JP2023116021A - Method for producing nanoparticle - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ナノ粒子の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing nanoparticles.
ナノ粒子、特に生体適合性ポリマーのナノ粒子は、様々な用途で使用することができ、例えば、所定の生理活性物質に対する吸着材、又は薬剤を送達するための担体として使用することができる。 Nanoparticles, particularly nanoparticles of biocompatible polymers, can be used in a variety of applications, for example, as adsorbents for certain biologically active substances or as carriers for the delivery of drugs.
ナノ粒子の製造方法としては、様々な方法が報告されている。例えば、特許文献１は、アクリル酸メトキシエチルと水とを混合し、モノマー水溶液を製造する工程と、前記モノマー水溶液を攪拌しながら加熱する工程と、重合開始剤を添加する工程と、を備えることを特徴とする、ナノ粒子の製造方法について開示している。
また、特許文献２は、所定の構造を有するビニル単量体を一定量使用して乳化重合することによる、ナノ粒子の製造方法について開示している。
Various methods have been reported as methods for producing nanoparticles. For example, Patent Document 1 discloses a process comprising mixing methoxyethyl acrylate and water to produce an aqueous monomer solution, heating the aqueous monomer solution while stirring, and adding a polymerization initiator. Disclosed is a method for producing nanoparticles, characterized by:
Moreover, Patent Document 2 discloses a method for producing nanoparticles by emulsion polymerization using a certain amount of a vinyl monomer having a predetermined structure.
特許文献１は、生体内部での利用のために、有機溶媒を使用せずに水を使用してナノ粒子を製造することを開示している。具体的には、特許文献１は、モノマー水溶液に加熱条件下で重合開始剤を添加するソープフリー重合によってナノ粒子を製造することを開示している。同様に、特許文献２も、水を溶媒として使用しており、モノマー及び乳化剤を含む水溶液に加熱条件下で重合開始剤を添加する乳化重合によってナノ粒子を製造することを開示している。 US Pat. No. 6,200,000 discloses the production of nanoparticles using water without the use of organic solvents for in vivo applications. Specifically, Patent Document 1 discloses producing nanoparticles by soap-free polymerization in which a polymerization initiator is added to an aqueous monomer solution under heating conditions. Similarly, Patent Document 2 also uses water as a solvent and discloses producing nanoparticles by emulsion polymerization in which a polymerization initiator is added to an aqueous solution containing monomers and an emulsifier under heating conditions.
特許文献１及び２に記載の方法でナノ粒子を製造した場合、不純物（例えば、未反応のモノマー）を透析等によって除去する必要があり、後処理が煩雑となる。また、目的とするナノ粒子を形成するためには、重合条件（例えば、反応温度及び撹拌速度）を厳密に制御することが必要とされる。 When nanoparticles are produced by the methods described in Patent Documents 1 and 2, it is necessary to remove impurities (eg, unreacted monomers) by dialysis or the like, which complicates post-treatment. In addition, strict control of the polymerization conditions (eg, reaction temperature and stirring speed) is required to form the desired nanoparticles.
そのため、本発明は、ナノ粒子の簡便な製造方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a simple method for producing nanoparticles.
本発明者等が鋭意検討した結果、所定の分子量を有する化合物を水と混合するだけで、ナノ粒子を形成できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies by the present inventors, they have found that nanoparticles can be formed simply by mixing a compound having a predetermined molecular weight with water, and have completed the present invention.
本発明は以下の実施形態を含む。
［１］
下記一般式（１）：
Ｘは、炭化水素基であり、
Ｙは、酸素原子を有する置換基である］
で表される構成単位を含む化合物を準備する工程と、
前記化合物と水媒体とを混合して、前記化合物を含むナノ粒子を含む水系混合物を得る工程と、
を含み、
ゲル浸透クロマトグラフィーによって得られる前記化合物の微分分子量分布曲線において、１，０００以上５，０００以下の分子量の領域のピークの面積が、全領域のピークの面積を基準として、５％以上である、ナノ粒子の製造方法。
［２］
ゲル浸透クロマトグラフィーによって得られる前記化合物の微分分子量分布曲線において、１，０００以上５，０００以下の分子量の領域のピークの面積が、全領域のピークの面積を基準として、１０％以上である、［１］に記載の製造方法。
［３］
Ｙが、エステル結合及び／又はエーテル結合を含む炭化水素基である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］
前記一般式（１）が、下記一般式（２）：
Ｒ1は、水素原子又はメチル基であり、
Ｒ2は、メチル基又はエチル基であり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、２～６の整数であり、
ｐは、０又は１であり、
ｑは、０～２の整数であり、
ｒは、０～３の整数である］
で表される、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］
前記混合が、１０℃以上５０℃未満で実施される、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］
前記混合が、０℃以上１０℃未満で実施された後に１０℃以上５０℃未満で更に実施される、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［７］
前記水系混合物を遠心分離し、上澄み液を得る工程を更に含む、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］
前記水系混合物をろ過し、ろ液を得る工程を更に含む、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［９］
前記ナノ粒子の平均粒子径が、３０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下である、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］
前記ナノ粒子の平均粒子径が、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］
前記水媒体のｐＨが、５以上９以下である、［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］
前記水媒体が、純水、注射用水、生理食塩水、細胞培養液、血漿、又は血清である、［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
The present invention includes the following embodiments.
[1]
The following general formula (1):
X is a hydrocarbon group,
Y is a substituent having an oxygen atom]
A step of preparing a compound containing a structural unit represented by
A step of mixing the compound and an aqueous medium to obtain an aqueous mixture containing nanoparticles containing the compound;
including
In the differential molecular weight distribution curve of the compound obtained by gel permeation chromatography, the area of the peak in the molecular weight range of 1,000 or more and 5,000 or less is 5% or more based on the peak area of the entire range. A method for producing nanoparticles.
