JP2023123746A - クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 - Google Patents
クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023123746A JP2023123746A JP2023107219A JP2023107219A JP2023123746A JP 2023123746 A JP2023123746 A JP 2023123746A JP 2023107219 A JP2023107219 A JP 2023107219A JP 2023107219 A JP2023107219 A JP 2023107219A JP 2023123746 A JP2023123746 A JP 2023123746A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- light chain
- antibody
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 title claims abstract description 101
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 109
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 90
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 89
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 74
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 121
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 31
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 22
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 18
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 18
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 13
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 11
- 210000005206 intestinal lamina propria Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical compound OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 6
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 3
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 101710146710 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase Proteins 0.000 claims 1
- 101710171275 Probable 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 281
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 62
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract 1
- 101710084636 Serine hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 abstract 1
- 101710099809 Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic Proteins 0.000 abstract 1
- 102100021225 Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic Human genes 0.000 abstract 1
- 101710087362 Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 137
- 102000002667 Glycine hydroxymethyltransferase Human genes 0.000 description 46
- 108010043428 Glycine hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 description 46
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 40
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 39
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 18
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 10
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 10
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 10
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 10
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 10
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 9
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000002585 base Chemical group 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000261561 Bembidion difficile Species 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 7
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 7
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 7
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 5
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 5
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 5
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 5
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 5
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 4
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 4
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 4
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 description 4
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- -1 nucleotide nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 3
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 3
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 3
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 3
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N chembl3301825 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)C(O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 2
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005469 synchrotron radiation Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- ZSDSQXJSNMTJDA-UHFFFAOYSA-N trifluralin Chemical compound CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O ZSDSQXJSNMTJDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050004624 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutases Proteins 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 108010091324 3C proteases Proteins 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241001202853 Blautia Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 241001464948 Coprococcus Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241001560646 Enterorhabdus Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 1
- 241000415053 Exapion difficile Species 0.000 description 1
- 241001608234 Faecalibacterium Species 0.000 description 1
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 description 1
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001040808 Homo sapiens Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic Proteins 0.000 description 1
- 101001067604 Homo sapiens Serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000043362 Megamonas Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000428199 Mustelinae Species 0.000 description 1
- 206010051606 Necrotising colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000605947 Roseburia Species 0.000 description 1
