JP2023036266A - 細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサおよび細胞イメージング装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞に異方性がある場合にも低侵襲で、高効率に、イオンチャネルの評価が可能な細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサおよび細胞イメージング装置を提供する。【解決手段】細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０は、基板２５と、基板２５上に設けられる４以上の電極２０および基板２５上に設けられ、細胞または細胞群が配置される細胞配置部２８からなる測定部４５と、を備え、電極２０は、細胞配置部２８の周囲に配置される。【選択図】図２

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り （１）第４８回可視化情報シンポジウム、講演論文集 ２０２０年９月２４日公開 （２）第４８回可視化情報シンポジウム ２０２０年９月２５日公開 （３）日本機械学会第３１回バイオフロンティア講演会、講演論文集 ２０２０年１２月８日公開 （４）日本機械学会第３１回バイオフロンティア講演会 ２０２０年１２月１２日公開 （５）日本機械学会 関東支部第２７期総会・講演会、講演論文集 ２０２１年３月３日公開 （６）日本機械学会 関東支部第２７期総会・講演会 ２０２１年３月１０日公開

本発明は、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサおよび細胞イメージング装置に関する。

創薬や細胞識別などの分野において、細胞膜上のタンパク質のイオンチャネルが注目されている。イオンチャネルは、細胞膜のイオン透過路で静止膜電位の形成、活動電位の発生、化学伝達物質放出制御、筋収縮制御、ホルモン分泌の制御を担っている。

創薬分野において、イオンチャネルは多くの疾患に関与するため、イオンチャネルを標的とした創薬が進められている。例えば、イオンチャネル標的薬の一つのアムロジピンは、ジヒドロピリジン系カルシウム・イオンチャネル拮抗薬の一つで、世界中で服用されている。

イオンチャネル創薬は、様々な疾患に関与する重要な創薬ターゲットであるが、イオンチャネル薬は医薬品全体の５％程度しかない。これの原因として、低侵襲で、容易に、高効率で、異方性のある細胞の薬効評価を行うことが困難であるということが挙げられる。例えば、高い精度でイオンチャネルのイオンの流れを電気的に計測する方法としてパッチクランプ法があるが、評価速度が低く高度な実験技術と経験が必要である。そのため、イオンチャネルのイオンの流れを低侵襲で、容易に高効率で、評価する方法が求められている。

細胞識別分野において、目的細胞と異種細胞とを低侵襲で識別する細胞識別技術は、再生医療において、重要な技術である。細胞識別技術としては、フローサイトメトリーがある。フローサイトメトリーは、高効率で細胞識別をすることができるが、蛍光試薬を利用する侵襲的な手法のため、肝細胞の再生医療応用には、不適である。幹細胞の再生応用には、品質、安全性の観点から、蛍光試薬を必要としない低侵襲で細胞および組織の状態などを計測評価する方法が求められている。

非特許文献１には、低侵襲で、効率的に細胞識別できる技術として、くし形インピーダンスセンサを利用し、細胞群外液のインピーダンスを経時的に計測する技術が開示されている。

D. Kawashima, S.Li, H.Obara, M. Takei, Low-frequency impedance-based cell discrimination considering ion transport model in cell suspension, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 68, 3, 1015-1023 (2021)

しかし、非特許文献１の技術では、細胞に異方性がある場合、計測精度が劣るという問題があった。

本発明は、上記の課題を鑑みてなされたものであり、細胞に異方性がある場合にも低侵襲で、高効率に、イオンチャネルの評価が可能な細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサおよび細胞イメージング装置を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提案している。
＜１＞ 本発明の一態様に係る細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサは、基板と、前記基板上に設けられる４以上の電極および前記基板上に設けられ、細胞または細胞群が配置される細胞配置部からなる測定部と、を備え、前記電極は、前記細胞配置部の周囲に配置される。

＜２＞ 上記＜１＞に記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサは、前記電極は、前記細胞配置部の中心を中心として同心円状に配置されてもよい。

＜３＞ 上記＜１＞または＜２＞に記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサは、前記測定部が２以上あってもよい。

＜４＞ 上記＜１＞～＜３＞のいずれか1つ記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサは、前記電極と前記電極の周囲を覆う絶縁体とからなる電極層を備えてもよい。

＜５＞ 上記＜４＞に記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサは、前記電極層が２以上積層されてもよい。

＜６＞ 本発明の一態様に係る細胞イメージング装置は、上記＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサを備える細胞イメージング装置であって、前記電極間に電流又は電位差を印加し、前記電流を印加する場合は電流印加電圧測定パターンに基づき電位差と位相を測定し、前記電極間に前記電位差を印加する場合は電圧印加電流測定パターンに基づき電流と位相を測定する、電流電圧印加測定部と、前記電流印加電圧測定パターンまたは前記電圧印加電流測定パターン、前記細胞配置部を分割して得たメッシュ座標、および各前記電極の座標を基に、ヤコビ行列を計算するヤコビ行列計算部と、前記ヤコビ行列計算部で計算された前記ヤコビ行列と、前記電流電圧印加測定部で測定された前記電位差および位相または前記電流および位相と、から前記細胞または前記細胞群の電気物性分布を計算する電気物性分布計算部と、
を備えてもよい。