[2]
In the differential molecular weight distribution curve of the compound obtained by gel permeation chromatography, the peak area in the molecular weight range of 1,000 or more and 5,000 or less is 10% or more based on the peak area of the entire range. The production method according to [1].
[3]
The production method according to [1] or [2], wherein Y is a hydrocarbon group containing an ester bond and/or an ether bond.
[4]
The general formula (1) is represented by the following general formula (2):
R 1 is a hydrogen atom or a methyl group,
R 2 is a methyl group or an ethyl group,
n is an integer from 1 to 12,
m is an integer from 2 to 6,
p is 0 or 1,
q is an integer from 0 to 2;
r is an integer from 0 to 3]
The manufacturing method according to any one of [1] to [3], represented by
[5]
The production method according to any one of [1] to [4], wherein the mixing is performed at 10°C or higher and lower than 50°C.
[6]
The production method according to any one of [1] to [4], wherein the mixing is carried out at 0°C or higher and lower than 10°C, and then further carried out at 10°C or higher and lower than 50°C.
[7]
The production method according to any one of [1] to [6], further comprising the step of centrifuging the aqueous mixture to obtain a supernatant.
[8]
The production method according to any one of [1] to [6], further comprising filtering the aqueous mixture to obtain a filtrate.
[9]
The production method according to any one of [1] to [8], wherein the nanoparticles have an average particle size of 30 nm or more and 1,000 nm or less.
[10]
The production method according to any one of [1] to [9], wherein the nanoparticles have an average particle size of 100 nm or more and 500 nm or less.
[11]
The production method according to any one of [1] to [10], wherein the aqueous medium has a pH of 5 or more and 9 or less.
[12]
The production method according to any one of [1] to [11], wherein the aqueous medium is pure water, water for injection, physiological saline, cell culture medium, plasma, or serum.
本発明によれば、簡便な方法でナノ粒子を製造することができる。 According to the present invention, nanoparticles can be produced by a simple method.
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。 Embodiments of the present invention will be specifically described below, but the present invention is not limited to these, and various modifications are possible without departing from the scope of the invention.
＜ナノ粒子の製造方法＞
本発明の一実施形態は、下記一般式（１）：
Ｘは、炭化水素基であり、
Ｙは、酸素原子を有する置換基である］
で表される構成単位を含む化合物（以下「化合物（１）」という。）を準備する工程（以下「準備工程」という。）と、
前記化合物（１）と水媒体とを混合して、前記化合物（１）を含むナノ粒子を含む水系混合物を得る工程（以下「ナノ粒子形成工程」という。）と、
を含み、
ゲル浸透クロマトグラフィーによって得られる前記化合物（１）の微分分子量分布曲線において、１，０００以上５，０００以下の分子量の領域のピークの面積が、全領域のピークの面積を基準として、５％以上である、ナノ粒子の製造方法に関する。
<Method for producing nanoparticles>
One embodiment of the present invention is represented by the following general formula (1):
X is a hydrocarbon group,
Y is a substituent having an oxygen atom]
A step of preparing a compound (hereinafter referred to as "compound (1)") containing a structural unit represented by (hereinafter referred to as "preparing step");
A step of mixing the compound (1) and an aqueous medium to obtain an aqueous mixture containing nanoparticles containing the compound (1) (hereinafter referred to as “nanoparticle formation step”);
including
In the differential molecular weight distribution curve of the compound (1) obtained by gel permeation chromatography, the peak area in the molecular weight range of 1,000 to 5,000 is 5% or more based on the peak area of the entire range. , relates to a method for producing nanoparticles.
本実施形態に係る製造方法では、化合物（１）を水と混合するだけで、ナノ粒子を形成することができる。この理由としては、下記のものが想定されるが、本発明はこの想定理由によって何ら限定されるものではない。
側鎖に酸素原子を有する置換基などの水と相互作用しうる元素を有する高分子では、高分子側鎖の親水性部分が水和することにより水溶性が観察され得る。また、側鎖の構造中に親水性部分と疎水性部分を有する高分子は、水中で下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）と呼ばれる相転移温度を有し、ある温度を境にそれより高い温度では疎水性部分の相互作用が強まることで不溶化し、それより低い温度では親水性部分の水和によって水に溶解され得る。この相転移挙動によって凝集・析出する粒子のサイズは、高分子の主鎖・側鎖の構造や分子量だけでなく、相転移を起こさせる温度や濃度などによっても影響を受けることが知られている。
すなわち、化合物（１）を水と混合した際に、化合物（１）の側鎖に酸素原子を有する置換基を有することにより、その親水性部分が水和状態となり得、一方で化合物（１）の疎水性部分の相互作用が働き得る。この両者の働きを利用して、特定の分子量において、温度や濃度を適宜に調節し前記相転移の挙動をコントロールすることにより、ナノ粒子を形成させることができる。
In the production method according to the present embodiment, nanoparticles can be formed simply by mixing compound (1) with water. The reason for this is assumed to be as follows, but the present invention is not limited by this assumed reason.
