JP2023109240A - ナチュラルキラー細胞活性の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡便で安全性の高いＮＫ細胞活性の測定方法を提供する。【解決手段】対象から採取した血液検体中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体の発現量を測定して、ＮＫ細胞活性を測定する。【選択図】なし
Description
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の測定方法に関する。
生体中には多様な免疫担当細胞が存在している。その中でもナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫を担うリンパ球の一つで、殺傷力が強く、またウイルス感染細胞、ストレス細胞、悪性細胞を認識して、攻撃、排除する能力をもつ重要な細胞である。
ヒトＮＫ細胞の免疫機能は、活性化受容体と抑制性受容体を介して調節され、自然細胞傷害性受容体（Ｎａｔｕｒａｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＮＣＲ）であるＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４４）、及びＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）やＣ型レクチンファミリーであるＮＫＧ２Ｄは活性化受容体として働き、一方、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）やＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは抑制性受容体として働く。これらの受容体によるシグナル伝達等を通じて活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性顆粒（パーフォリン、グランザイムなど）を放出し、またＩＦＮ－γやＴＮＦ－αなどのサイトカインを産生し、樹状細胞の成熟やＴ細胞分化に影響を与えることが知られる（非特許文献１）。
ＮＫ細胞活性は、加齢とともに低下することや、ストレスや食生活、睡眠などといった様々な生活環境要因に大きな影響を受けることが報告されている（非特許文献１、２）。そのため、ＮＫ細胞活性を免疫力の指標として用いることで、生体個体の免疫状態をモニターすることができると期待される。
ＮＫ細胞の細胞傷害活性の測定法としては、５１Ｃｒ遊離法が広く用いられている。５１Ｃｒ遊離法は、典型的には、患者の末梢血から比重遠心分離によりＮＫ細胞を含むリンパ球を分取して培養し、それを５１Ｃｒ標識白血病細胞（Ｋ５６２）と混合培養し、ＮＫ細胞によって傷害されたＫ５６２細胞から培養上清中に遊離した５１Ｃｒの放射性活性をγ線カウンターで測定して得られた細胞傷害率（％）をＮＫ細胞活性とする。しかし、５１Ｃｒ遊離法は、比較的多量（およそ５～１０ｍＬ）の血液検体を必要とし、判定までに日数を要し（およそ２～５日）、また末梢血単核球分離や細胞調製などの熟達した手技を必要とする。また、５１Ｃｒ遊離法には、使用したリンパ球数と標的細胞Ｋ５６２の割合や、アッセイ前のそれらの細胞の処理・培養条件によって結果が左右され易く、安定したデータを得にくいという問題がある。さらに、５１Ｃｒ遊離法は放射性同位元素を使用するため、専用施設や専用測定機器を必要とするだけでなく、実験者の被爆リスクも伴う、という問題もある（特許文献１、非特許文献３）。そのため、より簡便で、安定した検査結果を得られるＮＫ細胞活性の測定法の開発が求められている。
放射性同位元素を使用しないＮＫ細胞活性の測定方法の開発が進んでいる。例えば、Ｋ５６２細胞とＮＫ細胞とを共培養して、ＮＫ細胞の脱顆粒時に細胞膜表面に特異的に発現するＣＤ１０７ａタンパク質を蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーで定量化する方法が知られる。あるいは、Ｋ５６２細胞に代えてＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－ａｃｅｔａｔｅ）等の化合物を用いてＮＫ細胞を刺激する方法が開発されている（非特許文献３、４）。また、ＮＫ細胞を抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体と共に培養して、産生されたサイトカインの量を測定する方法も報告されている（特許文献１）。この他に、ＮＫ細胞によって傷害されるＫ５６２細胞から放出される細胞質内酵素ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の活性を、酵素基質を用いて比色計で測定する試薬キットが開発されているが（非特許文献５）、この方法は、５１Ｃｒ遊離法より感度が低いことが知られている。
Ageing Res. Rev., 12(4): 1069-1078 (2013)
Prev. Med., 44(2): 117-23 (2007)
Indian J. Exp. Biol., 52(10): 983-8 (2014)
J. Immunol. Res., 2016:3769590 (2016)
J. Immunol. Methods, 64:313-320 (1983)
上記の通り、従来のＮＫ細胞活性測定方法は、放射性同位元素を使用することから、安全性等で課題の残る方法であった。非特許文献３～５及び特許文献１に記載の方法は、いずれもＣＯ２インキュベーター等の細胞培養設備を要する方法であった。また、いずれの方法も、血液または血液から分離した細胞を刺激培養する時間を要することから、一度に多くの検体を解析することが困難であった。
本発明は、より簡便で安全性の高いＮＫ細胞活性の測定方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ヒト末梢血の一定量の全血サンプルにおけるＮＫ細胞活性化受容体の発現量が、従来法で測定したＮＫ細胞活性と高い相関を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
（１）対象から採取した血液検体中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体の発現量を測定する工程を含む、ＮＫ細胞活性の測定方法。