＜７＞ 上記＜６＞に記載の細胞イメージング装置は、前記電流電圧印加測定部において、印加する前記電流または前記電位差の印加周波数が１Ｈｚ以上１ＴＨｚ以下であってもよい。

＜８＞ 上記＜６＞に記載の細胞イメージング装置は、前記電流電圧印加測定部において、印加する前記電流または前記電位差の印加周波数が１ｋＨｚ以上１ＭＨｚ以下であってもよい。

＜９＞ 上記＜６＞に記載の細胞イメージング装置は、前記電流電圧印加測定部において、印加する前記電流または前記電位差の印加周波数が１ＭＨｚ超であってもよい。

＜１０＞ 上記＜６＞～＜９＞のいずれか1つに記載の細胞イメージング装置は、前記電気物性分布から、イオン輸送モデルを用い、前記細胞または前記細胞群のイオン輸送能を評価することで、前記細胞または前記細胞群を識別する細胞識別部をさらに備えてもよい。

＜１１＞ 上記＜６＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の細胞イメージング装置は、前記細胞または前記細胞群を前記細胞配置部に供給する細胞供給部をさらに備えてもよい。

＜１２＞ 上記＜６＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の細胞イメージング装置は、前記細胞または前記細胞群に刺激を与える刺激部を備えてもよい。

本発明の上記態様によれば、細胞に異方性がある場合にも低侵襲で、高効率に、イオンチャネルの評価が可能な細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサおよび細胞イメージング装置を提供することができる。

本発明の実施形態に係る細胞イメージング装置の模式図である。 電流電圧印加測定部の模式図である。 電流印加電圧測定パターンを説明するための図である。 細胞識別のフローチャートである。 第２実施形態に係る細胞イメージング装置の模式図である。 第２実施形態に係る電流電圧印加測定部の模式図である。 細胞腫の違いによるイメージ画像の違いを説明するための図である。 細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサの変形例の平面図である。 細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサの変形例の平面図である。 図９の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサのＡ－Ａ線に沿った断面図である。 細胞イメージング装置の一例を示す写真である。 細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサの電極の写真である。 スフェロイドの顕微鏡写真である。 ２次元イメージングの時間変化を示す図である。 ３次元イメージングの予想像である。

（細胞イメージング装置）
以下、図面を参照し、本発明の一実施形態に係る細胞イメージング装置１００について説明する。図１に示すように、細胞イメージング装置１００は、電流電圧印加測定部１及びイメージング計算部５０を備える。イメージング計算部５０は、ヤコビ行列計算部３、電気物性分布計算部４、細胞識別部５、及び出力部６を備える。

細胞イメージング装置１００のイメージング計算部５０は、例えば、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ（ＣＰＵ），Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ（ＲＯＭ）、Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ（ＲＡＭ）及びＨａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ（ＨＤＤ）／Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｒｉｖｅ（ＳＳＤ）を備える。ヤコビ行列計算部３、電気物性分布計算部４、細胞識別部５、及び出力部６は、ＣＰＵにおいて、所定のプログラムを実行することで実現される。プログラムは、記録媒体経由で取得してもよく、ネットワーク経由で取得してもよい。また、細胞イメージング装置１００の構成を実現するための専用のハードウェア構成を用いてもよい。以下、各部について説明する。

(電流電圧印加測定部）
電流電圧印加測定部１について、図２を用いて説明する。以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために便宜上特徴となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率などは実際とは異なっていることがある。以下の説明において例示される材料、寸法等は一例であって、本発明はそれらに限定されるものではなく、本発明の効果を奏する範囲で適宜変更して実施することが可能である。

まず方向について定義する。基板２５の表面と平行な一方向をｘ方向、基板２５の表面に沿って、ｘ方向と直交する方向をｙ方向とする。ｚ方向は、基板２５の表面と垂直な方向である。ｚ方向は、ｘ方向及びｙ方向と直交する方向である。以下、＋ｚ方向を「上」、－ｚ方向を「下」と表現する場合がある。上下は、必ずしも重力が加わる方向とは一致しない。

図２に示すように、電流電圧印加測定部１は、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０と制御部３０とを備える。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０は、基板２５と、基板２５上に設けられるＱ個の電極２０と、基板２５上に設けられ、細胞が配置される細胞配置部２８とを備える。測定部４５は、電極２０、細胞配置部２８とからなる。ここで、電極２０の数Ｑは４以上である。より好ましい電極２０の数は８個以上である。図２の例では、電極２０の数Ｑは、８個である。電極２０の数が４以上あることで、細胞の電気物性分布を評価することができる。電極２０の配置位置は、細胞配置部２８の周囲に配置されるのであれば、特に限定されない。電極２０は、細胞配置部２８の中心を中心として円周状に配置されることが好ましい。電極２０は、細胞配置部２８の中心を中心として円周上に、均等に配置されることがより好ましい。電流電圧印加測定部１は、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０の細胞配置部２８に細胞を配置後、電極２０間に所定の電流または電位差を印加し、電位差または電流を測定する。

