JP2023118050A - 脳癌又は脳転移の予防及び治療のための薬物負荷型メソ多孔質シリカナノ粒子 - Google Patents

脳癌又は脳転移の予防及び治療のための薬物負荷型メソ多孔質シリカナノ粒子 Download PDF

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Abstract

【課題】脳癌又は脳転移の予防及び治療のための薬物負荷型メソ多孔質シリカナノ粒子を提供する。【解決手段】本開示は、タキサン系化学療法薬、詳細にはパクリタキセル（ＰＴＸ）、カバジタキセル（ＣＴＸ）又はドセタキセル（ＤＴＸ）を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ）によって脳癌又は脳転移を予防又は治療する方法、及びＰＴＸ、ＣＴＸ又はＤＴＸを負荷したＭＳＮに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、タキサン系化学療法薬、例えば、パクリタキセル（ＰＴＸ）、カバジタキセル（ＣＴＸ）又はドセタキセル（ＤＴＸ）を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ）によって脳癌又は脳転移を予防又は治療する方法に関し、また、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＣＴＸ又はＤＴＸを負荷したＭＳＮ、及びその適用にも関する。
癌は、世界の主な死亡原因であり、ＷＨＯの記録によれば、２０２０年には１０００万近くの死亡例を成している。死亡を引き起こし得る癌は様々であり、脳癌の発生率は最も高いというわけではないものの、脳癌は、最も厄介であり得る。ヒト脳は生命の多くの側面を支配しており、腫瘍の治療という点に着眼したとき、薬物を含め、多くの化学物質が血液脳関門（ＢＢＢ）、詳細には血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）を透過できず、ひいては治療機能を提供することができない。
科学者及び医師は、脳癌の治療に有望な薬物を探し出すことに多大な努力を払ってきた。例としては、テモゾロミド（ＴＭＺ）、ベルズチファン、カルムスチン、エベロリムス、及びロムスチンが挙げられ、これらは、ＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢを透過して脳腫瘍の部位に到達することができると考えられている。ＴＭＺは、１０年超にわたって神経膠腫治療の第一選択化学療法薬となっている。しかしながら、ＴＭＺは、ある種の患者には禁忌となることもあり、又はＴＭＺに薬物耐性を示す患者では有効性が乏しいこともある。それ故、脳癌治療の新規治療ストラテジーを開発することが、なおも必要とされている。
別の問題は転移性脳癌であり、これは原発性脳癌よりも多くの死亡を引き起こす可能性がある。脳転移患者では死亡率が高い。肺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌等、よく見られる多くの癌は、特に脳への転移を起こし易い（ｒｅｎｄｅｒｉｎｇ）。原発性癌が脳内に転移した後は、患者／医師にとって限られた選択肢として外科手術及び放射線照射が採用され得るが、これらはいずれも特に有効というわけではない。外科手術及び放射線照射の他には、これまでのところ、なおもＴＭＺが、転移性脳癌を治療する唯一の薬物であり得る。
薬物送達システムの使用は、対象に薬物を送達するための一層効率的で有効な正攻法であり得る。脳癌又は脳転移の治療には、薬物送達システムとして、小胞（脂質、ミセル、ポリマー又はエキソソーム）、線状ポリマー、金属（Ａｕ、Ｇｄ、グラフェン）、カーボンドット、ナノインプラント、デンドリマー等が適用され得る。例えば、メソ多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ）は、大きい細孔容積、化学的／熱的安定性、高負荷容量、調整可能な表面特性及び優れた生体適合性など、そのユニークな物理的／化学的特性のため、薬物送達システムとして大きな可能性があると見なされている。それにも関わらず、脳癌の治療に有用な既存の薬物送達システムはないように見え、従って、脳癌の治療に有望な薬物を負荷した薬物送達システム、例えば、最適化されたＭＳＮの開発がなおも必要とされている。
本開示は、対象の脳癌又は脳転移を予防又は治療する方法であって、タキサン系化学療法薬、例えば、パクリタキセル（ＰＴＸ）、カバジタキセル（ＣＴＸ）又はドセタキセル（ＤＴＸ）を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子を対象に静脈内投与することを含む方法に関する。詳細には、メソ多孔質シリカナノ粒子は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
（ａ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾であって、（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比が６０：１～４：１の範囲である、表面修飾；
（ｂ）末端ヒドロカルビル部分による細孔表面修飾；
（ｃ）ＴＥＭで測定して、６０ｎｍ以下の平均粒径；
（ｄ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて動的光散乱法で測定して、６０ｎｍ以下の平均動的光散乱粒径；及び
（ｅ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾。
本開示はまた、カバジタキセル（ＣＴＸ）を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子にも関し、ここでメソ多孔質シリカナノ粒子は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
（ａ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾であって、（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比が６０：１～４：１の範囲である、表面修飾；
（ｂ）末端ヒドロカルビル部分による細孔表面修飾；
（ｃ）ＴＥＭで測定して、６０ｎｍ以下の平均粒径；
（ｄ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて動的光散乱法で測定して、６０ｎｍ以下の平均動的光散乱粒径；及び
（ｅ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾。
本開示はまた、ドセタキセル（ＤＴＸ）を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子にも関し、ここでメソ多孔質シリカナノ粒子は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
（ａ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾であって、（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比が６０：１～４：１の範囲である、表面修飾；
（ｂ）末端ヒドロカルビル部分による細孔表面修飾；
（ｃ）ＴＥＭで測定して、６０ｎｍ以下の平均粒径；
（ｄ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて動的光散乱法で測定して、６０ｎｍ以下の平均動的光散乱粒径；及び
（ｅ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾。
本開示はまた、パクリタキセル（ＰＴＸ）を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子にも関し、ここでメソ多孔質シリカナノ粒子は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
（ａ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾であって、（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比が６０：１～４：１の範囲である、表面修飾；
（ｂ）末端ヒドロカルビル部分による細孔表面修飾；
（ｃ）ＴＥＭで測定して、６０ｎｍ以下の平均粒径；
（ｄ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて動的光散乱法で測定して、６０ｎｍ以下の平均動的光散乱粒径；及び
（ｅ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾。
蛍光標識したＭＳＮを注射したマウスのうちの１匹の正常脳領域及び脳腫瘍領域の蛍光染色像を示す。 同所性ＴＭＺ耐性脳腫瘍マウスモデルにおけるＤＴＸ及びＤＴＸ＠ＭＳＮの実験詳細及び結果を示す。 それぞれ、ＰＢＳ（対照）、ＤＴＸ（５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＴＸ＠ＭＳＮ（５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）を注射したマウスの脳組織のＨ＆Ｅ染色を示す。 同所性ＴＭＺ耐性脳腫瘍マウスモデル（ｍｏｄｅ）でマウスの治療にＴＭＺと組み合わせたＤＴＸ又はＤＴＸ＠ＭＳＮを使用した実験詳細及び結果を示す。 同所性ＴＭＺ耐性脳腫瘍マウスモデル（ｍｏｄｅ）でマウスの治療にＴＭＺと組み合わせたＣＴＸ又はＣＴＸ＠ＭＳＮを使用した実験詳細及び結果を示す。
本開示の理解を容易にするため、本明細書で使用されるとおりの用語を以下に定義する。
本明細書及び特許請求の範囲の文脈において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」などの単数形は、特に具体的に指示されない限り複数の指示対象を含み、及び逆もまた同様である。特に指定されない限り、本明細書に提供されるいずれの例又は例示的文言（例えば、「など」）も、本発明の範囲を限定するのでなく、単に本発明をうまく説明するために使用されるに過ぎない。
本明細書に記載されるいずれの数値範囲も、そこに含まれるあらゆる部分的範囲を含むことが意図されると理解されるべきである。例えば、「５０～７０℃」の範囲には、指定される５０℃の最小値と指定される７０℃の最大値との間（端点を含む）にあるあらゆる部分的範囲及び具体的な値、例えば、５８℃～６７℃、及び５３℃～６２℃、６０℃又は６８℃が含まれる。開示される数値範囲は連続しているため、それは最小値と最大値との間にある各数値を含む。特に指定されない限り、本明細書に指示される様々な数値範囲は近似値である。
本発明において、用語「約」は、一部には、その値をどのように測定又は決定するかに依存する、当業者が測定した、所与の値の許容される偏差を指す。
本発明において、詳細に指定されない限り、接頭語「ナノ」は、本明細書で使用されるとき、約３００ｎｍ以下のサイズを意味する。詳細に指定されない限り、接頭語「メソ」は、本明細書で使用されるとき、ＩＵＰＡＣによって提案される定義と異なり、約５０ｎｍ以下のサイズを意味する。特定の実施形態では、接頭語「メソ」は、約、例えば、２０ｎｍ以下、１０ｎｍ以下又は５ｎｍ以下の更に小さいサイズを指し得る。
本発明において、用語「シラン」は、本明細書で使用されるとき、ＳｉＨ４の誘導体を指す。通常、４個の水素のうちの少なくとも１つが、以下に記載するとおりアルキル、アルコキシル、アミノ等の置換基に置き換えられている。用語「アルコキシシラン」は、本明細書で使用されるとき、ケイ素原子に直接結合した少なくとも１つのアルコキシル置換基を有するシランを指す。用語「有機アルコキシシラン」は、本明細書で使用されるとき、ケイ素原子に直接結合した少なくとも１つのアルコキシル置換基と少なくとも１つのヒドロカルビル置換基とを有するシランを指す。用語「ケイ酸塩源」は、本明細書で使用されるとき、オルトケイ酸の塩形態又はエステル形態と見なすことのできる物質、例えば、オルトケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、オルトケイ酸テトラエチル（テトラエトキシシラン、ＴＥＯＳ）、オルトケイ酸テトラメチル、又はオルトケイ酸テトラプロピルを指す。任意選択で、ヒドロカルビル置換基は更に置換されているか、又はヘテロ原子が割り込んでいてもよい。
本発明において、用語「ヒドロカルビル」は、本明細書で使用されるとき、炭化水素から誘導される一価の基を指す。用語「炭化水素」は、本明細書で使用されるとき、炭素原子及び水素原子のみからなる分子を指す。炭化水素の例としては、限定はされないが、（シクロ）アルカン類、（シクロ）アルケン類、アルカジエン類、芳香族等が挙げられる。上述のとおりヒドロカルビルが更に置換されているとき、置換基は、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基等であってもよい。上述のとおりヒドロカルビルにヘテロ原子が割り込んでいるとき、ヘテロ原子は、Ｓ、Ｏ又はＮであってもよい。本発明において、ヒドロカルビルは好ましくは、１～３０個のＣ原子を含む。
本発明において、用語「アルキル」は、好ましくは１～３０個の炭素原子、及びより好ましくは１～２０個の炭素原子を含む飽和型の直鎖又は分枝状アルキルを指す。アルキルの例としては、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、２－エチルブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、１－メチルペンチル、１，３－ジメチルブチル、ｎ－ヘキシル、１－メチルヘキシル、ｎ－ヘプチル、イソヘプチル、１，１，３，３－テトラメチルブチル、１－メチルヘプチル、３－メチルヘプチル、ｎ－オクチル、２－エチルヘキシル、１，１，３－トリメチルヘキシル、１，１，３，３－テトラメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、１－メチルウンデシル、ドデシル、１，１，３，３，５，５－ヘキサメチルヘキシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、又はオクタデシルなどが挙げられる。
