JP2023095427A

JP2023095427A - Immunochromatographic measurement kit for quantifying estradiol in biological sample

Info

Publication number: JP2023095427A
Application number: JP2021211306A
Authority: JP
Inventors: 達哉山口; Tatsuya Yamaguchi
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-07-06

Abstract

To provide an immunochromatographic measurement kit capable of highly sensitively, quickly, and simply measuring estradiol concentration in a biological sample in a horse production field.SOLUTION: An immunochromatographic measurement kit for quantifying estradiol in a biological sample includes: a specimen diluent liquid to dilute the biological sample; a competitive reagent; and an immunochromatographic strip. The immunochromatographic strip includes a sample addition member, an impregnation member, a membrane carrier, and an absorption member which are arranged connected in order. The impregnation member is impregnated with anti-biotin antibody or avidin or streptavidin labeled with lanthanoid complex. The membrane carrier contains a test line on which an anti-estradiol antibody is immobilized.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、生体試料中のエストラジオールを定量するためのイムノクロマト測定キットに関する。より詳しくは、生体試料（検体）を希釈するための検体希釈液、競合試薬およびイムノクロマトストリップからなる、生体試料中のエストラジオールを定量するための測定キットに関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunochromatographic measurement kit for quantifying estradiol in biological samples. More specifically, it relates to a measurement kit for quantifying estradiol in a biological sample, comprising a sample diluent for diluting the biological sample (specimen), a competitive reagent and an immunochromatographic strip.

日本は世界第５位のサラブレッド（競走馬）生産国である（２００８年）。サラブレッド生産においては、先ず、健康で丈夫な子馬を生産することが非常に重要である。馬の妊娠期間は１１か月であり、生産者は１年に１産を目指すこととなるが、交配しても不受胎に終わることも多く、また、受胎しても妊娠中に胚や胎子の死滅が５～１５％の発生率で起こることが大きな問題となっている（非特許文献１、非特許文献２）。万一、早期胚死滅があった場合でも、プロスタグランジンＦ２α投与による黄体退行処置をとることが出来れば、再発情を誘発し、同一シーズン内に再交配を行うことが可能となる。従って、交配後、早期に妊娠状態を把握することは、サラブレッド生産において極めて重要である。 Japan is the fifth largest Thoroughbred (racehorse) producing country in the world (2008). In Thoroughbred production, it is very important to produce healthy and strong foals first. The gestation period of horses is 11 months, and breeders aim to produce one offspring per year. It has become a big problem that the death rate of 5-15% occurs (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2). Even in the event of early embryonic death, if treatment for corpus luteum regression by administration of prostaglandin F2α can be taken, it will be possible to induce re-emergence and remating within the same season. Therefore, it is extremely important in Thoroughbred production to grasp the gestational status early after mating.

馬の妊娠診断法としては超音波診断が最も一般的であるが、熟練した獣医師が行う必要があり、また、高価な超音波診断装置が必要である。一方で、妊娠馬の血液中エストラジオール濃度を調べることにより、馬の妊娠状態（胎児の成長）を評価することが知られている。しかし、エストラジオールの測定法は、ガスクロマトグラフィーや、化学発光免疫測定法などであり、煩雑な操作や多大な時間がかかる問題がある。 Ultrasound diagnosis is the most common method for diagnosing pregnancy in horses, but it must be performed by a skilled veterinarian and requires an expensive ultrasound diagnostic apparatus. On the other hand, it is known to evaluate the pregnancy status (fetal growth) of a pregnant horse by examining the estradiol concentration in the blood of the pregnant horse. However, methods for measuring estradiol include gas chromatography, chemiluminescence immunoassay, and the like, which have the problems of complicated operations and taking a lot of time.

また、特許文献１、２には、尿中のエストラジオールをイムノクロマトストリップを用いて測定する技術が開示されている。 Further, Patent Documents 1 and 2 disclose techniques for measuring urinary estradiol using an immunochromatographic strip.

しかし、血中などのエストラジオール濃度は変動が大きく、一回の検査値で妊娠状態を予測することは難しい。頻回検査を行うことが好ましいが、頻回の採血は馬や獣医師に負担がかかることとなる。そのため、侵襲性の低い方法、即ち、簡便に採取可能な唾液などの生体試料中のエストラジオール濃度を簡便に測定できることが好ましいが、唾液のように夾雑物が多く、粘性が高い試料は高倍率に希釈する必要がある。このため、極めて低濃度のエストラジオールを高感度かつ簡便に定量できる技術が求められている。 However, the estradiol concentration in blood, etc. fluctuates greatly, and it is difficult to predict the pregnancy status from a single test value. Frequent examinations are preferable, but frequent blood sampling imposes a burden on horses and veterinarians. Therefore, it is preferable to use a less invasive method, that is, to easily measure the estradiol concentration in a biological sample such as saliva that can be easily collected. need to be diluted. For this reason, there is a demand for a technique that can quantify extremely low-concentration estradiol with high sensitivity and ease.

