JP2022553471A - ヘアピンループを含むポリヌクレオチド鋳型の末端に非対称アダプターを生成し、そこから配列決定するための方法 - Google Patents

ヘアピンループを含むポリヌクレオチド鋳型の末端に非対称アダプターを生成し、そこから配列決定するための方法 Download PDF

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Abstract

ヘアピン又はダンベルアダプターを使用することによって、遊離の５’及び３’末端を有する二本鎖核酸鋳型から非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を生成し、そこから配列決定する方法。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年１０月２５日に出願された米国仮出願第６２／９２６，３６０号からの、米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく優先権を主張し、その開示は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の概要）
本開示は、全般に、ヘアピンループを含むポリヌクレオチドの末端に非対称アダプターを生成し、そこから配列決定するための方法に関する。
配列リストの参照による組み込み
本出願には、２０２０年１０月１９日に作成された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルの配列リストが付属しており、ＩＢＭ－ＰＣ、ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムで機械フォーマット化された７８４バイトのデータを含む。配列リストは、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
閉端二本鎖鋳型を使用する配列プラットフォームでは、理想的には、配列決定鋳型の最後に２つの異なるアダプター配列が必要である。このような末端の非対称性により、単一の配列決定プライマとポリメラーゼが閉端鋳型の一端にのみ結合し、鋳型分子ごとに１つの配列読み取りのみを生成できる。現在、これは同じ配列が鋳型の両端に追加される標準ライブラリの準備では不可能であり、したがって、ポアソンアーティファクトを配列決定に導入し、即ち、一部の鋳型にはプライマ／ポリメラーゼが結合せず、一部の鋳型にはプライマ／ポリメラーゼが１つ結合し、一部の鋳型にはプライマ／ポリメラーゼが結合する必要がある（両端に１つずつ）。
本開示は、ヘアピンループを含むポリヌクレオチド鋳型の末端に非対称アダプターを生成するための方法を提供する。非対称アダプターを有効にすることにより、標準的な方法で送られるポアソンアーティファクトを回避でき、それによって配列決定ライブラリの変換収率が向上する。更に、本明細書に開示される方法は、ライブラリ調製ワークフローを簡略化し、ライブラリ調製のいくつかのステップを配列決定プラットフォーム上で実施することを可能にする。
一実施形態では、本開示は、遊離の５’及び３’末端を有する二本鎖核酸鋳型から非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を生成する方法を提供し、方法は、（Ａ）第１の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを、遊離の５’及び３’末端を含む二本鎖核酸鋳型の３’末端に結合させるステップと、（Ｂ）核酸ヘアピンの各３’末端から、プロセッシブポリメラーゼを使用して二本鎖核酸鋳型に相補的な配列を伸長させ、２つの長いヘアピン二本鎖鋳型を生成するステップであって、二本鎖鋳型の一端は閉じたヘアピン（「ヘアピン末端」）を含み、二本鎖の他端は遊離の３’鎖末端及び遊離の５’鎖末端（「遊離末端」）を含む、ステップと、（Ｃ）（ｉ）第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを二本鎖鋳型の遊離末端に連結すること、又は（ｉｉ）ＴｅｌＮプロテロメラーゼを使用し、ＴｅｌＮ認識配列を含むように設計された二本鎖鋳型の遊離末端を閉じることにより、各長いヘアピン二本鎖鋳型の遊離末端を閉じ、非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を形成するステップとを含む。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、二本鎖核酸鋳型は二本鎖ＤＮＡ鋳型である。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、二本鎖核酸鋳型の５’及び３’末端は、脱リン酸化され、末端修復される。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、二本鎖核酸鋳型は、平滑の５’及び３’末端を有する。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、二本鎖核酸鋳型は、Ａテールの３’末端を有する。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、第１の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、リガーゼを使用して二本鎖核酸鋳型の３’末端に連結される。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ又はＴ３ＤＮＡリガーゼである。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、第１の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、平滑末端又はＴテール末端を含む。本明細書に提示される実施形態の更なる別の実施形態では、第１の核酸ベースのヘアピンアダプターは、Ｙ字型アダプターである。本明細書に提示される実施形態の特定の実施形態では、互いに結合している２つの第１の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターから形成された二量体は、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用することによって除去される。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、プロセッシブポリメラーゼはＰｈｉ２９ポリメラーゼである。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、平滑末端又はＴテール末端を含む。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、ステップ（Ｃ）の前に、長いヘアピン二本鎖鋳型は、５’オーバーハングを生成する制限酵素で消化される。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、ステップ（Ｃ）の前に、長いヘアピン二本鎖鋳型は、３’オーバーハングを生成する制限酵素で消化される。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、消化された長いヘアピン二本鎖鋳型のオーバーハング配列に相補的なオーバーハング配列を含む。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、ポリヌクレオチドキナーゼ及びリガーゼを使用し、二本鎖鋳型の遊離末端に連結される。本明細書に提示される実施形態の更なる別の実施形態では、互いに結合している２つの第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターから形成された二量体は、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用することによって除去される。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、ＴｅｌＮプロテロメラーゼはファージＮ１５に由来し、ＴｅｌＮプロテロメラーゼは、ＴｅｌＮ認識配列で長いヘアピン二本鎖鋳型を切断し、切断部位に共有結合で閉じた末端を残す。本明細書に提示される実施形態の更なる別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、（Ｃ’）ローリングサークル複製を使用し、ポリシストロン性増幅非対称の閉末端二本鎖核酸鋳型を含むナノボール複合体を生成するステップを更に含む。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、本明細書に開示される方法は、（Ｄ）配列決定プライマ及びポリメラーゼを使用し、非対称の閉端二本鎖核酸鋳型又はナノボール複合体を配列決定するステップを更に含む。本明細書に提示される実施形態の更なる別の実施形態では、ステップ（Ｂ）、ステップ（Ｃ）（ｉｉ）及びステップ（Ｄ）は、ワンポット反応として共に組み合わせることができる。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、ステップ（Ｂ）、ステップ（Ｃ）（ｉｉ）、及びステップ（Ｄ）は、自動配列決定プラットフォームのウェル内で行われる。
特定の実施形態では、本開示はまた、相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡから非対称の二本鎖核酸鋳型を生成する方法を提供し、方法は、（Ｉ）各鎖の５’末端に相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡを生成するステップであって、ヘアピンループは、塩基対のトランスポザーゼ認識配列を含み、タグ付きＤＮＡの５’末端と３’末端との間に一本鎖配列のギャップがある、ステップと、（ＩＩ）ギャップフィルライゲーション反応を使用してタグ付きＤＮＡの５’末端と３’末端との間のギャップをファイリング（filing）し、閉端タグ付きＤＮＡを形成する、ステップと、（ＩＩＩ）閉端タグ付きＤＮＡの各ヘアピン領域のトップ鎖にニックを生成するステップと、（ＩＶ）プロセッシブポリメラーゼを使用して、二本鎖核酸鋳型に相補的な配列を各ニックから伸長させ、２つの長いヘアピン二本鎖鋳型を生成するステップであって、二本鎖鋳型の一端は閉じたヘアピン（「ヘアピン末端」）を含み、二本鎖の他端は３’鎖末端及び５’鎖末端（「遊離末端」）を含む、ステップと、（Ｖ）（ａ）核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを二本鎖鋳型の遊離末端に連結すること、又は、（ｂ）ＴｅｌＮプロテロメラーゼを使用し、ＴｅｌＮ認識配列を含むように設計された二本鎖鋳型の遊離末端を閉じることにより、各長いヘアピン二本鎖鋳型の遊離末端を閉じ、非対称の閉端の二本鎖核酸鋳型を形成するステップとを含む。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、トランスポザーゼ認識配列は、１９－ｂｐのモザイク末端配列である。