JP2023095429A

JP2023095429A - Immunochromatographic measurement kit for quantifying estrone in biological sample

Info

Publication number: JP2023095429A
Application number: JP2021211308A
Authority: JP
Inventors: 達哉山口; Tatsuya Yamaguchi
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-07-06

Abstract

To provide an immunochromatographic measurement kit capable of highly sensitively, quickly, and simply measuring estrone concentration in a biological sample such as saliva, in a pig farming field.SOLUTION: An immunochromatographic measurement kit for quantifying estrone in a biological sample includes: a specimen diluent liquid to dilute the biological sample; a competitive reagent; and an immunochromatographic strip. The immunochromatographic strip includes a sample addition member, an impregnation member, a membrane carrier, and an absorption member which are arranged connected in order. The impregnation member is impregnated with anti-biotin antibody or avidin or streptavidin labeled with lanthanoid complex. The membrane carrier contains a test line on which an anti-IgG antibody is immobilized.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、生体試料中のエストロンを定量するためのイムノクロマト測定キットに関する。より詳しくは、生体試料（検体）を希釈するための検体希釈液、競合試薬およびイムノクロマトストリップからなる、生体試料中のエストロンを定量するための測定キットに関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunochromatographic measurement kit for quantifying estrone in biological samples. More specifically, it relates to a measurement kit for quantifying estrone in a biological sample, comprising a sample diluent for diluting the biological sample (specimen), a competitive reagent and an immunochromatographic strip.

近年、養豚経営は大型化・企業化が進みつつあり、また、人工授精もかなり普及している。このような現状において、交配または人工授精後、早期に繁殖母豚の妊娠／非妊娠を診断することの重要性が高まっている。豚においても牛や馬と同様に、血液中のホルモン濃度を測定することにより、早期妊娠診断が可能であることは以前から知られている。しかし、これらはほとんど臨床応用されていないのが現状である。その理由の一つとして、豚の場合、検査材料である血液の採取が他の家畜に比べやや困難であることがあげられる。これに対し、例えば母豚の唾液中や糞中のエストロン濃度を測定することにより、妊娠診断が可能であることが報告されている。しかし、唾液中のエストロン濃度は、血液中の濃度の１／１０程度であり、通常は１ｎｇ／ｍＬ未満という極めて低い濃度であることも報告されている。（非特許文献１、非特許文献２）。 In recent years, pig farming has been becoming larger and more commercialized, and artificial insemination has become quite common. Under these circumstances, the importance of diagnosing pregnancy/non-pregnancy in breeding sows early after mating or artificial insemination is increasing. It has long been known that early pregnancy diagnosis is possible in pigs, as in cattle and horses, by measuring the hormone concentration in blood. However, at present, they are hardly applied clinically. One of the reasons for this is that in the case of pigs, it is somewhat more difficult to collect blood as a test material than in other livestock. On the other hand, it has been reported that pregnancy diagnosis is possible, for example, by measuring the estrone concentration in the saliva or feces of sows. However, it has also been reported that the estrone concentration in saliva is about 1/10 of the concentration in blood, and is usually as low as less than 1 ng/mL. (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).

従来、こうしたホルモンはＲＩＡやＥＩＡ法による測定が主であったが、操作が煩雑で結果が出るまでに長時間を要するため、豚の臨床現場では応用価値が低いと思われる。即ち、養豚の現場においては、極めて低濃度の生体試料中のホルモン濃度を、高感度かつ簡便に測定する技術が求められている。 Conventionally, these hormones have been measured mainly by the RIA and EIA methods, but since the operation is complicated and it takes a long time to obtain results, it is considered to be of low application value in the clinical practice of swine. That is, in the field of pig farming, there is a demand for a technology for highly sensitive and simple measurement of hormone concentrations in extremely low-concentration biological samples.

特許文献１、２には、尿中のエストロンをイムノクロマトストリップを用いて測定する技術が開示されている。 Patent Documents 1 and 2 disclose techniques for measuring estrone in urine using an immunochromatographic strip.

Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５９（９）：７５９－７６３，１９９７J. Vet. Med. Sci. 59(9):759-763, 1997 Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，５１：８２９－８４０，１９９９Theriogenology, 51:829-840, 1999

特表平８－５００６７０号公報Japanese Patent Publication No. 8-500670 特開平１０－１１５６１４号公報JP-A-10-115614

本発明は、上記問題点を解決するために案出されたもので、唾液などの生体試料中に存在するエストロン濃度を、高感度かつ迅速に測定し、豚の妊娠の有無を容易に判定することができるエストロン測定キットを提供することを目的とする。 The present invention has been devised to solve the above problems, and the estrone concentration present in a biological sample such as saliva is measured with high sensitivity and speed to easily determine the presence or absence of pregnancy in pigs. An object of the present invention is to provide an estrone measurement kit capable of

