JP2023133648A - Methods for evaluating disease susceptibility - Google Patents

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Abstract

To provide a method for evaluating disease susceptibility.SOLUTION: Provided is a method for evaluating disease susceptibility. The method associates genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene with the disease susceptibility of an individual.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、HS3ST4（Heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 4）遺伝子などの解析により疾患罹患性を評価する方法等に関する。具体的には、HS3ST4遺伝子等における遺伝子多型と個体の疾患罹患性とを関連づける、疾患罹患性の評価方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating disease susceptibility by analyzing the HS3ST4 (Heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 4) gene and the like. Specifically, the present invention relates to a method for evaluating disease susceptibility, which associates genetic polymorphisms in the HS3ST4 gene and the disease susceptibility of an individual.

水疱瘡の原因ウイルスである水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）が感染後、生涯潜伏感染し、免疫力が低下した際などに再活性化されると、強い痛みを伴う帯状疱疹（HZ）が引き起こされる。50歳以上でHZ罹患者が急増するが、50歳以上では帯状疱疹罹患者の18％程度、80歳以上では帯状疱疹罹患者の33％において、帯状疱疹後神経痛（PHN）が発症し、長期間に渡り神経障害性疼痛を引き起こし、高齢になるほどPHNを発症しやすいことが知られている（例えば、非特許文献１、２）。PHNで痛みが続く原因は、VZV増殖に伴う神経損傷によるが、PHNの発症のしやすさが人により異なる理由や、疼痛が長期間続くメカニズムについては未解明である。 Varicella zoster virus (VZV), the virus that causes chickenpox, remains latent for life after infection, and when it is reactivated when the immune system is weakened, it causes extremely painful herpes zoster (HZ). The number of people over the age of 50 who develop HZ increases rapidly, and postherpetic neuralgia (PHN) develops in approximately 18% of those over 50 years of age and 33% of those over 80 years of age with herpes zoster. It is known that PHN causes neuropathic pain over a period of time, and that the older one gets, the more likely they are to develop PHN (for example, Non-Patent Documents 1 and 2). The cause of persistent pain in PHN is nerve damage associated with VZV proliferation, but the reason why the ease with which PHN develops differs from person to person and the mechanism by which pain continues for a long period of time are unknown.

また、上記の帯状疱疹罹患やPHNによる痛み以外にも、一般に、神経障害性疼痛全般を含む慢性疼痛には、根本原因が不明なものが多く、疼痛持続の個人差の原因なども未解明である。 In addition to the above-mentioned pain caused by herpes zoster and PHN, the underlying causes of chronic pain, including neuropathic pain in general, are often unknown, and the causes of individual differences in pain duration are also unknown. be.

Yukiko Takao, et al., Incidences of Herpes Zoster and Postherpetic Neuralgia in Japanese Adults Aged 50 Years and Older From a Community-based Prospective Cohort Study: The SHEZ Study., J. Epidemiology, 2015;25(10):617-625.Yukiko Takao, et al., Incidences of Herpes Zoster and Postherpetic Neuralgia in Japanese Adults Aged 50 Years and Older From a Community-based Prospective Cohort Study: The SHEZ Study., J. Epidemiology, 2015;25(10):617-625 . Yawn BP, Gilden D., The global epidemiology of herpes zoster., Neurology, 2013;81(10):928-930.Yawn BP, Gilden D., The global epidemiology of herpes zoster., Neurology, 2013;81(10):928-930. Tiwari V. et al., 2005, BBRC, 338:930-937.Tiwari V. et al., 2005, BBRC, 338:930-937. Xiaoli Yu et al., Varicella Zoster Virus Infection of Highly Pure Terminally Differentiated Human Neurons., J. Neurovirol., 2013;19(1):75-81.Xiaoli Yu et al., Varicella Zoster Virus Infection of Highly Pure Terminally Differentiated Human Neurons., J. Neurovirol., 2013;19(1):75-81.

このような状況下において、疾患（疼痛等）の罹患性を評価する方法等の開発が望まれていた。 Under these circumstances, it has been desired to develop a method for evaluating the susceptibility of diseases (pain, etc.).

本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、疾患罹患性の評価方法等を提供するものである。 The present invention has been made in consideration of the above situation, and provides the following method for evaluating disease susceptibility.

（１）HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子又はIGF2遺伝子の遺伝子多型と、個体の疾患罹患性とを関連づけることを特徴とする、疾患罹患性の評価方法。
（２）前記遺伝子多型の解析結果に基づいて、個体の疾患罹患性の高低の傾向を評価することを特徴とする、上記（１）に記載の方法。
（３）（ａ）被験者由来の試料を用いて遺伝子多型解析を行い、遺伝子多型を選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）において選択された遺伝子多型の遺伝子型と、疾患罹患性との間の関連を解析する工程、及び
（ｃ）前記被験者における疾患罹患性と有意に関連した遺伝子多型を、疾患罹患性の評価に用いる工程
を含む、上記（１）又は（２）に記載の方法。 (1) A method for evaluating disease susceptibility, characterized by associating genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene with disease susceptibility of an individual.
(2) The method according to (1) above, characterized in that the tendency of the individual to have a high or low disease susceptibility is evaluated based on the analysis results of the genetic polymorphism.
(3) (a) Performing genetic polymorphism analysis using a sample derived from a subject and selecting genetic polymorphisms,
(b) analyzing the association between the genotype of the genetic polymorphism selected in step (a) and disease susceptibility; and (c) genetic polymorphism significantly associated with disease susceptibility in the subject. The method according to (1) or (2) above, which includes the step of using for evaluating disease susceptibility.

（４）前記疾患が疼痛である、上記（１）～（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）前記疼痛が、慢性疼痛、又は帯状疱疹に伴う疼痛である、上記（４）に記載の方法。
（６）慢性疼痛が、帯状疱疹後神経痛、脊柱管狭窄、椎間板ヘルニア、関節周囲炎、及び関節リウマチからなる群から選択される少なくとも１つである、上記（５）に記載の方法。 (4) The method according to any one of (1) to (3) above, wherein the disease is pain.
(5) The method according to (4) above, wherein the pain is chronic pain or pain associated with herpes zoster.
(6) The method according to (5) above, wherein the chronic pain is at least one selected from the group consisting of postherpetic neuralgia, spinal canal stenosis, intervertebral disc herniation, periarthritis, and rheumatoid arthritis.

（７）遺伝子多型が、一塩基多型、挿入型多型、欠失型多型及び塩基繰り返し多型からなる群から選択される少なくとも１つである、上記（１）～（６）のいずれか１つに記載の方法。
（８）HS3ST4遺伝子の遺伝子多型が、rs9989408、rs4511540、rs4578651、rs4381608、rs7190143、rs7359341、rs6497898、rs4238925、rs12708686、rs4787337、rs4533289、rs4303490、rs8050110、rs12596324、rs7205880、rs4787766、rs9928735、rs4331339、rs7196138、rs7200813、rs4305024、rs11640970、rs4238926、rs4787338、及びrs12933515からなる群から選択される少なくとも１つであり、
IGF2R遺伝子の遺伝子多型が、rs1805075、rs2274849、rs4709396、rs7746102、rs8191821、rs8191829、rs8191898、rs2282138、rs2282139、rs3777412、rs8191816、及びrs8191818からなる群から選択される少なくとも１つであり、
IGF2遺伝子の遺伝子多型が、rs3213216である、
上記（１）～（７）のいずれか１つに記載の方法。 (7) The above (1) to (6), wherein the genetic polymorphism is at least one selected from the group consisting of single nucleotide polymorphism, insertion polymorphism, deletion polymorphism, and nucleotide repeat polymorphism. Any one of the methods.
(8) Genetic polymorphism of HS3ST4 gene is rs9989408, rs4511540, rs4578651, rs4381608, rs7190143, rs7359341, rs6497898, rs4238925, rs12708686, rs4787337, rs4533289, rs4303490 , rs8050110, rs12596324, rs7205880, rs4787766, rs9928735, rs4331339, rs7196138, rs7200813 , rs4305024, rs11640970, rs4238926, rs4787338, and rs12933515,
The group of genetic polymorphisms in the IGF2R gene consists of rs1805075, rs2274849, rs4709396, rs7746102, rs8191821, rs8191829, rs8191898, rs2282138, rs2282139, rs3777412, rs8191816, and rs8191818. at least one selected from;
The genetic polymorphism of the IGF2 gene is rs3213216,
The method according to any one of (1) to (7) above.

（９）HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子又はIGF2遺伝子の遺伝子多型を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズしうる、配列番号１～３８の少なくとも１つに示される塩基配列のうち第51番目の塩基を含む少なくとも10塩基長の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）～（８）のいずれか１つのいずれか１項に記載の方法。
（１０）HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子又はIGF2遺伝の遺伝子多型を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズしうる、配列番号１～３８の少なくとも１つに示される塩基配列のうち第51番目の塩基を含む少なくとも10塩基長の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、疾患罹患性の評価用キット。 (9) The 51st base of the base sequence shown in at least one of SEQ ID NOs: 1 to 38, which can specifically hybridize to a DNA fragment containing a genetic polymorphism of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene. The oligonucleotide according to any one of (1) to (8) above, characterized in that an oligonucleotide consisting of a base sequence of at least 10 bases in length or a base sequence complementary to the base sequence is used. Method.
(10) The 51st base of the base sequence shown in at least one of SEQ ID NOs: 1 to 38 that can specifically hybridize to a DNA fragment containing a genetic polymorphism of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene. A kit for evaluating disease susceptibility, comprising an oligonucleotide consisting of a base sequence having a length of at least 10 bases or a base sequence complementary to the base sequence.

（１１）HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子又はIGF2遺伝子の遺伝子多型を含む、個体の疾患罹患性の高低の傾向を評価するための遺伝子多型マーカー。
（１２）HS3ST4遺伝子が発現可能なように導入されたトランスジェニック動物細胞に、候補物質を接触させて、該動物細胞の細胞融合及び／又は細胞伸展の状態を評価し、得られる評価結果を指標として、疼痛の治療薬又は予防薬をスクリーニングする方法。
（１３）前記疼痛が、慢性疼痛、又は帯状疱疹に伴う疼痛である、上記（１２）に記載の方法。 (11) A genetic polymorphism marker for evaluating the tendency of an individual to have high or low disease susceptibility, including genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene.
(12) A candidate substance is brought into contact with a transgenic animal cell into which the HS3ST4 gene has been introduced so that it can be expressed, and the state of cell fusion and/or cell expansion of the animal cell is evaluated, and the obtained evaluation results are used as an indicator. A method for screening therapeutic or preventive drugs for pain.
(13) The method according to (12) above, wherein the pain is chronic pain or pain associated with herpes zoster.

（１４）慢性疼痛が、帯状疱疹後神経痛、脊柱管狭窄、椎間板ヘルニア、関節周囲炎、及び関節リウマチからなる群から選択される少なくとも１つである、上記（１３）に記載の方法。
（１５）候補物質を接触させる前記動物細胞が、水痘帯状疱疹ウイルスを感染させたものである、上記（１２）に記載の方法。
（１６）前記動物細胞がヒト由来細胞である、上記（１２）に記載の動物細胞。 (14) The method according to (13) above, wherein the chronic pain is at least one selected from the group consisting of postherpetic neuralgia, spinal canal stenosis, intervertebral disc herniation, periarthritis, and rheumatoid arthritis.
(15) The method according to (12) above, wherein the animal cells to which the candidate substance is contacted are infected with varicella-zoster virus.
(16) The animal cell according to (12) above, wherein the animal cell is a human-derived cell.