電流電圧印加測定部１は、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０の細胞配置部２８に細胞を配置後、電極２０間に所定の電流または電位差を印加し、電位差または電流を測定する。電流を印加する場合は、あらかじめ決めた電流印加電圧測定パターン(多数ある電極から二つずつの電極を順番に選び、電流を印加し順次電位差を測定するパターン)に基づき、電位差を測定する。このとき、位相(印加電流と測定電位差との時間的なずれ)も測定することが望ましい。電位差を印加する場合は、あらかじめ決めた電圧印加電流測定パターン(多数ある電極から二つずつの電極を順番に選び、電位差を印加し順次電流を測定するパターン)に基づき、電流を測定する。このとき、位相(印加電位差と測定電流との時間的なずれ)も測定することが好ましい。以後、電流を印加する場合を中心に記載し、電位差を印加する場合の詳細な記載を省略する場合もある。

（基板）
基板２５は、特に限定されない。基板２５には、例えば、樹脂基板、ガラス基板などを用いることができる。

（電極）
電極２０は、基板２５上に設けられる。電気的に制御部３０と接続される。本実施形態では、電極２０と、配線接続部３５とが、基板配線３２で接続され、配線接続部３５と制御部３０とが外部配線３６で接続される。細胞に電流または電位差を印加できれば、電極２０の材質や形状は特に限定されない。電極２０の材料としては、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕなどの金属、導電性高分子などが挙げられる。

電極２０の幅および長さは、細胞または細胞群に対して、精度よく電流又は電位差を印加することができるのであれば、特に限定されない。電極２０の幅は例えば、０．１５ｍｍである。電極２０の長さは例えば、０．４０ｍｍである。

（細胞配置部）
細胞配置部２８は、基板２５上に設けられる。細胞配置部２８の大きさは細胞または細胞群を配置できる程度の大きさ位であれば、特に限定されない。例えば、細胞配置部２８は、直径１ｍｍの円状の領域であってもよい。細胞群は、例えば、スフェロイド、オルガノイドが挙げられる。

細胞配置部２８には、公知の方法で、一個の細胞またはスフェロイド、オルガノイドなどの細胞群を静止させて配置してもよい。また、公知の方法で、細胞または細胞群を流動させることで、細胞または細胞群を細胞配置部２８上に、連続的または間欠的に流動させてもよい。

（制御部）
制御部３０は、例えば、電流を印加する電流印加電極(または電位差を印加する電圧印加電極)と電位差を測定する電圧測定電極(または電流を測定する電流測定電極)の切り替えを行うためのマルチプレクサ、電圧測定(または電流測定)と位相測定を行うインピーダンスアナライザなどを備える。インピーダンスアナライザとは、印加周波数と振幅を変化させて、インピーダンス、すなわち、測定電位差(印加電位差)と印加電流(測定電流)の比、および、その位相とを計測する部品である。制御部３０は、例えば、ＣＰＵにおいて、所定のプログラムを実行し、マルチプレクサおよびインピーダンスアナライザを制御することで、インピーダンス測定（電位差と電流の比、およびその位相の測定）を行う。電流電圧印加測定部1内部だけで制御部３０を制御し、インピーダンス測定を行ってもよいし、イメージング計算部５０で実行されたプログラムに応じて制御部３０を制御し、インピーダンス測定を行ってもよい。インピーダンス測定の結果は、電気物性分布計算部４に送られる。電気物性分布計算部４への情報の伝達方法は特に限定されない。制御部３０から有線でイメージング計算部５０の電気物性分布計算部４に送ってもよいし、無線でイメージング計算部５０の電気物性分布計算部４に送ってもよい。

制御部３０は、あらかじめ決めた電流印加電圧測定パターン(どの電極間に電流を印加し、どの電極間に電位差を測定するかのパターン)に基づき、電極２０間に電流を印加し、電位差を測定する。または、制御部３０は、あらかじめ決めた電圧印加電流測定パターンに基づき、電極２０間に電位差を印加し、電流を測定する。電流を印加する場合、同様に電位差を印加する場合も、どの電極２０間に電流(電位差)を印加し、どの電極間で電位差(電流)を測定するかについては、特に限定されないが、２次元的または３次元的に配置した電極２０に「満遍なく」電流(電位差)を印加し電位差(電流)を測定することが好ましい。「満遍なく電流(電位差)を印加し電位差(電流)を測定する」とは、全ての電極２０が一度は電流電位差の印加または測定に用いられるように、電流電位差を印加測定することを意味する。

