JP2023067851A - 細胞の成熟度の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高速、正確、安価かつ簡便に細胞の成熟度の評価、分類を非標識で行うことが可能な細胞評価方法を提供すること。【解決手段】波長４６０ｎｍ～５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の照射光を細胞に照射して得られる透過光の波形を光学的計測情報として取得し、予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報を用いて細胞の成熟度を評価することを含んでなる、細胞の成熟度の評価方法を提供する。【選択図】図５Ｂ

Description

本発明は細胞の成熟度の評価方法に関する。

生物の機能や構造、形態等について各種解明を行う場合には、同じ機能や構造を有する細胞群をひとくくりとした対象（例えば、腎臓細胞や癌細胞）として行われることが多く、これを構成する個々の細胞を個別に独立して扱うことは行われてこなかった。

しかし近年において、同種の細胞においても、細胞毎に遺伝子の発現状態や機能が異なることが明らかになってきた。また細胞の状態（例えば発育状態や健康状態）や成長段階（例えば分化程度）などにより同種の細胞であっても形態や機能が異なるため、細胞群単位で各種解明を行うのではなく、個々の細胞単位で解析を行うことの重要性が指摘されている。

一細胞（シングルセル）による解析手法としては、顕微鏡を用いた観察が知られているが、こうした手法は詳細な検体観察が可能である一方で、観察に時間と手間がかかるという問題点があった。また、観測者間の主観的な判断により評価が行われ、観察者が的確な判断を行えるようになるまでに技能の取得に熟練を要するという課題もあった。一方、一細胞（シングルセル）による解析を行う別の細胞計測技術としては、フローサイトメトリー法が提案されている。このフローサイトメトリー法は、個々の細胞を流体中に分散させ、その流体を微細に流下させて光学的に分析する技術であり、この技術を用いた装置をフローサイトメータと呼ぶ。このフローサイトメトリー法では、流路中に観察対象となる細胞等の微粒子を高速に流下しながら励起光を照射し、個々の細胞から発せられる蛍光輝度や散乱光の総量を取得することよって、観察対象物を評価することができる。このフローサイトメトリー法を用いると、非常に高いスループットで単一細胞の解析を行うことが可能となる。特許文献１には，フローサイトメータ及びそのフローサイトメータを用いたフローサイトメトリー法が開示されている。

しかしながら、フローサイトメトリー法においては、高いスループットで細胞の解析を行うことができるものの、例えば従来の散乱光の総量等の限定的な情報に基づく測定法では、細胞内の分子局在等の解像度の高い形態情報を取得する事が難しかった。一方で細胞の病態や成熟度をバイオマーカーの発現量を指標に生物学的計測手法により細胞の病態や成熟度を検出する方法が知られており、フローサイトメトリー法でも蛍光標識された抗体等を用いて測定が行われている。

近年の技術革新により細胞自体を治療に用いる需要が高まっていることから、スループットが高い、単一細胞解析のニーズはさらに高まっている。バイオマーカーの発現量を指標とする生物学的計測手法には、光学的計測手法に比べると遥かに高価な試薬等が必要になるため、安価に単細胞レベルで迅速に膨大な数の細胞を評価できる方法の確立が求められている。また、細胞を染色あるいは標識化することで細胞の性質や状態が変化しうることが指摘されており、細胞を非侵襲あるいは非破壊的な計測方法により測定し、正確な評価、分類を行なう単一細胞解析の手法が求められている。