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。 Means for Solving the Problems As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventors have found that the above problems can be solved by means shown below, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）生体試料中のエストロンを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびイムノクロマトストリップを含み、
前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなり、
前記含浸部材には、ランタノイド錯体で標識された抗ビオチン抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンが含浸されおり、
前記膜担体は、抗ＩｇＧ抗体が固定化されたテストラインを備えることを特徴とする測定キット。
（２）前記競合試薬は、エストロンとビオチンとの複合体であり、前記含浸部材には、抗エストロン抗体が含浸されていることを特徴とする（１）に記載の測定キット。
（３）前記ランタノイドが、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、またはジスプロシウム、あるいはそれらの組み合わせである、（１）または（２）に記載の測定キット。
（４）前記抗ＩｇＧ抗体は、抗マウスＩｇＧ抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体および抗モルモットＩｇＧ抗体からなる群から選ばれる１以上であることを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の測定キット。
（５）前記生体試料は、唾液、糞、尿、全血、血漿または血清であることを特徴とする（１）～（４）のいずれかに記載の測定キット。
（６）ブタの妊娠状態を判定するために用いられることを特徴とする（１）～（５）のいずれかに記載の測定キット。 That is, the present invention consists of the following configurations.
(1) An immunochromatographic measurement kit for quantifying estrone in a biological sample, comprising a specimen diluent for diluting the biological sample, a competitive reagent, and an immunochromatographic strip,
The immunochromatographic strip comprises a sample addition member, an impregnation member, a membrane carrier, and an absorption member which are arranged in order,
The impregnated member is impregnated with an anti-biotin antibody, avidin or streptavidin labeled with a lanthanide complex,
A measurement kit, wherein the membrane carrier comprises a test line on which an anti-IgG antibody is immobilized.
(2) The assay kit according to (1), wherein the competitive reagent is a complex of estrone and biotin, and the impregnated member is impregnated with an anti-estrone antibody.
(3) The measurement kit according to (1) or (2), wherein the lanthanide is europium, terbium, samarium, or dysprosium, or a combination thereof.
(4) The anti-IgG antibody is one or more selected from the group consisting of an anti-mouse IgG antibody, an anti-rabbit IgG antibody and an anti-guinea pig IgG antibody, according to any one of (1) to (3). measurement kit.
(5) The measurement kit according to any one of (1) to (4), wherein the biological sample is saliva, feces, urine, whole blood, plasma or serum.
(6) The measurement kit according to any one of (1) to (5), which is used to determine the pregnancy status of pigs.

本発明により、ブタの生産現場において生体試料中のエストロン濃度を高感度かつ、迅速、簡便に測定することが可能なエストロン定量用イムノクロマト測定キットが提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, an immunochromatography kit for quantification of estrone is provided, which enables high-sensitivity, rapid, and simple measurement of estrone concentration in a biological sample at a pig production site.

本発明の測定キットに含まれるイムノクロマトストリップの一例を示す模式図（上面図）である。Fig. 2 is a schematic diagram (top view) showing an example of an immunochromatographic strip included in the measurement kit of the present invention; 本発明の測定キットに含まれるイムノクロマトストリップの一例を示す模式図（側面図）である。1 is a schematic diagram (side view) showing an example of an immunochromatographic strip included in the measurement kit of the present invention. FIG. 本発明の測定キットに含まれるイムノクロマトストリップをハウジングケースに収容した一例を示す模式図である。FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of housing the immunochromatographic strip included in the measurement kit of the present invention in a housing case. 本発明のイムノクロマト測定キットを用いて得られたエストロンの測定結果の一例を示す図（グラフ）である。FIG. 2 is a diagram (graph) showing an example of the estrone measurement results obtained using the immunochromatographic measurement kit of the present invention. 本発明のイムノクロマト測定キットおよび電気化学発光免疫測定法による測定値の関係を示す図（グラフ）である。FIG. 2 is a diagram (graph) showing the relationship between the values measured by the immunochromatographic measurement kit of the present invention and the electrochemiluminescence immunoassay.

以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be described in detail below.

本発明は、生体試料中のエストロンを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびイムノクロマトストリップを含み、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなり、前記含浸部材には、ランタノイド錯体で標識された抗ビオチン抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンが含浸されおり、前記膜担体は、抗ＩｇＧ抗体が固定化されたテストラインを備えることを特徴とする測定キットである。 The present invention is an immunochromatographic measurement kit for quantifying estrone in a biological sample, comprising a specimen diluent for diluting the biological sample, a competitive reagent, and an immunochromatographic strip, wherein the immunochromatographic strip is a sample addition member , an impregnated member, a membrane carrier, and an absorbent member are arranged in sequence, the impregnated member is impregnated with an anti-biotin antibody or avidin or streptavidin labeled with a lanthanide complex, and the membrane carrier comprises an anti-IgG antibody. is a measurement kit characterized by comprising a test line on which is immobilized.

（生体試料）
本発明において、生体試料は、特に限定されるものではないが、唾液、糞、尿、血液（全血でも血清でも血漿でもよい）等が適している。動物種も、ブタの他、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコなどの生体試料を測定対象とすることが出来る。 (biological sample)
In the present invention, the biological sample is not particularly limited, but saliva, feces, urine, blood (whole blood, serum or plasma may be used) and the like are suitable. As for animal species, biological samples such as pigs, humans, cows, horses, dogs, and cats can be used as measurement targets.

（エストロン）
エストロンは、動物の雌の卵巣から分泌されるステロイドホルモンで、卵胞ホルモンの一種である。エストラジオール、エストリオールなど同じ作用をする物質を含めエストロゲンと総称される。妊娠した動物の尿中には多く含まれており、天然物から最初に単離された卵胞ホルモンである。エストロンは、成熟した卵胞や胎盤から分泌され、生殖腺の発育などを促進する。特に、脳下垂体前葉から分泌される生殖腺刺激ホルモン、黄体から分泌される黄体ホルモンと共同して働き、性周期や妊娠から出産に至る期間を調節している。 (Estrone)
Estrone is a steroid hormone secreted from the female ovaries of animals, and is a kind of follicular hormone. Substances that have the same action as estradiol and estriol are collectively called estrogens. It is abundant in the urine of pregnant animals and is the first estrogen isolated from natural sources. Estrone is secreted from mature follicles and placenta, and promotes the development of gonads. In particular, it cooperates with gonadotropic hormone secreted from the anterior pituitary gland and progesterone secreted from the corpus luteum to regulate the estrous cycle and the period from pregnancy to childbirth.