In polymers having elements capable of interacting with water, such as substituents having oxygen atoms in their side chains, water solubility can be observed due to hydration of the hydrophilic moieties of the polymer side chains. In addition, polymers with hydrophilic and hydrophobic parts in the side chain structure have a phase transition temperature called the lower critical solution temperature (LCST) in water, and above a certain temperature, they are hydrophobic. Stronger interactions of the hydrophilic moieties make them insoluble, and at lower temperatures they can be dissolved in water by hydration of the hydrophilic moieties. It is known that the size of particles that aggregate and precipitate due to this phase transition behavior is affected not only by the structure and molecular weight of the main chain and side chains of the polymer, but also by the temperature and concentration that cause the phase transition. .
That is, when the compound (1) is mixed with water, the side chain of the compound (1) has a substituent having an oxygen atom, so that the hydrophilic portion thereof can be in a hydrated state, while the compound (1) interaction of the hydrophobic portion of Utilizing the functions of both, nanoparticles can be formed at a specific molecular weight by appropriately adjusting the temperature and concentration to control the behavior of the phase transition.
［準備工程］
本実施形態に係る製造方法における準備工程は、化合物（１）を準備する工程である。準備の方法は特に限定されず、化合物（１）を合成してもよいし、購入してもよい。化合物（１）の形態は特に限定されず、例えば、固体形態、及び溶液形態が挙げられる。
[Preparation process]
The preparation step in the production method according to this embodiment is a step of preparing compound (1). The preparation method is not particularly limited, and compound (1) may be synthesized or purchased. The form of compound (1) is not particularly limited, and examples thereof include a solid form and a solution form.
（化合物（１））
化合物（１）は、前記一般式（１）で表される構成単位を含む化合物（分子量分布を有する重合体）である。化合物（１）は、生体適合性を有することが好ましい。
(Compound (1))
The compound (1) is a compound (polymer having a molecular weight distribution) containing a structural unit represented by the general formula (1). Compound (1) preferably has biocompatibility.
一般式（１）において、Ｘは、炭化水素基であり、好ましくは飽和炭化水素基であり、より好ましくは炭素数２～１４の飽和炭化水素基であり、更に好ましくは炭素数２又は３の飽和炭化水素基である。 In the general formula (1), X is a hydrocarbon group, preferably a saturated hydrocarbon group, more preferably a saturated hydrocarbon group having 2 to 14 carbon atoms, still more preferably 2 or 3 carbon atoms It is a saturated hydrocarbon group.
一般式（１）において、Ｙは、酸素原子を有する置換基であり、好ましくはエステル結合及び／又はエーテル結合を含む炭化水素基であり、より好ましくはエステル結合及びエーテル結合を含む炭化水素基である。 In general formula (1), Y is a substituent having an oxygen atom, preferably a hydrocarbon group containing an ester bond and/or an ether bond, more preferably a hydrocarbon group containing an ester bond and an ether bond. be.
化合物（１）が、一般式（１）で表される構成単位を２以上含む場合には、各構成単位におけるＸ及びＹはそれぞれ同じでもよいし、異なっていてもよい。 When compound (1) contains two or more structural units represented by general formula (1), X and Y in each structural unit may be the same or different.
一般式（１）は、下記一般式（２）：
一般式（２）において、Ｒ1は、水素原子又はメチル基であり、好ましくは水素原子である。 In general formula (2), R 1 is a hydrogen atom or a methyl group, preferably a hydrogen atom.
一般式（２）において、Ｒ2は、メチル基又はエチル基であり、好ましくはメチル基である。 In general formula (2), R 2 is a methyl group or an ethyl group, preferably a methyl group.
一般式（２）において、ｎは、１～１２の整数であり、好ましくは１～８の整数であり、より好ましくは１～４の整数であり、更に好ましくは１である。 In general formula (2), n is an integer of 1 to 12, preferably an integer of 1 to 8, more preferably an integer of 1 to 4, and still more preferably 1.
一般式（２）において、ｍは、２～６の整数であり、好ましくは２～４の整数である。 In general formula (2), m is an integer of 2-6, preferably an integer of 2-4.
一般式（２）において、ｐは、０又は１であり、好ましくは１である。 In general formula (2), p is 0 or 1, preferably 1.
一般式（２）において、ｑは、０～２の整数であり、好ましくは１又は２であり、より好ましくは１である。 In general formula (2), q is an integer of 0 to 2, preferably 1 or 2, more preferably 1.
一般式（２）において、ｒは、０～３の整数であり、好ましくは０又は１であり、より好ましくは０である。 In general formula (2), r is an integer of 0 to 3, preferably 0 or 1, more preferably 0.
特に限定するものではないが、一般式（２）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2がメチル基であり、ｎが１であり、ｐが１であり、ｑが１であり、ｒが０であることが好ましい。このような構成単位は、メトキシエチルアクリレート（以下「ＭＥＡ」ともいう。）に由来するものである。ＭＥＡに由来する構成単位を複数含む化合物を、ポリメトキシエチルアクリレート（以下「ＰＭＥＡ」ともいう。）と称する。 Although not particularly limited, in the general formula (2), R 1 is a hydrogen atom, R 2 is a methyl group, n is 1, p is 1, q is 1, r is preferably 0. Such structural units are derived from methoxyethyl acrylate (hereinafter also referred to as "MEA"). A compound containing a plurality of constitutional units derived from MEA is called polymethoxyethyl acrylate (hereinafter also referred to as “PMEA”).
化合物（１）が、一般式（２）で表される構成単位を２以上含む場合には、各構成単位におけるＲ1、Ｒ2、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ及びｒはそれぞれ同じでもよいし、異なっていてもよい。 When compound (1) contains two or more structural units represented by general formula (2), R 1 , R 2 , n, m, p, q and r in each structural unit may be the same or , can be different.