図３の電極配置を例にして電極２０への電流印加電圧測定パターンを説明する。電極２０の位置を表す番号は、例えば、基準となる第１電極から反時計回りに番号が振られる。電流印加電圧測定パターンの数Ｍは、各電流印加電圧測定パターンで異なる。以下、各電流印加電圧測定パターンについて説明する。なお、以下に説明する電流印加電圧測定パターンは、電圧印加電流測定パターンにも適用することができる。以下、電流印加電圧測定パターンの例を説明するが、本発明は、以下の電流印加電圧測定パターンに限定されない。

まず、対極法による電流印加電圧測定パターンについて説明する。この場合、対向する一対の電極間に電流を印加する。例えば図３（ａ）で説明をすると、１番電極と９番電極、２番電極と１０番電極といったように、対向する電極に電流を印加する。図３（ａ）の場合は、電極数Ｑが１６であるので、全部で８通りある。電位差は、電流を印加する電極を除外した第２電極および第３電極、第３電極および第４電極のように電極ペアで測定し、第２電極および第３電極の電極ペアから第１５電極と第１６電極の電極ペアまで測定するので、１つの電流印加パターンに１３通りの電圧測定パターンが存在する。したがって、対極法の場合、測定数（測定パターン）Ｍは、全部で１０４通りとなる。ここで、電流を印加して電位差を測定した場合は、測定パターンは、電圧測定パターンとなる。電位差を印加して電流を測定した場合は、測定パターンは電流測定パターンとなる。

次に、隣接法による電流印加電圧測定パターンについて説明する。この場合、隣接する電極間に電流を印加する。例えば図３（ｂ）で説明をすると、１番電極と２番電極、２番電極と３番電極といったように、隣接する電極に電流を印加する。図３（ｂ）の場合は、電極数Ｑが１６であるので、全部で１６通りある。電位差は、電流を印加する電極を除外した第３電極および第４電極のように電極ペアで測定し、第３電極および第４電極から第１５電極と第１６電極まで測定するので、１つの電流印加パターンに１３通りの電圧測定パターンが存在する。したがって、隣接法の場合では、測定数（測定パターン）Ｍは、全部で２０８通りとなる。

リファレンス法による電流印加電圧測定パターンについて説明する。この場合、基準となる電極と、基準となる電極以外の電極との間のすべての組み合わせで電位差を測定する。例えば、図３（ｃ）で説明をすると、１番電極と２番電極、１番電極と３番電極といったように、基準となる電極と基準となる電極以外の電極との間に電流を印加する。図３（ｃ）の場合は、電極数Ｑが１６であるので、全部で１６通りある。電位差は、電流を印加する電極を除外した第３電極および第４電極のように電極ペアで測定し、第３電極および第４電極の電極ペアから第１５電極と第１６電極の電極ペアまで測定するので、１つの電流印加パターンに１３通りの電圧測定パターンが存在する。したがって、リファレンス法では、測定数（測定パターン）Ｍは、全部で２０８通りとなる。

２端子法による電流印加電圧パターンについて説明する。この場合は、電流を印加する電極と電位差を測定する電極とが同じであり、全ての電極の組み合わせで電圧を測定する。電極数Ｑが１６の場合は、測定数（測定パターン）Ｍは、全部で１２０通りとなる。

印加する電流値（または電位差）とその印加周波数は、細胞への影響や装置の簡便性を鑑みて、例えば、１．０ｍＡ以下の電流、１Ｈｚ以上１ＴＨｚ以下までの印加周波数が好ましい。細胞群外液のイオン濃度をイメージングする場合は、印加周波数は１ｋＨｚ以上１ＭＨｚ以下であることが好ましい。細胞群内部のイオン濃度をイメージングする場合は、印加周波数は１ＭＨｚ超であることが好ましい。

以下、本実施形態の細胞イメージング装置１００では、隣接法を用いて、電位差を測定した例について説明する。なお、以下では、電極２０の配置が２次元の例を用いて説明するが、電極２０の配置が３次元の場合にも適用することができる。

（ヤコビ行列計算部３）
ヤコビ行列は、空間に分布する電気物性（導電率、誘電率）の基準に対する変化に対して、電流印加したときの測定電位差(または、電圧印加したときの測定電流)がどれだけ変化するかを示した感度行列である。細胞または細胞群のヤコビ行列（感度行列）は細胞または細胞群の電気物性の空間分布などで異なり、細胞又は細胞群のヤコビ行列が分かれば電気物性分布を算出することができる。ヤコビ行列計算部３は、あらかじめ決められた電流印加電圧測定パターン(または電圧印加電流測定パターン)、メッシュ座標、および各電極２０の座標を基に、細胞配置部２８に配置された細胞または細胞群の領域についてヤコビ行列を計算する。ヤコビ行列計算部３は、細胞または細胞群の配置された画像データ、イオン濃度などをベースとして、例えば、下記式（３）を用いてヤコビ行列Ｊ^ｇを計算する。以下、ヤコビ行列Ｊ^ｇについて説明する。