（ランタノイド）
ランタノイド（Ｌｎ）とは、周期表で第６周期第３族に位置する１５個の金属元素の総称である。これらの金属は他の分子との複合体（錯体）を形成したときに強い蛍光を発するが、その蛍光は、通常の有機化合物の蛍光に比べて、水中で約１万倍から１０万倍という長い蛍光寿命を持つことが大きな特徴である。ランタノイド錯体の蛍光プローブを用いれば、励起光を照射した後に一定の時間を置いて（余分な蛍光が減衰してから）測定を開始することにより、高いＳ／Ｎ比で測定することが出来る。これは時間分解測定と呼ばれる。 (Lanthanoid)
Lanthanide (Ln) is a general term for 15 metal elements located in Group 3 of Period 6 in the periodic table. These metals emit strong fluorescence when they form complexes with other molecules, and the fluorescence is about 10,000 to 100,000 times higher than the fluorescence of ordinary organic compounds in water. A major feature is that it has a long fluorescence lifetime. If a lanthanide complex fluorescent probe is used, measurement can be performed at a high S/N ratio by starting measurement after a certain period of time after irradiation with excitation light (after excess fluorescence has decayed). This is called time-resolved measurement.

（ランタノイド標識）
ランタノイド錯体は、蛍光標識物質として抗体などのタンパク質に結合させることが出来る。例えば、市販の標識体作成のためのキット（ＱｕｉｃｋＡＬＬＡｓｓａｙ^ＴＭユーロピウムキレートラベリングキット、ＢＮｐａｎｄｓ、Ｗ１０２４）などを利用することが出来る。キットを利用して、例えば、ユウロピウム錯体標識した抗ビオチン抗体を作製することが出来る。 (lanthanide label)
Lanthanide complexes can be bound to proteins such as antibodies as fluorescent labeling substances. For example, a commercially available label preparation kit (QuickALLAssay ^™ europium chelate labeling kit, BNpands, W1024) can be used. Using the kit, for example, a europium complex-labeled anti-biotin antibody can be produced.

（蛍光強度測定）
前述のように、ランタノイドは、通常の蛍光物質と比較して蛍光寿命が非常に長いという特徴がある。この特徴を利用した時間分解測定では、通常の蛍光が消光した後に測定を開始し、一定時間内の蛍光強度の測定を行う。更に、ランタノイドはストークスシフト（ユウロピウムの場合は、励起波長３４０ｎｍ，蛍光波長６１５ｎｍ）が非常に広いという特徴も持ち合わせているため、バックグラウンドの影響を最小限に抑えることができる。本発明の測定キットの蛍光強度測定には、ユウロピウムの時間分解測定に対応したイムノクロマトリーダーなどが好適に利用出来る。 (Fluorescence intensity measurement)
As described above, lanthanoids are characterized by having a much longer fluorescence lifetime than ordinary fluorescent substances. In time-resolved measurement using this feature, measurement is started after normal fluorescence is quenched, and fluorescence intensity is measured within a certain period of time. Furthermore, lanthanoids also have the characteristic of having a very wide Stokes shift (in the case of europium, the excitation wavelength is 340 nm and the fluorescence wavelength is 615 nm), so that background effects can be minimized. An immunochromatographic reader compatible with time-resolved measurement of europium can be suitably used for the fluorescence intensity measurement of the measurement kit of the present invention.

（検体希釈液）
本発明において、検体希釈液は、所定のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。 (specimen diluent)
In the present invention, the sample diluent may use any type of buffer as long as it has a sufficient buffering capacity in a predetermined pH range. acid, succinic acid, oxalic acid, boric acid, tartaric acid, acetic acid, carbonic acid, Good's buffer (MES, ADA, PIPES, ACES, colamin hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamidoglycine, tricine, glycinamide, bicine) and the like. be done.

本発明において、検体希釈液は、イムノクロマトストリップ上での生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しない非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、検体希釈液中の界面活性剤の濃度は、生体試料の希釈倍率にもよるが０．０１質量％以上０．２質量％以下が好ましく、０．０５質量％以上０．２質量％以下がより好ましく、０．０５質量％以上０．１５質量％以下がさらに好ましい。濃度が低すぎると、生体試料希釈液が展開しにくくなることがあり、濃度が高すぎると、テストラインのシグナルが低くなることがある。 In the present invention, the specimen diluent preferably contains a nonionic surfactant that improves the spreadability of the biological sample on the immunochromatographic strip and does not affect immune reactions. Nonionic surfactants include polyoxyethylene alkylphenyl ethers (Triton (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene alkyl ethers (Brij (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene sorbitan Fatty acid esters (Tween (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, alkyl glucosides, sucrose fatty acid esters and the like can be mentioned. The surfactants may be used alone or in combination of two or more. Further, the concentration of the surfactant in the sample diluent is preferably 0.01% by mass or more and 0.2% by mass or less, and more preferably 0.05% by mass or more and 0.2% by mass or less, although it depends on the dilution ratio of the biological sample. is more preferable, and 0.05% by mass or more and 0.15% by mass or less is even more preferable. If the concentration is too low, the biological sample dilution may be difficult to develop, and if the concentration is too high, the test line signal may be low.