特許第５５３４２１４号公報

本発明は、高速、正確、安価かつ簡便に細胞の成熟度の評価、分類を非標識で行うことが可能な細胞評価方法を提供することを一つの目的としている。

本発明の一実施態様によれば、以下の発明が提供される。
［１］波長４６０ｎｍ～５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の照射光を細胞に照射して得られる透過光の波形を光学的計測情報として取得し、予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報を用いて細胞の成熟度を評価することを含んでなる、細胞の成熟度の評価方法。
［２］上記細胞が、成熟度に連関して色素の含有量または分布が変動しうる細胞である、［１］に記載の方法。
［３］上記細胞が、網膜色素上皮細胞である、［２］に記載の方法。
［４］上記照射光がＬＥＤ光またはレーザー光である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記照射光がコヒーレント光であり、その波長が４７５～５００ｎｍの範囲にある、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［６］上記照射光がインコヒーレント光であり、その波長が４６０～４７５ｎｍの範囲にある、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［７］上記細胞の成熟度を評価する際に、当該細胞が、当該細胞と直接的に接合される光学的に検出可能な標識を備えていない、［１］に記載の方法。
［８］上記標識が、蛍光色素により標識された抗体またはそのフラグメントペプチド、および、ペプチドまたは核酸で構成されるプローブ分子からなる群から選択される少なくとも１つの物質を含んでなる、［７］に記載の方法。
［９］上記予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報が、上記光学的計測情報と、細胞の成熟度に連関する参照用計測情報との３段階以上の連関度である、［１］に記載の方法。
［１０］上記予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報が、上記光学的計測情報を訓練データに用いて機械学習により作成した分類モデルである、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］上記訓練データとして機械学習させる上記光学的計測情報が、当該細胞と直接的に接合される光学的に検出可能な標識により標識付けされた細胞に照射光を照射して取得した光学的計測情報を含む、［１０］に記載の方法。
［１２］上記分類モデルが、上記光学的計測情報として、前記照射光を細胞に照射して得られる透過光の時系列波形を用いて作成される、［１０］に記載の方法。
［１３］波長 ４６０ｎｍ～５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の照射光を照射する光源と、
フローセルを移動する細胞に上記光源からの照射光を照射し、その透過光を受光部へと導く光学的素子を含む分析部と、
上記分析部から上記透過光を受光する受光部と、
上記受光部が受光した透過光の光学的計測情報に基づき細胞の成熟度を評価する評価部と、
上記評価部が細胞の成熟度を評価する際に利用する細胞の成熟度に連関する情報が予め記録されている記録部と
を備える細胞評価装置。
［１４］［１］に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
［１５］［１４］に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
［１６］［１４］に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
［１７］［１４］に記載のプログラムを実行して細胞の成熟度を評価する評価システム。

本発明によれば、細胞の成熟度の評価、分類を非標識で、高速、正確、簡便かつ安価に行うことが可能となる。本発明においては、標識を行うことなく、透過光の時系列波形を指標として細胞の成熟度を簡易に評価しうることから、標識に起因する細胞の性質や状態の変化を回避しつつ、高速かつ正確な細胞の評価、分類を行う上で特に有利である。

本発明を適用した細胞評価装置の一形態であるフローサイトメータの模式図である。 本発明の細胞評価装置の一形態であるフローサイトメータにおける分析部の構成を示す模式図である。 記録部に記憶されている、光学的計測情報と、細胞の成熟度に関する情報との３段階以上の連関度を示す図である。 ＭＩＡＰａＣａ２細胞（上図）とＲＰＥ細胞（下図）にレーザー光を照射した場合に取得された透過光の時系列波形データの一例である。 ＲＰＥ細胞およびＭＩＡＰａＣａ２細胞を被検細胞として用い、ＬＥＤ光を照射した際の透過光の時系列波形に基づき細胞種を判別評価した結果のヒストグラムである。ヒストグラムにおいて、縦軸はＣｏｕｎｔｓ（個体数）であり、横軸はＳＶＭ Ｓｃｏｒｅである。ＳＶＭ Ｓｃｏｒｅは、ある観測値についてＳＶＭ（サポートベクターマシーン）を用いて作成した分類モデルにより判別した際の判定境界からの距離に関する数値である。 ＲＰＥ細胞およびＭＩＡＰａＣａ２細胞を被検細胞として用い、レーザー光を照射した際の透過光の時系列波形に基づき細胞種を評価した結果のヒストグラムである。

発明の具体的説明

細胞の成熟度の評価方法
本発明の細胞の成熟度の評価方法は、波長４６０ｎｍ～５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長の照射光を細胞に照射して得られる細胞からの透過光の時系列波形からなる光学的計測情報に基づき、予め記録されている細胞の成熟度に連関する情報を用いて細胞の成熟度を評価することを特徴としている。

細胞に照射する照射光の波長の範囲は４６０～５００ｎｍの範囲であり、細胞の成熟度とより高度に連関する光学的計測情報を取得する観点からは、好ましくは４６５～４９５ｎｍであり、より好ましくは４６０～４７５ｎｍまたは４７５～５００ｎｍであり、さらに好ましくは４７０ｎｍまたは４８８ｎｍである。細胞に照射する照射光の波長の範囲は、事前に細胞の吸光スペクトルを測定し、細胞の成熟度により特定波長の光吸収が顕著になるという現象が判明している場合には、その特定の範囲の波長の照射光を使用することが効果的である。

