかつ完全に機能カスタマイズされたN-グリカンを産生するよ
うに修飾されている単細胞キネトプラスト目の真核宿主細胞に関する。
本発明は、哺乳動物の酵素活性(例えば、N-アセチルグルコサミン伸長、ガラクトシル
化、及びシアリル化に関与するもの)をキネトプラスト類の真核宿主細胞の細胞内区画に
うまくターゲッティングし、発現させるために使用することができる核酸分子及びコンビ
ナトリアルライブラリーを提供する。シアリル化糖タンパク質の産生のためのCMP-シアル
酸生合成経路の設計も提供される。
(7.1 宿主細胞)
ある実施態様において、本発明は、グリコシル化に関与する任意の所望の遺伝子を発現
させ、ターゲッティングするために使用することができる改変された宿主細胞を提供する
。本発明は、哺乳動物、例えば、ヒトの治療用糖タンパク質の産生のための宿主株になる
ように、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ
、及びシアリルトランスフェラーゼを含む、一連のグリコシルトランスフェラーゼの異種
発現によって、機能カスタマイズされ、かつ均一なN-グリカンをタンパク質上に産生する
ように修飾されている真核宿主細胞を提供する。
本発明は、全長治療用抗体を発現させ、ターゲッティングするために使用することがで
きる改変された宿主細胞も提供する。この新規の宿主細胞は、エリスロポエチン又は抗CD
20(リツキシマブ)などの糖タンパク質上の均一でかつ機能カスタマイズされたN-グリカン
を合成し、発現し、かつ分泌する。
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特定の酵素、遺伝子、プラスミド
、及びコンストラクトの使用に限定されない。当業者であれば、N-アセチルグルコサミン
トランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、
及びCMP-Sia生合成経路酵素の合成に関与する遺伝子の任意のホモログ、変異体、及び誘
導体を使用することができる。
特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードす
る組換え核酸;及び(b)異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含む
リーシュマニア宿主細胞である。ある実施態様において、異種グリコシルトランスフェラ
ーゼは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は異種ガラクトシルトラン
スフェラーゼ;及び/又は異種シアリルトランスフェラーゼである。いくつかの実施態様に
おいて、本明細書に提供されるのは、2以上のN-アセチルグルコサミントランスフェラー
ゼを含む宿主細胞である。他の実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含
む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質を
さらに含む。
一態様において、本明細書に提供されるのは、グリコシル化タンパク質を産生すること
ができるリーシュマニア宿主細胞であり、ここで、該リーシュマニア宿主細胞は、(i)天
然OST又は異種/組換えOST;(ii)異種N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラク
トシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、及びCMP-Sia生合成経路酵素
、又はこれらの修飾バージョンをコードするヌクレオチド;並びに(iii)組換え標的タンパ
ク質及び組換え標的タンパク質の修飾バージョンをコードするヌクレオチドを含む。さら
なる実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルト
ランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、表9に掲載
されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラー
ゼ、もしくはシアリルトランスフェラーゼ、又はこれらの任意の機能性ホモログ、アイソ
フォーム、もしくは変異体に由来する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-グリカン生合成経路由来の1以
上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されてい
る宿主細胞である。さらなる実施態様において、該宿主細胞で欠失させられ、突然変異さ
せられ、及び/又は機能的に不活化されている内在性酵素は、alg遺伝子によってコードさ
れる。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-グリカン生合成経路由来の
内在性酵素をコードする1以上の遺伝子が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機
能的に不活化されている宿主細胞である。さらに別の実施態様において、N-グリカン生合
成経路由来の内在性酵素(単数又は複数)をコードする遺伝子(単数又は複数)は、当技術分
野で公知の標準的な技法のいずれかを用いて(例えば、部位特異的相同組換え又はランダ
ム突然変異誘発によって)、欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化
される。ある実施態様において、該宿主細胞は、N-グリカン生合成経路由来の1以上の内
在性酵素を含まないリーシュマニアの株である。
ある実施態様において、リーシュマニア宿主細胞は、リーシュマニア・タレントラエ細
胞である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質を
コードする組換え核酸;及び(b)異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核
酸を含むリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞である。ある実施態様において、異種グ
リコシルトランスフェラーゼは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は
異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は異種シアリルトランスフェラーゼである
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、2以上のN-アセチルグルコ
サミントランスフェラーゼを含む宿主細胞である。他の実施態様において、異種シアリル
トランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia
生合成経路タンパク質をさらに含む。
一態様において、本明細書に提供されるのは、グリコシル化タンパク質を産生すること
ができるリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞であり、ここで、該リーシュマニア・タ
レントラエ宿主細胞は、(i)天然OST又は異種/組換えOST;(ii)異種N-アセチルグルコサミ
ントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ
、及びCMP-Sia生合成経路酵素、又はこれらの修飾バージョンをコードするヌクレオチド;
並びに(iii)組換え標的タンパク質及び組換え標的タンパク質の修飾バージョンをコード
するヌクレオチドを含む。さらなる実施態様において、該N-アセチルグルコサミントラン
スフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラー
ゼのアミノ酸配列は、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ
、ガラクトシルトランスフェラーゼ、もしくはシアリルトランスフェラーゼ、又はこれら
の任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、リーシュマニアシグナル及び/又
は保持配列が、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル
配列が、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラー
ゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲ
ッティングし、該保持配列が、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクト
シルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装
置に保持する、宿主細胞である。別の実施態様において、該保持配列は、該N-アセチルグ
ルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の
小胞体に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミント
ランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のシスゴルジ区
画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントラン
スフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の中間ゴルジ区画に
保持する。別の実施態様において、該保持配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼを
宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、シア
リルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様にお
いて、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼ
を宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該シグナル配列は
、プロセシングされ、除去される。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュ
マニア・タレントラエタンパク質に由来する細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。別
の実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、
又はNTPDアーゼ2に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番
号25、もしくは配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様におい
て、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する。別の実施態様において、
該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様にお
いて、該保持配列は、リーシュマニア又はその機能的活性断片に由来するGRIP配列を含む
。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含
む。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアタンパク質に由来するCT
S配列又はその機能的活性断片及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活
性断片を含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする
組換え核酸;及び(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸
を含むリーシュマニア宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるの
は、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)ガラクトシルトランスフェラー
ゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらに別の実施態様に
おいて、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b
)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞で
ある。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、
CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする
組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及
び(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿
主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質
をコードする組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組
換え核酸;及び(c)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマ
ニア宿主細胞である。さらに別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標
的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換
え核酸;及び(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュ
マニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを
含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質
をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする
組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;(c)
ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(d)シアリルトランスフェ
ラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様
において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させる
ことができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする
組換え核酸;及び(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸
を含むリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書
に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)ガラクトシルト
ランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらに
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組
換え核酸;及び(b)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマ
ニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含
む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質を
さらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする
組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及
び(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア・
タレントラエ宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)
標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ
をコードする組換え核酸;及び(c)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を
含むリーシュマニア宿主細胞である。さらに別の実施態様において、本明細書に提供され
るのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)シアリルトランスフェラーゼを
コードする組換え核酸;及び(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸
を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトラン
スフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成
経路タンパク質をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする
組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;(c)
ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(d)シアリルトランスフェ
ラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様
において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させる
ことができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
ある実施態様において、「異種」という用語は、異なる種由来を意味する。例えば、宿
主細胞内の「異種グリコシルトランスフェラーゼ」は、該宿主細胞以外の種に由来するグ
リコシルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、「異種」という用語は、異
なる株由来のものを意味する。例えば、宿主細胞内の「異種グリコシルトランスフェラー
ゼ」は、該宿主細胞以外の株に由来するグリコシルトランスフェラーゼである。より具体
的な実施態様において、「異種」という用語は、異なる属由来を意味する。例えば、宿主
細胞内の「異種グリコシルトランスフェラーゼ」は、該宿主細胞以外の属に由来するグリ
コシルトランスフェラーゼである。
ある実施態様において、本明細書に提供される方法及び組成物とともに使用されるグリ
コシルトランスフェラーゼは、その野生型遺伝子から遺伝子修飾されているグリコシルト
ランスフェラーゼである。より具体的な実施態様において、そのようなグリコシルトラン
スフェラーゼは、同じ種又は同じ株のものである。他の実施態様において、そのようなグ
リコシルトランスフェラーゼは、同じ属、種、又は株のものである。
(7.2 グリコシルトランスフェラーゼの細胞内局在)
いくつかの実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグ
ルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリル
トランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグルコ
サミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトラ
ンスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は
、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及
び/又はシアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。いくつかの実
施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントラ
ンスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル
配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼ
をリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチル
グルコサミントランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装
置に保持する。いくつかの実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、
N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼに付加
されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ
及びガラクトシルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティ
ングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びガラクトシル
トランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。いくつかの実施態様において、
リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシル
トランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該シアリルトランス
フェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にタ
ーゲッティングし、該保持配列は、該シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトラ
ンスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサ
ミントランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグ
ルコサミントランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし
、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置
に保持する。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチ
ルグルコサミントランスフェラーゼのN-末端に融合されている。別の実施態様において、
リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼの
C-末端に融合されている。さらなる実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持
配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼのN-末端に融合されていない。他の
実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミント
ランスフェラーゼのC-末端に融合されていない。他の実施態様において、リーシュマニア
シグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼのポリペプチド内
の1以上のアミノ酸に融合されている。
他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトラン
スフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該ガラクトシルトランスフ
ェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該ガ
ラクトシルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。他の実施態様におい
て、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼのN-末端
に融合されている。別の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガ
ラクトシルトランスフェラーゼのC-末端に融合されている。さらなる実施態様において、
リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼのN-末端に融
合されていない。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラ
クトシルトランスフェラーゼのC-末端に融合されていない。他の実施態様において、リー
シュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼのポリペプチド内
の1以上のアミノ酸に融合されている。
他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフ
ェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該シアリルトランスフェラーゼ
をリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該シアリルト
ランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。他の実施態様において、リーシュ
マニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼのN-末端に融合されている
。別の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフ
ェラーゼのC-末端に融合されている。さらなる実施態様において、リーシュマニアシグナ
ル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼのN-末端に融合されていない。他の実施
態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼの
C-末端に融合されていない。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配
列は、シアリルトランスフェラーゼのポリペプチド内の1以上のアミノ酸に融合されてい
る。
別の実施態様において、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及
び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の小胞体に保持する。別の実施態様
において、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラク
トシルトランスフェラーゼを宿主細胞のシスゴルジ区画に保持する。別の実施態様におい
て、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシル
トランスフェラーゼを宿主細胞の中間ゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該
保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持す
る。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼを宿主細胞のト
ランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランス
フェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持
する。
別の実施態様において、該シグナル配列及び/又は保持配列は、任意のリーシュマニア
種に由来するシグナル配列又は保持配列である。さらなる実施態様において、該シグナル
配列及び/又は保持配列は、リーシュマニア・タレントラエに由来するシグナル配列又は
保持配列である。
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニア・タレントラエタンパク質
に由来する細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。別の実施態様において、該CTS配列は
、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2に由来する。別の
実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26の配列
、又はその機能的活性断片を含む。
別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する。別
の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。
さらなる実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエMAN1に由来す
るCTSと少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、8
0％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93
％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である。別の実施態様におい
て、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％
、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98
％、99％、又は100％同一である配列を含む。
別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエNTPDアーゼ1に由来す
る。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号25の配列又はその機能的活性断片を
含む。さらなる実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエNTPDア
ーゼ1に由来するCTSと少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91
％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である。別の実
施態様において、該CTS配列は、配列番号25の配列又はその機能的活性断片と少なくとも
約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96
％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。
別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエNTPDアーゼ2に由来す
る。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号26の配列又はその機能的活性断片を
含む。さらなる実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエNTPDア
ーゼ2に由来するCTSと少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91
％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である。別の実
施態様において、該CTS配列は、配列番号26の配列又はその機能的活性断片と少なくとも
約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96
％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアに由来するGRIP配列又はそ
の機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又は
その機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニア
に由来するGRIP配列又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74
％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％
、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしく
は100％同一である。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又はその
機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％
、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアタンパク質に由来するCTS
配列又はその機能的活性断片及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性
断片を含む。別の実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアタンパク質に由来す
るもの又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76
％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％
、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であ
るCTS配列及びリーシュマニアに由来するもの又はその機能的活性断片と少なくとも約70
％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％
、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、又は100％同一であるGRIP配列である。
別の実施態様において、該標的タンパク質は、リーシュマニア由来のシグナル配列を含
むように改変されている。他の実施態様において、該シグナル配列は、リーシュマニア・
タレントラエ由来のシグナル配列である。いくつかの実施態様において、該シグナル配列
は、配列番号28もしくは配列番号29の配列又はその機能的活性断片を含む。具体的な実施
態様において、該シグナル配列は、配列番号28の配列又はその機能的活性断片を含む。さ
らに別の実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28の配列又はその機能的活性断
片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％
、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。他の実施態様
において、該シグナル配列は、プロセシングされ、該標的タンパク質から除去される。
(7.3 N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ)
特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のもの
ではないN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマ
ニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイ
ブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼである。
ある実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは
、リーシュマニア・タレントラエ由来のものである。
他の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは
、シグナル配列及び少なくとも1つの保持配列を含むように改変されており、ここで、該
シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをリーシュマニア・タレ
ントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサ
ミントランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
別の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは
、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを小胞体に保持する。別の実施態様にお
いて、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグル
コサミントランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハ
イブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグルコサミント
ランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する。
さらなる実施態様において、該保持配列は、細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。
別の実施態様において、該CTS配列は、MAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2のアミノ酸
配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは
配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該CTSは、M
AN1のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又は
その機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27のア
ミノ酸配列を含む。
別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-Iであ
る。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-IIで
ある。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-I
及びGnT-IIである。ある他の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェ
ラーゼは、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はその
機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。当技術分野で公知の任意
のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はそれをコードする核酸を本明細書に
記載される宿主細胞及び方法に合わせて使用することができる。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ヒト(H
omo sapiens)のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1である。別の実施態様に
おいて、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ヒトのマンノシル(α-1,6-)-
糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態
様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ヒト種のN-アセチルグル
コサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミ
ントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ヒトのN-アセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼ1又はマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％
、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ツマジ
ロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1
である。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ツマ
ジロクサヨトウのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2である。ある実施態様
において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ツマジロクサヨトウ種のN-
アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチ
ルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ツマジロクサヨトウの
N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1又はN-アセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼ2と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相
同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、トリパ
ノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラー
ゼ1である。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、
トリパノソーマ・ブルセイのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2である。あ
る実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、トリパノソーマ
・ブルセイ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例
えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、トリ
パノソーマ・ブルセイのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1又はN-アセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼ2と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、9
7％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ラット
(Rattus norvegicus)のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2である。ある実施
態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ラット種のN-アセチル
グルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコ
サミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ラットのN-アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ1又はN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2と約70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ボノボ
(Pan paniscus)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニル
トランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランス
フェラーゼは、ボノボ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるもの
である。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核
酸は、ボノボのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99
％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、イヌ(C
anis lupus familiaris)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコ
サミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミン
トランスフェラーゼは、イヌ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であ
るものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコード
する核酸は、イヌのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又
は99％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ウシ(B
os taurus)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトラ
ンスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェ
ラーゼは、ウシ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである
。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、
ウシのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同で
ある。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、マウス
(Mus musculus)のマンノシドアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2である。ある
実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、マウス種のN-アセ
チルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグ
ルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、マウスのマンノシドアセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼ2と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％
、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ラット
のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、
ラット種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば
、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ラットの
マンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラー
ゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ニワト
リ(Gallus gallus)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントラ
ンスフェラーゼは、ニワトリ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であ
るものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコード
する核酸は、ニワトリのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％
、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ネッタ
イツメガエル(Xenopus tropicalis)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグ
ルコサミントランスフェラーゼは、ネッタイツメガエル種のN-アセチルグルコサミントラ
ンスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフ
ェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ネッタイツメガエルのマンノシル(α-1,6-)-糖タ
ンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ゼブラ
フィッシュ(Danio rerio)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグル
コサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミ
ントランスフェラーゼは、ゼブラフィッシュ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラ
ーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又
はそれをコードする核酸は、ゼブラフィッシュのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-
1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ガンビエハ
マダラカ(Anopheles gambiae)のAgaP_AGAP004397(GI: 1274542)である。ある実施態様に
おいて、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ガンビエハマダラカ種のN-ア
セチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチル
グルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ガンビエハマダラカのAg
aP_AGAP004397(GI: 1274542)と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98
％、又は99％相同である。
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫(Caeno
rhabditis elegans)のAgaP_AGAP004397(GI: 1274542)である。ある実施態様において、該
N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫種のN-アセチルグルコサミントラン
スフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェ
ラーゼ又はそれをコードする核酸は、線虫のAgaP_AGAP004397(GI: 1274542)と約70％、75
％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫のgly-
20(GI: 179562)である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェ
ラーゼは、線虫種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである
。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、
線虫のgly-20(GI: 179562)と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％
、又は99％相同である。
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、シロイヌナ
ズナ(Arabidopsis thaliana)のβ-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII
である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、シロ
イヌナズナ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例
えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、シロ
イヌナズナのgly β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIと約70％、75
％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫のgly-
20(GI: 179562)である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェ
ラーゼは、線虫種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである
。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、
線虫のgly-20(GI: 179562)と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％
、又は99％相同である。
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ニホンヤモ
リ(Gekko japonicus)の予測上のα-1,3-マンノシル-糖タンパク質 2-β-N-アセチルグル
コサミニルトランスフェラーゼ(XP_015280466.1)である。ある実施態様において、該N-ア
セチルグルコサミントランスフェラーゼは、ニホンヤモリ種のN-アセチルグルコサミント
ランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランス
フェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ニホンヤモリのXP_015280466.1と約70％、75％
、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドN-アセチルグルコサ
ミントランスフェラーゼをコードする核酸である。
(7.4 ガラクトシルトランスフェラーゼ)
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のも
のではないガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマニアの小
胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含むハイブリッドガ
ラクトシルトランスフェラーゼである。
別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、リーシュ
マニア・タレントラエ由来のものである。
さらなる実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、シグ
ナル配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし
、該保持配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する
。
ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクト
シルトランスフェラーゼを小胞体に保持する。ある実施態様において、該ハイブリッドガ
ラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼをシスゴルジ装置に
保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、
ガラクトシルトランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、
該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼを
トランスゴルジ装置に保持する。
他の実施態様において、該保持配列は、細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。さら
なる実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、GRIP配列で
ある。ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、CTS
配列及びGRIP配列である。別の実施態様において、該CTS配列は、MAN1、NTPDアーゼ1、又
はNTPDアーゼ2のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24
、配列番号25、もしくは配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。別の実施態
様において、該CTSは、MAN1のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は
、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該GRIP
配列は、配列番号27のアミノ酸配列を含む。
他の実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、表9に掲載されている
ガラクトシルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは
変異体に由来する。当技術分野で公知の任意のガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれ
をコードする核酸を本明細書に記載される宿主細胞及び方法に合わせて使用することがで
きる。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヒトのβ-1,4-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ1(B4GALT1)である。ある実施態様において、該ガラクトシ
ルトランスフェラーゼは、ヒトの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるもの
である。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ヒト
のβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、チンパンジーのβ
-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシル
トランスフェラーゼは、チンパンジーの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であ
るものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は
、チンパンジーのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％
、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、アカゲザル(Macac
a mulatta)のβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、
該ガラクトシルトランスフェラーゼは、アカゲザルの種のガラクトシルトランスフェラー
ゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコー
ドする核酸は、アカゲザルのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、イヌのβ-1,4-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトラン
スフェラーゼは、イヌの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。
例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、イヌのβ-1,4
-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97
％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ウシのβ-1,4-ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトラン
スフェラーゼは、ウシの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。
例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ウシのβ-1,4
-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97
％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、マウスのβ-1,4-
ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、マウスの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものであ
る。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、マウスの
β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96
％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ラットのβ-1,4-
ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、ラットの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものであ
る。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ラットの
β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96
％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ニワトリのβ-1,4
-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、ニワトリの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるもので
ある。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ニワト
リのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％
、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ネッタイツメガエ
ルのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラク
トシルトランスフェラーゼは、ネッタイツメガエルの種のガラクトシルトランスフェラー
ゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコー
ドする核酸は、ネッタイツメガエルのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％
、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ゼブラフィッシュ
のβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクト
シルトランスフェラーゼは、ゼブラフィッシュの種のガラクトシルトランスフェラーゼと
相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードす
る核酸は、ゼブラフィッシュのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％
、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
さらなる実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドガラクトシルト
ランスフェラーゼをコードする核酸である。
(7.5 シアリルトランスフェラーゼ)
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のも
のではないシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマニアの小胞体
又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッドシア
リルトランスフェラーゼである。
別の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、リーシュマニ
ア・タレントラエ由来のものである。
ある実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、シグナル配列
を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該シアリルトランスフェラー
ゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列
は、該シアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。別の実施態様に
おいて、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼを
トランスゴルジ装置に保持する。
別の実施態様において、該保持配列は、CTS配列である。さらなる実施態様において、
該保持配列は、GRIP配列である。他の実施態様において、該保持配列は、CTS配列及びGRI
P配列である。別の実施態様において、該CTS配列は、MAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアー
ゼ2のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号
25、もしくは配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において
、該CTSは、MAN1のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号
24の配列又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番
号27の配列又はその機能的活性断片を含む。
別の実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、2,6-SiaT又は2,3-SiaTであ
る。ある他の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、表9に
掲載されているシアリルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム
、もしくは変異体に由来する。N-グリコシル化コンセンサス配列、例えば、Asn-X-Ser(Th
r)(ここで、Xは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる)中のAsn残基(又は他の関
連残基)に連結されているN-グリカンに連結された単糖(例えば、ガラクトース)に1以上の
シアル酸残基を付加することができる任意のシアリルトランスフェラーゼ又はそれをコー
ドする核酸を本明細書に記載される方法に合わせて使用することができ、例えば、本明細
書に記載される宿主細胞に組み込むことができる。当技術分野で公知の任意のシアリルト
ランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸を本明細書に記載される宿主細胞及び方法に
合わせて使用することができる。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのβ-ガラクトシ
ド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1である。別の具体的な実施態様において、該シ
アリルトランスフェラーゼは、ヒトのβ-ガラクトシド α-2,3-シアリルトランスフェラ
ーゼ4である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのシアリ
ルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ
又はそれをコードする核酸は、ヒトのβ-ガラクトシド α-2,6-シアリルトランスフェラ
ーゼ1又はβ-ガラクトシド α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ4と約70％、75％、80％
、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、マウスのβ-ガラクト
シド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1である。別の具体的な実施態様において、該
シアリルトランスフェラーゼは、マウスのβ-ガラクトシド α-2,3-シアリルトランスフ
ェラーゼ3である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、マウスの
シアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェ
ラーゼ又はそれをコードする核酸は、マウスのβ-ガラクトシド α-2,6-シアリルトラン
スフェラーゼ1又はβ-ガラクトシド α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ3と約70％、75
％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、ラットのβ-ガラクト