また、検体希釈液は、競合反応の効率化、促進、特異性向上のために、ポリエチレングリコールおよび／または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。検体希釈液へのポリエチレングリコールおよび塩化ナトリウムの添加濃度は、生体試料希釈液中の終濃度がそれぞれ、１質量％以上４質量％以下、１質量％以上３質量％以下となるように添加するのが好ましい。なお、使用するポリエチレングリコールの数平均分子量は、好ましくは２０００以上１６０００以下であり、より好ましくは５０００以上１００００以下である。数平均分子量が小さい場合、本発明に適した充分な抗原抗体反応の促進作用が得られないことがある。また、数平均分子量が大きい場合、同様に、抗原抗体反応の促進作用が得られないとか、検体希釈液の粘性が高くなり、イムノクロマトストリップ上の展開性が低下することがある。 In addition, the specimen diluent preferably contains polyethylene glycol and/or sodium chloride in order to make the competitive reaction more efficient, accelerate, and improve specificity. The concentrations of polyethylene glycol and sodium chloride added to the sample diluent are such that the final concentration in the biological sample diluent is 1% by mass or more and 4% by mass or less, and 1% by mass or more and 3% by mass or less. is preferred. The number average molecular weight of polyethylene glycol to be used is preferably 2000 or more and 16000 or less, more preferably 5000 or more and 10000 or less. If the number-average molecular weight is small, it may not be possible to obtain a sufficient antigen-antibody reaction-promoting action suitable for the present invention. Also, when the number average molecular weight is large, the effect of promoting antigen-antibody reactions may be similarly not obtained, or the viscosity of the sample diluent may increase, resulting in reduced developability on the immunochromatographic strip.

（競合試薬）
本発明において、競合試薬は、生体試料中の遊離またはタンパク質に結合した状態のエストロンと競合することが出来、かつ抗エストロン抗体に結合可能であれば特に制限はない。競合試薬としては、エストロンとビオチンとの複合体を用いるのが好ましい。複合体とすることによりエストロンが安定し、また性能の良い抗体が入手し易いことから好ましい。詳細な理由は不明だが、エストロンと低分子量であるビオチンとの複合体は、エストロンとアルブミン等の高分子量物質との複合体よりも、生体試料中のエストロンに対して競合原理が働きやすいと推測している。また、エストロンとビオチンとの複合体は、エストロンと牛血清アルブミンなどのタンパク質（高分子量物質）との複合体よりも製造コストを低く抑えられるメリットもある。 (competitive reagent)
In the present invention, the competitive reagent is not particularly limited as long as it can compete with free or protein-bound estrone in a biological sample and can bind to an anti-estrone antibody. A complex of estrone and biotin is preferably used as the competitive reagent. Forming a complex is preferable because estrone is stable and an antibody with good performance is readily available. Although the detailed reason is unknown, it is speculated that the complex of estrone and low-molecular-weight biotin is more likely to compete with estrone in the biological sample than the complex of estrone and high-molecular-weight substances such as albumin. are doing. In addition, the conjugate of estrone and biotin also has the advantage that the production cost can be kept lower than the conjugate of estrone and a protein (high molecular weight substance) such as bovine serum albumin.

なお、ビオチンと複合体を形成したエストロンは、不安定な化合物であり、容易に分解してしまう畏れがある。そのため、競合試薬は低温、暗所にて使用時まで保存するのが好ましい。保存温度としては４℃以下が好ましく、－２０℃以下がより好ましく、－８０℃以下がさらに好ましい。 In addition, estrone, which forms a complex with biotin, is an unstable compound and may be easily decomposed. Therefore, it is preferable to store the competitive reagent at a low temperature in a dark place until use. The storage temperature is preferably 4°C or lower, more preferably -20°C or lower, and even more preferably -80°C or lower.

本発明において、検体を検体希釈液を用いて希釈する際には、生体試料１ｍＬに対して競合試薬を１ｐｇ以上１ｎｇ以下添加するのが好ましい。生体試料中のエストロン濃度と競合試薬の添加量の差が大きすぎると競合が上手くいかず定量性が低下することがある。なお、競合試薬は凍結乾燥等されたものを用いてもよいし、溶液の状態であってもよい。また、競合試薬を予め検体希釈液に混合、低温保管したものを使用してもよい。 In the present invention, when diluting the specimen with the specimen diluent, it is preferable to add 1 pg or more and 1 ng or less of the competitive reagent to 1 mL of the biological sample. If the difference between the estrone concentration in the biological sample and the amount of the competitive reagent added is too large, the competition may not go well and the quantification may decrease. The competitive reagent may be freeze-dried or the like, or may be in the form of a solution. Alternatively, the competitive reagent may be preliminarily mixed with a specimen diluent and stored at a low temperature.

（イムノクロマトストリップ）
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１、２に示すようなイムノクロマトストリップ８が挙げられる。図１、２において、１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、４はテストライン、５はコントロールライン、６は試料添加部材、７は吸収部材を示している。膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体３には、クロマト展開の始点側、すなわち図１、２の左側（上流側）の末端から右側（下流側）に向かって３ｍｍ以上１５ｍｍ以下の位置に、抗エストロン抗体を捕捉するためのテストライン４が形成（抗マウスＩｇＧ抗体または抗ウサギＩｇＧ抗体または抗モルモットＩｇＧ抗体が線状に固定）されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に向かって８ｍｍ以上２５ｍｍ以下の位置にコントロールライン５が形成（標識体中のビオチンを特異的に結合する抗体が線状に固定）されている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に配置され、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン５は、分析対象物質であるエストロンの存否に係わらずイムノクロマト展開が行われたことを確認するためのものである。 (Immunochromato strip)
A specific example of the immunochromatographic strip is the immunochromatographic strip 8 shown in FIGS. 1 and 2, 1 is an adhesive sheet, 2 is an impregnation member, 3 is a membrane carrier, 4 is a test line, 5 is a control line, 6 is a sample addition member, and 7 is an absorption member. The membrane carrier 3 consists of an elongated belt-shaped nitrocellulose membrane having a width of 5 mm and a length of 25 mm, and is attached to the middle of the pressure-sensitive adhesive sheet 1 having a width of 5 mm. On the membrane carrier 3, a film for capturing an anti-estrone antibody is provided at a position 3 mm or more and 15 mm or less toward the right side (downstream side) from the starting point side of chromatographic development, that is, the left side (upstream side) end in FIGS. A test line 4 is formed (anti-mouse IgG antibody, anti-rabbit IgG antibody or anti-guinea pig IgG antibody is linearly immobilized). Furthermore, a control line 5 is formed at a position of 8 mm or more and 25 mm or less toward the downstream side from the upstream end of the membrane carrier 3 (an antibody that specifically binds biotin in the label is linearly immobilized). . In addition, it is preferable that the test line is arranged on the upstream side of the control line, and the distance between the test line and the control line is 3 mm or more and less than 10 mm. Control line 5 is for confirming that immunochromatographic development was performed regardless of the presence or absence of estrone, which is the substance to be analyzed.