細胞に照射される照射光は、コヒーレント光またはインコヒーレント光のいずれであってもよい。細胞の成熟度と高度に連関したインコヒーレント光の透過光に関する光学的計測情報を取得する観点からは、上記照射光は４６０～４７５ｎｍの範囲の波長を有するインコヒーレント光を照射することが好ましい。また、細胞の成熟度と高度に連関したコヒーレント光の透過光に関する光学的計測情報を取得する観点からは、上記照射光は４７５～５００ｎｍの範囲の波長を有するコヒーレント光を照射することが好ましい。さらに、上記照射光は、インコヒーレント光の透過光に関する光学的計測情報を取得する観点からは４７０ｎｍの波長を有することが好ましく、コヒーレント光の透過光に関する光学的計測情報を取得する観点からは４８８ｎｍの波長を有することが好ましい。

照射光の光源は、本発明の実施を妨げない限り特に限定されるものではないが、ＬＥＤまたはレーザーが好ましい。細胞の成熟度と高度に連関した計測情報を取得する観点からは、ＬＥＤ光は４６０～４７５ｎｍの範囲の波長であることが好ましい。また、レーザー光は４７５～５００ｎｍの範囲の波長であることが好ましい。

本発明において成熟度の評価を行う対象細胞は、標識等による細胞への影響を排除して正確な計測情報を取得する観点から、細胞と直接的に接合する光学的に検出可能な標識を備えていない細胞が好ましく、非標識細胞がより好ましい。また、上記光学的に検出可能な標識の好適な例としては、蛍光色素により標識された抗体またはそのフラグメントペプチドが挙げられるが、これに限られない。上記光学的に検出可能な標識の別の好適例としては、ペプチドや核酸等で構成されるプローブ分子が挙げられる。

また、本発明において成熟度の評価を行う対象の細胞は、透過光を指標とした精度の高い測定を実施する観点からは、成熟度に連関して色素の含有量または分布が変動しうる細胞が好ましい。好適な細胞の具体例としては、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞）が挙げられ、本発明の記載の方法により、前駆細胞からＲＰＥ細胞への分化の程度を評価することができる。なお、ここでの前駆細胞から網膜色素上皮細胞への分化には、人工多能性幹細胞（iＰＳ細胞）あるいは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞からＲＰＥ細胞への分化が含まれる。また、本発明の細胞評価方法はフローサイトメータのような一細胞（シングルセル）分析に用いられることが好ましいが、２以上の細胞を計測対象としてもよい。

本発明においては、上記照射光を細胞に照射し、得られる透過光の時系列波形を光学的計測情報として取得する。上記透過光の時系列波形が細胞の成熟度を評価する指標として用いうることは意外な事実である。ここで透過光の時系列波形が細胞の成熟度を評価する指標として用いるとは、透過光の時系列波形が細胞の成熟度の評価の目印になるということであり、時系列波形あるいはそれを加工した情報を用いて細胞成熟度の評価が行えるということである。光学的計測情報として、上記透過光の時系列波形情報をそのまま使用することもできるが、得られた前記波形データを適宜加工して用いることもできる。前記加工の一例は、観測した透過光の経時的な波形情報から、細胞が照射光の照射を受ける照射部位を通過している際に得られている透過光のみを切り出し、それ以外の不必要な波形情報を切り取るような処理である。光学的計測情報として、上記透過光の時系列波形情報を加工し、例えば、予め保存されている参照用計測情報との３段階以上の連関度を参照して細胞の成熟度と対応づけることができる。上記透過光の時系列波形情報の加工には、例えば、時系列波形に教師なし学習の手法を用いて特徴量を取得する方法がある。また別の加工法として、時系列波形情報を分光学的手法あるいは多変量解析手法により要素ピークに分解する等のデータ変換処理を好適に行い、後述する細胞の判別に用いてもよい。上記データ変換処理は、特に限定されるものではないが、分光学的手法としては、例えば、２次微分処理やフーリエ変換が挙げられ、多変量解析手法としてはウェブレット変換、ニューラルネットワーク法等が挙げられる。上記透過光の時系列波形情報の加工は、簡単な処理であれば表計算ソフト（マイクロソフト社のエクセルの分析ツール等）の市販のソフトを用いて行うことができ、さらに使用目的に特化したプログラムを作成することにより、迅速な情報処理解析が可能になる。

上記照射光を細胞に照射しかつ透過光由来の光学的計測情報を取得する工程は、公知の光学的測定法を用いて実施することができる。かかる光学的測定法は、正確な波長光の照射および一細胞分析のための計測情報の正確な取得を実施する観点からは、フローサイトメトリー法、顕微鏡を用いる観察法およびイメージングフローサイトメトリー法等が挙げられ、フローサイトメトリー法またはイメージングフローサイトメトリー法が、高いスループットで単一細胞の解析を行うことができる観点からは好ましい。