- 241000192031 Ruminococcus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 1
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014171 carbonated beverage Nutrition 0.000 description 1
- WZOZEZRFJCJXNZ-ZBFHGGJFSA-N cefoxitin Chemical compound N([C@]1(OC)C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 WZOZEZRFJCJXNZ-ZBFHGGJFSA-N 0.000 description 1
- 229960002682 cefoxitin Drugs 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012200 cell viability kit Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 229960003077 cycloserine Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 235000011850 desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 102000052634 human SHMT Human genes 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 235000008446 instant noodles Nutrition 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013310 margarine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003264 margarine Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 208000015688 methicillin-resistant staphylococcus aureus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 1
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020124 milk-based beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000016046 other dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 201000006195 perinatal necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 235000012046 side dish Nutrition 0.000 description 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 235000013547 stew Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008256 whipped cream Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Mycology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
Abstract
Description
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号17で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号11で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号12で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号13で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号14で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号15で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号16で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号21で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号22で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号23で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号24で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
配列番号37で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号38で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖CDR1~3、軽鎖CDR1~3および軽鎖FR1から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌SHMTタンパク質中のアミノ酸配列RQEEHIELIASおよびC.difficileのiPGMタンパク質中のアミノ酸配列VLDMMKLEKPEに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
X1YYIHのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
RIDPENX2X3TTYAPKFQのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
YCARSTVLのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
RX4SQSIVHTNGのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
KLLIYKVのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
GVYYFQGSのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖FR1が、
TPLSLPVSLGDQAのアミノ酸配列または
SPASX5SVSLGDRX6のアミノ酸配列を含む
X1、X2、X3はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、X4は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、X5、X6はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
X1がアスパラギン酸、X2がアスパラギン酸、X3がグルタミン酸であり、X4がアラニンであり、かつ軽鎖FR1が配列TPLSLPVSLGDQAを含むものを除く、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
1)腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたB細胞と、それ以外の種類の細胞を混合して融合させ、ハイブリドーマを作製する工程、
2)前記ハイブリドーマを培養し、クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程、および
3)前記クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程
を含む、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法を提供する。
[項目1]
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
a)
配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片;
b)
配列番号17で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片;
c)
配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片;または
d)
配列番号37で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号38で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖CDR1~3、軽鎖CDR1~3および軽鎖FR1から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌SHMTタンパク質中のアミノ酸配列RQEEHIELIASおよびC.difficileのiPGMタンパク質中のアミノ酸配列VLDMMKLEKPEに結合する抗体またはその抗原結合断片。
[項目2]
配列番号1で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域;
配列番号11で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号12で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号13で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号14で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号15で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号16で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域;または
配列番号21で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号22で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号23で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号24で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む項目1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目3]
配列番号7で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号8で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目4]
配列番号17で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号18で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目5]
配列番号27で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号28で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目6]
X1YYIHのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