（試料添加部材）
本発明において、試料添加部材６は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。 (Sample addition member)
In the present invention, the sample application member 6 is, for example, a porous synthetic resin sheet or film such as porous polyethylene or porous polypropylene, or cellulose paper or non-woven fabric such as filter paper or cotton cloth. be able to.

（含浸部材）
本発明において、含浸部材２は、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維を用いるが、これに限定されるものではなく、例えば、濾紙、ニトロセルロース膜、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック不織布なども使用できる。含浸部材２は、ランタノイド錯体で標識された抗体またはアビジン／ストレプトアビジン、および抗エストロン抗体を含む溶液を前記ガラス繊維等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。 (impregnated member)
In the present invention, the impregnated member 2 uses a belt-shaped glass fiber of 5 mm x 15 mm, but is not limited to this. For example, filter paper, nitrocellulose membrane, porous plastic nonwoven fabric such as polyethylene, polypropylene, etc. can. The impregnated member 2 can be produced by impregnating a member such as the glass fiber with a solution containing a lanthanoid complex-labeled antibody or avidin/streptavidin and an anti-estrone antibody, followed by drying.

（膜担体）
本発明において、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いるが、生体試料に含まれるエストロンをクロマト展開可能で、かつ、テストライン４を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。 (membrane carrier)
In the present invention, a nitrocellulose membrane filter is used as the membrane carrier 3 as long as it is capable of chromatographically developing estrone contained in the biological sample and immobilizing a substance such as an antibody that forms the test line 4. , and other cellulose membranes, nylon membranes, glass fiber membranes, etc. can also be used.

（テストライン）
本発明において、テストライン４に固定化する抗体は、マウスＩｇＧまたはウサギＩｇＧまたはモルモットＩｇＧに特異的に結合することが出来る抗体、即ち、抗マウスＩｇＧ抗体または抗ウサギＩｇＧ抗体または抗モルモットＩｇＧ抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。 (test line)
In the present invention, the antibody immobilized on the test line 4 is an antibody capable of specifically binding to mouse IgG, rabbit IgG or guinea pig IgG, that is, anti-mouse IgG antibody, anti-rabbit IgG antibody or anti-guinea pig IgG antibody. Any antibody may be used, and it may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable from the viewpoint of reaction specificity.

（抗エストロン抗体）
エストロンは低分子化合物（分子量２７０）であり十分な複雑性を備えていないため、通常では免疫応答を誘発できない。このため、免疫した動物に抗体を産出させるには、卵白アルブミンなどのキャリアタンパク質にエストロンを化学結合したものを免疫原として用いる必要がある。また、アジュバントを混合して免疫原を注入すると、免疫応答強度が上がり、よい抗体を得られる可能性が高まる。ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清から精製して得ることが出来る。モノクローナル抗体の産生細胞は、例えば、エストロンと卵白アルブミンの結合物を適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記エストロンとの結合物などを使用して、たとえば酵素標識免疫法などを利用して選別することにより取得することができる。 (anti-estrone antibody)
Estrone is a low molecular weight compound (molecular weight 270) and lacks sufficient complexity to normally induce an immune response. Therefore, in order to induce antibody production in an immunized animal, it is necessary to use, as an immunogen, a carrier protein such as ovalbumin that is chemically bound to estrone. Injecting an immunogen mixed with an adjuvant increases the strength of the immune response and increases the possibility of obtaining good antibodies. Polyclonal antibodies can be obtained by purifying antisera obtained by immunizing rabbits, mice and the like. Monoclonal antibody-producing cells are obtained by, for example, immunizing an animal such as a mouse with a conjugate of estrone and ovalbumin together with an appropriate adjuvant, then fusing the spleen cells of the immunized animal with myeloma cells, and producing only the fused cells. It can be obtained by culturing in a selective medium that allows proliferation, and then selecting the proliferated cells using the estrone-bound compound, for example, using an enzyme-labeled immunoassay.

（コントロールライン）
本発明において、コントロールライン５には、標識抗体中の抗体を特異的に結合する抗体が固定化されているのが好ましい。前記抗体としては、抗ＩｇＧ抗体を用いることができ、具体的には、抗ヤギＩｇＧ抗体などを捕捉すべき抗体の種類に合わせて用いる。コントロールラインは、この抗体を膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、標識された抗体が膜担体の最下流部まで移動したこと、即ち、イムノクロマト展開が（正常に）行われたことを確認することができる。 (control line)
In the present invention, the control line 5 is preferably immobilized with an antibody that specifically binds to the antibody in the labeled antibody. An anti-IgG antibody can be used as the antibody, and more specifically, an anti-goat IgG antibody or the like is used according to the type of antibody to be captured. A control line can be formed by immobilizing this antibody on a membrane carrier. By using the control line, it can be confirmed that the labeled antibody has migrated to the most downstream part of the membrane carrier, that is, that immunochromatographic development has been performed (normally).