本発明において、用語「アルキレン」は、上述のとおりのアルキルの二価の基を指す。用語「短鎖」は、その基又は繰り返し単位が主鎖に多くても６個の炭素原子、好ましくは多くても４個の炭素原子しか含まないことを表す。
本発明において、用語「アルコキシル」又は「アルコキシ」は、本明細書で使用されるとき、式「－Ｏ－アルキル」を有する基を意味し、ここで前記式中の「アルキル」の定義は、前述のとおりの「アルキル」の意味を有する。
本発明において、用語「シクロアルキル」は、本明細書で使用されるとき、３～１０個の環炭素原子及びより好ましくは３～８個の環炭素原子を含む、及び任意選択で環上にアルキル置換基を含む飽和又は部分不飽和環状炭素基を意味する。シクロアルキルの例としては、限定はされないが、シクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、２－シクロヘキセン－１－イルなどが挙げられる。
本発明において、用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を表す。
本発明において、用語「アミノ」は、本明細書で使用されるとき、式－ＮＲ１Ｒ２の官能基（式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素又は上記に定義するとおりのヒドロカルビル基を表す）を意味する。
本発明において、表現「内表面」は、細孔を画成する「壁」の表面を指し、表現「外表面」は、ナノ粒子の最も外側にある層、壁又は構造の表面を指す。
本発明において、用語「治療用薬剤」は、本明細書で使用されるとき、生物において治療効果のある物質を指す。治療用原料の例としては、限定はされないが、小分子薬物、酵素及びタンパク質薬物などのタンパク質、抗体、ワクチン、抗生物質又はヌクレオチド薬物が挙げられる。
本発明において、用語「タキサン系化学療法薬」、又は同義的に「タキサン系化学療法剤」は、本明細書で使用されるとき、タキサンのコア構造又はタキサンから誘導（脱水素化など）されたコア構造を有する化学的及び治療的に活性のある化合物を指す。タキサン系化学療法薬／タキサン系化学療法剤の例としては、限定はされないが、パクリタキセル（ＰＴＸ）、カバジタキセル（ＣＴＸ）及びドセタキセル（ＤＴＸ）が挙げられる。
脳癌又は脳転移
脳癌は、近年の診断及び治療モダリティの大きな進歩にもかかわらず、再発率が高く、転帰が致死的であるため、壊滅的な疾患である。脳癌は、脳から発生するか（原発性脳腫瘍）、又は別の身体部位から脳に広がるか（転移性腫瘍）のいずれかであり得る。原発性及び転移性脳癌患者の予後は、概して不良である。外科手術、放射線照射、化学療法、及びこれらの組み合わせを含めた治療の開始後の生存期間中央値は、１年未満である。例えば、原発性脳癌の一形態である膠芽腫は、ＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢがなおもインタクトでありながら、腫瘍周囲領域内に再発し得る。このことは、残存する浸潤癌細胞を消し去ろうとする化学療法薬の有効性を著しく制限する。テモゾロミド（ＴＭＺ）は、高悪性度神経膠腫である膠芽腫（ＧＢＭ）の治療における第一選択の化学療法剤である。残念ながら、５０％を超えるＧＢＭ患者がＴＭＺ療法に反応しない。ＴＭＺ耐性は、多くの場合に有効な治療の制限因子となり、ほぼ全ての患者が病勢進行を経験する。ＧＢＭ及びＴＭＺ不応性ＧＢＭ治療に有効な化学療法が切に必要とされている。現在までのところ、脳癌の治療には、僅か数種の薬物が承認されているに過ぎない。加えて、患者が罹患しているのが原発性脳腫瘍以外の癌であったとしても、その癌はなおも脳に広がり得る。脳転移を引き起こす可能性が最も高いものは、肺、乳房、前立腺、結腸、腎臓、黒色腫、及び甲状腺の癌腫又は癌である。転移性脳癌の発生率は原発性脳癌の５倍であり、３つの最もよく見られる転移性癌は、肺癌（患者の２０～５６％）、乳癌（５～２０％）、及び黒色腫（７～１６％）である。一たび腫瘍が脳に転移すると、外科手術も放射線療法も特に有効でなく、患者の生存確率は急激に下がる（全生存中央値は６ヵ月である）。全身化学療法が、脳転移に対する治療選択肢であるが、従来の化学療法剤は、ＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢに起因して、有効性が限られている。多くの化学療法剤の侵入を阻むＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢの問題に取り組むことは、かなりの程度まで、脳腫瘍細胞が本質的にそれに耐性を示すかどうかを考察するよりも一層重要であると言える。
ＢＢＢは、中枢神経系における生命に不可欠な生理学的関門であり、循環血液から脳内へのイオン及び分子の移動を制限して脳を侵入病原体及び毒物から保護する。しかしながら、ＢＢＢはまた、脳疾患の治療という点では、多くの薬物がＢＢＢの妨害を受けることになるため難題でもある。脳癌の治療に際しては、ＢＢＴＢの通過という問題について特別に考慮しなければならない。ＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢを克服するための既存の方法は、なおも限られている。例えば、ＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢを通過するための選択肢として、官能化された表面を持つ小径の万能ナノ粒子を考えることができる；しかしながら、ナノ粒子のそうした多様な特徴がＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢの透過の制御に及ぼす効果は、いまだ明らかになっていない。
意外にも、本発明者らは、特別な特徴を備えるＭＳＮが、化学療法薬を脳の主腫瘍及び腫瘍周囲領域に有効に送達し得ることを見出した。ＭＳＮを使用してＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢを通過し、脳腫瘍又はＣＮＳ疾患を治療するには、ナノ粒子の粒径（粒子直径（ＴＥＭ）及び流体力学直径（ＤＬＳ））及び表面特性（電荷、官能基等）の微調整が決定的に重要であると判明している。本発明において、本発明者は、細孔の特異的な内表面修飾及び粒子の最適化した表面修飾を有するＭＳＮが、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＤＴＸ及びＣＴＸの優れた負荷能力、緩衝液又は生理的条件での良好な分散度、及び保存又は生理的条件での良好な安定性を呈し、それらを、ＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢの透過、脳癌、及び脳転移治療に用い得ることを開示する。加えて、薬物負荷型ＭＳＮは、癌転移を予防し、阻害し、又は抑制する独自の抗細胞遊走活性を呈し得るため、転移性脳癌治療の新規治療法を提供することができる。一実施形態において、薬物を負荷したＭＳＮは、脳癌又は脳転移の予防又は治療に使用することができる。一実施形態において、薬物を負荷したＭＳＮは、単一の形態の脳癌、単一の形態の脳転移、複数の形態の脳癌、複数の形態の脳転移又はこれらの任意の組み合わせの予防又は治療に使用することができる。一実施形態において、薬物を負荷したＭＳＮは、単一の形態の脳転移の予防又は治療に使用することができる。一実施形態において、薬物を負荷したＭＳＮは、複数の形態の脳癌の予防又は治療に使用することができる。一実施形態において、薬物を負荷したＭＳＮは、複数の形態の脳転移の予防又は治療に使用することができる。一実施形態において、薬物を負荷したＭＳＮは、複数の形態の脳癌、複数の形態の脳転移又はこれらの組み合わせの予防又は治療に使用することができる。
一実施形態において、脳癌は、例えば、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が、例えば、２０２１年公開のウェブサイトページ「Ｄｒｕｇｓ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ」に公表している情報に指示されるとおりの、既存の薬物に耐性を示す。一実施形態において、脳癌は、テモゾロミド（ＴＭＺ）、ベバシズマブ、ベルズチファン、カルムスチン、エベロリムス、ロムスチン及びナキシタマブ－ｇｑｇｋからなる群から選択される薬物に耐性を示す。
タキサン系化学療法薬；パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）及びカバジタキセル（ＣＴＸ）
本明細書で考察するとおり、脳癌を有する特定の患者は、既存の薬物（ＴＭＺなど）では有効に治療されない恐れがあり、これは、急速に発生する薬物耐性によって臨床における既存の薬物の有用性が制限されるためである。ＰＴＸ、ＤＴＸ及びＣＴＸは、インビトロでは神経膠腫細胞に対して有効であり得るが、臨床試験では活性を示さず、又はごく僅かな活性があるに過ぎない。上記に指摘した問題の解消に向けて、本発明者らは、脳癌の治療に有望な３つの薬物：ＰＴＸ、ＤＴＸ及びＣＴＸに注目した。
よく使用される化学療法薬、ＰＴＸは、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、及びＡＩＤＳ関連カポジ肉腫の治療に承認されているが、脳癌の治療には販売承認が下りていない。ＰＴＸは、多剤耐性タンパク質ｐ－糖タンパク質（ｐ－ｇｐ）の基質であり、ｐ－ｇｐは、ある種の癌細胞及び脳内皮細胞に多量に発現するもので、排出ポンプとして作用することにより、腫瘍又は脳における薬物の蓄積防止に関与している。脳腫瘍におけるＰＴＸの透過効率の低さ及び蓄積に起因して、臨床試験では再発悪性膠芽腫における有効性は全く又は限定的にしか得られない。ドセタキセルは、乳癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃腺癌、及び頭頸部癌の治療に承認されているが、脳癌の治療には承認が下りていない。
加えて、ＤＴＸは、インビトロでは神経膠腫細胞の増殖の有効な阻害を呈することが認められているが、これは低い固有の血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）透過性及びオフターゲット細胞傷害効果を呈し、そのため臨床試験では、再発悪性膠芽腫に対する治療の成功につながったことはなく、又は成功は著しく限られている。
それ故、脳腫瘍を治療するためＰＴＸ又はＤＴＸを効率的且つ有効に送達する技術の開発がなおも必要とされている。
他方で、ＣＴＸは転移性去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）の治療に承認されているが、脳癌の治療には承認が下りていない。ＣＴＸは、そのメチル基修飾のためＰ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）に対する親和性が低下し、パクリタキセル又はドセタキセル耐性癌の治療に使用されている。加えて、ＣＴＸは血液脳関門を通過する可能性があり得る。最近の研究では、ＴＭＺ不応性膠芽腫（ＧＢＭ）患者にＣＴＸを適用しても、限られた治療有効性しか呈しないことが示されている。
上述のとおり、ＰＴＸ及びＤＴＸは、目下の実験結果に基づけば再発悪性膠芽腫に対して効果がなく、ＣＴＸは限られた有効性しか呈しないことが分かっているが、それでもなお、血液脳関門（ＢＢＢ）又は血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）を通過するという問題を克服できれば、これらは脳癌の治療に有望であり得る。ＰＴＸ、ＤＴＸ及びＣＴＸは水溶解度が低く、その製剤中に界面活性剤（例えばクレモフォールＥＬ、ポリソルベート８０）が含まれることは、幾つもの全身性の有害反応（例えば、過敏症、非アレルギー性アナフィラキシー、発疹）に関係があるとされており、そのため使用前に面倒な多段階希釈手順が必要となる。
タキサン系化学療法薬を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ）
脳癌の治療のためＭＳＮ又は他のナノ送達システムに薬物、詳細にはタキサン系化学療法薬を負荷することに関しては、限られた開示しかない。その中に、脳癌の治療用に開発されたＰＴＸ、ＤＴＸ及びＣＴＸ静脈内注射用ナノ製剤が少数あり、動物試験でそれらが呈する有効性の程度は様々である。例えば、ＰＴＸを負荷したポリマーミセル／ナノ粒子（例えば、デキストランベース）、ＰＬＧＡコートＭＳＮ、及び脂質コートＭＳＮ、及びＤＴＸを負荷したポリマーミセル／ナノ粒子（例えば、ＰＬＡ－ＰＥＧ、ＰＬＧＡ－ＰＥＧナノ粒子）、固形脂質ナノ粒子及びアルブミン－脂質ナノ粒子、並びにＣＴＸを負荷したポリマーナノ粒子及びリポソームがインビボ脳腫瘍動物モデル試験で使用されたが、一方で、ＰＴＸ負荷型、ＤＴＸ負荷型及びＣＴＸ負荷型ＭＳＮを含め、脳癌の治療用のタキサン系化学療法薬に関して行われた研究は限られているように見える。上述のとおり、多くのナノ粒子では、粒子の流体力学的粒径（水性媒体又は生理的媒体中で測定する）が１００ｎｍを超え、ターゲティングリガンドがＢＢＢ／ＢＢＴＢの透過を促進する必要があり得る。しかしながら、そうしたナノ粒子又はナノ製剤には、有効性に影響を及ぼし得る問題があり得る。詳細には、流体力学的粒径が大きい粒子ほど、効率の低い又は非効率なＢＢＢ／ＢＢＴＢの通過を呈し得る。更に、生体液への曝露時、ナノ粒子の外表面に血清タンパク質が吸着するため、それによって生体分子層が形成され、新規の物理化学的アイデンティティ、即ち、いわゆる「タンパク質コロナ」につながり得る。加えて、外表面上にターゲティングリガンドを有するナノ粒子であれば、よく見られる単にペグ化修飾で遮蔽されているに過ぎないナノ粒子と比べると、表面上にタンパク質を一層容易に引き付けることになり得る。ナノ粒子を取り囲むこの生体分子層（コロナ層）は、ナノ粒子の表面上にあるターゲティング分子を妨害し、更には凝塊形成及びオプソニン化の亢進までも引き起こし得るため、誤ったターゲティング又は肝臓、腎臓、若しくは脾臓による意図せぬスカベンジ作用につながり、従って望ましくない副作用の可能性又は治療有効性の低下を呈することになり得る。上述のとおり、流体力学的粒径が大きい、表面上にターゲティングリガンドがあるナノ製剤は障害に直面し、ひいては脳癌治療における有効性が不十分であるか、又はほとんどないことにつながり、実験台からインビボ又は臨床適用への移行は不成功となり得る。実際、現在までのところ、これらのうち市場で承認されたものは１つもない。
問題を回避し、又は解決するため、本発明者らは、ある種の表面修飾によってＭＳＮが、ＥＰＲ効果及びＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢ透過特性など、所望の薬理学的効果を提供する可能性があってよく、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＤＴＸ及びＣＴＸの負荷に使用することができると推論した。具体的には、タキサン系化学療法薬、例えば、ＤＴＸのメソ多孔質シリカナノ製剤、注射用懸濁液（ＤＴＸ＠ＭＳＮ）は、限定はされないが、（１）現行のＤＴＸ製剤の臨床使用における多くの全身性有害反応に関係があるとされている界面活性剤を使用しないＤＴＸ「溶解度」の亢進；（２）薬物関連有害作用の低減；（３）ＤＴＸのＢＢＴＢ透過及び腫瘍ターゲティング能力の増加を含め、複数の利益を提供する；このようにＤＴＸ＠ＭＳＮは、悪性多形性膠芽腫患者の寛解及び生存を延長することができる。本発明では、薬物を負荷するために様々なＭＳＮを使用することができる。ＭＳＮはまた、種々の表面官能基で修飾することにより、その生体適合性を向上させ、種々の目的に合わせた設計を行うこともできる。例えば、本発明者らは、（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾、及び末端ヒドロカルビル部分による細孔内表面修飾を有するＭＳＮを使用して、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＣＴＸ又はＤＴＸを負荷する。一実施形態において、特異的表面修飾（例えばペグ化、正電荷修飾等）を有するＭＳＮは、生理水溶液中でより小さい粒径、特により小さい流体力学的粒径を呈し、及びカスタマイズされた表面電荷を呈し、これによりタンパク質コロナの吸着が減少し、循環時間及び脳腫瘍ターゲティング能力が延長されることにより、脳癌の治療の有効性が亢進し得る。これとの関連において、特許請求される本発明で使用されるＭＳＮは、脳癌又は腫瘍に対する「ターゲティングリガンド」、又は細胞膜上の受容体等を何ら有しない。ターゲティングリガンドとしては、限定はされないが、ターゲティングペプチド、ターゲティングヌクレオチド、ターゲティングタンパク質、ターゲティング抗体、ターゲティング抗原等が挙げられる。
有機分子、オリゴマー又はポリマー（ｉ）の例としては、限定はされないが、短鎖ポリ（アルキレングリコール）（ＰＡＧ）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ＰＥＧ－ＰＰＧ共重合体等が挙げられる。更なる（有機）修飾剤を導入して、ＭＳＮの特性（例えば、表面特性等）を修飾することができる；その例としては、限定はされないが、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、クロロメチルトリメトキシシラン、エチルトリアセトキシシラン（ＥＴＡＳ）、Ｎ－（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡＳ）、メチルホスホン酸（３－トリヒドロキシシリル）プロピル（ＴＨＰＭＰ）、メチルトリアセトキシシラン（ＭＴＡＳ）、（３－メルカプトプロピル（ｍｅｒｃａｔｏｐｒｏｐｙｌ））トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、双性イオンシラン等が挙げられる。
正電荷分子、オリゴマー又はポリマー（ｉｉ）の例としては、限定はされないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；アルコキシシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミン、例えば、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＴＡ）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（ＥＤＰＴＭＳ）、Ｎ１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン等；有機アルコキシシラン、例えば、３－アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、３－アミノプロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。
特定の場合には、表面修飾を作る際に、有機分子、オリゴマー又はポリマー（ｉ）よりも短い長さの正電荷分子、オリゴマー又はポリマー（ｉｉ）を使用することが必要になる可能性があり、これは、非標的に対する非特異的結合を減少させると考えられる。
末端ヒドロカルビル部分の例としては、限定はされないが、末端芳香族部分、末端（シクロ）脂肪族部分又はこれらの組み合わせが挙げられる。表現「末端」とは、ヒドロカルビル部分がシリカナノ粒子のケイ素原子に直接連結していることを含意する。一部の実施形態において、末端芳香族部分は、低級アルキル、又はハロゲンで置換されている。更なる実施形態において、末端芳香族部分は、トリメトキシフェニルシラン（ＴＭＰＳ）から誘導される。一部の実施形態において、末端（シクロ）脂肪族部分は、任意選択で低級アルキル又はハロゲンで置換されていてもよい、（シクロ）アルキル、（シクロ）アルケニル又はこれらの組み合わせを含む。一実施形態において、末端脂肪族部分は、限定はされないが、ブチルトリメトキシシラン、ブチルトリエトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、ヘキシルトリエトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、オクチルトリエトキシシラン、イソ－オクチルトリメトキシシラン、イソ－オクチルトリエトキシシラン、デシルトリメトキシシラン（ｄｅｘｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、デシルトリエトキシシラン（ｄｅｘｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ドデシルトリメトキシシラン（ｄｏｄｅｘｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ドデシルトリエトキシシラン（ｄｏｄｅｘｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、テトラデシルトリメトキシシラン、テトラデシルトリエトキシシラン、ヘキサデシルトリメトキシシラン、ヘキサデシルトリエトキシシラン（ｈａｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、オクタデシルトリメトキシシラン、及びオクタデシルトリエトキシシラン、好ましくはトリメトキシＣ６～８アルキルシランが挙げられる、４～１８個の炭素原子を有する長鎖アルキルシランから誘導される。
本発明者らは、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＣＴＸ又はＤＴＸをＭＳＮに負荷するとき、ある種の問題が好ましくは解決されるべきであることを見出した。例えば、上記に指摘した（ｉ）及び（ｉｉ）による表面修飾が多過ぎれば、負荷効率に深刻な影響が及ぶことになり得る。別の課題があるとすれば、末端ヒドロカルビル部分の細孔内部修飾を有するナノ粒子の懸濁性及び安定性であろう。ひいては本発明者らは、意外にも、上記に指摘した（ｉ）及び（ｉｉ）による表面修飾を有し、（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比が６０：１～４：１、例えば、５５：１～４．５：１、５０：１～５：１、４５：１～５．５：１、４０：１～５．５：１、３５：１～５．５：１、３０：１～５．５：１、２５：１～５．５：１、２０：１～５．５：１、１５：１～５．５：１、１２．５：１～４．５：１、１０：１～５：１、８．５：１～５．５：１、７．５：１～６．５：１の範囲である、又は約７：１である、又は上述の端点からなる任意の数値範囲、例えば、５５：１～７：１、２０：１～６．５：１、４５：１～７：１等であるＭＳＮであれば、これらの問題が大幅に改善される可能性があることを見出した。（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比は、元素分析によるか、又はＭＳＮの調製に使用される試薬から決定することができる。加えて、本発明者らは、末端ヒドロカルビル部分（細孔表面上にある）の量が、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＤＴＸ又はＣＴＸの負荷効率を改善するのに十分に多くなければならないことを見出した。一実施形態において、細孔表面修飾は、末端ヒドロカルビル部分を有しないシラン及び少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシランを使用することによって実現してもよく、ここで末端ヒドロカルビル部分は、少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシランに由来する。一実施形態において、末端ヒドロカルビル部分を有しないシランと、少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシランとのモル比によって表されるＭＳＮの調製に使用される末端ヒドロカルビル部分の量は、少なくとも５０：１、又は少なくとも４０：１、少なくとも３５：１、少なくとも３０：１、少なくとも２５：１、少なくとも２０：１、少なくとも１５：１、少なくとも１０：１、少なくとも５：１又は上記に指摘した端点からなる任意の数値範囲内、例えば、５：１～５０：１、１５：１～５０：１、２０：１～４０：１等である。一実施形態では、計算及び／又は測定を行って、１粒子当たり少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシランの数を求めることができる。
具体的な一実施形態において、本発明者らは、ＭＳＮが、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＣＴＸ又はＤＴＸの負荷に使用されるとき、（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマーによる外表面修飾及び末端ヒドロカルビル部分による細孔内表面修飾を有し得るが、（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる外表面修飾はなくてもよく、この薬物負荷型ＭＳＮがなおも所望の特性を呈し得ることを見出した。
一実施形態において、本開示のメソ多孔質シリカナノ粒子は、ＴＥＭで測定して、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、又は２０ｎｍ以下の平均粒径を有する。一実施形態において、本開示のメソ多孔質シリカナノ粒子は、５０ｎｍ以下、４５ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３５ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２５ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、又は３ｎｍ以下、又は上記に指摘した端点からなる任意の数値範囲、例えば、３ｎｍ～５０ｎｍ、５ｎｍ～３５ｎｍ、１０ｎｍ～４５ｎｍ等の細孔径を有する。一実施形態において、本開示のメソ多孔質シリカナノ粒子は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて動的光散乱法で測定して、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、又は３０ｎｍ以下の平均動的光散乱粒径を有する。この理論に拘束されないが、（薬物負荷した）メソ多孔質シリカナノ粒子のＰＢＳ中での平均ＤＬＳ径が６０ｎｍ以下であれば、ナノ製剤の静脈内投与及びＢＢＢ／ＢＢＴＢの透過の両方の助けになるであろう。
特定の実施形態において、ＭＳＮのゼータ電位（ｐＨ７．４条件での）は、－２２～＋２５ｍＶ、－２０～＋２０ｍＶ、－１５～＋１５ｍＶ、又は－１０～＋１０ｍＶの範囲、又は本明細書に挙げられる端点の範囲内にある合理的な数値範囲、例えば－１５～＋２０ｍＶ、－１０～＋２５ｍＶ、－１５～＋１０ｍＶ等であり得る。一実施形態において、メソ多孔質シリカナノ粒子は、ＢＥＴ表面積が１０００ｍ２／ｇ以下、７５０ｍ２／ｇ以下、又は５００ｍ２／ｇ以下又は２５０ｍ２／ｇ以下である。
一実施形態において、タキサン系化学療法薬は、パクリタキセル（ＰＴＸ）、カバジタキセル（ＣＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一実施形態において、タキサン系化学療法薬は、ＣＴＸ、ＤＴＸ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態において、タキサン系化学療法薬は、ＰＴＸ、ＣＴＸ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態において、タキサン系化学療法薬は、ＰＴＸ、ＤＴＸ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態において、タキサン系化学療法薬はＤＴＸである。一実施形態において、タキサン系化学療法薬はＰＴＸである。一実施形態において、タキサン系化学療法薬はＣＴＸである。
メソ多孔質シリカナノ粒子は、以下の特徴：
（ａ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾であって、（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比が６０：１～４：１の範囲である、表面修飾；
（ｂ）末端ヒドロカルビル部分による細孔内表面修飾；
（ｃ）ＴＥＭで測定して、６０ｎｍ以下の平均粒径；
（ｄ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて動的光散乱法で測定して、６０ｎｍ以下の平均動的光散乱粒径；及び
（ｅ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾
のうちの少なくとも１つを有する。
一実施形態において、ＭＳＮは、特徴（ａ）及び（ｂ）；特徴（ｅ）及び（ｂ）；又は特徴（ｂ）及び（ｄ）を有し；好ましくは特徴（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を有し；好ましくは特徴（ｅ）、（ｂ）及び（ｃ）を有し；好ましくは特徴（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）を有し；好ましくは特徴（ｅ）、（ｂ）及び（ｄ）を有し；好ましくは特徴（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し；より好ましくは特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し；及びより好ましくは特徴（ｅ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有する。
タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＣＴＸ又はＤＴＸを負荷したＭＳＮであって、ＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢ透過能力を呈するＭＳＮは、脳関連の癌の治療に極めて有望な薬物送達システムであるという利点を示すことになる。本例に例示される全ての例、原料、反応条件又はパラメータは、単に例示を目的としているに過ぎず、材料又は調製方法について、本明細書に記載される例示的実施形態に限定する意図はない。
メソ多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ）は、十分に定義付けられた構造、及び広範囲の有機官能基で修飾することのできる高密度の表面シラノール基を備えている。種々の粒径のＭＳＮが、アンモニア塩基触媒法を用いて調製される。粒径は、アンモニア濃度、シラン源の量及び濃度、反応温度等を調整することによって制御される。
タキサン系化学療法薬（例えば、ＰＴＸ、ＤＴＸ又はＣＴＸ）の負荷に望ましいＭＳＮの特徴（例えば、負荷容量、分散度、及び安定性）に到達するため、本発明者らはクリティカル試行を行うことにより、限定はされないが、（１）シラン源及び内表面修飾剤を逐次的に加えるという概念の導入；具体的には、内表面修飾剤を導入した後にシラン源を加える；（２）シラン源／内表面修飾剤（内表面修飾）の比及び量の調整；（３）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子（外表面修飾）の比及び量の調整；及び（４）温度、加熱時間等を含めた水熱条件の調整を含め、ＭＳＮの合成手順を修正した。
この理論に拘束されないが、修正（１）及び（４）により、ＭＳＮの構造的ロバスト性及び水分散度／懸濁安定性が上昇し得る；修正（１）及び（２）により、薬物負荷能力及び粒子安定性が増加し得る；及び修正（３）により、水溶液中、詳細には生理的媒体中での粒子の分散度が向上し、及び例えば正電荷分子によって引き起こされる細孔閉塞（これは薬物負荷能力の低下につながり得る）が減少する。
本開示では、このように薬物は、ＭＳＮの外表面に取り付けるというよりむしろ、細孔内に負荷することができるため、薬物負荷の前後でＭＳＮのＤＬＳ径の有意な差がなくなる。要約すれば、本発明は、薬物負荷型ＭＳＮの小さい流体力学的径、良好な分散度、及び安定性（これらは全て、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＤＴＸ及びＣＴＸを負荷する担体としてのＭＳＮにとって、特に静脈内投与されるナノメディシンの適用において決定的に重要である）を提供することにより、既存のＭＳＮの予期せぬ欠陥を解消する。
一実施形態において、一晩（例えば、１５～２４時間）インキュベートした後の薬物負荷型ＭＳＮのＤＬＳ径の差（例えば、ＰＢＳ中３７℃で測定したもの）は、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満であることになり得る。
一態様において、ＭＳＮは、以下のステップ：（ａ）ミセルを形成するのに十分な濃度の界面活性剤を含有するアルカリ性溶液を提供するステップ；（ｂ）この溶液にシラン源を導入するステップ；（ｃ）この溶液に（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び任意選択で（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーを導入するステップ；（ｄ）この溶液に対して水熱処理を行うステップ；（ｅ）生成物を収集するステップ；（ｆ）生成物から残留する界面活性剤を除去するステップ；及び任意選択で（ｇ）生成物を精製又は清浄化するステップを含む方法で調製することができる。一実施形態において、本方法は、ステップ（ｂ）として、ステップ（ｂ－１）、少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するヒドロカルビル部分シランでシランを導入し、次にシラン源を導入するステップ、好ましくはステップ（ｂ－１－１）少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するヒドロカルビル部分シランによるシラン、シラン源の第１の部分及びシラン源の第２の部分を逐次的に導入するステップを含む。一実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ）として、ステップ（ｃ－１）、上記のステップ（ｃ）に指示される成分（ｉ）及び（ｉｉ）を導入するステップを含む。一実施形態において、本方法は、ステップ（ｄ）として、ステップ（ｄ－１）、溶液に対して第１の温度にて第１の時間及び第２の温度にて第２の時間で逐次的水熱処理を行うステップを含む。様々な実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）～（ｇ）；ステップ（ａ）、（ｂ－１）／（ｂ－１－１）、（ｃ）～（ｆ）；ステップ（ａ）、（ｂ－１）／（ｂ－１－１）、（ｃ）～（ｇ）；ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ－１）～（ｆ）；ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ－１）、（ｄ）～（ｇ）；ステップ（ａ）～（ｃ）、（ｄ－１）、（ｅ）、（ｆ）；ステップ（ａ）～（ｃ）、（ｄ－１）、（ｅ）～（ｇ）；ステップ（ａ）、（ｂ－１）／（ｂ－１－１）、（ｃ－１）、（ｄ）～（ｆ）；ステップ（ａ）、（ｂ－１）／（ｂ－１－１）、（ｃ－１）、（ｄ）～（ｇ）；ステップ（ａ）、（ｂ－１）／（ｂ－１－１）、（ｃ）、（ｄ－１）、（ｅ）、（ｆ）；ステップ（ａ）、（ｂ－１）／（ｂ－１－１）、（ｃ）、（ｄ－１）、（ｅ）～（ｇ）；ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ－１）、（ｄ－１）、（ｅ）、（ｆ）；ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ－１）、（ｄ－１）、（ｅ）～（ｇ）；ステップ（ａ）、（ｂ－１）／（ｂ－１－１）、（ｃ－１）、（ｄ－１）、（ｅ）、（ｆ）；又はステップ（ａ）、（ｂ－１）／（ｂ－１－１）、（ｃ－１）、（ｄ－１）、（ｅ）～（ｇ）を含む。
典型的には、密封したビーカー内にある所望の温度（４５～６５℃）の１５０～２５０ｍＬのアルカリ性水溶液（例えば、水酸化アンモニウム溶液（０．１～０．２５Ｍ））に、０．２～０．５ｇの界面活性剤を溶解させた。１０～３０分間撹拌した後、６０～５００μＬの溶媒（例えば、エタノールなどのアルコール）中の少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシラン１５～１３５μＬを加え、２０～６０分間撹拌した。この後、シール膜を取り外し、次にこの溶液に、撹拌下、好ましくは激しい撹拌下で０．８～３ｍＬの溶媒（例えば、エタノールなどのアルコール類）中の末端ヒドロカルビル部分を有しないシラン１５０～７５０μＬを加えた。０．５～１．５時間撹拌した後、０．４～２ｍＬの溶媒（例えば、エタノールなどのアルコール）中の更なる末端ヒドロカルビル部分を有しないシラン１００～５００μＬを加えた。２～４時間反応させた後、この反応液に、２．５～５．４ｍＬの溶媒（例えば、エタノールなどのアルコール類）中の８２５～１７００μＬのＰＥＧ－シラン（ＰＥＧ部分を有するシラン、例えば、（２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）６～９プロピル］－トリメトキシシラン））を０～４５５μＬ正電荷分子、オリゴマー又はポリマー（例えば、ＴＡ－シラン、（Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド））と共に導入した。次に任意選択で、０～５００μＬ ＥｔＯＨ中の更なる０～８５μＬ ＴＥＯＳを直ちに加えた。この混合物を０．５～１．５時間撹拌した後、それを所望の温度（例えば、４５～６５℃）で撹拌なしに少なくとも１２時間経時させた。次に、この溶液を密封し、オーブンに６５～７５℃で４０～６０時間置くか、又は６５～７５℃及び８５～９５℃で各２０～２８時間水熱処理した。合成したままの生成物を洗浄し、遠心又はクロスフローシステムによって収集した。ＭＳＮの細孔から界面活性剤を除去するため、合成したままの生成物を、酸（塩酸（３７％）など）を含有する４０～８５ｍＬの酸性溶媒（例えば、エタノールなどのアルコール類）中、５５～６５℃で０．５～１．５時間の抽出にわたってインキュベートし、このインキュベーションを１回又は数回行った。生成物を洗浄し、遠心又はクロスフローシステムによって回収し、最後に、好ましくは８５％以上のエタノール中に保存した。異なる官能基修飾ＭＳＮ－ＰＥＧ合成については、異なる正電荷分子、オリゴマー又はポリマー、例えば、ＴＡ－シラン、ＥＤＰＴＭＳ－シラン又は他の官能性シランなどを使用した。一例では、ＴＥＯＳ／オクチルトリエトキシシランのモル比は、５０：１～５：１、例えば、３５：１～８：１、３０：１、２０：１、１５：１、及び１０：１まで様々であり、及びＰＥＧ－シラン／ＴＡ－シランの比は、１８：１～４：１、例えば、１５：１、１０：１、７：１、４：１及びｎ：０（即ち、ＰＥＧのみ）まで様々であり、異なる修飾レベルが提供された。
一実施形態において、シラン源は、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、ケイ酸ナトリウム又はこれらの混合物を含む。表面修飾剤を使用して、ＭＳＮの特性を調整することができる。一実施形態において、（有機）修飾剤には、限定はされないが、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、ｎ－オクチルトリエトキシシラン、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、クロロメチルトリメトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシスチレンシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン（ＰＴＥＯＳ）、フェニルトリメトキシシラン（ＰＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリアセトキシシラン（ＥＴＡＳ）、Ｎ－（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡＳ）、メチルホスホン酸（３－トリヒドロキシシリル）プロピル（ＴＨＰＭＰ）、メチルトリアセトキシシラン（ＭＴＡＳ）、（３－メルカプトプロピル（ｍｅｒｃａｔｏｐｒｏｐｙｌ））トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、双性イオンシラン、（Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；アルコキシシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミン、又はアミノ基を有する有機アルコキシシラン等が含まれる。
ＭＳＮの調製に好適な界面活性剤の例としては、限定はされないが、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が挙げられる。適切な界面活性剤は、ｐＨ値、イオン強度、温度、反応物及び生成物等、反応条件に基づき選択される。カチオン性界面活性剤の例としては、限定はされないが、長鎖ヒドロカルビル基を有するｐＨ依存性第一級、第二級、又は第三級アミン類、この末端アミン基は特定のｐＨ値未満に存在するとき正電荷を帯びる、例えば、ｐＨ１０未満で正電荷となる第一級及び第二級アミン類、例えばオクテニジン二塩酸塩など；及び常時荷電している第四級アンモニウム塩、例えば、臭化セトリモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、及び臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＢ）が挙げられる。アニオン性界面活性剤の例としては、限定はされないが、硫酸塩、スルホン酸塩、及びリン酸塩又はエステル類；例えば、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＬＳ、又はＳＤＳ）、及び関連するアルキルエーテル硫酸塩、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム又はＳＬＥＳ）、及びミレス硫酸ナトリウム、ドキュセート（ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム）、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）、ペルフルオロブタンスルホン酸、アルキルアリールエーテルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩等が挙げられる。非イオン性界面活性剤の例としては、限定はされないが、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル、グリセロールアルキルエステル、ポリプロピレングリコールアルキルエーテル類、ブロック共重合体、ポロキサマー、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ラウリルジメチルアミンオキシド又はポリエトキシル化獣脂アミンが挙げられる。
ＭＳＮ径
アンモニア塩基触媒法を用いることにより、異なる径のＭＳＮを調製し得る。一態様において、ＭＳＮは、高度に希釈した低界面活性剤条件下で調製される。本開示において、ＭＳＮは好ましくは、ＴＥＭで測定して、４０ｎｍ未満の平均直径を有する。ＭＳＮの径制御は、アンモニア濃度、アルコキシシランの量及び濃度、反応温度等を調整することによって実現し得る。この理論に拘束されないが、アンモニア濃度が高くなると、ＭＳＮ径が大きくなり得るとともに、逆もまた同様である；アルコキシシランの量が多くなると、ＭＳＮ径が大きくなり得るとともに、逆もまた同様である。様々な実施形態において、１５０ｍＬ水酸化アンモニウム溶液中０．１４～０．５ｇ ＣＴＡＢが使用され、このアンモニア濃度は０．０５～１．５Ｍ、好ましくは０．１～０．５Ｍ、より好ましくは０．１～０．２５Ｍの範囲であり；１５０ｍＬ水酸化アンモニウム溶液に加えられるアルコキシシランの量は１ｍＬ～５ｍＬ、好ましくは１ｍＬ～３ｍＬ、より好ましくは２ｍＬ～２．５ｍＬのエタノール系ＴＥＯＳの範囲であり（即ち、エタノール中のＴＥＯＳ、約０．８６２～１．２Ｍ）；及び反応温度は３０℃～６０℃、好ましくは４０℃～６０℃、より好ましくは５０℃～６０℃の範囲であり；これらの条件の任意の組み合わせが、本開示の実施形態を成し得る。
追加の活性薬剤
疾患の治療のため、少なくとも１つの追加の生体活性成分（活性薬剤）をＭＳＮ上に、及び／又はＭＳＮ中に負荷することができ、例えばＭＳＮの空間の範囲内に、ＭＳＮの表面上に等、分布させることができる。追加の生体活性成分は、そのサイズ及び当該の障害／疾患に基づき適切に選択され得る。特定の実施形態において、追加の生体活性成分は、タキサン系化学療法薬負荷型ＭＳＮの投与と共投与されるか、それより前に投与されるか、又はその後に投与される。追加の生体活性成分の例としては、限定はされないが、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ ２８６、ＡＶ－２９９、ＤＮ－Ｉ０ｌ、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ ７４４、ＯＮ ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ ６２４４（ＡＲＲＹ－１４２８８６）、ＡＭＮ－１０７、ＴＫＩ－２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ １１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ－１９７、ＭＫ－０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ－７３９３５８、Ｒ－７６３、ＡＴ－９２６３、ＦＬＴ－３阻害薬、ＶＥＧＦＲ阻害薬、ＥＧＦＲ ＴＫ阻害薬、オーロラキナーゼ阻害薬、ＰＩＫ－１調節薬、Ｂｃｌ－２阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ｃ－ＭＥＴ阻害薬、ＰＡＲＰ阻害薬、Ｃｄｋ阻害薬、ＥＧＦＲ ＴＫ阻害薬、ＩＧＦＲ－ＴＫ阻害薬、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼ阻害薬、ＡＫＴ阻害薬、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害薬、チェックポイント－１又は２阻害薬、接着斑キナーゼ阻害薬、Ｍａｐキナーゼ（ｍｅｋ）阻害薬、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサチニブ（ｄａｓａｔａｎｉｂ）、ニロチニブ、デカタニブ（ｄｅｃａｔａｎｉｂ）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ－ｅｔｕ、ノラトレキセド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ １１１、１３１－Ｉ－ＴＭ－６０１、ＡＬＴ－１１０、ＢＩＯ １４０、ＣＣ ８４９０、シレンジタイド、ギマテカン、ＩＬ１３－ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ １００１、ＩＰｄＲ１ ＫＲＸ－０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（ｎｅｕｒａｄｉａｂ）、ビテスペン（ｖｉｔｅｓｐａｎ）、Ｒｔａ ７４４、Ｓｄｘ １０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ－Ｉ００３８０、スニチニブ，５－フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソーム型、５’－デオキシ－５－フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ－３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ－６２４４、カペシタビン、Ｌ－グルタミン酸、Ｎ－［４－［２－（２－アミノ－４，７－ジヒドロ－４－オキソ－１－Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）エチル］ベンゾイル］－ジナトリウム塩、七水和物、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、抱合卵胞ホルモン、ベバシズマブ、ＩＭＣ－１Ｃ１１、ＣＨＩＲ－２５８、３－［５－（メチルスルホニルピペラジンメチル）－インドリル］－キノロン、バタラニブ、ＡＧ－０１３７３６、ＡＶＥ－０００５、ゴセレリン酢酸塩、ロイプロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ－７２４７１４；ＴＡＫ－１６５、ＨＫＩ－２７２、エルロチニブ、ラパチニブ（ｌａｐａｔａｎｉｂ）、カネルチニブ、ＡＢＸ－ＥＧＦ抗体、アービタックス（ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＥＫＢ－５６９、ＰＫＩ－１６６、ＧＷ－５７２０１６、ロナファルニブ（Ｉｏｎａｆａｒｎｉｂ）、ＢＭＳ－２１４６６２、チピファルニブ（ｔｉｐｉｆａｍｉｂ）；アミホスチン、ＮＶＰ－ＬＡＱ８２４、スベロイルアニリド（ｓｕｂｅｒｏｙｌ ａｎａｌｉｄｅ）ヒドロキサム酸、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ－２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ－アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン等、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６－メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３－ｃｉｓ－レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５－デオキシウリジン（ｄｅｏｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、シトシンアラビノシド、６－メルカプトプリン（ｍｅｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ－３、ネオバスタット、ＢＭＳ－２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン－１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン（ｉｄｏｘｙｆｅｎｅ）、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン（ｃｉｍｉｔｉｄｉｎｅ）、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｉｍｉｂ）、パクリタキセル、クレモフォール不含パクリタキセル、エポチロンＢ（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ Ｂ）、ＢＭＳ－２４７５５０、ＢＭＳ－３１０７０５、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ－９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ－４２４、ＨＭＲ－３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４、ＶＸ－７４５、ＰＤ １８４３５２、ラパマイシン、４０－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ－２３５７３、ＲＡＤ００１、ＡＢＴ－５７８、ＢＣ－２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン（ｗｏｒｔｍａｒｍｉｎ）、ＺＭ３３６３７２、Ｌ－７７９，４５０、ＰＥＧ－フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレドロン酸（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ペグ化インターフェロンアルファ－２ａ、インターフェロンアルファ－２ａ、ペグ化インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ－Ｌ－アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン－１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、オールトランス型レチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン－２、メゲストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｇｕｍｏｍａｂｔｉｕｘｅｔａｎ）、アンドロゲン系薬、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロネート（ｅｄｉｔｒｏｎａｔｅ）、ミトタン、シクロスポリン、リポソームダウノルビシン、Ｅｄｗｉｎａ－アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ－１受容体拮抗薬、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセトロン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファ及びダルベポエチンアルファ、クルクミン、クルクミン類縁体が挙げられる。一実施形態において、タキサン系化学療法薬負荷型ＭＳＮは、（テモゾロミド）ＴＭＺと組み合わせて投与され、例えば、ＴＭＺは、タキサン系化学療法薬負荷型ＭＳＮの投与と共投与されるか、それより前に投与されるか、又はその後に投与される。
ＢＢＢ／ＢＢＴＢ透過効果
血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳内へと輸送される多くの治療薬を制限する；脳癌の治療という点に着眼したとき、血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）を通過することついて特に考慮しなければならない。ナノメディシンは、ナノ粒子の粒径、形状、表面電荷、及び／又はコンジュゲートリガンドを調節することによってＢＢＢ又はＢＢＴＢの透過を増加させ得る。トランスフェリン、ラクトフェリン、グルタチオン及び低密度リポタンパク質受容体など、内皮細胞上の受容体に結合するターゲティングリガンドをコンジュゲートしたナノ粒子もまたＢＢＢ又はＢＢＴＢ透過を促進し得る。本発明は、脳癌の治療において最適化された結果を実現するための、ＢＢＢ、詳細にはＢＢＴＢ透過効果の有効性とタキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＣＴＸ又はＤＴＸの負荷効率との間の均衡を提供する。
癌転移の阻害による脳癌の予防
癌転移があると、癌に罹患している患者の死亡率は高くなり得る。加えて、癌が転移性で、脳に移行した場合には、治療は一層困難になる。それ故、本開示はまた、脳癌の予防にも関し、これは、脳への転移性癌の移行を予防するため、脳外に発生する転移性癌に罹患している対象に本開示の薬剤、例えば、タキサン系化学療法薬、例えば、ＰＴＸ、ＤＴＸ又はＣＴＸを負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子を静脈内投与することによって実現される。一実施形態において、転移性癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎癌、黒色腫、甲状腺癌又はこれらの任意の組み合わせを含む。
以下の例は、本発明が関係する技術分野の当業者にとって本発明が一層理解し易いものとなるようにするために提供されるのであって、本発明の範囲を限定することは意図されない。
材料、方法論及び試験モデル
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いてシリカナノ粒子の外観を調べ、確かめる。ＴＥＭ像は、１００ｋＶの加速電圧で動作させたＨｉｔａｃｈｉ Ｈ－７１００透過型電子顕微鏡で撮像した。エタノール中に分散させた試料を炭素コート銅グリッドに滴下し、風乾させて、ＴＥＭ観察を行った。
動的光散乱法（ＤＬＳ）及びゼータ電位
異なる溶液環境でのシリカナノ粒子の粒径測定をＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で動的光散乱法（ＤＬＳ）によって実施した。以下の異なる溶液中で形成される（溶媒和）粒径を分析した：室温のＨ２Ｏ及びＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）。０．１ｍｇ／ｍＬの粒子濃度のＰＢＳ（０．０１×、ｐＨ７．４）中におけるシリカナノ粒子の表面電荷（ゼータ電位）をＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳにより実施した。
熱重量分析及び元素分析
４０～８００℃まで熱重量分析（ＴＧＡ）を熱分析計にて４０ｍＬ ｍｉｎ－１の空気パージ下に１０℃ ｍｉｎ－１の加熱速度で記録した。シリカナノ粒子中の炭素、窒素、酸素及び水素の質量百分率を元素分析計（ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ｖａｒｉｏ ＥＬ箱形、ＮＣＳＨ用、ドイツ）によって決定した。
多光子蛍光顕微鏡
多光子顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶＭＰＥ－ＲＳ）を使用して、Ｕ８７同所性異種移植片腫瘍マウスの脳組織領域及び脳腫瘍領域の脳血管における蛍光標識したＭＳＮの分布を可視化した。マウスを麻酔し、頭蓋を取り外して開頭術を行った。脳の表面から（即ち、約１５０ｕｍの深さで）粒子分布の画像を二光子顕微鏡を使用して、８５０ｎｍの励起波長で水浸対物レンズによって取得した。
Ｕ８７神経膠腫動物モデル
Ｕ８７－ＬＵＣ神経膠腫細胞を加湿５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した最小必須培地（ｍｅｄｉａｎ）（ＭＥＭ）又はダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞をトリプシン処理によって回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＭＥＭ又はＰＢＳ中に再懸濁し（１×１０５細胞／μＬ；３×１０５細胞／３μＬ）、続いてマウス脳の線条体に移植した。無菌雄ＮＵ／ＮＵマウス（５～７週齢）又はＢａｌｂ／ｃヌードマウス（５～７週齢、雄）をＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．から購入した。マウスは制御された環境で飼育及び管理し、手順は全て、実験動物管理指針に従い実施した。Ｕ８７－ＬＵＣ腫瘍細胞を移植するため、動物を２％イソフルランガスによるか、又はＺｏｌｅｔｉｌ（２０～４０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５～１０ｍｇ／ｋｇ）混合溶液で麻酔し、定位固定フレームに固定化した。頭蓋冠を覆う皮膚に矢状切開を加え、２３Ｇ針を使用して、露出した頭蓋のブレグマから前方に１．５ｍｍ及び側方に２ｍｍのところに穴を設けた。脳表面から２ｍｍの深さに５又は３マイクロリットルのＵ８７－ＬＵＣ神経膠腫細胞懸濁液を注入した。この注入は３分間かけて実施し、更に２分間かけて針を抜き取った。任意選択で、脳腫瘍の成長をＩＶＩＳ及びＭＲＩによってモニタした。
ＴＭＺ耐性神経膠腫動物モデル
ＴＭＺ耐性神経膠腫細胞（Ｕ８７ＭＧ－Ｒ）を加湿５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて、１０％ウシ胎仔血清及び１００ｕｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＮＯＤ－ＳＣＩＤ雄マウス（８週齢）をＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．から購入した。頭蓋内移植については、無菌条件下で実験手順を実施した。ＴＭＺ耐性膠芽腫移植については、右前脳領域に頭蓋穿頭孔を設けた。定位ガイダンス及びマイクロプロセッサシングルシリンジ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して細胞（２×１０５、又は５マイクロリットルのＴＭＺ耐性神経膠腫細胞懸濁液（Ｕ８７ＭＧ－Ｒ、６×１０５細胞／５μＬ）を皮質に３ｍｍの深さで注入した。
実施例１
細孔の側壁に様々な比のＴＥＯＳ対オクチルトリエトキシシラン（Ｃ８シラン）修飾を有し、ナノ粒子表面に様々な比のＰＥＧ対官能基修飾を有するメソ多孔質シリカナノ粒子の調製
メソ多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ）は、十分に定義付けられた構造、及び広範囲の有機官能基で修飾することのできる高密度の表面シラノール基を備えている。種々の粒径のＭＳＮを、高度に希釈した低界面活性剤条件下でアンモニア塩基触媒法を用いて調製した。粒径は、アンモニア濃度、ＴＥＯＳを加える量、及び反応温度を調整することにより制御した。ＭＳＮの表面に正電荷基を提供するための例示される電荷修飾剤としてＴＡ－シラン（Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）を使用し、ＭＳＮの細孔の内表面に脂肪族基を提供するための内表面修飾剤としてオクチルトリエトキシシランを使用した。典型的には、密封したビーカー内にある所望の温度（５０～６０℃）の１５０～２５０ｍＬの水酸化アンモニウム溶液（０．１～０．２５Ｍ）に０．２９～０．４９ｇのＣＴＡＢを溶解させた。１５分間撹拌した後、１５．６～１３０．５μＬの末端ヒドロカルビル部分（オクチルトリエトキシシラン）を６０～５００（例えば、２００）μＬエタノールと共に加え、３０分間撹拌した。この後、シール膜を取り外し、次にこの溶液に、激しい撹拌下で０．８～３．０ｍＬエタノール中の１５０～７５０μＬ ＴＥＯＳを加えた。１時間撹拌した後、０．４～２．０（例えば、０．６～１．３）ｍＬエタノール中の更なる１００～５００μＬ ＴＥＯＳを加えた。３時間反応させた後、ＰＥＧ－シラン（２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）６～９プロピル］－トリメトキシシラン）（８５０～１７００μＬ、例えば、１０００μＬ）を２．６～５．４ｍＬ（例えば、３．２ｍＬ）のエタノール中の０～４５５μＬ（例えば１５５．８μＬ）ＴＡ－シラン（Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）と共に反応液に導入した。特定の場合には、更に追加の最大５００μＬまでのＥｔＯＨ中の最大８５μＬまでのＴＥＯＳを直ちに加えた。１時間撹拌した後、混合物を所望の温度（例えば、５０～６０℃）で撹拌なしに少なくとも１２時間、最終反応容積が４０～８５ｍＬに減るまで経時させた。次に、この溶液を密封し、オーブンに約７０℃で４０～４８時間置くか、又は約７０℃で１８～２４時間置き、約９０℃で更に２２～２４時間水熱処理した。合成したままの試料を洗浄し、遠心又はクロスフローシステムにより収集した。ＭＳＮの細孔にある界面活性剤を除去するため、合成したままの試料を６７８～１４４２μＬ（例えば、８４８μＬ）（１回目）及び４０～８５μＬ（例えば、５０～８５μＬ）（２回目）の塩酸（３７％）を含量する４０～８５ｍＬ（例えば、５０～８５ｍＬ）の酸性エタノール中で６０℃で１時間の抽出にわたってインキュベートした。生成物を洗浄し、遠心又はクロスフローシステムによって回収し、最後に９０％を超える、又は（純）Ｈ２Ｏのエタノール中に保存した。異なる官能基で修飾されたＭＳＮ－ＰＥＧを合成するため、ＴＡ－シランをＥＤＰＴＭＳ－シラン、又は他の官能基－シランで置換した。種々の修飾レベルを達成するため、ＴＥＯＳ／オクチルトリエトキシシランのモル比は、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１及び５：１まで変え、ＰＥＧ－シラン／ＴＡ－シランの比は、１５：１、１０：１、７：１、４：１及びｎ：０（即ち、ＰＥＧのみ）まで変えた。
ＭＳＮにおけるタキサン系化学療法薬（ドセタキセル及びカバジタキセル）の負荷
Ｃ８－ＭＳＮ－ＰＥＧ／ＴＡ粒子（約１．６ｇ）を１６～５０ｍＬ（例えば、１６～３２ｍＬ）のＨ２Ｏに分散させた。ＤＭＳＯ中５０ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＴＸ又はＣＴＸストック溶液（１．１６１～１．８６２ｍＬ）を薬物負荷に使用し、それを激しい撹拌下の粒子溶液中にゆっくりと滴下した。溶液が完全に混合した後、混合物をＨ２Ｏ（４８～５０ｍＬ）で更に希釈してＤＭＳＯ濃度を低下させた。微量の遊離薬物凝集体を除去するため、混合物を０．２２μｍのフィルタでろ過した。次に、混合物を７～１０倍のＨ２Ｏでクロスフローシステムにより洗浄した。最後に、生成物をＨ２Ｏに保存した。
参照実施例１
ＭＳＮの内表面修飾を用いて、送達しようとする薬物、例えば、クルクミン類縁体などの抗癌剤が負荷されている。しかしながら、当該技術分野において公知の粒子は、タキサン系化学療法薬（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル及びカバジタキセル）の送達、詳細にはインビボ適用における送達には、タキサン系化学療法薬の薬物負荷有効性、水溶液に対する分散度並びに保存及び生理条件下での安定性のその低さに起因して、好適でない可能性がある。本発明者らの予備的研究では、ＰＢＳに対するＣ８－シラン導入粒子の分散度が、合成過程におけるＴＥＯＳ／Ｃ８－シランの比の影響を受けることが示された。例えば、ＴＥＯＳ：Ｃ８－シラン比＝２０：１で合成した粒子は、水及びＰＢＳに対して同程度の流体力学的径（ＤＬＳ）を呈する。しかしながら、本発明者らがＣ８－シランの比率を（ＴＥＯＳ：Ｃ８－シラン比＝１５：１にまで）増加させて薬物負荷能力を増強しようと試みると、ＰＢＳ中のＭＳＮのＤＬＳ径は水中の２倍になった。本発明者らがＣ８－シランの比率をＴＥＯＳ：Ｃ８－シラン比＝１０：１にまで更に増加させようと試みると、ＰＢＳ中では粒子の深刻な凝集が観察され、ＤＬＳ径は約１μｍであった。更に、３７℃にてＰＢＳ中で一晩インキュベートした後、粒子は不安定な分散及び凝集を呈し、従って、ＭＳＮの粒子構造又は表面修飾が分解又は破壊されている可能性があることを含意するＤＬＳ径の大幅な増加から明らかなとおり、不安定と考えられた。しかしながら、本発明者らはまた、内部有機修飾（この例では、Ｃ８－シラン）の比率が下がると薬物負荷効率に影響が及び得ることも懸念している。
タキサン系化学療法薬＠ＭＳＮ、詳細にはＤＴＸ＠ＭＳＮ及びＣＴＸ＠ＭＳＮナノ製剤の薬物負荷能力、分散度、及び安定性の改善
これらの因子（例えば、負荷容量、分散度、及び安定性）を最適化することに起因する問題を解決するため、実施例１に例示されるとおり、本発明者らは、限定はされないが、ＴＥＯＳ／Ｃ８－シランの比、水熱条件及び表面修飾等を含め、ＭＳＮ合成のための調整を行うこと試みた。詳細には、薬物負荷能力及び粒子安定性を増加させるため、本発明者らは合成過程におけるＣ８－シランの量をＴＥＯＳ：Ｃ８－シラン＝１５：１にまで増加させるのみならず、また、ＴＥＯＳ及びＣ８－シランを加える順序も、例えばＣ８－シランを加えた後にＴＥＯＳを加えるなど、調整した；水熱処理条件は７０℃で約１日から７０℃で約２日、又は７０℃で約１日及び９０℃でその他（約）１日に調整した；水溶液中、詳細には生理溶液中の粒子の分散度を改善し、及びＴＡ－シランによって引き起こされる細孔閉塞を低減するため、ＰＥＧ－シランの量を増加させて、ＴＡ－シランの量を減少させたことにより、ＰＥＧ－シラン：ＴＡ－シランの比が２：１から７：１に変わった；ＰＥＧ－シラン単独を外表面修飾として使用する更なる例も実施した。
これらの調整に加えて、ＭＳＮ粒子はＰＢＳ中及び生理的条件で良好な分散度（ＭＳＮのＤＬＳ径＜６０ｎｍ）、より高い懸濁安定性（３７℃で一晩の後、ＭＳＮ又はＤＴＸ＠ＭＳＮのＤＬＳ径＜６０ｎｍ）、より高い薬物負荷能力（ＤＴＸ及びＣＴＸの負荷効率は８０％又は７０％より高い）、及び薬物負荷型ＭＳＮの長期安定性を呈した。
先行研究及び本開示におけるＭＳＮの分散度の比較
表１に示されるデータによれば、タキサン系化学療法薬の負荷に最適化したＭＳＮが、ＰＢＳ中で所望のＤＬＳ径を呈し、内表面（細孔表面）修飾に至っては、より高いレベル（即ち、より低いＴＥＯＳ：内部修飾剤比）であり得ることが見出される。
適用条件下での安定性を評価するため、Ｃ８－シラン内部修飾を備えた、好適な特徴を有するＭＳＮを評価に採用した。ＭＳＮをＰＢＳ中３７℃（ヒト体温の模擬として）で一晩インキュベートし、インキュベーション前及びその後にそのＤＬＳ径を測定した。先行研究及び本開示におけるＭＳＮのＤＬＳ径及びＤＬＳ径のＰＤＩの比較を以下の表２に示す。