本発明においては、一例として、上述のようにして得られる透過光の波形として取得される光学的計測情報に基づき、予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報を用いて細胞の成熟度を評価する。予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報は、例えば、学習済み分類モデルとして記録部内に保存されたのち、用事利用することができる。

以下、本発明の細胞の成熟度に連関する情報を用いた細胞の成熟度を評価する手法について、本発明を適用した評価システムの一例に関する図面を参照しながら詳細に説明をする。

図１は、本発明を適用した細胞評価装置の一形態であるフローサイトメータ１の概要を示している。フローサイトメータは、フローサイトメトリー法を用い、個々の細胞を流体中に分散させた個々の細胞を流下する流体中で光学的に分析する細胞分析装置である。

フローサイトメータ１は、光源２と、光源２からの上記照射光が照射される分析部３と、分析部３からの光情報を受光する受光部４と、光源２、分析部３および受光部４にそれぞれ接続される制御部５と、光源２、受光部４および制御部５にそれぞれ接続される評価部６と、評価部６、受光部４に接続される記録部７とを備えている。図１では、説明のためフローサイトメータ１の光学的な測定のための構成を中心に記載しているため、個々の細胞を流通させる流路等の構成については記載が省略されている。

光源２は、分析部３における分析に必要な上記照射光を照射する。光源は、上記波長範囲を満たす照射光を照射する１つまたは複数の光源であってよい。光源は、例えば、連続光であってもパルス光であってもよいが、連続光が望ましい。光源の具体的な例は、レーザー光源、半導体レーザー光源、ＬＥＤ（ＬＩＧＨＴ ＥＭＩＴＴＩＮＧ ＤＩＯＤＥ）光源等が挙げられる。

光源からの照射光には、構造化されていない照明光（以下、スポット光ともいう。）を用いることができる。さらに、光源と受光部との間の光路に光を変調するための回折光学素子（ＤＯＥ：Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｌｅｍｅｎｔ））等を挿入し、構造化照明光として測定対象の細胞を照射することもできる。フローサイトメータにおいて構造化照明を測定対象物に照射して細胞を測定すると、照射光を受け細胞が発する光信号には測定対象物の形態情報が圧縮して含まれるため、より解像度の高い細胞の形態情報を取得することができる。こうした動的ゴーストイメージング法による解像度の高い細胞の形態情報を取得するイメージングサイトメトリー法については、例えば、Ota et al, Science vol360, 1246-1251 June 15,2018 あるいはWO2017/073737に記載されている。

分析部３は、フローサイトメトリー法等に基づき、個々の細胞を流体中に分散させ、その流体の移動に伴い移動する細胞に光源からの照明光を照射して、細胞の光学的計測情報を好適に取得するための光学的な構成である。この分析部３の詳細は、後段において詳述する。

受光部４は、分析部３を介して得られる細胞からの透過光情報を受光するための光センサ（光検出器）で構成される。センサとは、例えば、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）、ＡＰＤ（Ａｖａｌａｎｃｈｅ Ｐｈｏｔｏ－ｄｉｏｄｅ）、ＰＤ（Ｐｈｏｔｏ－ｄｅｔｅｃｔｏｒ）である。受光部４は、透過光の経時的な波形情報を細胞の光学的計測情報として取得する。

制御部５は、光源２、分析部３、受光部４、評価部６を制御するための中央制御ユニットとしての役割を担う。この制御部５は、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）、携帯端末、スマートフォン、ウェアラブル端末、タブレット型端末等で構成される。

評価部６は、受光部４から得られた光学的測定情報を取得し、さらに記録部７に記憶あるいは記録されている情報を参照し、光学的計測情報を取得した細胞の評価を行う。この評価部６も同様に、ＰＣ、携帯端末、スマートフォン、ウェアラブル端末、タブレット型端末等で好適に構成される。また、この評価部６は、ＦＰＧＡ（Field―programmable gate array）やＡＳＩＣ（application specific integrated circuit）の論理回路を含む構成としてもよく、上述した制御部５と同一デバイスで構成されていてもよい。記録部７は、上述した評価部６による細胞の評価を行う上で必要な情報を記録するためのコンピュータに読み取り可能な記録媒体を含む構成であってもよい。記録部７は、一例では、ハードディスクやメモリ等の固定型の記録媒体を含む構成である。また、記録部７の別の例は、ＣＤ－ＲＯＭ、磁気ディスク、光ディスク等の着脱可能等の記録媒体を含む構成である。記録部７は、その一部または全てをインターネット経由で提供されるストレージサービスにより構成することもできる。記録部７に記録されている情報は、コンピュータに読み込ませて実行させることができ、評価部６による評価に利用される。また。記録部７は、受光部４から光学的計測情報を受け取り記録あるいは保存することもできる。