シド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該シアリル
トランスフェラーゼは、ラットの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものであ
る。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ラットのβ-
ガラクトシド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％
、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジ
ェジュニ(Campylobacter jejuni)のα-2,3-シアリルトランスフェラーゼである。ある実
施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニの種
のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフ
ェラーゼ又はそれをコードする核酸は、カンピロバクター・ジェジュニのα-2,3-シアリ
ルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又
は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジ
ェジュニのα-2,3/8-シアリルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該シ
アリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ種のシアリルトランスフェ
ラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコー
ドする核酸は、カンピロバクター・ジェジュニのα-2,3/8-シアリルトランスフェラーゼ
と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、パスツレラ・ムルトシ
ダ(Pasteurella multocida)(AAY89061.1)のα-2,3/2,6-シアリルトランスフェラーゼであ
る。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、パスツレラ・ムルトシダ
の種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトラン
スフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、パスツレラ・ムルトシダのα-2,3/2,6-シア
リルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・
ダムセラ(Photobacterium damselae)のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(BAA25316.1)
である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム
・ダムセラの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シア
リルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテリウム・ダムセラの
α-2,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、9
7％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・
ダムセラの仮想上のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(WP_005298232.1)である。ある
実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・ダムセラの
種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランス
フェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテリウム・ダムセラのα-2,6-シア
リルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・
レイオグナチ(Photobacterium leiognathi)の仮想上のα-2,6-シアリルトランスフェラー
ゼ(BAF91416.1)である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォ
トバクテリウム・レイオグナチの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものであ
る。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテ
リウム・レイオグナチのα-2,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85
％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・
レイオグナチの仮想上のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(BAI49484.1)である。ある
実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・レイオグナ
チの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトラ
ンスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテリウム・レイオグナチのα-2
,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％
、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム属
の種の仮想上のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(BAF92026.1)である。ある実施態様
において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム属種の種のシアリルト
ランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又は
それをコードする核酸は、フォトバクテリウム属の種のα-2,6-シアリルトランスフェラ
ーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である
。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドシアリルトランスフ
ェラーゼをコードする核酸である。
(7.6 CMP-Sia生合成経路)
他の実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuA
cを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
さらなる実施態様において、CMP-NeuAcを生成させることができるCMP-Sia生合成経路タ
ンパク質は、表11に掲載されているCMP-Sia生合成経路タンパク質又はその任意の機能性
ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74
％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％
、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしく
は100％同一である。当技術分野で公知の任意のシアル酸生合成酵素又はそれをコードす
る核酸を本明細書に記載される宿主細胞及び方法に合わせて使用することができる。
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、マウスのUDP-GlcNAc 2-エピメ
ラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼである。別の実施態様において、該シアル酸生
合成酵素は、マウスのCMP-シアル酸トランスポーターである。ある実施態様において、該
シアル酸生合成酵素は、マウスの種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例え
ば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、マウスのUDP-GlcNAc 2-エピメ
ラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼ又はCMP-シアル酸トランスポーターと約70％、7
5％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのUDP-N-GlcNAc 2-エピメ
ラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼである。具体的な実施態様において、該シアル
酸生合成酵素は、ヒトのN-アセチルノイラミン酸ホスフェートシンターゼである。別の実
施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのNeu5Ac-9-Pホスファターゼである。具
体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのCMP-シアル酸シンテターゼで
ある。他の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのCMP-Neu5Acトランスポー
ターである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトの種のシアル酸生合
成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核
酸は、ヒトのUDP-N-GlcNAc 2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼ、N-アセチ
ルノイラミン酸ホスフェートシンターゼ、Neu5Ac-9-Pホスファターゼ、CMP-シアル酸シン
テターゼ、又はCMP-Neu5Acトランスポーターと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ラットのUDP-N-GlcNAc 2-エピ
メラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼである。ある実施態様において、該シアル酸
生合成酵素は、ラットの種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シ
アル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、ラットのUDP-N-GlcNAc 2-エピメラーゼ/
N-アセチルマンノサミンキナーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％
、98％、又は99％相同である。他の実施態様において、ラットのUDP-N-GlcNAc 2-エピメ
ラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼは、シアル酸尿症患者のGNE/MNK由来の点突然変
異を有する(Sonらの文献、2011)。
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌(Neisseria meningiti
dis)のCMP-シアル酸シンテターゼである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素
は、髄膜炎菌のUDP-N-アセチルグルコサミン 2-エピメラーゼである。具体的な実施態様
において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のCMP-シアル酸シンターゼである。ある実
施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌の種のシアル酸生合成酵素と相同で
あるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、髄膜炎菌
のCMP-シアル酸シンテターゼ、UDP-N-アセチルグルコサミン 2-エピメラーゼ、又はCMP-
シアル酸シンターゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は
99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、大腸菌K1のCMP-シアル酸シンテ
ターゼである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、大腸菌K1のUDP-N-アセ
チルグルコサミン 2-エピメラーゼである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合
成酵素は、大腸菌K1のCMP-シアル酸シンターゼである。ある実施態様において、該シアル
酸生合成酵素は、大腸菌K1の種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、
該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、大腸菌K1のCMP-シアル酸シンテター
ゼ、UDP-N-アセチルグルコサミン 2-エピメラーゼ、又はCMP-シアル酸シンターゼと約70
％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、カンピロバクター・ジェジュニ
のN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼ(CAM09378.1)であるGNPEである。
別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、カンピロバクター・ジェジュニのN-ア
セチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼである。具体的な実施態様において、該
シアル酸生合成酵素は、カンピロバクター・ジェジュニのN-アセチルグルコサミン-6-リ
ン酸 2'-エピメラーゼシンターゼである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素
は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼの種のシアル酸生合成酵素と相
同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、カン
ピロバクター・ジェジュニのN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼと約70
％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のN-アセチルグルコサ
ミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼ(AAY27727.1)であるGNPEである。別の実施態様において
、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラ
ーゼである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のN-アセチ
ルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼシンターゼである。ある実施態様において、
該シアル酸生合成酵素は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼの種のシ
アル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコ
ードする核酸は、髄膜炎菌のN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼと約70
％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、コリネバクテリウム・グルタミ
クム(Corynebacterium glutamicum)のN-アセチルノイラミン酸リアーゼ(NP_601846.1)で
あるCgNalである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムのN-アセチルノイラミン酸リアーゼであるCgNalである。具体的な実施
態様において、該シアル酸生合成酵素は、コリネバクテリウム・グルタミクムのN-アセチ
ルノイラミン酸リアーゼであるCgNalである。ある実施態様において、該シアル酸生合成
酵素は、N-アセチルノイラミン酸リアーゼであるCgNalの種のシアル酸生合成酵素と相同
であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、コリネ
バクテリウム・グルタミクムのN-アセチルノイラミン酸リアーゼであるCgNalと約70％、7
5％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である(Jiらの文献、20
15)。
(7.7 リーシュマニア属及びキネトプラスト目の株)
本明細書で使用される場合、宿主細胞は、リーシュマニア細胞である。ある実施態様に
おいて、宿主細胞は、リーシュマニア・タレントラエ細胞である。他の実施態様において
、宿主細胞は、表13のリーシュマニア株である。
ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・エチオピカ(Leishmania aethio
pica)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・エチオピカ種
複合体の一部である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・アリスチデ
シ(Leishmania aristidesi)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュ
マニア・デアネイ(Leishmania deanei)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は
、リーシュマニア・ドノバニ(Leishmania donovani)種複合体の一部である。ある実施態
様において、宿主細胞は、リーシュマニア・ドノバニ細胞である。ある実施態様において
、宿主細胞は、リーシュマニア・カガシ(Leishmania chagasi)細胞である。ある実施態様
において、宿主細胞は、リーシュマニア・インファンツム(Leishmania infantum)細胞で
ある。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・ヘルチギ(Leishmania hert
igi)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・メジャー(Leish
mania major)種複合体の一部である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニ
ア・メジャー細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・マルチ
ニクエンシス(Leishmania martiniquensis)細胞である。ある実施態様において、宿主細
胞は、リーシュマニア・メキシカーナ(Leishmania mexicana)種複合体の一部である。あ
る実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・メキシカーナ細胞である。ある実施
態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・ピファノイ(Leishmania pifanoi)細胞であ
る。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・トロピカ(Leishmania tropic
a)種複合体の一部である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・トロピ
カ細胞である。
ある実施態様において、宿主細胞は、キネトプラストのボド科(bodonidae)ファミリー
に属する。具体的な実施態様において、宿主細胞は、ボド・サルタンス(Bodo saltans)細
胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、キネトプラストのイクチオボド科(ichth
yobodonidae)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、キネトプラスト
のトリパノソーマ科(trypanosomatidae)ファミリーに属する。
ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のブラストクリチジア(blastoc
rithidia)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科
のブレコモナス(blechomonas)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は
、トリパノソーマ科のヘルペトモナス(herpetomonas)ファミリーに属する。ある実施態様
において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のハエニモナス(jaenimonas)ファミリーに属す
る。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のラフォンテルラ(lafontell
a)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のリーシ
ュマニア(leishmaniinae)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、ト
リパノソーマ科のノビモナス(novymonas)ファミリーに属する。ある実施態様において、
宿主細胞は、トリパノソーマ科のパラトリパノソーマ(paratrypanosoma)ファミリーに属
する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のフィトモナス(phytomona
s)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のセルゲ
イア(sergeia)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソー
マ科のストリゴモナジナエ(strigomonadinae)ファミリーに属する。ある実施態様におい
て、宿主細胞は、トリパノソーマ科のトリパノソーマ(trypanosoma)ファミリーに属する
。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のワルラセモナス(wallacemona
s)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のブラス
トクリチジア(blastocrithidia)ファミリーに属する。
(7.8 さらなる改変リーシュマニア宿主細胞)
ある実施態様において、本明細書で使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば、1以上
のキャリアタンパク質をコードする異種核酸及び/又は1以上のタンパク質をコードする異
種核酸、例えば、1以上のタンパク質をコードする遺伝子を含むように改変される。別の
具体的な実施態様において、異種核酸は、本明細書に提供される挿入方法を用いて、本明
細書に記載される宿主細胞に導入される。
ある実施態様において、さらなる修飾を本明細書に記載される宿主細胞に(例えば、組
換え技法を用いて)導入してもよい。例えば、競合又は妨害する可能性のあるグリコシル
化経路の一部を形成する(例えば、宿主細胞に組換え導入されるグリコシル化に関与する1
以上の異種遺伝子と競合するか又は該遺伝子を妨害する)タンパク質をコードする宿主細
胞核酸(例えば、遺伝子)を、それらが不活性/機能不全になるように宿主細胞バックグラ
ウンド(ゲノム)で欠失させるか又は修飾することができる(すなわち、欠失させられる/修
飾される宿主細胞核酸は、機能的タンパク質をコードしないか、又は何であれタンパク質
をコードしない)。ある実施態様において、核酸を本明細書に提供される宿主細胞のゲノ
ムから欠失させる場合、それを所望の配列、例えば、糖タンパク質産生に有用である配列
に置換する。そのような置換は、本明細書に記載される挿入方法のうちの1つ又は複数に
よるものであることができ、ここで、宿主細胞に挿入される異種挿入DNAは、宿主細胞か
ら欠失させられる遺伝子の機能を置換することができる。
ある実施態様において、本明細書に提供される宿主細胞は、遺伝子欠失を含み、ここで
、対象となるDNA配列は、遺伝子欠失の部位で宿主細胞ゲノムに挿入されている。具体的
な実施態様において、本明細書に提供される宿主細胞は、遺伝子欠失を有するリーシュマ
ニアである。
(7.9 宿主細胞への核酸の導入)
当技術分野で公知の任意の方法を用いて、核酸(例えば、その遺伝子断片)を宿主細胞、
例えば、リーシュマニア・タレントラエに導入することができる。
ある実施態様において、異種核酸は、プラスミドを用いて、本明細書に記載される宿主
細胞に導入され、例えば、異種核酸は、プラスミド(例えば、発現ベクター)によって、宿
主細胞で発現され、該プラスミドは、トランスフェクション、感染、もしくはエレクトロ
ポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、自然な形質転換、ファージ導入、又は
コンジュゲーションによって、修飾された宿主細胞に導入される。具体的な実施態様にお
いて、該プラスミドは、安定なトランスフェクションによって、修飾された宿主細胞に導
入される。
具体的な実施態様において、線状化された異種核酸は、トランスフェクション、感染、
もしくはエレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、自然な形質転換、
ファージ導入、又はコンジュゲーションを用いて、本明細書に記載される宿主細胞に導入
される。さらなる実施態様において、異種核酸は、相同組換えによって、宿主細胞ゲノム
に部位特異的に組み込まれる。
(7.10 グリコシル化標的タンパク質産生の方法)
本明細書に提供されるのは、N-グリコシル化標的タンパク質を産生する方法である。
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される宿主細胞を用
いて、グリコシル化標的タンパク質をインビボで産生する方法である。具体的な実施態様
において、本明細書に提供されるのは、グリコシル化標的タンパク質を産生する方法であ
って、(i)本明細書に提供される宿主細胞をタンパク質産生に好適な条件下で培養するこ
と、及び(ii)該標的タンパク質を単離することを含む、方法である。具体的な実施態様に
おいて、該宿主細胞は、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)異種グリコ
シルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含む。ある実施態様において、該異種
グリコシルトランスフェラーゼは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;又は異
種ガラクトシルトランスフェラーゼ;又は異種シアリルトランスフェラーゼである。ある
実施態様において、該宿主細胞は、リーシュマニア細胞である。
ある実施態様において、提供される宿主細胞によって産生される標的タンパク質は、治
療用タンパク質、すなわち、疾患又は障害の治療で使用されるタンパク質である。例えば
、本明細書に提供される宿主細胞によって産生される標的タンパク質は、酵素、サイトカ
イン、又は抗体であることができ、ここで、該標的タンパク質は、グリコシル化、例えば
、シアリル化されている。標的タンパク質の非限定的なリストは、下の第7.12節に提供さ
れている。
(7.11 細胞を培養する方法)
本明細書に提供されるのは、宿主細胞を培養する方法である。
一実施態様において、宿主細胞は、当技術分野で公知の標準的な培養技法のいずれかを
用いて培養される。例えば、細胞は、全て5ug/mlのヘミンを含有する、ブレインハートイ
ンフュージョン、トリプチケースソイブロス、又は酵母抽出液のようなリッチ培地中で、
常法により培養される。さらに、インキュベーションは、静止又は振盪培養として、暗所
26℃で、2～3日間行われる。いくつかの実施態様において、組換え細胞株の培養物は、適
切な選択剤を含有する。選択剤の非限定的なリストは、表9に提供されている。
(7.12 標的タンパク質)
当技術分野で公知の任意のタンパク質(又は該タンパク質に対応するペプチド/ポリペプ
チド)を本明細書に記載される方法に合わせて標的タンパク質として使用することができ
る。当業者は、既知のタンパク質及び新たに同定されたタンパク質の核酸配列を当技術分
野で公知の方法を用いて容易に推定することができ、したがって、対象となる任意のタン
パク質をコードする核酸を本明細書に提供される宿主細胞に導入すること(例えば、発現
ベクター、例えば、プラスミドによるもの、例えば、相同組換えによる部位特異的組込み
)が十分に当業者の能力の範囲内であることを容易に理解するであろう。
他の実施態様において、標的タンパク質は、ヒトインターフェロン-α(INF-α)、イン
ターフェロン-β(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、
キメラジフテリアトキシン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(IL
1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、腫瘍
壊死因子アルファ(TNF-α)、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インス
リン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1
アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状
腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)
、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長
因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(FGF20)、線維芽細胞成
長因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3
、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリ
スロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因
子(GM-CSF)、CTLA4の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)、又はTNF受容体の細胞外ドメ
イン(例えば、FC-融合体)のアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、本明細書
に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用される標的タンパク質は、酵素又は阻害因
子である。標的タンパク質として使用することができる例示的な酵素及び阻害因子として
は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロ
ンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びtPA変異体、
ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシ
ダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルファーゼ(イズロン酸-2-
スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、
ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNアーゼ-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-
アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダー
ゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害因子(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、
膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、及びアデノシンデアミナーゼが挙げられ
るが、これらに限定されない。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用さ
れる標的タンパク質は、サイトカインである。標的タンパク質として使用することができ
る例示的なサイトカインとしては、インターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β
(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリア
トキシン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、I
L4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、及び腫瘍壊死因子アル
ファ(TNF-α)が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用さ
れる標的タンパク質は、ホルモン又は成長因子である。標的タンパク質として使用するこ
とができる例示的なホルモン及び成長因子としては、インスリン、プラムリンタイド、成
長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、
グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GH
RH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形
成タンパク質7(hBMP7)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(K
GF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(F
GF20)、線維芽細胞成長因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、
ニューロトロフィン-3、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、
ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、及び顆粒球-マク
ロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用さ
れる標的タンパク質は、受容体である。標的タンパク質として使用することができる例示
的な受容体としては、ヒトCTLA4の細胞外ドメイン(例えば、Fcに融合されているもの)及
び可溶性TNF受容体(例えば、Fcに融合されているもの)が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
他の実施態様において、標的タンパク質は、治療用タンパク質である。他の実施態様に
おいて、標的タンパク質は、認可された生物製剤である。別の実施態様において、治療用
タンパク質は、アバタセプト(例えば、Orencia)、アフリベルセプト(例えば、Eylea)、ア
ガルシダーゼベータ(例えば、Fabrazyme)、アルビグルチド(例えば、Eperzan)、アルデス
ロイキン(例えば、Proleukin)、アレファセプト(例えば、Amevive)、アルグルセラーゼ(
例えば、Ceredase)、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、LUMIZYME)、アリスキレン(例
えば、Tekturna)、アルファ-1-プロテイナーゼ阻害因子(例えば、Aralast)、アルテプラ
ーゼ(例えば、Activase)、アナキンラ(例えば、Kineret)、アニストレプラーゼ(例えば、
Eminase)、ヒト炭疽菌免疫グロブリン(例えば、ANTHRASIL)、抗血友病因子(例えば、Adva
te)、アンチインヒビター血液凝固複合体(例えば、Feiba Nf)、アンチトロンビンアルフ
ァ、ヒトアンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリン(例えば、抗胸腺細胞グロブリン)
、抗胸腺細胞グロブリン(ウマ)(例えば、ATGAM)、抗胸腺細胞グロブリン(ウサギ)(例えば
、ATG-Fresenius)、アプロチニン(例えば、Trasylol)、アスフォターゼアルファ、アスパ
ラギナーゼ(例えば、Elspar)、エルウィニア・クリサンテミのアスパラギナーゼ(例えば
、Erwinaze)、ベカプレルミン(例えば、REGRANEX)、ベラタセプト(例えば、Nulojix)、ベ
ラクタント、ビバリルジン(例えば、Angiomax)、A型ボツリヌストキシン(例えば、BOTOXE
)、B型ボツリヌストキシン(例えば、Myobloc)、ブレンツキシマブベドチン(例えば、Adce
tris)、ブセレリン(例えば、Suprecur)、C1エステラーゼ阻害因子(ヒト)、C1エステラー
ゼ阻害因子(組換え体)(例えば、Ruconest)、セルトリズマブペゴール(例えば、Cimzia)、
コリオゴナドトロピンアルファ(例えば、コリオゴナドトロピンアルファ)、絨毛性ゴナド
トロピン(ヒト)(例えば、Ovidrel)、絨毛性ゴナドトロピン(組換え体)(例えば、Ovitrell
e)、凝固因子ix(例えば、Alprolix)、凝固因子VIIa(例えば、NovoSeven)、ヒト凝固因子X
(例えば、Coagadex)、凝固因子XIIIA-サブユニット(組換え体)、コラゲナーゼ(例えば、C
ordase)、コネスタットアルファ、コルチコトロピン(例えば、H.P.Acthar)、コシントロ
ピン(例えば、Cortrosyn)、ダルベポエチンアルファ(例えば、Aranesp)、デフィブロチド
(例えば、Noravid)、デニロイキンディフチトクス(例えば、Ontak)、デシルジン、ジゴキ
シン免疫Fab(ヒツジ)(例えば、DIGIBIND)、ドルナーゼアルファ(例えば、Pulmozyme)、ド
ロトレコギンアルファ(例えば、Xigris)、デュラグルチド、エフモロクトコグアルファ(
例えば、ELOCTA)、エロスルファーゼアルファ、エンフュービルタイド(例えば、FUZEON)
、エポエチンアルファ(例えば、Binocrit)、エポエチンゼータ(例えば、Retacrit)、エプ
チフィバチド(例えば、INTEGRILIN)、エタネルセプト(例えば、Enbrel)、エキセナチド(
例えば、Byetta)、第IX因子複合体(ヒト)(例えば、AlphaNine)、フィブリノリジン、別名
、プラスミン(例えば、Elase)、フィルグラスチム(例えば、N.A.)、フィルグラスチム-sn
dz、フォリトロピンアルファ(例えば、Gonal-F)、フォリトロピンベータ(例えば、Follis
tim AQ)、ガルスルファーゼ(例えば、Naglazyme)、胃内因子、ゲムツズマブオゾガマイシ
ン(例えば、Mylotarg)、グラチラマー酢酸塩(例えば、Copaxone)、グルカゴン組換え体(
例えば、GlucaGen)、グルカルピダーゼ(例えば、Voraxaze)、グラミシジンD(例えば、Neo
sporin)、B型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒト破傷風菌トキソイド免疫グロ
ブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン(例えば、Hyperabヒト狂犬病免疫グロブリン
)、ヒトRho(D)免疫グロブリン(例えば、Hyp Rho D Inj 16.5％)、ヒト血清アルブミン(例
えば、Albuminar)、ヒト水痘・帯状疱疹免疫グロブリン(例えば、Varizig)、ヒアルロニ
ダーゼ(例えば、HYLENEX)、ヒアルロニダーゼ(ヒト組換え体)、イブリツモマブチウキセ
タン(例えば、Zevalin)、イズルスルファーゼ(例えば、Elaprase)、イミグルセラーゼ(例
えば、Cerezyme)、ヒト免疫グロブリン、インスリンアスパルト(例えば、NovoLog)、ウシ
インスリン、インスリンデグルデク(例えば、Tresiba)、インスリンデテミル(例えば、LE
VEMIR)、インスリングラルギン(例えば、Lantus)、インスリングルリジン(例えば、APIDR
A)、インスリンリスプロ(例えば、Humalog)、ブタインスリン(例えば、Iletin II)、レギ
ュラーインスリン(例えば、Humulin R)、ブタインスリン(例えば、vetsulin)、イソフェ
ンインスリン(例えば、Novolin N)、インターフェロンアルファ-2a、組換え体(例えば、R
oferon A)、インターフェロンアルファ-2b(例えば、INTRON A)、インターフェロンアルフ
ァコン-1(例えば、INFERGEN)、インターフェロンアルファ-n1(例えば、Wellferon)、イン
ターフェロンアルファ-n3(例えば、Alferon)、インターフェロンベータ-1a(例えば、Avon
ex)、インターフェロンベータ-1b(例えば、Betaseron)、インターフェロンガンマ-1b(例
えば、Actimmune)、静注用免疫グロブリン(例えば、Civacir)、ラロニダーゼ(例えば、Al
durazyme)、レノグラスチム(例えば、Granocyte)、レピルジン(例えば、Refludan)、ロイ
プロリド(例えば、Eligard)、リラグルチド(例えば、Saxenda)、ルシナクタント(例えば
、Surfaxin)、ルトロピンアルファ(例えば、Luveris)、メカセルミン(例えば、N.A.)、メ
ノトロピン(例えば、Menopur)、メトキシポリエチレングリコール-エポエチンベータ(例
えば、Mircera)、メトレレプチン(例えば、Myalept)、天然アルファインターフェロンも
しくはマルチフェロン(例えば、Intron/Roferon-A)、ネシリチド(例えば、NATRECOR)、オ
クリプラスミン(例えば、Jetrea)、オプレルベキン(例えば、Neumega)、OspAリポタンパ
ク質(例えば、Lymerix)、オキシトシン(例えば、Pitocin)、パリフェルミン(例えば、Kep
ivance)、パンクレリパーゼ(例えば、Pancrecarb)、ウシペガデマーゼ(例えば、Adagen)
、ペグアスパラガーゼ(例えば、Oncaspar)、ペグフィルグラスチム(例えば、Neulasta)、
ペグインターフェロンアルファ-2a(例えば、Pegasys)、ペグインターフェロンアルファ-2
b(例えば、PEG-Intron)、ペグインターフェロンベータ-1a(例えば、Plegridy)、ペグロテ
ィカーゼ(例えば、(Krystexxa))、ペグビソマント(例えば、SOMAVERT)、ポラクタントア
ルファ(例えば、Curosurf)、プラムリンタイド(例えば、Symlin)、プレオタクト(例えば
、Preotact E)、プロタミン硫酸塩(例えば、プロタミン硫酸塩注射液、USP)、ヒトプロテ
インS(例えば、ヒトプロテインS)、プロトロンビン(例えば、Feiba Nf)、プロトロンビン
複合体(例えば、Cofact)、プロトロンビン複合体濃縮製剤(例えば、Kcentra)、Rasbウリ
カーゼ(例えば、Elitek)、レテプラーゼ(例えば、Retavase)、リロナセプト(例えば、Arc
alyst)、ロミプロスチム(例えば、Nplate)、サクロシダーゼ(例えば、Sucraid)、サケカ
ルシトニン(例えば、Calcimar)、サルグラモスチム(例えば、Leucomax)、サツモマブペン
デチド(例えば、OncoScint)、セベリパーゼアルファ(例えば、Kanuma)、セクレチン(例え
ば、SecreFlo)、セルモレリン(例えば、酢酸セルモレリン)、血清アルブミン(例えば、Al
bunex)、ヨウ素標識血清アルブミン(例えば、Megatope)、シモクトコグアルファ(例えば
、Nuwiq)、シプリューセル-T(例えば、Provenge)、ソマトトロピン組換え体(例えば、Nut
ropinAQ)、ソマトロピン組換え体(例えば、BioTropin)、ストレプトキナーゼ(例えば、St
reptase)、スソクトコグアルファ(例えば、Obizur)、タリグルセラーゼアルファ(例えば
、Elelyso)、テデュグルチド(例えば、Gattex)、テネクテプラーゼ(例えば、TNKase)、テ
リパラチド(例えば、Forteo)、テサモレリン(例えば、Egrifta)、トロンボモデュリンア
ルファ(例えば、Recomodulin)、サイマルファシン(例えば、Zadaxin)、サイログロブリン
、チロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen)、ツベルクリン精製タンパク質誘導体(例え
ば、Aplisol)、ツロクトコグアルファ(例えば、Zonovate)、ウロフォリトロピン(例えば
、BRAVELLE)、ウロキナーゼ(例えば、Kinlytic)、バソプレッシン(例えば、Pitressin)、
ベラグルセラーゼアルファ(例えば、Vpriv)、アブシキシマブ(例えば、ReoPro)、アダリ
ムマブ(例えば、Humira)、アレムツズマブ(例えば、CAMPATH)、アリロクマブ(例えば、Pr
aluent)、アルシツモマブ(例えば、CEA-Scan)、アテゾリズマブ(例えば、Tecentriq)、バ
シリキシマブ(例えば、Simulect)、ベリムマブ(例えば、Benlysta)、ベバシズマブ(例え
ば、Avastin)、ブリナツモマブ(例えば、Blincyto)、ブロダルマブ(例えば、Siliq)、カ
ナキヌマブ(例えば、ILARISE)、カナキヌマブ(例えば、Ilaris)、カプロマブ(例えば、Pr
ostaScint)、セツキシマブ(例えば、Erbitux)、ダクリズマブ(例えば、Zenapax)、ダラツ
ムマブ(例えば、DARZALEX)、デノスマブ(例えば、Xgeva)、ジヌツキシマブ(例えば、unit
uxin)、エクリズマブ(例えば、Soliris)、エファリズマブ(例えば、RAPTIVA)、エロツズ
マブ(例えば、EMPLICITI)、エボロクマブ(例えば、Repatha)、ゴリムマブ(例えば、Simpo
ni注射液)、イブリツモマブ(例えば、Zevalin)、イダルシズマブ(例えば、Praxbind)、イ
ンフリキシマブ(例えば、REMICADE)、イピリムマブ(例えば、YERVOY)、イキセキズマブ(
例えば、Taltz)、メポリズマブ(例えば、Nucala)、ムロモナブ(例えば、ORTHOCLONE OKT3
)、ナタリズマブ(例えば、Tysabri)、ネシツムマブ(例えば、Portrazza)、ニボルマブ(例
えば、Opdivo)、オビルトキサキシマブ(例えば、Anthim)、オビヌツズマブ(例えば、Gazy
va)、オファツムマブ(例えば、Arzerra)、オマリズマブ(例えば、Xolair)、パリビズマブ
(例えば、Synagis)、パニツムマブ(例えば、Vectibix)、ペンブロリズマブ(例えば、Keyt
ruda)、ペルツズマブ(例えば、Perjeta)、ラムシルマブ(例えば、Cyramza)、ラニビズマ
ブ(例えば、Lucentis)、ラキシバクマブ(例えば、ラキシバクマブ)、リツキシマブ(例え
ば、Rituxan)、セクキヌマブ(例えば、Cosentyx)、シルツキシマブ(例えば、Sylvant)、
トシリズマブ(例えば、ACTEMRA)、トシツモマブ(例えば、Bexxar)、トラスツズマブ(例え
ば、Herceptin)、ウステキヌマブ(例えば、Stelara)、又はベドリズマブ(例えば、Entyvi
o)のアミノ酸配列を含む。
他の実施態様において、標的タンパク質は、抗体である。別の実施態様において、標的
タンパク質は、ヒトタンパク質に対する抗体である。
さらなる実施態様において、抗体は、アダリムマブ(Humira); Remicade(インフリキシ
マブ); ReoPro(アブシキシマブ); Rituxan(リツキシマブ); Simulect(バシリキシマブ);
Synagis(パリビズマブ); Herceptin(トラスツズマブ); Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマ
イシン); Campath(アレムツズマブ); Zevalin(イブリツモマブチウキセタン); Xolair(オ
マリズマブ); Bexxar(トシツモマブ-I-131); Erbitux(セツキシマブ); Avastin(ベバシズ
マブ); Tysabri(ナタリズマブ); Actemra(トシリズマブ); Vectibix(パニツムマブ); Luc
entis(ラニビズマブ); Soliris(エクリズマブ); Cimzia(セルトリズマブペゴール); Simp
oni(ゴリムマブ); Ilaris(カナキヌマブ); Stelara(ウステキヌマブ); Arzerra(オファツ
ムマブ); Prolia(デノスマブ); Numax(モタビズマブ); ABThrax(ラキシバクマブ); Benly
sta(ベリムマブ); Yervoy(イピリムマブ); Adcetris(ブレンツキシマブベドチン); Perje
ta(ペルツズマブ); Kadcyla(アド-トラスツズマブエムタンシン);又はGazyva(オビヌツズ
マブ)のアミノ酸配列を有する。
他の実施態様において、抗体は、全長抗体、Fab、F(ab')2、Scfv、又はsdAbである。他
の実施態様において、標的タンパク質は、酵素又はその阻害因子のアミノ酸配列を含む。
別の実施態様において、標的タンパク質は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子
、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミ
ノゲン活性化因子(tPA)及びtPA変異体、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、
グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)
、イデュルスルファーゼ(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、アガルシ
ダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNア
ーゼ-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダ
ーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害
因子(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ
)、及びアデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列を含む。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、培養培地中に分泌され、ここ
で、該グリコシル化標的タンパク質は、グリコシル化されている。ある実施態様において
、グリコシル化標的タンパク質は、培養培地から精製される。別の実施態様において、グ
リコシル化標的タンパク質は、親和性精製又はイオン交換クロマトグラフィーによって培
養培地から精製される。別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、FCドメ
インを含有し、プロテイン-Aによって培養培地から親和性精製される。別の実施態様にお
いて、グリコシル化標的タンパク質は、親和性タグを含有し、親和性精製される。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の集団は、少なくとも約90％、91
％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％均一である。さらな
る実施態様において、グリコシル化によって占有されている標的タンパク質上のN-糖部位
の90％～100％。他の実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わ
せて使用される標的タンパク質は、全長タンパク質、切断物、タンパク質ドメイン、領域
、モチーフ、又はこれらのペプチドであることができる。
他の実施態様において、標的タンパク質は、Fc-融合タンパク質である。
別の実施態様において、標的タンパク質は、修飾され得る。別の実施態様において、標
的タンパク質は、リーシュマニア由来のシグナル配列を含むように改変されている。他の
実施態様において、該シグナル配列は、プロセシングされ、標的タンパク質から除去され
る。別の実施態様において、標的タンパク質は、1以上のタグを含むように改変されてい
る。他の実施態様において、該タグは、プロセシングされ、標的タンパク質から除去され
る。
(7.13 組成物)
(7.13.1 宿主細胞を含む組成物)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される宿主細胞を含む組
成物である(第7.1節を参照)。そのような組成物は、本明細書に記載されるグリコシル化
標的タンパク質を作製する方法で使用することができ、例えば、宿主細胞を含む組成物は
、タンパク質の産生に好適な条件下で培養することができる。その後、グリコシル化標的
タンパク質は、当技術分野で公知の方法を用いて、該宿主細胞を含む組成物から単離する
ことができる。
本明細書に提供される宿主細胞を含む組成物は、本明細書に記載される宿主細胞の維持
及び生存に好適なさらなる成分を含むことができ、宿主細胞によるタンパク質の産生に必
要又は有益なさらなる成分、例えば、誘導性プロモーターの誘導因子、例えば、アラビノ
ース、IPTGをさらに含むことができる。
(7.13.2 グリコシル化標的タンパク質を含む組成物)
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000021
 (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を含むオリゴ糖を担持する組成物中の標的タンパク質のN-結合型グリコシル化コン
センサス配列の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％、35％～45
％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～75％、70％
～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000022
 (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を特徴とするG0-Gnグリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくと
も約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～
55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80
％～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000023
 (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を特徴とするG0グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも
約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55
％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％
～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000024
 (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型
グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)のいずれかを特徴とするG1-Gnグリカンであ
る、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35
％、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％
～70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～10
0％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000025
 (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型
グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG2グリカンである、該標的タン
パク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％
、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～
75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000026
 (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型
グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG2グリカンである、該標的タン
パク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％
、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～
75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000027
 を特徴とするG2グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～
20％、20％～30％、25％～35％、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50
％～60％、55％～65％、60％～70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％
、85％～95％、又は90％～100％を有する。
ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型
グリコシル化コンセンサス配列のAsnである。
別の実施態様において、標的タンパク質上のグリコシル化は、対象に導入されたときに
該標的タンパク質の薬物動態特性を最適化するようにさらに修飾される。別の実施態様に
おいて、標的タンパク質上のグリコシル化は、シアリル化される。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000028
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000029
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000030
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000031
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000032
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000033
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000034
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000035
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000036
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000037
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000038
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
Figure 2023134519000039
 (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、
該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする
、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10～20％、20％～30％、25％～35％
、30％～40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～
70％、65％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100
％を有する。
ある実施態様において、本明細書に記載されるグリコシル化標的タンパク質(第7.12節
を参照)を含むことに加えて、本明細書に記載される組成物(例えば、医薬組成物)は、医
薬として許容し得る担体を含む。本明細書で使用される場合、「医薬として許容し得る」
という用語は、連邦もしくは州政府の規制当局によって認可されているか、又は動物での
、より特には、ヒトでの使用について米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬
局方に掲載されていることを意味する。医薬として許容し得る担体との関連において本明
細書で使用される「担体」という用語は、それとともに医薬組成物が投与される希釈剤、
アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。生理食塩水溶液並びに水性ブドウ糖及びグ
リセロール溶液も、特に、注射用溶液の液体担体として、利用することができる。好適な
賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、
コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリ
セロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール
、水、エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の例は、E.W. Martin著、「レミン
トンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、対象への意図される投与経路
に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、皮下、非経
口、経口、皮内、経皮、結腸直腸、腹腔内、及び直腸投与に好適であるように製剤化する
ことができる。具体的な実施態様において、該医薬組成物は、静脈内、経口、腹腔内、鼻
腔内、気管内、皮下、筋肉内、局所、皮内、経皮、又は肺投与用に製剤化することができ
る。
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、1以上のバッファー、例えば
、リン酸バッファー及びリン酸グルタミン酸スクロースバッファーをさらに含む。他の実
施態様において、本明細書に記載される組成物は、バッファーを含まない。
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、1以上の塩、例えば、塩化ナ
トリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸モノナトリウム、及びアル
ミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸カリウ
ムアルミニウム)、又はそのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施態様
において、本明細書に記載される組成物は、塩を含まない
本明細書に記載される組成物は、投与の指示書と一緒にキット、容器、パック、又はデ
ィスペンサーに含めることができる。
本明細書に記載される組成物は、使用前に保存することができ、例えば、該組成物は、
凍結させて(例えば、約-20℃でもしくは約-70℃で)保存するか;冷蔵条件で(例えば、約4
℃で)保存するか;又は室温で保存することができる。
(7.14 予防的及び治療的用途)
一態様において、本明細書に提供されるのは、対象の疾患又は障害を予防又は治療する
方法であって、該対象に、本明細書に記載されるグリコシル化標的タンパク質又はその組
成物を投与することを含む、方法である。本明細書にさらに提供されるのは、対象の疾患
又は障害を予防する方法であって、該対象に、本明細書に記載されるグリコシル化標的タ
ンパク質又はその組成物を投与することを含む、方法である。
(8.実施例)
(8.1 実施例1 グリコシル化経路のバイオインフォマティクス的評価)
まず、リーシュマニア・タレントラエは、表1、表2、表3、表4、表5、表6、及び表7に
記載されているように、分類学的に近いリーシュマニア・メジャーとさえも、初期の保存
されたN-グリカン生合成工程が大きく異なることが比較ゲノム解析によって分かった。al
g遺伝子の欠損により、N-グリカン前駆体の強い低下及び同じく前駆体トリミングの低下
が示される(図3及び図4)(Varkiの文献、2009)。ALG3は存在するものの、ヒトALG3との比
較から、ヒトALG3における機能喪失型突然変異(R171Q)に対応する、保存された残基127に
おけるグルタミンへの潜在的なミスセンス突然変異が明らかになっている(Sunらの文献、
2005)。
表1 前駆体生合成
Figure 2023134519000040
Figure 2023134519000041
表2 トリミング
Figure 2023134519000042
 表3 N-グリカン伸長
Figure 2023134519000043
Figure 2023134519000044
表4 オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)
Figure 2023134519000045
Figure 2023134519000046
表5 前駆体生合成(Neu5Ac)
Figure 2023134519000047
 表6 ヌクレオチド活性化糖の合成及び輸送
Figure 2023134519000048
 表7 リポホスホグリカン修飾酵素
Figure 2023134519000049
図3Bに概説されている驚くほど独特な生合成経路の後、トリミング及び小胞体(ER)品質
管理(表1、表2、及び表8)の低下は、適切なフォールディングプロセスの保持と同時に高
い部位占有に関して、糖鎖改変修飾の有益な特性を示唆している。図5は、表8にも概説さ
れているような、通常、不適切にトリミングされたN-グリカン前駆体を逆方向に又はフォ
ールディングされていないタンパク質をプロテアソーム分解のためのERAD経路に循環させ
るレクチン媒介(カルネキシン及びカルレティキュリン)経路が存在しない場合の正しい糖
タンパク質フォールディングのための本シャペロン経路をより詳細に記載している(Morem
enらの文献、2012)。重要なことに、OST複合体は、前駆体N-グリカンをタンパク質アクセ
プターのコンセンサスアスパラギンに転移するStt3からのみ構成される(表4)。L.タレン
トラエの場合、任意の他の記載されている真核生物と顕著に異なる縮小した前駆体がStt3
によって転移され、OST複合体を含有する他の真核生物に見られる部位選好又は厳密な部
位選好がないことが示唆される。
表8 ER品質管理
Figure 2023134519000050
Figure 2023134519000051
一般に認められている見方として、図6及び7は、真核細胞の小胞体及びゴルジ装置で起
こるN-グリカンプロセシング工程の略図を示しており、図は、(Kellokumpuらの文献、201
6)から抜粋したものである。L.タレントラエでは、切断され、縮小した前駆体は、タンパ
ク質に転移され、それは、分泌経路を通るその輸送の間に、ゴルジ体でのそれ以上のN-グ
リカン伸長に失敗する。これは、GlcNAcトランスフェラーゼGnT-I及びGnT-II、Galトラン
スフェラーゼ、並びにシアリルトランスフェラーゼの欠如により結論付けられている(図6
、表6)。さらに、比較データから、シアル酸生合成の工程の欠如が示された(表5)。密接
に関連するトリパノソーマ・ブルセイのTbGnTI(Damerowらの文献、2014)及びTbGnTII(Dam
erowらの文献、2016)由来のゴルジ常在性GlcNAcグリコシルトランスフェラーゼは、L.タ
レントラエで明確には同定することができなかった。C-末端でエピトープタグ化されたTb
GnTI及びTbGnTIIは、免疫蛍光によりゴルジに局在することが示された(Damerowらの文献
、2014; Damerowらの文献、2016)。
ヌクレオチド活性化糖供与体は、グリコシルトランスフェラーゼによって触媒される酵
素反応に必要とされ、かつゴルジ区画の内腔の内側で利用可能である必要があるので、膜
局在トランスポーターの存在がバイオインフォマティクスの手法により確認された。UDP-
グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-糖ピロホスホリラーゼ、UDP-ガラクトース 4-エピ
メラーゼ、並びにUDP-Gal/UDP-GlcNAcインポーター、GDP-Man/UDP-GlcNAcインポーター、
UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc、GDP-Manインポーター、及びUDP-Glcインポーターのホモログ(Ro
per及びFergusonの文献、2003; Roperらの文献、2002; Urbaniakらの文献、2006; Capul
らの文献、2007)の存在が確認された(表6)。UDP-GlcNAcトランスポーター(T.クルージTcN
ST1及びT.ブルセイTbNST1～4、L.メジャー)がL.タレントラエに存在し、UDP-Galトランス
ポーター(T.ブルセイTbNST 1及び2、L.メジャー)がL.タレントラエに存在する。これらの
結果は、UDP-GlcNAcとUDP-Galの両方がゴルジ内腔に輸送されることができることを示し
ている。したがって、LTAR_180008900.1、LTAR_240008400.1、LTAR_340034000.1、及びLT
AR_300033500.1(以前の命名体系: LtaP18.0420、LtaP24.0350、LtaP34.3030、及びLtaP30
.2670)は、ゴルジ内腔の内側でのGDP-Gal及びUDP-GlcNAcの利用可能性を示唆している。
(8.2 実施例2 完全に機能カスタマイズされたN-グリカン変異体の糖鎖を改変するため
の手法)
図7及び8は、a)FcとFc受容体の相互作用の望ましい下流効果、及びb)半減期の増加(薬
物動態PKの増加)、及びc)抗炎症特性(潜在的に免疫原性であるタンパク質治療薬における
ADAの発生を回避するための2,6結合Neu5Acの免疫寛容化利益のようなもの)のために、L.