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、ギャップの長さは９塩基対である。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、ギャップフィルライゲーション反応はクレノウ断片を含む。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、ギャップフィルライゲーション反応は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びアンプリガーゼを含む。本明細書に提示される実施形態の特定の実施形態では、ニックは、部位特異的エンドヌクレアーゼを使用することによって生成される。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、プロセッシブポリメラーゼはＰｈｉ２９ポリメラーゼである。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、平滑末端又はＴテール末端を含む。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、ステップ（Ｖ）の前に、長いヘアピン二本鎖鋳型は、５’オーバーハングを生成する制限酵素で消化される。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、ステップ（Ｖ）の前に、長いヘアピン二本鎖鋳型は、３’オーバーハングを生成する制限酵素で消化される。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、消化された長いヘアピン二本鎖鋳型のオーバーハング配列に相補的なオーバーハング配列を含む。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、ポリヌクレオチドキナーゼ及びリガーゼを使用し、二本鎖鋳型の遊離末端に連結される。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、互いに結合している２つの核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターから形成された二量体は、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用することによって除去される。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、ＴｅｌＮプロテロメラーゼはファージＮ１５に由来し、ＴｅｌＮプロテロメラーゼは、ＴｅｌＮ認識配列で長いヘアピン二本鎖鋳型を切断し、切断部位に共有結合で閉じた末端を残す。本明細書に提示される実施形態の更なる実施形態では、方法は、（Ｖ’）ローリングサークル複製を使用し、ポリシストロン性増幅非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を含むナノボール複合体を生成するステップを更に含む。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、方法は、（ＶＩ）配列決定プライマ及びポリメラーゼを使用し、非対称の閉端二本鎖核酸鋳型又はナノボール複合体を配列決定するステップを更に含む。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、ステップ（Ｖ）（ｉｉ）及びステップ（ＶＩ）を共に組み合わせて単一のステップにすることができる。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、ステップ（Ｖ）（ｉｉ）及びステップ（ＶＩＩ）は、自動配列決定プラットフォームのウェル内で行われる。
特定の実施形態では、本開示はまた、相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡを配列決定する方法を提供し、方法は、（Ｉ）各鎖の５’末端に相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡを生成するステップであって、ヘアピンループは、塩基対のトランスポザーゼ認識配列を含み、タグ付きＤＮＡの５’末端と３’末端との間に一本鎖配列のギャップがある、ステップと、（ＩＩ）ポリメラーゼを使用することにより、タグ付きＤＮＡの各伸長鎖の５’及び３’末端にトランスポザーゼ認識配列及び相補的なトランスポザーゼ認識配列を含むタグ付きＤＮＡの２本の伸長鎖を形成するステップと、（ＩＩＩ）タグ付きＤＮＡの伸長鎖を分離し、タグ付きＤＮＡの伸長鎖のそれぞれの末端でトランスポザーゼ認識配列及び相補的なトランスポザーゼ認識配列を再ハイブリダイズし、相補的なヘアピンループを形成するステップと、（ＩＶ）配列決定ポリメラーゼを使用し、相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡの伸長鎖を配列決定するステップとを含む。本明細書に提示される実施形態の他の実施形態では、ステップ（ＩＶ）は、自動配列決定プラットフォームのウェル内で行われる。本明細書に提示される実施形態の更なる他の実施形態では、ステップ（ＩＶ）の配列決定の前に、（ＩＩＩ’）タグ付きＤＮＡのポリシストロン性増幅伸長鎖を含むナノボール複合体を生成する。
ヘアピンの５’を二本鎖ポリヌクレオチド鋳型の３’末端に連結し、プロセッシブポリメラーゼを使用してヘアピンの３’末端を伸長させることによってヘアピン末端及び遊離末端を生成することにより鋳型末端非対称性を生成する方法を示す概略図である。追加のヘアピン又はダンベルを非対称鋳型の遊離末端に連結し、非対称領域を含む閉端鋳型を提供することができる。小さなアダプター二量体は、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用して除去されることができる。
Ｙ字型アダプターの５’を二本鎖ポリヌクレオチド鋳型の３’末端に連結し、プロセッシブポリメラーゼを使用してＹ字型アダプターの３’末端を伸長させることによってヘアピン末端及び遊離末端を生成することにより鋳型末端非対称性を生成する方法を示す概略図である。
非対称鋳型の「遊離末端」へのダンベルアダプター又はシンプルなヘアピンアダプターの平滑末端ライゲーションを示す概略図である。
５’又は３’オーバーハングを有する制限消化の非対称鋳型への相補的なオーバーハング配列を有するダンベルアダプター又はシンプルなヘアピンアダプターの平滑末端ライゲーションを示す概略図である。
非対称鋳型配列へのＴｅｌＮプロテロメラーゼ部位の包含とそれに続く環状化（配列番号１及び２）を示す概略図である。
非対称領域を含む閉端鋳型が自動配列決定プラットフォームを使用して配列決定され得、したがって、示されるように、少なくともいくつかのステップが配列決定プラットフォームのセルにおいて原位置で実行され得る方法を示す概略図である。
ギャップファイリング（filing）反応を使用してトップ鎖にニックを生成することにより、タグ付きＤＮＡから非対称末端を生成する方法を示す概略図である。トップ鎖のニックは、部位特異的エンドヌクレアーゼ、ユーザ消化、ＲＮＡ塩基及びリボヌクレアーゼ、ジオールなどの使用を含むいくつかのアプローチを使用して生成できる。
タグ付きＤＮＡから３’末端ヘアピンループを生成するためのポリメラーゼフラッシュベースの方法の使用を示す概略図である。
タグ付きＤＮＡからの機器鋳型の生成と配列決定の方法を示す概略図である。
本明細書で使用される場合、「含める（includes）」、「含める（including）」、「含める（includes）」、「含む（including）」、「含む（contains）」、「含む（containing）」、「有する（have）」、「有する（having）」、及びそれらの任意の変形という用語は、要素又は要素のリストを含める（includes）又は含む（contains）プロセス、方法、プロセスによって定義された製品、又は物質の組成が、それらの要素だけでなく、そのようなプロセス、方法、プロセスによって定義された製品、又は物質の組成に明示的にリストされない、又は固有ではない他の要素を含み得るように、非排他的な包含をカバーすることを意図する。同様に、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含める（include）」、「含める（includes）」、及び「含めている（including）」は、互換可能であり、限定することを意図するものではない。
様々な実施形態の説明が用語「含んでいる（comprising）」を使用する場合、当業者であれば、いくつかの特定の例では、実施形態が、語句「から本質的になる（consisting essentially of）」又は「からなる（consisting of）」を使用して代替的に説明され得ることを更に理解するであろう。
本明細書で使用される場合、単数形「１つ（a）」、「１つ（an）」及び「この（the）」は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、２つ以上のタンパク質の混合物などを含む、といった具合である。
また、別途記載のない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。
操作実施例以外又は特に明記されていない場合、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数値は、全ての場合において用語「約（about）」によって修飾されると理解されるべきである。本開示の実施形態を説明するために使用される場合の「約」という用語は、パーセンテージに関連し、±１％、±２％、±３％、±４％、±５％を意味する。本明細書で使用される「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味することができ、それは、値がどのように測定又は決定されるかに部分的に依存する場合があり、例えば、測定システムの制限などである。代替的に、「約」は、所与の値のプラスマイナス２０％、プラスマイナス１０％、プラスマイナス５％、又はプラスマイナス１％の範囲を意味することができる。代替的に、特に生物学的システム又はプロセスに関し、この用語は、１０倍以内、５倍以内、又は２倍以内を意味することができる。特定の値が出願及び特許請求の範囲に記載される場合、特に明記しない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定することができる。また、値の範囲及び／又は部分的な範囲が提供される場合、範囲及び／又は部分的な範囲は、範囲及び／又は部分的な範囲の端点を含み得る。一部の例では、変動は、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、更には０．１％の量又は濃度を含み得る。
本明細書における数値範囲の列挙については、同じ程度の精度でその間にある各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲では、６と９に加えて、数字７と８が考慮され、６．０～７．０の範囲では、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に考慮される。