次に、上述した構成を有するフローサイトメータ１の動作について説明をする。
図２は、フローサイトメータ１における分析部３の構成を示す模式図である。分析部３は、光源からの照明光を細胞に照射して、細胞の光学的計測情報を好適に取得するための光学的な構成であり、図２の例ではダイクロイックミラー８ａ、８ｂ、８ｃと、対物レンズ９と、第二レンズ１０と、フローセル１１とを備えている。

図２ではフローセル１１からサンプル液の流れに乗って細胞１２が一列で流路を流れている。そして、光源２から照射される照射光はダイクロイックミラー８ａ、８ｂにおいて細胞１２へ照射されるように調節される。そして、照射光は対物レンズ９を介して細胞１２に照射され、細胞１２から発せられる透過光および散乱光（前方散乱光等）は第二レンズ１０を通過する。ここで、対物レンズ９は照射光の焦点位置やスポット径の調整等を行う役割を担い、第二レンズ１０は透過光をダイクロイックミラー８ｃおよび受光部４に導く役割を担う。そして、第二レンズ１０を通過する透過光はダイクロイックミラー８ｃにて分光され、ダイクロイックミラー８ｃを透過した透過光は受光部４にて検出される。一方、ダイクロイックミラー８ｃにより反射される散乱光は、細胞１２がフローセル１１中の照射部位を通過するタイミングを確認するため、図中に記載されていない別の受光部により取得される。

上記受光部４において透過光が検出される。このように受光部４により検出された透過光の計測データは光学的計測情報として、評価部６へと送られる。

評価部６は、受光部４から送られてきた計測データをもとに細胞１２の成熟度についての評価を行う。評価部６は、細胞１２の光学的計測情報を解析することにより、細胞１２の成熟度を評価する。ここで成熟とは、時間の経過により細胞が変化することであり、成熟度とはその変化の程度である。細胞は成熟することにより、形態や状態に変化を起こしたり新たな機能を獲得したり機能を失ったりという変化を生じる。例えば、幹細胞等の分化能を有する細胞は、成熟し目的細胞へ分化する。ここでの分化とは、分化能を有する細胞が目的細胞に変化することである。細胞の成熟度の具体例としては、前駆細胞から網膜色素細胞への分化の程度である。評価部６は、受光部４から送られてきた光学的計測情報をもとに細胞１２の成熟度を判別評価する。光学的計測情報は、受光部４が取得した計測データであり、透過光の経時的な波形情報である。

評価部６は、光学的計測情報として受光部４が取得した透過光の時系列の波形情報を訓練データとして用い、機械学習により、時系列波形情報を細胞の成熟度と直接関連づけて判別を行う分類モデルを構築する。評価部６は、構築した学習済みモデルを記録部７内に予め記録・保存させる。

また、評価部６は、光学的計測情報である時系列波形データから細胞１２の成熟度を判別評価する。その際、評価部６は、前記学習済みの分類モデルを用いて光学的計測情報から細胞の成熟度の判定を行う。このように、光学的計測情報である時系列波形データと細胞の成熟度との連関度に関する情報として、事前に機械学習により作成した分類モデルを用いて細胞の成熟度を評価することにより、迅速かつ正確な解析を測定者の主観を排除して行なうことが可能になる。

図３は、記録部に記憶されている、光学的計測情報と、細胞の成熟度に関する情報との３段階以上の連関度の一例を示す図である。図３では、受光部４を介して取得された透過光の時系列波形である光学的計測情報が、連関度を介して左側に配列されている。一方、細胞の成熟度に関する情報がこの連関度を介して右側に配列されている。細胞の成熟度に関する情報は、成熟度の異なる細胞を特定する細胞特定情報である。ここで連感度は、光学的計測情報である透過光の時系列波形がいずれの成熟度の細胞と紐づけられる可能性が高いかを示す指標である。例えば、時系列波形Ｕ１１は、未成熟細胞と連関度７０％、成熟レベルが低い細胞と連関度２０％、成熟レベルが中程度の細胞と連関度１０％であることが示されている。図３は、機械学習により作成した分類モデルの一例である。なお、光学的計測情報と細胞特定情報との連関度から機械学習により事前に学習済みモデルを構築し、その学習済みのモデルに基づいて光学的測定情報から細胞を評価する方法は、例えば、ＷＯ２０１８／２０３５６８Ａ１に記載の方法を参照することができる。