RIDPENX2X3TTYAPKFQのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
YCARSTVLのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
RX4SQSIVHTNGのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
KLLIYKVのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
GVYYFQGSのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖FR1が、
TPLSLPVSLGDQAのアミノ酸配列または
SPASX5SVSLGDRX6のアミノ酸配列を含み、
X1、X2、X3はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、X4は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、X5、X6はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
X1がアスパラギン酸、X2がアスパラギン酸、X3がグルタミン酸であり、X4がアラニンであり、かつ軽鎖FR1が配列TPLSLPVSLGDQAを含むものを除く、項目1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目7]
X1YYIHのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
RIDPENX2X3TTYAPKFQのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
YCARSTVLのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
RX4SQSIVHTNGのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
KLLIYKVのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
GVYYFQGSのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖FR1が
TPLSLPVSLGDQAのアミノ酸配列または
SPASX5SVSLGDRX6のアミノ酸配列を含み、
X1、X2はそれぞれ独立にアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、X3はグルタミンまたはグルタミン酸であり、X4はアラニンまたはセリンであり、X5はロイシンまたはメチオニンであり、X6はアラニンまたはバリンである抗体であって、
X1がアスパラギン酸、X2がアスパラギン酸、X3がグルタミン酸であり、かつ軽鎖FR1が配列TPLSLPVSLGDQASISCRAを含むものを除く、項目1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目8]
配列番号31または41で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号32、42~44のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域;配列番号34または52で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号35で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号36で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;ならびに、
配列番号53~56のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖FR1、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって、
配列番号37で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号38で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを除く、項目1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目9]
項目1~8のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
[項目10]
項目9に記載される核酸を含む発現ベクター。
[項目11]
項目9に記載される核酸、または項目10に記載の発現ベクターを含む細胞。
[項目12]
項目1~8のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体または添加物を含む医薬組成物。
[項目13]
凍結乾燥状態である、項目12に記載の医薬組成物。
[項目14]
1)腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたB細胞から抗体産生不死化細胞を作製する工程、
2)前記抗体産生不死化細胞を培養し、クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程、および
3)前記クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程
を含む、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法。
[項目15]
前記工程2が、担体に固定された細菌体に対して結合する抗体を産生する細胞を決定することにより行われる、項目14に記載のクロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法。
本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
Prevotella属に属する細菌、
Bacteroides属に属する細菌、
Megamonas属に属する細菌、
Bifidobacterium属に属する細菌、
Faecalibacterium属に属する細菌、
Coprococcus属に属する細菌、
Ruminococcus属に属する細菌、
Blautia属に属する細菌、
Eubacterium属に属する細菌、
Roseburia属に属する細菌、
Lactobacillus属に属する細菌、
Clostridium属に属する細菌、
Escherichia属に属する細菌、
Staphylococcus属に属する細菌、
Enterococcus属に属する細菌、
Pseudomonas属に属する細菌、
Enterorhabdus属に属する細菌、
Fusobacterium属に属する細菌
等が挙げられる。
本発明のC.difficile細菌体に結合する抗体は、C.difficile細菌に結合する。典型的には、本発明の抗体は培養上清中に存在する破壊されていないC.difficile細菌に結合する。
配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号1で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号7で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号8で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
抗体SNK0001ARは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
配列番号17で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号11で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号12で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号13で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号14で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号15で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
配列番号16で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号17で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号18で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
抗体SNK0002ARは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号21で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号22で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号23で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号24で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号27で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号28で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
抗体SNK0003Aは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
配列番号37で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号38で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖CDR1~3、軽鎖CDR1~3および軽鎖FR1から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌SHMTタンパク質中のアミノ酸配列RQEEHIELIAS(配列番号72)およびC.difficileのiPGMタンパク質中のアミノ酸配列VLDMMKLEKPE(配列番号73)に結合する抗体である。
X1YYIHのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
RIDPENX2X3TTYAPKFQのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
YCARSTVLのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
RX4SQSIVHTNGのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
KLLIYKVのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
GVYYFQGSのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖FR1が
TPLSLPVSLGDQAのアミノ酸配列または
SPASX5SVSLGDRX6のアミノ酸配列を含み、
X1、X2、X3はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、X4は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、X5、X6はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
X1がアスパラギン酸、X2がアスパラギン酸、X3がグルタミン酸であり、X4がアラニンであり、かつ軽鎖FR1が配列TPLSLPVSLGDQAを含むものを除く抗体である。