タレントラエにおいて均一でかつ機能カスタマイズされたN-グリカン伸長を生じさせるた
めの糖鎖改変設計を表現している。図8は、糖鎖改変の有益な特性をもたらす主要かつ新
規の違いを示す、提案されたL.タレントラエのN-グリカン生合成について記載している。
本発明は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラー
ゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを含む、一連のグリコシルトランスフェラーゼの異
種発現によって、機能カスタマイズされ、かつ均一なN-グリカンをタンパク質上に産生す
るように修飾されている真核宿主細胞に関する。
(8.3 実施例3 キネトプラスト類のリーシュマニア・タレントラエにおける縮小し、か
つ100％均一なN-グリカンの実験的証拠)
予想される有益な特性に基づいてL.タレントラエというキネトプラスト目の生物を選択
した後、3種の野生型(wt)株(St10569、St10616、St11262)をそのネイティブなN-グリカン
について解析した。まず、細胞ペレットを変性させ、PNGアーゼA又はPNGアーゼFのいずれ
かにより媒介されるN-グリカン放出に供した。放出されたN-グリカンを、急速な酵素的放
出及び迅速なN-グリカン標識のために、a)完全メチル化するか、又はb)Waters GlycoWork
s(商標) RapiFluor-MS(商標) N-Glycanで標識した。
RapiFluor(商標)を用いる蛍光標識とUPLC分離とにより、本発明者らは、計算上のm/z＝
1222.7166; [M+Na]+ 1244.6985; [M+K]+ 1260.6724を有する(Man)3(GlcNAc)2に対応する1
つの単一のN-グリカン形態のみを観察した。N-グリカンについては、3種の単離されたL.
タレントラエ細胞の全てにおいて、ただ1つの均一なN-グリカン、いわゆる、ポーシマン
ノース又はMan3グリカンが同定された(図9)。
本発明者らは、リーシュマニア・タレントラエの2つの異なるwt試料(St10569、St10616
)のN-グリカンプロファイルを解明するために、完全メチル化も適用した。この手法(脱脂
質化した細胞ペレットから得られたトリプシン消化ペプチドの脱グリコシル化又は細胞ペ
レットの脱脂質化後のインタクトタンパク質の直接的な脱グリコシル化)とは無関係に、1
つのN-グリカン構造の存在を両方の株で確認した。基本的な(Man)3(GlcNAc)2コアに対応
するこのN-グリカンは、脱グリコシル化に使用されるN-グリコシダーゼとは無関係に得ら
れる。模擬対照は、ポリヘキソース記号によって示される、おそらくはリポホスホグリカ
ン由来の細胞壁混入グリカンの存在を示した。ポリヘキソースの混入は抽出物のMALDIス
ペクトル中に観察されたが、本発明者らは、より複雑なN-グリカンに対応する可能性のあ
るイオンを発見しなかった。特に、α1,6又はα1,3結合フコースを有する想定された二分
岐フコシル化グリカン(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2(G2F)(Breitlingらの文献
、2002)(2244.1の理論上の完全メチル化質量[M+Na]+)は発見されなかった。スペクトルは
、このm/z値を有するイオンの痕跡を含まなかった。コア構造と他の複雑なフコシル化、N
-アセチルグルコサミニル化、又はガラクトシル化構造との間の可能性のある中間体が観
察されなかったことに言及しておくことにも価値がある。ゴルジ体におけるN-グリコシル
化経路の前駆体(例えば、Man5GlcNAc2)はいずれも同定されなかった。リーシュマニア・
タレントラエにおけるN-グリカンの生合成が他の生物と同等ならば、この点は実に独特で
ある。PNGアーゼF又はPNGアーゼAによる脱グリコシル化の後に得られるスペクトルは、同
一であった。結果として、リーシュマニア・タレントラエ細胞ペレットのN-グリカンプロ
ファイルがPNGアーゼFにより放出されないα1,3結合コアフコースを有するN-グリカンを
含有するという徴候はなかった(データは示さない)。
L.タレントラエのN-グリカンが他のキネトプラスト目のN-グリカンとどのように異なっ
ているのかをさらに明らかにするために、クリチディア・ファシキュラータ、フィトモナ
ス・ダビディ・ラフォント(Phytomonas davidi Lafont)、及びクリチジア・デアネイ(ア
ンゴモナス)をゲノム解析及びN-グリカンプロファイリングによりさらに調べた。L.タレ
ントラエと比較して、C.ファシキュラータは、実験的に証明された高マンノースグリカン
(Man5GlcNAc2～Man11GlcNAc2)の合成を説明するマンノシルトランスフェラーゼALG3、ALG
9、及びALG11をさらに含有する(図45)。さらに、C.ファシキュラータは、L.タレントラエ
で欠損している品質管理シャペロンのカルレティキュリンを保有する。P.ダビディ・ラフ
ォントについては、ゲノム情報が利用できない。PNGアーゼF及びPNGアーゼA並びにその後
の完全メチル化及びMALDI-TOFによるN-グリカンプロファイリングにより、1つ又は2つの
さらなるペントースを有する高マンノース型グリカン(Man9GlcNAc2)が明らかになった。C
.デアネイ及びL.タレントラエのグリコシル化経路のバイオインフォマティクス的比較に
より、C.デアネイにおけるMAN1の欠如を除いて違いがないことが明らかになった。しかし
ながら、N-グリカンプロファイリングにより、コアN-グリカン(Man3GlcNAc2)が2つのヘキ
ソース及び2つのデオキシヘキソースによってさらに修飾されることが示された(図45)。
まとめると、様々な実験方法により、基本的なただ1つの均一なN-グリカンである(Man)
3(GlcNAc)2が3種のL.タレントラエwt株で同定された。Man3又はポーシマンノースとも呼
ばれる、(Man)3(GlcNAc)2を有する、この均一なN-グリコシル化は、これまで他のどの真
核生物でも観察されたことがなく、均一なN-グリコシル化を目的としてこの生物を治療用
タンパク質の発現宿主として使用し、高い部位占有を保持したままヒト化N-グリカンを糖
鎖改変するための新規の特徴を表す。
(8.4 実施例4 インビトロでネイティブなポーシマンノースN-グリカンを伸長させる異
種グリコシルトランスフェラーゼの同定)
ヒト化された伸長二分岐N-グリカンを得るために、好適なGntをL.タレントラエで組換
え発現させ、L.タレントラエの粗ライセート、膜可溶化画分、及び培養上清から親和性濃
縮した。半精製酵素を、その適切な活性について、共因子及び関連する活性化ヌクレオチ
ド糖供与体を用いてインビトロで試験した。基質は、「遊離」N-グリカン、2-アミノベン
ズアミド(2AB)標識N-グリカン、又はポーシマンノース(Man3)のみを含有するwt細胞由来
の粗ライセートのいずれかであった。
本発明は、その効果に関して、L.タレントラエ細胞から発現及び精製された昆虫又は哺
乳動物源由来の試験された全ての異種Gnt候補が共因子及びその活性化糖供与体の存在下
で遊離オリゴ糖基質又は2AB標識基質に対するその活性を発揮することができることを示
すインビトロアッセイで解析された様々なかつ好適なグリコシルトランスフェラーゼ候補
(表9)の発現を対象としている(図10～14)。
表9 GnT候補
Figure 2023134519000052
Figure 2023134519000053
Figure 2023134519000054
分類学的に最も密接に関連する生物であるトリパノソーマ・ブルセイ由来のGnT-I(「Tb
GnT-I」)は、ネイティブなポーシマンノースを基質として含むwtライセートに対して活性
を示さなかった(図10)。しかしながら、基質としての遊離ポーシマンノース(Man3)に対す
るわずかな活性(ピークの重複)が観察された。TbGnT-IIは、Man3基質に対する活性を示さ
ず、これにより、GntIの先行活性という必要条件を示すこともできた。昆虫細胞由来のSf
GnT-I活性は、ストレプトアビジン溶出により半精製した画分又は可溶化画分を遊離ポー
シマンノースに対するインビトロアッセイで使用したとき、NGA2-N標準と一緒に移動する
ように見える特徴的なピークを伴って確認された。対照は、wtライセートのHA溶出物又は
Strep溶出物のいずれかを含有していたが、使用された基質に対する修飾を示さなかった
。
hMGAT1をライセート+/-TritonX(TrX)から精製し、細胞ペレット由来のhMGAT1 HA-溶出
画分は、2AB-Man5基質の～100％の伸長(図11A)及び2AB-Man3基質の～100％の伸長(図11B)
基質を示した。上清(SN)のHA濃縮物由来のMGAT-I溶出画分は、2AB-Man5又は2AB-Man3に対
する最小限の活性しか有さなかった。陰性対照としてのwt由来のライセートは、2AB-Man5
保持時間に影響を及ぼすことも、標準を修飾することもなかった。
上清又は膜画分(「ペレット」)からHA濃縮した場合のrMGAT2は、NGA2-N標準をG0(NGA2)
型に効率的に変換した(図12A)。予想通り、rMGAT-2は、インビトロで2AB-Man3aをNGA2-N
へと伸長することができない(図12B)。MGAT2は、先行するGnT-I活性を必要とする。NGA2-
N標準は、製造業者によると、各々約50％でα1,3結合Man分岐上のGlcNAcとα1,6結合Man
分岐上のGlcNAcの両方の形態から構成されている。NGA2-N及びNGA2のピークは50/50であ
り、その後、α1,6のインビトロ変換は、rMGAT2により100％となる。
SfGnT-IIは細胞内に局在し、細胞ライセート+/-1％(v/v) TritonX中で検出され、膜会
合を示したが、非排他的ではなかった(図13)。SfGnT-IIは、検討された他のGnt候補のSfG
nT-Iとは異なり、SN中に少量しか存在しなかった。HA画分を用いたインビトロ活性アッセ
イは、バックグラウンドノイズのために決定的なものではなかった。ライセート中のSfGn
T-IIは、おそらく粗ライセート中に存在する量が少ないために、かなり低い程度のNGA2-N
の変換を示した(図13B)。SN又はライセート(+TrX)のいずれかのSfGnT-II HA溶出物を含む
インビトロ活性試料は、基質として使用された純粋な2AB標準に対する強いバックグラウ
ンド蛍光を示した(図示せず)。SfGnT-IIも、先行するGnT-I活性を必要とし(図13A)、かつ
Man5に対して作用しない(図13C)。
基質NGA2-N(緑、76.8m)を用いて、インビトロのhB4GALT-I活性を評価した(図14A)。ス
トレプトアビジン精製hB4GALT-Iは、NGA2-N(緑)を仮説上同等の割合のα1-3及びα1-6 G1
-Gn(a)とG1-Gn(b)に変換し(図14B);弱い(青)ピークが76.8mで検出されるので、変換は100
％ではなかった。しかしながら、少なくとも＞90％の変換が予想される。B4GALT-I試料の
「二重のピーク」は、G1標準(赤)由来の「二重の」ピークと同一のパターンを示している
が、構造中に1×GlcNAcが少ないため、保持時間はより短い。図14Cは、G2グライコフォー
ムを生じるG0基質に対するB4GALT1のインビボでの予想される機能を示している。
(8.5 実施例5 インビボでネイティブなタンパク質上にネイティブなポーシマンノースN
-グリカンを伸長させる異種グリコシルトランスフェラーゼの同定)
次に、グリコシルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞を回収し、PNGアーゼF
でそのN-グリカンを放出するように処理した。放出されたグリカンを完全メチル化又は2A
B標識し、ネイティブな糖タンパク質アクセプターに対する活性を解析した。GnT-Iを発現
する細胞(SfGnT-I、St11707)は、インビボでポーシマンノースを34％NGA2-N(G0-Gn)に変
換した。試料は粗細胞抽出物由来のものであるので、小胞体(ER)局在糖タンパク質も含ま
れ、これらのタンパク質がGlcNAc伸長を達成するためにゴルジ体を通過しないことを意味
する。GnT-II候補のみを発現する細胞(図示せず)は、インビトロ解析により裏付けられた
知見であるGnT-Iの先行活性の必要性のため、予想通り、ポーシマンノースを伸長させる
ことができなかった。GnT-IをGnT-II酵素と一緒に組換えにより共発現させたとき(SfGnT-
I及びSfGnT-II、St12320)、2つのGlcNAcを有するポーシマンノースからG0形態への伸長が
確認された(図15及び16)。
完全メチル化及びMALDI TOFによって解析すると、細胞ペレット試料St10569 P16_378野
生型は、ただ1つのN-グリカン構造(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)を含有していた。リーシ
ュマニア・タレントラエSt11707遺伝子型ssu::SfGnT-I由来の試料St11707 P16_378におけ
るGnt-Iの発現は、それぞれ、66％及び34％の相対強度で(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)と
(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)の両方の存在をもたらした。リーシュマニア・タ
レントラエSt12320遺伝子型ssu::SfGnT-I;ssu::SfGnT-II(ポリクローナル)由来のSt12320
P16_378におけるGnT1とGnT2の両方の共発現は、それぞれ、48％、15％、及び37％で、3
つの異なるN-グリカン構造(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)、(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/
z 1416.7)、及び(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1661.8)の存在をもたらした(図15)。
さらに、N-グリカン構造に対応するイオンをMALDI-TOF/TOF MSによりフラグメント化し
た。m/z 1171.6のスペクトル中に存在するフラグメントイオンは、N-グリカン構造(Man)3
(GlcNAc)2を裏付けるものである。m/z 1416.7のスペクトル中に存在するフラグメントイ
オンは、N-グリカン構造(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2を裏付けるものである。GnT-Iは、(Ma
n)3(GlcNAc)2のα-1,3マンノースへのGlcNAcの転移を触媒する。本発明者らは、付加され
たGlcNAcの位置を裏付け、m/z 560.26という予想された[M+Na]+質量を有するα-1,3マン
ノースに結合したGlcNAcフラグメントを識別するクロスリングフラグメントの存在につい
て、m/z 1416.7におけるイオンのフラグメンテーションスペクトルを検索した。α-1,6結
合マンノースに結合したGlcNAcの対応するクロスリングフラグメントは、m/z 546.25及び
574.28の質量を有する。末端GlcNAcの結合を識別するクロスリングフラグメントは、スペ
クトル中に見られなかった。m/z 1661.8のスペクトル中に存在するフラグメントイオンは
、N-グリカン構造(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2を裏付けるものである(図16)。
細胞ペレットの脱脂質化後にインタクトタンパク質の直接的な脱グリコシル化を用いる
リーシュマニア・タレントラエの3つの異なる試料のN-グリカンプロファイリングを行っ
た。以前に解析された野生型試料について既に観察されたように、細胞ペレット試料St10
569野生型は、ただ1つのN-グリカン構造(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)を含有する。試料S
t11707遺伝子型ssu::GnT-IにおけるGnT-Iの発現は、(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)と(Glc
NAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)の両方を示した。Gnt-Iは、ネイティブな糖タンパク
質上に存在する(Man)3(GlcNAc)2の部分のα-1,3マンノースへのGlcNAcの転移を触媒する
。St12320遺伝子型ssu::SfGnT-I; ssu::SfGnT-IIにおけるGnt-IとGnt-IIの両方の共発現
は、(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)、(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)、及び(GlcN
Ac)2(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1661.8)という3つの異なるN-グリカンタイプの存在をもたらす
。Gnt-IIのさらなる発現は、(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2のα-1,6マンノースへの第二のGl
cNAc残基の転移を触媒する。
したがって、これらのデータは、糖鎖改変におけるその使用のためにL.タレントラエで
異種発現したときの昆虫細胞由来Gntのインビボ活性を裏付けるものである。さらに、ゴ
ルジ内腔におけるUDP-GlcNAcの存在も示唆され、ネイティブなL.タレントラエにおける活
性化ヌクレオチド糖トランスポーターの存在というバイオインフォマティクス的評価から
の仮定を裏付けている。
これらの知見は、GlycoWorks(商標) RapiFluor-MS(商標)を用いて、St11707及びSt1252
5株由来のN-グリカンを放出させ、標識し、それぞれ、SfGnT-Iのみ又はSfGnT-IIと一緒の
SfGnT-Iのいずれかを発現させた場合に確認され、それについて、SfGnT-I細胞由来のG0-G
n及びSfGnT-I＋SfGnT-II細胞由来のG0グリカンが、そのm/zと一致して同定された(図17A)
。St13065は、hMGAT1とrMGAT2を共発現し、そのネイティブな分泌タンパク質上にG0グリ
カンを生成させ、両方のGntがインビボで活性があることを示した(図17B)。
興味深いことに、組合せのStrep-トリプルHAタグを有するか、Strepタグのみを有する
か、又はネイティブなC-末端を有するかのいずれかのSfGnt-Iの様々な変異体に関して、
活性は、それぞれ、全N-グリカンに対して20％～75％の範囲であり、インビボでのポーシ
マンノースからNGA2-N(G0-Gn)への変換に対するC-末端タグのマイナスの影響を示した(図
47B)。
したがって、表9に示されるMGAT1ライブラリー由来の異種Gnt-I候補をC-末端タグなし
で試験した。様々な種由来の組換えGnt-Iを発現するリーシュマニアは、ネイティブなMan
3 N-グリカンをG0-Gnに変換した。活性は、muMGAT1(マウス)の10％のような非常に低い効
率から、DrMGAT1(ゼブラフィッシュ)又はGjMGAT1(ニホンヤモリ)について示されているよ
うな、90％をさらに上回る範囲にまで及んだ(図47A)。
SfGnT-I活性から得られるグリカンは、GlcNAcがα1,3 Man分岐に付加されているG0-Gn
グリカンにまで至る。SfGnT-IとhB4GALT1を共発現するSt13066を作製した。GlcNAcは、イ
ンビトロでB4GALT1のアクセプターとしての役割を果たし(図14)、この活性は、m/z＝1587
.63を有するG1-Gn(a)が保持時間15.32分におけるピークとして出現することにより、イン
ビボで確認された(図17C)。
これは、機能的Gntの選択、さらには、バイオインフォマティクス的評価から結論付け
られるようなリーシュマニア・タレントラエのゴルジ区画におけるUDP-GlcNAc及びUDP-Ga
lの利用可能性を支持する(表6)。したがって、インビボでの糖鎖改変が、改変され、かつ
機能カスタマイズされたN-グリカンの産生のためのGntを共発現する新規のリーシュマニ
ア・タレントラエ宿主細胞で確認された。
(8.6 実施例6 インビボで組換えヒトエリスロポエチン上にネイティブなポーシマンノ
ースN-グリカンを伸長する異種グリコシルトランスフェラーゼの同定)
ネイティブな糖タンパク質又は分泌糖タンパク質に対してばかりではないGnt活性を評
価するために、組換え標的タンパク質のヒトエリスロポエチン(hEPO)をGnT-Iと共発現さ
せた。上清中に分泌されるために、分泌移行のための2つの異なるシグナルペプチドを付
けて、EPOを発現させた。ペプチドマッピング及びMSによるN-グリカン放出及び部位占有
解析を行った。非糖鎖改変細胞で発現させたとき、均一なポーシマンノースがEPO上に確
認されたが、GnT-Iと共発現されたEPOは、N-グリカン放出及び完全メチル化によって決定
される、1つのGlcNAcを伴って伸長した約50％のN-グリカンを示した(図18)。
部位占有をトリプシン消化ペプチドマッピングにより解析した(図19及び20)。両方のEP
O試料の濃縮された糖ペプチド画分は、グリコシル化部位N24及びN38を有する占有された
糖ペプチド
Figure 2023134519000055
 に対応するイオンを含有する。対照的に、N83に対応する占有された糖ペプチドは検出さ
れない。ペプチド
Figure 2023134519000056
 上の両方のグリコシル化部位は、N-グリカンで占有されていた。野生型リーシュマニア・
タレントーラ(Leishmania tarentola)株St11521で産生されたEPOは、両方のN-グリコシル
化部位に結合した(Man)3(GlcNAc)2コア構造しか含有していなかった。St11895株における
EPOとGnT-Iの共発現は、(Man)3(GlcNAc)2又は(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2のいずれかによ
るN-グリコシル化部位N24及びN38の占有をもたらした。両方のEPO試料において、糖ペプ
チド
Figure 2023134519000057
 は、2つのN-グリコシル化部位のうちの1つだけがN-グリカンによって占有されている状態
では見出されなかった。N-グリコシル化部位N24及びN38を有するペプチド[21-45]
Figure 2023134519000058
 は、2つのN-グリカンだけで占有されているのが見出された。野生型リーシュマニア株St1
1521で産生されたEPOの場合、m/z 4588のイオンは、2つの(Man)3(GlcNAc)2 N-グリカンを
保有する糖ペプチドに対応する。St11895株由来のEPOは、対照的に、3つの異なる糖ペプ
チドイオン: 2つの(Man)3(GlcNAc)2 N-グリカンを保有する糖ペプチドに対応するm/z 458
8; 1つの(Man)3(GlcNAc)2及び1つの(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2を保有する糖ペプチドに対
応するm/z 4792、並びに2つの(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2残基を保有する糖ペプチドに対
応するm/z 4994を示した。St11521(rhEPO)株について、wt EPO N-グリコシル化部位N24及
びN38は、(Man)3(GlcNAc)2コアN-グリカンだけで占有されていた。St11895(rhEPO＋SfgnT
1)株について、EPOとGnT1の共発現は、(Man)3(GlcNAc)2又は(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2の
いずれかによる両方の部位の占有をもたらした。これらの部位に結合した異なるN-グリカ
ン構造を有するさらなるN-糖ペプチドイオンは、観察されなかった。
タンパク質のトリプシン消化後に、本発明者らが明確に帰属可能なペプチドイオンを見
出すことができなかったので、N-グリコシル化部位N83を有するペプチド[77-97]
Figure 2023134519000059
 は、本研究で解析することができなかった。したがって、部位N83の占有に関する結論を
導くことはできない。PNGアーゼによる脱グリコシル化により、明確に同定可能なイオン
としてのN-グリコシル化部位N83を有する脱グリコシル化ペプチド[77-97]
Figure 2023134519000060
 の存在は明らかにならなかった。脱グリコシル化ペプチドの理論上のモノアイソトピック
質量は2360.24Daである。St11895のP2813及びSt11521のP2814というスペクトルは、それ
ぞれ、m/z 2361.5及び2360.01で、分離が悪い非常に微かなイオンを含有していた。これ
らのイオンが何であるかをフラグメンテーションによって確認することはできなかった。
したがって、本発明者らは、その非グリコシル化又はその脱グリコシル化形態でのこのペ
プチドの存在の兆候を確認していない。
両方のペプチド質量フィンガープリントにおいて、本発明者らが、N-グリコシル化部位
N24及びN38を有するトリプシン消化ペプチド[21-45]
Figure 2023134519000061
 又はN-グリコシル化部位N83を有するペプチド[77-97]
Figure 2023134519000062
 をその非グリコシル化非含有形態で見出すことはなく、100％のN-グリコシル化占有が示
された。これらのペプチドの切断の失敗は確認されなかった。3つのN-糖部位のうち2つし
か専ら100％占有されていることが確認されなかったが、本発明者らは、3つ目の部位も占
有されていたと推測しており、これは、以前に非糖鎖改変細胞に由来するEPOに対して実
施されたインタクトタンパク質MSと相互に関連がある。
(8.7 実施例7 ネイティブな分泌タンパク質からの分泌シグナルの同定)
当初、シグナルペプチドは、(Klatt及びKonthurの文献、2012)によって記載されたリー
シュマニア・メキシカーナ由来のアルカリホスファターゼから得られた。本明細書におい
て、シグナルペプチドは、ConA精製とその後のプロテオミクス的手法及びEDMAN N-末端シ
ークエンシングを用いて同定されたネイティブな宿主細胞による分泌糖タンパク質から得
られた。MSによってネイティブな宿主細胞により分泌された同定された糖タンパク質の中
で、最も顕著なタンパク質は、インベルターゼ(スクロースヒドロラーゼ様タンパク質)(L
TAR_040008100.1;以前の命名体系: LtaP04.0290)及びGP63変異体LTAR_100010400.1(以前
の命名体系: LtaPcontig00616-1)であり(図21)、両方とも、N-グリコシル化コンセンサス