（２）前記ＮＫ細胞活性化受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＮＫＧ２Ｄである、（１）に記載の方法。
（３）前記発現量を、単位容量当たりの血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体タンパク質の定量により測定する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記タンパク質の定量を、フローサイトメトリー法、イムノアッセイ法、ウェスタンブロット法又は質量スペクトル法で行う、（３）に記載の方法。
（５）前記タンパク質の定量を、フローサイトメトリー法で行う、（４）に記載の方法。
（６）前記発現量を、単位容量当たりの血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの定量により測定する、（１）又は（２）に記載の方法。
（７）以下のａ）又はｂ）を含む、ＮＫ細胞活性測定用試薬：
ａ）ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体；
ｂ）ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸。
（８）前記ＮＫ細胞活性化受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＮＫＧ２Ｄである、（７）に記載の試薬。
（９）ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体を含む、（７）又は（８）に記載の試薬。
（１）対象から採取した血液検体中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体の発現量を測定する工程を含む、ＮＫ細胞活性の測定方法。
（２）前記ＮＫ細胞活性化受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＮＫＧ２Ｄである、（１）に記載の方法。
（３）前記発現量を、単位容量当たりの血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体タンパク質の定量により測定する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記タンパク質の定量を、フローサイトメトリー法、イムノアッセイ法、ウェスタンブロット法又は質量スペクトル法で行う、（３）に記載の方法。
（５）前記タンパク質の定量を、フローサイトメトリー法で行う、（４）に記載の方法。
（６）前記発現量を、単位容量当たりの血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの定量により測定する、（１）又は（２）に記載の方法。
（７）以下のａ）又はｂ）を含む、ＮＫ細胞活性測定用試薬：
ａ）ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体；
ｂ）ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸。
（８）前記ＮＫ細胞活性化受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＮＫＧ２Ｄである、（７）に記載の試薬。
（９）ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体を含む、（７）又は（８）に記載の試薬。
本発明によれば、既知の方法よりも、より簡便で安全性の高いＮＫ細胞活性の測定方法を提供することが可能である。
１．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の測定方法
本発明のＮＫ細胞活性の測定方法（以下、「本発明の方法」とも称する）は、対象から採取した血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体の発現量を測定する工程を含む、ことを特徴とする。
本発明のＮＫ細胞活性の測定方法（以下、「本発明の方法」とも称する）は、対象から採取した血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体の発現量を測定する工程を含む、ことを特徴とする。
本発明では、検体として、対象から採取した「血液検体」を用いる。本発明において「血液検体」は、少なくともＮＫ細胞を含む血液であることを要する。このような血液検体としては、例えば、全血（全血検体）が挙げられる。本発明において、「全血」又は「全血検体」は、血清や血漿とは異なり、血液成分の分離・除去等をしていない血液検体を指す。あるいは、血液検体は、リンパ球以外の血球成分を除いた検体であってもよい。このような検体は、たとえば、全血検体中の赤血球を溶血させ、細胞以外を洗浄することによって得ることができる。
本発明において血液検体は、血液凝固により測定が困難となることを避けるために、抗凝固剤等の添加したものも包含する。抗凝固剤としては、ヘパリン（ヘパリンＮａ、ヘパリンＬｉ等）、ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ－２Ｎａ、ＥＤＴＡ－２Ｋ、ＥＤＴＡ－３Ｋ等）、フッ化Ｎａ、クエン酸Ｎａ、シュウ酸Ｎａ等が挙げられるが、これらに限定されない。
血液検体は、対象から採血することにより取得することができる。血液検体は、限定されるものではないが、典型的には末梢血である。対象は、任意の動物であり得るが、哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、ニホンザル等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、リャマ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、フェレット等の家畜やペットが挙げられる。より好ましくはヒトである。
本発明において、「ＮＫ細胞」は、リンパ球のうち、ＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞として識別される細胞を指す。全血に含まれるＮＫ細胞の数は、通常は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５６抗体を用いたフローサイトメトリーによって計数される。