（１７）HS3ST4遺伝子が発現可能なように導入された、疼痛の治療薬又は予防薬をスクリーニングするために用いられるトランスジェニック動物細胞。
（１８）前記動物細胞が、水痘帯状疱疹ウイルスを感染させたものである、上記（１７）に記載の方法。
（１９）前記動物細胞がヒト由来細胞である、上記（１７）又は（１８）に記載の動物細胞。 (17) Transgenic animal cells used for screening therapeutic or preventive drugs for pain, into which the HS3ST4 gene can be expressed.
(18) The method according to (17) above, wherein the animal cells are infected with varicella-zoster virus.
(19) The animal cell according to (17) or (18) above, wherein the animal cell is a human-derived cell.

本発明により、疼痛等の疾患の罹患性に関する個人差を評価することができる、HS3ST4遺伝子等の遺伝子多型を用いた疾患罹患性の評価方法等を提供することができる。当該評価方法等は、疼痛等の疾患に対する、テーラーメイド予防及び治療などに有用である。 According to the present invention, it is possible to provide a method for evaluating disease susceptibility using genetic polymorphisms such as the HS3ST4 gene, which can evaluate individual differences in susceptibility to diseases such as pain. The evaluation method and the like are useful for tailor-made prevention and treatment of diseases such as pain.

HS3ST4, IGF2R, IGF2 の SNPsは、帯状疱疹後神経痛（PHN）や帯状疱疹罹患（HZ）に有意に関連し、HS3ST4 の SNPs は PHN や HZ 以外の末梢神経障害性疼痛、神経痛にも有意に関連していることを示す図である。 図中、NPPGは、慢性疼痛患者を意味し、NOCGは、健常者を意味する。また、図中の各数値は、相関の優位性を示す値（ｐ値）である。SNPs in HS3ST4, IGF2R, and IGF2 are significantly associated with postherpetic neuralgia (PHN) and herpes zoster (HZ), and SNPs in HS3ST4 are also significantly associated with peripheral neuropathic pain and neuralgia other than PHN and HZ. FIG. In the figure, NPPG means a chronic pain patient, and NOCG means a healthy person. Moreover, each numerical value in the figure is a value (p value) indicating the superiority of correlation. VZV感染 HS3ST4発現細胞の方が、プラーク辺縁が明瞭である（感染７日目）ことを示す図である。FIG. 3 is a diagram showing that VZV-infected HS3ST4-expressing cells have clearer plaque edges (7th day of infection). HS3ST4発現細胞では水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）感染により効率的に細胞融合する（感染２日目）ことを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing that HS3ST4-expressing cells undergo efficient cell fusion upon infection with varicella-zoster virus (VZV) (second day of infection). HS3ST4 発現細胞ではVZV感染により効率的に細胞融合する（フュージョンアッセイによる）ことを示す図である。This figure shows that HS3ST4-expressing cells undergo efficient cell fusion (based on fusion assay) upon VZV infection. HS3ST4発現細胞ではVZV糖タンパク質 gB, gH, gLの発現により細胞融合が促進される（フュージョンアッセイによる）ことを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing that cell fusion is promoted in HS3ST4-expressing cells by expression of VZV glycoproteins gB, gH, and gL (based on fusion assay). 単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）感染でもHS3ST4発現により融合が促進される（感染細胞の顕微鏡観察による）ことを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing that fusion is promoted by HS3ST4 expression even in herpes simplex virus type 2 (HSV-2) infection (based on microscopic observation of infected cells). HS3ST4発現細胞ではVZV複製効率がほとんど低下しない又は少し低下する（定量PCRによる）ことを示す図である。FIG. 4 is a diagram showing that VZV replication efficiency hardly decreases or slightly decreases (based on quantitative PCR) in HS3ST4-expressing cells. HS3ST4発現細胞の方が、播種後細胞が伸展しにくい（播種24時間後）ことを示す図である。FIG. 3 is a diagram showing that HS3ST4-expressing cells are less likely to spread after seeding (24 hours after seeding).

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。 The present invention will be explained in detail below. The scope of the present invention is not limited to these explanations, and other than the examples below may be modified and implemented as appropriate without departing from the spirit of the present invention. All publications cited in this specification, such as prior art documents, publications, patent publications, and other patent documents, are incorporated herein by reference.

１．本発明の概要
一般に、神経障害性疼痛全般を含む慢性疼痛には、根本原因が不明なものが多く、疼痛持続の個人差の原因なども未解明である。本発明者は、ゲノムワイド関連解析（GWAS）等により、神経障害性疼痛全般、並びに帯状疱疹罹患、及び帯状疱疹後神経痛（PHN）のいずれとも非常に関連の強い一塩基多型（SNP）が存在する遺伝子として、HS3ST4（Heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 4）遺伝子を発見した。この発見は、PHN以外の神経障害性疼痛にも、帯状疱疹罹患やPHNと同一の要因が関与する集団が存在する可能性を強く示唆する。さらに、本発明者は、統計上だけではなく実際に、帯状疱疹の原因ウイルスである水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）複製時に、HS3ST4タンパク質により細胞融合が促進されることを見出し、HS3ST4タンパク質により帯状疱疹発症時の神経障害が増悪する可能性を示した。また、本発明者は、HS3ST4タンパク質が細胞伸展時間の長期化に関わることも見出し、損傷神経再生時の軸索伸長時間の長期化が疼痛持続に寄与する可能性を示した。本発明において解明する、神経障害性疼痛全般を含む慢性疼痛の憎悪及び持続機構は、PHN以外の疼痛にも直結し得るものである。 1. Summary of the Invention In general, the root cause of many chronic pains, including neuropathic pain in general, is unknown, and the causes of individual differences in pain duration are also unknown. Through genome-wide association analysis (GWAS), the present inventor has identified single nucleotide polymorphisms (SNPs) that are highly associated with neuropathic pain in general, herpes zoster, and postherpetic neuralgia (PHN). The HS3ST4 (Heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 4) gene was discovered. This finding strongly suggests that there may be a population of neuropathic pain other than PHN in which the same factors as those for herpes zoster and PHN are involved. Furthermore, the present inventors have found that cell fusion is promoted by the HS3ST4 protein during replication of varicella zoster virus (VZV), which is the causative virus of shingles, not only statistically but actually. This indicated the possibility that the neurological disorder at onset may worsen. The present inventors also found that the HS3ST4 protein is involved in prolonging the cell elongation time, and demonstrated that the prolongation of the axon elongation time during injured nerve regeneration may contribute to pain persistence. The mechanisms of aggravation and persistence of chronic pain, including neuropathic pain in general, elucidated in the present invention can be directly linked to pain other than PHN.

また、本発明者は、VZVの受容体として報告のあるIGF2R（Insulin-like growth factor 2 receptor）の遺伝子や、IGF2RのリガンドであるIGF2（Insulin-like growth factor 2）の遺伝子のSNPについても解析したところ、PHN及び帯状疱疹罹患と有意に関連していた。このことから、これらSNPは、VZV感染に関連が予想される遺伝子のSNPで有意となることが確認された。
さらに、上述した遺伝子のSNPが、PHNや帯状疱疹罹患以外の、末梢神経障害性疼痛・神経痛と関連するかを検討したところ、例えば、HS3ST4のSNPsでは、有意な関連あるいは有意な傾向が確認された。従って、HS3ST4 SNPsは、VZV感染に寄らない末梢神経疼痛全般にも関連することが示唆された。 The present inventor also analyzed SNPs in the gene for IGF2R (Insulin-like growth factor 2 receptor), which has been reported as a receptor for VZV, and the gene for IGF2 (Insulin-like growth factor 2), which is a ligand for IGF2R. As a result, it was found to be significantly associated with PHN and herpes zoster. From this, it was confirmed that these SNPs were significant SNPs of genes predicted to be related to VZV infection.
Furthermore, when we examined whether the SNPs of the genes mentioned above were associated with peripheral neuropathic pain/neuralgia other than PHN and herpes zoster, for example, a significant association or a significant tendency was confirmed for the SNPs of HS3ST4. Ta. Therefore, it was suggested that HS3ST4 SNPs are also associated with general peripheral nerve pain that is not related to VZV infection.

本発明によれば、HS3ST4遺伝子や、IGF2R遺伝子や、IGF2遺伝子の遺伝子多型を解析することによって、例えば慢性疼痛や帯状疱疹に伴う疼痛といった疾患の罹患に関する表現型（すなわち疾患罹患性）についての個体差を評価することができる。疾患罹患性について評価した結果は、個体における慢性疼痛や帯状疱疹に伴う疼痛といった疾患の、発症のしやすさ、並びにその憎悪性（重症化の可能性及び重症化している状態を含む）及び持続性（長期化の可能性及び長期化している状態を含む）の予測や、当該疾患の治療薬や予防薬の投与回数、投与量及び種類などの決定において利用可能な重要な情報となる。よって、本発明は、HS3ST4遺伝子や、IGF2R遺伝子や、IGF2遺伝子の遺伝子多型の解析結果に基づいて、疾患罹患性を評価する方法、具体的には、個体（個人）の疾患罹患性の有無（詳しくは、その遺伝的要因の有無）や疾患罹患性の高低の傾向を評価する（具体的には、予め知るまたは予測する）方法を提供するものである。 According to the present invention, by analyzing genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, the IGF2R gene, and the IGF2 gene, it is possible to determine the phenotype related to the morbidity (i.e., disease susceptibility) of diseases such as chronic pain and pain associated with herpes zoster. Individual differences can be evaluated. The results of evaluating disease susceptibility are the ease with which an individual develops a disease, such as chronic pain or pain associated with herpes zoster, as well as its severity (including the possibility of becoming severe and the state in which it is becoming severe), and its persistence. This is important information that can be used in predicting the risk of disease (including the possibility of prolongation and protracted conditions) and in determining the number of administrations, dosage, and type of therapeutic or prophylactic drugs for the disease. Therefore, the present invention provides a method for evaluating disease susceptibility based on the analysis results of genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, and IGF2 gene, and specifically, a method for evaluating disease susceptibility in an individual. (Specifically, the presence or absence of genetic factors) and the tendency of disease susceptibility (specifically, to know or predict in advance).

また本発明では、HS3ST4遺伝子や、IGF2R遺伝子や、IGF2遺伝子の遺伝子多型は、個体（個人）の疾患罹患性の有無（詳しくは、その遺伝的要因の有無）や疾患罹患性の高低の傾向を評価する（予め知る又は予測することを意味することがある。）ための、遺伝子多型マーカーとして利用することができる。
本明細書において、「個体」とは、疾患罹患性を評価する対象者であり、被験者個人を意味する。 In addition, in the present invention, genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, and IGF2 gene are determined by the presence or absence of disease susceptibility (specifically, the presence or absence of genetic factors) of an individual (individual) and the tendency of disease susceptibility. It can be used as a genetic polymorphism marker for evaluating (which may mean knowing or predicting in advance).
As used herein, the term "individual" refers to a subject whose disease susceptibility is to be evaluated, and refers to an individual subject.