部位を含有し、かつ均一なMan3ポーシマンノースN-グリカンを保有していた。EDMAN N-末
端シークエンシングにより、インベルターゼ由来の推定上の分泌シグナルペプチド:
Figure 2023134519000063
 が同定された(図22)。
Figure 2023134519000064
 (＋異なるサイクルでさらなるアミノ酸が生じていた可能がある:第1サイクルでK、第2サ
イクルでP、第4サイクルでE)。これらの対応するヌクレオチドをhEPOヌクレオチドコード
配列とインフレームで遺伝子融合することにより、C-末端でHis又はStrepIIタグ化された
EPOを組換え発現する宿主細胞を用いて、分泌された組換えEPOを精製した(図23)。
(8.8 実施例8 正しい細胞内区画へのターゲッティング及び保持)
図6及び7で概説されているように、グリコシルトランスフェラーゼによるN-グリカンの
逐次的プロセシングは、小胞体(ER)及びゴルジ体で起こる(Kellokumpuらの文献、2016)。
関与する酵素(グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ)は、従来、成長してい
るオリゴ糖鎖に糖残基を一度に1つずつ特定の順序で付加するか又は成長しているオリゴ
糖鎖から糖残基を一度に1つずつ特定の順序で除去することにより、個別に順々に機能す
ると考えられている。これは、糖鎖改変に使用されるGntが分泌経路に沿った適切な局在
及び保持によって改善され得ることを意味する。ゴルジ局在Gntの大半は、短いN-末端細
胞質ドメイン(「C」)、約20アミノ酸のらせん状TMドメイン(「T」)、ステムドメイン(「S
」)、そして次に、分泌経路の内腔内のC-末端球状触媒ドメインを有するII型膜タンパク
質である(図24A)。グリコシル化にとってのその機能的重要性は、ホモマー又はヘテロマ
ーとしてのその相互作用に基づくものであり得る。その分布率及びこれらの相互作用を媒
介するタンパク質ドメインは、複合体形成時に生じる酵素活性変化をもたらし得る(Kello
kumpuらの文献、2016)。したがって、a)正しい細胞内区画(中間ゴルジ及びトランスゴル
ジ、図8を参照)へのターゲッティング及び保持の改善、並びにb)糖鎖改変のためのより優
れた活性をもたらすホモ及びヘテロ二量体化強化のために、ハイブリッド-Gntを設計した
。
図24Aは、図24Bに例示されているハイブリッドGnt設計のために本発明者らが示唆した
、典型的なII型膜タンパク質の構造を示しており、この設計では、ネイティブなゴルジ体
タンパク質の予測されるCTSを、異種GnT-x、以下の例では、SfGnT-Iの触媒ドメインに遺
伝子融合した。図24Bは、予想されるL.タレントラエのゴルジ内在又は関連タンパク質を
示している。トリパノソーマ及びリーシュマニアの分泌シグナル配列は、グラム陽性細菌
と同様;哺乳動物では機能せず(Al-Qahtaniらの文献、1998)、シグナルペプチド配列の必
要条件及び切断部位は、トリパノソーム(trypanosomes)と高等真核生物で異なるように思
われる(La Flamme, A Cらの文献、1995)。トリパノソーマ科の分泌経路の構成は、別所で
総説されている(McConvilleらの文献、2002b)。T.ブルセイの細胞表面タンパク質(GPIア
ンカー型)は、分泌のための非常に保存されたシグナルペプチドを含有する(Bohme及びCro
ss, George A Mの文献、2002)。トランスゴルジネットワークのターゲッティング配列が
トリパノソーマ・ブルセイに存在することが示されており、トリパノソーマ・ブルセイに
おいて、T.ブルセイのGRIPドメインは、緑色蛍光タンパク質のC-末端に融合したとき(GFP
-TbGRIP)、トランスフェクトされたCOS細胞のゴルジ装置に効率的に局在化した。さらに
、これらのGRIPドメインはT.ブルセイ及びリーシュマニア・メキシカーナで機能したが、
静止期のL.メキシカーナでは、GRIP輸送が減少した。GRIPタンパク質は、通常、GFP-GRIP
融合タンパク質において、コイルドコイル領域を有すると記載されており、これらは、伸
長したGRIP領域から導入される(McConvilleらの文献、2002a)。NTPDアーゼのヌクレオシ
ド三リン酸ジホスホヒドロラーゼは、ヌクレオチドを加水分解し、パラサイト毒性におい
て役割を果たし、リポホスホグリカン(LPG)伸長と関連している。L.メジャーにおいて、L
mNTPDアーゼ1は、ゴルジ体に局在し、LmjF.15.0030は、TMドメイン、おそらくは、CTSモ
チーフを有する。LmNTPDアーゼ2は、分泌されることが示された。LmjF.10.0170は、予測
されたシグナルペプチドを有する(Sansomらの文献、2014)。
L.タレントラエにおけるホモログは、NTPDアーゼ1＝LTAR_150005200.1(以前の命名体系
: LtaP15.0020)[LmjF.15.0030に対する最高のリバースヒット]及びNTPDアーゼ2＝LTAR_10
0006700.1(以前の命名体系: LtaP10.0140)[LmjF.10.0170に対する最高のrevヒット]とし
て同定された。L.メジャーとは対照的に、両方のL.タレントラエNTPDアーゼは、CTSドメ
インを有する。本発明者らは、5アミノ酸を活性領域に; 10アミノ酸をハイブリッド配列
の融合のためのCTS領域に設定している。CTSのステム領域の長さは、通常、明確に定義さ
れておらず、(Geislerらの文献、2015b)は、TMドメインの後ろの13のアミノ酸を使用した
。wt Gnt及びハイブリッド構造(Man1のCTS-SfGnT-I Strep; LtaNTPDアーゼ1のCTS-SfGnT-
I Strep; TbGnTIのCTS-SfGnT-II)をL.タレントラエで異種発現させ、その後、その局在を
粗分画実験により解析した。本発明者らはまた、GnT-y、以下の例では、ヒトMGAT1の予測
されたCTSドメインを使用し、様々な長さのものをレシピエントGnT-x、以下の例では、Sf
GnT-Iに融合させた(図25)。これらのプラスミド(表10)を局在について試験した(図46)。
増加する長さのMGAT1 N-末端ドメインをN-末端が減少するSfGnt-I触媒ドメインに融合し
たものを使用することにより(図46B)、細胞(膜)局在の改善が観察された(図46A)。これに
より、L.タレントラエ由来のネイティブなゴルジ体局在タンパク質に由来するか又は異種
ゴルジGnTに由来するかのいずれかの異なるN-末端保持シグナルを試験する仮説が強化さ
れる(MGAT1 N末端保持シグナルを使用することにより例証される)。しかしながら、N-グ
リカン変換に対する活性は低く、Strep-トリプルHAタグを使用したために、90MG1-SfGnT-
I-3HA-Strepコンストラクトを発現するSt13561でしか検出されず、Strep-トリプルHAタグ
を有するネイティブなSf GnT-Iの活性は、Strepタグ化Sf-GnT-Iと比較した場合、約10％
減少した(図46B)。
表10 ハイブリッド
Figure 2023134519000065
まず、本発明者らは、分泌ペプチドを有する組換えヒトエリスロポエチン、又はそのネ
イティブなターゲッティングシグナルを含有するSfGnT-Iのいずれかを発現する組換え細
胞株の通常の成長を検討した。ODをモニタリングし、細胞形状の変化を顕微鏡観察により
追跡調査した。振盪培養物は高いODに達し、成長/発現は72時間でピークに達したが、96
時間で減少した。静止培養物は、96時間でOD 1.8の最大成長及び発現に達し、活発な生産
が持続した。成長の間、L.タレントラエ細胞は、細胞周期変化(G1＞S＞G2＞M＞G1…)に関
連する形態を示した(図26A)。粗細胞ペレット(全細胞抽出物)及び上清の分離による発現
及び大まかな局在は、EPOが主に分泌され、細胞内部に保持されないことを示した。また
、予想されたゴルジ酵素Sf-GnT-Iは、上清中に切断形態で見出され、分泌経路を経由する
潜在的なタンパク質分解的切断又はそれをL.タレントラエのゴルジ体に保持するのに適し
ていないCTSが示唆された(図26B)。さらに、SfGnT-IもSNに分泌されるが、トリパノソー
マ由来酵素は、粗画分及びTriton-X可溶化画分中にしか見られず、膜及びゴルジ局在を示
した(図27)。TbGnT-I及びTbGnT-IIは、ほとんどが膜に会合していた(図27B)。SfGnT-Iは
、Tb由来酵素とは対照的に、インビボ及びインビトロで十分に活性があり、したがって、
本発明者らは、Sf-GnT-Iをハイブリッド設計用の触媒ドメインとして使用した。図24及び
25に記載されているCTS N-末端領域をSf-GnT-Iの予測された触媒ドメインに遺伝子融合さ
せた。図24Bの記載されているCTS変異体を除けば、TbGnT-I CTSを、機能的なGnT-I又はGn
T-II酵素の触媒ドメインのN-末端に融合させるのに使用することもできた。CTS変異体は
全て、機能的でかつゴルジ体に保持されるハイブリッドGntを作製するために、活性のあ
る全てのGnt(GnT-I、GnT-II、GalT、SiaT)の触媒ドメインに使用されると仮定される。
SfGnT-I全長及びそのCTS-ハイブリッドの局在は、図28に示されている。空ベクター対
照はバンドを示さないが、SfGnT-I-Strep(St11898)は、抗Strep免疫ブロットにより、継
代3回～継代6回の培養物SNで、38kDa(二重のバンド)、30kDa、及び20kDaの分解物を伴っ
て、50kDaの切断されたサイズで検出されたが、ライセート(+/-TrX)及び不溶性細胞残渣
では、バンドが検出されなかった。CTS-Man1-SfGnT-I-Strep(St11899)は、47kDaのp3～p6
のSN、並びに38kDa(二重のバンド)、30kDa、及び20kDaの分解物で検出されたが(aStrep)
、ライセート(+/-TrX)及び不溶性細胞残渣では、バンドが検出されなかった。CTS-LtaNTP
Dアーゼ1-SfGnT-I-Strep(St11900)は、それが膜画分中にもSN中にも検出されなかったの
で、発現されることも、安定であることも全くなかった。CTS-LtaNTPDアーゼ2-SfGnT-I-S
trep(St11899)は、47kDaのp5、p6のSNで微かなバンドとして検出されたが、ライセート(+
/-TrX)及び不溶性細胞残渣では、バンドが検出されなかった。これは、SfGnT-Iがより触
媒ドメインの近くにタンパク質分解に利用しやすい部位を有するように思われ、CTSの増
加を目指す第二の戦略を設計し、試験したときに、局在が変化しないことを示した(図25
、表10、図46A、図47B)。細胞内局在は、これらの増加したハイブリッドで顕著に改善し
、仮説が支持された(図47A)。しかしながら、第一に、ネイティブなSfGntIをSfGntI-Stre
po及びSfGnt-I Strep-3HAと比較した場合、活性にマイナスの影響を与えるStrep-トリプ
ルHAタグのために(図47B)、第二に、110アミノ酸のN-末端の切断も、おそらくは、SfGnT-
Iの触媒活性を損なったので、N-グリカン変換を考慮することはできない。
ネイティブなヒトGnt、3×HAでタグ化されたhMGAT1を発現するp5及びp6のSt12239を試
験したとき、hMGAT1は、全細胞抽出物(WCE)とSNの両方で検出された。MGAT1は、細胞残渣
でも検出された(図29)。これは、分泌/放出を示しているが、インビトロ活性酵素は、主
に、膜画分から精製され、SNからは精製されなかった(図11)。
p10のSt12318から発現されたSfGnT-II(ssu::SfGnT-II-3×HA)は、WCE及びSN中で検出さ
れ、低いレベルで分泌/放出された。SfGnT-IIはTrX-ライセート中で検出され、細胞質ゾ
ル局在が示された。しかしながら、SfGNT-IIはTrX+ライセート中で強く検出され、膜会合
が示された(図30)。
p5及びp6のSt11897からのrMGAT2の相対的な強い発現(ssu::MGAT2-3×HA)が、SNへのrMG
AT2の分泌、全細胞抽出物における存在、及びまたrMGAT2の細胞内/細胞質ゾル局在ととも
に観察された。rMGAT2は、TrX+ライセート及び不溶性画分中で強く膜に結合していること
も見出された。約33～35kDaでの分解も観察された(図31)。rMGAT2をインビトロ活性試験
用にSN及びTrX+ペレットから精製した(図12)。
したがって、これらの新規のハイブリッド戦略は、L.タレントラエのゴルジ区画におけ
る異種のかつ活性のあるGntの保持を支持するために必要である。
(8.9 実施例9 シアル酸生合成及び二分岐N-グリカンのシアリル化)
哺乳動物及び細菌において、Neu5Acの同化及び異化は、異なる経路を通じて起こる(Ang
ata及びVarkiの文献、2002)。2つの主要なクラスの酵素を用いて、Neu5Acを形成させるこ
とができる。N-アセチルノイラミン酸リアーゼ(Neu5Acリアーゼ)は、可逆反応でNeu5Acか
らN-アセチルマンノサミン(D-ManNAc)及びピルビン酸への切断を触媒することにより、シ
アル酸の異化に関与する。高濃度のD-ManNAc及びピルビン酸で、平衡をNeu5Acの合成にシ
フトさせることができる。グルコサミン 2-エピメラーゼ活性と共役させて、大腸菌由来
のNeu5AcリアーゼをD-GlcNAcからの大規模なNeu5Ac産生に使用することができる。或いは
、NeuBなどのNeu5Acシンターゼは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)へのManNAcの縮合を
触媒するために使用することができ、かつシアル酸の生合成に直接関与する(Tannerの文
献、2005で総説されている)。CgNalは、Neu5Acの産生のためのコリネバクテリウム・グル
タミクム由来のN-アセチルノイラミン酸リアーゼであり、これは、ManNAc及びピルビン酸
からのNeu5Acの可逆的アルドール縮合を触媒するが、Neu5Acの切断ではなく、合成に有利
である(Jiらの文献、2015)。哺乳動物のシアリル化経路における最初の工程は、活性化糖
ヌクレオチド前駆体CMP-Neu5Acの生合成である。内在性に存在する代謝物質UDP-GlcNAcか
らのこの前駆体の生成を達成するために、少なくとも4つの酵素:(1)UDP-GlcNAcからManNA
cへの変換及びManNAcからManNAc-6-リン酸へのリン酸化を触媒する二機能性酵素であるGN
E;(2)ManNAc-6-リン酸とホスホエノールピルビン酸を縮合して、Neu5Ac-9-リン酸を生じ
させるNANS;(3)Neu5Ac-9-リン酸に作用する特異的ホスファターゼ;並びに(4)結果として
生じる核内の一級シアル酸をCMP-Neu5Acへと活性化するCMASの作用を使用することができ
る(Castilhoらの文献、2010)。さらに、細菌NanE又はGNPE(Geisler及びJarvisの文献、20
12)は、GlcNAc-6-リン酸からの前駆体ManNAc-6-リン酸の形成にさらに有利であることが
できる(図53)。
好適なシアリルトランスフェラーゼ(表9)をL.タレントラエで組換え発現させ、L.タレ
ントラエの粗ライセート、膜可溶化画分、及び培養上清から親和性濃縮することができる
。その後、半精製酵素(図49A)を、その適切な活性について、共因子及び活性化糖ヌクレ
オチド前駆体CMP-Neu5Acを用いてインビトロで試験した。図48Aは、1つのシアル酸(＝単
鎖シアリル化)又は2つのシアル酸(二分岐シアリル化)を二分岐のガラクトシル化基質に転
移することに関する、2AB標識G2基質に対するL.タレントラエ発現シアリルトランスフェ
ラーゼの相対活性を示している。保持時間の比較により(図49)、2AB標識グリカンに対す
る結合決定を評価し、α2,6結合シアル酸又はα2,3結合シアル酸のいずれかと確認した。
図48Bは、このスクリーニングアッセイにおける相対量を示している。次の手法では、主
な候補(マウスmST6GAL1)を、完全にフォールディングしたモノクローナル抗体(MabThera)
に対するその活性に関して試験した(図50A～50E)。ライセートから抽出され、親和性濃縮
されたmST6(図50A)は、2AB標識G2基質の100％の二分岐α2,6シアリル化をもたらしたが(
図50B)、同じ酵素調製物は、主に、1つの分岐をシアリル化し(～14％)、二分岐は、ほと
んど検出不可能であった(0.4％)(図50C及び50D)。mST6のHA溶出物は、全N-グリカンの14.
2％を変換(シアリル化)し(全ガラクトシル化N-グリカンの～25％変換); rSAP＋mST6のHA
溶出物は、全N-グリカンの15.36％を変換(シアリル化)した(全ガラクトシル化N-グリカン
～26.5％変換)。HA-タグを介してmST6を捕捉しているビーズ(溶出されていないもの)は、
全N-グリカンの20.13％を変換(シアリル化)した(全ガラクトシル化N-グリカンの～34.7％
変換)。2μM dCTPは、mST6のHA溶出物のシアリルトランスフェラーゼ活性を阻害する(又
はシアリダーゼ活性を増強する)ように思われ、全N-グリカンの4.12％の変換(シアリル化
)しかもたらさなかった(全ガラクトシル化N-グリカンの～6.9％変換)(図50D)。まとめる
と、mST6は、遊離状態(溶出されたもの)又は捕捉された状態(ビーズ形態)のいずれかで、
MabTheraのガラクトシル化N-グリカンをインビトロでシアリル化することができ、rSAPは
、ST-変換に対してわずかにプラスの効果を有し、dCTPは、ST変換を阻害する。
宿主細胞を、機能的CMP-シアル酸(CMP-Sia)生合成経路を発現するように改変すること
ができる。ピキア、昆虫細胞、及び植物のような他の多様な生物で以前に実施されている
ように、哺乳動物の生合成及び/又は細菌の生合成(表11)をL.タレントラエ宿主細胞で利
用することができる(Aumillerらの文献、2003; Hamiltonらの文献、2006; Castilhoらの
文献、2010)。CMP-NeuAcがL.タレントラエ宿主細胞のゴルジ体で利用可能となれば、特異
的なシアリルトランスフェラーゼがシアル酸をアクセプター基質(例えば、β1,4-ガラク
トシル化二分岐N-グリカン)に転移することができる。表9は、哺乳動物及び細菌のシアリ
ルトランスフェラーゼを示し、図53は、生合成経路の予想される細胞内局在を示している
。
表11 シアル酸生合成
Figure 2023134519000066
CMP-Sia生合成経路を非ヒト真核細胞のものに改変する方法が提供されている。この方
法は、内在性のシアリル化を欠くL.タレントラエ宿主細胞における哺乳動物起源、細菌起
源、又はその両方のいくつかの酵素のクローニング及び発現を含む。改変されたCMP-Sia
生合成経路は、シアリル化された糖脂質、O-グリカン、及びN-グリカンをインビボで産生
するのに有用である。したがって、これは、内在性のシアリル化を欠く非ヒト宿主細胞に
おけるシアリル化された治療用糖タンパク質の生成を促進するのに有用である。
α2,3-又はα2,6-シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのトランスゴルジ及びトランス
ゴルジネットワーク(TGN)において、ガラクトース残基にシアル酸で蓋をし、成熟形態の
糖タンパク質を生じさせる。このプロセシング工程を改変して、天然にはシアリルトラン
スフェラーゼ活性を欠く下等真核宿主細胞及び他の宿主細胞に導入するために、以下のも
の、(1)α2,3-又はα2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性及び(2)CMP-N-アセチルノイラ
ミン酸の十分な供給を宿主細胞の後期ゴルジ体に組み込むことができる。分泌経路(例え
ば、後期ゴルジ)で十分なα2,3-又はα2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性を得るため
に、例えば、既知のシアリルトランスフェラーゼ(例えば、哺乳動物又は細菌源由来のも
の)の触媒ドメインを下等真核宿主細胞の分泌経路に誘導することができる。同様に、ト
ランスポーターを改変して、分泌経路の同じ場所(例えば、後期ゴルジ)へのCMP-N-アセチ
ルノイラミン酸の輸送を可能にすることができる。その結果、対応するグリコシルトラン
スフェラーゼに対する基質の十分な供給を確保するために、CMP-シアル酸の産生を代謝的
に改変して、これらの宿主細胞に導入することができる。解析は全て、先に実施例4及び5
で記載された通りに行うことができる。
(8.10 実施例10 L.タレントラエにおける抗CD20「リツキシマブ」発現)
先に論じられ、図1及び2で模式的に示されているように、効力を改善し、治療的投薬量
を低下させ、Fcグリカンによる改変によって抗体の全体的な臨床成績を向上させることに
より、グリカンレパートリーの設計が様々な特性で選ばれるようになった(図32)。潜在的
用途における概念を試すために、MabThera(登録商標)(Roche)として市販されている抗CD2
0モノクローナル抗体のリツキシマブを、その既知のADCC作用様式のテストケースとして
選んだ。図33は、アミノ酸配列、シグナルペプチド、及び考察されたAsn 297糖部位を示
している。図34は、L.タレントラエ宿主細胞に組み込まれる発現カセットを示している。
得られた細胞株St12427を成長させ、「リツキシマブ_LMTB」と呼ばれる、培養上清中に分
泌された抗体分子を回収した。濾過上清を用いて、まず、プロテインA捕捉精製、次いで
、疎水性相互作用カラムという2工程で、精製を行った(図35)。
図36Aは、リツキシマブ_LMTBとRoche製の市販の比較物質MabThera(登録商標)との比較
を示している。非還元条件下において、リツキシマブ_LMTBは、何となく異なる強度で、M
abThera(登録商標)と類似のバンドパターンを示した。分解産物の痕跡は、両方の試料で
観察された。PNGアーゼFにより消化されたタンパク質は、リツキシマブ_LMTBよりもMabTh
era(登録商標)で大きく伸長したグリカンを有し、より大きな不均一性を示唆した。予想
された違いが図36Bに示されている。キャピラリーゲル電気泳動により、これらの観察結
果を裏付けた(図37)。
リツキシマブ_LMTBの凝集体形成は、特にモノクローナル抗体の分離及び特徴解析用の
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムである、MAbPac SEC-1を用いて、MabThera(登
録商標)の0.3％と比較して、5.8％と決定された(図38)。
次に、Waters GlycoWorks(商標) RapiFluor-MS(商標)手順(図39)又はPNGアーゼF放出及
び完全メチル化とその後のMALDI-TOF(図40及び41)のいずれかを用いるN-グリカンプロフ
ァイリングを行って、リツキシマブ_LMTBと比較したMabThera(登録商標)のN-グリカン及
びそのフコースレベルの不均一性に取り組んだ。実際、リツキシマブ_LMTBは、CHOで産生
された抗体MabThera(登録商標)で見られる8つを上回るグライコフォームと比較して、100
％均一なMan3グリカンを有していた。図40に示される完全メチル化に基づく定量的比較は
、ADCCのFc媒介性受容体機能にとって最適ではない、大部分がフコシル化された構造を示
している。実際、ADCCのために糖鎖改変だけでなく、タンパク質改変もされている第三世
代の抗CD20抗体であるGazyvaro(登録商標)(Roche)は、アフコシル化N-グリカンが既に増
加している(図42)。Gazyvaro(登録商標)の完全メチル化N-グリカンプロファイリングは、
リーシュマニア・タレントラエで産生されたリツキシマブ及びRoche製のMabThera(登録商
標)のプロファイルと顕著に異なる。主要な構造は、バイセクティングN-グリカンのG0B、
G0BF、G1B、及びG1BFである。Gazyvaro(登録商標)のフコシル化レベルは、MabThera(登録
商標)の94％と比較して、52％である。すなわち、リーシュマニア・タレントラエで産生
されたリツキシマブ_LMTBは、Gazyvaro(登録商標)の48％及びMabThera(登録商標)のわず
か6％と比較して、100％フコシル化されていない。しかし、リーシュマニア・タレントラ
エで産生されたリツキシマブは、Gazyvaro(登録商標)で見られる14の構造及びMabThera(
登録商標)で見られる8つの構造と比較して、Man3 GlcNAc2に対応するただ1つの構造を示
した。CHO細胞で産生された市販の比較物質MabThera(登録商標)の完全メチル化N-グリカ
ンプロファイリングは、典型的なフコシル化二分岐構造であるG0F及びG1Fを主要な構造と
して有する8つの構造を示した。
これは、治療用組換え抗体又はFc含有分子のためのリーシュマニア・タレントラエにお
ける均一でかつ機能カスタマイズされたN-グリカンの糖鎖改変という概念を強く支持する
。
さらに、FACS染色を用いて、Raji細胞でのCD20抗原結合能を決定し(図43A)、組換えCD2
0をスポットし、表示された抗体とともにインキュベートするドットプロット解析(図43B)
;両方のアッセイにおいて、リツキシマブ_LMTBは、MabThera(登録商標)と同程度に、その
抗原(CD20)に結合していた。どちらの抗体も、FACSでIgG1対照抗体を上回る明白な用量依
存的シグナルを生じるが、Mabtheraシグナルが若干強く見えた。
図44は、表12にも掲載されている実施された模式的な品質評価をさらに示している。
表12 リツキシマブ品質基準
Figure 2023134519000067
図52は、グリコシルトランスフェラーゼSfGnt-I Strep及びMGAT2-HAを安定に発現し;か
つリツキシマブをpLMTB5026からエピソーム性に発現するリーシュマニア・タレントラエ
株(St13418)におけるMan3からG0へのインビボグリカン伸長を示している。次に、分泌さ
れたリツキシマブを1Lスケールで2日培養物からプロテインAにより精製した。20ugの精製
リツキシマブ_LMTBをPNGアーゼF及びRF-MSにより解析し、これにより、インビボでの糖鎖
改変が分泌標的タンパク質の全長モノクローナル抗体で成功することが示された。
(8.11 材料及び方法)
(8.11.1 株、成長、及び遺伝的方法)
別途示されない限り、株(表13)は、5ug/mlのヘミンを含むブレインハートインフュージ
ョン(BHIH)中、暗所26℃で、静止培養物又は振盪培養物として、2～3日間、常法により成
長させた。組換え細胞株の培養物は、適当な選択剤を含有していた(表14)。
表13 株
Figure 2023134519000068
Figure 2023134519000069
Figure 2023134519000070
表14 選択剤
Figure 2023134519000071
安定細胞株を作製するためのトランスフェクションを下記の通りに行って、目的の異種
遺伝子を組み込んだ。発現カセットは、1.)相同組換えによる部位特異的組込みのための
相同性部位、2.)スプライスリーダーアクセプター配列を含有する5'非翻訳末端反復、3.)