まず、細胞配置部２８が含まれる領域に対して、Ｑ個の電極２０に応じて、適切な解像度が得られるように、その領域を２次元のメッシュに分割する（３次元の場合は、３次元のメッシュに分割する）。例えば、電極２０がＱ＝８個の場合は、細胞配置部２８をｘ方向に６４分割、ｙ方向におよそ６４分割の合計４０９６点に分割してメッシュｎを作成してもよい（１≦ｎ≦Ｎ）。この場合、メッシュ数Ｎは４０９６となる。メッシュ数や形状は、電極２０の個数や必要な解像度に合わせて適宜設定することができる。電極の配置が３次元的であれば、３次元のメッシュに分割する。

ヤコビ行列Ｊ^ｇは、下記の式（１）で表される。式（１）のＭは、電流印加電圧測定パターンの数を示し、Ｎはメッシュ数を示す。メッシュｎ（１≦ｎ≦Ｎ）におけるヤコビ行列Ｊ^ｇ _nは、式(２)で示される。メッシュｎ（１≦ｎ＜Ｎ）の電流印加電圧測定パターンｍ（１≦ｍ≦Ｍ）におけるヤコビ行列要素Ｊ^ｇ _ｎｍは、下記の式（３）を用い、計算される。ここで、σ_ｎは、電気物性分布の例としてメッシュｎにおける導電率を示すが、他の電気物性分布（導電率差分布Δσ、誘電率分布、誘電率差分布、位相分布、位相差分布）でもよい。Ａ_ｎはｎ番目のメッシュの面積（３次元の場合は体積）を示す。Ｚｍ（ｅ，ｄ）は、電流印加電圧測定パターンｍにおける測定電位差Ｖを示す。ｅは電流印加電圧測定パターンｍにおける電流印加電極ペアを示し、ｄは電流印加電圧測定パターンｍにおける電圧測定電極ペアを意味する。ｖ（ｉ^ｅ）は、電流印加電極ペアｅへの電流印加により誘発された、電圧測定電極ペアd間の電位差を示す。ｖ（ｉ^ｄ）は電圧測定電極ペアｄへの電流印加により誘発された、電流印加電極ペアｅ間の電位差である。∇はナブラ記号で微分演算子である。

（電気物性分布計算部）
電気物性分布計算部４は、ヤコビ行列計算部３から送られてきた細胞または細胞群のヤコビ行列Ｊ^ｇと、電流電圧印加測定部１で測定された電位差および位相（または電流および位相）とから細胞または細胞群の電気物性分布を計算する。ここで、電気物性分布とは、例えば、導電率分布σ、導電率差分布Δσ、誘電率分布、誘電率差分布、位相分布、および、位相差分布などである。以後、導電率と導電率差（時間ｔ_０の基準に対する時間ｔの導電率）を区別して記載する場合があり、差を表す記号としてΔを用いる。以下、導電率分布σに焦点をあてて説明する。細胞および細胞群のヤコビ行列Ｊ^ｇと、測定したインピーダンスＺから、導電率分布σを求める問題は、不適切逆問題と呼ばれ、例えば、繰り返し計算を使って求めることができる。その繰り返し回数を右数の数字で表す。繰り返し回数０回目の初期の導電率分布σ^０は（右上の数字は繰り返し回数）、細胞又は細胞群のヤコビ行列Ｊ^ｇを用い下記の式（４）から計算される。Ｔは転置行列を示す。式（４）中のＺは、下記の式（５）に示す通り、あらかじめ決められた電流印加電圧測定パターン（または電圧印加電流測定パターン）Ｍ個の要素を持つ列ベクトルである。式（５）中のＺｍは、下記の式（６）で表される。式（６）中のｍは、電流印加電圧測定パターンである。
細胞又は細胞群の導電率分布σは、初期の導電率分布σ^０を繰り返し回数のスタートとして、下記の式（７）を用いて計算される。式（７）中のｉは、繰り返し計算回数を表す。式（７）中のＲは正則化行列、λは計算を収束させるための、任意のパラメータを示し、例えば、０．０１である。Ｒは例えば、下記の式（８）で表され、細胞または細胞群のヤコビ行列Ｊ^ｇの関数である。計算された細胞又は細胞群の電気物性分布は、細胞識別部５または出力部６に送られる。電気物性分布計算部４は、電気物性分布（例えば、導電率分布）を別の電気物性分布に変換して細胞識別部５又は出力部６に送ってもよい。例えば、電気物性分布計算部４は、導電率分布σを下記の式（９）を用いることで、イオン濃度分布に変換して細胞識別部５に送ってもよい。下記の式（９）でＣ_ｅｘｐ（ｘ，ｙ，ｔ）は、時間ｔにおける座標（ｘ、ｙ）における計測イオン濃度、γは定数、σ（ｘ，ｙ，ｔ）は時間ｔにおける座標（ｘ、ｙ）における導電率を示す。