（吸収部材）
本発明において、吸収部材７は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。 (absorbing member)
In the present invention, the absorbent member 7 may be made of a material that can quickly absorb and retain liquid, and examples thereof include cotton cloth, filter paper, and porous plastic nonwoven fabrics made of polyethylene, polypropylene, etc., particularly filter paper. is optimal.

イムノクロマトストリップは、これを保護するため、また、取り扱いがし易いように、プラスチック製のハウジングケース９などに収容されるのが好ましい（図３）。このケースは、例えば、イムノクロマトストリップの試料添加部材６の上部に試料滴下部１０が開口され、テストライン４およびコントロールライン５の上部に判定部（判定窓）１１が開口されていることが好ましい。 The immunochromato strip is preferably housed in a plastic housing case 9 or the like in order to protect it and facilitate handling (Fig. 3). In this case, for example, a sample dropping portion 10 is opened above the sample addition member 6 of the immunochromatographic strip, and a determination portion (determination window) 11 is preferably opened above the test line 4 and the control line 5 .

（イムノクロマト展開）
本発明のエストロンの定量方法について説明する。まず、生体試料、競合試薬、および検体希釈液を混合して生体試料希釈液を調製する。得られた生体試料希釈液をイムノクロマトストリップの試料滴下部位に滴下して毛細管現象を利用してイムノクロマトストリップ上を展開させる。展開した生体試料希釈液は、含浸部材を通過する際に、標識された抗体（または標識されたアビジン／ストレプトアビジン）および抗エストロン抗体を溶出させる。生体試料希釈液中のエストロンは、展開中に競合試薬（エストロンと化合物との複合体）と競合的に抗エストロン抗体に捕捉される。標識された抗体は、抗エストロン抗体に捕捉された競合試薬（エストロンとビオチンとの複合体）に結合し、更に、この結合体はテストラインの抗マウスＩｇＧ抗体によって捕捉される。こうして得られたテストラインのシグナル（蛍光強度）を測定することにより定量することが出来る。なお、展開開始後、５～１２分の間にテストラインのシグナルを測定することが望ましい。この間に測定を行えば、エストロンと、競合試薬（エストロンとビオチンの複合体）との競合反応が最も効果的に起き、エストロンの濃度変化に応じた測定値の変化がテストラインにおいて得られ、エストロン濃度の違いが測定値に的確に反映されるため好ましい。即ち、生体試料中のエストロン濃度を正確に測定することが出来る。５分未満では、抗エストロン抗体と生体試料中のエストロンまたは競合試薬（エストロンとビオチンとの複合体）との反応が充分でないため測定値が低くなるか、生体試料中のエストロン濃度の違いを正確に反映した測定値を得ることが出来ないことがある。また、１２分を超えると、テストラインに固定された抗ＩｇＧ抗体などに対する非特異的な反応が増加するため、生体試料中のエストロン濃度に応じた正確な測定値変化が得られなくなることがある。 (Immunochromatographic development)
A method for quantifying estrone according to the present invention will be described. First, a biological sample diluent is prepared by mixing a biological sample, a competitive reagent, and a specimen diluent. The obtained biological sample diluted solution is dropped onto the sample drop site of the immunochromatographic strip, and is spread on the immunochromatographic strip using capillary action. The developed biological sample diluent elutes the labeled antibody (or labeled avidin/streptavidin) and the anti-estrone antibody when passing through the impregnated member. Estrone in the biological sample diluent is captured by an anti-estrone antibody competitively with a competing reagent (a complex of estrone and a compound) during development. The labeled antibody binds to a competing reagent (a conjugate of estrone and biotin) that is captured by the anti-estrone antibody, and this conjugate is then captured by a test line anti-mouse IgG antibody. It can be quantified by measuring the signal (fluorescence intensity) of the test line thus obtained. It is desirable to measure the signal of the test line within 5 to 12 minutes after the start of deployment. If the measurement is performed during this period, the competitive reaction between estrone and the competitive reagent (complex of estrone and biotin) occurs most effectively, and changes in the measured values in response to changes in the concentration of estrone can be obtained at the test line. This is preferable because the difference in concentration is accurately reflected in the measured value. That is, it is possible to accurately measure the estrone concentration in the biological sample. If the time is less than 5 minutes, the reaction between the anti-estrone antibody and the estrone or competitive reagent (complex of estrone and biotin) in the biological sample is insufficient, resulting in a low measurement value or inaccurate estrone concentration differences in the biological sample. It may not be possible to obtain measured values reflected in In addition, if it exceeds 12 minutes, non-specific reactions to the anti-IgG antibody immobilized on the test line will increase, so it may not be possible to obtain accurate changes in measured values according to the estrone concentration in the biological sample. .

（競合法）
本発明において、生体試料中のエストロンは競合法により定量するのが好ましい。エストロンのような低分子化合物は、２種類の抗体でサンドイッチすることが難しいため、競合法をとることが好ましい。 (competition law)
In the present invention, estrone in a biological sample is preferably quantified by a competitive method. Since it is difficult to sandwich a low-molecular-weight compound such as estrone between two kinds of antibodies, it is preferable to employ a competitive method.