リーシュマニア(L.メジャー又はL.タレントラエのいずれか)用にコドン使用が最適化され
たORFとしての目的の遺伝子、4.)例えば、ポリアデニル化配列の3'UTR及び下流遺伝子の5
'UTRを含有する遺伝子間領域、5.)耐性マーカーと、それに続く、6.)その3'UTR、並びに7
.)ゲノムへの部位特異的組込みのための3'相同性領域を含有している。
ゲノムへの組込みのために、5～10ugのドナープラスミドDNAを隣接する制限酵素で消化
して、発現カセットをベクター骨格から切り出した。制限消化を最後まで又は30℃でo/n
行い、DNAをEtOH沈殿により精製した(2容量の100％氷冷EtOHを1容量の消化したDNAに添加
し、氷上で30分間インキュベートし、4℃で30分間、17'500×gで遠心分離した)。ペレッ
トを70％EtOHで洗浄し、ペレットを最大15分間乾燥させ、ddH2Oに再懸濁させた。環状化
したプラスミドの除去を最適化するために、ベクター骨格中に認識部位を有する1つ又は2
つの制限酵素を選び、37℃で約1時間消化を行い、上記の通りに、EtOHにより精製した。
大腸菌DH5αにおける100ngの消化したDNA、未消化の対照、及びddH2O対照の形質転換を
熱ショックにより行って、インタクトなプラスミドDNAが残存しているかどうかを調べた
。氷上で10～15分間解凍した化学的にコンピテントなDH5αを100ngの消化したプラスミド
DNAと慎重に混合し、氷上で25～30分間インキュベートし、その後、42℃で90秒間、熱シ
ョック処理し、氷上で5分間インキュベートした。1mlのLB又はSOC培地を添加し、37℃で1
時間インキュベートした。その後、アリコートを、アンピシリンを含むLB上にプレーティ
ングし、上下逆さまにして、37℃でo/nインキュベートした。
トランスフェクション用のリーシュマニア培養物の調製を、26℃で静止状態で、トラン
スフェクション前日に、BHIH中の高密度成長培養物の1:10希釈により行った。ODを、使い
捨てキュベット中で光度計を用いて600nmで測定し、最適な効率のために0.4～1.0(4～6×
10*7細胞)の範囲にした。細胞は、対数期のものであるべきであり、これは、丸い形及び
滴状の形の細胞からの混合集団によって示される。より丸い形の細胞が好ましかった。10
mlの培養物を1回のトランスフェクションに使用し、1つの培養物を、それぞれの選択マー
カーの陰性対照として、ddH2Oで必ずエレクトロポレーションした。トランスフェクショ
ンのために、培養物を、RTで5分間、1'800×gでスピンした。SNを除去し、ペレットを5ml
のトランスフェクションバッファー(200mM Hepes pH 7.0、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM
Na2HPO4、6mMブドウ糖、無水(グルコース)、0.22umで滅菌濾過済み)に再懸濁させた。細
胞を再び遠心分離し、ペレットを400ulのトランスフェクションバッファーに再懸濁させ
た。400ulの細胞をDNAに添加し、キュベットに移し、氷上で10分間インキュベートした。
低電圧プロトコル、指数的減衰: 450V、450uF、5～6ms、キュベット: d＝2mmを用いて、G
ene Pulser Xcell(商標)(Biorad)で、エレクトロポレーションを行った。直ちに、ちょう
ど10分間、氷上に置いた。キュベットの中身全体を、選択マーカーを含まない10mlのBHIH
に移し、細胞を、通気して、静止状態で、暗所26℃で20～24時間、成長させた。
その後のクローン選択によるポリクローナル細胞株の選択のために、半分の濃度の選択
マーカーを添加し、培養物を26℃で1～2日間インキュベートし、10mlのBHIH＋最大濃度の
選択マーカー中、1:10で継代した。新しい株番号を割り当て、継代数0とした。その後の
全ての実験について、トランスフェクトした株の継代数を記録した。細胞を暗所26℃でさ
らに成長させた。7日後、培養物が濁った培養物に変わりつつある場合、細胞を、RTで5分
間、1'800×gでスピンし、ペレットを、最大限の選択マーカー濃度を含む新しいBHIH培地
に再懸濁させた。
クローン選択のために、液体培養物が濁ってきたらすぐに、細胞をBHIHプレート(1.4％
寒天を含有)及び適切な100％選択剤にストリークした。プレートをパラフィルムで密閉し
、上下逆さまにして、暗所26℃で7～10日間インキュベートした。単一のコロニー(1～2mm
の大きさ)を、1mlのBHIHを含有する24-ウェルプレートに移し、パラフィルムで密閉し、
暗所26℃で、約7～10日間インキュベートした。その後、1mlの培養物を24-ウェルプレー
トからフラスコ中の10mlのBHIに移し、通常通り静的に、さらに成長させた。
標的とされたゲノム部位における組込みをPCR及びシークエンシングにより確認した。
(8.11.2 プラスミド)
プラスミドは、大腸菌増殖用のpUC57ベクター骨格から得られ、アンピシリン部分マー
カーを含有していた。発現カセットは、切り出しに好適な制限部位に隣接している。この
カセットは、1.)相同組換えによる部位特異的組込みのための相同性部位、2.)スプライス
リーダーアクセプター配列を含有する5'非翻訳末端反復、3.)リーシュマニア(L.メジャー
又はL.タレントラエのいずれか)用にコドン使用が最適化されたORFとしての目的の遺伝子
、4.)例えば、ポリアデニル化配列の3'UTR及び下流遺伝子の5'UTRを含有する遺伝子間領
域、5.)耐性マーカーと、それに続く、6.)その3'UTR、並びに7.)ゲノムへの部位特異的組
込みのための3'相同性領域を含有している。このプラスミドは、遺伝子合成供給業者によ
り作製され、シークエンシングされた。http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showco
don.cgi?species=347515に見られるL.メジャー又はhttp://genomes.urv.es/OPTIMIZER/上
のL.タレントラエのいずれかに由来する、リーシュマニア用に最適化されたコドン使用は
、以下のコドン使用表を使用している:
Figure 2023134519000072
最適化された配列を制限部位の回避及びリピート又はホモポリマーストレッチの欠失の
ために手作業でキュレートした。プラスミド及び説明は、表15に見られる。
表15 プラスミド
Figure 2023134519000073
Figure 2023134519000074
Figure 2023134519000075
(8.11.3 Gnt候補)
Gnt及びさらなるGntハイブリッドは、表9及び表10に掲載されている。
(8.11.4 Rapifluor(RF)標識及びMSを用いたN-グリカンプロファイリング)
(a)試料調製
Watersのアプリケーションノート:≪品質管理及び自動化に適したGlycoWorks RapiFluo
r-MS N-Glycanによる試料調製(Quality control and Automation Friendly GlycoWorks R
apiFluor-MS N-Glycan Sample Preparation)≫に従って、試料を調製した。簡潔に述べる
と、試料の量は10μlであり、精製タンパク質試料の場合、1.5mg/ml(15μg)又はペレット
として10*8細胞であった。3％RapiGestを100℃で3分間、RTで3分間添加した後、10μlのP
NGアーゼF(Sigma、希釈済みの30μlのPNGアーゼ＋220μlの水)を添加し、50℃で5分間イ
ンキュベートした。RTで3分後、10μlのRFMS(110μlの無水DMF中、9mg)を添加し、RTで5
分間インキュベートした。360μlのACNを添加し、試料を、3×30μlでの溶出を用いるSPE
クリーンアップにより洗浄し、90μlまでプールした。完全ループ注入で10μlを注入する
前に(4×過剰充填係数)、試料を100μlのDMF及び210μlのACNで希釈した。
(b)カラムセッティング
液体クロマトグラフィーを、Waters Acquity UPLCシステムで、Glycan BEHアミドカラ
ム(Waters; 130Å、1.7μm、2.1mm×150mm)を用いて行った。N-グリカンの分離を、20％
の水中の0.1％ギ酸(FA)(バッファーA)及び80％のアセトニトリル中の0.1％FA(バッファー
B)から始まり、3分で27％バッファーA、その後、32分以内に、37％のバッファーAに至る
勾配を用いて、0.5mL/分の流速で行った。215nmでUV検出器を用いて、検出を行った。
ESIモードでの質量決定のために、UPLCをWaters Q-TOF Synapt HDMSに直接接続した。
ロック質量スプレー(ロイシンエンケファリン)をロック質量補正に用いて、質量をポジテ
ィブイオンモードでm/z 300～3500で獲得した。
ACQUITY UPLC Glycan BEHアミド130Å、1.7μm、2.1×150mm;バッファー: A: 50mM AmF
or(H2O) pH 4.5、B: CAN;流速: 0.5ml/分;温度: 45℃;注入量: 10μl(完全ループ注入);
勾配: 3分で80～73％B、32分で73～63％B(合計55分間)、LC法 ESI_RFMS_mAB_55_FLR; Sy
napt設定: 20161006_uba284_esi_RFMS)、MS法 ESI_RFMS_mAB_300_3500_vpos_55;キャッ
プ電圧: 3kV;コーン電圧: 80V;ソース温度: 120℃;溶解温度: 350℃;溶存ガス: 800l/h;
ロック質量:ロイシンエンケファリン、流速4uL/分で1ng/ul;蛍光検出: Ex 265/Em 425nm(
RapiFluor-MS)(2Hz)。
(8.11.5 完全メチル化及びMALDI-TOFによる粗細胞ペレットのN-グリカンプロファイリン
グ)
(a)試料調製
10*8個の細胞を用いたペレットを、振盪させながら30分間、クロロホルム/メタノール(
2:1)により脱脂質化した。遠心分離後、クロロホルムメタノール水(40:20:3)による2回目
の脱脂質化工程を、振盪させながら、30分間実施した。遠心分離後、脱脂細胞ペレットを
窒素流下で乾燥させた。
細胞ペレットのタンパク質を、0.1％Rapigest(登録商標) SF(WATERS)及び10mM DTTを含
有する200μlの50mM重炭酸アンモニウムバッファー中の3×90秒の超音波処理により抽出
した。タンパク質を56℃で45分間変性させ、ヨードアセトアミド(50mM)により、暗所室温
で60分間アルキル化した。その後、試料を10μgのトリプシン/Lys-Cミックス質量分析等
級(PROMEGA)とともに37℃で16時間インキュベートして、消化されたタンパク質を得た。
(b)N-グリカンのグリコシダーゼ消化及び完全メチル化
95℃で5分間、トリプシン/Lys-Cを不活化した後、試料を2つのアリコートに分割した。
1つのアリコートを20ユニットのPNGアーゼF(Promega #175715)で脱グリコシル化し、2つ
目のアリコートを、200mM酢酸バッファー(pH 5)でpH 5に合わせた15μlのPNGアーゼA(Roc
he #10472620)で脱グリコシル化した。4つの試料を37℃で16時間インキュベートした。消
化されたタンパク質試料に0.5％TFAを添加することにより、加水分解性界面活性剤を除去
し、37℃で30分間インキュベートし、15'000×gで10分間遠心分離した。トリプシン消化
ペプチドをSEP PACK C18 200mgカラムに充填し、N-グリカンを含有するフロースルーを回
収した。
N-グリカンをUltra Clean SPE Carbograph(ALLTECH)で精製した。SPEを0.1％TFA中で平
衡化した後、PNGアーゼにより放出されたN-グリカンを充填し、0.1％TFAで洗浄した。3ml
の25％アセトニトリル、0.1％TFAによる溶出の後、N-グリカンを凍結乾燥させ、その後、
完全メチル化した。約25mgの水酸化ナトリウム、500μlのDMSO、及び300μlのICH3を用い
る完全メチル化を凍結乾燥試料に対して40分間行った。反応物を1mlの水でクエンチした
後、3×500μlのクロロホルムを完全メチル化グリカンの抽出に用いた。クロロホルム相
を等量の水で洗浄し、その後、乾燥させた。反応産物をC18 SepPak 200mg(WATERS)に充填
し、2mlの80％アセトニトリル中で溶出させ、凍結乾燥させた後、MALDI-TOF MS解析した
。
(c)N-グリカンのMALDI-TOF分析
精製した完全メチル化グリカンを20μlの50:50メタノール/水中で可溶化した。2μlの
希釈していないN-グリカンと1/2希釈したN-グリカンを2μlの2,5 DHB(LaserBiolabs)マト
リックス溶液(10mg/mlの50:50メタノール/水)と混合した。ポジティブイオンリフレクト
ロンMALDI-TOF質量スペクトルを、Autoflex III質量分析計(Bruker)を用いて獲得した。
スペクトルを4000ショットの蓄積により取得し、外部標準(Pepmix4 LaserBiolabs)で較正
した。加速及びリフレクター電圧条件は、次のように設定した:電圧10.3×1954V、80％レ
ーザー。
(8.11.6 インビトロ活性アッセイのための親和性タグ化異種Gntの精製)
HA精製手順は、次の通りであった。異種Gntを発現する組換え細胞の培養物を目的のHA
タグ化Gnt酵素の細胞内発現についてまず解析した。1×109個の細胞を回収し、遠心分離
して(2000×g/5分)、親和性精製のために細胞ペレットを分離した。ペレットを、1％(v/v
) Tritonを含有する1mLの抽出バッファー(25mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、1％v/v Trito
n X-100、EDTA非含有プロテアーゼインヒビター[Roche]、1mM PMSF)に再懸濁させた。再
懸濁した細胞を氷上で超音波処理して、いかなる種類の過熱も回避した。超音波処理[Ban
delin Sonopuls]を、3工程で、20秒間、70％電源入力、7サイクルで実行した。ボルテキ
サーで10秒間激しく撹拌した。破壊された細胞の懸濁液を、4℃で1時間、13'000×gで遠
心分離した。上清(ライセート)を慎重に除去し、精製に使用した。残りの固体画分を1×L
aemmliに再懸濁させ、SDS-PAGE解析に使用した。ライセートを冷PBS(1×プロテアーゼイ
ンヒビター錠剤を含む)と1:2で混合し、100μLの抗HA磁気ビーズ[Thermo Scientific]と
ともに、RT、600rpmで30分間インキュベートした。HA磁気ビーズを磁気ラック[Thermo Sc
ientific]を用いて2mLチューブに回収し、2mLの氷冷TBSで2回洗浄した。溶出を、70μLの
溶出バッファー(TBS中の2mg/mL HAペプチド[Thermo Scientific])を用いて行った。溶出
画分を、SDS-PAGE、次いで、抗HA WBで解析し、インビトロ活性アッセイに使用した。
StrepTactin精製手順は、次の通りであった:異種Gntを発現する組換え細胞の培養物を
目的のStrepタグ化Gnt酵素の細胞内発現について解析した。1×109個の細胞を回収し、遠
心分離して(2000×g/5分)、親和性精製のために細胞ペレットを分離した。ペレットを、1
％(v/v) Tritonを含有する1mLの抽出バッファーに再懸濁させた。再懸濁した細胞を氷上
で超音波処理して、いかなる種類の過熱も回避した。超音波処理[Bandelin Sonopuls]を
、3工程で、20秒間、70％電源入力、7サイクルで実行した。ボルテキサーで10秒間激しく
撹拌した。破壊された細胞の懸濁液を、4℃で1時間、13'000×gで遠心分離した。上清(ラ
イセート)を慎重に除去し、精製に使用した。残りの固体画分を1×Laemmliに再懸濁させ
、SDS-PAGE解析に使用した。ライセートを冷PBS(1×プロテアーゼインヒビター錠剤を含
む)と1:5で混合し、100μLのStrepTactinセファロース[VWR]とともに、RT、600rpmで30分
間インキュベートした。StrepTactin精製の効果に対する細胞/培地のビオチンの干渉効果
を軽減するために、PBS中で5倍希釈を行った。StrepTactinセファロースを遠心分離(2000
×g/1分)によって2mLチューブに回収し、2mLの冷TBSで2回洗浄した。溶出を、70μLの溶
出バッファー(1×TBS中の2.5mMのデスチオビオチン)を用いて行った。溶出画分を、SDS-P
AGE、次いで、抗Strep WBで解析し、インビトロ活性アッセイに使用した。
(8.11.7 インビトログリコシルトランスフェラーゼ活性アッセイ、グリカンの2-アミノ
ベンズアミド(2AB)標識及び/又は洗浄並びにHPLC分離)
新たに調製した試薬を氷上の1.5mlチューブに以下の順番で添加して、HA精製又はスト
レプトアビジン精製GNTのインビトロ活性アッセイを行った: 1. 50ngの適当な2AB標識ア
クセプターグリカン(例えば、2AB-Man3a[Prozymes])又は500ngの適当な非標識アクセプタ
ーグリカン(例えば、Man3a[Prozymes]); 10mM MgCl2; 10mM MnCl2; 1.2mM活性化糖(例え
ば、UDP-GlcNAc又はUDP-Gal[Sigma Aldrich])。TBSバッファー(pH 8.0、25mM Tris pH 7.
5、100mM NaCl)を用いて、容量を50μLに調整し; 20μLのHA濃縮もしくはストレプトアビ
ジン濃縮GNT酵素を添加するか、又は対応する模擬対照用の水、例えば、溶出バッファー
のみを添加した。その後、混合物を短時間遠沈し、RT、600rpmで、o/nインキュベートし
た。非標識基質の場合、HPLC実行前に、Sep-Pak C18クラシックカートリッジ[Waters]を
用いて、グリカンを反応混合物から精製した。試料を(Biggeらの文献、1995)に従って2-A
Bで標識した。(Merryらの文献、2002)に記載されている濾紙円板法を用いて、グリカン洗
浄を行った。インビトロアッセイにおける2AB標識基質の場合、HPLC実行前に、PTFE洗浄
を行った。
2AB標準を用いるシアリルトランスフェラーゼのインビトロ反応(Luley-Goedlらの文献
、2016)は、40ngの2AB-G2(基質糖)、20μLのHA濃縮タンパク質SiaT; 24μLの100mM MES p
H 6.5(最終50mM MES pH 6.5);最終0.1％(v/v) TritonX-100までの1μLのTritonX-100溶液
(100mM MES中)、及び1μLの3.75mM CMP-Neu5AC(dH2Oに溶解)ストック溶液(最終0.75mM)を
含む4μLを含有していた。反応を、37℃で12時間、400rpmで行い、4℃で冷却し、PTFE洗
浄及びHPLC分析まで、-20℃で凍結させた。MabTheraを基質として用いて、さらなる反応
を行った。
MabThera抗体を用いるシアリルトランスフェラーゼのインビトロ活性アッセイは、50μ
g(5μL)の市販のMabThera(Roche、製剤化バッファー中)、20μLのHA濃縮タンパク質SiaT(
溶出バッファーから得られる100mM MES中に40μgのHA ペプチドを含有); 22μLの100mM M
ES pH 6.5(最終～100mM MES pH 6.5);最終0.1％(v/v) TritonX-100までの1μLのTritonX-
100溶液(100mM MES中)を使用していた。1.5mM CMP-Neu5Acをまず添加し、6時間後、さら
に1.5mM CMP-Neu5Acを追加で添加して、最終3mMのCMP-Neu5Acとした。反応を、37℃で12
時間、400rpmで行い、4℃で冷却し、PNGアーゼFによるN-グリカン放出及びRF-MS標識(6.1
1.4 Rapifluor(RF)標識及びMSを用いたN-グリカンプロファイリングに準拠)まで、-20℃
で凍結させた。
2-AB標識グリカンの分離を、(Royleらの文献、2002)に従って、GlycoSep-N順相カラム
を用いるHPLCにより行ったが、3溶媒系に修正した。溶媒Aは、80％アセトニトリル中の10
mMギ酸アンモニウム、pH 4.4であった。溶媒Bは、40％アセトニトリル中の30mMギ酸アン
モニウム、pH 4.4であった。溶媒Cは0.5％ギ酸であった。カラム温度は30℃であり、2-AB
標識グリカンは、蛍光(λex＝330nm、λem＝420nm)により検出した。勾配条件は、0.4ml/
分の流速で160分間かけて100％A～100％B、次に、流速を1ml/分に上昇させて、2分間、10
0％B～100％Cの線形勾配であった。カラムを、100％Cで5分間、100％Aに2分間かけて戻し
、100％Aで1ml/分の流速で15分間、その後、流速を0.4ml/分に戻して5分間、実行した。
試料は、水中で注入した。
(8.11.8 非改変細胞株及び糖鎖改変細胞株からのrhEPOの発現及び精製)
両方の株の2×200mlの培養物を、140rpmで振盪させながら、BHIH中、26℃で72時間成長
させた。培養物を回収し、2000×gで45分間遠心分離した。SNを硫酸アンモニウム沈殿用
に回収した。簡潔に述べると、SNを、(NH4)2SO4(40％W/V)により、RTで45分間沈殿させた
後、4°で1時間、11'000×gで遠心分離した。SNを除去し、再懸濁させ、残りの茶色い/黒
いペレットを50mlの1×PBS pH 7.4に溶解させた。5LのPBSを用いて2時間、及び5Lに対し
て4℃でo/n、透析を行った。50mlの透析した試料を6ml StrepTactinカラムに充填した。2
0CVの1×PBS pH 7.4、0.5ml/分で、洗浄を行った。1ml画分中の1×PBS中の2.5mMデスチオ
ビオチンで10CVを用いて、タンパク質を溶出させた。画分をプールし、プールした4.5ml
の溶出物に冷アセトン(-20℃)を添加して-20℃でo/n沈殿させた。試料を8000gで2時間遠
心分離し、ペレットを500ulのddH2Oに溶解させた。
(8.11.9 N-グリコシル化部位占有及び部位特異的グリコシル化の決定)
(a)rhEPOのペプチド質量フィンガープリント
Rapigest(登録商標) SFを用いて、50mM重炭酸アンモニウム中での酵素によるタンパク
質消化を増強した。250μLの各試料に対応する180μgのタンパク質を、Vivaspin 500 PES
(5kDa)及び4回の遠心分離(15'000×g; 10分、4℃)により、50mM重炭酸アンモニウムバッ
ファー、pH 8中に調製した。タンパク質の最終濃度は、約3mg/mlであった。
タンパク質を、Rapigest(登録商標) SFプロトコル(WATERS)に従って、0.1％Rapigest(
登録商標) SF中で変性させ、DTT(5mM)により60℃で45分間還元し、ヨードアセトアミド(1
5mM)により室温暗所で45分間アルキル化した。試料を、6.4μgのトリプシン/Lys-Cミック
ス、質量分析等級(Promega V507A #201254)とともに、37℃で16時間インキュベートして
、消化されたタンパク質を得た。0.5％TFAを消化されたタンパク質試料に添加することに
より、加水分解性界面活性剤を除去し、37℃で30分間インキュベートし、15000gで10分間
遠心分離した。全てのトリプシン消化ペプチドを、SEP Pack C18、200mg(Waters)で、0.1
％TFAを含む水中で精製した。溶出容量2mLの70％アセトニトリル、0.1％TFAを凍結乾燥に
より完全に乾燥させた。
(b)糖ペプチド濃縮法
ProteoExtract(登録商標)糖ペプチド濃縮キットプロトコル72103-3(Novagen)に従って
、ペプチドを40μLの超純水中で可溶化し、30μlを糖ペプチド濃縮に使用した。
30μLの試料を150μLのZIC Glycocapture樹脂に添加し、結合しなかったペプチドを含
有するフロースルーを回収した。糖ペプチドを225μLのZIC溶出バッファーで溶出させた
。フロースルー及び溶出試料をスピードバック中で完全に蒸発させた。糖ペプチドを15μ
LのMilliQ水に再懸濁させた。シグナル/ノイズ比を改善するためにZip Tips MILLIPORE C
18で精製した後、50％メタノール中の糖ペプチド溶液をmaldiプレート上で乾燥させ、1μ
lのCHCA(LaserBiolabs)マトリックス溶液(7mg/mLの50％アセトニトリル)を添加した。
(c)濃縮画分の脱グリコシル化
5μLの懸濁糖ペプチドを50mM酢酸ナトリウムバッファーにまで調整し、1μLのPNGアー
ゼF(Promega V483A#226517)及び1μLのPNGアーゼA(Sigma # 01000353)を添加して、37℃
で16時間脱グリコシル化した。Zip Tips MILLIPORE C18(SOP P17/2)で調製した後の脱グ
リコシル化ペプチドをCHCA(1:1)(LaserBiolabs)マトリックス溶液(7mg/mLの50:50アセト
ニトリル/水、0.1％TFA)と混合した。
フロースルー画分を調製し、CHCA(1:1)(LaserBiolabs)マトリックス溶液(7mg/mLの50:5
0アセトニトリル/水、0.1％TFA)を用いて解析した。
(d)MALDI-TOF MS解析
フロースルー画分中のペプチド、脱グリコシル化糖ペプチド、及び占有された糖ペプチ
ドを、ポジティブモードリフレクトロン及びリニアモードのMALDI-TOF MS質量分析により
分析した。リニアモードMALDI質量スペクトルは、MALDI-TOF/TOF Autoflex III(Bruker D
altonics)で獲得した。獲得条件は: 14.3×2904V、レーザー49％、6000ショットであった
。ポジティブイオンリフレクトロンMALDI質量スペクトルは、MALDI-TOF/TOF Autoflex II
I(Bruker Daltonics)(SOP 44/1)で獲得した。RP850-3500 Bruker法での獲得条件は、40×
2160V;レーザー97％、5000ショットであった。
(8.11.10 リーシュマニア・タレントラエ分泌タンパク質の同定のためのペプチドマッピ
ング)
St10569細胞を、振盪培養(140rpm)下、OD 3.4になるまで26℃で2日間、400mlのBHIH中
で成長させた。上清を2000×gでの遠心分離により回収し、使用するまで-80℃で保存した
。SNを4℃でo/n解凍し、プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤(Roche、EDTA非含有)と
ともにRTで4時間保持した。
分泌タンパク質を沈殿させるために、硫酸アンモニウム(NH4)2SO4沈殿を行った。簡潔
に述べると、40g(NH4)2SO4を段階的にSNに添加した(パーセンテージでの出発濃度10％)。
160gを添加した後、試料が濁り、40gの最終工程を行った。試料を撹拌しながらRTで40分
間インキュベートした。遠心分離を、4℃で30分間、11000×gで行った。ペレットを20ml
の1×結合バッファー(1×TBS＋1mM CaCl2＋1mM MnCl2)に再懸濁させた(「第一のSN」)。
遠心分離を、4℃で15分間、4000×gで行い、BHIHの残りを含まないタンパク質のみをペレ
ット化した。少量の黒っぽいペレットが観察され、これを10mlの1×結合バッファー(1×T
BS＋1mM CaCl2＋1mM MnCl2)に再懸濁させた。SN及び再懸濁したペレットを、12～14K MWC
Oで、1×TBS中、4℃でo/n透析して、(NH4)2SO4を除去した。バッファーを新たに調製した
1×TBSと交換し、12～14K MWCOで、4℃でさらに2.5時間透析した。1:50のビーズ対試料比
のために、0.7ml ConAカラムを調製した(1.4mlのスラリー)。1mM CaCl2＋1mM MnCl2を第
二のSNの試料に添加し、「再懸濁ペレット」試料用に1×結合バッファーを35mlまで充填
した。ConAスラリーを試料に添加し、RTで4時間回転させた。以下の全ての工程について
、遠心分離を、RTで5分間、1000×gで行った。フロースルー(FT)を回収し、100ulをSDS P
AGEに利用した。スラリーを2CVの結合バッファーで4回洗浄し、洗浄画分を回収した。タ
ンパク質を1CV(700ul)で6CVかけて溶出させ、一方、最初の2つの溶出物を溶出バッファー
(Vectorlab)中で10分間インキュベートした。
以下の手順を用いて、ペプチドマッピングを行った。5μlの試料を40μlのバッファー(
10mM Tris/2mM CaCl2、pH 8.2)及び5μlのトリプシン(10mM HCl中、100ng/μl)と混合し
、マイクロ波中、60℃で30分間処理した。試料を乾燥させ、20μlの0.1％ギ酸に溶解させ
、0.1％FAで1:2希釈し、LC/MS/MS用のオートサンプラーバイアルに移した。1μlを測定の
ために注入した。
検索プログラム中の以下のfastaファイルのデータベースであるMascot(swiss prot及び
uniref(全ての種)を用いて、データベース検索を行った。
TriTrypDB-26_LmajorFriedlin_AnnotatedProteins.fasta
TriTrypDB-26_LtarentolaeParrotTarII_AnnotatedProteins.fasta
さらに、リーシュマニア及びトリパノソーマの既知のプロテオームを含むカスタムデー
タベースに対して、検索を行った:
Uniprot:トリパノソーマ・ブルセイ(927/4 GUTat10.1株);トリパノソーマ・クルージ(Try
panosoma cruzi);トリパノソーマ・クルージ・マリンケルレイ(Trypanosoma cruzi marin
kellei);トリパノソーマ・ビバックス(Trypanosoma vivax)(Y486株);トリパノソーマ・ク
ルージDm28c;トリパノソーマ・ランゲリ(Trypanosoma rangeli)SC58;トリパノソーマ・コ
ンゴレンス(Trypanosoma congolense)(IL3000株);トリパノソーマ・クルージ(CL Brener
株);トリパノソーマ・ブルセイ・ガンビエンス(Trypanosoma brucei gambiense)(MHOM/CI
/86/DAL972株);リーシュマニア・インファンツム;リーシュマニア・メジャー;リーシュマ
ニア・ブラジリエンス(Leishmania braziliensis);リーシュマニア・メキシカーナ(MHOM/
GT/2001/U1103株);リーシュマニア・ドノバニ(BPK282A1株)。
TriTrypDB(http://tritrypdb.org/tritrypdb/):リーシュマニア・メジャー・フリートリ
ン(Leishmania major Friedlin);リーシュマニア・タレントラエ・パロットタール(Leish
mania tarentolae Parrot Tar) II;トリパノソーマ・ブルセイ・リスター(Trypanosoma b
rucei Lister) 427;トリパノソーマ・クルージDm28c。全タンパク質: 155'504
検索結果をScaffoldにまとめた(存在する場合、トリプシン、ケラチン、他の一般的な
混入物質、及びデコイのヒットは、表示されていない)。
(8.11.11 シグナルペプチドを同定するためのN-末端シークエンシング)
EDMAN分解によるシグナルペプチドのN-末端シークエンシングのために、Con A濃縮した
分泌タンパク質をSEC 10/300 Superdex GLを用いてさらに精製した。このために、24mlの
CV ConA溶出物をプールし、3K MWCO Amiconフィルターを用いて、1×PBS pH 7.4中に、50
0ulまで濃縮した。SECカラムに、0.5ml/分の流速で充填し、画分を0.5mlの容量で回収し
た。非常に低いmAU範囲で観測されるいくつかのピークを観測し、プールした。このプー
ルは、異なるピーク/タンパク質を分離することができるように行った。Amicon 3K MWCO
による超遠心分離を行って、試料容量を濃縮した。試料をSDS PAGE上に充填し、PDVFメン
ブレン上にブロットし、ポンソーで染色し、タンパク質バンドを切り出し、EDMANシーク
エンシングに供した。
(8.11.12 異なるシグナルペプチドを用いたrhEPO発現及び分泌の評価)
組換え細胞株St11376及びSt11377を、各々、5×400mlのBHIH中に1:40で、26℃で3日間(
72時間)にわたって、140rpmで成長させた。2000×gで40分間沈降させた後、上清を回収し
た。15 ODに相当する上清を、次のように、トリクロロ酢酸(TCA)沈殿に使用した:上清を
氷上で冷却し、100％TCAを最終10％まで添加し、氷上で15～30分間インキュベートし、4
℃で30分間、11'000×gで遠心分離し、1mLの氷冷アセトンで洗浄し、4℃で30分間、11'00
0×gで遠心分離した。ペレットを1×Laemmli(30μL)に再懸濁させ、最大5μLの1M TrisHC
l(pH 8.0)を添加して、pHを調整した(黄色から青への色の表示)。分泌されたStrepタグ化
rhEPOを含有するTCA沈殿上清をWB及びクマシー解析に使用した。15 ODのSN TCAを充填し
、10％Bis-Trisゲル上で、MOPS泳動バッファーを用いて、200Vで60分間泳動させた。uDar
pinLLを抗Strep免疫ブロット及びクマシー用の充填対照として2ugで使用した。ブロッテ
ィングを、iblot(商標)(Invitrogen) P0を用いて、20～25Vで7分間行い、その後、メンブ
レンを10％ミルク中でブロッキングした。検出は、ポリクローナル抗Strep-タグII抗体(
ウサギ、Abcam ab76949)を、1:1000で、30℃で1時間、その後、二次抗体ヤギ抗ウサギHRP
(Biorad, 170-6515)を、1:1000で、30℃で1時間用いて行った。TMBを発色検出に使用した
。クマシー染色は、o/nの染色及びo/nのddH20脱染色を用いて行った。
(8.11.13 ゴルジ局在タンパク質のCTS領域のバイオインフォマティクス予測及びハイブ
リッド設計)
使用されたTM及びシグナルペプチド予測法は: 1)http://phobius.sbc.su.se/Phobius(K
allの文献、2004)、膜貫通トポロジー及びシグナルペプチドを組み合わせた予測法); 2)H
MMに基づくシグナルペプチド及び膜貫通トポロジー予測(TMHMM及びSignalPよりも低い偽
陽性率が主張される)、並びに3)SignalPであった。HMMは、4種類のタンパク質:シグナル
ペプチドあり/なしの膜貫通タンパク質、シグナルペプチドあり/なしの非膜貫通タンパク
質に対してトレーニングされた。
(8.11.14 細胞下分画のための親和性タグ化異種Gntの精製)
HA又はStrepタグ化GNT酵素を発現する細胞(50 ODに相当する1×109個)を回収し、遠心
分離して(4000×g/10分)、細胞ペレットからSNを分離した。上清(5又は10 ODに相当)を、
次のようにTCA沈殿に使用した:上清を氷上で冷却し、100％TCAを最終10％まで添加し、氷
上で15～30分間インキュベートし、11'000×g/4℃で30分間遠心分離し、1mLの氷冷アセト
ンで洗浄し、11'000×g/4℃で30分間遠心分離した。ペレットを1×Lammli(～30μL)に再
懸濁させ、最大5μLの1M TrisHCl(pH 8.0)を添加して、pHを調整した(黄色から青への色
の表示)。TCA沈殿上清をWB解析に使用した。ペレットを、1％(v/v) TritonX-100を含むか
又はそれを含まない、1mLの抽出バッファー(ExB、125mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、EDTA
非含有プロテアーゼインヒビター[Roche]、1mM PMSF)に再懸濁させた。再懸濁した細胞を
氷上で超音波処理[Bandelin Sonopuls]して、いかなる種類の過熱も回避した。超音波処
理を、3工程で、10秒間、70％電源入力、7サイクルで実行し、ボルテックスで10秒間激し
く混合した。破壊された細胞懸濁液を4℃で1時間、13'000×gでスピンした。上清(ライセ
ート)を慎重に除去し、ウェスタンブロット解析用の直接充填物(1×Laemmliを含む)とし
てとして使用した。残りのペレット(+/- TritonX)を、より良い均一化のために細胞ダウ
ンサー(cell douncer)[Sigma Aldrich]を用いて、1％(v/v) TritonX-100が補充された500
μLのExB中で別々に可溶化した。その後、細胞懸濁液を、4℃で1時間、13'000×gで遠心
分離した。可溶性画分をWB解析用の直接充填物(1×Laemmliを含む)として使用した(「不
溶性画分」と呼ばれる)。任意に、残りのペレット(細胞残渣と呼ばれる)を1×Laemmliに
再懸濁させ、WB解析に使用する。全ての画分を、SDS-PAGE、続いて、適当な検出抗体を用
いるWBで解析した。Gntの膜結合は、様々な画分(例えば、上清、ライセート+/-TritonX、
細胞残渣)におけるWBバンドの存在及び強度に基づいて解釈することができる。
SDS PAGEの条件は、次の通りであった:試料を1×Laemmli充填染料中で95℃まで10分間
加熱し; 10％Bis-TrisゲルをMOPSバッファーを用いて200Vで60分間泳動させた。ブロッテ
ィングは、iblot(商標)(Invitrogen) P0を用いて、20～25Vで7分間行い、その後、メンブ
レンを10％ミルク中でブロッキングした。検出は、30℃で1時間の1:1000のポリクローナ
ル抗Strep-タグII抗体(ウサギ、abcam ab76949)又は1:1000のウサギ抗HAタグ抗体(Sigma,
H6908)のいずれか、その後、1:1000又は1:2000の二次抗体ヤギ抗ウサギIgG HRP(Biorad,
170-6515)を30℃で1時間を用いて行った。TMBを発色検出に使用した。
(8.12 L.タレントラエにおける抗CD20「リツキシマブ」の発現、精製、及び解析)
(a)発現
5×1000mlのSt12427(p13、p5026)の培養物を、140rpmで振盪させながら、BHIH中、26℃
で72時間成長させた。培養物を回収し、2000×gで15分間、遠心分離した。4錠のプロテア
ーゼインヒビターカクテル(Roche)及びEDTA(最終濃度1mM)を5000mlの培地SNに添加した。
5000mlの培地SNを0.22umフィルターに通して濾過した後、Vivaflow 200(50'000Da)で濃縮
した。Vivaflowを、100mlのBSA(2g/L)を用いてブロッキングし、ブロッキング後、メンブ
レンを1LのddH2Oで洗浄した。SNをvivaflowの流速(600ml/分)で1000mlまで5倍濃縮した。
(b)精製
培地SNを、オフラインで、蠕動ポンプを用いて4℃で一晩、10mlプロテインAカラムに連
続的に充填した。カラムをNGCシステムに接続し、8CVの1×PBS pH 7.4で洗浄した。溶出
は、0.15MグリシンpH 2.5を用いて行い、150ulの1M Tris pH 8.5を添加することにより、
直接中和した。リツキシマブを含有するプール画分(10ml)を0.7g(NH4)2SO4で調整し、1ml
のHIC(PhenylSepharose GE)に1ml/分の流速で充填し、20mM Tris、1M(NH4)2SO4 pH 7.0の
バッファーAと20mM Tris pH 7.0のバッファーBの勾配で溶出させた。1000ulの画分を回収
し、クマシーSDS PAGE及びウェスタンブロットにより解析した。
(c)解析
(SDS PAGE及びキャピラリーゲル電気泳動:)
SDS PAGEを、クマシーの場合10ug、WBの場合2.5ugを用いて、還元条件下又は非還元条
件下で行い、MOPSバッファーを用いて、4-12％ゲルで55分間分離した。タンパク質純度の
決定は、10ugのタンパク質を用いてクマシー染色SDS-PAGEにより決定し、BSA標準曲線と
比較した。不純物をImageQuantにより定量した。キャピラリーゲル電気泳動(CGE)を、プ
ロトコルに従って、Agilent Protein 230キット(5067-1518)を用いて行った。
(分析的SEC:)
MAbPac SEC-1(4×300mm)は、モノクローナル抗体(mAb)の分離及び特徴解析用に特別に
設計されたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムであり、製造業者の推奨に従って
使用された(温度: 30℃;溶離液: PBS 50mM NaPO4、300mM NaCl pH 6.8;溶出:アイソクラ
ティック、30分;流量: 0.2mL/分;検出: 215nm;注入V: 5ugのタンパク質に相当する5uL)。
(8.12.2 モノクローナル抗体試料のN-グリカンプロファイリング)
(a)N-グリカンのグリコシダーゼ消化及び完全メチル化:
IgG(200μg/40μl)を200μlの50mMリン酸バッファーpH 7.5に懸濁させ、0.5％ドデシル
硫酸ナトリウム(SDS Sigma L4509)及び1％βメルカプトエタノール中、90℃で10分間で変
性させた。22μlのNP40を484μlの最終反応容量で添加した後、タンパク質を、15ユニッ
トのPNGアーゼF(PROMEGA #226517 ref V483A)を用いる15時間の酵素消化により、リン酸
バッファーpH 7.5中、37℃で脱グリコシル化した。脱グリコシル化を電気泳動により制御
した。脱グリコシル化の前及び後の6.5μlの試料を70℃で10分間加熱し、NuPAGE(登録商
標) MESバッファー(Invitrogen NP0002)＋抗酸化剤中、1.0MM、12wのNuPAGE(登録商標) N
ovex Bis-Tris 4-12％ゲル(Invitrogen)上に充填した。泳動時間35分、200V一定。ゲルを
Simply BlueSafestain(Invitrogen)で1時間染色し、水中で脱染色した。
N-グリカンをHypercarb Hypersep 200mg(Thermo Fisher)で精製した。SPEを0.1％TFA中
で平衡化させた後、PNGアーゼにより放出されたN-グリカンを充填し、0.1％TFAで洗浄し
た。3mlの25％アセトニトリル、0.1％TFAによる溶出の後、完全メチル化の前に、N-グリ
カンを凍結乾燥させた。約25mgの水酸化ナトリウム、500μlのDMSO、及び300μlのICH3を
用いた完全メチル化を凍結乾燥試料に対して40分間行った。反応物を1mlの水でクエンチ
した後、3×500μlのクロロホルムを完全メチル化グリカンの抽出に使用した。クロロホ
ルム相を等量の水で洗浄し、その後、乾燥させた。反応産物をC18 SepPak 200mg(WATERS)