本明細書に記載される全ての刊行物は、本明細書の説明に関連して使用され得る方法論を説明及び開示する目的で、参照により全体が本明細書に組み込まれる。更に、本開示において明示的に定義されている用語と類似又は同一である１つ以上の刊行物に提示される任意の用語に関して、本開示において明示的に提供される用語の定義は、全ての点において支配する。
本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されるものではなく、したがって変化する可能性があることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態又は態様を説明することのみを目的としており、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「アダプター（adaptor）」という用語は、他の核酸の末端に連結し得る一本鎖又は二本鎖核酸分子である。本開示の目的で、「アダプター」は、特に明記しない限り、ヘアピン又はダンベルループを含む。特定の実施形態では、本開示のアダプターは、５’及び／又は３’末端に一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む二本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）である。更なる実施形態では、一本鎖のオーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から２０ヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドに関して使用される場合の「相補的（complementary）」という用語は、特定の条件下で標的ポリヌクレオチドの同定領域に選択的にアニーリングすることができるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的（substantially complementary）」という用語及び文法上同等物は、特定の条件下で標的ポリヌクレオチドの同定領域に特異的にアニーリングすることができるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意味することを意図する。アニーリングとは、ある核酸と別の核酸とのヌクレオチド塩基対相互作用を指し、その結果、二本鎖、三本鎖、又は他の高次構造が形成される。一次相互作用は、通常、ワトソン－クリック及びフーグスティーン型水素結合によるヌクレオチド塩基特異的、例えば、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、及びＧ：Ｃである。特定の実施形態では、塩基スタッキング及び疎水性相互作用はまた、二本鎖の安定性に寄与し得る。ポリヌクレオチドが標的核酸の相補的又は実質的に相補的な領域にアニーリングする条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）及びＷｅｔｍｕｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９（１９６８）に記載されるように、当技術分野で周知である。アニーリング条件は、特定の用途に依存し、過度の実験なしに、当業者によって日常的に決定し得る。
本明細書で使用される場合、「ｄＮＴＰ」という用語は、デオキシヌクレオシド三リン酸を指す。ＮＴＰはリボヌクレオチド三リン酸を指す。プリン塩基（Ｐｕ）は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、及びそれらの誘導体と類似体を含む。ピリミジン塩基（Ｐｙ）は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）及びそれらの誘導体及び類似体を含む。そのような誘導体又は類似体の例は、限定ではなく例示として、レポーター基で修飾されたもの、ビオチン化のもの、アミンで修飾されたもの、放射性標識のもの、アルキル化のものなどであり、ホスホロチオエート、亜リン酸塩、環原子で修飾された誘導体なども含む。レポーター基は、フルオレセインなどの蛍光基、ルミノールなどの化学発光基、遅延蛍光による検出が可能なＮ－（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸などのテルビウムのキレート剤等であり得る。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション（hybridization）」という用語は、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。得られた二本鎖ポリヌクレオチドは「ハイブリッド」又は「二本鎖」である。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満の塩濃度を含み、約２００ｍＭ未満であり得る。ハイブリダイゼーション緩衝液は、５％ＳＳＰＥなどの緩衝塩溶液、又は当技術分野で知られる他のそのような緩衝液を含む。ハイブリダイゼーション温度は５℃まで低くすることができるが、典型的には２２℃より高く、より典型的には約３０℃より高く、及び典型的には３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは通常、厳しい条件下で実行され、つまり、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の非相補的な配列にはハイブリダイズしない条件下で実行される。厳しい条件は配列に依存し、異なる状況で異なり、当業者によって日常的に決定され得る。
本明細書で使用される場合、「標識（label）」という用語は、成分及びその関連要素の分離を容易にするように、成分、例えば、アダプターが修飾される、例えば、別の分子に結合するプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「ライゲーション（ligation）」「連結（ligating）」という用語、及びその文法上同等物は、典型的には鋳型駆動反応において、２つ以上の核酸、例えば、オリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドの末端間に共有結合又は連鎖を形成することを意味することを意図する。結合又は連鎖の性質は大きく異なり得、ライゲーションは酵素的又は化学的に実行され得る。本明細書で使用される場合、ライゲーションは通常、酵素的に行われ、あるオリゴヌクレオチドの５’炭素末端ヌクレオチドと別のヌクレオチドの３’炭素との間にホスホジエステル結合を形成する。鋳型駆動ライゲーション反応は、米国特許第４，８８３，７５０号、米国特許第５，４７６，９３０号、米国特許第５，５９３，８２６号、及び米国特許第５，８７１，９２１号などの参考文献に記載され、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。「ライゲーション」という用語はまた、ホスホジエステル結合の非酵素的形成、並びにホスホロチオエート結合、ジスルフィド結合などのオリゴヌクレオチドの末端間の非ホスホジエステル共有結合の形成を包含する。
本明細書で使用される場合、「核酸（nucleic acid）」という用語は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合又はヌクレオチド間類似体によって連結された２’－デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）及びリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、並びに関連する対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、テトラアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋などを含む、ヌクレオチドモノマーの一本鎖及び二本鎖ポリマーを意味する。核酸は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであり得る。核酸は、完全にデオキシリボヌクレオチド、完全にリボヌクレオチド、又はそれらのキメラ混合物から構成され得る。ヌクレオチドモノマー単位は、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含むが、それらに限定されない、本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかを含み得る。核酸は、典型的には、いくつかの単量体単位、例えば、５～４０から数千の単量体ヌクレオチド単位までのサイズの範囲である。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｅＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、断片化された核酸、ミトコンドリアや葉緑体などの細胞内小器官から得られた核酸、生体サンプル上又は生体サンプル中に存在し得る微生物又はＤＮＡ又はＲＮＡウイルスから得られた核酸を含むが、それらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド類似体（nucleotide analogs）」という用語は、修飾されたヌクレオチド塩基部分、修飾されたペントース部分、及び／又は修飾されたリン酸部分、並びにポリヌクレオチドの場合、他の場所で一般的に記載される修飾されたヌクレオチド間結合を有する合成類似体を指す（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：６１３－２９，１９９１、Ａｇａｒｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９４、及びＳ．Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９－１３４，１９９８）。例示的なリン酸類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート、ボラノホスフェートが含まれ、そのような対イオンが存在する場合、関連する対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、Ｎａ＋を含むが、それらに限定されない。例示的な修飾されたヌクレオチド塩基部分は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）；Ｃ－５プロピニル－Ｃ及びＣ－５プロピニル－Ｕを含むがそれらに限定されないＣ－５－プロピニル類似体；２，６－ジアミノプリン（２－アミノアデニン又は２－アミノ－ｄＡとしても知られる）；ヒポキサンチン、シュードウリジン、２－チオピリミジン、イソシトシン（ｉｓｏＣ）、５－メチルｉｓｏＣ、及びイソグアニン（ｉｓｏＧ、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号を参照）を含むが、それらに限定されない。例示的な修飾されたペントース部分は、Ｂｚ－Ａ－ＬＮＡ、５－Ｍｅ－Ｂｚ－Ｃ－ＬＮＡ、ｄｍｆ－Ｇ－ＬＮＡ、及びＴ－ＬＮＡを含むがそれらに限定されないロックド核酸（ＬＮＡ）類似体（例えば、Ｔｈｅ Ｇｌｅｎ Ｒｅｐｏｒｔ，１６（２）：５，２００３；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４：３６０７－３０，１９９８を参照）、及び２’－又は３’－位置が水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ及びフェノキシ）、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、又はブロモである２’－又は３’－修飾を含むが、それらに限定されない。修飾されたヌクレオチド間結合は、リン酸類似体、アキラル及び非荷電サブユニット間結合を有する類似体（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｒｎ．，５２：４２０２，１９８７）、並びにアキラルサブユニット間結合を有する非荷電モルフォリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）を含む。一部のヌクレオチド間結合類似体は、モルホリデート、アセタール、及びポリアミド結合複素環を含む。