２．遺伝子多型
本発明における、HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子、及びIGF2遺伝子の遺伝子多型としては、主に一塩基多型(single nucleotide polymorphism；SNP)を含むが、限定はされず、挿入型多型、欠失型多型、および塩基繰り返し多型をも含み得る。
一塩基多型（SNP(SNPs)）とは、遺伝子の特定の1塩基が他の塩基に置換することによる遺伝子多型を意味する。挿入／欠失型多型とは、1以上の塩基が欠失／挿入することによる遺伝子多型を意味する。 2. Genetic polymorphisms In the present invention, genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, and IGF2 gene mainly include single nucleotide polymorphisms (SNPs), but are not limited to insertional polymorphisms, It may also include deletion polymorphisms and base repeat polymorphisms.
Single nucleotide polymorphism (SNPs) refers to genetic polymorphism caused by substitution of one specific base in a gene with another base. Insertion/deletion polymorphism refers to genetic polymorphism due to deletion/insertion of one or more bases.

また、塩基繰り返し多型とは塩基配列の繰り返し数の異なることにより生じる遺伝子多型を意味する。塩基繰り返し多型は繰り返す塩基数の違いにより、マイクロサテライト多型（塩基数：2塩基～4塩基程度）とVNTR（variable number of tandem repeat）多型（繰り返し塩基：数塩基～数十塩基）に分けられ、その繰り返し数が個々人によって異なる。 Furthermore, nucleotide repeat polymorphism refers to genetic polymorphism caused by a difference in the number of repeats in a nucleotide sequence. Base repeat polymorphisms are divided into microsatellite polymorphisms (number of bases: approximately 2 to 4 bases) and VNTR (variable number of tandem repeat) polymorphisms (repeat bases: several to several dozen bases) due to differences in the number of repeating bases. The number of repetitions varies depending on the individual.

本発明における疾患罹患性の評価に用い得る遺伝子多型（HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子、及びIGF2遺伝子におけるSNP）の遺伝子多型名は、以下に列挙する通りである。これらの遺伝子多型は、後述する本願実施例で示す方法により統計学的に同定されたもの（P値＜0.05）であるか、あるいは、それらと統計学的に連鎖性が高い（LD≧0.8、連鎖不平衡解析による）又は高いと予測されるものである。なお、遺伝子多型名は、ゲノム上の位置におけるSNPの名称であり、dbSNPデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ からアクセス可能）に登録されたものである。基本的に、４桁以上の数字の前に「rs」のIDが付与され、どのSNPであるかが識別されている。 The names of genetic polymorphisms (SNPs in the HS3ST4 gene, IGF2R gene, and IGF2 gene) that can be used to evaluate disease susceptibility in the present invention are listed below. These genetic polymorphisms are those that have been statistically identified (P value < 0.05) by the method shown in the Examples of the present application, or have a high statistical linkage with them (LD≧0.8). , by linkage disequilibrium analysis) or is predicted to be high. The genetic polymorphism name is the name of the SNP at the location on the genome, and is registered in the dbSNP database (accessible from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). be. Basically, an ID of "rs" is added before a number of 4 or more digits to identify which SNP it is.

・HS3ST4遺伝子におけるSNP：
rs9989408、rs4511540、rs4578651、rs4381608、rs7190143、rs7359341、rs6497898、rs4238925、rs12708686、rs4787337、rs4533289、rs4303490、rs8050110、rs12596324、rs7205880、rs4787766、rs9928735、rs4331339、rs7196138、rs7200813、rs4305024、rs11640970、rs4238926、rs4787338、rs12933515 ・SNP in HS3ST4 gene:
rs9989408, rs4511540, rs4578651, rs4381608, rs7190143, rs7359341, rs6497898, rs4238925, rs12708686, rs4787337, rs4533289, rs4303490, rs8050110, rs12 596324, rs7205880, rs4787766, rs9928735, rs4331339, rs7196138, rs7200813, rs4305024, rs11640970, rs4238926, rs4787338, rs12933515

・IGF2R遺伝子におけるSNP：
rs1805075、rs2274849、rs4709396、rs7746102、rs8191821、rs8191829、rs8191898、rs2282138、rs2282139、rs3777412、rs8191816、rs8191818 ・SNP in IGF2R gene:
rs1805075, rs2274849, rs4709396, rs7746102, rs8191821, rs8191829, rs8191898, rs2282138, rs2282139, rs3777412, rs8191816, rs8191818

・IGF2遺伝子におけるSNP：
rs3213216 ・SNP in IGF2 gene:
rs3213216

本発明は、HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子、又はIGF2遺伝子の遺伝子多型を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、すなわち、具体的には、上述した各遺伝子多型名のSNPのいずれか１つを含むオリゴヌクレオチドを提供する。当該遺伝子多型部位は、配列番号１～３８のいずれか１つに示される塩基配列の第51番目の塩基である。
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基は、少なくとも10塩基、好ましくは10～150塩基、より好ましくは10～45塩基、さらに好ましくは14～25塩基を有することが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１～３８のいずれか１つに示される塩基配列または当該塩基配列に相補的な塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチド、あるいは当該オリゴヌクレオチドの一部（但し、前記遺伝子多型部位を含む）が挙げられる。 The present invention provides an oligonucleotide that can specifically hybridize to a DNA fragment containing a genetic polymorphism of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene, that is, specifically, any of the SNPs of each of the above-mentioned genetic polymorphisms. An oligonucleotide comprising one of the following is provided. The genetic polymorphism site is the 51st base of the base sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 38.
The oligonucleotide of the present invention preferably has at least 10 bases, preferably 10 to 150 bases, more preferably 10 to 45 bases, and even more preferably 14 to 25 bases. The oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide selected from the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 38 or a base sequence complementary to the base sequence, or a part of the oligonucleotide (however, (including the genetic polymorphism site).

本発明のオリゴヌクレオチドは、後述する遺伝子多型の検出において、HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子、又はIGF2遺伝子の特異的なプローブおよびプライマーとして用いることができる。
下記の表１－１及び表１－２には、101塩基長の塩基配列（配列番号１～３８）が表示されており、それぞれの51番目に、遺伝子多型部位を表示されている。例えば、[G/A]と表示したものは「G」と「A」の遺伝子多型であることを意味し、[C/G/T]と表示したものは「C」と「G」と「T」の遺伝子多型であることを意味し、[T/A/C/G]と表示したものは「T」と「A」と「C」と「G」の遺伝子多型であることを意味する。なお、遺伝子多型部位に関し、「メジャーアレル」および「マイナーアレル」は、それぞれ日本人健常者のゲノム上での多数派および少数派となるアレルを表す。表１－１及び表１－２中の遺伝子多型部位の表記において、左端のアレルがメジャーアレル、それ以外のアレルがマイナーアレルを意味する。例えば、遺伝子多型部位が[C/G/T]と表記されているものであれば、メジャーアレルが「C」であり、マイナーアレルが「G」と「T」である。 The oligonucleotide of the present invention can be used as a specific probe and primer for the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene in the detection of genetic polymorphisms described below.
In Tables 1-1 and 1-2 below, 101 base long base sequences (SEQ ID NOS: 1 to 38) are displayed, and the genetic polymorphism site is displayed at the 51st position of each. For example, [G/A] means the genetic polymorphism of “G” and “A”, and [C/G/T] means “C” and “G”. It means that it is a genetic polymorphism of "T", and what is indicated as [T/A/C/G] is a genetic polymorphism of "T", "A", "C", and "G". means. Regarding genetic polymorphism sites, "major allele" and "minor allele" represent the majority and minority alleles, respectively, on the genome of healthy Japanese individuals. In the notation of genetic polymorphism sites in Tables 1-1 and 1-2, the leftmost allele means the major allele, and the other alleles mean the minor alleles. For example, if the genetic polymorphism site is expressed as [C/G/T], the major allele is "C" and the minor alleles are "G" and "T".

３．遺伝子多型と疾患罹患性との相関
遺伝子に遺伝子多型が生じると、タンパク質の機能や発現量が変化する場合があると考えられる。従って、多型と、遺伝子によりコードされるタンパク質に関するさまざまな表現型とは相関関係にある場合がある。本発明に関しては、HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子、及びIGF2遺伝子における遺伝子多型と、疾患罹患性（表現型）とは、相関関係にある場合がある。ここで、疾患罹患性としては、疼痛に対する罹患性が挙げられ、例えば、慢性疼痛や帯状疱疹に伴う疼痛に対する罹患性が挙げられる。慢性疼痛としては、例えば、帯状疱疹後神経痛（PHN）、脊柱管狭窄、椎間板ヘルニア、関節周囲炎、及び関節リウマチからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。 3. Correlation between genetic polymorphism and disease susceptibility When genetic polymorphism occurs in a gene, it is thought that the function or expression level of a protein may change. Therefore, polymorphisms may be correlated with various phenotypes related to proteins encoded by genes. Regarding the present invention, genetic polymorphisms in the HS3ST4 gene, IGF2R gene, and IGF2 gene and disease susceptibility (phenotype) may be correlated. Here, disease susceptibility includes susceptibility to pain, for example, susceptibility to chronic pain and pain associated with herpes zoster. Examples of chronic pain include at least one selected from the group consisting of postherpetic neuralgia (PHN), spinal canal stenosis, intervertebral disc herniation, periarthritis, and rheumatoid arthritis.

各遺伝子多型と、表現型との相関は、一般的には、例えば、以下の（１）～（３）のように調べることができる。
（１）健常者における連鎖不平衡解析等の結果、推定された連鎖不平衡ブロック内の遺伝子多型を選択する。例えば、代表的な遺伝子多型であるTag SNPを表現型との相関解析用の遺伝子多型として選択する。
（２）次に、被験者（疾患に罹患している患者）における当該遺伝子多型についての遺伝子多型頻度を解析する。遺伝子多型と疾罹患性との相関を調べる場合、被験者と健常者の遺伝子多型頻度との比較を行う。比較においてはχ2乗検定などの統計手法を用いることが有効である。ここで、さらに、表現型の違いにより被験者を分類し、分類毎に健常者と被験者の遺伝子多型頻度や遺伝子型を比較してもよい。
（３）被験者において疾患罹患性と有意に関連した遺伝子多型があれば、当該遺伝子多型を疾患罹患性の遺伝的素因の評価に用いることができる。また、健常者と被験者との間で遺伝子多型頻度に有意差のある遺伝子多型があれば、当該遺伝子多型を疾患脆弱性の遺伝的素因の評価に用いることができる。 The correlation between each genetic polymorphism and a phenotype can generally be investigated, for example, as in (1) to (3) below.
(1) Genetic polymorphisms within the linkage disequilibrium block estimated as a result of linkage disequilibrium analysis in healthy subjects are selected. For example, Tag SNP, which is a typical genetic polymorphism, is selected as a genetic polymorphism for correlation analysis with a phenotype.
(2) Next, the frequency of the gene polymorphism in the subject (patient suffering from the disease) is analyzed. When investigating the correlation between genetic polymorphisms and disease susceptibility, the frequencies of genetic polymorphisms in subjects and healthy individuals are compared. For comparisons, it is effective to use statistical methods such as the chi - square test. Here, the subjects may be further classified according to differences in phenotype, and the genetic polymorphism frequencies and genotypes of healthy subjects and subjects may be compared for each classification.
(3) If there is a genetic polymorphism significantly associated with disease susceptibility in a subject, the genetic polymorphism can be used to evaluate the genetic predisposition to disease susceptibility. Furthermore, if there is a genetic polymorphism with a significant difference in the frequency of genetic polymorphisms between healthy individuals and test subjects, the genetic polymorphism can be used to evaluate the genetic predisposition to disease vulnerability.