また、図３では、光学的計測情報が細胞特定情報（成熟度の異なる細胞）と複数の連関度により紐づけられる分類モデルの例が示されていたが、別の方法として、成熟度の分類モデルを二価分類によって作成することもできる。その場合、成熟細胞に照射光を照射した際の透過光の経時的なデータと未成熟細胞に照射光を照射した際の透過光の経時的なデータを訓練データとして用い、光学的計測情報として受光部４が取得した透過光の時系列波形データから、当該細胞が成熟細胞かあるいは未成熟細胞かを判定する分類モデルが作成される。評価部６は、前記の成熟度の分類モデルを用い、透過光の時系列波形データから、当該細胞が成熟細胞か未成熟細胞かを判定する。

細胞の成熟度を評価する分類モデルは、例えば、ＳＶＭ（サポートベクターマシーン）あるいはニューラルネットワークを用いて作成することができる。分類モデルの作成には、それ以外の既存の機械学習アルゴリズムを用いても良い。また、分類モデルは、深層学習がなされることを前提としたネットワークで構成されていてもよい。細胞の成熟度を評価する分類モデルは、訓練データを更新しさらに学習をすることにより更新が可能なモデルで構成されていてもよい。

成熟度の分類モデルは、前記の通り、光学的計測情報として受光部４が取得した時系列の波形情報と細胞の成熟度を直接関連づけ作成することもできるが、それ以外に、時系列の波形情報を適宜加工して算出したデータ（例えば、透過光の変化量）と細胞の成熟度を直接関連づけ作成することもできる。その場合、成熟度の分類モデルは、同様に、ＳＶＭ（サポートベクターマシーン）で構成されていてもよく、またニューラルネットワークで構成されていてもよい。またこれらモデルは、深層学習がなされることを前提としたネットワークで構成されていてもよい。

上記記録部７に記録する情報は、汎用のプログラムを用いて作成管理することができるが、さらに使用目的に特化したプログラムを作成することにより、迅速な解析が可能になる。また、評価部６による分類モデルの構築にも汎用のプログラムを用いることができる。例えば、光学的計測情報と細胞の成熟度を直接関連づけ学習により分類モデルを作成する場合には、Ｐｙｔｈｏｎを用いたプログラムにより機械学習を実装することができる。また提供されている機械学習プラットフォームを使用することもできる。

本発明を適用した評価方法において、上記の光学的計測情報を取得する測定法は、正確な波長光の照射および計測情報の取得を１細胞毎に高いスループットで実施する観点からはフローサイトメトリー法により行うことが好ましいが、それに限らない。

また、本発明を適用した細胞評価装置によれば、受光部４を介して新たに取得した細胞の光学的計測情報を、例えば、光学的計測情報と細胞の成熟度が紐づけられた訓練データを用いて機械学習により作成した分類モデルにより判別することができる。しかも本発明を適用した細胞評価装置によれば、これらの評価動作を人の手を介することなく自動的に行うことが可能となる。これにより、光学的測定による情報に基づいて、観察者の主観的判断によらず、生物学的に正しい細胞の分類、評価を高速かつ正確に行うことが可能となる。

本発明によれば、上記の照射光由来の透過光の経時的な波形に基づいて細胞の成熟度を判定する全行程を、コンピュータ等により自動化することができる。従って、本発明の方法をコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。
具体的には、本発明によれば、光学的計測情報である透過光の経時的な波形を入力した際に細胞の成熟度を出力する分類モデルを得る工程と、分類モデルに基づいて細胞の光学的計測情報から細胞の成熟度を自動判定する工程とをコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。本発明によればまた、本発明のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。本発明によればさらに、本発明のプログラムをその内部記録装置に記録したコンピュータまたは本発明のコンピュータを備えた細胞の成熟度の評価システムが提供される。

本発明のプログラムは、フレキシブルディスクやＣＤ－ＲＯＭ等の記録媒体に記録し、コンピュータに読み込ませて実行させてもよい。記録媒体は、磁気ディスクや光ディスク等の着脱可能なものに限定されず、ハードディスク装置やメモリ等の固定型の記録媒体でもよい。また、本発明のプログラムは、クラウド上の保管場所（クラウドサーバー等）に保管することもできる。クラウド上に置いたプログラムやデータは、ダウンロードして利用することや必要に応じてインターネット経由でアクセスして利用することができる。また、本発明のプログラムを、インターネット等の通信回線（無線通信も含む）を介して頒布してもよい。さらに、同プログラムを暗号化したり、変調をかけたり、圧縮した状態で、インターネット等の有線回線や無線回線を介して、あるいは記録媒体に収納して頒布してもよい。本発明における評価システムには、コンピュータに本発明の成熟度評価方法を実行するためのプログラムや予め記録されている細胞の成熟度に連関する情報を、評価装置を構成する自身のコンピュータに記録して利用する場合に加え、インターネット等の通信回線（無線通信も含む）を介して必要時にアクセスして利用する場合が含まれる。