「ポリヌクレオチド（polynucleotides）」の文脈において、本明細書で使用される「変異体（variant）」及び「誘導体（derivative）」という用語は、ヌクレオチドの置換、欠失又は付加の導入によって変更された、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列又はポリヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの変異体又は誘導体は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部を含む融合ポリヌクレオチドであり得る。本明細書で使用される「変異体（variant）」又は「誘導体（derivative）」という用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドへの任意のタイプの分子の共有結合によって化学的に修飾されたポリヌクレオチド又はその断片を指す。例えば、限定ではないが、ポリヌクレオチド又はその断片は、例えば、アセチル化、リン酸化、メチル化などによって化学的に修飾され得る。変異体又は誘導体は、結合した分子のタイプ又は位置のいずれかにおいて、天然に存在する又は開始するヌクレオチド又はポリヌクレオチドとは異なる方法で修飾される。変異体又は誘導体は、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド上に天然に存在する１つ以上の化学基の欠失を更に含む。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片の変異体又は誘導体は、特定の化学的切断、アセチル化、製剤などを含むがそれらに限定されない、当業者に知られる技術を使用する化学修飾によって化学的に修飾され得る。更に、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片の変異体又は誘導体は、１つ以上のｄＮＴＰ又はヌクレオチド類似体を含み得る。ポリヌクレオチド変異体又は誘導体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片と類似又は同一の機能を有し得る。ポリヌクレオチド変異体又は誘導体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片と比較し、追加の又は異なる機能を有し得る。
本明細書で使用される場合、「タグ付け（tagmentation）」、「タグ付け（tagment）」、又は「タグ付け（tagmenting）」という用語は、トランスポザーゼを介した断片化及びタグ付けを使用することにより、クラスター形成及び配列決定の準備ができている溶液中で、核酸、例えば、ＤＮＡをアダプター修飾鋳型に変換することを指す。このプロセスは、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと複合体を形成したトランスポザーゼ酵素を含むトランスポゾン複合体による核酸の修飾を伴うことが多い。タグ付けにより、核酸の断片化と、二本鎖断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションを同時にもたらす。トランスポザーゼ酵素を除去するための精製ステップに続いて、ＰＣＲによって適合された断片の末端に追加の配列を加える。
「トランスポザーゼ（transposase）」は、トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）を備えた機能複合体を形成し、例えば、インビトロ転位反応で、それがインキュベートされる二本鎖標的核酸へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素を意味する。本明細書に提示されるトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含み得る。トランスポザーゼ、トランスポソーム及びトランスポソーム複合体は、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示によって例示されるように、当業者に一般に知られる。本明細書に記載の多くの実施形態は、Ｔｎ５トランスポザーゼ及び／又は過活性Ｔｎ５トランスポザーゼに言及するが、意図された目的で標的核酸に５’タグを付けて断片化するのに十分な効率でトランスポゾン末端を挿入し得る任意の転位システムを本発明で使用し得ることが理解される。特定の実施形態では、好ましい転位システムは、トランスポゾン末端をランダムに又はほぼランダムな方法で挿入し、標的核酸に５’タグを付けて断片化することができる。
本明細書で使用される場合、「転位反応（transposition reaction）」という用語は、１つ以上のトランスポゾンが、例えば、ランダム部位又はほぼランダム部位で標的核酸に挿入される反応を指す。転位反応の必須成分は、転送したトランスポゾン配列及びその相補体（転送されないトランスポゾン末端配列）、並びに官能的転位又はトランスポゾン複合体を形成するために必要な他の成分を含む、トランスポゾンのヌクレオチド配列を示すトランスポザーゼ及びＤＮＡオリゴヌクレオチドである。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、又は期望に応じて、追加の配列（例えば、アダプター又はプライマ配列）を更に含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、過活性Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＴｎ５型トランスポゾン末端（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７）により、又はＲ１及びＲ２末端配列を含むＭｕＡトランスポザーゼ及びＭｕトランスポゾン末端（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，１９８３，Ｃｅｌｌ，３５：７８５；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４８９３）によって形成される転位複合体を使用することによって例示される。しかし、意図された目的で標的ＤＮＡに５’－タグを付け及び断片化するのに十分な効率でランダム又はほぼランダムな方法でトランスポゾン末端を挿入し得る任意の転位システムを本発明で使用し得る。本発明の方法に使用し得る当技術分野で知られる転位システムの例は、黄色ブドウ球菌Ｔｎ５５２（（Ｃｏｌｅｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｄ．，１８３：２３８４－８、Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４３：１７３－８６）、ＴｙＩ（Ｄｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２及び国際特許出願第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：１５１２、Ｃｒａｉｇ，１９９６，Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ：Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０４：２７－４８）、ＴｎＩＯ及びＩＳｌＯ（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０４：４９－８２）、マリナートランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９）、Ｔｃｉ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，１９９６，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０４：１２５－４３）、Ｐ要素（Ｇｌｏｏｒ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ，２６０：９７－１１４）、ＴｎＪ（Ｉｃｈｉｋａｗａ ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ，１９９０，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６５：１８８２９－３２）、細菌の挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６）、レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：２５２５－９）、及び酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，１９８９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４）を含むが、それらに限定されない。トランスポゾン末端を標的配列に挿入するための方法は、適切なインビトロ転位システムが利用可能であるか、又は当技術分野の知識に基づいて開発し得る任意の適切なトランスポゾンシステムを使用してインビトロで実施することができる。一般に、本明細書で提供される方法で使用するための適切なインビトロ転位システムは、少なくとも、十分な純度、十分な濃度、及び十分なインビトロ転位活性のトランスポザーゼ酵素、並びにトランスポザーゼが、転位反応を触媒し得るそれぞれのトランスポザーゼと機能複合体を形成するトランスポザーゼ末端を必要とする。本発明で使用され得る適切なトランスポザーゼトランスポゾン末端配列は、トランスポザーゼの野生型、誘導体又は突然変異体から選択されるトランスポザーゼと複合体を形成する野生型、誘導体又は突然変異体型トランスポゾン末端配列を含むが、それらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「トランスポソーム複合体（transposome complex）」という用語は、二本鎖核酸に非共有結合するトランスポザーゼ酵素を指す。例えば、複合体は、非共有結合複合体形成をサポートする条件下で二本鎖トランスポゾンＤＮＡとプレインキュベートされたトランスポザーゼ酵素であり得る。二本鎖トランスポゾンＤＮＡは、Ｔｎ５ＤＮＡ、Ｔｎ５ＤＮＡの一部、トランスポゾン末端組成物、トランスポゾン末端組成物の混合物、又は過活性Ｔｎ５トランスポザーゼなどのトランスポザーゼと相互作用することができる他の二本鎖ＤＮＡを含み得るが、それらに限定されない。