ただし、遺伝子多型の傾向は、人種や出身地等に影響されることが示唆されているため、関連する遺伝子多型（例えばSNP）を見出すのに用いた母集団と同様な遺伝子多型を示す集団おいて、当該遺伝子多型を用いる上記評価を行うことが望ましい。 However, since it has been suggested that the tendency of genetic polymorphisms is influenced by race, place of birth, etc., genetic polymorphisms similar to the population used to find related genetic polymorphisms (e.g. SNPs) It is desirable to perform the above evaluation using the genetic polymorphism in a population showing this.

上記のように調べられた、HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子、及びIGF2遺伝子における遺伝子多型と疾患罹患性（表現型）との相関は、慢性疼痛や帯状疱疹に伴う疼痛といった疾患の発症のしやすさ、並びにその憎悪性（重症化の可能性及び重症化している状態を含む）及び持続性（長期化の可能性及び長期化している状態を含む）を評価する（予め知る、予測する）方法や、当該疾患の治療法又は予防法を選択する（治療薬や予防薬の適正投与量を決定等することも含む）方法などの指標として利用することができる。 The correlation between genetic polymorphisms in the HS3ST4 gene, IGF2R gene, and IGF2 gene and disease susceptibility (phenotype) investigated as described above indicates the susceptibility to the onset of diseases such as chronic pain and pain associated with herpes zoster. , and how to evaluate (know in advance or predict) its aggravation (including the possibility of becoming severe and the state of becoming severe) and sustainability (including the possibility of prolongation and the state of being prolonged); It can be used as an indicator for methods of selecting a treatment or prevention method for the disease (including determining the appropriate dosage of a therapeutic drug or a preventive drug), etc.

また、本発明の遺伝子多型または評価方法を用いて、人種の違いによる疾患罹患性を評価することも可能である。対象者は特に限定されるものではなく、日本人、欧米人などが挙げられるが、本発明においては日本人又は日本人と同様の遺伝子多型傾向を有する者であることが好ましい。 Furthermore, using the genetic polymorphism or evaluation method of the present invention, it is also possible to evaluate disease susceptibility due to racial differences. Subjects are not particularly limited, and include Japanese people, Europeans and Americans, but in the present invention, they are preferably Japanese people or people who have genetic polymorphism tendencies similar to Japanese people.

４．遺伝子多型の検出
被験者からのゲノムサンプルは、血液、唾液、皮膚等の生体試料から抽出することができるが、ゲノムサンプルを採取できるものであれば、これに限定されるものではない。ゲノムDNAの抽出及び精製法は周知である。例えば、ヒトから採取した血液、唾液、皮膚等の検体から、フェノール法等を用いてゲノムDNAを精製する。その際、GFX Genomic Blood DNA Purification Kit等の市販のゲノムDNA抽出キットや装置を用いてもよい。調査するSNPがオープンリーディングフレーム中にある場合は、ゲノムDNAの代わりにmRNAやtotal RNAを抽出してもよい。以下、上記の被験サンプルの遺伝子多型検出法の一例を示す。 4. Detection of Genetic Polymorphism Genome samples from subjects can be extracted from biological samples such as blood, saliva, skin, etc., but are not limited to this as long as genome samples can be collected. Methods for extraction and purification of genomic DNA are well known. For example, genomic DNA is purified from specimens such as blood, saliva, and skin collected from humans using a phenol method or the like. At that time, commercially available genomic DNA extraction kits and devices such as GFX Genomic Blood DNA Purification Kit may be used. If the SNP to be investigated is in an open reading frame, mRNA or total RNA may be extracted instead of genomic DNA. An example of the method for detecting genetic polymorphism in the test sample described above will be shown below.

（１）PCR法を用いた検出
PCRにより被験サンプルを増幅するには、Fidelityの高いDNAポリメラーゼ、例えば、KOD Dashポリメラーゼ（TOYOBO社）を用いることが好ましい。用いるプライマーは、被験サンプル中の対象SNPを増幅できるようにプライマーの任意の位置に遺伝子多型が含まれるように設計し合成する。
増幅反応終了後は、増幅産物の検出を行い、多型の有無を判定する。 (1) Detection using PCR method
To amplify a test sample by PCR, it is preferable to use a DNA polymerase with high fidelity, such as KOD Dash polymerase (TOYOBO). The primers used are designed and synthesized so that the genetic polymorphism is included at any position in the primers so that the target SNP in the test sample can be amplified.
After the amplification reaction is completed, the amplification product is detected and the presence or absence of polymorphism is determined.

遺伝子多型情報を得る方法は、例えば、以下の通りである。
（i）ヒトから採取した検体（例えば血液）から、フェノール法等を用いてゲノムDNAを精製する。その際、GFX Genomic Blood DNA Purification Kit（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）等の市販のゲノムDNA抽出キットや装置を用いてもよい。
（ii）次に、得られたゲノムDNAを鋳型として、PCR法によりゲノムDNAをいくつかに分けて増幅し、シークエンス用の鋳型DNAとする。本発明は、遺伝子多型を対象とするため、PCR法に用いる酵素はなるべくFidelity（忠実度）の高いものを用いることが望ましい。 A method for obtaining genetic polymorphism information is, for example, as follows.
(i) Genomic DNA is purified from a specimen (for example, blood) collected from a human using a phenol method or the like. At that time, commercially available genomic DNA extraction kits and devices such as GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.) may be used.
(ii) Next, using the obtained genomic DNA as a template, the genomic DNA is divided into several parts and amplified by the PCR method, and used as template DNA for sequencing. Since the present invention targets genetic polymorphisms, it is desirable to use enzymes with as high fidelity as possible for the PCR method.

（iii）各遺伝子多型周辺の領域を、GenBankに公開されている配列情報に基づいて設計したプライマーを用いて約500～1000bpずつPCRにより増幅を行う。
（iv）これらのPCR断片の全領域の塩基配列を、GenBankに公開されている配列情報に基づいて設計したプライマーを用いて約500～700bpずつシークエンス法により解読し、目的の遺伝子多型情報を得ることができる。 (iii) Amplify the region around each gene polymorphism by PCR in approximately 500 to 1000 bp portions using primers designed based on sequence information published in GenBank.
(iv) Decipher the nucleotide sequences of the entire region of these PCR fragments by sequencing approximately 500 to 700 bp each using primers designed based on the sequence information published in GenBank, and obtain the desired genetic polymorphism information. Obtainable.

（２）塩基配列決定法による検出
本発明においては、ジデオキシ法に基づく塩基配列決定法により本発明の多型を検出することもできる。塩基配列決定に用いるシークエンサーには、市販のABIシリーズ（アマシャムバイオサイエンス）を用いる。 (2) Detection by base sequencing method In the present invention, the polymorphism of the present invention can also be detected by a base sequencing method based on the dideoxy method. A commercially available ABI series (Amersham Biosciences) is used as a sequencer for base sequencing.

（３）DNAマイクロアレイによる検出
DNAマイクロアレイは、支持体上にヌクレオチドプローブが固定されたものであり、DNAチップ、Gene チップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
まず、被験サンプルのポリヌクレオチドを単離し、PCRにより増幅し、蛍光レポーター基により標識する。続いて、標識化DNA/mRNA, total RNAをアレイと共にインキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した（すなわち標的配列に取り込まれた）蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。 (3) Detection by DNA microarray
DNA microarrays have nucleotide probes immobilized on a support, and include DNA chips, Gene chips, microchips, bead arrays, and the like.
First, the polynucleotide of the test sample is isolated, amplified by PCR, and labeled with a fluorescent reporter group. Subsequently, labeled DNA/mRNA and total RNA are incubated with the array. The array is then inserted into a scanner to detect hybridization patterns. Hybridization data is collected as luminescence from fluorescent reporter groups bound to the probe array (ie, incorporated into the target sequence). Probes with a perfect match to the target sequence will produce a stronger signal than those with portions that are not matched to the target sequence. Since the sequence and position of each probe on the array is known, complementarity allows the sequence of target polynucleotides reacted with the probe array to be determined.

遺伝子多型情報を得る方法は、以下の通りである。
（i）ヒトから採取した検体（例えば血液）から、フェノール法等を用いてゲノムDNAを精製する。その際、GFX Genomic Blood DNA Purification Kit（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）等の市販のゲノムDNA抽出キットや装置を用いてもよい。
（ii）次に、得られたゲノムDNAをTE buffer（10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）に溶解し、100 ng/μlに調整する。
（iii）イルミナ社製、iScanシステム（Illumina, San Diego, CA）を利用したInfinium assay II法などにより、メーカー側のプロトコルに従い全ゲノムジェノタイピングを行う。 The method for obtaining genetic polymorphism information is as follows.
(i) Genomic DNA is purified from a specimen (for example, blood) collected from a human using a phenol method or the like. At that time, commercially available genomic DNA extraction kits and devices such as GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.) may be used.
(ii) Next, dissolve the obtained genomic DNA in TE buffer (10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and adjust to 100 ng/μl.
(iii) Perform whole genome genotyping using the Infinium assay II method using the iScan system (Illumina, San Diego, CA) according to the manufacturer's protocol.

（iv）BeadStudio Genotyping module v3.3.7（Illumina）などを用いて全ゲノムジェノタイピングデータ解析を行い、各サンプルの遺伝子多型データの品質評価（Quality control）を行う。
（v）これらの全ゲノムジェノタイピングデータより、目的の遺伝子名のアノテーション情報を手掛かりにしてその遺伝子領域及びフランキング領域に含まれる遺伝子多型を選定し、BeadStudio Genotyping module v3.3.7（Illumina）などの出力機能を用いてそれらの遺伝子多型情報を全て抽出する。 (iv) Perform whole-genome genotyping data analysis using BeadStudio Genotyping module v3.3.7 (Illumina), etc., and perform quality control of genetic polymorphism data for each sample.
(v) From these whole genome genotyping data, select genetic polymorphisms included in the gene region and flanking region using the annotation information of the target gene name as a clue, and use BeadStudio Genotyping module v3.3.7 (Illumina) etc. Extract all genetic polymorphism information using the output function.

（４）TaqMan PCR法による検出
TaqMan PCR法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である。TaqMan PCR法で用いるアレル特異的オリゴ(TaqManプローブという)は、前記遺伝子多型情報に基づいて設計することができる。 (4) Detection by TaqMan PCR method
The TaqMan PCR method is a method that utilizes fluorescently labeled allele-specific oligos and a PCR reaction using Taq DNA polymerase. Allele-specific oligos (referred to as TaqMan probes) used in the TaqMan PCR method can be designed based on the above genetic polymorphism information.

（５）インベーダー法による遺伝子多型の検出
インベーダー法は、アレル特異的オリゴと鋳型とをハイブリダイゼーションすることにより遺伝子多型を検出する方法である。インベーダー法を行うためのキットは市販されており、この方法により容易に遺伝子多型を検出することが可能である。 (5) Detection of genetic polymorphism using the invader method The invader method is a method for detecting genetic polymorphism by hybridizing allele-specific oligos and templates. Kits for performing the invader method are commercially available, and genetic polymorphisms can be easily detected using this method.