X1YYIHのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
RIDPENX2X3TTYAPKFQのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
YCARSTVLのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
RX4SQSIVHTNGのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
KLLIYKVのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
GVYYFQGSのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖FR1が
TPLSLPVSLGDQAのアミノ酸配列または
SPASX5SVSLGDRX6のアミノ酸配列を含み、
X1、X2はそれぞれ独立にアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、X3はグルタミンまたはグルタミン酸であり、X4はアラニンまたはセリンであり、
X5はロイシンまたはメチオニンであり、X6はアラニンまたはバリンである抗体であって、
X1がアスパラギン酸、X2がアスパラギン酸、X3がグルタミン酸であり、X4がアラニンであり、かつ軽鎖FR1が配列TPLSLPVSLGDQAを含むものを除く抗体である。
配列番号31または41で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号32、42~44のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号31で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号32で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号31で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号42で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号31で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号43で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号31で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号44で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号41で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号32で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号41で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号42で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号41で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号43で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号41で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号44で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む。
配列番号34または52で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号35で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
配列番号36で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む。
配列番号34で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号35で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
配列番号36で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む。
配列番号52で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号35で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
配列番号36で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む。
当該配列は、Protein Lと抗体分子が結合するように、W27G2抗体の軽鎖FR1領域の配列TPLSLPVSLGDQA(配列番号56)に変異を導入したものである。
当該配列は、Protein Lと抗体分子がより強固に結合するように、配列番号54に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖FR1領域にさらに変異を導入したものである。
当該配列は、Protein Lと抗体分子がより強固に結合するように、配列番号54に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖FR1領域にさらに変異を導入したものである。
配列番号31または41で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号32、42~44のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域;
配列番号34または52で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号35で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号36で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;ならびに、
配列番号53~56のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖FR1、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって、
配列番号37で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号38で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを除く抗体である。
W27G2抗体に対して、抗原特異性を実質的に変更しないように重鎖または軽鎖に変異を導入して、CHO細胞で産生された抗体を、RS変異体リコンビナント精製抗体と呼ぶ。これらのRS変異体リコンビナント精製抗体は、さらにプロテインLへの結合のための変異を有している。
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、リボヌクレオチドであっても、デオキシヌクレオチドであってもよい。また、当該核酸の形態は特に限定されず、1本鎖の形態であっても、2本鎖の形態であってもよい。当該核酸配列の利用するコドンは特に限定されず、目的に応じて各種コドンを適宜選択して使用することができる。例えば、製造時に採用する宿主細胞の種類に応じて、コドン頻度などを考慮して適宜選択することができる。一態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片を発現し、製造することに利用される。
本発明に係るC.difficile細菌体に結合する抗体の製造方法は、下記の工程1~3を含むことを特徴とする。
(工程1)
腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたB細胞から、抗体産生不死化細胞を作製する工程。
(工程2)
上記工程1にて作製した抗体産生不死化細胞を培養し、C.difficile細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程。
(工程3)
前記C.difficile細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程。
本発明に係るC.difficile細菌体と結合する抗体の製造方法における工程1は、腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたB細胞から、抗体産生不死化細胞を作製する工程である。
本発明に係るC.difficile細菌体と結合する抗体の製造方法における工程2は、上記工程1にて作製した抗体産生不死化細胞を培養し、C.difficile細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程である。
本発明に係るC.difficile細菌体と結合する抗体の製造方法における工程3は、上記工程2で決定された、C.difficile細菌体と結合する抗体を産生する細胞から、抗体を回収する工程である。
工程3における具体的な回収方法は、特に限定はされないが、例えばIgA抗体を産生する細胞の培養液の上清を回収する方法、前記細胞の溶解液を回収する方法が挙げられる。細胞の溶解液は、超音波破砕、フレンチプレス等といった公知の機械的手段及び/又は界面活性剤、細胞壁消化酵素、細胞膜消化酵素を用いた公知の化学的処理による方法を適宜組み合わせて細胞を溶解し、その後固液分離工程に供した後の液相画分を回収して本発明のC.difficile細菌体と結合する抗体を製造することができる。
別の態様において、本発明のC.difficile細菌体と結合する抗体は、C.difficile細菌体と結合することの確認された抗体をコードする核酸を、モノクローナル抗体を産生し得る細胞に導入し、当該細胞を培養して、その細胞抽出液又は培養上清から、モノクローナル抗体を回収し、必要に応じて精製する方法が挙げられる。
本発明に係る抗体産生不死化細胞は、上述の本発明に係るC.difficile細菌体と結合する抗体を産生する不死化細胞である。
本発明に係る医薬組成物は、本発明に係るC.difficile細菌体と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
本発明に係る経口又は経腸組成物は、本発明に係るC.difficile細菌体と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。この様な経口又は経腸組成物を使用することによって、C.difficile細菌と関連する疾患を治療することができる。
本発明に係る疾患の治療方法は、C.difficile細菌と関連する腸内疾患の治療方法であって、上述の本発明に係るC.difficile細菌体と結合する抗体もしくはその抗原結合断片、本発明に係る医薬組成物、又は本発明に係る経口組成物の有効量を、C.difficile細菌と関連する腸内疾患に罹患したヒトに投与する工程を含む方法である。
1.マウス
8-25週齢のC57BL/6、もしくはBALB/cマウスを使用した。これらをSPF飼育し、またはこれらのマウスにヒト腸内細菌叢を移植し、あるいは特定の病原菌を感染させた。
(1-1)小腸および大腸粘膜固有層細胞の分離