（細胞識別部）
細胞識別部５は、電気物性分布計算部４から送られた電気物性分布から、イオン輸送モデルを用い、細胞または細胞群のイオン輸送能を評価することで、細胞または細胞群を識別する。イオン輸送能の評価は、例えば、以下の方法により行うことができる。図４は、細胞識別のフローチャートを示す。まず、細胞のイオン輸送能の初期値の設定を行う（Ｓ１）。ここで、細胞のイオン輸送能としては、拡散係数、膜透過率などが挙げられる。次に、設定した細胞のイオン輸送の値およびイオン輸送モデルを用いて、数値解析を行い、モデルイオン濃度Ｃ_ｎｕｍ（ｘ，ｙ，ｔ）（Ｍ）を求める（Ｓ２）。ここで、イオン輸送モデルは、例えば、下記の（１０）式で表されるＦｉｃｋの拡散方程式などである。下記の（１０）式において、Ｄ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ、ｙ）における拡散係数（ｍ^２／ｓ）を示し、ｔは時間（ｓ）、∇はナブラ記号で微分演算子である。次に、得られたモデルイオン濃度Ｃ_ｎｕｍ（ｘ，ｙ，ｔ）と計測イオン濃度Ｃ_ｅｘｐ（ｘ，ｙ，ｔ）との誤差を計算し（Ｓ３）。誤差の数値が規定値の範囲内かどうかを判定する（Ｓ４）。誤差の数値が範囲外であれば、再度イオン輸送能の数値を設定し（Ｓ５）、モデルイオン濃度Ｃ_ｎｕｍを計算しなおす（Ｓ２）。誤差の数値が規定値の範囲内であれば、細胞識別部５は、その細胞のイオン輸送能の数値などに基づき細胞または細胞群を識別する（Ｓ６）。識別した細胞または細胞群の情報は出力部６に送られる。

（出力部）
出力部６は、電気物性分布計算部４から送られた細胞または細胞群の電気物性分布、細胞識別部５から送られた細胞または細胞群の識別情報を出力する。細胞または細胞群の電気物性分布および識別情報の出力先は特に限定されない。出力先は、液晶ディスプレイのような表示部であってもよいし、ＨＤＤのような記憶装置であってもよい。

＜第２実施形態＞
次に第２実施形態に係る細胞イメージング装置１００Ａについて図５および図６を用いて説明する。なお、この第２の実施形態においては、第１の実施形態における構成要素と同一の部分については同一の符号を付し、その説明を省略し、異なる点についてのみ説明する。図６に示すように、細胞イメージング装置１００Ａは、電流電圧印加測定部１Ａ及びイメージング計算部５０を備える。イメージング計算部５０は、ヤコビ行列計算部３、電気物性分布計算部４、細胞識別部５、及び出力部６を備える。

(電流電圧印加測定部）
電流電圧印加測定部１Ａについて、図６を用いて説明する。図６に示すように、電流電圧印加測定部１Ａは、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ａと、制御部３０と、細胞または細胞群に刺激を与える刺激部６０Ａおよび６０Ｂと、細胞または細胞群を細胞配置部２８に供給する細胞供給部７０と、を備える。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ａは、基板２５と、基板２５上に設けられるＱ個の電極２０と、基板２５上に設けられ、細胞が配置される細胞配置部２８とを備える。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ａは、電極２０および細胞配置部２８からなる測定部を２以上備える。第２実施形態では、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ａは、測定部４５Ａ、４５Ｂおよび４５Ｃの３つの測定部を有する。ここで、各測定部の電極２０の数Ｑはそれぞれ４以上である。電極２０の数は、各測定部によって、同一でもよいし、異なっていてもよい。複数の測定部を備えることで、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ａは、同時に複数の細胞または細胞群の測定を行うことができる。また、各測定部の電極２０は、各測定部の細胞配置部２８の中心を中心として、円周上に均等に配置されることがより好ましい。電流電圧印加測定部１Ａは、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０に細胞を配置後、電極２０間に所定の電流または電圧を印加し、電位差または電流を測定する。各測定部における測定は同時に行ってもよいし、各測定部ごとに測定時間をずらしてもよい。

刺激部６０Ａおよび６０Ｂは、細胞または細胞群に刺激を与える機能を有する。刺激の種類は、細胞又は細胞群に刺激を与えられるのであれば、特に限定されず、機械的刺激、電気的刺激、薬液的刺激などが挙げられる。刺激部６０Ａは、薬液を供給する薬液供給手段である。刺激部６０Ｂは電気的に細胞または細胞群に刺激を与える電極である。

刺激部６０Ａおよび６０Ｂによって、細胞または細胞群に刺激を与え、細胞群内部および／または細胞群外液のイオン濃度をイメージングすることで、細胞群の細胞膜に３次元的に分布したイオンチャネルの動作を確認することができる。例えば、ヒドロピリジン系カルシウム・イオンチャネル拮抗薬のひとつのアムロジピンは、Ｌ型Ｃａイオンチャネルを阻害し、他のＮ型やＴ型Ｃａイオンチャネルなどは阻害しない特徴を持つ。したがって、図７のように、細胞群内部および／または細胞群外液のイオン濃度イメージング画像に異方性が顕著に表れる。刺激部６０Ａを備えることで、薬液的刺激によるイオンチャネルの挙動を可視化でき、薬液の影響を詳細に調べることができる。