日本獣医師会雑誌、２００８、６２：６３０－６３５Journal of Japan Veterinary Medical Association, 2008, 62: 630-635 Ｈｉｐｐｏｐｈｉｌｅ、２０１２、４９：３４－４１Hippophile, 2012, 49:34-41

特開平１０－１１５６１４号公報JP-A-10-115614 特表平０８－５００６７０号公報Japanese Patent Publication No. 08-500670

本発明は、上記問題点を解決するために案出されたもので、唾液中などに存在するエストラジオール濃度を高感度かつ迅速に測定し、馬の妊娠や胎児の成長の有無を容易に判定することができる妊娠診断キットを提供することを目的とする。 The present invention was devised to solve the above-mentioned problems, by measuring the estradiol concentration present in saliva with high sensitivity and speed, and easily determining the presence or absence of pregnancy and fetal growth in horses. An object of the present invention is to provide a pregnancy diagnosis kit capable of

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により前記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。 Means for Solving the Problems As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the inventors have found that the above problems can be solved by means shown below, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）生体試料中のエストラジオールを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびイムノクロマトストリップを含み、
前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなり、
前記含浸部材には、ランタノイド錯体で標識された抗ビオチン抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンが含浸されており、
前記膜担体は、抗エストラジオール抗体が固定化されたテストラインを備えることを特徴とする測定キット。
（２）前記競合試薬は、エストラジオールとビオチンとの複合体であることを特徴とする（１）に記載の測定キット。
（３）前記ランタノイドが、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、またはジスプロシウム、あるいはそれらの組み合わせである、（１）または（２）に記載の測定キット。
（４）前記生体試料は、唾液、鼻汁、全血、血漿または血清であることを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の測定キット。
（５）ウマの妊娠状態を判定するために用いられる、（１）～（４）のいずれかに記載の測定キット。 That is, the present invention consists of the following configurations.
(1) An immunochromatographic measurement kit for quantifying estradiol in a biological sample, comprising a specimen diluent for diluting the biological sample, a competitive reagent, and an immunochromatographic strip,
The immunochromatographic strip comprises a sample addition member, an impregnation member, a membrane carrier, and an absorption member which are arranged in order,
The impregnated member is impregnated with an anti-biotin antibody, avidin or streptavidin labeled with a lanthanide complex,
A measurement kit, wherein the membrane carrier comprises a test line on which an anti-estradiol antibody is immobilized.
(2) The assay kit according to (1), wherein the competitive reagent is a complex of estradiol and biotin.
(3) The measurement kit according to (1) or (2), wherein the lanthanide is europium, terbium, samarium, or dysprosium, or a combination thereof.
(4) The measurement kit according to any one of (1) to (3), wherein the biological sample is saliva, nasal discharge, whole blood, plasma or serum.
(5) The measurement kit according to any one of (1) to (4), which is used to determine the pregnancy status of a horse.

本発明により、馬の生産現場において生体試料（唾液など）中のエストラジオール濃度を高感度かつ迅速、簡便に測定することが可能なエストラジオール定量用のイムノクロマト測定キットが提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides an immunochromatographic measurement kit for quantifying estradiol that enables highly sensitive, rapid, and simple measurement of estradiol concentration in biological samples (such as saliva) at horse production sites.

本発明の測定キットに含まれるイムノクロマトストリップの一例を示す模式図（上面図）である。Fig. 2 is a schematic diagram (top view) showing an example of an immunochromatographic strip included in the measurement kit of the present invention; 本発明の測定キットに含まれるイムノクロマトストリップの一例を示す模式図（側面図）である。1 is a schematic diagram (side view) showing an example of an immunochromatographic strip included in the measurement kit of the present invention. FIG. 本発明の測定キットに含まれるイムノクロマトストリップをハウジングケースに収容した一例を示す模式図である。FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of housing the immunochromatographic strip included in the measurement kit of the present invention in a housing case. 本発明のイムノクロマト測定キットを用いて得られたエストラジオールの測定結果の一例を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an example of estradiol measurement results obtained using the immunochromatographic measurement kit of the present invention. 本発明のイムノクロマト測定キットおよび電気化学発光免疫測定法による測定値の関係を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the values measured by the immunochromatographic measurement kit of the present invention and the electrochemiluminescence immunoassay.

以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be described in detail below.

本発明は、生体試料中のエストラジオールを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記生体試料を希釈するための検体希釈液、競合試薬、およびイムノクロマトストリップを含み、前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、含浸部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されてなり、前記含浸部材には、ランタノイド錯体で標識された抗ビオチン抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンが含浸されており、前記膜担体は、抗エストラジオール抗体が固定化されたテストラインを備えることを特徴とする測定キットである。 The present invention is an immunochromatographic measurement kit for quantifying estradiol in a biological sample, comprising a specimen diluent for diluting the biological sample, a competitive reagent, and an immunochromatographic strip, wherein the immunochromatographic strip is a sample addition member , an impregnated member, a membrane carrier, and an absorbent member are arranged in sequence, the impregnated member is impregnated with an anti-biotin antibody labeled with a lanthanide complex, avidin or streptavidin, and the membrane carrier comprises anti-estradiol This measurement kit is characterized by comprising a test line on which an antibody is immobilized.

（生体試料）
本発明において、生体試料は、特に限定されるものではないが、唾液、鼻汁、血液（全血でも血清でも血漿でもよい）、尿等が適している。動物種も、ウマの他、ヒト、ウシ、イヌ、ネコなどの血液を測定対象とすることが出来る。 (biological sample)
In the present invention, the biological sample is not particularly limited, but saliva, nasal discharge, blood (whole blood, serum or plasma may be used), urine and the like are suitable. As for animal species, the blood of humans, bovines, dogs, cats, etc. can be measured as well as horses.

（エストラジオール）
エストロゲンは、代表的な女性性ステロイドホルモンであり、標的臓器の細胞質内レセプターと結合して作用する。エストロゲンは多種確認されているが、エストロン、エストラジオール、エストリオールの３つが主となっている。このうち、エストラジオールは、生理活性が最も高く、特に重要なホルモンである。エストラジオールは、主として卵巣から産生される。また、妊娠中は胎子・胎盤から大量に分泌されるとされ、妊娠の維持や胎子の発育に重要な作用を持つと考えられている。 (Estradiol)
Estrogen is a representative female sex steroid hormone and acts by binding to intracytoplasmic receptors in target organs. Various types of estrogen have been identified, but the three main types are estrone, estradiol, and estriol. Among these, estradiol has the highest physiological activity and is a particularly important hormone. Estradiol is produced primarily by the ovaries. During pregnancy, it is said to be secreted in large amounts from the fetus and placenta, and is thought to have an important effect on the maintenance of pregnancy and the development of the fetus.