「トランスポゾン末端（transposon end）」（ＴＥ）という用語は、二本鎖核酸、例えば、インビトロ転位反応で機能するトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素との複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す二本鎖ＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端は、転位反応においてトランスポザーゼと機能複合体を形成することができる。非限定的な例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示に記載されるように、トランスポゾン末端は、１９－ｂｐの外側末端（「ＯＥ」）トランスポゾン末端、内末端（「ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は野生型若しくは突然変異体型Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識される「モザイク末端」（「ＭＥ」）トランスポゾン末端、又はＲ１及びＲ２トランスポゾン末端を含み得る。トランスポゾン末端は、インビトロ転位反応においてトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素と機能複合体を形成するのに適した任意の核酸又は核酸類似体を含み得る。例えば、トランスポゾン末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された塩基、非天然の塩基、修飾された骨格を含み得、一本鎖又は二本鎖にニックを含み得る。「ＤＮＡ」という用語は、トランスポゾン末端組成物に関連して本開示では時々使用されるが、任意の適切な核酸又は核酸類似体がトランスポゾン末端において利用され得ることが理解されるべきである。
閉端二本鎖配列決定鋳型を使用する配列決定プラットフォームでは、通常、配列決定鋳型の最後に２つの異なるアダプター配列が必要である。このような末端の非対称性により、単一の配列決定ポリマーとポリメラーゼが閉端配列決定鋳型の一端にのみ結合し、鋳型分子ごとに１つの配列読み取りのみを生成できる。しかし、そのような末端非対称性は、現在、ライブラリ調製のためのそのような配列決定プラットフォームによって使用されない。代わりに、それらの配列決定プラットフォームには対称的な端があり、配列決定プライマは配列決定鋳型のいずれかの末端に結合できるため、ポアソンアーティファクトが配列決定に導入される。言い換えると、一部の配列決定鋳型にはプライマ／ポリメラーゼが結合されず、一部の配列決定鋳型には１つのプライマが結合され、一部の配列決定鋳型には一部の配列決定鋳型の両端に２つのプライマが結合される。非対称の末端を有する閉端配列決定鋳型を使用すると、それらのポアソンアーティファクトを回避できる。したがって、本開示の方法は、配列決定ライブラリの変換収率を顕著に増加させることにより、非対称の末端を有する閉端二本鎖鋳型の生成を提供することにより、最先端技術に対する顕著な改善を提供する。更に、本開示の方法は、配列決定プラットフォームのウェル内で原位置で実行できるステップを提供し、配列決定プラットフォームでライブラリ調製を実施することを可能にする。
図１に示すように、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、遊離の５’及び３’末端を有する二本鎖核酸鋳型に結合される。二本鎖核酸鋳型は、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又は二本鎖分子を形成するＤＮＡとＲＮＡのキメラ混合物であり得る。核酸のヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を介して共に結合される、天然に存在するヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＵから構成され得る。代替的に、核酸の１つ以上のヌクレオチドは、何らかの方法（例えば、ヌクレオチド類似体）で修飾され得る。ヌクレオチド類似体の例は、リボース又はデオキシリボースの２’位で修飾されて－メトキシ－エチル基を有するヌクレオチド又はリボヌクレオチド、－Ｏ－メチル基、フルオロ基、２－アミノプリン、５－ブロモデュ、デオキシウリジン、２，６－ジアミノプリン、デオキシイノシン、ヒドロキシメチルｄＣ、５－メチルｄＣ、５－ニトロインドール、５－ヒドロキシブチン－２’－デオキシウリジン、及び８－アザ－７－デアザグアノシンを含む。更に、ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合に加えて、ホスホロチオエート結合によって共に連結され得る。二本鎖核酸鋳型の遊離の５’及び３’末端は、平滑であり得、又は１つ以上の一致しない塩基のオーバーハング（例えば、３’オーバーハング又は５’オーバーハング）を有し得る。特定の実施形態では、二本鎖核酸鋳型の遊離の５’及び／又は３’末端は、１つ以上のアデニン塩基の３’オーバーハングを含む。更なる実施形態では、二本鎖核酸鋳型の５’及び／又は３’末端は、脱リン酸化され、末端修復される。
核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、末端が二本鎖核酸鋳型に結合できるように、それ自体で一巡して元に戻る配列を含む。核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、任意の配列を有し得、又は標的配列を含むように設計され得る。標的配列の例は、共通プライマ配列、ユニバーサル配列決定プライマ配列、バーコード配列、制限酵素配列、ＴｅｌＮ認識シーケンス、又は前述の任意の組み合わせを含むが、それらに限定されない。核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、リガーゼを使用することによって二本鎖核酸鋳型に結合され得る。リガーゼの例は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ＣｏｌｉＤＮＡリガーゼ、ＡｍｐｌｉｇａｓｅＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、及びＴａｑＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼ、並びにＴ４ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、及びＭ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍリガーゼなどのＲＮＡリガーゼを含むが、それらに限定されない。リン酸化又は脱リン酸化のステップは、必要に応じて、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを二本鎖核酸鋳型又はタグ付きＤＮＡに結合させる前に実行してもよい。本開示の目的で、前述の酵素のいずれかは、処理能力、熱安定性、忠実度などのような酵素の１つ以上の機能性を高めるために、遺伝子工学技術によって更に修飾され得る。核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、核酸鋳型に結合したアダプターなどのアダプター含有配列の検出及び／又は精製を可能にするために、標識を更に含み得る。核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、末端が二本鎖鋳型配列又はタグ付きＤＮＡに結合できるように、それ自体で一巡して元に戻る配列を含む。本開示の目的で、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、ヘアピンループを形成するその配列の一部を含むＹ字型アダプターであり得る。図２に示すように、Ｙ字型アダプターを使用し、５’及び３’末端が遊離の二本鎖核酸鋳型から非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を生成できる。更に、２つの核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを共に連結することによって形成された二量体は、そのような二量体が下流の反応を暗示する場合、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用して除去できる。
本開示は更に、核酸ヘアピンの各３’末端から、プロセッシブポリメラーゼ及び遊離ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ又はＮＴＰ）を使用して二本鎖核酸鋳型又はタグ付きＤＮＡに相補的な配列を伸長させ、２つの長いヘアピン二本鎖鋳型を生成することを提供し、ここで二本鎖鋳型の一端は閉じたヘアピン（「ヘアピン末端」）を含み、二本鎖鋳型の他端は遊離の３’鎖末端及び遊離の５’鎖末端（「遊離末端」）を含む。プロセッシブポリメラーゼの例は、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含むが、それらに限定されない。