マウスを安楽死させた後、開腹し小腸全長を摘出した。摘出した小腸から結合組織とパイエル板を取り除いた後、小腸を縦切開し、小腸内容物をPBSで洗浄した。次に、1mM EDTAを含むPBS 50mlが満たされている100mlビーカーに洗浄した小腸を1cm程度の長さに切断して加えた。37℃で20分間振盪した後、ストレイナーに小腸断片を集め、EDTAを含むPBSを破棄した。50mlチューブに小腸断片を加え20mlのPBSを加え10秒間激しく振盪した後、再びストレイナーに小腸断片を集め、PBSを破棄した。この作業を2回繰り返し、小腸組織から小腸上皮細胞のみを取り除いた。次に、100mlビーカーに37℃に温めた消化酵素液(100ml RPMI 1640、5ml FCS(最終濃度5%)、50μlの2-メルカプトエタノール(最終濃度55μM)、0.15gのコラゲナーゼ、1mlのジスパーゼ(50U/ml)(最終濃度0.5U/ml)にて調整)を50ml加え、小腸組織をさらに細かく切り加え、37℃で30分間振盪した。その後100mlビーカーを静置し小腸組織を沈めた後、上清を新しい50mlチューブに移した。この消化酵素液を用いた消化工程を20分間1回繰り返した。消化液を1,500rpm、室温で5分間遠心し、上清を破棄した。沈殿物として得られた粘膜固有層細胞を2% FCSを含むRPMI 1640で一回洗浄した後に、2mlの2% FCSを含むRPMI 1640に懸濁し氷上に保存した。2回目の消化工程の反応を行った上清についても同様の作業を行い1回目の細胞懸濁液と2回目の細胞懸濁液を合わせ、フィルターに通し組織片を取り除き、小腸(大腸)粘膜固有層細胞とした。
小腸(大腸)粘膜固有細胞もしくは脾臓細胞とマウスミエローマ細胞であるNS1細胞を融合してハイブリドーマの作製を行った。細胞融合はClonaCell-HY Hybridoma Cloning Kit(STEMCELL Technologies)に従い、kitの試薬と手順に従って行った。得られたハイブリドーマをClonaCell-HY Hybridoma Cloning Kit(STEMCELL Technologies)に従ってメチルセルロース含有培地で増殖させ、クローンを肉眼でピックアップして、96穴プレートでさらに各クローンを増殖させた。その後、クローニングしたハイブリドーマから凍結細胞ストックを作製すると同時に培養上清を取得した。上清中に含まれる抗体について、通常のサンドイッチELISA法により抗体のアイソタイプを確認し、その後に上清中に含まれる抗体の抗体価を測定し、各アイソタイプ抗体産生ハイブリドーマとして分離した。ELISAで使用した抗体はプレートへのコーティングにAnti-goat-mouse IgA(Southern Biotech)、Anti-goat-mouse IgG(Southern Biotech)、もしくはAnti-goat-mouse IgM(Southern Biotech)を2μg/ml、検出用にAlkaline Phosphatase(ALP)-conjugated anti-goat mouse IgA(Southern Biotech)、Alkaline Phosphatase(ALP)-conjugated anti-goat mouse IgG(Southern Biotech)、もしくは Alkaline Phosphatase(ALP)-conjugated anti-goat mouse IgM(Southern Biotech)を0.5μg/mlで使用した。コントロール抗体としてMouse IgAκ(Immunology Consultants Laboratory)、Purified mouse IgG1κIsotype Control(BD Pharmingen)、PE-CF594 mouse IgMκIsotype Control(BD Horizon)をそれぞれ使用した。測定は、TriStar2 LB942(BERTHOLD TECHNOLOGIES)を使用し、OD405 nmを測定した。以上の操作により、合計で500以上のハイブリドーマクローンを取得した。
各腸内細菌に結合する抗体をスクリーニングするために、各細菌に対するELISAを行った。特に、Clostridium difficile(C. difficile)菌に対して実施したスクリーニング法を記述する。C. difficileを37℃嫌気培養(Brain Heart Infusion media、80% N2、10% H2、10% CO2)を行い、遠心分離により集めた。0.05M Na2CO3バッファーに細菌を懸濁し、ELISAプレートにコーティングした。1% BSA添加PBSによるブロッキング後に、96穴プレート中の各抗体培養上清を加え、室温で約1時間反応させた。その後、プレートを0.05% Tween 20添加PBSで洗浄し、各抗体アイソタイプに対応した2次検出抗体(上述)を加え反応後、Alkali Phosphatase tablet(Sigma)を使用して発色反応を行った。十分な反応のために、発色後のELISAプレートを4度で一晩反応させ、TriStar2 LB942(BERTHOLD TECHNOLOGIES)を使用し、OD405nmを測定した。OD405nmが2.0以上を示したクローンをC. difficile菌に結合する抗体とした。
各クローンの細胞からIsogenII(Nippon Gene Co.,Ltd.)を使用しRNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型にしてcDNAを合成し、抗体のVH領域に対する7種類のプライマー(MH1-7)とCα領域、Cγ領域もしくはCγ領域特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。軽鎖に関してはVκプライマーとCκプライマーでPCRを行った。プライマーの塩基配列は表1に示した。増幅されたVH領域PCR産物またはVκ領域PCR産物を直接シークエンスし、各クローンの可変領域遺伝子配列を取得した。これをIg blast で検索し、特定のVHもしくはVκ遺伝子のさらに上流配列(シグナル配列を含む)を取得し、その最上流配列をもとにPCRプライマーを作製し、各C領域分泌型配列の3’端のリバースプライマーとともにPCRを実施し、H鎖とL鎖の全長遺伝子塩基配列を得た。これをもとにpcDNA 3.1(+)ベクター(Invitrogen)にH鎖、L鎖、J鎖(データベースから塩基配列を検索しハイブリドーマのcDNAを用いてPCRにより遺伝子配列全長を取得)にクローニングした。
表 1. ハイブリドーマ由来抗体の抗体遺伝子可変領域増幅用プライマーの塩基配列
表中の塩基配列において、SはGまたはC、RはAまたはG、NはA、C、GまたはT、WはAまたはT、VはG、CまたはAを表す。
上記の発現ベクターをExpi CHOS細胞(Thermo Fischer Scientific)にH:L:J=2:2:1の量比となるようにキットのプロトコルに従ってトランスフェクションを行った。(Thermo Fischer Scientific,ExpiCHO Expression System)トランスフェクション後10-12日目に培養上清を回収し、上記と同様にProteinLカラムにより抗体を精製、濃縮、PBSに透析で置換後にフィルター滅菌を行い、抗体価測定や活性試験に使用した。
(材料と方法)
実施例1と同様の条件にて、C. difficile菌を一晩37℃で嫌気培養した。培養液を遠心分離し、細菌を集菌後、培養液で2回洗浄を行った。細菌液を培養液で10倍に希釈後に、SYTO24(Invitrogen)とCell Viability Kit(Becton Dickinson)に含まれるCounting beadsを加え、フローサイトメトリーによりSYTO24陽性の生細菌数をCounting beadsとの比較から算出した。培養液で細菌10,000 cells/5μlになるように希釈した。エッペンチューブに細菌希釈液5μl加え、さらにPBS(嫌気化済)、または精製した試験抗体(嫌気化済)を25μl(抗体濃度 1mg/ml)加え、37℃ 1時間静置培養した。その後、培養液を30μl加え、37℃ 20時間静置嫌気培養を行った(抗体最終濃度は0.42mg/ml)。
20時間培養後、上記と同様にSYTO24とCounting beadsを加えてフローサイトメトリーにより生細菌数を測定した。PBSサンプル(抗体の添加なし)と比較して、生細菌数が30%以下に減少した抗体を増殖抑制効果ありとして、次のマウス感染実験に使用した。
結果を図1に示す。試験したいずれの抗体も、陰性対照(PBS)に比して著明なC. difficile増殖抑制能を示した。
(材料と方法)
C. difficile菌株(VPI10483)は芽胞液を作製し小分けにして-80度保存した。芽胞液を解凍して培養後にC. difficile菌選択培地プレート(TCCFAプレート)に播種して得られる生細菌数をあらかじめ求めた。
芽胞の作製方法は以下のようである。
C. difficileをSMC培地にプレーティングし、37 ℃で7日間嫌気培養した。プレートに氷冷滅菌水3 mlを加えて、セルスクレーパーでコロニーを掻き取り、50 mlチューブに移した。さらに氷冷滅菌水3 mlでプレートを洗浄し、洗浄液も同じチューブへ移した。8,000 g、4 ℃で10分間遠心した後に、上清を捨てて氷冷滅菌水20 mlで菌体を懸濁した。再び8,000 g、4 ℃で10分間遠心後、上清を捨てて氷冷滅菌水10 mlで懸濁した。懸濁後、エタノール10 mlを加えてボルテックスで攪拌させて、室温で1時間静置した。8,000 g、4 ℃で10分間遠心し、上清を捨てて氷冷滅菌水20 mlで菌体を懸濁した。この操作を2回繰り返し、上清を廃棄してから、氷冷滅菌水 5 mlで懸濁した。1.5 mlチューブに100 μlずつ分注し、-80℃で保存した。SMC培地組成を以下に示す。
SMC培地組成
上記試薬を滅菌蒸留水200 mlに溶解し、オートクレーブ滅菌した。60 ℃くらいまで冷めたら、10 %(w/v)L-cysteine 600 μlを加え、10 cmプレートに適量ずつ分注した。
W27G2またはSNK0002M抗体を投与したマウス群では、陰性対照(PBS投与群)に比して、C. difficile菌芽胞液投与後の体重減少が抑制された(図2)。
また、便中のC. difficile生菌について、4日目の便に十分な数の生菌数を観察したことから各マウスへの感染は成立していることが確認された。10日目の便について、W27G2抗体またはSNK0002M抗体を投与したマウス群では生菌数が激減していたことから、これらの抗体により菌の増殖が有意に生体内でも抑制されたことが確認された(図3)。
上記C. difficile菌に結合する抗体について、実施例1で用いたELISAと同様の方法により、他の細菌に対する結合特性および当該細菌に対する効果を調べた。例として、大腸ガン原因菌と考えられているFusobacterium nucleatumに対する結合特性および効果を調べた結果を提示する。細菌を嫌気培養後、フローサイトメトリーを用いて菌数を1,000 cells/tubeにそろえて各試験抗体と反応させ、抗体による増殖抑制効果を検証した。加えた抗体の最終濃度と培養時間は実施例2と同様であった。抗体と菌を反応後、培養液を加えてさらに20時間培養後に生菌数を測定した。
抗体SNK0001M、SNK0001MR、SNK0001AR、SNK0002MR、SNK0002AR、RS_H000_L001、およびSNK0003Aは、Fusobacterium nucleatumに対して著明な増殖抑制効果を示した(図4)。一方で、SNK0004AやSNK0005Aは増殖抑制効果を示さなかった(negative control)。
W27抗体は大腸菌のserine hydroxymethyl transferase(SHMT)に結合することが確認されている(WO2014/142084等)、以下の方法により、W27抗体が大腸菌のSHMTに結合することを確認するとともに、W27抗体のC. difficile抗原分子を特定した。なお、W27G2抗体はW27抗体と同一の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する。
(材料と方法)
大腸菌を25mlのLB培地で16時間静置培養した。2,150gで5分間遠心して集菌した。上清を取り除いた後に、1mlのlysis buffer(滅菌1×PBS,10% NP-40,×100 Protease Inhibitor Cocktail(Nacalai))で懸濁して、超音波破砕後、氷上で30分間静置した。細菌溶解液を新しいチューブに200μlずつ分注した後に2-ME 50μl、10% SDS 200μlを加えて変性(95℃,10min)した。2-MEとSDSを希釈するために希釈液(滅菌1×PBS,0.1% NP-40,×100 Protease Inhibitor Cocktail)を800μl加えた。タンパク質溶液を可溶性と不溶性分画に分離するため、15,000rpmで5分間の遠心を行なった。可溶性画分を使用して、2D-PAGEを行なって標的タンパク質のスポットの同定を行なった。