化合物（１）は、一般式（１）又は（２）で表される構成単位に加えて、その他の構成単位を含んでいてもよい。その他の構成単位は、ナノ粒子の形成に悪影響を与えるものでなければ、特に限定されない。また、その他の構成単位は、生体適合性に悪影響を与えないものであることが好ましい。 Compound (1) may contain other structural units in addition to the structural units represented by general formula (1) or (2). Other structural units are not particularly limited as long as they do not adversely affect the formation of nanoparticles. In addition, other structural units are preferably those that do not adversely affect biocompatibility.
化合物（１）を構成する全ての構成単位に対する、一般式（１）又は（２）で表される構成単位の量は、好ましくは６０モル％以上であり、より好ましくは７０モル％以上であり、更に好ましくは８０モル％以上であり、特に好ましくは９０モル％以上である。このような量とすることによって、生体適合性をより向上させることができる。上限は特に限定されないが、例えば、１００モル％、９８モル％、又は９６モル％としてもよい。
一般式（１）又は（２）で表される構成単位の量は、得られた化合物（１）のＮＭＲ測定により定量することができる。また、重合反応後の溶媒に含まれる残存モノマーをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、仕込み時のモノマー量との差し引きから反応に消費されたモノマーを算出することができる。この結果から、得られた化合物（１）の構成単位を算出することができる。
The amount of the structural unit represented by general formula (1) or (2) is preferably 60 mol% or more, more preferably 70 mol% or more, relative to all the structural units constituting compound (1). , more preferably 80 mol % or more, particularly preferably 90 mol % or more. By setting it as such an amount, biocompatibility can be improved more. Although the upper limit is not particularly limited, it may be, for example, 100 mol %, 98 mol %, or 96 mol %.
The amount of the structural unit represented by general formula (1) or (2) can be quantified by NMR measurement of the obtained compound (1). In addition, the residual monomer contained in the solvent after the polymerization reaction is analyzed by gas chromatography (GC) or high performance liquid chromatography (HPLC), and the monomer consumed in the reaction is calculated from the subtraction from the amount of monomer at the time of preparation. be able to. From this result, the structural unit of the obtained compound (1) can be calculated.
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって得られる化合物（１）の微分分子量分布曲線において、１，０００以上５，０００以下の分子量の領域（以下「低分子量領域」という。）のピークの面積は、全領域のピークの面積を基準として、５％以上であり、好ましくは１０％以上であり、より好ましくは２０％以上であり、更に好ましくは３０％以上であり、特に好ましくは５０％以上である。化合物（１）のうち、低分子量領域のピークに対応する化合物（以下「低分子量化合物」という。）を、水媒体と混合することによってナノ粒子を形成することができる。低分子量領域のピークの面積の割合の上限は特に限定されないが、例えば、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、又は８０％としてもよい。 In the differential molecular weight distribution curve of compound (1) obtained by gel permeation chromatography (GPC), the peak area of the molecular weight region of 1,000 or more and 5,000 or less (hereinafter referred to as “low molecular weight region”) is Based on the peak area of the region, it is 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more, even more preferably 30% or more, and particularly preferably 50% or more. Among compounds (1), nanoparticles can be formed by mixing a compound corresponding to a peak in the low molecular weight region (hereinafter referred to as "low molecular weight compound") with an aqueous medium. The upper limit of the area ratio of the low molecular weight region peak is not particularly limited, but may be, for example, 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%.
化合物（１）の微分分子量分布曲線は、実施例に記載の方法によって得ることができる。なお、化合物（１）の分子量は、ポリスチレン換算値である。 A differential molecular weight distribution curve of compound (1) can be obtained by the method described in Examples. In addition, the molecular weight of compound (1) is a polystyrene conversion value.
ＧＰＣによって得られる化合物（１）の微分分子量分布曲線において、５，０００を超える分子量の領域（以下「高分子量領域」という。）のピークに対応する化合物（以下「高分子量化合物」という。）は、低分子量化合物を含むナノ粒子が形成された後、容易に除去可能である。そのため、重合により得られた低分子量化合物と高分子量化合物との混合物から、低分子量化合物を予め単離する工程は省略することができる。高分子量領域の上限は特に限定されないが、例えば、２００,０００、又は１００,０００としてもよい。 In the differential molecular weight distribution curve of compound (1) obtained by GPC, the compound (hereinafter referred to as "high molecular weight compound") corresponding to the peak of the molecular weight region exceeding 5,000 (hereinafter referred to as "high molecular weight region") is , can be easily removed after nanoparticles containing low molecular weight compounds are formed. Therefore, the step of previously isolating the low-molecular-weight compound from the mixture of the low-molecular-weight compound and the high-molecular-weight compound obtained by polymerization can be omitted. Although the upper limit of the high molecular weight region is not particularly limited, it may be, for example, 200,000 or 100,000.
（重合方法）
化合物（１）を合成によって準備する方法は、特に限定されず、既知の重合方法を適宜採用することができる。例えば、国際公開第２０１６／２０８６４２号に記載の重合方法を採用してもよい。
(Polymerization method)
A method for synthesizing compound (1) is not particularly limited, and a known polymerization method can be appropriately employed. For example, the polymerization method described in WO2016/208642 may be employed.
準備工程の一例として、重合反応により一般式（１）又は（２）で表される構成単位を形成するモノマーと、重合開始剤と、を溶媒の存在下で反応させる方法が挙げられる。この反応により得られる化合物（１）の微分分子量分布曲線は、例えば、重合開始剤の量を変化させることで調節することができる。すなわち、重合開始剤の量を増やすことにより、低分子量領域のピークの面積の割合を増やすことができる。 An example of the preparatory step is a method of reacting a monomer forming a structural unit represented by general formula (1) or (2) by polymerization with a polymerization initiator in the presence of a solvent. The differential molecular weight distribution curve of compound (1) obtained by this reaction can be adjusted, for example, by changing the amount of the polymerization initiator. That is, by increasing the amount of the polymerization initiator, the ratio of the peak area of the low molecular weight region can be increased.