（ランタノイド）
ランタノイド（Ｌｎ）とは、周期表で第６周期第３族に位置する１５個の金属元素の総称である。これらの金属は他の分子との複合体（錯体）を形成したときに強い蛍光を発するが、その蛍光は、通常の有機化合物の蛍光に比べて、水中で約１万倍から１０万倍という長い蛍光寿命を持つことが大きな特徴である。ランタノイド錯体の蛍光プローブを用いれば、励起光を照射した後に一定の時間を置いて（余分な蛍光が減衰してから）測定を開始することにより、高いＳ／Ｎ比で測定することが出来る。これは時間分解測定と呼ばれる。 (Lanthanoid)
Lanthanide (Ln) is a general term for 15 metal elements located in Group 3 of Period 6 in the periodic table. These metals emit strong fluorescence when they form complexes with other molecules, and the fluorescence is about 10,000 to 100,000 times higher than the fluorescence of ordinary organic compounds in water. A major feature is that it has a long fluorescence lifetime. If a lanthanide complex fluorescent probe is used, measurement can be performed at a high S/N ratio by starting measurement after a certain period of time after irradiation with excitation light (after excess fluorescence has decayed). This is called time-resolved measurement.

（ランタノイド標識）
ランタノイド錯体は、蛍光標識物質として抗体などのタンパク質に結合させることが出来る。例えば、市販の標識体作成のためのキット（ＱｕｉｃｋＡＬＬＡｓｓａｙ^ＴＭユーロピウムキレートラベリングキット、ＢＮｐａｎｄｓ、Ｗ１０２４）などを利用することが出来る。キットを利用して、例えば、ユウロピウム錯体標識した抗ビオチン抗体を作製することが出来る。 (lanthanide label)
Lanthanide complexes can be bound to proteins such as antibodies as fluorescent labeling substances. For example, a commercially available label preparation kit (QuickALLAssay ^™ europium chelate labeling kit, BNpands, W1024) can be used. Using the kit, for example, a europium complex-labeled anti-biotin antibody can be produced.

（蛍光強度測定）
前述のように、ランタノイドは、通常の蛍光物質と比較して蛍光寿命が非常に長いという特徴がある。この特徴を利用した時間分解測定では、通常の蛍光が消光した後に測定を開始し、一定時間内の蛍光強度の測定を行う。更に、ランタノイドはストークスシフト（ユウロピウムの場合は、励起波長３４０ｎｍ，蛍光波長６１５ｎｍ）が非常に広いという特徴も持ち合わせているため、バックグラウンドの影響を最小限に抑えることができる。本発明の測定キットの蛍光強度測定には、ユウロピウムの時間分解測定に対応したイムノクロマトリーダーなどが好適に利用出来る。 (Fluorescence intensity measurement)
As described above, lanthanoids are characterized by having a much longer fluorescence lifetime than ordinary fluorescent substances. In time-resolved measurement using this feature, measurement is started after normal fluorescence is quenched, and fluorescence intensity is measured within a certain period of time. Furthermore, lanthanoids also have the characteristic of having a very wide Stokes shift (in the case of europium, the excitation wavelength is 340 nm and the fluorescence wavelength is 615 nm), so that background effects can be minimized. An immunochromatographic reader compatible with time-resolved measurement of europium can be suitably used for the fluorescence intensity measurement of the measurement kit of the present invention.

（検体希釈液）
本発明において、検体希釈液は、所定のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。 (specimen diluent)
In the present invention, the sample diluent may use any type of buffer as long as it has a sufficient buffering capacity in a predetermined pH range. acid, succinic acid, oxalic acid, boric acid, tartaric acid, acetic acid, carbonic acid, Good's buffer (MES, ADA, PIPES, ACES, colamin hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamidoglycine, tricine, glycinamide, bicine) and the like. be done.

本発明において、検体希釈液は、イムノクロマトストリップ上での生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しない非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、検体希釈液中の界面活性剤の濃度は、生体試料の希釈倍率にもよるが０．０１質量％以上０．２質量％以下が好ましく、０．０５質量％以上０．２質量％以下がより好ましく、０．０５質量％以上０．１５質量％以下がさらに好ましい。濃度が低すぎると、生体試料希釈液が展開しにくくなることがあり、濃度が高すぎると、テストラインのシグナルが低くなることがある。 In the present invention, the specimen diluent preferably contains a nonionic surfactant that improves the spreadability of the biological sample on the immunochromatographic strip and does not affect immune reactions. Nonionic surfactants include polyoxyethylene alkylphenyl ethers (Triton (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene alkyl ethers (Brij (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene sorbitan Fatty acid esters (Tween (registered trademark) surfactants, etc.), polyoxyethylene fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, alkyl glucosides, sucrose fatty acid esters and the like can be mentioned. The surfactants may be used alone or in combination of two or more. Further, the concentration of the surfactant in the sample diluent is preferably 0.01% by mass or more and 0.2% by mass or less, and more preferably 0.05% by mass or more and 0.2% by mass or less, although it depends on the dilution ratio of the biological sample. is more preferable, and 0.05% by mass or more and 0.15% by mass or less is even more preferable. If the concentration is too low, the biological sample dilution may be difficult to develop, and if the concentration is too high, the test line signal may be low.