図３及び図４に示すように、本開示はまた、第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを二本鎖鋳型に結合させることにより、長いヘアピン二本鎖鋳型の「遊離末端」を閉じ、非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を形成することを提供する。第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、それ自体で一巡して元に戻る配列を含み、その結果、末端を二本鎖鋳型に結合し得る。図３に示すように、二本鎖鋳型への第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、平滑末端を有し得、また平滑末端を有する二本鎖鋳型に結合され得る。図４に示すように、第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、５’オーバーハング又は３’オーバーハング末端を有し得、相補的なオーバーハング末端を有する二本鎖鋳型に結合され得る。二本鎖鋳型のオーバーハング末端は、制限酵素で消化し、相補的なオーバーハング末端を有するように第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを設計することで生成され得る。第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、任意の配列を有し得、又は標的配列を含むように設計され得る。標的配列の例は、共通プライマ配列、ユニバーサル配列決定プライマ配列、バーコード配列、制限酵素配列、ＴｅｌＮ認識シーケンス、又は前述の任意の組み合わせを含むが、それらに限定されない。鋳型に結合された第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、二本鎖核酸鋳型又はタグ付きＤＮＡに結合された核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターと５０％未満、５０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、又は１００％同一の配列を含み得る。第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、リガーゼを使用することによって二本鎖鋳型に結合され得る。リガーゼの例は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ＣｏｌｉＤＮＡリガーゼ、ＡｍｐｌｉｇａｓｅＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、及びＴａｑＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼ；Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、及びＭ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍリガーゼなどのＲＮＡリガーゼを含むが、それらに限定されない。リン酸化又は脱リン酸化のステップは、必要に応じて、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを二本鎖鋳型に結合させる前に実行してもよい。本開示の目的で、前述の酵素のいずれかは、処理能力、熱安定性、忠実度などのような酵素の１つ以上の機能性を高めるために、遺伝子工学技術によって更に修飾され得る。第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、二本鎖鋳型に結合されたアダプターなどのアダプター含有配列の検出及び／又は精製を可能にするために、標識を更に含み得る。２つの第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを共に連結することによって形成された二量体は、そのような二量体が下流の反応を暗示する場合、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用して除去できる。得られた非対称の閉端二本鎖核酸鋳型は、ローリングサークル増幅によって増幅されてナノボールを形成することができる。ナノボールは、自動配列決定プラットフォームのウェルにロードされ、そこから配列決定が行われる。ナノボール構造は、１つの鋳型ナノボールを除く全てが配列ウェルに入るのを排除するのに十分なサイズであり得、したがって、個々のウェルからの複数の干渉配列決定反応を回避する。更に、ナノボールワークフローステップは、溶液又はチューブで調製し得る。
二本鎖鋳型を閉じるための代替の実施形態が図５に示される。二本鎖鋳型はＴｅｌＮ認識配列を含み、二本鎖鋳型は、ＴｅｌＮプロテロメラーゼ（例えば、ファージＮ１５プロテロメラーゼ）を使用することによって「閉じられる」ことができる。特定の実施形態では、ＴｅｌＮ認識配列は、
５’－ＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡ－３’（配列番号１）
５’－ＡＴＡＧＴＣＧＴＧＴＧＴＴＡＡＣＧＧＧＴＡＡＴＡＴＧＣＧＣＧＣＡＴＡＴＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＣＡＣＡＣＧＡＣＴＡＴ－３’（配列番号２）の５６ｂｐ配列を含む。
図６に示すように、本明細書に開示される方法のステップの多くは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）ウェルのように、配列プラットフォームのウェル内で実行され得る。例えば、ＺＭＷウェルには、結合されたヘアピン又はダンベルアダプター、ポリメラーゼ、ＴｅｌＮプロテロメラーゼ、１つ以上の配列決定プライマ、及びｄＮＴＰＳ又はＮＴＰＳを含む反応バッファーを含む二本鎖核酸鋳型がロードされ得る。最初の読み取りでは、核酸ヘアピン又はダンベル配列の３’末端が伸長され、閉じたヘアピン（「ヘアピン末端」）を含む二本鎖鋳型を生成し、二本鎖の他端は、遊離の３’鎖末端及び遊離の５’鎖末端（「遊離末端」）を含む。そうすることで、ＴｅｌＮ酵素が作用するＴｅｌＮ認識配列が生成され、それによって配列決定プライマが結合する閉端二本鎖核酸鋳型が形成され、その後の読み取りで自動プラットフォームで配列決定が実行される。
図７～図９に示すように、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、トランスポザーゼによって仲介されたタグ付け又は転位反応を介して二本鎖核酸鋳型に結合する。そのような反応の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１０／０１２００９８号に記載される。トランスオポソームには遊離のＤＮＡ末端があり、「切り貼り」反応でランダムにＤＮＡに挿入される。ＤＮＡ末端は遊離するため、核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを追加しながら、ＤＮＡを効果的に断片化する。本明細書で提供される方法での使用に適した例示的な転位複合体は、過活性Ｔｎ５トランスポザーゼとＴｎ５型トランスポゾン末端、又はＲ１とＲ２末端配列、トランスポザーゼＴｎ３、及び眠り姫トランスポザーゼを含むＭｕＡトランスポザーゼとＭｕトランスポゾン末端によって形成されるもの（例えば、Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７３６７，１９９８及びＭｉｚｕｕｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ３５：７８５，１９８３、Ｓａｖｉｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４８９３，１９９５を参照されたく、それらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含むが、それらに限定されない。しかし、転位システムにより、二本鎖核酸鋳型の５’末端に核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを結合させるのに十分な効率でトランスポゾン末端を挿入できる。提供される方法で使用できる既知の転位システムの他の例は、黄色ブドウ球菌Ｔｎ５５２、Ｔｙｌ、トランスポゾンＴｎ７、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０、マリナートランスポザーゼ、Ｔｅｌ、Ｐ要素、Ｔｎ３、細菌の挿入配列、レトロウイルス、並びに酵母のレトロトランスポゾン（例えば、Ｃｏｌｅｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：２３８４－８、ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１７３－８６、Ｄｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２、国際特許出願第９５／２３８７５号、Ｃｒａｉｇ，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１５１２、Ｃｒａｉｇ，１９９６，Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ：Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：２７－４８、Ｋｌｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：４９－８２、Ｌａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：５４７０－９、Ｐｌａｓｔｅｒｋ，１９９６，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０４：１２５－４３、Ｇｌｏｏｒ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：９７－１１４、Ｉｃｈｉｋａｗａ ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ，１９９０，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８８２９－３２、Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：２５２５－９、Ｂｏｅｋｅ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，１９８９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４を参照されたく、それらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含むが、それらに限定されない。特定の実施形態では、タグ付き鋳型はモザイク末端（ＭＥ）配列を含み、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。
トランスポザーゼ反応の後、各鎖の５’末端に相補的なヘアピンループを含む得られたタグ付きＤＮＡは、クレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、及び／又はアンプリガーゼを使用したギャップフィリング反応を使用して充填できる一本鎖ギャップ（例えば、９ｂｐギャップ）を含む（図７を参照）。次に、得られた閉端タグ付きＤＮＡは、部位特異的エンドヌクレアーゼの使用、ユーザ消化、ＲＮＡ塩基の組み込み、次にリボヌクレアーゼ、ジオールなどを含む、任意の数の手法を使用してトップストランドにニックを入れる。特定の実施形態では、部位特異的エンドヌクレアーゼを使用し、トップストランドにニックを生成する。ニックの入ったタグ付き鋳型は、プロセッシブポリメラーゼを使用して２つの長いヘアピン二本鎖鋳型を生成することにより、二本鎖核酸鋳型に相補的な配列である各ニックから伸長でき、ここで二本鎖鋳型の一端は閉じたヘアピン（「ヘアピン末端」）を含み、二本鎖の他端は３’鎖末端及び５’鎖末端（「遊離末端」）を含む。二本鎖鋳型がＴｅｌＮ認識配列を含むように設計される場合、ＴｅｌＮプロテロメラーゼの使用を含め、上記と同じ方法を使用して二本鎖鋳型が「閉じられる」ことができる。