モノマーの種類は、一般式（１）又は（２）で表される構成単位に応じて適宜選択すればよい。 The type of monomer may be appropriately selected according to the structural unit represented by general formula (1) or (2).
重合開始剤の種類は特に限定されないが、例えば、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、２，２’－アゾビス（４－メトキシ－２，４－ジメチルバレロニトリル）、２，２’－アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）、及び２，２’－アゾビス（２－シクロプロピルプロピオニトリル）が挙げられる。 Although the type of polymerization initiator is not particularly limited, for example, 2,2'-azobisisobutyronitrile, 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile), 2,2'- Azobis(2,4-dimethylvaleronitrile), and 2,2'-azobis(2-cyclopropylpropionitrile).
溶媒の種類は、重合反応を阻害しなければ特に限定されないが、例えば、エーテル系溶媒（例えば、ジオキサン及びテトラヒドロフラン）、ケトン系溶媒（例えば、メチルエチルケトン）、ニトリル系溶媒（例えば、アセトニトリル及びプロピオニトリル）、アミド系溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド）、及び芳香族炭化水素系溶媒（例えば、ベンゼン及びトルエン）が挙げられる。 The type of solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit the polymerization reaction. ), amide solvents (eg, N,N-dimethylformamide and N,N-dimethylacetamide), and aromatic hydrocarbon solvents (eg, benzene and toluene).
通常、重合反応で化合物（１）を準備すると、低分子量化合物と高分子量化合物との混合物が得られるが、高分子量化合物は、低分子量化合物を含むナノ粒子が形成された後、容易に除去できるため、低分子量化合物を予め単離する工程は省略することが可能である。 Generally, preparation of compound (1) in a polymerization reaction results in a mixture of low molecular weight compounds and high molecular weight compounds, but the high molecular weight compounds can be easily removed after nanoparticles containing the low molecular weight compounds are formed. Therefore, the step of preliminarily isolating the low-molecular-weight compound can be omitted.
（分画方法）
低分子量化合物が高分子量化合物と混合状態にある場合、分画によって低分子量化合物を単離してもよい。分画の方法は特に限定されず、既知の方法を適宜採用することができる。例えば、単離対象化合物に対する良溶媒と貧溶媒との割合を段階的に変更した複数の混合溶媒を使用して、複数の画分を得、目的の画分を選択することが挙げられる。低分子量化合物及び高分子量化合物がＰＭＥＡの場合には、例えば、トルエンとヘキサンとの混合溶媒を使用して分画を行うことができる。
(Fraction method)
When low molecular weight compounds are in admixture with high molecular weight compounds, the low molecular weight compounds may be isolated by fractionation. The fractionation method is not particularly limited, and known methods can be appropriately employed. For example, a plurality of mixed solvents in which the ratio of good solvent and poor solvent to the compound to be isolated is changed stepwise is used to obtain a plurality of fractions, and a desired fraction is selected. When the low-molecular-weight compound and the high-molecular-weight compound are PMEA, for example, fractionation can be performed using a mixed solvent of toluene and hexane.
［ナノ粒子形成工程］
本実施形態に係る製造方法におけるナノ粒子形成工程は、化合物（１）と水媒体とを混合して、前記化合物（１）を含むナノ粒子を含む水系混合物を得る工程である。
[Nanoparticle formation step]
The nanoparticle-forming step in the production method according to the present embodiment is a step of mixing compound (1) and an aqueous medium to obtain an aqueous mixture containing nanoparticles containing compound (1).
水媒体は、水を含む液体であれば特に限定されないが、生体適合性を有するものが好ましい。 The aqueous medium is not particularly limited as long as it is a liquid containing water, but one having biocompatibility is preferred.
水媒体のｐＨは、生体物質に悪影響を及ぼさない範囲が好ましく、好ましくは５以上９以下であり、より好ましくは６以上８以下である。 The pH of the aqueous medium is preferably in a range that does not adversely affect biological substances, preferably 5 or more and 9 or less, more preferably 6 or more and 8 or less.
水媒体としては、例えば、純水、注射用水、生理食塩水、細胞培養液、血漿、及び血清が挙げられる。 Aqueous media include, for example, pure water, water for injection, physiological saline, cell culture media, plasma, and serum.
化合物（１）と水媒体との混合温度は特に限定されないが、生体物質に悪影響を及ぼさない範囲が好ましく、好ましくは１０℃以上５０℃未満であり、より好ましくは１５℃以上４０℃以下である。 The temperature at which compound (1) is mixed with the aqueous medium is not particularly limited, but is preferably within a range that does not adversely affect biological substances, preferably 10° C. or higher and lower than 50° C., more preferably 15° C. or higher and 40° C. or lower. .