５．キット
本発明は、疾患罹患性を評価するためのキットを提供する。本発明の遺伝子多型検出用キットは、本発明を実施するために必要な１種以上の成分を含む。
例えば、本発明のキットは、酵素を保存若しくは供給するためのもの、および／または遺伝子多型検出を実施するために必要な反応成分を含むことが好ましい。当該成分としては、限定されるものではないが、例えば、本発明のオリゴヌクレオチド、酵素緩衝液、dNTP、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブおよびネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用および／または検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。 5. Kit The present invention provides a kit for assessing disease susceptibility. The genetic polymorphism detection kit of the present invention contains one or more components necessary for carrying out the present invention.
For example, the kit of the present invention preferably contains components for storing or supplying enzymes and/or reaction components necessary for detecting genetic polymorphisms. Such components include, but are not limited to, oligonucleotides of the present invention, enzyme buffers, dNTPs, control reagents (e.g. tissue samples, target oligonucleotides for positive and negative controls, etc.), labels and Examples include a detection reagent, a solid phase support, an instruction manual, and/or a detection reagent. The kit of the present invention may also be a partial kit containing only some of the necessary components, in which case the user can provide the other components.

本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイとして提供することもできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであり、DNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
本発明のキットは、本発明において見出された、HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子、及び／又はIGF2遺伝子における遺伝子多型を含み、当該遺伝子多型を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。 The kit of the present invention can also be provided as a microarray in which the oligonucleotides described above are immobilized on a support. Microarrays have oligonucleotides of the present invention immobilized on a support, and include DNA chips, Gene chips, microchips, bead arrays, and the like.
The kit of the present invention contains a genetic polymorphism in the HS3ST4 gene, IGF2R gene, and/or IGF2 gene found in the present invention, and comprises an oligonucleotide that can specifically hybridize to a DNA fragment containing the genetic polymorphism. It is preferable to include.

本発明のキットにより遺伝子多型を判定する場合、例えば、疾患の罹患前又は罹患後に採血して、HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子、及び／又はIGF2遺伝子を含むDNAを単離し、当該遺伝子をキット中のオリゴヌクレオチドと反応させて遺伝子型を判定する。
判定した遺伝子型および遺伝子多型から、慢性疼痛や帯状疱疹に伴う疼痛といった疾患の、発症のしやすさや、その憎悪性（重症化の可能性及び重症化している状態を含む）及び持続性（長期化の可能性及び長期化している状態を含む）を予測したり、当該疾患の治療薬や予防薬の種類または用量などの投与計画を作成することもできる。その結果、個体に合った予測・診断・治療・予防の効果を得ることができ、オーダーメイド医療に有用となる。 When determining genetic polymorphism using the kit of the present invention, for example, blood is collected before or after contracting a disease, DNA containing the HS3ST4 gene, IGF2R gene, and/or IGF2 gene is isolated, and the gene is collected in the kit. Genotype is determined by reacting with oligonucleotide.
From the determined genotypes and genetic polymorphisms, we can determine the ease of onset, aggravation (including the possibility of becoming severe and the state of becoming severe), and persistence (including the possibility of becoming severe and the state of becoming severe) of diseases such as chronic pain and pain associated with herpes zoster. It is also possible to predict the possibility of prolongation of the disease (including the possibility of prolongation and the condition being protracted), and to create an administration plan for the type or dose of therapeutic or preventive drugs for the disease. As a result, it is possible to obtain predictive, diagnostic, therapeutic, and preventive effects tailored to each individual, which is useful for customized medical care.

６．疼痛治療又は予防薬のスクリーニング
後述する本願実施例においても示すとおり、本発明者は、HS3ST4タンパク質の発現上昇により、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）感染時の細胞融合能が亢進することや、細胞伸展に要する時間が長期化することも見出し、これらの現象が、疼痛（帯状疱疹に伴う疼痛や慢性疼痛など）の発症のしやすさや、その疼痛の憎悪性（重症化の可能性及び重症化している状態を含む）及び持続性（長期化の可能性及び長期化している状態を含む）の要因となり得ることを見出した。 6. Screening for Pain Treatment or Preventive Drugs As shown in the Examples of the present application described below, the present inventors have discovered that increased expression of HS3ST4 protein enhances cell fusion ability upon infection with varicella zoster virus (VZV) and that cell expansion We also found that the time required for the onset of symptoms is prolonged, and these phenomena are associated with the ease of onset of pain (such as pain associated with herpes zoster and chronic pain) and the severity of that pain (the possibility of it becoming severe and the possibility of it becoming more severe). We have found that this can be a factor in the development of long-term conditions (including the state of being present) and sustainability (including the possibility of prolongation and the state of being prolonged).

従って、本発明においては、疼痛の治療薬又は予防薬をスクリーニングする方法なども提供される。
具体的には、HS3ST4遺伝子が発現可能なように導入されたトランスジェニック動物細胞に、候補物質を接触させて、該動物細胞の細胞融合及び／又は細胞伸展の状態を評価し、得られる評価結果を指標として、前記スクリーニングを行う方法などが提供される。
ここで、前記疼痛としては、先に述べた本発明の評価方法での説明と同様に、例えば、慢性疼痛、又は帯状疱疹に伴う疼痛などが挙げられ、また、慢性疼痛としては、帯状疱疹後神経痛、脊柱管狭窄、椎間板ヘルニア、関節周囲炎、及び関節リウマチなどが挙げられる。 Therefore, the present invention also provides methods for screening therapeutic or preventive drugs for pain.
Specifically, a candidate substance is brought into contact with a transgenic animal cell into which the HS3ST4 gene has been introduced so that it can be expressed, and the state of cell fusion and/or cell expansion of the animal cell is evaluated, and the evaluation results obtained. A method for performing the screening using the above as an indicator is provided.
Here, the pain includes, for example, chronic pain or pain associated with herpes zoster, as described above in the evaluation method of the present invention, and the chronic pain includes post-herpes zoster pain. These include neuralgia, spinal canal stenosis, intervertebral disc herniation, periarthritis, and rheumatoid arthritis.

また、HS3ST4遺伝子が発現可能なように導入される動物細胞としては、限定はされず、ヒト由来細胞や、各種非ヒト動物細胞（マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類（ネズミ目）動物や、ウサギ、ブタ、イタチ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ及びウマ等のヒトを除く哺乳類動物由来の細胞）が挙げられるが、ヒト由来細胞が好ましい。ヒト由来細胞としては、例えば、ヒト悪性メラノーマ細胞（MeWo細胞、COLO679細胞、G-361細胞、DEOC-1細胞、HMV-I細胞、HMV-II細胞、HTMM細胞）、ヒト多能性幹細胞（iPSC）、iPSC由来分化細胞、子宮頸部類上皮がん（HeLa細胞、HeLa S3細胞）、ヒト神経膠腫由来細胞（NP2細胞, NP3細胞, NP5細胞, NP8細胞、A172細胞、ONDA10細胞、ONDA11細胞、KG-1-C細胞、TM-31細胞）、ヒト神経芽細胞腫細胞（SK-N-NH細胞、SK-N-MC細胞、HSNB細胞、TN-2細胞、SCCH-26細胞、NB-1細胞、TN-1細胞、NH-12細胞、NH-6細胞、IMR32細胞）、未分化神経外胚葉性腫瘍細胞（FU-RPNT-1細胞、FU-RPNT-2細胞）、ヒト繊維芽細胞（Detroit551細胞）、ヒト膠芽腫細胞株（U87MG細胞、U373細胞、U138細胞）、ヒト胎児線維芽細胞株（HEF細胞、KMST-6細胞）、ヒト骨腫瘍細胞（U2OS細胞）、ヒト胎児肺細胞（MRC-5細胞、HEL細胞）、および、ヒト網膜芽細胞腫由来細胞株（WERI-Rb-1細胞、NCC-RbC-39細胞、NCC-RbC-51、NCC-RbC-54、NCC-RbC-59細胞、NCC-RbC-60細胞、NCC-RbC-67細胞、NCC-RbC-83細胞、NCC-RbC-92細胞、NCC-RbC-T1細胞）などが挙げられる。 In addition, the animal cells into which the HS3ST4 gene can be expressed are not limited, and include human-derived cells and various non-human animal cells (rodents such as mice, rats, and guinea pigs). , rabbit, pig, weasel, dog, cat, monkey, sheep, cow, horse, and other mammals other than humans), but human-derived cells are preferred. Examples of human-derived cells include human malignant melanoma cells (MeWo cells, COLO679 cells, G-361 cells, DEOC-1 cells, HMV-I cells, HMV-II cells, HTMM cells), human pluripotent stem cells (iPSCs), ), iPSC-derived differentiated cells, cervical epithelioid carcinoma (HeLa cells, HeLa S3 cells), human glioma-derived cells (NP2 cells, NP3 cells, NP5 cells, NP8 cells, A172 cells, ONDA10 cells, ONDA11 cells) , KG-1-C cells, TM-31 cells), human neuroblastoma cells (SK-N-NH cells, SK-N-MC cells, HSNB cells, TN-2 cells, SCCH-26 cells, NB- 1 cell, TN-1 cell, NH-12 cell, NH-6 cell, IMR32 cell), undifferentiated neuroectodermal tumor cell (FU-RPNT-1 cell, FU-RPNT-2 cell), human fibroblast cell (Detroit551 cells), human glioblastoma cell lines (U87MG cells, U373 cells, U138 cells), human fetal fibroblast cell lines (HEF cells, KMST-6 cells), human bone tumor cells (U2OS cells), human fetal lung cells (MRC-5 cells, HEL cells) and human retinoblastoma-derived cell lines (WERI-Rb-1 cells, NCC-RbC-39 cells, NCC-RbC-51, NCC-RbC-54, NCC- Examples include RbC-59 cells, NCC-RbC-60 cells, NCC-RbC-67 cells, NCC-RbC-83 cells, NCC-RbC-92 cells, NCC-RbC-T1 cells).

HS3ST4遺伝子が発現可能なように導入されたトランスジェニック動物細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて、適宜作製することができる。なお、本発明のスクリーニング方法に用いるトランスジェニック動物細胞は、例えば、予め、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）を感染させたものであることが好ましい。VZV感染トランスジェニック動物細胞は、主に、当該動物細胞の細胞融合の状態を評価する場合に、好ましく用いられる。
トランスジェニック動物細胞への候補物質の接触（添加等）は、限定はされず、公知の方法及び条件等を採用することができる。接触させる量についても、動物細胞の種類及び状態、並びに候補物質の種類等を考慮して、適宜設定可能である。 Transgenic animal cells into which the HS3ST4 gene can be expressed can be appropriately produced using known genetic recombination techniques. The transgenic animal cells used in the screening method of the present invention are preferably those that have been infected with varicella-zoster virus (VZV) in advance, for example. VZV-infected transgenic animal cells are preferably used mainly when evaluating the state of cell fusion of the animal cells.
Contact (addition, etc.) of a candidate substance to transgenic animal cells is not limited, and known methods and conditions can be employed. The amount of contact can also be appropriately set in consideration of the type and condition of animal cells, the type of candidate substance, etc.