代替的に、トランスポザーゼ反応の後にポリメラーゼフラッシュが使用され得る（図８を参照）。各鎖の５’末端に相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡが最初に生成される。その後、トランスポザーゼ認識配列と、タグ付きＤＮＡの各伸長鎖の５’及び３’末端に相補的なトランスポザーゼ認識配列を含むタグ付きＤＮＡの２つの伸長鎖がポリメラーゼを使用して合成される。次に、伸長鎖が分離され、タグ付きＤＮＡの末端にあるトランスポザーゼ認識配列と相補的なトランスポザーゼ認識配列がヘアピンループに再形成される。次に、ヘアピンループを含む伸長鎖は自動配列決定プラットフォームのウェルにロードされ、配列決定ポリメラーゼを使用して配列決定される（図９を参照）。
いくつかの実施形態では、非対称の閉端二本鎖核酸鋳型の配列決定は、合成による配列決定、ブリッジＰＣＲ、連鎖停止配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポア配列決定、及びライゲーションによる配列決定のうちの１つ以上の使用を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用される配列決定方法論は、合成による配列決定（ＳＢＳ）である。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば標的核酸又はそのアンプリコン）に沿った核酸プライマの伸長を監視し、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリマーベースのＳＢＳの実施態様では、プライマに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用して鋳型の配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存的にプライマに付加する（それによってプライマを伸長させる）。
パイロシーケンシングなどの、サイクル反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に組み込まれるときに無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１），８４－９ （１９９６）、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１），３－１１（２００１）、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５）、３６３（１９９８）；米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号、及び米国特許第６，２７４，３２０号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシーケンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出でき、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ生成光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して監視することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシーケンシング手順には必要ない。本開示により生成されたアンプリコンへのパイロシーケンシングの適用に適合させることができる有用な流体システム、検出器、及び手順は、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８Ａ１号、米国特許第７，５９５，８８３号、及び米国特許第７，２４４，５５９号に記載され、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して、又はゼロモード導波路（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースの配列決定のための技術及び試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２－６８６（２００３）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）、Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６－１１８１（２００８）に記載され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ，ａ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ）から市販される電気検出器及び関連技術、又は米国特許出願公開第２００９／００２６０８２Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９Ａ１号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３Ａ１号、又は米国特許出願公開第２０１０／０２８２６１７Ａ１号に記載される配列決定方法及びシステムを使用でき、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。結合平衡除外を使用してターゲット核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用し、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を産生することができる。
別の有用な配列決定技術は、ナノポア配列決定である（例えば、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１４７－１５１（２０００）、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７－８２５（２００２）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１－６１５（２００３）を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのナノポアの実施形態では、標的核酸又は標的核酸から除去された個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸又はヌクレオチドがナノポアを通過するとき、各ヌクレオチド種は、細孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別され得る。（米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）、Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）、Ｃｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
前述の説明から、本明細書に記載の発明に変更及び修正を加えて、それを様々な使用法及び条件に採用できることは明らかである。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内にある。
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、リストされた要素の任意の単一の要素又は組み合わせ（又は下位組み合わせ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、その実施形態を、任意の単一の実施形態として、あるいは任意の他の実施形態と、又はその一部と組み合わせて含む。
本明細書に記載されている全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (43)

  1. 遊離の５’及び３’末端を有する二本鎖核酸鋳型から非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を生成する方法であって、
    （Ａ）第１の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを、遊離の５’及び３’末端を含む二本鎖核酸鋳型の前記３’末端に結合させるステップと、
    （Ｂ）前記核酸ヘアピン又はダンベルの各３’末端から、プロセッシブポリメラーゼを使用して前記二本鎖核酸鋳型に相補的な配列を伸長させ、２つの長いヘアピン二本鎖鋳型を生成するステップであって、前記二本鎖鋳型の一端は閉じたヘアピン（「ヘアピン末端」）を含み、前記二本鎖の他端は遊離の３’鎖末端及び遊離の５’鎖末端（「遊離末端」）を含む、ステップと、
    （Ｃ）
    （ｉ）第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを前記二本鎖鋳型の前記遊離末端に連結すること、又は、
    （ｉｉ）ＴｅｌＮプロテロメラーゼを使用し、ＴｅｌＮ認識配列を含むように設計された前記二本鎖鋳型の前記遊離末端を閉じることにより、各長いヘアピン二本鎖鋳型の前記遊離末端を閉じ、非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を形成するステップと、を含む、方法。