また、検体希釈液は、競合反応の効率化、促進、特異性向上のために、ポリエチレングリコールおよび／または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。検体希釈液へのポリエチレングリコール、塩化ナトリウムの添加濃度は、生体試料希釈液中の終濃度がそれぞれ、１質量％以上４質量％以下、１質量％以上３質量％以下となるように添加するのが好ましい。なお、使用するポリエチレングリコールの数平均分子量は、好ましくは２０００以上１６０００以下であり、より好ましくは５０００以上１００００以下である。数平均分子量が小さい場合、本発明に適した充分な抗原抗体反応の促進作用が得られないことがある。また、数平均分子量が大きい場合、同様に、抗原抗体反応の促進作用が得られないとか、検体希釈液の粘性が高くなり、イムノクロマトストリップ上の展開性が低下することがある。 In addition, the specimen diluent preferably contains polyethylene glycol and/or sodium chloride in order to make the competitive reaction more efficient, accelerate, and improve specificity. The concentrations of polyethylene glycol and sodium chloride added to the sample diluent are such that the final concentration in the biological sample diluent is 1% by mass to 4% by mass and 1% by mass to 3% by mass. is preferred. The number average molecular weight of polyethylene glycol to be used is preferably 2000 or more and 16000 or less, more preferably 5000 or more and 10000 or less. If the number-average molecular weight is small, it may not be possible to obtain a sufficient antigen-antibody reaction-promoting action suitable for the present invention. Also, when the number average molecular weight is large, the effect of promoting antigen-antibody reactions may be similarly not obtained, or the viscosity of the sample diluent may increase, resulting in reduced developability on the immunochromatographic strip.

（競合試薬）
本発明において、競合試薬は、生体試料中の遊離またはタンパク質に結合した状態のエストラジオールと競合することが出来、かつ標識体（物質）により検出が可能であるものが良く、競合試薬としては、エストラジオールとビオチンとの複合体を用いるのが好ましい。複合体とすることによりエストラジオールが安定し、また性能の良い抗体が入手し易いことから好ましい。詳細な理由は不明だが、エストラジオールと低分子量であるビオチンとの複合体は、エストラジオールとアルブミン等の高分子量物質との複合体よりも、生体試料中のエストラジオールに対して競合原理が働きやすいと推測している。また、エストラジオールと低分子量物質との複合体は、エストラジオールと牛血清アルブミンなどのタンパク質（高分子量物質）との複合体よりも製造コストを低く抑えられるメリットもある。 (competitive reagent)
In the present invention, the competitive reagent is preferably one that can compete with estradiol in a biological sample in a free or protein-bound state and that can be detected by a labeled substance (substance). and biotin complexes are preferably used. Forming a complex is preferable because estradiol is stable and an antibody with good performance is readily available. Although the detailed reason is unknown, it is speculated that the estradiol-low-molecular-weight biotin complex is more likely to compete with estradiol in the biological sample than the estradiol-high-molecular-weight substance complex such as albumin. are doing. A complex of estradiol and a low-molecular-weight substance also has the advantage of being able to keep production costs lower than a complex of estradiol and a protein (high-molecular-weight substance) such as bovine serum albumin.

なお、ビオチンと複合体を形成したエストラジオールは不安定な化合物であり、光や熱によって二重結合の異性化が起こりやすく、また酸や空気、金属イオンとも反応しやすいため容易に分解してしまう畏れがある。そのため、競合試薬は低温、暗所にて使用時まで保存するのが好ましい。保存温度としては４℃以下が好ましく、－２０℃以下がより好ましく、－８０℃以下がさらに好ましい。 Estradiol complexed with biotin is an unstable compound that easily undergoes isomerization of the double bond by light or heat, and is easily decomposed because it easily reacts with acid, air, and metal ions. there is fear Therefore, it is preferable to store the competitive reagent at a low temperature in a dark place until use. The storage temperature is preferably 4°C or lower, more preferably -20°C or lower, and even more preferably -80°C or lower.

本発明において、生体試料１ｍＬに対して競合試薬を０．１ｐｇ以上１０ｎｇ以下添加するのが好ましい。生体試料中のエストラジオール濃度と競合試薬の添加量の差が大きすぎると競合が上手くいかず定量性が低下することがある。なお、競合試薬は凍結乾燥等されたものを用いてもよいし、溶液の状態であってもよい。 In the present invention, it is preferable to add 0.1 pg or more and 10 ng or less of the competitive reagent to 1 mL of the biological sample. If the difference between the estradiol concentration in the biological sample and the amount of the competitive reagent added is too large, the competition may not go well, resulting in a decrease in quantification. The competitive reagent may be freeze-dried or the like, or may be in the form of a solution.

（標識抗体）
本発明において、標識抗体は、競合試薬中の化合物に対する抗体、および／または高親和性物質に標識物質を結合させて得ることが出来る。抗体は、競合試薬中の化合物に対する抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。例えば、抗ビオチン抗体が挙げられる。また、高親和性物質としては、例えば化合物がビオチンの場合、アビジンやストレプトアビジンが好適に用いられる。 (labeled antibody)
In the present invention, a labeled antibody can be obtained by binding a labeled substance to an antibody against a compound in a competitive reagent and/or a high affinity substance. The antibody may be an antibody against the compound in the competitive reagent, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred from the viewpoint of reaction specificity. Examples include anti-biotin antibodies. As the high-affinity substance, for example, when the compound is biotin, avidin and streptavidin are preferably used.

（希釈倍率）
本発明において、生体試料の希釈倍率は、５０倍～１０００倍とするのが適当である。希釈倍率が低すぎると、生体試料中の夾雑物質が定量値に影響を与えることがある。また、希釈倍率が高すぎると、生体試料中のエストラジオール量が少なくなるため、測定の精度が低くなることがある。 (Dilution ratio)
In the present invention, the dilution ratio of the biological sample is preferably 50-fold to 1000-fold. If the dilution ratio is too low, contaminants in the biological sample may affect the quantitative value. On the other hand, if the dilution factor is too high, the amount of estradiol in the biological sample will decrease, which may lower the accuracy of measurement.