候補物質についても、特に制限はされず、例えば、HS3ST4タンパク質の発現上昇を抑制する又は当該発現を阻害する物質などが挙げられる。具体的には、例えば、天然又は人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素や抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド(DNA(アンチセンスDNAなど), RNA)、オリゴヌクレオチド(siRNA、shRNA及びマイクロRNA等)、ペプチド核酸(PNA)など）、低分子、中分子又は高分子有機化合物等を例示することができる。 Candidate substances are not particularly limited either, and include, for example, substances that suppress an increase in the expression of the HS3ST4 protein or inhibit the expression thereof. Specifically, for example, various peptides, proteins (including enzymes and antibodies), nucleic acids (polynucleotides (DNA (antisense DNA, etc.), RNA), oligonucleotides (siRNA, shRNA, etc.) that are naturally or artificially synthesized. (microRNA, etc.), peptide nucleic acid (PNA), etc.), low-molecular, middle-molecular, or high-molecular organic compounds.

トランスジェニック動物細胞の細胞融合の状態の評価は、候補物質の接触前に比べて、細胞融合の促進が、有意に抑制又は阻害されているかどうかを評価することが好ましい。また、トランスジェニック動物細胞の細胞伸展の状態の評価は、候補物質の接触前に比べて、細胞伸展の抑制が、有意に抑制又は阻害されているかどうかを評価することが好ましい。有意性が認められれば、その候補物質は、疼痛の治療薬又は予防薬としてスクリーニングし得るものであると評価できる。 The state of cell fusion of transgenic animal cells is preferably evaluated by evaluating whether promotion of cell fusion is significantly suppressed or inhibited compared to before contact with the candidate substance. Furthermore, when evaluating the state of cell spreading of transgenic animal cells, it is preferable to evaluate whether cell spreading is significantly suppressed or inhibited compared to before contact with the candidate substance. If significance is recognized, it can be evaluated that the candidate substance can be screened as a therapeutic or preventive drug for pain.

なお、本発明のスクリーニング方法は、必要に応じ、他の何らかの工程を含んでいてもよい。
また本発明においては、上記スクリーニングをするために用いられるトランスジェニック動物細胞に係る発明も提供される。さらに本発明においては、上記スクリーニング方法により得られた治療又は予防薬を含む、疼痛（慢性疼痛、又は帯状疱疹に伴う疼痛など）の治療又は予防用医薬組成物に係る発明や、当該医薬組成物を、当該疼痛を患っている又は患っている可能性がある患者に投与することを含む、疼痛の治療又は予防方法に係る発明も提供される。 Note that the screening method of the present invention may include some other steps as necessary.
The present invention also provides an invention relating to transgenic animal cells used for the above screening. Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing pain (chronic pain, pain associated with herpes zoster, etc.) containing a therapeutic or preventive drug obtained by the above-mentioned screening method, and the pharmaceutical composition. Also provided is an invention relating to a method for treating or preventing pain, which comprises administering to a patient who is suffering from or may be suffering from the pain.

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

本発明者は、ゲノムワイド関連解析等により、神経障害性疼痛および帯状疱疹罹患、PHN 全てと極めて有意な関連がある一塩基多型（SNP）が存在する遺伝子HS3ST4を見出した。このHS3ST4 タンパク質は、細胞膜表面タンパク質等に結合しているヘパラン硫酸の修飾酵素をコードし、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）感染に関与するとの報告がある（前掲の非特許文献３参照）。HSV-1は、VZVと同じヘルペスウイルス科に属する近縁ウイルスであるため、VZV感染にもHS3ST4タンパク質が関与する可能性が考えられ、ひいてはPHNのみならず神経障害性疼痛全般にも関連する可能性が考えられた。そこで、HS3ST4タンパク質がVZV感染に及ぼす影響を解明すると同時に、HS3ST4タンパク質が痛みに関わる機構を明らかにする。 Through genome-wide association analysis, the present inventors discovered the gene HS3ST4, which has a single nucleotide polymorphism (SNP) that has a highly significant association with neuropathic pain, herpes zoster, and PHN. This HS3ST4 protein encodes an enzyme that modifies heparan sulfate, which binds to cell membrane surface proteins, and has been reported to be involved in herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection (see Non-Patent Document 3 cited above). . Since HSV-1 is a closely related virus that belongs to the same family of herpesviridae as VZV, it is possible that the HS3ST4 protein is also involved in VZV infection, which in turn may be related not only to PHN but also to neuropathic pain in general. Gender was considered. Therefore, we will elucidate the effect of HS3ST4 protein on VZV infection and at the same time clarify the mechanism by which HS3ST4 protein is involved in pain.

１．方法
ゲノム解析
ＪＲ総合東京病院、順天堂大学病院、日本大学飯田橋病院に来院した194名の末梢神経障害性疼痛患者、および関東近辺在住の282名の健常人の全血サンプルからDNAを抽出し、全ゲノムジェノタイピングをInfinium assay II を用いiScan system (Illumina, San Diego, CA, USA)で解析した。194名の末梢神経障害性疼痛患者サンプルについてはHumanOmni1-Quad v1.0 (total markers: 1,134,514) and HumanOmniExpress-12 v1.1 (total markers: 719,665) のBeadChipsを用いた。282名の健常人サンプルにはHumanOmniExpressExome-8 v1.2 (total markers: 964,193) BeadChipを用いた。 1. Method
Genome analysis DNA was extracted from whole blood samples of 194 peripheral neuropathic pain patients who visited JR General Tokyo Hospital, Juntendo University Hospital, and Nihon University Iidabashi Hospital, and 282 healthy individuals living in the Kanto area. Genotyping was performed using the Infinium assay II with the iScan system (Illumina, San Diego, CA, USA). For samples of 194 peripheral neuropathic pain patients, HumanOmni1-Quad v1.0 (total markers: 1,134,514) and HumanOmniExpress-12 v1.1 (total markers: 719,665) BeadChips were used. HumanOmniExpressExome-8 v1.2 (total markers: 964,193) BeadChip was used for samples from 282 healthy individuals.

全ゲノムジェノタイピングデータの質を GenomeStudio with the Genotyping module v3.3.7 (Illumina)で評価した。Call rateが0.95未満のものを除外したところ、194名の末梢神経障害性疼痛患者サンプルのうち3名のサンプルが除外された。ゲノムワイド関連解析（GWAS）の結果、末梢神経障害性疼痛との関連が有意に強いSNPの中に、単純ヘルペスウイルス1型との関連が報告されているHS3ST4遺伝子のSNP rs9989408があった。単純ヘルペスウイルス1型は、帯状疱疹を引き起こす水痘帯状疱疹ウイルスの近縁ウイルスであり、帯状疱疹は激痛を伴う疾患で、さらに帯状疱疹後神経痛に進行することから、HS3ST4遺伝子の当該SNPと帯状疱疹罹患、帯状疱疹後神経痛患者との関連の統計解析を行った。末梢神経障害性疼痛患者サンプルの中から、帯状疱疹罹患経験者96名、帯状疱疹後神経痛患者91名、神経痛患者（帯状疱疹後神経痛患者を除く）39名を抽出し、それぞれ健常人との比較解析を当該SNPについてSSPSソフトウェア（IBM）を用いて分割表解析を行った。また、当該SNP近傍のSNP rs4578651、rs4491506、rs4381608、rs7190143、rs6497898、rs4238925、rs12708686、rs4787337について、TaqMan SNP遺伝子型決定アッセイ（Thermo Fisher）により各サンプルの遺伝子型を同定し、追加統計解析を行った。 The quality of whole-genome genotyping data was evaluated using GenomeStudio with the Genotyping module v3.3.7 (Illumina). After excluding those with a call rate less than 0.95, 3 samples out of 194 peripheral neuropathic pain patients were excluded. As a result of genome-wide association analysis (GWAS), SNP rs9989408 in the HS3ST4 gene, which has been reported to be associated with herpes simplex virus type 1, was among the SNPs that were significantly associated with peripheral neuropathic pain. Herpes simplex virus type 1 is a closely related virus to the varicella-zoster virus that causes shingles, and herpes zoster is an extremely painful disease that progresses to postherpetic neuralgia. A statistical analysis of the relationship between morbidity and postherpetic neuralgia patients was performed. From a sample of patients with peripheral neuropathic pain, 96 people with experience of herpes zoster, 91 people with postherpetic neuralgia, and 39 people with neuralgia (excluding patients with postherpetic neuralgia) were selected and compared with healthy subjects. Contingency table analysis was performed on the SNP using SSPS software (IBM). In addition, for SNPs rs4578651, rs4491506, rs4381608, rs7190143, rs6497898, rs4238925, rs12708686, and rs4787337 near the relevant SNP, the genotype of each sample was identified using TaqMan SNP genotyping assay (Thermo Fisher), and additional statistical analysis was performed. .

定常発現細胞作製
HS3ST4 cDNAをpcDNA3ベクターに導入したプラスミドを作製した。pcDNA3-HS3ST4, pcDNA3をヒト悪性メラノーマ細胞（MeWo細胞）に導入後G418で選択しモノクローナル細胞MeWo-HS3ST4, MeWo-vectorを得た。それらの細胞でのHS3ST4の発現を確認し実験に使用した。 Constant expression cell production
A plasmid was created by introducing HS3ST4 cDNA into the pcDNA3 vector. pcDNA3-HS3ST4, pcDNA3 was introduced into human malignant melanoma cells (MeWo cells) and selected with G418 to obtain monoclonal cells MeWo-HS3ST4, MeWo-vector. The expression of HS3ST4 in these cells was confirmed and used for experiments.

ウイルス感染実験
VZV野生株感染MeWo細胞をターゲット細胞に感染させた。MeWo-HS3ST4, MeWo-vector, MeWo細胞を24穴または96穴プレートに播種し、翌日1000 plaque forming unit（PFU）相当の感染MeWo細胞を添加し（multiplicity of infection = 0.01）、37℃、5％CO2インキュベーター内で加温した。随時顕微鏡下観察を行った。 Virus infection experiment
Target cells were infected with MeWo cells infected with VZV wild strain. MeWo-HS3ST4, MeWo-vector, and MeWo cells were seeded in a 24-well or 96-well plate, and infected MeWo cells equivalent to 1000 plaque forming units (PFU) were added the next day (multiplicity of infection = 0.01) at 37℃ and 5%. Warmed in a CO2 incubator. Observations were made under a microscope from time to time.

プラークアッセイ
MeWo-HS3ST4, MeWo-vector, MeWo細胞を12穴プレート等に播種翌日にVZV野生株感染MeWo細胞を段階希釈したものを添加し、37℃、5％CO2インキュベーター内で6日間程度加温した。その間に顕微鏡下観察を行った。最終的に培地をホルマリン入りクリスタルバイオレット固定染色液に交換し2時間室温に放置後、固定染色液を洗浄し乾燥させ、形態観察、計数を行った。 plaque assay
The day after MeWo-HS3ST4, MeWo-vector, and MeWo cells were seeded in a 12-well plate, etc., serial dilutions of VZV wild strain-infected MeWo cells were added and incubated at 37°C in a 5% CO 2 incubator for about 6 days. . During that time, observation under a microscope was performed. Finally, the culture medium was replaced with crystal violet fixation staining solution containing formalin, and after being left at room temperature for 2 hours, the fixation staining solution was washed and dried, and morphological observation and counting were performed.

エレクトロポレーション
Amaxa 4D Nucleofector Kit SF（Lonza）と添付の16 wellキュベットを用い、Amaxa 4D Nucleofector X unit（Lonza）で細胞に遺伝子導入し96穴プレートに播種後、4～6時間後に新鮮な培地100μlに交換した。 electroporation
Using Amaxa 4D Nucleofector Kit SF (Lonza) and the attached 16-well cuvette, cells were transfected with genes using Amaxa 4D Nucleofector .