化合物（１）と水媒体との混合を、０℃以上１０℃未満で実施し、次に１０℃以上５０℃未満（好ましくは１５℃以上４０℃以下）で更に実施してもよい。この方法は、低分子量化合物と高分子量化合物との混合物を使用する際に好適である。すなわち、低分子量化合物及び高分子量化合物（特に、ＰＭＥＡ）は水に難溶性であるが、低温条件では溶解性が向上する性質を有するため、０℃以上１０℃未満で混合すると、これらの化合物が溶解する。その際、高分子量化合物に囲まれていた低分子量化合物が解放されることになり、解放された低分子量化合物がナノ粒子を形成することができるため、ナノ粒子の生成効率が向上する。 Mixing of compound (1) and an aqueous medium may be carried out at 0° C. or higher and lower than 10° C., and then further carried out at 10° C. or higher and lower than 50° C. (preferably 15° C. or higher and 40° C. or lower). This method is suitable when using mixtures of low and high molecular weight compounds. That is, low-molecular-weight compounds and high-molecular-weight compounds (in particular, PMEA) are poorly soluble in water, but have the property of improving solubility under low-temperature conditions. Dissolve. At that time, the low-molecular-weight compound surrounded by the high-molecular-weight compound is released, and the released low-molecular-weight compound can form nanoparticles, thereby improving the production efficiency of nanoparticles.
ナノ粒子の好ましい平均粒子径は、その用途に応じて異なるが、例えば、３０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下、又は１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下としてもよい。
ナノ粒子の平均粒子径は、実施例に記載の方法によって測定することができる。
A preferred average particle size of the nanoparticles varies depending on the application, but may be, for example, 30 nm or more and 1,000 nm or less, or 100 nm or more and 500 nm or less.
The average particle size of nanoparticles can be measured by the method described in Examples.
［ナノ粒子回収工程］
本実施形態に係る製造方法は、形成されたナノ粒子を回収する工程を更に含むことが好ましい。「回収」とは、ナノ粒子を他の成分から分離し、取得することを意味する。他の成分としては、例えば、ナノ粒子を形成しない高分子量化合物が挙げられる。なお、ナノ粒子を他の成分から分離し、廃棄することは「回収」には該当しない。
[Nanoparticle recovery step]
The production method according to this embodiment preferably further includes a step of collecting the formed nanoparticles. "Recovery" means separating and obtaining the nanoparticles from other components. Other ingredients include, for example, high molecular weight compounds that do not form nanoparticles. Note that separating nanoparticles from other components and discarding them does not fall under "recovery."
回収工程としては、例えば、ナノ粒子形成工程で得られた水系混合物を遠心分離し、上澄み液を得る工程が挙げられる。遠心分離により、高分子量化合物は沈殿し、ナノ粒子は上澄みに含まれるため、上澄みを得ることにより、ナノ粒子を回収することができる。 Examples of the recovery step include a step of centrifuging the aqueous mixture obtained in the nanoparticle formation step to obtain a supernatant. By centrifugation, the high-molecular-weight compound is precipitated, and the nanoparticles are contained in the supernatant, so the nanoparticles can be recovered by obtaining the supernatant.
遠心分離の遠心力は、例えば、１６００～３０００×ｇ、又は２０００～２６００×ｇとしてもよい。 The centrifugal force for centrifugation may be, for example, 1600-3000×g, or 2000-2600×g.
遠心分離の時間は、例えば、５～３０分、又は１０～２０分としてもよい。 The centrifugation time may be, for example, 5-30 minutes, or 10-20 minutes.
別の回収工程としては、例えば、ナノ粒子形成工程で得られた水系混合物をろ過し、ろ液を得る工程が挙げられる。ろ過により、高分子量化合物を除去し、ナノ粒子を含むろ液を得ることにより、ナノ粒子を回収することができる。 Another recovery step includes, for example, a step of filtering the aqueous mixture obtained in the nanoparticle formation step to obtain a filtrate. The nanoparticles can be recovered by filtering to remove high molecular weight compounds and obtaining a filtrate containing the nanoparticles.
以下、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below using examples and comparative examples, but the technical scope of the present invention is not limited thereto.
＜測定方法＞
［微分分子量分布曲線］
ピーク分子量が既知の標準ポリスチレンを用い、該標準ポリスチレンで校正したゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（島津社製「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＧＰＣシステム」、カラム構成：Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ－ｇｅｌ ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＨＨＲ－Ｈ、Ｇ５０００ＨＨＲ、Ｇ４０００ＨＨＲ、Ｇ３０００ＨＨＲ）を使用して、重合体の数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。（溶媒：テトラヒドロフラン、温度：４０℃、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ）。得られたクロマトグラムのピーク面積でＭｗ＝５０００以下の面積を除し、Ｍｗ＝５０００以下のポリマーの含有量を求めた。
<Measurement method>
[Differential molecular weight distribution curve]
Using a standard polystyrene with a known peak molecular weight, gel permeation chromatography (GPC) calibrated with the standard polystyrene ("Prominence GPC system" manufactured by Shimadzu Corporation, column configuration: Tosoh TSK-gel guardcolumn HHR-H, G5000HHR, G4000HHR, G3000HHR ) was used to determine the number average molecular weight (Mn) and weight average molecular weight (Mw) of the polymer. (Solvent: tetrahydrofuran, temperature: 40°C, flow rate: 1.0 mL/min). The area of Mw=5000 or less was divided by the peak area of the obtained chromatogram to obtain the content of the polymer of Mw=5000 or less.
［ナノ粒子の平均粒子径］
ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００、解析ソフトＮＴＡ３．４（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を使用してナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を実施した。
測定サンプル原液をモジュールセルに注入し、青色レーザ（４８８ｎｍ、＜４５ｍＷ）を照射し、その散乱光からサンプル原液中のナノ粒子のブラウン運動の様子をリアルタイムに観察した。その後、室温（２７℃）にて６０秒毎に合計５回サンプル原液中のナノ粒子のブラウン運動の速度を計測し、当該速度に基づき算出された粒子径の平均値から平均粒子径を算出した。実施例２では、その後３７℃に温度設定して１０分静置後、同様に平均粒子径を算出した。
[Average particle size of nanoparticles]
Nanoparticle tracking analysis (NTA) was performed using NanoSight NS300 and analysis software NTA3.4 (manufactured by Malvern).