また、本発明の細胞の成熟度の評価システムは、上述の通り、ディスプレイ等から構成される表示部を備えていてもよい。表示部は、例えば、各種手段によって取得または分析された結果（例えば、細胞の成熟度の分析結果等）を表示する。具体的には、データベースにより分類されたクラス判別結果に基づき、「成熟している」「成熟している可能性高い」「成熟している可能性低い」「成熟の程度高い」「成熟の程度低い」「未成熟状態」等といった表示を行う。なお、本装置を小型化する場合は、表示部を液晶等のフラットディスプレイとすることが好ましい。

以下に、具体的な実施例に則して本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例の特定の態様により制限されると理解されるべきではない。本発明には、実施例に開示された発明のあらゆる改変や変更が含まれると理解されるべきである。

試験例１
光学分析
被検細胞として、ＲＰＥ細胞、およびヒト膵臓がん由来細胞であるＭＩＡＰａＣａ２細胞を用意した。ＲＰＥ細胞は成熟度に連関して色素の含有量または分布が変動する細胞であり、成熟度に連関して色素の含有量または分布が変動する細胞における成熟細胞のモデルである。一方、ＭＩＡＰａＣａ２細胞は色素含有量が低い対照細胞である。試験例１では、ＭＩＡＰａＣａ２細胞を成熟度に連関して色素の含有量または分布が変動する細胞における未成熟な細胞のモデルとして用いた。

次に、予め洗浄した被検細胞を５×１０^６～１０×１０^６細胞／ｍＬになるよう希釈し、当該液１ｍＬを１．５ｍＬ容チューブに分注し、フローサイトメータにより光学分析を行った。

本試験例１で使用したフローサイトメータの構成の概要は、図２に記載されているフローサイトメータ１と同じであるが、流路において細胞の通過した位置の透過光だけを切り出して検出するため、さらにレンズと絞りを含む光学系を含む構成となっている。本試験例では、光源２から、インコヒーレント光として波長４７０ｎｍのＬＥＤ光を、コヒーレント光として波長４８８ｎｍのレーザー光を、被験細胞である細胞１２に照射した。照射する照射光の波長は、事前にＲＰＥ細胞の吸光スペクトルを測定し、上記の光源を選択した。本試験例１では、光源からの照射光にはスポット光を用いている。細胞１２は、フローセル１１を通過する過程で、それぞれの照射光の照射を受け、細胞１２を透過した透過光は受光部４に該当する光センサにより検出された。図４には、ＭＩＡＰａＣａ２細胞（上図）またはＲＰＥ細胞（下図）に、４８８ｎｍのレーザー光を照射した場合に取得された透過光の波形データの一例を示している。本試験例１における光学分析では、流速を６００ｅｖｅｎｔｓ／ｓｅｃ以下とし、計測細胞数を１０，０００細胞として行った。本試験例１では、透過光の変化量よりにより色素量の異なるＲＰＥ細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞との判別を行った。より具体的には、本試験例１では、取得した透過光強度を積算し、透過光の吸収（細胞への照射による透過光総量の減少）から色素量の異なるＲＰＥ細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞との判別を行った。さらに本試験例１では、透過光の波形データ（時系列の透過光強度データ）を訓練データとして後述の方法で分類モデルを作成し、その分類モデルを用いてＲＰＥ細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞との判別を行った。

分類モデル作成
ＲＰＥ細胞およびＭＩＡＰａＣａ２細胞をそれぞれ４，５００細胞個ずつ用意し、上記光学分析と同様の手法によりＬＥＤ光およびレーザー光で照射した際の透過光の波形を測定し、由来の判明している波形データを訓練データとして取得し、それに基づいて細胞判別のための分類モデル（二値分類モデル）をＳＶＭアルゴリズムにより作成した。なお分類モデルの作成の実行にはＰｙｔｈｏｎ３を用いた。