細胞供給部７０は、細胞または細胞群を細胞配置部２８に供給する。細胞供給部は、細胞又は細胞群を細胞配置部２８に供給できるのであれば特に限定されない。細胞供給部７０は細胞配置部２８に静止して細胞を配置してもよいし、細胞又は細胞群を連続的または間欠的に細胞配置部２８を通過するように流動させてもよい。

＜細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサの変形例１＞
次に細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサの変形例である細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｂを説明する。図８に示すように細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｂは、基板２５と、基板２５上に設けられるＱ個の電極２０Ａ，２０Ｂと、基板２５上に設けられ、細胞が配置される細胞配置部２８とを備える。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｂは、電極２０Ａ，２０Ｂおよび細胞配置部２８からなる測定部４５Ｄを備える。電極２０Ａの個数は４個以上であり、電極２０Ｂの個数は４個以上である。電極２０Ａと電極２０Ｂの数は同一であってもよく、異なっていてもよい。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｂの電極２０Ａおよび２０Ｂは、細胞配置部２８の中心を中心として同心円状に配置される。具体的には、異なる半径の同心円Ｃ１，Ｃ２の円周上に電極２０Ａ，２０Ｂがそれぞれ配置される。電極２０Ａは、半径の小さい内側の円Ｃ１に配置され、電極２０Ｂは、半径が大きい外側の円Ｃ２に配置される。各電極２０Ａ，２０Ｂは、各円Ｃ１、Ｃ２のそれぞれの円周上に均等に配置されることが好ましい。また、電極２０Ａと電極２０Ｂとは、動径方向に重ならないように配置されることが好ましい。このように電極２０Ａと電極２０Ｂとを配置することで、同じ面内に電極を配置していても３次元の細胞イメージングを行うことができる。

＜細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサの変形例２＞
次に細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサの変形例である細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｃを図９および図１０を用いて説明する。図９は、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｃの平面図である。図１０は、図９のＡ－Ａ線に沿った断面図である。図９および図１０に示すように、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｃは、基板２５と、基板２５上に設けられるＱ個の電極２０Ｃ，２０Ｄと、基板２５上に設けられ、細胞が配置される細胞配置部２８とを備える。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｃは、電極２０Ｃ，２０Ｄ、細胞配置部２８とからなる測定部４５Ｄを備える。電極２０Ｃと電極２０Ｃの周囲を覆う絶縁体８１Ａによって、電極層８０Ａが構成される。同様に、電極２０Ｄと電極２０Ｄの周囲を覆う絶縁体８１Ｂによって、電極層８０Ｂが構成される。本実施形態では、電極層８０Ａの上に電極層８０Ｂが設けられている。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｃは、極２０Ｃと電極２０Ｃの周囲を覆う絶縁体８１Ａおよび電極層８０Ａ、電極２０Ｄと電極２０Ｄの周囲を覆う絶縁体８１Ｂとからなる電極層８０Ｂを備える。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０Ｃにおいて、電極層が２以上積層されていてもよい。電極２０Ｃと電極２０Ｄとは、それぞれＸＹ平面において円状に配置される。電極２０Ｃの個数は４以上であり、電極２０Ｄの数は４以上である。電極２０Ｃおよび電極２０Ｄの数は同一であってもよく、異なっていてもよい。このように電極２０Ｃと電極２０Ｄとを３次元的に配置することで、３次元の細胞イメージングを行うことができる。

以上、本開示の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０および細胞イメージング装置を詳説した。なお、本発明の技術的範囲は前記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。また、本発明の趣旨に逸脱しない範囲で、前記実施形態における構成要素を周知の構成要素に置き換えることは適宜可能であり、また、前記した変形例を適宜組み合わせてもよい。

（実施例）
次に、本開示の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサおよび細胞イメージング装置の有効性を検証するために実験した例について説明する。

細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサおよび細胞イメージング装置を用いて、細胞配置部にスフェロイドを静止させて配置して、導電率分布から、細胞群外液のイオン濃度を２次元的にイメージングした。図１１は、本開示の細胞イメージング装置の一例の写真である。本実施例で用いた細胞イメージング装置は、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ、マルチプレクサ、インピーダンスアナライザ（ＩＭ３５７０，ＨＩＯＫＩ， Ｊａｐａｎ）および制御・データ集積用ＰＣで構成される。図１２は細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ１０の電極の拡大図である。細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサの電極は、イメージング領域のｘ－ｙ平面内に１層あたり８電極を２層分、合計１６電極からなる。各電極長ｌｅ＝０．４０ｍｍ、電極幅ｗｅ＝０．１５ｍｍである。１層および多層の電極間においてインピーダンス計測される電極ペア数はそれぞれ、４０パターンと２０８パターンである。電極ペアの切替は、マルチプレクサで行われ、各電極ペアにおいて、インピーダンスアナライザを用いて定電圧を印加し、電流を計測した。細胞スフェロイド（直径３１７μｍ）（図１３はスフェロイドの顕微鏡写真）をイメージング対象の細胞組織として、センサ中央に固定し、スクロース溶液を５μＬ滴下し、インピーダンス計測を開始した。時刻ｔ＝０ｓのときのインピーダンスを基準に正規化したインピーダンスＺｎにより、逆問題解析により、導電率分布を求めた。このときの印加電圧の周波数は、１ｋＨｚから１ＭＨｚまで掃引した。