本発明において、ＮＫ細胞活性化受容体は、ＮＫ細胞の活性化シグナル伝達を担うＮＫ受容体を指す。ＮＫ細胞活性化受容体は、ＮＫ細胞以外の血液細胞表面に存在しないことが好ましく、ＮＫ細胞表面特異的に存在することがより好ましい。このようなＮＫ細胞活性化受容体としては、例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６（Pende D., et al., J. Exp. Med., 190 (10): 1505-1516 (1999)を参照のこと；NCBI Gene ID: 259197及び9437）及びＮＫＧ２Ｄ（Houchins J. P., et al., J. Exp. Med., 173: 1017-1020 (1991)を参照のこと；NCBI Gene ID: 22914）が挙げられる。
本発明の方法の第１態様において、ＮＫ細胞活性化受容体の発現量は、単位容量当たりの血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体タンパク質を定量することにより、測定することができる。ＮＫ細胞活性化受容体タンパク質を定量する手段としては、公知のタンパク質定量法をいずれも使用することができるが、例えば、フローサイトメトリー法、イムノアッセイ法、ウェスタンブロット法、質量スペクトル法等とすることができる。特に、フローサイトメトリー法が、簡便で、かつ正確な測定が可能であるため、好適に使用できる。
フローサイトメトリー法としては、具体的には、ＦＩＴＣ、ＰＥ等で蛍光標識した抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体を血液検体中の細胞表面に反応させ、細胞ごとに表面に結合した標識の蛍光強度を測定する方法をとり得る。ここで、ＮＫ細胞活性化受容体発現量は、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）ではなく、単位容量当たりの血液検体における、各細胞の蛍光強度の積算値として求める必要がある（総蛍光強度：Ｔｏｔａｌ ＦＩ）。Ｔｏｔａｌ ＦＩは、単位容量当たりの血液検体のフローサイトメトリーにおけるＮＫ細胞活性化受容体のピーク下面積（ＡＵＣ）から算出することができる。あるいは、ＭＦＩと細胞数の積として算出することができる。
フローサイトメトリー法において、抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体に加えて、それぞれ異なる蛍光色素で標識した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５６抗体を使用することができる。この場合、血液検体中の細胞から、ＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞、すなわちＮＫ細胞のみをゲーティングして、ＮＫ細胞中のＴｏｔａｌ ＦＩを求めることができる。ＮＫ細胞活性化受容体はＮＫ細胞に特異的に発現するため、理論的には全細胞測定時の蛍光強度と大きな差異はないが、非特異的反応の影響を回避できることから、Ｓ／Ｎ比を高くすることが可能となる。
イムノアッセイ法としては、公知の手法をいずれも使用できる。使用する手法は、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法、金属コロイド法等のいずれであってもよい。また、イムノアッセイ法は、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法等のいずれであってもよい。特に、放射性同位体を使用しない手法を用いることが好ましい。
イムノアッセイ法は、具体的には、抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体を血液検体に反応させ、検体中のＮＫ細胞活性化受容体タンパク質を測定する方法である。血液検体は、溶血処理された検体であってもよく、さらに溶血後に赤血球成分を除去した検体であってもよい。さらに、イオン系／非イオン系の界面活性剤を含む細胞溶解剤等を使用して、血球成分を溶解させた検体であってもよい。特に光学検出系を使用する場合、赤血球成分を除去し、他の血球成分を溶解することで、検体由来の色素の影響を受けにくく、より正確な値を得ることが可能となる。
イムノアッセイ法により、単位当たりの血液検体中の抗ＮＫ細胞活性化受容体タンパク質を簡易に、かつ直接的に定量することが可能である。
フローサイトメトリー法及びイムノアッセイ法において、使用される抗体は、抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体であり、好ましくは、抗ＮＫｐ３０抗体、抗ＮＫｐ４６抗体、又は抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である。より好ましくは、抗ＮＫｐ３０抗体である。抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体は、特に、ヒトのＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体であることが好ましい。抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体は、任意の免疫グロブリンクラスであってよいが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＤ又はＩｇＥであり、より好ましくはＩｇＧである。抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体は任意のサブクラスであってよく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であってよい。様々な抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体が市販されており、いずれも使用することができる。