に充填し、2mlの80％アセトニトリル中で溶出させ、凍結乾燥させた後、MALDI-TOF MS解
析を行った。
(8.12.3 N-グリカンのMALDI-TOF解析:)
精製した完全メチル化グリカンを20μlの50:50メタノール/水中で可溶化した。2μlの
希釈していないN-グリカンと1/2希釈したN-グリカンを1μlのCHCA(LaserBiolabs)マトリ
ックス溶液(7mg/mlの50:50アセトニトリル/水)とともにスポットした。ポジティブイオン
リフレクトロンMALDI-TOF質量スペクトルを、Autoflex III質量分析計(Bruker)を用いて
獲得した。スペクトルを4000ショットの蓄積により取得し、外部標準(Pepmix4 LaserBiol
abs)で較正した。加速及びリフレクター電圧条件は、次のように設定した:電圧14.7×200
8V、80％レーザー。
モノアイソトピック質量[M+Na]+に対応するN-グリカン構造の解釈は、EXPAZY GlycoMod
ツールを用いて行った。N-グリカンの相対強度(％)を計算して、各々のスペクトルのN-グ
リカンプロファイルを確立した。このために、脱同位体化したN-グリカンピークの強度の
合計を決定し、100％に設定した。その後、各々のグリカンの相対強度(％)をこの値との
関連で決定した。
(8.12.4 FACS)
Raji細胞を抗CD20抗体検査に使用した。10マイクログラム/mlをフローサイトメトリー
の予想最適濃度として用いて、5つの異なる濃度を想定した(表16)。染色する順序:－FcR
ブロッキング、－IgG1ブロッキング、－一次抗体、－二次抗体抗IgG1 APC。ゲートをかけ
た後、各々の試料は、10000～13000個の細胞の解析を表している。対照IgG1抗体も若干の
シグナルを生じる。理由は、不十分なブロッキング及びFc受容体を介する結合又はその特
異性による結合であり得－対照抗体は、この目的のために一般に使用されるが、その特異
性は不明である。ブロッキング対照は、それ自体に対するFcRブロッキングが、非標識抗
ヒトIgG1を用いる第二のブロッキング工程によって再び解消される、低バックグラウンド
シグナルを実際に生じることを示す(図示せず)。
150×g(790rpm Hettich Rotixa RP Rotor 4210)で5分間スピンすることにより培養フラ
スコから回収されたRaji細胞を用いる抗CD20抗体の解析のために、上清を完全に除去し、
細胞を、80μlの洗浄バッファー当たり107個の細胞で、洗浄バッファー(Ca++/Mg++を含ま
ず、2％胎仔ウシ血清を添加し、4℃で保存したDPBS; Ca++/Mg++を含まないDPBS、Corning
21-031-CMR、Lot 21031494R)に再懸濁させ、20μlのFcRブロッキング試薬を添加した。
インキュベーションを暗所4℃で10分間行った。107個の細胞当たり1.4mlのD-PBSを添加す
ることにより洗浄を行い、細胞を250×g(1750rpm Eppendorf 5415C)で5分間スピンし、上
清を完全に除去した。
細胞を107細胞当たり80μlのDPBSに再懸濁させ、20μlの純粋な抗ヒトIgG1(＝20μg/ml
)を添加し、暗所冷蔵庫で10分間インキュベートし、107細胞当たり1.4mlの洗浄バッファ
ーを添加することにより洗浄し、細胞を250×gで5分間スピンし、上清を完全に除去した
。細胞を2×106細胞当たり20μlの洗浄バッファーに再懸濁させ、一次抗体を下記の試料
スケジュールに従って添加し、暗所冷蔵庫で10分間インキュベートし、107細胞当たり0.7
mlの洗浄バッファーを添加することにより洗浄し、細胞を250×gで5分間スピンし、上清
を完全に除去した。細胞を2×106細胞当たり20μlの洗浄バッファーに再懸濁させ、2μl
の二次抗体抗ヒトIgG1-APCを下記の試料スケジュールに従って添加し、暗所冷蔵庫で10分
間インキュベートし、107細胞当たり0.7mlの洗浄バッファーを添加することにより洗浄し
、細胞を250×gで5分間スピンし、上清を完全に除去した。細胞を300μlの洗浄バッファ
ーに再懸濁させ、フローサイトメトリーによる解析まで氷上で保持した。試薬を次のよう
に使用した: FcRブロッキング試薬、Miltenyi 130-059-901、ロット5170330778;純粋な抗
ヒトIgG1(1ml中、100μg)、Miltenyi 130-093-197、ロット5170426031;抗ヒトIgG1-APC、
Miltenyi 130-099-126、ロット5170426074。
表16 FACS用の試料調製
Figure 2023134519000076
Figure 2023134519000077
(ドット-ブロット:)
DotBlotマニフォールドを用いてNC-メンブレン上にブロットされた5～1000ngのCD20-GS
T(Proteintech, #ag17309)を、10％ミルク/PBSTで、4℃でo/nブロッキングした。レーン
を切り出し、5ug/mlのリツキシマブ_LMTB、MabThera(登録商標)、2ug/mlの抗GoEL、2ug/m
lの抗MBP、1:2000の抗Hisとともに、PBST 1％ミルク中、RTで2時間インキュベートした。
レーンをPBSTで3×5分間洗浄し、抗ヒトIgG-HRP(1:2000)又は抗マウスとともに、PBST 1
％ミルク中、RTで1時間インキュベートした。レーンをPBSTで3×5分間洗浄し、ブロット
をTMBを用いて発色させた。
(リツキシマブのEDMAN分解、IP-MS、及びペプチドマッピング:)
試料の調製及び解析は、次の通りに行った:
(還元、アルキル化:)
8Mウレア、50mM TEABバッファー中での可溶化、5mM TCEPによる還元、及びRTで20分間
のインキュベーション。10mM IAAによるアルキル化及び暗所RTで20分間のインキュベーシ
ョン。
(脱グリコシル化:)
アルキル化した後、PNGアーゼF酵素バッファーの添加により、抗体試料を1:10希釈した
。25μgの抗体の場合、0.5μlのPNGアーゼFを添加した。試料を37℃で1時間さらにインキ
ュベートした。
(SDS-PAGE:)
アルキル化し、脱グリコシル化した抗体試料をLammliバッファー中で可溶化した。5μg
の試料のアリコートをSDS-PAGEゲル上に充填した。ゲル泳動後(150V、最大400mA、75分)
、ゲルを50％エタノール、10％酢酸中で30分間インキュベートし、その後、クマシーブリ
リアントブルーでゲルを染色した。
(ゲル内酵素切断:)
それぞれ、100mM TEAB又は50mM TEAB、60％ACN中で3回膨潤/収縮させることにより、SD
S-PAGEゲルからのゲルスライスを酵素切断用に調製した。各々の工程をRTで30分間実施し
た。最後の収縮工程の後、ゲルスライスを蓋が開いたエッペンドルフチューブ(eppy)中で
15分間乾燥させた。3容量の酵素溶液を1:40の酵素/タンパク質比で添加することにより、
タンパク質分解を開始させた。タンパク質分解を一晩行った。得られたペプチドを0.5％(
最終)ギ酸で酸性化した後、質量分析を行った。
(インタクト質量決定:)
0.5％ACN、0.5％FAで約1pmol/μl(1:50)に希釈した後、脱グリコシル化し、還元した抗
体を、そのサブ鎖のインタクト質量決定のために使用し、5μlをLC-システムによる質量
分析計に適用した。検出は、Thermo Scientific Orbitrap XL質量分析計のLTQ及びFT検出
器で行った。電荷のデコンボリューション処理は、Znovaアルゴリズムを用いて行った。
(高分解能MS:)
Agilent 1100 nanoLCシステムをOrbitrap XL質量分析計と連動させた。酸性化の後、タ
ンパク質分解由来の試料をnanoLC-ESI MS/MSに適用した。0.5％ACN/0.5％FA溶液を5分間
用いて、濃縮カラム(Zorbax SB C18、0.3mm×5mm、Agilent)でペプチドを捕捉し、脱塩し
た後、ペプチドを5％～40％ACNのACN/0.1％FA勾配を用いてZorbax 300 SB C18、75μm×1
50mmカラム(Agilent)で分離した。MSオーバービュースペクトルをnanoLC-ESI-MSMS分析用
の製造業者の機器設定に従ってFT-モードで自動的に採取した。ペプチドフラグメンテー
ション(CID)及び検出もFT-モードで操作した。
(データベース検索:)
高分解能質量分析により獲得されたデータセットを依頼人によって提供される配列のカ
スタムデータベースに対するデータベース検索に使用した。検索パラメータは、予想され
るタンパク質修飾及び本研究で使用されるMS機器に従って設定した。配列アセンブリは、
所与の酵素特異性に関して、PEAKS(Bioinformatics solutions)ソフトウェアにより完成
させた。
(6.13 ゲノムシークエンシング及びアノテーション)
(a)シークエンシング及び配列補正
St10569ゲノムDNAを12のPacBio RS2 SMRTセル(v3.0 P6/C4ケミストリー、製造業者の仕
様によるライブラリー調製、及び8～9kbpで選択されたサイズ)並びにIllumina HiSeq(2×
150bpペアエンドシークエンシング;製造業者の仕様による400～600bpの断片へのTruSeqラ
イブラリー調製)でシークエンシングした。得られた生データは、6MのPacBioリードから
なり、平均リード長は、6549bp及び14MのIlluminaリードである。
PacBioの未加工のリードを、HGAP[https://github.com/PacificBiosciences/Bioinform
atics-Training/wiki/HGAP-in-SMRT-Analysis]を用いて、長いコンティグにアセンブルし
、2回のArrow [https://github.com/PacificBiosciences/GenomicConsensus]を用いて、
エラーを補正した。Abacas2(Assefaらの文献、2009)を用いて、リーシュマニア・ドノバ
ニ(Dumetzらの文献、2017)に基づく参照ゲノム(最小オーバーラップ1000bp、最小同一性1
5％)に沿って、得られたコンティグのスキャフォールドを作成した。PBjelly(Englishら
の文献、2012)を用いて、PacBioポリッシングされた1kbよりも大きいリードに基づいて、
残りのギャップを埋めようと試みた。Illuminaデータに基づく5回のPilonポリッシング(W
alkerらの文献、2014)を行って、得られた染色体スキャフォールド中の残りのシークエン
シングエラーを補正した。
(b)アノテーション
ポリッシングされた染色体スキャフォールドに、参照としてのリーシュマニア・メジャ
ー株フリートリン(Ivensらの文献、2005)の注釈付きゲノムに基づくCompanion(Steinbiss
らの文献、2016)を用いて注釈を付けた。
(出版目録)
Figure 2023134519000078
Figure 2023134519000079
Figure 2023134519000080
Figure 2023134519000081
Figure 2023134519000082
(b)アノテーション
ポリッシングされた染色体スキャフォールドに、参照としてのリーシュマニア・メジャ
ー株フリートリン(Ivensらの文献、2005)の注釈付きゲノムに基づくCompanion(Steinbiss
らの文献、2016)を用いて注釈を付けた。
(出版目録)
Figure 2023134519000159
Figure 2023134519000160
Figure 2023134519000161
Figure 2023134519000162
Figure 2023134519000163
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
a.標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び
b.異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸
:を含む、リーシュマニア宿主細胞。
（態様２）
前記異種グリコシルトランスフェラーゼが、N-アセチルグルコサミントランスフェラー
ゼ;及び/又は異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は異種シアリルトランスフェ
ラーゼである、態様1記載の宿主細胞。
（態様３）
前記宿主細胞が、2以上のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は2以上
の異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は2以上の異種シアリルトランスフェラ
ーゼを含む、態様2記載の宿主細胞。
（態様４）
前記異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞がCMP-NeuAcを生成させることが
できる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む、態様1～3のいずれか一項記載の
宿主細胞。
（態様５）
N-グリカン生合成経路由来の1以上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、
及び/又は機能的に不活化されている、態様1～4のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様６）
前記リーシュマニア細胞がリーシュマニア・タレントラエ細胞である、態様1～4のいず
れか一項記載の宿主細胞。
（態様７）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、
及び/又はシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、表9に掲載されているN-アセチ
ルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、もしくはシアリ
ルトランスフェラーゼ、又はこれらの任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは
変異体に由来する、態様2～6のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様８）
リーシュマニアシグナル及び/又は保持配列が、前記N-アセチルグルコサミントランス
フェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼ
に付加され、ここで、該シグナル配列が、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ
、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼを前記リー
シュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ該保持配列が、該N-アセチルグ
ルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリル
トランスフェラーゼをゴルジ装置に保持する、態様1～7のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様９）
前記CMP-NeuAcを生成させることができるCMP-Sia生合成経路タンパク質が、表11に掲載
されているCMP-Sia生合成経路タンパク質、又はその任意の機能性ホモログ、アイソフォ
ーム、もしくは変異体と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％
、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である、態様4
～8のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様１０）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-Iである、態様1～9のいずれか
一項記載の宿主細胞。
（態様１１）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-IIである、態様1～9のいずれか
一項記載の宿主細胞。
（態様１２）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIである、態様1～9
のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様１３）
前記ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1である、態様1～9のいずれか一項記載
の宿主細胞。
（態様１４）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラ
クトシルトランスフェラーゼがB4GALT1である、態様1～9のいずれか一項記載の宿主細胞
。
（態様１５）
前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT又は2,3-SiaTである、態様1～9のいずれか
一項記載の宿主細胞。
（態様１６）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラ
クトシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-S
iaT又は2,3-SiaTである、態様1～9のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様１７）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラ
クトシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-S
iaT又は2,3-SiaTであり、かつ該シアリルトランスフェラーゼがCMP-NeuAcを生成させるこ
とができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む、態様1～9のいずれか一項記
載の宿主細胞。
（態様１８）
前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシ
ルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のシスゴルジ区画に保持する、態様8記載の宿主細
胞。
（態様１９）
前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシ
ルトランスフェラーゼを前記宿主細胞の中間ゴルジ区画に保持する、態様8記載の宿主細
胞。
（態様２０）
前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のトランスゴルジ
区画に保持する、態様8記載の宿主細胞。
（態様２１）
前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のトランスゴルジ区画
に保持する、態様8記載の宿主細胞。
（態様２２）
前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼ
を前記宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する、態様8記載の宿主細胞。
（態様２３）
前記シグナル配列及び/又は保持配列がリーシュマニア・タレントラエに由来するシグ
ナル配列又は保持配列である、態様8又は10～22のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様２４）
前記シグナル配列がプロセシングされ、除去される、態様23記載の宿主細胞。
（態様２５）
前記保持配列がリーシュマニア・タレントラエタンパク質に由来する細胞質-膜貫通-ス
テム(CTS)配列である、態様8又は10～23のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様２６）
前記CTS配列が、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2
に由来する、態様25記載の宿主細胞。
（態様２７）
前記CTS配列が、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26、又はこれらの機能的
活性断片の配列を含む、態様25記載の宿主細胞。
（態様２８）
前記CTS配列が、配列番号24の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75
％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％
、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100
％同一である配列又はその機能的活性断片;配列番号25の配列と少なくとも約70％、71％
、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98
％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片;或いは配列番号26の配
列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％
、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活
性断片を含む、態様25記載の宿主細胞。
（態様２９）
前記CTSがリーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する、態様25記載の宿主細胞。
（態様３０）
前記CTS配列が配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む、態様25記載の宿主細
胞。
（態様３１）
前記保持配列がリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む、態
様20～22のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様３２）
前記GRIP配列が配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む、態様31記載の宿主細
胞。
（態様３３）
前記GRIP配列が、配列番号27の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75
％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％
、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100
％同一である配列又はその機能的活性断片を含む、態様31記載の宿主細胞。
（態様３４）
前記保持配列が、リーシュマニアタンパク質に由来するCTS配列又はその機能的活性断
片、及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む、態様20～22
のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様３５）
前記CTS配列が、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2
に由来する、態様34記載の宿主細胞。
（態様３６）
前記CTS配列が、配列番号24、配列番号25、又は配列番号26の配列を含み、前記GRIP配
列が、配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む、態様34記載の宿主細胞。
（態様３７）
前記CTS配列がリーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する、態様34記載の宿主細胞
。
（態様３８）
前記CTS配列が配列番号24の配列を含み、前記GRIP配列が配列番号27の配列又はその機
能的活性断片を含む、態様34記載の宿主細胞。
（態様３９）
前記標的タンパク質が前記リーシュマニア宿主細胞にとって異種である、態様1～38の
いずれか一項記載の宿主細胞。
（態様４０）
前記標的タンパク質がリーシュマニア由来のシグナル配列を含むように改変されている
、態様39記載の宿主細胞。
（態様４１）
前記リーシュマニア由来のシグナル配列がリーシュマニア・タレントラエ由来のシグナ
ル配列である、態様40記載の宿主細胞。
（態様４２）
前記シグナル配列が、配列番号28もしくは配列番号29又はこれらの機能的活性断片の配
列を含む、態様39記載の宿主細胞。
（態様４３）
前記シグナル配列が配列番号28の配列又はその機能的活性断片を含む、態様39記載の宿
主細胞。
（態様４４）
前記シグナル配列が、配列番号28の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％
、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは
100％同一である配列又はその機能的活性断片を含む、態様39記載の宿主細胞。
（態様４５）
前記シグナル配列がプロセシングされ、前記標的タンパク質から除去される、態様41～
44のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様４６）
前記標的タンパク質が、ヒトインターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β(INF
-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリアトキ
シン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、
IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-
α)、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)
、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、
グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)
、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)、ゴナドトロピン放出
ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細
胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(FGF20)、線維芽細胞成長因子21(FGF21)、上
皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3、ヒト濾胞刺激ホル
モン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒
球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、CTLA4
の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)、又はTNF受容体の細胞外ドメイン(例えば、FC-融
合体)のアミノ酸配列を含む、態様39～45のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様４７）
前記標的タンパク質が治療用タンパク質である、態様39～45のいずれか一項記載の宿主
細胞。
（態様４８）
前記標的タンパク質が抗体である、態様39～45のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様４９）
前記抗体がヒトタンパク質に対する抗体である、態様48記載の宿主細胞。
（態様５０）
前記抗体が、アダリムマブ(Humira); Remicade(インフリキシマブ); ReoPro(アブシキ
シマブ); Rituxan(リツキシマブ); Simulect(バシリキシマブ); Synagis(パリビズマブ);
Herceptin(トラスツズマブ); Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマイシン); Campath(アレム
ツズマブ); Zevalin(イブリツモマブチウキセタン); Xolair(オマリズマブ); Bexxar(ト
シツモマブ-I-131); Erbitux(セツキシマブ); Avastin(ベバシズマブ); Tysabri(ナタリ
ズマブ); Actemra(トシリズマブ); Vectibix(パニツムマブ); Lucentis(ラニビズマブ);
Soliris(エクリズマブ); Cimzia(セルトリズマブペゴール); Simponi(ゴリムマブ); Ilar
is(カナキヌマブ); Stelara(ウステキヌマブ); Arzerra(オファツムマブ); Prolia(デノ
スマブ); Numax(モタビズマブ); ABThrax(ラキシバクマブ); Benlysta(ベリムマブ); Yer
voy(イピリムマブ); Adcetris(ブレンツキシマブベドチン); Perjeta(ペルツズマブ); Ka
dcyla(アド-トラスツズマブエムタンシン);又はGazyva(オビヌツズマブ)のアミノ酸配列
を有する、態様48又は49記載の宿主細胞。
（態様５１）
前記抗体が、全長抗体、Fab、F(ab') 2 、Scfv、又はsdAbである、態様48～50のいずれか
一項記載の宿主細胞。
（態様５２）
前記標的タンパク質が酵素又はその阻害因子のアミノ酸配列を含む、態様39～45のいず
れか一項記載の宿主細胞。
（態様５３）
前記標的タンパク質が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第
VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノゲン活性化因子
(tPA)及びtPA変異体、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシ
ダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルフ
ァーゼ(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ-β(ヒトα-
ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNアーゼ-I、ヒアルロニ
ダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸
カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害因子(α1アンチトリ
プシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、及びアデノシン
デアミナーゼのアミノ酸配列を含む、態様52記載の宿主細胞。
（態様５４）
前記治療用タンパク質が、アバタセプト(例えば、Orencia)、アフリベルセプト(例えば
、Eylea)、アガルシダーゼベータ(例えば、Fabrazyme)、アルビグルチド(例えば、Eperza
n)、アルデスロイキン(例えば、Proleukin)、アレファセプト(例えば、Amevive)、アルグ
ルセラーゼ(例えば、Ceredase)、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、LUMIZYME)、アリ
スキレン(例えば、Tekturna)、アルファ-1-プロテイナーゼ阻害因子(例えば、Aralast)、
アルテプラーゼ(例えば、Activase)、アナキンラ(例えば、Kineret)、アニストレプラー
ゼ(例えば、Eminase)、ヒト炭疽菌免疫グロブリン(例えば、ANTHRASIL)、抗血友病因子(
例えば、Advate)、アンチインヒビター血液凝固複合体(例えば、Feiba Nf)、アンチトロ
ンビンアルファ、ヒトアンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリン(例えば、抗胸腺細胞
グロブリン)、抗胸腺細胞グロブリン(ウマ)(例えば、ATGAM)、抗胸腺細胞グロブリン(ウ
サギ)(例えば、ATG-Fresenius)、アプロチニン(例えば、Trasylol)、アスフォターゼアル
ファ、アスパラギナーゼ(例えば、Elspar)、エルウィニア・クリサンテミアスパラギナー
ゼ(例えば、Erwinaze)、ベカプレルミン(例えば、REGRANEX)、ベラタセプト(例えば、Nul
ojix)、ベラクタント、ビバリルジン(例えば、Angiomax)、A型ボツリヌストキシン(例え
ば、BOTOXE)、B型ボツリヌストキシン(例えば、Myobloc)、ブレンツキシマブベドチン(例
えば、Adcetris)、ブセレリン(例えば、Suprecur)、C1エステラーゼ阻害因子(ヒト)、C1
エステラーゼ阻害因子(組換え体)(例えば、Ruconest)、セルトリズマブペゴール(例えば
、Cimzia)、コリオゴナドトロピンアルファ(例えば、コリオゴナドトロピンアルファ)、
絨毛性ゴナドトロピン(ヒト)(例えば、Ovidrel)、絨毛性ゴナドトロピン(組換え体)(例え
ば、Ovitrelle)、凝固因子ix(例えば、Alprolix)、凝固因子VIIa(例えば、NovoSeven)、
ヒト凝固因子X(例えば、Coagadex)、凝固因子XIIIA-サブユニット(組換え体)、コラゲナ
ーゼ(例えば、Cordase)、コネスタットアルファ、コルチコトロピン(例えば、H.P.Acthar
)、コシントロピン(例えば、Cortrosyn)、ダルベポエチンアルファ(例えば、Aranesp)、
デフィブロチド(例えば、Noravid)、デニロイキンディフチトクス(例えば、Ontak)、デシ
ルジン、ジゴキシン免疫Fab(ヒツジ)(例えば、DIGIBIND)、ドルナーゼアルファ(例えば、
Pulmozyme)、ドロトレコギンアルファ(例えば、Xigris)、デュラグルチド、エフモロクト
コグアルファ(例えば、ELOCTA)、エロスルファーゼアルファ、エンフュービルタイド(例
えば、FUZEON)、エポエチンアルファ(例えば、Binocrit)、エポエチンゼータ(例えば、Re
tacrit)、エプチフィバチド(例えば、INTEGRILIN)、エタネルセプト(例えば、Enbrel)、
エキセナチド(例えば、Byetta)、第IX因子複合体(ヒト)(例えば、AlphaNine)、フィブリ
ノリジン、別名、プラスミン(例えば、Elase)、フィルグラスチム(例えば、N.A.)、フィ
ルグラスチム-sndz、フォリトロピンアルファ(例えば、Gonal-F)、フォリトロピンベータ
(例えば、Follistim AQ)、ガルスルファーゼ(例えば、Naglazyme)、胃内因子、ゲムツズ
マブオゾガマイシン(例えば、Mylotarg)、グラチラマー酢酸塩(例えば、Copaxone)、グル
カゴン組換え体(例えば、GlucaGen)、グルカルピダーゼ(例えば、Voraxaze)、グラミシジ
ンD(例えば、Neosporin)、B型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒト破傷風菌ト
キソイド免疫グロブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン(例えば、Hyperabヒト狂犬
病免疫グロブリン)、ヒトRho(D)免疫グロブリン(例えば、Hyp Rho D Inj 16.5％)、ヒト
血清アルブミン(例えば、Albuminar)、ヒト水痘・帯状疱疹免疫グロブリン(例えば、Vari
zig)、ヒアルロニダーゼ(例えば、HYLENEX)、ヒアルロニダーゼ(ヒト組換え体)、イブリ
ツモマブチウキセタン(例えば、Zevalin)、イズルスルファーゼ(例えば、Elaprase)、イ
ミグルセラーゼ(例えば、Cerezyme)、ヒト免疫グロブリン、インスリンアスパルト(例え
ば、NovoLog)、ウシインスリン、インスリンデグルデク(例えば、Tresiba)、インスリン
デテミル(例えば、LEVEMIR)、インスリングラルギン(例えば、Lantus)、インスリングル
リジン(例えば、APIDRA)、インスリンリスプロ(例えば、Humalog)、ブタインスリン(例え
ば、Iletin II)、レギュラーインスリン(例えば、Humulin R)、ブタインスリン(例えば、
vetsulin)、イソフェンインスリン(例えば、Novolin N)、インターフェロンアルファ-2a
、組換え体(例えば、Roferon A)、インターフェロンアルファ-2b(例えば、INTRON A)、イ
ンターフェロンアルファコン-1(例えば、INFERGEN)、インターフェロンアルファ-n1(例え
ば、Wellferon)、インターフェロンアルファ-n3(例えば、Alferon)、インターフェロンベ
ータ-1a(例えば、Avonex)、インターフェロンベータ-1b(例えば、Betaseron)、インター
フェロンガンマ-1b(例えば、Actimmune)、静注用免疫グロブリン(例えば、Civacir)、ラ
ロニダーゼ(例えば、Aldurazyme)、レノグラスチム(例えば、Granocyte)、レピルジン(例
えば、Refludan)、ロイプロリド(例えば、Eligard)、リラグルチド(例えば、Saxenda)、
ルシナクタント(例えば、Surfaxin)、ルトロピンアルファ(例えば、Luveris)、メカセル
ミン(例えば、N.A.)、メノトロピン(例えば、Menopur)、メトキシポリエチレングリコー
ル-エポエチンベータ(例えば、Mircera)、メトレレプチン(例えば、Myalept)、天然アル
ファインターフェロンもしくはマルチフェロン(例えば、Intron/Roferon-A)、ネシリチド
(例えば、NATRECOR)、オクリプラスミン(例えば、Jetrea)、オプレルベキン(例えば、Neu
mega)、OspAリポタンパク質(例えば、Lymerix)、オキシトシン(例えば、Pitocin)、パリ
フェルミン(例えば、Kepivance)、パンクレリパーゼ(例えば、Pancrecarb)、ウシペガデ
マーゼ(例えば、Adagen)、ペグアスパラガーゼ(例えば、Oncaspar)、ペグフィルグラスチ
ム(例えば、Neulasta)、ペグインターフェロンアルファ-2a(例えば、Pegasys)、ペグイン
ターフェロンアルファ-2b(例えば、PEG-Intron)、ペグインターフェロンベータ-1a(例え
ば、Plegridy)、ペグロティカーゼ(例えば、(Krystexxa))、ペグビソマント(例えば、SOM
AVERT)、ポラクタントアルファ(例えば、Curosurf)、プラムリンタイド(例えば、Symlin)
、プレオタクト(例えば、Preotact E)、プロタミン硫酸塩(例えば、プロタミン硫酸塩注
射液、USP)、ヒトプロテインS(例えば、ヒトプロテインS)、プロトロンビン(例えば、Fei
ba Nf)、プロトロンビン複合体(例えば、Cofact)、プロトロンビン複合体濃縮製剤(例え
ば、Kcentra)、Rasbウリカーゼ(例えば、Elitek)、レテプラーゼ(例えば、Retavase)、リ
ロナセプト(例えば、Arcalyst)、ロミプロスチム(例えば、Nplate)、サクロシダーゼ(例
えば、Sucraid)、サケカルシトニン(例えば、Calcimar)、サルグラモスチム(例えば、Leu
comax)、サツモマブペンデチド(例えば、OncoScint)、セベリパーゼアルファ(例えば、Ka
numa)、セクレチン(例えば、SecreFlo)、セルモレリン(例えば、酢酸セルモレリン)、血
清アルブミン(例えば、Albunex)、ヨウ素標識血清アルブミン(例えば、Megatope)、シモ
クトコグアルファ(例えば、Nuwiq)、シプリューセル-T(例えば、Provenge)、ソマトトロ
ピン組換え体(例えば、NutropinAQ)、ソマトロピン組換え体(例えば、BioTropin)、スト
レプトキナーゼ(例えば、Streptase)、スソクトコグアルファ(例えば、Obizur)、タリグ
ルセラーゼアルファ(例えば、Elelyso)、テデュグルチド(例えば、Gattex)、テネクテプ
ラーゼ(例えば、TNKase)、テリパラチド(例えば、Forteo)、テサモレリン(例えば、Egrif
ta)、トロンボモデュリンアルファ(例えば、Recomodulin)、サイマルファシン(例えば、Z
adaxin)、サイログロブリン、チロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen)、ツベルクリン
精製タンパク質誘導体(例えば、Aplisol)、ツロクトコグアルファ(例えば、Zonovate)、
ウロフォリトロピン(例えば、BRAVELLE)、ウロキナーゼ(例えば、Kinlytic)、バソプレッ
シン(例えば、Pitressin)、ベラグルセラーゼアルファ(例えば、Vpriv)、アブシキシマブ
(例えば、ReoPro)、アダリムマブ(例えば、Humira)、アレムツズマブ(例えば、CAMPATH)
、アリロクマブ(例えば、Praluent)、アルシツモマブ(例えば、CEA-Scan)、アテゾリズマ
ブ(例えば、Tecentriq)、バシリキシマブ(例えば、Simulect)、ベリムマブ(例えば、Benl
ysta)、ベバシズマブ(例えば、Avastin)、ブリナツモマブ(例えば、Blincyto)、ブロダル
マブ(例えば、Siliq)、カナキヌマブ(例えば、ILARISE)、カナキヌマブ(例えば、Ilaris)
、カプロマブ(例えば、ProstaScint)、セツキシマブ(例えば、Erbitux)、ダクリズマブ(
例えば、Zenapax)、ダラツムマブ(例えば、DARZALEX)、デノスマブ(例えば、Xgeva)、ジ
ヌツキシマブ(例えば、unituxin)、エクリズマブ(例えば、Soliris)、エファリズマブ(例
えば、RAPTIVA)、エロツズマブ(例えば、EMPLICITI)、エボロクマブ(例えば、Repatha)、
ゴリムマブ(例えば、Simponi注射液)、イブリツモマブ(例えば、Zevalin)、イダルシズマ
ブ(例えば、Praxbind)、インフリキシマブ(例えば、REMICADE)、イピリムマブ(例えば、Y