C. difficile菌についても同様の方法で細菌溶解液を調製し、可溶性画分を使用して、2D-PAGEを行った。
上記の方法により、W27抗体の抗原分子として大腸菌のSHMT、およびC. difficile菌の2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase(iPGM)を特定した。一例として、C. difficile菌の抗原分子を特定した際の2次元電気泳動データを図5に示す。
W27抗体は大腸菌のSHMTのN末25-30アミノ酸にエピトープがあることが特定されている(論文発表済み)。C. difficileのiPGMに関してもトランケーションタンパクを作製しようと試みたが、タンパク発現の効率が著しく低下するためウェスタンブロット解析でW27抗体の反応を確認することができなかった。
そこで、W27抗体はE. coliのiPGMを認識しないことをウェスタンブロットで確認し、W27抗体が認識するC. difficileのiPGMおよびE. coliのiPGMのキメラタンパク質を発現するプラスミドをIn-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit(TaKaRa)を用いて作製した。データベース上の各細菌のiPGM遺伝子配列情報からプライマーを作成した(表)。キメラタンパク質をDH5αで過剰発現させ、W27抗体の認識をウェスタンブロットで確認しエピトープ配列の場所を絞り込んだ。
上記試験の結果、大腸菌のSHMTのエピトープ配列はRQEEHIELIASEN、C. difficile iPGM のエピトープ配列はAPTVLDMMKLEKPEEMTGHSLISKであることが判明した。
(7-1)IgG W27 Fabの調製と精製
W27抗体の抗原認識を調べるために、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞により発現させたW27リコンビナントIgG抗体を作製した。これは、結晶構造解析に向けて抗原結合部位(Fab)を大量に確保する必要があったためである。粗精製されたIgG W27 を10mM Tris-HCl(pH8.0)で1mg/mlに調整した後、0.05mg/mlのパパイン(ナカライテスク)で、20℃で24時間消化してFc領域とFab領域に消化した。その後、HiTrap SP HPカラム(Cytiva)を用いた 陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製した。Bufferは、10mM Bis-Tris buffer(pH6.0)(buffer A)と、10mM Bis-Tris buffer(pH6.0),300mM NaCl(buffer B)を使って、buffer B濃度を徐々に上昇させたリニアグラジエント溶出でFabとFcを分離精製した。その後、Fabを多く含むフラクションは、HiLoad 26/600 Superdex 2000 pgゲルろ過カラム(Cytiva)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーでさらに精製を行った。ゲルろ過のbufferには5mM BisTris(pH6.5),100mM NaCl(ゲルろ過buffer)を使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製の後、rProtein A Sepharose Fast Flow樹脂(Cytiva)を充填したカラムで微量のFcの夾雑を吸着させて除き、素通り画分にあるFabを回収した。精製したFabは、ゲルろ過bufferの条件でAmicon Ultra 10000 MWCO(Millipore)で48.2mg/mlまで濃縮したあと、エッペンドルフチューブに20μlずつ分注して液体窒素で瞬間凍結させ、使用するまで-80℃に保存した。収量は、50mgのIgG W27から17.4mgのFabを得た。
E. coli由来SHMT(25-45)をコードするcDNA領域をPrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)を用いて増幅した後、プラスミドpGEX6P-3(Cytiva)を改良したプラスミドpGEXM(Kim SY,et al.(2021)Sci Rep 11(1):2120)のSma IとNotIマルチクローニングサイトにIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)で組み込んで発現プラスミドを構築した。作成した発現プラスミドを、大腸菌Rosetta2株(Merck)に形質転換した。なお、SHMT(25-45)はGultathione-S-transferase(GST)融合タンパク質(以下、GST-SHMT(25-45)と記載する。)として発現した。また、GSTと目的タンパク質の間には、ヒトライノウイルス 3Cプロテアーゼ(以下、HRV3Cプロテアーゼ)による切断配列LEVLFQGP(切断部位はQとGの間である)が挿入されているので、発現させたGST融合タンパク質は、GSTと目的タンパク質との間をHRV3Cプロテアーゼで切り離すことができる。最終精製産物となるE. coli SHMT(25-45)のアミノ酸配列は、GPRQEEHIELIASENYTSPRVMQである。
Clostridium difficile 由来iPGM(486-509)(C. difficile iPGM(486-509))のcDNAのpGEXベクターへのクローニングはSHMTとほぼ同様の手法で行った。この際、C. difficile iPGM(486-509)にはチロシンやトリプトファンが存在せず精製過程において280nmの波長で吸光が観察できないため、N末端にチロシン1残基を付加してクローニングした。このiPGM(486-509)は、N末端にHRV 3Cプロテアーゼの認識配列の一部を含むGPY配列が余分に付加される。最終精製産物となるC. difficile iPGM(486-509)のアミノ酸配列は、GPYAPTVLDMMKLEKPEEMTG HSLISKである。形質転換、培養、精製に関する手順はSHMT(25-45)と同様に行い、4L培養の菌体から結晶化に用いるiPGM(486-509)48.52mgを得た。
精製したRS_H000_L000GR FabとE. coli SHMT(25-45)を用いてモル比1:5(0.2mM:1.0mM)で混合液を作成して結晶化スクリーニングを行った。
結晶化条件のスクリーニングは、市販の結晶化スクリーニングキットであるJCSG core suite I-IV,PACT suite(Qiagen)と結晶化ロボットmosquito(TTP Labtech)を用いて行った。結晶化プレート(VIOLAMO)に平衡化用の沈殿剤を充填し、沈殿剤とタンパク質溶液1:1の体積比(0.2μl:0.2μl)で混合した液滴(ドロップ)を作成して、シッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化条件の探索をした。結晶化スクリーニングに使用したタンパク質溶液は、あらかじめ遠心分離で不溶性画分を取り除いたものを使用した。温度条件は4℃と20℃でインキュベートした。
結晶化スクリーニングによって得られた結晶の条件をもとにpHとPEGの濃度をそれぞれ変化させた沈殿剤を調製して、シッティングドロップ蒸気拡散法で行った。
結晶化条件は0.2M Magnesium Acetate,0.1M Sodium Cacodylate pH6.3,22% PEG10000をリザーバー溶液とした。RS_H000_L000GR Fab:0.2mM、E. coli SHMT(25-45):0.6mMで混ぜたタンパク液とリザーバーを0.2μl:0.2μl、で混ぜた後、温度条件は20℃、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化で7日後に観察した。スケールバーは100μmを示す(図9)。
上記の結晶化条件の最適化において得られたRS_H000_L000GR Fab-E. coli SHMT(25-45)複合体結晶は、0.2M Magnesium Acetate,0.1M Sodium Cacodylate pH6.3,22.0% PEG10000,20.0% Glycerolを抗凍結剤(クライオプロテクタント)として、液体窒素中で凍結した。その後、兵庫県の大型放射光施設SPring-8のBL44XUにて測定を行った。取得した回折データをXDSプログラムで処理した後、RS_H000_L000GR Fabの構造情報を用いて分子置換法により位相決定を行った。空間群はP212121、格子定数はa=60.4Å,b=140.7Å,c=180.7Å,α=90°,β=90°,γ=90°、非対称単位中にRS_H000_L000GR Fab-E. coli SHMT(25-45)が3分子存在していた。構造の精密化は、プログラムrefmac 5、phenix refine、cootを組み合わせて使用して行った、Rwork/Rfreeはそれぞれ22.8%、25.7%で精密化を終了した。構造図はプログラムPyMOLを用いて作成した。
IgG W27 Fab C. difficile iPGM(486-509)の結晶化は、構造解析されたIgG W27 Fab-E. coli SHMT(25-45)結晶化条件(0.2M Magnesium Acetate,0.1M Sodium Cacodylate pH6.3,22% PEG10000)をもとにpH,PEG10000の濃度をそれぞれ変化させた沈殿剤を調製して、シッティングドロップ蒸気拡散法で行った。
結晶化条件は0.2 M Magnesium Acetate,0.1 M Sodium Cacodylate pH6.5,23% PEG10000をリザーバー溶液とした。RS_H000_L000GR Fab:0.25mM、C. difficile iPGM(486-509):1.0mMで混ぜたタンパク液とリザーバーの混合比は0.2μl:0.2μl、温度条件は20℃、スケールバーは100μm、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化で10日後に観察した(図10)。
結晶化条件の最適化において得られたRS_H000_L000GR Fab-C. difficile iPGM(486-509)複合体結晶は0.2M Magnesium Acetate,0.1M Sodium Cacodylate pH6.5,23.0% PEG10000,20.0% Glycerolを抗凍結剤(クライオプロテクタント)として、液体窒素中で凍結した。その後、兵庫県の大型放射光施設SPring-8のBL41XUにて測定を行った。取得した回折データをXDSプログラムで処理した後、IgG W27 Fabの構造情報を用いて分子置換法により位相決定を行った。空間群はP212121、格子定数はa=60.423Å,b=140.185Å,c=185.956Å,α=90°,β=90°,γ=90°、非対称単位中にRS_H000_L000GR Fab-C. difficile iPGM(486-509)が3分子存在していた。構造の精密化は、プログラムrefmac 5、phenix refine、cootを組み合わせて使用して行った、Rwork/Rfreeはそれぞれ22.2%、25.2%で精密化を終了した。構造図はプログラムPyMOLを用いて作成した。
具体的には、SHMTとiPGMのエピトープペプチドは、互いに逆向きに結合し、そのエピトープのアミノ酸配列は下記のような類似性を示していた。
これらの情報を元に、アミノ酸残基の種類だけでなく、アミノ酸側鎖が相互作用に及ぼす効果も判断可能となった。構造解析から得られたこれらの情報をもとに、抗原結合に影響を与えないアミノ酸変異を選んで、一連のRS変異型抗体を作成したところ、下記に詳述するように、そのすべてがW27G2抗体と同等の活性を保持することが明らかとなった。したがって、本発明の構造解析結果を用いて、W27G2抗体と同等の活性を保持する様々なRS変異型リコンビナント抗体の作成が可能となった。
RS変異体作製はH鎖発現ベクターとL鎖ベクターを鋳型として、それぞれの変異に応じた塩基配列を含んだmutagenesis用プライマーを用いてPCRを行い、ベクター全長を増幅した。その後、鋳型ベクターDNAをDpnI処理後、イソプロパノール沈殿によりDNAを精製し、DH5αコンピテント細胞に形質転換を行った。得られたクローンからプラスミドを抽出し、目的の変異が導入されたクローンを選択し、ExpiCHOに遺伝子導入して変異型リコンビナント抗体を得た。