フュージョンアッセイ
96穴プレート中の感染細胞等またはエレクトロポレーション翌日の細胞の上清100μlの半量である50μlを新しい96穴プレートに分取し、CytoTox 96 non-radioactive cytotoxicity assay（プロメガ）のプロトコルに従って行った。 fusion assay
50 μl, which is half of the 100 μl supernatant of the infected cells, etc. in the 96-well plate or the day after electroporation, was dispensed into a new 96-well plate, and the assay was performed according to the protocol of CytoTox 96 non-radioactive cytotoxicity assay (Promega).

定量PCR
24穴プレートの感染細胞等から、QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）を用いてトータルDNAを精製した。TaqMan リアルタイムPCRマスターミックス（Thermo Fisher）を用い、7500 FastリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）で解析を行った。VZVプローブ、プライマーは下記の通りである。細胞数評価のために、細胞のRNasePコピー数をTaqManTMCopy Number Reference Assay, human, RNase P（VIC-TAMRA）で検出した。 quantitative PCR
Total DNA was purified from infected cells in a 24-well plate using QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Analysis was performed with a 7500 Fast real-time PCR system (Applied Biosystems) using TaqMan real-time PCR master mix (Thermo Fisher). The VZV probe and primers are as follows. For cell number evaluation, the RNaseP copy number of cells was detected using TaqMan ™ Copy Number Reference Assay, human, RNase P (VIC-TAMRA).

VZV genome 検出（前掲の非特許文献４参照）
プローブ（final 0.25μM）：
ORF28 probe：TCCAGGTTTTAGTTGATACCA FAM-TAMRA（配列番号３９）
プライマー（final 0.9μM）：
Senseプライマー：CGA ACA CGT TCC CCA TCA A（配列番号４０）
Antisenseプライマー：CCC GGC TTT GTT AGT TTT GG（配列番号４１） VZV genome detection (see non-patent document 4 mentioned above)
Probe (final 0.25μM):
ORF28 probe: TCCAGGTTTTAGTTGATACCA FAM-TAMRA (Sequence number 39)
Primer (final 0.9μM):
Sense primer: CGA ACA CGT TCC CCA TCA A (SEQ ID NO: 40)
Antisense primer: CCC GGC TTT GTT AGT TTT GG (SEQ ID NO: 41)

RNaseP genome 検出
プローブ・プライマー：
TaqManTM Copy Number Reference Assay, human, RNase P (VIC-TAMRA)を１×で使用 RNaseP genome detection probe/primer:
Use TaqMan TM Copy Number Reference Assay, human, RNase P (VIC-TAMRA) at 1×

PCR反応：
50℃ 2分
95℃ 10分 以上1サイクル
95℃ 15秒
60℃ 1分 以上40サイクル PCR reaction:
50℃ 2 minutes
95℃ 10 minutes or more 1 cycle
95℃ 15 seconds
60℃ 1 minute or more 40 cycles

細胞伸展観察
MeWo-HS3ST4, MeWo-vector, MeWo細胞を播種後、経時的に顕微鏡下観察を行った。 Observation of cell spread
After seeding MeWo-HS3ST4, MeWo-vector, and MeWo cells, microscopic observation was performed over time.

２．結果
ゲノム解析
末梢神経障害性疼痛との関連をGWASで検討した結果、Trend modelの上位４位にHSV-1との関連が報告されているHS3ST4 遺伝子のrs9989408 SNPが入っていた。HSV-1は、帯状疱疹を引き起こすVZVの近縁ウイルスであり、帯状疱疹は激痛を伴う疾患で、さらにPHNに進行することから、HS3ST4遺伝子rs9989408 SNPと帯状疱疹罹患、PHNとの関連の統計解析を行った（図１）。HS3ST4遺伝子rs9989408 SNPはPHNおよび帯状疱疹罹患と有意に関連していた。また、HS3ST4遺伝子のrs12708686 SNPでも同様の結果が得られた。さらに、VZVの受容体として報告のあるIGF2Rのrs1805075 SNPと、VZVの関連は報告がないIGF2RのリガンドであるIGF2のrs3213216 SNPについても解析したところ、PHNおよび帯状疱疹罹患と有意に関連していたことから、VZV感染に関連が予想される遺伝子のSNPで有意となることが確認された。 2. result
Genome analysis As a result of examining the relationship with peripheral neuropathic pain using GWAS, the rs9989408 SNP of the HS3ST4 gene, which has been reported to be associated with HSV-1, was in the top four spots in the trend model. HSV-1 is a virus closely related to VZV that causes herpes zoster, and herpes zoster is an extremely painful disease that progresses to PHN. Statistical analysis of the relationship between the HS3ST4 gene rs9989408 SNP, herpes zoster incidence, and PHN. (Figure 1). HS3ST4 gene rs9989408 SNP was significantly associated with PHN and herpes zoster incidence. Similar results were also obtained for the rs12708686 SNP of the HS3ST4 gene. Furthermore, we analyzed the rs1805075 SNP of IGF2R, which has been reported to be a receptor for VZV, and the rs3213216 SNP of IGF2, a ligand of IGF2R that has not been reported to be associated with VZV, and found that it was significantly associated with PHN and herpes zoster. Therefore, it was confirmed that SNPs of genes predicted to be related to VZV infection were significant.

次に、これらの遺伝子のSNPが、PHNや帯状疱疹罹患以外の末梢神経障害性疼痛・神経痛と関連するかを検討したところ、IGF2RおよびIGF2のSNPでは有意な関連が見られなかったのに対し、HS3ST4 SNPsでは有意な関連あるいは有意傾向が確認された。したがって、HS3ST4 SNPsはVZV感染に寄らない末梢神経疼痛全般にも関連することが示唆された。 Next, we examined whether SNPs in these genes were associated with peripheral neuropathic pain/neuralgia other than PHN and herpes zoster, and found no significant association with SNPs in IGF2R and IGF2. , a significant association or a significant trend was confirmed for HS3ST4 SNPs. Therefore, it was suggested that HS3ST4 SNPs are related to general peripheral nerve pain that is not related to VZV infection.

HS3ST4発現によるVZV等感染への影響
HS3ST4 SNP がVZV関連疼痛および非関連疼痛両方に関与することから、まず、HS3ST4発現によるVZV感染に対する影響を検討した。MeWo-HS3ST4細胞およびネガティブコントロール細胞であるMeWo-vector細胞にVZV感染細胞を添加し感染させ、プラークアッセイを行った（図２）。プラーク辺縁部を比較すると、HS3ST4発現細胞ではプラーク境界が明瞭であり、プラーク辺縁がまとまって剥がれていると考えられる。
次に、MeWo-HS3ST4細胞およびネガティブコントロール細胞にVZVを感染させ、VZV感染細胞を顕微鏡下観察した（図３－１）。感染2日後、ネガティブコントロール細胞よりもHS3ST4発現細胞の方が、感染細胞である融合細胞の大きさが大きく、HS3ST4発現細胞ではVZV感染により効率的に細胞融合すると考えられた。プラーク辺縁がHS3ST4発現細胞で明瞭だったのも、細胞融合した感染細胞がまとめて剥がれるためと考えられる。 Effect of HS3ST4 expression on infection with VZV etc.
Since HS3ST4 SNP is involved in both VZV-related pain and unrelated pain, we first investigated the effect of HS3ST4 expression on VZV infection. VZV-infected cells were added to MeWo-HS3ST4 cells and MeWo-vector cells, which are negative control cells, and a plaque assay was performed (Fig. 2). Comparing the plaque edges, the plaque boundaries were clear in HS3ST4-expressing cells, suggesting that the plaque edges were peeled off en masse.
Next, MeWo-HS3ST4 cells and negative control cells were infected with VZV, and the VZV-infected cells were observed under a microscope (Figure 3-1). Two days after infection, the size of the fused cells (infected cells) was larger in HS3ST4-expressing cells than in negative control cells, suggesting that HS3ST4-expressing cells undergo efficient cell fusion due to VZV infection. The reason why the plaque margin was clear in HS3ST4-expressing cells is thought to be because infected cells that had fused together were detached all at once.

そこで、細胞融合の度合いを数値化するために、フュージョンアッセイを行ったところ（図３－２）、感染3日後にHS3ST4発現細胞の方が、盛んに融合が起こっていることが明らかとなった。感染4日後には、ネガティブコントロール細胞でも細胞融合以外のウイルス感染による細胞死の影響が見られてくると考えらえる。以上の結果から、HS3ST4はVZV感染下、細胞融合が活性化されることが示唆された。 Therefore, in order to quantify the degree of cell fusion, we performed a fusion assay (Figure 3-2) and found that 3 days after infection, fusion occurred more frequently in HS3ST4-expressing cells. . Four days after infection, it is thought that even in the negative control cells, effects of cell death due to virus infection other than cell fusion are observed. The above results suggested that HS3ST4 activates cell fusion under VZV infection.

VZV感染時の細胞融合が、VZVのどの因子によって引き起こされるのかを検討した。VZVの糖タンパク質のうち、gB, gH, gLが特によく細胞融合に関与する報告があることから、VZVを感染させずこれらの糖タンパク質のみをHS3ST4発現細胞およびネガティブコントロール細胞に発現させ、細胞融合が惹起されるかをフュージョンアッセイで検討した（図４）。HS3ST4発現細胞では、gB, gH, gLの発現により細胞融合が促進されていたことから、gB, gH, gL発現がHS3ST4による細胞融合を引き起こすことが明らかになった。 We investigated which VZV factors cause cell fusion during VZV infection. Among the VZV glycoproteins, it has been reported that gB, gH, and gL are particularly commonly involved in cell fusion. Therefore, we expressed only these glycoproteins in HS3ST4-expressing cells and negative control cells without infecting them with VZV to induce cell fusion. We investigated whether this was induced by fusion assay (Fig. 4). In HS3ST4-expressing cells, expression of gB, gH, and gL promoted cell fusion, indicating that expression of gB, gH, and gL causes cell fusion by HS3ST4.

HS3ST4発現のVZV近縁ウイルス感染による細胞融合に及ぼす影響
VZV近縁ウイルスによる細胞融合促進現象が見られるのかを検討した。VZVと同じαヘルペスウイルス亜科に属する単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）は、帯状疱疹等と同様に疼痛を伴う病態を示すことが知られているので、HSV-2の細胞融合現象に対するHS3ST4発現の効果を検討した（図５）。HSV-2も感染細胞が細胞融合を起こすことが知られているので、MeWo-HS3ST4細胞またはMeWo-vector細胞にHSV-2を感染させ、顕微鏡下感染細胞の観察を行い、感染細胞集団のうち細胞融合を起こしているものの割合を調べたところ、MeWo-HS3ST4細胞ではネガティブコントロール細胞に比べ細胞融合を起こしている感染細胞集団の割合が高いことが判明した。したがって、VZV感染同様、HSV-2感染でもHS3ST4発現により細胞融合が促進されることが示唆された。 Effect of HS3ST4 expression on cell fusion induced by VZV related virus infection
We investigated whether a virus related to VZV promotes cell fusion. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2), which belongs to the same α-herpesvirus subfamily as VZV, is known to exhibit painful pathologies similar to those of herpes zoster. The effect of HS3ST4 expression was examined (Fig. 5). HSV-2 is also known to cause cell fusion in infected cells, so we infected MeWo-HS3ST4 cells or MeWo-vector cells with HSV-2 and observed infected cells under a microscope. When we examined the percentage of cells undergoing cell fusion, we found that the percentage of infected cell populations undergoing cell fusion was higher in MeWo-HS3ST4 cells than in negative control cells. Therefore, it was suggested that cell fusion is promoted by HS3ST4 expression in HSV-2 infection as well as in VZV infection.