（イムノクロマトストリップ）
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１、２に示すようなイムノクロマトストリップ８が挙げられる。図１、２において、１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、４はテストライン、５はコントロールライン、６は試料添加部材、７は吸収部材を示している。膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体３には、クロマト展開の始点側、すなわち図１、２の左側（上流側）の末端から右側（下流側）に向かって３ｍｍ以上１５ｍｍ以下の位置に、試料中エストラジオールまたはエストラジオールとビオチンの複合体を競合的に捕捉するためのテストライン４が形成（抗エストラジオール抗体が線状に固定）されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に向かって８ｍｍ以上２５ｍｍ以下の位置にコントロールライン５が形成（ランタノイド）標識抗体を特異的に結合する抗体が線状に固定）されている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に位置し配置され、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン５は、分析対象物質であるエストラジオールの存否に係わらずイムノクロマト展開が行われたことを確認するためのものである。 (Immunochromato strip)
A specific example of the immunochromatographic strip is the immunochromatographic strip 8 shown in FIGS. 1 and 2, 1 is an adhesive sheet, 2 is an impregnation member, 3 is a membrane carrier, 4 is a test line, 5 is a control line, 6 is a sample addition member, and 7 is an absorption member. The membrane carrier 3 consists of an elongated belt-shaped nitrocellulose membrane having a width of 5 mm and a length of 25 mm, and is attached to the middle of the pressure-sensitive adhesive sheet 1 having a width of 5 mm. On the membrane carrier 3, estradiol or estradiol and biotin in the sample is placed at a position of 3 mm or more and 15 mm or less toward the right side (downstream side) from the starting point side of chromatographic development, that is, from the left (upstream side) end in FIGS. A test line 4 is formed (anti-estradiol antibody is linearly immobilized) for competitively capturing the complex. Furthermore, a control line 5 is formed at a position of 8 mm or more and 25 mm or less from the upstream end of the membrane carrier 3 toward the downstream side (an antibody that specifically binds to the lanthanide-labeled antibody is linearly immobilized). It is preferable that the test line is positioned upstream of the control line, and the distance between the test line and the control line is 3 mm or more and less than 10 mm. The control line 5 is for confirming that the immunochromatographic development was performed regardless of the presence or absence of estradiol, which is the substance to be analyzed.

（試料添加部材）
本発明において、試料添加部材６は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。 (Sample addition member)
In the present invention, the sample application member 6 is, for example, a porous synthetic resin sheet or film such as porous polyethylene or porous polypropylene, or cellulose paper or non-woven fabric such as filter paper or cotton cloth. be able to.

（含浸部材）
本発明において、含浸部材２は、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維を用いるが、これに限定されるものではなく、例えば、濾紙、ニトロセルロース膜、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック不織布なども使用できる。含浸部材２は、ランタノイド錯体で標識された抗体またはアビジン／ストレプトアビジンを含む溶液を前記ガラス繊維等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。 (impregnated member)
In the present invention, the impregnated member 2 uses a belt-shaped glass fiber of 5 mm x 15 mm, but is not limited to this. For example, filter paper, nitrocellulose membrane, porous plastic nonwoven fabric such as polyethylene, polypropylene, etc. can. The impregnated member 2 can be produced by impregnating a member such as the glass fiber with a solution containing a lanthanoid complex-labeled antibody or avidin/streptavidin, followed by drying.

（膜担体）
本発明において、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いるが、生体試料に含まれるエストラジオールをクロマト展開可能で、かつ、テストライン４を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。 (membrane carrier)
In the present invention, a nitrocellulose membrane filter is used as the membrane carrier 3 as long as it is capable of chromatographically developing estradiol contained in the biological sample and immobilizing a substance such as an antibody that forms the test line 4. , and other cellulose membranes, nylon membranes, glass fiber membranes, etc. can also be used.

（テストライン）
本発明において、テストライン４に固定化する抗体は、エストラジオールに特異的に結合することが出来る抗エストラジオール抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。 (test line)
In the present invention, the antibody immobilized on the test line 4 may be an anti-estradiol antibody that can specifically bind to estradiol, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies are preferred from the viewpoint of sex.

（抗エストラジオール抗体）
エストラジオール（分子量２７２）は低分子化合物であり十分な複雑性を備えていないため、通常では免疫応答を誘発できない。このため、免疫した動物に抗体を産出させるには、卵白アルブミンなどのキャリアタンパク質にエストラジオールを化学結合したものを免疫原として用いる必要がある。また、アジュバントを混合して免疫原を注入すると、免疫応答強度が上がり、よい抗体を得られる可能性が高まる。ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清から精製して得ることが出来る。モノクローナル抗体の産生細胞は、例えば、エストラジオールと卵白アルブミンの結合物を適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記エストラジオールとの結合物などを使用して、たとえば酵素標識免疫法などを利用して選別することにより取得することができる。 (anti-estradiol antibody)
Estradiol (molecular weight 272) is a low-molecular-weight compound and lacks sufficient complexity to normally elicit an immune response. Therefore, in order to induce antibody production in immunized animals, it is necessary to use, as an immunogen, a carrier protein such as ovalbumin that is chemically bound to estradiol. Injecting an immunogen mixed with an adjuvant increases the strength of the immune response and increases the possibility of obtaining good antibodies. Polyclonal antibodies can be obtained by purifying antisera obtained by immunizing rabbits, mice and the like. Monoclonal antibody-producing cells are produced by, for example, immunizing an animal such as a mouse with a conjugate of estradiol and ovalbumin together with an appropriate adjuvant, then fusing the spleen cells of the immunized animal with myeloma cells to obtain only the fused cells. It can be obtained by culturing in a selective medium that allows proliferation, and then selecting the proliferated cells using the estradiol conjugate, for example, using an enzyme-labeled immunoassay.