A measurement sample undiluted solution was injected into a module cell, irradiated with a blue laser (488 nm, <45 mW), and the state of Brownian motion of nanoparticles in the sample undiluted solution was observed in real time from the scattered light. After that, the speed of the Brownian motion of the nanoparticles in the sample undiluted solution was measured five times in total every 60 seconds at room temperature (27°C), and the average particle size was calculated from the average value of the particle sizes calculated based on the speed. . In Example 2, the temperature was then set to 37° C. and after standing for 10 minutes, the average particle size was similarly calculated.
＜ポリメトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）の製造＞
［ＰＭＥＡ（０）の製造］
溶媒としての１，４－ジオキサン（６００ｇ）、２－メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）モノマー（３０．０ｇ）、及び重合開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（１．５１ｇ）を混合し、窒素雰囲気下７５℃で６時間反応させた。上記の反応を二回繰り返したのち、得られた重合溶液を混合してヘキサン注ぎ込むことでＰＭＥＡ（０）を５８．７ｇ得た。得られたＰＭＥＡ（０）の分子量はＭｗ＝１１４００、Ｍｎ＝３２５０であった。Ｍｗ＝１０００以上５０００以下の含有量は３８％であった。
<Production of polymethoxyethyl acrylate (PMEA)>
[Production of PMEA (0)]
1,4-dioxane (600 g) as a solvent, 2-methoxyethyl acrylate (MEA) monomer (30.0 g), and azobisisobutyronitrile (AIBN) (1.51 g) as a polymerization initiator were mixed. , under a nitrogen atmosphere at 75° C. for 6 hours. After the above reaction was repeated twice, the resulting polymerization solutions were mixed and hexane was poured into the mixture to obtain 58.7 g of PMEA (0). The obtained PMEA (0) had a molecular weight of Mw=11400 and Mn=3250. The content of Mw=1000 or more and 5000 or less was 38%.
［ＰＭＥＡ（１）の製造］
上記ＰＭＥＡ（０）（５８．７ｇ）をトルエン（５００ｍＬ）に溶解させ、攪拌しながら徐々にヘキサンを加えた。溶媒の比率（トルエン／ヘキサン）が０．２５になった時点で３０分間静置し、上澄み液を回収した。上澄み液の溶媒をエバポレーターで除去し、ＰＭＥＡ（１）を得た。ＰＭＥＡ（１）の分子量はＭｗ＝１５２０、Ｍｎ＝１３７０であった。Ｍｗ＝１０００以上５０００以下の含有量は８８％であった。
[Production of PMEA (1)]
The above PMEA (0) (58.7 g) was dissolved in toluene (500 mL), and hexane was gradually added while stirring. When the solvent ratio (toluene/hexane) reached 0.25, the mixture was allowed to stand for 30 minutes, and the supernatant was collected. The solvent of the supernatant was removed by an evaporator to obtain PMEA (1). The molecular weights of PMEA (1) were Mw=1520 and Mn=1370. The content of Mw=1000 or more and 5000 or less was 88%.
［ＰＭＥＡ（２）の製造］
上記ＰＭＥＡ（０）（５８．７ｇ）をトルエン（５００ｍＬ）に溶解させ、攪拌しながら徐々にヘキサンを加えた。溶媒の比率（トルエン／ヘキサン）が１なった時点で３０分間静置し、上澄み液を回収した。上澄み液の溶媒をエバポレーターで除去し、ポリマーを得た。前記ポリマー（４０ｇ）をトルエン（５００ｍＬ）に溶解させ、攪拌しながら徐々にヘキサンを加えた。溶媒の比率（トルエン／ヘキサン）が１．２５なった時点で３０分間静置し、上澄み液を回収した。上澄み液の溶媒をエバポレーターで除去し、ＰＭＥＡ（２）を得た。ＰＭＥＡ（２）の分子量はＭｗ＝１７４００、Ｍｎ＝９１５０であった。Ｍｗ＝１０００以上５０００以下の含有量は１３％であった。
[Production of PMEA (2)]
The above PMEA (0) (58.7 g) was dissolved in toluene (500 mL), and hexane was gradually added while stirring. When the solvent ratio (toluene/hexane) reached 1, the mixture was allowed to stand for 30 minutes, and the supernatant was collected. The solvent of the supernatant was removed by an evaporator to obtain a polymer. The polymer (40 g) was dissolved in toluene (500 mL) and hexane was gradually added while stirring. When the solvent ratio (toluene/hexane) reached 1.25, the mixture was allowed to stand for 30 minutes, and the supernatant was recovered. The solvent of the supernatant was removed by an evaporator to obtain PMEA (2). The molecular weights of PMEA (2) were Mw=17400 and Mn=9150. The content of Mw=1000 or more and 5000 or less was 13%.