（イムノクロマト測定キット）
本発明のイムノクロマト測定キットは、上記のイムノクロマトストリップに加えて、検体を希釈するための検体希釈液、競合試薬を少なくとも含み、更に必要に応じて、検量線を作成するためのエストロン標準液や、生体試料希釈液を調製するための容器などを含む。また、イムノクロマト結果を測定するための測定装置（クロマトリーダー等）も含む場合がある。 (Immunochromatographic measurement kit)
The immunochromatographic measurement kit of the present invention includes at least a sample diluent for diluting the sample and a competitive reagent, in addition to the immunochromatographic strips described above, and, if necessary, an estrone standard solution for preparing a calibration curve, Including a container for preparing a biological sample diluent. It may also include a measurement device (chromato reader, etc.) for measuring immunochromatography results.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で測定された特性値の測定は、以下の方法に従った。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these examples. The characteristic values measured in the examples were measured according to the following methods.

（競合試薬の調製）
エストロン（シグマアルドリッチ、Ｅ９７５０）を、Ｂｉｏｔｉｎ－ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（同仁化学、Ｂ３０３）を用いて、ビオチン化することにより、競合試薬（エストロン－ビオチン複合体）を調製した。調製後、使用時まで－３０℃にて保存した。 (Preparation of competitive reagent)
A competitive reagent (estrone-biotin complex) was prepared by biotinylating estrone (Sigma-Aldrich, E9750) with Biotin-hydrazide (Dojindo, B303). After preparation, it was stored at -30°C until use.

（ランタノイド錯体標識抗ビオチン抗体の作製）
蛍光標識試薬であるユウロピウム錯体（ＡＴＢＴＡ－Ｅｕ^３＋、東京化成工業、Ａ２０８３）を用いた。即ち、タンパク質のアミノ基にジクロロトリアジニル基を導入し、ＤＴＢＴＡ―Ｅｕ^３＋に変換することにより、抗ビオチン抗体のアミノ基をユウロピウム錯体標識して作製した。抗ビオチン抗体として、ＧｏａｔＡｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ、シグマアルドリッチ、Ｂ３６４０を用いた。 (Preparation of lanthanoid complex-labeled anti-biotin antibody)
A fluorescent labeling reagent, a europium complex (ATBTA-Eu ³⁺ , Tokyo Kasei Kogyo, A2083) was used. That is, a dichlorotriazinyl group was introduced into the amino group of the protein and converted to DTBTA-Eu ³⁺ to label the amino group of the anti-biotin antibody with a europium complex. As an anti-biotin antibody, Goat Anti-Biotin antibody, Sigma-Aldrich, B3640 was used.

（検体希釈液の調製）
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、ナカライテスク社、２７５７６－２１）に、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社、１０７８９７０４００１）、ポリエチレングリコール、およびＮａＣｌの終濃度がそれぞれ、０．１質量％、１．５質量％、１．０質量％になるように加えて溶解させ、検体希釈液を調製した。 (Preparation of specimen diluent)
Phosphate-buffered saline (pH 7.4, Nacalai Tesque, 27576-21), Triton X-100 (Sigma-Aldrich, 10789704001), polyethylene glycol, and NaCl at final concentrations of 0.1 wt%, 1 0.5% by mass and 1.0% by mass were added and dissolved to prepare specimen diluents.

（抗エストロン抗体の作製）
エストロンとＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の結合物をマウスに免疫して得られた血清から、アフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製して得られたものを、抗エストロン抗体とした。 (Preparation of anti-estrone antibody)
An anti-estrone antibody was obtained by purifying IgG from serum obtained by immunizing a mouse with a conjugate of estrone and BSA (bovine serum albumin) by affinity chromatography.

（抗マウスＩｇＧ抗体）
抗マウスＩｇＧ抗体（ＧｏａｔＡｎｔｉ―ＭｏｕｓｅＩｇＧ、アブカム、ａｂ６７０８）を、抗マウスＩｇＧ抗体として用いた。 (Anti-mouse IgG antibody)
An anti-mouse IgG antibody (Goat Anti-Mouse IgG, Abcam, ab6708) was used as the anti-mouse IgG antibody.

（含浸部材の作製）
８ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、上記で得られたユウロピウム錯体標識した抗ビオチン抗体、および抗エストロン抗体が、いずれも０．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように混合調製した抗体液を含浸させた。室温で乾燥させた後に、８ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、含浸部材とした。 (Production of impregnated member)
An 8 mm × 150 mm belt-shaped glass fiber nonwoven fabric was impregnated with an antibody solution prepared by mixing the europium complex-labeled anti-biotin antibody and the anti-estrone antibody obtained above to a concentration of 0.5 mg/mL. let me After drying at room temperature, it was cut into a size of 8 mm×5 mm to obtain an impregnated member.

（膜担体の作製）
前記抗マウスＩｇＧ抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを作製した。次に、抗ヤギＩｇＧ抗体（ＤｏｎｋｅｙＡｎｔｉ－ＧｏａｔＩｇＧ、アブカム、ａｂ１８２０２１）を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを作製した。テストラインおよびコントロールラインを作製後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、膜担体とした。 (Preparation of membrane carrier)
After adjusting the concentration of the anti-mouse IgG antibody to 1 mg/mL, it was linearly applied to a 25 mm×300 mm nitrocellulose membrane filter at an amount of 1.0 μL/cm to prepare a test line. Next, an anti-goat IgG antibody (Donkey Anti-Goat IgG, Abcam, ab182021) was adjusted to a concentration of 1 mg/mL, and then linearly applied to the nitrocellulose membrane filter at an amount of 1.0 μL/cm. A control line was made. After the test line and control line were prepared, they were dried at 50° C. for 30 minutes and cut into a size of 25 mm×5 mm to obtain a membrane carrier.