質量スペクトル法においては、血液検体をそのまま希釈して、又は溶血・溶解処理等を行った後に質量分析計に供し、ＮＫ細胞活性化受容体タンパク質に特異的なシグナルの強度を測定することで、ＮＫ細胞活性化受容体タンパク質の定量を行うことができる。質量分析計としては、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ質量分析計を使用することができる。簡便かつ高感度な方法であるが、条件によっては、検体中に、イオン化時の挙動と質量スペクトルパターンが目的のタンパク質に類似する物質が混在することが想定され、その場合、目的のタンパク質の判別が困難になる、という問題がある。そのため、予め検体の前処理、測定条件等を最適化する必要がある。
本発明の方法の第２態様において、ＮＫ細胞活性化受容体の発現量は、単位容量当たりの血液検体のＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡを定量することにより、測定することができる。ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡを定量する手段は、公知の核酸定量法をいずれも使用することができるが、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ドットプロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法等を使用できる。特にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を好適に使用できる。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ法等、公知の手法をいずれも使用できる。
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を使用する場合、各種ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの定量に使用するプライマー配列は、目的のｍＲＮＡを逆転写・増幅できる配列であれば限定されるものではないが、例えば表１に示す配列を使用することができる。
上記した方法は、いずれもＮＫ細胞活性化受容体の発現量を測定する方法であるが、本発明者らは、これらの方法により測定されたＮＫ細胞活性化受容体の発現量が、既知の方法で測定したＮＫ細胞活性と高い相関性を示すことを見出した。したがって、本発明の方法は、ＮＫ細胞活性の測定を行う方法に該当する。本発明の方法は、放射性同位元素を使用することなく、また細胞培養工程を必要としないことから、安全かつ簡便にＮＫ細胞活性を測定することが可能である。
２．ＮＫ細胞活性測定用試薬
本発明のＮＫ細胞活性測定用試薬（以下、「本発明の試薬」とも称する）は、以下のａ）又はｂ）を含む、ことを特徴とする。
ａ）ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体
ｂ）ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸。
本発明のＮＫ細胞活性測定用試薬（以下、「本発明の試薬」とも称する）は、以下のａ）又はｂ）を含む、ことを特徴とする。
ａ）ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体
ｂ）ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸。
本発明の試薬は、検体中のＮＫ細胞活性化受容体の発現量の測定を介して、ＮＫ細胞活性を測定するための試薬である。ここでいう「検体」は、対象から採取した「血液検体」を指す。
本発明の試薬の第１態様は、試料中のＮＫ細胞活性化受容体タンパク質を定量するために、ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体、すなわち、抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体を含む。定量の対象となるＮＫ細胞活性化受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＮＫＧ２Ｄであることが好ましい。特に、ＮＫｐ３０であることがより好ましい。
第１態様は、抗原抗体反応を用いるタンパク質定量手法に適した形態とすることが好ましい。タンパク質定量手法としては、抗体を使用する手法であれば特に限定されないが、フローサイトメトリー法、イムノアッセイ法を使用することができる。イムノアッセイ法は、例えば、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法、金属コロイド法、ウェスタンブロット法のいずれであってもよい。また、イムノアッセイ法は、ＣＬＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＴＩＡ、ＥＩＡ。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ラテックス凝集反応法、ＦＩＡ、及びイムノクロマトグラフィー法のいずれであってもよい。
抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体は、任意の免疫グロブリンクラスであってよいが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＤ又はＩｇＥであり、より好ましくはＩｇＧである。抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体は任意のサブクラスであってよく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であってよい。様々な抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体が市販されており、いずれも使用することができる。
抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体は、タンパク質の測定手法にもよるが、蛍光色素、酵素、ビオチン、放射性同位元素等で標識されていてもよい。この場合、放射性同位元素以外で標識されていることが好ましい。抗ＮＫ細胞活性化受容体抗体は、タンパク質の定量手法にもよるが、水溶液中に含まれていてもよく、また、磁性ビーズ、ラテックス粒子、マイクロウェルプレート、メンブレンフィルター等に固相化されてもよい。