作成した変異型リコンビナント抗体の一部について、これらの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図13、14に示す。
それぞれのRS変異型リコンビナント精製抗体を非還元型SDS-PAGEとクマシーブルー染色により、2量体が主に産生されていることを確認した(図15)。
リコンビナントRS改変抗体について、W27G2抗体の抗原分子である大腸菌のserine hydroxymethyltransferase(SHMT)に対する結合力をELISAで測定した。
(材料と方法)
大腸菌の野生型SHMTとSHMTmutantをGST融合タンパク質として大腸菌に過剰発現させたて精製した。これらを2μg/mlとなるように0.05M Na2CO3バッファーに懸濁し、ELISAプレートに固着させ、各変異型精製抗体の希釈系列を作製して加え、上記の細菌に対する結合力を測定するELISAと同じ方法で結合力を検出した。
(結果)
代表例として6種(RS_H00_L001、RS_H007_L001、RS_H007_L002、RS_H00_L005、RS_H007_L005およびRS_H007_L004)の変異型精製抗体について試験したところ、これらの抗体はハイブリドーマ由来W27G2抗体(ゲル濾過精製)とほぼ同程度に大腸菌野生型SHMTに結合すること、さらにSHMTmutantには結合しないことが確認された(図16)。
大腸菌BW38029株をLB培地で16時間、37℃静置嫌気培養した。8,000gで5分間遠心を行って集菌した。滅菌嫌気LBで洗浄後、フローサイトメーターで生菌数を計測した。
上記の測定結果をもとに細菌を300個/5μlとなるようにLB培地で希釈し、各抗体またはPBSを25μl加え、さらにM9最小培地を30μl加えて20時間後にフローサイトメーターにより上記の方法で細菌数を計測した。抗体の最終濃度は0.42mg/mlとした。
各種の変異型リコンビナント抗体はいずれも、陰性対照(PBS添加)サンプルに比べて大腸菌の増殖を抑制した(図18)。
実施例3において、ハイブリドーマ由来の抗体のC. difficile感染マウスに対する効果を調べたが、リコンビナントIgA抗体についても、同様のC. difficile感染マウスに対する効果確認実験を行った。リコンビナントIgA抗体として、抗体RS_H000_L001(図19においてrW27として示す)および抗体SNK0002ARを用いた。C. difficile感染マウスに対して、リコンビナントIgA抗体、抗体RS_H000_L001(rW27)およびSNK0002ARをそれぞれ投与したところ、両者ともC. difficile感染マウスの体重減少を有意に抑制した(図19)。興味深いことに、抗体の代わりにVancomycinが投与されたマウスは、投与中はまったく体重の減少が見られなかったものの、投与終了後に顕著な体重減少が見られ、生存率も低下した(図19)。当該減少の原因の一つとして、グラム陽性細菌が感受性を示すVancomycinの投与により、グラム陰性細菌が選択的に腸管内で増加してdysbiosisの状態が起こり、Vancomycin投与中止後に残存していたC. difficile菌が増殖して上記の病態を示した可能性が考えられた。
Claims (15)
- クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
a)
配列番号7で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号8で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片;
b)
配列番号17で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片;
c)
配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖CDR1のアミノ酸配列、重鎖CDR2のアミノ酸配列、および重鎖CDR3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖CDR1のアミノ酸配列、軽鎖CDR2のアミノ酸配列、および軽鎖CDR3のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片;または
d)
配列番号37で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号38で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖CDR1~3、軽鎖CDR1~3および軽鎖FR1から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌SHMTタンパク質中のアミノ酸配列RQEEHIELIASおよびC.difficileのiPGMタンパク質中のアミノ酸配列VLDMMKLEKPEに結合する抗体またはその抗原結合断片。 - 配列番号1で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号4で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号6で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域;
配列番号11で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号12で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号13で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号14で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号15で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号16で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域;または
配列番号21で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号22で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号23で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号24で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 配列番号7で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号8で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 配列番号17で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号18で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 配列番号27で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号28で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - X1YYIHのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
RIDPENX2X3TTYAPKFQのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
YCARSTVLのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
RX4SQSIVHTNGのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
KLLIYKVのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
GVYYFQGSのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖FR1が、
TPLSLPVSLGDQAのアミノ酸配列または
SPASX5SVSLGDRX6のアミノ酸配列を含み、
X1、X2、X3はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、X4は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、
X5、X6はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
X1がアスパラギン酸、X2がアスパラギン酸、X3がグルタミン酸であり、X4がアラニンであり、かつ軽鎖FR1が配列TPLSLPVSLGDQAを含むものを除く、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - X1YYIHのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
RIDPENX2X3TTYAPKFQのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
YCARSTVLのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域、ならびに
RX4SQSIVHTNGのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
KLLIYKVのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
GVYYFQGSのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖FR1が
TPLSLPVSLGDQAのアミノ酸配列または
SPASX5SVSLGDRX6のアミノ酸配列を含み、
X1、X2はそれぞれ独立にアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、X3はグルタミンまたはグルタミン酸であり、X4はアラニンまたはセリンであり、X5はロイシンまたはメチオニンであり、X6はアラニンまたはバリンである抗体であって、
X1がアスパラギン酸、X2がアスパラギン酸、X3がグルタミン酸であり、かつ軽鎖FR1が配列TPLSLPVSLGDQASISCRAを含むものを除く、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 配列番号31または41で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号32、42~44のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号33で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
を含む重鎖可変領域;
配列番号34または52で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号35で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号36で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;ならびに、
配列番号53~56のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖FR1、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって、
配列番号37で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号38で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを除く、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 請求項1~8のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