  2. 前記二本鎖核酸鋳型は二本鎖ＤＮＡ鋳型である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記二本鎖核酸鋳型の前記５’及び３’末端は脱リン酸化され、末端修復される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記二本鎖核酸鋳型は、平滑の５’及び３’末端を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記二本鎖核酸鋳型は、Ａテールの３’末端を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記第１の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、リガーゼを使用して前記二本鎖核酸鋳型の前記３’末端に連結される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼ又はＴ３ＤＮＡリガーゼである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記第１の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、平滑末端又はＴテール末端を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第１の核酸ベースのヘアピンアダプターはＹ字型アダプターである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 互いに結合している２つの第１の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターから形成された二量体は、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用することによって除去される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記プロセッシブポリメラーゼはＰｈｉ２９ポリメラーゼである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、平滑末端又はＴテール末端を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ステップ（Ｃ）の前に、前記長いヘアピン二本鎖鋳型は、５’オーバーハングを生成する制限酵素で消化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. ステップ（Ｃ）の前に、前記長いヘアピン二本鎖鋳型は、３’オーバーハングを生成する制限酵素で消化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、消化された前記長いヘアピン二本鎖鋳型の前記オーバーハング配列に相補的なオーバーハング配列を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 前記第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、ポリヌクレオチドキナーゼ及びリガーゼを使用して二本鎖鋳型の遊離末端に連結される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 互いに結合している２つの第２の核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターから形成された二量体は、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用することによって除去される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＴｅｌＮプロテロメラーゼはファージＮ１５に由来し、前記ＴｅｌＮプロテロメラーゼは、前記ＴｅｌＮ認識配列で前記長いヘアピン二本鎖鋳型を切断し、前記切断部位に共有結合で閉じた末端を残す、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  19. （Ｃ’）ローリングサークル複製を使用し、ポリシストロン性増幅非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を含むナノボール複合体を生成するステップを更に含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. （Ｄ）配列決定プライマ及びポリメラーゼを使用し、前記非対称の閉端二本鎖核酸鋳型又はナノボール複合体を配列決定するステップを更に含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ステップ（Ｂ）、ステップ（Ｃ）（ｉｉ）及びステップ（Ｄ）は、ワンポット反応として共に組み合わせることができる、請求項２０に記載の方法。
  22. ステップ（Ｂ）、ステップ（Ｃ）（ｉｉ）及びステップ（Ｄ）は、自動配列決定プラットフォームのウェル内で行われる、請求項２０に記載の方法。
  23. 相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡから非対称の二本鎖核酸鋳型を生成する方法であって、
    （Ｉ）各鎖の前記５’末端に相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡを生成するステップであって、前記ヘアピンループは、塩基対のトランスポザーゼ認識配列を含み、前記タグ付きＤＮＡの前記５’末端と前記３’末端との間に一本鎖配列のギャップがある、ステップと、
    （ＩＩ）ギャップフィルライゲーション反応を使用して前記タグ付きＤＮＡの前記５’末端と前記３’末端との間の前記ギャップをファイリングし、閉端タグ付きＤＮＡを形成するステップと、
    （ＩＩＩ）前記閉端タグ付きＤＮＡの各ヘアピン領域のトップ鎖にニックを生成するステップと、
    （ＩＶ）プロセッシブポリメラーゼを使用し、前記二本鎖核酸鋳型に相補的な配列を各ニックから伸長させ、２つの長いヘアピン二本鎖鋳型を生成するステップであって、前記二本鎖鋳型の一端は閉じたヘアピン（「ヘアピン末端」）を含み、前記二本鎖の他端は３’鎖末端及び５’鎖末端（「遊離末端」）を含む、ステップと、
    （Ｖ）
    （ａ）核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターを前記二本鎖鋳型の前記遊離末端に連結すること、又は
    （ｂ）ＴｅｌＮプロテロメラーゼを使用し、ＴｅｌＮ認識配列を含むように設計された前記二本鎖鋳型の前記遊離末端を閉じることにより、各長いヘアピン二本鎖鋳型の前記遊離末端を閉じ、非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を形成するステップと、を含む、方法。
  24. 前記トランスポザーゼ認識配列は１９－ｂｐのモザイク末端配列である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ギャップの長さは９塩基対である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ギャップフィルライゲーション反応はクレノウ断片を含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ギャップフィルライゲーション反応は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びアンプリガーゼを含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ニックは、部位特異的エンドヌクレアーゼを使用して生成される、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記プロセッシブポリメラーゼはＰｈｉ２９ポリメラーゼである、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、平滑末端又はＴテール末端を含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. ステップ（Ｖ）の前に、前記長いヘアピン二本鎖鋳型は、５’オーバーハングを生成する制限酵素で消化される、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. ステップ（Ｖ）の前に、前記長いヘアピン二本鎖鋳型は、３’オーバーハングを生成する制限酵素で消化される、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、消化された前記長いヘアピン二本鎖鋳型の前記オーバーハング配列に相補的なオーバーハング配列を含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. 前記核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターは、ポリヌクレオチドキナーゼ及びリガーゼを使用して前記二本鎖鋳型の前記遊離末端に連結される、請求項２３～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 互いに結合している２つの核酸ベースのヘアピン又はダンベルアダプターから形成された二量体は、サイズ選択又はサイズ排除技術を使用することによって除去される、請求項２３～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＴｅｌＮプロテロメラーゼはファージＮ１５に由来し、前記ＴｅｌＮプロテロメラーゼは、前記ＴｅｌＮ認識配列で前記長いヘアピン二本鎖鋳型を切断し、前記切断部位に共有結合で閉じた末端を残す、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  37. （Ｖ’）ローリングサークル複製を使用し、ポリシストロン性増幅非対称の閉端二本鎖核酸鋳型を含むナノボール複合体を生成するステップを更に含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
  38. （ＶＩ）配列決定プライマ及びポリメラーゼを使用し、前記非対称の閉端二本鎖核酸鋳型又はナノボール複合体を配列決定するステップを更に含む、請求項２３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ステップ（Ｖ）（ｉｉ）及びステップ（ＶＩ）は、共に組み合わせて単一のステップにすることができる、請求項３８に記載の方法。
  40. ステップ（Ｖ）（ｉｉ）及びステップ（ＶＩＩ）は、自動配列決定プラットフォームのウェル内で行われる、請求項３９に記載の方法。
  41. 相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡを配列決定する方法であって、
    （Ｉ）各鎖の前記５’末端に相補的なヘアピンループを含むタグ付きＤＮＡを生成するステップであって、前記ヘアピンループは、塩基対のトランスポザーゼ認識配列を含み、前記タグ付きＤＮＡの前記５’末端と前記３’末端との間に一本鎖配列のギャップがある、ステップと、
    （ＩＩ）ポリメラーゼを使用することにより、タグ付きＤＮＡの各伸長鎖の５’及び３’末端にトランスポザーゼ認識配列及び相補的なトランスポザーゼ認識配列を含むタグ付きＤＮＡの２本の伸長鎖を形成するステップと、
    （ＩＩＩ）前記タグ付きＤＮＡの伸長鎖を分離し、前記タグ付きＤＮＡの伸長鎖のそれぞれの末端で前記トランスポザーゼ認識配列及び前記相補的なトランスポザーゼ認識配列を再ハイブリダイズして、相補的なヘアピンループを形成するステップと、
    （ＩＶ）配列決定ポリメラーゼを使用し、相補的なヘアピンループを含む前記タグ付きＤＮＡの伸長鎖を配列決定するステップと、を含む、方法。
  42. ステップ（ＩＶ）は、自動配列決定プラットフォームのウェル内で行われる、請求項４１に記載の方法。
  43. ステップ（ＩＶ）の配列決定の前に、
    （ＩＩＩ’）タグ付きＤＮＡのポリシストロン性増幅伸長鎖を含むナノボール複合体を生成する、請求項４１に記載の方法。
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