（イムノクロマトストリップの作製）
粘着シート上に、調製した膜担体、含浸部材に加えて試料添加部材、吸収部材を配置し、イムノクロマトストリップを作製した。 (Preparation of immunochromatographic strip)
An immunochromatographic strip was prepared by arranging a sample addition member and an absorption member in addition to the prepared membrane carrier and impregnated member on an adhesive sheet.

（エストロン標準液の調製）
エストロン（シグマアルドリッチ、Ｅ９７５０）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液）に添加し、エストロン標準液を調製した。 (Preparation of estrone standard solution)
Estrone (Sigma-Aldrich, E9750) was added to PBS (phosphate buffered saline) to prepare an estrone standard solution.

（測定キットを用いた定量）
上記標準液に検体希釈液を加えて表１に示す各濃度のエストロン（生体試料）希釈液を調製した。エストロン希釈液１００μＬあたり３０ｐｇの競合試薬を加えた後、イムノクロマトストリップの試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製、Ｃ１００６６－５０）を用いてテストラインの蛍光強度を測定した。結果を表１および図４に示す。本発明の測定キットを用いることにより、エストロン濃度が０ｐｇ／ｍＬ～２００ｐｇ／ｍＬの範囲において、精度よくエストロンを定量できることが確認された。 (quantitation using a measurement kit)
The specimen diluent was added to the above standard solution to prepare estrone (biological sample) diluents having respective concentrations shown in Table 1. After adding 30 pg of the competitive reagent per 100 μL of the estrone diluent, 100 μL was dropped onto the sample drop portion of the immunochromatographic strip for development. 10 minutes after dropping, the fluorescence intensity of the test line was measured using an immunochromatographic reader (manufactured by Hamamatsu Photonics, C10066-50). Results are shown in Table 1 and FIG. It was confirmed that by using the measurement kit of the present invention, estrone can be quantified with high accuracy in an estrone concentration range of 0 pg/mL to 200 pg/mL.

（化学発光免疫測定法測定との対比実験）
１２頭の雌豚から得られた唾液中のエストロン濃度を、それぞれ化学発光免疫測定法および本発明のイムノクロマト測定キットを用いて測定した。化学発光免疫測定法による測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）にて測定した。イムノクロマト法では、標準液を同時に測定して得られた標準曲線を用いて、各唾液検体中のエストロン濃度を算出し測定結果を表２および図５に示した。イムノクロマト法の測定値と化学発光免疫測定法による測定値の相関係数は０．９６であり、良好な相関関係を示した。本発明の測定キットを用いることにより、精度よくエストロンを定量できることが確認された。 (Comparison experiment with chemiluminescence immunoassay measurement)
Estrone concentrations in saliva obtained from 12 sows were measured using the chemiluminescence immunoassay method and the immunochromatography assay kit of the present invention, respectively. The measurement by the chemiluminescence immunoassay method was performed at the Clinical Laboratory Center (Kinki Preventive Medical Research Institute Co., Ltd.). In the immunochromatographic method, the estrone concentration in each saliva specimen was calculated using a standard curve obtained by simultaneously measuring standard solutions, and the measurement results are shown in Table 2 and FIG. The correlation coefficient between the values measured by the immunochromatography method and the values measured by the chemiluminescence immunoassay method was 0.96, indicating a good correlation. It was confirmed that estrone can be quantified with high accuracy by using the measurement kit of the present invention.

本発明によって、養豚の現場において唾液などの生体試料中のエストロン濃度を高感度、かつ迅速、簡便に測定することにより、豚の妊娠／非妊娠を把握することが出来、効率の良い豚の生産を行うことが可能となる。 According to the present invention, the estrone concentration in a biological sample such as saliva can be measured with high sensitivity, quickly, and easily at the site of pig farming, so that pregnancy/non-pregnancy of pigs can be determined, and efficient pig production can be achieved. It is possible to do

１粘着シート
２含浸部材
３膜担体
４テストライン
５コントロールライン
６試料添加部材
７吸収部材
８イムノクロマトストリップ
９ハウジングケース
１０試料滴下部
１１判定部（判定窓） 1 adhesive sheet 2 impregnation member 3 membrane carrier 4 test line 5 control line 6 sample addition member 7 absorption member 8 immunochromatographic strip 9 housing case 10 sample drop portion 11 determination portion (determination window)

Claims

An immunochromatographic measurement kit for quantifying estrone in a biological sample, comprising a specimen diluent for diluting the biological sample, a competitive reagent, and an immunochromatographic strip,
The immunochromatographic strip comprises a sample addition member, an impregnation member, a membrane carrier, and an absorption member which are arranged in order,
The impregnated member is impregnated with an anti-biotin antibody, avidin or streptavidin labeled with a lanthanide complex,
A measurement kit, wherein the membrane carrier comprises a test line on which an anti-IgG antibody is immobilized.

The assay kit according to (1), wherein the competitive reagent is a complex of estrone and biotin, and the impregnation member is impregnated with an anti-estrone antibody.

3. The measurement kit according to claim 1 or 2, wherein the lanthanide is europium, terbium, samarium, or dysprosium, or a combination thereof.

The anti-IgG antibody is one or more selected from the group consisting of an anti-mouse IgG antibody, an anti-rabbit IgG antibody and an anti-guinea pig IgG antibody (1) to (3). The measurement kit according to any one of .

The measurement kit according to any one of claims 1 to 4, wherein the biological sample is saliva, feces, urine, whole blood, plasma or serum.

6. The measurement kit according to any one of claims 1 to 5, which is used for determining the pregnancy status of pigs.