- 請求項9に記載される核酸を含む発現ベクター。
- 請求項9に記載される核酸、または請求項10に記載の発現ベクターを含む細胞。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体または添加物を含む医薬組成物。
- 凍結乾燥状態である、請求項12に記載の医薬組成物。
- 1)腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたB細胞から抗体産生不死化細胞を作製する工程、
2)前記抗体産生不死化細胞を培養し、クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程、および
3)前記クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程
を含む、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法。 - 前記工程2が、担体に固定された細菌体に対して結合する抗体を産生する細胞を決定することにより行われる、請求項14に記載のクロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021110421 | 2021-07-01 | ||
JP2021110421 | 2021-07-01 | ||
JP2022566303A JP7425452B2 (ja) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 |
PCT/JP2022/026277 WO2023277142A1 (ja) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022566303A Division JP7425452B2 (ja) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023123746A true JP2023123746A (ja) | 2023-09-05 |
JP7405386B2 JP7405386B2 (ja) | 2023-12-26 |
Family
ID=84692781
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022566303A Active JP7425452B2 (ja) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 |
JP2023107219A Active JP7405386B2 (ja) | 2021-07-01 | 2023-06-29 | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 |
JP2024002756A Pending JP2024041901A (ja) | 2021-07-01 | 2024-01-11 | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022566303A Active JP7425452B2 (ja) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2024002756A Pending JP2024041901A (ja) | 2021-07-01 | 2024-01-11 | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4365293A1 (ja) |
JP (3) | JP7425452B2 (ja) |
KR (1) | KR20240026999A (ja) |
CN (1) | CN117716035A (ja) |
AU (1) | AU2022305377A1 (ja) |
CA (1) | CA3224497A1 (ja) |
TW (1) | TW202317611A (ja) |
WO (1) | WO2023277142A1 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030003104A1 (en) * | 2001-07-02 | 2003-01-02 | John Mottola | Method for removal of pathogens from a localized environment |
WO2014142084A1 (ja) * | 2013-03-11 | 2014-09-18 | 学校法人関西文理総合学園 | モノクローナルIgA抗体の製造方法 |
JP2017001987A (ja) * | 2015-06-11 | 2017-01-05 | 学校法人関西文理総合学園 | ポリペプチド |
-
2022
- 2022-06-30 CN CN202280046162.1A patent/CN117716035A/zh active Pending
- 2022-06-30 TW TW111124616A patent/TW202317611A/zh unknown
- 2022-06-30 WO PCT/JP2022/026277 patent/WO2023277142A1/ja active Application Filing
- 2022-06-30 AU AU2022305377A patent/AU2022305377A1/en active Pending
- 2022-06-30 JP JP2022566303A patent/JP7425452B2/ja active Active
- 2022-06-30 KR KR1020247001366A patent/KR20240026999A/ko unknown
- 2022-06-30 EP EP22833288.8A patent/EP4365293A1/en active Pending
- 2022-06-30 CA CA3224497A patent/CA3224497A1/en active Pending
-
2023
- 2023-06-29 JP JP2023107219A patent/JP7405386B2/ja active Active
-
2024
- 2024-01-11 JP JP2024002756A patent/JP2024041901A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030003104A1 (en) * | 2001-07-02 | 2003-01-02 | John Mottola | Method for removal of pathogens from a localized environment |
WO2014142084A1 (ja) * | 2013-03-11 | 2014-09-18 | 学校法人関西文理総合学園 | モノクローナルIgA抗体の製造方法 |
JP2017001987A (ja) * | 2015-06-11 | 2017-01-05 | 学校法人関西文理総合学園 | ポリペプチド |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
NATURE MICROBIOLOGY, vol. 1, JPN6023033333, 2016, pages 16103, ISSN: 0005129484 * |
THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS, vol. 70, no. 1, JPN6023033334, 2017, pages 1 - 13, ISSN: 0005129483 * |
日本臨床免疫学会会誌, vol. 40, no. 6, JPN6023033335, 2017, pages 408 - 415, ISSN: 0005129482 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7405386B2 (ja) | 2023-12-26 |
JP7425452B2 (ja) | 2024-01-31 |
CN117716035A (zh) | 2024-03-15 |
CA3224497A1 (en) | 2023-01-05 |
KR20240026999A (ko) | 2024-02-29 |
JP2024041901A (ja) | 2024-03-27 |
EP4365293A1 (en) | 2024-05-08 |
TW202317611A (zh) | 2023-05-01 |
AU2022305377A1 (en) | 2024-02-15 |
WO2023277142A1 (ja) | 2023-01-05 |
JPWO2023277142A1 (ja) | 2023-01-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5916946B2 (ja) | モノクローナルIgA抗体の製造方法 | |
TWI502068B (zh) | 革蘭氏陽性菌特異性結合的化合物 | |
US11359021B2 (en) | PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
US11746150B2 (en) | Anti-LRP5/6 antibodies and methods of use | |
KR20120128687A (ko) | 녹농균의 혈청형 g 지질다당류에 대한 항체 | |
KR20160117467A (ko) | 이. 콜라이 특이성 항체 서열 | |
US10316079B2 (en) | Monoclonal antibody against muramyl peptides | |
TW202035455A (zh) | 抗ox40抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
WO2023277142A1 (ja) | クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体 | |
WO2023277166A1 (ja) | クロストリジウム・ディフィシル菌の増殖を抑制するためのモノクローナル抗体含有組成物 | |
WO2023054726A1 (ja) | モノクローナル抗体含有組成物 | |
WO2023219175A1 (ja) | 炎症性腸疾患(ibd)を治療または診断する方法および組成物 | |
TW202102546A (zh) | 密蛋白抗體及其應用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230629 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230629 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230721 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20230721 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230815 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230912 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231010 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231027 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231114 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231206 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7405386 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |