JP2023116167A - 標的核酸検出用オリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents

Abstract

【課題】 標的核酸を高感度に検出可能なステムループ構造を有したプローブを提供すること。【解決の手段】 ステム領域の塩基配列を、（ｉ）一方の末端がＣＣＣＴｇＴｇであり他方の末端がＣＡＣＡｇｇｇ、（ｉｉ）一方の末端がＣＣＣＴｇＴｇＴｇであり他方の末端がＣＡＣＡＣＡｇｇｇ、および（ｉｉｉ）一方の末端がＣＴＣｇｇｇであり他方の末端がＣＣＣｇＡｇのいずれかにすることで、前記課題を解決する。【選択図】 なし

Description

本発明は、標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。特に本発明は、ステムループ構造を有した、標的核酸を高感度に検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに関する。

ウイルス感染症の検査において、試料中に含まれるウイルス核酸を標的とし検出する方法を採用する場合、一般に前記試料中に含まれるウイルス核酸が極微量であることから、前記ウイルス核酸を増幅し検出する方法が用いられる。

標的核酸を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が広く知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有する一組のプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下で、熱変性－プライマーアニール－伸長反応からなるサイクルを繰り返し行なうことによってＤＮＡを増幅する方法である。また標的核酸がＲＮＡの場合、逆転写酵素によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲ法を行なう、いわゆるＲＴ－ＰＣＲ法が知られている。しかし、ＰＣＲ法およびＲＴ－ＰＣＲ法は急激に何度も反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。

一方、一定温度で標的ＲＮＡを増幅する方法としてＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった方法が知られている。これらの方法は、反応温度を昇降させることなく一定温度で核酸が増幅するため、簡便に核酸を増幅できる。そのため自動化の際、反応装置の省力化や低コスト化ができる点で好ましい方法といえる。また、近年では、ｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）法などのデジタル核酸増幅法が知られている。デジタル核酸増幅法は、標的核酸を含む反応液を液滴化し、核酸増幅を行なう方法である。

前述した方法で増幅した標的核酸は、当該核酸の特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する。前記プローブの例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＴａｑＭａｎ（商品名）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブなどの蛍光色素標識プローブがあげられる。中でも標的核酸の検出をｄｄＰＣＲ法などのデジタル核酸増幅法で行なう場合、エンドポイントでの蛍光強度に基づき行なうため、蛍光強度が高く、かつＳ／Ｎ比も高い、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブが好ましい。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブは、標的核酸（核酸増幅している場合は標的核酸の増幅産物）の一部と相補的または相同的な配列を有するループ領域と、当該ループ領域の両末端に付加した二本鎖形成領域（ステム領域）から構成される、ステムループ構造を有したプローブであり、かつ前記ステム領域の一方の末端に蛍光色素（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ）、他方の末端に消光剤（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）をさらに付加している（図１）。前記ループ領域が標的核酸またはその増幅産物とハイブリダイズしていないときは、前記ステム領域により蛍光色素と消光剤とが接近しているため、当該蛍光色素による蛍光を発しないが、前記ループ領域が標的核酸またはその増幅産物とハイブリダイズすると、前記ステム領域が解離し、蛍光色素が消光剤から離れることで、当該蛍光色素由来の蛍光を発する。一例として、特許文献１には、デジタル核酸増幅法で試料中に含まれるＣ型肝炎ウイルス核酸を増幅し、当該増幅した核酸をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブで検出した例を開示している。

特開２０２０－１６２５９１号公報

本発明の課題は、標的核酸を高感度に検出可能なステムループ構造を有したプローブを提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブを構成する二本鎖形成領域（ステム領域）の塩基配列を最適化することで、本発明を完成するにいたった。

すなわち本発明の第一の態様は、
標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有するループ領域と、当該ループ領域の両末端に付加したステム領域とを有した、前記標的核酸検出用オリゴヌクレオチドプローブであって、
前記ステム領域の塩基配列が以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかである、前記プローブである；
（ｉ）一方の末端がＣＣＣＴｇＴｇであり他方の末端がＣＡＣＡｇｇｇ、
（ｉｉ）一方の末端がＣＣＣＴｇＴｇＴｇであり他方の末端がＣＡＣＡＣＡｇｇｇ、
（ｉｉｉ）一方の末端がＣＴＣｇｇｇであり他方の末端がＣＣＣｇＡｇ。

また本発明の第二の態様は、プローブの一方の末端に蛍光色素を、他方の末端に消光剤を、さらに付加した、前記第一の態様に記載のプローブである。

また本発明の第三の態様は、標的核酸がアデノ随伴ウイルス核酸であり、ループ領域の塩基配列が配列番号２７に記載の配列またはその相補配列である、前記第一または第二の態様に記載のプローブである。

また本発明の第四の態様は、標的核酸がＣ型肝炎ウイルス核酸であり、ループ領域の塩基配列が配列番号２８に記載の配列またはその相補配列である、前記第一または第二の態様に記載のプローブである。

さらに本発明の第五の態様は、標的核酸の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、核酸増幅試薬と、前記特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有するループ領域と当該ループ領域の両末端に付加したステム領域とを有した前記第一から第四の態様のいずれかに記載のプローブとを含む、標的核酸の検出試薬である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のプローブのうち、ループ領域は標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有している。本発明において、相補的な配列（相補配列）とは、標的核酸に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能な配列をいい、相同的な配列（相同配列）とは、標的核酸の相補配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能な配列をいう。ここでいう「ストリンジェントな条件」の例としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。

一例を示せば、相同性（例えば、同一性や類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。限定されないが、具体的には、ハイブリダイゼーション条件として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（商品名）、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅検出条件があげられる。また、洗浄条件として、６０℃、１×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ等のストリンジェントな条件に相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２から３回洗浄する条件等が挙げられる。

ループ領域の好ましい例として、標的核酸がアデノ随伴ウイルス核酸である場合は配列番号２７に記載の配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが、標的核酸がＣ型肝炎ウイルス核酸である場合は配列番号２８に記載の配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドが、それぞれあげられる。

本発明のプローブは、前述したループ領域の両末端に付加したステム領域の塩基配列が、（ｉ）一方の末端がＣＣＣＴｇＴｇであり他方の末端がＣＡＣＡｇｇｇ、（ｉｉ）一方の末端がＣＣＣＴｇＴｇＴｇであり他方の末端がＣＡＣＡＣＡｇｇｇ、および（ｉｉｉ）一方の末端がＣＴＣｇｇｇであり他方の末端がＣＣＣｇＡｇ、のいずれかであることを特徴としている。なおこれら塩基配列を付加するループ領域の末端位置に限定はなく、例えば前記（ｉ）の場合、
ＣＣＣＴｇＴｇをループ領域の５’末端側に、ＣＡＣＡｇｇｇをループ領域の３’末端側に、それぞれ付加してもよいし、
ＣＣＣＴｇＴｇをループ領域の３’末端側に、ＣＡＣＡｇｇｇをループ領域の５’末端側に、それぞれ付加してもよい。

前述したステム領域の一方の末端に蛍光色素を、他方の末端に消光剤をさらに付加すると、標的核酸を簡便かつ高感度に検出できる点で好ましい。蛍光色素および消光剤を付加するステム領域の末端位置に限定はない。すなわち、
蛍光色素をステム領域の５’末端側に、消光剤をステム領域の３’末端側に、それぞれ付加してもよいし、
蛍光色素をステム領域の３’末端側に、消光剤をステム領域の５’末端側に、それぞれ付加してもよい。

本発明のプローブに付加する蛍光色素および消光剤は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブで用いられる蛍光色素および消光剤の組み合わせを適用してよい。具体的には、
蛍光色素として６－ＦＡＭ（６－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＪＯＥ（６－Ｃａｒｂｏｘｙ－４’，５’－Ｄｉｃｈｌｏｒｏ－２’，７’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＥＴ（５’－Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）およびＨＥＸ（５’－Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）のいずれかを用いる場合は、消光剤としてＢＨＱ－１（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）またはＤＡＢＣＹＬ（４－（（４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ）を用いればよく、
蛍光色素としてＣｙ３（Ｃｙａｎｉｎｅ ３）、ＲＯＸ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ Ｘ）およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１ ａｃｉｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）のいずれかを用いる場合は、消光剤としてＢＨＱ－２（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）またはＤＡＢＣＹＬを用いればよく、
蛍光色素としてＣｙ５（Ｃｙａｎｉｎｅ ５）またはＣｙ５．５（Ｃｙａｎｉｎｅ ５．５）を用いる場合は、消光剤としてＢＨＱ－３（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）またはＤＡＢＣＹＬを用いればよい。

試料中に含まれる標的核酸を、本発明のプローブを用いて検出する際、当該プローブのループ領域の塩基配列が互いに相補配列とならない限り、複数添加してもよい。

本発明のプローブを用いて標的核酸を検出する際、あらかじめ当該標的核酸の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、核酸増幅酵素とを用いて、前記特定塩基配列を増幅してから検出すると、標的核酸をより高感度に検出できる点で好ましい。なお本明細書において特定塩基配列とは、標的核酸のうち、第一のプライマーとの相補領域の３’末端から第二のプライマーとの相同領域の５’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち第一および第二のプライマーならびに核酸増幅酵素により、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。

また標的核酸のうち、本発明のプローブのループ領域とハイブリダイズ可能な配列（相補配列）は、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列内に位置しており、前記増幅した核酸は本発明のプローブで検出できる。なお特定塩基配列が増幅される場合、本発明のプローブのループ領域は当該特定塩基配列の一部と相補的な配列となり、特定塩基配列の相補配列が増幅される場合、本発明のプローブのループ領域は当該特定塩基配列の一部と相同的な配列となる。

なお第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸から、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法により、ＲＮＡを増幅できる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

標的核酸がアデノ随伴ウイルス核酸であり、かつ配列番号２７に記載の配列またはその相補配列からなるループ配列を有した本発明のプローブで検出する場合は、第一のプライマーとして配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、第二のプライマーとして配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いると好ましい。また標的核酸がＣ型肝炎ウイルスであり、かつ配列番号２８に記載の配列またはその相補配列からなるループ配列を有した本発明のプローブで検出する場合は、第一のプライマーとして配列番号２２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、第二のプライマーとして配列番号２３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いると好ましい。

なお、本発明において標的核酸は、アデノ随伴ウイルス核酸、C型肝炎ウイルス核酸に限らずインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスの様なウイルス核酸や、ウイルス以外の生物の核酸、人工的に作製した核酸であってもよく、適宜標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有するループ領域と、当該ループ領域の両末端に付加した二本鎖形成領域（ステム領域）とを有し、かつ当該ステム領域の塩基配列を最適化したプローブを設計することで標的核酸を高感度に検出することができる。
特定塩基配列またはその相補配列を増幅させる際の反応温度は、使用する核酸増幅酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ（融解温度）等に依存するが、核酸増幅酵素としてＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび９６－７ ＤＮＡポリメラーゼを用い、第一および第二のプライマーならびに本発明のプローブのループ領域の長さが１０塩基以上３０塩基以下である場合は、３５℃以上６５℃以下で反応温度を設定すればよく、４０℃以上５０℃以下で設定するとより好ましい。

本発明のプローブは、標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有するループ領域と、当該ループ領域の両末端に付加した二本鎖形成領域（ステム領域）とを有し、かつ当該ステム領域の塩基配列を最適化したプローブであり、標的核酸を高感度に検出できる。

さらに標的核酸の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、核酸増幅試薬と、前記特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有するループ領域を有した本発明のプローブとを含む、標的核酸の検出試薬の態様にすると、標的核酸の特定塩基配列またはその相補配列を増幅してから本発明のプローブで検出するため、標的核酸をより高感度に検出できる。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブの説明図である。

以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。

実施例１ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）一本鎖ＤＮＡの調製
ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを標的核酸として用い、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブのステム領域の違いによる標的核酸検出への影響を検討した。

特開２０２１－１７０９７５号公報に記載の方法で作製した、ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡ（配列番号１）（以下、「ＮＳ３」とも表記する）溶液を、０．０１％（ｗ／ｖ）コール酸ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ）バッファーを用いて３．０×１０^４コピー／２μＬとなるように希釈し、これをＤＮＡ試料とした。

（２）以下の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した後、前記（１）で調製したＤＮＡ試料２μＬを添加した。なおＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ（配列番号５から２０）のループ領域（配列番号２７）は、ＮＳ３（配列番号１）の１４７７番目から１４９２番目までの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、かつステム領域の５’末端にＦＡＭを、３’末端にＩＢＦＱを、それぞれ付加している。また第一のプライマーは、ＮＳ３（配列番号１）の１６２０番目から１６３７番目までの塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであり、かつ当該５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号４）を付加している。また第二のプライマーは、ＮＳ３（配列番号１）の１４２９番目から１４４６番目までの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
６７ｍＭ トレハロース
７５ｎＭ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ（配列番号５から２０のいずれか、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号２）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号３）
１．３３Ｕ ９６－７ ＤＮＡポリメラーゼ
１．４２Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
９５Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。

開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１９．０ｍＭ 塩化マグネシウム
８０．０ｍＭ 塩化カリウム
３．８％（ｗ／ｖ） グリセロール
１０．５％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。

（５）開始剤添加１０分後の反応液の蛍光強度値を、初期蛍光強度値（開始剤添加時および添加直後の蛍光強度値の平均）で除することで蛍光強度比を算出した。

（６）ＤＮＡ試料の代わりに陰性コントロール（０コピー）を添加した他は、（２）から（５）と同様な方法で蛍光強度比を算出し、（５）で算出した蛍光強度比との差を算出した。

結果を表１から３に示す。特開２０２１－１７０９７５号公報で開示したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブにおけるステム領域（ＣＣＣｇｇｇ／ＣＣＣｇｇｇ［（５’末端側塩基配列／３’末端側塩基配列）を意味する、以下同じ］、配列番号５）での結果（蛍光強度比の差）を基準とし比較した結果、ステム領域をＣＣＣＴｇＴｇ／ＣＡＣＡｇｇｇ（配列番号６、表１から３）、ＣＣＣＴｇＴｇＴｇ／ＣＡＣＡＣＡｇｇｇ（配列番号１０、表１）、またはＣＴＣｇｇｇ／ＣＣＣｇＡｇ（配列番号１３、表２）にすることで、蛍光強度比の差が顕著に拡大していることがわかる。したがって、これら塩基配列をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブにおけるステム領域とすることで、ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを、より高感度に検出できることが示唆される。

一方、特開２０２１－１７０９７５号公報での知見（ステム領域：ＣＣＣｇｇｇ／ＣＣＣｇｇｇ）を基づき、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）のみからなるステム領域を複数設計したが、蛍光強度比の差が顕著に拡大したステム領域は見出せなかった（配列番号１５から２０、表３）。

実施例２ Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの検出
標的核酸をＡＡＶ一本鎖ＤＮＡからＣ型肝炎ウイルスＲＮＡに替えても、本発明のプローブの効果を有しているか、確認した。

（１）Ｃ型肝炎ウイルス標準ＲＮＡ（以下、単に「標準ＲＮＡ」とも表記）遺伝子が挿入されたプラスミドから、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、前記標準ＲＮＡ（配列番号２１）を調製した。当該標準ＲＮＡを注射用水を用いて３×１０^４コピー／２μＬとなるように希釈し、これをＲＮＡ試料とした。

（２）以下の組成からなる反応液１２μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、前記（１）で調製したＲＮＡ試料２μＬを添加した。なおＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ（配列番号２４から２６）のループ領域（配列番号２８）は、標準ＲＮＡ（配列番号２１）の１０８番目から１２２番目までの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ウラシル（Ｕ）はチミン（Ｔ）に変換、以下同じ）であり、ただしループ領域７番目（配列番号２４では１３番目、配列番号２５では１４番目、配列番号２６では１５番目）はシトシンとチミンとの混合塩基（Ｙ）としている。また第一のプライマー（配列番号２２）は標準ＲＮＡ（配列番号２１）の１２５番目から１４５番目までの塩基配列の相補配列からなるオリゴヌクレオチドであり、かつ当該５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号４）を付加している。また第二のプライマーは、標準ＲＮＡ（配列番号２１）の１番目から１６番目までの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
各０．３３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．３ｍＭ ＩＴＰ
１５０ｍＭ トレハロース
５０ｎＭ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ（配列番号２４から２６のいずれか）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号２２）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号２３）
１２．８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１６６Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤６μＬを添加した。

開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１８．４ｍＭ 塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ 塩化カリウム
２．５％（ｗ／ｖ） グリセロール
９．０％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ
０．１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）
（４）実施例１（４）に記載の方法で蛍光強度を測定し、実施例１（５）に記載の方法で蛍光強度比を算出し、実施例１（６）に記載の方法で蛍光強度比の差を算出した。

結果を表４に示す。実施例１と同様、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブにおけるステム領域をＣＣＣｇｇｇ／ＣＣＣｇｇｇ（配列番号２４）から本発明のプローブの一態様であるＣＣＣＴｇＴｇ／ＣＡＣＡｇｇｇ（配列番号２５）にすることで蛍光強度比の差が著しく拡大した一方、ＣＣＣｇｇｇ以外のシトシンおよびグアニンのみからなるステム領域（ＣＣＣＣｇｇｇｇ／ＣＣＣＣｇｇｇｇ、配列番号２６）にすると蛍光強度比の差が著しく縮小した。

Claims (5)

1. 標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有するループ領域と、当該ループ領域の両末端に付加した二本鎖形成領域（ステム領域）とを有した、前記標的核酸検出用オリゴヌクレオチドプローブであって、
   前記ステム領域の塩基配列が以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかである、前記プローブ；
   （ｉ）一方の末端がＣＣＣＴｇＴｇであり他方の末端がＣＡＣＡｇｇｇ、
   （ｉｉ）一方の末端がＣＣＣＴｇＴｇＴｇであり他方の末端がＣＡＣＡＣＡｇｇｇ、
   （ｉｉｉ）一方の末端がＣＴＣｇｇｇであり他方の末端がＣＣＣｇＡｇ。
2. プローブの一方の末端に蛍光色素を、他方の末端に消光剤を、さらに付加した、請求項１に記載のプローブ。
3. 標的核酸がアデノ随伴ウイルス核酸であり、ループ領域の塩基配列が配列番号２７に記載の配列またはその相補配列である、請求項１または２に記載のプローブ。
4. 標的核酸がＣ型肝炎ウイルス核酸であり、ループ領域の塩基配列が配列番号２８に記載の配列またはその相補配列である、請求項１または２に記載のプローブ。
5. 標的核酸の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、核酸増幅試薬と、前記特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有するループ領域と当該ループ領域の両末端に付加したステム領域とを有した請求項１から４のいずれかに記載のプローブとを含む、標的核酸の検出試薬。

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