［ＰＭＥＡ（３）の製造］
溶媒としての１，４－ジオキサン（６０ｇ）、ＭＥＡモノマー（１５ｇ）、及び重合開始剤としてのＡＩＢＮ（１５ｍｇ）を混合し、窒素雰囲気下７５℃で６時間反応させた。残存したＭＥＡモノマー、溶媒、及び低分子量画分を除去するため、良溶媒としてのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、及び貧溶媒としてのヘキサンを用いて、沈殿精製操作を３度繰り返した。生じた沈殿に対して純水１５００ｍＬを加えて１２時間攪拌し、水に可溶な成分を除去し、得られた沈殿を回収しＰＭＥＡ（３）を得た。ＰＭＥＡ（３）の分子量はＭｗ＝５８３００、Ｍｎ＝２０８００であった。Ｍｗ＝１０００以上５０００以下の含有量は１．３％であった。
[Production of PMEA (3)]
1,4-dioxane (60 g) as a solvent, MEA monomer (15 g), and AIBN (15 mg) as a polymerization initiator were mixed and reacted at 75° C. for 6 hours under a nitrogen atmosphere. To remove residual MEA monomers, solvent, and low molecular weight fractions, the precipitation purification procedure was repeated three times using tetrahydrofuran (THF) as a good solvent and hexane as a poor solvent. 1500 mL of pure water was added to the resulting precipitate, and the mixture was stirred for 12 hours to remove water-soluble components. The obtained precipitate was recovered to obtain PMEA (3). The molecular weights of PMEA (3) were Mw=58,300 and Mn=20,800. The content of Mw=1000 or more and 5000 or less was 1.3%.
＜ナノ粒子の形成＞
［実施例１］
ＰＭＥＡ（１）（０．２ｇ）に純水（１０ｍＬ）を加え、４℃で１時間静置した後、３７℃、２２８０×ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み液を回収した。回収した上澄み液に含まれるＰＭＥＡの分子量はＭｗ＝１４９０、Ｍｎ＝１３３０であった。
回収した上澄み液を、室温（２７℃）でナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）にて分析したところ、平均１０５ｎｍのナノ粒子が形成されていることを確認した。
<Formation of nanoparticles>
[Example 1]
Pure water (10 mL) was added to PMEA (1) (0.2 g), left to stand at 4° C. for 1 hour, and then centrifuged at 37° C. and 2280×g for 15 minutes to collect the supernatant. The molecular weights of PMEA contained in the collected supernatant were Mw=1490 and Mn=1330.
When the recovered supernatant was analyzed by nanoparticle tracking analysis (NTA) at room temperature (27° C.), it was confirmed that nanoparticles with an average size of 105 nm were formed.
［実施例２］
実施例１に記載の方法と同様に上澄み液を回収した。実施例２では、前記［ナノ粒子の平均粒子径］の欄に記載のとおり、回収した上澄み液を昇温し、３７℃でＮＴＡにて分析したところ、平均４４８ｎｍのナノ粒子が形成されていることを確認した。
[Example 2]
The supernatant was recovered in the same manner as described in Example 1. In Example 2, as described in the section [Average particle size of nanoparticles], the collected supernatant was heated and analyzed by NTA at 37 ° C. As a result, nanoparticles with an average size of 448 nm were formed. It was confirmed.
［実施例３］
ＰＭＥＡ（１）の代わりにＰＭＥＡ（２）を使用した以外は実施例１に記載の方法と同様に上澄み液を回収した。回収した上澄み液に含まれるＰＭＥＡの分子量はＭｗ＝２７００、Ｍｎ＝２２８０であった。回収した上澄み液を、２７℃下でＮＴＡにて分析したところ、平均１３２ｎｍのナノ粒子が形成されていることを確認した。
[Example 3]
The supernatant was recovered in the same manner as in Example 1 except that PMEA (2) was used instead of PMEA (1). The molecular weights of PMEA contained in the recovered supernatant were Mw=2700 and Mn=2280. When the collected supernatant was analyzed by NTA at 27° C., it was confirmed that nanoparticles with an average size of 132 nm were formed.
［比較例１］
ＰＭＥＡ（１）の代わりにＰＭＥＡ（３）を使用した以外は実施例１に記載の方法と同様に上澄み液を回収した。回収した上澄み液を、２７℃でＮＴＡにて分析したところ、ナノ粒子は観察されなかった。
[Comparative Example 1]
The supernatant was recovered in the same manner as in Example 1, except that PMEA (3) was used instead of PMEA (1). When the recovered supernatant was analyzed by NTA at 27° C., no nanoparticles were observed.
Claims (12)
Ｘは、炭化水素基であり、
Ｙは、酸素原子を有する置換基である］
で表される構成単位を含む化合物を準備する工程と、
前記化合物と水媒体とを混合して、前記化合物を含むナノ粒子を含む水系混合物を得る工程と、
を含み、
ゲル浸透クロマトグラフィーによって得られる前記化合物の微分分子量分布曲線において、１，０００以上５，０００以下の分子量の領域のピークの面積が、全領域のピークの面積を基準として、５％以上である、ナノ粒子の製造方法。 The following general formula (1):
X is a hydrocarbon group,
Y is a substituent having an oxygen atom]
A step of preparing a compound containing a structural unit represented by
A step of mixing the compound and an aqueous medium to obtain an aqueous mixture containing nanoparticles containing the compound;
including
In the differential molecular weight distribution curve of the compound obtained by gel permeation chromatography, the area of the peak in the molecular weight range of 1,000 or more and 5,000 or less is 5% or more based on the peak area of the entire range. A method for producing nanoparticles.
Ｒ1は、水素原子又はメチル基であり、
Ｒ2は、メチル基又はエチル基であり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、２～６の整数であり、
ｐは、０又は１であり、
ｑは、０～２の整数であり、
ｒは、０～３の整数である］
で表される、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。 The general formula (1) is represented by the following general formula (2):
R 1 is a hydrogen atom or a methyl group,
R 2 is a methyl group or an ethyl group,
n is an integer from 1 to 12,
m is an integer from 2 to 6,
p is 0 or 1,
q is an integer from 0 to 2;
r is an integer from 0 to 3]
Represented by the manufacturing method according to any one of claims 1 to 3.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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2022
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