（コントロールライン）
本発明において、コントロールライン５には、標識抗体中の抗体を特異的に結合する抗体が固定化されているのが好ましい。前記抗体としては、抗ＩｇＧ抗体を用いることができ、具体的には、例えば抗ビオチン抗体がヤギ由来であれば、抗ヤギＩｇＧ抗体を膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、標識抗体が膜担体の最下流部まで移動したこと、即ち、イムノクロマト展開が（正常に）行われたことを確認することができる。 (control line)
In the present invention, the control line 5 is preferably immobilized with an antibody that specifically binds to the antibody in the labeled antibody. An anti-IgG antibody can be used as the antibody. Specifically, for example, if the anti-biotin antibody is derived from a goat, it can be formed by immobilizing the anti-goat IgG antibody on a membrane carrier. By using the control line, it is possible to confirm that the labeled antibody has migrated to the most downstream portion of the membrane carrier, that is, that immunochromatographic development has been performed (normally).

（吸収部材）
本発明において、吸収部材７は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。 (absorbing member)
In the present invention, the absorbent member 7 may be made of a material that can quickly absorb and retain liquid, and examples thereof include cotton cloth, filter paper, and porous plastic nonwoven fabrics made of polyethylene, polypropylene, etc., particularly filter paper. is optimal.

イムノクロマトストリップは、これを保護するため、また、取り扱いがし易いように、プラスチック製のハウジングケース９などに収容されるのが好ましい（図３）。このケースは、例えば、イムノクロマトストリップの試料添加部材６の上部に試料滴下部１０が開口され、テストライン４およびコントロールライン５の上部に判定部（判定窓）１１が開口されていることが好ましい。 The immunochromato strip is preferably housed in a plastic housing case 9 or the like in order to protect it and facilitate handling (Fig. 3). In this case, for example, a sample dropping portion 10 is opened above the sample addition member 6 of the immunochromatographic strip, and a determination portion (determination window) 11 is preferably opened above the test line 4 and the control line 5 .

（イムノクロマト展開）
本発明のエストラジオールの定量方法について説明する。まず、生体試料、競合試薬、および検体希釈液を混合して生体試料希釈液を調製する。得られた生体試料希釈液をイムノクロマトストリップの試料滴下部に滴下して毛細管現象を利用してイムノクロマトストリップ上を展開させる。展開した生体試料希釈液は、含浸部材を通過する際に、標識された抗体（または標識されたアビジン／ストレプトアビジン）を溶出させる。生体試料希釈液中のエストラジオールは、展開中に競合試薬（エストラジオールとビオチンとの複合体）と競合的にテストラインを成す抗エストラジオール抗体に捕捉される。そして、標識された抗体は、抗エストラジオール抗体に捕捉された競合試薬（エストラジオールとビオチンとの複合体）に結合する。こうして得られたテストラインのシグナル（蛍光強度）を測定することにより定量することが出来る。なお、展開開始後、５～１２分の間にテストラインの呈色を測定することが望ましい。この間に測定を行えば、エストラジオールと、競合試薬（エストラジオールと化合物の複合体）との競合反応が最も効果的に起き、エストラジオールの濃度変化に応じた測定値の変化がテストラインにおいて得られ、エストラジオール濃度の違いが測定値に的確に反映されるため好ましい。即ち、生体試料中のエストラジオール濃度を正確に測定することが出来る。５分未満では、テストラインの抗エストラジオール抗体と生体試料中のエストラジオールまたは競合試薬（エストラジオールとビオチンとの複合体）との反応が充分でないため測定値が低くなるとか、生体試料中のエストラジオール濃度の違いを正確に反映した測定値を得ることが出来ないことがある。また、１２分を超えると、抗エストラジオール抗体に対する非特異的な反応が増加するため、生体試料中のエストラジオール濃度に応じた正確な測定値変化が得られなくなることがある。 (Immunochromatographic development)
A method for quantifying estradiol according to the present invention will be described. First, a biological sample diluent is prepared by mixing a biological sample, a competitive reagent, and a specimen diluent. The obtained biological sample diluted solution is dropped onto the sample dropping part of the immunochromatographic strip, and is spread on the immunochromatographic strip by utilizing capillary action. The developed biological sample diluent elutes the labeled antibody (or labeled avidin/streptavidin) when passing through the impregnated member. Estradiol in the biological sample diluent is captured by an anti-estradiol antibody that forms a test line competitively with a competing reagent (complex of estradiol and biotin) during development. The labeled antibody then binds to the competing reagent (estradiol-biotin complex) captured by the anti-estradiol antibody. It can be quantified by measuring the signal (fluorescence intensity) of the test line thus obtained. It is desirable to measure the coloration of the test line within 5 to 12 minutes after the start of development. If the measurement is performed during this period, the competitive reaction between estradiol and the competitive reagent (complex of estradiol and the compound) occurs most effectively, and changes in the measured values in response to changes in the concentration of estradiol can be obtained at the test line. This is preferable because the difference in concentration is accurately reflected in the measured value. That is, it is possible to accurately measure the estradiol concentration in the biological sample. If it is less than 5 minutes, the reaction between the anti-estradiol antibody in the test line and the estradiol in the biological sample or the competing reagent (complex of estradiol and biotin) is not sufficient, resulting in a low measurement value or a decrease in the estradiol concentration in the biological sample. It may not be possible to obtain measurements that accurately reflect the differences. Moreover, if the time exceeds 12 minutes, non-specific reaction to the anti-estradiol antibody increases, so that it may not be possible to obtain an accurate measurement value change according to the estradiol concentration in the biological sample.