ERVOY)、イキセキズマブ(例えば、Taltz)、メポリズマブ(例えば、Nucala)、ムロモナブ(
例えば、ORTHOCLONE OKT3)、ナタリズマブ(例えば、Tysabri)、ネシツムマブ(例えば、Po
rtrazza)、ニボルマブ(例えば、Opdivo)、オビルトキサキシマブ(例えば、Anthim)、オビ
ヌツズマブ(例えば、Gazyva)、オファツムマブ(例えば、Arzerra)、オマリズマブ(例えば
、Xolair)、パリビズマブ(例えば、Synagis)、パニツムマブ(例えば、Vectibix)、ペンブ
ロリズマブ(例えば、Keytruda)、ペルツズマブ(例えば、Perjeta)、ラムシルマブ(例えば
、Cyramza)、ラニビズマブ(例えば、Lucentis)、ラキシバクマブ(例えば、ラキシバクマ
ブ)、リツキシマブ(例えば、Rituxan)、セクキヌマブ(例えば、Cosentyx)、シルツキシマ
ブ(例えば、Sylvant)、トシリズマブ(例えば、ACTEMRA)、トシツモマブ(例えば、Bexxar)
、トラスツズマブ(例えば、Herceptin)、ウステキヌマブ(例えば、Stelara)、又はベドリ
ズマブ(例えば、Entyvio)のアミノ酸配列を含む、態様47記載の宿主細胞。
（態様５５）
前記標的タンパク質がFc-融合タンパク質である、態様39～54のいずれか一項記載の宿
主細胞。
（態様５６）
前記宿主細胞が
a.Stt3オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)を含み、かつ
b.内在性のN-グリカン伸長を有さない、
態様1～55のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様５７）
前記宿主細胞が表13に掲載されている任意の株である、態様1～56のいずれか一項記載
の宿主細胞。
（態様５８）
前記宿主細胞が図53に示されている原核生物又は真核生物酵素を有するCMP-Neu5Ac経路
を含む、態様1～57のいずれか一項記載の宿主細胞。
（態様５９）
グリコシル化標的タンパク質を作製する方法であって、態様1～47のいずれか一項記載
の宿主細胞を培養すること、及び該標的タンパク質を培養物から精製することを含む、前
記方法。
（態様６０）
態様59記載の方法から得られるグリコシル化標的タンパク質の組成物。
（態様６１）
前記組成物中の前記標的タンパク質のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列の少なく
とも約90％～100％が、以下の構造:
（化１）
Figure 2023134519000164
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を含むオリゴ糖を担持する、態様60記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
（態様６２）
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
下の構造:
（化２）
Figure 2023134519000165
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を特徴とするG0-Gnグリカンである、態様60記載のグリコシル化標的タンパク質の組
成物。
（態様６３）
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
下の構造:
（化３）
Figure 2023134519000166
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を特徴とするG0グリカンである、態様60記載のグリコシル化標的タンパク質の組成
物。
（態様６４）
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
下の構造:
（化４）
Figure 2023134519000167
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)を特徴とするG1-Gnグリカンである、態様60記載のグリコシル化標的タンパク質の組
成物。
（態様６５）
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
下の構造:
（化５）
Figure 2023134519000168
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)のうちの1つ又は複数を特徴とするG2又はG1グリカンである、態様60記載のグリコシ
ル化標的タンパク質の組成物。
（態様６６）
前記標的タンパク質上のグリコシル化が、対象に導入されたときに、該標的タンパク質
の薬物動態特性を最適化するようにさらに修飾されている、65記載のグリコシル化標的タ
ンパク質の組成物。
（態様６７）
前記標的タンパク質上のグリコシル化がシアリル化されている、態様66記載のグリコシ
ル化標的タンパク質の組成物。
（態様６８）
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
下の構造:
（化６）
Figure 2023134519000169
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)のうちの1つ又は複数を特徴とする、態様67記載のグリコシル化標的タンパク質の組
成物。
（態様６９）
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
下の構造:
（化７）
Figure 2023134519000170
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
ある)のうちの1つ又は複数を特徴とする、態様67記載のグリコシル化標的タンパク質の組
成物。
（態様７０）
前記N-結合型グリコシル化コンセンサス配列がAsn-X-Ser/Thrであり;
ここで、Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である、
態様61～65、68、又は69のいずれか一項記載の組成物。
（態様７１）
前記グリコシル化標的タンパク質が培養培地中に分泌され、ここで、該グリコシル化標
的タンパク質が態様52～61のいずれか一項記載の通りにグリコシル化されている、態様59
記載の方法。
（態様７２）
前記グリコシル化標的タンパク質が前記培養培地から精製される、態様71の方法。
（態様７３）
前記グリコシル化標的タンパク質が親和性精製又はイオン交換クロマトグラフィーによ
って前記培養培地から精製される、態様72の方法。
（態様７４）
前記グリコシル化標的タンパク質がFCドメインを含有し、プロテイン-Aによって前記培
養培地から親和性精製される、態様73記載の方法。
（態様７５）
前記グリコシル化標的タンパク質が親和性タグを含有し、親和性精製される、態様73記
載の方法。
（態様７６）
態様59又は71～75のいずれか一項記載の方法によって産生されるグリコシル化標的タン
パク質を含む組成物であって、グリコシル化標的タンパク質の集団が少なくとも約90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％均一である、前記
組成物。
（態様７７）
態様59又は71～75のいずれか一項記載の方法によって産生されるグリコシル化標的タン
パク質を含む組成物であって、該標的タンパク質上のN-糖部位の90％～100％がグリコシ
ル化によって占有されている、前記組成物。
（態様７８）
a.リーシュマニア由来のものではないN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼの触
媒ドメイン;並びに
b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配
列
を含む、ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
（態様７９）
前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、態様78記載のハイブリッ
ドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
（態様８０）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがシグナル配列及び少なくとも1つの
保持配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列が該N-アセチルグルコサ
ミントランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲ
ッティングし、かつ該保持配列が該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを該小胞
体又はゴルジ装置に保持する、態様78又は79記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミン
トランスフェラーゼ。
（態様８１）
前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保
持する、態様78記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
（態様８２）
前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保
持する、態様78記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
（態様８３）
前記保持配列が細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である、態様78～82のいずれか一項記
載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
（態様８４）
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されてい
るN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォー
ム、もしくは変異体に由来する、態様78～83のいずれか一項記載のN-アセチルグルコサミ
ントランスフェラーゼ。
（態様８５）
a.リーシュマニア由来のものではないガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン
;並びに
b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配
列
を含む、ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
（態様８６）
前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、態様85記載のハイブリッ
ドガラクトシルトランスフェラーゼ。
（態様８７）
前記ガラクトシルトランスフェラーゼがシグナル配列を含むように改変されており、こ
こで、該シグナル配列が該ガラクトシルトランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレ
ントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ前記保持配列が該ガラクトシルト
ランスフェラーゼを該小胞体又はゴルジ装置に保持する、態様85又は86記載のハイブリッ
ドガラクトシルトランスフェラーゼ。
（態様８８）
前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する、態
様87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
（態様８９）
前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する、態
様87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
（態様９０）
前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する
、態様87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
（態様９１）
前記保持配列が細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である、態様87～89のいずれか一項記
載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
（態様９２）
前記保持配列がGRIP配列である、態様87～89のいずれか一項記載のハイブリッドシアリ
ルトランスフェラーゼ。
（態様９３）
前記保持配列がCTS配列及びGRIP配列である、態様87～89のいずれか一項記載のハイブ
リッドシアリルトランスフェラーゼ。
（態様９４）
前記ガラクトシルトランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されているガラクト
シルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に
由来する、態様87～93のいずれか一項記載のガラクトシルトランスフェラーゼ。
（態様９５）
a.リーシュマニア由来のものではないシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;並
びに
b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配
列
を含む、ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
（態様９６）
前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、態様95記載のハイブリッ
ドシアリルトランスフェラーゼ。
（態様９７）
前記シアリルトランスフェラーゼがシグナル配列を含むように改変されており、ここで
、該シグナル配列が該シアリルトランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレントラエ
宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ前記保持配列が該シアリルトランスフェラ
ーゼを該小胞体又はゴルジ装置に保持する、態様95又は96記載のハイブリッドシアリルト
ランスフェラーゼ。
（態様９８）
前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する、態
様97記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
（態様９９）
前記保持配列がCTS配列である、態様97又は98記載のハイブリッドシアリルトランスフ
ェラーゼ。
（態様１００）
前記保持配列がGRIP配列である、態様97又は98記載のハイブリッドシアリルトランスフ
ェラーゼ。
（態様１０１）
前記保持配列がCTS配列及びGRIP配列である、態様97又は98記載のハイブリッドシアリ
ルトランスフェラーゼ。
（態様１０２）
前記シアリルトランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されているシアリルトラ
ンスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する
、態様89～101のいずれか一項記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
（態様１０３）
前記CTSシグナルが、MAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2 CTSのアミノ酸配列を含む
、態様83、91、93、99、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
（態様１０４）
前記CTSシグナルが、配列番号24、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸配列を含む
、態様83、91、93、98、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
（態様１０５）
前記CTSシグナルが、MAN1 CTSのアミノ酸配列を含む、態様83、91、93、99、又は101の
いずれか一項記載のハイブリッド。
（態様１０６）
前記CTSシグナルが配列番号24のアミノ酸配列を含む、態様83、91、93、99、又は101の
いずれか一項記載のハイブリッド。
（態様１０７）
前記GRIP配列が配列番号27のアミノ酸配列を含む、態様92、93、100、又は101のいずれ
か一項記載のハイブリッド。
（態様１０８）
態様78～84のいずれか一項記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラ
ーゼをコードする核酸。
（態様１０９）
態様85～94のいずれか一項記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼをコー
ドする核酸。
（態様１１０）
態様95～102のいずれか一項記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼをコード
する核酸。

Claims (110)

  1. a.標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び
    b.異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸
    :を含む、リーシュマニア宿主細胞。
  2. 前記異種グリコシルトランスフェラーゼが、N-アセチルグルコサミントランスフェラー
    ゼ;及び/又は異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は異種シアリルトランスフェ
    ラーゼである、請求項1記載の宿主細胞。
  3. 前記宿主細胞が、2以上のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は2以上
    の異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は2以上の異種シアリルトランスフェラ
    ーゼを含む、請求項2記載の宿主細胞。
  4. 前記異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞がCMP-NeuAcを生成させることが
    できる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む、請求項1～3のいずれか一項記載
    の宿主細胞。
  5. N-グリカン生合成経路由来の1以上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、
    及び/又は機能的に不活化されている、請求項1～4のいずれか一項記載の宿主細胞。
  6. 前記リーシュマニア細胞がリーシュマニア・タレントラエ細胞である、請求項1～4のい
    ずれか一項記載の宿主細胞。
  7. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、
    及び/又はシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、表9に掲載されているN-アセチ
    ルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、もしくはシアリ
    ルトランスフェラーゼ、又はこれらの任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは
    変異体に由来する、請求項2～6のいずれか一項記載の宿主細胞。
  8. リーシュマニアシグナル及び/又は保持配列が、前記N-アセチルグルコサミントランス
    フェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼ
    に付加され、ここで、該シグナル配列が、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ
    、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼを前記リー
    シュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ該保持配列が、該N-アセチルグ
    ルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリル
    トランスフェラーゼをゴルジ装置に保持する、請求項1～7のいずれか一項記載の宿主細胞
    。
  9. 前記CMP-NeuAcを生成させることができるCMP-Sia生合成経路タンパク質が、表11に掲載
    されているCMP-Sia生合成経路タンパク質、又はその任意の機能性ホモログ、アイソフォ
    ーム、もしくは変異体と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％
    、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
    91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である、請求
    項4～8のいずれか一項記載の宿主細胞。
  10. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-Iである、請求項1～9のいずれ
    か一項記載の宿主細胞。
  11. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-IIである、請求項1～9のいずれ
    か一項記載の宿主細胞。
  12. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIである、請求項1～
    9のいずれか一項記載の宿主細胞。
  13. 前記ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1である、請求項1～9のいずれか一項記
    載の宿主細胞。
  14. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラ
    クトシルトランスフェラーゼがB4GALT1である、請求項1～9のいずれか一項記載の宿主細
    胞。
  15. 前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT又は2,3-SiaTである、請求項1～9のいずれ
    か一項記載の宿主細胞。
  16. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラ
    クトシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-S
    iaT又は2,3-SiaTである、請求項1～9のいずれか一項記載の宿主細胞。
  17. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラ
    クトシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-S
    iaT又は2,3-SiaTであり、かつ該シアリルトランスフェラーゼがCMP-NeuAcを生成させるこ
    とができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む、請求項1～9のいずれか一項
    記載の宿主細胞。
  18. 前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシ
    ルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のシスゴルジ区画に保持する、請求項8記載の宿主
    細胞。
  19. 前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシ
    ルトランスフェラーゼを前記宿主細胞の中間ゴルジ区画に保持する、請求項8記載の宿主
    細胞。
  20. 前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のトランスゴルジ
    区画に保持する、請求項8記載の宿主細胞。
  21. 前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のトランスゴルジ区画
    に保持する、請求項8記載の宿主細胞。
  22. 前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼ
    を前記宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する、請求項8記載の宿主細胞。
  23. 前記シグナル配列及び/又は保持配列がリーシュマニア・タレントラエに由来するシグ
    ナル配列又は保持配列である、請求項8又は10～22のいずれか一項記載の宿主細胞。
  24. 前記シグナル配列がプロセシングされ、除去される、請求項23記載の宿主細胞。
  25. 前記保持配列がリーシュマニア・タレントラエタンパク質に由来する細胞質-膜貫通-ス
    テム(CTS)配列である、請求項8又は10～23のいずれか一項記載の宿主細胞。
  26. 前記CTS配列が、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2
    に由来する、請求項25記載の宿主細胞。
  27. 前記CTS配列が、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26、又はこれらの機能的
    活性断片の配列を含む、請求項25記載の宿主細胞。
  28. 前記CTS配列が、配列番号24の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75
    ％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％
    、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100
    ％同一である配列又はその機能的活性断片;配列番号25の配列と少なくとも約70％、71％
    、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
    85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98
    ％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片;或いは配列番号26の配
    列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％
    、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
    94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活
    性断片を含む、請求項25記載の宿主細胞。
  29. 前記CTSがリーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する、請求項25記載の宿主細胞。
  30. 前記CTS配列が配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項25記載の宿主
    細胞。
  31. 前記保持配列がリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む、請
    求項20～22のいずれか一項記載の宿主細胞。
  32. 前記GRIP配列が配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項31記載の宿主
    細胞。
  33. 前記GRIP配列が、配列番号27の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75
    ％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％
    、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100
    ％同一である配列又はその機能的活性断片を含む、請求項31記載の宿主細胞。
  34. 前記保持配列が、リーシュマニアタンパク質に由来するCTS配列又はその機能的活性断
    片、及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む、請求項20～
    22のいずれか一項記載の宿主細胞。
  35. 前記CTS配列が、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2
    に由来する、請求項34記載の宿主細胞。
  36. 前記CTS配列が、配列番号24、配列番号25、又は配列番号26の配列を含み、前記GRIP配
    列が、配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項34記載の宿主細胞。
  37. 前記CTS配列がリーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する、請求項34記載の宿主細
    胞。
  38. 前記CTS配列が配列番号24の配列を含み、前記GRIP配列が配列番号27の配列又はその機
    能的活性断片を含む、請求項34記載の宿主細胞。
  39. 前記標的タンパク質が前記リーシュマニア宿主細胞にとって異種である、請求項1～38
    のいずれか一項記載の宿主細胞。
  40. 前記標的タンパク質がリーシュマニア由来のシグナル配列を含むように改変されている
    、請求項39記載の宿主細胞。
  41. 前記リーシュマニア由来のシグナル配列がリーシュマニア・タレントラエ由来のシグナ
    ル配列である、請求項40記載の宿主細胞。
  42. 前記シグナル配列が、配列番号28もしくは配列番号29又はこれらの機能的活性断片の配
    列を含む、請求項39記載の宿主細胞。
  43. 前記シグナル配列が配列番号28の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項39記載の
    宿主細胞。
  44. 前記シグナル配列が、配列番号28の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％
    、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
    88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは
    100％同一である配列又はその機能的活性断片を含む、請求項39記載の宿主細胞。
  45. 前記シグナル配列がプロセシングされ、前記標的タンパク質から除去される、請求項41
    ～44のいずれか一項記載の宿主細胞。
  46. 前記標的タンパク質が、ヒトインターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β(INF
    -β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリアトキ
    シン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、
    IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-
    α)、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)
    、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、
    グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)
    、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)、ゴナドトロピン放出
    ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細
    胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(FGF20)、線維芽細胞成長因子21(FGF21)、上
    皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3、ヒト濾胞刺激ホル
    モン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒
    球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、CTLA4
    の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)、又はTNF受容体の細胞外ドメイン(例えば、FC-融
    合体)のアミノ酸配列を含む、請求項39～45のいずれか一項記載の宿主細胞。
  47. 前記標的タンパク質が治療用タンパク質である、請求項39～45のいずれか一項記載の宿
    主細胞。
  48. 前記標的タンパク質が抗体である、請求項39～45のいずれか一項記載の宿主細胞。
  49. 前記抗体がヒトタンパク質に対する抗体である、請求項48記載の宿主細胞。
  50. 前記抗体が、アダリムマブ(Humira); Remicade(インフリキシマブ); ReoPro(アブシキ
    シマブ); Rituxan(リツキシマブ); Simulect(バシリキシマブ); Synagis(パリビズマブ);
    Herceptin(トラスツズマブ); Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマイシン); Campath(アレム
    ツズマブ); Zevalin(イブリツモマブチウキセタン); Xolair(オマリズマブ); Bexxar(ト
    シツモマブ-I-131); Erbitux(セツキシマブ); Avastin(ベバシズマブ); Tysabri(ナタリ
    ズマブ); Actemra(トシリズマブ); Vectibix(パニツムマブ); Lucentis(ラニビズマブ);
    Soliris(エクリズマブ); Cimzia(セルトリズマブペゴール); Simponi(ゴリムマブ); Ilar
    is(カナキヌマブ); Stelara(ウステキヌマブ); Arzerra(オファツムマブ); Prolia(デノ
    スマブ); Numax(モタビズマブ); ABThrax(ラキシバクマブ); Benlysta(ベリムマブ); Yer
    voy(イピリムマブ); Adcetris(ブレンツキシマブベドチン); Perjeta(ペルツズマブ); Ka
    dcyla(アド-トラスツズマブエムタンシン);又はGazyva(オビヌツズマブ)のアミノ酸配列
    を有する、請求項48又は49記載の宿主細胞。
  51. 前記抗体が、全長抗体、Fab、F(ab')2、Scfv、又はsdAbである、請求項48～50のいずれ
    か一項記載の宿主細胞。
  52. 前記標的タンパク質が酵素又はその阻害因子のアミノ酸配列を含む、請求項39～45のい
    ずれか一項記載の宿主細胞。
  53. 前記標的タンパク質が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第
    VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノゲン活性化因子
    (tPA)及びtPA変異体、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシ
    ダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルフ
    ァーゼ(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ-β(ヒトα-
    ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNアーゼ-I、ヒアルロニ
    ダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸
    カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害因子(α1アンチトリ
    プシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、及びアデノシン
    デアミナーゼのアミノ酸配列を含む、請求項52記載の宿主細胞。
  54. 前記治療用タンパク質が、アバタセプト(例えば、Orencia)、アフリベルセプト(例えば
    、Eylea)、アガルシダーゼベータ(例えば、Fabrazyme)、アルビグルチド(例えば、Eperza
    n)、アルデスロイキン(例えば、Proleukin)、アレファセプト(例えば、Amevive)、アルグ
    ルセラーゼ(例えば、Ceredase)、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、LUMIZYME)、アリ
    スキレン(例えば、Tekturna)、アルファ-1-プロテイナーゼ阻害因子(例えば、Aralast)、
    アルテプラーゼ(例えば、Activase)、アナキンラ(例えば、Kineret)、アニストレプラー
    ゼ(例えば、Eminase)、ヒト炭疽菌免疫グロブリン(例えば、ANTHRASIL)、抗血友病因子(
    例えば、Advate)、アンチインヒビター血液凝固複合体(例えば、Feiba Nf)、アンチトロ
    ンビンアルファ、ヒトアンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリン(例えば、抗胸腺細胞
    グロブリン)、抗胸腺細胞グロブリン(ウマ)(例えば、ATGAM)、抗胸腺細胞グロブリン(ウ
    サギ)(例えば、ATG-Fresenius)、アプロチニン(例えば、Trasylol)、アスフォターゼアル
    ファ、アスパラギナーゼ(例えば、Elspar)、エルウィニア・クリサンテミアスパラギナー
    ゼ(例えば、Erwinaze)、ベカプレルミン(例えば、REGRANEX)、ベラタセプト(例えば、Nul
    ojix)、ベラクタント、ビバリルジン(例えば、Angiomax)、A型ボツリヌストキシン(例え
    ば、BOTOXE)、B型ボツリヌストキシン(例えば、Myobloc)、ブレンツキシマブベドチン(例
    えば、Adcetris)、ブセレリン(例えば、Suprecur)、C1エステラーゼ阻害因子(ヒト)、C1
    エステラーゼ阻害因子(組換え体)(例えば、Ruconest)、セルトリズマブペゴール(例えば
    、Cimzia)、コリオゴナドトロピンアルファ(例えば、コリオゴナドトロピンアルファ)、
    絨毛性ゴナドトロピン(ヒト)(例えば、Ovidrel)、絨毛性ゴナドトロピン(組換え体)(例え
    ば、Ovitrelle)、凝固因子ix(例えば、Alprolix)、凝固因子VIIa(例えば、NovoSeven)、
    ヒト凝固因子X(例えば、Coagadex)、凝固因子XIIIA-サブユニット(組換え体)、コラゲナ
    ーゼ(例えば、Cordase)、コネスタットアルファ、コルチコトロピン(例えば、H.P.Acthar
    )、コシントロピン(例えば、Cortrosyn)、ダルベポエチンアルファ(例えば、Aranesp)、
    デフィブロチド(例えば、Noravid)、デニロイキンディフチトクス(例えば、Ontak)、デシ
    ルジン、ジゴキシン免疫Fab(ヒツジ)(例えば、DIGIBIND)、ドルナーゼアルファ(例えば、
    Pulmozyme)、ドロトレコギンアルファ(例えば、Xigris)、デュラグルチド、エフモロクト
    コグアルファ(例えば、ELOCTA)、エロスルファーゼアルファ、エンフュービルタイド(例
    えば、FUZEON)、エポエチンアルファ(例えば、Binocrit)、エポエチンゼータ(例えば、Re
    tacrit)、エプチフィバチド(例えば、INTEGRILIN)、エタネルセプト(例えば、Enbrel)、
    エキセナチド(例えば、Byetta)、第IX因子複合体(ヒト)(例えば、AlphaNine)、フィブリ
    ノリジン、別名、プラスミン(例えば、Elase)、フィルグラスチム(例えば、N.A.)、フィ
    ルグラスチム-sndz、フォリトロピンアルファ(例えば、Gonal-F)、フォリトロピンベータ
    (例えば、Follistim AQ)、ガルスルファーゼ(例えば、Naglazyme)、胃内因子、ゲムツズ
    マブオゾガマイシン(例えば、Mylotarg)、グラチラマー酢酸塩(例えば、Copaxone)、グル
    カゴン組換え体(例えば、GlucaGen)、グルカルピダーゼ(例えば、Voraxaze)、グラミシジ
    ンD(例えば、Neosporin)、B型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒト破傷風菌ト
    キソイド免疫グロブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン(例えば、Hyperabヒト狂犬