第１態様は、前記抗体の他に、必要に応じて、安定化剤（ＢＳＡ、糖類等）、ｐＨ緩衝剤（Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ等）、酸化防止剤、保存料等を含んでいてもよい。
本発明の試薬の第２態様は、ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を有する核酸を含む。より具体的には、ＮＫｐ３０をコードする遺伝子（例えば、NCBI Gene ID: 259197）、ＮＫｐ４６をコードする遺伝子（例えば、NCBI Gene ID: 9437）又はＮＫＧ２Ｄをコードする遺伝子（例えば、NCBI Gene ID: 22914）の全部又は一部と相補的な配列を有する核酸を含む。ここでいう核酸は、好ましくはＤＮＡである。前記核酸が、ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの一部と相補的な配列を有する場合、ＮＫｐ３０をコードする遺伝子、ＮＫｐ４６をコードする遺伝子又はＮＫＧ２Ｄをコードする遺伝子の塩基配列のうち、連続する１６塩基以上、特に２０塩基以上の塩基配列と相補的な配列を有することが好ましい。
第２態様は、核酸定量手法に適した形態とすることが好ましい。核酸定量手法としては、核酸のハイブリダイゼーションを使用する手法であれば特に限定されないが、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ドットプロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法等を使用できる。特にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法のいずれであってもよい。
第２態様において、核酸は、ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成し、かつ、さらに当該ｃＤＮＡを増幅するためのプライマーであってもよい。あるいは、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを捕捉・検出するためのプローブであってもよい。プライマーを使用する場合、その配列は、目的のｍＲＮＡを逆転写・増幅できる配列であれば限定されるものではないが、例えば上記表１に示す配列を使用することができる。
第２態様において、前記核酸は、蛍光色素、酵素、ビオチン、放射性同位元素等で標識されていてもよい。この場合、放射性同位元素以外で標識されていることが好ましい。前記核酸は、水溶液中に含まれていてもよく、また、ｍＲＮＡの定量手法にもよるが、ＤＮＡチップ、磁性ビーズ、マイクロウェルプレート、メンブレンフィルター等に固相化されてもよい。
第２態様は、前記核酸の他に、必要に応じて、金属塩、ｐＨ緩衝剤等を含んでいてもよい。特にＰＣＲ法を使用する場合、二価金属塩、ポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ等）、ｄＮＴＰ等を含んでいてもよい。
本発明の試薬は、「１．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の測定方法」に記載した本発明の方法に使用することができる。本発明の試薬において、用語の定義及び測定の詳細な条件等は、特に矛盾のない限り、「１．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の測定方法」の項に記載した通りである。
実施例 ヒト全血中のＮＫ活性化受容体発現とＮＫ細胞活性との相関性試験
試験計画に同意した２０歳以上６０歳未満の男女一般ボランティア計１５名より各１１ｍＬ（末梢血一般検査用（ＥＤＴＡ－２Ｋ採血管）：２ｍＬ、ＮＫ細胞受容体発現解析用（ヘパリンナトリウム採血管）：２ｍＬ、５１Ｃｒ遊離法用（専用採血管（ＰＮＫ））：５ｍＬを含む）静脈採血を行った。末梢血一般検査、及び５１Ｃｒ遊離法によるＮＫ細胞活性検査は、株式会社エスアールエルにて常法で実施された。表２に、ボランティアの性別、既往歴等の背景情報及び総白血球数（ＷＢＣ）を示す。ＷＢＣが１５名ともに正常範囲内にあることから、感染症の疑いはない状態であると確認された。各患者の５１Ｃｒ遊離法により測定されたＮＫ細胞活性の値を表４に示す。
試験計画に同意した２０歳以上６０歳未満の男女一般ボランティア計１５名より各１１ｍＬ（末梢血一般検査用（ＥＤＴＡ－２Ｋ採血管）：２ｍＬ、ＮＫ細胞受容体発現解析用（ヘパリンナトリウム採血管）：２ｍＬ、５１Ｃｒ遊離法用（専用採血管（ＰＮＫ））：５ｍＬを含む）静脈採血を行った。末梢血一般検査、及び５１Ｃｒ遊離法によるＮＫ細胞活性検査は、株式会社エスアールエルにて常法で実施された。表２に、ボランティアの性別、既往歴等の背景情報及び総白血球数（ＷＢＣ）を示す。ＷＢＣが１５名ともに正常範囲内にあることから、感染症の疑いはない状態であると確認された。各患者の５１Ｃｒ遊離法により測定されたＮＫ細胞活性の値を表４に示す。
採血した全血２ｍＬにＦｃＲブロック（４２２３０２／ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）溶液３０μＬを加えて室温で１５分間反応させた後、２００μＬずつ４本に分注した。表３に示す各標識抗体を４μＬ／チューブとなるように加えて、４℃で４５分間反応させた後、溶血バッファー（３４９２０２／ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ））を２ｍＬ加えて室温で１５分間反応させて赤血球を溶血させた。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去し、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ添加ＰＢＳ（－））０．５ｍＬで再懸濁した。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離、再懸濁を２回繰り返して細胞を洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ））で３色蛍光解析を行った。