（競合法）
本発明において、生体試料中のエストラジオールは競合法により定量するのが好ましい。エストラジオールのような低分子化合物は、２種類の抗体でサンドイッチすることが難しいため、競合法をとることが好ましい。 (competition law)
In the present invention, estradiol in a biological sample is preferably quantified by a competitive method. Since it is difficult to sandwich a low-molecular-weight compound such as estradiol between two types of antibodies, it is preferable to adopt a competitive method.

（イムノクロマト測定キット）
本発明のイムノクロマト測定キットは、上記のイムノクロマトストリップに加えて、検体を希釈するための検体希釈液、競合試薬を少なくとも含み、更に必要に応じて、検量線を作成するためのエストラジオール標準液や、生体試料希釈液を調製するための容器などを含む。また、イムノクロマト結果を測定するための測定装置（クロマトリーダー等）も含む場合がある。 (Immunochromatographic measurement kit)
The immunochromatographic measurement kit of the present invention includes, in addition to the above-described immunochromatographic strips, at least a specimen diluent for diluting the specimen and a competitive reagent, and if necessary, an estradiol standard solution for preparing a calibration curve, Including a container for preparing a biological sample diluent. It may also include a measurement device (chromato reader, etc.) for measuring immunochromatography results.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で測定された特性値の測定は、以下の方法に従った。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these examples. The characteristic values measured in the examples were measured according to the following methods.

（競合試薬の調製）
エストラジオール（ナカライテスク、１４５４１－６１）を、Ｂｉｏｔｉｎ－ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（同仁化学、Ｂ３０３）を用いて、ビオチン化することにより、競合試薬（エストラジオール－ビオチン複合体）を調製した。調製後、使用時まで－３０℃にて保存した。 (Preparation of competitive reagent)
A competitive reagent (estradiol-biotin complex) was prepared by biotinylating estradiol (Nacalai Tesque, 14541-61) with Biotin-hydrazide (Dojindo Laboratories, B303). After preparation, it was stored at -30°C until use.

（ランタノイド錯体標識抗ビオチン抗体の作製）
蛍光標識試薬であるユウロピウム錯体（ＡＴＢＴＡ－Ｅｕ^３＋、東京化成工業、Ａ２０８３）を用いた。即ち、タンパク質のアミノ基にジクロロトリアジニル基を導入し、ＤＴＢＴＡ―Ｅｕ^３＋に変換することにより、抗ビオチン抗体のアミノ基をユウロピウム錯体標識して作製した。抗ビオチン抗体として、ＧｏａｔＡｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ、シグマアルドリッチ、Ｂ３６４０を用いた。 (Preparation of lanthanoid complex-labeled anti-biotin antibody)
A fluorescent labeling reagent, a europium complex (ATBTA-Eu ³⁺ , Tokyo Kasei Kogyo, A2083) was used. That is, a dichlorotriazinyl group was introduced into the amino group of the protein and converted to DTBTA-Eu ³⁺ to label the amino group of the anti-biotin antibody with a europium complex. As an anti-biotin antibody, Goat Anti-Biotin antibody, Sigma-Aldrich, B3640 was used.

（検体希釈液の調製）
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、ナカライテスク社、２７５７６－２１）に、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社、１０７８９７０４００１）、ポリエチレングリコール、およびＮａＣｌの終濃度がそれぞれ、０．１５質量％、２質量％、１．５質量％になるように加えて溶解させ、検体希釈液を調製した。 (Preparation of specimen diluent)
Phosphate-buffered saline (pH 7.4, Nacalai Tesque, 27576-21), Triton X-100 (Sigma-Aldrich, 10789704001), polyethylene glycol, and NaCl at final concentrations of 0.15% by mass and 2 % by mass and dissolved by adding to 1.5% by mass to prepare a specimen diluent.

（抗エストラジオール抗体の作製）
エストラジオールとＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の結合物をウサギに免疫して得られた血清から、アフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製して得られたものを、抗エストラジオール抗体とした。 (Preparation of anti-estradiol antibody)
An anti-estradiol antibody was obtained by purifying IgG from serum obtained by immunizing a rabbit with a conjugate of estradiol and BSA (bovine serum albumin) by affinity chromatography.

（含浸部材の作製）
８ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、上記で得られたユウロピウム錯体標識した抗ビオチン抗体液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を０．５ｍＬ含浸させた。室温で乾燥させた後に、８ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、含浸部材とした。 (Production of impregnated member)
A band-shaped glass fiber non-woven fabric of 8 mm×150 mm was impregnated with 0.5 mL of the europium complex-labeled anti-biotin antibody solution (0.5 mg/mL) obtained above. After drying at room temperature, it was cut into a size of 8 mm×5 mm to obtain an impregnated member.

（膜担体の作製）
前記調製した抗エストラジオール抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを作製した。
次に、抗ヤギＩｇＧ抗体（ＤｏｎｋｅｙＡｎｔｉ－ＧｏａｔＩｇＧ、アブカム、ａｂ１８２０２１）を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを作製した。
テストラインおよびコントロールラインを作製後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、膜担体とした。 (Preparation of membrane carrier)
After adjusting the concentration of the anti-estradiol antibody prepared above to 1 mg/mL, it was linearly applied to a 25 mm×300 mm nitrocellulose membrane filter at an amount of 1.0 μL/cm to prepare a test line.
Next, an anti-goat IgG antibody (Donkey Anti-Goat IgG, Abcam, ab182021) was adjusted to a concentration of 1 mg/mL, and then linearly applied to the nitrocellulose membrane filter at an amount of 1.0 μL/cm. A control line was made.
After the test line and control line were prepared, they were dried at 50° C. for 30 minutes and cut into a size of 25 mm×5 mm to obtain a membrane carrier.