作成した分類モデルを用いた判別評価
ＲＰＥ細胞およびＭＩＡＰａＣａ２細胞をそれぞれ９，８００細胞個ずつ用意し、上記光学分析と同様の手法によりレーザー光およびＬＥＤ光での透過光の時系列波形データを取得し、保存されていた上記分類モデルを用いて、その細胞がＲＰＥ細胞かＭＩＡＰａＣａ２細胞かを波形データをもとに判別評価を行った。

判別評価の結果
以下の表１は、透過光の変化量よりによりＲＰＥ細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞との判別を行った結果を示している。表１の透過光の変化量は、ＬＥＤ光あるいはレーザー光を各細胞に照射した際の透過光の吸収（透過光総量の減少）を示している。ＬＥＤ光およびレーザー光のいずれの光を照射した場合においても、透過光の吸収により２つの細胞を明確に判別することは難しかった。

一方、ＬＥＤ光を照射した際の透過光の時系列波形データを取得し、波形データを訓練データとして学習させ作成した分類モデルを用いて評価した結果を示すヒストグラムは、図５Ａに示される通りであった。また、レーザー光を照射した際の透過光の時系列波形データを取得し、同様に波形データを訓練データとして学習させ作成した分類モデルを用いて評価を行った結果を示すヒストグラムは、図５Ｂに示される通りであった。いずれの場合も、ヒストグラムの右側（SVM Scoreがより高い側）にＲＰＥ細胞が、ヒストグラムの左側にＭＩＡＰａＣａ２細胞が示され、両者を良く分離して判別することができた。

また、上記分類モデルを用いたＲＰＥ細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞の判別評価により得られた、判別精度（Ａｃｃｕｒａｃｙ）およびＲＯＣ曲線のＡＵＣ（ＲＯＣ－ＡＵＣ）は、表２に示される通りであった。いずれも高レベルの判別精度およびＲＯＣ－ＡＵＣを示した。

１ フローサイトメータ
２ 光源
３ 分析部
４ 受光部
５ 制御部
６ 評価部
７ 記録部
８ａ、８ｂ、８ｃ ダイクロイックミラー
９ 対物レンズ
１０ 第二レンズ
１１ フローセル
１２ 細胞

Claims (17)

1. 波長４６０ｎｍ～５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の照射光を細胞に照射して得られる透過光の波形を光学的計測情報として取得し、予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報を用いて細胞の成熟度を評価することを含んでなる、細胞の成熟度の評価方法。
2. 前記細胞が、成熟度に連関して色素の含有量または分布が変動しうる細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞が、網膜色素上皮細胞である、請求項２に記載の方法。
4. 前記照射光がＬＥＤ光またはレーザー光である、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記照射光がコヒーレント光であり、その波長が４７５～５００ｎｍの範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
6. 前記照射光がインコヒーレント光であり、その波長が４６０～４７５ｎｍの範囲にある、請求項１または２に記載の方法。
7. 前記細胞の成熟度を評価する際に、当該細胞が、当該細胞と直接的に接合される光学的に検出可能な標識を備えていない、請求項１に記載の方法。
8. 前記標識が、蛍光色素により標識された抗体またはそのフラグメントペプチド、および、ペプチドまたは核酸で構成されるプローブ分子からなる群から選択される少なくとも１つの物質を含んでなる、請求項７に記載の方法。
9. 前記予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報が、前記光学的計測情報と、細胞の成熟度に連関する参照用計測情報との３段階以上の連関度である、請求項１に記載の方法。
10. 前記予め取得されている細胞の成熟度に連関する情報が、前記光学的計測情報を訓練データに用いて機械学習により作成した分類モデルである、請求項１または２に記載の方法。
11. 前記訓練データとして機械学習させる前記光学的計測情報が、当該細胞と直接的に接合される光学的に検出可能な標識により標識付けされた細胞に照射光を照射して取得した光学的計測情報を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記分類モデルが、前記光学的計測情報として、前記照射光を細胞に照射して得られる透過光の時系列波形を用いて作成される、請求項１０に記載の方法。
13. 波長４６０ｎｍ～５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の照射光を照射する光源と、
    フローセルを移動する細胞に前記光源からの照射光を照射し、その透過光を受光部へと導く光学的素子を含む分析部と、
    前記分析部から前記透過光を受光する受光部と、
    前記受光部が受光した透過光の光学的計測情報に基づき細胞の成熟度を評価する評価部と、
    前記評価部が細胞の成熟度を評価する際に利用する細胞の成熟度に連関する情報が予め記録されている記録部と
    を備える細胞評価装置。
14. 請求項１に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
15. 請求項１４に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
16. 請求項１４に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
17. 請求項１４に記載のプログラムを実行して細胞の成熟度を評価する評価システム。

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