図１４は、１層目の８電極（電極ペア数４０パターン）を使用した場合において、ｔ＝２０ｓ、ｔ＝２７ｓ、ｔ＝３４ｓにおける本発明によるスフェロイド外液のイオン濃度分布の２Ｄ＋時間のイメージング結果である。図１４に示した通り、スクロース溶液を滴下した後、時間が経過することで、図１４のイメージング像の左上側に多くのイオンが発していることが分かった。一般に、スフェロイドを形成した場合、細胞分布や性質は非等方的になる。以上より、本開示の細胞イメージング装置により、細胞または細胞群のイオンチャネルの評価が可能であることが分かった。

次に、図１２で示した２層分１６電極（電極ペア数２０８パターン）を使用した場合の３Ｄイメージング例を示す。図１５（ａ）は、２層分１６電極を使用した場合の３次元的な電位分布を示す。図１５（ｂ）は、本発明により得られる、ある時間の細胞群外液のイオン濃度分布の３Ｄイメージングの予想図である。色が濃色ほどイオン濃度が高く、細胞スフェロイドの周囲の濃度が高いことが分かる。中心部はスフェロイドのため塗りつぶしている。そのスフェロイドの近傍は導電率が高く、外縁部に近づくに従って導電率は低くなると予想される。図１４のように時刻ｔの経過により導電率分布も変化し、導電率の上昇がスフェロイド近傍から観察されている。そのため、スフェロイドからのイオンの流出および周囲溶液への拡散を、本発明により３次元的にイメージングできることが予想される。

１ 電流電圧印加測定部、３ ヤコビ行列計算部、４ 電気物性分布計算部、５ 細胞識別部、６ 出力部、１０ 細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ、２０ 電極、２５ 基板、２８ 細胞配置部、１００ 細胞イメージング装置

Claims (12)

1. 基板と、
   前記基板上に設けられる４以上の電極および前記基板上に設けられ、細胞または細胞群が配置される細胞配置部からなる測定部と、
   を備え、
   前記電極は、前記細胞配置部の周囲に配置される、細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ。
2. 前記電極は、前記細胞配置部の中心を中心として同心円状に配置される、請求項１に記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ。
3. 前記測定部が２以上ある、請求項１または２に記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ。
4. 前記電極と前記電極の周囲を覆う絶縁体とからなる電極層を備える、請求項１～３のいずれか1項に記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ。
5. 前記電極層が２以上積層される、請求項４に記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサ。
6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞イメージング用電気インピーダンス・トモグラフィセンサを備える細胞イメージング装置であって、
   前記電極間に電流又は電位差を印加し、前記電流を印加する場合は電流印加電圧測定パターンに基づき電位差と位相を測定し、前記電極間に前記電位差を印加する場合は電圧印加電流測定パターンに基づき電流と位相を測定する、電流電圧印加測定部と、
   前記電流印加電圧測定パターンまたは前記電圧印加電流測定パターン、前記細胞配置部を分割して得たメッシュ座標、および各前記電極の座標を基に、ヤコビ行列を計算するヤコビ行列計算部と、
   前記ヤコビ行列計算部で計算された前記ヤコビ行列と、前記電流電圧印加測定部で測定された前記電位差および位相または前記電流および位相と、から前記細胞または前記細胞群の電気物性分布を計算する電気物性分布計算部と、
   を備える、細胞イメージング装置。
7. 前記電流電圧印加測定部において、印加する前記電流または前記電位差の印加周波数が１Ｈｚ以上１ＴＨｚ以下である、請求項６に記載の細胞イメージング装置。
8. 前記電流電圧印加測定部において、印加する前記電流または前記電位差の印加周波数が１ｋＨｚ以上１ＭＨｚ以下である、請求項６に記載の細胞イメージング装置。
9. 前記電流電圧印加測定部において、印加する前記電流または前記電位差の印加周波数が１ＭＨｚ超である、請求項６に記載の細胞イメージング装置。
10. 前記電気物性分布から、イオン輸送モデルを用い、前記細胞または前記細胞群のイオン輸送能を評価することで、前記細胞または前記細胞群を識別する細胞識別部をさらに備える、請求項６～９のいずれか1項に記載の細胞イメージング装置。
11. 前記細胞または前記細胞群を前記細胞配置部に供給する細胞供給部をさらに備える、請求項６～１０のいずれか１項に記載の細胞イメージング装置。
12. 前記細胞または前記細胞群に刺激を与える刺激部を備える、請求項６～１１のいずれか１項に記載の細胞イメージング装置。

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