（イムノクロマトストリップの作製）
粘着シート上に、調製した膜担体、含浸部材に加えて試料添加部材、吸収部材を配置し、イムノクロマトストリップを作製した。 (Preparation of immunochromatographic strip)
An immunochromatographic strip was prepared by arranging a sample addition member and an absorption member in addition to the prepared membrane carrier and impregnated member on an adhesive sheet.

（エストラジオール標準液の調製）
妊娠馬から採血して得られた血清中のエストラジオール濃度を化学発光免疫測定法にて測定し、値付けしたものをエストラジオール標準液とした。化学発光免疫測定法による測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）にて測定した。 (Preparation of estradiol standard solution)
The concentration of estradiol in serum obtained by collecting blood from a pregnant horse was measured by a chemiluminescence immunoassay method, and the value obtained was used as an estradiol standard solution. The measurement by the chemiluminescence immunoassay method was performed at the Clinical Laboratory Center (Kinki Preventive Medical Research Institute Co., Ltd.).

（測定キットを用いた定量）
上記標準液に検体希釈液を加えて表１に示す各濃度のエストラジオール（生体試料）希釈液を調製した。エストラジオール希釈液１００μＬあたり３ｐｇの競合試薬を加えた後、イムノクロマトストリップの試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製、Ｃ１００６６－５０）を用いてテストラインの蛍光強度を測定した。結果を表１および図４に示す。本発明の測定キットを用いることにより、エストラジオール濃度が０ｐｇ／ｍＬ～２０ｐｇ／ｍＬの範囲において、精度よくエストラジオールを定量できることが確認された。 (quantitation using a measurement kit)
An estradiol (biological sample) diluent having each concentration shown in Table 1 was prepared by adding the sample diluent to the above standard solution. After adding 3 pg of the competitive reagent per 100 μL of the estradiol diluted solution, 100 μL was dropped onto the sample dropping part of the immunochromato strip and developed. 10 minutes after dropping, the fluorescence intensity of the test line was measured using an immunochromatographic reader (manufactured by Hamamatsu Photonics, C10066-50). Results are shown in Table 1 and FIG. It was confirmed that estradiol can be quantified with high accuracy in an estradiol concentration range of 0 pg/mL to 20 pg/mL by using the measurement kit of the present invention.

（化学発光免疫測定法測定との対比実験）
１２頭のめす馬から得られた血清中のエストラジオール濃度を、それぞれ化学発光免疫測定法および本発明のイムノクロマト測定キットを用いて測定した。化学発光免疫測定法による測定は、臨床検査センター（株式会社近畿予防医学研究所）にて測定した。イムノクロマト法では、標準液を同時に測定して得られた標準曲線を用いて、各血清のエストラジオール濃度を算出し測定結果を表２および図５に示した。イムノクロマト法の測定値と化学発光免疫測定法による測定値の相関係数は０．９７であり、良好な相関関係を示した。
本発明の測定キットを用いることにより、精度よくエストラジオールを定量できることが確認された。 (Comparison experiment with chemiluminescence immunoassay measurement)
Serum estradiol concentrations obtained from 12 female horses were measured using the chemiluminescent immunoassay method and the immunochromatographic assay kit of the present invention, respectively. The measurement by the chemiluminescence immunoassay method was performed at the Clinical Laboratory Center (Kinki Preventive Medical Research Institute Co., Ltd.). In the immunochromatographic method, the estradiol concentration of each serum was calculated using a standard curve obtained by simultaneously measuring standard solutions, and the measurement results are shown in Table 2 and FIG. The correlation coefficient between the values measured by the immunochromatography method and the values measured by the chemiluminescence immunoassay method was 0.97, indicating a good correlation.
It was confirmed that estradiol can be quantified with high accuracy by using the measurement kit of the present invention.

本発明により、馬の生産現場において生体試料中のエストラジオール濃度を高感度かつ迅速、簡便に測定することができるので、妊娠状態を把握することが出来、効率の良い馬の生産を行うことが可能となる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, the concentration of estradiol in a biological sample can be measured with high sensitivity, speed, and convenience at the horse production site, so that it is possible to grasp the pregnancy status and efficiently produce horses. becomes.

１粘着シート
２含浸部材
３膜担体
４テストライン
５コントロールライン
６試料添加部材
７吸収部材
８イムノクロマトストリップ
９ハウジングケース
１０試料滴下部
１１判定部（判定窓） 1 adhesive sheet 2 impregnation member 3 membrane carrier 4 test line 5 control line 6 sample addition member 7 absorption member 8 immunochromatographic strip 9 housing case 10 sample drop portion 11 determination portion (determination window)

Claims

An immunochromatographic measurement kit for quantifying estradiol in a biological sample, comprising a specimen diluent for diluting the biological sample, a competitive reagent, and an immunochromatographic strip,
The immunochromatographic strip comprises a sample addition member, an impregnation member, a membrane carrier, and an absorption member which are arranged in order,
The impregnated member is impregnated with an anti-biotin antibody, avidin or streptavidin labeled with a lanthanide complex,
A measurement kit, wherein the membrane carrier comprises a test line on which an anti-estradiol antibody is immobilized.

2. The assay kit according to claim 1, wherein the competitive reagent is a complex of estradiol and biotin.

3. The measurement kit according to any one of claims 1 or 2, wherein the lanthanide is europium, terbium, samarium, or dysprosium, or a combination thereof.

The measurement kit according to any one of claims 1 to 3, wherein the biological sample is saliva, nasal secretion, whole blood, plasma or serum.

The measurement kit according to any one of claims 1 to 4, which is used for determining the pregnancy status of a horse.