HS3ST4発現のVZV感染・複製に及ぼす影響
次に、HS3ST4発現がVZV感染・複製に及ぼす影響を検討した。MeWo-HS3ST4細胞またはMeWo-vector細胞を播種翌日、VZV感染細胞を添加し、経時的に細胞を採取し、細胞内に含まれるVZV genome DNAのコピー数と、それを細胞数あたりに換算するために、細胞数を反映するRNaseP genomeコピー数をリアルタイムPCR法で測定した（図６）。感染48時間後からVZV genome コピー数がいずれの細胞でも上昇し始めたが、96時間後まで常にMeWo-HS3ST4細胞よりもネガティブコントロール細胞の方が2倍前後の高値を示した。以上の結果から、両細胞間でのウイルスコピー数の差は大きくはないものの、HS3ST4の発現により、VZVの感染または複製がわずかに阻害されることが示唆された。先にHS3ST4発現細胞ではVZV感染により細胞融合が促進されることを示したが、VZV感染構造体での複製が細胞融合により阻害されることにより、ウイルスの複製が阻害される可能性が考えられる。 Effect of HS3ST4 expression on VZV infection and replication Next, we examined the effect of HS3ST4 expression on VZV infection and replication. The day after seeding MeWo-HS3ST4 cells or MeWo-vector cells, add VZV-infected cells, collect cells over time, and calculate the copy number of VZV genome DNA contained within the cells and convert it to the number of cells. Next, the RNaseP genome copy number, which reflects the number of cells, was measured using real-time PCR (Figure 6). The VZV genome copy number began to increase in all cells 48 hours after infection, but it was always about twice as high in negative control cells than in MeWo-HS3ST4 cells until 96 hours. The above results suggested that although the difference in virus copy number between both cells was not large, expression of HS3ST4 slightly inhibited VZV infection or replication. We previously showed that VZV infection promotes cell fusion in HS3ST4-expressing cells, but it is possible that virus replication is inhibited by inhibiting replication in VZV-infected constructs due to cell fusion. .

HS3ST4発現による細胞伸展への影響
ヒトゲノム解析の結果から、HS3ST4はVZVに関連しない一般の末梢神経障害性疼痛や神経痛にも関連することが示唆されている。したがって、HS3ST4は、上記のウイルス感染複製関連への寄与以外に、ウイルスに関連しない表現型を誘導する可能性が考えられた。そこで、HS3ST4発現の有無による細胞の性質の違いを観察した。MeWo-HS3ST4細胞またはMeWo-vector細胞を播種後、経時的に顕微鏡下観察を行ったところ、MeWo-HS3ST4細胞の方が播種後ネガティブコントロール細胞と同様に接着はするものの、伸展までに長い時間がかかることを見出した（図７）。この結果から、HS3ST4発現により細胞伸展に抑制効果が見られることが明らかとなった。 Effect of HS3ST4 expression on cell spreading The results of human genome analysis suggest that HS3ST4 is also related to general peripheral neuropathic pain and neuralgia that are not related to VZV. Therefore, it was considered that HS3ST4, in addition to contributing to the above-mentioned relationship with virus infection and replication, may also induce phenotypes unrelated to viruses. Therefore, we observed differences in cell properties depending on the presence or absence of HS3ST4 expression. After seeding MeWo-HS3ST4 cells or MeWo-vector cells, observation under a microscope over time revealed that although MeWo-HS3ST4 cells adhered after seeding in the same way as negative control cells, they took a longer time to spread. We found that this was the case (FIG. 7). These results revealed that HS3ST4 expression had a suppressive effect on cell spreading.

配列番号３９：合成DNA
配列番号４０：合成DNA
配列番号４１：合成DNA SEQ ID NO: 39: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 40: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 41: Synthetic DNA

Claims (19)

HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子又はIGF2遺伝子の遺伝子多型と、個体の疾患罹患性とを関連づけることを特徴とする、疾患罹患性の評価方法。 A method for evaluating disease susceptibility, the method comprising associating genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene with disease susceptibility of an individual. 前記遺伝子多型の解析結果に基づいて、個体の疾患罹患性の高低の傾向を評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 2. The method according to claim 1, wherein a tendency of an individual to have a high or low disease susceptibility is evaluated based on the analysis results of the genetic polymorphism. （ａ）被験者由来の試料を用いて遺伝子多型解析を行い、遺伝子多型を選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）において選択された遺伝子多型の遺伝子型と、疾患罹患性との間の関連を解析する工程、及び
（ｃ）前記被験者における疾患罹患性と有意に関連した遺伝子多型を、疾患罹患性の評価に用いる工程
を含む、請求項１又は２に記載の方法。 (a) Performing genetic polymorphism analysis using a sample derived from a subject and selecting genetic polymorphisms,
(b) analyzing the association between the genotype of the genetic polymorphism selected in step (a) and disease susceptibility; and (c) genetic polymorphism significantly associated with disease susceptibility in the subject. The method according to claim 1 or 2, comprising the step of using for evaluation of disease susceptibility. 前記疾患が疼痛である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the disease is pain. 前記疼痛が、慢性疼痛、又は帯状疱疹に伴う疼痛である、請求項４に記載の方法。 5. The method according to claim 4, wherein the pain is chronic pain or pain associated with herpes zoster. 慢性疼痛が、帯状疱疹後神経痛、脊柱管狭窄、椎間板ヘルニア、関節周囲炎、及び関節リウマチからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の方法。 6. The method of claim 5, wherein the chronic pain is at least one selected from the group consisting of postherpetic neuralgia, spinal canal stenosis, herniated disc, periarthritis, and rheumatoid arthritis. 遺伝子多型が、一塩基多型、挿入型多型、欠失型多型及び塩基繰り返し多型からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。 According to any one of claims 1 to 6, the genetic polymorphism is at least one selected from the group consisting of a single nucleotide polymorphism, an insertion polymorphism, a deletion polymorphism, and a nucleotide repeat polymorphism. the method of. HS3ST4遺伝子の遺伝子多型が、rs9989408、rs4511540、rs4578651、rs4381608、rs7190143、rs7359341、rs6497898、rs4238925、rs12708686、rs4787337、rs4533289、rs4303490、rs8050110、rs12596324、rs7205880、rs4787766、rs9928735、rs4331339、rs7196138、rs7200813、rs4305024、rs11640970、rs4238926、rs4787338、及びrs12933515からなる群から選択される少なくとも１つであり、
IGF2R遺伝子の遺伝子多型が、rs1805075、rs2274849、rs4709396、rs7746102、rs8191821、rs8191829、rs8191898、rs2282138、rs2282139、rs3777412、rs8191816、及びrs8191818からなる群から選択される少なくとも１つであり、
IGF2遺伝子の遺伝子多型が、rs3213216である、
請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。 The genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene are rs9989408, rs4511540, rs4578651, rs4381608, rs7190143, rs7359341, rs6497898, rs4238925, rs12708686, rs4787337, rs4533289, rs4303490, rs 8050110, rs12596324, rs7205880, rs4787766, rs9928735, rs4331339, rs7196138, rs7200813, rs4305024, at least one selected from the group consisting of rs11640970, rs4238926, rs4787338, and rs12933515,
The group of genetic polymorphisms in the IGF2R gene consists of rs1805075, rs2274849, rs4709396, rs7746102, rs8191821, rs8191829, rs8191898, rs2282138, rs2282139, rs3777412, rs8191816, and rs8191818. at least one selected from;
The genetic polymorphism of the IGF2 gene is rs3213216,
The method according to any one of claims 1 to 7. HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子又はIGF2遺伝子の遺伝子多型を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズしうる、配列番号１～３８の少なくとも１つに示される塩基配列のうち第51番目の塩基を含む少なくとも10塩基長の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。 At least 10 bases containing the 51st base of the base sequence shown in at least one of SEQ ID NOs: 1 to 38, which can specifically hybridize to a DNA fragment containing a genetic polymorphism of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that an oligonucleotide consisting of a base sequence with a base length or a base sequence complementary to the base sequence is used. HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子又はIGF2遺伝の遺伝子多型を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズしうる、配列番号１～３８の少なくとも１つに示される塩基配列のうち第51番目の塩基を含む少なくとも10塩基長の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、疾患罹患性の評価用キット。 At least 10 bases containing the 51st base of the base sequences shown in at least one of SEQ ID NOs: 1 to 38, which can specifically hybridize to a DNA fragment containing a genetic polymorphism of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene. A kit for evaluating disease susceptibility, comprising an oligonucleotide consisting of a base sequence of base length or a base sequence complementary to the base sequence. HS3ST4遺伝子、IGF2R遺伝子又はIGF2遺伝子の遺伝子多型を含む、個体の疾患罹患性の高低の傾向を評価するための遺伝子多型マーカー。 A genetic polymorphism marker for evaluating an individual's tendency to increase or decrease disease susceptibility, including genetic polymorphisms of the HS3ST4 gene, IGF2R gene, or IGF2 gene. HS3ST4遺伝子が発現可能なように導入されたトランスジェニック動物細胞に、候補物質を接触させて、該動物細胞の細胞融合及び／又は細胞伸展の状態を評価し、得られる評価結果を指標として、疼痛の治療薬又は予防薬をスクリーニングする方法。 Candidate substances are brought into contact with transgenic animal cells into which the HS3ST4 gene has been introduced so that they can be expressed, and the state of cell fusion and/or cell expansion of the animal cells is evaluated. A method of screening for therapeutic or preventive drugs. 前記疼痛が、慢性疼痛、又は帯状疱疹に伴う疼痛である、請求項１２に記載の方法。 13. The method of claim 12, wherein the pain is chronic pain or pain associated with herpes zoster. 慢性疼痛が、帯状疱疹後神経痛、脊柱管狭窄、椎間板ヘルニア、関節周囲炎、及び関節リウマチからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の方法。 14. The method of claim 13, wherein the chronic pain is at least one selected from the group consisting of postherpetic neuralgia, spinal canal stenosis, herniated disc, periarthritis, and rheumatoid arthritis. 候補物質を接触させる前記動物細胞が、水痘帯状疱疹ウイルスを感染させたものである、請求項１２に記載の方法。 13. The method according to claim 12, wherein the animal cell contacted with the candidate substance is infected with varicella-zoster virus. 前記動物細胞がヒト由来細胞である、請求項１２に記載の動物細胞。 The animal cell according to claim 12, wherein the animal cell is a human-derived cell. HS3ST4遺伝子が発現可能なように導入された、疼痛の治療薬又は予防薬をスクリーニングするために用いられるトランスジェニック動物細胞。 A transgenic animal cell used for screening therapeutic or preventive drugs for pain, into which the HS3ST4 gene is introduced so that it can be expressed. 前記動物細胞が、水痘帯状疱疹ウイルスを感染させたものである、請求項１７に記載の方法。 18. The method of claim 17, wherein the animal cells are infected with varicella-zoster virus. 前記動物細胞がヒト由来細胞である、請求項１７又は１８に記載の動物細胞。 The animal cell according to claim 17 or 18, wherein the animal cell is a human-derived cell.
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