明らかに、ＰＢＳ中３７℃で一晩インキュベートした後、参照ＭＳＮ（ａ－１）及び（ａ－２）のＤＬＳ径は大幅に成長し、６０ｎｍを超えることさえあり得るが、最適化したＭＳＮのＤＬＳ径はほぼ変化しないままである。この結果が示すところによれば、最適化したＭＳＮは模擬適用条件下で安定したままである。ＴＭＰＳによる内部修飾を有するＭＳＮもまた評価した。
適用条件下で薬物を負荷した後の適用性を更に評価するため、表２の好適な特徴を有するＭＳＮをＤＴＸの負荷に使用し、このＤＴＸ＠ＭＳＮをＰＢＳ中３７℃で一晩インキュベートし、そのＤＬＳ径を測定した。ＤＴＸを負荷したＭＳＮのＤＬＳ径及びＤＬＳ径のＰＤＩの比較を以下の表３に示す。
明らかに、ＰＢＳ中３７℃で一晩インキュベートした後、参照ＤＴＸ＠ＭＳＮ（ａ－３）のＤＬＳ径は大幅により大きく成長し、６０ｎｍを超えることさえあるが、本発明のＤＴＸ＠ＭＳＮのＤＬＳ径はほぼ変化しないままである。この結果が示すところによれば、本発明のＤＴＸ＠ＭＳＮは模擬適用条件下で安定したままである。ＴＭＰＳによる内部修飾を有するＭＳＮもまた評価した。
実施例２
ＤＴＸ又はＣＴＸを負荷した、良好な分散度及びより高い懸濁安定性を備える参照実施例１で合成したままのＭＳＮをＴＥＭ及びＤＬＳ測定に供した。結果を以下の表４に示す。
負荷量は、薬物＠ＭＳＮに対する薬物の重量比率によって表される。負荷効率は、負荷に使用した薬物の総量に対するＭＳＮへの薬物負荷量の重量比によって表される。本発明者らは、意外にも、外表面修飾がタキサン系化学療法薬（ＤＴＸ及びＣＴＸ）の負荷量及び負荷効率に影響を及ぼし得ることを見出した。詳細には、最適化したＭＳＮ（１）、（２）及び（３）の間での差は、単に外表面修飾剤の比、即ち、それぞれ（ｒｅｓｐｅｃｔｆｕｌｌｙ）ＰＥＧ－シラン：ＴＡ－シラン＝２：１、４：１、７：１に過ぎない。ＤＴＸ＠ＭＳＮの場合、ＰＥＧ／ＴＡシラン比が大きくなると（即ち、正電荷修飾剤レベルが下がると）、負荷量（能力）が約２６％から３１％に増加し得るとともに、負荷効率が約２６％から４７％に増加し得る。ＴＭＰＳによる内部修飾を有するＭＳＮもまた、タキサン系化学療法薬の負荷について評価した。
長期（保存）安定性
薬物負荷型ＭＳＮを異なる媒体中に保存して、表５に示す特徴によって長期安定性を評価した。
試験条件：ＤＴＸの負荷にはＮＴＴ２＿２００（表１の最適化ＭＳＮ（３））を使用し、約１５０ｍｇ／ｍＬ ＤＴＸ＠ＮＴＴ２＿２００の保存濃度で各媒体中に分散させて、４℃で少なくとも３ヵ月間保存した。ＤＴＸ＠ＮＴＴ２＿２００のＴＥＭ径、ＤＬＳ径（Ｈ２Ｏ又はＰＢＳ中）及び封入されているＤＴＸを測定し、溶液／分散体の状態を目視で評価した。結果を以下に要約する。ストックＤＴＸ濃度、即ち、分散体中の総ＤＴＸ濃度（遊離ＤＴＸ及びＤＴＸ＠ＭＳＮ（封入されているＤＴＸ））を保存中のＤＴＸの分解の指標として測定した。封入されているＤＴＸの割合は、試料量の分散体の遠心又はろ過によって達成した、ＤＴＸ＠ＭＳＮからの遊離ＤＴＸの分離によって決定した。
上記に示す結果によれば、３ヵ月間保存した後にもＤＴＸ＠ＭＳＮのＴＥＭ径及びＤＬＳ径に大きい変化はなかったことから、これは、ＭＳＮが長期保存後になおもインタクトな構造及び表面修飾並びに保存媒体中で凝集のない良好な分散度を有することを指し示すものであり得る。加えて、分散体中に遊離ＤＴＸはほとんど認められず、保存後もストックＤＴＸ濃度は低下しなかったことから、これは、少なくともＤＴＸの放出及び分解が観察されなかったという事実について、本発明のＤＴＸ＠ＭＳＮが様々な保存媒体中で長期安定性を呈することを指し示すものであり得る。ＴＭＰＳによる内部修飾を有するＭＳＮもまた評価した。
元素分析及び熱重量分析
Ｃ８－ＭＳＮ－ＰＥＧ／ＴＡ合成過程においては、ＭＳＮの細孔の内表面を修飾するのにＣ８－シラン（脂肪族分子）を使用し、ＭＳＮの外表面上のＰＥＧ／ＴＡ比を調節するための反応に、異なるモル比のＰＥＧシラン（（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー）及びＴＡシラン（（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマー）を使用した。Ｃ８－ＭＳＮ－ＰＥＧ／ＴＡナノ粒子上の官能基を定量化するため、Ｃ８－ＭＳＮ－ＰＥＧ／ＴＡ粒子の元素組成を元素分析計によって測定した。Ｃ８－ＭＳＮ（表面修飾剤を導入する前の粒子）の炭素質量百分率から１粒子当たりのＣ８基の数（重量、ｍｇ又はｇ）が導き出され、Ｃ８－ＭＳＮ－ＰＥＧ／ＴＡ粒子の窒素質量百分率からＴＡ基の数が導き出され、合計炭素質量百分率からＣ８－ＭＳＮ－ＰＥＧ／ＴＡのＣ８基及びＴＡ基からの寄与分の炭素質量百分率を減じることによって求めたその炭素質量百分率からＰＥＧ基の数が導き出される。
加えて、合計有機基質量百分率を熱重量分析により測定した。Ｃ８基、ＰＥＧ基、及びＴＡ基の合計質量百分率は、１５０℃から８００℃までのＣ８－ＭＳＮ－ＰＥＧ／ＴＡの重量減少から導き出される。上記の分析及び計算に基づけば、ＮＴＴ２＿２００のＣ８基、ＴＡ基、及びＰＥＧ基の数は、それぞれ、約０．８３１、０．０９４、及び０．４２５（ｍｍｏｌ／ｇ）であり、Ｃ８－ＭＳＮ－ＰＥＧ／ＴＡのＣ８基、ＴＡ基及びＰＥＧ基の合計有機質量百分率は、約２２．１５％であった。
実施例３
ＴＭＺ耐性脳腫瘍に対するドセタキセル（ＤＴＸ）及びカバジタキセル（ＣＴＸ）の用量依存的有効性
ＤＴＸ及びＣＴＸの毒性並びにＤＴＸ及びＣＴＸの直接投与がＴＭＺ耐性脳腫瘍の治療に及ぼす有効性を評価するため、実験においては、ＴＭＺ耐性脳腫瘍を移植した３６匹のマウスを使用し、各群６匹のマウスを含む６群に分けた；投薬量の詳細を以下の表７に提示する。
投与頻度は、本研究の終了時まで週２回であった。マウスには、ＤＴＸ、ＣＴＸ及びＰＢＳを静脈内（ＩＶ）注射し、ＴＭＺを腹腔内（ＩＰ）注射した。全生存を判定するため、マウスを自然死が起こる時点又は瀕死状態が近づく時点に至るまでモニタした。
結果から、対照群及び比較群（群１及び群２）では、マウスは試験期間（（１５）／１９、（初回注射後の日数）／腫瘍細胞移植後の日数）の終了時まで生存できることが示された。しかしながら、群３～群６の試験結果によれば、ＣＴＸ及びＤＴＸは、用量が１０ｍｇ／ｋｇ以上になると高い毒性を呈することになり、これは、試験期間中のマウスの著しい体重減少及びマウスの低い生存率によって明らかである（全てのマウスが試験期間の終了前に死亡した）。加えて、群３～群６のマウスは、薬物投与から数時間後には不快感及び活動の減少を示すことになり得る。
ＣＴＸの毒性を更に調べるため、本発明者らは追加の群、群２－１及び群７を実施した。詳細は以下の表８に提示する。
結果から、比較群２－１では、全てのマウスが３０日間生存したことが示された；しかしながら、群７では１匹のマウスのみが（１５）／１９（（初回注射後の日数）／腫瘍細胞移植後の日数）を超えて生存した。群７の唯一の生存マウスには、引き続き第５週まで同じ投与頻度で薬物を投与した；前記マウスに関して脳及び病理学的生検を実施した。
以上を所与とすれば、１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量でのＤＴＸ、又は５ｍｇ／ｋｇ以上の用量でのＣＴＸの直接投与は、この用量レベルでの毒性が高いため、脳癌の治療には使用されない可能性がある。
実施例４
ＤＴＸ送達用のＭＳＮのＢＢＴＢ透過及び腫瘍ターゲティング
ＢＢＴＢ透過能及び腫瘍ターゲティング能は、両方とも、ＤＴＸ又はＣＴＸそれ自体の非効率的な治療活性を改変するためにＭＳＮナノ製剤を導入するのに基本的且つ不可欠な能力である。動物試験モデルにおいて、同所性異種移植片脳腫瘍マウスに蛍光標識したＭＳＮ（蛍光標識したＮＴＴ２＿２００）を静脈内注射し、脳組織領域及び脳腫瘍領域の脳血管における粒子分布を多光子蛍光顕微鏡によって取得した。詳細には、注射の翌日、マウス脳を採取し、固定して凍結切片を調製した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（青色シグナル）で染色した切片を使用して核を可視化することにより、脳形態を判定し、及び腫瘍組織を同定し、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）コンジュゲートＭＳＮの分布を蛍光顕微鏡法にて赤色シグナルで観察した。正常脳組織と比較したとき、明らかな数のＭＳＮが脳腫瘍領域に蓄積しており（図１）、これは、ＭＳＮが血管内を循環し、脳腫瘍部位の周辺に蓄積して貯留したため、治療有効性が高くなり、薬物関連毒性が低くなったことを指し示していた。
実施例５
ＴＭＺ耐性脳腫瘍に対するドセタキセル（ＤＴＸ）及びＤＴＸ＠ＭＳＮの用量依存的有効性
上述のとおり、ＴＭＺに対する耐性は、多くの場合に有効な治療の制限因子となる。これを所与とすれば、ＴＭＺ耐性同所性異種移植片ＧＢＭモデルは、治療薬の有効性を確かめるのに良好なモデルである。５、９、１３、２６、３０、及び３４日目、同所性ＴＭＺ耐性脳腫瘍マウスに、ＤＴＸ単独及びナノ製剤中のＤＴＸ（ＤＴＸ＠ＭＳＮ、ＭＳＮの種類はＮＴＴ２＿２００であった）を静脈内注射した。自然死が起こる時点に至るまで、動物の体重及び生存期間をモニタした。ＤＴＸ＠ＭＳＮは、対照群及びＤＴＸ単独治療群と比較したとき、有効な腫瘍阻害及び大幅に長い全生存を呈した。高用量ＤＴＸ＠ＭＳＮ群の寿命の増加率は、対照と比較して約８３．７％の改善であり、ＤＴＸ＠ＭＳＮのこの生存の向上は用量依存性であった。対照的に、ＤＴＸ単独の生存期間中央値は、ＤＴＸ単独の有効性の低さ及び毒性の高さに起因して対照群と同程度か、又はそれより短く、これは臨床での観察と同じであった。更に、ＤＴＸ単独で治療したマウスは、毒性に起因して不動状態、相互作用の欠落、及びＤＴＸ＠ＭＳＮよりも多い体重減少を見せた（図２）。
脳腫瘍における組織切片の組織学的顕微鏡写真もまた取得して、治療後の腫瘍サイズを判定した（図３を参照のこと）。ＤＴＸ＠ＭＳＮ治療群の腫瘍サイズは、５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれの用量レベルでも、ＤＴＸ単独治療群及び対照と比べると有意に小さかった。対照的に、ＤＴＸ単独治療群の腫瘍サイズは対照群と同程度であったことから、ＤＴＸ単独は脳腫瘍成長に対して効果がなかったことが指摘される（図３）。加えて、アポトーシスバイオマーカー（カスパーゼ３及び切断型ＰＡＲＰアポトーシスマーカーはＤＴＸ誘発性癌細胞死に関係する）の脳組織における発現レベルは、ＤＴＸ＠ＭＳＮ及びＤＴＸ単独の抗腫瘍有効性と正の相関があり、これにより、ＤＴＸがＭＳＮによって脳腫瘍内に送達されたこと及び癌細胞死を誘導することが実証された。
実施例６
ＴＭＺ耐性脳腫瘍に対するＴＭＺと組み合わせたドセタキセル＠ＭＳＮ（ＤＴＸ＠ＭＳＮ）の用量依存的有効性
ＤＴＸの毒性及び本開示のメソ多孔質シリカナノ粒子（実施例１に示すＮＴＴ２＿２００）に負荷したＤＴＸの直接投与がＴＭＺ耐性脳腫瘍の治療に及ぼす有効性を評価するため、１つの群に４匹のマウスを有し（対照）、及び他の群に各々６匹のマウスを有する実験において同所性ＴＭＺ耐性脳腫瘍マウスを使用した。本発明者らは、１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量レベルが高い毒性を呈し得ることを認識していたため、この実験の用量レベルは調整した。投薬量及び平均生存時間の詳細を以下の表９に提示する。
群８及び群９のマウスは、投与期間中、体重の減少のみで、活動減少又は他の異常な状態は呈しなかったことが観察される。群８及び群９の生存期間中央値（生存率が５０％に等しくなる時点）は群１及び群２よりも有意に長かった。詳細には、ＴＭＺ単独で治療したマウス（群２）は対照群（群１）と同程度の生存期間を有し、腫瘍細胞がＴＭＺに耐性を有したことが実証された。ＴＭＺと組み合わせたＭＳＮナノ製剤中のＤＴＸ（ＤＴＸ＠ＭＳＮ）では、対照群（ＰＢＳ及びＴＭＺ）及びＴＭＺと組み合わせたＤＴＸ群と比べて全生存が有意に増加した（図４）。ＴＭＺ＋ＤＴＸの毒性の高さは有効性を制限し、治療したマウスの不動状態、相互作用の欠落、有意な体重減少、及び早期死亡につながり得るため、従って慎重に適用しなければならないことに留意しなければならない。
これらの結果は全て、ＭＳＮナノ製剤が、単独での使用又はＴＭＺと組み合わせた使用のいずれでも、ＢＢＴＢを越えて標的脳腫瘍へとＤＴＸを送達することができ、そのためＤＴＸ＠ＭＳＮが増殖を効率的に阻害して癌細胞のアポトーシスを誘発し、薬物関連毒性が低減され、全生存が有意に増加し、ひいては脳癌又は脳に転移した癌の治療においてＤＴＸ単独よりも優れた効果を提供すること指し示している。
実施例７
ＴＭＺ耐性脳腫瘍に対するＴＭＺと組み合わせたカバジタキセル＠ＭＳＮ（ＣＴＸ＠ＭＳＮ）の用量依存的有効性
ＴＭＺと組み合わせたＣＴＸの毒性及びＴＭＺと組み合わせた本開示のメソ多孔質シリカナノ粒子（ここでは、実施例１に示すＮＴＴ２＿２００）に負荷したＣＴＸの静脈内投与がＴＭＺ耐性脳腫瘍の治療に及ぼす有効性を評価するため、１つの群に４匹のマウスを有し（対照）、及び他の群に各々６匹のマウスを有する実験において同所性ＴＭＺ耐性脳腫瘍マウスを使用した。本発明者らは、１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量レベルが高い毒性を呈し得ることを認識していたため、この実験の用量レベルは調整した。投薬量及び平均生存時間の詳細を以下の表１０に提示する。
ＴＭＺと組み合わせたＣＴＸは、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、試験期間中におけるマウスの有意な体重減少及び早期死亡によって明らかな高い毒性を呈した。ＴＭＺと組み合わせたＣＴＸ＠ＭＳＮでは毒性が低下し、ＣＴＸ群よりも生存期間が長くなったが、１０ｍｇ／ｋｇは、マウスが忍容するにはなおも高過ぎた。ＣＴＸ＠ＭＳＮの用量レベルを、マウスの耐用量である５ｍｇ／ｋｇに低下させると、ＴＭＺと組み合わせたＣＴＸ＠ＭＳＮが有効性を呈し、生存期間が延長することになった（図５を参照のこと）。