    病免疫グロブリン)、ヒトRho(D)免疫グロブリン(例えば、Hyp Rho D Inj 16.5％)、ヒト
    血清アルブミン(例えば、Albuminar)、ヒト水痘・帯状疱疹免疫グロブリン(例えば、Vari
    zig)、ヒアルロニダーゼ(例えば、HYLENEX)、ヒアルロニダーゼ(ヒト組換え体)、イブリ
    ツモマブチウキセタン(例えば、Zevalin)、イズルスルファーゼ(例えば、Elaprase)、イ
    ミグルセラーゼ(例えば、Cerezyme)、ヒト免疫グロブリン、インスリンアスパルト(例え
    ば、NovoLog)、ウシインスリン、インスリンデグルデク(例えば、Tresiba)、インスリン
    デテミル(例えば、LEVEMIR)、インスリングラルギン(例えば、Lantus)、インスリングル
    リジン(例えば、APIDRA)、インスリンリスプロ(例えば、Humalog)、ブタインスリン(例え
    ば、Iletin II)、レギュラーインスリン(例えば、Humulin R)、ブタインスリン(例えば、
    vetsulin)、イソフェンインスリン(例えば、Novolin N)、インターフェロンアルファ-2a
    、組換え体(例えば、Roferon A)、インターフェロンアルファ-2b(例えば、INTRON A)、イ
    ンターフェロンアルファコン-1(例えば、INFERGEN)、インターフェロンアルファ-n1(例え
    ば、Wellferon)、インターフェロンアルファ-n3(例えば、Alferon)、インターフェロンベ
    ータ-1a(例えば、Avonex)、インターフェロンベータ-1b(例えば、Betaseron)、インター
    フェロンガンマ-1b(例えば、Actimmune)、静注用免疫グロブリン(例えば、Civacir)、ラ
    ロニダーゼ(例えば、Aldurazyme)、レノグラスチム(例えば、Granocyte)、レピルジン(例
    えば、Refludan)、ロイプロリド(例えば、Eligard)、リラグルチド(例えば、Saxenda)、
    ルシナクタント(例えば、Surfaxin)、ルトロピンアルファ(例えば、Luveris)、メカセル
    ミン(例えば、N.A.)、メノトロピン(例えば、Menopur)、メトキシポリエチレングリコー
    ル-エポエチンベータ(例えば、Mircera)、メトレレプチン(例えば、Myalept)、天然アル
    ファインターフェロンもしくはマルチフェロン(例えば、Intron/Roferon-A)、ネシリチド
    (例えば、NATRECOR)、オクリプラスミン(例えば、Jetrea)、オプレルベキン(例えば、Neu
    mega)、OspAリポタンパク質(例えば、Lymerix)、オキシトシン(例えば、Pitocin)、パリ
    フェルミン(例えば、Kepivance)、パンクレリパーゼ(例えば、Pancrecarb)、ウシペガデ
    マーゼ(例えば、Adagen)、ペグアスパラガーゼ(例えば、Oncaspar)、ペグフィルグラスチ
    ム(例えば、Neulasta)、ペグインターフェロンアルファ-2a(例えば、Pegasys)、ペグイン
    ターフェロンアルファ-2b(例えば、PEG-Intron)、ペグインターフェロンベータ-1a(例え
    ば、Plegridy)、ペグロティカーゼ(例えば、(Krystexxa))、ペグビソマント(例えば、SOM
    AVERT)、ポラクタントアルファ(例えば、Curosurf)、プラムリンタイド(例えば、Symlin)
    、プレオタクト(例えば、Preotact E)、プロタミン硫酸塩(例えば、プロタミン硫酸塩注
    射液、USP)、ヒトプロテインS(例えば、ヒトプロテインS)、プロトロンビン(例えば、Fei
    ba Nf)、プロトロンビン複合体(例えば、Cofact)、プロトロンビン複合体濃縮製剤(例え
    ば、Kcentra)、Rasbウリカーゼ(例えば、Elitek)、レテプラーゼ(例えば、Retavase)、リ
    ロナセプト(例えば、Arcalyst)、ロミプロスチム(例えば、Nplate)、サクロシダーゼ(例
    えば、Sucraid)、サケカルシトニン(例えば、Calcimar)、サルグラモスチム(例えば、Leu
    comax)、サツモマブペンデチド(例えば、OncoScint)、セベリパーゼアルファ(例えば、Ka
    numa)、セクレチン(例えば、SecreFlo)、セルモレリン(例えば、酢酸セルモレリン)、血
    清アルブミン(例えば、Albunex)、ヨウ素標識血清アルブミン(例えば、Megatope)、シモ
    クトコグアルファ(例えば、Nuwiq)、シプリューセル-T(例えば、Provenge)、ソマトトロ
    ピン組換え体(例えば、NutropinAQ)、ソマトロピン組換え体(例えば、BioTropin)、スト
    レプトキナーゼ(例えば、Streptase)、スソクトコグアルファ(例えば、Obizur)、タリグ
    ルセラーゼアルファ(例えば、Elelyso)、テデュグルチド(例えば、Gattex)、テネクテプ
    ラーゼ(例えば、TNKase)、テリパラチド(例えば、Forteo)、テサモレリン(例えば、Egrif
    ta)、トロンボモデュリンアルファ(例えば、Recomodulin)、サイマルファシン(例えば、Z
    adaxin)、サイログロブリン、チロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen)、ツベルクリン
    精製タンパク質誘導体(例えば、Aplisol)、ツロクトコグアルファ(例えば、Zonovate)、
    ウロフォリトロピン(例えば、BRAVELLE)、ウロキナーゼ(例えば、Kinlytic)、バソプレッ
    シン(例えば、Pitressin)、ベラグルセラーゼアルファ(例えば、Vpriv)、アブシキシマブ
    (例えば、ReoPro)、アダリムマブ(例えば、Humira)、アレムツズマブ(例えば、CAMPATH)
    、アリロクマブ(例えば、Praluent)、アルシツモマブ(例えば、CEA-Scan)、アテゾリズマ
    ブ(例えば、Tecentriq)、バシリキシマブ(例えば、Simulect)、ベリムマブ(例えば、Benl
    ysta)、ベバシズマブ(例えば、Avastin)、ブリナツモマブ(例えば、Blincyto)、ブロダル
    マブ(例えば、Siliq)、カナキヌマブ(例えば、ILARISE)、カナキヌマブ(例えば、Ilaris)
    、カプロマブ(例えば、ProstaScint)、セツキシマブ(例えば、Erbitux)、ダクリズマブ(
    例えば、Zenapax)、ダラツムマブ(例えば、DARZALEX)、デノスマブ(例えば、Xgeva)、ジ
    ヌツキシマブ(例えば、unituxin)、エクリズマブ(例えば、Soliris)、エファリズマブ(例
    えば、RAPTIVA)、エロツズマブ(例えば、EMPLICITI)、エボロクマブ(例えば、Repatha)、
    ゴリムマブ(例えば、Simponi注射液)、イブリツモマブ(例えば、Zevalin)、イダルシズマ
    ブ(例えば、Praxbind)、インフリキシマブ(例えば、REMICADE)、イピリムマブ(例えば、Y
    ERVOY)、イキセキズマブ(例えば、Taltz)、メポリズマブ(例えば、Nucala)、ムロモナブ(
    例えば、ORTHOCLONE OKT3)、ナタリズマブ(例えば、Tysabri)、ネシツムマブ(例えば、Po
    rtrazza)、ニボルマブ(例えば、Opdivo)、オビルトキサキシマブ(例えば、Anthim)、オビ
    ヌツズマブ(例えば、Gazyva)、オファツムマブ(例えば、Arzerra)、オマリズマブ(例えば
    、Xolair)、パリビズマブ(例えば、Synagis)、パニツムマブ(例えば、Vectibix)、ペンブ
    ロリズマブ(例えば、Keytruda)、ペルツズマブ(例えば、Perjeta)、ラムシルマブ(例えば
    、Cyramza)、ラニビズマブ(例えば、Lucentis)、ラキシバクマブ(例えば、ラキシバクマ
    ブ)、リツキシマブ(例えば、Rituxan)、セクキヌマブ(例えば、Cosentyx)、シルツキシマ
    ブ(例えば、Sylvant)、トシリズマブ(例えば、ACTEMRA)、トシツモマブ(例えば、Bexxar)
    、トラスツズマブ(例えば、Herceptin)、ウステキヌマブ(例えば、Stelara)、又はベドリ
    ズマブ(例えば、Entyvio)のアミノ酸配列を含む、請求項47記載の宿主細胞。
  55. 前記標的タンパク質がFc-融合タンパク質である、請求項39～54のいずれか一項記載の
    宿主細胞。
  56. 前記宿主細胞が
    a.Stt3オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)を含み、かつ
    b.内在性のN-グリカン伸長を有さない、
    請求項1～55のいずれか一項記載の宿主細胞。
  57. 前記宿主細胞が表13に掲載されている任意の株である、請求項1～56のいずれか一項記
    載の宿主細胞。
  58. 前記宿主細胞が図53に示されている原核生物又は真核生物酵素を有するCMP-Neu5Ac経路
    を含む、請求項1～57のいずれか一項記載の宿主細胞。
  59. グリコシル化標的タンパク質を作製する方法であって、請求項1～47のいずれか一項記
    載の宿主細胞を培養すること、及び該標的タンパク質を培養物から精製することを含む、
    前記方法。
  60. 請求項59記載の方法から得られるグリコシル化標的タンパク質の組成物。
  61. 前記組成物中の前記標的タンパク質のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列の少なく
    とも約90％～100％が、以下の構造:
    Figure 2023134519000083
     (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
    表し;かつ
    ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
    ある)を含むオリゴ糖を担持する、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物
    。
  62. 前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
    40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
    ％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
    下の構造:
    Figure 2023134519000084
     (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
    表し;かつ
    ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
    ある)を特徴とするG0-Gnグリカンである、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の
    組成物。
  63. 前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
    40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
    ％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
    下の構造:
    Figure 2023134519000085
     (ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を
    表し;かつ
    ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
    ある)を特徴とするG0グリカンである、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の組
    成物。
  64. 前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
    40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
    ％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
    下の構造:
    Figure 2023134519000086
     (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
    を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
    ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
    ある)を特徴とするG1-Gnグリカンである、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の
    組成物。
  65. 前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
    40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
    ％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
    下の構造:
    Figure 2023134519000087
     (ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基
    を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
    ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
    ある)のうちの1つ又は複数を特徴とするG2又はG1グリカンである、請求項60記載のグリコ
    シル化標的タンパク質の組成物。
  66. 前記標的タンパク質上のグリコシル化が、対象に導入されたときに、該標的タンパク質
    の薬物動態特性を最適化するようにさらに修飾されている、65記載のグリコシル化標的タ
    ンパク質の組成物。
  67. 前記標的タンパク質上のグリコシル化がシアリル化されている、請求項66記載のグリコ
    シル化標的タンパク質の組成物。
  68. 前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
    40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
    ％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
    下の構造:
    Figure 2023134519000088
     (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
    、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
    ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
    ある)のうちの1つ又は複数を特徴とする、請求項67記載のグリコシル化標的タンパク質の
    組成物。
  69. 前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％～30％、25％～35％、30％～
    40％、35％～45％、40％～50％、45％～55％、50％～60％、55％～65％、60％～70％、65
    ％～75％、70％～80％、75％～85％、80％～90％、85％～95％、又は90％～100％が、以
    下の構造:
    Figure 2023134519000089
     (ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は
    、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
    ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnで
    ある)のうちの1つ又は複数を特徴とする、請求項67記載のグリコシル化標的タンパク質の
    組成物。
  70. 前記N-結合型グリコシル化コンセンサス配列がAsn-X-Ser/Thrであり;
    ここで、Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である、
    請求項61～65、68、又は69のいずれか一項記載の組成物。
  71. 前記グリコシル化標的タンパク質が培養培地中に分泌され、ここで、該グリコシル化標
    的タンパク質が請求項52～61のいずれか一項記載の通りにグリコシル化されている、請求
    項59記載の方法。
  72. 前記グリコシル化標的タンパク質が前記培養培地から精製される、請求項71の方法。
  73. 前記グリコシル化標的タンパク質が親和性精製又はイオン交換クロマトグラフィーによ
    って前記培養培地から精製される、請求項72の方法。
  74. 前記グリコシル化標的タンパク質がFCドメインを含有し、プロテイン-Aによって前記培
    養培地から親和性精製される、請求項73記載の方法。
  75. 前記グリコシル化標的タンパク質が親和性タグを含有し、親和性精製される、請求項73
    記載の方法。
  76. 請求項59又は71～75のいずれか一項記載の方法によって産生されるグリコシル化標的タ
    ンパク質を含む組成物であって、グリコシル化標的タンパク質の集団が少なくとも約90％
    、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％均一である、前
    記組成物。
  77. 請求項59又は71～75のいずれか一項記載の方法によって産生されるグリコシル化標的タ
    ンパク質を含む組成物であって、該標的タンパク質上のN-糖部位の90％～100％がグリコ
    シル化によって占有されている、前記組成物。
  78. a.リーシュマニア由来のものではないN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼの触
    媒ドメイン;並びに
    b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配
    列
    を含む、ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
  79. 前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、請求項78記載のハイブリ
    ッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
  80. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがシグナル配列及び少なくとも1つの
    保持配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列が該N-アセチルグルコサ
    ミントランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲ
    ッティングし、かつ該保持配列が該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを該小胞
    体又はゴルジ装置に保持する、請求項78又は79記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミ
    ントランスフェラーゼ。
  81. 前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保
    持する、請求項78記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
  82. 前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保
    持する、請求項78記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
  83. 前記保持配列が細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である、請求項78～82のいずれか一項
    記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
  84. 前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されてい
    るN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォー
    ム、もしくは変異体に由来する、請求項78～83のいずれか一項記載のN-アセチルグルコサ
    ミントランスフェラーゼ。
  85. a.リーシュマニア由来のものではないガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン
    ;並びに
    b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配
    列
    を含む、ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
  86. 前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、請求項85記載のハイブリ
    ッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
  87. 前記ガラクトシルトランスフェラーゼがシグナル配列を含むように改変されており、こ
    こで、該シグナル配列が該ガラクトシルトランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレ
    ントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ前記保持配列が該ガラクトシルト
    ランスフェラーゼを該小胞体又はゴルジ装置に保持する、請求項85又は86記載のハイブリ
    ッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
  88. 前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する、請
    求項87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
  89. 前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する、請
    求項87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
  90. 前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する
    、請求項87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
  91. 前記保持配列が細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である、請求項87～89のいずれか一項
    記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
  92. 前記保持配列がGRIP配列である、請求項87～89のいずれか一項記載のハイブリッドシア
    リルトランスフェラーゼ。
  93. 前記保持配列がCTS配列及びGRIP配列である、請求項87～89のいずれか一項記載のハイ
    ブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
  94. 前記ガラクトシルトランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されているガラクト
    シルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に
    由来する、請求項87～93のいずれか一項記載のガラクトシルトランスフェラーゼ。
  95. a.リーシュマニア由来のものではないシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;並
    びに
    b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配
    列
    を含む、ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
  96. 前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、請求項95記載のハイブリ
    ッドシアリルトランスフェラーゼ。
  97. 前記シアリルトランスフェラーゼがシグナル配列を含むように改変されており、ここで
    、該シグナル配列が該シアリルトランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレントラエ
    宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ前記保持配列が該シアリルトランスフェラ
    ーゼを該小胞体又はゴルジ装置に保持する、請求項95又は96記載のハイブリッドシアリル
    トランスフェラーゼ。
  98. 前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する、請
    求項97記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
  99. 前記保持配列がCTS配列である、請求項97又は98記載のハイブリッドシアリルトランス
    フェラーゼ。
  100. 前記保持配列がGRIP配列である、請求項97又は98記載のハイブリッドシアリルトランス
    フェラーゼ。
  101. 前記保持配列がCTS配列及びGRIP配列である、請求項97又は98記載のハイブリッドシア
    リルトランスフェラーゼ。
  102. 前記シアリルトランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されているシアリルトラ
    ンスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する
    、請求項89～101のいずれか一項記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
  103. 前記CTSシグナルが、MAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2 CTSのアミノ酸配列を含む
    、請求項83、91、93、99、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
  104. 前記CTSシグナルが、配列番号24、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸配列を含む
    、請求項83、91、93、98、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
  105. 前記CTSシグナルが、MAN1 CTSのアミノ酸配列を含む、請求項83、91、93、99、又は101
    のいずれか一項記載のハイブリッド。
  106. 前記CTSシグナルが配列番号24のアミノ酸配列を含む、請求項83、91、93、99、又は101
    のいずれか一項記載のハイブリッド。
  107. 前記GRIP配列が配列番号27のアミノ酸配列を含む、請求項92、93、100、又は101のいず
    れか一項記載のハイブリッド。
  108. 請求項78～84のいずれか一項記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェ
    ラーゼをコードする核酸。
  109. 請求項85～94のいずれか一項記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼをコ
    ードする核酸。
  110. 請求項95～102のいずれか一項記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼをコー
    ドする核酸。
JP2023104857A 2017-06-30 2023-06-27 改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質 Pending JP2023134519A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762527466P 2017-06-30 2017-06-30
US62/527,466 2017-06-30
PCT/EP2018/067494 WO2019002512A2 (en) 2017-06-30 2018-06-28 GLYCOPROTEINS CUSTOMIZED FROM ENGINEERING AND FULLY FUNCTIONAL
JP2019572486A JP7437162B2 (ja) 2017-06-30 2018-06-28 改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019572486A Division JP7437162B2 (ja) 2017-06-30 2018-06-28 改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023134519A true JP2023134519A (ja) 2023-09-27
JP2023134519A5 JP2023134519A5 (ja) 2024-02-08

Family

ID=62815031

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019572486A Active JP7437162B2 (ja) 2017-06-30 2018-06-28 改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質
JP2023104857A Pending JP2023134519A (ja) 2017-06-30 2023-06-27 改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019572486A Active JP7437162B2 (ja) 2017-06-30 2018-06-28 改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質

Country Status (7)

Country Link
US (2) US11913051B2 (ja)
EP (1) EP3645732A2 (ja)
JP (2) JP7437162B2 (ja)
KR (2) KR20240145084A (ja)
CN (2) CN111108211A (ja)
AU (1) AU2018294504B2 (ja)
WO (1) WO2019002512A2 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11913051B2 (en) 2017-06-30 2024-02-27 Limmatech Biologics Ag Engineered and fully-functional customized glycoproteins
WO2019234021A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Limmatech Biologics Ag Glycoengineered monoclonal antibody
WO2021140144A1 (en) 2020-01-07 2021-07-15 Limmatech Biologics Ag Engineered leishmania cells
AU2021205617A1 (en) 2020-01-07 2022-07-28 Limmatech Biologics Ag Glycoengineering using Leishmania cells
CA3192770A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Limmatech Biologics Ag Fab sialylation of antibodies
AU2022246021A1 (en) 2021-03-23 2023-10-05 Glycoera Ag Glycan-mediated protein degradation
AU2022244103A1 (en) 2021-03-23 2023-10-05 Glycoera Ag Mannose 3 glycan-mediated protein degradation
WO2022229854A1 (en) * 2021-04-29 2022-11-03 Novartis Ag Hypersialylating cells
WO2024068768A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Glycoera Ag Glycoengineering using leishmania cells
WO2024147111A1 (en) 2023-01-05 2024-07-11 Glycoera Ag Glycoengineered polypeptides targeting anti-neutrophil autoantibodies and uses thereof
WO2024147112A1 (en) 2023-01-05 2024-07-11 Glycoera Ag Glycoengineered polypeptides targeting immunoglobulin a and complexes comprising the same
WO2024147113A1 (en) 2023-01-05 2024-07-11 Glycoera Ag Glycoengineered polypeptides targeting anti-podocyte autoantibodies and uses thereof
WO2024218743A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Glycoera Ag Multi-functional molecules comprising glycans and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2301495T3 (es) * 1999-11-05 2008-07-01 Jena Bioscience Gmbh Sistemas de expresion de proteinas para kinetoplastidae no patogenos.
US7863020B2 (en) * 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
CN101960017B (zh) * 2008-01-03 2017-06-09 康乃尔研究基金会有限公司 原核生物中的糖基化蛋白表达
EP2341139B1 (en) * 2008-10-01 2016-05-04 Asahi Glass Company, Limited Host, transformant, method for producing the transformant, and method for producing heterogeneous protein containing o-glycoside type sugar chain
KR20140091017A (ko) * 2011-10-28 2014-07-18 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Alg3 발현이 결핍된 피키아 파스토리스 균주에서 n-글리칸 점유율을 증가시키고 하이브리드 n-글리칸의 생산을 감소시키는 방법
CA3006400A1 (en) 2015-11-30 2017-06-08 Limmatech Biologics Ag Methods of producing glycosylated proteins
US11913051B2 (en) 2017-06-30 2024-02-27 Limmatech Biologics Ag Engineered and fully-functional customized glycoproteins
AU2021205617A1 (en) 2020-01-07 2022-07-28 Limmatech Biologics Ag Glycoengineering using Leishmania cells
WO2021140144A1 (en) 2020-01-07 2021-07-15 Limmatech Biologics Ag Engineered leishmania cells
CA3192770A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Limmatech Biologics Ag Fab sialylation of antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240145084A (ko) 2024-10-04
CN117487873A (zh) 2024-02-02
AU2018294504A1 (en) 2020-01-23
AU2018294504B2 (en) 2024-07-11
US11913051B2 (en) 2024-02-27
EP3645732A2 (en) 2020-05-06
CN111108211A (zh) 2020-05-05
JP7437162B2 (ja) 2024-02-22
KR20200022486A (ko) 2020-03-03
KR102711998B1 (ko) 2024-10-04
US20240287568A1 (en) 2024-08-29
JP2020530273A (ja) 2020-10-22
WO2019002512A3 (en) 2019-02-28
WO2019002512A2 (en) 2019-01-03
US20210332403A1 (en) 2021-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7437162B2 (ja) 改変されかつ完全に機能カスタマイズされた糖タンパク質
US20240167069A1 (en) Sialylated Glycoproteins
US20220056109A1 (en) Glycoproteins with anti-inflammatory properties
EP2971030B1 (en) Oligosaccharide compositions, glycoproteins and methods to produce the same in prokaryotes
US20230287327A1 (en) Glycoengineering using leishmania cells
US20110207214A1 (en) Novel tools for the production of glycosylated proteins in host cells
WO2019234021A1 (en) Glycoengineered monoclonal antibody
AU2016363711A1 (en) Methods of producing glycosylated proteins
WO2024068768A9 (en) Glycoengineering using leishmania cells
EP2996772B1 (en) Methods for the treatment of neurodegeneration
US20200277641A1 (en) Genetically engineered eukaryotic cells producing sialylated glycoproteins
Jenkins Analysis and manipulation of recombinant glycoproteins manufactured in mammalian cell culture
Kumar Posttranslational modifications in soluble recombinant therapeutical proteins secreted by lower aukaryotes: structure and function

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230720

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230720

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240611

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240910