フローサイトメトリーを用いて、前方散乱光（ＦＳＣ）と側方散乱光（ＳＳＣ）で白血球を解析し、ＦＳＣ、ＳＳＣともに小さいリンパ球画分にゲートをかけて全ＷＢＣ中のリンパ球の比率を測定した。さらにそのリンパ球画分をＣＤ５６およびＣＤ３の発現強度で展開し、ＣＤ５６陽性／ＣＤ３陰性のＮＫ細胞画分にゲーティングして、各種受容体（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ）の発現量を解析した（図１）。詳細な陽性細胞の比率や発現蛍光強度などは解析ソフトＦｌｏｗＪｏ ｖｅｒ８．６を用いて解析した。
血中ＮＫ細胞数及びＮＫ細胞あたりの各種受容体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の解析結果を表４に示す。また、ＮＫ細胞あたりの各種受容体のＭＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を解析した結果を図２に示す。図２Ａは、ＮＫｐ３０のＭＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。図２Ｂは、ＮＫｐ４６のＭＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。図２Ｃは、ＮＫＧ２ＤのＭＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。各種受容体について、ＮＫｐ３０とＮＫｐ４６はそれぞれ相関係数０．２８９と０．２６８で弱い相関、ＮＫＧ２Ｄは相関係数０．０６１で相関が認められなかった。なお、相関性については相関係数０～０．２を相関性なし、０．２～０．４を弱い相関性あり、０．４～０．７を中程度の相関性あり、０．７～１を強い相関性ありと評価した。
全血試料中の各種受容体の総発現量（Ｔｏｔａｌ ＦＩ）を表４に、各種受容体のＴｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法の測定結果との相関性を解析した結果を図３に示す。ここで、Ｔｏｔａｌ ＦＩは血中における細胞の各受容体の蛍光強度（ＦＩ）の積算値である。各種受容体はＮＫ細胞に特異的な受容体であることから、Ｔｏｔａｌ ＦＩの値は、血中ＮＫ細胞数とＮＫ細胞における受容体のＭＦＩの積とほぼ一致する。図３Ａは、ＮＫｐ３０のＴｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。図３Ｂは、ＮＫｐ４６のＴｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。図３Ｃは、ＮＫＧ２ＤのＴｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。各種受容体において、ＭＦＩと比較して、Ｔｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法の測定結果との相関性はいずれも向上し、ＮＫｐ３０とＮＫＧ２Ｄはそれぞれ相関係数０．５２５と０．５７５で、５１Ｃｒ遊離法との間で中程度の相関性を示すことが分かった。
図３において、ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４６のＴｏｔａｌ ＦＩは、ボランティア１名（Ｎｏ．８）の検体だけが相関曲線から外れて突出して高値を示していた。この全血検体では、他の検体と比較してＮＫ細胞数が顕著に高かったことから、直前に何らかの感染症に罹患していた等の要因により、免疫が亢進した状態であったものと推察された。Ｎｏ．８のデータを除いて各種受容体のＴｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法の測定結果との相関性を解析しなおしたところ、図４に示す結果となった。図４Ａは、ＮＫｐ３０のＴｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。図４Ｂは、ＮＫｐ４６のＴｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。図４Ｃは、ＮＫＧ２ＤのＴｏｔａｌ ＦＩと５１Ｃｒ遊離法との相関性を示す。いずれの相関性も向上し、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄは、それぞれ相関係数０．９１７、０．７４０及び０．５８７となり、特にＮＫｐ３０で非常に高い相関性が示された。
Claims (9)
- 対象から採取した血液検体中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体の発現量を測定する工程を含む、ＮＫ細胞活性の測定方法。
- 前記ＮＫ細胞活性化受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＮＫＧ２Ｄである、請求項１に記載の方法。
- 前記発現量を、単位容量当たりの血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体タンパク質の定量により測定する、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記タンパク質の定量を、フローサイトメトリー法、イムノアッセイ法、ウェスタンブロット法又は質量スペクトル法で行う、請求項３に記載の方法。
- 前記タンパク質の定量を、フローサイトメトリー法で行う、請求項４に記載の方法。
- 前記発現量を、単位容量当たりの血液検体中のＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの定量により測定する、請求項１又は２に記載の方法。
- 以下のａ）又はｂ）を含む、ＮＫ細胞活性測定用試薬：
ａ）ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体；
ｂ）ＮＫ細胞活性化受容体ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸。 - 前記ＮＫ細胞活性化受容体が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＮＫＧ２Ｄである、請求項７に記載の試薬。
- ＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合する抗体を含む、請求項７又は８に記載の試薬。
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