群１～群３、群５及び群８～群１１（図示せず）のマウスの脳生検もまた実施して、脳癌に対する治療有効性を評価した。マウスが自然に死亡した後に脳を取り出し、次にヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）で染色した。群１及び群２のマウスについては、腫瘍の有意な成長を観察することができた。群３及び群５のマウスについては、マウスは試験期間が終了する前に死亡したが、腫瘍サイズは群１及び群２よりも小さかった。他方で、群８～群１１のマウスのデータは有望であった。詳細には、群８～群１１のマウスの腫瘍サイズは群１又は群２のマウスよりも有意に小さく、群１１のマウスの腫瘍は、ほぼ消失さえした（但し、前記群のマウスの方が早く死亡した）。加えて、腫瘍の縮小は用量依存的であり、群９（ＴＭＺ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋１０ｍｇ／ｋｇ ＤＴＸ＠ＭＳＮ）及び群１１（ＴＭＺ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋１０ｍｇ／ｋｇ ＣＴＸ＠ＭＳＮ）のマウスの腫瘍サイズは、それぞれ、群８（ＴＭＺ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋５ｍｇ／ｋｇ ＤＴＸ＠ＭＳＮ）及び群１０（ＴＭＺ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋５ｍｇ／ｋｇ ＣＴＸ＠ＭＳＮ）よりも小さかった。加えて、ＣＴＸ＠ＭＳＮの治療効果は、ＤＴＸ＠ＭＳＮより優れたものであり得る。
実施例８
脳転移を伴う及び伴わない再発又は不応性高悪性度神経膠腫及び固形腫瘍を有する成人におけるＭＳＮナノ製剤中のドセタキセルの第Ｉ／ＩＩ相試験。
適応疾患
脳転移を伴う又は伴わない再発又は不応性高悪性度神経膠腫及び進行固形腫瘍の治療として。
研究目的
脳転移を伴う又は伴わない高悪性度神経膠腫及び進行固形腫瘍における単剤療法又は併用療法としてのＭＳＮナノ製剤中のＤＴＸ又はＣＴＸの安全性、忍容性、ＰＫ及び有効性を評価する第Ｉ／ＩＩ相多施設非盲検試験。
研究デザイン
本研究は、３相からなる：高悪性度神経膠腫における第Ｉａ相（単剤療法による用量漸増）、第Ｉｂ相（及びテモゾロミド（ＴＭＺ）併用療法による用量漸増）。第ＩＩ相では、脳転移を伴う及び伴わない固形腫瘍で第Ｉａ相からの推奨最大耐用量のナノ製剤を調べる。
治療継続期間及び研究終了
第Ｉａ相
ナノ製剤を加速反復投与用量漸増方式で試験する。全ての患者に、１４日又は２１日サイクルの１日目、２８日又は４２日サイクルの１日目及び２２日目に、病勢進行、毒性、同意の撤回、又は研究の終了まで、ナノ製剤の静脈内投与が与えられることになる。
第Ｉｂ相
ナノ製剤とＴＭＺの組み合わせを３＋３、３＋４、４＋３又は４＋４用量漸増デザインで試験する。
用量：１４日又は２１日サイクルの１日目、又は２８日又は４２日サイクルの１日目及び２２日目にナノ製剤の投与；ＴＭＺの投与：焦点放射線療法と同時に７５ｍｇ／ｍ２を４２日間、続いて６サイクルにわたるＴＭＺの２８日サイクルの１～５日目に１５０ｍｇ／ｍ２、１日１回の初期維持量。
研究の終了：病勢進行、毒性、同意の撤回、又は研究の終了まで。
第ＩＩ相
各研究癌種の多重拡大コホートにおける第Ｉａ相からの推奨最大耐用量（ＭＴＤ）。ナノ製剤による単剤療法を一定用量でＨＧＧ、ｍＢＣ、ｍＮＳＣＬ、及びｍＣＲＰＣで試験して臨床的有効性を決定する。
投与のタイミング：１４日又は２１日サイクルの１日目、又は２８日又は４２日サイクルの１日目及び２２日目。
継続期間：注入１時間、１サイクル当たり１４日又は２１日。
研究の終了：病勢進行、毒性、同意の撤回、又は研究の終了まで
試験エンドポイント
第Ｉａ及びＩｂ相エンドポイント：忍容性、安全性、薬物動態。
第ＩＩ相：
主要エンドポイント：ＰＦＳ、ＯＳ
副次的エンドポイント：クオリティ・オブ・ライフ
研究治療
第Ｉａ相：
治験薬：ＭＳＮナノ製剤中のＤＴＸ又はＭＳＮナノ製剤中のＣＴＸ
用量レベル：４つの用量レベル
１つの治療サイクル：１４日又は２１日サイクルの１日目、又は２８日又は４２日サイクルの１日目及び２２日目に、全ての患者にナノ製剤の静脈内投与が与えられる。
対象は、病勢進行、毒性、同意の撤回、又は研究の終了まで治療を継続してもよい。
第Ｉｂ相：
治験薬：ナノ製剤中のＤＴＸとＴＭＺ又はナノ製剤中のＣＴＸとＴＭＺの組み合わせ
用量レベル：２つの用量レベル
１つの治療サイクル：１４日又は２１日サイクルの１日目、又は２８日又は４２日サイクルの１日目及び２２日目に、全ての患者にナノ製剤の静脈内投与が与えられる；ＴＭＺの投与：焦点放射線療法と同時に７５ｍｇ／ｍ２を４２日間、続いて６サイクルにわたるＴＭＺの２８日サイクルの１～５日目に１５０ｍｇ／ｍ２、１日１回の初期維持量。
対象は、病勢進行、毒性、同意の撤回、又は研究の終了まで治療を継続してもよい。
第ＩＩ相：
治験薬：ＭＳＮナノ製剤中のＤＴＸ又はＭＳＮナノ製剤中のＣＴＸ
用量レベル：第Ｉａ相からの推奨最大耐用量（ＭＴＤ）
１つの治療サイクル：１４日又は２１日サイクルの１日目、又は２８日又は４２日サイクルの１日目及び２２日目。
対照薬：なし、１４又は２１日／サイクル使用、２治療サイクル、実世界データ。
要約すれば、特許請求されるタキサン系化学療法薬＠ＭＳＮ（例えば、ＣＴＸ＠ＭＳＮ及びＤＴＸ＠ＭＳＮ）は、脳腫瘍及び転移性脳癌、詳細には薬物耐性脳腫瘍の治療において既存の薬物よりも優れた効果を提供することができ、生存期間が延び、活動性の低下、注射部位反応（疼痛、発赤、又は腫脹）、悪心、嘔吐、下痢、筋肉痛、関節痛、灼熱痛、刺痛、しびれ感、手、腕、足、又は脚等の疼痛などの副作用が減る。
本実施例に例示される成分、反応条件及びパラメータは、単に例示を目的としているに過ぎず、材料又は調製方法を限定するよう意図するものではない。
主題の発明の当業者は、本願の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の教示及び開示の変形例及び改良例が作られてもよいことを理解しなければならない。上記の内容に基づけば、本願は、その任意の変形例及び改良例を包含することが意図され、但し、それらの変形例及び改良例は、添付の特許請求の範囲又はその均等物に定義されるとおりの範囲に含まれるものとする。

Claims (20)

  1. 対象の脳癌又は脳転移を予防又は治療する方法であって、タキサン系化学療法薬を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子を前記対象に静脈内投与することを含む、方法。
  2. 前記タキサン系化学療法薬が、パクリタキセル（ＰＴＸ）、カバジタキセル（ＣＴＸ）及びドセタキセル（ＤＴＸ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記タキサン系化学療法薬がＤＴＸである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記メソ多孔質シリカナノ粒子が、以下の特徴：
    （ａ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾であって、（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比が６０：１～４：１の範囲である、表面修飾；
    （ｂ）末端ヒドロカルビル部分による細孔内表面修飾；
    （ｃ）ＴＥＭで測定して、６０ｎｍ以下の平均粒径；
    （ｄ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて動的光散乱法で測定して、６０ｎｍ以下の平均動的光散乱粒径；及び
    （ｅ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾
    のうちの少なくとも１つを有する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記メソ多孔質シリカナノ粒子が、（ａ）及び（ｂ）の特徴、（ｅ）及び（ｂ）の特徴、又は（ｂ）及び（ｄ）の特徴を有する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記メソ多孔質シリカナノ粒子が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の特徴、又は（ｅ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有する、請求項４に記載の方法。
  7. 前記脳癌が、テモゾロミド（ＴＭＺ）、ベバシズマブ、ベルズチファン、カルムスチン、エベロリムス、ロムスチン及びナキシタマブ－ｇｑｇｋからなる群から選択される薬物に耐性を示す、請求項１に記載の方法。
  8. 脳癌又は脳転移の前記予防が、脳外に発生する転移性癌に罹患している対象へと、前記タキサン系化学療法薬を負荷した前記メソ多孔質シリカナノ粒子を静脈内投与することにより、前記転移性癌が脳に移行することが予防されて実現する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記転移性癌が、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎癌、黒色腫、甲状腺癌、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. （１）前記有機分子、オリゴマー又はポリマー（ｉ）が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ＰＥＧ－ＰＰＧ共重合体、及びこれらの組み合わせから選択され、（２）前記正電荷分子、オリゴマー又はポリマー（ｉｉ）が、（Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；アルコキシシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミン、アミノ基を有する有機アルコキシシラン、及びこれらの組み合わせから選択され、又は（３）（１）及び（２）の両方、請求項４に記載の方法。
  11. 前記細孔内表面修飾が、末端ヒドロカルビル部分を有しないシラン及び少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシランを使用することによって実現し、前記末端ヒドロカルビル部分を有しないシランと、前記少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシランとのモル比が５０：１未満である、請求項４に記載の方法。
  12. 前記末端ヒドロカルビル部分が、末端芳香族部分、末端脂肪族部分、末端脂環族部分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  13. 追加の活性薬剤の投与を更に含む、請求項１に記載の方法。
  14. タキサン系化学療法薬を負荷したメソ多孔質シリカナノ粒子であって、特徴（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ、又は特徴（ｅ）及び（ｂ）の組み合わせ又は特徴（ｂ）及び（ｄ）の組み合わせ：
    （ａ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマー及び（ｉｉ）正電荷分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾であって、（ｉ）と（ｉｉ）とのモル比が６０：１～４：１の範囲である、表面修飾；
    （ｂ）末端ヒドロカルビル部分による細孔表面修飾；
    （ｃ）任意選択で、ＴＥＭで測定して、６０ｎｍ以下の平均粒径；
    （ｄ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定して、６０ｎｍ以下の平均動的光散乱粒径；及び
    （ｅ）（ｉ）有機分子、オリゴマー又はポリマーによる表面修飾
    を有する、メソ多孔質シリカナノ粒子。
  15. 特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）、又は特徴（ｅ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有する、請求項１４に記載のメソ多孔質シリカナノ粒子。
  16. 前記タキサン系化学療法薬が、パクリタキセル（ＰＴＸ）、カバジタキセル（ＣＴＸ）及びドセタキセル（ＤＴＸ）からなる群から選択される、請求項１４に記載のメソ多孔質シリカナノ粒子。
  17. 前記タキサン系化学療法薬がドセタキセル（ＤＴＸ）である、請求項１４に記載のメソ多孔質シリカナノ粒子。
  18. （１）前記有機分子、オリゴマー又はポリマー（ｉ）が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ＰＥＧ－ＰＰＧ共重合体、及びこれらの組み合わせから選択され、（２）前記正電荷分子、オリゴマー又はポリマー（ｉｉ）が、（Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；アルコキシシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミン、アミノ基を有する有機アルコキシシラン、及びこれらの組み合わせから選択され、又は（３）（１）及び（２）の両方、請求項１４に記載のメソ多孔質シリカナノ粒子。
  19. 前記細孔表面修飾が、末端ヒドロカルビル部分を有しないシラン及び少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシランを使用することによって実現し、前記末端ヒドロカルビル部分を有しないシランと、前記少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を有するシランとのモル比が５０：１未満である、請求項１４に記載のメソ多孔質シリカナノ粒子。
  20. 前記末端ヒドロカルビル部分が、末端芳香族部分、末端脂肪族部分、末端脂環族部分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載のメソ多孔質シリカナノ粒子。
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